Способ прогнозирования острых сосудистых событий у пациентов с Ph-негативными миелопролиферативными новообразованиями на основании уровня костномозговой экспрессии MMP9 Российский патент 2024 года по МПК G01N33/53 G01N35/00 C12Q1/28 

Изобретение относится к медицине, в частности к патологической анатомии, кардиологии и гематологии, и может быть использовано для прогнозирования возникновения острых сосудистых событий у пациентов с Ph-негативными миелопролиферативными новообразованиями.

Ph-негативные миелопролиферативные новообразования (МПН) - группа медленно прогрессирующих заболеваний крови, прогноз и структура летальности которых зависит во многом от нозологической принадлежности. Так, при истинной полицитемии медиана выживаемости пациентов составляет около 10 лет, при эссенциальной тромбоцитемии - 10-15 лет, а при первичном миелофиброзе колеблется от нескольких месяцев до десятилетий в зависимости от стадии диагностированного страдания и своевременности начатой терапии [1]. Эти заболевания сопровождаются повышением уровня эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов в периферической крови, что обусловливает высокий риск возникновения и развития острых сосудистых событий (ОСС) [2] и их тяжелых последствий: острого инфаркта миокарда, ишемического инсульта, тромбоэмболии легочных артерий и пр. [3-5].

Следует отметить, что большинство исследователей [6,7], оценивающих роль компонентов экстрацеллюлярного матрикса в генезе ОСС, изучали уровень металлопротеиназ и ростовых факторов в сыворотке крови пациентов. Нами проведен количественный анализ уровня экспрессии ММР9 непосредственно в трепанобиоптатах костного мозга больных МПН, что позволило объективизировать и конкретизировать суждение о роли экстрацеллюлярного матрикса костного мозга в генезе ОСС у этого контингента больных. Так, по современным представлениям [8], повышение уровня ММР9 способствует дестабилизации атеросклеротической бляшки, что в совокупности с тромбоцитозом и эритроцитозом у пациентов с МПН вызывает инициацию и развитие ОСС. J.M. Florence et al. [9] отмечают связь повышения уровня экспрессии ММР9 с развитием эндотелиальной дисфункции посредством активации апоптоза эндотелиальных клеток, a L. Lahdentausta et al. [10] указывают на снижение уровня ММР9 в период реконвалесценции пациентов с острым коронарным синдромом на 49%.

На момент подачи заявки из свободных источников было известно о следующих наиболее близких аналогах.

Из патента RU 2568577, 03.06.2014 г. (Тепляков А.Т., Гракова Е.В., Андриянова А.В., ФГБНУ "Научно-исследовательский институт кардиологии") известен способ прогнозирования риска развития неблагоприятных сердечно-сосудистых событий у больных ишемической болезнью сердца с ишемической и/или постинфарктной дисфункцией миокарда на фоне хронической сердечной недостаточности. Сущность способа состоит в том, что при выявлении уровня тканевого ингибитора матриксных металлопротеиназ-1 более 242,8 нг/мл и сердечнососудистого сопряжения более 1,29 риск развития неблагоприятных сердечно-сосудистых событий оценивается как высокий.

Метод схож использованием определения металлопротеиназ для прогнозирования неблагоприятных сердечно-сосудистых событий. Недостатком данного способа является то, что он рассматривает только группу пациентов с ишемической болезнью сердца или постинфарктной дисфункцией миокарда, упуская из виду группу пациентов с МПН.

