Способ синтеза библиотек олигонуклеотидов и система автоматического синтеза Российский патент 2025 года по МПК C12Q1/68 C12Q1/6806 

Изобретение относится к устройствам для молекулярной биологии, генной инженерии, медицины и биотехнологии и предназначено для синтеза библиотек олигонуклеотидов (плотностью до 2500 спотов/см²) в автоматическом режиме.

Известны планшетные синтезаторы для получения олигонуклеотидов, основанные на принципе дозирования микролитровых объемов реагентов в лунки планшетов или специальных колонок, заполненных твердофазным носителем, например, стеклом с контролируемым размером пор. Так, в патенте US 5368823 A описан аппарат для синтеза олигонуклеотидов, где подача реагентов в лунки планшета осуществляется под действием избыточного давления инертного газа в емкостях для хранения растворов реагентов через трубки и дозирующие клапаны. В патенте RU88021 описан аппарат для синтеза олигонуклоетидов, где синтез ведется аналогичным образом, но, для подачи редких реагентов система снабжена автодозатором, способным затягивать редкие реагенты в иглу за счет разряжения, создаваемого вакуумным насосом и далее дозировать их под избыточным давлением. Недостатком описанных аппаратов является одновременный синтез от десятков до сотен штук разных олигонуклеотидов, поскольку областями реакции являются лунки планшета в количестве 96 или 384 штуки. К тому же объемы дозирования при такой системе подачи реагентов не могут быть меньше 1 мкл.

В патентах компании Agilent [US 6323043B1] описан способ создания массивов биополимеров и аппарат, состоящий из печатающей головки с несколькими соплами для подачи реагентов. В качестве системы дозирования реагентов рассматриваются термоэлектрические печатающие головки, хотя указывается возможность использования пьезоэлектрических печатающих головок. Для очистки дозаторов устройство снабжено промывочной станцией, а также областью с мягкой впитывающей поверхностью, куда дозатор может касаться для удаления остатков жидкости. В качестве подложек для синтеза используются гладкие стекла с малой удельной площадью поверхности, поэтому синтезируемые олигонуклеотиды в каждом споте получаются в фемтомолярных количествах.

Удаление реагентов с гладких поверхностей, обычно осуществляется в проточном режиме с предварительной нейтрализацией активных реагентов. В патенте [US 2006/0182664A1] приведена конструкция проточной ячейки, обеспечивающей смыв реагентов с поверхности гладких стекол на стадиях промывки, кэпирования и окисления. Остальные реагенты наносятся адресно методами струйной печати.

Наиболее близким прототипом в части синтеза является подход компании Twist Bioscience, описанный в патентах [US 10384188B2, US 10669304B2, US 10744477B2]. Синтез олигонуклеотидов ведется на функционализированных кремниевых подложках с сформированным массивом колодцев микрометрового размера и со сквозной микроперфорацией на дне колодцев, обеспечивающей удаление реагентов при помощи вакуумной системы откачки по требованию. Подложка помещается на держатель, оснащенный вакуумной системой откачки. Реагенты для синтеза наносятся в колодцы при помощи струйной печатающей головки, после чего, по прошествии времени, необходимого на протекание реакции, осуществляется откачка реагентов. Групповые операции, такие как, деблокирование, окисление, промывка, продувка азотом выполняются в закрытой проточной ячейке. Для этого, после работы печатающей системы, держатель подложки автоматически накрывается крышкой с герметичным уплотнением по периметру крышки. Внутри крышки и держателя подложки расположены вводы и выводы газа и реагентов. Подавая инертный газ или реагенты на вводы и выполняя их откачку на выводах осуществляется проведение групповых операций. Недостатком указанного подхода является небольшая удельная площадь поверхности применяемых подложек с колодцами и микроперфорациями, сравнимая с площадью гладкого стекла.

Кроме того, в указанных приборах для групповой подачи реагентов используется отдельное устройство проточной кюветы, накрывающее подложку и обеспечивающее одновременную подачу и откачку реагентов. Это усложняет конструкцию прибора, поскольку закрывающая крышка должна обеспечивать герметичность и при этом не смещать подложку или модуль для ее размещения с места.

