ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХРОМОСОМНЫХ АНОМАЛИЙ В КЛЕТКАХ, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ ФОЛЛИКУЛЯРНОЙ ЖИДКОСТИ Российский патент 2010 года по МПК C12Q1/68 

Перекрестные ссылки на родственную заявку

В настоящей заявке испрашивается приоритет по предварительной индийской заявке на патент № 642/MUM/2004, зарегистрированной 11 июня 2004 г.

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к способу определения у индивидуума в клетках, полученных из фолликулярной жидкости хромосомных аномалий, включая гонадный мозаицизм.

Описание смежной области

Представленные в ядре эукариотических клеток хромосомы несут генетическую информацию клетки. Как правило, в каждой диплоидной клетке человека присутствует 23 пары хромосом с общим количеством 46 хромосом. Аномалии в структуре или количестве хромосом могут приводить к физиологическим и связанным с развитием аномалиям. Структурные аномалии хромосом могут представлять собой транслокации (реципрокные и робертсоновские), делеции, инверсии (парацентрические и перицентрические), кольцевые хромосомы и изохромосомы. Структурные хромосомные аномалии также включают в себя реаранжировку хромосом, возникающую в результате разрыва хромосомы и последующей сборки с различной сбалансированной или несбалансированной конфигурацией (Mueller RF and Young ID; Emery's Elements of Medical Genetics Ninth Edition, 1995, p. 37).

Количественные хромосомные аномалии представляют собой потерю или увеличение на одну или несколько хромосом (анеуплоидия), потерю полного набора хромосом (моноплоидия) или увеличение на один или несколько полных наборов хромосом (полиплоидия). Анеуплоидия может встречаться в форме нуллисомии (потери пары гомологичных хромосом, 2n-2), моносомии (потери одной хромосомы, 2n-1), трисомии (увеличении на одну хромосому, 2n+1) или тетрасомии (увеличении на пару гомологов, 2n+2). Анеуплоидия может быть результатом отсутствия расхождения, когда парные хромосомы не разделяются друг с другом во время деления клетки. Если нерасхождение происходит во время гаметогенеза, половина (нерасхождение при мейозе II) или все (нерасхождение при мейозе I) образующиеся гаметы будут являться анеуплоидными. Нерасхождение также может происходить при митозе, образуя две клеточные линии с различным количеством хромосом.

Следовательно, отдельный индивидуум может иметь две или несколько клеточных популяций с различными кариотипами или генетическим составом, который можно назвать мозаицизмом, хромосомным мозаицизмом или гонадным мозаицизмом. Здесь мозаичным является организм, состоящий из клеток с двумя или несколькими различными генотипами. Различные части тела индивидуума могут иметь клетки с различным общим количеством хромосом или содержанием хромосом, если явление нерасхождения происходит на этапе раннего развитии индивидуума. Мозаицизм также может являться следствием событий генных мутаций. Аналогичным образом, если мутация происходит на этапе раннего эмбрионального развития, некоторые, но не все, клетки индивидуума могут иметь мутацию.

Хромосомный мозаицизм может возникать в любом количестве тканей, в зависимости от временного интервала явления нерасхождения и типа клеток, в которых оно происходит. Следовательно, трудно предсказать тип или тяжесть симптомов у индивидуума с хромосомным мозаицизмом. Если мозаицизм ограничен гонадами, он известен как гонадный мозаицизм (Goldstein et al., J. Pediatrics, 1977, 90:604). Гонадный мозаицизм может возникать в результате происходящей в гонадах развивающегося эмбриона мутации.

Также известно, что хромосомные аномалии влияют на развитие и функционирование яичников в зависимости от доли аномальных клеток в яичниках (Cunniff et al., Hum Genet., 1991, 86: 553-556). Например, показано, что женщины с потерей копии X-хромосомы (45,X) или обладающие дополнительной копией X-хромосомы (46,XX) имеют повышенный риск преждевременного угасания функции яичников (Cunniff et al., Hum. Genet., 1991, 86: 553-556; Zinn et al., Trends Genet. 1993, 9: 90-93). Исследования показали, что до 99% оплодотворений с моносомией 45,X приводят к преждевременному прерыванию беременности (Hook and Warburton, Hum. Genet., 1983, 64: 24-27; Hassold et al., Am. J. Hum. Genet., 1988, 42: 534-541). Мозаичная X-хромосомная моносомия (45,X/46,XX) ассоциирована с атрезией фолликулов, гонадной дисгенезией, а также отчасти является причиной прерывания беременности на ранних сроках (Zinn et al., Trends Genet., 1993, 9: 90-93; Shreck et al., Emery and Rimoni's Principles of Practice of Medical Genetics, Vol. 1, Churchill Livingstone, 2002, 982-97).

Женщины с гонадным мозаицизмом могут иметь ооциты с хромосомными аномалиями, которые могут являться причиной бесплодия или хромосомных аномалий у развивающегося эмбриона. Данные возможные эффекты служат основанием для консультации или лечебных действий, как, например, донорство ооцитов/эмбрионов, предимплантационная генетическая диагностика или пренатальная диагностика. Следовательно, усовершенствование определения или диагностики гонадного мозаицизма улучшат обслуживание больных.

Существующие способы идентификации и диагностики хромосомных аномалий ограничены гонадным мозаицизмом, а при обнаружении слабо выраженного мозаицизма доступные способы являются инвазивными или неэффективными. Например, подозрение на хромосомную аномалию у индивидуума можно подтвердить или исключить посредством анализа образца крови. Однако данное исследование необязательно определяет мозаицизм, ограниченный одним органом или тканью или даже ограниченной части клеток в данной ткани. Например, анализ образца крови может не определить гонадный мозаицизм. Кроме того, люди с гонадным мозаицизмом могут оставаться в значительной степени бессимптомными в течение жизни, что дополнительно снижает возможности диагностики.

Для диагностики ограниченного одной тканью мозаицизма должны быть проанализированы клетки данной конкретной ткани. Обнаружение мозаицизма в данной ткани зависит от количества пораженных клеток и количества проанализированных клеток. Кариотипирование представляет собой часто применяемый генетический тест для хромосомного анализа, при котором исследуют полный хромосомный состав клетки индивидуума посредством визуализации хромосом и подсчета хромосом. Подверженные кариотипированию клетки предпочтительно культивируют и останавливают митоз на стадии метафазы клеточного деления, так как хромосомы лучше всего визуализируются на стадии метафазы клеточного деления. Это делает кариотипирование длительной и трудоемкой процедурой и не позволяет анализировать очень большое количество клеток. Следовательно, при помощи кариотипирования можно не определить слабо выраженный мозаицизм, при котором поражена лишь небольшая часть клеток в органе или ткани.

В настоящее время для определения гонадного мозаицизма гонадную ткань выделяют посредством биопсии гонад. Биопсия гонад не является обычной процедурой, ее выполняют посредством тонкоигольной пункционно-аспирационной биопсии или клинообразной биопсии с применением лапаротомии или лапароскопии. После этого полученный образец ткани кариотипируют, что может не выявить слабо выраженный гонадный мозаицизм. Следовательно, существующие исследования для определения хромосомных аномалий имеют ограниченные возможности в определении гонадного мозаицизма, конкретно слабовыраженного гонадного мозаицизма.

Следовательно, желательно предоставить миниинвазивный способ для определения хромосомных аномалий, включая гонадный мозаицизм, предпочтительно определяющий даже слабовыраженный гонадный мозаицизм.

КРАТКАЯ СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способам определения по меньшей мере одной хромосомной аномалии в клетках, полученных из фолликулярной жидкости, включающим в себя

a) получение клеток из фолликулярной жидкости;

b) генетический анализ клеток;

где часть клеток имеет по меньшей мере одну хромосомную аномалию. В конкретных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к способам идентификации аномалий репродуктивной системы, где идентификация по меньшей мере одной хромосомной аномалии в части полученных из фолликулярной жидкости клеток является характерной аномалией репродуктивной системы. Другие варианты осуществления настоящего изобретения относятся к способам идентификации гонадного мозаицизма посредством идентификации по меньшей мере одной хромосомной аномалии в клетках, полученных из фолликулярной жидкости с применением тех же способов. В конкретных вариантах осуществления гонадный мозаицизм представляет собой слабовыраженный гонадный мозаицизм, где предпочтительно менее 10% клеток, более предпочтительно, менее чем 5%-10% клеток в ткани или органе имеют хромосомную аномалию. В предпочтительных вариантах осуществления фолликулярную жидкость получают от животного, более предпочтительно, от человека. Полученные из фолликулярной жидкости клетки могут происходить из репродуктивных тканей и в конкретных вариантах осуществления представляют собой соматические клетки. В предпочтительных вариантах осуществления, фолликулярную жидкость получают во время процедуры оплодотворения или процедуры внутрицитоплазматической инъекции сперматозоида in vitro. В других вариантах осуществления, фолликулярную жидкость не получают в связи с любой из данных процедур. Предпочтительно фолликулярную жидкость получают из одного или обоих яичников субъекта.

Настоящее описание изобретения также относится к способам анализа повышенного риска бесплодия у животных, включающим в себя

a) получение клеток из фолликулярной жидкости животного; и

b) генетический анализ клеток,

где определение по меньшей мере одной хромосомной аномалии в части клеток является характерным указанием на повышенный риск бесплодия. В предпочтительных вариантах осуществления животным является человек. Полученные из фолликулярной жидкости клетки могут происходить из репродуктивных тканей и в конкретных вариантах осуществления представляют собой соматические клетки. В предпочтительных вариантах осуществления фолликулярную жидкость получают во время процедуры оплодотворения или процедуры внутрицитоплазматической инъекции сперматозоида in vitro. В других вариантах осуществления фолликулярную жидкость получают способом, не связанным с любой из указанных процедур. Предпочтительно фолликулярную жидкость получают из одного или обоих яичников животного. В предпочтительных вариантах осуществления, когда идентифицируют, что животное имеет повышенный риск бесплодия, и подвергают животное процедуре оплодотворения in vitro, эмбрион, полученный из выделенных у животного ооцитов, можно подвергать предимплантационному генетическому анализу. В более предпочтительных вариантах осуществления, когда генетический анализ показывает, что эмбрион не имеет хромосомной аномалии, эмбрион предпочтительно пересаживают в матку животного.

