Набор реактивов для одновременного выявления пяти основных соматических мутаций Ph-негативных миелопролиферативных новообразований и способ диагностики на его основе Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/68 C12Q1/6806 C12Q1/6844 C12Q1/686 

Группа изобретений относится к области медицины, в том числе к диагностике онкогематологических заболеваний, и предназначена для использования при проведении молекулярно-генетических исследований в клинико-диагностических лабораториях с целью выявления генетических маркеров хронических Ph-негативных миелопролиферативных новообразований.

В соответствии с клиническими рекомендациями [Barbui Т., Thiele J., Gisslinger Н., Finazzi G., Vannucchi A.M, Tefferi A. The 2016 revision of WHO classification of myeloproliferative neoplasms: Clinical and molecular advances. Blood Reviews, 2016. 30: 453-459] основным диагностическим критерием для постановки диагноза Ph-негативных миелопролиферативных новообразований, а именно истинной полицитемии (ИП), эссенциальной тромбоцитемии (ЭТ) и первичного миелофиброза (ПМФ) является выявление одной из пяти наиболее частых патогенетических соматических мутаций в генах янускиназы-2 (JAK2 V617F), кальретикулина (CALR 1 типа - с. 1092_1143del и 2 типа - с. 1154_1155insTTGTC) и рецептора тромбопоэтина (MPL W515L и W515K).

Наиболее распространенные в практике клинико-диагностических лабораторий методы и наборы реагентов для детекции мутаций предусматривают возможность проведения исследования только мутаций в отдельных генах, выполнение полного лабораторного тестирования всех основных мутаций ассоциированных с миелопролиферацией занимает достаточно большой промежуток времени.

Известно одновременное исследование различных мутаций в разных генах с использованием методов секвенирования ДНК [Langabeer SE, Andrikovics Н, Asp J, et al. Molecular diagnostics of myeloproliferative neoplasms. Eur J Haematol. 2015, 95:270-279] и микрочипов (https://tools.mermofisher.com/content/sfs/brochures/genomewide_snp6_datasheet.pdf).

Однако требования к оборудованию и квалификации персонала, а также высокая трудоемкость выполнения и стоимость тестирования осложняет широкое использование данных методов в реальной практике клинико-диагностических лабораторий.

Известен способ, который заключается в использовании аллель-специфичных праймеров с регистрацией результатов ПЦР в режиме реального времени с использованием флуоресцентно-меченных проб. Реакционная смесь включает праймеры, отличающиеся для каждого аллеля, и общие для двух аллелей праймер и пробу, а также общий флуоресцентный зонд [RU, пат. 2445373, МПК C12Q 1/68, опубл. 20.03.2012 г., бюл. №8].

Недостатки способа заключаются в невозможности проведения мультиплексной реакции в виду использования одного флуоресцентного зонда общего для двух анализируемых аллелей.

Наиболее близким к заявляемому набору реактивов и способу диагностики на его основе по совокупности признаков является набор реактивов для выявления Ph-негативных миелопролиферативных новообразований, предусматривавший использование при выполнении мультиплексной полимеразной цепной реакции четырех реакционных смесей, включающих специфические праймеры и TaqMan зонды [RU пат. 2679653, МПК G01N 33/533, опубл. 12.02.2019, Бюл. №5 (прототип)]. В патенте 2679653 предложен набор, содержащий специфичные праймеры и флуоресцентно-меченые ДНК-зонды. Праймеры имеют следующий нуклеотидный состав (5'-3'-): JAK2-W-F, JAK2-W-R, JAK2-W-P, JAK2-M-F, JAK2-M-R, JAK2-M-P, CALR-1-F, CALR-1-R, MPL-K-F, MPL-K-R, CALR-1-P, MPL-K-P, CALR-2-F, CALR-2-R, MPL-L-F, MPL-L-R, CALR-2-P, MPL-L-P. В TaqMan зондах на 5' конце применяют красители: флуоресцеин (FAM) и хлорированный флуоресцеин (HEX). Для тушения флуоресценции используют Black Hole Quencher-1 (BHQ1) на 3' конце. Данное техническое решение позволяет проводить одновременное исследование нескольких мутаций в одной аналитической серии, что приводит к результату в более короткие сроки. А также обеспечивает точную диагностику хронических Ph-негативных миелопролиферативных опухолей, позволяет выявлять группу пациентов с наличием сочетанных патогенетических мутаций.

