Способ коррекции опухоль-индуцированной инволюции тимуса Российский патент 2024 года по МПК C01G9/06 A61K33/30 A61P43/00 

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, в частности иммунологии и онкологии, и может быть использовано для торможения развития инволюции тимуса и увеличения клеточности данного органа при опухолевом росте.

Проблема возникновения, развития и коррекции состояний, сопровождающихся нарушением функционирования иммунной системы организма, является одной из важнейших проблем клинической медицины, в особенности в клинической онкологии.

В настоящее время доказано, что тимус (вилочковая железа) и опухоль оказывают друг на друга взаимное влияние. Помимо того, что развитие опухоли влечет за собой запуск акцидентальной инволюции тимуса, большинство опухолей являются тимусзависимыми [Драндрова Е.Г. Морфологическая и иммуногистохимическая характеристика тимуса при экспериментальном канцерогенезе потомства самок с вторичным иммунодефицитом. Дисс. канд. мед. наук, Чебоксары, 2015]. Это характерно для злокачественных новообразований различного происхождения: возникающих спонтанно (A. Hussain et al., 1990), индуцированных с помощью введения вирусов (В.Н. Степина, 1966) или канцерогенов (D.A. Wagner et al., 1982), а также для перевиваемых сингенных опухолей (S.A. Carlsson et al., 1981).

С ростом опухоли тимус атрофируется, уменьшаются его масса и клеточность, снижается уровень Т-лимфоцитов. У мышей с перевиваемой опухолью масса тимуса к 21 суткам опухолевого роста снижается вплоть до 30% от нормального веса данного органа [Рутто К.В. Влияние семафорина 3а на клетки тимуса мышей в норме и при опухолевом росте. Дисс. канд. биол. наук. Санкт-Петербург, 2019.].

У человека тимус достигает максимального относительного веса в возрасте одного года, а максимального абсолютного - в подростковом возрасте. Возрастная инволюция тимуса начинается после окончания периода полового созревания. Лимфоидные компоненты тимуса человека уменьшаются на 3% ежегодно вплоть до 35-45 лет, а после этого возраста на 1% [Pearse G. Normal structure, function and histology of the thymus. Toxicol. Pathol. - 2006. - Vol. 34, №5. - P. 504-514].

Однако тимус подвергается инволюционным изменениям не только с возрастом, но и в результате различных заболеваний, включающих инфекции [Valentin H et al. Measles virus infection induces terminal differentiation of human thymic epithelial cells. J Virol. - 1999. - Vol. 73, №3. - P. 2212-2221], злокачественные опухоли [Song Y. et al. Disruption of the thymic microenvironment is associated with thymic involution of transitional cell cancer. Urol. Int. - 2014. - Vol. 92, №1. - P. 104-115], а также при лечении некоторыми лекарственными веществами, например, глюкокортикостероидами [Talaber G. et al. Wnt-4 protects thymic epithelial cells against dexamethasone-induced senescence. Rejuvenation Res. - 2011. - Vol. 14, №3. - P. 241-248], цитостатиками [Mackall C.L. et al. Age, thymopoiesis, and CD4+ T-lymphocyte regeneration after intensive chemotherapy. N. Engl. J. Med. - 1995. - Vol. 332, №3. - P. 143-149] или в результате лучевой терапии [Adkins В. et al. Total lymphoid irradiation leads to transient depletion of the mouse thymic medulla and persistent abnormalities among medullary stromal cells. J. Immunol. - 1988. - Vol. 140, №10. - P. 3373-3379.].

Нарушение тимопоэза у взрослых приводит к снижению выхода зрелых тимоцитов и сужению разнообразия Т-клеточных рецепторов, необходимых для полноценной противоинфекционной защиты, что особенно важно для пациентов, проходящих курс химио- или рентгенотерапии [Heng T.S.P., Chidgey А.Р., Boyd R.L. Getting back at nature: understanding thymic development and overcoming its atrophy. Curr. Opin. Pharmacol. 2010. Vol. 10, №4. P. 425-433]. Разработка эффективных стратегий для улучшения функций тимуса у онкологических больных является актуальной задачей.

