Способ получения подложки для массового параллельного синтеза олигонуклеотидов Российский патент 2024 года по МПК B01J19/00 C12N15/10 C07H1/00 

Изобретение относится к области синтетической биологии и представляет пористый твердотельный носитель для массового параллельного синтеза олигонуклеотидов и их аналогов методами адресного дозирования.

Массовый параллельный синтез на пористой подложке может осуществляться с использованием технологий струйной печати. Из работы [LeProust E.M. et al. Synthesis of high-quality libraries of long (150mer) oligonucleotides by a novel depurination controlled process // Nucleic acids research. – 2010. – V. 38. – No. 8. – P. 2522-2540.] известно, что компания Agilent использует для массового параллельного синтеза олигонуклеотидов принцип струйной пьезоэлектрической печати на поверхности гладких стекол. Струйное дозирование осуществлялось только для растворов амидофосфитов, в то время как остальные реагенты подавались на поверхность подложки, расположенной в проточной ячейке, сплошной заливкой. При таком способе наблюдается большой расход реагентов для работы с проточной ячейкой. Так, для единичной промывки подложки размером 6×6 дюйма уходит 3×20 мл (тройное замещение) ацетонитрила, на одну промывку, которых в ходе присоединения одного нуклеотидного звена может быть до 4, соответственно, на синтез массива с количеством нуклеотидных звеньев 100 требуется почти 24 литра ацетонитрила.

В настоящее время в лабораториях олигонуклеотидные последовательности синтезируют с использованием планшетных, либо колоночных синтезаторов, отличающихся тем, что в ячейки планшета (или колонки) загружается твердотельный носитель, представляющий собой гранулы пористого стекла с контролируемым размером пор (CPG), либо полимерные гранулы (полистирол, силикагель, Порасил, полиакриламид). Количество колонок, либо ячеек в одном планшете ограничено и не превышает 384. Большинство планшетных синтезаторов работает с 96 луночными планшетами, как, например, синтезатор Биоссет, описание принципа работы которого приведено в патенте RU 88021 «Аппарат для синтеза олиго(поли)нуклеотидов». Таким образом, чтобы обеспечить синтез хотя бы 10000 олигонуклеотидов, потребуется многократный запуск прибора. При среднем времени синтеза одной партии 12 часов, на синтез 10 000 олигонуклеотидов с использованием одного прибора потребуется около двух месяцев. Кроме того, колоночные и планшетные синтезаторы ведут синтез в нано- и микромолярном масштабе даже в тех случаях, когда требуемые количества олигонуклеотидов составляют всего лишь пико- или даже фемтомоль. Такое ограничение связано с тем, что реагенты в таких синтезаторах находятся под давлением, создаваемым газом (обычно гелий), а дозирование осуществляется при помощи открытия и закрытия прецизионных клапанов [US4517338A], скорость переключения которых, однако, не позволяет формировать объемы жидкостей менее 1–2 мкл.

Снижение объема дозируемой жидкости можно достичь при переходе на пьезоэлектрическое дозирование, где минимальные объемы капель могут достигать 1 пл и менее, что в пределе на 6 порядков меньше, по сравнению с дозированием соленоидными клапанами. Однако при работе с объемами в 1 пл возникают сложности повторяемости позиционирования, поскольку капли различных реагентов, обеспечивающих цикл синтеза, должны строго попадать на одни и те же участки твердофазного носителя. При диаметре капель 12–13 мкм, что соответствует объему дозируемой жидкости 1 пл, точность и повторяемость перемещений печатающей головки должны быть не хуже 0,5 мкм, что достаточно сложно обеспечить на практике, особенно в условиях печати при непрерывно движущейся головке с дозаторами. Оптимальный объем дозирования, при котором будет обеспечиваться хорошая повторяемость, составляет 400 пл и более, тогда диаметр капли будет составлять 100 мкм и более, а требуемая точность и повторяемость перемещений печатающей головки должна быть не хуже 3–5 мкм (для достижения 95 % перекрытия).

