Область техники, к которой относится изобретение
Настоящая заявка относится к области биомедицинской химии. Более конкретно, настоящая заявка относится к билигандному конъюгату лекарственного средства, фармацевтической композиции, содержащей билигандный конъюгат лекарственного средства, способу доставки полезной нагрузки субъекту, нуждающемуся в этом, посредством применения билигандного конъюгата лекарственного средства и способу лечения заболевания с помощью билигандного конъюгата лекарственного средства.
Предпосылки изобретения
В целом, пораженные заболеванием клетки и нормальные клетки значительно отличаются как в отношении патологических, так и в отношении физиологических характеристик, и одно из различий заключается в том, что пораженные заболеванием клетки содержат специфические или избыточно экспрессированные компоненты (такие как антигены, химические сигналы и рецепторы) на своей поверхности, тогда как эти компоненты отсутствуют или слабо экспрессированы в нормальных клетках. Исходя из этого, для лечения заболеваний разрабатывают конъюгат антитела и лекарственного средства (ADC) и конъюгат полипептида и лекарственного средства (PDC). В настоящее время некоторые лекарственные средства на основе ADC и PDC представлены на рынке или проходят клинические исследования; однако вследствие принципов, лежащих в основе их конструкции, для лекарственных средств на основе ADC и PDC имеются сильные ограничения в отношении клинического применения.
Вследствие сложности строения и относительно большой молекулярной массы ADC их разработка сталкивается со многими трудностями, включая отсутствие подходящих мишеней, трудности при изготовлении и низкую стабильность лекарственного средства. В настоящее время ADC в основном применяются в области лечения опухолей. В некоторых случаях аффинность нацеливающего антитела по отношению к поверхностному антигену раковой клетки может достигать 10-9-10-12 (Kd, моль/литр). Следовательно, обладая высокой специфичностью к клеткам-мишеням, ADC также обладают высокой специфичностью к нормальным клеткам, имеющим тот же рецептор-мишень, что и клетки-мишени. Более того, для метаболизирования ADC in vivo может потребоваться много времени (от 1 до 3 недель), в течение которого ADC постоянно уничтожают нормальные клетки, что приводит к значительному увеличению токсических и побочных эффектов. Следовательно, ADC в большей степени применимы к заболеваниям, характеризующимся очень большой разницей в количестве антигенов клеточной поверхности между опухолевыми и нормальными клетками. Однако очень немногие заболевания, известные в данной области, могут соответствовать такому строгому требованию.
PDC применялись для лечения ряда различных заболеваний в рамках клинических или доклинических исследований, однако в этом случае химиотерапевтические средства просто связаны с полипептидами, или полипептиды добавляют к наночастицам или полимерным материалам, в которые включены химиотерапевтические лекарственные средства, что делает большую часть полипептидов не способными проникать в клетки вследствие их большой молекулярной массы и имеющихся у них зарядов. Таким образом, большинство PDC в настоящее время подходят только для внеклеточного лечения, а области применения и эффективность PDC являются сильно ограниченными.
Соединение в виде конъюгата лекарственного средства также может являться конъюгатом лиганда и лекарственного средства (LDC), где лиганд может являться пептидом или низкомолекулярным соединением. Однако с точки зрения биодоступности, стабильности, эффективности, токсичности и т. д. при применении LDC возникают различные проблемы. Например, вследствие высоких значений молекулярной массы, липофильности или других свойств многие лиганды не способны проникать в клетки, что ограничивает области их терапевтического применения. Кроме того, лиганды обычно характеризуются низкой эффективностью при конъюгировании с традиционными химиотерапевтическими средствами (такими как доксорубицин и паклитаксел), а при конъюгировании с молекулами высокоэффективных лекарственных средств (таких как MMAE и DM1) лиганды могут вызывать высокую токсичность, тем самым отравляя и даже убивая животных до достижения терапевтически эффективного количества для обеспечения лечения опухоли.
Таким образом, в данной области также существует острая потребность в получении улучшенного LDC, который может воздействовать на высокоэкспрессируемые рецепторы, широко представленные на поверхности пораженных заболеванием клеток, расширить диапазон нацеливания и окно лечения, повысить эффективность лекарственных средств и избежать побочных эффектов лекарственных средств.
Краткое описание изобретения
В одном аспекте в настоящей заявке раскрыты конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль, содержащие полезную нагрузку и две нацеливающие молекулы, где двумя нацеливающими молекулами соответственно являются фрагмент, представляющий собой синергетическую молекулу, и фрагмент, представляющий собой лиганд к простатспецифическому мембранному антигену.
В другом аспекте в настоящей заявке раскрыты конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль, содержащие полезную нагрузку и две нацеливающие молекулы, где двумя нацеливающими молекулами соответственно являются фрагмент, представляющий собой синергетическую молекулу, и фрагмент, представляющий собой лиганд, представленный формулой (I):
В другом аспекте в настоящей заявке раскрыты конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль, содержащие полезную нагрузку и две нацеливающие молекулы, где двумя нацеливающими молекулами соответственно являются фрагмент, представляющий собой синергетическую молекулу, и P10, и полезная нагрузка представляет собой камптотецин или любое его производное.
В некоторых вариантах осуществления лиганд к простатспецифическому мембранному антигену, содержащийся в конъюгированном соединении или его фармацевтически приемлемой соли, имеет следующую структуру:
.
В некоторых вариантах осуществления лиганд к простатспецифическому мембранному антигену, содержащийся в конъюгированном соединении или его фармацевтически приемлемой соли, имеет следующую структуру:
.
В некоторых вариантах осуществления лиганд к простатспецифическому мембранному антигену, содержащийся в конъюгированном соединении или его фармацевтически приемлемой соли, имеет следующую структуру:
.
В некоторых вариантах осуществления лиганд к простатспецифическому мембранному антигену, содержащийся в конъюгированном соединении или его фармацевтически приемлемой соли, имеет следующую структуру:
.
В некоторых вариантах осуществления две нацеливающие молекулы, содержащиеся в конъюгированном соединении или его фармацевтически приемлемой соли, различаются.
В некоторых вариантах осуществления синергетическая молекула, содержащаяся в конъюгированном соединении или его фармацевтически приемлемой соли, представляет собой молекулу, взаимодействующую с клеткой.
В некоторых вариантах осуществления две нацеливающие молекулы, содержащиеся в конъюгированном соединении или его фармацевтически приемлемой соли, представляют собой молекулы, взаимодействующие с клеткой, которые взаимодействуют с разными молекулами клетки.
В некоторых вариантах осуществления синергетическая молекула, содержащаяся в конъюгированном соединении или его фармацевтически приемлемой соли, представляет собой молекулу, способствующую эндоцитозу, которая способна опосредовать эндоцитоз.
В некоторых вариантах осуществления синергетическая молекула, содержащаяся в конъюгированном соединении или его фармацевтически приемлемой соли, связывается с молекулой, выбранной из группы, состоящей из FOLR1, TRPV6, FOLH1 (PMSA), GNRHR, Her2, Trop2, Her3, NECTIN4, LRP1, GLUT1, EGFR1, AXL, CA9, CD44, клаудина 18.2, APN, DLL3, CEACAM5, FZD10, TFRC, MET, IGFR1, SSTR2, CCKBR, LFA1, ICAM, GPR87, GM-CSF, GM-CSFR, TIM3, членов семейства TLR, CD40, CD40L, OX40, OX40L, GITRL, GITR, 4-BBL, 4-1BB, CD70, CD27, ICOSL, ICOS, HHLA2, CD28, CD86/80, CD28, антигена MHCII, TCR, CTLA-4, CD155, CD122, CD113, IGIT, PD-L1, PD1, галектина-9, TIM-3, HVEM, BTLA, CD160, VISTA, B7-H4, B7-H3, фосфатидилсерина, HHLA2, LAG3, галектина-3, LILRB4, SIGLEC15, NKG2A, NKG2D, SLAMF7, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, FGFR1, FGFR2, FGFR4, NeuGcGM3 и CXCR4.
В некоторых вариантах осуществления конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль содержат фрагмент, представляющий собой лиганд к простатспецифическому мембранному антигену, и фрагмент, представляющий собой синергетическую молекулу, где фрагмент, представляющий собой синергетическую молекулу, связывается с молекулой, выбранной из группы, состоящей из FOLR1, TRPV6, FOLH1 (PMSA), SSTR2 и GNRHR.
В некоторых вариантах осуществления конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль содержат фрагмент, представляющий собой лиганд, представленный формулой (I), и фрагмент, представляющий собой синергетическую молекулу, где фрагмент, представляющий собой синергетическую молекулу, связывается с молекулой, выбранной из группы, состоящей из FOLR1, TRPV6, SSTR2 и GNRHR.
В некоторых других вариантах осуществления конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль содержат P10 и фрагмент, представляющий собой синергетическую молекулу, где синергетическая молекула связывается с молекулой, выбранной из группы, состоящей из FOLR1, TRPV6, FOLH1 (PMSA) и GNRHR.
В некоторых вариантах осуществления синергетическая молекула, содержащаяся в конъюгированном соединении или его фармацевтически приемлемой соли, представляет собой фолат или его аналог. В некоторых вариантах осуществления аналог фолата выбран из группы, состоящей из 5-метилтетрагидрофолата, 5-формилтетрагидрофолата, метотрексата и 5,10-метилентетрагидрофолата.
В некоторых вариантах осуществления конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль содержат одну, две, три, четыре или более полезных нагрузок. В некоторых вариантах осуществления полезная нагрузка выбрана из группы, состоящей из низкомолекулярного соединения, нуклеотида, пептида и белка. В некоторых вариантах осуществления полезная нагрузка представляет собой низкомолекулярное соединение. В некоторых вариантах осуществления низкомолекулярное соединение выбрано из группы, состоящей из камптотецина и любого его производного, ауристатина и любого его производного, майтанзина и любого его производного, радионуклидного комплекса, ингибитора циклооксигеназы-2, паклитаксела и любого его производного, эпотилона и любого его производного, блеомицина и любого его производного, дактиномицина и любого его производного, пликамицина и любого его производного и митомицина C. В некоторых вариантах осуществления низкомолекулярное соединение представляет собой камптотецин или любое его производное, ауристатин или любое его производное, майтанзин или любое его производное, радионуклидный комплекс или ингибитор циклооксигеназы-2.
В некоторых вариантах осуществления полезная нагрузка, содержащаяся в конъюгированном соединении или его фармацевтически приемлемой соли согласно настоящей заявке, связана с по меньшей мере одной нацеливающей молекулой посредством линкера.
В некоторых вариантах осуществления линкер, содержащийся в конъюгированном соединении или его фармацевтически приемлемой соли согласно настоящей заявке, представляет собой пептидный линкер, дисульфидный линкер, pH-зависимый линкер или комбинацию вышеупомянутых линкеров.
В некоторых вариантах осуществления пептидный линкер является расщепляемым при нахождении в определенной физиологической среде за счет расщепления протеазой или восстановления. В некоторых вариантах осуществления пептидный линкер выбран из группы, состоящей из цистеина, лизина, лизин-лизин, валин-цитруллин, фенилаланин-лизин, валин-лизин, цистеин-лизин, цистеин-глутаминовая_кислота, аспарагиновая_кислота-аспарагиновая_кислота и аспарагиновая_кислота-аспарагиновая_кислота-лизин, и необязательно карбоновая кислота в вышеупомянутых аминокислотах является амидированной.
В некоторых вариантах осуществления дисульфидный линкер выбран из группы, состоящей из DMDS, MDS, DSDM и NDMDS.
В некоторых вариантах осуществления pH-зависимый линкер представляет собой цис-аконитовый ангидрид.
В некоторых вариантах осуществления линкер в конъюгированном соединении или его фармацевтически приемлемой соли согласно настоящей заявке имеет следующую структуру:
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
или линкер представляет собой комбинацию вышеупомянутых структур и пептидного линкера.
В некоторых вариантах осуществления две нацеливающие молекулы, содержащиеся в конъюгированном соединении или его фармацевтически приемлемой соли согласно настоящей заявке, связаны друг с другом посредством спейсера. В некоторых вариантах осуществления спейсер, описанный в настоящей заявке, содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-14, Arg-Arg, Ala-Ser-Asn, Ala-Ala-Ala, Ser-Ser-Arg, Pro-Arg и Pro-Leu-Gly.
В некоторых вариантах осуществления конъюгированное соединение согласно настоящей заявке представляет собой CB-20B, которое имеет следующую структурную формулу:
В некоторых вариантах осуществления конъюгированное соединение согласно настоящей заявке представляет собой CB-20BK, которое имеет следующую структурную формулу:
В некоторых вариантах осуществления конъюгированное соединение согласно настоящей заявке представляет собой CB-60S, которое имеет следующую структурную формулу:
В некоторых вариантах осуществления конъюгированное соединение согласно настоящей заявке представляет собой CB-60SK, которое имеет следующую структурную формулу:
В некоторых вариантах осуществления конъюгированное соединение согласно настоящей заявке представляет собой CB-20C, которое имеет следующую структурную формулу:
В некоторых вариантах осуществления конъюгированное соединение согласно настоящей заявке представляет собой CB-1020, которое имеет следующую структурную формулу:
В некоторых вариантах осуществления конъюгированное соединение согласно настоящей заявке представляет собой CB-1320, которое имеет следующую структурную формулу:
В некоторых вариантах осуществления конъюгированное соединение согласно настоящей заявке представляет собой CB-1820, которое имеет следующую структурную формулу:
В некоторых вариантах осуществления конъюгированное соединение согласно настоящей заявке представляет собой CR19428, которое имеет следующую структурную формулу:
В некоторых вариантах осуществления конъюгированное соединение согласно настоящей заявке представляет собой 20R-SM09, которое имеет следующую структурную формулу:
В некоторых вариантах осуществления конъюгированное соединение согласно настоящей заявке представляет собой CB-20R, которое имеет следующую структурную формулу:
,
где M представляет собой радионуклид.