Из патента RU 2757752, 26.04.2021 (Гусев Е.И., Беляева И.А., Мартынов М.Ю., Вершинин А.А., ООО МТК) известен способ определения индивидуального профиля факторов суммарного сердечнососудистого риска у пациента трудоспособного возраста. Проводят анамнестическое, клинико-инструментальное и лабораторные обследования пациента на предмет выявления у него значений следующих причинных факторов риска (ФР) ССЗ: систолическое артериальное давление (САД) в покое, мм рт. ст., частота сердечных сокращений (ЧСС) в покое, уд./мин, индекс массы тела (ИМТ), г/см², статус стенокардии напряжения, острый инфаркт миокарда (ОИМ) в анамнезе, острый инсульт (ОНМК) в анамнезе, сомнительные ЭКГ-признаки ишемической болезни сердца (ИБС), достоверно установленные ЭКГ-признаки ИБС, статус курения отдельно для мужчин и женщин, статус употребления алкоголя, уровень липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), ммоль/л. Рассчитывают индивидуальный профиль факторов суммарного риска ССЗ пациента (ИСПР) на момент обследования. Для этого полученное при ранжировании значение каждого ФР умножают на соответствующий ему весовой коэффициент. Полученные произведения суммируют, получая значение ИСПР пациента. Дополнительно выявляют наличие у пациента подтвержденного диагноза сахарного диабета, либо, в его отсутствие, проводят клинико-инструментальные и лабораторные исследования на предмет его выявления у пациента. Принимая значение ИСПР пациента за 100%, определяют в нем долю - вклад в % каждого из полученных произведений индивидуальных значений ФР на их весовые коэффициенты, определяя таким образом персональный профиль причинных факторов сердечно-сосудистого риска данного пациента на момент обследования.

Метод может учитывать всех пациентов, включая пациентов с МПН. Недостатком данного способа является то, что все перечисленные факторы риска неспецифические, метод не учитывает клинические и патогенетические особенности пациентов с МПН.

Из патента RU 2741195, 27.03.2020 (Шаленкова М.А., Иванов А.В., Климкин П.Ф., Румянцева СМ., Миронов Н.Н. ГБУЗ НО "Нижегородская областная клиническая больница им. Н.А. Семашко") известен способ прогнозирования ургентных сердечно-сосудистых осложнений при остром коронарном синдроме у больных с онкологическим заболеванием в анамнезе. Рассчитывают баллы по шкале GRACE, определяют содержание NT-proBNP (пг/мл) в 1-е сутки госпитализации при остром коронарном синдроме у больных с онкологическим заболеванием в анамнезе в стадии подготовки к лечению, в период активного лечения или после его завершения. Рассчитывают суммарный показатель «ОЗ.GRACE - NT-proBNP» по построенному уравнению логистической регрессии. При значении более -0,1667 прогнозируется возможное развитие ургентных сердечнососудистых осложнений в госпитальном периоде при остром коронарном синдроме у больных с онкологическим заболеванием в анамнезе.

Метод отличается использованием определения мозгового натрийуретического пептида, при этом учитывает особую группу больных с онкологическим заболеванием в анамнезе. Недостатками метода является учет пациентов только с клиникой острого коронарного синдрома, без учета других состояний - острых церебральных сосудистых событий, тромбоэмболии легочных артерий.

Наиболее близким к предлагаемому является способ из патента RU 2651708, 23.04.2018 г. (Джилл Р.Д., Уилльямс С.А., Стюарт А.Е., Мелер Р., Форман Т., Сингер Б., Сомалоджик, ИНК. (US)), описывающий способ определения того, что индивид имеет повышенный риск сердечнососудистого события, включающий определение биомаркеров ММР-12, комплемента С7, CCL18, комплекса α-1-антихимотрипсина, GDF-11, α-2-антиплазмина и ангиопоэтина-2. Предложены способ оценки риска будущего сердечно- сосудистого (CV) события в пределах пятилетнего периода времени и панель биомаркеров, включающая ММР-12, комплемент С7, CCL18, комплекс α-1-антихимотрипсина, GDF-11, α-2-антиплазмин и ангиопоэтин-2.

В методе применяются биомаркеры, в том числе металлопротеиназа, для определения риска сердечно-сосудистого события. Недостатком данного способа является то, что метод не учитывает клинические и патогенетические особенности пациентов с МПН.

