Способ комбинаторной терапии при лечении миелопролиферативных новообразований конъюгатом дифтерийного токсина с интерлейкином-3 человека в комбинации с другими агентами Российский патент 2025 года по МПК A61K38/20 A61K31/519 A61K38/16 A61K45/06 C07K14/54 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[001] Данная международная заявка претендует на приоритетное преимущество относительно предварительной заявки США с серийным номером 62/753145, поданной 31 октября 2018 г., и предварительной заявки США с серийным номером 62/832558, поданной 11 апреля 2019 г., содержание каждой из которых полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[002] Данная заявка подана со списком последовательностей в электронном формате. Список последовательностей представлен в виде файла с названием «2019-10-21_01214-0017-00PCT_SEQ_List_ST25.txt», созданного 21 октября 2019 г., размером 12 288 байт. Информация в электронном формате списка последовательностей полностью включена в настоящий документ посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[003] Настоящее изобретение обеспечивает способы лечения или ингибирования миелопролиферативного новообразования (МПН) у субъекта, нуждающегося в этом. Способ включает введение субъекту конъюгата дифтерийного токсина с интерлейкином-3 человека (DT-IL3) и одного или более ингибиторов Янус-киназ (Jak) и/или одного или более гипометилирующих агентов.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[004] Миелопролиферативные новообразования (МПН), также известные как миелопролиферативные заболевания (МПЗ), представляют собой гематологические заболевания, характеризующиеся избыточной продукцией клеток костного мозга. МПН также характеризуются клональной экспансией одного или более клонов гемопоэтических клеток в костном мозге. В некоторых случаях генетическая мутация, такая как мутация в белке Jak-2, может присутствовать в стволовых клетках пациента с МПН.

[005] МПН могут приводить к увеличению количества определенных клеток крови, аномальных клеток крови и увеличению селезенки (спленомегалии). МПН также могут повредить костный мозг и привести к фиброзу костного мозга (миелофиброзу или МФ). Из-за изменений количества клеток крови в МПН могут возникать анемия, утомляемость и слабость. Тромбогеморрагические осложнения, такие как тромбоз, также являются риском МПН. Прогрессирование МПН может привести к развитию других состояний, таких как острый миелоидный лейкоз.

[006] В данной заявке описаны улучшенные способы лечения МПН конъюгатом дифтерийного токсина с интерлейкином-3 человека (DT-IL3) и одним или более ингибиторами Jak и/или одним или более гипометилирующими агентами.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[007] В соответствии с описанием, в данной заявке представлены способы лечения DT-IL3 и (а) одним или более ингибиторами Jak и/или (б) одним или более гипометилирующими агентами.

[008] В одном варианте воплощения данная заявка относится к способу лечения или ингибирования миелопролиферативного новообразования (МПН) у субъекта, нуждающегося в этом, включающему введение субъекту конъюгата дифтерийного токсина и человеческого интерлейкина-3 (DT-IL3) и а) одного или более ингибиторов Jak и/или б) одного или более гипометилирующих агентов.

[009] В некоторых вариантах воплощения DT-IL3 вводят в дозе 1 мкг/кг или более, 2 мкг/кг или более или 4 мкг/кг или более. В некоторых вариантах воплощения DT-IL3 вводят в дозе от 2 мкг/кг до 20 мкг/кг или от 9 мкг/кг до 20 мкг/кг. В некоторых вариантах воплощения DT-IL3 вводят в дозе от 4 мкг/кг до 12 мкг/кг или от 9 мкг/кг до 12 мкг/кг. В некоторых вариантах воплощения DT-IL3 вводят в дозе 5, 7, 9 или 12 мкг/кг. В некоторых вариантах воплощения DT-IL3 вводят в дозе, которая является максимально переносимой.

[0010] В некоторых вариантах воплощения DT-IL3 и один или более ингибиторов Jak и/или гипометилирующих агентов вводят по меньшей мере один раз в неделю. В некоторых вариантах воплощения DT-IL3 и один или более ингибиторов Jak и/или гипометилирующих агентов вводят по меньшей мере два раза в неделю. В некоторых вариантах воплощения DT-IL3 и один или более ингибиторов Jak и/или гипометилирующих агентов вводят по меньшей мере три раза в неделю.

[0011] В некоторых вариантах воплощения DT-IL3 и (а) один или более ингибиторов Jak и/или (б) один или более гипометилирующих агентов вводятся в течение одной недели или более. В некоторых вариантах воплощения DT-IL3 и (а) один или более ингибиторов Jak и/или (б) один или более гипометилирующих агентов вводятся в течение двух недель или более.

[0012] В некоторых вариантах воплощения DT-IL3 и (а) один или более ингибиторов Jak и/или (б) один или более гипометилирующих агентов вводятся в течение по меньшей мере 3 последовательных дней.

[0013] В некоторых вариантах воплощения DT-IL3 и (а) один или более ингибиторов Jak и/или (б) один или более гипометилирующих агентов вводятся в нескольких циклах лечения. В некоторых вариантах воплощения циклы лечения разделены по меньшей мере 1 неделей, по меньшей мере 2 неделями, по меньшей мере 3 неделями, по меньшей мере 4 неделями, по меньшей мере 5 неделями или проводятся комбинировано.

[0014] В некоторых вариантах воплощения DT-IL3 вводят по меньшей мере 3 дня подряд с каждого 21 дня в течение четырех циклов, затем с каждого 28 дня в течение 3 циклов, а затем с каждого 42 дня.

[0015] В некоторых вариантах воплощения один или более ингибиторов Jak вводят по меньшей мере один раз в день или по меньшей мере два раза в день.

[0016] В некоторых вариантах воплощения один или более гипометилирующих агентов вводят по меньшей мере в течение первых 3 дней, по меньшей мере первых 4 дней, по меньшей мере первых 5 дней, по меньшей мере первых 6 дней или по меньшей мере первых 7 дней, по меньшей мере одного цикла.

[0017] В некоторых вариантах воплощения один или более гипометилирующих агентов вводят по меньшей мере в течение первых 3 дней, по меньшей мере первых 4 дней, по меньшей мере первых 5 дней, по меньшей мере первых 6 дней или по меньшей мере первых 7 дней 28-дневного цикла в течение 3 циклов после введения DT-IL3 в течение четырех 21-дневных циклов.

[0018] Способ, описанный в любом из предшествующих пунктов, где DT-IL3 и (а) один или более ингибиторов Jak и/или (б) один или более гипометилирующих агентов применяют до достижения прогресса в заболевании и/или до возникновения показателей неприемлемой токсичности.

[0019] В некоторых вариантах воплощения субъекту вводят фармацевтическую композицию, содержащую DT-IL3 и (а) один или более ингибиторов Jak и/или (б) один или более гипометилирующих агентов.

[0020] В некоторых вариантах воплощения субъектом является человек. В некоторых вариантах воплощения у человека неблагоприятная цитогенетика.

[0021] В некоторых вариантах воплощения DT-IL3 представляет собой химический конъюгат.

[0022] В некоторых вариантах воплощения DT-IL3 представляет собой рекомбинантно экспрессируемый белок.

[0023] В некоторых вариантах воплощения DT-IL3 экспрессируется как отдельный полипептид, содержащий каталитический и транслокационный домены дифтерийного токсина и человеческого IL-3. В некоторых вариантах воплощения DT-IL3, экспрессируемый как отдельный полипептид, содержащий каталитический домен и домен транслокации дифтерийного токсина, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 и/или человеческий IL-3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.

[0024] В некоторых вариантах воплощения DT-IL3 содержит от 1 до 388 аминокислотных остатков дифтерийного токсина, связанных пептидной связью с человеческим IL-3. В некоторых вариантах воплощения токсин дифтерии имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 и/или человеческий IL-3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.

[0025] В некоторых вариантах воплощения ингибирование приводит к снижению пролиферации клеток МПН, стабилизации количества клеток МПН и/или снижению количества клеток МПН.

[0026] В некоторых вариантах воплощения ингибирование приводит к уменьшению размера селезенки и/или печени.

[0027] В некоторых вариантах воплощения МПН представляет собой истинную полицитемию, эссенциальный тромбоцитоз, миелофиброз, хронический миеломоноцитарный лейкоз, хронический нейтрофильный лейкоз, хронический эозинофильный лейкоз, системный мастоцитоз, симптоматическое гиперэозинофильное расстройство или другое заболевание костного мозга, которое вызывает выработку избыточных эритроцитов, лейкоцитов и/или тромбоцитов. В некоторых вариантах воплощения МПН представляет собой миелофиброз. В других вариантах воплощения изобретения миелофиброз представляет собой первичный миелофиброз, постполицитемический миелофиброз, посттромбоцитемический миелофиброз, первичный миелофиброз в острой фазе, постполицитемический миелофиброз в острой фазе или посттромбоцитемический миелофиброз в острой фазе.

[0028] В некоторых вариантах воплощения МПН находится в острой фазе.

[0029] В некоторых вариантах воплощения МПН представляет собой первичный миелофиброз в острой фазе, постполицитемический миелофиброз в острой фазе или посттромбоцитемический миелофиброз в острой фазе.

[0030] В некоторых вариантах воплощения один или более ингибиторов Jak включают руксолитиниб.

[0031] В некоторых вариантах воплощения один или более гипометилирующих агентов включают азацитидин, децитабин и/или SGI-110.

[0032] В некоторых вариантах воплощения вводят по меньшей мере один ингибитор Jak и по меньшей мере один агент гипометилирования.

[0033] В некоторых вариантах воплощения по меньшей мере один ингибитор Jak содержит руксолитиниб и по меньшей мере один гипометилирующий агент включает децитабин, азацитидин и/или SGI-110.

[0034] В некоторых вариантах воплощения субъект был невосприимчив к предшествующему лечению одним или более ингибиторами Jak и/или одним или более гипометилирующими агентами. В некоторых вариантах воплощения субъект был невосприимчив к предшествующему лечению ингибитором Jak руксолитинибом. В некоторых вариантах воплощения у субъекта есть МФ.

[0035] В некоторых вариантах воплощения субъект не мог переносить полную дозу предшествующего лечения одним или более ингибиторами Jak и/или одним или более гипометилирующими агентами. В некоторых вариантах воплощения субъект не мог переносить полную дозу предшествующего лечения ингибитором Jak руксолитинибом. В некоторых вариантах воплощения у субъекта есть МФ.

[0036] В некоторых вариантах воплощения у субъекта низкое количество тромбоцитов или он не подходил для лечения руксолитинибом. В некоторых вариантах воплощения у субъекта есть МФ.

[0037] В некоторых вариантах воплощения субъект первоначально отвечал на ингибитор Jak и/или агент гипометилирования. В некоторых вариантах воплощения у субъекта есть МФ.