В некоторых вариантах осуществления конъюгированное соединение согласно настоящей заявке представляет собой CB-18G, которое имеет следующую структурную формулу:
В некоторых вариантах осуществления конъюгированное соединение согласно настоящей заявке представляет собой CR19426, которое имеет следующую структурную формулу:
В некоторых вариантах осуществления конъюгированное соединение согласно настоящей заявке представляет собой CB-10S, которое имеет следующую структурную формулу:
В некоторых вариантах осуществления конъюгированное соединение согласно настоящей заявке представляет собой CR19425, которое имеет следующую структурную формулу:
В некоторых вариантах осуществления конъюгированное соединение согласно настоящей заявке представляет собой CB-50S, которое имеет следующую структурную формулу:
В другом аспекте в настоящей заявке раскрыта фармацевтическая композиция, содержащая конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемую соль согласно настоящей заявке и фармацевтически приемлемый носитель.
В некоторых вариантах осуществления композиция вводится внутривенно, подкожно, перорально, внутримышечно или интравентрикулярно.
В другом аспекте в настоящей заявке раскрыт способ доставки полезной нагрузки субъекту, нуждающемуся в этом, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества конъюгированного соединения или его фармацевтически приемлемой соли согласно настоящей заявке или фармацевтической композиции согласно настоящей заявке.
В другом аспекте в настоящей заявке раскрыт способ лечения заболевания у субъекта, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества конъюгированного соединения или его фармацевтически приемлемой соли согласно настоящей заявке или фармацевтической композиции согласно настоящей заявке.
В некоторых вариантах осуществления способ лечения заболевания у субъекта согласно настоящей заявке дополнительно включает введение одного или нескольких терапевтических средств в комбинации с конъюгированным соединением или его фармацевтически приемлемой солью или фармацевтической композицией.
В еще одном аспекте в настоящей заявке раскрыто применение конъюгированного соединения или его фармацевтически приемлемой соли согласно настоящей заявке или фармацевтической композиции согласно настоящей заявке в получении лекарственного средства для лечения заболевания у субъекта.
В еще одном аспекте в настоящей заявке раскрыто конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль согласно настоящей заявке или фармацевтическая композиция согласно настоящей заявке для лечения заболевания у субъекта.
В некоторых вариантах осуществления заболевание выбрано из группы, состоящей из рака, заболевания иммунной системы, сердечно-сосудистого заболевания, метаболического заболевания и неврологического заболевания.
В некоторых вариантах осуществления рак выбран из группы, состоящей из рака предстательной железы, рака молочной железы, рака легкого, рака почки, лейкоза, рака яичника, рака желудочно-кишечного тракта, рака матки, карциномы эндометрия, рака печени, рака толстой кишки, рака щитовидной железы, рака поджелудочной железы, колоректального рака, рака пищевода, рака кожи, лимфомы и множественной миеломы.
В некоторых вариантах осуществления заболевание иммунной системы представляет собой аутоиммунное заболевание. В некоторых вариантах осуществления аутоиммунное заболевание выбрано из группы, состоящей из заболевания соединительной ткани, системного склероза, ревматоидного артрита и системной красной волчанки.
В некоторых вариантах осуществления сердечно-сосудистое заболевание выбрано из группы, состоящей из стенокардии, инфаркта миокарда, инсульта, сердечного приступа, гипертонической болезни сердца, ревматической болезни сердца, кардиомиопатии, аритмии и врожденного порока сердца.
В некоторых вариантах осуществления метаболическое заболевание выбрано из группы, состоящей из диабета, подагры, ожирения, гипогликемии, гипергликемии и дислипидемии.
В некоторых вариантах осуществления неврологическое заболевание выбрано из группы, состоящей из болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, болезни Хантингтона, травмы головы, рассеянного склероза, головокружения, комы и эпилепсии.
Краткое описание графических материалов
На фиг. 1 показаны химические структурные формулы конъюгированных соединений CB-20B, CB-20BK, CB-60S, CB-60SK, CB-20C, CB-1020, CB-1320, CB-1820, CR19428, 20R-SM09, CB-20R, CB-18G, CR19426, CB-10S, CR19425 и CB-50S.
На фиг. 2A показана кривая связывания и эндоцитоза Cy5-pep-20BK различными клетками (сверху вниз: клетки LNCaP, клетки SKOV3, клетки DU145 и клетки NCI-H460) с течением времени. На фиг. 2B показана кривая связывания и эндоцитоза Cy5-pep-20AK различными клетками (сверху вниз: клетки LNCaP, клетки SKOV3, клетки DU145 и клетки NCI-H460) с течением времени.
На фиг. 3 показаны флуоресцентные изображения связывания и эндоцитоза Cy5-FA различными клетками с течением времени, где флуоресценция, показанная в виде сплошного круга, представляет собой флуоресценцию ядер клеток, а флуоресценция, распределенная в виде пятен, является флуоресценцией Cy5-FA.
На фиг. 4A показана подавляющая активность конъюгированного соединения CB-20BK в отношении увеличения численности указанных опухолевых клеток. На фиг. 4B показана подавляющая активность конъюгированного соединения CB-20B в отношении увеличения численности указанных опухолевых клеток. На фиг. 4C показана подавляющая активность конъюгированного соединения CB-10S в отношении увеличения численности указанных опухолевых клеток. На фиг. 4D показана подавляющая активность конъюгированного соединения CB-60S в отношении увеличения численности указанных опухолевых клеток. На фиг. 4E показана подавляющая активность конъюгированного соединения CB-60SK в отношении увеличения численности указанных опухолевых клеток. На фиг. 4F показана подавляющая активность конъюгированного соединения CB-18G в отношении увеличения численности указанных опухолевых клеток. На фиг. 4G показана подавляющая активность конъюгированного соединения CB-50S в отношении увеличения численности указанных опухолевых клеток.
На фиг. 5A-5E показаны опухолеподавляющие эффекты конъюгированного соединения CB-20BK у мышей.
На фиг. 6A-6C показаны опухолеподавляющие эффекты конъюгированного соединения CB-20B у мышей.
На фиг. 7A-7E показаны опухолеподавляющие эффекты конъюгированного соединения CB-18G у мышей.
На фиг. 8A-8B показаны эффекты для инъекции CBP-1018 в отношении значений объема опухоли для модели рака легкого на основе клеток LU2505 и для модели рака легкого на основе клеток LU1206.
Подробное описание вариантов осуществления
Хотя в настоящей заявке будут раскрыты различные аспекты и варианты осуществления, очевидно, что специалист в данной области техники может внести различные эквивалентные изменения и модификации в аспекты и варианты осуществления без отклонения от сущности и объема настоящей заявки. Различные аспекты и варианты осуществления, раскрытые в настоящей заявке, предназначены только для целей иллюстрации и не предназначены для ограничения, при этом истинный объем указан в прилагаемой формуле изобретения. Все публикации, патенты и заявки на патенты, цитируемые в настоящей заявке, включены посредством ссылки во всей своей полноте. Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют такое же значение, которое обычно понятно специалисту в данной области техники, к которой принадлежит настоящая заявка.
Используемые в данном документе и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа предусматривают ссылку на множественное число, если из контекста явно не следует иное. Формы единственного числа, термины "один или несколько" и "по меньшей мере один" могут использоваться в данном документе взаимозаменяемо. Также следует отметить, что термины "содержать/содержащий", "включать/включающий" и "иметь/имеющий" могут использоваться взаимозаменяемо.
Используемый в данном документе и в прилагаемой формуле изобретения термин "аналог" включает структурный аналог и функциональный аналог. Структурный аналог относится к классу соединений с подобными химическими структурами, которые могут содержать один или несколько отличающихся атомов или одну или несколько отличающихся функциональных групп. Функциональный аналог относится к классу соединений, которые обладают одинаковыми или подобными химическими, биологическими или фармакологическими эффектами. Например, аналоги фолата включают 5-метилтетрагидрофолат, 5-формилтетрагидрофолат, метотрексат и 5,10-метилентетрагидрофолат.
Используемый в данном документе и прилагаемой формуле изобретения термин "производное" относится к относительно сложному соединению, полученному из молекулы исходного соединения, в которой один или несколько атомов или групп атомов замещены другими атомами или группами атомов. Например, производные камптотецина включают иринотекан, SN-38, Dxd, топотекан, GI-147211C, топотекан, 9-аминокамптотецин, 7-гидроксиметилкамптотецин, 7-аминометилкамптотецин, 10-гидроксикамптотецин, (20S)-камптотецин, 9-нитрокамптотецин, гиматекан, каренитецин, силатекан, луртотекан, экзатекан, дифломотекан, белотекан, луртотекан и S39625.
В одном аспекте в настоящей заявке раскрыты конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль, содержащие полезную нагрузку и две нацеливающие молекулы, где двумя нацеливающими молекулами соответственно являются фрагмент, представляющий собой синергетическую молекулу, и фрагмент, представляющий собой лиганд к простатспецифическому мембранному антигену.
В другом аспекте в настоящей заявке раскрыты конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль, содержащие полезную нагрузку и две нацеливающие молекулы, где двумя нацеливающими молекулами соответственно являются фрагмент, представляющий собой синергетическую молекулу, и фрагмент, представляющий собой лиганд, представленный формулой (I):
В другом аспекте в настоящей заявке раскрыты конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль, содержащие полезную нагрузку и две нацеливающие молекулы, где двумя нацеливающими молекулами соответственно являются фрагмент, представляющий собой синергетическую молекулу, и P10, и полезная нагрузка представляет собой камптотецин или любое его производное.
Используемый в данном документе термин "полезная нагрузка" относится к молекуле или материалу, подлежащим доставке в клетку- или ткань-мишень. Без ограничения полезной нагрузкой может быть любая молекула или материал, предназначенные для применения в диагностике, лечении или предупреждении заболевания у субъекта. В некоторых вариантах осуществления полезная нагрузка имеет молекулярную массу, меньшую или равную приблизительно 5 кДа. В некоторых вариантах осуществления полезная нагрузка имеет молекулярную массу, меньшую или равную приблизительно 1,5 кДа. В некоторых вариантах осуществления полезная нагрузка представляет собой лекарственное средство или диагностический реагент, которые признаны безопасными и эффективными для применения соответствующими организациями по утверждению и регистрации лекарственных средств (такими как FDA, EMEA или NMPA).
В некоторых вариантах осуществления полезная нагрузка согласно настоящей заявке представляет собой низкомолекулярное соединение, нуклеотид (такой как ДНК, плазмидная ДНК, РНК, siRNA, антисмысловой олигонуклеотид и аптамер), пептид или белок (например, фермент). В некоторых вариантах осуществления полезная нагрузка представляет собой низкомолекулярное соединение.
В некоторых вариантах осуществления полезные нагрузки согласно настоящей заявке включают без ограничения противораковое лекарственное средство, радиоактивное вещество, витамин, лекарственное средство против СПИДа, антибиотик, иммунодепрессант, противовирусное лекарственное средство, ингибитор фермента, нейротоксин, опиоид, регулятор взаимодействия клетки с внеклеточным матриксом, вазодилататор, антигипертензивное средство, снотворное средство, антигистаминное средство, антиконвульсивное средство, миорелаксант, средство против болезни Паркинсона, антиконвульсивное средство и лекарственное средство для подавления мышечного сокращения, противопаразитарное лекарственное средство и/или антипротозойное лекарственное средство, обезболивающее лекарственное средство, жаропонижающее средство, стероидное или нестероидное противовоспалительное лекарственное средство, антиангиогенный фактор, угнетающий секрецию фактор, антикоагулянт и/или антитромботическое средство, местный анестетик, простагландин, антидепрессант, антипсихотик, противорвотное средство или средство для визуализации.
В некоторых вариантах осуществления полезная нагрузка согласно настоящей заявке имеет свободную амино- или карбоксильную группу перед конъюгированием с конъюгированным соединением согласно настоящей заявке, и полезную нагрузку конъюгируют с конъюгированным соединением посредством реакции ацилирования между упомянутой выше амино- или карбоксильной группой и соответствующей частью (например, линкером) конъюгированного соединения. В некоторых вариантах осуществления модификация вышеупомянутой свободной амино- или карбоксильной группы (например, путем конъюгирования с конъюгированным соединением согласно настоящей заявке) может значительно снизить активность полезной нагрузки (например, на по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 99%).
Используемый в данном документе термин "низкомолекулярное соединение" относится к соединению, имеющему молекулярную массу, меньшую или равную приблизительно 2 кДа. В некоторых вариантах осуществления низкомолекулярное соединение имеет молекулярную массу, меньшую или равную приблизительно 1,5 кДа. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления низкомолекулярное соединение имеет молекулярную массу, меньшую или равную приблизительно 1 кДа, 800 Да, 700 Да, 600 Да или 500 Да. В некоторых вариантах осуществления низкомолекулярное соединение согласно настоящей заявке выбрано из группы, состоящей из камптотецина и любого его производного (например, SN38 или Dxd), ауристатина и любого его производного (например, MMAE и MMAF), майтанзина и любого его производного, ингибитора циклооксигеназы-2 (например, целекоксиба), радионуклидного комплекса, паклитаксела и любого его производного, эпотилона и любого его производного, блеомицина и любого его производного, дактиномицина и любого его производного, пликамицина и любого его производного и митомицина C. В некоторых вариантах осуществления низкомолекулярное соединение представляет собой камптотецин или любое его производное, ауристатин или любое его производное, радионуклидный комплекс или ингибитор циклооксигеназы-2. В некоторых вариантах осуществления низкомолекулярное соединение, описанное в настоящей заявке, представляет собой лекарственное средство для облегчения проявлений или лечения рака. В некоторых вариантах осуществления низкомолекулярное соединение, описанное в настоящей заявке, представляет собой лекарственное средство для облегчения проявлений или лечения аутоиммунного заболевания.