Задачей изобретения является разработка способа прогнозирования развития острых сосудистых событий методом иммуногистохимического исследования костного мозга с разработкой референсных значений для экспрессии ММР9 в цитоплазме нейтрофильных гранулоцитов, мегакариоцитов, макрофагов и экстрацеллюлярном матриксе костного мозга у пациентов с Ph-негативными миелопролиферативными новообразованиями.

Техническим результатом предлагаемого способа является прогнозирование развития острых сосудистых событий у пациентов с Ph-негативными миелопролиферативными новообразованиями.

Технический результат достигается тем, что способ прогнозирования развития острого сосудистого события включает исследование костного мозга на экспрессию ММР9 у пациентов с Ph-негативными миелопролиферативными новообразованиями.

Отличие способа заключается в том, что проводят определение экспрессии ММР9 методом иммуногистохимии (ИГХ) с помощью поликлональных антител в костном мозге, полученном методом трепанобиопсии подвздошной кости. Если значение экспрессии равно или более порогового параметра 692,6 мкм², делают заключение о неблагоприятном прогнозе - устанавливают высокую вероятность ОСС, если значение экспрессии меньше порогового параметра, делают заключение о благоприятном прогнозе и устанавливают малую вероятность развития ОСС. Пороговое значение определено на основе экспериментальных данных с помощью ROC-анализа.

Осуществление изобретения

С целью разработки референсных значений для экспрессии ММР9 в костном мозге нами был проведен ROC-анализ на основе ретроспективного обсервационного исследования пациентов с МПН (n=113), в ходе которого была определена точка разделения (cut-off) для экспрессии ММР9 в костном мозге у пациентов с наличием ОСС и без них.

Пороговое значение экспрессии ММР9 в клетках и экстрацеллюлярном матриксе костного мозга в точке cut-off составило значение 692,6 мкм².

При статистической обработке полученных данных (ROC- анализ) была определена площадь под ROC - кривой, которая соответствует взаимосвязи развития ОСС и экспрессии ММР9 в костном мозге у пациентов с МПН, и составила 0,897, ДИ 95% 0,808-0,986, р<0,0001 (фиг. 1). Чувствительность метода составила 80% (ДИ 95% 51,9-95,7), специфичность 88,8% (ДИ 95% 80,8-94,3), диагностическая эффективность 84,4% (при максимальном значении индекса Юдена J=0,688) (фиг. 2).

Способ прогнозирования заключается в выполнении следующих операций.

1) Проводят трепанобиопсию костного мозга из крыла подвздошной кости. Полученные образцы костного мозга обрабатывают по стандартной методике с получением парафиновых блоков. ИГХ проводят на депарафинизированных и дегидратированных срезах толщиной 5 мкм с использованием авидин-биотинового иммунопероксидазного метода.

2) Иммуногистохимическое исследование трепанобиоптатов костного мозга проводят с применением стандартных наборов поликлональных антител фирмы Epitomics, США, кроличьи поликлональные антитела ММР9, клон ЕР1254. Для визуализации первичных антител используют систему детекции Ultra VIEW Universal с хромогеном DAB (США).

3) Оцифровка микропрепаратов производят в гистосканере PANNORAMIC® 250 Flash III DX (3DHISTECH, Венгрия). Результаты реакции ММР9 идентифицируют по окрашиванию клеток (нейтрофильных гранулоцитов, мегакариоцитов, макрофагов) и экстрацеллюлярного матрикса костного мозга. С помощью программы ImageJ с плагином ICH Profiler рассчитывают среднюю окрашенную площадь в мкм² в 5 участках общей площадью 1000 мкм² за исключением субкортикальных тканей и артифициально смятых костномозговых пространств.

4) При значении порогового параметра равно и более 692,6 мкм² устанавливают неблагоприятный прогноз - высокая вероятность развития ОСС; при значении менее 692,6 мкм² порогового параметра устанавливают благоприятный прогноз - низкая вероятность развития ОСС.