Любой из описанных здесь способов можно применять в качестве хорошо известных специалисту в данной области способов генетического анализа для определения хромосомных аномалий в клетках, полученных из фолликулярной жидкости. В предпочтительных вариантах осуществления, генетический анализ представляет собой флуоресцентную гибридизацию in situ, кариотипирование или секвенирование ДНК. В других предпочтительных вариантах осуществления генетический анализ представляет собой сравнительную геномную гибридизацию (CGH) (например, выполненную с метафазными хромосомами или CGH-матрицей), многоцветный бэндинг (MCB), количественную FISH (Q-FISH), полимеразную цепную реакцию (PCR), технологию GBA (минитипирование), мультиплексное секвенирование, SNaPshot, MassEXTEND, MassArray, лигирование на миниматрицах, минисеквенирование на микроматрицах, маркерные миниматрицы, удлинение праймеров на матрицах (APEX), удлинение праймеров на микроматрицах, GOOD-анализ, кодированные микросферы, анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (RFLP), аллель-специфический анализ олигонуклеотидов (ASO), специфичную к метилированию ПЦР (MSPCR), способ пиросеквенирования, анализ acycloprime, обратный дот-блот, микроматрицы GeneChip, динамическую аллель-специфическую гибридизацию (DASH), пептидные зонды нуклеиновых кислот (PNA) и запирающие зонды нуклеиновых кислот (LNA), TaqMan, Molecular Beacons, интеркалирующее окрашивание, праймеры FRET, AlphaScreen, SNPstream, Invader assay, управляемое матрицей включение (TDI), флуоресцентную поляризацию, анализ олигонуклеотидного лигирования и выделение кодированных последовательностей, лигазную цепную реакцию, запирающие зонды, амплификацию по типу катящегося кольца или колориметрический анализ олигонуклеотидного лигирования (OLA).

В выделенных из фолликулярной жидкости клетках можно идентифицировать любое количество хромосомных аномалий, которые могут являться характерными для гонадного мозаицизма или слабо выраженного гонадного мозаицизма. В конкретных вариантах осуществления, хромосомная аномалия, идентифицированная во всех клетках или в части клеток из фолликулярной жидкости, представляет собой анеуплоидию, транслокацию, делецию, микроделецию, инверсию или удвоение. Идентифицированная анеуплоидия может представлять собой полную или частичную трисомию, например, трисомию 13, трисомию 16, трисомию 18, трисомию 21, трисомию 22, XXY, XYY или XXX; полную или частичную моносомию, например, моносомию X, моносомию 13, моносомию 16, моносомию 18, моносомию 21 или моносомию 22; или полную или частичную нуллисомию, например, для хромосом 13, 16, 18, 21, 22, X или Y.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Сопровождающие фигуры являются частью настоящего изобретения и включены для дополнительной демонстрации конкретных аспектов настоящего изобретения. Описание изобретения можно лучше понять со ссылкой на одну или несколько данных фигур в сочетании с подробным описанием представленных здесь конкретных вариантов осуществления.

Фигура 1. Микрофотография анализа FISH нормальной диплоидной человеческой женской клетки, полученной из фолликулярной жидкости. Применяют специфичные для хромосом X (зеленый), Y (оранжевый) и 18 (голубой) зонды, а докрашивают клетки темно-синим контрастирующим красителем DAPI. Видны два голубых сигнала для хромосомы 18 и два зеленых сигнала для хромосомы X, обозначающие нормальную диплоидную женскую клетку.

Фигура 2. Микрофотография анализа FISH полученной из фолликулярной жидкости человеческой женской клетки с моносомией 18. Применяют специфичные для хромосом X (зеленый), Y (оранжевый) и 18 (голубой) зонды, а докрашивают клетки темно-синим контрастирующим красителем DAPI. Видны один голубой сигнал для хромосомы 18 и два зеленых сигнала для хромосомы X, обозначая в женской клетке моносомию 18.

Фигура 3. Микрофотография анализа FISH полученной из фолликулярной жидкости человеческой женской клетки с моносомией X. Применяют специфичные для хромосом X (зеленый), Y (оранжевый) и 18 (голубой) зонды, а докрашивают клетки темно-синим контрастирующим красителем DAPI. Видны два голубых сигнала для хромосомы 18 и один зеленый сигнал для хромосомы X, обозначая в женской клетке моносомию X.

Фигура 4. Микрофотография анализа FISH полученной из фолликулярной жидкости человеческой женской клетки с трисомией 18. Применяют специфичные для хромосом X (зеленый), Y (оранжевый) и 18 (голубой) зонды, а докрашивают клетки темно-синим контрастирующим красителем DAPI. Видны три голубых сигнала для хромосомы 18 и два зеленых сигнала для хромосомы X, обозначая в женской клетке трисомию 18.

Фигура 5. Микрофотография анализа FISH полученной из фолликулярной жидкости человеческой женской клетки с трисомией X. Применяют специфичные для хромосом X (зеленый), Y (оранжевый) и 18 (голубой) зонды, а докрашивают клетки темно-синим контрастирующим красителем DAPI. Видны два голубых сигнала для хромосомы 18 и три зеленых сигнала для хромосомы X, обозначая в женской клетке трисомию X.

Фигура 6. Микрофотография анализа FISH нормальной полученной из фолликулярной жидкости человеческой женской клетки. Применяют специфичные для хромосом 13 (зеленый) и 21 (оранжевый) зонды, а докрашивают клетки темно-синим контрастирующим красителем DAPI. Видны два зеленых сигнала для хромосомы 13 и два оранжевых сигнала для хромосомы 21, обозначая диплоидную клетку с нормальным набором хромосом 13 и 21.

Фигура 7. Микрофотография анализа FISH полученной из фолликулярной жидкости человеческой женской клетки с трисомией 13. Применяют специфичные для хромосом 13 (зеленый) и 21 (оранжевый) зонды, а докрашивают клетки темно-синим контрастирующим красителем DAPI. Видны три зеленых сигнала для хромосомы 13 и два оранжевых сигнала для хромосомы 21, обозначая трисомию 13 женской клетки.

Фигура 8. Микрофотография анализа FISH полученной из фолликулярной жидкости человеческой женской клетки с трисомией 21. Применяют специфичные для хромосом 13 (зеленый) и 21 (оранжевый) зонды, а докрашивают клетки темно-синим контрастирующим красителем DAPI. Видны два зеленых сигнала для хромосомы 13 и три оранжевых сигнала для хромосомы 21, обозначая трисомию 21 женской клетки.

Фигура 9. Кариотипический анализ полученной из фолликулярной жидкости человеческой женской клетки с моносомией X. В данном кариотипе видна одна хромосома X, обозначая моносомию X данной клетки. При анализе дополнительных клеток из того же образца фолликулярной жидкости, 3 из 20 проанализированных клеток продемонстрировали аналогичный профиль, означающий гонадный мозаицизм при моносомии X.

Фигура 10. Кариотипический анализ полученной из фолликулярной жидкости человеческой женской клетки с трисомией 21. В данном кариотипе показаны три 21 хромосомы, обозначая трисомию 21 данной клетки.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем описании изобретения описаны способы идентификации хромосомных аномалий у субъекта посредством получения клеток из фолликулярной жидкости и анализа данных клеток, например, генетического анализа хромосомных аномалий. Предпочтительно посредством описанного способа выявляют субъектов с гонадным мозаицизмом или слабовыраженным гонадным мозаицизмом. Слабовыраженным гонадный мозаицизм является, если мозаичность субъекта составляет предпочтительно менее 10% клеток, а более предпочтительно, менее чем от 5% до 1% клеток в ткани или органе. В одном варианте осуществления проанализированные посредством описанных здесь способов клетки происходят из репродуктивной ткани субъекта, от которого выделяют образец фолликулярной жидкости. В еще одном варианте осуществления клетки, проанализированные посредством описанных здесь способов, являются соматическими клетками субъекта, от которого выделяют образец фолликулярной жидкости, и исключают любые присутствующие в фолликулярной жидкости половые клетки, как, например, ооциты. Хромосомные аномалии можно идентифицировать с применением любого одного из ряда известных специалисту в данной области способов генетического анализа. Здесь выражение "генетический анализ" относится к любому анализу на основании хромосом, ДНК или РНК, с помощью которого можно определить в клетках индивидуума, или предпочтительно в полученных из фолликулярной жидкости клетках аномалии хромосом, ДНК или экспрессии генов.

Полученные из фолликулярной жидкости клетки также можно подвергать анализу ДНК для идентификации повреждений отдельных генов вместо аномалий хромосомного уровня. Идентификация повреждений отдельных генов, нарушений импринтинга или предрасположенности к злокачественной опухоли можно выполнять с применением любого способа, приемлемого для определения по меньшей мере одной замены нуклеиновой кислоты, например, однонуклеотидного полиморфизма (SNP). Тогда как перечисленные выше способы генетического анализа являются предпочтительными, другие способы, способные использовать клетки из фолликулярной жидкости для идентификации хромосомных аномалий, включающих в себя гонадный мозаицизм или слабовыраженный мозаицизм, находятся в рамках объема настоящего изобретения и известны специалисту в данной области.

Хромосомные аномалии являются общей причиной бесплодия и врожденных пороков развития и включают в себя структурные и количественные аномалии. Организм может иметь мозаицизм при хромосомных аномалиях, обнаруженных только в конкретных клеточных популяциях или линиях в организме, тогда как другие клетки являются нормальными. Наряду с тем, что целостный организм может являться мозаичным, также мозаицизм может быть ограничен конкретными органами или тканями, как, например, гонадный мозаицизм. Гонадный мозаицизм может оставаться необнаруженным из-за преимущественного отсутствия симптомов у пораженных индивидуумов. Однако, если гонадный мозаицизм представляет собой предполагаемую причину бесплодия, существующие способы для идентификации или определения гонадного мозаицизма требуют хирургического вмешательства для забора образца ткани для анализа. Таким образом, существующие аналитические способы являются продолжительными и ограничивают количество клеток, которые можно проанализировать, ограничивая тем самым определение слабо выраженного гонадного мозаицизма.