Используемый в данном документе термин "камптотецин" относится к цитотоксическому алкалоиду, главным образом получаемому из Camptotheca acuminata (Nyssaceae) и проявляющему сильную противоопухолевую активность. Камптотецин и его производное согласно настоящей заявке включают камптотецин и его производное, которые уже существуют или будут получены в будущем. Камптотецин и его производное согласно настоящей заявке включают без ограничения камптотецин, иринотекан, SN-38, Dxd, топотекан, GI-147211C, топотекан, 9-аминокамптотецин, 7-гидроксиметилкамптотецин, 7-аминометилкамптотецин, 10-гидроксикамптотецин, (20S)-камптотецин, 9-нитрокамптотецин, гиматекан, каренитецин, силатекан, луртотекан, экзатекан, дифломотекан, белотекан, луртотекан и S39625.
Используемый в данном документе термин "ауристатин и любое его производное/ауристатин или любое его производное" относится к природному противоопухолевому продукту, представляющему собой аплизиатоксин 10, и ряду его производных, где такие соединения препятствуют самосборке компонентов на микроскопическом уровне с задержкой клеток в митотической фазе, что приводит к высокой клеточной летальности. Ауристатин и любое его производное согласно настоящей заявке включают ауристатин и любое его производное, которые уже существуют или будут получены в будущем. Ауристатин и его производное согласно настоящей заявке включают без ограничения ауристатин, монометилауристатин E (MMAE), монометилауристатин F (MMAF), монометилауристатин D (MMAD), AFP и AFHPA.
Используемый в данном документе термин "ингибитор циклооксигеназы-2" относится к классу специфических ингибиторов циклооксигеназы-2. Циклооксигеназа-2 участвует в развитии и инфильтрации злокачественных опухолей посредством ряда различных механизмов. Ингибиторы циклооксигеназы-2 могут обеспечивать подавление миграции и адгезии опухолевых клеток, а также внутрисосудистой инфильтрации, подавляя тем самым возникновение и развитие злокачественных опухолей. Ингибиторы циклооксигеназы-2 согласно настоящей заявке включают ингибиторы циклооксигеназы-2, которые уже существуют или будут получены в будущем. Ингибиторы циклооксигеназы-2 включают без ограничения целекоксиб, рофекоксиб, парекоксиб, валдекоксиб и эторикоксиб.
Используемый в данном документе термин "радионуклидный комплекс" относится к особому классу комплексов, содержащих радионуклиды, где хелатирующее средство в комплексе можно хелатировать радионуклидом, и оно может обеспечивать связующую часть, которая более стабильно связывается с веществом-мишенью. Используемый в данном документе термин "радионуклид" относится к элементу, который может спонтанно испускать излучение (такое как α-лучи, β-лучи или γ-лучи). Радионуклиды согласно настоящей заявке включают все радионуклиды для лечения и диагностики, которые уже существуют или будут получены в будущем. Радионуклиды согласно настоящей заявке включают без ограничения 67Cu, 64Cu, 90Y, 109Pd, 111Ag, 149Pm, 153Sm, 165Ho, 166Ho, 177Lu, 186Re, 188Re, 99mTc, 67Ga, 68Ga, 111In, 90Y, 177Lu, 186Re, 188Re, 197Au, 198Au, 199Au, 105Rh, 161Tb, 149Pm, 44Sc, 47Sc, 70As, 71As, 72As, 73As, 74As, 76As, 77As, 212Pb, 212Bi, 213Bi, 225Ac, 117mSn, 67Ga, 201Tl, 123I, 131I, 160Gd, 148Nd, 89Sr и 211At. В некоторых вариантах осуществления хелатирующее средство представляет собой макроциклическое хелатирующее средство. Хелатирующие средства согласно настоящей заявке включают без ограничения H2dedpa, H4octapa, H2azapa, DTPA, CHX-A''-DTPA, DTPA-бис-ангидрид, малеимид-DTPA, DTPA(tBu)4, DiamSar CB-TE2A, циклам, DO2A, DOTA, OTA-GA(tBu)4, малеимид-DOTA-GA, p-NCS-Bz-DOTA-GA, NH2-DOTA-GA, DOTA-GA-ангидрид, сложный эфир DOTA-трис(tBu), сложный эфир пропаргил-DOTA-трис(tBu), DO3AM-уксусная кислота, DO3AM-N-(2-аминоэтил)этанамид, DO3AtBu-N-(2-аминоэтил)этанамид, сложный DOTA-ди(tBu)-эфир, сложный NHS-эфир сложного DOTA-трис(tBu)-эфира, сложный DOTA-NHS-эфир, сложный пропаргил-DOTA-трис(tBu)-эфир, DOTADOTA-GA-ангидрид, DOTA-GA(tBu)4, p-NCS-Bz-DOTA-GA, NH2-DOTA-GA, малеимид-DOTA-GA, AGuIX, Gado-H, циклен, DO2AtBu, DO3AtBu, DO3AEt, DO3AM, DOTAEt, DOTPrEt, цис-глиоксаль-циклен, моно-N-бензил-циклен, транс-N-дибенил-циклен, TriBOC-циклен, моно-N-бензил-TACN, DiBOC-TACN, циклам с поперечными мостиками (CB-циклам), (13)анN4, TACN, TACN·3HCl, TACD, моно-N-бензил-TACD, DiBOC-TACD, 1,7-диокса-4,10-диазациклододекан, сложный C-метиловый эфир-циклам, C-карбоновую кислоту-циклам, транс-N-диметил-циклам, TETRAM, TETAEt, TETAMEt2, TETAMMe2, TETAM, CPTA, производные CB-циклама, CB-TE2A, метиламино-(13)анN4, бис-(13)анN4, оксо-(13)анN4, моно-N-бензил-(13)анN4, TriBOC-(13)анN4, TRITRAM, TRI3AEt, TRI3AtBu, TRITAM, TRITA, моно-N-бензил-циклам, формальдегид-циклам, цис-глиоксаль-циклам, диоксоциклам, оксоциклам, транс-N-дибензил-циклам, TriBOC-циклам, DOTP, DOTMA, TETA, DOTAM, DiAmSar, CB-циклам, CB-TE2A, NOTA, NOTAM, NH2-NODA-GA, йод-NODA-GA, NCS-MP-NODA, NH2-MPAA-NODA, NODA-GA(tBu)3, сложный NODA-GA-NHS-эфир, малеимид-NODA-GA, сложный NOTA-NHS-эфир, малеимид-NOTA, пропаргил-NOTA(tBu)2, p-NCS-бензил-NODA-GA, NOTA(tBu)2, NCS-MP-NODA, NH2-MPAA-NODA, NH2-NODA-GA, йод-NODA-GA и TACN.
В некоторых вариантах осуществления конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль согласно настоящей заявке содержат одну полезную нагрузку. В некоторых вариантах осуществления конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль согласно настоящей заявке содержат две или более полезных нагрузок. Например, конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль согласно настоящей заявке содержат 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более полезных нагрузок. В конъюгированном соединении, содержащем несколько полезных нагрузок, каждая из полезных нагрузок может быть идентична другим или отличаться друг от друга. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере две полезные нагрузки отличаются друг от друга.
Используемый в данном документе термин "нацеливающая молекула" относится к любой молекуле или фрагменту, способным нацеливать конъюгированное соединение согласно настоящей заявке на сайт-мишень, ткань-мишень, орган-мишень, клетку-мишень или внутриклеточную область-мишень. В некоторых вариантах осуществления нацеливающая молекула обеспечивает для конъюгированного соединения согласно настоящей заявке более высокий уровень распределения в сайте-мишени, ткани-мишени, органе-мишени, клетке-мишени или внутриклеточной области-мишени по сравнению с не являющимся мишенью сайтом, не являющейся мишенью тканью, не являющимся мишенью органом, не являющейся мишенью клеткой или не являющейся мишенью внутриклеточной областью, например, на по меньшей мере 10% более высокий, 20% более высокий, 50% более высокий, 80% более высокий, 100% более высокий, 150% более высокий, 200% более высокий, 300% более высокий, 400% более высокий, 500% более высокий уровень и т. д. В некоторых вариантах осуществления нацеливающая молекула обеспечивает для конъюгированного соединения, содержащего нацеливающую молекулу, по сравнению с конъюгированным соединением, не содержащим нацеливающую молекулу, более высокий уровень распределения в сайте-мишени, ткани-мишени, органе-мишени, клетке-мишени или внутриклеточной области-мишени, например, на по меньшей мере 10% более высокий, 20% более высокий, 50% более высокий, 80% более высокий, 100% более высокий, 150% более высокий, 200% более высокий, 300% более высокий, 400% более высокий, 500% более высокий уровень и т. д. В некоторых вариантах осуществления нацеливающая молекула может индуцировать или стимулировать специфическое связывание конъюгированного соединения, содержащего такие нацеливающие молекулы, с молекулой-мишенью, индуцировать или стимулировать эндоцитоз конъюгированного соединения клеткой-мишенью и индуцировать или стимулировать накопление конъюгированного соединения вблизи клетки-мишени и/или проникновение в клетку-мишень.
В некоторых вариантах осуществления конъюгированное соединение согласно настоящей заявке содержит по меньшей мере две нацеливающие молекулы. В некоторых вариантах осуществления две или более нацеливающие молекулы, содержащиеся в конъюгированном соединении согласно настоящей заявке, являются идентичными или различающимися. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере две нацеливающие молекулы из двух или более нацеливающих молекул, содержащихся в конъюгированном соединении согласно настоящей заявке, являются различающимися. В некоторых вариантах осуществления все из двух или более нацеливающих молекул, содержащихся в конъюгированном соединении согласно настоящей заявке, отличаются друг от друга. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере две нацеливающие молекулы из двух или более нацеливающих молекул, содержащихся в конъюгированном соединении согласно настоящей заявке, могут специфически связываться с разными белками или маркерами клеточной поверхности. В некоторых вариантах осуществления две или более нацеливающие молекулы, содержащиеся в конъюгированном соединении согласно настоящей заявке, могут специфически связываться с разными белками или маркерами клеточной поверхности.
В некоторых вариантах осуществления конъюгированное соединение согласно настоящей заявке содержит по меньшей мере две нацеливающие молекулы, по меньшей мере одна из которых является синергетической молекулой.
Используемый в данном документе термин "синергетическая молекула" относится к любой молекуле или фрагменту, которые способны действовать синергетическим образом совместно с другими нацеливающими молекулами, содержащимися в конъюгированном соединении согласно настоящей заявке, с обеспечением более высокого уровня индуцирования или стимулирования специфического связывания конъюгированного соединения с молекулой-мишенью, индуцирования или стимулирования эндоцитоза конъюгированного соединения клеткой-мишенью, индуцирования или стимулирования накопления конъюгированного соединения вблизи клетки-мишени, и/или проникновения в клетку-мишень, и/или другим образом обуславливаемого специфического связывания конъюгированного соединения с клеткой-мишенью и его сохранения. В некоторых вариантах осуществления синергетическая молекула обеспечивает для конъюгированного соединения согласно настоящей заявке более высокий уровень распределения в сайте-мишени, ткани-мишени, органе-мишени, клетке-мишени или внутриклеточной области-мишени по сравнению с не являющимся мишенью сайтом, не являющейся мишенью тканью, не являющимся мишенью органом, не являющейся мишенью клеткой или не являющейся мишенью внутриклеточной областью, например, на по меньшей мере 10% более высокий, 20% более высокий, 50% более высокий, 80% более высокий, 100% более высокий, 150% более высокий, 200% более высокий, 300% более высокий, 400% более высокий, 500% более высокий уровень и т. д. В некоторых вариантах осуществления синергетическая молекула обеспечивает для конъюгированного соединения, содержащего синергетическую молекулу, по сравнению с конъюгированным соединением, не содержащим синергетическую молекулу, более высокий уровень распределения в сайте-мишени, ткани-мишени, органе-мишени, клетке-мишени или внутриклеточной области-мишени, например, на по меньшей мере 10% более высокий, 20% более высокий, 50% более высокий, 80% более высокий, 100% более высокий, 150% более высокий, 200% более высокий, 300% более высокий, 400% более высокий, 500% более высокий уровень и т. д. В некоторых вариантах осуществления синергетическая молекула обеспечивает для конъюгированного соединения, содержащего синергетическую молекулу, по сравнению с конъюгированным соединением, не содержащим синергетическую молекулу, наличие более высокого уровня активности в отношении клетки-мишени, например, на по меньшей мере 10% более высокого, 20% более высокого, 50% более высокого, 80% более высокого, 100% более высокого, 150% более высокого, 200% более высокого, 300% более высокого, 400% более высокого, 500% более высокого уровня и т. д.
В некоторых вариантах осуществления синергетическая молекула согласно настоящей заявке представляет собой молекулу, взаимодействующую с клеткой.
Используемый в данном документе термин "молекула, взаимодействующая с клеткой" относится к молекуле, которая способна взаимодействовать с материалом клеточной поверхности клетки-мишени с индуцированием или стимулированием специфического связывания с клеткой конъюгированного соединения, содержащего такие молекулы, взаимодействующие с клеткой, с индуцированием или стимулированием эндоцитоза конъюгированного соединения клеткой-мишенью и/или индуцированием или стимулированием накопления конъюгированного соединения вблизи клетки-мишени и/или проникновения в клетку-мишень.
Молекула, взаимодействующая с клеткой, может быть молекулой низкомолекулярного химического соединения или крупной биомолекулой. В некоторых вариантах осуществления молекула, взаимодействующая с клеткой, является низкомолекулярным соединением или полипептидом. В некоторых вариантах осуществления молекула, взаимодействующая с клеткой, является низкомолекулярным соединением или полипептидом, содержащим 2-50, 2-40, 2-30, 2-25, 2-22, 2-20, 2-18, 2-15, 2-12, 2-10, 2-8, 4-50, 5-50, 5-40, 5-30, 5-25, 5-22, 5-20, 5-18, 5-15, 5-12, 5-10, 6, 7, 8, или 9 аминокислот.