[0038] В некоторых вариантах воплощения у субъекта присутствуют мутации в генах JAK2, MPL, ASXL1, ТЕТ2 или CALR. В некоторых вариантах воплощения субъект имеет мутацию JAK2V617F.

[0039] В представленном документе также предложены фармацевтические композиции для лечения или ингибирования миелопролиферативного новообразования (МПН) у субъекта, нуждающегося в этом, содержащие эффективное количество конъюгата дифтерийного токсина с человеческим интерлейкином-3 (DT-IL3) и одного или более ингибиторов Jak, и/или одного или более гипометилирующих агентов. В некоторых вариантах воплощения фармацевтическая композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

[0040] В данном документе также представлены способы лечения миелопролиферативного новообразования (МПН) у субъекта, нуждающегося в этом, включающие: а) идентификацию МПН и б) введение эффективного количества конъюгата дифтерийного токсина с интерлейкином-3 человека (DT-IL3) и одного или более ингибиторов Jak, и/или одного или более агентов гипометилирования для субъекта, нуждающегося в этом.

[0041] В некоторых вариантах воплощения МПН идентифицируется с помощью физического обследования, анализов крови, аспирата и биопсии костного мозга, цитогенетического анализа, тестирования на мутации в генах JAK2, MPL, ASXL1, ТЕТ2 или CALR, сатурации артериального кислорода и уровней карбоксигемоглобина, анализа уровней щелочной фосфатазы нейтрофилов, анализа уровня или способности связывания витамина В12 или анализа уровня мочевины в сыворотке крови.

[0042] В некоторых вариантах воплощения МПН идентифицируется путем тестирования мутации JAK2V617F.

[0043] Дополнительные цели и преимущества будут частично изложены в нижеследующем описании, а частично будут очевидны из описания или могут быть изучены на практике. Цели и преимущества будут реализованы и достигнуты посредством элементов и комбинаций, конкретно указанных в прилагаемой формуле изобретения.

[0044] Следует понимать, что, как предшествующее общее описание, так и последующее подробное описание являются только иллюстративными и пояснительными и не ограничивают формулу изобретения.

[0045] Прилагаемые иллюстрации, которые включены в данное описание и составляют его часть, иллюстрируют один (несколько) вариантов воплощения и вместе с описанием служат для объяснения принципов, описанных в данном документе.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0046] ФИГ. 1А-1Е иллюстрируют экспрессию CD123 на бластных клетках и моноцитах у пациентов с хроническим миеломоноцитарным лейкозом (ХММЛ) (N=20) по данным проточной цитометрии. Экспрессию лимфоцитов CD123 использовали в качестве контроля. ФИГ. 1А иллюстрирует среднюю интенсивность флуоресценции CD123 на бластных клетках, моноцитах и лимфоцитах ХММЛ. ФИГ. 1В показывает среднюю интенсивность флуоресценции CD123 на бластных клетках и моноцитах ХММЛ, нормализованную к средней интенсивности флуоресценции CD123 на лимфоцитах. На ФИГ. 1С и 1D показана средняя интенсивность флуоресценции CD123 на бластных клетках (ФИГ. 1С) и моноцитах (ФИГ. 1D) для разных подтипов ХММЛ, ХММЛ-0, ХММЛ-1 и ХММЛ-2. Результаты нормализованы к средней интенсивности флуоресценции CD123 на лимфоцитах. ФИГ. 1Е показывает процент CD123-положительных бластных клеток в подтипах ХММЛ ХММЛ-1 и ХММЛ-2. В целом ФИГ. 1А-1Е демонстрируют, что CD123 выше экспрессируется на бластных клетках и моноцитах по сравнению с лимфоцитами у пациентов с ХММЛ.

[0047] ФИГ. 2А-2С иллюстрируют результаты анализов жизнеспособности клеток с СВ123-экспрессирующей линией клеток K562 после обработки увеличивающимися концентрациями азацитидина (AZA, ФИГ. 2А), DT-IL-3 (SL-401, ФИГ. 2В) или комбинацией AZA и DT-IL3 (ФИГ. 2С) in vitro. AZA и DT-IL3 значительно снижали жизнеспособность клеток K562 по сравнению с одним AZA.

[0048] ФИГ. 3А-3В иллюстрируют результаты анализов жизнеспособности клеток со свежими мононуклеарными клетками из периферической крови пациентов с ХММЛ после лечения AZA, DT-IL3 или комбинацией AZA и DT-IL3 (SL-401) in vitro. На ФИГ. 3А, клетки подвергались воздействию возрастающих концентраций AZA или комбинации AZA и DT-IL3. На ФИГ. 3В, клетки подвергали воздействию 1 мкМ AZA, 4,8 нМ DT-IL3 или комбинации 1 мкМ AZA и 4,8 нМ DT-IL3. В целом, ФИГ. 3А-3В показывают, что AZA и DT-IL3 значительно снижают жизнеспособность первичных мононуклеарных клеток ХММЛ по сравнению с одним AZA.

[0049] ФИГ. 4A-4D иллюстрируют результаты анализов образования колоний с использованием свежих мононуклеарных клеток из периферической крови пациентов с ХММЛ. На ФИГ. 4A-4D показаны результаты для клеток отдельного пациента. На ФИГ. 4А-4С, клетки подвергали воздействию только AZA (1, 5 или 10 мкМ) или комбинации 1 мкМ AZA и DT-IL-3 (2,5 или 10 нМ). Добавление 10 нМ DT-IL3 к 1 мкМ AZA привело к значительному снижению образования колоний. На ФИГ. 4D, клетки подвергали воздействию только DT-IL3 (2,5, 10 или 20 нМ) или комбинации 10 нМ DT-IL3 и AZA (1 или 2,5 мкМ). Добавление AZA к DT-IL3 привело к значительному снижению образования колоний. В целом, ФИГ. 4A-4D показывают, что AZA и DT-IL3 значительно снижали образование колоний мононуклеарных клеток ХММЛ по сравнению с одним AZA или DT-IL3.

ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[0050] Таблица 1 предоставляет список определенных последовательностей, упомянутых в данном документе.

ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ВОПЛОЩЕНИЯ

I. Агенты лечения

[0051] В данной заявке представлены способы лечения миелопролиферативного новообразования (МПН), включающие введение конъюгата дифтерийного токсина с человеческим интерлейкином-3 (DT-IL3) и (а) одного или более ингибиторов Jak и/или (б) одного или более гипометилирующих агентов к субъекту.

[0052] В некоторых вариантах воплощения DT-IL3 и (а) один или более ингибиторов Jak и/или (б) один или более гипометилирующих агентов вводятся в одно и то же время или в один и тот же день. В некоторых вариантах воплощения фармацевтическая композиция содержит DT-IL3 и (а) один или более ингибиторов Jak и/или (б) один или более гипометилирующих агентов.

[0053] В некоторых вариантах воплощения DT-IL3 и (а) один или более ингибиторов Jak и/или (б) один или более гипометилирующих агентов вводятся отдельно. В некоторых вариантах воплощения DT-IL3 и (а) один или более ингибиторов Jak и/или (б) один или более гипометилирующих агентов вводятся в разное время или в разные дни.

А. Конъюгат дифтерийного токсина с интерлейкином-3 человека (DT-IL3)

[0054] «DT-IL3» относится к конъюгату человеческого интерлейкина-3 (IL-3) и дифтерийного токсина (DT). Конъюгаты DT-IL-3 известны в данной области техники, и их введение в соответствии со способами настоящего изобретения рассматривается в настоящем документе. Например, конъюгаты DT-IL-3, описанные в патенте США №7763242; патенте США №8470307; патенте США №9181317; патентах США №9631006 и WO 2008/030539 могут использоваться в соответствии со способами, раскрытыми в настоящем изобретении. Эти ссылки включены в качестве ссылки во всей их полноте для раскрытия DT-IL3. См. также, например, конъюгаты Liu et al. Exp. Hematol. 32:277-281 (2004); Hogge et al. Clin. Cancer Res. 12:1284-1291 (2006); Testa et al. Blood 106:2527-2529 (2005); и Klein et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 288:1244-1249 (2001)), которые также полностью включены в данный документ посредством ссылки.

[0055] В некоторых вариантах воплощения конъюгат содержит каталитический и транслокационный домены дифтерийного токсина, слитые через ковалентную связь с человеческим IL-3. В других вариантах воплощения токсин дифтерии связан через пептидный линкер с частью конъюгата, состоящей из человеческого IL-3. Линкер для конъюгата может состоять, например, из двух, трех, четырех, пяти, десяти, до пятнадцати или пятнадцать аминокислот в длину. Длина линкера может варьироваться для обеспечения оптимального связывания конъюгата. В некоторых вариантах воплощения пептидный линкер состоит из двух-четырех аминокислот в длину. Пептидный линкер может быть гистидин-метиониновым линкером. Гибкий пептидный линкер, хотя и не предназначен для связывания с конкретным механизмом действия, способствует спариванию цепей и сводит к минимуму возможность повторной укладки. Линкерные молекулы широко известны в данной области техники и описаны в Denardo et al, 1998, Clin. Cancer Res. 4:2483-90; Peterson et al, 1999, Bioconjug. Chem. 10:553; и Zimmerman et al, 1999, Nucl. Med. Biol. 26:943-50, каждый из которых полностью включен в данный документ посредством ссылки.

[0056] В некоторых вариантах воплощения заявка предлагает фармацевтические композиции, включающие DT-IL3 по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. В соответствии с настоящим изобретением конъюгат может включать любой домен DT, связанный через любую линкерную молекулу, известную в данной области техники, с любым доменом IL-3. В некоторых вариантах воплощения конъюгат представляет собой DT₃₈₈IL-3, который представляет собой слитый белок N-концевого метионина, за которым следуют аминокислоты 1-388 DT, слитые с полноразмерным зрелым человеческим IL-3 через гистидин-метиониновый аминокислотный линкер.

[0057] В некоторых вариантах воплощения DT-IL3 опосредует селективное нацеливание на клетки, экспрессирующие рецептор интерлейкина-3 (рецептор IL-3). В некоторых вариантах воплощения DT-IL3 нацелен на клетки МПН, экспрессирующие рецептор IL-3. В некоторых вариантах воплощения DT-IL3 нацелен на опухолевые клетки (такие как IL-3R + плазматические дендритные клетки) в микроокружении опухоли.

1. Интерлейкин-3

[0058] Интерлейкин-3 (IL-3) представляет собой цитокин, который поддерживает пролиферацию и дифференцировку мультипотенциальных и коммитированных миелоидных и лимфоидных предшественников. См., например, Nitsche et al. Stem Cells 21: 236-244 (2003). IL-3 может также называться гемопоэтическим фактором роста, фактором роста тучных клеток (ФРТК), мультипотенциальным колониестимулирующим фактором или Р-клеточностимулирующим фактором.

