УЛУЧШЕННЫЙ СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА В ДОФАМИНЭРГИЧЕСКИЕ НЕЙРОНЫ Российский патент 2024 года по МПК C12N5/793 C12N5/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области биотехнологии и медицине и представляет собой способ получения биомедицинского клеточного продукта, а именно дофаминэргических нейронов, дифференцированных in vitro из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (ИПСК).

Уровень техники

Болезнь Паркинсона (БП) - это нейродегенеративное заболевание, которым страдают миллионы людей во всем мире. Оно вызвано потерей дофаминэргических нейронов в головном мозге, что приводит к появлению двигательных и недвигательных симптомов, таких как тремор, ригидность и когнитивные нарушения. Клеточные технологии с использованием плюрипотентных стволовых клеток (ПСК) представляют собой перспективную стратегию терапии БП, поскольку позволяют генерировать неограниченное количество дофаминэргических нейронов для трансплантации. ПСК могут быть выделены из бластоцист, полученных путем экстракорпорального оплодотворения, с получением эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) или репрограммированы из соматических клеток, таких как клетки кожи или крови, с получением ИПСК. Из уровня техники известно множество способов (протоколов) получения дофаминэргических нейронов направленной дифференцировкой из ПСК in vitro, что представлено в разработках, опубликованных в работах [Swistowski, A., Peng, J., Liu, Q., Mali, P., Rao, M. S., Cheng, L., & Zeng, X. (2010). Efficient generation of functional dopaminergic neurons from human induced pluripotent stem cells under defined conditions. Stem cells, 28(10), 1893-1904, 10.1002/stem.499; Kriks, S.; Shim, J.W.; Piao, J.; Ganat, Y.M.; Wakeman, D.R.; Xie, Z.; Carrillo-Reid, L.; Auyeung, G.; Antonacci, C.; Buch, A.; et al. (2011) Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson’s disease. Nature, 480, 547–551, doi: 10.1038/nature10648; Kirkeby, A., Nelander, J., & Parmar, M. (2013). Generating regionalized neuronal cells from pluripotency, a step-by-step protocol. Frontiers in cellular neuroscience, 6, 64, doi: 10.3389/fncel.2012.00064; Liu, Q., Pedersen, O. Z., Peng, J., Couture, L. A., Rao, M. S., & Zeng, X. (2013). Optimizing dopaminergic differentiation of pluripotent stem cells for the manufacture of dopaminergic neurons for transplantation. Cytotherapy, 15(8), 999-1010, 10.1016/j.jcyt.2013.03.006; Doi, Daisuke, et al. (2020) Clinically compatible differentiation protocol for human pluripotent stem cell-derived dopaminergic progenitor cells. Protocol Exchange, doi: 10.21203/rs.3.pex-954/v1]. Все протоколы используют последовательное изменение композиций (рецептур) культуральных сред, что позволяет направить дифференцировку ПСК сначала в нейроэпителиальные клетки-предшественники, затем клетки-предшественники вентрального среднего мозга и далее в более зрелые дофаминэргические нейроны. В некоторых случаях протоколы содержат стадию сортировки клеток или стадию получения эмбриоидных телец.