Однако при использовании вышеуказанного набора необходимо на каждую анализируемую пробу использовать четыре реакционные смеси требующие не менее 4 отдельных пробирок, что ограничивает производственные ресурсы лаборатории, особенно при больших объемах тестирования.

Задача изобретения - разработка набора реактивов для одновременного выявления пяти основных соматических мутаций в генах JAK2, CALR и MPL, а также ускоренного и экономичного способа диагностики Ph- негативных миелопролиферативных новообразований на его основе.

Техническим результатом, достигаемым заявляемой группой изобретений, является изготовление набора реактивов для выявления пяти соматических мутаций в генах янускиназы-2 (JAK2 V617F), кальретикулина (CALR 1 типа - с. 1092_1143de1 и 2 типа - с. 1154_1155insTTGTC) и рецептора тромбопоэтина (MPL W515L и W515K) методом мультиплексной полимеразной цепной реакции, сокращение рабочего времени на выполнение лабораторных тестов и экономия расходных материалов.

Указанный единый технический результат при осуществлении группы изобретений по объекту набор реактивов достигается тем, что в наборе реактивов для одновременного выявления пяти основных соматических мутаций Ph-негативных миелопролиферативных новообразований, содержащем специфичные праймеры и флуоресцентно-меченые ДНК-зонды, в качестве источника флуоресценции в TaqMan зондах на 5' конце используют красители: флуоресцеин (FAM), и хлорированный флуоресцеин (HEX), а для тушения флуоресценции используют Black Hole Quencher-1 (BHQ1) на 3' конце, новым является то, что для анализа одного биологического образца используют две реакционные смеси, при этом первая смесь включает праймеры: JAK2-W-F, JAK2-R, CALR-D, CALR-R, 515K, 515-R5 и TaqMan зонды: JAK2-P, CALR-P, 515-Р6, а вторая смесь включает праймеры: JAK2-W-F, JAK2-R, CALR-R, JAK2-RM, CALR-I, 515L, 515-R9 и TaqMan зонды: JAK2-P, CALR-P, 515-Р10 и имеют следующий нуклеотидный состав (5'-3'-):

JAK2-W-F: AGCAGCAAGTATGATGAGC,

JAK2-R: GATGCTCTGAGAAAGGCAT,

JAK2-P: FAM-CACAGACACATACTC-BHQ1,

JAK2-RM: GATGCTCTGAGAAAGGCAT,

CALR-D: GAGGAGTTTGGCAACGAGAC,

CALR-R: ССТСАТССТССТСАТССТСА,

CALR-P: HEX-AGGAGCAGAGGACAAGGAGGATGA-BHQ2,

CALR-I: GCAACGAGACGTGGGGCGTA

515-R9: TAGCCTGGATCTCCTTGGTG,

515L: ACAGAGCGAACCAAGAATGC,

515-P6: HEX-TGCTGCTGAGGAAGCAGTTTCC-BHQ2,

515K: TAGCCTGGATCTCCTTGGTG,

515-R5: ACAGAGCGAACCAAGAATGC,

515-Р10: HEX-CTGCTGAGGTTGCAGTTTC-BHQ2,

дополнительно в качестве источника флуоресценции в TaqMan зондах на 5' конце используют краситель карбокси-Х-родамин (ROX), а для тушения флуоресценции используют Black Hole Quencher-2 (BHQ2) на 3' конце.

Указанный единый технический результат при осуществлении группы изобретений по объекту способу достигается также и тем, что в способе диагностики Ph-негативных миелопролиферативных новообразований, включающем проведение мультиплексного варианта полимеразной цепной реакции в режиме реального времени путем смешивания буфера, дНТФ, специфичных праймеров, TaqMan зондов, Taq-полимеразы, MgCI₂; и воды в оптимальных объемах, с последующей амплификацией которую проводят в следующем режиме: предварительная активация при 95°С - 5 минут и последующие циклы, включающие денатурацию при 95°С - 15 секунд, отжиг и элонгацию при 60°С - 60 секунд, цикл повторяют 50 раз, новым является то, что мультиплексную полимеразную цепную реакцию проводят одновременно в двух реакционных смесях, первая смесь включает праймеры: JAK2-W-F, JAK2-R, CALR-D, CALR-R, 515К, 515-R5 и TaqMan зонды: JAK2-P, CALR-P, 515-Р6, вторая смесь включает праймеры: JAK2-W-F, JAK2-R, CALR-R, JAK2-RM, CALR-I, 515L, 515-R9 и TaqMan зонды: JAK2-P, CALR-P, 515-Р10, имеющих следующий нуклеотидный состав (5'-3'-):