В настоящем описании изобретения анализируют полученные из фолликулярной жидкости клетки посредством генетического анализа для определения хромосомных аномалий и для диагностики гонадного мозаицизма, например, слабо выраженного гонадного мозаицизма. Например, фолликулярную жидкость выделяют у подверженного сбору ооцитов для оплодотворения in vitro пациента. При данной процедуре содержащую ооциты фолликулярную жидкость отсасывают из яичников пациента с применением, например, трансвагинального ультразвука. В фолликулярной жидкости идентифицируют и удаляют ооциты с окружающими скоплениями клеток, а жидкость затем, как правило, сбрасывают. Следовательно, для уже подверженных извлечению ооцитов пациенток, настоящее описание изобретения не требует дополнительных хирургических вмешательств для обеспечения возможности детекции гонадного мозаицизма.

В предпочтительном варианте осуществления, фолликулярную жидкость собирают при заборе ооцитов для оплодотворения in vitro. Способы фолликулярной аспирации хорошо известны специалисту в области гинекологии и акушерства. Как правило, ооциты извлекают посредством фолликулярной аспирации через 36 часов после индукции овуляции, после чего ооциты с окружающими их клетками удаляют из оставшейся фолликулярной жидкости. Предпочтительным способом получения клеток из оставшейся фолликулярной жидкости является центрифугирование, но можно применять любой известный способ клеточного выделения. Предпочтительно, фолликулярную жидкость центрифугируют в течение любого интервала времени приблизительно от 1 минуты приблизительно до 30 минут, приблизительно от 1000 об/мин до 3000 об/мин и при любой температуре приблизительно от 20°C приблизительно до 40°C. В альтернативном варианте осуществления, фолликулярную жидкость не собирают при извлечении ооцитов для оплодотворения in vitro, например, посредством фолликулярной аспирации или лапароскопии.

После того, как клетки выделены из фолликулярной жидкости, их можно подвергнуть генетическому анализу для детекции хромосомных аномалий. По предпочтительному варианту осуществления, клетки подвергают анализу FISH. Например, клетки подвергают обработке гипотоническим раствором в течение приблизительно от 5 до 45 минут при температуре приблизительно от 20°C приблизительно до 40°C, а затем фиксируют на приемлемой поверхности приемлемым фиксатором, как, например, фиксатор Карнуа, приблизительно от 1°C приблизительно до 25°C. Можно проводить гибридизацию соответствующих зондов с однократно фиксированными клетками образца с применением известных специалисту в данной области способов. Предпочтительно, меченые зонды ДНК для анализируемых хромосом предварительно смешивают с блокирующей ДНК и гибридизационным буфером, а затем вносят к фиксированным клеткам из образца фолликулярной жидкости. Затем зонд и образец подвергают денатурации в течение 5 минут приблизительно при 73°C и инкубируют в темной гибридизационной камере приблизительно при 37°C в течение приблизительно от 16 до 18 часов для обеспечения гибридизации. После гибридизации стекла промывают приблизительно в течение 2 минут приблизительно при 73°C в растворе из 1 мл 20×SSC, 49 мл RO H₂O и 150 мкл Igepal или другого аналогичного сурфактанта, а затем в течение приблизительно 1 минуты приблизительно при комнатной температуре в растворе из 5 мл 20×SSC, 45 мл RO H₂O и 50 мкл Igepal или другого аналогичного сурфактанта. После отмывки стеклам позволяют высохнуть и докрашивают с применением, предпочтительно, DAPI. После этого клетки можно анализировать с применением флуоресцентного микроскопа. Приблизительно от 20 до 1000 клеток из данного образца фолликулярной жидкости можно анализировать с применением данных предпочтительных способов. Можно выявлять поражающий лишь небольшую часть клеток в яичниках слабо выраженный гонадный мозаицизм, так как подход FISH позволяет анализировать большое количество клеток из отдельного образца фолликулярной жидкости.

В предпочтительных вариантах осуществления клетки, выделенные из фолликулярной жидкости, анализируют на хромосомные аномалии, например, анеуплоидию, как, например, моносомию или трисомию, любой хромосомы можно определять с применением хорошо известных специалисту в данной области способов генетического анализа. В предпочтительных вариантах осуществления клетки, выделенные из фолликулярной жидкости, анализируют для определения анеуплоидии для хромосом 13, 15, 16, 18, 21, 22, X или Y. Хромосомные аномалии можно определять с применением анализа FISH со специфичными для данных хромосом зондами. Сходным образом, обнаружение клеток с моносомией для хромосом 13, 15, 16, 18, 21, 22, X или Y можно выполнять с применением специфичных для данных хромосом зондов. Известно, что моносомия хромосом 15, 16, 21 и 22 вовлечена в прерывание беременности (Munne, S. et al., 2004, Reprod. Biomed. Online, 8: 91-90).

По другим предпочтительным вариантам осуществления, кариотипирование можно применять для анализа хромосомных аномалий в клетках. В предпочтительном способе кариотипирования клетки, полученные из фолликулярной жидкости, сначала культивируют с применением приемлемой культуральной среды. Примеры коммерчески доступных культуральных сред включают в себя Amniomax, среду F10 или Rose Park Memorial Institute medium. Клетки предпочтительно культивируют с применением известных специалисту в данной области стандартных способов при подходящей температуре (например, 37°C) до получения сплошного роста. Затем культивированные клетки предпочтительно собирают с применением обычных способов и фиксируют на соответствующей поверхности приемлемым фиксатором, как, например, фиксатор Карнуа при температуре приблизительно от 1°C приблизительно до 25°C. Бэндинг микропрепаратов выполняют с применением известных обычному специалисту в данной области способов и микропрепараты анализируют на метафазные хромосомы под контролем соответствующего микроскопа. Можно проанализировать приблизительно от 1 до 40 клеток из данного образца фолликулярной жидкости, применяя данные предпочтительные способы.

В других предпочтительных вариантах осуществления применяют сравнительную геномную гибридизацию (CGH) для идентификации хромосомных аномалий, включающих в себя едва различимые хромосомные аномалии. CGH основан на количественной двухцветной FISH, с применением синтезированных из контрольного образца зондов, например, выделенных из фолликулярной жидкости клеток и клеток нормального контрольного референсного образца. Предпочтительно, одновременно проводят гибридизацию зондов с метафазными хромосомами из нормального референсного образца. Сравнение интенсивности сигнала от гибридизованных зондов может показать области патологии в клетках фолликулярной жидкости.

В других вариантах осуществления, сконструированные выше зонды можно наносить на матрицу ДНК в называемом CGH-матрица способе. Показали, что CGH-матрица подтверждает аномалии, как, например, мозаицизм трисомии 20 (Schaeffer et al., Am. J. Hum. Genet., 2004; 74: 1168-1174), несбалансированную транслокацию (Klein et al., Clin. Genet., 2004; 65: 477-82), несбалансированные субтеломерные реаранжировки (Ness et al., Am. J. Med. Genet, 2002, 113: 125-136) и несбалансированные инверсии или хромосомные реаранжировки (Daniely et al., Cytogenet. Cell. Genet., 1999, 86: 51-5). Способы CGH-матриц и получения специфичных для хромосом библиотек ДНК описаны и известны в данной области (Hu, et al., Mol. Hum. Reprod., 2004, 10: 283-289; Bolzer et al., Cytogenet. Cell. Genet., 1999, 84: 233-240). Применение основанного на матрицах CGH для определения генетического мозаицизма в клеточной популяции также показано Mansoor Mohammed в опубликованной заявке на патент США № 20030124584, которая включена сюда в качестве ссылки в полном объеме.

Специалисту в данной области хорошо известны другие способы для анализа хромосомных и генетических аномалий, в качестве не ограничивающих примеров включающие в себя многоцветный бэндинг (MCB), количественную FISH (Q-FISH), полимеразную цепную реакцию (PCR), технологию GBA (минитипирование), мультиплексное секвенирование, SNaPshot, MassEXTEND, MassArray, лигирование на мини-матрицах, мини-секвенирование на микроматрицах, маркерные миниматрицы, удлинение праймеров на матрицах (APEX), удлинение праймеров на микроматрицах, GOOD-анализ, кодированные микросферы, анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (RFLP), аллель-специфический анализ олигонуклеотидов (ASO), специфичную к метилированию ПЦР (MSPCR), способ пиросеквенирования, анализ acycloprime, обратный дот-блот, микроматрицы GeneChip, динамическую аллель-специфическую гибридизацию (DASH), пептидные зонды нуклеиновых кислот (PNA) и запирающие зонды нуклеиновых кислот (LNA), TaqMan, Molecular Beacons, интеркалирующее окрашивание, праймеры FRET, AlphaScreen, SNPstream, Invader assay, управляемое матрицей включение (TDI), флуоресцентную поляризацию, анализ олигонуклеотидного лигирования и выделение кодированных последовательностей, лигазную цепную реакцию, запирающие зонды, амплификацию по типу катящегося кольца и колориметрический анализ олигонуклеотидного лигирования (OLA).

В программах оплодотворения in vitro предимплантационная генетическая диагностика ооцитов и эмбрионов является способом выбора для отделения аномального эмбриона перед пересадкой эмбриона. Таким образом, в альтернативных вариантах осуществления, у субъектов с идентифицированным гонадным мозаицизмом предимплантационную генетическую диагностику и диагностику хромосомных аномалий в ооцитах и эмбрионах можно выполнять для повышения вероятности отбора и имплантации выживающего в продолжение беременности эмбриона.

Наконец, определение хромосомной аномалии, включающей в себя гонадный мозаицизм, применимо у других животных, предпочтительно млекопитающих, и конкретно трансгенных животных. Генетический мозаицизм часто возникает у полученных посредством микроинъекции в пронуклеустрансгенных животных. Успешный способ скрининга родительских животных на гонадный мозаицизм до спаривания может сократить стоимость размножения трансгенных линий и посредством скрининга родительских животных на гонадный мозаицизм до спаривания повысить эффективность получения трансгенных животных для получения трансгенных млекопитающих.

В свете настоящего описания изобретения, описанные и заявленные здесь способы можно разрабатывать и осуществлять без проведения лишней экспериментальной работы. Хотя способы настоящего описания изобретения описаны в границах предпочтительных вариантов осуществления, специалисту в данной области очевидно, что в способы и в стадии или в последовательность стадий описанных здесь способов можно вносить вариации без отклонения от концепции, объема и сущности изобретения. Более конкретно, очевидно, что вместо описанных здесь средств можно использовать определенные химически или физиологически близкие средства, если достигают аналогичных или сходных результатов. Считают, что все очевидные специалисту в данной области подобные аналогичные замены и модификации находятся в пределах сущности, объема и концепции изобретения, как обозначено в прилагаемой формуле изобретения.

