Штамм SтарнуLососсUS SарRорнутIсUSн 1-продуцент уреазы Советский патент 1981 года по МПК C12N15/00 

1 Изобретение относится к микробиологической про1-ышленности, в частности к получению нового штамма, используемого для получения фермент уреазы. В настоящее время для получения , уреазы используют источники растительного происхождения, в основном сою. В качестве продуцентов уреазы описаны также микроорганизмы Proteu mo rg an i i И др-.- fl . Однако указанные микроорганизмы применяют только в лабораторных условиях для научных целей. Наиболее близким по технической сущности к заявленному является продуцент уреазы Вас i1I us pas teu г i i который используется на производстве для получения коммерческого пре-парата фермента,достатком указанног штамма является сравнительно продол жительный цикл его развития (28 ч). Кроме того, штамм Bacillus pasteuri выращивают на среде, состоящей из дорогостоящих-компонейтов: полипептона и дрожжевого экстракта, что отражается на стоимости полученного продукта. Биосинтез уреазы, наконец происходит только в присутствии субстрата, что вызывает необходимос вносить его в процессе выргицивания, тем самым усложняя технологию процесса культивированияJ Цель изобретения - поиск нового штамма - продуцента уреазы, отвечающего всем треб9ваниям производства фермента уреазы при глубинном культивировании. В результате поиска штаммов продуцентов уреазы йй воздуха цеха мочевых пузырей Вильнюсского мясо- комбината был вьщелен высокоактивный штамм Staphylococcus saprophyticus L-1, продуцирующий уреазу. Полученный новый штамм Staphylococcus saprophytiCUS L-1 обладает следующими морфологическими, культуральными и физиологическими признаками. Шаровидные бактерии, в стандартных жидких средах, образуются пары, тетраэдры, квадратные пакетики, иногда гроздья клеток. Неподвижен. Величина клеток односуточной культуры на МП А 0,,5 мкм в диаметре. Клетки хорошо окрашиваются разбавлённьт основным фуксином и метиловым синим. Грамположительные, спор не образуют. На МПА после 24 ч инкубации в термостате при 37С образует колонии

0,5-2 мм в диаметре. После 48 ч инкубации иногда в центре колонии образует выпуклость зеленоватого оттенка. На МПА с добавлением глюкозы и мальтрзы после 48-72 ч инкубации колоний приобретают розовато-оранжевую окраску. Пигмент в среду не выделяется и ее не окрашивает. В мясопент.рннрм бульоне вначале образуется муть, которая потом осаждается на дно пробирки. Среда, становится прозрачной. На поверхности ломтиков картофеля не растет.

Оптимальная температура роста 3037С. При 45°С растет слабо. При 50°С не растет. Факультативный анаэроб. Одинаково хорошо растет в стро-о анаэробных и строго аэробных условиях. Крахмал не гидролизирует. Молоко не пе.нтонизирует. Желатину не рЭзжйжае :. На среде с минеральным азотом не растет. Нитраты восстанавливает в нитриты. Усваивает мальтозу, глюкозу, фруктозу, глицерин. Сахарозу усваивает слабо. Не ,усваивает лактозу, арабинозу, ксилозу, сорбит, рамнозу, маннит, дульцит и инозит. Устойчив к лизоциму. Содержаниё ГЦ-пар в ДНК колеблется в пределах 30,5-35 мол.%. Не патогенен.

При смешанном засеве полностью подавляет рост Proteus vulgar s, Bacillus polymy.xa, Bacillus circulans

Культура хранится в пробирках на агаризованной среде под вазелиновым ;маслом.

Сравнение уреазной активности Bacillus pasteurii и Staphy1ococcus saprophyticusL-1 проводили на препаратах уреазы грубой очистки. Активйб б Ё т5Гб и друГого штаммов оказ алась одинаковой и составляла , 25 ед./мг препарата.

Штамм StaphyiOCOCCUS saprophyticus L-1 отличается коротким циклом развития. Выращивание длится 18 ч. Среда, состоящая из дорогостоящих :.: йоМпонвнТОв - полйпентона и дрожжевого экстракта, заменена средой дешевого состава. Йовая среда содержит минеральные соли, кукурузный экстракт и ферментативный гидролизат дрожжей. Биосинтезфермента происходит в отсутствии субстрата, что упрощает технологию культивирования данного штгмма. .