[0059] В некоторых вариантах воплощения конъюгаты DT-IL3 включают полноразмерный зрелый (без сигнального пептида) белок интерлейкина-3 (IL-3) или его часть, аналог или производное. Далее он связывается с рецептором интерлейкина-3 или его субъединицей, которые экспрессируются на поверхности клетки, конъюгированные с помощью рекомбинантной технологии или посредством химической (ковалентной) связи с дифтерийным токсином (DT), или его частью, аналогом или производным, причем токсин не имеет собственного связывающего клетки домена.

[0060] Фрагменты, аналоги и производные IL-3 могут быть полезны в настоящем изобретении при условии, что при слиянии с DT-частью конъюгата такие фрагменты, аналоги и производные сохраняют способность связывать субъединицу IL-3 рецептора или нативный рецептор IL-3, экспрессируемый на поверхности клетки. Кинетика связывания фрагментов, аналогов или производных может оставаться неизменной или варьироваться не более чем на 25%. Полипептид IL-3 может быть любого вида. В некоторых вариантах воплощения IL-3 представляет собой IL-3 млекопитающего, например, полипептид IL-3 представляет собой человеческий IL-3, его аналог, производное или фрагмент.

[0061] В некоторых вариантах воплощения IL-3 представляет собой человеческий IL-3. Примерная аминокислотная последовательность человеческого IL-3 может быть найдена в базе данных GenBank (см., например, Accession No. ААС08706) или UniProt # Р08700. Примерная аминокислотная последовательность IL-3 человека такова:

[0062] В некоторых вариантах воплощения, IL-3 по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичен SEQ ID NO: 1.

2. Токсин дифтерии

[0063] Токсин дифтерии (DT) представляет собой белок с тремя доменами: каталитический домен (аминокислоты 26-112; подчеркнутая последовательность в SEQ ID NO: 1 ниже), соединенный богатой аргинином дисульфидной петлей с доменом транслокации (аминокислоты 225-404; последовательность в SEQ ID NO: 1, выделенная курсивом), за которой следует клеточный связывающий домен (аминокислоты 406-559). Примерная аминокислотная последовательность DT, доступная из GenBank Accession No. AOU74567.1 или UniProt # A0A142BWN1, представляет собой:

[0064] Фрагменты, аналоги и производные DT могут быть полезны в настоящей заявке. В некоторых вариантах воплощения DT состоит из каталитического, транс локационного и связывающего клетки доменов DT. В некоторых вариантах воплощения DT состоит из каталитических и связывающих клетки доменов DT. В некоторых вариантах воплощения DT состоит из транслокационного и связывающего клетки доменов DT. В некоторых вариантах воплощения DT состоит из каталитического домена и домена транслокации DT. В некоторых вариантах воплощения DT содержит одно из следующего: транс локационный, каталитический или связывающий клетки домен.

[0065] Фрагмент DT, конъюгированный с IL-3, представляет собой каталитический домен и домен транслокации DT, представленный примерной SEQ ID NO: 3:

[0066] В некоторых вариантах воплощения, фрагмент DT по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичен SEQ ID NO: 3.

3. Способы получения конъюгатов DT-IL3.

[0067] Конъюгаты DT-IL3 по настоящему изобретению могут быть получены стандартными методами рекомбинантной ДНК или методами синтеза белков, например, с использованием синтезатора пептидов. Например, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая конъюгат по изобретению, может быть синтезирована обычными методами, включая автоматические синтезаторы ДНК. В качестве альтернативы, ПЦР-амплификация фрагментов гена может быть проведена с использованием якорных праймеров, которые вызывают комплементарные выступы между двумя последовательными фрагментами гена, которые впоследствии могут быть отожжены и повторно усилены для создания последовательности химерного гена (см., например, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, 1992).

[0068] Нуклеотидные последовательности, кодирующие конъюгат по изобретению (последовательности IL-3 и дифтерийного токсина), могут быть получены из любой информации, доступной специалистам в данной области техники (то есть из GenBank, литературы или обычным клонированием). Нуклеотидная последовательность, кодирующая конъюгат, может быть вставлена в соответствующий вектор экспрессии, т.е. вектор, который содержит необходимые элементы для транскрипции и трансляции вставленной последовательности, кодирующей белок. В некоторых случаях последовательность дифтерийного токсина может быть усечена, чтобы удалить определенный домен, такой как целевой домен. Методы модификации или усечения ДНК хорошо известны специалистам в области молекулярной биологии. Кроме того, последовательности IL-3 и дифтерийного токсина могут быть лигированы таким образом, чтобы генерировать последовательность ДНК, которая при трансляции создает полипептид, который является соединением по настоящему изобретению. В некоторых вариантах воплощения линкерная последовательность вводится в рекомбинантную последовательность, которая связывает последовательность IL-3 и последовательность дифтерийного токсина. В настоящем изобретении можно использовать множество систем хозяин-вектор для экспрессии последовательности, кодирующей белок. Они включают, но не ограничиваются ими, клеточные системы млекопитающих, инфицированные вирусом (например, вирусом осповакцины, аденовирусом и т.д.); системы клеток насекомых, инфицированные вирусом (например, бакуловирусом); микроорганизмы, такие как дрожжи (например, Pichia), содержащие дрожжевые векторы; или бактерии (такие как E.coli), трансформированные бактериофагом, ДНК, плазмидной ДНК или космидной ДНК. Элементы экспрессии векторов различаются по своей силе и специфике. В зависимости от используемой системы вектор-хозяин может быть использован любой из ряда подходящих элементов транскрипции и трансляции. В некоторых вариантах воплощения белок экспрессируется в Е. coli. В некоторых вариантах воплощения белок экспрессируется в Pichia.

[0069] Экспрессия конъюгата по изобретению может контролироваться любым элементом промотора или энхансера, известным в данной области техники. В некоторых вариантах воплощения экспрессия конъюгата по изобретению регулируется конститутивным промотором. В другом варианте воплощения экспрессия регулируется индуцибельным промотором. В другом варианте воплощения экспрессия регулируется тканеспецифическим промотором.

[0070] В некоторых вариантах воплощения изобретения используется вектор, который содержит промотор, функционально связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей конъюгат, один или более источников репликации и, необязательно, один или более селектируемых маркеров (например, ген устойчивости к антибиотику).

[0071] Векторы экспрессии, содержащие вставки гена, кодирующего конъюгат, могут быть идентифицированы тремя общими подходами: (а) гибридизацией нуклеиновых кислот, (б) наличием или отсутствием функций «маркерного» гена и (в) экспрессией встроенных последовательностей. В первом подходе присутствие гена, кодирующего конъюгат, в векторе экспрессии может быть обнаружено гибридизацией нуклеиновой кислоты с использованием зондов, содержащих последовательности, гомологичные вставленному гену, кодирующему конъюгат. Во втором подходе система рекомбинантный вектор/хозяин может быть идентифицирована и выбрана на основании наличия или отсутствия определенных функций «маркерного» гена (например, активности тимидинкиназы, устойчивости к антибиотикам, фенотипа трансформации, образования окклюзионных тел в бакуловирусе и т.д.), вызванного вставкой в вектор нуклеотидной последовательности, кодирующей конъюгат. Например, если нуклеотидная последовательность, кодирующая конъюгат, вставлена в последовательность маркерного гена вектора, рекомбинанты, содержащие ген, кодирующий вставку конъюгата, могут быть идентифицированы по отсутствию функции маркерного гена. В третьем подходе рекомбинантные векторы экспрессии могут быть идентифицированы путем анализа продукта гена (например, конъюгата), экспрессируемого рекомбинантным веществом. Такие анализы могут быть основаны, например, на физических или функциональных свойствах конъюгата в системах анализа in vitro, например, на связывании с антителом или рецептором IL-3.

[0072] Рекомбинантные конъюгаты могут стабильно экспрессироваться для длительного получения с высоким выходом. Например, могут быть созданы клеточные линии, которые стабильно экспрессируют конъюгат по изобретению. Вместо использования векторов экспрессии, которые содержат вирусные источники репликации, можно трансформировать ДНК линии клеток-хозяев, и контролировать трансформацию соответствующими элементами контроля экспрессии (например, промотором, энхансером, последовательностями, терминаторами транскрипции, сайтами полиаденилирования и т.д.) и селективным маркером. После введения чужеродной ДНК сконструированным клеткам можно дать возможность расти в течение 1-2 дней в обогащенной среде, а затем перевести на селективную среду. Селектируемый маркер в рекомбинантной плазмиде придает устойчивость к отбору и позволяет клеткам стабильно интегрировать плазмиду в свои хромосомы и расти с образованием фокусов, которые, в свою очередь, можно клонировать и размножать в клеточных линиях. Этот способ можно успешно использовать для конструирования клеточных линий, которые экспрессируют конъюгат по изобретению.

[0073] DT-IL3 обычно получают рекомбинантно с использованием клеток бактерий, насекомых или млекопитающих, содержащих нуклеиновую кислоту, сконструированную для экспрессии конъюгированного белка, как описано выше.

[0074] После того, как конъюгат по изобретению был получен методом рекомбинантной экспрессии или химическим синтезом, он может быть очищен любым известным в данной области техники способом очистки белка, например, хроматографией (например, ионным обменом, аффинностью, в частности, по аффинности к специфическому антигену после протеина А и калибровочной колоночной хроматографией), центрифугированием, дифференциальной растворимостью или любым другим стандартным методом очистки белков.

B. Ингибиторы Jak

[0075] В контексте данного документа, «ингибитор Jak» представляет собой агент, который ингибирует одну или более Янус-киназ (Jak). Ингибитор Jak может быть любым агентом, который ингибирует один или более Jak, независимо от того, оказывает ли этот агент другие фармацевтические эффекты. Jak включает Jakl, Jak2, Jak3 и Tyk2. В некоторых вариантах воплощения ингибитор Jak ингибирует Jakl или Jak2. В некоторых вариантах воплощения ингибитор Jak представляет собой ингибитор Jak2/Jakl. В некоторых вариантах воплощения ингибитор Jak может также ингибировать другие киназы.

[0076] Янус-киназы опосредуют передачу сигналов определенных цитокинов и факторов роста, критических для кроветворения и иммунной функции. В некоторых вариантах воплощения ингибирование одной или более Jak снижает спленомегалию и уровни циркулирующих цитокинов.

[0077] В некоторых вариантах воплощения один или более ингибиторов Jak включают руксолитиниб, гандотиниб, момелотиниб, пакритиниб, CHZ868, NS-018, SRC, тофацитиниб или итацитиниб. В некоторых вариантах воплощения ингибитор Jak, используемый в соответствии с некоторыми из способов, представленных в настоящем документе, представляет собой руксолитиниб.

C. Гипометилирующие агенты

[0078] В контексте данного документа, термин «гипометилирующий агент» представляет собой любое лекарственное средство, которое ингибирует метилирование ДНК (т.е. добавление метильной группы к нуклеотиду ДНК). Агент гипометилирования может быть любым агентом, ингибирующим метилирование ДНК, независимо от того, оказывает ли этот агент другие фармацевтические эффекты.