Близкий к настоящему изобретению аналог описан в работе Kriks et al. (2011), где показана возможность получения культуры тирозингидроксилаза-положительных дофаминэргических нейронов с 80 % чистотой клеточной популяции путем направленной дифференцировки ИПСК [Kriks, S.; Shim, J.W.; Piao, J.; Ganat, Y.M.; Wakeman, D.R.; Xie, Z.; Carrillo-Reid, L.; Auyeung, G.; Antonacci, C.; Buch, A. et al. (2011) Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson’s disease. Nature, 480, 547–551, doi: 10.1038/nature10648]. В этом протоколе основными драйверами дифференцировки являются малые молекулы-активаторы сигнального пути Sonic Hedgehog (SHH) и канонического WNT сигнального пути. В данном протоколе ИПСК вначале выращивали в течение 11 дней на чашках Петри, покрытых Матригелем, в среде, содержащей DMEM, 15 % заменителя сыворотки, 2 мМ L-глутамина и 10 мкМ β-меркаптоэтанола. Начиная с 5-го дня дифференцировки до 11-го дня ИПСК постепенно переводили в среду, содержащую среду Neurobasal с нейротрофической добавкой B27 и глутамином (NB/B27; Invitrogen), дополненную аскорбиновой кислотой, рекомбинантными белками BDNF (brain-derived neurotrophic factor,), GDNF (глиальный нейротрофический фактор), TGFβ3 (трансформирующий фактор роста типа β3 и малыми молекулами дибутирилом cAMP (dbcAMP), CHIR99021 (до 13-го дня), являющимся ингибитором сигнального пути WNT, и DAPT, являющейся ингибитором сигнального пути Notch. После чего клетки культивировали в такой среде в течение 9 дней. На 20-й день клетки диссоциировали с помощью фермента аккутазы и переводили клетки в среду для окончательного созревания следующего состава: NB/B27, BDNF, аскорбиновая кислота, GDNF, dbcAMP, TGFβ3 и DAPT (ингибитор γ-секретазы, ключевого регулятора сигнального пути Notch). Дофаминэргические нейроны в этом протоколе получают к 25-му дню, и они могут поддерживаться в культуре in vitro в течение нескольких месяцев. Данные молекулярного профилирования, биохимические и электрофизиологические эксперименты подтверждают идентичность полученных клеток дофаминэргическим нейронам среднего мозга. Однако, несмотря на высокую заявленную эффективность предложенного способа получения дофаминэргических нейронов (до 80 % тирозингидроксилаза-позитивных дофаминэргических нейронов), при масштабировании стоимость исполнения данного протокола становится существенной составляющей в исследованиях, в силу большого количества компонентов и рецептур культуральных сред, общее число которых достигает восьми. К тому же на одном из этапов авторы применяли культивирование ИПСК на фидерном слое из мышиных эмбриональных фибробластов, что повышает риски ксеногенной кросс-контаминации и увеличивает требования к контролю качества при медицинском применении получаемого биомедицинского клеточного продукта. Эти недостатки устранены в предлагаемом изобретении, где в процессе дифференцировки ИПСК в дофаминэргические нейроны используется три рецептуры культуральных сред и не используются компоненты животного происхождения.

Другим близким аналогом способа получения дофаминэргических нейронов является изобретение, описанное в патенте Японии № JP 7225163 B2 (опубл. 20.02.2023; МПК: C12N5/0619), в котором описано получение дофаминэргических нейронов из ПСК путем направленной дифференцировки in vitro, где также используется до 8 смен композиций культуральных сред.

Целью настоящего изобретения является создание нового усовершенствованного способа дифференцировки ИПСК в дофаминэргические нейроны, лишенного недостатков, присущих известным из уровня техники аналогам.

Основным техническим результатом заявленного изобретения является расширение арсенала технических средств получения дофаминэргических нейронов из ИПСК при помощи направленной дифференцировки in vitro. Способ реализуется в течение 38 дней и включает в себя уменьшенное до трех число смен композиций культуральных сред.

Раскрытие изобретения

Предлагаемое изобретение представляет собой способ получения дофаминэргических нейронов путем направленной дифференцировки in vitro популяции ИПСК человека, который включает следующие стадии:

1. Культивирование ИПСК в стандартных для этих клеток средах, не содержащих животных компонентов, в монослойной культуре до достижения конфлюэнтной плотности не менее 90 %.

2. Культивирование в течение двух недель в среде, стимулирующей дифференцировку ИПСК в нейрональном направлении до стадии нейральных клеток-предшественников с использованием в культуральной среде следующих морфогенов: рекомбинантного белка NOGGIN и двух малых молекул, ингибирующих сигнальный путь SMAD (SB431542 и дорсоморфин).

3. Пересев полученных прогениторных нейральных клеток при помощи раствора Версена с посевом в высокой плотности 250,000-400,000 клеток/см² с последующим культивированием в течение 10 дней в питательной среде, содержащей рекомбинантные белки SHH, FGF8 (fibroblast growth factor 8), а также низкомолекулярное соединение – пурморфамин, являющееся активатором сигнального пути Hedgehog.

4. Полученные нейрональные предшественники вентрального среднего мозга пересевают при помощи раствора Версена в высокой плотности 250,000-400,000 клеток/см² и культивируют в среде, содержащий рекомбинантные белки BDNF и GDNF, а также аскорбиновую кислоту и низкомолекулярное соединение - форсколин. В этой среде клетки культивируют в течение 7 дней, затем повышают концентрацию форсколина для более глубокого созревания нейронов и культивируют клетки еще не менее недели. Полученные в результате дофаминэргические нейроны можно использовать, начиная с 38 дня дифференцировки, при этом осуществлять контроль качества полученных клеток можно, начиная с 34 дня дифференцировки.