В отличие от указанных прототипов в заявляемом изобретении синтез ведется на нанопористых подложках, имеющих площадь удельной поверхности на 2-3 порядка больше (в зависимости от толщины подложки, диаметра пор и межпорового расстояния) по сравнению с гладкими стеклами и микроколодцами в кремнии. Подложки находятся в модуле размещения подложек, который позволяет с помощью вакуума по требованию выполнять откачку жидкости из пор подложки. Реагенты наносятся при помощи пьезоэлектрических или игольчатых дозаторов. Пьезодозаторы обеспечивают дозирование объемами десятки и сотни пиколитров, в то время как через игольчатые дозаторы подаются микро- и миллилитровые объемы реагентов для выполнения групповых операций заливки и промывки. Жидкость из емкостей с реагентами подается в игольчатые и пьезоэлектрические дозаторы при помощи многоканальной шприцевой станции. В отличие от прототипов игольчатые и пьезоэлектрические дозаторы расположены на печатающей каретке, которая перемещается внутри принтера с высокой точностью, обеспечиваемой при помощи контроля перемещения по магнитным линейкам. Помимо модуля размещения подложки и подвижной печатающей каретки внутри принтера располагаются модули промывки и просушки дозаторов, обеспечивающие возможность очистки дозаторов от кристаллов реагентов, образующихся в ходе испарения растворителя с кончика дозатора. Также в принтере находятся «стробоскопическая» и «обзорная» камеры, служащие для настройки параметров печати пьезодозаторами (подбор напряжения и длительности управляющего импульса для формирования капель нужного объема, скорости и т.д.) и точного определения координат спотов.

Для сокращения делеционных фрагментов олигонуклеотидов из-за неполного перекрытия капель подаваемых из разных пьезодозаторов в системе используется специальная процедура формирования спотов.

Технический результат заключается в повышении плотности массивов олигонуклеотидов и увеличения масштаба синтеза.

Технический результат достигается за счет прецизионного перемещения печатающей каретки, обеспечивающей дозирование реагентов в пиколитровых (пьезоэлектрические дозаторы) или микролитровых (игольчатые дозаторы) количествах, а также специальной процедуры калибровки системы пьезоэлектрического дозирования с использованием стробоскопической и обзорной камер, определяющих точные координаты спотов, минимальные и максимальные объемы пьезоэлектрического дозирования, отклонение координат капель ±Δxy, а также область спота, в которой обеспечивается воспроизводимое перекрытие капель со всех дозаторов, и принципа формирования спотов, позволяющего сократить количество делеционных фрагментов.

Также результат достигается за счет синтеза на нанопористых подложках, имеющих поры канального типа, не позволяющие каплям реагентов растекаться в горизонтальной плоскости внутри подложки, а также за счет конструкции системы синтезатора, позволяющей располагать и фиксировать тонкие пористые подложки с низкой механической прочностью и, в то же время, производить удаление реагентов из пор путем вакуумной откачки.

Система автоматического синтеза олигонуклеотидов представляет собой принтер с герметичной камерой и расположенными внутри модулями для размещения подложек, стробоскопической и обзорной камерами, вспомогательными модулями промывки и просушки дозаторов; стойки управления с блоком управления принтером, управляющий компьютером с программным обеспечением для управления системой отличается тем, что шприцевая станция обеспечивает подачу реагентов по трубкам в пьезодозаторы либо игольчатые дозаторы расположенные на печатающей каретке.

Способ синтеза библиотек олигонуклеотидов системой заключается в циклической подаче реагентов из емкостей шприцевой станции на печатающую каретку перемещающеюся по осям координатографа, из которой происходит дозирование на поверхность функционализированной пористой подложки, для прецизионной подачи пьезодозаторами осуществляют дозирование пиколитровыми объемами, а дозирование микролитровыми объемами осуществляют игольчатами дозаторами, после протекания химической реакции реагенты удаляют с подложки с помощью вакуумного контура в модуле размещения подложек.