[0079] В некоторых вариантах воплощения гипометилирующий агент блокирует активность ДНК-метилтрансферазы (т.е. соединение является ингибитором ДНК-метилтрансферазы или ингибитором DNMT). В некоторых вариантах воплощения гипометилирующий агент снижает метилирование ДНК, не вызывая существенного подавления синтеза ДНК. В некоторых вариантах воплощения агент гипометилирования восстанавливает нормальную функцию генов. В некоторых вариантах воплощения гипометилирующий агент вызывает гибель быстро делящихся клеток.

[0080] В некоторых вариантах воплощения один или более гипометилирующих агентов включают азацитидин, децитабин и/или SGI-110.

D. Дозировка

[0081] Агенты по настоящему изобретению можно дозировать в любой клинически значимой дозе. Под «клинически значимым» подразумевается, что доза агента оказывает влияние на субъекта. В некоторых вариантах воплощения комбинации агентов, раскрытые в данном документе, позволяют дозировать один или более агентов на более низком уровне дозировки, чем доза, при которой указанный агент будет иметь эффект при дозировании в виде единственного агента. Например, лечение DT-IL3 вместе с одним или более ингибиторами Jak и/или одним или более гипометилирующими агентами обеспечивает клинически значимые эффекты, которые не наблюдались бы для той же дозы ингибитора Jak или гипометилирующего агента при дозировании в виде единственного агента.

[0082] В некоторых вариантах воплощения один или более агентов вводятся в максимально переносимой дозе. «Максимальная переносимая доза», в контексте данного документа, относится к наивысшей дозе агента, которую может переносить отдельный пациент. Другими словами, побочные эффекты у данного пациента могут определять максимально переносимую дозу. Побочные эффекты могут ограничивать возможность назначения более высоких доз препарата, чем максимально переносимая доза. Следовательно, максимальная переносимая доза для данного пациента может быть ниже, чем те, которые указаны в информации о назначении для лечения или обычно используемые в клинической практике. Максимальная переносимая доза может иметь ограниченную или неклиническую эффективность у пациента.

1. Иллюстративные примеры доз DT-IL3

[0083] В некоторых вариантах воплощения DT-IL3 вводят в дозе 1 мкг/кг или больше, 2 мкг/кг или больше или 4 мкг/кг или больше. В некоторых вариантах воплощения DT-IL3 вводят в дозе от 2 мкг/кг до 20 мкг/кг или от 9 мкг/кг до 20 мкг/кг. В некоторых вариантах воплощения DT-IL3 вводят в дозе от 4 мкг/кг до 12 мкг/кг или от 9 мкг/кг до 12 мкг/кг. В некоторых вариантах воплощения DT-IL3 вводят в дозе 5 мкг/кг. В некоторых вариантах воплощения DT-IL3 вводят в дозе 7 мкг/кг. В некоторых вариантах воплощения DT-IL3 вводят в дозе 9 мкг/кг. В некоторых вариантах воплощения DT-IL3 вводят в дозе 12 мкг/ кг.

[0084] В некоторых вариантах воплощения DT-IL3 вводят в дозе, которая является максимально переносимой.

2. Типовые дозы ингибиторов Янус-киназ

[0085] В некоторых вариантах воплощения один или более ингибиторов Jak включают руксолитиниб. В некоторых вариантах воплощения руксолитиниб вводят в дозах 0,5, 1, 2,5, 5, 10, 15, 20 или 25 мг перорально.

[0086] В некоторых вариантах воплощения гандотиниб вводят в дозах 0,5, 1, 2,5, 5, 10, 15, 30, 60, 90 или 120 мг перорально.

[0087] В некоторых вариантах воплощения момелотиниб вводится в дозах 0,5, 1, 2,5, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300 или 400 мг перорально.

[0088] В некоторых вариантах воплощения пакритиниб вводится в дозах 0,5, 1, 2,5, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300 или 400 мг перорально.

[0089] В некоторых вариантах воплощения CHZ868 вводится в дозах 0,5, 1, 2,5, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300 или 400 мг перорально.

[0090] В некоторых вариантах воплощения NS-018 вводится в дозах 0,5, 1, 2,5, 5, 10, 15, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300 или 400 мг перорально.

[0091] В некоторых вариантах воплощения SRC вводят в дозах 0,5, 1, 2,5, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300 или 400 мг перорально.

[0092] В некоторых вариантах воплощения тофацитиниб вводят в дозах 0,5, 1, 2,5, 5, 10, 15, 20, 25 или 30 мг перорально.

[0093] В некоторых вариантах воплощения итацитиниб вводится в дозах 0,5, 1, 2,5, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300 или 400 мг перорально.

[0094] В некоторых вариантах воплощения ингибитор Jak вводят в дозе, которая является максимально переносимой.

3. Иллюстративные примеры доз гипометилирующих агентов

[0095] В некоторых вариантах воплощения азацитидин (Vidaza®) дозируется в дозе 75 мг/м² или меньше. В некоторых вариантах воплощения азацитидин дозируется в дозах 1, 2,5, 5, 10, 15, 20, 25, 37,5, 50, 75 или 100 мг/м² путем непрерывной внутривенной инфузии или подкожной инъекции.

[0096] В некоторых вариантах воплощения децитабин (Dacogen®) вводится в дозе 45 мг/м²/день или меньше. В некоторых вариантах воплощения децитабин (Dacogen®) дозируется из расчета 1, 5, 10, 15 20, 33, или 45 мг/м²/день. Инфузия может представлять собой однократную ежедневную непрерывную внутривенную инфузию или несколько непрерывных внутривенных инфузий в течение дня.

[0097] В некоторых вариантах воплощения SGI-110 (гвадецитабин) дозируется в дозах 1, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30 или 60 мг/м² путем подкожной инъекции.

[0098] В некоторых вариантах воплощения гипометилирующий агент вводят в максимально переносимой дозе.

[0099] В некоторых вариантах воплощения субъект предварительно получает лекарства от тошноты и рвоты перед введением гипометилирующего агента.

II. Способы лечения

[00100] В некоторых вариантах воплощения DT-IL3 вводят с (а) одним или более ингибиторами Jak и/или (б) еще одним гипометилирующим агентом для лечения МПН.

[00101] В некоторых вариантах воплощения способ лечения включает введение субъекту DT-IL3 и одного или более ингибиторов Jak.

[00102] В некоторых вариантах воплощения способ лечения включает введение субъекту DT-IL3 и одного или более гипометилирующих агентов.

[00103] В некоторых вариантах воплощения способ лечения включает введение субъекту DT-IL3, одного или более ингибиторов Jak и одного или более гипометилирующих агентов. В некоторых вариантах воплощения вводят по меньшей мере один ингибитор Jak и по меньшей мере один агент гипометилирования. В некоторых вариантах воплощения по меньшей мере один ингибитор Jak включает руксолитиниб и по меньшей мере один гипометилирующий агент включает децитабин, азацитидин и/или SGI-110.

[00104] В некоторых вариантах воплощения способ лечения включает введение субъекту DT-IL3 и децитабина.

[00105] В некоторых вариантах воплощения способ лечения включает введение субъекту DT-IL3 и азацитидина.

[00106] В некоторых вариантах воплощения способ лечения включает введение субъекту DT-IL3 и SGI-110.

[00107] В контексте данного документа, термины «субъект» и «пациент» используются взаимозаменяемо. В контексте данного документа, термин «субъект» относится к животному. В некоторых вариантах воплощения животное представляет собой млекопитающее, не являющееся приматом (например, корова, свинья, лошадь, кошка, собака, крыса и т.д.) или являющееся приматом (например, обезьяна и человек). В некоторых вариантах воплощения субъектом является человек. В некоторых вариантах воплощения субъект представляет собой животное, отличное от человека, такое как сельскохозяйственное животное (например, лошадь, свинья или корова) или домашнее животное (например, собака или кошка). В некоторых вариантах воплощения субъект представляет собой пожилого человека. В некоторых вариантах воплощения субъектом является взрослый человек. В некоторых вариантах воплощения субъектом является ребенок. В некоторых вариантах воплощения субъектом является педиатрический человек (т.е. человек младше 18 лет). В некоторых вариантах воплощения субъектом является младенец.

[00108] В некоторых вариантах воплощения у субъекта неблагоприятная цитогенетика. Благоприятная или неблагоприятная цитогенетика у субъектов определяется на основании результатов выживаемости. Неблагоприятная цитогенетика относится к профилю цитогенетического риска, связанного с неблагоприятным исходом. Неблагоприятная цитогенетика у субъекта с МФ может включать, например, сложный кариотип (более 3 аномалий перестройки) или одну или две аномалии, которые включают трисомию 8, делению 7/7q, инверсию 17q, инверсию 3, делению 5/5q, делению 12р, или перестройку 11q23, и благоприятная цитогенетика включает все другие сценарии, включая нормальный кариотип.

[00109] В некоторых вариантах воплощения субъект был невосприимчив к предшествующему лечению одним или более ингибиторами Jak и/или одним или более гипометилирующими агентами. В контексте данного документа, субъект является «невосприимчивым» к предшествующему лечению, если пациенту не удалось достичь ответа на терапию, то есть определено, что терапия не является терапевтически эффективной, например: неспособность достичь клинической конечной точки, включая любой ответ, увеличенная продолжительность ответа, увеличенная продолжительность отсутствия болезни, выживаемость, выживаемость без рецидивов, выживаемость без прогрессировать и общая выживаемость. В некоторых вариантах воплощения субъект был невосприимчив к предшествующему лечению руксолитинибом. В некоторых вариантах воплощения субъект, не поддающийся предшествующему лечению руксолитинибом, страдает миелофиброзом (МФ).

[00110] В некоторых вариантах воплощения субъект не мог переносить полную дозу предшествующего лечения одним или более ингибиторами Jak и/или одним или более гипометилирующими агентами. В контексте данного документа, термин «полная доза» относится к дозе(ам), указанной(ым) в информации о назначении, и/или дозе, обычно используемой в клинической практике. В некоторых вариантах воплощения максимальная переносимая доза для данного пациента была ниже полной дозы. Другими словами, субъект не мог переносить полную дозу предшествующего лечения из-за побочных эффектов. В некоторых вариантах воплощения субъект не мог переносить полную дозу предшествующего лечения руксолитинибом. В некоторых вариантах воплощения субъект, который не мог переносить полную дозу предшествующего лечения руксолитинибом, имеет МФ.

