НОВЫЕ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЕ СУБСТРАТЫ ДЛЯ ФАКТОРА Xa Российский патент 2024 года по МПК C07D277/68 C07K5/08 C07K5/10 C12Q1/66 G01N21/64 G01N33/68 G01N33/86 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к хемилюминесцентным молекулам-субстратам, подходящим для мониторинга фермента свертывания крови фактора Xa. Субстраты особенно подходят для анализа факторов свертывания и количественного анализа антикоагулянта в образце.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Свертывание крови, также известное как коагуляция, представляет собой превращение крови из жидкости в гель, приводящее к образованию сгустка крови. Свертывание является частью процесса гемостаза и, в конечном итоге, предотвращает избыточную кровопотерю. Свертывание начинается вскоре после повреждения эндотелиальной выстилки сосуда. Воздействие на субэндотелиальное пространство приводит к связыванию плазматического фактора VII (FVII) с тканевым фактором, что, в конечном итоге, приводит к образованию фибрина. В так называемом первичном гемостазе тромбоциты незамедлительно образуют пробку в месте повреждения. Так называемый вторичный гемостаз происходит одновременно: факторы свертывания отвечают в комплексном каскаде с образованием фибриновых нитей, укрепляющих тромбоцитарную пробку. Свертывание является высоко консервативным среди животных.

Фактор X (FX) является ключевым белком для свертывания. FX является проферментом активированного фактора X (FXa). FX может активироваться комплексом тканевого фактора (TF) с фактором VII(a) (FVII(a)) или теназным комплексом. Теназный комплекс содержит активированный фактор IX (FIXa) в качестве фермента, активированный FVIII (FVIIIa) в качестве кофактора и профермент FX, все из которых связаны с фосфолипидной поверхностью, содержащей некоторую долю отрицательно заряженных фосфолипидов. Комплекс превращает FX в FXa.

Детекция и количественный анализ активности FX или FXa представляет интерес по разным причинам. FXa действует, расщепляя протромбин, что приводит к образованию активного тромбина; FX является проферментом FXa, таким образом, что FX может превращаться в FXa. Таким образом, их детекция дает представление о динамике свертывания крови. Активность FXa также можно использовать в качестве меры активности антикоагулянта: детекцию FXa или его образования можно использовать для измерения концентрации антикоагулянтных белков, подобных протеину C и протеину S. И наконец, FXa также используют в качестве показателя для нескольких антикоагулянтных лекарственных средств, подобных гепариноидам или пероральным антикоагулянтам прямого действия (DOAC) против FXa.

Способы количественного анализа факторов свертывания крови хорошо известны (см. S. S. van Berkel, диссертация на соискание ученой степени PhD, 1 глава, 2008 год, Radboud University Nijmegen). Способы глобального анализа гемостаза, более новый класс анализов, описаны в M. van Geffen (диссертация на соискание ученой степени PhD, главы 2 и 3, 2012 год, Radboud University Nijmegen). Общепринято, в этих способах количественного анализа факторов свертывания крови в качестве показателя измеряют образование фибрина. Альтернативно, разработанные позже хромогенные зонды на основе паранитроанилина, конъюгированного с пептидом, высвобождают свободный паранитроанилин (pNA), когда пептид отщепляется ферментом, таким как тромбин или FXa. Получающийся цвет можно подвергать количественному анализу, и он является мерой активности фермента. Примерами являются коммерчески доступный S-2765 от Chromogenix, представляющий собой Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA⋅2HCl, и коммерчески доступный S-2222 от Chromogenix, содержащий Bz-IIe-Glu-Gly-Arg-pNA⋅HCl (IEGR является SEQ ID NO: 1).

Хромогенные теста обладают недостатком: т.к. эти способы зависят от измерения оптической плотности, их нельзя осуществлять в смеси, которая будет становиться мутной из-за образования сгустка, и хромогенный желтый цвет служит помехой характерному желтому цвету плазмы. Таким образом, эти анализы необходимо осуществлять в дефибринированной и, таким образом, бедной тромбоцитами плазме. Для них также необходимо взятие части образца, т.к. их невозможно измерять в проточных условиях. Проходя от бедной тромбоцитами плазмы (PPP) к богатой тромбоцитами плазме (PRP) к цельной крови, физиологическая система становится все более типичной для того, что происходит в организме, хотя технически трудно анализировать это одновременно.

Использование флуорогенных субстратов делает возможным измерение в недефибринированной, богатой тромбоцитами плазме и цельной крови, что, таким образом, на один шаг приближает аналитическую систему к физиологической системе, позволяя осуществлять непрерывный мониторинг. В процитированной выше диссертации Van Berkel обсуждают разработку флуорогенных зондов для тромбина.

Флуориметрический зонд ab204711 является коммерчески доступным (от Abcam PLC, UK). В этом наборе для анализа активности фактора Xa (флуориметрический) (ab204711) используют способность фактора Xa расщеплять синтетический субстрат, таким образом, высвобождая флуорофор, который можно количественно анализировать с помощью флуоресцентных спектрофотометров. Схожий набор доступен в Merck (кат. № MAK238-1KT).

Другие коммерчески доступные субстраты представляют собой набор для анализа фактора Xa SensoLyte® Rh110 от Eurogentec, в котором также используют флуорогенный субстрат, генерирующий флуорофор, который можно определять после расщепления FXa субстрата. В наборе для анализа фактора Xa SensoLyte® 520 используют пептид 5-FAM/QXL™ 520 с резонансным переносом энергии флуоресценции (FRET), где флуоресценцию 5-FAM гасят с помощью QXL™ 520. Когда FXa расщепляет интактный пептид на два отдельных фрагмента, флуоресценция 5-FAM восстанавливается. Этот FRET-пептид демонстрирует меньшую флуоресценцию от аутофлуоресценции тестируемых соединений и клеточных компонентов. В WO2006/072602 описывают использование множества флуорогенных субстратов с разными характеристиками, чтобы сделать возможной детекцию нескольких продуктов в одном образце.

Флуорогенные субстраты обладают недостатками: коммерческие платформы для анализа системы свертывания, как правило, не поддерживают флуориметрический анализ, и, таким образом, для них необходимо дополнительное оборудование. Кроме того, желательно воплощать все тесты свертывания, которые возможны, на одном анализаторе для упрощения тестирования и минимизации труда. Использование отдельного устройства для осуществления глобальных анализов, таким образом, снижает его пригодность в качестве рутинного способа. Флуоресцентные сигналы также обладают недостатком, состоящим в том, что они не являются линейными относительно концентрации продукта из-за эффектов внутренних фильтров и эффектов гашения.

Люминесцентные субстраты не имеют этих недостатков. Они являются более чувствительными, чем хромогенные или флуорогенные субстраты, и не требуют комплексных фильтров или источников возбуждения. Патент США № 5035999 относится к люминесцентным субстратам, но эти субстраты не подходят ни для измерения в водных растворах (таких как плазма), ни для проточных измерений. WO2012096566 относится к субстратам для тромбина или плазмина. Cosby et al. ("Custom enzyme substrates for luciferase-based assays", Cell Notes, Issue 18 pages 9-11, 2007) описывали люминесцентные субстраты, но они не подходят ни для измерения в водных растворах (таких как плазма), ни для проточных измерений. Из-за плохой растворимости зачастую необходимы органические сорастворители, нарушающие физиологические условия анализа, или из-за нее необходимы более крупные объемы образца или добавление большего объема реагентов.

Во многих клинических случаях (например, при заборе крови у детей, мониторинг при оказании медицинской помощи в домашних условиях, в ситуациях выездного лечения критических состояний с использованием санитарного вертолета) было бы желательным иметь диагностические тесты на факторы свертывания, для которых необходим меньший объем реакционной смеси и, таким образом, меньше крови. Система должна быть небольшой по своей конструкции и не требовать сложной технологии, что делает ее полезной в (одноразовом) устройстве "все в одном" для оказания помощи у постели больного. Кроме того, зонд должен обеспечивать широкий динамический диапазон, предпочтительно, в интервале трех порядков величины, обеспечиваемых существующими анализами. Зонд должен быть специфическим для своего фермента, такого как FXa, и чувствительным, чтобы сделать возможным его использование при небольших объемах образцов. Возможность измерения в реальном времени будет улучшать гибкость анализов, в которых можно использовать эти новые зонды.

Существует потребность в новом анализе для измерения образования FXa и/или измерения других факторов свертывания крови или их активности, который не имел бы указанных выше недостатков, должен быть более простым, и с помощью которого можно будет измерять образование факторов свертывания и фибринолитических факторов непосредственным образом, предпочтительно, в линейном режиме. Цель по настоящему изобретению относится к субстратам и способам для такого анализа.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новым молекулам в качестве субстратов для использования в анализах, относящихся к медицине, в частности, свертывания крови. Молекулы высвобождают хемилюминесцентное вещество, когда они расщепляются соответствующим ферментом. Более конкретно, новые молекулы можно использовать в новом способе прямого измерения активности факторов гемостаза. Если быть более точным, настоящее изобретение относится к молекулам для использования в способе количественного анализа факторов свертывания или использования в способ анализа образования FXa в глобальном анализе. Факторы свертывания, подлежащие количественному анализу, представляют собой по меньшей мере прокоагулянтные факторы FIX, FVIII, FVII и антикоагулянтный фактор антитромбин, протеин C и протеин S. Настоящее изобретение также относится к способу количественного анализа гепариноидов и пероральных антикоагулянтов прямого действия (DOAC) против Xa.

В одном из аспектов изобретение относится к соединению общей формулы (I-3) или (I-4)

где r представляет собой 0, 1, 2 или 3; r' представляет собой 0, 1, 2 или 3; d представляет собой 0, 1 или 2; g представляет собой 0 или 1; g' представляет собой 0 или 1; и X является концевым остатком, выбранным из NH₂, OH, O(C_1-6-алкила), (OCH₂CH₂)_1-6OH, (OCH₂CH₂)_1-6O(C_1-6-алкила), NHC(=O)(O)_0-1(C_1-6-алкила), NHC(=O)(O)_0-1(C_1-6-алкилена)(OCH₂CH₂)_1-6OH, NHC(=O)(O)_0-1(C_1-6-алкилен)(OCH₂CH₂)_1-6O(C_1-6-алкила), NHC(=O)(O)_0-1(C_1-6-алкилен)O(C_1-6-алкила), NHC(=O)(O)_0-1(C_1-6-алкилен)OH и NP', где P' является амин-защитной группой; необязательно, где остаток аминолюциферина заменяют другим хемилюминесцентным амином; или его физиологически приемлемой соли.

В другом аспекте изобретение относится к комбинации, содержащей соединение по первому аспекту и по меньшей мере одно дополнительное соединение, выбранное из группы, состоящей из люциферазы, АТФ, источника Mg²⁺ и фактора свертывания, такого как фактор Xa. В предпочтительных вариантах осуществления термин "комбинация" относится к устройству для измерения хемилюминесценции, содержащему соединение по первому аспекту.

В другом аспекте изобретение относится к способу количественного анализа фактора свертывания в образце, включающему стадии a) приведения образца в контакт с композицией, содержащей соединение по первому аспекту, для высвобождения аминолюциферина; b) приведения аминолюциферина в контакт с люциферазой и c) определения относительной интенсивности света, генерируемого люциферазой. Этот способ можно использовать для количественного анализа антикоагулянта в образце, если FXa получают на стадии a).

ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что в анализах гемостаза для детекции активности FXa или косвенной детекции активности других факторов посредством детекции FXa можно использовать класс хемилюминесцентных соединений. Таким образом, в первом аспекте изобретение относится к соединению общей формулы (I-3) или (I-4),

где

r представляет собой 0, 1, 2 или 3;

r' представляет собой 0, 1, 2 или 3;

d представляет собой 0, 1 или 2;

g представляет собой 0 или 1;

g' представляет собой 0 или 1; и

X является концевым остатком, выбранным из NH₂, OH, O(C_1-6-алкила), (OCH₂CH₂)_1-6OH, (OCH₂CH₂)_1-6O(C_1-6-алкила), NHC(=O)(O)_0-1(C_1-6-алкила), NHC(=O)(O)_0-1(C_1-6-алкилен)(OCH₂CH₂)_1-6OH, NHC(=O)(O)_0-1(C_1-6-алкилен)(OCH₂CH₂)_1-6O(C_1-6-алкила), NHC(=O)(O)_0-1(C_1-6-алкилен)O(C_1-6-алкила), NHC(=O)(O)_0-1(C_1-6-алкилен)OH и NP', где P' является амин-защитной группой;

необязательно, где остаток аминолюциферина замещен другим хемилюминесцентным амином;

необязательно, где остаток карбоновой кислоты этерифицирован C_1-4-алканолом;

или его физиологически приемлемой соли. Далее в настоящем описании такое соединение обозначено как соединение по изобретению.

Соединения общей формулы I-3 содержат трипептид, связанный с хемилюминесцентным амином через амидную связь. Соединения общей формулы I-4 содержат тетрапептид, связанный с хемилюминесцентным амином через амидную связь. В случаях, если X образует аминокислоту, термин "трипептид" все равно используют в случае общей формулы I-3, и "тетрапептид" - в случае общей формулы I-4; хотя тетрапептид содержит трипептид, контекст позволит прояснить, когда эти термины относятся к структурам общей формулы I-3 или I-4, а не к трипептидам и тетрапептидам в целом. Общие формулы I-3 и I-4 имеют множество общих характеристик. Таким образом, в рамках изобретения ссылка на общую формулу без показателя, такого как -3 или -4, должна относиться к обоим вариантам -3 и -4 этой общей формулы. Например, термин "общая формула I" относится и к I-3, и к I-4, и термин "общая формула Is" относится и к I-3s, и к I-4s. Для простоты обозначения аминокислоты, присутствующие в трипептиде или тетрапептиде, нумеруют, начиная с катионной аминокислоты, непосредственно смежной с хемилюминесцентным амином. Таким образом, остаток, связанный с X в общей формуле I-3, является остатком 3, в то время как он является остатком 4 в общей формуле I-4.