В некоторых вариантах осуществления нацеливающая молекула представляет собой лиганд, способный связываться с рецептором или другими молекулами на клеточной поверхности. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна из нацеливающих молекул представляет собой лиганд, способный связываться с рецептором или другими молекулами на клеточной поверхности.
Лиганды согласно настоящей заявке могут включать ряд различных химических или биологических молекул, которые могут обладать специфической аффинностью связывания по отношению к выбранной мишени, где выбранной мишенью может являться, например, рецептор клеточной поверхности, антиген клеточной поверхности, клетка, ткань, орган и т. д. В некоторых вариантах осуществления лиганд может специфически связываться с белком или маркером, экспрессированным на поверхности клетки-мишени. В некоторых вариантах осуществления лиганд согласно настоящей заявке связывается с белком или маркером клеточной поверхности с аффинностью 10-6-10-11 M (значение Kd). В некоторых вариантах осуществления лиганд согласно настоящей заявке связывается с белком или маркером клеточной поверхности с аффинностью по меньшей мере 10-7, по меньшей мере 10-8 и по меньшей мере 10-9 M (значение Kd). В некоторых вариантах осуществления лиганд согласно настоящей заявке связывается с белком или маркером клеточной поверхности с аффинностью менее 10-6, менее 10-7 и менее 10-8 M (значение Kd). В некоторых вариантах осуществления лиганд согласно настоящей заявке связывается с белком или маркером клеточной поверхности с определенной аффинностью, где определенная аффинность относится к аффинности лиганда к белку-мишени или маркеру-мишени на клеточной поверхности, которая по меньшей мере в два, три, четыре, пять, шесть, восемь, десять, двадцать, пятьдесят, сто или более раз выше, чем аффинность к не являющимся мишенями белку или маркеру клеточной поверхности. В некоторых вариантах осуществления экспрессия белка или маркера клеточной поверхности согласно настоящей заявке в клетках-мишенях (например, раковых клетках) значительно выше, чем в нормальных клетках. Используемый в данном документе термин "значительно" относится к статистически значимым различиям или значительным различиям, которые могут быть распознаны специалистом в данной области.
В некоторых вариантах осуществления уровень экспрессии белка или маркера клеточной поверхности согласно настоящей заявке в клетках-мишенях (например, раковых клетках) в 2-1000000 раз выше, чем в нормальных клетках; например, уровень экспрессии в клетках-мишенях (например, раковых клетках) в 2-10, 2-100, 2-1000, 2-10000, 2-100000 или 2-1000000 (что может быть равно любому значению в пределах вышеуказанного числового диапазона, и при этом включая конечные значения этого диапазона) раз выше, чем в нормальных клетках. В некоторых вариантах осуществления уровень экспрессии рецептора клеточной поверхности в клетках-мишенях (например, раковых клетках) по меньшей мере в 10 раз выше, или в 100 раз выше, или в 1000 раз выше, или в 10000 раз выше, или в 100000 раз выше, чем в нормальных клетках. В некоторых вариантах осуществления по сравнению с уровнем белка или маркера клеточной поверхности на клетках-мишенях (например, раковых клетках) уровень рецептора клеточной поверхности на нормальных клетках снижен на по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99%. В некоторых вариантах осуществления белок или маркер клеточной поверхности, описанные в настоящей заявке, не поддаются обнаружению в нормальных клетках.
В некоторых вариантах осуществления белок или маркер клеточной поверхности согласно настоящей заявке является рецептором клеточной поверхности.
В некоторых вариантах осуществления рецептор клеточной поверхности согласно настоящей заявке выбран из группы, состоящей из рецептора трансферрина (TFR), рецептора липопротеинов низкой плотности (LDLR), фолатного рецептора (FR), рецептора гормона, ингибирующего гормон роста, рецептора киназы мочевой кислоты, рецептора фактора некроза опухоли (TNFR), рецептора интегрина (LFA-1), рецептора SST-14 (SSTR2), рецептора GNRH (GNRHR), рецептора TRPV6 и интегрина α.
В некоторых вариантах осуществления белок или маркер клеточной поверхности согласно настоящей заявке представляет собой антиген клеточной поверхности.
В некоторых вариантах осуществления антиген клеточной поверхности согласно настоящей заявке выбран из группы, состоящей из простатспецифического мембранного антигена, муцина MUC1, общего антигена острого лимфобластного лейкоза, антигена клеточной поверхности Thy-1, белка мелан-А, антигена плоскоклеточной карциномы, галектина 3 и антигена лейкоцитов человека.
В некоторых вариантах осуществления молекула, взаимодействующая с клеткой, согласно настоящей заявке может связываться с молекулой, выбранной из группы, состоящей из FOLR1, TRPV6, FOLH1 (PMSA), GNRHR, Her2, Trop2, Her3, NECTIN4, LRP1, GLUT1, EGFR1, AXL, CA9, CD44, клаудина 18.2, APN, DLL3, CEACAM5, FZD10, TFRC, MET, IGFR1, SSTR2, CCKBR, LFA1, ICAM, GPR87, GM-CSF, GM-CSFR, TIM3, членов семейства TLR, CD40, CD40L, OX40, OX40L, GITRL, GITR, 4-BBL, 4-1BB, CD70, CD27, ICOSL, ICOS, HHLA2, CD28, CD86/80, CD28, антигена MHCII, TCR, CTLA-4, CD155, CD122, CD113, IGIT, PD-L1, PD1, галектина-9, TIM-3, HVEM, BTLA, CD160, VISTA, B7-H4, B7-H3, фосфатидилсерина, HHLA2, LAG3, галектина-3, LILRB4, SIGLEC15, NKG2A, NKG2D, SLAMF7, KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, FGFR1, FGFR2, FGFR4, NeuGcGM3 и CXCR4.
В некоторых вариантах осуществления конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль согласно настоящей заявке содержат фрагмент, представляющий собой лиганд к простатспецифическому мембранному антигену, и фрагмент, представляющий собой синергетическую молекулу, где фрагмент, представляющий собой синергетическую молекулу, связывается с молекулой, выбранной из группы, состоящей из FOLR1, TRPV6, FOLH1 (PMSA), SSTR2 и GNRHR.
В некоторых вариантах осуществления конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль согласно настоящей заявке содержат фрагмент, представляющий собой лиганд, представленный формулой (I), и фрагмент, представляющий собой синергетическую молекулу, где фрагмент, представляющий собой синергетическую молекулу, связывается с молекулой, выбранной из группы, состоящей из FOLR1, TRPV6, SSTR2 и GNRHR.
В некоторых других вариантах осуществления конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль согласно настоящей заявке содержат P10 и фрагмент, представляющий собой синергетическую молекулу, где синергетическая молекула связывается с молекулой, выбранной из группы, состоящей из FOLR1, TRPV6, FOLH1 (PMSA) и GNRHR.
В некоторых вариантах осуществления одна из синергетических молекул в конъюгированном соединении или его фармацевтически приемлемой соли согласно настоящей заявке представлена фрагментом, представляющим собой молекулу, способствующую эндоцитозу, которая способна опосредовать эндоцитоз. Используемый в данном документе термин "эндоцитоз" означает, что конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль взаимодействуют с клеткой-мишенью, а затем способны опосредовать свой собственный эндоцитоз, интернализацию или захват клеткой-мишенью. Используемый в данном документе термин "молекула, способствующая эндоцитозу" относится к молекуле, которая взаимодействует с клеткой-мишенью, а затем способна опосредовать эндоцитоз, интернализацию или захват конъюгированного соединения или его фармацевтически приемлемой соли согласно настоящей заявке клеткой-мишенью.
В некоторых вариантах осуществления молекула, способствующая эндоцитозу, выбрана из группы, состоящей из фолата и его аналога, пептида, способного опосредовать эндоцитоз, и проникающего в клетку пептида.
В некоторых вариантах осуществления молекула, способствующая эндоцитозу, согласно настоящей заявке представляет собой фолат или его аналог.
Фолат применим для образования химической связи с другими группами вследствие его небольшой молекулярной массы, неиммуногенности и хорошей стабильности. Фолат может с высокой аффинностью связываться с фолатным рецептором, экспрессированным на клеточной поверхности, с опосредованием клеточного захвата фолата. Хотя фолатный рецептор экспрессируется на очень низком уровне в большинстве нормальных клеток, он экспрессируется на высоком уровне во многих раковых клетках, чтобы удовлетворить высокую потребность быстро делящихся клеток в фолате в условиях его низкого содержания (см. Kelemen LE, Int J Cancer, 2006; 119:243-50; Kane MA, et al., J Clin Invest. 1988; 81: 1398-406; Matsue H, et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1992; 89: 6006-9; Zhao R, et al., Annu Rev Nutr. 2011; 31: 177-201). Фолат способен специфически связываться с фолатным рецептором на поверхности клетки, а также опосредовать эндоцитоз конъюгированного соединения или его фармацевтически приемлемой соли в клетки-мишени.
В некоторых вариантах осуществления аналог фолата выбран из группы, состоящей из 5-метилтетрагидрофолата, 5-формилтетрагидрофолата, метотрексата и 5,10-метилентетрагидрофолата.
В некоторых вариантах осуществления молекула, способствующая эндоцитозу, представляет собой пептид, способный опосредовать эндоцитоз.
В некоторых вариантах осуществления пептид, способный опосредовать эндоцитоз, содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 и Arg-Gly-Asp (называемой RGD), а также гомологичных пептидов, характеризующихся по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% гомологией аминокислотной последовательности с любой из SEQ ID NO: 16-18, где гомологичные пептиды являются функциональными эквивалентами пептидов, указанных под SEQ ID NO: 16-18 соответственно.
В некоторых вариантах осуществления пептид, способный опосредовать эндоцитоз, как описано в настоящей заявке, предусматривает консервативную аминокислотную замену только в одном аминокислотном сайте по сравнению с последовательностями под SEQ ID NO: 16-20 и RGD. В некоторых вариантах осуществления пептид, способный опосредовать эндоцитоз, как описано в настоящей заявке, предусматривает консервативную аминокислотную замену в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных сайтах по сравнению с последовательностями под SEQ ID NO: 16-20.
При условии, что это не влияет на его биологическую активность, пептид, способный опосредовать эндоцитоз, как описано в настоящей заявке, может также содержать не встречающиеся в природе аминокислоты, включая, например, β-фтораланин, 1-метилгистидин, γ-метиленглутаминовую кислоту, α-метиллейцин, 4,5-дегидролизин, гидроксипролин, 3-фторфенилаланин, 3-аминотирозин, 4-метилтриптофан и т. п.
Процент гомологии можно определить различными способами, хорошо известными в данной области. Например, сравнение последовательностей может быть достигнуто с помощью следующих общедоступных инструментов: программного обеспечения BLASTp (доступно на веб-сайте Национального центра биотехнологической информации (NCBI): http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi; также см.: Altschul S.F. et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990); Stephen F. et al, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997)), ClustalW2 (доступно на сайте Европейского института биоинформатики: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/; также см.: Higgins D.G. et al., Methods in Enzymology, 266:383-402 (1996); Larkin M.A. et al., Bioinformatics (Oxford, England), 23(21): 2947-8 (2007)), а также Tcoffee (доступно на сайте Шведского института биоинформатики; также см.: Poirot O. et al., Nucleic Acids Res., 31(13): 3503-6 (2003); Notredame C. et al., J. Mol. Boil., 302(1): 205-17 (2000)). Если выравнивание последовательностей выполняют с использованием программного обеспечения, можно использовать параметры по умолчанию, доступные в программном обеспечении, или в противном случае можно настроить параметры в соответствии с целью выравнивания. Все это находится в пределах знаний специалиста в данной области.
Используемый в данном документе термин "функциональный эквивалент" относится к производному пептиду, который сохраняет биологическую активность, по существу аналогичную активности исходной пептидной последовательности, из которой происходит производный пептид. Функциональный эквивалент может быть природным производным или являться полученным синтетическим путем. Примеры функциональных эквивалентов включают аминокислотные последовательности, предусматривающие замены, делеции или добавления одной или нескольких аминокислот, при условии, что биологическая активность пептида сохраняется. Аминокислота, используемая для замены, желательно обладает химико-физическими свойствами, аналогичными таковым у заменяемой аминокислоты. Желательные аналогичные химико-физические свойства включают сходство зарядов, объемность, гидрофобность, гидрофильность и тому подобное.
В некоторых вариантах осуществления функциональные эквиваленты включают консервативную замену аминокислотного остатка. Консервативная замена аминокислотного остатка относится к замене, происходящей между аминокислотами со схожими свойствами, например, замене между полярными аминокислотами (например, замене между глутамином и аспарагином), замене между гидрофобными аминокислотами (например, замене между лейцином, изолейцином, метионином и валином), замене между аминокислотами с одинаковыми зарядами (например, замене между аргинином, лизином и гистидином или замене между глутаминовой кислотой и аспарагиновой кислотой) и т. д.
В некоторых вариантах осуществления молекула, способствующая эндоцитозу, представляет собой проникающий в клетку пептид. Проникающие в клетку пептиды (CPP), также известные как домены белковой трансдукции (PTD), представляют собой короткие пептиды (обычно менее 40 аминокислот), способные проникать внутрь клетки независимым от рецептора образом. Проникающие в клетку пептиды при конъюгировании с полезными нагрузками способны опосредовать трансмембранный транспорт полезных нагрузок и обладают активностью белковой трансдукции. В некоторых вариантах осуществления проникающий в клетку пептид, описанный в настоящей заявке, выбран из группы, состоящей из пептида, обеспечивающего хоминг по отношению к опухоли, проникающего в митохондрии пептида, активируемого проникающего в клетку пептида и антибактериального пептида. В некоторых вариантах осуществления проникающий в клетку пептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 19 (RRRRRRRRR, называемой R9) и SEQ ID NO: 20 (GRKKRRQRRRPPQ, которая представляет собой пептид Tat, т. е. проникающий в клетку пептид на основе белка-трансактиватора транскрипции HIV).