[00111] В некоторых вариантах воплощения у субъекта низкое количество тромбоцитов или он не подходил для лечения руксолитинибом. В некоторых вариантах воплощения у субъекта с низким количеством тромбоцитов или у субъекта, не подходящего для лечения руксолитинибом, имеется МФ. В некоторых вариантах воплощения низкое количество тромбоцитов измеряется как количество тромбоцитов на уровне 5×10⁹/л или ниже, на уровне или ниже 10×10⁹/л, на уровне или ниже 20×10⁹/л, при 30×10⁹/л или ниже, на уровне или ниже 40×10⁹/л, или на уровне или ниже 50×10⁹/л. В некоторых вариантах воплощения пациенты могут не подходить для лечения руксолитинибом из-за почечной или печеночной недостаточности.

[00112] В некоторых вариантах воплощения субъект ранее отвечал на ингибитор Jak и/или агент гипометилирования. В некоторых вариантах воплощения субъект, который ранее отвечал на ингибитор Jak и/или агент гипометилирования, имеет МФ. В некоторых вариантах воплощения субъект ранее отвечал на руксолитиниб. Был охарактеризован ряд причин неэффективности предшествующей терапии МФ, таких как миелосупрессия, лекарственная устойчивость и сохранение основного злокачественного клона (см. Pettit and Odenike Curr Hematol Malig Rep. 12(6):611-624 (2017)).

А. Миелопролиферативное новообразование

[00113] В некоторых вариантах воплощения, МПН представляет собой истинную полицитемию (ИП), эссенциальный тромбоцитоз (ЭТ), миелофиброз (МФ), хронический миеломоноцитарный лейкоз (ХММЛ), хронический нейтрофильный лейкоз, хронический эозинофильный лейкоз, системный мастоцитоз (СМ), симптоматическую гиперемию, расстройство или другое заболевание костного мозга, которое вызывает выработку избыточных эритроцитов, лейкоцитов и/или тромбоцитов. В некоторых вариантах воплощения МПН представляет собой первичное эозинофильное заболевание (ПЭЗ).

[00114] В некоторых вариантах воплощения МПН представляет собой миелофиброз (МФ). МФ характеризуется замещением костного мозга рубцовой тканью. При рубцевании костного мозга может образовываться недостаточное количество клеток крови, что может привести к анемии, кровотечениям и риску инфицирования. Печень и селезенка могут увеличиваться, чтобы попытаться произвести дополнительные клетки крови.

[00115] В некоторых вариантах воплощения изобретения МФ представляет собой первичный МФ (ПМФ), постполицитемический МФ (пост-ИП МФ), посттромбоцитемический МФ (пост-ЭТ МФ), первичный МФ в острой фазе (ПМФ-ОФ), пост-ИП МФ в острой фазе или пост-ЭТ МФ в острой фазе.

[00116] В некоторых вариантах воплощения МПН находится в острой фазе.

[00117] В некоторых вариантах воплощения, МПН представляет собой ПМФ-ОФ, пост-ИП МФ в острой фазе или пост-ЭТ МФ в острой фазе.

B. Лечение и идентификация субъектов с МПН

[00118] В некоторых вариантах воплощения, способ лечения МПН у субъекта, нуждающегося в этом, включает определение МПН и введение эффективного количества DT-IL3 и одного или более ингибиторов Jak и/или одного или более гипометилирующих агентов, субъекту, нуждающемуся в этом.

[00119] В некоторых вариантах воплощения, МПН идентифицируется с помощью физического обследования, анализов крови, аспирата и биопсии костного мозга, цитогенетического анализа, тестирования на мутации в генах JAK2, MPL, ASXL1, ТЕТ2 или CALR, сатурации артериального кислорода и уровней карбоксигемоглобина, анализа уровня щелочной фосфатазы нейтрофилов, анализа уровня витамина В12, или способности его связывания, или анализа уровня мочевины в сыворотке крови. В некоторых вариантах воплощения мутация в гене JAK2 представляет собой мутацию JAK2V617F.

[00120] В некоторых вариантах воплощения у пациента есть мутации в генах JAK2, MPL, ASXL1, ТЕТ2 или CALR. В некоторых вариантах воплощения у пациента есть мутация JAK2V617F.

C. Способы измерения клинической эффективности

[00121] В некоторых вариантах воплощения ингибирование МПН приводит к снижению пролиферации клеток МПН, стабилизации количества клеток МПН и/или снижению количества клеток МПН. В контексте данного документа, термин «клетки МПН» относится к любой аномальной клетке костного мозга, которая дает начало МПН.

[00122] В некоторых вариантах воплощения ингибирование МПН приводит к уменьшению размера селезенки и/или печени. В некоторых вариантах воплощения размер селезенки измеряется с помощью МРТ или КТ в разные моменты времени до и после лечения. В некоторых вариантах воплощения у субъекта с МПН аномально большая селезенка (т.е. спленомегалия) или аномально большая печень. В некоторых вариантах воплощения изобретения при физическом осмотре спленомегалия определяется, начиная от более 5 см ниже реберного края (НРК).

[00123] В некоторых вариантах воплощения у субъекта с МПН нет аномально большой селезенки или аномально большой печени. В некоторых вариантах воплощения у субъекта с МПН отсутствует исходная спленомегалия (≤5 см НРК).

[00124] В некоторых вариантах воплощения уменьшение размера селезенки представляет собой уменьшение размера селезенки по меньшей мере на 25%, по меньшей мере 29%, по меньшей мере 33%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40% или по меньшей мере на 50%. В некоторых вариантах воплощения уменьшение размера селезенки представляет собой уменьшение размера селезенки на более, чем 33% у субъектов с исходной спленомегалией. Субъекты, которые соответствуют параметрам снижения показателей селезенки, являются терапевтическими «респондентами селезенки».

[00125] В некоторых вариантах воплощения клиническая эффективность измеряется по улучшению спленомегалии. В некоторых вариантах воплощения улучшение спленомегалии в группе субъектов измеряется процентом респондентов селезенки.

[00126] В некоторых вариантах воплощения улучшение спленомегалии измеряется процентным изменением спленомегалии, измеренным в сантиметрах пальпации ниже левого реберного края.

[00127] В некоторых вариантах воплощения у субъекта есть МФ. Критерии ответа для МФ включают, но не ограничиваются ими, примерные критерии ответа в таблице 2 ниже от Международной рабочей группы -MRT и ELN для МФ.

[00128] По материалам Tefferi et al., Blood 122 (6): 1395-98 (2013). В таблице 2 ПО = полный ответ или ремиссия, ЧО = частичный ответ или ремиссия, ЭМГ = экстрамедуллярный гематопоэз, ЛБК = левый береговой край и ВПН = верхний предел нормы. * Слайды костного мозга исходного уровня и после лечения должны интерпретироваться за один присест в рамках централизованного процесса обзора. Цитогенетические и молекулярные ответы не требуются для определения ПО. Классификация МФ соответствует европейской классификации (Thiele et al., Haematologica 90: 1128 (2005)). Незрелые миелоидные клетки объединяют бластные клетки + промиелоциты + миелоциты + метамиелоциты + ядросодержащие эритроциты. У пациентов, подвергшихся спленэктомии, допускается наличие менее 5% незрелых миелоидных клеток. § См. выше определения реакции анемии, реакции селезенки и прогрессирующего заболевания. Увеличение тяжести анемии означает возникновение новой зависимости от переливания крови или снижение уровня гемоглобина на более, чем 20 г/л по сравнению с исходным уровнем до лечения, которое длится по меньшей мере 12 недель. Увеличение тяжести тромбоцитопении или нейтропении определяется как снижение на 2 степени (от исходного уровня до лечения) количества тромбоцитов или абсолютного количества нейтрофилов в соответствии с Общими критериями терминологии для нежелательных явлений (СТСАЕ) версии 4.0. Кроме того, для отнесения к КУ требуется минимальное количество тромбоцитов больше 25000×10⁹/л и абсолютное количество нейтрофилов больше 0,5×10⁹/л. Применимо только к пациентам с исходным уровнем гемоглобина менее 100 г/л. У пациентов, не отвечающих строгим критериям зависимости от переливания крови на момент включения в исследование, но получивших переливание крови в течение предыдущего месяца, в качестве исходного уровня следует использовать уровень гемоглобина перед переливанием. Зависимость от переливания крови до включения в исследование определяется как переливание по меньшей мере 6 единиц упакованных эритроцитов (PRBC) за 12 недель до включения в исследование при уровне гемоглобина менее 85 г/л при отсутствии кровотечения или анемии, вызванной лечением. Кроме того, самый последний эпизод переливания крови должен был произойти за 28 дней до включения в исследование. Ответ у пациентов, зависимых от переливания крови, требует отсутствия каких-либо переливаний PRBC в течение любого последовательного «скользящего» 12-недельного интервала во время фазы лечения, ограниченного уровнем гемоглобина больше 85 г/л. # У пациентов с удаленной селезенкой пальпируемая гепатомегалия заменяется той же стратегией измерения. ** Ответы селезенки или печени должны быть подтверждены визуализирующими исследованиями, при которых требуется уменьшение объема селезенки на более чем 35%, по оценке МРТ или КТ. Кроме того, уменьшение объема селезенки или печени на более чем 35% по данным МРТ или КТ представляет собой ответ независимо от того, что сообщается при физическом обследовании. Симптомы оцениваются с помощью MPN-SAF TSS. MPN-SAF TSS оценивается самими пациентами и включает в себя усталость, концентрацию, раннее насыщение, отсутствие активности, ночную потливость, зуд, боль в костях, дискомфорт в животе, потерю веса и лихорадку. Оценка составляет от 0 (отсутствует/настолько хорошо, насколько это возможно) до 10 (наихудший вариант/настолько плохо, насколько это возможно) по каждому пункту. MPN-SAF TSS является суммой всех индивидуальных оценок (шкала от 0 до 100). Симптоматическая реакция требует более 50% снижения MPN-SAF TSS. Для определения прогрессирующего заболевания по поводу спленомегалии требуется подтверждение МРТ или компьютерной томографии, показывающих увеличение объема селезенки на более чем 25% по сравнению с исходным уровнем. Базовые значения, как для физического осмотра, так и для визуализационных исследований относятся к исходному уровню до лечения, а не к измерениям после лечения.

III. Введение агентов

[00129] Эти способы включают различные схемы введения DT-IL3 и одного или более ингибиторов Jak и/или гипометилирующих агентов.

[00130] В некоторых вариантах воплощения DT-IL3 вводят по меньшей мере один раз в неделю. В некоторых вариантах воплощения DT-IL3 вводят по меньшей мере два раза в неделю. В некоторых вариантах воплощения DT-IL3 вводят по меньшей мере три раза в неделю.

[00131] В некоторых вариантах воплощения один или более ингибиторов Jak вводят по меньшей мере один раз в неделю. В некоторых вариантах воплощения один или более ингибиторов Jak вводят по меньшей мере два раза в неделю. В некоторых вариантах воплощения один или более ингибиторов Jak вводят по меньшей мере три раза в неделю. В некоторых вариантах воплощения один или более ингибиторов Jak вводят через день. В некоторых вариантах воплощения один или более ингибиторов Jak вводят каждый день. В некоторых вариантах воплощения один или более ингибиторов Jak вводят более одного раза в день. В некоторых вариантах воплощения один или более ингибиторов Jak вводят два раза в день.