Наиболее близким аналогом предлагаемого изобретения являются патенты US 10744477 B2 и US 10669304 B2 компании TWIST BIOSCIENCE CORPORATION, описывающие устройства и методы для синтеза библиотек олигонуклеотидов. В патентах описываются подложки из кремния, в которых вытравлены массивы углублений диаметром 50 мкм. На дне каждого углубления располагается массив вертикальных пор диаметром порядка 5 мкм. Форма сечения пор может варьироваться от круглых до сложных зигзагообразных для облегчения протекания жидкости. Для синтеза на таких подложках применяется технология струйной принтерной печати. Общим недостатком таких подложек является малая площадь поверхности, поскольку при заявленной толщине перфорированного слоя в 30 мкм поры диаметром 5 мкм вносят лишь небольшой вклад в увеличение удельной площади и можно считать, что синтез проводится на поверхности углублений.

По сравнению с аналогами предлагаемое изобретение отличается более высокой суммарной площадью поверхности, поскольку при электрохимическом росте пористой подложки диаметр пор может быть на 1–3 порядка меньше, чем заявленные 5 мкм у аналога, а высота пористого слоя составлять 100–150 мкм. Кроме того, изобретение отличается простотой изготовления и низкой стоимостью материала, поскольку для создания пористой подложки не требуются дорогостоящие процессы химического нанесения из паровой фазы (CVD, ALD, MOCVD и др), литографии, плазмохимического травления и других вакуумных технологий. Поры в процессе анодирования образуются естественным образом и, при соблюдении потенциостатического режима в процессе всего цикла роста, постоянным остается диаметр пор и межпоровое расстояние. Функционализация поверхности пор может осуществляться любым известным методом, например, через силаны (R-алкилтриэтоксисилан, R-алкилтриметоксисилан и т.п, где под R понимается амино-, гидрокси-, альдегидо-, карбокси-, галогенильная группа), обеспечивающая, либо присоединение следующего функционализирующего агента, либо прямое присоединение амидофосфитной группы.

В изобретении предлагается в качестве твердофазного носителя использовать функционализированные пористые подложки с вертикальным расположением пор для массового параллельного синтеза олигонуклеотидов методами адресного дозирования малых объемов реагентов. При этом поры формируются непересекающимися. Такое расположение пор на всю глубину подложки не даст увеличиваться площади пятна по мере проникновения жидкости вглубь пор и позволит локализовать все протекающие процессы внутри пор.

Наличие пор позволит обеспечить нанесение капель реагентов с одной стороны подложки и удаление продуктов реакции и растворителя путем вакуумной откачки – с другой стороны. Синтез олигонуклеотидов будет обеспечиваться на внутренней поверхности пор, а их строго вертикальное расположение не допустит перемешивание реагентов между соседними спотами. В этом случае обеспечивается практически полная совместимость с протоколами и реагентами, используемыми в стандартных колоночных или планшетных синтезаторах, что позволит в пределах одной лаборатории иметь синтезаторы разных типов (колоночные, планшетные, струйные), но работающих на одной реагентной базе.

В качестве подложек для синтеза предлагается использовать пористый анодированный оксид алюминия. В результате анодирования в кислотных электролитах при постоянном напряжении образуется пористая структура с вертикальным расположением пор, причем, при определенных режимах анодирования поры растут упорядоченно. Напряжение анодирования и состав электролита обеспечивают рост пор с заданным межпоровым расстоянием и диаметром пор и может варьироваться от единиц до сотен нанометров. Описание синтеза таких подложек имеется в литературе [Masuda H., Yada K., Osaka A. Self-ordering of cell configuration of anodic porous alumina with large-size pores in phosphoric acid solution // Japanese Journal of Applied Physics. – 1998. –V. 37. – No. 11A. – P. L1340; Masuda H. et al. Ordered mosaic nanocomposites in anodic porous alumina //Advanced materials. – 2003. – V. 15. – No. 2. – P. 161-164; Белов А.Н., Гаврилов С.А., Шевяков В.И. Особенности получения наноструктурированного анодного оксида алюминия // Российские нанотехнологии. – 2006. – Т. 1. – №. 1-2. – С. 223-227] и в патентах RU 2405621, RU 2724308, RU 2474466, RU 2678055 и др. Обычно анодирование с целью получения ПАОА выполняется только на одной стороне листа алюминия, противоположная сторона закрыта кислотостойким резистом, или заклеена гальванотехнической лентой, или конструкция ванны предусматривает контакт с электролитом только одной стороны пластины алюминия. После стравливания алюминия и барьерного слоя пористый оксид может подвергаться термическому отжигу в печи с повышением температуры выше 1150 °С для перевода оксида алюминия в α-фазу [Brown I. W. M. et al. Structural and thermal characterisation of nanostructured alumina templates //Current Applied Physics. – 2006. – V.6. – No.3. – P.557-561]. После функционализации подложек якорными группами, например, растворами 3-аминопропилтриэтоксисилана (АПТЭС, или подобным), янтарного ангидрида и универсального линкера (или стартового нуклеозида) они становятся пригодными для твердофазного синтеза.