Техническим результатом, достигаемым при реализации способа дифференцировки ИПСК в дофаминэргические нейроны по настоящему изобретению, заключается в уменьшении количества применяемых композиций культуральных сред до трех при сохранении эффективности дифференцировки. Это позволяет упростить и удешевить процесс получения биомедицинского клеточного продукта, дофаминэргических нейронов, при возможности масштабировании производства. Технический результат был достигнут неожиданно обнаруженной комбинацией ключевых морфогенов, представленных рекомбинантными белками и низкомолекулярными соединениями.

Краткое описание чертежей

Для пояснения сущности заявляемого технического решения к описанию приложены фиг. 1-7.

На фиг. 1 представлена схема получения дофаминэргических нейронов из культуры ИПСК (А), которые дифференцируют в нейральные предшественники (Б), затем в нейрональные предшественники вентрального среднего мозга (В) и далее в зрелые дофаминэргические нейроны.

На фиг. 2a и 2b представлены результаты дифференцировки в процессе выполнения предлагаемого способа по Примеру 1, для чего проводили анализ экспрессии маркера плюрипотентного состояния клеток и маркеров дифференцировки нейронов на разных этапах его осуществления.

(А) - Иммунофлуоресцентный анализ клеток на последовательных этапах дифференцировки для выявления экспрессии маркера плюрипотентного состояния OCT4, маркеров нейрональных предшественников SOX1, PAX6, нейронального маркера β-III-тубулина и маркера дофаминэргических нейронов - тирозингидроксилазы (TH) на примере линии ИПСК IPSRG2L от здорового донора. NPC - нейральные предшественники (день дифференцировки 14), VM NPC - нейрональные предшественники вентрального среднего мозга (день дифференцировки 24), Зрелые - дофаминэргические нейроны (день дифференцировки 38). DAPI - синий цвет, соответствующий маркер - зеленый или красный. Масштабная линейка 100 мкм.

(Б) - Анализ уровня экспрессии плюрипотентного маркера OCT4 методом ПЦР в реальном времени в ИПСК и на 14-й день дифференцировки; IPSRG2L - линия ИПСК от здорового донора; IPSPDL2.15L - линия ИПСК от пациента с БП с мутацией в гене PARK8; IPSPDP1.5L - линия ИПСК от пациента с БП с мутацией в гене PARK2.

(В) - Анализ уровня экспрессии нейронального маркера β-III-тубулина методом ПЦР в реальном времени в ИПСК и на дни дифференцировки 14, 24, 54 на примере линии ИПСК IPSPDL2.6S-ИПСК от пациента с БП с мутацией в гене PARK8.

(Г) - Анализ уровня экспрессии маркера дофаминэргических нейронов тирозингидроксилазы TH методом ПЦР в реальном времени в ИПСК и в дни дифференцировки 14, 24 и 54 на примере линии ИПСК IPSPDL2.6S - ИПСК от пациента с БП с мутацией в гене PARK8.

(Д) - Анализ уровня экспрессии гена, кодирующего транспортер дофамина DAT1, методом ПЦР в реальном времени в ИПСК и в дни дифференцировки 14, 24, 38, 45, 52 и 59; линия IPSRG2L-ИПСК от здорового донора; линия IPSPDP1.5L - ИПСК от пациента с БП с мутацией в гене PARK2. * - уровень экспрессии статистически значимо отличается от уровня экспрессии в ИПСК (p < 0,05). По оси y - изменения в разах по сравнению с ИПСК. Столбики представляют собой среднее значение ± SEM (SEM, стандартная ошибка среднего).

На фиг. 3 представлен анализ культур нейронов через 34 дня дифференцировки, проведенной согласно Примеру 1, на наличие нейрональных маркеров и маркера зрелого состояния нейронов с помощью ПЦР и иммуноцитохимического окрашивания.

(А) - ПЦР-анализ культур нейронов, дифференцированных из линий ИПСК здоровых и больных БП. Экспрессия общего нейронального маркера SYN (синаптофизин) и маркера дофаминэргических нейронов TH показана на 34-й и 54-й дни дифференцировки. GAPDH - глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа. IPSRG2L, IPSRG6L - здоровые донорские линии ИПСК; IPSPDL1.4L, IPSPDL1.6L, IPSPDL2.15L - линии ИПСК от двух пациентов с БП с мутацией в гене PARK8; IPSPDP1.5L - линия ИПСК от пациента с БП с мутацией в гене PARK2.

(Б) - иммуноцитохимический анализ культур нейронов, дифференцированных из линий ИПСК IPSRG2L (здоровые) и IPSPDL2.6S (мутация в гене PARK8) на 45-й день дифференцировки. Зеленым цветом показан β-III-тубулин, красным - TH, синим цветом - DAPI. Масштабная линейка 100 мкМ.

