Модуль размещения подложки для твердофазного синтеза олигонуклеотидов Российский патент 2024 года по МПК B05C13/00 C12N15/11 

Область применения

Изобретение относится к области комбинаторной химии и синтетической биологии и представляет конструкцию модуля размещения подложки с вакуумной фиксацией для обеспечения твердофазного синтеза олигонуклеотидов.

Массовый параллельный синтез олигонуклеотидов с использованием струйной принтерной печати заключается в адресной доставке малых количеств реагентов для синтеза в реакционных зонах (спотах), расположенных на гладкой либо пористой подложке. Гладкие подложки, такие как функционализированные стекла, кремниевые пластины, пластики, либо композитные материалы имеют достаточно высокую жесткость и обычно не возникает проблем фиксации таких подложек. Однако масштаб синтеза на гладких поверхностях обычно не превышает фемтомолярных количеств. К тому же смыв промежуточных реагентов на каждой стадии синтеза будет осуществляться по поверхности, с перекрестным загрязнением соседних спотов. Для предотвращения перекрестного загрязнения смывы требуют предварительной дезактивации и существенного изменения протоколов синтеза. Повысить выход синтетических олигонуклеотидов и решить проблему со смывом реагентов можно перейдя к пористым поверхностям. В таком случае подложка для синтеза будет представлять собой тонкую пористую пластину или пленку с канальным расположением пор малого диаметра. Выход олигонуклеотидов в этом случае будет значительно выше за счет увеличения площади удельной поверхности, на которой идет синтез, а смыв будет вестись через поры сквозь подложку при пониженном давлении (вакуумной откачке). Однако возникают проблемы с фиксацией таких подложек, поскольку наличие вертикально расположенных пор значительно снижает механическую прочность подложек. Избежать смещения, изгиба или повреждения подложки можно фиксацией подложки по периметру и, обеспечив снизу упор, позволяющий проходить газу и жидкости сквозь пористую структуру упора.

Технический уровень

Модули размещения с вакуумным прижимом широко используются в микроэлектронике для обеспечения фиксации образцов. Например, в патенте RU2310218 Предметный столик, вакуумный прижим чипа осуществляется по всей площади образца, а шероховатость подложки обеспечивает равномерное удержание всего чипа. В олигонуклеотидном синтезе на гладких поверхностях с использованием систем струйной печати фиксация образцов осуществляется механически. Так, известны проточные ячейки для установки стеклянных подложек с механической фиксацией для создания массивов олигонуклеотидов методом струйной печати [Lausted C. et al. POSaM: a fast, flexible, open-source, inkjet oligonucleotide synthesizer and microarrayer // Genome biology. – 2004. – V. 5. – No. 8. – P. 1-17; LeProust E. M. et al. Synthesis of high-quality libraries of long (150mer) oligonucleotides by a novel depurination controlled process // Nucleic acids research. – 2010. – V. 38. – No. 8. – P. 2522-2540.]. Недостатком указанных держателей является невозможность работы с пористыми подложками.

Наиболее близким аналогом предлагаемого изобретения, является держатель с вакуумной плитой, описанный в патенте US9403141B2, для выполнения синтеза ДНК библиотек на кремниевых пластинах, имеющих сквозные микроканалы. Для придания механической прочности подложке во время вакуумной откачки жидкости в держателе имеется поддерживающая пористая вставка, выполненная из спеченного металла. Металл дополнительно обеспечивает теплопроводность и может служить для поддержания заданной температуры. Недостатком такой конструкции является необходимость очень высокой точности соблюдения размеров кремниевых пластин, поскольку в случае несоответствия размера пластины она, либо не поместится внутри фиксирующего паза столика, либо, при меньших размерах и наличии люфта, может произойти смещение подложки во время вакуумной откачки, что приведет к ошибке синтеза. К тому же извлечение подложки из такого держателя затруднительно.