В некоторых вариантах осуществления одна нацеливающая молекула в конъюгированном соединении или его фармацевтически приемлемой соли согласно настоящей заявке является фрагментом, представляющим собой лиганд к простатспецифическому мембранному антигену.
Используемый в данном документе термин "простатспецифический мембранный антиген" относится к трансмембранному гликопротеину типа Ⅱ, который присутствует в мембране эпителиальных клеток предстательной железы и состоит из 750 аминокислот, предусматривающих 19 аминокислот во внутриклеточной области, 24 аминокислоты в трансмембранной области и 707 аминокислот во внеклеточной области. Простатспецифический мембранный антиген экспрессируется в нормальных эпителиальных клетках предстательной железы, но на гораздо более высоком уровне экспрессируется в клетках рака предстательной железы. По сравнению с традиционным простатспецифическим антигеном, используемым для клинического обнаружения, простатспецифический мембранный антиген является более чувствительным и специфическим опухолевым маркером рака предстательной железы, и, в частности, он экспрессируется на высоком уровне как при гормонрезистентном раке предстательной железы, так и при метастатических поражениях рака предстательной железы, а также обладает высокой чувствительностью и специфичностью применительно к выявлению различий между раком предстательной железы и другими типами злокачественных опухолей. Более того, в ряде различных не относящихся к предстательной железе солидных опухолей (таких как рак легкого, рак мочевого пузыря, рак желудочно-кишечного тракта, рак поджелудочной железы, рак почки и колоректальный рак) простатспецифический мембранный антиген также на высоком уровне и специфически экспрессируется на эндотелиальных клетках сосудов опухоли.
Используемый в данном документе термин "лиганд к простатспецифическому мембранному антигену" относится к антителу, аптамеру и малой молекуле, которые способны специфически распознавать и связываться с простатспецифическим мембранным антигеном. Лиганды к простатспецифическому мембранному антигену согласно настоящей заявке включают лиганды к простатспецифическому мембранному антигену, которые уже существуют или будут получены в будущем, а также фрагменты вышеупомянутых лигандов при условии, что эти фрагменты все еще сохраняют способность связываться с простатспецифическим мембранным антигеном. Лиганды на основе антител являются наиболее распространенными лигандами к простатспецифическому мембранному антигену, которые включают без ограничения моноклональные антитела J591, J533, J415 и E99 (например, см. Liu H, Rajasekaran AK, Moy P et al. Constitutive and antibody-induced internalization of prostate-specific memberane antigen [J]. Cancer Res, 1998, 58 (18): 4055-4060). Аптамер представляет собой однонитевую ДНК или РНК, которую получают путем технического скрининга с помощью системы экспоненциального обогащения лигандами, и может связываться с простатспецифическими мембранными антигенами с высокой аффинностью и высокой специфичностью. Такие лиганды к простатспецифическому мембранному антигену включают без ограничения аптамер xPSM-A10 и его производное, а также аптамер xPSM-A9 и его производное (например, см. Lupoid SE et al., Identification and Characterization of nuclease-stabilized RNA molecules that bind human prostate cancer cells via the prostate-specific membrane antigen, Cncer Res, 2002, 62(14):4029-4033). По сравнению с лигандами на основе антител и лигандами на основе аптамеров низкомолекулярные лиганды к простатспецифическому мембранному антигену обладают преимуществами небольшой молекулярной массы, высокой проницаемости, низкой иммуногенности и простоты синтеза и включают без ограничения низкомолекулярные лиганды на основе глутаминмочевины и фосфорамидатные низкомолекулярные лиганды.
В некоторых вариантах осуществления низкомолекулярные лиганды к простатспецифическому мембранному антигену согласно настоящей заявке могут быть выбраны из группы, состоящей из 2-[[метилгидроксифосфинил]метил]глутаровой кислоты; 2-[[этилгидроксифосфинил]метил]глутаровой кислоты; 2-[[пропилгидроксифосфинил]метил]глутаровой кислоты; 2-[[бутилгидроксифосфинил]метил]глутаровой кислоты; 2-[[циклогексилгидроксифосфинил]метил]глутаровой кислоты; 2-[[фенилгидроксифосфинил]метил]глутаровой кислоты; 2-[[2-(тетрагидрофуранил)гидроксифосфинил]метил]глутаровой кислоты; 2-[[(2-тетрагидропиранил)гидроксифосфинил]метил]глутаровой кислоты; 2-[[((4-пиридил)метил)гидроксифосфинил]метил]глутаровой кислоты; 2-[[((2-пиридил)метил)гидроксифосфинил]метил]глутаровой кислоты; 2-[[(фенилметил)гидроксифосфинил]метил]глутаровой кислоты; 2-[[((2-фенилэтил)метил)гидроксифосфинил]метил]глутаровой кислоты; 2-[[((3-фенилпропил)метил)гидроксифосфинил]метил]глутаровой кислоты; 2-[[((3-фенилбутил)метил)гидроксифосфинил]метил]глутаровой кислоты; 2-[[((2-фенилбутил)метил)гидроксифосфинил]метил]глутаровой кислоты; 2-[[(4-фенилбутил)гидроксифосфинил]метил]глутаровой кислоты и 2-[[(аминометил)гидроксифосфинил]метил]глутаровой кислоты; 2-[[метилгидроксифосфинил]окси]глутаровой кислоты; 2-[[этилгидроксифосфинил]окси]глутаровой кислоты; 2-[[пропилгидроксифосфинил]окси]глутаровой кислоты; 2-[[бутилгидроксифосфинил]окси]глутаровой кислоты; 2-[[фенилгидроксифосфинил]окси]глутаровой кислоты; 2-[[((4-пиридил)метил)гидроксифосфинил]окси]глутаровой кислоты; 2-[[((2-пиридил)метил)гидроксифосфинил]окси]глутаровой кислоты; 2-[[(фенилметил)гидроксифосфинил]окси]глутаровой кислоты и 2[[((2-фенилэтил)метил)гидроксифосфинил]окси]глутаровой кислоты; 2-[[(n-гидроксил)карбамоил]метил]глутаровой кислоты; 2-[[(n-гидроксил-n-метил)карбамоил]метил]глутаровой кислоты; 2-[[(n-бутил-n-гидроксил)карбамоил]метил]глутаровой кислоты; 2-[[(n-бензил-n-гидроксил)карбамоил]метил]глутаровой кислоты; 2-[[(n-гидроксил-n-фенил)карбамоил]метил]глутаровой кислоты; 2-[[(n-гидроксил-n-2-фенилэтил)карбамоил]метил]глутаровой кислоты; 2-[[(n-этил-n-гидроксил)карбамоил]метил]глутаровой кислоты; 2-[[(n-гидроксил-n-пропил)карбамоил]метил]глутаровой кислоты; 2-[[(n-гидроксил-n-3-фенилпропил)карбамоил]метил]глутаровой кислоты; 2-[[(n-гидроксил-n-4-пиридил)карбамоил]метил]глутаровой кислоты; 2-[[(n-гидроксил)амид]метил]глутаровой кислоты; 2-[[n-гидроксил(метил)амид]метил]глутаровой кислоты; 2-[[n-гидроксил(бензил)амид]метил]глутаровой кислоты; 2-[[n-гидроксил(фенил)амид]метил]глутаровой кислоты; 2-[[n-гидроксил(2-фенилэтил)амид]метил]глутаровой кислоты; 2-[[n-гидроксил(этил)амид]метил]глутаровой кислоты; 2-[[n-гидроксил(пропил)амид]метил]глутаровой кислоты; 2-[[n-гидроксил(3-фенилпропил)амид]метил]глутаровой кислоты и 2-[[n-гидроксил(4-пиридил)амид]метил]глутаровой кислоты; 2-[(тионил)метил]глутаровой кислоты; 2-[(метилтионил)метил]глутаровой кислоты; 2-[(этилтионил)метил]глутаровой кислоты; 2-[(пропилтионил)метил]глутаровой кислоты; 2-[(бутилтионил)метил]глутаровой кислоты; 2-[(фенилтионил]метил]глутаровой кислоты; 2-[[(2-фенилэтил)тионил]метил]глутаровой кислоты; 2-[[(3-фенилпропил)тионил]метил]глутаровой кислоты; 2-[[(4-пиридил)тионил]метил]глутаровой кислоты; 2-[(бензилтионил)метил]глутаровой кислоты; 2-[(сульфонил)метил]глутаровой кислоты; 2-[(метилсульфонил)метил]глутаровой кислоты; 2-[(этилсульфонил)метил]глутаровой кислоты; 2-[(пропилсульфонил)метил]глутаровой кислоты; 2-[(бутилсульфонил)метил]глутаровой кислоты; 2-[(фенилсульфонил]метил]глутаровой кислоты; 2-[[(2-фенилэтил)сульфонил]метил]глутаровой кислоты; 2-[[(3-фенилпропил)сульфонил]метил]глутаровой кислоты; 2-[[(4-пиридил)сульфонил]метил]глутаровой кислоты; 2-[(бензилсульфонил)метил]глутаровой кислоты; 2-[(сульфоксиминил)метил]глутаровой кислоты; 2-[(метилсульфоксиминил)метил]глутаровой кислоты; 2-[(этилсульфоксиминил)метил]глутаровой кислоты; 2-[(пропилсульфоксиминил)метил]глутаровой кислоты; 2-[(бутилсульфоксиминил)метил]глутаровой кислоты; 2-[(фенилсульфоксиминил]метил]глутаровой кислоты; 2-[[(2-фенилэтил)сульфоксиминил]метил]глутаровой кислоты; 2-[[(3-фенилпропил)сульфоксиминил]метил]глутаровой кислоты; 2-[[(4-пиридил)сульфоксиминил]метил]глутаровой кислоты и 2-[(бензилсульфоксиминил)метил]глутаровой кислоты; n-[метилгидроксифосфинил]глутаминовой кислоты; n-[этилгидроксифосфинил]глутаминовой кислоты; n-[пропилгидроксифосфинил]глутаминовой кислоты; n-[бутилгидроксифосфинил]глутаминовой кислоты; n-[фенилгидроксифосфинил]глутаминовой кислоты; n-[(фенилметил)гидроксифосфинил]глутаминовой кислоты; n-[((2-фенилэтил)метил)гидроксифосфинил]глутаминовой кислоты и N-метил-N-[фенилгидроксифосфинил]глутаминовой кислоты. Лиганды к простатспецифическому мембранному антигену согласно настоящей заявке также включают все низкомолекулярные лиганды к простатспецифическому мембранному антигену, раскрытые в заявках согласно РСТ WO 2010/108125 и WO 2006/093991, причем две вышеупомянутые заявки на патенты включены в данный документ во всей своей полноте.
В некоторых вариантах осуществления низкомолекулярный лиганд к простатспецифическому мембранному антигену согласно настоящей заявке представляет собой производное глутаровой кислоты. В некоторых вариантах осуществления низкомолекулярный лиганд к простатспецифическому мембранному антигену согласно настоящей заявке представляет собой аминокарбонильное производное глутаровой кислоты.
В некоторых вариантах осуществления низкомолекулярный лиганд к простатспецифическому мембранному антигену согласно настоящей заявке имеет следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления лиганд к простатспецифическому мембранному антигену, содержащийся в конъюгированном соединении или его фармацевтически приемлемой соли, имеет следующую структуру:
.
В некоторых вариантах осуществления лиганд к простатспецифическому мембранному антигену, содержащийся в конъюгированном соединении или его фармацевтически приемлемой соли, имеет следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления лиганд к простатспецифическому мембранному антигену, содержащийся в конъюгированном соединении или его фармацевтически приемлемой соли, имеет следующую структуру:
.
В некоторых вариантах осуществления лиганд к простатспецифическому мембранному антигену, содержащийся в конъюгированном соединении или его фармацевтически приемлемой соли, имеет следующую структуру:
В некоторых вариантах осуществления одна нацеливающая молекула в конъюгированном соединении или его фармацевтически приемлемой соли согласно настоящей заявке является фрагментом, представляющим собой лиганд, представленный формулой (I):
или фрагментом, представляющим собой лиганд, характеризующимся по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85% или по меньшей мере 90% гомологией аминокислотной последовательности по отношению к нему, или предусматривающим не более 3, 2 или 1 аминокислотной замены (например, консервативных замен) относительно него.
В некоторых вариантах осуществления одна нацеливающая молекула в конъюгированном соединении или его фармацевтически приемлемой соли согласно настоящей заявке представляет собой P10 или фрагмент, представляющий собой лиганд, характеризующийся по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92% или по меньшей мере 93% гомологией аминокислотной последовательности по отношению к нему, или предусматривающий не более 3, 2 или 1 аминокислотной замены (например, консервативных замен) относительно него.
Используемый в данном документе термин "P10" относится к пептиду, имеющему аминокислотную последовательность Cys-Lys-Glu-Phe-Leu-His-Pro-Ser-Lys-Val-Asp-Leu-Pro-Arg.
В некоторых вариантах осуществления конъюгированное соединение согласно настоящей заявке содержит нацеливающие молекулы, выбранные из группы, состоящей из (1) лиганда к фолатному рецептору и лиганда к простатспецифическому мембранному антигену; (2) лиганда к TRPV6 и лиганда к простатспецифическому мембранному антигену; (3) лиганда к GNRHR и лиганда к простатспецифическому мембранному антигену; (4) лиганда к SSTR2 и лиганда к простатспецифическому мембранному антигену; (5) лиганда к фолатному рецептору и лиганда к SSTR2 или (6) лиганда к TRPV6 и лиганда к фолатному рецептору.