П р и м е р 1. Лабораторные опыты дл:я получения уреазы из бактерии Staphyl OCOCCUS заргорЪу tJjcjjj.L-1 .

Для поддержки и кyльтивиpoiaнйя штамма Staphy1ococcus saprophyt cus L-1 глубинным способом служили две среды: 1 и 2. Среда № 1 содержит, %: пентон 1, дрожжевой экстракт 0,7. Среда № 2 содержит, следующие компо- , нёнты, г/л: NaCl 5, 2,. NaNOj 2,5, ферментативный гидролизат 20, кукурузный экстракт 22 мл/л, раствор микроэлементов 1 мл/л. Соетав раствора микроэлементов, г/л:

Fe СЦ 3, MnCl/j- лQ 4,

Na,Mo04. 1, H.jB034, Ca Clj-6H,jO 2

Жидкую среду № 1 разли;вали по 100 мл в качалочные колбь объемом . 750 мл и стерилизовали при 120с 40 мин. Жидкую среду № 2 вначале автоклавировали при 20 мин. После охлаждения, с целью удаления осадков, образующихся из кукурузного экстракта и ферментативного гидрЬлизата дрожжей, филЬтровали через бумажный фильтр. Затем разливали в качалочные колбы объемом 750 мл по 100 мл питательной србдн и стерилизовали вторично при L20°C в течени 40 мин. Агаризованную среду № 2 стерилизовали при 120с 40 мин без последующей фильтрации.

Шта1им Staphylococcus saprophy ti cu L-1 поддерживали в пробирках со скошенной агаризованной средой № 2.

Для оживления штамм Staphylococcu saprohyticus L-1 пересевали на агаризованную среду № 2 в чашках Петри и инкубировали в термостате при 37С в течение 24 ч. Оживленную культуру засевали в качалочные колбы со средами,№ 1 и № 2 соответственно. Выращивали на круговой качалке (200 об/мин) при в.течение 4ч. Таким образом подготовленную культуру использовали в качестве инокулята при глубинном культивировании. Посевной материал вносили в, качалочные колбы из расчета Ю бактериальных клеток на 1 мл питательной среды.

Штамм выращивали на круговой качалке (200 об/мин) при в течение 18 ч. После 4-18 чроста определяли уреазйую активность ; в высушенных ацетоном клетках. Ферментативную активность определяли колориметрическим методом. Количество аммиака : измеряли, используя реактив Несслера. За единицу уреазной активности принимали количество фермента, катализируняцее освобождение 1А моль аммиака за 1 мин при 30°С. Было установлено, что максимальное накопление Уреазы происходило от 9 до 12 ч роста. Культивирование в течение более длительного времени приводило к уменьшению уреазной активности.

Средние данные уреазной активности приведены в табл. 1.

Таблица

Пример 2. Полупроизводственные опыты для получения уреаэы из бактерии Staphy1ococcus saprophyticus L-1.

Поддерживание штамма и подготовку посе в ного мат ери ал а зводй ли та:КИМ же способом, как было описано в примере 1. Разница состояла лишь в том, что посевной материал в колбах на качалке выращивали в течение 12 ч

Полупроизводственные испытания проводили параллельно .на двух средах 1 и № 2. Состав сред указан в примере 1. Ферментеры емкостью 1,5 м , содержащие по 750 л соответствуквдей стерильной питательной среды, засевали посевным материалом из расчета 10 бактериальных клеток.на 1 мл среды. Выра.цивание проводили: при аэрации 8 (200 об/мин) при З7с в течение 18-20 ч. рН среды поддерживали в инте|)вале 6,8-7,2, используя 25%-ный раствор аммиачной воды или концентрированную фосфорную

кислоту. После 4-18 ч роста определяли уреазйую активность в высушенных охлажденных ацетоном бактериальных клетках. В конце ферментации из 1 л культуральной среды цектрифуги роваТ й&м (14000 об/мин) бактериальную массу. Собранные и взвешенные клетки разрушали механически, используя .стеклянные шарики диаметром 0,1-0,4 мм. В полученном грубом экстракте измеряли уреазиую

0 активность.и концентрацию белка по Лоури.