В отличие от прототипа предлагаемое изобретение имеет два вакуумных контура, один из которых, служит для откачки жидкости с пористой подложки и в процессе синтеза может включаться и отключаться по требованию, а второй контур служит для обеспечения фиксации подложек, поскольку вакуум создается только по периметру подложки, удерживая ее. Для этого по периметру подложки должен располагаться участок, не имеющий пор, который может быть выполнен из непористого материала, такого как полиэтилен, полипропилен, фторопласт, кремний, металл и др.

Раскрытие сущности

Выполнение синтеза на функционализированных пористых материалах, таких как пористый кремний, пористый оксид алюминия, пористый полиэтилен, и др. связано со сложностью выполнения процедуры откачки реагентов, поскольку высокопористые материалы для олигонуклеотидного синтеза имеют небольшую толщину (30-200 мкм), в связи с чем на таких подложках без дополнительной механической поддержки невозможно выполнять манипуляции, связанные с вакуумной откачкой.

Технический результат заключается в специальной конструкции модуля, которая обеспечивает одновременно размещение и фиксацию подложки, и удаление регентов путем вакуумного откачивания.

Технический результат достигается за счет того, что на дне модуля располагается камера откачки реагентов, подсоединенная через штуцер к вакуумной линии откачки, где низкое давление создается при помощи насоса. Эта камера сверху закрыта пористым упором. Поверх пористого упора размещается пористая подложка для синтеза. Для вакуумной фиксации подложки по периметру пористого упора имеется ряд отверстий, не связанных с камерой откачки реагентов и образующих отдельный контур для вакуумного прижима соединенных со вторым штуцером. При этом по периметру пористой подложки приклеен бортик из химически стойкого материала (полиэтилен, полипропилен, поливинилидендифторид, фторопласт, кремний, металл и т.п.) с помощью которого осуществляется вакуумный прижим.

Осуществление

Пример осуществления конструкции модуля с вакуумной фиксацией подложки представлен на фиг. 1, где 1 – пористая подложка; 2 – полимерный бортик; 3 – камера откачки жидкости; 4 – штуцер для подключения к вакуумной линии прижима; 5 – вакуумная линия прижима; 6 – вакуумная линия откачки; 7 – штуцер для подключения к вакуумной линии откачки; 8 – отверстия для прижима подложки; 9 – пористый упор; 10 – дозаторы (печатающие головки).

Модуль, изготовленный из химически инертного материала (фторопласт, полиэфирэфиркетон, полипропилен, нержавеющая сталь и др.), содержащий паз для установки пористой подложки для синтеза (1) с полимерным бортиком (2), которая размещается поверх упора и фиксируется посредством вакуума в линии прижима (5), куда посредством штуцера (4) подведен источник вакуума. По внешнему периметру камеры выполнены отверстия (8), объединенные в единый контур. Модуль размещения подложки содержит камеру для откачки жидкости (3) со штуцером (7) в нижней части для подключения к вакуумной линии откачки (6). Камера откачки жидкости (3) сверху закрыта пористым упором (9), выполненным из пористого материала, толщиной достаточной для обеспечения механической прочности и возможности прохождения газов и жидкости через упор. Например, для круглых подложек диаметром 25 мм упор может быть выполнен из пористого стекла толщиной порядка 2 мм с размером пор от 10 мкм до 500 мкм (марки пористых стекол могут быть от ПОР 10 до ПОР 500 по ГОСТ 25336-82), либо из перфорированной нержавеющей стали толщиной 1 мм с аналогичными размерами пор. Для прямоугольных подложек большего размера, например, 25×75 мм толщина упора из пористого стекла 3 мм. Пористый упор герметично фиксируется сверху и выравнивается в плоскости с модулем.