Наиболее полные данные по вопросу инволюции тимуса при опухолевом росте приводятся в зарубежном обзоре Carrio R [Carrio R, Lopez DM. Insights into thymic involution in tumor-bearing mice. Immunol. Res. 2013 Dec; 57(l-3):106-14. doi: 10.1007/s 12026-013-8446-3. PMID: 24198066.]. Основные данные этой работы сводятся к следующему: при росте опухолей у мышей наблюдается выраженное снижение массы тимуса и количества тимоцитов. Нет существенных данных, указывающих на недостаточность поступления пре-Т лимфоцитов из костного мозга в тимус или усиленный выход незрелых тимоцитов на периферию, хотя эти вопросы и обсуждаются в литературе [Ohm JE, Gabrilovich DI, Sempowski GD, Kisseleva E, Parman KS, Nadaf S, Carbone DP. VEGF inhibits T-cell development and may contribute to tumor-induced immune suppression. Blood. 2003 Jun 15; 101(12):4878-86. doi: 10.1182/blood-2002-07-1956. Epub 2003 Feb 13. PMID: 12586633]. В основном все изменения фиксируются непосредственно внутри тимуса. Фенотипически наибольшему снижению подвержены двойные позитивные CD4+CD8+ клетки [Fu Y, Paul RD, Wang Y, Lopez DM (1989) Thymic involution and thymocyte phenotypical terations induced by murinemammary adenocarcinomas. J. Immunol. 143(12):4300-7. PMID: 259277].

Многими исследователями отмечается снижение пролиферативной активности тимоцитов [Edwards AJ, Rowland GF, Sumner MR, Hurd CM. Changes in lymphoreticular tissues during growth of a murine adenocarcinoma. II. Nucleic acid content and synthesis in lymph nodes, spleen, and thymus. J Natl Cancer Inst. 1971 Aug; 47(2):313-20. PMID: 5559239], а также блок дифференцировки тимоцитов на уровне ранних этапов созревания двойных негативных клеток в субкапсулярной зоне [Adkins В. Development of neonatal Th1/Th2 function. Int. Rev. Immunol. 2000; 19 (2-3):157-71. doi: 10.3109/08830180009088503. PMID: 10763707] и усиление апоптоза [Adkins В. Development of neonatal Th1/Th2 function. Int. Rev. Immunol. 2000; 19 (2-3): 157-71. doi: 10.3109/08830180009088503. PMID: 10763707]

Нарушение тимопоэза у взрослых людей значительно снижает противоинфекционную защиту организма, что особенно важно, например, для сохранения адекватного качества жизни пациентов, проходящих курс химио- или лучевой терапии, а также получающих иммунобиологические препараты по поводу онкологического заболевания. Ввиду этого, помимо углубления понимания фундаментальных процессов, вовлеченных в процесс опухоль-индуцированной инволюции тимуса, сохранение функции данного органа при опухолевом росте является актуальной задачей и для современной практической медицины.

В качестве индукторов инволюции тимуса при опухолевом росте рассматриваются различные факторы, которые могут синтезироваться в организме в процессе опухолевого роста и находиться в циркуляции в избыточном количестве. К ним относятся глюкокортикоидные гормоны, ростовые факторы, интерлейкины, медиаторы воспаления и др. Однако конкретная роль ни одного из этих факторов в механизме инволюции тимуса при опухолевом росте не установлена. Данных о возможности коррекции опухоль-индуцированной инволюции тимуса при росте гепатомы 22А в литературе нет.

Задача настоящей работы состояла в том, чтобы найти способ корректировать инволюцию тимуса у экспериментальных животных, тормозить уменьшение массы тимуса и его клеточности.

Данные литературы о торможении развития инволюции тимуса при росте перевиваемых опухолей практически отсутствуют, за исключением одной работы, в которой исследовали состояние тимуса у мышей с карциномой Льюиса при введении тимулина [Kaiserlian D, Savino W, Hassid J, Dardenne M. Studies of the thymus in mice bearing the Lewis lung carcinoma. III. Possible mechanisms of tumor-induced thymic atrophy // Clinical Immunology and Immunopathology. 1984; 32(3):316-325. https: // doi: 10.1016/0090-1229(84)90275-7].

Инволюция тимуса зависит в большей или меньшей степени от разных факторов. Например, при дефиците цинка независимо от других условий наблюдается атрофия тимуса, причем в любом возрасте [Taub D.D., Longo D.L. Insights into thymic aging and regeneration // Immunol Rev. - 2005. - Vol. 205. - P. 72-93]. Поскольку такой металл как цинк нужен для нормального функционирования не только лимфоидной, но и любой другой ткани, и с возрастом количество цинка в организме уменьшается, можно сказать, что это тоже вносит свой вклад в возрастную инволюцию тимуса [Зассеева М.Д. Изменения гистологической структуры тимуса мыши и митотической активности тимоцитов в ходе акцидентальной трансформации и иммунного ответа. Дисс. канд. биол. наук. СПб, 2015. Электронный ресурс. URL: https://disser.spbu.ru/disser2/disser/zaseeva_disser.pdf. Обращение 10.08.2021].