Преимущество использования таких подложек заключается в том, что обеспечивается синтез с высокой плотностью спотов, реагенты распределяются равномерно по каналам и отсутствует эффект «кофейного пятна» – концентрации реагентов по периметру при высыхании капли, обеспечивается совместимость с реагентами и протоколами для классических синтезаторов, поскольку смыв реагентов может выполняться через подложку, повышается выход конечного продукта за счет протекания реакции в условиях синтеза на поверхности нанометровых пор одинаковых размеров. К тому же стоимость пористых подложек, изготовленных методом анодирования, существенно ниже, по сравнению с подложками изготовленными методами фотолитографии, вакуумного осаждения, ионного травления и т.п.

Технический результат заявляемого изобретения заключается в получении подложек с пористой структурой, вертикальным расположением пор и заданным межпоровым расстоянием и наличием функциональных групп на поверхности пор, обеспечивающие ковалентное присоединение нуклеотидов в процессе синтеза с адресным дозированием малых количеств реагентов такими методами, как струйная печать, аэрозольная печать, капиллярное нанесение и др.

Технический результат достигается тем, что подложки синтезируются в потенциостатическом режиме при температуре от 0 до 10 °С, что обеспечивает рост пор с заданным диаметром и межпоровым расстоянием. После стравливания алюминия и барьерного слоя оксид алюминия переводится в устойчивую α-фазу путем нагрева до температуры фазового перехода, после чего выполняется один из вариантов функционализации подложки, например, с последовательным выдерживанием в растворах аминопропилтриэтоксисилана, янтарного ангидрида и универсального линкера (либо стартового нуклеозида), либо с последовательным выдерживанием в растворе 3-глицидоксипропилтриметоксисилана, аминокапроновой кислоты и универсального линкера (либо стартового нуклеозида).

Подложка из пористого анодированного оксида алюминия формируется в процессе анодирования в кислотном электролите (состав электролита и условия анодирования зависят от требуемого диаметра пор), после чего удаляется слой алюминия и стравливается барьерный слой. Полученная подложка отжигается при температуре не ниже 1150 °С для осуществления процесса рекристаллизации. После этого по периметру подложки фиксируется полиэтиленовый бортик методом плавления. После этого подложки функционализируются аминопропилтриэтоксисиланом и янтарным ангидридом в соответствии с протоколом.

Функционализированная подложка устанавливается на пористый подложкодержатель (столик) и фиксируется вакуумом, либо механически. Синтез олигонуклеотидов может быть осуществлен путем дозирования реагентов любым доступным способом, например, адресное нанесение растворов пьезодозатором или шприцевым дозатором, аэрозольным распылением, полной заливкой и др. Для удаления реагентов с пористой подложки используется вакуумная откачка. Последовательность добавляемых реагентов ведется в соответствии со стандартным протоколом синтеза и заданным массивом последовательностей олигонуклеотидов.

После завершения синтеза деблокирование полученных олигонуклеотидов производится при помощи водного раствора аммиака.

Пример реализации (варианты):

Вариант 1

Гладкую алюминиевую пластину с зеркальным блеском предварительно отмытую, обезжиренную и отожженную при температуре 400–500 °С подвергают анодированию в потенциостатическом режиме в кислотном электролите концентрации 0,3–0,5 М при температуре 0–10 °С. Для получения межпорового расстояния 50–60 нм используют сернокислотный электролит и напряжение анодирования 15–30 В. Для межпорового расстояния 70–140 нм используют щавелевокислый электролит и напряжение анодирования 30–70 В. Для межпорового расстояния 350–500 нм используют фосфорнокислый электролит и напряжение анодирования 160–195 В. Также возможно использование других электролитов, таких как, хромовая, малоновая, гликолевая, лимонная, винная, яблочная кислоты, либо смесей кислот. Толщина пористого оксида алюминия напрямую зависит от величины прошедшего заряда. После анодирования пластина промывается водой и непрореагировавший алюминий стравливается 0,5 М раствором хлорида меди с добавлением 10 % HCl.