На фиг. 4 представлены результаты проточной цитометрии нейронов, дифференцированных из ИПСК пациентов с БП и здорового донора, на 65-й день дифференцировки, проведенной по Примеру 2. Верхняя панель - показана доля нейронов, экспрессирующих молекулу адгезии нейрональных клеток CD56 (N-CAM), нижняя панель - показана доля нейронов, экспрессирующих молекулы клеточной адгезии CD24. Линия IPSRG2L - ИПСК от здорового донора; линия IPSPDL2.15L - ИПСК пациента с БП с мутацией в гене PARK8, линия IPSPDP1.5L - ИПСК пациента с БП с мутацией в гене PARK2. Данные представлены в виде наложения графиков, полученных для нейронов, окрашенных специфическими антителами, и нейронов, окрашенных изотип-контрольными антителами. Зеленый - контроль изотипа, фиолетовый - клетки, окрашенные на N-CAM, красный - клетки, окрашенные на CD24.

На фиг. 5 представлена проточная цитометрия нейронов, дифференцированных из ИПСК пациентов с БП и здорового донора, на 65-й день дифференцировки, проведенной по Примеру 2.

(А) - окрашивание антителами к TH. Линия IPSPDP1.5L - ИПСК пациента с БП с мутацией в гене PARK2; линии IPSRG2L и IPSFF1S - ИПСК здорового донора; линия IPSPDL2.6S - ИПСК пациента с БП с мутацией в гене PARK8. (Б) - результаты анализа популяций нейронов на экспрессию TH, представленные в графическом виде (n = 1-4). Столбики представляют среднее значение ± SEM.

На фиг. 6 представлен анализ клеточного цикла дофаминэргических нейронов на 65-й день дифференцировки, выполненный методом проточной цитометрии.

(А) - распределение по фазам клеточного цикла нейронов, полученных в течение 65 дней дифференцировки из линии ИПСК IPSRG2L здорового донора (слева), из линии ИПСК IPSPDL2.15L пациента с БП с мутацией в гене PARK8 (в середине), из линии ИПСК IPSPDP1.5L пациента с БП с мутацией в гене PARK2 (справа).

(Б) - на гистограмме показана доля нейронов, находящихся в G1, S и G2 фазах клеточного цикла.

На фиг. 7 показаны результаты измерений спонтанного выброса дофамина тирозингидроксилаза-положительными дофаминэргическими нейронами, полученными направленной дифференцировкой in vitro из ИПСК здоровых доноров и пациентов с БП по Примеру 2.

Осуществление изобретения

Возможность осуществления заявленного изобретения иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение дофаминэргических нейронов из ИПСК здорового донора и ИПСК пациентов с БП при дифференцировке в течение 38 дней

Для дифференцировки в нейрональном направлении брали культуру ИПСК здорового донора или пациента с БП при достижении 90-100 % конфлюэнтности (пошаговая схема представлена на фиг.1 А-Д), то есть, по достижении почти полного монослоя (фиг. 2А). ИПСК поддерживали в среде mTeSR1 (Stem Cell Technologies, Канада) или Гибрис-8 (Панэко, Россия) в соответствии с инструкциями производителя. Для покрытия поверхности чашек Петри использовали Матригель (BD Biosciences, США). Покрытие Матригелем поверхности чашек Петри проводили в соответствии с инструкцией производителя. ИПСК пассировали с помощью 0,05 % трипсина. При конфлюэнтности около 90-100 % среда mTeSR1 или Гибрис-8 заменяли на среду для нейральной дифференцировки, содержащей DMEM/F12 (Gibco, США), 2 % заменителя сыворотки (Gibco, США), 1 % добавка N2 (Gibco, США), 1× Glutamax (Gibco, США), 50 ед./мл пенициллина-стрептомицина (Панэко, Россия), 80 нг/мл Noggin (PeproTech, США), 10 мкM SB431542 (Stemgent, США), 2 мкМ дорсоморфин (Stemgent, США). Клетки культивировали в течение 14 дней со сменой среды через день.