JAK2-W-F: AGCAGCAAGTATGATGAGC,

JAK2-R: GATGCTCTGAGAAAGGCAT,

JAK2-P: FAM-CACAGACACATACTC-BHQ1,

JAK2-RM: GATGCTCTGAGAAAGGCAT,

CALR-D: GAGGAGTTTGGCAACGAGAC,

CALR-R: CCTCATCCTCCTCATCCTCA,

CALR-P: HEX-AGGAGCAGAGGACAAGGAGGATGA-BHQ2,

CALR-I: GCAACGAGACGTGGGGCGTA

515-R9: TAGCCTGGATCTCCTTGGTG,

515L: ACAGAGCGAACCAAGAATGC,

515-P6: HEX-TGCTGCTGAGGAAGCAGTTTCC-BHQ2,

515K: TAGCCTGGATCTCCTTGGTG,

515-R5: ACAGAGCGAACCAAGAATGC,

515-P10: HEX-CTGCTGAGGTTGCAGTTTC-BHQ2,

дополнительно в качестве источника флуоресценции в TaqMan зондах на 5' конце используют краситель карбокси-Х-родамин (ROX), а для тушения флуоресценции используют Black Hole Quencher-2 (BHQ2) на 3' конце, а результат признают положительным, если значение порогового цикла (Ct) для образца не больше 35.

Заявляемая группа изобретений соответствует требованию единства изобретения, поскольку группа разнообъектных изобретений образует единый изобретательский замысел, причем один из заявляемых объектов - набор реактивов для выявления Ph-негативных миелопролиферативных новообразований, предназначен для использования в другом - способе диагностики Ph-негативных миелопролиферативных новообразований, при этом оба объекта группы изобретений направлены на решение одной и той же задачи с получением единого технического результата.

Сопоставительный анализ с прототипом позволил выявить совокупность существенных по отношению к техническому результату отличительных признаков для каждого из заявляемых объектов группы, изложенных в формулах. Следовательно, каждый из объектов группы изобретений соответствует критерию «новизна».

Из литературы и практики ПЦР-исследований неизвестно о способе мультиплексного ПЦР-анализа и (или) наборе реактивов для одновременного выявления отдельных патогенетических соматических мутаций V617F, с. 1092_1143del, с. 1154_1155insTTGTC, W515L, W515K в генах JAK2, CALR и MPL с использованием всего двух реакционных смесей для одной биологической пробы, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого решения критерию «изобретательский уровень».

Сущность изобретения поясняется с помощью графических материалов.

На фиг. 1 представлены кривые накопления флуоресцентного сигнала после проведения ПЦР-РВ для пробы без соматических мутаций: 1 - аллель "дикого типа" JAK2.

На фиг. 2 представлены кривые накопления флуоресцентного сигнала после проведения ПЦР-РВ для пробы с одной из пяти соматических мутаций: 1 - аллель "дикого типа" JAK2, 2 - мутация JAK2 V617F.

На фиг. 3 представлены кривые накопления флуоресцентного сигнала после проведения ПЦР-РВ для пробы одновременно с двумя соматическим мутациями: 1 - аллель "дикого типа" JAK2, 2 - мутация JAK2 V617F, 3 - CALR 1 типа (с.1092_1143del).

Способ осуществляется следующим образом.