Хемилюминесцентные молекулы известны в этой области. Примерами хемилюминесцентных аминов являются амины люциферина, такие как амины люциферина светлячка, люциферина моллюсков Latia, бактериального люциферина, коэлентеразина, люциферина кипридины или 3-гидроксигиспидина. Хемилюминесцентный амин, предпочтительно, является аминолюциферином люциферина светлячка или, необязательно, его C_1-4-алкиловым сложным эфиром, таким как 2-(6-амино-1,3-бензотиазол-2-ил)-4,5-дигидротиазол-(4/5)-карбоновая кислота, более предпочтительно - 2-(6-амино-1,3-бензотиазол-2-ил)-4,5-дигидротиазол-4-карбоновой кислотой или, необязательно, ее C_1-4-алкиловым сложным эфиром, таким как (4S)-2-(6-амино-1,3-бензотиазол-2-ил)-4,5-дигидротиазол-4-карбоновая кислота или, необязательно, ее C_1-4-алкиловые сложные эфиры, наиболее предпочтительно - (4S)-2-(6-амино-1,3-бензотиазол-2-ил)-4,5-дигидротиазол-4-карбоновая кислота.

2-(6-амино-1,3-бензотиазол-2-ил)-4,5-дигидротиазол-(4/5)-карбоновая кислота

В предпочтительных вариантах осуществления изобретение относится к соединению по изобретению, где соединение имеет общую формулу (II-3) или (II-4):

где r, r', d, g, g' и X являются такими, как определено в другом месте в настоящем описании, предпочтительно, где 4-карбоновая кислота остатка аминолюциферина является S.

Хемилюминесцентные амины не могут являться субстратами для своих соответствующих ферментов люцифераз, если они содержатся в соединениях по изобретению. Расщепление посредством FXa высвобождает хемилюминесцентный амин и делает возможным превращение под действием соответствующего фермента, что приводит к испусканию фотона или, другими словами, образованию кванта света.

Соединения по изобретению могут содержать остатки карбоновой кислоты. Необязательно, их можно этерифицировать с помощью C_1-4-алканола. Примерами C_1-4-алканолов являются метанол, этанол, n-пропанол, изопропанол, трет-бутанол, n-бутанол, бутан-2-ол и изобутанол. В этом контексте предпочтительным C_1-4-алканолом является метанол. C_1-4-алканол необязательно замещен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 атомами галогена, такого как фтор, и необязательно замещен метокси- или этоксигруппой. Он также может являться необязательно ненасыщенным, таким как виниловый спирт или аллиловый спирт. Соединения по изобретению могут являться смесями таких сложных эфиров и свободной кислоты, например, смесями 1:1 метилового сложного эфира в положении 3 общей формулы I-4 или 0-4.

Соединения по изобретению, таким образом, также могут быть представлены общей формулой 0:

где r, r' d, g, g' и X являются такими, как определено выше, и где R является H или C_1-4-алкилом, предпочтительно, R является H. C_1-4-алкил необязательно замещен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 атомами галогена, такого как фтор, и необязательно замещен метокси- или этоксигруппой. Он также может являться необязательно ненасыщенным, таким как винил или аллил.

Соединения по изобретению могут являться физиологически приемлемыми солями. Такие соли известны в этой области, и специалист в этой области может выбирать подходящую солевую форму. В этом контексте физиологически приемлемая соль является солью, которую все равно можно использовать в качестве субстрата в анализах, примеры которых приведены ниже в настоящем описании. Примерами физиологически приемлемых солей являются кислые соли присоединения или щелочные соли, такие как натриевые соли или калиевые соли. Кислые соли присоединения являются предпочтительными. Подходящие кислые соли присоединения являются солями, образованными посредством присоединения муравьиной кислоты, уксусной кислоты, пропионовой кислоты, трифторуксусной кислоты, мезиловой кислоты, тозиловой кислоты или галогенводородных кислот, таких как HBr или HCl. В предпочтительных вариантах осуществления изобретение относится к соединению по изобретению, где соединение является кислой солью присоединения, необязательно выбранной из соли HCl, соли уксусной кислоты, соли муравьиной кислоты, соли TFA и соли мезиловой кислоты, предпочтительно - соли HCl или соли TFA, наиболее предпочтительно - соли TFA.

Третий остаток соединения общей формулы I-4 имеет боковую цепь, длина которой может составлять 1, 2 или 3 метиленовых единиц. Это связано с тем, что d представляет собой 0, 1 или 2. Третий остаток может являться аспарагиновой кислотой, если d представляет собой 0; третий остаток может являться глутаминовой кислотой, если d является 1. Такие соединения демонстрируют хорошие результаты. Таким образом, в предпочтительных вариантах осуществления изобретение относится к соединению по изобретению, где d представляет собой 0 или 1, предпочтительно - 1.

Первый остаток общей формулы I имеет катионную боковую цепь, как и третий остаток общей формулы I-3. Эти катионные боковые цепи могут быть основаны на первичном амине, если g или g' представляет собой 0, и могут быть основаны на остатке гуанидина, если g или g' представляет собой 1. Субстраты, где g представляет собой 1, имеют хорошую аффинность к FXa; таким образом, в предпочтительных вариантах осуществления g представляет собой 1. В предпочтительных вариантах осуществления g' представляет собой 1. В более предпочтительных вариантах осуществления, g и g' представляют собой 1. Если g представляет собой 1, предпочтительно, чтобы r представлял собой 1, как в случае аргинина, когда r представляет собой 1, и g представляет собой 1. Аналогично, если g представляет собой 0, предпочтительно, чтобы r представлял собой 2, как в случае лизина, когда r представляет собой 2, и g представляет собой 0. Аналогично, если g' представляет собой 1, предпочтительно, чтобы r' представлял собой 1. Аналогично, если g' представляет собой 0, предпочтительно, чтобы r' представлял собой 2. В предпочтительных вариантах осуществления изобретение относится к соединению по изобретению, где r представляет собой 1 или 2, или где g представляет собой 1,предпочтительно, где r представляет собой 1, более предпочтительно, где r представляет собой 1, и g представляет собой 1.

Аргинин и лизин являются предпочтительными для количественного анализа активности сериновых протеаз, включая FXa. Аргинин может являться предпочтительным, если желателен более быстродействующий субстрат. Лизин может являться предпочтительным, если желателен более медленно действующий субстрат. Аффинность соединения по изобретению к FXa влияет на параметры анализа. Для глобальных анализов желателен субстрат с более низкой аффинностью. Для количественных анализов желателен субстрат с более высокой аффинностью.

Обнаружено, что субстраты с конкретной хиральностью имеют улучшенную аффинность к FXa. Предпочтительно, первый остаток является L. Нет хирального предпочтения для второго остатка, в котором отсутствует боковая цепь таким образом, что можно указать, что он является глицином. Нет общих предпочтений в отношении третьего остатка, но в случае общей формулы с трипептидом он, предпочтительно, является D, в то время как в случае общей формулы с тетрапептидом он, предпочтительно, является L. Четвертый остаток, предпочтительно, является L. Таким образом, в предпочтительных вариантах осуществления соединение по изобретению содержит первый остаток, являющийся L. В более предпочтительных вариантах осуществления соединение по изобретению содержит первый остаток, являющийся L, и третий остаток, являющийся D, если соединение имеет общую формулу I-3, или третий и четвертый остаток, являющийся L, если соединение имеет общую формулу I-4. Таким образом, в предпочтительных вариантах осуществления изобретение относится к соединению по изобретению, где соединение имеет общую формулу (I-3s) или (I-4s),

где r, r', d, g, g' и X являются такими, как определено в другом месте в настоящем описании.

X является концевым остатком, выбранным из NH₂, OH, O(C_1-6-алкила), (OCH₂CH₂)_1-6OH, (OCH₂CH₂)_1-6O(C_1-6-алкила), NHC(=O)(O)_0-1(C_1-6-алкила), NHC(=O)(O)_0-1(C_1-6-алкилена)(OCH₂CH₂)_1-6OH, NHC(=O)(O)_0-1(C_1-6-алкилен)(OCH₂CH₂)_1-6O(C_1-6-алкила), NHC(=O)(O)_0-1(C_1-6-алкилен)O(C_1-6-алкила), NHC(=O)(O)_0-1(C_1-6-алкилен)OH и NP', где P' является амин-защитной группой. В этом контексте концевой остаток может не находиться на конце соединения по изобретению, но он находится на конце (как правило, N-концевой стороне) трипептида или тетрапептида общей формулы I. Обнаружено, что концевые остатки, содержащие остатки (OCH₂CH₂)_1-6, приводят к образованию соединений по изобретению с хорошей растворимостью в воде. Таким образом, предпочтительно X является (OCH₂CH₂)_1-6OH, (OCH₂CH₂)_1-6O(C_1-6-алкила), NHC(=O)(O)_0-1(C_1-6-алкилен)(OCH₂CH₂)_1-6OH, или NHC(=O)(O)_0-1(C_1-6-алкилен)(OCH₂CH₂)_1-6O(C_1-6-алкила).

Если X является NHC(=O)(O)_0-1(C_1-6-алкилом), NHC(=O)(O)_0-1(C_1-6-алкилен)(OCH₂CH₂)_1-6OH, NHC(=O)(O)_0-1(C_1-6-алкилен)(OCH₂CH₂)_1-6O(C_1-6-алкила), NHC(=O)(O)_0-1(C_1-6-алкилен)O(C_1-6-алкила) или NHC(=O)(O)_0-1(C_1-6-алкилен)OH, X связан с соединением по изобретению через амид или карбамат благодаря мотиву NHC(=O)(O)_0-1. Предпочтительно, в этих случаях X является амидом. Таким образом, в предпочтительных вариантах осуществления X является NHC(=O)(C_1-6-алкилом), NHC(=O)(C_1-6-алкилен)(OCH₂CH₂)_1-6OH, NHC(=O)(C_1-6-алкилен)(OCH₂CH₂)_1-6O(C_1-6алкил), NHC(=O)(C_1-6-алкилен)O(C_1-6-алкилом) или NHC(=O)(C_1-6-алкилен)OH, более предпочтительно, X является NHC(=O)(C_1-6-алкилен)(OCH₂CH₂)_1-6OH, или NHC(=O)(C_1-6-алкилен)(OCH₂CH₂)_1-6O(C_1-6-алкилом).

В том виде, в котором он содержится в X, C_1-6-алкил может являться метилом, этилом, n-пропилом, изопропилом, n-бутилом, втор-бутилом, трет-бутилом, изобутилом, n-пентилом, трет-пентилом, неопентилом, изопентилом, втор-пентилом, 3-пентилом, втор-изопентилом, 2-метилбутилом, n-гексилом или изогексилом, предпочтительно, C_1-6-алкил является метилом, этилом, n-пропилом, изопропилом, n-бутилом, втор-бутилом, трет-бутилом или изобутилом, более предпочтительно, он является метилом, этилом, изопропилом или трет-бутилом, наиболее предпочтительно, метилом.

В том виде, в котором он содержится в X, C_1-6-алкилен может являться метиленом, метилметиленом, этиленом, n-пропиленом, метилэтиленом, n-бутиленом, 1-метилпропиленом, 1,1-диметилэтиленом, n-пентиленом, изопентиленом, 2-метилбутиленом, n-гексиленом или изогексиленом, предпочтительно, C_1-6-алкилен является метиленом, этиленом, n-пропиленом, n-бутиленом, n-пентиленом или n-гексиленом, более предпочтительно, он является метиленом, этиленом, n-пропиленом, n-бутиленом или n-пентиленом, наиболее предпочтительно, метиленом.

В том виде, в котором он содержится в X, (OCH₂CH₂)_1-6 представляет собой повторы этиленгликоля. Предпочтительно, (OCH₂CH₂)_1-6 является (OCH₂CH₂)₂, (OCH₂CH₂)₃, (OCH₂CH₂)₄ или (OCH₂CH₂)₅, более предпочтительно - (OCH₂CH₂)₂, (OCH₂CH₂)₃, или (OCH₂CH₂)₄, даже более предпочтительно - (OCH₂CH₂)₂ или(OCH₂CH₂)₃, наиболее предпочтительно - (OCH₂CH₂)₂. Если X содержит (OCH₂CH₂)_1-6, любой C_1-6-алкилен, предпочтительно, является метиленом или этиленом, более предпочтительно - метиленом, и любой C_1-6-алкил, предпочтительно, является метилом или трет-бутилом, более предпочтительно, метилом.

X также может являться NP'. P' является амин-защитной группой. Амин-защитные группы известны в этой области, и с помощью них можно защищать атомы азота в аминах, а также другие атомы азота. Примеры подходящих амин-защитных групп подробно описаны в этой области, например, в P.G.M. Wuts and T.W. Greene, Greene's Protective Groups in Organic Synthesis, Fourth Edition, 2006 (ISBN: 978-0-471-69754-1). Специалист в этой области сможет выбирать подходящие защитные группы для использования в соответствии с настоящим изобретением. Примерами подходящих амин-защитных групп являются тритил, аллил, бензил (Bn), 9-флуоренилметилоксикарбонил (Fmoc), трет-бутилоксикарбонил (Boc), бензилоксикарбонил (Z), 2-триметилсилилэтилоксикарбонил, тозил (Ts), ацетил (Ac), трифторацетил, фталимид, бензилиденамин и аллилоксикарбонил (Alloc). Предпочтительными группами для P' являются тритил, аллил, бензил (Bn), 9-флуоренилметил оксикарбонил (Fmoc), трет-бутилоксикарбонил (Boc), бензилоксикарбонил (Z), тозил (Ts) и аллилоксикарбонил (Alloc). Более предпочтительными группами для P' являются аллилоксикарбонил и трет-бутилоксикарбонил. P' всегда присоединен к азоту, и с помощью множества амин-защитных групп можно защищать один амин или атом азота, как будет понятно специалисту в этой области, с помощью амин-защитных групп также можно защищать атомы азота, в узком смысле не являющиеся амином, таким как атомы азота в пиридиновых кольцах. Для поддержания правильной валентности азота, к которому присоединен P', необходимо добавлять или не включать водород. Таким образом, при соответствующей валентности NP' можно взаимозаменять с NHP' и NHP' можно взаимозаменять с NP'. В предпочтительных вариантах осуществления изобретение относится к соединению по изобретению, где P' выбран из группы, состоящей из тритила, аллила, бензила (Bn), бензоила (Bz), 9-флуоренилметилоксикарбонила (Fmoc), трет-бутилоксикарбонила (Boc), бензилоксикарбонила (Z), 2-триметилсилилэтилоксикарбонила, тозила (Ts), ацетила (Ac), трифторацетила, фталимида, бензилиденамина и аллилоксикарбонила (Alloc), предпочтительно, из группы, состоящей из бензил (Bn), 9-флуоренилметилоксикарбонила (Fmoc), трет-бутилоксикарбонила (Boc), бензилоксикарбонила (Z), тозила (Ts) и аллилоксикарбонила (Alloc), более предпочтительно, P' является бензилоксикарбонилом.