В экспериментальной и клинической фармакологии достаточно широко используются соли цинка для профилактики и лечения онкологических заболеваний [Hoang В.Х., Han В., ShawDG, NimniM. Zinc as a possible preventive and therapeutic agent in pancreatic, prostate, and breast cancer // Eur. J. Cancer. Prev. 2016. Vol. 25, №5. P. 457-461]. Эти препараты и в настоящее время используются для терапии синдрома усталости и улучшения качества жизни лиц, получающих химиотерапию [Ribeiro S.M., Braga С.В., Peria F.M., Martinez E.Z., Rocha J.J., Cunha S.F. Effects of zinc supplementation on fatigue and quality of life in patients with colorectal cancer // Einstein. 2017. Vol. 15, №1. P. 24-28].

В зарубежной литературе имеется ряд данных о том, что для восстановления массы и клеточности тимуса можно применить диету с повышенным содержанием цинка или с его добавлением в питьевую воду, что было успешно использовано у старых мышей, но никогда не было исследовано при росте опухолей [Dardenne М., Boukaiba N., Gagneraout М.-С. et al. Restoration of the thymus in ageing mice by in vivo zinc supplementation. Clinical Immunology and Immunopathology; Mocchegiani E., Santarelli L., Muzzioli M., Fabris N. Reversibility of the thymus involution and of age-related peripheral immune dysfunction by zinc supplementation in old mice. International Journal of Immunopharmacology. 1995; 17(9):703-718; Wong C.P., Song Y, Ellas V.D. et al. Zinc supplementation increases zinc status and thymopoiesis in aged mice. The Journal of nutrition. 2009; 139(7): 1393-1397].

Приведенные данные указывают на то, что соли цинка могут быть перспективными препаратами также и для разработки новых тактик по восстановлению функций тимуса у онкологических больных.

Сущность изобретения заключается в том, что качестве средства для коррекции инволюции тимуса при опухолевом росте предложено пероральное применение сульфата цинка с питьевой водой.

Проведено исследование влияния применения препарата цинка вводимого перорально с питьевой водой в дозировке 22-66 мкг на 1 мл питьевой воды. Для изучения действия заявляемого способа, в качестве экспериментальных животных-млекопитающих выбраны мыши линии С3НА. В качестве модели опухолевого процесса использовали опухоль - сингенную гепатому 22А.

Клетки культивировали в среде DMEM, с добавлением 10% фетальной сыворотки. Для получения солидных опухолей мышам подкожно инокулировали в область спины 2×10⁵ клеток сингенной гепатомы 22а в объеме 0,2 мл физиологического раствора. Контрольные животные получали инъекцию физиологического раствора. Все экспериментальные животные находились на стандартной диете и получали сухой комбикорм ПК-120 («Лабораткорм», Москва, Россия), содержащий 22,5 мг цинка на кг. Для изучения действия цинка животные с опухолями получали ad libitum питьевую воду с добавлением сульфата цинка (Sigma-Aldrich, для клеточных культур) в концентрациях 11, 22 и 66 мкг/мл с первого дня после инокуляции клеток гепатомы 22а в течение всего периода эксперимента. Все исследования проводились в соответствии с требованиями и условиями, изложенными в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» и приказом Минздрава РФ №267 от 19.06.03 «Об утверждении правил лабораторной практики». На 21 сутки опухолевого роста животных наркотизировали и после декапитации извлекали и проводили измерение массы тимуса и подсчет клеток.

Размеры опухолей измеряли в двух взаимно перпендикулярных направлениях и вычисляли средний диаметр опухоли по формуле: , где “а” - наибольший размер опухоли, "b" - наименьший размер опухоли, а 1 мм - толщина кожной складки. Оценку выживаемости проводили в группах по 10 животных с гепатомой 22а, получавших либо питьевую воду, либо воду с добавлением сульфата цинка в концентрации 22 мкг/мл в течение всего срока наблюдения. Статистическую обработку результатов проводили в программе Statistica 13.0 с использованием t-критерия Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при р≤0,05. Данные представлены в виде среднего значения ± ошибка среднего (М±m). Расчет кривых выживаемости проводили с помощью метода Каплана-Майера в программе Graph Pad Prism 6,0 (Graph Pad Software, США), а статистически значимую разницу определяли с помощью критерия Гехана-Бреслоу-Вилкоксона.