Синтез олигонуклеотидов может быть осуществлен путем дозирования реагентов любым доступным способом, например, адресное нанесение растворов дозаторами (печатающими головками) фиг.1 (10) либо полной заливкой. Для удаления реагентов с пористой подложки используется вакуум в линии откачки (6), создаваемый по требованию. Для защиты источника генерации вакуума от попадания паров жидкости (удержания влаги и конденсата), подключаемого в штуцер вакуумной линии откачки (7) может быть использован фильтр, буферная емкость и т.д. Последовательность добавляемых реагентов ведется в соответствии со стандартным протоколом синтеза и заданным массивом последовательностей олигонуклеотидов. После завершения синтеза подложка может быть легко удалена после выключения вакуума в линии прижима (5). Некоторые варианты исполнения модуля размещения подложки (12) представлено на фиг. 2. Посредством установочных винтов (11) модуль устанавливается на рабочей платформе синтезатора.

Примеры исполнения модулей размещения подложки для твердофазного синтеза олигонуклеотидов представлены на фиг. 2, где 1 – пористая подложка; 4 – штуцер для подключения к вакуумной линии прижима; 7 – штуцер для подключения к вакуумной линии откачки; 11 – установочные винты; 12 – модуль размещения подложки.

Создание вакуума для работы модуля размещения подложки может обеспечиваться стационарной газовой линией в помещении, компрессором с эжектором, вакуумным генератором, насосом и т. д. Управление давлением может быть организовано как вручную, так и автоматизированными способами посредством электромагнитных клапанов, реле, электропривода (двигатель, редуктор) и т.д. Для контроля давления может быть использован цифровой или аналоговый манометр, тензометрические/пьезорезистивные/капацитивные датчики, механические и электрические датчики давления и т. д. Пример одного из вариантов реализации системы управления модулем размещения подложки для твердофазного синтеза олигонуклеотидов, достаточного для автоматизированной эксплуатации, представлен на фиг. 3. Структурная схема управления модулем размещения подложки для твердофазного синтеза олигонкулеотидов, где 1 – пористая подложка; 5 – вакуумная линия прижима; 6 – вакуумная линия откачки; 12 – модуль размещения подложки; 13 – источник вакуума; 14 – буферная емкость; 15 – соленоидный клапан; 16 – реле; 17 – микроконтроллер.

Согласно фиг. 3 пример функционирования схемы подключения модуля размещения подложки для твердофазного синтеза олигонуклеотидов может быть устроен следующим образом. Основной линией на фиг. 3 условно показано подключение вакуумного контура, штриховой линией – схема электрическая соединений. В качестве источника вакуума (13) предлагается к использованию вакуумный насос. Поскольку в вакуумной линии откачки (6), подводящейся к вакуумному насосу, могут наблюдаться пары откачиваемой жидкости, во избежание повреждения насоса используется промежуточная буферная емкость (14) с осушительными гранулами-сорбентами (например, силикагель, цеолит, нейтрализующие реагенты и т.д.) в которой оседает основная часть откачиваемых реагентов, содержащейся в атмосфере синтезатора, а непосредственно в механизм насоса поступает очищенный от паров газ. Один из вариантов управления модулем размещения подложки подразумевает перекрытие вакуумных линий электромагнитными клапанами (15). Для управления нагрузкой (электромагнитными клапанами) используются реле (16), на которые с микроконтроллера (17) поступают сигналы об открытии/закрытии клапанов.

Изобретение относится к конструкции модуля размещения подложки для твердофазного синтеза олигонуклеотидов. Указанный модуль включает независимый контур вакуумного прижима по периметру подложки для ее фиксации и независимый контур с камерой для откачки жидкости с подложки, а также жесткий упор из пористого материала для обеспечения поддержки подложки и откачки реагентов из пор подложки. Техническим результатом является обеспечение одновременно фиксации подложки и удаления регентов путем вакуумного откачивания. 3 ил.

Модуль размещения подложки для твердофазного синтеза, включающий независимый контур вакуумного прижима по периметру подложки для ее фиксации и независимый контур с камерой для откачки жидкости с подложки, а также жесткий упор из пористого материала, обеспечивающий поддержку подложки и откачку реагентов из пор подложки.