В предпочтительных вариантах осуществления X представлен общей формулой X-2:

где m представляет собой 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6; p представляет собой 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6; s представляет собой 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6; и a представляет собой 0 или 1; где остатки метилена, содержащиеся в m, s или p, можно заменять метилом, этилом или изопропилом, необязательно, где полученный остаток алкила или алкилена можно заменять одним или более атомами галогена, такими как фтор или хлор. Таким образом, в предпочтительных вариантах осуществления изобретение относится к соединению по изобретению, где соединение имеет общую формулу (III-3) или (III-4),

где

d представляет собой 0, 1 или 2;

r представляет собой 0, 1, 2 или 3;

r' представляет собой 0, 1, 2 или 3;

g представляет собой 0 или 1;

g' представляет собой 0 или 1;

m представляет собой 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6;

p представляет собой 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6;

s представляет собой 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6; и

a представляет собой 0 или 1;

где остатки метилена, содержащиеся в m, s или p, можно заменять метилом, этилом или изопропилом, необязательно, где полученные остатки алкила можно заменять одним или более атомами галогена, такими как фтор или хлор. Для сохранения правильной валентности можно добавлять или удалять атомы водорода. Предпочтительно, если заменяют остатки метилена, содержащиеся в m, m представляет собой 1 или 2; более предпочтительно, если заменяют остатки метилена, содержащиеся в m, m представляет собой 2, и остаток метилена, смежный с атомом кислорода, заменяют одним или двумя метильными остатками. Это приводит к образованию изопропокси- и трет-бутоксигрупп, соответственно. Если p представляет собой 1, 2, 3, 4, 5 или 6, предпочтительно, чтобы m представлял собой 0, 1 или 2, и если m представляет собой 2, остаток метилена, смежный с атомом кислорода, заменяют одним или двумя метильными остатками.

a является целым числом, составляющим 0 или 1, и, таким образом, можно включать амидный остаток в X. Благодаря доступности их удобного синтеза, предпочтительными являются соединения, где a представляет собой 1.

s является целым числом, составляющим 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 6. Если s представляет собой 0, и a представляет собой 1, X содержит остаток карбамата. В других случаях s может образовывать линкерный остаток, с помощью которого соединяют пептид с остатком олигоэтиленгликоля, если он присутствует, или с концевым спиртом или метиловым простым эфиром. Остатки метилена в s могут быть необязательно замещены метилом, этилом или метоксигруппой, и необязательно замещены одним или более атомами галогена, такого как фтор или хлор. Если p представляет собой 1, 2, 3, 4, 5 или 6, предпочтительно, чтобы s представлял собой 0, 1 или 2, более предпочтительно - 1 или 2, более предпочтительно - 1. Если p представляет собой 1, 2, 3, 4, 5 или 6, предпочтительно, чтобы a представлял собой 0, и s представлял собой 0, 1 или 2, более предпочтительно, чтобы a представлял собой 1, и s представлял собой 1 или 2, более предпочтительно - 1.

p является целым числом, составляющим 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 6. Он может образовывать остаток олигоэтиленгликоля, который может иметь положительный эффект в отношении растворимости соединений по изобретению в воде. Остатки этиленгликоля в p могут быть необязательно замещены метилом, и необязательно замещены одним или более атомами галогена, такого как фтор или хлор. p, предпочтительно, представляет собой 1, 2, 3 или 4, более предпочтительно - 1, 2 или 3, даже более предпочтительно - 2 или 3, наиболее предпочтительно - 2.

В предпочтительных вариантах осуществления изобретение относится к соединению общей формулы III-3 или III-4, где

- d представляет собой 0 или 1, предпочтительно - 1; и/или

- r представляет собой 1 или 2, предпочтительно - 1; и/или

- r' представляет собой 1 или 2, предпочтительно - 1; и/или

- g представляет собой 0 или 1, предпочтительно - 1; и/или

- g' представляет собой 0 или 1, предпочтительно - 1; и/или

- m представляет собой 0 или 1; и/или

- p представляет собой 1, 2 или 3, предпочтительно - 2; и/или

- s представляет собой 1 или 2, предпочтительно - 1; и/или

- a представляет собой 1.

В таблице 1 приведены предпочтительные варианты осуществления общей формулы I-4, I-4s, II-4 или III-4.

Таблица 1

Вариант осуществления r g d Вариант осуществления r g d AA 0 0 0 AM 0 1 1 AB 1 0 0 AN 1 1 1 AC 2 0 0 AO 2 1 1 AD 3 0 0 AP 3 1 1 AE 0 1 0 AQ 0 0 2 AF 1 1 0 AR 1 0 2 AG 2 1 0 AS 2 0 2 AH 3 1 0 AT 3 0 2 AI 0 0 1 AU 0 1 2 AJ 1 0 1 AV 1 1 2 AK 2 0 1 AW 2 1 2 AL 3 0 1 AX 3 1 2

В предпочтительных вариантах осуществления соединения общей формулы I-4, I-4s, II-4 или III-4 выбраны из AE, AF, AG, AH, AM, AN, AO, AP, AU, AV, AW и AX. В предпочтительных вариантах осуществления соединения общей формулы I-4, I-4s, II-4 или III-4 выбраны из AE, AF, AG, AH, AM, AN, AO и AP. В предпочтительных вариантах осуществления соединения общей формулы I-4, I-4s, II-4 или III-4 выбраны из AE, AF, AG, AM, AN и AO, более предпочтительно - выбраны из AF, AG, AN и AO, даже более предпочтительно - выбраны из AF и AN, наиболее предпочтительно, он является AN.

В таблице 2 приведены предпочтительные варианты осуществления общей формулы I-3, I-3s, II-3 или III-3.

Таблица 2

Вариант осуществления r g r' g' Вариант осуществления r g r' g' BA 0 0 0 0 BGA 0 0 0 1 BB 1 0 0 0 BHA 1 0 0 1 BC 2 0 0 0 BIA 2 0 0 1 BD 3 0 0 0 BJA 3 0 0 1 BE 0 1 0 0 BKA 0 1 0 1 BF 1 1 0 0 BLA 1 1 0 1 BG 2 1 0 0 BMA 2 1 0 1 BH 3 1 0 0 BNA 3 1 0 1 BI 0 0 1 0 BOA 0 0 1 1 BJ 1 0 1 0 BPA 1 0 1 1 BK 2 0 1 0 BQA 2 0 1 1 BL 3 0 1 0 BRA 3 0 1 1 BM 0 1 1 0 BSA 0 1 1 1 BN 1 1 1 0 BTA 1 1 1 1 BO 2 1 1 0 BUA 2 1 1 1 BP 3 1 1 0 BVA 3 1 1 1 BQ 0 0 2 0 BWA 0 0 2 1 BR 1 0 2 0 BXA 1 0 2 1 BS 2 0 2 0 BYA 2 0 2 1 BT 3 0 2 0 BZA 3 0 2 1 BU 0 1 2 0 BAB 0 1 2 1 BV 1 1 2 0 BBB 1 1 2 1 BW 2 1 2 0 BCB 2 1 2 1 BX 3 1 2 0 BDB 3 1 2 1 BY 0 0 3 0 BEB 0 0 3 1 BZ 1 0 3 0 BFB 1 0 3 1 BAA 2 0 3 0 BGB 2 0 3 1 BBA 3 0 3 0 BHB 3 0 3 1 BCA 0 1 3 0 BIB 0 1 3 1 BDA 1 1 3 0 BJB 1 1 3 1 BEA 2 1 3 0 BKB 2 1 3 1 BFA 3 1 3 0 BLB 3 1 3 1

В таблице 3 приведены предпочтительные варианты осуществления X, где он имеет общую формулу X-2.

Таблица 3

Вариант осуществления m p s a Вариант осуществления m p s a XAA 0 1 0 0 XBG 0 1 0 1 XAB 0 2 0 0 XBH 0 2 0 1 XAC 0 3 0 0 XBI 0 3 0 1 XAD 0 4 0 0 XBJ 0 4 0 1 XAE 1 или 2 1 0 0 XBK 1 или 2 1 0 1 XAF 1 или 2 2 0 0 XBL 1 или 2 2 0 1 XAG 1 или 2 3 0 0 XBM 1 или 2 3 0 1 XAH 1 или 2 4 0 0 XBN 1 или 2 4 0 1 XAI 0 1 1 0 XBO 0 1 1 1 XAJ 0 2 1 0 XBP 0 2 1 1 XAK 0 3 1 0 XBQ 0 3 1 1 XAL 0 4 1 0 XBR 0 4 1 1 XAM 1 или 2 1 1 0 XBS 1 или 2 1 1 1 XAN 1 или 2 2 1 0 XBT 1 или 2 2 1 1 XAO 1 или 2 3 1 0 XBU 1 или 2 3 1 1 XAP 1 или 2 4 1 0 XBV 1 или 2 4 1 1 XAQ 0 1 2 0 XBW 0 1 2 1 XAR 0 2 2 0 XBX 0 2 2 1 XAS 0 3 2 0 XBY 0 3 2 1 XAT 0 4 2 0 XBZ 0 4 2 1 XAU 1 или 2 1 2 0 XCA 1 или 2 1 2 1 XAV 1 или 2 2 2 0 XCB 1 или 2 2 2 1 XAW 1 или 2 3 2 0 XCC 1 или 2 3 2 1 XAX 1 или 2 4 2 0 XCD 1 или 2 4 2 1 XAY 0 1 3 0 XCE 0 1 3 1 XAZ 0 2 3 0 XCF 0 2 3 1 XBA 0 3 3 0 XCG 0 3 3 1 XBB 0 4 3 0 XCH 0 4 3 1 XBC 1 или 2 1 3 0 XCI 1 или 2 1 3 1 XBD 1 или 2 2 3 0 XCJ 1 или 2 2 3 1 XBE 1 или 2 3 3 0 XCK 1 или 2 3 3 1 XBF 1 или 2 4 3 0 XCL 1 или 2 4 3 1

В предпочтительных вариантах осуществления из таблицы 3, где m представляет собой 1 или 2, он представляет собой 1. Предпочтительно, в вариантах осуществления из таблицы 3, где m представляет собой 1 или 2, остаток метилена, смежный с атомом кислорода, замещен одним или двумя метильными остатками, где m представляет собой 2. В предпочтительных вариантах осуществления X выбран из группы, состоящей из XBO, XBP, XBQ, XBR, XBS, XBT, XBU, XBV, XBW, XBX, XBY, XBZ, XCA, XCB, XCC и XCD, более предпочтительно - из группы, состоящей из XBO, XBP, XBQ, XBR, XBS, XBT, XBU и XBV, более предпочтительно - из группы, состоящей из XBO, XBP, XBQ, XBS, XBT и XBU, наиболее предпочтительно - XBT.

В предпочтительных вариантах осуществления соединения общей формулы I-4, I-4s, II-4 или III-4 выбраны из AE, AF, AG, AH, AM, AN, AO, AP, AU, AV, AW и AX, наиболее предпочтительно - AN; где X выбран из группы, состоящей из XBO, XBP, XBQ, XBR, XBS, XBT, XBU, XBV, XBW, XBX, XBY, XBZ, XCA, XCB, XCC и XCD, более предпочтительно - из группы, состоящей из XBO, XBP, XBQ, XBR, XBS, XBT, XBU и XBV, более предпочтительно - из группы, состоящей из XBO, XBP, XBQ, XBS, XBT и XBU, наиболее предпочтительно - XBT. В предпочтительных вариантах осуществления соединения общей формулы I-4, I-4s, II-4 или III-4 выбраны из AE, AF, AG, AH, AM, AN, AO и AP, наиболее предпочтительно - AN; где X выбран из группы, состоящей из XBO, XBP, XBQ, XBR, XBS, XBT, XBU, XBV, XBW, XBX, XBY, XBZ, XCA, XCB, XCC и XCD, более предпочтительно - из группы, состоящей из XBO, XBP, XBQ, XBR, XBS, XBT, XBU и XBV, более предпочтительно - из группы, состоящей из XBO, XBP, XBQ, XBS, XBT и XBU, наиболее предпочтительно - XBT. В предпочтительных вариантах осуществления соединения общей формулы I-4, I-4s, II-4 или III-4 выбраны из AE, AF, AG, AM, AN и AO, наиболее предпочтительно - AN; где X выбран из группы, состоящей из XBO, XBP, XBQ, XBR, XBS, XBT, XBU, XBV, XBW, XBX, XBY, XBZ, XCA, XCB, XCC и XCD, более предпочтительно - из группы, состоящей из XBO, XBP, XBQ, XBR, XBS, XBT, XBU и XBV, более предпочтительно - из группы, состоящей из XBO, XBP, XBQ, XBS, XBT и XBU, наиболее предпочтительно - XBT.

В таблице 4 приведены предпочтительные варианты осуществления соединений по изобретению. Более предпочтительными соединениями по изобретению являются физиологически приемлемые соли соединений, приведенные в таблице 4, более предпочтительно - кислые соли присоединения, наиболее предпочтительно - соли TFA. В предпочтительных вариантах осуществления изобретение относится к соединению по изобретению, где оно выбрано из MePEG2-IEGR, MePEG2-IDGR, MePEG3-IEGR, MePEG3-IDGR, MePEG2-RGR, MePEG2-RGK, MePEG3-RGR и MePEG3-RGK.