У получившегося слоя оксида алюминия стравливают барьерный слой, закрывающий поры с той стороны, где находился алюминий. Для этого используют разбавленную ортофосфорную кислоту концентрации 5-10 %. Вместе с травлением барьерного слоя возможно растравливание пор до нужного диаметра. Время травления зависит от изначальной толщины алюминия, времени анодирования и состава электролита и подбирается экспериментально до полного стравливания алюминия. Затем пористый оксид алюминия промывается водой и сушится.

Для формирования ровных краев и задания определенной геометрии полученной подложки пористого оксида алюминия можно применить метод лазерной гравировки. После этого подложки отжигаются в печи при температуре выше 1150 °С для перевода оксида алюминия в α-фазу. После остывания по краю подложки фиксируется полиэтиленовый бортик путем нагрева.

Полученная подложка выдерживается в 1–3 % растворе 3-аминопропилтриэтоксисилана в безводном толуоле в течение 2–4 часов с последующей промывкой толуолом для функционализации поверхности оксида аминогруппами. После этого подложка выдерживается в 5–15 % растворе янтарного ангидрида в диметилформамиде в течение 2–4 часов с последующей промывкой бидистиллированной водой. При этом янтарный ангидрид связывается аминогруппами и дает функционализацию карбоксильными группами. Подложка готова к синтезу с использованием амидофосфитов, коваленто связывающихся по карбоксильной группе.

Вариант 2

Способ по варианту 2 выполняется в том же порядке до травления непрореагировавшего алюминия и барьерного слоя, далее положку обрабатывают 3–5 % раствором 3-глицидоксипропилтриметоксисилана в этаноле в течение 6–8 часов. Затем поверхность тщательно отмывается от 3-глицидоксипропилтриметоксисилана и выдерживается при 80 °С один час. Далее для введения карбоксильных групп на поверхность, подложку обрабатывают 2 М водным раствором аминокапроновой кислоты в течение суток с последующей промывкой водой. Подложка готова к синтезу с использованием амидофосфитов, коваленто связывающихся по карбоксильной группе.

Вариант 3

К поверхности подложек, функционализированных карбоксильными группами по варианту 1 или варианту 2 можно ковалентно присоединить стартовое звено, несущее незащищенную гидроксильную группу. Для этого подложка обрабатывается в смеси бис-(2-гидроксиэтил)сульфона или 2-((2-(4,4’-диметокситритилокси)этил)сульфонил)этанола с 2,4,6-триизопропилбензолсульфохлоридом и 1-метилимидазолом (0,3:0,3:0,1 ммоль) в ацетонитриле в течение 2–4 часов с последующей обработкой метанолом. Промытая и высушенная подложка готова к использованию в синтезе с использованием стандартных амидофосфитов.

Вариант 4

К поверхности подложек, функционализированных по варианту 3 вместо присоединения универсального линкера возможна функционализация любым стартовым нуклеозидом, применяемым в стандартном синтезе олигонуклеотидов, пришивающийся к карбоксильной группе, например: N4-Бензоил-5'-O-(4,4'-диметокситритил)-β2'-дезоксицитидин, N6-Феноксиацетил-5'-O-(4,4'-диметокситритил)-β2'-дезоксиаденозин, N2-Изобутирил-5'-O-(4,4'-диметокситритил)-β2'-дезоксигуанозин, 5'-O-(4,4'-диметокситритил)-β2'-тимидин или их аналоги. Подложка обрабатывается в смеси нуклеозида с 2,4,6-триизопропилбензолсульфохлоридом и 1-метилимидазолом (0,3:0,3:0,1 ммоль) в ацетонитриле в течение 2-4 часов с последующей обработкой метанолом. Промытая и высушенная подложка готова к использованию в синтезе с использованием стандартных амидофосфитов.