Мультиплексную полимеразную цепную реакцию проводят в смеси объемом 25 мкл на 1 пробу ДНК. Для каждого анализируемого образца ДНК пациента готовят 2 пробирки, в которые вносят реакционные смеси, соответствующие номеру пробирки (таблица 1). В каждую пробирку добавляют Taq-полимеразу (5 ед/мкл) в объеме 0,5 мкл, а затем ДНК исследуемого образца с концентрацией не менее 40 нг в объеме 10 мкл. При каждом исследовании необходимо использовать две дополнительные пробирки, в которые вместо ДНК вносят контрольные образцы ПКО (положительный контрольный образец) и ОКО (отрицательный контрольный образец). ПКО представляет собой человеческую геномную ДНК с наличием мутантных аллелей всех исследуемых генов. ОКО представляет собой человеческую геномную ДНК здорового донора, не имеющего мутаций в исследуемых генах.

Указанные в таблице 1 реакционные смеси, входящие в состав набора включают специфичные праймеры и зонды:

Реакционная смесь №1 содержит праймеры: JAK2-W-F, JAK2-R, JAK2-P, CALR-D, CALR-R, 515K, 515-R5 и TaqMan зонды: JAK2-P, CALR-P, 515-Р6 с красителями: флуоресцеин (FAM), карбокси-Х-родамин (ROX) и хлорированный флуоресцеин (HEX) на на 5' конце, а для тушения флуоресценции используют Black Hole Quencher-1 (BHQ1) и Black Hole Quencher-2 (BHQ2) на 3' конце.

Реакционная смесь №2 содержит праймеры: JAK2-W-F, JAK2-P, CALR-R, JAK2-RM, CALR-I, 515L, 515-R9 и TaqMan зонды: JAK2-P, CALR-P, 515-Р10 с красителями: флуоресцеин (FAM), карбокси-Х-родамин (ROX) и хлорированный флуоресцеин (HEX) на на 5' конце, а для тушения флуоресценции используют Black Hole Quencher-1 (BHQ1) и Black Hole Quencher-2 (BHQ2) на 3' конце.

Праймеры имеют следующий нуклеотидный состав:

JAK2-W-F: AGCAGCAAGTATGATGAGC,

JAK2-R: GATGCTCTGAGAAAGGCAT,

JAK2-P: FAM-CACAGACACATACTC-BHQ1,

JAK2-RM: GATGCTCTGAGAAAGGCAT,

CALR-D: GAGGAGTTTGGCAACGAGAC,

CALR-R: CCTCATCCTCCTCATCCTCA,

CALR-P: HEX-AGGAGCAGAGGACAAGGAGGATGA-BHQ2,

CALR-I: GCAACGAGACGTGGGGCGTA

515-R9: TAGCCTGGATCTCCTTGGTG,

515L: ACAGAGCGAACCAAGAATGC,

515-P6: HEX-TGCTGCTGAGGAAGCAGTTTCC-BHQ2,

515K: TAGCCTGGATCTCCTTGGTG,

515-R5: ACAGAGCGAACCAAGAATGC,

515-P10: HEX-CTGCTGAGGTTGCAGTTTC-BHQ2

Праймеры и зонды подбирали с использованием программы «Primer 3». Подобранные последовательности были проанализированы в GenBank с помощью программы BLAST (таблица 2). По итогам анализа не было обнаружено последовательностей в геноме человека, гомологичных подобранным праймерам и зондам.

Реакционные смеси № 1 и № 2, состав которых указан в таблице 1, готовят в двух соответствующих пробирках и одновременно помещают в термоблок амплификатора. Температурно-временной режим проведения реакции для амплификатора «CFX96» («Bio-Rad», США) следующий: предварительная активация при 95°С - 5 минут и последующие циклы включающие денатурацию при 95°С - 15 секунд и отжиг и элонгацию при 60°С - 60 секунд, цикл повторяют 50 раз.

Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала с обеих пробирок анализируют с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в режиме «реального времени» в соответствии с инструкцией к прибору (фиг. 1-3).

Для определения порогового цикла (Ct) для каждой пробирки необходимо использовать автоматический расчет. Интерпретация результатов возможна при условии, что пороговые циклы ОКО больше 35, а пороговые циклы ПКО меньше 35 в обеих пробирках. В противном случае результат признается недостоверным. Для всех исследуемых биологических проб пороговый цикл смеси №1 по каналу FAM должен быть менее 30. Несоблюдение этого условия указывает на малое количество ДНК, добавленное в пробу. Пороговые циклы флуоресцентных сигналов в любой из пробирок не должны быть менее что указывает на избыточное количество ДНК, добавленное в пробу. В этом случае необходимо повторить анализ с предварительным разведением ДНК.

