Способ терапии глиомы человека за счет снижения пролиферации и индукции дифференцировки опухолевых клеток глиомы человека Российский патент 2024 года по МПК A61K31/7088 A61K45/06 C12N15/115 A61P35/00 

Область техники

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, конкретно к способу снижения пролиферации опухолевых клеток глиомы человека.

Уровень техники

Опухолевые клетки обладают способностью к активному и бесконтрольному делению. В случае глиом современные подходы к терапии, такие как хирургическая резекция опухоли, радио- и химиотерапия, не способны полностью элиминировать опухолевые клетки из очага поражения. Возникновение рецидивов глиом, в результате которых из оставшихся после терапии клеток происходит разрастание опухоли, до сих пор остается нерешенной задачей. Например, 5-летняя выживаемость пациентов с диагнозом глиобластома составляет 5%, 2-летняя - 26-33% [1, 2]. Таким образом, актуальным является вопрос снижения возможности клеток к делению и стимуляции их дифференцировки.

Существует способ для лечения заболеваний, включающих пролиферацию клеток, заключающийся в обработке комбинацией, состоящей из предложенного средства 1 [3] и хотя бы одного терапевтического средства. Способ позволяет сдерживать рост различных видов опухоли, например, рака ободочной кишки, рака легких и рака поджелудочной железы. Однако данный способ подразумевает большую палитру синтезируемых средств, что усложняет выбор определенной действующей комбинации.

Известен способ ингибирования пролиферации раковой стволовой клетки (РСК), в основе которого лежит взаимодействие РСК с антителом к лектиноподобному рецептору 1 окисленных LDL (LOX1) [4]. Способ позволяет создавать популяции клеток с увеличенным количеством раковых стволовых клеток, идентифицировать связующие средства с улучшенным связыванием с раковыми клетками, ингибировать пролиферацию раковых стволовых клеток и идентифицировать LOX1 в качестве мишени для подавления раковых стволовых клеток. Однако способ предполагает приведение РСК в контакт с ингибитором LOX1, концентрация которого заранее неизвестна и должна подбираться опытным путем.

Существует способ воздействия на опухолевые клетки с помощью гетероциклических соединений, обладающих антипролиферативной активностью [5]. Было показано, что в бесклеточной тест-системе из регенерирующей печени крыс исследуемые вещества способны изменять активность аминооксидаз, что, однако, является косвенным показателем пролиферативной активности опухолевых клеток и может быть не самым точным методом оценки способности клеток к делению. Прототип.

Известен способ использования аптамера к мидкину, который является фактором роста/дифференцировки, позволяющий лечить связанные с этим фактором заболевания [6]. Указано, что данный фактор впервые обнаружен как продукт гена, транзиентно экспрессирующийся в процессе индукции дифференцировки эмбриональных раковых клеток ретиноевой кислотой. Увеличение экспрессии гена, отвечающего за синтез мидкина, наблюдается при таких видах рака, как рак пищевода, рак щитовидной железы, рак мочевого пузыря, рак прямой кишки, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак груди, рак печени, рак легких, рак молочной железы, нейробластому, глиобластому, рак матки, рак яичников и опухоль Вильмса. Отмечено, что мидкин способствует выживанию и перемещению раковых клеток и облегчает неоваскуляризацию, что приводит к прогрессированию рака. Таким образом, использование данного аптамера должно способствовать блокированию процессов, связанных с развитием опухоли. К недостаткам можно отнести то, что аптамер к мидкину представляет собой довольно большую молекулу, поскольку заявленная длина может достигать 80 нуклеотидов. Оптимальная длина для синтезируемых аптамеров - 20-40 нуклеотидов [7].

Сущность изобретения

Задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является улучшение подхода к созданию антипролиферативного и нейроиндукторного эффектов в отношении опухолевых клеток.

Предлагаемый способ решения данной задачи заключается в следующем. К культурам клеток глиомы III и IV грейда последовательно с интервалом в один день добавляются антипролиферативный фактор, как, например, аптамер GGGTGGGTGGGTGGGTTTGGGTGGGTGGGTGGG, обладающий антипролиферативными свойствами, и нейроиндукторные факторы, такие как малые молекулы SB431542, LDN-193189, Purmorphamine и BDNF, используемые для нейральной дифференцировки клеток.

Определяющими отличиями заявляемого способа, по сравнению с прототипом, являются:

1. В комбинации с антипролиферативным фактором - аптамером применяются нейроиндукторные малые молекулы.

2. В качестве антипролиферативного аптамера используется последовательность длиной 33 нуклеотида.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Оценка пролиферации клеток культуры G01 на 10-й день после воздействия исследованной комбинацией факторов по сравнению с контролем.

Фиг. 2. Оценка экспрессии генов стволовости на 10-й день после воздействия исследованной комбинацией факторов по сравнению с контролем.

Фиг. 3. Оценка пролиферации клеток культуры 22 на 10-й день после воздействия исследованной комбинацией факторов по сравнению с контролем.