Процедура калибровки осуществляется следующим образом: «Стробоскопическая камера» фиксирует объемы и скорости полета капель, наличие или отсутствие сателлитов, траектории полета капель и сателлитов при различных напряжениях и длительностях управляющего импульса на пьезокристалле, в результате чего определяется диапазон режимов стабильной печати. Далее формируется калибровочный массив спотов, и «Обзорная камера» фиксирует точные координаты и размеры спотов от разных дозаторов, сформированных при различных режимах из диапазона стабильной печати, определяются минимальные и максимальные отклонения координат спотов.

В программном обеспечении управляющего компьютера определение контуров капель и спотов и их координат выполняется следующим образом: выполняется повышение контраста и бинаризация изображения с заранее установленным порогом бинаризации, подобранным таким образом, чтобы бинарное изображение наилучшим образом соответствовало изображению спота/капли и шум от посторонних объектов был минимален. Далее выполняется поиск контуров и их аппроксимация эллипсом при помощи функций findContours и fitEllipse из библиотеки OpenCV, при этом определяются и координаты эллипсов. Поскольку по входному изображению со стробоскопической камеры возможно определение только двух полуосей эллипсоида (a,b), значение третей полуоси (с) берется таким же, как и значение горизонтальной полуоси. Тогда объем капли рассчитывается как V=4×π×a×b×c/3. Скорость капель определяется при помощи изменения задержки стробирующего подсвета относительно управляющего импульса, в результате чего получаются два изображения в разные моменты времени (соответствующие задержке Δt), обработка которых по описанному выше алгоритму позволяет получить изменение координаты Δy и, соответственно, скорости капли u= Δy/Δt.

Для снижения делеционных фрагментов за счет неполного перекрытия капель применяется следующий способ: капля раствора амидофосфита, формирующая первую «букву» в синтезируемой цепочке олигонуклеотида, дозируется в меньшем объеме, обычно на 30 %, за счет установки параметров управляющего импульса (из определенного в ходе калибровки диапазона режимов стабильной печати), по сравнению с объемами растворов амидофосфитов на последующих циклах (фиг.1). Затем, на стадии кэпирования блокируются все области вокруг спота, где не прошла реакция; растворы амидофосфитов с последующих циклов перекрывают спот с первой «буквой», в результате чего в области пересечения полностью проходит реакция конденсации, а за пределами области пересечения все цепи заблокированы во время стадии кэпирования и конденсация не происходит.

В заявляемом изобретении предлагается система автоматического синтеза олигонуклеотидов (фиг.2), использующая в качестве подложек для синтеза функционализированные универсальным линкером или стартовым нуклеотидом нанопористые мембраны, такие как пористый анодированный оксид алюминия или трековые мембраны, имеющие поры канального типа, не позволяющие каплям реагентов растекаться в горизонтальной плоскости внутри подложки, за счет чего обеспечивается высокая плотность спотов (до 2500 шт/см², а в случае дозирования реагентов единицами пиколитров и выше), а также имеющих большую удельную площадь поверхности, соответственно и большие масштабы синтеза олигонуклеотидов при том же количестве затраченных реагентов. В зависимости от режимов создания таких подложек обеспечивается увеличение площади удельной поверхности на 2-3 порядка по сравнению с гладкими стеклами или микроперфорированными кремниевыми пластинами. Для выполнения синтеза на таких материалах в модуле размещения подложек обеспечивается механический упор подложек, поскольку, при малой толщине порядка 100 мкм подложки не обладают достаточной механической прочностью. Кроме того, упор также выполнен из пористого материала и обеспечивает прохождение газов и жидкостей сквозь него. Для обеспечения протекания реакции в инертной среде стол координатографа с расположенными на нем модулями закрыт герметичной крышкой (фиг. 3). Нанесение пиколитровых объемов реагентов (100-800 пл) выполняется при помощи пьезоэлектрических дозаторов на стадии конденсации, а групповые операции на остальных стадиях выполняются из игольчатых дозаторов микролитровыми объемами. Подача реагентов из емкостей в пьезоэлектрические или игольчатые дозаторы выполняется по трубкам при помощи шприцевой станции, состоящей из нескольких шприцевых дозаторов, при этом каждый шприцевой дозатор снабжен автоматическим многоходовым клапаном, имеющим различные варианты коммутации: вход - шприц, шприц - выход, вход - выход. Ко входам трубками обычно подсоединены емкости для реагентов, а к выходам - дозаторы. Для точного позиционирования печатающей каретки, включающей пьезоэлектрические и игольчатые дозаторы, система включает высокоточный координатограф. Высокая точность перемещения достигается за счет отслеживания и коррекции перемещения при помощи магнитных линеек (имеющих магнитные метки с шагом в 1 мкм), логика работы которых реализуется платой управления, расположенной в блоке управления.