Таблица 4

В более предпочтительных вариантах осуществления соединение выбрано из MePEG2-IEGR, MePEG2-IDGR, MePEG3-IEGR, MePEG3-IDGR, MePEG2-RGR и MePEG3-RGR. В даже более предпочтительных вариантах осуществления соединение выбрано из MePEG2-IEGR, MePEG2-IDGR, MePEG3-IEGR и MePEG3-IDGR. В наиболее предпочтительных вариантах осуществления изобретение относится к соединению по изобретению, где оно выбрано из MePEG2-IEGR и MePEG2-IDGR, предпочтительно - MePEG2-IDGR; более предпочтительно - их физиологически приемлемым солям, таким как соль TFA.

Комбинация

В другом аспекте изобретение относится к комбинации, содержащей соединение по изобретению и по меньшей мере одно дополнительное соединение, выбранное из группы, состоящей из люциферазы, АТФ, источника Mg²⁺ и фактора свертывания, такого как фактор Xa. Далее в настоящем описании такую комбинацию обозначают как комбинацию по изобретению. Предпочтительно, комбинация дополнительно содержит люциферазу или фактор свертывания, такой как фактор Xa, наиболее предпочтительно, она дополнительно содержит люциферазу. В предпочтительных вариантах осуществления комбинация по изобретению содержит каждое из соединения по изобретению, люциферазы, АТФ, источника Mg²⁺ и фактора свертывания, такого как фактор Xa.

"Люцифераза" является общим термином для класса окислительных ферментов, приводящих к биолюминесценции при использовании люциферина в качестве субстрата. Для люцифераз не требуется внешний источник света, но необходимы люциферин и O₂, а также зачастую АТФ. Известно, что Mg²⁺ повышает выход люминесценции люцифераз. Люциферазы и их анализы известны в этой области, и специалист в этой области может выбирать подходящую люциферазу для комбинации с субстратом люциферином, таким как люциферин, содержащийся в соединении по изобретению. Люцифераза должна обладать способностью превращать аминолюциферин, содержащийся в соединении по изобретению, в его окисленный аналог после высвобождения аминолюциферина при испускании кванта света. Подходящими люциферазами являются люцифераза светлячка (EC 1.13.12.7), ренилла-люциферин-2-монооксигеназа (EC 1.13.12.5) и люцифераза метридий (MetLuc). Если соединение по изобретению содержит остаток 2-(6-амино-1,3-бензотиазол-2-ил)-4,5-дигидротиазол-(4/5)-карбоновой кислоты, люцифераза, предпочтительно, является люциферазой светлячка. Люцифераза может являться любой люциферазой, известной в этой области или той, которая будет открыта или сконструирована в будущем. В этой области известно множество люцифераз. Их можно приобретать в коммерческих источниках от таких производителей, как Promega, Sigma и т. п. Люцифераза может являться нативной, рекомбинантной или мутантной люциферазой. Указанная мутантная люцифераза может являться модифицированной люциферазой, содержащей одну или более замен аминокислот, делеций аминокислот или инсерций аминокислот, при условии, что она сохраняет свою люциферазную активность, предпочтительно - по меньшей мере 25%, 50%, 75% люциферазной активности нативной (рекомбинантной) люциферазы. Ее можно получать из любого организма, при условии, что она обладает люциферазной активностью. В предпочтительных вариантах осуществления люцифераза является быстродействующей люциферазой; это особенно подходит для анализов, где с помощью люциферазы необходимо получать количественную информацию, т.к. быстродействие люциферазы снижает помехи, которые могут быть вызваны люциферазой, являющейся насыщенной или действующей вне линейного диапазона.

АТФ необходим люциферазе и, предпочтительно, присутствует в комбинации по изобретению в количестве, подходящем для осуществления люциферазной активности, или в стоковом растворе в количестве, подходящем для получения разведений, позволяющих осуществлять люциферазную активность. Подходящим стоковым раствором АТФ является 1 мМ раствор в дистиллированной воде, но он может являться любым стоковым раствором в диапазоне от 200 мкМ до 10 мМ в любой физиологически приемлемой системе растворителей.

Комбинация по изобретению может дополнительно содержать ионы магния, т.к. обнаружено, что они усиливают люминесцентный сигнал, генерируемый люциферазой. Однако также можно достигать этого эффекта с использованием других бивалентных катионов, таких как Mn²⁺ (Rodionova and Petushkov, J. Photochem. Photobiol B., DOI: 10.1016/j.jphotobiol.2005.12.014). Источник Mg²⁺ является источником ионов магния, усиливающих функцию люциферазы. Предпочтительными источниками Mg²⁺ являются соли магния, такие как цитрат магния, MgSO₄, MgCO₃, MgO, MgCl₂, MgF₂, MgI₂, MgBr₂ и их гидраты. Более предпочтительными являются галиды магния, такие как MgCl₂, MgF₂, MgI₂, MgBr₂ и их гидраты. Наиболее предпочтительным источникам Mg²⁺ является MgCl₂ или его гидрат.

Комбинация по изобретению может дополнительно содержать фактор свертывания. Факторы свертывания иногда обозначают как факторы гемостаза, и они хорошо известны в этой области. Примерами подходящих факторов свертывания является группа сериновых протеаз, в частности, сериновых эндопептидаз (EC 3.4.21), предпочтительно, выбранных из группы, состоящей из тромбина, FXa, плазмина, фактора VIIa, фактора IXa, калликреина плазмы, фактора XIIa, фактора XIa, тканевого активатора плазминогена (tPA) (предпочтительно, двухцепочечного tPA (tc-tPA)), активированного протеина C и урокиназы (uPA) (предпочтительно, tc-uPA). Также включены проферменты сериновых протеаз, такие как протромбин, FX, FVII, FIX, прекалликреин, FXII, FXI, sc-tPA (одноцепочечный tPA), протеин C и sc-uPA. В предпочтительном варианте осуществления фактор гемостаза является FXa или FX. Предпочтительно, факторы свертывания присутствуют в такой комбинации, что FXa может образовываться под действием присутствующих факторов, или что FXa может образовываться, если комбинацию по изобретению приводят в контакт с образцом, содержащим дополнительный фактор свертывания. В таком случае в образце присутствует фактор свертывания, отсутствующий в каскаде образования FXa, и контакт с образцом делает возможным образование FXa. Предпочтительно, все факторы, присутствующие в таком каскаде, в котором отсутствует только один фактор, присутствуют в избытке относительно ожидаемой концентрации отсутствующего фактора. В результате этого фактор из образца приводит к образованию FXa как функции его концентрации, после чего FXa может генерировать люминесцентный сигнал, пропорциональный его концентрации и, таким образом, пропорциональный концентрации фактора в образце. Раздел с описанием способов содержит больше подробностей о том, как можно составлять такие композиции.

В предпочтительных вариантах осуществления вещества из комбинации содержатся в одной композиции. Такая композиция может содержать дополнительные вещества, такие как эксципиенты. Вода, такая как дистиллированная вода, является подходящим эксципиентом. Другие подходящие эксципиенты являются буферными солями, таким как Трис (трис(гидроксиметил)аминометан).

В других предпочтительных вариантах осуществления вещества из комбинации содержатся в отдельных композициях. Это может быть удобным для получения наборов из частей. В предпочтительных вариантах осуществления изобретение относится к набору из частей, содержащему соединение по изобретению и по меньшей мере одно дополнительное соединение, выбранное из группы, состоящей из люциферазы, АТФ, источника Mg²⁺ и фактора свертывания, такого как фактор Xa.

В конкретных вариантах осуществления изобретение относится к устройству для измерения хемилюминесценции, содержащему соединение по изобретению, предпочтительно, где устройство является устройством для использования в месте оказания медицинской помощи. Далее в настоящем описании такое устройство обозначают как устройство по изобретению.

Устройство по изобретению, например, может являться люминометром, таким как общепринятый настольный люминометр или люминометр для использования в операционной, или оно может являться световым микроскопом; предпочтительно, оно является люминометром. Люминометры и микроскопы известны в этой области, и специалист в этой области может выбирать люминометр или микроскоп, подходящий для использования с соединениями по изобретению. Устройство по изобретению также может являться одноразовым или многоразовым картриджем, или вставкой, или кюветой, или объемом реактора, содержащим соединение по изобретению или комбинацию по изобретению. Такое устройство, предпочтительно, конструируют для использования с общепринятым люминометром или микроскопом.

В предпочтительных вариантах осуществления устройство по изобретению является устройством для использования в месте оказания медицинской помощи. Небольшие объемы, которые можно измерять способом по изобретению, как описано в настоящем описании ниже, делают способ идеально подходящим для анализа в месте оказания медицинской помощи, такого как анализ у постели больного, анализ в полевых условиях или анализ в условиях передвижения. Предпочтительное устройство для использования в месте оказания медицинской помощи содержит мобильный люминометр и подходит для измерения активности фермента в образце, полученном в полевых условиях, или в условиях передвижения, или у постели больного.

Предпочтительно, устройство по изобретению не содержит источник света для использования в анализе. Предпочтительно, устройство по изобретению имеет множество объемов или каналов, которые можно использовать для одновременного анализа множества параметров. Предпочтительно, устройство по изобретению сконфигурировано для анализа объема максимум 100, 80, 60, 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 или 1 мкл образца, более предпочтительно - максимум 15, 10, 5, 4, 3, 2 или 1 мкл, даже более предпочтительно - максимум 5 мкл образца. Предпочтительно, устройство по изобретению сконфигурировано для вывода результатов анализа в реальном времени, например, с помощью дисплея или с помощью датчика или индикатора уровня. Предпочтительно, устройство по изобретению сконфигурировано для одновременного анализа с помощью по меньшей мере двух разных способов анализа, предпочтительно, количественного анализа активности фермента, такой как активность FVIII или активность FXa, и глобального анализа, такого как анализ свертывания крови.

Способ

В дополнительном аспекте изобретение относится к способу количественного анализа фактора свертывания в образце, включающему стадии:

a) приведения образца в контакт с композицией, содержащей соединение по изобретению, для высвобождения аминолюциферина;

b) приведения аминолюциферина в контакт с люциферазой; и

c) определения относительной интенсивности света, генерируемого люциферазой.

Далее в настоящем описании такой способ обозначают как анализ по изобретению. В этом контексте количественный анализ фактора свертывания можно понимать как количественный анализ активности фактора свертывания. Специалисту в этой области будет понятно, что, если определяют активность профермента, активность соответствующего фермента является частью анализа.

Специалисту в этой области хорошо известен принцип хемилюминесценции, включающий люциферазу. Как правило, в нем используют люциферазу, люциферин, АТФ и молекулярный кислорода для продукции фотона; известно, что Mg²⁺ улучшает выход люминесценции реакции. Люцифераза катализирует конъюгацию люциферина с АТФ, а также последующее окисление промежуточного соединения люциферил-АМФ. В конечном итоге, люцифераза обеспечивает формирование среды, в которой окисленное промежуточное соединение люциферина преобразуется с образованием оксилюциферина и одного фотона с высокой квантовой эффективности. Интенсивность света, являющаяся результатом такой люминесценции, зависит от концентраций компонентов, вовлеченных в химическое или ферментативное превращение высвобожденной люминесцентной молекулы. При использовании избытка таких компонентов люминесцентный сигнал в способе по изобретению начинает зависеть только от образования свободных люминесцентных молекул посредством расщепления субстрата с помощью интересующего фактора гемостаза, например, FXa или другого фактора, как описано в настоящем описании ниже. Таким образом, в таких условиях интенсивность света пропорциональна образованию указанного фактора гемостаз, например, образованию FXa. Таким образом, интересующий фактор свертывания можно подвергать количественному анализу благодаря дизайну анализа по изобретению, т. к. его концентрация пропорциональна выходному световому сигналу в анализе.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что, используя соединения по изобретению, образование фактора гемостаза, например, образования FXa, является ли оно прямым или непрямым, или концентрацию FXa как такового можно измерять непрерывно, полунепрерывно или напрямую без необходимости вычисления первой производной, как это требуется при хромогенном или флуорогенном способе измерения образования факторов свертывания крови. Как правило, после расщепления субстрата по изобретению интересующим фактором гемостаза высвобождается "люминесцентная молекула", являющаяся аминолюциферином, подверженная последующему химическому или ферментативному превращению, приводящему к детектируемому световому сигналу (или "кванту света", или "фотону", или "световой единице"). Т. к. квант света образуется на необратимой стадии, не происходит накопления выходного сигнала; сигнал является прямой мерой активности FXa (и, таким образом, возможно, активности фактора, участвующего в образовании FXa). По сравнению с существующими способами, в которых используют флуоресцентные или хромогенные субстраты, значительным преимуществом настоящего изобретения является то, что сигнал можно определять в реальном времени, что напрямую пропорционально количеству фактора гемостаза, присутствующего в любой указанный момент времени; нет необходимости вычислять первую производную накапливаемого оптического сигнала. В способе по изобретению нет помех генерированию световых сигналов в будущем. Кроме того, для измерения сигнала не требуется внешний источник света и оптические фильтры. Таким образом, способ по настоящему изобретению удобнее способов на предшествующем уровне техники.

Образец может являться образцом от индивидуума, предпочтительно, он является образцом, ранее полученным из индивидуума. Индивидуум может являться человеком. Индивидуум может не являться человеком. Предпочтительно, образец является жидкостью. Предпочтительным образцом является кровь, или он получен из крови. Подходящими образцами являются цельная кровь и плазма, такая как бедная тромбоцитами плазма или богатая тромбоцитами плазма. Наиболее предпочтительным образцом является бедная тромбоцитами плазма, такая как бедная тромбоцитами плазма, ранее полученная из индивидуума.

Факторы свертывания хорошо известны в этой области. Что касается анализа по изобретению, предпочтительными факторами свертывания являются фактор IX (FIX), фактор IXa (FIXa), фактор VIII (FVIII), фактор VIIIa (FVIIIa), фактор VII (FVII), фактор VIIa (FVIIa), фактор XI (FXI), фактор XIa (FXIa), фактор XII (FXII), фактор XIIa (FXIIa), фактор X (FX) и фактор Xa (FXa). Обозначение, такое как FX(a), относится к обоим из FX и FXa или любому из них.