Фиг. 4. Оценка пролиферации клеток культуры 40 на 10-й день после воздействия исследованной комбинацией факторов по сравнению с контролем.

Осуществление изобретения

Нами были проведены исследования, направленные на оценку пролиферативной активности клеток после воздействия комбинацией аптамера и малых молекул с помощью МТТ теста и на оценку экспрессии генов стволовости после воздействия указанными факторами.

Были выведены культуры клеток глиомы человека III и IV грейда. Для постановки эксперимента клетки высаживались на 96-луночные плашки в зависимости от скорости роста культуры, чтобы на 10-й день была возможность оценить контроль, то есть клетки без добавления факторов. Добавление факторов проводилось по следующей схеме: на следующий день после высева клеток в 96-луночную плашку проводилось добавление аптамера. На 3-й день в культуральную среду добавлялись факторы SB431542 и LDN-193189. На 5-й день проводилась частичная смена среды и добавлялся следующая малая молекула - Purmorphamine. Последний фактор BDNF добавлялся на 7-й день эксперимента. Далее клетки инкубировались в СО₂-инкубаторе в течение 72 часов. На 10-й день происходит оценка пролиферативной активности клеток методом МТТ.

При постановке МТТ теста производилась смена среды и добавлялся MTS реагент. Клетки инкубировались во влажной атмосфере с 5% СО₂. Изменения оптической плотности проводились на приборе CLARIOstar Plus. Строятся графики, на которых по оси «х» указывается оптическая плотность, на оси «у» располагается контрольный и экспериментальный образец.

Оценка экспрессии генов стволовости CD44, CD133, Nestin, L1CAM, Sox2 и Notch2 проводится методом ПЦР в реальном времени. Из культуры клеток выделяют тотальную РНК с помощью реагента RNAzol в соответствии с протоколом производителя. Проводят синтез первой цепи кДНК в реакции обратной транскрипции. С полученной кДНК ставят реакцию ПЦР в реальном времени и определяют уровни экспрессии генов стволовости. Снижение экспрессии генов стволовости оценивается на 10-й день после начала эксперимента.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения способа.

Пример 1

Больной Г., 39 лет, проведена операция по удалению опухоли левой лобной доли. Диагноз - глиобластома, IV грейд злокачественности. Из биоптата опухоли выделена культура клеток G01. Клетки культивировались в среде DMEM/F12 с добавлением 10% FBS, 1% глутамина при 37°С во влажной атмосфере с 5% СО₂. Клетки высаживались в количестве 1000 клеток на лунку в объеме среды 200 мкл. Контроль и опыт ставились в 3-х повторах. На следующий день добавлялся аптамер в концентрации 37,5 мкМ. Через день в среду добавлялись факторы SB41542 в концентрации 10 μМ и LDN-193189 в концентрации 1 μМ. На 5-й день производилась частичная смена среды и добавлялся Purmorphamine в концентрации 2 цМ. На 7-й день добавлялся последний фактор BDNF в концентрации 20 ng/mL. На 10-й день ставился МТТ тест. Проводилась полная смена среды и из расчета 1:10 к 200 мкл свежей среды добавлялось 20 мкл реагента MTS. Клетки инкубировались в течение 2 часов во влажной атмосфере с 5% СО₂. Изменения оптической плотности проводились на приборе CLARIOstar Plus при длине волны 495 нм.

Для постановки ПЦР в реальном времени сначала из культуры клеток выделяли тотальную РНК с помощью реагента RNAzol в соответствии с протоколом производителя. Для синтеза кДНК применяли обратную транскриптазу MMLV и рандомный N10 праймер в соответствии с протоколом производителя. Выделенная тотальная РНК добавлялась в смесь в качестве матрицы. Полученная кДНК проверялась с помощью пробной ПЦР с последующим разгоном образцов в 1% агарозном геле. В качестве праймера использовался GAPDH. Данную кДНК использовали для постановки ПЦР в реальном времени. Реакция проводилась с помощью амплификатора LightCycler 96. При этом использовали набор реагентов для проведения ПЦР в реальном времени в присутствии SYBR Green I. Реакцию проводили в объеме 25 мкл, реакционная смесь состояла из 2.5 мкл dNTP (концентрация 2.5 мМ), 10-кратного ПЦР буфера Б, MgCl₂ (25 мМ), смеси праймеров (конечная концентрация каждого праймера 0.25 мМ), 1 единицы Taq ДНК-полимеразы.

Параметры ПЦР-амплификации: 1) 20 сек денатурации при 94°С; 2) 12 сек отжиг праймеров при 60°С; 3) 15 сек элонгации при 72°С. 41 цикл амплификации. Обсчет результатов количественного ПЦР в реальном времени проводили с использованием программного обеспечения, поставляемого с прибором LightCycler® 96 SW 1.1. Праймеры подбирали с использованием программы Primer-Blast (NCBI). В качестве гена сравнения использовались гены домашнего хозяйства - HPRT и GAPDH. Использованные олигонуклеотиды приведены в таблице 1.