Следующие далее примеры включены сюда для иллюстрации предпочтительных вариантов осуществления изобретения. Специалисту в данной области следует понимать, что в примерах описаны способы, сопровождающие представленные способы, открытые авторами изобретения для правильной работы при применении изобретения, и, таким образом, могут рассматриваться для составления предпочтительных способов его применения. Однако в свете настоящего изобретения специалист в данной области должен понимать, что в определенных вариантах осуществления можно сделать много описанных изменений, и, тем не менее, получить подобный или аналогичный результат без отклонения от объема и сущности изобретения.

Пример 1

1) Забор и обработка клеток из образцов фолликулярной жидкости

Образцы оставшейся фолликулярной жидкости подверженных оплодотворению in vitro пациенток собирают в центрифужные пробирки в аликвотах приблизительно от 5 до 10 мл. Затем образцы центрифугируют приблизительно при 1000 об/мин в течение 10 минут. После этого большую часть супернатанта удаляют, оставляя над осадком приблизительно 0,5 мл жидкости. К осадку добавляют приблизительно 8 мл предварительно нагретого до 37°C 75 мМ KCl, перемешивают, а затем инкубируют при 37°C в течение 20 минут. После инкубации пробирки центрифугируют приблизительно при 1000 об/мин в течение 10 минут. После этого супернатант сбрасывают, оставляя над осадком приблизительно 0,5 мл жидкости. При постоянном перемешивании добавляют приблизительно 8 мл холодного фиксатора Карнуа. Пробирки инкубируют при 2-8°C в течение по меньшей мере 30 минут, а затем центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 минут. После центрифугирования супернатант сбрасывают, оставляя над осадком приблизительно 0,5 мл жидкости. Стадию отмывки с фиксатором повторяют 2 раза.

2) Подготовка микропрепарата и анализ FISH

На задней стороне чистых стекол алмазным маркером отмечают один или два небольших квадрата. В каждый квадрат добавляют 10 мкл фиксированных клеток и оставляют стекла сохнуть на воздухе. Стекла последовательно обезвоживают в спирте: 70% одну минуту; 85% одну минуту; 100% две минуты. После этого покровные стекла обрезают до размера области образца и наносят на покровное стекло 1-2 мкл зонда. Стекло переворачивают на покровное стекло и заклеивают каучуковым клеем. Затем стекло подвергают денатурации, помещая его на подогревательный столик при 73°C в течение пяти минут. После этого стекла немедленно помещают в гибридизационную камеру и инкубируют при 37°C в течение времени от 16 до 18 часов. После инкубации покровные стекла снимают в 5 мл 20×SSC и 45 мл RO H₂O. Затем стекло отмывают в 1 мл 20×SSC и 49 мл RO H₂O и 150 мкл Igepal (Sigma) в течение двух минут, с последующей еще одной отмывкой в растворе 5 мл 20×SSC, 45 мл H₂O и 50 мкл Igepal в течение одной минуты. Стекло сушат на воздухе и заключают в 10 мкл заключающей среды (200 нг/мл DAPI в Vectashield, Vector Lab) и накладывают покровное стекло. Стекло заклеивают каучуковым клеем и изучают под контролем флуоресцентного микроскопа.

3) Зонды для анализа FISH

Для определения гонадного мозаицизма для хромосом 18, X и Y применяют смесь зондов, содержащую CEP 18 Spectrum Aqua/X Spectrum Green/Y Spectrum Orange (AneuVysion EC DNA probe kit, Vysis). Также можно раздельно применять отдельные зонды для 18, X и Y хромосом, несмотря на то, что авторы применяли в виде смеси.

Таблица 1 Серийн.№ № образца Один яичник Состояние оплодотворе-ния № проанализиро-ванных клеток Норма для X&18 (%) Х хр. аном. % хр. 18 аном. % 1 FF-001 100 100 0 0 - 2 FF-002 100 96 2 2 - 3 FF-003 200 90 10 0 - 4 FF-004 100 100 0 0 - 5 FF-005 100 100 0 0 - 6 FF-006 100 100 0 0 + 7 FF-007 100 100 0 0 + 8 FF-008 100 100 0 0 - 9 FF-009 100 95 2 3 - 10 FF-010 100 95 5 0 - 11 FF-011 100 92 3 5 - 12 FF-012 100 100 0 0 - 13 FF-013 100 100 0 0 +/потеря (прерывание беременности) 14 FF-014 100 96 2 2 + 15 FF-015 100 100 0 0 - 16 FF-016 100 90 4 6 - 17 FF-017 100 100 0 0 - 18 FF-018 100 100 0 0 - 19 FF-019 100 97 1 2 - 20 FF-020 100 100 0 0 + 21 FF-021 100 100 0 0 - 22 FF-022 100 98 1 1 - 23 FF-023 100 100 0 0 - 24 FF-024 100 100 0 0 - 25 FF-025 100 100 0 0 +/потеря (прерывание беременности) 26 FF-026 200 96 3 0 - 27 FF-027 200 99 1 0 + 28 FF-028 200 94 5 1 + 29 FF-029 200 97 0 3 - 30 FF-030 200 95 3 2 - 31 FF-031 200 97 1 2 - 32 FF-032 100 96 3 1 - 33 FF-033 100 96 1 3 - 34 FF-034 100 100 0 0 + 35 FF-035 100 98 2 0 -

36 FF-036 100 100 0 0 - 37 FF-037 30 28 2 0 - 38 FF-038 100 100 0 0 + 39 FF-039 100 98 1 1 - 40 FF-040 100 100 0 0 - 41 FF-041 100 96 2 2 - 42 FF-042 100 100 0 0 + 43 FF-043 100 100 0 0 - 44 FF-044 100 100 0 0 +/потеря (прерывание беременности) 45 FF-045 100 98 2 0 + 46 FF-046 100 100 0 0 + 47 FF-047 200 92 6 2 - 48 FF-048 100 97 1 2 + 49 FF-049 200 96 3 1 - 50 FF-050 200 95 3 2 - 51 FF-051 200 99 1 0 - 52 FF-052 100 96 1 3 + 53 FF-053 200 97 2 1 - 54 FF-054 100 100 0 0 - 55 FF-055 100 100 0 0   56 FF-056 200 96 3 1 + 57 FF-057 200 99 1 0 - 58 FF-058 200 94 5 1 - 59 FF-059 200 97 0 3 + 60 FF-060 200 95 3 2 + 61 FF-061 200 97 1 2 - 62 FF-062 200 96 3 1 + 63 FF-063 200 99 1 0 + 64 FF-064 200 94 1 5 - 65 FF-065 200 97 0 3 - 66 FF-066 100 89 10 1 - 67 FF-067 200 95 3 2 - 68 FF-068 200 97 1 2 - 69 FF-069 100 100 0 0 +/потеря (прерывание беременности) 70 FF-070 100 95 3 2 - 71 FF-071 100 100 0 0 - 72 FF-072 100 99 1 0 - 73 FF-073 100 92 5 2 - 74 FF-074 200 93 5 2 -

75 FF-075 200 95 5 0 - 76 FF-076 200 95 5 0 - 77 FF-077 200 90 8 2 - 78 FF-078 200 93 5 2 - 79 FF-079 200 93 6 1 - 80 FF-080 100 89 11 0 - 81 FF-081 100 97 3 0 + 82 FF-082 100 98 2 0 + 83 FF-083 100 95 5 0 - 84 FF-084 100 100 0 0 - 85 FF-085 100 93 5 2 +/потеря (прерывание беременности) 86 FF-086 100 100 0 0 - 87 FF-087 100 100 0 0 + 88 FF-088 100 99 1 0 - 89 FF-089 100 98 2 0 - 90 FF-090 100 100 0 0 - 91 FF-091 100 100 0 0 - 92 FF-092 100 97 3 0 - 93 FF-093 100 98 1 1 + 94 FF-094 100 100 0 0 + 95 FF-095 100 92 6 2 +/потеря (прерывание беременности) 96 FF-096 100 100 0 0 + 97 FF-097 100 93 5 2 +/потеря (прерывание беременности) 98 FF-098 100 99 1 0 - 99 FF-099 100 100 0 0 - 100 FF-100 Отсутствие клетки       - 101 FF-101 100 99 1 0 + 102 FF-102 Отсутствие клетки       - 103 FF-103 100 97 3 0 + 104 FF-104 100 100 0 0 - 105 FF-105 Отсутствие клетки       - 106 FF-106 100 100 0 0 + 107 FF-107 100 100 0 0 - 108 FF-108 100 100 0 0 + 109 FF-109 100 92 6 2 - 110 FF-110 100 100 0 0 + 111 FF-111 100 90 9 1 - 112 FF-112 100 100 0 0 -

113 FF-113 100 100 0 0 - 114 FF-114 Отсутствие клетки       + 115 FF-115 300 100 0 0 + 116 FF-116 Отсутствие клеток       - 117 FF-117 200 94 1 5 - 118 FF-118 200 97 1 2 - 119 FF-119 Отсутствие клеток       - 120 FF-120 100 96 2 2 + 121 FF-121 200 98 1 1 - 122 FF-122 100 100 0 0 - 123 FF-123 100 95 3 2 - 124 FF-124 200 93 3 4 - 125 FF-125 200 96 1 3 - 126 FF-126 100 92 3 5 - 127 FF-127 100 100 0 0 - 128 FF-128 200 87 12 1 - 129 FF-129 200 97 3 0 - 130 FF-130 100 100 0 0 - 131 FF-131 200 98 0 2 - 132 FF-132 200 92 1 7 - 133 FF-133 200 95 2 3 - 134 FF-134 200 96 1 3 + 135 FF-135 200 94 2 4 + 136 FF-136 200 98 2 0 - 137 FF-137 200 98 2 0 - 138 FF-138 200 99 1 0 - 139 FF-139 200 98 2 0 - 140 FF-140 200 100 0 0 + 141 FF-141 100 93 4 3 +/потеря (прерывание беременности) 142 FF-142 100 96 4 0 - 143 FF-143 100 98 2 0 + 144 FF-144 200 97 2 1 - 145 FF-145 100 100 0 0 + 146 FF-146 100 92 4 4 - 147 FF-147 200 96 1 3 - 148 FF-148 200 94 2 4 + 149 FF-149 200 98 2 0 + 150 FF-150 200 98 2 0 - 151 FF-151 200 99 1 0 - 152 FF-152 200 98 2 0 -

