Способ изготовления набора стандартных образцов для контроля качества молекулярно-генетической диагностики Ph-негативных миелопролиферативных заболеваний Российский патент 2024 года по МПК G01N33/48 C12Q1/00 

Изобретение относится к области медицины, в частности онкогематологии, а именно к выполнению контроля качества молекулярно-генетических исследований при лабораторной диагностике Ph-негативных миелопролиферативных заболеваний (МПЗ). Предложен способ изготовления набора стандартных образцов для проведения контроля выявления основных пяти диагностически значимых мутаций: JAK2V617F, MPLW515K и MPLW515L, CALR del (1-го типа) и CALR ins (2-го типа).

Миелопролиферативные заболевания включают в себя группу Ph-негативных новообразований (МПН), к которой относится истинная полицитемия (ИП), эссенциальная тромбоцитемия (ЭТ) и первичный миелофиброз (ПМФ). Мутация JAK2V617F встречается в 95% случаев ИП, 50% случаев ЭТ и 60% случаев ПМФ; мутации гена CALR 1-го типа (делеция) и 2-го типа (вставка) встречаются в 20-30% случаев ЭТ или ПМФ; наиболее редкими из представленных при данных заболеваниях являются мутации MPLW515K и MPLW515L - 3-8% случаев ПМФ или ЭТ [Tefferi A, Pardanani A. Myeloproliferative neoplasms: a contemporary review. JAMA oncology 1.1 (2015): 97-105. doi:10.1001/jamaoncol.2015.89]. В соответствии с клиническими рекомендациями, указанные соматические мутация признаны ключевыми критериями для постановки диагноза «Ph-негативные миелопролиферативные заболевания» [Клинические рекомендации. Ph-негативные миелопролиферативные заболевания. Ассоциация содействия развитию гематологии и трансплантологии костного мозга Национальное гематологическое общество. 2022]. Результаты выполнения молекулярно-генетического исследования при онкологических заболеваниях во многом определяет прогноз и выбор наиболее эффективной схемы лечения.

В соответствии с требованиями стандартов ИСО 15189- [International Organization for Standardization. ISO 15189: 2022 Medical Laboratories Requirements for Quality and Competence. ISO, 2022], ГОСТ ИСО 15189-2024 и Правилами выполнения клинических лабораторных исследований [Приказ Минздрава России от 18.05.2021 N 464н (ред. от 23.11.2021) "Об утверждении Правил проведения лабораторных исследований"] обязательным условием деятельности клинических лабораторий является обеспечение гарантий качества получаемых результатов тестирования. Важным свидетельством правильного выполнения анализа в лаборатории являются результаты систематического контроля их качества, заключающиеся в оценке сопоставимости и воспроизводимости результатов исследования специально приготовленных стандартных образцов с известным уровнем значений исследуемых аналитов [ГОСТ Р 53133.2-2008 Технологии лабораторные клинические. Контроль качества клинических лабораторных исследований. Часть 2. Правила проведения внутрилабораторного контроля качества количественных методов клинических лабораторных исследований с использованием контрольных материалов]. Используемые для выполнения внутри лабораторного контроля качества и для межлабораторных сличений контрольные материалы должны соответствовать требованиям [ГОСТ Р 53133.3-2008 Технологии лабораторные клинические. Контроль качества клинических лабораторных исследований. Часть 3. Описание материалов для контроля качества клинических лабораторных исследований].

Для контроля правильности выполнения молекулярно-генетических исследований соматических мутаций используют специально изготовленные ДНК-плазмиды с целевыми последовательностями нуклеотидов, которыми комплектуют диагностические тест-системы в качестве положительных контрольных образцов. Однако контрольные образцы, как правило, включают короткие олигонуклеотидные последовательности, выявляемые только данной тест-системой и предназначены для подтверждения валидности результатов, полученных с её использованием. Такие плазмиды не предназначены для контроля правильности полученных результатов при использовании тест-систем другого производителя. Кроме того, геномная ДНК клеток человека может содержать редкие полиморфные участки в исследуемом гене, отличающиеся от целевых последовательностей в ДНК плазмиде, что может приводить к ложноотрицательным результатам тестирования образцов ДНК пациента тест-системой несмотря на то, что результат тестирования контрольной ДНК-плазмиды будет валидным.

Контрольные материалы, основанные на использовании полногеномной ДНК человека в отличии от ДНК-плазмид, могут использоваться при выполнении анализов разными диагностическими тест-системами.