Пьезоэлектрический дозатор, по конструкции аналогичный описанному в патентах [US 6179584B1, PCT/DE97/02874], представляет собой тонкий канал шириной и глубиной порядка 60 мкм вытравленный в кремниевой пластине и закрытый сверху стеклянной или кремниевой крышкой, имеющий рядом с выходным отверстием (соплом) расширение - резонаторную камеру, с обратной стороны которой присоединен пьезокристалл с верхним и нижним электродами. Стенка между пьезокристаллом и резонаторной камерой имеет толщину порядка 100 мкм и служит мембраной, передающей колебания пьезокристалла в камеру резонатора, создаваемые подачей электрических импульсов на электроды пьезокристалла. Импульсы прямоугольной формы имеют такую амплитуду и длительность, чтобы создавать затухающие колебания в жидкости, находящейся в камере резонатора, и приводить к выходу столба жидкости из сопла с последующим отрывом капли.

Точность дозирования предварительно определяется при помощи «стробоскопической» и «обзорной» камер, с которых изображение передается на компьютер в программное обеспечение. Контроль стабильности вылета капель, а также измерение объемов и траектории полета капель обеспечивается при помощи камеры со стробоскопическим подсветом («стробоскопической камеры»). Драйвер управления пьезодозатором, расположенный в блоке управления принтером, подает управляющий импульс на пьезодозатор, чем обеспечивает вылет капли, и, с некоторой регулируемой задержкой подаются два синхроимпульса запускающих камеру и подсвет. В результате камера фиксирует кадр изображения капли в заданный момент времени. Регулируя длительность задержки синхроимпульса подсвета и камеры, можно фиксировать вылет капель в разные моменты времени. При стабильном вылете капель кадры, полученные с одинаковыми задержками, выглядят одинаково, что говорит о хорошей повторяемости дозирования капель. Измерение характеристик капель при разных амплитудах и длительностях управляющего импульса позволяет определить диапазон рабочих режимов и подобрать оптимальные характеристики при печати.

Обеспечение попадания капель из разных дозаторов в одно и то же место достигается при помощи «обзорной камеры», расположенной на каретке с печатающими головками. После установки печатающих головок, перед процессом синтеза выполняется процедура калибровки, заключающаяся в точном определении координат спотов от всех дозаторов, нанесенных на гладкую ровную поверхность. Изображение спотов фиксируется обзорной камерой и передается в программное обеспечение на управляющий компьютер, где происходит автоматическая обработка изображения с выделением координат всех спотов и определяется величина поправки координат каждого дозатора, автоматически учитываемая программным обеспечением во время печати. Калибровка позволяет рассчитать минимальные расстояния между спотами, при которых не будет происходить перекрестное загрязнение, для обеспечения наибольшей плотности массива. Кроме того, в совокупности со стробоскопическим контролем вылета капель калибровка с помощью обзорной камеры позволяет установить разброс вылета капель и область спота, в которой обеспечивается воспроизводимое перекрытие капель со всех дозаторов. Эта зона меньше размера спота обычно на 8-10 %.

В системе, для создания больших массивов спотов олигодезоксирибонуклеотидов или олигорибонуклеотидов, включающих 4 нуклеозидных звена (аденин, гуанин, цитозин, тимин (или урацил)), должно быть установлено не менее пяти игольчатых и не менее пяти пьезодозаторов. Раствор активатора конденсации амидофосфитов - такого как 5-(этилтио)тетразол, также желательно подавать через отдельный пьезоэлектрический дозатор в споты, куда подается пришиваемый амидофосфит.

В случае, если не требуется создавать массивы высокой плотности, синтез можно выполнять в планшете для синтеза, тогда дозирование всех реагентов может осуществляться только через игольчатые дозаторы.