153 FF-153 100 93 4 3 + 154 FF-154 100 100 0 0 - 155 FF-155 Отсутствие клетки       + 156 FF-156 200 92 6 2 +/потеря (прерывание беременности) 157 FF-157 100 97 1 2 - 158 FF-158 200 96 3 1 - 159 FF-159 200 95 3 2 - 160 FF-160 200 99 1 0 - 161 FF-161 100 96 1 3 + 162 FF-162 200 97 2 1 + 163 FF-163 Отсутствие клетки       - 164 FF-164 200 96 3 1 + 165 FF-165 200 95 1 4 + 166 FF-166 200 97 3 0 - 167 FF-167 200 98 2 0 - 168 FF-168 200 94 5 1 - 169 FF-169 200 95 2 3 - 170 FF-170 200 96 3 0 - 171 FF-171 200 99 1 0 - 172 FF-172 200 94 5 1 +/потеря (прерывание беременности) 173 FF-173 200 97 0 3   174 FF-174 200 95 3 2 - 175 FF-175 200 97 1 2 - 176 FF-176 Отсутствие клетки       - 177 FF-177 200 98 1 1 +/потеря (прерывание беременности) 178 FF-178 100 97 3 0 - 179 FF-179 200 94 2 4 - 180 FF-180 200 98 2 0 + 181 FF-181 200 98 2 0 - 182 FF-182 200 99 1 0 - 183 FF-183 100 96 2 2 - 184 FF-184 200 97 3 0 +/потеря (прерывание беременности) 185 FF-185 Отсутствие клетки       + 186 FF-186 200 92 6 2 - 187 FF-187 200 92 1 7 + 188 FF-188 200 95 2 3 + 189 FF-189 200 96 1 3 +/потеря (прерывание беременности)

190 FF-190 200 94 2 4 - 191 FF-191 200 98 2 0 +/потеря (прерывание беременности) 192 FF-192 200 98 2 0 - 193 FF-193 200 99 1 0 - 194 FF-194 200 98 2 0 + 195 FF-195 Отсутствие клетки       - 196 FF-196 200 97 3 0 - 197 FF-197 200 95 1 4 - 198 FF-198 100 97 0 3 + 199 FF-199 200 96 1 3 + 200 FF-200 200 99 1 0 + 201 FF-201 200 94 1 5 + 202 FF-202 200 98 1 1 - 203 FF-203 200 100 0 0 - 204 FF-204 200 98 2 0 - 205 FF-205 100 97 1 2 +/потеря (прерывание беременности) 206 FF-206 200 94 2 4 - 207 FF-207 100 95 5 0 - 208 FF-208 200 98 2 0 + 209 FF-209 200 98 2 0 - 210 FF-210 200 99 1 0 - 211 FF-211 100 95 3 2 - 212 FF-212 100 97 3 0 - 213 FF-213 100 98 2 0 - 214 FF-214 100 99 1 0 - 215 FF-215 200 92 6 2 - 216 FF-216 100 100 0 0 + 217 FF-217 100 98 1 1 - 218 FF-218 100 97 2 1 + 219 FF-219 100 97 2 1 + 220 FF-220 100 97 2 1 - 221 FF-221 100 100 0 0 + 222 FF-222 100 97 2 1 + 223 FF-223 100 97 3 0 + 224 FF-224 200 98 2 0 - 225 FF-225 100 94 5 1 - 226 FF-226 100 91 5 4 - 227 FF-227 Отсутствие клеток       - 228 FF-228 100 93 6 1 -

229 FF-229 100 98 2 0 - 230 FF-230 100 89 9 2 + 231 FF-231 Отсутствие клетки       - 232 FF-232 100 96 1 3 + 233 FF-233 100 98 2 0 - 234 FF-234 100 98 2 0 + 235 FF-235 100 97 3 0 - 236 FF-236 100 98 2 0 - 237 FF-237 100 98 2 0 + 238 FF-238 100 100 0 0 - 239 FF-239 100 98 1 1 - 240 FF-240 100 96 3 1 - 241 FF-241 100 98 2 0 + 242 FF-242 100 99 1 0 - 243 FF-243 100 96 3 1 + 244 FF-244 200 97 3 0 - 245 FF-245 100 98 2 0 - 246 FF-246 100 94 6 0 +/потеря (прерывание беременности) 247 FF-247 200 95 3 2 + 248 FF-248 100 100 0 0 + 249 FF-249 100 96 3 1 - 250 FF-250 200 97 3 0 - 251 FF-251 100 98 2 0 + 252 FF-252 200 95 3 2 + 253 FF-253 100 98 2 0 - 254 FF-254 200 97 2 1 - 255 FF-255 100 95 5 0 - 256 FF-256 100 100 0 0 - 257 FF-257 100 96 3 1 - 258 FF-258 200 97 3 0 +/потеря (прерывание беременности) 259 FF-259 100 98 2 0 + 260 FF-260 200 95 3 2 - 261 FF-261 Отсутствие клетки       - 262 FF-262 100 100 0 0 + 263 FF-263 100 100 0 0 + 264 FF-264 100 100 0 0 - 265 FF-265 100 100 0 0 - 266 FF-266 100 98 2 0 -

267 FF-267 100 98 1 1 +/потеря (прерывание беременности) 268 FF-268 100 100 0 0 - 269 FF-269 100 100 0 0 - 270 FF-270 100 98 2 0 - 271 FF-271 200 92 6 2 - 272 FF-272 100 97 2 1 - 273 FF-273 100 100 0 0 + 274 FF-274 100 97 2 1 - 275 FF-275 100 90 8 2 - 276 FF-276 100 97 1 2 - 277 FF-277 100 96 4 0 - 278 FF-278 100 96 2 2 - 279 FF-279 100 97 3 0 - 280 FF-280 100 100 0 0 + 281 FF-281 100 99 0 1 +/потеря (прерывание беременности) 282 FF-282 100 99 0 1 - 283 FF-283 100 97 2 1 - 284 FF-284 100 95 3 2 + 285 FF-285 100 95 2 3 - 286 FF-286 100 98 2 0 - 287 FF-287 100 98 2 0 - 288 FF-288 100 95 2 3 - 289 FF-289 100 98 2 0 - 290 FF-290 100 97 3 0 - 291 FF-291 100 100 0 0 - 292 FF-292 100 99 0 1 - 293 FF-293 100 97 2 1 + 294 FF-294 100 100 0 0 + 295 FF-295 100 97 2 1 + 296 FF-296 100 97 3 0 + 297 FF-297 100 93 4 3 - 298 FF-298 100 96 4 0 + 299 FF-299 100 96 3 1 - 300 FF-300 100 92 4 4 - 301 FF-301 200 98 2 0 - 302 FF-302 100 100 0 0 + 303 FF-303 100 100 0 0 - 304 FF-304 100 100 0 0 + 305 FF-305 100 98 2 0 +

306 FF-306 100 92 6 2 - 307 FF-307 100 98 1 1 + 308 FF-308 100 98 1 1 - 309 FF-309 100 95 4 1 - 310 FF-310 100 98 1 1 - 311 FF-311 100 95 4 1 - 312 FF-312 100 100 0 0 + 313 FF-313 100 98 2 0 - 314 FF-314 100 95 3 2 - 315 FF-315 200 95 3 2 + 316 FF-316 100 100 0 0 - 317 FF-317 100 100 0 0 - 318 FF-318 100 93 5 2 - 319 FF-319 100 99 1 0 + 320 FF-320 100 98 1 1 - 321 FF-321 100 95 4 1 + 322 FF-322 100 100 0 0 + 323 FF-323 100 96 3 1 - 324 FF-324 Отсутствие клетки       - 325 FF-325 100 98 1 1 - 326 FF-326 100 95 4 1 + 327 FF-327 100 100 0 0 +/потеря (прерывание беременности) 328 FF-328 100 100 0 0 + 329 FF-329 100 95 2 3 + 330 FF-330 100 97 1 2 - 331 FF-331 100 100 0 0 + 332 FF-332 100 100 0 0 +/потеря (прерывание беременности) 333 FF-333 100 96 1 3 + 334 FF-334 100 94 3 3 - 335 FF-335 100 100 0 0 - 336 FF-336 100 99 1 0 - 337 FF-337 100 96 2 2 - 338 FF-338 100 96 3 1 +/потеря (прерывание беременности) 339 FF-339 100 100 0 0 - 340 FF-340 100 100 0 0 - 341 FF-341 100 100 0 0 + 342 FF-342 100 100 0 0 - 343 FF-343 100 95 3 2 -

344 FF-344 100 100 0 0 + 345 FF-345 100 100 0 0 + 346 FF-346 100 98 1 1 - 347 FF-347 100 95 4 1 - 348 FF-348 100 95 3 2 - 349 FF-349 100 96 2 2 + 350 FF-350 100 96 3 1 + 351 FF-351 100 100 0 0 - 352 FF-352 100 100 0 0 + 353 FF-353 100 100 0 0 + 354 FF-354 100 100 0 0 + 355 FF-355 100 100 0 0 - 356 FF-356 100 94 5 1 - 357 FF-357 100 99 1 0 + 358 FF-358 100 98 1 1 - 359 FF-359 100 99 0 1 - 360 FF-360 100 99 0 1 - 361 FF-361 100 97 2 1 - 362 FF-362 100 95 3 2 - 363 FF-363 100 95 2 3 - 364 FF-364 100 98 2 0 - 365 FF-365 100 98 2 0 - 366 FF-366 Отсутствие клетки       - 367 FF-367 100 98 2 0 - 368 FF-368 Отсутствие клетки       - 369 FF-369 100 100 0 0 - 370 FF-370 100 99 1 0 - 371 FF-371 100 98 2 0 - 372 FF-372 100 96 4 0 ~ 373 FF-373 200 88 0 12 - 374 FF-374 100 98 2 0 + 375 FF-375 100 99 1 0 - 376 FF-376 100 93 7 0 + 377 FF-377 100 91 5 4 - 378 FF-378 100 100 0 0 + 379 FF-379 100 95 3 2 - 380 FF-380 100 100 0 0 - 381 FF-381 100 99 1 0 - 382 FF-382 100 97 3 0 - 383 FF-383 100 98 2 0 + 384 FF-384 100 97 1 2 -