Известны способы изготовления контрольных материалов с использованием поддерживаемых регулярным пересевом культур иммортализованных клеточных линий, содержавших искомые мутации. Такой способ был использован при изготовлении международного стандарта, рекомендованного ВОЗ в качестве референтного эталона количественного значения уровня молекул ДНК, несущих мутацию V617F в гене JAK2, предназначенного для оценки прослеживаемости сопоставимых результатов в контрольных материалах вторичного и последующих уровней. Контрольная панель стандартных образцов включает семь лиофилизированных материалов геномной ДНК с диапазоном номинальных значений JAK2 V617F (в процентах от общего количества JAK2); 100% JAK2 V617F (код материала NIBSC 15/164), 90% (15/246), 30% (15/244), 10% (15/166), 1% (15/168), 0,1% (15/ 170) и 0% (15/172) и была приготовлена из разных соотношений двух клеточных линий генотипов JAK2 дикого типа (линия ATDG102) и JAK2 V617F (линия, UKE-1) [Asp J, et al. International external quality assurance of JAK2 V617F quantification. Annals of hematology 98 (2019): 1111-1118. https://doi.org/10.1007/s00277-018-3570-8]. Данная панель стандартных образцов потребовала чрезвычайных технологических усилий в изготовлении, гарантирующих их максимальную стабильность в течение неограниченного времени хранения и как эталонный образец она не доступна для непосредственного использования в обычных клинических лабораториях.

Компанией Horizon Discovery представлен полученный из клеточных линий человека коммерческий стандартный образец JAK2V617F «Reference Standard, 50%» представляющий собой высокомолекулярную ДНК с целевой мутаций в соотношении 1:1 к не мутированному (дикому) варианту гена JAK2. Преимуществом данного образца является, то что он не требует восстановления из лиофилизированного состояния и стабилен в буферном растворе Tris-EDTA (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA) и pH 8.42 в течение 44 месяцев при +4°С. Однако этот стандартный образец не предусматривает возможность проведения контроля качества тестирования соматических мутаций в генах CALR и MPL, не менее важных в диагностике МПЗ. Кроме того, его длительная стабильность гарантирована только при хранении в холодильнике при +4°C.

Приготовление стандартных образцов на основе клеточных линий требует выполнения трудоемких операций, наличия специальных реактивов и оборудования для регулярного поддержания жизнеспособности клеточных культур. Известно о нестабильности ДНК при культивировании клеток и возникновении новых мутаций или потери целевых участков генома, в том числе сообщалось и о нестабильности уровня мутации V617F в гене JAK2 в клетках линии UKE-1 [Buors C, et al. Clonal evolution in UKE-1 cell line leading to an increase in JAK2 copy number. Blood Cancer Journal 2.4 (2012): e66-e66., https://doi.org/10.1038/bcj.2012.11] и поэтому его полезность в качестве эталонного материала была поставлена под сомнение.

Наиболее близким к заявляемому изобретению являются использованные в исследовании [Asp J, et al. International external quality assurance of JAK2 V617F quantification. Annals of hematology 98 (2019): 1111-1118. https://doi.org/10.1007/s00277-018-3570-8. (прототип)] контрольные материалы, приготовленные с использованием геномной ДНК, экстрагированной из крови пациентов. Контрольные материалы среди прочих использованных образцов представляли в том числе образцы цельной крови, гемолизированной крови пациентов или предварительно выделенных гранулоцитов. Использование нативного геномного материала пациентов представляет возможность проверки качества молекулярно-генетических исследований на более вариабельных клинических образцах более близких к реально практике медицинских лабораторий. Вместе с тем, недостатком описанных образцов является их низкая стабильность при хранении и также отсутствие подтвержденных результатов тестирования для других диагностически значимых мутаций МПЗ.

Предметом настоящего изобретения является способ изготовления на основе геномной ДНК пациентов панели стандартных образцов для одновременного контроля качества молекулярно-генетических исследований количественного определения аллельной нагрузки соматической мутации JAK2V617F, а также для выявления мутаций 1-го и 2-го типов в гене CALR и мутаций W515K/L в гене MPL.

При проведении контроля качества молекулярно-генетических исследований диагностически значимых мутаций при МПЗ такие комбинированные контрольные образцы на основе стабилизированной геномной ДНК пациентов ранее не применялись, что свидетельствует о новизне предлагаемого изобретения.

Предлагаемое техническое решение заключается в использовании следующего способа изготовления контрольных панелей.

Отбираются образцы крови от пациентов с подтвержденным заболеванием МПЗ, выявленными соматическими мутациями JAK2V617F, CALR 1-го, 2-го типов и MPLW515K/L, а также при отсутствии клинических и лабораторных данных об инфекционном заболевании высокого риска передачи при контакте с кровью: инфекций ВИЧ и вирусных гепатитов В или С. Для получения отрицательного контрольного образца отбирается кровь пациентов с отрицательными результатами тестирования упомянутых маркеров.

В случае отложенной процедуры изготовления контрольной панели создается архив образцов крови, который хранится в морозильной камере при -20°С. Перед началом изготовления стандартных образцов пробирки с кровью размораживаются при комнатной температуре.

Группа образцов крови с определенной мутацией смешивается в общую пробирку с последующей экстракцией ДНК, после которой измеряется концентрация молекул ДНК и при необходимости доводится до оптимальных значений: не менее 40 нг/мкл. Также производится повторное тестирование выделенной ДНК на наличие исследуемых аналитов методом ПЦР-РВ для исключения контаминации и случайных ошибок при отборе образцов для этапа экстракции.

Следующим шагом производится процесс стабилизации нуклеиновых кислот путем смешивания с водным раствором трегалозы с конечной концентрации 0,5 М. Аликвотированая смесь высушивается при температуре 65°С в термостате в течение суток до полного затвердевания содержимого.