Примером синтетического цикла, обеспечивающего удлинение цепи олигонуклеотида на одно нуклеозидное звено, который может быть использован в системе автоматического синтеза олигонуклеотидов, является стандартный протокол синтеза, включающий следующие стадии: деблокирование, конденсацию, кэпирование и окисление. На стадии деблокирования под действием раствора кислоты, подаваемого на подложку из игольчатого дозатора, происходит удаление диметокситритильной защиты с удлиняемых цепей внутри пор подложки. На стадии конденсации из пьезоэлектрических дозаторов адресно в спот подается раствор необходимого амидофосфита и раствор активатора конденсации. На стадии кэпирования выполняется подача из игольчатых дозаторов раствора ангидрида (уксусный, пропионовый и т.п.) и раствора катализатора (1-метилимидазол, 4-диметиламинопиридин и т.п.), обеспечивающие блокирование непрореагировавших на стадии конденсации гидроксильных групп. На стадии окисления из игольчатого дозатора выполняется подача окислителя - раствор йода с водой и пиридином в тетрагидрофуране, обеспечивающие окисление фосфита в фосфотриэфир.

Для снижения количества делеционных олигонуклеотидов в системе используется нижеописанный принцип формирования спотов (фиг. 1): а - исходная подложка с привитым по всей поверхности универсальным линкером; б - споты, сформированные в первом цикле с меньшей площадью за счет уменьшенного объема дозирования на 30 %; в - споты с амидофосфитами второго цикла, полностью перекрывающие споты первого цикла; г - споты с амидофосфитами третьего цикла и т.д.

Капля раствора амидофосфита, формирующая первую «букву» в синтезируемой цепочке олигонуклеотида, дозируется в меньшем объеме (обычно на 30 %), по сравнению с объемами растворов амидофосфитов на последующих циклах; на стадии кэпирования блокируются все области вокруг спота, где не прошла реакция; растворы амидофосфитов с последующих циклов перекрывают спот с первой «буквой», в результате чего в области пересечения полностью проходит реакция конденсации, а за пределами области пересечения все цепи заблокированы на стадии кэпирования и конденсация не происходит.

При перерывах печати между циклами на выходном отверстии пьезодозаторов, в результате испарения растворителя может образоваться осадок растворенного вещества (амидофосфиты, активатор конденсации), что может снизить качество печати. Для устранения загрязнений в системе предусмотрен модуль промывки дозаторов (8), представляющий собой набор индивидуальных лунок под каждый дозатор, через которые по запросу происходит подача чистого растворителя, омывающего наружную поверхность пьезодозаторов. Загрязненная жидкость удаляется из модуля промывки при помощи насоса. После промывки с кончиков дозаторов удаляются капли жидкости путем промакивания дозаторов в безворсовую салфетку на мягком основании модуля просушки дозаторов (9).

На фиг. 2 приведен пример реализации общего вида системы автоматического синтеза олигонуклеотидов, включающего 1 - принтер, 2 - стойку управления и 3 - управляющий компьютер.

На фиг. 3 приведен внешний вид принтера с герметичной крышкой.

На фиг.4 приведен вид принтера со снятой герметичной крышкой. На столе координатографа видно расположение отдельных модулей: 4 - модули для размещения круглых подложек, 5 - печатающая каретка с пьезодозаторами или игольчатыми дозаторами и подсоединенными трубками подачи реагентов, 6 - обзорная камера, 7 - стробоскопическая камера, 8 - модуль промывки дозаторов, 9 - модуль просушки дозаторов, 10 - стол координатографа.

На фиг. 5 приведен внешний вид стойки управления системой: 11 - блок управления, 12 - шприцевая станция, 13 - емкости с реагентами.

Растворы реагентов из емкостей (13) при помощи шприцевой станции (12) подаются по трубкам в игольчатые, либо пьезоэлектрические дозаторы, расположенные на печатающей каретке (5), откуда происходит их дозирование на поверхность функционализированной пористой подложки, расположенной на модуле для размещения подложек (4). После протекания химической реакции реагенты удаляются с подложки с помощью вакуума в вакуумном контуре, присоединенного через фланец к модулю размещения подложек (4) и включаемого/отключаемого при помощи управляемого клапана, расположенного внутри блока управления (11).