Физиологическая роль факторов свертывания связана с тем, чтобы в конечном итоге сделать возможным образование тромбина. Тромбин является наиболее важной составляющей каскада свертывания в терминах его роли в активации обратной связи. У людей частями процесса, как правило, являются следующие: FVIIa циркулирует в более высоком количестве, чем любой другой активированный фактор свертывания. После повреждения кровеносного сосуда FVII(a) может контактировать с тканевым фактором (TF), в конечном итоге, образуя активированный комплекс (TF-FVIIa). TF-FVIIa активирует FIX с образованием FIXa и активирует FX с образованием FXa. Активация FX (для образования FXa) под действием TF-FVIIa почти незамедлительно ингибируется ингибитором пути TF (тканевого фактора) (TFPI) в комплексе TF-TFPI-FXa. FXa и его кофактор FVa образуют протромбиназный комплекс, активирующий протромбин до тромбина. Затем тромбин активирует другие компоненты каскада свертывания, включая FV и FVIII (образующие комплекс с FIX), и активирует и высвобождает FVIII из связанного состояния с vWF, образуя FVIIIa. FVIIIa является кофактором FIXa, и вместе они образуют "теназный" комплекс, активирующий FX, продолжая цикл.

В предпочтительных вариантах осуществления изобретение относится к анализу по изобретению, где фактор свертывания выбран из фактора IX, фактора IXa, фактора VIII, фактора VIIIa, фактора VII, фактора VIIa, фактора XI, фактора XIa, фактора XII, фактора XIIa, фактора X и фактора Xa. Фактор свертывания должен являться FXa или должен участвовать в образовании FXa.

Например, если фактор свертывания, подлежащий анализу, является FXa, то фактор свертывания является FXa. Если фактор, свертывания подлежащий анализу, не является FXa, то фактор свертывания должен участвовать в образовании FXa. В связи с этим, необходимо наличие FX.

В некоторых комбинациях образование FXa пропорционально концентрации нескольких факторов свертывания, подобных FVIII, FIX и FX в теназном комплексе или тканевому фактору или FVIIa в комплексе TF-FVIIa. Если все факторы, за исключением одного отсутствующего, присутствуют в избытке, активность отсутствующего фактора может коррелировать с конечной активностью FXa, определяемой по люминесцентному выходному сигналу.

FX может превращаться в FXa под действием FVIIa или FVIIa в присутствии TF, таким образом, что, если FVIIa подлежит анализу, фактор свертывания должен являться FX; это является результатом того, что FVIIa в образце затем может преобразовывать избыток FX в FXa.

FX также может превращаться в FXa под действием FIXa и FVIIIa в так называемом теназном комплексе. Теназный комплекс состоит из FIXa, FVIIIa, FX, анионных фосфолипидов и кальция. Таким образом, если FIXa подлежит анализу, фактор свертывания должен являться FX или FVIIIa, и, предпочтительно, должны присутствовать и FX, и FVIIIa, более предпочтительно, вместе с анионными фосфолипидами и кальцием. Таким образом, если FVIIIa подлежит анализу, фактор свертывания должен являться FX или FIXa, и, предпочтительно, должны присутствовать и FX, и FIXa, более предпочтительно, вместе с анионными фосфолипидами и кальцием. В свою очередь, FIX может превращаться в FIXa под действием FXIa, таким образом, что, если FIX подлежит анализу, предпочтительно, FXIa присутствует в дополнение к условиям, описанным для FIXa. Специалисту в этой области известны различные взаимодействия в путях свертывания, и он сможет выбирать подходящие факторы свертывания для использования в анализе по изобретению в зависимости от того, какой фактор свертывания подвергают анализу. В основном, компоненты пути свертывания должны присутствовать в избытке, при этом, компонент, подлежащий анализу, исключен. Затем фактор свертывания, подлежащий анализу, добавляют в составе образца, и, т. к. любые из его субстратов, кофакторов или других взаимодействующих веществ присутствуют в избытке, количество фактора свертывания, подлежащего анализу, будет напрямую коррелировать с активностью FXa, образующегося и, в конечном итоге, определяемого с помощью соединений по изобретению.

Специалисту в этой области будет понятно, что детекция профермента, как правило, будет включать детекцию соответствующего фермента, и что детекция профермента, таким образом, соответствует детекции профермента и соответствующего активного фермента. Например, детекция FVII приводит к одновременной детекции FVII и FVIIa.

Глобальный анализ

В одном из классов предпочтительных вариантов осуществления присутствуют все компоненты пути свертывания. Такой анализ обозначают в настоящем описании как глобальный анализ, и, предпочтительно, его осуществляют с использованием факторов свертывания, обеспечиваемых с помощью самого образца. Таким образом, в глобальном анализе, предпочтительно, компоненты пути свертывания присутствуют в соотношениях, напоминающих соотношения, обнаруживаемые в физиологических системах. Предпочтительными образцами для глобального анализа являются цельная кровь и плазма, такая как богатая тромбоцитами плазма, или бедная тромбоцитами плазма, более предпочтительно - плазма, наиболее предпочтительно - бедная тромбоцитами плазма. Глобальный анализ гемостаза, предпочтительно, начинают с добавления в плазму активных факторов свертывания, таких как FXIIa, FXIa или FIXa, тканевого фактора (TF) и/или кальция, более предпочтительно, TF и/или кальция, наиболее предпочтительно, и TF, и кальция; это приводит к образованию FXa с последующим образованием тромбина и последующим образованием сгустка. После инициации тромбин необходим для развития и терминации каскада. Измерение концентрации FXa при таком глобальном дизайне позволяет получать информацию о вкладе образца в каскад свертывания.

Стадия a) - высвобождение аминолюциферина

На стадии a) образец приводят в контакт с композицией, содержащей соединение по изобретению, для высвобождения аминолюциферина. FXa может распознавать пептид, содержащийся в соединении по изобретению, и отщеплять его от люминесцентного остатка для высвобождения аминолюциферина. Таким образом, если FXa является фактором свертывания, подлежащим анализу, на стадии a) не требуется наличие других факторов свертывания. В предпочтительных вариантах осуществления на стадии a) присутствуют кальций и фосфолипиды. Кальций и фосфолипиды должны подходить для образования теназого комплекса. Эти фосфолипиды, предпочтительно, являются анионными фосфолипидами.

В этой области известны условия для активности фактора свертывания, и приведение в контакт, предпочтительно, осуществляют в этих условиях. Примером является использование физиологически приемлемого буфера, например, буфера Трис, необязательно, содержащего 1% сывороточного альбумина, такого как BSA. Примером подходящего буфера Трис является Трис-забуференный физиологический раствор (TBS; 50 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl; pH 7,4). Концентрация субстрата по изобретению, предпочтительно, составляет по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 мкМ или более, более предпочтительно - по меньшей мере 20 или 30 мкМ, например, по меньшей мере, 30 мкМ. Концентрация субстрата по изобретению, предпочтительно, составляет максимум 5000, 4000, 3000, 2000, 1750, 1500, 1250, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60 мкМ или менее, более предпочтительно - максимум 2500 мкМ, или 200 мкМ, или 1750 мкМ, или 1500 мкМ, или 1250 мкМ, или 1000 мкМ, или 900 мкМ, или 800 мкМ, или 700 мкМ, или 600 мкМ, или 500 мкМ или менее, даже более предпочтительно - максимум 2000 или 750 мкМ или менее, например, максимум 750 мкМ.

Эта стадия предназначена для определения корреляции наличия фактора свертывания, подлежащего анализу, с люминесцентным выходным сигналом, и, таким образом, на этой стадии высвобождается субстрат для люциферазы. В этом контексте термин "высвобождение", следует интерпретировать как гидролиз, например, остатка аминолюциферина, как показано в общей формуле II-4, где карбоновая кислота представляет собой S. В зависимости от субстрата, также могут высвобождаться люминесцентные остатки. Высвобождение необходимо для того, чтобы сделать хемилюминесцентный субстрат доступным для последующего превращения на стадии b), т.к. хемилюминесцентный субстрат недоступен для дальнейшего превращения, если он содержится в соединении по изобретению.

В предпочтительных вариантах осуществления изобретение относится к анализу по изобретению, где фактор свертывания, подлежащий анализу, выбран из фактора IX, фактора IXa, фактора VIII, фактора VIIIa, фактора VII, фактора VIIa, фактора XI, фактора XIa, фактора XII, фактора XIIa, фактора X, фактора Xa, прекалликреина и калликреина, предпочтительно, выбран из фактора IX, фактора IXa, фактора VIII, фактора VIIIa, фактора X и фактора Xa, необязательно, где на стадии a) композиция содержит по меньшей мере один дополнительный фактор свертывания, выбранный из фактора IX, фактора IXa, фактора VIII, фактора VIIIa, фактора VII, фактора VIIa, фактора XI, фактора XIa, фактора XII, фактора XIIa, фактора X, прекалликреина и калликреина, предпочтительно, выбранного из фактора IX, фактора IXa, фактора VIII, фактора VIIIa и фактора X. Фактор свертывания должен являться FXa или должен участвовать в образовании FXa, как описано выше. Дополнительный фактор свертывания должен участвовать в образовании FXa.

FX может превращаться в FXa под действием FIXa и FVIIIa в так называемом теназном комплексе. Теназный комплекс состоит из FIXa, FVIIIa, FX, анионных фосфолипидов и кальция. Таким образом, если FIXa подлежит анализу, фактор свертывания может являться любым из FX или FVIIIa, и дополнительный фактор свертывания, предпочтительно, является FX или FVIIIa, в зависимости от того, какой фактор не является уже выбранным фактором свертывания. Таким образом, если FVIIIa подлежит анализу, фактор свертывания должен являться любым из FX или FIXa, и дополнительный фактор свертывания, предпочтительно, должен являться FX или FIXa, в зависимости от того, какой фактор не является уже выбранным фактором свертывания. Специалисту в этой области известны различные взаимодействия в путях свертывания, и он сможет выбирать подходящие факторы свертывания и дополнительные факторы свертывания, которые должны присутствовать в анализе по изобретению, в зависимости от того, какой фактор свертывания подлежит анализу.

Стадия b) - окисление аминолюциферина люциферазой

На стадии b) аминолюциферин приводят в контакт с люциферазой. Целью этого приведения в контакт является генерирование кванта света из хемилюминесцентной молекулы, высвободившейся на стадии a), например, из высвободившегося аминолюциферина. В этой области известны способы превращения хемилюминесцентного субстрата для получения кванта света, и люцифераза, предпочтительно - люцифераза светлячка, может становиться более функциональной, если во время приведения в контакт также присутствуют дополнительные вещества. Таким образом, в предпочтительных вариантах осуществления стадия b) дополнительно включает приведение высвобожденной хемилюминесцентной молекулы в контакт с АТФ. В предпочтительных вариантах осуществления стадия b) дополнительно включает приведение высвободившейся хемилюминесцентной молекулы в контакт с Mg²⁺. В предпочтительных вариантах осуществления стадия b) дополнительно включает приведение высвободившейся хемилюминесцентной молекулы в контакт с АТФ и Mg²⁺. Если на стадии b) также присутствует АТФ, он может присутствовать в конечной концентрации приблизительно 50-1000 мкМ, предпочтительно - в конечной концентрации приблизительно 250-500 мкМ, более предпочтительно - приблизительно 300-400 мкМ, такой как приблизительно 333 мкМ. Если на стадии b) присутствует Mg²⁺, он может присутствовать в конечной концентрации приблизительно 1-30 мкМ, предпочтительно - в конечной концентрации приблизительно 4-12 мМ, более предпочтительно - приблизительно 6-10 мМ, такой как приблизительно 8,3 мМ. Люцифераза, предпочтительно, присутствует в концентрации приблизительно 0,05-50 мг/мл, более предпочтительно - приблизительно 0,1-10 мг/мл, даже более предпочтительно - приблизительно от 0,5 до 5 мг/мл, такой как приблизительно 0,9 мг/мл.

Стадию a) и стадию b) можно осуществлять одновременно и/или в одном объеме реакционной смеси. В предпочтительных вариантах осуществления стадию a) и стадию b) осуществляют в одном объеме реакционной смеси, предпочтительно одновременно содержащей все реагенты, необходимые для обеих стадий a) и b). Это позволяет высвободившейся хемилюминесцентной молекуле превращаться под действием люциферазы без задержки.

Стадия c) - определение относительной интенсивности света

На стадии c) определяют люминесцентный сигнал. Это можно осуществлять любым способом, известным в этой области, например с использованием люминометра. Определенную интенсивность света используют в качестве основы для количественного анализа фактора свертывания, подлежащего анализу. Как описано выше в настоящем описании и примерах 5 и 6, это может являться результатом того, что концентрация фактора свертывания коррелирует с относительной интенсивностью света, предпочтительно, выраженных в относительных единицах света (RLU). В некоторых вариантах осуществления относительную интенсивность света сравнивают с референсным значением или калибровочной кривой. Такую калибровочную кривую, предпочтительно, получают с использованием известных количеств фактора свертывания, подлежащего анализу, например, как показано в примерах. Референсное значение может представлять собой заданное значение, такое как заранее определенное значение, или оно может представлять собой результаты анализа в случае контрольного образца. В этом контексте контрольный образец, предпочтительно, является образцом, о котором известно, что он соответствует некоторым требованиям, или образцом, полученным (ранее) из здорового индивидуума, или он может являться нормальной объединенной плазмой.