Способ иллюстрируется фигурами:

Фиг. 1. - ROC-кривая для ММР9 (площадь под кривой 0,897, р<0,0001, ДИ 95% 0,808-0,986), возрастание значений обозначает повышение вероятности развития ОСС.

Фиг. 2. -Распределение значений ММР9 между группами пациентов с ОСС и без ОСС, красная линия обозначает пороговое значение 692,6 мкм².

Клинические примеры

Пример 1. Пациент К., 56 лет, жалоб нет, тромбоцитоз до 1187×10⁹/л, мутация JAK2 V617F, селезенка увеличена, диагноз - первичный миелофиброз. По данным иммуногистохимии экспрессия ММР9 в костном мозге 692,6 мкм². За период наблюдения (с 2016 по 2022 гг.) - острый инфаркт миокарда.

Пример 2. Пациент К., 56 лет, в течение 10 лет отмечает боли в пальцах и стопах, тромбоцитоз до 1041×10⁹/л, мутация JAK2 V617F, диагноз - эссенциальная тромбоцитемия. По данным иммуногистохимии экспрессия ММР9 в костном мозге 729,6 мкм². За период наблюдения (с 2014 по 2022 гг.) - эпизод транзиторной ишемической атаки.

Пример 3. Пациентка Р., 61 год, жалоб нет, при прохождении медосмотра обнаружены изменения в OAK - тромбоцитопения 80×10⁹/л, мутация JAK2 V617F, селезенка 189 см² (увеличена), диагноз - первичный миелофиброз. По данным иммуногистохимии экспрессия ММР9 в костном мозге 784,2 мкм². За период наблюдения (с 2019 по 2022 гг.) - тромбоз глубоких вен голеней с тромбоэмболией легочных артерий.

Пример 4. Пациентка С., 43 года, более 10 лет отмечает гиперемию лица, повышение гемоглобина до 180 г/л, мутация JAK2 V617F, селезенка 50 см² диагноз - истинная полицитемия. По данным иммуногистохимии экспрессия ММР9 в костном мозге 539,8 мкм². За период наблюдения (с 2020 по 2022 гг.) - ОСС нет.

Пример 5. Пациентка Г., 59 лет, с 2012 года в OAK тромбоцитоз до 576-597×10⁹/л, мутация JAK2 V617F, селезенка 45 см², диагноз эссенциальная тромбоцитемия. По данным иммуногистохимии экспрессия ММР9 в костном мозге 569,7 мкм². За период наблюдения (с 2015 по 2022 гг.) - ОСС нет.

Клинические примеры представлены в виде таблицы 1, в которой перечислены значения ММР9 из примеров 1-5 и соответствующие им ОСС (есть/нет).

Полученные результаты исследования позволяют расширить спектр прогностических маркеров для оценки вероятности развития острых сосудистых событий у пациентов с Ph-негативными миелопролиферативными новообразованиями.

Выявленное референсное значение экспрессии ММР9 в костном мозге, открывает перспективы для эффективной профилактики развития острых сосудистых событий у пациентов с Ph-негативными миелопролиферативными новообразованиями и позитивно повлиять на динамику показателей выживаемости этого контингента больных.

Литература

1. Меликян А.Л., Ковригина A.M., Суборцева И.Н. и др. Национальные клинические рекомендации по диагностике и лечению Ph-негативных миелопролиферативных заболеваний (истинной полицитемии, эссенциальной тромбоцитемии, первичного миелофиброза) (редакция 2020 г.). Клиническая онкогематология 2021;14(2):262-98. doi:10.21320/2500-2139-2021-14-2-262-298

2. Hintermair S., Zwickl-Traxler E., Pecherstorfer M., Singer J. Evaluation of vascular events in patients with myeloproliferative syndromes and mutations of either the januskinase-2 or calreticulin gene at the university hospital Krems from 2008 to 2015. Oncotarget. 2018;9(9):8450-8462. doi:10.18632/oncotarget.23879