[00132] В некоторых вариантах воплощения один или более гипометилирующих агентов вводят по меньшей мере один раз в неделю. В некоторых вариантах воплощения один или более гипометилирующих агентов вводят по меньшей мере два раза в неделю. В некоторых вариантах воплощения один или более гипометилирующих агентов вводят по меньшей мере три раза в неделю. В некоторых вариантах воплощения один или более гипометилирующих агентов вводят каждый день. В некоторых вариантах воплощения один или более гипометилирующих агентов вводят два раза в день. В некоторых вариантах воплощения один или более гипометилирующих агентов вводят три раза в день. В некоторых вариантах воплощения один или более гипометилирующих агентов вводят ежедневно в течение периода времени, за которым следует период, когда они не вводятся. В некоторых вариантах воплощения один или более гипометилирующих агентов вводят ежедневно в течение периода до 7 дней.

[00133] В некоторых вариантах воплощения DT-IL3 и (а) один или более ингибиторов Jak и/или (б) один или более гипометилирующих агентов вводятся в течение одной недели или более. В некоторых вариантах воплощения DT-IL3 и (а) один или более ингибиторов Jak и/или (б) один или более гипометилирующих агентов вводятся в течение двух недель или более. В некоторых вариантах воплощения DT-IL3 и (а) один или более ингибиторов Jak и/или (б) один или более гипометилирующих агентов вводят по меньшей мере в течение 3 дней подряд.

А. Циклы лечения

[00134] В некоторых вариантах воплощения DT-IL3 и (а) один или более ингибиторов Jak и/или (б) один или более гипометилирующих агентов вводят в нескольких циклах лечения.

[00135] В контексте данного документа, «цикл лечения» относится к периоду введения DT-IL3 и (а) одного или более ингибиторов Jak и/или (б) одного или более гипометилирующих агентов. В некоторых вариантах воплощения существует один цикл лечения. В некоторых вариантах воплощения существует несколько циклов лечения.

[00136] В некоторых вариантах воплощения существует период времени между несколькими циклами лечения, когда DT-IL3 и (а) один или более ингибиторов Jak и/или (б) один или более гипометилирующих агентов не вводятся. В некоторых вариантах воплощения циклы лечения или их комбинация разделены по меньшей мере на 1 неделю, по меньшей мере на 2 недели, по меньшей мере на 3 недели, по меньшей мере на 4 недели или по меньшей мере на 5 недель.

[00137] В некоторых вариантах воплощения DT-IL3 вводят по меньшей мере 3 дня подряд каждый 21 день в течение четырех циклов, затем каждые 28 дней в течение 3 циклов, а затем каждые 42 дня. В некоторых вариантах воплощения один или более ингибиторов Jak и/или один или более гипометилирующих агентов вводятся одновременно с DT-IL3.

[00138] В некоторых вариантах воплощения один или более ингибиторов Jak и/или один или более гипометилирующих агентов вводятся по меньшей мере один раз в день или по меньшей мере два раза в день.

[00139] В некоторых вариантах воплощения один или более ингибиторов Jak и/или один или более гипометилирующих агентов вводят по меньшей мере в течение первых 3 дней, по меньшей мере первых 4 дней, по меньшей мере первых 5 дней, по меньшей мере первых 6 дней или не менее 7 дней по меньшей мере одного цикла.

[00140] В некоторых вариантах воплощения, один или более ингибиторов Jak и/или один или более гипометилирующих агентов вводят по меньшей мере в течение первых 3 дней, по меньшей мере первых 4 дней, по меньшей мере первых 5 дней, по меньшей мере первых 6 дней или по меньшей мере первых 7 дней 28-дневного цикла по 3 цикла. В некоторых вариантах воплощения DT-IL3 вводят одновременно с одним или более ингибиторами Jak и/или одним или более гипометилирующими агентами. В некоторых вариантах воплощения один или более ингибиторов Jak и/или один или более гипометилирующих агентов вводят после введения DT-IL3 в течение четырех 21-дневных циклов.

[00141] В некоторых вариантах воплощения DT-IL3 и (а) один или более ингибиторов Jak и/или (б) один или более гипометилирующих агентов вводятся до тех пор, пока не будет достигнут прогресс в заболевании и/или возникнет неприемлемая токсичность, по усмотрению, например, лечащего врача.

IV. Фармацевтические композиции

[00142] В некоторых вариантах воплощения фармацевтическая композиция для лечения или ингибирования миелопролиферативного новообразования (МПН) у субъекта, нуждающегося в этом, содержит эффективное количество DT-IL3 и одного или более ингибиторов Jak и/или одного или более гипометилирующих агентов. В некоторых вариантах воплощения фармацевтическая композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

[00143] В некоторых вариантах воплощения изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую эффективное количество конъюгата по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. В некоторых вариантах воплощения фармацевтическая композиция содержит эффективное количество конъюгата по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. Фармацевтические композиции подходят для ветеринарии и/или введения человеку.

[00144] Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть в любой форме, которая позволяет введение композиции субъекту.

[00145] Материалы, используемые при приготовлении фармацевтических композиций, могут быть нетоксичными в используемых количествах. Для специалистов в данной области техники, очевидно, что оптимальная дозировка активного ингредиента(ов) в фармацевтической композиции будет зависеть от множества факторов. Соответствующие факторы включают, без ограничения, тип субъекта (например, человек), общее состояние здоровья субъекта, тип рака, которым страдает субъект, использование композиции как часть схемы приема нескольких лекарственных препаратов, конкретную форму состава по изобретению и способ введения.

[00146] Термин «носитель» относится к разбавителю, адъюванту или наполнителю, с которым вводят композицию по настоящему изобретению. Могут использоваться любые вспомогательные вещества, стабилизирующие вещества, загустители, смазывающие вещества и красители. В одном варианте воплощения при введении субъекту композиции по изобретению и фармацевтически приемлемые носители являются стерильными. Вода может быть носителем, когда композицию по изобретению вводят внутривенно. Солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина также можно использовать в качестве жидких носителей, особенно для растворов для инъекций. Данные композиции, при необходимости, могут также содержать небольшие количества буферных агентов рН.

[00147] Жидкие композиции по изобретению, независимо от того, представляют ли они растворы, суспензии или другую подобную форму, также могут включать одно или более из следующего: стерильные разбавители, такие как вода для инъекций, солевой раствор, физиологический раствор, раствор Рингера, изотонический хлорид натрия, нелетучие масла, такие как синтетические моно- или диглицериды, которые могут служить в качестве растворителя или суспензирующей среды, полиэтиленгликоли, глицерин, циклодекстрин, пропиленгликоль или другие растворители; антибактериальные агенты, такие как бензиловый спирт или метилпарабен; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; хелатирующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота; буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты; и агенты для регулирования тонуса, такие как хлорид натрия или декстроза. Парентеральная композиция может быть заключена в ампулу, одноразовый шприц или флакон для многократных доз из стекла, пластика или другого материала. В некоторых вариантах воплощения физиологический раствор является адъювантом. Композиция для инъекций может быть стерильной.

[00148] Фармацевтические композиции содержат эффективное количество композиции по изобретению, так что будет получена подходящая дозировка. Обычно это количество составляет по меньшей мере 0,01% композиции по настоящему изобретению от веса фармацевтической композиции. При пероральном введении это количество может варьироваться от 0,1% до 80% от веса фармацевтической композиции. Пероральные фармацевтические композиции могут включать от 4% до 50% композиции по изобретению от веса фармацевтической композиции. Фармацевтические композиции могут быть приготовлены таким образом, чтобы парентеральная дозированная единица содержала от 0,01% до 2% от веса композиции по настоящему изобретению.

[00149] Фармацевтические композиции можно вводить любым удобным путем, например, путем инфузии или болюсной инъекции, путем абсорбции через эпителиальные или кожно-слизистые оболочки (например, слизистую оболочку полости рта, слизистую оболочку прямой кишки и кишечника и т.д.). Введение может быть системным или местным. Известны различные системы доставки, например микрочастицы, микрокапсулы, капсулы и т.д., и они могут быть полезны для введения композиции по изобретению. Способы введения могут включать, но не ограничиваются ими, пероральное введение и парентеральное введение; парентеральное введение, включая, но, не ограничиваясь ими, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное, внутривенное, подкожное введение; интраназальный, эпидуральный, сублингвальный, интраназальный, внутримозговой, внутрижелудочковый, интратекальный, интравагинальный, трансдермальный, ректальный способы, посредством ингаляции или местно в уши, нос, глаза или кожу. Способ введения остается на усмотрение практикующего врача и будет частично зависеть от места заболевания (например, места рака, раковой опухоли или предракового состояния).

[00150] В некоторых вариантах воплощения композиции по настоящему изобретению вводят парентерально. В некоторых вариантах воплощения композиции по настоящему изобретению вводят внутривенно. В другом варианте воплощения композиции по изобретению вводят путем непрерывной инфузии. В конкретном варианте воплощения композиции по настоящему изобретению вводят инфузией, которая длится 15 минут, 20 минут, 30 минут, 45 минут, 1 час или 2 часа.

[00151] В некоторых вариантах воплощения может быть желательно введение одной или более композиций по настоящему изобретению локально в область, нуждающуюся в лечении. Этого можно достичь, например, а не в качестве ограничения, путем местной инфузии во время операции; местного применения, например, в сочетании с повязкой на рану после операции; путем инъекции; с помощью катетера; с помощью суппозитория; или с помощью имплантата, который представляет собой пористый, непористый или гелеобразный материал, включая мембраны, такие как сиалластические мембраны или волокна. В некоторых вариантах воплощения одну или более композиций по настоящему изобретению можно вводить внутрибрюшинно.

[00152] В еще одном варианте воплощения композиции по настоящему изобретению можно доставлять в системе с контролируемым высвобождением.

[00153] В некоторых вариантах воплощения для доставки композиций по настоящему изобретению можно использовать насос (см., например, Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 1987, 14, 201; Buchwald et al., Surgery 1980, 88: 507; Saudek et al., N. Engl. J. Med. 1989, 321: 574). В некоторых вариантах воплощения помпа может быть, но не ограничивается, инсулиноподобной помпой.

[00154] Настоящие композиции могут принимать форму растворов, суспензий, таблеток, пилюль, пеллет, капсул, капсул, содержащих жидкости, порошков, составов с замедленным высвобождением, суппозиториев, эмульсий, аэрозолей, спреев, суспензий или любой другой формы, подходящей для использования. Примеры подходящих фармацевтических носителей описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences под авторством E.W. Martin.