Относительная интенсивность света напрямую соответствует точной люциферазной активности, которая, в свою очередь, напрямую соответствует точному количеству высвобождаемого люминесцентного субстрата, которое, в свою очередь, напрямую соответствует активности FXa. Как описано выше, активность FXa, в свою очередь, может напрямую соответствовать активности других факторов свертывания. Таким образом, относительная интенсивность света позволяет получать непосредственную информацию о количестве фактора свертывания, подлежащего анализу, по причине фиксированной k_a участвующих ферментов и субстратов. Это является отличием от анализов накопления, таких как флуорогенные анализы или хромогенные анализы. В случае последних двух анализов для определения скорости превращения необходимо вычислять угол наклона. В люминесцентных анализах плоский выходной сигнал (например, в RLU) напрямую свидетельствует о скорости превращения. В предпочтительных вариантах осуществления стадия c) не включает определение производной любого сигнала, определенного на стадии c). В более предпочтительных вариантах осуществления стадия c) не включает определение первой производной относительной интенсивности света, генерируемого люциферазой. В этом контексте интенсивность света, генерируемого люциферазой, относится к относительной интенсивности света, происходящего из люминесцентной молекулы, такой как аминолюциферин, высвобождающейся из соединения по изобретению. Люминесценцию можно измерять при длинах волн, соответствующих известным в этой области способам. Примерами подходящих длин волн являются 360-630 нм.

Таким образом, относительная интенсивность света, определяемая в момент времени, позволяет напрямую получать информацию об активности фактора свертывания. Однако определение относительной интенсивности света в течение периода времени или до удовлетворения некоторых условий может позволять получать необходимую информацию о динамике анализа. Это особенно подходит для глобального анализа, как описано выше, где выходной сигнал, как правило, будет представлять собой колоколообразную кривую. Таким образом, в предпочтительных вариантах осуществления стадия c) включает определение относительной интенсивности света, генерируемого люциферазой, за период времени. Этот период времени составляет, предпочтительно, максимум 150, 120, 90, 80, 70, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 минуту или менее, более предпочтительно - максимум 35, 30, 15 или 10 минут или менее. Период времени, предпочтительно, составляет по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 секунд, более предпочтительно - по меньшей мере 10, 20 или 30 секунд, например, по меньшей мере 30 секунд.

Способ количественного анализа антикоагулянта в образце

Анализ по изобретению можно модифицировать, чтобы сделать возможным количественный анализ антикоагулянтов. Таким образом, изобретение также относится к способу количественного анализа антикоагулянта в образце, включающему стадии:

a) приведения образца в контакт с композицией, содержащей фактор Xa и соединение по изобретению, для высвобождения аминолюциферина;

b) приведения аминолюциферина в контакт с люциферазой; и

c) определения относительной интенсивности света, генерируемого люциферазой.

Этот способ является способом, с помощью которого количественно анализируют ингибирование активности FXa, и далее в настоящем описании его обозначают как анализ ингибирования по изобретению. Отличие от анализа по изобретению, как описано выше, состоит в том, что в этом способе FXa также получают на стадии a). Результатом этого является то, что будет генерироваться известное количество люминесцентного сигнала в отсутствие ингибитора FXa в результате активности FXa, приводящей к высвобождению аминолюциферина из соединений по изобретению. Таким образом, любое снижение люминесцентного выходного сигнала можно приписать ингибированию FXa, например, когда присутствует антикоагулянт. Предпочтительными антикоагулянтами, подлежащими анализу, являются антикоагулянты прямого действия (DOAC), гепарин и гепариноиды. Предпочтительные DOAC направлены против FXa, такие как ривароксабан (CAS 366789-02-8), апиксабан (CAS 503612-47-3) и эдоксабан (CAS 480449-70-5).

Как описано, FXa уже получен на стадии a). Это предоставление FXa может являться прямым предоставлением FXa или предоставлением композиции, которая может приводить к образованию FXa. Такие композиции известны в этой области. Предпочтительно, если стадия a) включает предоставление композиции, которая может приводить к образованию FXa, композиция приводит к образованию фиксированного или известного количества FXa.

Стадии b) и c), по существу, не отличаются и, таким образом, описаны выше. В случае стадии c), как ее используют в этом способе для количественного анализа антикоагулянтов, предпочтительным может являться сравнение с референсным значением, особенно, если референсное значение соответствует калибровочной кривой, где используют ингибирование FXa известными количествами антикоагулянта, подлежащего анализу. Это описано в примере 4 и показано на фиг. 4.

В предпочтительных вариантах осуществления изобретение относится к анализу по изобретению или анализу ингибирования по изобретению, где стадия c) включает определение относительной интенсивности света, генерируемого люциферазой, за период времени, и/или где анализ или анализ ингибирования не включает определение первой производной относительной интенсивности света, генерируемого люциферазой.

В совокупности, настоящее изобретение относится к улучшенному, чувствительному способу мониторинга образования факторов гемостаза в тестируемом образце. Способ по настоящему изобретению делает возможным дизайн оптического устройства для использования в месте оказания медицинской помощи для измерения образования одного или более факторов гемостаза.

Общие определения

В предпочтительных вариантах осуществления соединения и композиции по изобретению предназначены для использования в способах по изобретению или для применения по изобретению. Каждый вариант осуществления, определенный в настоящем описании, можно комбинировать друг с другом, если не указано иначе.

Если из структурной формулы или химического названия специалисту в этой области понятно, что соединение имеет хиральные центры, но хиральность не указана, для каждого хирального центра делают отдельную ссылку на все три из рацемической смеси (имеющей какой-либо энантиомерный избыток), чистого R-энантиомера и чистого S-энантиомера.

Соединения и соединения для использования по изобретению могут являться необязательно замещенными. Подходящие необязательные замены представляют собой замену -H галогеном. Предпочтительными галогенами являются F, Cl, Br и I. Дополнительными подходящими необязательными заменами являются замены одного или более -H на -NH₂, -OH, =O, алкил, алкоксигруппу, галогеналкил, галоалкоксигруппу, алкен, галоалкен, алкин, галоалкин и циклоалкил. Алкильные группы имеют общую формулу C_nH_2n+1 и могут являться альтернативно линейными или разветвленными. Незамещенные алкильные группы также могут содержать циклический остаток и, таким образом, имеют соответствующую общую формула C_nH_2n-1. Необязательно, алкильные группы замещены одним или более заместителями, дополнительно определенными в настоящем описании. Примеры алкильных групп включают метил, этил, пропил, 2-пропил, трет-бутил, 1-гексил, 1-додецил и т.д. На всем протяжении настоящей заявки правило валентности атомов всегда должно быть удовлетворено, и, при необходимости, можно добавлять или удалять H. Наиболее предпочтительно, необязательные замены представляют собой замену одного, двух или трех -H на F, Cl, CH₃, CH₂CH₃, OCH₃ или OCH₂CH₃.

Каждый раз, когда параметр вещества описан в контексте по настоящему изобретению, предполагают, что, если не указано иначе, параметр определяют, измеряют или обнаруживают в физиологических условиях. Физиологические условия известны специалисту в этой области и включают системы водных растворителей, атмосферное давление, значения pH от 6 до 8, температуру в диапазоне от комнатной температуры до приблизительно 37°C (от приблизительно 20°C до приблизительно 40°C) и подходящую концентрацию буферных солей или других компонентов. Следует понимать, что заряд часто ассоциирован с равновесием. Остаток, как указано, несущий заряд, является остатком, который будет обнаружен в состоянии, в котором он несет такой заряд чаще, чем не несет такой заряд. В связи с этим, атом, указанный в настоящем описании как заряженный, может являться незаряженным в конкретных условиях, нейтральный остаток может являться заряженным в конкретных условиях, как будет понятно специалисту в этой области.

В контексте настоящего изобретения термины "снижение" или "повышение" параметра, подлежащего оценке, означает изменение по меньшей мере на 5% от значения, соответствующего этому параметру. Более предпочтительно, снижение или повышение значения означает изменение по меньшей мере на 10%, даже более предпочтительно - по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 90% или 100%. В случае последнего может оказаться так, что больше нет детектируемого значения, ассоциированного с параметром.

В настоящем описании и формуле изобретения глагол "содержат" и его спряжения используют в неограничивающем смысле для обозначения того, что пункты после термина включены, но пункты, не указанные конкретно, не исключены. Термины "гемостаз" и "гемостаз" в настоящем описании можно использовать взаимозаменяемо. Кроме того, ссылка на элемент в единственном числе не исключает возможности наличия более одного элемента, если контекст четко не указывает, что присутствует один и только один из элементов. Таким образом, термин в единственном числе, как правило, означает "по меньшей мере один". Термин "приблизительно" при использовании с числовым значением (например, приблизительно 10), предпочтительно, означает, что значение может являться указанным значением (10) на 1% больше или меньше значения. Кроме того, глагол "состоять" можно заменять термином "состоять, по существу, из", что означает, что композиция по изобретению может содержать дополнительные компоненты относительно конкретно указанных компонентов, указанные дополнительные компоненты не изменяют уникальные характеристики изобретения.

Все патенты и литературные источники, процитированные в настоящем описании, включены в него, таким образом, в качестве ссылки в полном объеме.

В контексте настоящего изобретения клетка или образец могут являться клеткой или образцом из образца, полученного из индивидуума. Такой полученный образец может являться образцом, ранее полученным из образца. Такой образец можно получать от человека. Такой образец можно получать из не являющегося человеком индивидуума.

Далее приведены последовательности, на которые ссылаются в настоящем описании:

SEQ ID NO: 1 IEGR

SEQ ID NO: 2 IDGR

SEQ ID NO: 3 IEGK

SEQ ID NO: 4 IDGK

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1. Синтез соединений по изобретению. A) синтез в направлении общего кора Gly-Arg/Gly-Orn; B) превращение общего кора в предшественника, имеющего пептидный кор Ile-Glu-Gly-Arg; C) превращение промежуточного соединения Ile-Glu-Gly-Arg в MePEG2-IEGR.

Фигура 2. Кривая кинетики Михаэлиса-Ментен для фермента FXa и его субстрат MePEG2-IEGR при концентрации FXa 1,6 нМ. Определяли V_max=468000 RLU и K_M=619 мкМ, что приводит к K_cat=V_max/[FXa]= 1,05×10¹⁴ с^-1.

Фигура 3. Субстрат MePEG2-IEGR имеет минимальную перекрестную реактивность в отношении сериновых протеаз, иных, чем FXa. A) 80 нм FXa приводили к сигналу 1000000 RLU; 52 нМ тромбина приводили к ~30000 RLU; 8 нМ плазмина приводили к ~8000 RLU; 193 МЕ/мл tPA (общепринятая концентрация для облегчения фибринолиза) приводили к ~6000 RLU; 145 нМ FXIIa приводили к ~500 RLU; концентрации иных веществ, чем tPA, типичны для концентраций в плазме человека после активации. B) вид в увеличенном масштабе секции панели A, где ось y преобразована в логарифмическую шкалу.

Фигура 4. Апиксабан ингибирует превращение субстрата MePEG2-IEGR. FXa (4 нМ) в присутствии от 100 пг/мл до 100 мг/мл Апиксабан демонстрирует ингибирование в диапазоне 10-1000 нг/мл.

Фигура 5. Активность FVIII в образце определяли на основе активности FXa посредством получения реакционной смеси, содержащей избыток компонентов каскада, но несодержащей FVIII. Таким образом, люминесценция, вызванная активностью FXa, становится мерой активности FVIII; A) RLU, измеренные при разных концентрациях FVIII, выражали как процентную долю от нормальной объединенной плазмы; B) калибровочная кривая для результатов на панели A. При калибровке использовали линейную регрессию y=30331+ 376x и r²=0,9935.

Фигура 6. Активность FIX в образце определяли на основе активности FXa посредством получения реакционной смеси, содержащей избыток компонентов каскада, но несодержащей FIX. Таким образом, люминесценция, вызванная активностью FXa, становится мерой активности FIX; A) RLU, измеренные при разных концентрациях FIX, выражали как процентную долю от нормальной объединенной плазмы; B) калибровочная кривая для результатов на панели A. При калибровке использовали линейную регрессию y=97471+8547x и r²=0,9872.

Фигура 7. Активация FXa в глобальном анализе гемостаза с использованием высокой и низкой концентрации тканевого фактора (7 пМ или 0,28 пМ).

Фигура 8. A) необработанные данные, измеренные кинетически, с использованием хемилюминесцентного ридера. B) В этом примере используют фиксированный момент времени, в этом случае - 3 минуты, для построения калибровочной кривой. C) В этом примере вычисляют угол наклона между 0,5-3 минутами каждого калибратора для построения калибровочной кривой.

Фигура 9. A) Наложение 4 калибровочных кривых использовали для измерения 31 клинического образца FVIII. Среднее значение R² для этих четырех калибровочных кривых в совокупности составлял 0,9810. B) Восстановление клинических образцов в хемилюминесцентном анализе, а также хромогенного анализа FVIII с использованием образцов, содержащих рекомбинантный пегилированный продукт FVIII. C) Как и в случае B), но с использованием образцов, содержащих рекомбинантный полноразмерный продукт FVIII.

Фигура 10. A) Необработанные данные, измеренные кинетически, с использованием хемилюминесцентного ридера с калибраторами, содержащими различные уровни FIX. B) Построенная калибровочная кривая.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Получение субстратов по изобретению

Как показано на фиг. 1A, субстраты синтезировали с помощью ключевого промежуточного соединения A1. Синтез этого промежуточного соединения начинали с превращения бензо тиазола 1 в нитрил 2 с выходом 91%. Посредством восстановления получали чистый анилин 3 с выходом 54% после прямофазной и обращенно-фазовой флэш-хроматографии на колонках. Сопряжение с Fmoc-Orn(Boc)-OH (4) осуществляли с помощью PCl₃ в пиридине. После снятия защиты Fmoc успешно получали соединение 6. Посредством пептидного сопряжения 6 с Fmoc-Gly-OH 7 в направлении 8 и снятия защиты Boc получали 9 с выходом 84% за эти две стадии. С помощью реакции с 1,3-бис(трет-бутоксикарбонил)-2-(трифторметансульфонил)гуанидином получали гуанидин 10 с хорошим выходом и чистотой после очистки посредством колоночной флэш-хроматографии. Для получения соединений общей формулы I-3 или I-4, где присутствуют другие аминокислоты, указанный выше способ повторяют с указанными другими аминокислотами, или соединение 8 не превращается в соединение 10.