Снижение пролиферации в опытном образце по сравнению с контрольным составило 85,7% (фиг. 1).

Как видно из фиг. 2, в результате воздействия комбинацией факторов происходит снижение экспрессии всех исследуемых генов стволовости.

Пример 2

Больной Д., 46 лет, проведена операция по удалению опухоли правой височной, островковой доли. Диагноз - анапластическая астроцитома, III грейд злокачественности. Из биоптата опухоли выделена культура клеток 22. Клетки культуры обрабатывались комбинацией факторов по указанной выше схеме, на 10-й день проводился МТТ тест.

Снижение пролиферации в опытном образце по сравнению с контрольным составило 96,5% (фиг. 3).

Пример 3

Больной С., 55 лет. Проведена операция по удалению опухоли левой височной доли. Диагноз - глиобластома, IV грейд злокачественности. Из биоптата опухоли выделена культура клеток 40. Клетки культуры обрабатывались комбинацией факторов по указанной выше схеме, на 10-й день проводился МТТ тест.

Как видно из фиг. 4, снижение пролиферации культуры клеток 40 произошло на 94,1%.

Заявленный способ демонстрирует эффективное снижение пролиферации клеток и индукцию дифференцировки культур глиом III и IV грейда с помощью комбинации из 5 определенных факторов в выверенной концентрации.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Batash R. Glioblastoma Multiforme, Diagnosis and Treatment; Recent Literature Review / Batash R., Asna N., Schaffer P., Francis N., Schaffer M. // Current Medicinal Chemistry - 2017. - T. 24 - №27 - C. 3002-3009.

2. Delgado-Lopez P.D. Survival in glioblastoma: a review on the impact of treatment modalities / Delgado- Lopez P.D., Corrales-Garcia E.M. // Clinical and Translational Oncology - 2016. - T. 18-№11 - C. 1062-1071.

3. Мунцерт Г. (DE) Комбинации, предназначенные для лечения заболеваний, включающих пролиферацию клеток / Мунцерт Г. (DE), Штегмайер М. (DE), Баум A. (AT) - 2009. - С. 1-134.

4. Раст С.(GB) Композиции и способы подавления раковых стволовых клеток / Раст С.(GB), Сандеркок A. (GB), Минтер P. (GB), Каратанасис С.(US), Херт, Элейн М. (US) - 2021. - С. 1-76.

5. Шевченко A.A. (RU) Гетероциклические соединения, обладающие антипролиферативной активностью, и способ замедления скорости пролиферации опухолевых клеток / Шевченко А.А. (RU), Сяткин СП. (RU), Левов А.Н. (RU), Бенинати С. (RU), Федорончук Т.В. (RU) - 2011.

6. Миякава С.(JP) Аптамер против мидкина и его применение / Миякава С.(JP), Фудзивара М. (JP), Накамура Й. (JP), Мацуи Т. (JP), Сакума С.(JP) - 2007. - С. 1-83.

7. Bouchard P.R. Discovery and Development of Therapeutic Aptamers / Bouchard P.R., Hutabarat R.M., Thompson K.M. // Annual Review of Pharmacology and Toxicology - 2010. - Т. 50-C. 237-257.

Перечень последовательностей

<110> Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии Российской академии наук <120> Способ терапии глиомы человека за счет снижения пролиферации и индукции дифференцировки опухолевых клеток глиомы человека. <160> 1 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Искусственная последовательность <400> 1 GGGTGGGTGGGTGGGTTTGGGTGGGTGGGTGGG

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Предложен способ снижения пролиферации и индукции дифференцировки опухолевых клеток глиомы человека при терапии глиомы. На клетки глиомы человека III и IV грейда на следующий день после высева воздействуют аптамером, имеющим последовательность GGGTGGGTGGGTGGGTTTGGGTGGGTGGGTGGG, затем через день добавляют нейроиндукторные факторы SB431542 и LDN-193189, на 5-й добавляют Purmorphamine и на 7-й день добавляют фактор BDNF. Способ позволяет снижать пролиферацию опухолевых клеток глиом человека высоких грейдов, в частности, на 85,7-94,1% в случае глиом IV грейда, на 96,5% в случае глиомы III грейда, а также позволяет уменьшить экспрессию маркеров стволовости. 4 ил., 1 табл., 3 пр.

Способ снижения пролиферации и индукции дифференцировки опухолевых клеток глиомы человека при терапии глиомы человека, включающий обработку клеток антипролиферативным аптамером и нейроиндукторными факторами, отличающийся тем, что последовательно к культурам клеток глиомы человека III и IV грейда на следующий день после высева клеток добавляют аптамер, имеющий последовательность GGGTGGGTGGGTGGGTTTGGGTGGGTGGGTGGG, обладающий антипролиферативными свойствами, затем через день добавляют нейроиндукторные факторы, используемые для нейральной дифференцировки клеток, такие как малые молекулы SB431542 и LDN-193189, на 5-й добавляют Purmorphamine и на 7-й день добавляют последний фактор BDNF.