В некоторых вариантах осуществления две нацеливающие молекулы в конъюгированном соединении или его фармацевтически приемлемой соли, предусмотренных в настоящей заявке, являются фрагментом, представляющим собой синергетическую молекулу, и фрагментом, представляющим собой лиганд к простатспецифическому мембранному антигену, соответственно. В некоторых вариантах осуществления синергетическая молекула способна опосредовать эндоцитоз. В некоторых вариантах осуществления две нацеливающие молекулы в конъюгированном соединении или его фармацевтически приемлемой соли, предусмотренных в настоящей заявке, являются фолатом или его аналогом и фрагментом, представляющим собой лиганд к простатспецифическому мембранному антигену, соответственно. Не желая ограничиваться теорией, выбирают конкретные фолат или его аналог и фрагмент, представляющий собой лиганд к простатспецифическому мембранному антигену, которые имеют лучшую стабильность, чем комбинации лигандов, представленные в предшествующем уровне техники.
В некоторых вариантах осуществления две нацеливающие молекулы в конъюгированном соединении или его фармацевтически приемлемой соли, предусмотренных в настоящей заявке, являются фрагментом, представляющим собой синергетическую молекулу, и фрагментом, представляющим собой лиганд, представленный формулой (I), соответственно. В некоторых вариантах осуществления синергетическая молекула способна опосредовать эндоцитоз. В некоторых вариантах осуществления две нацеливающие молекулы в конъюгированном соединении или его фармацевтически приемлемой соли, предусмотренных в настоящей заявке, являются фолатом или его аналогом и фрагментом, представляющим собой лиганд, представленный формулой (I), соответственно.
В некоторых вариантах осуществления две нацеливающие молекулы в конъюгированном соединении или его фармацевтически приемлемой соли, предусмотренных в настоящей заявке, являются фрагментом, представляющим собой синергетическую молекулу, и P10 соответственно. В некоторых вариантах осуществления синергетическая молекула способна опосредовать эндоцитоз. В некоторых вариантах осуществления две нацеливающие молекулы в конъюгированном соединении или его фармацевтически приемлемой соли, предусмотренных в настоящей заявке, являются фолатом или его аналогом и P10 соответственно.
В некоторых вариантах осуществления конъюгированное соединение, предусмотренное в настоящей заявке, содержит только одну полезную нагрузку, конъюгированную с двумя нацеливающими молекулами. В некоторых вариантах осуществления конъюгированное соединение, предусмотренное в настоящей заявке, содержит несколько полезных нагрузок, конъюгированных с двумя нацеливающими молекулами.
Используемый в данном документе термин "конъюгированный" относится к связыванию посредством ковалентной связи двух химических групп, либо непосредственно образуя ковалентную связь между двумя химическими группами, либо опосредованно связывая две химические группы посредством линкера.
В некоторых вариантах осуществления конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль содержат полезную(-ые) нагрузку(-и) (например, 1 полезную нагрузку) и две нацеливающие молекулы, при этом полезная нагрузка непосредственно ковалентно связана с по меньшей мере одной из нацеливающих молекул. В некоторых вариантах осуществления полезная нагрузка непосредственно ковалентно связана с двумя нацеливающими молекулами.
В некоторых вариантах осуществления конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль содержат полезную(-ые) нагрузку(-и) (например, 1 полезную нагрузку) и две нацеливающие молекулы, при этом полезная нагрузка ковалентно связана с по меньшей мере одной из нацеливающих молекул посредством линкера. В некоторых вариантах осуществления полезная нагрузка ковалентно связана с двумя нацеливающими молекулами посредством линкера.
Используемый в данном документе термин "линкер" относится к молекуле или фрагменту, которые ковалентно связывают полезную нагрузку с нацеливающей молекулой. Линкеры содержат функциональную группу для связывания полезной нагрузки с по меньшей мере одной нацеливающей молекулой. В некоторых вариантах осуществления функциональная группа может содержать два реакционноспособных фрагмента, причем один предназначается для связывания с полезной нагрузкой, а другой предназначается для связывания с нацеливающей молекулой. В некоторых вариантах осуществления функциональные группы отличаются друг от друга. В некоторых вариантах осуществления функциональные группы предусматривают группу, содержащую фрагмент, вступающий в реакцию с тиолом, и фрагмент, вступающий в реакцию с амином. В некоторых вариантах осуществления функциональные группы идентичны друг другу. В некоторых вариантах осуществления функциональные группы представляют собой малеимидные группы. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления карбоновая кислота в аминокислоте, содержащейся в линкере, является амидированной. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит полиэтиленгликоль с короткой цепью (например, содержащий 2-10, 2-8, 3-8, 4-8, 4-7, 4-6 или 5 повторяющихся звеньев).
В некоторых вариантах осуществления линкер согласно настоящей заявке представляет собой мультивалентный линкер, способный связываться с по меньшей мере одной (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше) полезной нагрузкой и по меньшей мере одной нацеливающей молекулой. Полезные нагрузки, связанные с мультивалентным линкером, могут быть идентичными или различающимися, и нацеливающие молекулы, связанные с мультивалентным линкером, могут быть идентичными или различающимися.
В одном аспекте линкер должен быть достаточно стабильным, чтобы избежать непреднамеренного высвобождения полезных нагрузок в ходе циркуляции в кровотоке для увеличения эффективного количества полезных нагрузок, доставляемых к клеткам-мишеням или тканям-мишеням, а также во избежание токсичности. В другом аспекте линкер должен быть способен высвобождать полезные нагрузки вблизи или внутри клеток-мишеней, чтобы эффективно уничтожать клетки-мишени или блокировать функции клеток-мишеней. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит по меньшей мере одну расщепляемую функциональную группу. Предпочтительно расщепляемая функциональная группа является достаточно стабильной вне клетки-мишени, но при поступлении в клетку-мишень расщепляется с высвобождением полезной(полезных) нагрузки(нагрузок). В некоторых вариантах осуществления расщепляемая функциональная группа расщепляется в по меньшей мере 10, 20, 30, 50, 100 или более раз эффективнее в клетках-мишенях, чем в крови или сыворотке крови.
Расщепляемый линкер может расщепляться с помощью гидролиза, ферментативной реакции или реакции восстановления, или при изменении pH. В некоторых вариантах осуществления линкер является расщепляемым при нахождении в определенной физиологической среде (например, в среде с подходящим pH). В некоторых вариантах осуществления линкер является расщепляемым в кислой среде с pH приблизительно 6,5 или ниже или с помощью таких реагентов, как ферменты. В некоторых вариантах осуществления линкер чувствителен к факторам, опосредующим расщепление, например, pH, окислительно-восстановительному потенциалу или присутствию разрушающих молекул.
В некоторых вариантах осуществления линкер является нерасщепляемым. Нерасщепляемые линкеры, как используется в данном документе, относятся к линкерам, которые остаются в основном интактными в ходе внутриклеточного метаболизма.
В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой пептидный линкер, состоящий из аминокислот с прямой или разветвленной цепью, связанных пептидными связями. В некоторых вариантах осуществления пептидный линкер является расщепляемым протеазой, которая на высоком уровне или специфически экспрессируется вблизи клеток-мишеней или внутри них, например катепсин B в лизосоме или эндосоме. Пептидный линкер, используемый в данном документе, может характеризоваться различными значениями длины. Как правило, пептидный линкер согласно настоящей заявке имеет длину, составляющую от 1 до 50 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления пептидный линкер имеет длину, составляющую от 1 до 45, от 1 до 40, от 1 до 35, от 1 до 30, от 1 до 25, от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 9, от 1 до 8, от 1 до 7, от 1 до 6, от 1 до 5, от 1 до 4, от 1 до 3, от 1 до 2 или 1 аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления пептидный ликер имеет длину, составляющую от 2 до 45, от 2 до 40, от 2 до 35, от 2 до 30, от 2 до 25, от 2 до 20, от 2 до 15, от 2 до 10, от 2 до 9, от 2 до 8, от 2 до 7, от 2 до 6, от 2 до 5, от 2 до 4, от 2 до 3 или 2 аминокислоты. Количество аминокислот в пептидном линкере, как описано в настоящей заявке, может быть равно любому целому значению в пределах вышеуказанного числового диапазона, включая конечные значения этого диапазона. В некоторых вариантах осуществления предпочтительным является пептидный линкер, длина которого составляет 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления пептидный линкер представляет собой цистеин, лизин, лизин-лизин, валин-цитруллин, фенилаланин-лизин, валин-лизин, цистеин-лизин, цистеин-глутаминовая_кислота, аспарагиновая_кислота-аспарагиновая_кислота и аспарагиновая_кислота-аспарагиновая_кислота-лизин, и необязательно карбоновая кислота в вышеупомянутых аминокислотах является амидированной.
В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой дисульфидный линкер, содержащий дисульфидную связь. Дисульфидная связь может расщепляться во внутриклеточной восстановительной среде, при этом остается стабильной в кровотоке. Дисульфидный линкер согласно настоящей заявке может представлять собой DSDM, DMDS, MDS или NDMDS. Структуры этих дисульфидных линкеров показаны в таблице 1 ниже.
Таблица 1. Структуры DSDM, DMDS, MDS и NDMDS
В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой pH-зависимый линкер. pH-зависимый линкер, описанный в настоящей заявке, является расщепляемым в среде с определенным pH. В некоторых вариантах осуществления pH-зависимый линкер может быть стабильным в щелочных условиях, но при этом являться расщепляемым в кислых условиях, например, при значении pH 6,5 или ниже. В некоторых вариантах осуществления pH-зависимый линкер представляет собой цис-аконитовый ангидрид.
В некоторых вариантах осуществления линкер в конъюгированном соединении или его фармацевтически приемлемой соли представляет собой
,
или представляет собой комбинацию вышеупомянутой структуры и пептидного линкера (например, связывание с нацеливающей молекулой посредством пептидного линкера, содержащего 1-3 аминокислоты).
В некоторых вариантах осуществления линкер в конъюгированном соединении или его фармацевтически приемлемой соли имеет следующую структуру:
,
или представляет собой комбинацию вышеупомянутой структуры и пептидного линкера (например, связывание с нацеливающей молекулой посредством пептидного линкера, содержащего 1-3 аминокислоты).
В некоторых вариантах осуществления линкер в конъюгированном соединении или его фармацевтически приемлемой соли имеет следующую структуру:
,
или представляет собой комбинацию вышеупомянутой структуры и пептидного линкера (например, связывание с нацеливающей молекулой посредством пептидного линкера, содержащего 1-3 аминокислоты).
В некоторых вариантах осуществления линкер в конъюгированном соединении или его фармацевтически приемлемой соли имеет следующую структуру:
,
или представляет собой комбинацию вышеупомянутой структуры и пептидного линкера (например, связывание с нацеливающей молекулой посредством пептидного линкера, содержащего 1-3 аминокислоты).
В некоторых вариантах осуществления линкер в конъюгированном соединении или его фармацевтически приемлемой соли имеет следующую структуру:
,
или представляет собой комбинацию вышеупомянутой структуры и пептидного линкера (например, связывание с нацеливающей молекулой посредством пептидного линкера, содержащего 1-3 аминокислоты).
В некоторых вариантах осуществления линкер в конъюгированном соединении или его фармацевтически приемлемой соли имеет следующую структуру:
,
или представляет собой комбинацию вышеупомянутой структуры и пептидного линкера (например, связывание с нацеливающей молекулой посредством пептидного линкера, содержащего 1-3 аминокислоты).
В некоторых вариантах осуществления линкер в конъюгированном соединении или его фармацевтически приемлемой соли имеет следующую структуру:
,
или представляет собой комбинацию вышеупомянутой структуры и пептидного линкера (например, связывание с нацеливающей молекулой посредством пептидного линкера, содержащего 1-3 аминокислоты).
В некоторых вариантах осуществления линкер в конъюгированном соединении или его фармацевтически приемлемой соли имеет следующую структуру:
,
или представляет собой комбинацию вышеупомянутой структуры и пептидного линкера (например, связывание с нацеливающей молекулой посредством пептидного линкера, содержащего 1-3 аминокислоты).
В некоторых вариантах осуществления линкер в конъюгированном соединении или его фармацевтически приемлемой соли имеет следующую структуру:
,
или представляет собой комбинацию вышеупомянутой структуры и пептидного линкера (например, связывание с нацеливающей молекулой посредством пептидного линкера, содержащего 1-3 аминокислоты).
В некоторых вариантах осуществления линкер в конъюгированном соединении или его фармацевтически приемлемой соли имеет следующую структуру:
,
или представляет собой комбинацию вышеупомянутой структуры и пептидного линкера (например, связывание с нацеливающей молекулой посредством пептидного линкера, содержащего 1-3 аминокислоты).
В некоторых вариантах осуществления линкер в конъюгированном соединении или его фармацевтически приемлемой соли имеет следующую структуру:
или представляет собой комбинацию вышеупомянутой структуры и пептидного линкера (например, связывание с нацеливающей молекулой посредством пептидного линкера, содержащего 1-3 аминокислоты).
В некоторых вариантах осуществления линкер в конъюгированном соединении или его фармацевтически приемлемой соли имеет следующую структуру:
,
или представляет собой комбинацию вышеупомянутой структуры и пептидного линкера (например, связывание с нацеливающей молекулой посредством пептидного линкера, содержащего 1-3 аминокислоты).
В некоторых вариантах осуществления линкер согласно настоящей заявке может предусматривать любой из линкеров или их комбинацию, как описано выше.
