Способ получения носителя для иммобилизации белков Советский патент 1982 года по МПК C07F7/02 C12N11/00 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ lOaiTEJIH ДЛЯ ИММОБИЛИЗА1ДО1

БЕЖОВ

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам получения носителей для иммобил зации биологически активных веществ, например ферментов. Полученные препараты могут найти применение в качестве катализаторов для проведения ферментативных реакций в химической, фармацевтической и пишевой промышлен ности ., В настоящее время для иммобилизации ферментов используется большое количество носителей как органической, так и неорганической природы. Наибольшего внимания заслуживают органоминеральные материалы; в частнос ти покрытые полимерами пористые крем неземные материалы. Носители такого типа характеризуются хорошими гидродинамическими свойствами и достаточной стабильностью получаемых препара тов. Свойства получаемых препаратов во многом зависят от способа покрыти носителя полимерами и активации полимерного слоя на носителе. В литературе описан ряд способов получения носителей для иммобилизации белков путем пропитки пористого неорганического материала органическим пленкообразующим веществом, содержащим реакционноспособные группы. Известен способ, в котором в качестве пленкообразующего вещества используют полиакролеин. Носитель (Ларфор, измельченное стекло) пропитывают мономером, содержащим свободные альдегидные группировки. Полимеризация происходит на поверхности носителя, В результате модификации носителя таким способом получают носитель со свободными альдегидными группами. Иммобилизация фермента (трипсина, папаина) производится через реакцию альдегидных групп носителя с аминогруппами фермента ClJ. Недостатком этого способа является малая операционная стабильность получаемых активированных носителеЛ. Покрытие неорганического материала линейными полимерами, образующимися при полимеризации винильных полимеров, не обеспечивает достаточную нерастворимость, а следовательно, стабильность получаемых ферментных препаратов. Этот способ также ограничивает модификацию носителя альдегидсо держащими полимерами, а связываниеФерментов только через альдегидные группы не всегда дает возможность по лучить препараты с высокой активностью и высокой стабильностью. Известн способ не обеспечивает также и высокого содержания белка на единицу носителя. (При иммобилизшши трипсина достигается связывание до 0,2 мг белка на 1 мл носителя) Известен также способ получения носителей для иммобилизации белков путем пропитки пористого неорганичес кого носителя органическим пленкообразующим веществом. В качестве -г пленкообразукщего вещества используют эпоксидную смолу, отверждение которой на носителе проводят при помощи полиэтиленполиамина. Носитель далее активируют при помощи реагентов, выбранных из группы, включающей глутаровый диапьдегид, диизоцианат адип HOBOrt кислоты, пара-бензохинон 21. Недостатком этого способа являетс невозможность несложной регенерации носителя после инактивации иммобилизованного фермента в процессе его ис пользования, небольшая реакционостой кость и стабильность носителя. Целью изобретения является повыше ние реакционоспособности носителей относительно белков, повышение стабильнос-га получаемых конъюгатов и обеспечение регенерации носителя. Цель достигается тем, что согласн способу получения носителя для иммоб лизации белков путем пропитки пористого неорга1шческого материала органическим пленкообразунщим веществом содержащим реакционноспособные группы, с последующей активацией носител реагентами, выбранными из группы, включающей глутаровый диапьдегид, диизоцианат адипиновой кислоты ИЛи пара-бензохкнон, неорганический носи тель пропитывают растворами адипиноВОЙ кислоты и 1,6-гексаметилендиами в соотношении эквивалентов адипиновр кислоты и 1,6-гексаметилендиамина 1:1,5 после чего осуществляют поли4конденсацию при 180-200 0 в атмосфере инертного газа в течение 2-3 ч. Способ осуществляется следующим образом. Неорганический материал, предпочтительно силохром или силикагель, смачивают водным раствором, содержащим адипиновую кислоту и 1,6-гексаметилендиамин в соотношении эквивалентов адипиновой кислоты и диамина 1:1,5. Носитель высушивают при 140®С и после высушивания прокаливают в специальной трубке в атмосфере пропан бутана при 180-200 С в течение 2-3 ч. Затем носитель промывают водой и ацетоном и суиат при . Полученньй носитель (с содержанием активных аминогрупп в количестве 50 мк зкв на 1 г носителя) используют для иммобилизащш протеолитичесхих ферментов (трипсина, химотрипсина, панкреатина) с помощью бифункциональных реагентов, таких, как глутаровьй диальдегид, диизоциамат адипиновой кислоты или пар а-бензохинон. Пример 1. Получение носителя, модифицированного полиаг-идом, jDtfM ползгчения носителя проводят реакцию полимеризации адипиновой кислоты и гексаметилендиамина в порах носителя при колнчестбе амина свыше эквимолярного(соотношение эквивалентов 1:1,5). 