385 FF-385 100 95 3 2 - 386 FF-386 100 96 3 1 - 387 FF-387 100 96 1 3 + 388 FF-388 100 100 0 0 +/потеря (прерывание беременности) 389 FF-389 100 98 2 0 - 390 FF-390 100 95 2 3 + 391 FF-391 30 28 2 0 + 392 FF-392 100 100 0 0 - 393 FF-393 100 100 0 0 - 394 FF-394 100 100 0 0 - 395 FF-395 100 100 0 0 - 396 FF-396 100 98 2 0 - 397 FF-397 100 98 2 0 - 398 FF-398 100 98 1 1 - 399 FF-399 100 94 4 2 - 400 FF-400 Отсутствие клетки       - 401 FF-401 100 100 0 0 - 402 FF-402 100 97 1 2 + 403 FF-403 100 100 0 0 - 404 FF-404 100 100 0 0 - 405 FF-405 Отсутствие клеток       - 406 FF-406 100 96 0 4 + 407 FF-407 100 100 0 0 - 408 FF-408 100 100 0 0 - 409 FF-409 100 100 0 0 - 410 FF-410 100 98 2 0 +/потеря (прерывание беременности) 411 FF-411 100 100 0 0 +/потеря (прерывание беременности) 412 FF-412 100 98 0 2 - 413 FF-413 100 98 2 0 + 414 FF-414 100 94 6 0 +/потеря (прерывание беременности) 415 FF-415 100 97 3 0 - 416 FF-416 100 94 2 4 - 417 FF-417 100 95 3 2 - 418 FF-418 100 100 0 0 - 419 FF-419 100 100 0 0 - 420 FF-420 100 98 2 0 - 421 FF-421 100 100 0 0 +

422 FF-422 100 100 0 0 - 423 FF-423 100 98 2 0 - 424 FF-424 100 98 0 2 + 425 FF-425 100 98 2 0 - 426 FF-426 100 100 0 0 - 427 FF-427 100 95 3 2 +/потеря (прерывание беременности) 428 FF-428 200 94 5 1 - 429 FF-429 200 97 0 3 - 430 FF-430 200 95 3 2 - 431 FF-431 200 97 1 2 - 432 FF-432 100 96 3 1 + 433 FF-433 100 96 1 3 - 434 FF-434 100 100 0 0 - 435 FF-435 100 100 0 0 + 436 FF-436 100 100 0 0 - 437 FF-437 100 100 0 0 - 438 FF-438 100 94 3 3 - 439 FF-439 100 95 3 2 - 440 FF-440 100 94 2 4 + 441 FF-441 100 100 0 0 - 442 FF-442 100 98 0 2 - 443 FF-443 100 98 2 0 - 444 FF-444 100 100 0 0 - 445 FF-445 100 95 3 2 - 446 FF-446 200 94 5 1 - 447 FF-447 200 95 3 2 + 448 FF-448 200 95 3 2 + 449 FF-449 200 97 1 2 + 450 FF-450 100 96 3 1 - 451 FF-451 100 96 1 3 + 452 FF-452 100 94 2 4 - 453 FF-453 100 100 0 0 - 454 FF-454 200 97 0 3 + 455 FF-455 200 95 3 2 + 456 FF-456 100 93 4 3 + 457 FF-457 100 100 0 0 + 458 FF-458 100 98 2 0 - 459 FF-459 100 100 0 0 - 460 FF-460 100 95 3 2 - 461 FF-461 200 94 5 1 +

462 FF-462 200 97 0 3 - 463 FF-463 200 95 3 2 - 464 FF-464 200 97 0 3 - 465 FF-465 200 95 3 2 +/потеря (прерывание беременности) 466 FF-466 100 100 0 0 - 467 FF-467 100 100 0 0 + 468 FF-468 100 98 0 2 - 469 FF-469 100 98 2 0 + 470 FF-470 100 100 0 0 + 471 FF-471 100 95 3 2 - 472 FF-472 100 96 1 3 - 473 FF-473 100 95 3 2 - 474 FF-474 100 98 1 1 - 475 FF-475 100 94 0 6 - 476 FF-476 100 95 3 2 + 477 FF-477 100 95 3 2 - 478 FF-478 100 98 1 1 +

На фигурах 1-5 показаны клетки, выбранные из указанных выше образцов, проанализированные посредством FISH. На фигуре 1 показана микрофотография анализа FISH одной из клеток с нормальным состоянием хромосом 18 и X, полученных из фолликулярной жидкости в исследуемом образце FF-205. На фигуре 2 показана микрофотография анализа FISH одной из клеток с моносомией 18, полученных из фолликулярной жидкости в исследуемом образце FF-070. На фигуре 3 показана микрофотография анализа FISH одной из клеток с моносомией X, полученных из фолликулярной жидкости в исследуемом образце FF-097. На фигуре 4 показана микрофотография анализа FISH одной из клеток с трисомией 18, полученных из фолликулярной жидкости в исследуемом образце FF-200. На фигуре 5 показана микрофотография анализа FISH одной из клеток с трисомией X, полученных из фолликулярной жидкости в исследуемом образце FF-318.

Представленные в таблице 1 данные обобщены в таблице 2:

Таблица 2   № случаев Количество проанализированных для каждого яичника образцов 478 Непригодные клетки для анализа 19 Общее количество проанализированных образцов 459 Общее количество нормальных пациенток по диплоидной хромосоме X после анализа FISH 415 Анеуплоидию для хромосомы X обнаружили в ≥5% клеток из выделенной фолликулярной жидкости 44 (9,58%)

Далее в таблице 3 показан ретроспективный анализ в состоянии беременности или выкидыша у пациенток с нормальными хромосомами X или аномальной X-хромосомной анеуплоидией, определяемыми посредством FISH:

Таблица 3   Пациентки с X-хромосомной анеуплоидией в фолликулярной жидкости (44) Пациентки с нормальным состоянием X-хромосом в фолликулярной жидкости (415) № пациенток с беременностью 11/44 (25%) 148/415 (35,66%) № пациенток с прерыванием беременности 7/11 (63,63%) 21/148 (14,19%)

Из проанализированных для каждого яичника 478 образцов фолликулярной жидкости в 19 случаях не получили клетки, необходимые для анализа. Результаты FISH на клетках фолликулярной жидкости в остальных 459 случаях показаны в таблице 1. В лаборатории авторов изобретения полагают, что 1-4% анеуплоидных клеток представляют собой нормальную величину. Это также обнаружили в других лабораториях (Vysis AneuVysion® Multicolor DNA Probe Kit (Part Number 32-161075 & 33-161075 & 35-161075) листок-вкладыш, таблица 4, прикрепленная сюда как приложение A и включенная сюда в качестве ссылки). Из проанализированных посредством FISH образцов, у 415 пациенток показан нормальный профиль хромосомы X, в то же время у 44 пациенток показан мозаичный профиль фолликулярной жидкости (≥5% анеуплоидии хромосомы X). У индивидуумов с обнаруженной мозаичной анеуплоидией хромосомы X также выполняли кариотипирование и анализ FISH на образцах крови. У восемнадцати из этих 44 (40,9%) пациенток в крови так же выявили слабо выраженный мозаицизм (≥5% анеуплоидии) хромосомы X, подтверждая результаты фолликулярной жидкости. Остальные 26 пациенток при анализе крови являлись нормальными по анеуплоидии хромосомы X, давая возможность предположить, что мозаицизм у этих 26 пациенток может быть ограничен гонадами (гонадный мозаицизм).

При дополнительном анализе авторы обнаружили, что 11 из 44 пациенток (25%) с определенной посредством FISH анеуплоидией являлись беременными. В то же время являлись беременными 148 из 415 пациенток (35,66%) с нормальной фолликулярной жидкостью по результатам FISH. Таким образом, соотношение беременных среди пациенток с определенной в клетках фолликулярной жидкости анеуплоидией является меньшим, чем соотношение для пациенток с нормальной фолликулярной жидкостью по результатам FISH. Это подтверждает, что гонадный мозаицизм коррелирует со сниженными коэффициентами фертильности среди использующих оплодотворение in vitro с целью забеременеть женщин. Кроме того, из 11 забеременевших пациенток с анеуплоидией хромосомы X, у 7 пациенток произошло прерывание беременности (63,63%). С другой стороны, из 148 забеременевших пациенток с нормальной фолликулярной жидкостью по результатам FISH, только у 21 пациентки произошло прерывание беременности (14,19%), что коррелирует с нормальным соотношением прерывания беременностей в общей популяции. Это подтверждает, что гонадный мозаицизм для анеуплоидии хромосомы X коррелирует с повышенным риском прерывания беременности.

Пример 2

Идентификация гонадного мозаицизма в отношении аномалий хромосом 13 и 21 посредством FISH с применением клеток из фолликулярной жидкости из каждого яичника.

Клетки и стекла обрабатывают, как указано в примере 1. Однако образцы фолликулярной жидкости получали от пациенток с анамнезом пораженных трисомией 13 или 21 детей. Самим пациенткам посредством анализа крови также ставили диагноз наличия мозаичного профиля анеуплоидии для 13 или 21 хромосом. Применяют специфичные для хромосомы 13 (LSI 13 Spectrum Green) и 21 (LSI 21 Spectrum Orange) зонды (AneuVysion EC DNA probe kit, Vysis). Результаты данных исследований показаны далее в таблице 4:

Таблица 4 сер. № № образца Идентификация аномалий хромосом 13 и 21 на клетках, полученных из фолликулярной жидкости из каждого яичника состояние оплодотворения № проанализир. клеток Норма для 13 & 21 (%) аном. хр. 13 % аном. хр. 21 % 1 FF-A01 200 92 8 0 + 2 FF-A02 200 94 6 0 - 3 FF-A03 200 99 0 1 -

4 FF-A04 200 91 1 8 + 5 FF-A05 200 88 2 10 - 6 FF-A06 200 96 2 2 - 7 FF-A07 200 97 1 2 - 8 FF-A08 200 92 3 5 - 9 FF-A09 200 99 1 0 - 10 FF-A10 200 93 3 4 +

На фигурах 6-8 показаны клетки, выбранные из указанных выше образцов, проанализированные посредством FISH. На фигуре 6 показана микрофотография анализа FISH одной из клеток с нормальным состоянием хромосом 13 и 21, полученных из фолликулярной жидкости в исследуемом образце FF-A01. На фигуре 7 показана микрофотография анализа FISH одной из клеток с трисомией 13, полученных из фолликулярной жидкости в исследуемом образце FF-A03. На фигуре 8 показана микрофотография анализа FISH одной из клеток с трисомией 21, полученных из фолликулярной жидкости в исследуемом образце FF-A053.