В некоторых вариантах осуществления полезная нагрузка конъюгирована непосредственно или опосредованно с первой нацеливающей молекулой, а первая нацеливающая молекула конъюгирована непосредственно или опосредованно со второй нацеливающей молекулой. В некоторых вариантах осуществления полезная нагрузка конъюгирована непосредственно с каждой из первой и второй нацеливающих молекул. В некоторых вариантах осуществления полезная нагрузка конъюгирована опосредованно с каждой из первой и второй нацеливающих молекул. В некоторых вариантах осуществления полезная нагрузка конъюгирована опосредованно с первой нацеливающей молекулой, например посредством линкера, а первая нацеливающая молекула конъюгирована непосредственно или опосредованно со второй нацеливающей молекулой. В некоторых вариантах осуществления полезная нагрузка конъюгирована с первой нацеливающей молекулой посредством первого линкера, и при этом полезная нагрузка конъюгирована со второй нацеливающей молекулой посредством второго линкера. В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой мультивалентный линкер, который связывается с по меньшей мере одной (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше) полезной нагрузкой и двумя нацеливающими молекулами.
В некоторых вариантах осуществления две нацеливающие молекулы связаны друг с другом посредством спейсера. В некоторых вариантах осуществления спейсер расщепляется протеазой, которая специфически экспрессируется в клетках-мишенях или подлежит экспрессии в клетках-мишенях. Такие протеазы включают, например, протеазы, перечисленные в таблице 2 ниже. В некоторых вариантах осуществления спейсер содержит аминокислотную последовательность, выбранную из любой из аминокислотных последовательностей, перечисленных в таблице 2 ниже.
Таблица 2. Перечень ферментативно расщепляемых последовательностей
Используемые в данном документе термины "расщепляемый" или "расщепленный" относятся к метаболическому процессу или процессу реакции с конъюгированным соединением, предусмотренным в настоящей заявке, в результате чего линкер между полезной нагрузкой и нацеливающей молекулой или спейсер между нацеливающими молекулами разрушаются с высвобождением свободной полезной нагрузки или нацеливающей молекулы. Линкер и спейсер либо расщепляются протеазой, либо расщепляются при нахождении в определенной физиологической среде, например, среде с некоторым значением pH.
В некоторых вариантах осуществления конъюгированное соединение имеет структуру формулы I, II, III или IV, показанных далее, где n, m, p и q независимо равняются 0 или 1, означая тем самым, что линкер и спейсер независимо присутствуют или отсутствуют. "Молекула" в следующей формуле является сокращением от "нацеливающей молекулы".
В некоторых вариантах осуществления конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль, предусмотренные в настоящей заявке, содержат по меньшей мере одну (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше) полезную нагрузку, как предусмотрено в настоящей заявке, две нацеливающие молекулы, как предусмотрено в настоящей заявке, и необязательно линкер или спейсер, как предусмотрено в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль, предусмотренные в настоящей заявке, содержат одну полезную нагрузку, как предусмотрено в настоящей заявке, один лиганд, который специфически связывается с белком или маркером клеточной поверхности, как предусмотрено в настоящей заявке, одну синергетическую молекулу, как предусмотрено в настоящей заявке, и линкер или спейсер, как предусмотрено в настоящей заявке.
В некоторых вариантах осуществления конъюгированное соединение имеет структуру формулы V, VI, VII или VIII, показанных далее, где n, m, p, q и s независимо равняются 0 или 1, означая тем самым, что линкер, мультивалентный линкер и спейсер независимо присутствуют или отсутствуют.
В некоторых вариантах осуществления конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль, предусмотренные в настоящей заявке, содержат полезную нагрузку и две нацеливающие молекулы, где две нацеливающие молекулы являются фрагментом, представляющим собой синергетическую молекулу, и фрагментом, представляющим собой лиганд к простатспецифическому мембранному антигену, соответственно, например, CB-20B, CB-20BK, CB-60S, CB-60SK, CB-20C, CB-1020, CB-1320, CB-1820, CR19428, 20R-SM09 и CB-20R.
В некоторых вариантах осуществления конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль, предусмотренные в настоящей заявке, содержат одну или несколько полезных нагрузок и две нацеливающие молекулы, где две нацеливающие молекулы являются фрагментом, представляющим собой синергетическую молекулу, и фрагментом, представляющим собой лиганд, представленный формулой (I), соответственно, например, CB-18G, CB-1820 и CR19426.
В некоторых вариантах осуществления конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль, предусмотренные в настоящей заявке, содержат одну полезную нагрузку и две нацеливающие молекулы, где две нацеливающие молекулы соответственно являются фрагментом, представляющим собой синергетическую молекулу, и P10, а полезная нагрузка представляет собой камптотецин или любое его производное, как например CB-10S, CR19425 и CB-50S.
В некоторых вариантах осуществления конъюгированное соединение согласно настоящей заявке выбрано из группы, состоящей из следующих соединений: CB-20B, CB-20BK, CB-60S, CB-60SK, CB-20C, CB-1020, CB-1320, CB-1820, CR19428, 20R-SM09, CB-20R, CB-18G, CR19426, CB-10S, CR19425 и CB-50S (конкретная структура каждого конъюгированного соединения показана на фиг. 1). В некоторых вариантах осуществления конъюгированное соединение согласно настоящей заявке получают путем связывания фрагмента, представляющего собой линкер-лекарственное средство, с фрагментом, представляющим собой лиганд, посредством ковалентной связи. Фрагмент, представляющий собой линкер-лекарственное средство, согласно настоящей заявке, содержит полезную нагрузку и линкер, а фрагмент, представляющий собой лиганд, согласно настоящей заявке, содержит две нацеливающие молекулы и необязательный спейсер или линкер, где два фрагмента образуют конъюгированное соединение согласно настоящей заявке путем вступления в реакцию и образования ковалентной связи, и ковалентная связь может образовываться между линкером во фрагменте, представляющем собой линкер-лекарственное средство, и молекулой лиганда во фрагменте, представляющем собой лиганд, или она может образовываться между линкером во фрагменте, представляющем собой линкер-лекарственное средство, и спейсером или линкером во фрагменте, представляющем собой лиганд.
Конъюгированное соединение согласно настоящей заявке, CB-20B, образуется путем связывания фрагмента, представляющего собой линкер-лекарственное средство, LT1002 с фрагментом, представляющим собой лиганд, 20B-SM09 посредством ковалентной связи. Конъюгированное соединение согласно настоящей заявке, CB-20BK, образуется путем связывания фрагмента, представляющего собой линкер-лекарственное средство, LT1002 с фрагментом, представляющим собой лиганд, 20BK-SM09 посредством ковалентной связи. Конъюгированное соединение согласно настоящей заявке, CB-60S, образуется путем связывания фрагмента, представляющего собой линкер-лекарственное средство, LT2000C с фрагментом, представляющим собой лиганд, 60S-SM09 посредством ковалентной связи. Конъюгированное соединение согласно настоящей заявке, CB-60SK, образуется путем связывания фрагмента, представляющего собой линкер-лекарственное средство, LT2000C с фрагментом, представляющим собой лиганд, 60SK-SM09 посредством ковалентной связи. Конъюгированное соединение согласно настоящей заявке, CB-20C, образуется путем связывания фрагмента, представляющего собой линкер-лекарственное средство, LD1001 с фрагментом, представляющим собой лиганд, 20BK-SM09 посредством ковалентной связи. Конъюгированное соединение согласно настоящей заявке, CB-1020, образуется путем связывания фрагмента, представляющего собой линкер-лекарственное средство, LT1002 с фрагментом, представляющим собой лиганд, 1020BK-SM09 посредством ковалентной связи. Конъюгированное соединение согласно настоящей заявке, CB-1320, образуется путем связывания фрагмента, представляющего собой линкер-лекарственное средство, LT1002 с фрагментом, представляющим собой лиганд, 1320BK-SM09 посредством ковалентной связи. Конъюгированное соединение согласно настоящей заявке, CB-1820, образуется путем связывания фрагмента, представляющего собой линкер-лекарственное средство, LT1002 с фрагментом, представляющим собой лиганд, 1820BK-SM09 посредством ковалентной связи. Конъюгированное соединение согласно настоящей заявке, CR19428, образуется путем связывания фрагмента, представляющего собой линкер-лекарственное средство, CR19423 с фрагментом, представляющим собой лиганд, 20BK-SM09 посредством ковалентной связи. Конъюгированное соединение согласно настоящей заявке, CB-20R, образуется путем образования комплекса 20R-SM09 с радионуклидным ионом M. Конъюгированное соединение согласно настоящей заявке, CB-18G, образуется путем связывания фрагмента, представляющего собой линкер-лекарственное средство, LT1002 с фрагментом, представляющим собой лиганд, 18G-SM09 посредством ковалентной связи. Конъюгированное соединение согласно настоящей заявке, CR19426, образуется путем связывания фрагмента, представляющего собой линкер-лекарственное средство, CR19423 с фрагментом, представляющим собой лиганд, 18G-SM09 посредством ковалентной связи. Конъюгированное соединение согласно настоящей заявке, CB-10S, образуется путем связывания фрагмента, представляющего собой линкер-лекарственное средство, LT1000 с фрагментом, представляющим собой лиганд, CBSM09 посредством ковалентной связи. Конъюгированное соединение согласно настоящей заявке, CR19425, образуется путем связывания фрагмента, представляющего собой линкер-лекарственное средство, CR19423 с фрагментом, представляющим собой лиганд, CBSM09 посредством ковалентной связи. Конъюгированное соединение согласно настоящей заявке, CB-50S, образуется путем связывания фрагмента, представляющего собой линкер-лекарственное средство, LT1000N3 с фрагментом, представляющим собой лиганд, 50S-SM09 посредством ковалентной связи. Каждая структура показана в таблице 3 ниже.
Таблица 3. Структуры фрагмента, представляющего собой линкер-лекарственное средство, и фрагмента, представляющего собой лиганд
В некоторых вариантах осуществления конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль, предусмотренные в настоящей заявке, поступают в кровоток и наружное по отношению к клеткам пространство (в межклеточное вещество). Поскольку линкер очень стабилен во внеклеточной среде и молекулы лекарственного средства не могут высвобождаться, токсичность молекул лекарственного средства блокируется. Конъюгат представляет собой лекарственное средство, не обладающее цитотоксичностью или обладающее низкой токсичностью, и он не будет оказывать токсический эффект в отношении нормальных клеток.
В некоторых вариантах осуществления конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль, предусмотренные в настоящей заявке, связываются с несколькими рецепторами или антигенами и другими активными молекулами, которые одновременно экспрессируются на высоком уровне на пораженных заболеванием клетках, и их синергетический эффект значительно увеличивает аффинность конъюгированного соединения к клеткам-мишеням, уменьшая вероятность связывания с нормальными клетками. Следовательно, лекарственное средство на основе высокоэффективного токсина, такое как комплекс MMAE/Dxd/SN38/радионуклид, можно использовать для повышения эффективности лекарственных средств, расширения терапевтического окна и предотвращения побочных эффектов лекарственного средства.
В некоторых вариантах осуществления конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль, предусмотренные в настоящей заявке, проникают внутрь клеток-мишеней, и затем линкер может расщепляться за счет изменений внутренней среды клеток (путем расщепления специфическим ферментом, изменения pH, восстановления дисульфидной связи и т. д.) с высвобождением молекул лекарственного средства (эквивалентно удалению модифицирующих групп молекул лекарственного средства), что оказывает терапевтический эффект в отношении опухолевых клеток.
В некоторых вариантах осуществления конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемую соль согласно настоящей заявке можно использовать для специфической доставки полезной нагрузки по отношению к клеткам-мишеням, находящимся в пределах образуемой тканью-мишенью среды. В целом, две нацеливающие молекулы в конъюгированном соединении или его фармацевтически приемлемой соли имеют три преимущества. Во-первых, две нацеливающие молекулы могут действовать в нескольких режимах (часто синергетически), что приводит к улучшенным терапевтическим эффектам при одновременном уменьшении побочных эффектов. Во-вторых, связывание двух нацеливающих молекул увеличивает аффинность и авидность конъюгированного соединения или его фармацевтически приемлемой соли по отношению к рецепторам-мишеням или клеткам-мишеням, тем самым повышая их специфичность и избегая нецелевой токсичности. Наконец, при правильной разработке комбинация двух нацеливающих молекул может реализовывать многофункциональные свойства, необходимые для конъюгата лекарственного средства.
Конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль согласно настоящей заявке обеспечивают достижение неожиданных технических эффектов, включая без ограничения следующее: (1) комбинация лиганда, способного связываться с рецепторами клеточной поверхности, и молекулы, способствующей эндоцитозу, способной опосредовать эндоцитоз, позволяет конъюгированному соединению специфически проникать в клетки-мишени; (2) конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль усиливают аффинность и специфичность нацеливания лекарственных соединений, тем самым доставляя пациенту высокоэффективные химиотерапевтические средства, такие как MMAE, расширяя терапевтическое окно таких средств и избегая побочных эффектов; (3) линкер может предотвращать высвобождение полезной нагрузки за пределами клеток-мишеней (например, в систему кровообращения, межклеточное вещество и т. д.), что обеспечивает стабильность конъюгированного соединения во время нахождения в кровотоке и снижает токсичность лекарственного средства; при этом после проникновения в клетки-мишени линкер расщепляется с высвобождением полезной нагрузки и оказанием эффекта, предусматриваемого лекарственным средством, и при этом может избегаться развитие множественной лекарственной устойчивости (MDR); и (4) широкий спектр лекарственных средств можно доставлять в форме конъюгированного соединения согласно настоящей заявке, и, следовательно, области применения соответствующих лекарственных средств расширяются. Следовательно, конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль согласно настоящей заявке не только расширяют спектр нацеливания и терапевтическое окно лекарственных средств на основе LDC, но также снижают токсичность и побочные эффекты некоторых лекарственных средств.