5 г силохрома или С1ШИ кагеля смачивают 7 мл водного раствора, содержащего 0,13 г адипиновой кислоти и 0,16 г 1,6-гексамеп-1ленднамина. Смоченный носитель. высушивают при , прокаливают в специальной труб ке (обмотанной нагревательной хромоникелевой проволокой) диаметром 40 мм в атмосфере пропан-бутана при 80200 С в течение 2 ч. Затем промывают водой и ацетоном и высушивают при . В результате получают носитель; содержащий на поверхности активные аминогруппы в количестве 50 мк экв на 1 г носителя. Полученный носитель используют для иммобилизации протеолитических ферментов (трипсина, химотрипсина, панкреатина) с помощью бифункциональных реагентов, таких как глуТаровый альдегид, диизоциангт адипиновой кислоты и п-бензсхинон. Пример 2 Получение нерастворимого ферментного препарата с использованием носителя, модифкдированного полиамидом, актнророкянием глутаровым-альдегидом. к модифицированному полиамидом носителю (5 г) добавляют 15 мл 2%-ного водного раствора глутарового альдегида. Смесь перемешивают и выдерживают при комнатной температур в течение 2ч. После этого материал отмывают дистиллированной водой от глутарового альдегида на воронке Бюкнера до исчезновения глутарового альдегида в промывных водах и к влаж ному активированному носителю добавляют 5 мл раствора фермента {химо- трипсина) с концентрацией 50 мг/мл в боратном буфере рН 8,0. Смесь перемешивают для удаления воздуха из пор и И)Щерживамт при .в течение 1 ч. После инкубации препарат промывают в воронке Бюхнера боратным буфе ром рН 8,0 М раствором хлористого натрия и затем еще боратным буфером, добавляя эти растворы порциями. Объе промывшлх вод составляет 100 мл. Полученный иммобилизовашпуЕ препарат хранят во влажном виде в боратном буфере в холодильнике. Содержание белка в препарате химотрипсина, определенное по модифицированному методу Лоури, составляет 15,5 мг/г (45% от количества, использованного для иммобилизации). Ферментативную активность препарата определяют на синтетическом субстрате этилового эфира ацетил-1-тирозина (АТЭЭ). Препарат обладает активностью 1550 Е/г, Выход иммобилизации по активности составляет 8,0л. Стабильность препарата при операцион ных условиях оценивают по остаточной активности после проведе1шя педропиза 2%-ного раствора казеина с рН 8,0 при в течение 17 ч в реакторе с активным ротором (контрольный гар,ролиз). После такого гидролиза препарат иммобилизованного хймотрипсина обладает активностью 1050 Е/г, что составляет 68% от исходной. Пример 3. Получение нераство римого ферментного препарата с испол зованием носителя, модифицированного полиамидом, активированием диизоцианатом адипиновой кислоты. К 5 г модифицированного полиамидо носителя (пример 1) добавляют 20 мл 0,25 н раствора диизоцианата адипитолуоле и смесь кипя новой кислоты в тят при в течение I ч. После этого носитель фильтруют, прогрызают ацетоном и высуиивапт при течение ч. Вследствие такой обрабо 0,6 кк получают носитель с активными изо-, цианатными группами. Носитель смачивают 8 мл боратного буфера. Иммобилизацию хймотрипсина проводят, как описано в примере 2. Получают препарат хймотрипсина с активностью на АТЭЭ 2400 Е/г; выход иммобилизации по активности составляет 18,6%. Содержание в препарате белка 16,8 мг/г и выход белка 48,8%. После контрольного гидролиза препарат обладает активностью в количестве 44% от исходной. П р и м е р 4. Получение нерастворимого ферментного препарата (имгдабилизованного хймотрипсина) с использованием носителя, модифицированного полиамгадом, активированием п-бензохиноном. 5 г модифицированного полиамидом носителя (прш-jep 1) нагревают с 20 мл 0,5%-ного водного раствора п-бензокинона на водяной бане в течение 1 ч. Затем носитель водой и ацетоном и высуиивают при комнатной тег шературе. Активироваиньй носитель смачивают 8 мп боратного буфера.Иммобилизацию зашотрипсина проводят, как описано s примере 2. Получают препарат с активностью 7200 Е/г (на ЛТЭЭ); выход иммобилизации по активности составляет 37,2%. Содержание белка в препарате составляет 21,2 мг/г и выход белка 61,6%. После контрольного гидролиза препарат обладает активностью 60% от исходной. П р и м е р 5. Получе ше нерастворимо Ч ферментного препарата (иммобшшзировашюго панкреатина) с использованием носителя, модифициpoBajffioro полиаьидом, активированием п бензохиноном, 5 г модифицированного полиамидом носителя (пример ) обрабатывают п-бензохиноном. как в примере 1. Лктивировашагй носитель смачивают 8 мл боратного буфера. Иммобилизацию панкреатина проводят, как описано в примере 2, с тем различием, что концентрация фермента составляет 80 мг/мл. Получают нераствориьа.1Й препарат панкреатина с активностью 17,4 Е/г (активность определяют ка 2%-ном растворе казеина). Выход иммобилизации по активности 23,6%. Содержание белка в. препарате составляет 24,2 мг/г и выход белка 56%. После контрольного гидролиза сохраняется 58% от исходной активности.