Печатающая каретка (5) перемещается с высокой точностью за счет того, что по всем осям присутствуют магнитные линейки, постоянно фиксирующие координаты перемещения и передающие их на плату управления, которая, при необходимости, корректирует положение печатающей каретки. Дозирование реагентов из игольчатых дозаторов осуществляется путем перемещения поршня шприцевого дозатора, соединенного трубкой с нужным дозатором, расположенного в шприцевой станции (12). Дозирование реагентов из пьезоэлектрических дозаторов осуществляется путем подачи импульса напряжения на пьезокристалл пьезодозатора. Амплитуда и длительность импульса задаются драйвером управления пьезодозаторами, расположенного в блоке управления (11). При необходимости выполняется оценка качества капель: фиксируется наличие/отсутствие сателлитов, отклонение и скорость капель при помощи стробоскопической камеры (7). Для этого нужный пьезодозатор перемещается в область фокуса стробоскопической камеры (7) между камерой и стробоскопическим подсветом. Драйвер управления пьезодозаторами подает импульс на пьезодозатор и синхроимпульс на камеру и стробоскопический подсвет в результате чего фиксируется вылет капли. Попадание капель из разных пьезодозаторов в одно и то же место достигается с помощью процедуры калибровки: сначала, изменяя длительности и амплитуды управляющих импульсов определяется диапазон режимов стабильного вылета капель для каждого дозатора, после чего устанавливаются точные координаты спотов, полученных от разных дозаторов. Споты от всех дозаторов фиксируются обзорной камерой (6), расположенной на печатающей каретке, после чего выполняется обработка изображения и определяются координаты всех спотов относительно первого дозатора, после чего указанная информация используется для точного задания координат всех пьезодозаторов.

Синтез выполняется в атмосфере инертного газа, для чего принтер закрыт герметичной крышкой (фиг. 3), а внутрь подается инертный газ через управляющий клапан, расположенный в блоке управления (11).

Программное обеспечение системы позволяет управлять всеми узлами системы, составлять сценарии при помощи скриптового языка, а также переводить записанные последовательности массивов олигонуклеотидов в сценарии синтеза на основе заданных протоколов.

Для подтверждения работы устройства и анализа ошибочности выполнен синтез массива 35 последовательностей олигонуклеотидов фрагмента гена интерлейкина-2, приведенных в таблице 1. Массив создавался с трехкратным повторением (всего 3×35=105 спотов).

Таблица 1 - Синтезированные последовательности ДНК-олигонуклеотидов для сборки фрагмента гена интерлейкина-2

Шифр олигонуклеотида Последовательность олигонуклеотида в направлении 5'→3' >IL2_LCA_1 ATGGCACCTACTTCAAGTTC >IL2_LCA_2 TACAAAGAAAACACAGCTACAACT >IL2_LCA_3 GGAGCATTTACTTCTGGATTTACA >IL2_LCA_4 GATGATTTTGAATGGAATTAATAATTACAAG >IL2_LCA_5 AATCCCAAACTCACCAGGATG >IL2_LCA_6 CTCACATTTAAGTTTTACATGCCC >IL2_LCA_7 AAGAAGGCCACAGAACTGAAA >IL2_LCA_8 CATCTTCAGTGTCTAGAAGAAGAAC >IL2_LCA_9 TCAAACCTCTGGAGGAAGTG >IL2_LCA_10 CTAAATTTAGCTCAAAGCAAAAACTTT >IL2_LCA_11 CACTTAAGACCCAGGGACTTAA >IL2_LCA_12 TCAGCAATATCAACGTAATAGTTCT >IL2_LCA_13 GGAACTAAAGGGATCTGAAACAAC >IL2_LCA_14 ATTCATGTGTGAATATGCTGATGA >IL2_LCA_15 GACAGCAACCATTGTAGAATTTCT >IL2_LCA_16 GAACAGATGGATTACCTTTTGTCAA >IL2_LCA_17 AGCATCATCTCAACACTAACT >IL2_LCA_18 GTTTTCTTTGTAGAACTTGAAG >IL2_LCA_19 AGTAAATGCTCCAGTTGTAGCTGT >IL2_LCA_20 CCATTCAAAATCATCTGTAAATCCAGA >IL2_LCA_21 GTTTGGGATTCTTGTAATTATTAATT >IL2_LCA_22 CTTAAATGTGAGCATCCTGGTGA >IL2_LCA_23 GTGGCCTTCTTGGGCATGTAAAA >IL2_LCA_24 ACACTGAAGATGTTTCAGTTCT >IL2_LCA_25 AGAGGTTTGAGTTCTTCTTCTAG >IL2_LCA_26 TGAGCTAAATTTAGCACTTCCTCC >IL2_LCA_27 GGTCTTAAGTGAAAGTTTTTGCTT >IL2_LCA_28 TTGATATTGCTGATTAAGTCCCTG >IL2_LCA_29 CCCTTTAGTTCCAGAACTATTACG >IL2_LCA_30 TCACACATGAATGTTGTTTCAGAT >IL2_LCA_31 ATGGTTGCTGTCTCATCAGCATAT >IL2_LCA_32 ATCCATCTGTTCAGAAATTCTACA >IL2_LCA_33 AGATGATGCTTTGACAAAAGGTA >IL2_LCA_34 TAGGTGCCAT >IL2_LCA_35 AGTTAGTGTTG