Для расчета аллельной нагрузки мутации V617F необходимо воспользоваться формулой:

При значении аллельной нагрузки >0,5% проба считается положительной по мутации JAK2 V617F.

Для определения наличия мутаций в гене CALR необходимо воспользоваться формулами:

При значении CALR c.1092_1143del>3 проба считается положительной по мутации с. 1092_1143del гена CALR.

При значении c.1154_1155insTTGTC>3 проба считается положительной по мутации с. 1154_1155insTTGTC гена CALR.

Наличие мутации W515K в гене MPL определяется при Ct<35 смеси 1 по каналу ROX. Наличие мутации W515L в гене MPL определяется при Ct<35 смеси 2 по каналу ROX. Образцы пациентов в редких случаях могут содержать одновременно несколько мутаций.

Кривые накопления флуоресцентного сигнала для образца, не содержащего ни одной из анализируемых мутаций, имеют вид, представленный на фиг. 1. На фиг. 2 представлены кривые для образца с одной соматической мутацией, в данном случае с мутацией JAK2 V617F. На фиг. 3 представлены кривые интенсивности флуоресценции для образца с двумя одновременно выявленными соматическими мутациями - JAK2 V617F и CALR 1 типа. Во всех примерах - по оси X - указаны циклы амплификации, по оси У - уровень флюоресценции продукта амплификации.

Преимуществом заявляемого изобретения является то, что разработанный набор реактивов и использование мультиплексной ПЦР позволяют проводить одновременное исследование пяти соматических мутаций в одной аналитической серии с использованием всего двух реакционных смесей для анализа одной биологической пробы, при этом в сравнении с прототипом достигается двукратное снижение времени выполнения анализа, расход лабораторных пробирок и реактивов, а также повышается эффективность использования амплификаторов (таблица 3).

Параллельный анализ 138 образцов клинического материала, установил, что положительные и отрицательные результаты ПЦР тестов совпали во всех образцах (таблица 4).

Изобретение позволяет проводить одновременное исследование пяти мутаций в одной аналитической серии, используя всего две пробирки с реакционными смесями, что приводит к экономии используемого для анализа объема биологического образца, реактивов и времени выполнения анализа. Набор заявляемых реактивов позволяет с большей эффективностью использовать оборудование для амплификации нуклеиновых кислот.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к технологии молекулярной диагностики миелопролиферативных новообразований. Предложен набор реактивов для одновременного выявления пяти основных соматических мутаций Ph-негативных миелопролиферативных новообразований в генах JAK2, CALR и MPL и способ диагностики на его основе. Отличительной особенностью набора является использование оригинальных комбинаций специфичных праймеров и флуоресцентно-меченых ДНК-зондов в двух реакционных смесях. Первая смесь включает праймеры: JAK2-W-F, JAK2-R, CALR-D, CALR-R, 515K, 515-R5 и TaqMan зонды: JAK2-P, CALR-P, 515-Р6. Вторая смесь содержит праймеры: JAK2-W-F, JAK2-R, CALR-R, JAK2-RM, CALR-I, 515L, 515-R9 и TaqMan зонды: JAK2-P, CALR-P, 515-Р10. Изобретение позволяет проводить одновременное исследование пяти мутаций в одной аналитической серии, используя всего две пробирки с реакционными смесями, что приводит к экономии используемого для анализа объема биологического образца, реактивов и времени выполнения анализа. 2 н.п. ф-лы, 3 ил., 4 табл.