В результате полупроизводственных испытаний было установлено, что на

5 среде 1 максимальное накопление фермента происходило между 9-12 ч роста, на среде № 2 - между 9-15 ч роста. Дальнейшее культивирование не приводило к падению уреазной ак0тивности.

Средние показатели ферментативной активности приведены в табл. 2.

Таблица 2

При полупроизводственных испытаниях из 1 л культуральной жидкости получено 0,99 г сухого продукта с уреазной активностью 25 ед/мг препарата.

Стоимость уреазы, выделенной из соевых бобов, производимой Олайнским биохимическим заводом, за . 1000 единиц составляет 3,75 руб. Стоимость уреазь, производимой фирмой Колбиохем за 1000 единиц составляет. 2, 65 руб. валютой. Стоимос уреазы, производимой во ВНИИПЭ в 10 раз дешевле стоимости уреазы, призводимой зарубежными фирмами, и в 25-30 раз дешевле стоимости уреазы, получаемой из соевых бобов.

При полупроизводственных испытаниях 1 кг грубо очищенной уреазы, полученной из Staphyloco ecus saprophyticus L-1, стоит 2500 руб. с рентабельностью продукции 18,3%. Стоимость 1000 единиц данной уреазы, производимой из Bacillus -pasteurli в Бельгии составляет 1,0 руб. валютой. При производстве только во ВНИИПЭ 3,5 кг бактериальной уреазы экономия денежных затрат составила бы около 10 тыс.руб. в год.

9,7 16,6

. Формула изобретения

S taphy I OCOCCU S saprophyticus L-1 - продуцент уреазы, хранится в коллекции лаборатории чистых культур Всесоюзного научно-исследовательского института прикладной эн.зимологии под регистрационным № ИПЭ - 150.

Морфологические признаки.

Шаровидные бактерии, часто образуют пары, тетраэдры, квадратные пакеты, иногда гроздья клеток. Неподвижен. Величина клеток односуточной культуры на МПА 0,5-1,5 мкм в диаметре. Клетки хорошо окрашиваются разбавленным основным фуксином и метиловым синим. Грамположительные, спор не образуют.

Культуральныё признаки.

На мясо-пентонном агаре после 24 ч инкубации в термостате при 37°С штамм образует колонии диаметром 0,5-2 NW. Колонии серовато-белые непрозрачные, гладкие, блестящие, выпуклые с правильными краями. После 48 ч инкубации в центре колонии иногда образуется выпуклость зеленоватого оттенка. На среде с добавлением

мальтозы после 48-72 ч ;-вкя еяо-кг9Х1роста в термостате при 37°С колонии приобретают розовато-оранжевую окраску. Пигмент в среду не выделя(ется и Тё|ё йё окрШива;ёт.ГВ мясЬ-пептЬннЬм бульоне вначале образуется муть, которая затем оседает на дно пробирки. CpejdfS c:t ff 5rHfc& прозрачной по- верхнойтй ЛоМтгйШв картофеля не растет.

Физиологические признаки. Оптимальная температура роста 3037 0 при рН 6,7-7,2. При 5р°С не растет. При 45 1растёт сшаВоГ Шкультатчвный анаэроб. Одинаково хорошо растет в строго анаэробных и строго аэробных условиях. Крахмал

не гиДролизирует. Молоко ме пен тон и-: Шруёт Желатинун разж На - , среде с минеральным источником азота не растет. Нитраты восстанавливает в нитриты. Усваива ёт Мальтозу, глюкозу, фруктозу, глицерин. Саха;г и;чж |рвдаг.. V; «,:«j

розу Усваивает слабо. Не усваивает лактозу, арабинозу, ксилозу, сорбит, рамнозу, маннит, дульцит и инозит. Устойчив к лизоциму. Содержание. ГЦ-пар колеблется в пределах J 30,5-35 мол.%. Не патогенен. При .смешанном засеве полностью подавляет рост Pro геи s vulgarls. Bacillus polytnyxa, Bacillus circulans.

Культу1)а хранится в пробирках на агаризованной среде под вазелиновым маслом.

Источники информации, принятие вр внимание при экспертизе

2.The 1975-1976 Al br ch-Eu rop.e Catalog/Hand book of Organic and Btpchemicals.The Sourse J.anssen PhartnacenticaN.Y. Al d r i ch-Eu rope . Belgium, tiqa N.Y.Aldrich-Europe. Belgium, 1974 (прототип). .