Синтез массива олигонуклеотидов проводится с использованием стандартной амидофосфитной химии методами адресного дозирования. По окончанию синтеза подложка для удаления массива олигонуклеотидов инкубируется в АМА (28 % раствор водного аммиака/40 % водный метиламин (1:1, v/v)) при комнатной температуре в течение одного часа, после супернатант с массивом олигонуклеотидов дополнительно инкубируется при 65 °С десять минут для полного удаления защитных групп по экзоциклическим аминогруппам оснований. Смесь далее упаривается для удаления аммиака и метиламина. Пул олигонуклеотидов с 3´-фосфатом далее инкубируется с термолабильной щелочной фосфотазой в течение 12 часов после чего фосфатаза инактивируется при 65 °С, далее раствор олигонуклеотидов может быть использован по назначению или олигонуклеотиды могут быть осаждены этанолом.

Изобретение относится к области синтетической биологии, а именно к вариантам способа изготовления пористых подложек для олигонуклеотидного синтеза из функционализированного оксида алюминия. Один из вариантов способа включает формирование методом кислотного анодирования на одной стороне тонкого листа алюминия пористого анодированного оксида в потенциостатическом режиме при температуре 0-10°С. Далее осуществляют травление непрореагировавшего алюминия и барьерного слоя, термический отжиг оксида алюминия для перевода его в α-фазу и фиксацию полимерного бортика. Полученную подложку обрабатывают в 1–3% растворе 3-аминопропилтриэтоксисилана в безводном толуоле в течение 2–4 часов с последующей промывкой толуолом и обработкой в 5–15% растворе янтарного ангидрида в диметилформамиде в течение 2–4 часов с последующей промывкой водой. Технический результат заключается в получении подложек с пористой структурой, вертикальным расположением пор и заданным межпоровым расстоянием и наличием функциональных групп на поверхности пор, которые обеспечивают ковалентное присоединение нуклеотидов в процессе синтеза с адресным дозированием малых количеств реагентов такими методами, как струйная печать, аэрозольная печать, капиллярное нанесение. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 1 пр.

1. Способ изготовления пористых подложек для олигонуклеотидного синтеза из функционализированного оксида алюминия, включающий формирование методом кислотного анодирования на одной стороне тонкого листа алюминия пористого анодированного оксида в потенциостатическом режиме при температуре 0-10°С, последующее травление непрореагировавшего алюминия и барьерного слоя, термический отжиг оксида алюминия для перевода его в α-фазу и фиксация полимерного бортика, отличающийся тем, что полученную подложку обрабатывают в 1–3% растворе 3-аминопропилтриэтоксисилана в безводном толуоле в течение 2–4 часов с последующей промывкой толуолом и обработкой в 5–15% растворе янтарного ангидрида в диметилформамиде в течение 2–4 часов с последующей промывкой водой.

2. Способ изготовления пористых подложек для олигонуклеотидного синтеза из функционализированного оксида алюминия, включающий формирование методом кислотного анодирования на одной стороне тонкого листа алюминия пористого анодированного оксида в потенциостатическом режиме при температуре 0-10°С, последующее травление непрореагировавшего алюминия и барьерного слоя, термический отжиг оксида алюминия для перевода его в α-фазу и фиксация полимерного бортика, отличающийся тем, что полученную подложку обрабатывают 3–5% раствором 3-глицидоксипропилтриметоксисилана в этаноле в течение 6–8 часов с последующей обработкой 2 М водным раствором аминокапроновой кислоты в течение суток и промывкой водой.

3. Способ по п.1 и 2, отличающийся тем, что подложку дополнительно функционализируют универсальным линкером, например: смесью 2-((2-(4,4'-диметокситритилокси)этил)сульфонил)этанола с 2,4,6-триизопропилбензолсульфохлоридом и 1-метилимидазолом (0,3:0,3:0,1 ммоль) в ацетонитриле в течение 2–4 часов с последующей обработкой метанолом.

4. Способ по п.1 и 2, отличающийся тем, что подложку дополнительно функционализируют стартовым нуклеозидом, например: N4-Бензоил-5'-O-(4,4'-диметокситритил)-β2'-дезоксицитидин в смеси с 2,4,6-триизопропилбензолсульфохлоридом и 1-метилимидазолом (0,3:0,3:0,1 ммоль) в ацетонитриле в течение 2–4 часов с последующей обработкой метанолом.