Как показано на фиг. 1B, с помощью снятия защиты Fmoc и дальнейшего сопряжения промежуточного соединения с Fmoc-Glu(OtBu)-OH 12 получали 13 с выходом 72% за 2 стадии. Посредством повторения этой последовательности, но теперь с использованием Fmoc-Ile-OH 15, получали тетрапептид 16 с выходом 78% за 2 стадии. Снятие защиты Fmoc с ключевого модуля A1 приводило к выходу 95%. Для получения соединений общей формулы I-3 или I-4, где присутствуют другие аминокислоты, указанный выше способ повторяют с указанными другими аминокислотами.

Как показано на фиг. 1C, синтез продолжали с использованием сопряжения пептида A1 с [2-(2-метоксиэтокси)этокси]уксусной кислоты 17 в направлении 18 с выходом 93%. Для других остатков X схожее сопряжение можно осуществлять с использованием соответствующих реагентов. С помощью сопряжения d-цистеина 19 получали аминолюциферин 20 с выходом 76% после очистки посредством обращенно-фазовой препаративной хроматографии. Удаление защитных групп осуществляли с использованием трифторуксусной кислоты, после чего продукт, обозначенный как MePEG2-IEGR, выделяли посредством растирания в диэтиловом простом эфире.

Пример 2. Кинетика субстратов по изобретению

Кинетику Михаэлиса-Ментен определяли для фермента FXa и его субстрата MePEG2-IEGR (в этих примерах использовали соль TFA). Следующую композицию получали с микрофлаконе на льду:

Композиция 1:

160 мкл Трис-забуференного физиологического раствора (TBS), 50 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl (pH 7,4);

4 мкл АТФ (конечная концентрация 333 мкМ);

4 мкл MgCl₂ (конечная концентрация 8,3 мМ);

12 мкл люциферазы (конечная концентрация 0,9 мг/мл).

Композиции субстрата 2a-g:

Микрофлаконы получают с количеством субстрата 30 мкл, что приводит к конечным концентрациям 2000, 1333, 1000, 666, 333, 167 и 66 мкМ.

Композиция фермента 3:

Композицию FXa (Coachrom, 16 нМ) получали в микрофлаконе на льду.

Затем следующие композиции вместе добавляли в белый 384-луночный планшет:

24 мкл композиции 1;

3 мкл композиции 2a-g;

3 мкл композиции 3

Затем планшет помещали в термостатируемый Flexstation 3 (Molecular Devices) при 37°C. Длина волны испускания люминесценции имела время интеграции 1500 мс, измеренное в течение 1 с каждые 30 с в течение 30 мин.

Результаты приведены на фиг. 2. При концентрации FXa 1,6 нМ определяли V_max=468000 RLU и K_M=619 мкМ, что приводило к K_cat=V_max/[FXa]= 1,05×10¹⁴ с^-1.

Пример 3. Перекрестная реактивность

Для определения перекрестной реактивности анализ осуществляли с использованием диапазона ферментов свертывания при типичных концентрациях в плазме человека. Выбранные концентрации ферментов сравнимы с ожидаемыми концентрациями in vivo после активации. В случае тканевого активатора плазминогена (tPA) концентрация является общепринятой концентрацией для облегчения фибринолиза.

Концентрация 80 нм FXa приводила к сигналу 1000000 RLU. Другие ферменты свертывания приводили к следующим сигналам: 52 нМ тромбина приводили к ~30000 RLU, 8 нМ плазмина приводили к ~8000 RLU, 193 МЕ/мл tPA приводили к ~6000 RLU, и 145 нМ FXIIa приводили к ~500 RLU (фиг. 3). Эти данные свидетельствуют о том, что субстрат по изобретению преференциально расщепляется FXa.

Пример 4. Количественный анализ активности антикоагулянтов

В качестве примера антикоагулянта добавляли апиксабан (CAS № 503612-47-3) в разных концентрациях в смеси FXa и MePEG2-IEGR. Апиксабан является антикоагулянтом для лечения венозных тромбоэмболических явлений для перорального введения. Он является прямым ингибитором FXa. На фиг. 4 показано ингибирование апиксабаном превращения субстрата под действием FXa (4 нМ) в присутствии от 100 пг/мл до 100 мг/мл апиксабана. Показан ингибиторный эффект в отношении активности FXa в диапазоне 10-1000 нг/мл.

Пример 5. Количественный анализ FVIII

Этот люминесцентный анализ FVIII является двухстадийным анализом активности, приводящей к активации фиксированного количества FVIII из образца, что затем приводит к активации FX и, таким образом, стабильному превращению субстрата по изобретению. Люминесцентные анализы факторов приводят к стабильному превращению субстрата из-за небольшого времени распада фотонов, в то время как хромогенные или флуоресцентные субстраты накапливают сигнал (например, при 405 нм), что приводит к повышению сигнала с течением времени (OD/мин). В случае последнего анализа, необходимо вычислять угол наклона для определения скорости превращения. В люминесцентных анализах плоский выходной сигнал (в RLU) напрямую свидетельствует о скорости превращения, что делает способы по настоящему изобретению очень удобными.

В анализе добавляют тромбин для активации FVIII. Активированный фактор VIII образует ферментативный комплекс с фактором IXa, фосфолипидами (PLP) и кальцием. Этот комплекс активирует фактор X до FXa; FX поступает в аналитическую смесь в постоянной концентрации и в избытке. FXa действует на субстраты по изобретению, высвобождая субстрат от люциферазы, что приводит к люминесцентной активности. Таким образом, люминесцентная активность напрямую связана со степенью активности фактора VIII, являющейся ограничивающим фактором в присутствии постоянного количества фактора IXa. Затем образующийся фактор Xa точно измеряют по его активности в отношении специфического люминесцентного субстрата фактора Xa по изобретению. Фактор Xa расщепляет субстрат и приводит к высвобождению фотона. Количество образующихся фотонов (выраженных в виде относительных единиц света, RLU) прямо пропорционально активности фактора Xa и, таким образом, количеству фактора VIII. Хромогенные аналоги таких анализов коммерчески доступны (например, анализ фактора VIII BIOPHEN от Hyphen Biomed, кат. № 221402). Важным отличием этого примера является то, что субстрат по изобретению используют с АТФ, Mg²⁺ и люциферазой вместо хромогенного субстрата.

В анализе использовали разные количества FVIII (с использованием нормальной объединенной плазмы (NPP) или их разведений). Образцы смешивали с раствором FX. После приблизительно 2 минут инкубации при 37°C добавляли раствор FIXa, тромбина, кальция и фосфолипидов в дистиллированной воде, после чего реакционную смесь инкубировали в течение приблизительно 3 минут при 37°C. Затем добавляли MePEG2-IEGR (в этом случае - соль TFA) в качестве субстрата для FXa, после чего люминесценцию определяли с использованием общепринятой смеси люциферазы, АТФ и Mg²⁺. На фиг. 5A показаны RLU активности FXa в зависимости от активности FVIII, присутствующего в образце, при этом добавленный FVIII выражали как процентную долю NPP. На фиг. 5B показана соответствующая калибровочная кривая. При калибровке использовали линейную регрессию y=30331+4376x и r²=0,9935.

Пример 5.1. Подробный анализ FVIII

Реагенты

Реагент 1 (R1):

Разведенные образцы плазмы использовали для тестирования или калибровочной кривой. Образцы разводили буфером, содержащим 50 мМ имидазола и 100 мМ NaCl (pH 7,4).

Реагент 2 (R2):

Фактор IXa человека, тромбин человека, кальций, Gly-Pro-Arg-Pro в качестве ингибитора полимеризации фибрина и синтетические фосфолипиды (28% фосфатидилсерина). Фосфолипиды и кальций хранят при 4-8°C. Другие компоненты хранят при -80°C. Смесь реагентов получают в буфере, содержащем 50 мМ имидазола и 100 мМ NaCl (pH 7,4).

Реагент 3 (R3):

Фактор X человека, АТФ, магний, люминесцентный субстрат, специфический для фактора Xa (в этом примере использовали MePEG2-IEGR) и рекомбинантная люцифераза Ultra-Glo от Promega. Люциферазу можно заменять люциферазой QuantiLum, можно использовать оба типа. Магний хранят при 4-8°C. Отдельные компоненты хранят при -80°C в водном растворе. Смесь реагентов получают в буфере, содержащем 50 мМ имидазола и 100 мМ NaCl (pH 7,4).

Получение образцов для калибровочной кривой

В таблице 5 показано получение образцов для калибровки для анализа FVIII. Для получения калибровочной кривой следующие разведенные образцы плазмы смешивают, как показано в таблице 5. В 384-луночном планшете используют 3 мкл разведенного образца или калибратора для тестового объема 10 мкл. Неизвестные образцы получают так же, как и 100% образцы.

Таблица 5

Стоковый раствор Рабочий раствор Калибратор Начальная конц. (FVIII%) Начальный объем (мкл) Объем плазмы FVIIIdef (мкл) Общий объем (мкл) Разведение Объем стокового раствора (мкл) Объем буфера (мкл)* Общий объем (мкл) Конечная конц. (FVIII%) C1 100 20 0 20 7/30 3,5 11,5 15 100 C2 100 10 10 20 7/30 3,5 11,5 15 50 C3 50 10 10 20 7/30 3,5 11,5 15 25 C4 25 10 10 20 7/30 3,5 11,5 15 12,5 C5 12,5 10 10 20 7/30 3,5 11,5 15 6,25 C6 6,25 10 10 20 7/30 3,5 11,5 15 3,125 C7 3,125 10 90 100 7/30 3,5 11,5 15 0,3

* буфер представляет собой 50 мМ имидазола и 100 мМ NaCl.

Получение белковых реагентов

В таблицах 6 и 7 представлено получение реагента 2 или 3, соответственно. Эти объемы соответствуют одной реакции или одному образцу в 384-луночном планшете с конечным тестовым объемом 10 мкл или 30 мкл. Конечная концентрация в каждой лунке приведена в таблице 8.

Таблица 6

Компонент Концентрация в стоковом растворе Объем в 10 мкл (мкл) Объем в 30 мкл (мкл) FIXa (человека) 274 нМ 0,25 0,75 Фосфолипиды 0,5 мМ 0,2 0,6 Gly-Pro-Arg-Pro 11,8 мМ 0,675 2,025 Кальций 162,2 нМ 0,375 1,125 Тромбин (человека) 114 нМ 0,06 0,18 Буфер имидазол/NaCl 50 мМ/100 мМ 1,44 4,32 Всего 3 9

Таблица 7

Компонент Концентрация в стоковом растворе Объем в 10 мкл (мкл) Объем в 30 мкл (мкл) FX (человека) 4,8 мкМ 0,083 0,25 АТФ 20 мМ 0,85 2,55 Магний 500 мМ 0,083 0,25 Субстрат люциферин 10 мМ 1 3 rЛюцифераза (Promega) 12,5 мг/мл 0,483 1,45 Буфер имидазол/NaCl 50 мМ 100 мМ 1,5 4,5 Всего 4 12

Таблица 8

Компонент Конечная концентрация FIXa (человека) 6,85 нМ Фосфолипиды 10 мкМ Gly-Pro-Arg-Pro 0,8 мМ Кальций 6 мМ Тромбин (человека) 0,7 нМ FX (человека) 40 нМ АТФ 1,7 мМ Магний 4,2 мМ Субстрат люциферин 1 мМ rЛюцифераза (Promega) 0,6 мг/мл

Способ

Тест осуществляют с использованием хемилюминесцентного ридера при 37°C. Три смеси раздельно распределяли в 384-луночный микропланшет, который инкубировали при 37°C. В таблице 9 показано разделение только для одной лунки. Во время теста реагенты смешивают и кинетически измеряют интенсивность в относительных единицах света (RLU) в течение 20 минут. Ниже описано, как интерпретировать полученные результаты.

Таблица 9

Объем в лунке 10 мкл (мкл) Объем в лунке 30 мкл (мкл) Реагент 1 3 9 Реагент 2 3 9 Реагент 3 4 12

Калибровочная кривая

Хемилюминесцентный количественный анализ FVIII можно калибровать для исследования фактора VIII. Анализ охватывает динамический диапазон, показанный в таблице 5. Существует по меньшей мере два способа построения калибровочной кривой с использованием кинетических данных. Первым вариантом является задание временной точки после просмотра необработанных данных. Временную точку считают очень подходящей, если кривые отдельных образцов-калибраторов образуют плато. Вторым вариантом является определение угла наклона между приблизительно 0,5-3 минутами. В обоих способах калибровочную кривую строят в двойном логарифмическом формате.

Калибровочную кривую, показанную на фигурах, получают с помощью Flex3 Station (Molecular Devices, USA) в конечном тестовом объеме 10 мкл. Учитывая эту фигуру (необработанные данные) два варианта, упомянутых выше, использовали для построения конечной калибровочной кривой.

Более раннюю версию этого количественного анализа, главным образом, осуществляли в 30 мкл и с использованием люциферазы QuantiLum (Promega). Последнее является важным замечанием, учитывая, что эта люцифераза не позволяет достигать той же интенсивности в той же среде, что и люцифераза Ultra-Glo, которую использовали в варианте с 10 мкл. Таким образом, фигуры 1-3 и 4-6 нельзя сравнивать один к одному. На фигурах 4-6 визуализированы результаты, полученные с помощью анализа в 30 мкл. Валидацию этого анализа осуществляли с использованием клинических образцов 31 пациентов с гемофилией, подвергаемых заместительной терапии FVIII. Двадцать два образца содержали рекомбинантный пегилированный продукт FVIII, трем из которых было приписано менее 1% FVIII и выделено менее 1% FVIII. Десять образцов содержали рекомбинантный полноразмерный продукт FVIII, одному из которых было приписано менее 1% FVIII и выделено менее 1% FVIII. Эти образцы подвергали измерениям с помощью теста золотого стандарта, а также люминесцентного анализа FVIII. Анализом золотого стандарта, используемым для валидации, являлся хромогенный анализ FVIII, включающий бычьи факторы.

