Способ получения иммобилизованного трипсина Советский патент 1983 года по МПК C12N9/76 C12N11/14 

( СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНМОБИЛИЗОВАННОГО ТРИПСИНА

1

Изобретение относится к ферментной технологии и может быть fcnoльзoвaнo для получения ферментных производных на основе трипсина.

В медицинской практике широко используется трипсин, выделяемый из поджелудочной, железы крупного рогатого скота, для лечения ран и ожогов заболеваний кишечно-желудочного тракта. Действие, этого препарата крат- ковременно, так как он в организме человека сразу подвергается действию литических и протеолитических ферментов.

Пролонгация .действия фермента вознежна при использовании иммобилизованных форм.

Известен способ получения иммобилизованного трипсина связыванием фер-го мента с поликремниевой кислотой, взятой в форме золя с дальнейшей коагуляцией золя до стадии гидрогеля и грануляцией Cl .

Недостатком данного способа, ог раничивающим практическое применение, полученного иммобилизованного фер мента, является то, что целевой продукт получают в форме сильно оводненных гидросиликагелей, имекхцих малую твердость и большой объем. Активность препарата по низкомолекулярному синтетическому субстрату - бензол-аргининэтиловому эфиру (ВАЕЕ)-составляет 65%.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности является способ получения иммобилизованного трипсина путем введения фермента в золь поликремниевой кислоты с последующей бы трой крагуляцией золя в гидрогель и . дегидратацией полученного продукта до ксеросиликагеля. В указанном спо- собе отмечается сохранение активности по низкомолекулярному субстрату (ВАЕЕ) до 3 от активности нативного фермента и полная потеря актив39ности по высокомолекулярному субстра ту 2. Это является следствием стерических затруднений диффузии высокомолекулярных субстратов в геле. Недостатком известного способа яв ляются отсутствие активности по высо комолекулярному субстрату получаемог данным способом иммобилизованного трипсина и невозможность использования его в конкретных технологических процессах. Цель изобретения - сохранение- активности иммобилизованного трипсина по высокомолекулярному субстрату. Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения иммобилизованного трипсина, заключающемуся в связывании фермента с поликремниевой кислотой с последующей дегидратацией продукта, поликремниевую кислоту используют в форме гидрогеля, процесс ведут в присутствии ионов кальция, а дегидратацию осуществляют в течение 6-8 ч до остато ной влажности 12-15 Проведение процесса в присутстви ионов кальция стабилизирует активность получаемого продукта, а время дегидратации 6-8 ч, обеспечивает именно такую скорость обезвоживания препарата, которая приводит к медленному структурированию гидрогеля прочному закреплению фермента в не Предлагаемый способ позволяет получить ферментный .препарат, сохраняющий активность до 20 по высокомолекулярному субстрату (казеину) от активности нативного фермента, стабильный при хранении за 90 сут. хранения при +k°C он потерял 15% своей первоначальной активности, вр мя его полужизни (время, характеризующее активное действие фермента не субстрат) 3 ч. Синтез гидрогеля силикагеля осуществляется нейтрализацией водного раствора силиката натрия смесью мин ральных кислот до величины рН 4,0 с последующей коагуляцией золя в гидрогель В течение 2 ч и промывкой полученного носителя дистиллированной водой до отсутствия хлор-ионов в промывных водах. 6 Получение ферментного препарата осуществляется при контакте раствора энзима и гидрогеля в течение 1Ц-16 ч в присутствии ионов кальция с последующим высушиванием полученного препарата до влажности 12-15%. Пример1. 25 г гранулированного гидрогеля силикагеля заливают 25 мл раствора трипсина концентрацией 5 в фосфатном буфере 0,05 м рН 7,6 (Содержащем раствор хлорида кальция. Фиксирование осуЩеетвляется при f.C в течение 1 ч при легком перемешивании. Далее контактный раствор сливают, препарат денатрируют при 37°С в течение 6 ч при вентиляции до остаточной влажности 15 -промывают фосфатным буферным раствором и сушат. Хранят полученные препараты в холодильнике. Активность по казеину полученных образцов составляет 2G% от активности фермента, взятого Для иммобилизации, и колеблется в пределах 10-15 ПЕ/г сухого .носителя. П р И м е р 2. Аналогично примеру 1получают гидрогель силикагеля с фиксированным ферментом. П олученный препарат дегидратируют при 37°С в течение 8 ч при вентиляции до остаточной влажности 12%. Промывают фосфатным буферным раствором и сушат. Хранят в холодильнике. Для исследования пролонгирующих свойств иммобилизованного трипсина 2г полученного сухого препарата обрабатывают в течение 1 ч моделью желудочного сока раствор пепсина при рН 2,А ). Далее определяется остаточная протеолитическая активность на носителе, она составляет 53% от активности необработанного препарата. Эти данные свидетельствуют о том, что трипсин лишь частично разрушается под действием желудочного сока. Стабильность полученного препарата в процессе гидролиза субстрата при 30°С на порядок выше стабильности нативного фермента. Она составляет 3 ч, что соответствует периоду действия при его использовании. В таблице приведены свойства ферментного препарата в сравнении с прототипом и нативнь1М ферментом.

Нативный фермент

Фермент включенный в золь (прототип)

Фермент, включенный в гидрогель

Из данных таблицы видно, что включение трипсина в структуру гидрогеля силикагеля позволяет получить активные препараты прологниро ванного действия. Условия процесса иммобилизации исключают применение химических реагентов и тем самым какое-либо модифицирование белка. Предлагаемый метод позволяет- получить препараты, сохранение активности которых по высокомолекулярному субстрату достигает 2Q%, что является высоким показателем для препаратов, полученных методом включения в гель. Включение в структуру предохраняет препарат от действия других литических энзимов и микроорганизмов. Инертность и нетоксичность носителя делает возможным использование препарата в медицине.

Препараты, полученные методом включения в структуру геля являются дешевыми и удобными в обращении. Дешевизна полученных препаратов определяется стоимостью исходных реагентов.

3,1

Не стабилен

Стабилен

3

Стабилен

53

Формула изобретения

Способ получения иммобилизованного трипсина путем связывания фермента с поликремниевой кислотой с последующей дегидратацией продукта, отличающийся тем, что, с целью сохранения активности иммобилизованного трипсина по высокомолекулярному субстрату, поликремниевую кислоту используют в форме гидрогеля, процесс ведут в присутствии ионов кальция, а дегидратацию осущесвляют в течение 6-8 ч до остаточной влажности 12-15 Источники информации, принятые во внимание, при экспертизе

1 . Патент Великобритании № 1267685,кл. С Н 3, опублик. 1972. 2. Р. Johnson, T.L.Whateley On the Use of Polymeriging Silica Xel systems for the Immob 1izatfon of Trypsin J. of Col land Interface Science, 1971, vol. 37/ N 3,557-563