Синтез велся на функционализированной подложке пористого анодированного оксида алюминия. Растворы амидофосфитов dA, dT, dC, dG и активатора 5-(этилтио)тетразола раскапывались при помощи пьезоэлектрических дозаторов, а детритилирующий агент (2% раствор дихлоруксусной кислоты в толуоле), промывочный растворитель (ацетонитрил), раствор окислителя (0,02 М раствор I₂ в смеси тетрагидрофуран/пиридин/вода (88/10/2, v/v/v)) подавались с помощью игольчатых дозаторов.

Синтетический цикл для конденсации одного основания к растущей цепи включал следующие стадии:

1. Детритилирование (3 повтора)

2. Промывка (3 повтора)

3. Конденсация (амидофосфит+активатор) (3 повтора)

4. Окисление (3 повтора)

5. Промывка (3 повтора)

В конце проводилось общее детритилирование, с целью получения 5'-незащищенных олигонуклеотидов.

Удаление массива олигонуклеотидов с поверхности подложки проводили водным раствором аммиака. Удаление защитных групп с экзоциклических аминогрупп азотистых оснований синтезированных олигонуклеотидов выполняли водным раствором метиламина. После концентрирования и очистки раствор смеси олигонуклеотидов использовался для проведения полимеразной цепной сборки. Для этого к раствору были добавлены концевые праймеры, ДНК-полимераза (transstart fast pfu fly), набор трифосфатов и буфер. Сборку фрагмента гена вели следующим образом: 98°С 1 мин, 20×(98°С 10 сек, 40°С 5 сек, 72°С 3 сек); последующую амплификацию: 30×(98°С 10 сек, 53°С 5 сек, 72°С 3 сек), 72°С 1 мин. Продукт сборки и амплификации анализировали методом гель-электрофореза в агарозном геле. На электрофореграмме присутствовал только один фрагмент с целевой длиной 404 н.т. Полученный ампликон, соответствующий длине собираемого фрагмента гена, был реамплифицирован еще раз с праймерами (IL2_F_EcoRI CTATTGgaattc ATGGCACCTACTTCAAGTTCTAC, IL2_R_HindIII TCCTATaagctt AGTTAGTGTTGAGATGATGCTTTGAC, несущими сайты рестрикции EcoRI и HindIII, для его дальнейшего клонирования в вектор. В качестве вектора для клонирования исследуемого образца фрагмента гена использовали плазмиду pUC19 от Sibenzyme. Очищенные лианеризованный вектор и фрагмент гена интерлейкина-2, содержащие липкие концы, лигировали между собой. После, полученной лигазной смесью трансформировали электрокомпетентные клетки E. coli NovaBlue. После чего клетки подращивали в 1 мл LB-среды без антибиотика, 1 ч при 37°С и качании. Далее суспензию центрифугировали 4 мин 2000 g, осадок наносили на чашку Петри с твердой LB-средой, содержащей антибиотик ампициллин 0,1 мг/мл. В пробирки помещали по 3 мл LB, 3 мкл водного раствора ампициллина 100 мг/мл, 50 мкл суспензии клеток, содержащих плазмиду с целевой вставкой. Инкубацию клеток вели 15 ч при 37°С. После чего выделяли плазмиды из подращенных клонов. Далее с каждой плазмиды, содержащей вставку, с помощью праймеров М13 был амплифицирован интересующий фрагмент вектора, все ампликоны были секвенированы методом Сэнгера.