[00155] В некоторых вариантах воплощения композиции по настоящему изобретению составляют в соответствии с обычными процедурами в виде фармацевтической композиции, адаптированной для внутривенного введения животным, особенно людям. Обычно носители или наполнители для внутривенного введения представляют собой стерильные изотонические водные буферные растворы. При необходимости композиции могут также включать солюбилизирующий агент. Композиции для внутривенного введения могут необязательно содержать местный анестетик, такой как лигнокаин, для облегчения боли в месте инъекции. Обычно ингредиенты поставляются либо по отдельности, либо в смеси в стандартной лекарственной форме, например, в виде сухого лиофилизированного порошка или безводного концентрата в герметично закрытом контейнере, таком как ампула или саше, с указанием количества активного агента. Если композицию по настоящему изобретению следует вводить путем инфузии, ее можно распределять, например, с помощью бутылки для инфузии, содержащей стерильную воду или физиологический раствор фармацевтического качества. Если композицию по изобретению вводят путем инъекции, может быть предоставлена ампула стерильной воды для инъекций или физиологического раствора, чтобы ингредиенты можно было смешать перед введением.

[00156] Композиции по настоящему изобретению могут включать дополнительный активный агент, выбранный из тех, которые включают, помимо прочего, дополнительный профилактический агент, дополнительный терапевтический агент, противорвотный агент, фактор, стимулирующий гемопоэтические колонии, адъювантную терапию, вакцину или другой иммуностимулирующий агент, агент на основе антитела/фрагмента антитела, антидепрессант и анальгетик. В некоторых вариантах воплощения фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.

[00157] Фармацевтические композиции могут быть приготовлены с использованием методологии, хорошо известной в области фармацевтики. Например, композиция, предназначенная для введения путем инъекции, может быть приготовлена путем объединения композиции по настоящему изобретению с водой с образованием раствора. Поверхностно-активное вещество может быть добавлено для облегчения образования гомогенного раствора или суспензии. Поверхностно-активные вещества представляют собой комплексы, которые могут нековалентно взаимодействовать с композицией изобретения, чтобы облегчить растворение или гомогенное суспензирование композиции изобретения в водной системе доставки.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Тестирование DT-IL3 и гипометилирующего агента in vitro.

[00158] Доклинические исследования проводили с использованием клеточных линий лейкемии человека, а также первичных мононуклеарных клеток периферической крови пациентов с ХММЛ. Чтобы определить активные концентрации как гипометилирующего агента (ГМА) азацитидина (AZA), так и DT-IL3 (SL-401) in vitro, клетки подвергали воздействию возрастающих концентраций AZA, DT-IL3 или их комбинации, а также были выполнены анализы жизнеспособности клеток. В экспрессирующей CD123 клеточной линии K562 IC50 AZA и DT-IL3 составлял 772 мкМ и 4,8 нМ, соответственно (ФИГ. 2А-2С). ФИГ. 2А-2С показывают, что AZA и DT-IL3 значительно снижают жизнеспособность клеток K562 по сравнению с одним AZA.

[00159] Затем были проведены анализы жизнеспособности клеток с использованием свежих мононуклеарных клеток из периферической крови пациентов с ХММЛ, подвергшихся воздействию возрастающих концентраций AZA и DT-IL3 in vitro. IC50 агента AZA, вводимого отдельно, составляла 1442 мкМ, тогда как IC50 комбинации AZA и DT-IL3 (при концентрации 4,8 нМ) составляла 725 мкМ (ФИГ. 3А). Добавление 4,8 нМ DT-IL3 к 1 мкМ AZA в этом анализе вызывало значительное снижение жизнеспособности клеток по сравнению с 1 мкМ AZA, введенным отдельно (ФИГ. 3В; р<0,05).

[00160] В анализах образования колоний с использованием свежих мононуклеарных клеток из периферической крови пациентов с ХММЛ комбинация AZA и DT-IL3 значительно снижала образование колоний по сравнению с агентом AZA, введенным отдельно (ФИГ. 4А-4С, р<0,05). Точно так же добавление AZA к увеличивающимся концентрациям DT-IL3 значительно уменьшало образование колоний по сравнению с агентом DT-IL3, введенным отдельно (ФИГ. 4D, р<0,05). Важно отметить, что комбинированный эффект наблюдался у образцов пациентов с генотипами высокого риска, включая пациентов с мутациями в NRAS / ASXL1 / ТЕТ2 (ФИГ. 4С) и мутациями в SRSF2 / ТЕТ2 / STAG2 (ФИГ. 4А).

[00161] Текущие терапевтические возможности ХММЛ ограничены, и лечение ХММЛ остается значительной неудовлетворенной медицинской потребностью. Хотя терапия гипометилирующими агентами (ГМА) продемонстрировала эффективность при ХММЛ, эффекты часто ограничены по степени и продолжительности. Доклинические данные, в том числе в первичных образцах ХММЛ, демонстрируют потенциальную терапевтическую роль комбинации ГМА и DT-IL3 в ХММЛ. См. ФИГ. 2А-2С, 3А-3В и 4A-4D.

Пример 2. Клинические испытания пациентов, не получавших лечения.

[00162] Клинические испытания могут оценить эффективность DT-IL3 и одного или более ингибиторов Jak и/или одного или более гипометилирующих агентов у не получавших лечения пациентов с МПН. Под «наивным лечением» подразумевается, что эти пациенты ранее не получали лечения от МПН. В частности, эти пациенты не получали ранее лечения ингибитором Jak или гипометилирующим агентом.

[00163] У пациентов в испытании может быть ряд различных типов МПН. Кроме того, у всех пациентов в исследовании может быть миелофиброз.

[00164] Пациентам может быть поставлен диагноз МПН на основании физического обследования, анализов крови, аспирата и биопсии костного мозга, цитогенетического анализа, тестирования на мутации в гене JAK2, MPL, ASXL1, ТЕТ2 или CALR, показателей насыщения артериальной крови кислородом и уровней карбоксигемоглобина, уровня щелочной фосфатазы нейтрофилов, наличия или связывающей способности витамина В12 или уровня мочевины в сыворотке крови.

[00165] В некоторых вариантах воплощения у пациента есть мутации в гене JAK2, MPL, ASXL1, ТЕТ2 или CALR. В некоторых вариантах воплощения у пациента есть мутация JAK2V617F.

[00166] Испытание может иметь адаптивный дизайн. Другими словами, испытание может позволить внести изменения в испытание и/или процедуры во время испытания. В качестве альтернативы в испытании могут быть установлены группы лечения, которые сохраняются на протяжении всего испытания.

[00167] Группы лечения могут включать сравнение DT-IL3 с комбинацией DT-IL3 и одного или более ингибиторов Jak и/или одного или более гипометилирующих агентов.

[00168] Группы лечения могут включать сравнение одного или более ингибиторов Jak с комбинацией DT-IL3 и одного или более ингибиторов Jak и/или одного или более гипометилирующих агентов.

[00169] Группы лечения могут включать сравнение одного или более гипометилирующих агентов с комбинацией DT-IL3 и одного или более ингибиторов Jak и/или одного или более гипометилирующих агентов.

[00170] При адаптивном дизайне пациенты, которые не прошли лечение одним или более гипометилирующими агентами или одним или более ингибиторами Jak, могут начинать лечение комбинацией DT-IL3 и одного или более ингибиторов Jak и/или одного или более гипометилирующих агентов.

[00171] Успех или неудачу лечения можно оценить с помощью стандартных мер, используемых в исследованиях МПН, таких как уменьшение размера селезенки и/или печени. Изменения в составе крови, рецидивы заболевания и выживаемость пациентов также будут оцениваться во время лечения. Во время лечения будут измеряться токсичность и побочные эффекты.

[00172] Можно использовать любые дозы агентов и циклы лечения, описанные в этой заявке. DT-IL3 может быть DT₃₈₈IL-3. Ингибитор Jak может быть руксолитинибом. Один или более гипометилирующих агентов могут представлять собой азацитидин, децитабин и/или SGI-110.

[00173] Заявитель ожидает, что у пролеченных пациентов будет клиническое улучшение.

Пример 3. Клинические испытания пациентов, не поддающихся лечению.

[00174] Клинические испытания могут оценить эффективность DT-IL3 и одного или более ингибиторов Jak и/или одного или более гипометилирующих агентов у пациентов с МПН, которые были невосприимчивы к предыдущему лечению или которые не могли переносить полную дозу предыдущего лечения. Предшествующее лечение может быть одним или более гипометилирующими агентами или одним или более ингибиторами Jak. В качестве предварительного лечения может выступать руксолитиниб.

[00175] Клиническое испытание пациентов, не поддающихся лечению, может не включать терапевтическую группу предыдущего лечения, к которому пациент был невосприимчивым. Клиническое испытание таких пациентов может сравнивать эффективность DT-IL3 и одного или более ингибиторов Jak и/или одного или более гипометилирующих агентов с эффективностью агента, которым пациент ранее не лечился. Например, исследование пациентов, резистентных к руксолитинибу, может включать группу лечения гипометилирующим агентом и группу лечения DT-IL3 и одним или более ингибиторами Jak и/или одним или более гипометилирующими агентами.

[00176] Помимо отбора пациентов, клиническое испытание на пациентах, не поддающихся лечению, может иметь параметры, аналогичные или идентичные клиническому испытанию на пациентах, не получавших лечения.

[00177] Заявитель ожидает, что у пролеченных пациентов будет клиническое улучшение.

ЭКВИВАЛЕНТЫ

[00178] Вышеизложенное письменное описание считается достаточным, чтобы дать возможность специалисту в данной области техники реализовать варианты воплощения на практике. Вышеприведенное описание и примеры подробно описывают определенные варианты воплощения и описывают лучший режим, предполагаемый изобретателями. Однако следует понимать, что независимо от того, насколько подробно вышеизложенное может появиться в тексте, вариант воплощения может быть реализован на практике многими способами и должен толковаться в соответствии с прилагаемой формулой изобретения и любыми ее эквивалентами.

[00179] В контексте данного документа, предполагается, что все числовые значения являются «приблизительными». В контексте данного документа, термин «приблизительно» относится к числовому значению, включая, например, целые числа, дроби и проценты, независимо от того, указаны они или нет явно. Термин «приблизительно» обычно относится к диапазону числовых значений (например, +/- 5-10% от указанного диапазона), которые рядовой специалист в данной области техники счел бы эквивалентными указанному значению (например, имеющими ту же функцию или результат). Когда такие термины, как по меньшей мере и приблизительно, предшествуют списку числовых значений или диапазонов, они корректируют все значения или диапазоны, представленные в списке. В некоторых случаях термин «приблизительно» предусматривает включение числовых значений, округленных до ближайшего значащего числа.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Stemline Therapeutics, Inc.

