Иммобилизованный ферментный препарат на основе трипсина и способ его получения Российский патент 2024 года по МПК C12N11/04 C12N9/76 C12Q1/37 

Изобретение относится к области биотехнологии, биохимии и инженерной энзимологии, в частности к способам получения иммобилизованных ферментов, и может быть использовано в химии, биохимии, медицине, экологии, пищевой промышленности и сельском хозяйстве для аналитического определения токсичности отдельных веществ и интегральной токсичности смесей различных веществ, в том числе ингибирующих активность трипсина.

Данное изобретение предназначено для получения препаратов иммобилизованного трипсина, обладающих высокой активностью, которые могут использоваться в устройствах типа «биосенсор» в качестве биологического модуля для контроля степени загрязнения объектов окружающей среды ингибиторами трипсина, а также в пищевой промышленности для оценки безопасности применения пищевых добавок.

Трипсин обладает высокой чувствительностью к ряду соединений: тяжелым металлам (медь, марганец, хром, кобальт), пестицидам (глифосат, метрибузин, тебуконазол), хинонам (1,4-бензохинон, толухинон), консервантам (бензоат натрия, сорбат калия).

В настоящее время применяют препараты фермента для анализа ингибиторов трипсина, представляющие собой трипсин, иммобилизованный на различных носителях химическими способами.

Известен аналогичный реагент, полученный путем ковалентного связывания трипсина с полимерным носителем, в качестве которого используется сополимер винилиденфторида и гексафторпропилена, фторэласт, сополимер винилиденфторида и перфторметилвинилового эфира и сшивающего агента [RU 2437936 «Способ иммобилизации трипсина», опубл. 27.12.2011]. Известный способ иммобилизации предназначен для получения энзима пролонгированного действия и подразумевает стерилизацию носителя химическим способом с последующей промывкой водой или буфером.

Недостатком известного способа является необходимость в стерилизации и промывке носителя, сложность изготовления ввиду большого количества исходных реагентов.

Наиболее близким техническим решением, выбранным в качестве прототипа, является способ получения иммобилизованного трипсина путем связывания фермента с поликремниевой кислотой с последующей дегидратацией продукта [SU 994556 «Способ получения иммобилизованного трипсина», опубл. 07.02.1983]. Поликремниевую кислоту используют в форме гидрогеля, процесс ведут в присутствии ионов кальция. Получение ферментного препарата осуществляется при контакте раствора энзима и гидрогеля в течение 14-16 ч с последующим высушиванием полученного препарата до влажности 12-15% в течение 6-8 ч.

Недостатком препарата и способа его приготовления являются многостадийность и длительность процедуры его получения. Сначала готовят раствор гидрогеля силикагеля путем нейтрализации водного раствора силиката натрия смесью минеральных кислот. Затем в течение 2-х ч необходимо промывать носитель дистиллированной водой для избавления от ионов хлора. Далее необходимо обеспечить контакт ферментного препарата с гидрогелем в течение 1-16 ч в присутствии ионов кальция, с последующим высушиванием препарата в течение 6-8 ч. Подобная технология является достаточно трудоемкой и требует больших временных затрат.

Техническим результатом изобретения является получение ферментного препарата на основе иммобилизованного трипсина в крахмальном геле, предназначенного для проведения одного количественного анализа, повышение стабильности реагентов для определения ингибиторов трипсина при хранении и использовании, упрощение процедуры приготовления реагента, а также снижение стоимости ферментного препарата за счет использования в качестве носителя дешевого высокомолекулярного соединения -крахмала.

Технический результат достигается тем, что ферментный препарат на основе иммобилизованного трипсина содержит трипсин, иммобилизованный в крахмальный гель, при следующем соотношении, масс. %: трипсин - 1, крахмальный гель - 99. Также в способе получения ферментного препарата на основе иммобилизованного трипсина, включающим иммобилизацию фермента трипсина в гелевую матрицу с последующим высушиванием продукта, новым является то, что крахмальный гель готовят в фосфатном буфере при рН 7,6, охлаждают гель до температуры 26°С, смешивают препарат трипсина с гелем, производят дозирование смеси крахмального геля с трипсином на гидрофобную подложку, высушивают препарат в течение суток при температуре 8°С.

Количественный анализ ингибиторов трипсина проводят следующим образом. Ферментный препарат трипсина иммобилизуют известным способом в высокомолекулярный носитель - крахмальный гель при помощи известного оборудования, например, автоматического дозатора. Доза трипсина представляет собой количество, достаточное и необходимое для выполнения одного количественного анализа исследуемого вещества.

Дозирование реагентов, например, по 25 мкл, проводят на гидрофобную подложку. Высушивание до образования твердой фазы каждой дозы реагента проводят при температуре 8°С. Высушенный реагент представляет собой тонкие прозрачные дискообразные пленки, так называемые «диски». Их отделяют от подложки и используют для анализа.

Изобретение поясняется чертежами. На фиг.1 представлена активность иммобилизованных препаратов ферментов в зависимости от количества трипсина, содержащегося в одном диске. На фиг.2 представлена зависимость активности иммобилизованного трипсина от времени инкубации ферментного препарата («диска») в кювете. Фиг.3 иллюстрирует зависимость активности иммобилизованного трипсина от времени хранения.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1

Иммобилизацию трипсина в крахмальный гель проводят следующим образом: раствор трипсина готовят на 1 мМ HCl. Навеску 0,402 г крахмала помещают в 13 мл 0,1 М буфера по Кларку-Лабсу рН 7,6, интенсивно перемешивают и кипятят в течение 2 мин. Полученную смесь охлаждают до 26°С, затем вносят 500 мкл раствора трипсина, содержащего 3,4 мг фермента для получения препарата с содержанием 8,5 мкг трипсина в одном «диске»; для получения препарата с содержанием трипсина в одном «диске» 17 мкг или 22 мкг берут навеску 6,8 или 8,8 мг фермента соответственно. Интенсивно перемешивают и дозируют полученную смесь по 25 мкл на гидрофобную подложку с помощью дозатора, высушивают при температуре 8°С в течение 24 ч.