По итогам секвенирования было установлено, что два клона содержали полностью корректный фрагмент гена интерлейкина-2, четыре были с одной, два с двумя и один с тремя ошибками, выравнивание проанализированных последовательностей на референсную последовательность представлено на фиг. 6. Статистический анализ результатов секвенирования показал, что устройство позволяет по описанному протоколу синтезировать олигонуклеотиды, обеспечивающие во время сборки относительную частоту ошибки 3,04 на 1000 п. о.

Изобретение относится к устройствам для молекулярной биологии, генной инженерии, медицины и биотехнологии и предназначено для синтеза библиотек олигонуклеотидов плотностью до 2500 спотов/см² в автоматическом режиме. Система автоматического синтеза олигонуклеотидов состоит из принтера с герметичной камерой; стойки управления с блоком управления принтером, шприцевой станцией и емкостями с реагентами и управляющего компьютера с программным обеспечением для управления системой. Внутри герметичной камеры принтера расположена печатающая каретка с подсоединенными трубками подачи реагентов и расположенными на печатающей каретке игольчатыми и пьезоэлектрическими дозаторами и обзорной камерой. На столе координатографа в герметичной камере принтера расположены модули для размещения подложек, стробоскопическая камера, модуль промывки дозаторов и модуль просушки дозаторов. Перед синтезом библиотек выполняют калибровку. Осуществляют циклическую подачу реагентов из емкостей шприцевой станции по трубкам в игольчатые либо пьезоэлектрические дозаторы. После протекания химической реакции реагенты удаляют. Группа изобретений обеспечивает повышение плотности массивов олигонуклеотидов и увеличение масштаба синтеза. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл.

1. Система автоматического синтеза олигонуклеотидов, характеризующаяся тем, что состоит из принтера с герметичной камерой; стойки управления с блоком управления принтером, шприцевой станцией и емкостями с реагентами и управляющего компьютера с программным обеспечением для управления системой, при этом внутри герметичной камеры принтера расположена печатающая каретка с подсоединенными трубками подачи реагентов и расположенными на печатающей каретке игольчатыми и пьезоэлектрическими дозаторами и обзорной камерой; на столе координатографа в герметичной камере принтера расположены модули для размещения подложек, стробоскопическая камера, модуль промывки дозаторов и модуль просушки дозаторов.

2. Способ синтеза библиотек олигонуклеотидов системой по п.1, характеризующийся тем, что перед синтезом выполняют процедуру калибровки, затем осуществляют циклическую подачу реагентов из емкостей шприцевой станции по трубкам в игольчатые либо пьезоэлектрические дозаторы, расположенные на печатающей каретке, перемещающейся по осям координатографа, из которой происходит дозирование на поверхность функционализированной нанопористой подложки, расположенной на модуле для размещения подложек, при этом для прецизионной подачи пьезодозаторами осуществляют дозирование пиколитровыми объемами, а дозирование микролитровыми объемами осуществляют игольчатами дозаторами, после протекания химической реакции реагенты удаляют с подложки с помощью вакуумного контура в модуле размещения подложек; процедура калибровки заключается в том, что стробоскопическая камера фиксирует объемы и скорости полета капель при различных напряжениях и длительностях управляющих импульсов на пьезодозаторах, в результате чего определяется диапазон режимов стабильного вылета капель, затем со всех пьезодозаторов формируется калибровочный массив спотов из диапазона режимов стабильного вылета капель, споты фиксируются обзорной камерой и определяются их точные размеры и координаты и выполняется программная коррекция положения каждого пьезодозатора.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что печать первого слоя осуществляется с объемом реагентов амидофосфитов на 30 % меньше, чем в последующих циклах нанесения амидофосфитов.