Пример 3

Идентификация гонадного мозаицизма в отношении аномалий хромосом 18, X и Y посредством FISH, с применением клеток из полученной из обоих яичников индивидуума фолликулярной жидкости.

Данный эксперимент проводили в тех же условиях, что и для примера 1, за исключением того, что клеточный образец фолликулярной жидкости получали из обоих яичников, а не из каждого из яичников, как в примере 1. Результаты данных исследований показаны далее в таблице 5:

Таблица 5  

сер. № № образца Левый Правый Состояние оплодотво-рения № проанали-зирован-ных клеток Норма для X&18 (%) Х хр. аном. % аном. хр. 18 (%) № проанализированных клеток Норма для X&18 (%) Х хр. аном. (%) аном. хр. 18 (%) 1 FF-479 100 92 6 2 100 86 8 2 - 2 FF-480 100 92 6 2 100 91 5 4 - 3 FF-481 100 100 0 0 100 100 0 0 - 4 FF-482 100 97 3 0 100 100 0 0 - 5 FF-483 100 100 0 0 100 100 0 0 - 6 FF-484 100 100 0 0 100 98 2 0 + 7 FF-485 100 98 2 0 100 100 0 0 - 8 FF-486 100 95 4 0 100 98 0 2 - 9 FF-487 100 94 3 3 100 98 2 0 - 10 FF-488 100 94 5 1 100 93 4 3 - 11 FF-489 100 94 0 6 100 97 0 3 + 12 FF-490 100 99 0 1 100 94 6 0 + 13 FF-491 50 96 2 2 100 97 3 0 - 14 FF-492 100 82 14 4 100 92 6 2 +/потеря (прерывание беременности) 15 FF-493 100 97 0 3 100 95 3 2 - 16 FF-494 100 100 0 0 100 98 2 0 - 17 FF-495 100 100 0 0 100 91 5 4 - 18 FF-496 100 95 5 0 100 95 5 0 - 19 FF-497 100 96 1 4 100 96 2 2 + 20 FF-498 100 96 4 0 100 98 1 1 - 21 FF-499 100 100 0 0 100 94 4 2 - 22 FF-500 100 94 3 3 100 93 2 5 + 23 FF-501 100 95 3 2 100 97 0 3 - 24 FF-502 100 97 0 3 100 97 0 3 - 25 FF-503 100 100 0 0 100 97 3 1 + 26 FF-504 100 95 2 3 100 93 3 4 - 27 FF-505 100 96 4 0 100 97 0 3 + 28 FF-506 100 92 2 6 100 95 1 4 - 29 FF-507 100 95 3 2 100 94 2 4 - 30 FF-508 100 100 0 0 100 94 4 2 - 31 FF-509 100 97 0 3 100 94 4 2 + 32 FF-510 100 96 2 3 100 95 1 4 - 33 FF-511 100 96 2 2 100 98 2 0 + 34 FF-512 100 99 1 0 100 100 0 0 - 35 FF-513 100 94 5 2 100 95 5 0 - 36 FF-514 100 96 0 4 100 93 3 4 +/потеря (прерывание беременности)

37 FF-515 100 97 3 0 100 98 0 2 + 38 FF-516 100 97 1 2 100 96 2 2 - 39 FF-517 100 97 1 2 100 98 2 0 - 40 FF-518 100 98 0 2 100 97 3 0 - 41 FF-519 100 97 2 1 100 96 4 2 - 42 FF-520 100 93 2 5 100 99 0 1 - 43 FF-521 100 90 5 5 100 94 5 2 + 44 FF-522 100 98 1 1 100 97 2 1 - 45 FF-523 100 95 3 2 100 95 2 3 - 46 FF-524 100 91 3 6 100 93 5 2 +/потеря (прерывание беременности) 47 FF-525 100 95 3 2 100 93 2 5 - 48 FF-526 100 100 0 0 100 94 2 4 - 49 FF-527 100 97 2 1 100 98 1 1 +/потеря (прерывание беременности) 50 FF-528 100 95 2 3 100 86 7 7 - 51 FF-529 100 100 0 0 100 100 0 0 - 52 FF-530 100 93 2 3 100 100 0 0 - 53 FF-531 100 96 3 1 100 94 2 5 +/потеря (прерывание беременности) 54 FF-532 100 97 2 1 100 94 2 4 + 55 FF-533 100 100 0 0 100 100 0 0 - 56 FF-534 100 95 3 2 100 93 3 4 - 57 FF-535 100 100 0 0 100 100 0 0 - 58 FF-536 100 93 5 2 100 95 5 0 - 59 FF-537 100 93 1 5 100 90 3 7 - 60 FF-538 100 97 1 2 100 92 2 6 + 61 FF-539 100 98 0 2 100 94 0 6 - 62 FF-540 100 98 0 2 100 94 4 2 - 63 FF-541 100 96 2 2 100 95 1 4 - 64 FF-542 100 96 2 2 100 96 2 2 - 65 FF-543 100 87 6 7 100 92 3 5 - 66 FF-544 100 93 3 4 100 94 2 4 + 67 FF-545 100 95 3 2 100 91 5 4 +/ прерывание беременности) 68 FF-546 100 94 2 4 100 93 3 4 + 69 FF-547 100 97 0 3 100 96 2 2 - 70 FF-548 100 97 1 2 100 100 0 0 + 71 FF-549 100 93 4 3 100 96 2 2 - 72 FF-550 100 92 3 5 100 91 4 5 - 73 FF-551 100 95 1 4 100 97 2 3 - 74 FF-552 100 89 2 9 100 93 2 5 -

75 FF-553 100 96 2 2 100 94 2 5 - 76 FF-554 100 96 1 3 100 98 1 1 - 77 FF-555 100 96 0 4 100 95 1 4 - 78 FF-556 100 91 4 5 100 94 0 6 + 79 FF-557 100 93 3 4 100 95 2 3 - 80 FF-558 100 94 2 4 100 94 2 4 - 81 FF-559 100 86 6 8 100 83 8 9 -

Данные из таблицы 5 обобщили и проанализировали, а результаты показаны далее в таблице 6:

Таблица 6   № случаев Количество проанализированных для обоих яичников образцов 81 Непригодные для анализа клетки 0 Общее количество проанализированных образцов 81 Общее количество пациенток, нормальных в отношении X-хромосомной аномалии, согласно анализу FISH 67 Анеуплоидия по хромосоме X ≥5% в фолликулярной жидкости в каждом яичнике 06 Анеуплоидия по хромосоме X ≥5% в фолликулярной жидкости в обоих яичниках 08

Далее в таблице 7 показан ретроспективный анализ в состоянии беременности или выкидыша у нормальных пациенток по сравнению с пациентками с определяемой посредством FISH X-хромосомной анеуплоидией:

Таблица 7   Пациентки с X-хромосомной анеуплоидией в фолликулярной жидкости в обоих яичниках Пациентки с X-хромосомной анеуплоидией в фолликулярной жидкости в любом яичнике Пациентки с нормальным состоянием X-хромосом в фолликулярной жидкости № пациенток с беременностью 2/8 (25%) 2/6 (33,33%) 16/67 (23,88%) № пациенток с прерыванием беременности 2/2 (100%) 1/2 (50%) 3/16 (18,75%)

Из 81 проанализированного образца фолликулярной жидкости, 67 образцов не показали X-хромосомной аномалии (≤ 5% анеуплоидных клеток; таблица 6). В образцах из одного яичника анеуплоидию обнаружили только для 6 из оставшихся 14 случаев, тогда как в образцах фолликулярной жидкости из обоих яичников анеуплоидию обнаружили в других 8 случаях (таблица 6).

При ретроспективном анализе 2 из 8 пациенток с X-хромосомной анеуплоидией в обоих яичниках являлись беременными, но у обеих произошло прерывание беременности. Две из 6 пациенток с X-хромосомной анеуплоидией в каждом из двух проанализированных яичников являлись беременными, у одной из них произошло прерывание беременности. При сравнении, из 67 нормальных по X-хромосоме пациенток 16 являлись беременными (23,88%), из которых только у 3 произошло прерывание беременности (18,75%).

Пример 4

Определение гонадного мозаицизма при кариотипическом анализе с применением клеток из фолликулярной жидкости (Способ с покровным стеклом).

1) Забор клеток из фолликулярной жидкости.

Клетки из фолликулярной жидкости собирают от 4 пациенток, подверженных способу оплодотворения in vitro, как описано в примере 1.

2) Клеточная культура

Для осаждения клеток образец фолликулярной жидкости от каждой пациентки центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 минут. Супернатант сбрасывают, оставляя над осадком приблизительно 4 мл жидкости, а затем ресуспендируют осадок в оставшейся жидкости. На помещенное в чашку Петри стерильное покровное стекло капают из пипетки приблизительно 0,5 мл. Образцу позволяют подсохнуть в течение нескольких минут перед добавлением 0,5 мл культуральной среды (Amniomax; Sigma) и инкубируют в течение ночи при температуре 37°C и 5% CO₂. На следующий день добавляют приблизительно 2 мл культуральной среды и инкубируют планшеты в течение дополнительных двух суток. Ежедневно под контролем микроскопа за культурами наблюдают в отношении образования фибробластов и вносят дополнительную культуральную среду, если необходимо. Супернатант удаляют и добавляют свежую среду, когда культуры являются конфлуентными. Через двое суток клетки собирают, добавлением в культуру 20 мкл Demicolcine (Sigma), инкубируя в CO₂-инкубаторе в течение 20 минут и добавляя 2 мл гипотонического раствора (0,75 М KCl и 0,6% цитрата натрия). После этого культуры инкубируют в течение 20 минут при 37°C.