На 21 сутки роста гепатомы 22а у мышей наблюдали значительное снижение концентрации цинка в образцах сыворотки крови - в 1,9 раз по сравнению с контрольными показателями (фиг. 1).

Прием цинка в концентрациях 22 и 66 мкг/мл вызывал увеличение массы тимуса у мышей-опухоленосителей по сравнению с тимусами мышей с опухолью, цинк не получавших. Наилучший эффект в отношении сохранения массы тимуса оказывала концентрация сульфата цинка 22 мкг/мл, которая достоверно повышала массу тимуса, хотя и оставалась ниже значений у контрольных животных (фиг. 2).

Для коррекции этих показателей в питьевую воду животным добавляли сульфат цинка в одной из трех концентраций, а именно 11, 22 и 66 мкг/мл. Прием цинка в концентрациях 22 и 66 мкг/мл вызывал повышение уровня содержания эндогенного цинка в крови, хотя этот уровень и не достигал контрольных показателей (см. фиг. 1).

Масса тимуса у мышей, получавших цинк, также была больше. Наилучший эффект в отношении сохранения массы тимуса оказывала концентрация сульфата цинка 22 мкг/мл, которая достоверно повышала массу тимуса, хотя и оставалась ниже значений у контрольных животных (фиг. 2). Для дальнейших экспериментов была выбрана эта концентрация.

Как показано на фиг. 3, в группе мышей с гепатомой 22а, получавших цинк, более высокие показатели массы тимуса сопровождались также и большим числом тимоцитов в расчете на весь орган, по сравнению с группой животных, цинка не получавших.

Следует отметить, что у мышей, которым не прививали опухоль и у которых не было дефицита цинка (группа К2 на фиг. 1 и фиг. 2), прием цинка с питьевой водой не оказывал влияния ни на массу тимуса, ни на содержание цинка в образцах сыворотки крови. Тем самым было показано, что дополнительный прием сульфата цинка в концентрации 22 мкг/мл действовал только на мышей с дефицитом цинка (в данном случае имеющих опухоли) и не влиял на контрольных животных с нормальным уровнем содержания данного микроэлемента в циркуляции, что согласуется с литературными данными об отсутствии влияния дополнительного поступления цинка на состояние тимуса и содержание цинка в сыворотке здоровых мышей.

Для того, чтобы ответить на вопрос, не являются ли наблюдаемые эффекты следствием задержки опухолевого роста, оценивали влияние приема цинка на размеры опухолей и выживаемость мышей. Как показано на фиг. 4 и фиг. 5, прием сульфата цинка не оказывал влияния на эти показатели. Таким образом, влияние цинка на тимус не опосредовано его действием на опухоль.

При исследовании активности каталазы и супероксиддисмутазы (СОД) в тимусе мышей с гепатомой 22а на 21-е сутки ее роста оба показателя были повышены по сравнению с контрольным уровнем (фиг. 6 и фиг. 7). При этом оказалось, что прием сульфата цинка с питьевой водой не оказывал влияния на активность каталазы и СОД в тимусе мышей с гепатомой 22а.

Заключение

Введение дополнительного цинка с первого дня после инокуляции опухоли позволило сохранить массу тимуса на уровне 60% от исходного, а также значительно увеличить клеточность в тимусе при росте опухоли.

Кроме того, показано, что восстановление тимуса под действием цинка происходило на фоне отсутствия влияния на размеры опухолей и выживаемость мышей, что предполагает существование независимого механизма действия цинка на тимус.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к простому и эффективному способу коррекции массы и клеточности тимуса. В качестве средства для торможения инволюции тимуса при опухолевом росте предложено применение сульфата цинка с питьевой водой перорально в дозировке 33 мкг на 1 мл питьевой воды в течение трех недель. Изобретение может быть использовано для торможения развития инволюции тимуса и увеличения клеточности данного органа при опухолевом росте. 7 ил.

Способ коррекции опухоль-индуцированной инволюции тимуса, заключающийся в том, что в качестве корректора используют сульфат цинка, вводимый перорально с питьевой водой в концентрации 33 мкг/мл в течение трех недель.