Полученные нейральные клетки-предшественники (фиг. 1B) отделяли от поверхности чашки Петри с помощью раствора Версена (Панэко, Россия), инкубируя клетки в течение 10 мин в CO₂-инкубаторе при 37 °C. После этого клетки центрифугировали в течение 5 мин при 250×g. Клетки дважды промывали средой DMEM/F12 (Gibco, США), каждый раз центрифугируя в указанных выше условиях. Клетки высевали на чашки Петри, покрытые Матригелем, при плотности 250,000-400,000 клеток/см² и культивировали в течение 10 дней в среде для нейрональных клеток-предшественников, состоящей из DMEM/F12 (Gibco, США), 2 % B27 (Gibco, США), 1× Glutamax (Gibco, США), 50 ед./мл пенициллина-стрептомицина (Панэко, Россия), 100 нг/мл SHH (PeproTech, США), 100 нг/мл FGF8 (PeproTech, США) и 2 мкМ пурморфамин (Stemgent, США). Среду меняли каждые два дня.

Полученные предшественники нейронов вентрального среднего мозга отделяли от поверхности чашки Петри с помощью раствора Версена, как описано выше. Клетки затем высевали с плотностью тыс. клеток/см² на чашки Петри, покрытые Матригелем, и культивировали в течение 7 дней в среде для созревания дофаминэргических нейронов, состоящую из среды Neurobasal (Gibco, США), 2 % добавка B27 (Gibco, США), 1× Glutamax (Gibco, США), 50 ед./мл пенициллина-стрептомицина (Панэко, Россия), 20 нг/мл BDNF (PeproTech, США), 20 нг/мл GDNF (PeproTech, США), 200 мкМ аскорбиновой кислоты (Sigma-Aldrich, США) и 4 мкМ форсколина (Stemgent, США). Среду меняли каждые два дня. Клетки культивировали в целом в данной среде вплоть до 38 дня дифференцировки, после чего анализировали экспрессию маркеров, характерных для дофаминэргических нейронов. Подобный анализ показал, что предлагаемый протокол позволяет получать из ИПСК уже на 38-й день тирозингидрокислаза-положительные (фиг. 2A, 2D) дофаминэргические нейроны, экспрессирующие транспортер дофамина DAT1 (фиг. 2Е).

Пример 2. Получение дофаминэргических нейронов из ИПСК здорового донора и ИПСК пациентов с БП при дифференцировке в течение 65 дней

Дофаминэргические нейроны получали по методике, приведенной в Примере 1, с тем отличием, что дифференцировку проводили в течение 65 дней и при этом, начиная с 34 дня дифференцировки, базовую среду меняли на Neurobasal-А (Gibco, США) и концентрацию форсколина поднимали до 10 мкМ, остальные компоненты добавляли в той же концентрации. Анализ чистоты популяции полученных в результате дифференцировки нейронов с помощью проточной цитометрии показал, что около 90 % полученных клеток экспрессирует специфичный нейрональный маркер CD56 (N-CAM) (фиг. 4). При этом полученная популяция содержит 50-90 % дофаминэргических нейронов (фиг. 5А, B). Функциональность дофаминэргических нейронов подтверждали при помощи измерения спонтанного выброса дофамина (фиг. 7).

Изобретение относится к области биотехнологии. Раскрыт способ получения дофаминэргических нейронов путем направленной дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (ИСПКЧ) in vitro. Способ реализуется в течение 38 дней и включает в себя уменьшенное до трех число смен композиций культуральных сред. Изобретение позволяет расширить арсенал технических средств получения дофаминэргических нейронов из ИПСКЧ при помощи направленной дифференцировки in vitro, а также данное изобретение можно использовать для получения биомедицинского клеточного продукта, предназначенного для лечения болезни Паркинсона. 8 ил., 2 пр.

Способ получения дофаминэргических нейронов человека путем направленной дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, включающий следующие стадии:

a) культивирование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека в монослойной культуре в среде, не содержащей животных компонентов, до достижения конфлюэнтной плотности не менее 90 %;

b) культивирование на поверхности в течение 14 дней в среде, стимулирующей дифференцировку в нейрональном направлении, содержащей 80 нг/мл NOGGIN, 10 мкM SB431542 и 2 мкМ дорсоморфина;

c) пересев полученных прогениторных нейральных клеток человека с использованием раствора Версена на поверхность с плотностью от 250,000 до 400,000 клеток/см² с дальнейшим культивированием в течение 10 дней в среде, содержащей 100 нг/мл SHH, 100 нг/мл FGF8 и 2 мкМ пурморфамина;

d) пересев полученных предшественников нейронов вентрального среднего мозга человека с использованием раствора Версена на поверхность с плотностью от 250,000 до 400,000 клеток/см² и дальнейшее культивирование в среде, содержащей 20 нг/мл BDNF, 20 нг/мл GDNF, аскорбиновую кислоту и 4 мкМ форсколина, в течение 7 дней с дальнейшим повышением концентрации форсколина до 10 мкМ и культивированием клеток в течение еще как минимум 7 дней.