3. Tefferi A. Primary myelofibrosis: 2014 update on diagnosis, risk-stratification, and management. Am J Hematol 2014;89(9):915-925. doi:10.1002/ajh.23703

4. Barbui T., De Stefano V., Falanga A. et al. Addressing and proposing solutions for unmet clinical needs in the management of myeloproliferative neoplasm-associated thrombosis: A consensus-based position paper. Blood Cancer J. 2019;9(8):61. doi:10.1038/s41408-019-0225-5

5. Leiva O., Xia Y., Siddiqui E., Hobbs G., Bangalore S. Outcomes of patients with myeloproliferative neoplasms admitted with myocardial infarction: insights from national inpatient sample. JACC CardioOncol 2023;5(4):457-468. doi:10.1016/j.jaccao.2023.03.014

6. Танана O.С., Сукманова И.А., Пономаренко И.В. Клиническое значение копептина и матриксных металлопротеиназ у мужчин с острым коронарным синдромом. Кардиология 2017;57(3S):32-39. doi: 10.18087/cardio.2400

7. Ferroni P., Basili S., Martini F. et al. Serum metalloproteinase 9 levels in patients with coronary artery disease: a novel marker of inflammation. J Investig Med 2003;51(5):295-300. doi:10.1136/jim-51-05-17

8. Kremastiotis G., Handa I., Jackson C., George S., Johnson J. Disparate effects of MMP and TIMP modulation on coronary atherosclerosis and associated myocardial fibrosis. Sci Rep. 202111(1):23081. doi:10.1038/s41598-021-02508-4

9. Florence J.M., Krupa A., Booshehri L.M., Allen T.C., Kurdowska A.K. Metalloproteinase-9 contributes to endothelial dysfunction in atherosclerosis via protease activated receptor-l.PLoS One. 2017;12(2):e0171427. doi:10.1371/journal.pone.0171427

10. Lahdentausta L., Leskelä J., Winkelmann A. et al. Serum MMP Winkelmann A. et al. Serum MMP-9 Diagnostics, Prognostics, and Activation in Acute Coronary Syndrome and Its Recurrence. J Cardiovasc Transl Res 201811(3):210-220. doi:10.1007/sl2265-018-9789-х

Изобретение относится к медицине, а именно к патологической анатомии, кардиологии и гематологии, и может быть использовано для прогнозирования острых сосудистых событий у пациентов с Ph-негативными миелопролиферативными новообразованиями. Оценивают экспрессию ММР9 в клетках и экстрацеллюлярном матриксе костного мозга. Рассчитывают среднюю окрашенную площадь в 5 участках общей площадью 1000 мкм², за исключением субкортикальных тканей и артифициально смятых костномозговых пространств. При значении экспрессии, равном и более порогового параметра 692,6 мкм², прогнозируют высокую вероятность развития острых сосудистых событий у пациентов с Ph-негативными миелопролиферативными новообразованиями. Способ обеспечивает эффективное прогнозирование развития острых сосудистых событий у пациентов с Ph-негативными миелопролиферативными новообразованиями за счет оценки экспрессии ММР9 в клетках и экстрацеллюлярном матриксе костного мозга. 2 ил., 1 табл., 5 пр.

Способ прогнозирования острых сосудистых событий у пациентов с Ph-негативными миелопролиферативными новообразованиями, включающий оценку экспрессии ММР9 в клетках и экстрацеллюлярном матриксе костного мозга методом иммуногистохимии, расчет средней окрашенной площади в 5 участках общей площадью 1000 мкм², за исключением субкортикальных тканей и артифициально смятых костномозговых пространств, и при значении экспрессии, равном и более порогового параметра 692,6 мкм², прогнозируют высокую вероятность развития острых сосудистых событий у пациентов с Ph-негативными миелопролиферативными новообразованиями.