78

И р и м е р 6. Получение регенерированного носителя, пригодного для последующего модифицирования полимерами.

Для удале1гая полиамидного покрытия с поверхности пор кремнеземсодержащего материала и возобновления свойств поверхности его проводят гидролиз с минеральной кислЬтой при кипячении.

100 г регенерируемого носителя помещают в 1-литровую колбу, снабженную механической мешалкой. Добавляют 500 мл 1 н соляной кислоты и кипятят при перемешиватгаи (600800 об/мин) в течение 1 ч. После этого раствор декантируют и носитель моют два раза горячей водой. Затем носитель высушивают иа кювете при ком натной температуре или в термостате при . .

Формула изобретения

Способ получения носителя для иммобилизации белков путем пропитки пористого неорганического материала

8

органическим пленкообразующим ведеством, содержащим реакщюнноспособные группы с последующей активацией носителя реагентами, выбранными из группы, включакядей глутаровый диальдегид, диизоцианат адипиновой кислоты или пара-бензохинон, отличающийся тем, что, с целью повышения реакционной способности носителя повышения стабильности получаемых конъюгатов и обеспечения регенерации носителя, неорганический носитель пропитывают растворами адипиновой кислоты и 1,6-гексаметиле1щиамина в соотношении эквивалентов адипиновой кислоты и 1,6-гeкcaмeтшleндиa IИнa 1:1,5, после чего осуществляют поликонденсацию при в атмосфере инертного газа в течение 2-3 ч.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

кл. С 07 G 7/02, 1977 (прототип).