Пример 6. Количественный анализ FIX

Используя ту же стратегию, что и в примере 5, создавали люминесцентный анализ FIX. Дизайн анализа сравним с анализом FVIII, описанным выше, но, более конкретно, сенсибилизирован к FIX посредством предоставления избыточного количества FXIa вместо FIXa. FIX является проферментом, который может расщепляться FXIa с образованием FIXa. В присутствии Ca²⁺, мембранных фосфолипидов и FVIIIa FIXa гидролизует FX с образованием FXa. В реакционной смеси факторы из этого каскада, за исключением FIX, подлежащего анализу, присутствовали в избытке. Таким образом, количество FIX, добавляемого в реакционную смесь, приводит к образованию коррелирующего количества FXa, который, в свою очередь, приводит к детектируемой люминесценции. Хромогенные аналоги таких анализов коммерчески доступны (например, анализ фактора IX BIOPHEN от Hyphen Biomed, кат. № 221802). Важным отличием от этого примера является то, что используют субстрат по изобретению вместе с Mg²⁺, АТФ и люциферином вместо хромогенного субстрата.

В реакционную смесь добавляли различные количества FIX (с использованием NPP или его разведения), после чего определяли люминесценцию. На фиг. 6A показаны RLU активности FXa, зависящей от активности FIX, присутствующего в образце, при этом добавленный FIX выражали как процентную долю NPP. На фиг. 6B показана соответствующая калибровочная кривая. При калибровке использовали линейную регрессию y=97471+8547x и r²=0,9872.

Пример 6.1. Подробный анализ FIX

Реагенты

Реагент 4 (R4):

Разведенные образцы плазмы использовали для тестирования или калибровочной кривой. Образцы разводили в буфере, содержащем буфер 50 мМ имидазола и 100 мМ NaCl (pH 7,4).

Реагент 5 (R5):

Рекомбинантный фактор VIII человека, фактор XIa человека, тромбин человека, синтетические фосфолипиды (28%) кальций и Gly-Pro-Arg-Pro в качестве ингибитора полимеризации фибрина. Отдельные компоненты хранят при -80°C в водном растворе. Смесь реагентов получают в буфере, содержащем буфер 50 мМ имидазола и 100 мМ NaCl (pH 7,4).

Реагент 6 (R6):

Фактор X человека, АТФ, магний, люминесцентный субстрат, специфический для фактора Xa (в этом примере использовали MePEG2-IEGR) и рекомбинантная люцифераза Quantilum от Promega. Люциферазу можно заменять люциферазой Ultra-Glo, можно использовать оба типа. Магний хранят при 4-8°C. Отдельные компоненты хранят при -80°C в водном растворе. Смесь реагентов получают в буфере, содержащем 50 мМ имидазола и 100 мМ NaCl (pH 7,4).

Получение образцов для калибровочной кривой

Для получения калибровочной кривой следующие разведенные образцы плазмы смешивают, как показано в таблице 10. В 384-луночном планшете 6 мкл разведенных образцов или калибратора используют для тестового объема 30 мкл. Неизвестные образцы получают так же, как и 100% образцы.

Таблица 10

Стоковый раствор Рабочий раствор Калибратор Начальная конц. (FIX%) Начальный объем (мкл) Объем плазмы FIXdef (мкл) Общий объем (мкл) Разведение Объем стокового раствора (мкл) Объем буфера (мкл)* Общий объем (мкл) Конечная конц. (FIX%) C1 100 40 0 40 7/60 7 53 60 100 C2 100 20 20 40 7/60 7 53 60 50 C3 50 20 20 40 7/60 7 53 60 25 C4 25 20 20 40 7/60 7 53 60 12,5 C5 12,5 20 20 40 7/60 7 53 60 6,25 C6 6,25 20 20 40 7/60 7 53 60 3,125 C7 3,125 10 90 100 7/60 7 53 60 0,3

* буфер представляет собой 50 мМ имидазол и 100 мМ NaCl.

Получение белковых реагентов

В таблице 11 и 12 приведены способы получения реагентов. Эти объемы соответствуют 1 образцу или 1 лунке в 384-луночном планшете с конечным тестовым объемом 30 мкл. Конечная концентрация каждого компонента в одном образце приведена в таблице 13.

Таблица 11

Компонент Стоковая концентрация Объем в 30 мкл (мкл) Рекомбинантный FVIII 12 МЕ/мл 3 FXIa (человека) 317 нМ 0,15 Тромбин (человека) 114 нМ 0,26 Фосфолипиды 0,5 мМ 0,6 Кальций 162,2 мМ 1,1 GPRP 11,8 мМ 2 Буфер имидазол/NaCl 50 мМ/100 мМ 4,89 Всего 12

Таблица 12

Компонент Стоковая концентрация Объем в 30 мкл (мкл) FX (человека) 4,8 мкМ 0,25 АТФ 20 мМ 2,55 Магний 500 мМ 0,25 Субстрат люциферин 10 мМ 3 rЛюцифераза (Promega) 13,8 мг/мл 1,5 Буфер имидазол/NaCl 50 мМ/100 мМ 4,45 Всего 12

Таблица 13. Конечная концентрация каждого компонента iв одном образце

Компонент Конечная концентрация Рекомбинантный FVIII 1,2 МЕ/мл FX (человека) 40 нМ Субстрат люциферин 1 мМ FXIa (человека) 1,56 нМ Фосфолипиды 10 мкМ Кальций 6 мМ Тромбин (человека) 1 нМ АТФ 1,7 мМ Магний 4,2 мМ rЛюцифераза (Promega) 0,7 мг/мл

Способ

Тест осуществляют с использованием хемилюминесцентного ридера при 37°C. Четыре смеси раздельно распределяли в 384-луночный микропланшет, который инкубировали при 37°C. В таблице 14 показано разделение только для одной лунки. Во время теста кинетически измеряют интенсивность в относительных единицах света (RLU).

Таблица 14

Объем в лунке 30 мкл (мкл) Реагент 4 6 Реагент 5 12 Реагент 6 12 Смешивают и измеряют интенсивность в RLU в течение 20 минут

Калибровочная кривая

Люминесцентный тест FIX можно калибровать для анализа фактора IX или терапевтических концентратов. Калибраторы плазмы, охватывающие предполагаемый динамический диапазон, приведены в таблице 10, и их можно использовать для получения калибровочной кривой. Сначала необработанные данные визуально оценивают, где после подходящего момента времени выбирают конфигурацию калибровочных кривых. Калибровочную кривую строят в двойном логарифмическом формате.

Калибровочную кривую, приведенную на фигурах, получают с помощью Flex3 Station (Molecular Devices, USA). Учитывая эту фигуру (необработанные данные) два варианта, упомянутых выше, использовали для построения конечной калибровочной кривой.

Пример 7. Анализ образования FXa

Субстрат также использовали в глобальном анализе гемостаза, где FXa образуется в бедной тромбоцитами плазме посредством активации FX в процессе свертывания после инициации под действием тканевого фактора, фосфолипидов и кальция. Анализ образования FXa инициируют посредством добавления тканевого фактора и кальция в плазму, что приводит к образованию FXa с последующим образованием тромбина и последующим образованием сгустка. Образование FXa и его последующее ингибирование под действием физиологических ингибиторов приводит к получению колоколообразной кривой (фиг. 7). Использовали разные дозы тканевого фактора: 7 пМ или 0,28 пМ. Измеряя концентрацию FXa в таком глобальном анализе, получают информацию о приблизительно мощности каскада свертывания на уровне фактора Xa.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Enzyre B.V.

<120> НОВЫЕ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЕ СУБСТРАТЫ ДЛЯ ФАКТОРА Xa

<130> P6078919PCT

<150> EP18201051.2

<151> 2018-10-17

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Распознаваемая последовательность для FXa

<400> 1

Ile Glu Gly Arg

1

<210> 2

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Распознаваемая последовательность для FXa

<400> 2

Ile Asp Gly Arg

1

<210> 3

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Распознаваемая последовательность для FXa

<400> 3

Ile Glu Gly Lys

1

<210> 4

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Распознаваемая последовательность для FXa

<400> 4

Ile Asp Gly Lys

1

<---

Группа изобретений относится к области хемилюминесцентных субстратов и включает соединения формул (I-3) и (I-4), их кислотно-аддитивные соли, комбинации для измерения хемилюминесценции, их содержащие, способ количественного анализа фактора свертывания в образце и способ количественного анализа антикоагулянта в образце. В формулах (I-3) и (I-4) r представляет собой 0, 1, 2 или 3; r' представляет собой 0, 1, 2 или 3; d представляет собой 0, 1 или 2; g представляет собой 0 или 1; g' представляет собой 1; X является концевым остатком, выбранным из OH, O(C_1-6-алкила), (OCH₂CH₂)_1-6OH, (OCH₂CH₂)_1-6O(C_1-6-алкила), NHC(=O)(O)_0-1(C_1-6-алкила), NHC(=O)(O)_0-1(C_1-6-алкилен)(OCH₂CH₂)_1-6OH, NHC(=O)(O)_0-1(C_1-6-алкилен)(OCH₂CH₂)_1-6O(C_1-6-алкила), NHC(=O)(O)_0-1(C_1-6-алкилен)O(C_1-6-алкила), NHC(=O)(O)_0-1(C_1-6-алкилен)OH. Технический результат - соединения формул (I-3) и (I-4) в качестве хемилюминесцентных субстратов для измерения факторов свертывания крови. 5 н. и 14 з.п. ф-лы, 20 ил., 14 табл., 7 пр.

1. Соединение общей формулы (I-3) или (I-4)

,

где

r представляет собой 0, 1, 2 или 3;

r' представляет собой 0, 1, 2 или 3;

d представляет собой 0, 1 или 2;

g представляет собой 0 или 1;

g' представляет собой 1; и

X является концевым остатком, выбранным из OH, O(C_1-6-алкила), (OCH₂CH₂)_1-6OH, (OCH₂CH₂)_1-6O(C_1-6-алкила), NHC(=O)(O)_0-1(C_1-6-алкила), NHC(=O)(O)_0-1(C_1-6-алкилен)(OCH₂CH₂)_1-6OH, NHC(=O)(O)_0-1(C_1-6-алкилен)(OCH₂CH₂)_1-6O(C_1-6-алкила), NHC(=O)(O)_0-1(C_1-6-алкилен)O(C_1-6-алкила), NHC(=O)(O)_0-1(C_1-6-алкилен)OH,

или его кислотно-аддитивная соль.

2. Соединение по п.1, где d представляет собой 0 или 1.

3. Соединение по п.2, где d представляет собой 1.

4. Соединение по любому из пп.1-3, где r представляет собой 1 или 2, или где g представляет собой 1.

5. Соединение по любому из пп.1-4, где r представляет собой 1.

6. Соединение по любому из пп.1-5, где r представляет собой 1 и g представляет собой 1.

7. Соединение по любому из пп.1-6, где соединение имеет общую формулу (I-3s) или (I-4s)

,

где r, r', d, g, g' и X являются такими, как определено по пп.1-3.

8. Соединение по любому из пп.1-7, где соединение имеет общую формулу (II-3) или (II-4)

,

где r, r', d, g, g' и X являются такими, как определено по пп.1-4.

9. Соединение по любому из пп.1-8, где соединение имеет общую формулу (III-3) или (III-4)

,

где

d представляет собой 0, 1 или 2;

r представляет собой 0, 1, 2 или 3;

r' представляет собой 0, 1, 2 или 3;

g представляет собой 0 или 1;

g' представляет собой 1;

m представляет собой 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6;

p представляет собой 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6;

s представляет собой 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6; и

a представляет собой 0 или 1.

10. Соединение по п.9, где

d представляет собой 1, и/или

r представляет собой 1, и/или

r’ представляет собой 1, и/или

g представляет собой 1, и/или

g’ представляет собой 1, и/или

p представляет собой 2, и/или

s представляет собой 1.

11. Соединение по п.9, где

d представляет собой 0 или 1, и/или

r представляет собой 1 или 2, и/или

r' представляет собой 1 или 2, и/или

g представляет собой 0 или 1, и/или

g' представляет собой 1, и/или

m представляет собой 0 или 1, и/или

p представляет собой 1, 2, или 3, и/или

s представляет собой 1 или 2, и/или

a представляет собой 1.

12. Соединение по любому из пп.1-11, где соединение выбрано из MePEG2-IEGR и MePEG2-IDGR

13. Соединение по любому из пп.1-12, где соединение является кислотно-аддитивной солью, выбранной из соли HCl, соли уксусной кислоты, соли муравьиной кислоты, соли трифторуксусной кислоты и соли мезиловой кислоты.

14. Соединение по любому из пп.1-12, где соединение является кислотно-аддитивной солью, выбранной из соли HCl или соли трифторуксусной кислоты.

15. Комбинация для измерения хемилюминесценции, содержащая эффективное количество соединения по любому из пп.1-14 и люциферазу, АТФ, источник Mg²⁺ и фактор свертывания.

16. Комбинация для измерения хемилюминесценции, содержащая эффективное количество соединения по любому из пп.1-14 и люциферазу, АТФ, источник Mg²⁺ и фактор свертывания Xa.

17. Способ количественного анализа фактора свертывания в образце, включающий стадии:

a) приведения образца в контакт с композицией, содержащей соединение по любому из пп.1-14, для высвобождения аминолюциферина;

b) приведения аминолюциферина в контакт с люциферазой; и

c) определения относительной интенсивности света, генерируемого люциферазой.

18. Способ по п.17, где фактор свертывания выбран из фактора IX, фактора IXa, фактора VIII, фактора VIIIa, фактора VII, фактора VIIa, фактора XI, фактора XIa, фактора XII, фактора XIIa, фактора X, фактора Xa, прекалликреина и калликреина,

необязательно, где на стадии a) композиция содержит по меньшей мере один дополнительный фактор свертывания, выбранный из фактора IX, фактора IXa, фактора VIII, фактора VIIIa, фактора VII, фактора VIIa, фактора XI, фактора XIa, фактора XII, фактора XIIa, фактора X, прекалликреина и калликреина.

19. Способ количественного анализа антикоагулянта в образце, включающий стадии:

a) приведения образца в контакт с композицией, содержащей фактор Xa и соединение по любому из пп.1-14, для высвобождения аминолюциферина;

b) приведения аминолюциферина в контакт с люциферазой; и

c) определения относительной интенсивности света, генерируемой люциферазой.