3) Фиксация клеток и кариотипирование

К культурам при комнатной температуре медленно добавляют пять капель свежего фиксатора и инкубируют культуры при 37°C в течение 10 минут. Добавляют еще одну 1 мл аликвоту фиксатора, а через 10 минут добавляют еще 2 мл. Через 20 минут весь фиксатор удаляют при комнатной температуре и добавляют 2 мл свежего фиксатора, и снова инкубируют в течение 20 минут при комнатной температуре. Эту последнюю стадию фиксации повторяют дважды. Покровное стекло вынимают из чашки Петри и оставляют на влажной ткани для высушивания. Затем покровное стекло заключают на чистом, сухом стекле с применением заключающей среды DPX. После этого стекло окрашивают способом GTG-бэндинга (The AGT Cytogenetics Laboratory Manual, 3rd Edition, 1997, P 259-324) и сушат на воздухе. Затем стекло изучают под масляной иммерсией для проверки четкой исчерченности хромосом. При исследовании количественных и структурных аномалий анализируют как минимум от 20 до 30 метафаз.

4) Результаты

Моносомию обнаружили в 3 метафазах (фигура 9) из 20 проанализированных в образце от одного индивидуума метафаз. Данный результат также подтвердили в 1 из 20 проанализированных в образце крови метафаз.

Пример 5

Определение гонадного мозаицизма при кариотипическом анализе с применением клеток из фолликулярной жидкости (Способ с культуральным флаконом)

1) Забор клеток фолликулярной жидкости

Образцы фолликулярной жидкости забирают от шести подвергнутых процедуре оплодотворения in vitro индивидуумов, как описано в примере 1.

2) Клеточная культура и фиксация

Для осаждения клеток образец фолликулярной жидкости от каждого индивидуума центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 минут. Супернатант сбрасывают, оставляя над осадком приблизительно 4 мл жидкости. Затем осадок ресуспендируют в оставшемся супернатанте. В два флакона для культур ткани вносят соответственно по 2 мл клеточной суспензии. Во флаконы добавляют культуральную среду (Amniomax, Sigma) и инкубируют флаконы при 37°C в течение 6-8 суток. В каждый флакон вносят дополнительные 2 мл культуральной среды и инкубируют флаконы еще двое суток. Ежедневно под контролем микроскопа за культурами наблюдают в отношении образования фибробластов и вносят культуральную среду по мере необходимости. При обнаружении колоний фибробластов клетки собирают, добавляя 50 мкл Demicolcine (Sigma) и инкубируя приблизительно при 37°C в течение от 2 до 3 часов. Затем клетки переносят в центрифужную пробирку. Во флакон добавляют раствор ЭДТА, встряхивают флакон и снова переносят содержимое в центрифужную пробирку. После этого флакон отмывают раствором трипсина в продолжение от двух до трех минут и снова переносят содержимое в центрифужную пробирку.

В содержащую культивированные клетки центрифужную пробирку добавляют приблизительно 2 мл гипотонического раствора (0,75 М KCl и 0,6% цитрата натрия) и оставляют пробирку приблизительно при 37°C в течение приблизительно 20 минут. К этому медленно добавляют от 10 до 12 капель свежего фиксатора комнатной температуры и оставляют пробирку приблизительно при 37°C в течение приблизительно 10 минут. После этого пробирку центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 минут. Супернатант сбрасывают, оставляя над осадком приблизительно 0,5 мл раствора. Осадок ресуспендируют в оставшемся супернатанте. Сначала добавляют 1 мл свежего охлажденного фиксатора; к этому добавляют еще приблизительно 5 мл фиксатора и суспензию оставляют при 2-8°C в течение 16-20 часов. Фиксированные образцы центрифугируют и сбрасывают супернатант, оставляя над осадком приблизительно 0,5 мл раствора. Вносят приблизительно 6 мл свежего холодного (от 2 до 8°C) фиксатора Карнуа, содержимое центрифугируют и вносят дополнительный фиксатор. Эту стадию фиксации повторяют дважды.

3) Кариотипирование

Несколько капель клеточной суспензии помещают на охлажденное влажное стекло. После этого стекло в течение 2 секунд нагревают на настроенной на 60-68°C водяной бане и затем переносят на установленную на 45°C горячую плитку на одну минуту. Стекло исследуют на метафазы с длинными сильно спирализованными хромосомами под контролем фазово-контрастного микроскопа при 10× увеличении. Стекло окрашивают способом GTG-бэндинга, как описано выше, и сушат. Затем стекло изучают под масляной иммерсией для проверки хорошей и четкой исчерченности хромосом. При исследовании количественных и структурных аномалий анализируют как минимум от 20 до 30 метафаз.

4) Результаты

Трисомию 21 определили в 4 метафазах из 30 проанализированных в образце от каждой пациентки метафаз с анамнезом у плода синдрома Дауна (фигура 10). Напротив, все исследованные в образце крови метафазы являлись нормальными. Данные результаты подтверждают наличие гонадного мозаицизма у данного индивидуума.

Как показано в примерах 1-5, гонадный мозаицизм, включающий в себя слабо выраженный гонадный мозаицизм, можно выявлять в полученных из фолликулярной жидкости клетках. Это показывает, что полученные из фолликулярной жидкости клетки можно использовать в качестве эффективного средства для выявления хромосомных аномалий в популяции симптоматических и бессимптомных индивидуумов.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ идентификации аномалии репродуктивной системы, представляющей собой анеуплоидию, включающий в себя получение соматических клеток из фолликулярной жидкости у человека и выполнение генетического анализа указанных клеток, где идентификация по меньшей мере одной хромосомной аномалии в части клеток указывает на слабовыраженный гонадный мозаицизм. Представлен способ анализа повышенного риска бесплодия, вызванного анеуплоидией, у млекопитающего, предпочтительно, человека, включающий в себя получение соматических клеток из фолликулярной жидкости животного и выполнение генетического анализа клеток, где идентификация по меньшей мере слабовыраженного гонадного мозаицизма в части клеток указывает на наличие повышенного риска бесплодия. Изобретение позволяет идентифицировать и диагностировать хромосомные аномалии, например, слабо выраженный мозаицизм. 2 н. и 18 з.п. ф-лы, 10 ил., 7 табл.

1. Способ идентификации аномалии репродуктивной системы, представляющей собой анеуплоидию, включающий в себя
a) получение соматических клеток из фолликулярной жидкости у человека;
b) выполнение генетического анализа указанных клеток;
где идентификация по меньшей мере одной хромосомной аномалии в части клеток указывает на слабовыраженный гонадный мозаицизм.

2. Способ по п.1, где фолликулярную жидкость получают во время процедуры оплодотворения in vitro.

3. Способ по п.1, где фолликулярную жидкость получают во время процедуры внутрицитоплазматической инъекции сперматозоида.

4. Способ по п.1, где фолликулярную жидкость получают из одного яичника субъекта.

5. Способ по п.1, где фолликулярную жидкость получают из обоих яичников субъекта.

6. Способ по п.1, где генетический анализ представляет собой флуоресцентную гибридизацию in situ.

7. Способ по п.1, где генетический анализ представляет собой кариотипирование.

8. Способ по п.1, где генетический анализ представляет собой секвенирование ДНК.

9. Способ по п.1, где генетический анализ представляет собой способ, выбранный из группы, состоящей из сравнительной геномной гибридизации (CGH), многоцветного бэндинга (МСВ), количественной FISH (Q-FISH), полимеразной цепной реакции (PCR), технологии GBA (минитипирования), мультиплексного секвенирования, SNaPshot, MassEXTEND, MassArray, лигирования на миниматрицах, минисеквенирования на микроматрицах, маркерных матриц, удлинения праймеров на матрицах (APEX), удлинения праймеров на микроматрицах, GOOD-анализа, кодироуемых микросфер, анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (RFLP), аллель-специфического анализа олигонуклеотидов (ASO), специфичной к метилированию ПЦР (MSPCR), способа пиросеквенирования, анализа acycloprime, обратного дот-блот-анализа, микроматриц GeneChip, динамической аллель-специфической гибридизации (DASH), пептидных зондов нуклеиновых кислот (PNA) и запирающих зондов нуклеиновых кислот (LNA), TaqMan, Molecular Beacons, интеркалирующего окрашивания, FRET-праймеров, AlphaScreen, SNPstream, Invader assay, управляемого матрицей включения (TDI), флуоресцентной поляризации, анализа олигонуклеотидного лигирования и выделения кодируемых последовательностей, лигазной цепной реакции, запирающих зондов, амплификации по типу катящегося кольца и колориметрического анализа олигонуклеотидного лигирования (OLA).

10. Способ по п.9, где сравнительную геномную гибридизацию выполняют с метафазными хромосомами или CGH-матрицей.

11. Способ по п.1, где анеуплоидия представляет собой полную или частичную трисомию.

12. Способ по п.11, где трисомия представляет собой трисомию 13, трисомию 16, трисомию 18, трисомию 21, трисомию 22, XXY, XYY или XXX.

13. Способ по п.1, где анеуплоидия представляет собой полную или частичную моносомию.

14. Способ по п.13, где моносомия представляет собой моносомию X, моносомию 13, моносомию 16, моносомию 18, моносомию 21 или моносомию 22.

15. Способ по п.14, где анеуплоидия представляет собой полную или частичную нуллисомию.

16. Способ по п.15, где нуллисомия представлена для хромосом 13, 16, 18, 21, 22, X или Y.

17. Способ анализа повышенного риска бесплодия, вызванного анеуплоидией, у млекопитающего, предпочтительно человека, включающий в себя
a) получение соматических клеток из фолликулярной жидкости животного; и
b) выполнение генетического анализа клеток;
где идентификация по меньшей мере слабовыраженного гонадного мозаицизма в части клеток указывает на наличие повышенного риска бесплодия.

18. Способ по п.17, где фолликулярную жидкость получают во время процедуры оплодотворения in vitro или процедуры внутрицитоплазматической инъекции сперматозоида.

19. Способ по п.18, согласно которому эмбрион, полученный во время процедуры оплодотворения in vitro, подвержен предимплантационному генетическому анализу.

20. Способ по п.19, где генетический анализ показывает, что эмбрион не имеет хромосомной аномалии, и эмбрион переносят в матку животного.