Выполняют количественный анализ активности иммобилизованного трипсина следующим образом. В кювету спектрофотометра помещают один иммобилизованный реагент («диск»), содержащий, например, 8,5 мкг трипсина (11 ед. активности), 40 мкл 1 мМ соляной кислоты, 500 мкл 0,1 М фосфатного буфера по Кларку и Лабсу рН 7,6. После 5 минут инкубации «диска» в кювете раствор активируют 460 мкл 0,5 мМ БАЭЭ, кювету помещают в спектрофотометр и регистрируют изменение оптической плотности в единицу времени на длине волны 253 нм.

Процедуру повторяют для дисков с содержанием трипсина в 17 мкг (22 ед. активности) и 22 мкг (29 ед. активности).

Активность препарата прямо пропорциональна скорости ферментативного гидролиза БАЭЭ.

С повышением количества трипсина наблюдается увеличение активности препарата (фиг.1). Так, для препарата с содержанием 8,5 мкг трипсина активность составляет 0,014 усл. ед., для препаратов с 17 и 22 мкг фермента активность составляет 0,03 и 0,05 усл. ед.

Пример 2

Иммобилизацию трипсина в крахмальный гель проводят следующим образом: раствор трипсина готовят на 1 мМ HCl. Навеску 0,402 г крахмала помещают в 13 мл 0,1 М буфера по Кларку-Лабсу рН 7,6, интенсивно перемешивают и кипятят в течение 2 мин. Полученную смесь охлаждают до 26°С, затем вносят 500 мкл раствора, содержащего 6,8 мг трипсина. Интенсивно перемешивают и дозируют полученную смесь по 25 мкл на гидрофобную подложку с помощью, например, электронного дозатора Biohit Picus («Sartorius», Финляндия), высушивают при температуре 8°С в течение 24 ч.

Выполняют количественный анализ активности иммобилизованного трипсина следующим образом. В кювету спектрофотометра помещают один иммобилизованный реагент («диск»), содержащий 17 мкг трипсина (22 ед. активности), 40 мкл 1 мМ соляной кислоты, 500 мкл 0,1М фосфатного буфера по Кларку и Лабсу рН 7,6. После инкубации «диска» в кювете в течение 1-5 мин раствор активируют 460 мкл 0,5 мМ БАЭЭ, и помещают в спектрофотометр и регистрируют изменение оптической плотности в единицу времени на длине волны 253 нм.

Как видно из фиг.2, активность иммобилизованного фермента растет с увеличением времени инкубации и достигает своего максимума при инкубации длительностью 5 минут. Таким образом, при выдержке препарата от 2 до 5 минут достигается оптимальная активность и воспроизводимость результатов.

Пример 3

Иммобилизацию трипсина в крахмальный гель и анализ активности полученного препарата проводят способом, аналогичным примеру 2. Предварительно препарат инкубируют в кювете в течение 5 минут.

На фиг.3 можно наблюдать значения активности трипсина в составе иммобилизованного реагента в зависимости от времени хранения. Видно, что иммобилизованный препарат трипсина сохраняет свою активность не менее месяца.

Пример 4

Иммобилизацию трипсина в крахмальный гель и анализ активности полученного препарата проводят способом, аналогичным примеру 2. Предварительно препарат инкубируют в кювете в течение 5 минут.

В качестве модельного ингибитора используется коммерческий пестицид «Торнадо» (содержание глифосата 500 г/л). Для количественной оценки ингибирующего действия глифосата в составе коммерческого препарата «Торнадо» используется параметр IC₅₀, соответствующий концентрации токсиканта, вызывающей снижение активности на 50%. Значение IC₅₀ для глифосата в составе коммерческого пестицида «Торнадо» составило 5 г/л.

Изобретение относится к области биотехнологии, биохимии и инженерной энзимологии, в частности к способам получения иммобилизованных ферментов, и может быть использовано в химии, биохимии, медицине, экологии, пищевой промышленности и сельском хозяйстве для аналитического определения токсичности отдельных веществ и интегральной токсичности смесей различных веществ, в том числе ингибирующих активность трипсина. Изобретение позволяет упростить процедуру иммобилизации фермента, повысить стабильности реагентов для определения ингибиторов трипсина при хранении и использовании, а также снизить стоимость ферментного препарата за счет использования в качестве носителя дешевого высокомолекулярного соединения - крахмала. 2 н.п. ф-лы, 3 ил., 4 пр.

1. Ферментный препарат с активностью трипсина, предназначенный для определения ингибиторов трипсина, содержащий трипсин, иммобилизованный в крахмальный гель, при следующем соотношении, масс. %:

Трипсин 1 Крахмальный гель 99

2. Способ получения ферментного препарата на основе иммобилизованного трипсина по п. 1, характеризующийся тем, что осуществляют иммобилизацию трипсина в крахмальный гель, при этом крахмальный гель готовят в фосфатном буфере при pH 7,6, охлаждают гель до температуры 26°С, смешивают препарат трипсина с гелем, производят дозирование смеси крахмального геля с трипсином на гидрофобную подложку, высушивают препарат в течение суток при температуре 8°С.