1. Набор реактивов для одновременного выявления пяти основных соматических мутаций Ph-негативных миелопролиферативных новообразований, содержащий специфичные праймеры и флуоресцентно-меченые ДНК-зонды, в качестве источника флуоресценции в TaqMan зондах на 5' конце используют красители: флуоресцеин (FAM) и хлорированный флуоресцеин (HEX), а для тушения флуоресценции используют Black Hole Quencher-1 (BHQ1) на 3' конце, отличающийся тем, что для анализа одного биологического образца используют две реакционные смеси, при этом первая смесь включает праймеры: JAK2-W-F, JAK2-R, CALR-D, CALR-R, 515K, 515-R5 и TaqMan зонды: JAK2-P, CALR-P, 515-Р6, а вторая смесь включает праймеры: JAK2-W-F, JAK2-R, CALR-R, JAK2-RM, CALR-I, 515L, 515-R9 и TaqMan зонды: JAK2-P, CALR-P, 515-Р10 и имеют следующий нуклеотидный состав (5'-3'-):

JAK2-W-F: AGCAGCAAGTATGATGAGC,

JAK2-R: GATGCTCTGAGAAAGGCAT,

JAK2-P: FAM-CACAGACACATACTC-BHQ1,

JAK2-RM: GATGCTCTGAGAAAGGCAT,

CALR-D: GAGGAGTTTGGCAACGAGAC,

CALR-R: ССТСАТССТССТСАТССТСА,

CALR-P: HEX-AGGAGCAGAGGACAAGGAGGATGA-BHQ2,

CALR-I: GCAACGAGACGTGGGGCGTA

515-R9: TAGCCTGGATCTCCTTGGTG,

515L: ACAGAGCGAACCAAGAATGC,

515-P6: HEX-TGCTGCTGAGGAAGCAGTTTCC-BHQ2,

515K: TAGCCTGGATCTCCTTGGTG,

515-R5: ACAGAGCGAACCAAGAATGC,

515-P10: HEX-CTGCTGAGGTTGCAGTTTC-BHQ2,

дополнительно в качестве источника флуоресценции в TaqMan зондах на 5' конце используют краситель карбокси-Х-родамин (ROX), а для тушения флуоресценции используют Black Hole Quencher-2 (BHQ2) на 3' конце.

2. Способ диагностики Ph-негативных миелопролиферативных новообразований, включающий проведение мультиплексного варианта полимеразной цепной реакции в режиме реального времени путем смешивания буфера, дНТФ, специфичных праймеров, TaqMan зондов, Taq-полимеразы, MgCl₂ и воды в оптимальных объемах, с последующей амплификацией, которую проводят в следующем режиме: предварительная активация при 95°С - 5 минут и последующие циклы, включающие денатурацию при 95°С - 15 секунд, отжиг и элонгацию при 60°С - 60 секунд, цикл повторяют 50 раз, отличающийся тем, что мультиплексную полимеразную цепную реакцию проводят одновременно в двух реакционных смесях, первая смесь включает праймеры: JAK2-W-F, JAK2-R, CALR-D, CALR-R, 515K, 515-R5 и TaqMan зонды: JAK2-P, CALR-P, 515-Р6, вторая смесь включает праймеры: JAK2-W-F, JAK2-R, CALR-R, JAK2-RM, CALR-I, 515L, 515-R9 и TaqMan зонды: JAK2-P, CALR-P, 515-Р10, имеющих следующий нуклеотидный состав (5'-3'-):

JAK2-W-F: AGCAGCAAGTATGATGAGC,

JAK2-R: GATGCTCTGAGAAAGGCAT,

JAK2-P: FАМ-СACAGACACATACTC-BHQ1,

JAK2-RM: GATGCTCTGAGAAAGGCAT,

CALR-D: GAGGAGTTTGGCAACGAGAC,

CALR-R: ССТСАТССТССТСАТССТСА,

CALR-P: HEX-AGGAGCAGAGGACAAGGAGGATGA-BHQ2,

CALR-I: GCAACGAGACGTGGGGCGTA

515-R9: TAGCCTGGATCTCCTTGGTG,

515L: ACAGAGCGAACCAAGAATGC,

515-P6: HEX-TGCTGCTGAGGAAGCAGTTTCC-BHQ2,

515K: TAGCCTGGATCTCCTTGGTG,

515-R5: ACAGAGCGAACCAAGAATGC,

515-P10: HEX-CTGCTGAGGTTGCAGTTTC-BHQ2,

дополнительно в качестве источника флуоресценции в TaqMan зондах на 5' конце используют краситель карбокси-Х-родамин (ROX), а для тушения флуоресценции используют Black Hole Quencher-2 (BHQ2) на 3' конце, а результат признают положительным, если значение порогового цикла (Ct) для образца не больше 35.