Перед контрольной проверкой работоспособности методом ПЦР и оценкой концентрации итогового варианта стандартных образцов, которая не должна быть ниже 2 нг/мкл, аликвоты восстанавливаются посредством добавления деионизированный воды с последующим инкубированием в термостате при 95°С в течение 5 минут.

Пример использования изобретения

Образцы крови пациентов с выявленными соматическими мутациями JAK2V617F (в 3-х разных уровнях аллельной нагрузки: низкая нагрузка - 5-10%, средняя нагрузка - 11-50%, высокая нагрузка - 51-100%), CALR 1-го, 2-го типов и MPLW515K/L замораживались при -20°С до момента проведения процедуры изготовления стандартных образцов.

Для изготовления панели стандартных образцов архивированные образцы цельной крови с определенной выявленной мутацией, доведенные до комнатной температуры, смешивали в отдельную пробирку с конечным объемом 7,5 мл. Из общей пробирки отбирали по 500 мкл крови для проведения экстрации ДНК с помощью набора «НуклеоЭкстран ДНК сорб» (Формула гена, Россия») согласно протоколу изготовителя. Экстрагированная ДНК, содержащаяся в буфере, смешивалась в 2 мл пробирке, избегая попадания осадка, и тщательно «вортексировалась». Используя набор реагентов для измерения концентрации ДНК «Spectra Q HS» на флюориметре Qubit (Thermo Fisher Scientific, USA), было определено количественное содержание молекул ДНК, которое не было ниже оптимального значения в 40 нг/мкл. Методом ПЦР-РВ было проведено повторное тестирование с использованием амплификатора Real-time CFX96 Touch (Bio-Rad, Сингапур) и коммерческого набора «Миелоскрин» (Формула гена, Россия) по инструкции производителя. Общий объем ДНК смешивался с водным 1 М раствором трегалозы в соотношении 1:1 и раскапывался по 50 мкл в пробирки объемом 1,5 мл для последующего процесса высушивания при 65°С в термостате до полного стеклования содержимого. Для контрольного тестирования итогового варианта стандартных образцов методом ПЦР-РВ, а также определения концентрации ДНК была проведена пробоподготовка согласно прилагаемой к будущему набору инструкции, а именно:

1. В пробирку добавлено 50 мкл деионизированной воды;

2. Пробирки перемешали на «Вортексе», не допуская расплескивания содержимого по стенкам;

3. Для лучшего растворения пробирки были прогреты в термостате 5 мин при 95°С;

4. В течение 3-5 секунд пробирки отцентрифугировали для сброса конденсата с крышек.

В результате была сформирована панель стандартных образцов (Фигура) со значениями концентрации ДНК от 3,5 до 6,9 нг/мкл. Для чистоты исследования набор стандартных образцов будет поставляться без указания измеряемых показателей на образцах проверки качества (ОПК) или прилагаемых документах.

Таблица 1 - Пример комплектации набора стандартных образцов

Таблица 2 - Пример использования панели стандартных образцов при контроле воспроизводимости результатов количественного определения маркера JAK2V617F. Ct W и Ct M - циклы выхода кривой флуоресценции дикого и мутантного типа маркера соответственно

Таблица 3 - Пример использования панели стандартных образцов при контроле воспроизводимости результатов качественного определения маркеров CALR 1-го и 2-го типов, MPLW515K и MPLW515L. Ct W и Ct M - циклы выхода кривой флуоресценции дикого и мутантного типа маркера соответственно

Отличие заявляемого набора стандартных образцов от прототипа заключается в том, что

1. Набор предусматривает возможность одновременного контроля результатов количественного определения маркера JAK2V617F, а также качественного определения маркеров CALR 1-го и 2-го типов, MPLW515K и MPLW515L.

2. Набор предусматривает хранение при комнатной температуре, а также транспортировку без использования оборудования для поддержания особых условий.

Изобретение относится к области биотехнологии, медицине. Предложен способ изготовления набора стандартных образцов для контроля качества молекулярно-генетической диагностики Ph-негативных миелопролиферативных заболеваний (МПЗ). Набор предназначен для проведения контроля качества определения пяти основных диагностически значимых генетических мутаций: JAK2V617F, MPLW515K и MPLW515L, CALR 1-го и 2-го типов. 1 ил., 3 табл., 1 пр.

Способ изготовления панели стандартных образцов для контроля качества молекулярно-генетической диагностики Ph-негативных миелопролиферативных заболеваний, заключающийся в сборе образцов крови пациентов, выделении ДНК, смешивании в необходимых соотношениях проб ДНК для получения целевых значений уровня определения соматической мутации и последующей стабилизации, отличающийся тем, что при изготовлении панели положительных стандартных образцов используются образцы венозной крови пациентов с клинически подтвержденным заболеванием и выявленными соматическими мутациями JAK2 V617F, CALR 1-го, 2-го типов и MPLW515K/L, а стабилизация образцов достигается путем добавления раствора трегалозы с конечной концентрацией 0,5 М.