<120> СПОСОБ КОМБИНАТОРНОЙ ТЕРАПИИ ПРИ ЛЕЧЕНИИ

МИЕЛОПРОЛИФЕРАТИВНЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ КОНЪЮГАТОМ

ДИФТЕРИЙНОГО ТОКСИНА С ИНТЕРЛЕЙКИНОМ-3 ЧЕЛОВЕКА В

КОМБИНАЦИИ С ДРУГИМИ АГЕНТАМИ

<130> 01214-0017-00PCT

<150> US 62/753,145

<151> 2018-10-31

<150> US 62/832,558

<151> 2019-04-11

<160> 3

<170> Патентная версия 3.5

<210> 1

<211> 152

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Ser Arg Leu Pro Val Leu Leu Leu Leu Gln Leu Leu Val Arg Pro

1 5 10 15

Gly Leu Gln Ala Pro Met Thr Gln Thr Thr Ser Leu Lys Thr Ser Trp

20 25 30

Val Asn Cys Ser Asn Met Ile Asp Glu Ile Ile Thr His Leu Lys Gln

35 40 45

Pro Pro Leu Pro Leu Leu Asp Phe Asn Asn Leu Asn Gly Glu Asp Gln

50 55 60

Asp Ile Leu Met Glu Asn Asn Leu Arg Arg Pro Asn Leu Glu Ala Phe

65 70 75 80

Asn Arg Ala Val Lys Ser Leu Gln Asn Ala Ser Ala Ile Glu Ser Ile

85 90 95

Leu Lys Asn Leu Leu Pro Cys Leu Pro Leu Ala Thr Ala Ala Pro Thr

100 105 110

Arg His Pro Ile His Ile Lys Asp Gly Asp Trp Asn Glu Phe Arg Arg

115 120 125

Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Lys Thr Leu Glu Asn Ala Gln Ala Gln Gln

130 135 140

Thr Thr Leu Ser Leu Ala Ile Phe

145 150

<210> 2

<211> 560

<212> Белок

<213> Corynebacterium diphtheriae

<400> 2

Met Ser Arg Lys Leu Phe Ala Ser Ile Leu Ile Gly Ala Leu Leu Gly

1 5 10 15

Ile Gly Ala Pro Pro Ser Ala His Ala Gly Ala Asp Asp Val Val Asp

20 25 30

Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr

35 40 45

Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys

50 55 60

Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser

65 70 75 80

Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn

85 90 95

Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly

100 105 110

Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys

115 120 125

Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly

130 135 140

Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val

145 150 155 160

Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn

165 170 175

Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe

180 185 190

Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala

195 200 205

Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu

210 215 220

Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr

225 230 235 240

Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser

245 250 255

Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu

260 265 270

Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu

275 280 285

Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala

290 295 300

Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp

305 310 315 320

Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly

325 330 335

Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala Val His His Asn Thr Glu Glu

340 345 350

Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala

355 360 365

Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn

370 375 380

Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr

385 390 395 400

Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr Gln Pro Phe Leu His

405 410 415

Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn Thr Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg

420 425 430

Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly His Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu

435 440 445

Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly Val Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly

450 455 460

Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr His Ile Ser Val Asn Gly Arg

465 470 475 480

Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala Ile Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys

485 490 495

Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val Gly Asn Gly Val His Ala Asn Leu

500 505 510

His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser Glu Lys Ile His Ser Asn Glu

515 520 525

Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp

530 535 540

His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser

545 550 555 560

<210> 3

<211> 388

<212> Белок

<213> Corynebacterium diphtheriae

<400> 3

Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn

1 5 10 15

Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln

20 25 30

Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp

35 40 45

Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly

50 55 60

Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val

65 70 75 80

Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val

85 90 95

Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu

100 105 110

Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly

115 120 125

Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser

130 135 140

Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser

145 150 155 160

Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp

165 170 175

Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg

180 185 190

Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val

195 200 205

Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly

210 215 220

Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu

225 230 235 240

Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu

245 250 255

His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val

260 265 270

Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val

275 280 285

Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu

290 295 300

Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala

305 310 315 320

Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser

325 330 335

Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp

340 345 350

Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe

355 360 365

Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His

370 375 380

Lys Thr Arg Pro

385

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к применению конъюгата дифтерийного токсина и человеческого интерлейкина-3 (DT-IL3) совместно с а. ингибитором Jak, выбранным из руксолитиниба и пакритиниба, или б. гипометилирующим агентом, выбранным из азацитидина и децитабина, для лечения и ингибирования миелопролиферативного новообразования. Настоящее изобретение обеспечивает лечение миелопролиферативного новообразования. 2 н. и 15 з.п. ф-лы, 4 ил., 2 табл., 3 пр.

1. Применение конъюгата дифтерийного токсина и человеческого интерлейкина-3 (DT-IL3) и

а. ингибитора Jak, выбранного из руксолитиниба и пакритиниба, или

б. гипометилирующего агента, выбранного из азацитидина и децитабина,

для лечения миелопролиферативного новообразования (МПН) у нуждающегося в этом субъекта, представляющего собой человека, отличающееся тем, что DT-IL3 и ингибитор Jak или гипометилирующий агент вводят в одно и то же время или в разное время.

2. Применение конъюгата дифтерийного токсина и человеческого интерлейкина-3 (DT-IL3) и

а. ингибитора Jak выбранного из руксолитиниба и пакритиниба, или

б. гипометилирующего агента, выбранного из азацитидина и децитабина,

для ингибирования миелопролиферативного новообразования (МПН) у нуждающегося в этом субъекта, представляющего собой человека, отличающееся тем, что DT-IL3 и ингибитор Jak или гипометилирующий агент вводят в одно и то же время или в разное время.

3. Применение по п. 1 или 2, отличающееся тем, что:

а. DT-IL3 вводят в дозе 1 мкг/кг или больше, 2 мкг/кг или больше или 4 мкг/кг или больше;

б. DT-IL3 вводят в дозе от 2 мкг/кг до 20 мкг/кг или от 9 мкг/кг до 20 мкг/кг;

в. DT-IL3 вводят в дозе от 4 мкг/кг до 12 мкг/кг или от 9 мкг/кг до 12 мкг/кг;

г. вводят в дозе 5 мкг/кг, 7 мкг/кг, 9 мкг/кг или 12 мкг/кг; или

д. в дозе, которая является максимально переносимой дозой.

4. Применение по любому из пп. 1-3, отличающееся тем, что DT-IL3 и ингибитор Jak или гипометилирующий агент вводят:

а. по меньшей мере один раз в неделю, по меньшей мере два раза в неделю или по меньшей мере три раза в неделю;

б. в течение периода, равного одной неделе или более, или в течение периода, равного двум неделям или более;

в. в течение по меньшей мере 3 дней подряд и/или

г. в нескольких циклах лечения.

5. Применение по п. 4, отличающееся тем, что указанные циклы лечения проводят с интервалом по меньшей мере 1 неделя, с интервалом по меньшей мере 2 недели, с интервалом по меньшей мере 3 недели, с интервалом по меньшей мере 4 недели, с интервалом по меньшей мере 5 недель или их комбинацией.

6. Применение по п. 4 или 5, отличающееся тем, что:

а. DT-IL3 вводят по меньшей мере 3 дня подряд на каждый 28 день в нескольких циклах лечения;

б. DT-IL3 вводят по меньшей мере 3 дня подряд на каждый 21 день в течение четырех циклов, затем на каждый 28 день в течение 3 циклов;

в. ингибитор Jak вводят по меньшей мере один раз в день или по меньшей мере два раза в день;

г. гипометилирующий агент вводят в течение по меньшей мере первых 3 дней, по меньшей мере первых 4 дней, по меньшей мере первых 5 дней, по меньшей мере первых 6 дней или по меньшей мере первых 7 дней по меньшей мере одного цикла;

д. гипометилирующий агент вводят в течение по меньшей мере первых 3 дней, по меньшей мере первых 4 дней, по меньшей мере первых 5 дней, по меньшей мере первых 6 дней или по меньшей мере первых 7 дней 28-дневного цикла в течение 3 циклов после введения DT-IL3 в течение четырех 21-дневных циклов; или

е. DT-IL3 и (а) ингибитор Jak или (б) гипометилирующий агент вводят до прогрессирования заболевания и/или достижения неприемлемой токсичности.

7. Применение по любому из пп. 1-6, отличающееся тем, что у указанного субъекта, представляющего собой человека, неблагоприятная цитогенетика.

8. Применение по любому из пп. 1-6, отличающееся тем, что DT-IL3 представляет собой химический конъюгат и/или рекомбинантно экспрессируемый белок.

9. Применение по п. 8, отличающееся тем, что DT-IL3 представляет собой рекомбинантно экспрессируемый белок, который экспрессируется в виде одного полипептида, содержащего каталитический и транслокационный домены дифтерийного токсина и человеческого IL-3.

10. Применение по п. 8, отличающееся тем, что DT-IL3 содержит аминокислотные остатки дифтерийного токсина с 1 по 388, связанные пептидной связью с IL-3 человека.

11. Применение любому из пп. 2-9, отличающееся тем, что ингибирование приводит к снижению пролиферации клеток МПН, стабилизации количества клеток МПН, снижению количества клеток МПН и/или уменьшению размера селезенки и/или печени.

12. Применение по любому из пп. 1-11, отличающееся тем, что МПН представляет собой истинную полицитемию, эссенциальный тромбоцитоз, миелофиброз, хронический миеломоноцитарный лейкоз, хронический нейтрофильный лейкоз, хронический эозинофильный лейкоз, системный мастоцитоз, симптоматическое гиперэозинофильное расстройство или другое заболевание костного мозга, вызывающее выработку избыточных эритроцитов, лейкоцитов и/или тромбоцитов.

13. Применение по любому из пп. 1-12, отличающееся тем, что МПН находится в острой фазе.

14. Применение по п. 12 или 13, отличающееся тем, что МПН представляет собой миелофиброз (МФ).

15. Применение по п. 14, отличающееся тем, что указанный миелофиброз представляет собой первичный миелофиброз, истинный постполицитемический миелофиброз или посттромбоцитемический миелофиброз.

16. Применение по любому из пп. 1-15, отличающееся тем, что:

а. субъект, представляющий собой человека, был невосприимчив к предшествующему лечению одним или более ингибиторами Jak и/или одним или более гипометилирующими агентами;

б. субъект, представляющий собой человека, не мог переносить полную дозу предшествующего лечения одним или более ингибиторами Jak и/или одним или более гипометилирующими агентами;

в. у субъекта, представляющего собой человека, низкое количество тромбоцитов или он не подходил для лечения одним или более ингибитором Jak и/или одним или более гипометилирующим агентом;

г. субъект, представляющий собой человека, ранее отвечал на ингибитор Jak и/или гипометилирующий агент; и/или

д. субъект, представляющий собой человека, имеет мутации в гене JAK2, MPL, ASXL1, TET2 или CALR.

17. Применение по п. 16, отличающееся тем, что субъект, представляющий собой человека, имеет мутацию JAK2V617F.