Используемые в данном документе термины "полипептид", "белок" и "пептид" могут означать одну аминокислоту или полимер из аминокислот. Полипептид, белок или пептид, описанные в настоящей заявке, могут содержать встречающиеся в природе аминокислоты и не встречающиеся в природе аминокислоты или их аналоги и миметики. Полипептид, белок или пептид можно получить любым способом, хорошо известным в данной области, например, без ограничения, путем выделения и очистки из природных материалов, рекомбинантной экспрессии, химического синтеза и т. д.
В другом аспекте в настоящей заявке раскрыта фармацевтическая композиция, содержащая конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемую соль, предусмотренные в настоящей заявке, и фармацевтически приемлемый носитель.
Используемый в данном документе термин "фармацевтически приемлемый" означает, в рамках обоснованной медицинской оценки, пригодность для приведения в контакт с клетками человека и других животных без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции и т. д. и соизмеримость с разумным соотношением польза/риск.
Используемый в данном документе термин "фармацевтически приемлемая соль" относится к относительно нетоксичной полученной путем присоединения неорганической и органической кислоты соли, а также полученной путем присоединения оснований соли конъюгированного соединения согласно настоящей заявке. Иллюстративные соли присоединения кислоты включают гидробромиды, гидрохлориды, сульфаты, бисульфаты, фосфаты, нитраты, ацетаты, оксалаты, валераты, олеаты, пальмитаты, стеараты, лаураты, бораты, бензоаты, лактаты, фосфаты, тозилаты, цитраты, малеаты, фумараты, сукцинаты, тартраты, нафтилаты, мезилаты, глюкогептонаты, лактиобионаты, сульфаматы, малонаты, салицилаты, пропионаты, метилен-бис-b-гидроксинафтоаты, гентизаты, изетионаты, ди-п-толуоилтартраты, метансульфонаты, этансульфонаты, бензолсульфонаты, п-толуолсульфонаты, циклогексилсульфаматы, хинатеслаурилсульфонатные соли и т. п. Соли присоединения основания включают фармацевтически приемлемые соли металлов и аминов. Подходящие соли металлов включают соли натрия, калия, кальция, бария, цинка, магния и алюминия. В некоторых вариантах осуществления соли натрия и калия являются предпочтительными. Подходящие соли присоединения неорганического основания получают из оснований металлов, которые включают, например, гидрид натрия, гидроксид натрия, гидроксид калия, гидроксид кальция, гидроксид алюминия, гидроксид лития, гидроксид магния и гидроксид цинка. Подходящие соли присоединения аминового основания получают из аминов, которые имеют достаточную основность для образования стабильной соли и предпочтительно включают следующие амины, которые часто используются в медицинской химии вследствие их низкой токсичности и приемлемости для медицинского применения: аммиак, этилендиамин, N-метилглюкамин, лизин, аргинин, орнитин, холин, N, N'-дибензилэтилендиамин, хлорпрокаин, диэтаноламин, прокаин, N-бензилфенэтиламин, диэтиламин, пиперазин, трис(гидроксиметил)аминометан, гидроксид тетраметиламмония, триэтиламин, дибензиламин, эфенамин, дегидроабиетиламин, N-этилпиперидин, бензиламин, тетраметиламмоний, тетраэтиламмоний, метиламин, диметиламин, триметиламин, этиламин, основные аминокислоты, например лизин и аргинин, дициклогексиламин и тому подобное.
Используемый в данном документе термин "фармацевтически приемлемый носитель" относится к фармацевтически приемлемому растворителю, суспензии или любой другой фармакологически инертной среде-носителю для доставки конъюгированного соединения, предусмотренного в настоящей заявке, субъекту без нарушения структуры и свойств конъюгированного соединения. Такие носители позволяют составлять конъюгированное соединение, например, в виде таблеток, пилюль, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, паст, суспензий и пастилок для перорального приема субъектом. Такие носители позволяют составлять конъюгированное соединение в виде инъекций, инфузий или препаратов для местного введения.
Фармацевтически приемлемые носители для применения в фармацевтической композиции, предусмотренной в настоящей заявке, могут включать без ограничения, например, фармацевтически приемлемые жидкости, гели или твердые носители, водные среды-носители (такие как раствор хлорида натрия для инъекций, раствор Рингера для инъекций, изотонический раствор декстрозы для инъекций, стерильная вода для инъекций или раствор Рингера с декстрозой и лактатом для инъекций), неводные среды-носители (например, нелетучие масла, полученные из растений, хлопковое масло, кукурузное масло, кунжутное масло или арахисовое масло), противомикробные средства, изотонические средства (такие как хлорид натрия или декстроза), буферы (например, фосфатные или цитратные буферы), антиоксиданты (например, бисульфат натрия), анестетики (например, гидрохлорид прокаина), суспензии/дисперсии (например, карбоксиметилцеллюлоза натрия, гидроксипропилметилцеллюлоза или поливинилпирролидон), хелатирующие средства (такие как EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) или EGTA (этиленгликольтетрауксусная кислота)), эмульгаторы (такие как полисорбат 80 (Tween-80)), разбавители, вспомогательные средства, вспомогательные вещества или нетоксичные вспомогательные материалы, другие компоненты, хорошо известные в данной области, или их различные комбинации. Подходящие компоненты могут включать, например, наполнители, связующие вещества, буферы, консерванты, смазывающие вещества, ароматизаторы, загустители, красящие вещества или эмульгаторы.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция представляет собой препарат для инъекций. Препараты для инъекций включают стерильные водные растворы или дисперсии, суспензии или эмульсии. Во всех случаях препараты для инъекций должны быть стерильными и представлять собой жидкость для обеспечения простоты введения. Они должны быть стабильными в условиях изготовления и хранения и должны быть защищены от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Носители могут быть растворителями или дисперсионными средами, содержащими, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и т. п.) и их подходящие смеси и/или растительные масла. Препараты для инъекций должны сохранять соответствующую текучесть. Соответствующую текучесть можно поддерживать, например, путем применения покрытий, таких как лецитин, путем применения поверхностно-активных веществ и т. п. Предупреждения действия микроорганизмов можно достигать с помощью различных противобактериальных и противогрибковых средств, например парабенов, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты, тимеросала и т. п.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция представляет собой препарат для перорального применения. Препараты для перорального применения включают без ограничения капсулы, крахмальные капсулы, пилюли, таблетки, пастилки для рассасывания (с использованием ароматизированной основы, обычно сахарозы и аравийской камеди или трагаканта), порошки, гранулы, или представленные в виде растворов или суспензий в водных или неводных жидкостях, или находящиеся в виде жидких эмульсий по типу "масло-в-воде" или "вода-в-масле", или представленные в виде эликсиров или сиропов, или в виде пастилок (с использованием инертной основы, такой как желатин и глицерин или сахароза и аравийская камедь) и/или в виде жидкостей для полоскания рта.
В твердых лекарственных формах для перорального введения (например, капсулах, таблетках, пилюлях, драже, порошках, гранулах и т. п.) конъюгированное соединение смешано с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями, такими как цитрат натрия или дикальцийфосфат, и/или любым из следующего: (1) наполнителями или разбавителями, такими как разновидности крахмала, лактоза, сахароза, глюкоза, маннит и/или кремниевая кислота; (2) связующими веществами, такими как карбоксиметилцеллюлоза, разновидности альгината, разновидности желатина, поливинилпирролидон, сахароза и/или аравийская камедь; (3) увлажнителями, такими как глицерин; (4) средствами для улучшения распадаемости, такими как агар-агар, карбонат кальция, картофельный или тапиоковый крахмал, альгиновая кислота, определенные силикаты и карбонат натрия; (5) замедлителями растворения, такими как парафин; (6) ускорителями всасывания, такими как соединения четвертичного аммония; (7) смачивающими средствами, такими как ацетиловый спирт и моностеарат глицерина; (8) абсорбентами, такими как каолин и бентонитовая глина; (9) смазывающими веществами, такими как тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердый полиэтиленгликоль, лаурилсульфат натрия и их смеси; и (10) красящими веществами.
В жидких лекарственных формах для перорального введения конъюгированное соединение смешивают с любым из следующего: фармацевтически приемлемыми эмульсиями, микроэмульсиями, растворами, суспензиями, сиропами и эликсирами. В дополнение к конъюгированному соединению жидкие лекарственные формы могут содержать инертные разбавители, обычно используемые в данной области, такие как вода или другие растворители, солюбилизирующие средства и эмульгаторы, такие как этиловый спирт, изопропиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, изопропанол, 1,3-бутиленгликоль, масла (в частности, хлопковое масло, арахисовое масло, кукурузное масло, оливковое масло, касторовое масло и кунжутное масло), глицерин, тетрагидрофурфуриловый спирт, полиэтиленгликоль и сложные эфиры жирных кислот и сорбитана и их смеси. Помимо инертных разбавителей пероральная композиция может также предусматривать вспомогательные средства, такие как смачивающие средства, эмульгаторы и суспензии, подсластители, ароматизаторы, красящие вещества, отдушки и консерванты.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция представляет собой препарат в виде спрея для полости рта или препарат в виде назального спрея. Препараты в виде спрея включают без ограничения водные аэрозоли, неводные суспензии, липосомальные препараты или твердые гранулированные препараты. Водные аэрозоли получают путем смешивания водных растворов или суспензий средств с традиционными фармацевтически приемлемыми носителями и стабилизаторами. Носители и стабилизаторы варьируются в зависимости от требований для конкретных соединений, но в целом они включают неионогенные поверхностно-активные вещества (разновидности Tween или полиэтиленгликоль), олеиновую кислоту, лецитин, аминокислоты, такие как глицин, буферный раствор, соли, сахар или сахарный спирт. Аэрозоли обычно получают из изотонических растворов и могут доставляться с помощью распылителей.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтическую композицию можно использовать путем смешивания с одним или несколькими другими лекарственными средствами. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере одно другое лекарственное средство. В некоторых вариантах осуществления другие лекарственные средства представляют собой противоопухолевые лекарственные средства, лекарственные средства для сердечно-сосудистой системы, противовоспалительные лекарственные средства, противовирусные лекарственные средства, лекарственные средства для пищеварительной системы, лекарственные средства для нервной системы, лекарственные средства для респираторной системы, лекарственные средства для иммунной системы, дерматологические лекарственные средства, метаболические лекарственные средства и тому подобное.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции можно вводить субъекту, нуждающемуся в этом, подходящими путями, включая без ограничения пероральное, инъекционное (как например внутривенная, внутримышечная, подкожная, внутрикожная, внутрисердечная, интратекальная, внутриплевральная и внутрибрюшинная инъекция), мукозальное (как например назальное и внутриротовое введение), сублингвальное, ректальное, чрескожное, внутриглазное и легочное введение. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическую композицию можно вводить внутривенно, подкожно, перорально, внутримышечно или интравентрикулярно.
Ввиду свойств некоторых полезных нагрузок, таких как высокая токсичность и высокая гидрофильность, желательно доставлять полезные нагрузки нуждающемуся в этом субъекту более специфическим и более эффективным образом. Например, при лечении рака желательно специфически доставлять химиотерапевтические средства по отношению к раковым клеткам без токсичности для нормальных клеток. Следовательно, в другом аспекте в настоящей заявке раскрыт способ доставки полезной нагрузки субъекту, нуждающемуся в этом, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества конъюгированного соединения или его фармацевтически приемлемой соли, предусмотренных в настоящей заявке, или фармацевтической композиции, предусмотренной в настоящей заявке. Полезные нагрузки, описанные в настоящей заявке, могут представлять собой любое фармацевтическое средство, которое вызывает биологические или лечебные ответы в тканях, системе, у животного, индивидуума или человека, к достижению которых стремятся исследователь, ветеринар, врач или другие клиницисты при предупреждении, подавлении, снижении интенсивности или лечении заболевания.
Используемый в данном документе термин "объект" относится к человеку и животным, отличным от человека. Животные, отличные от человека, включают всех позвоночных, например млекопитающих и животных, отличных от млекопитающих. Субъектом также может быть животное, относящееся к домашнему скоту, как например крупный рогатый скот, свинья, овца, домашняя птица и лошадь, или домашнее животное, как например собака и кошка. Субъект может быть мужского пола (например, мужчиной) или женского пола (например, женщиной), может быть пожилым и может быть взрослым, подростком, ребенком или младенцем. Человек может являться человеком европеоидного, африканского, азиатского, семитского происхождения или человеком с другими расовыми характеристиками или комбинацией таких расовых характеристик.
Используемый в данном документе термин "терапевтически эффективное количество" относится к количеству конъюгированного соединения или его фармацевтически приемлемой соли или фармацевтической композиции, которое в некоторой степени облегчает один или несколько симптомов заболевания или нарушения у субъекта, частично или полностью возвращает к норме один или несколько физиологических или биохимических параметров, ассоциированных с заболеванием или нарушением или являющихся их причиной, и/или снижает вероятность начала развития заболевания или нарушения. Такие количества обычно варьируются в зависимости от ряда факторов, которые могут быть определены и объяснены в соответствии с объемом описания, представленного в настоящей заявке, специалистами в данной области техники. Эти факторы включают без ограничения конкретного субъекта и его возраст, вес, рост, общее физическое состояние и медицинский анамнез, конкретное используемое соединение, носитель для препарата и выбранный путь введения, а также природу и тяжесть состояния, подлежащего лечению.
В некоторых вариантах осуществления количество конъюгированного соединения или его фармацевтически приемлемой соли или фармацевтической композиции достаточно для подавления заболевания или нарушения у субъекта или для профилактического подавления или предотвращения начала развития заболевания или нарушения у субъекта. Хотя терапевтически эффективное количество может варьироваться для разных субъектов, оно обычно находится в диапазоне от 0,01 до 100 мг/кг, например, от 0,01 до 90 мг/кг, от 0,01 до 80 мг/кг, от 0,01 до 70 мг/кг, от 0,01 до 60 мг/кг, от 0,01 до 50 мг/кг, от 0,01 до 40 мг/кг, от 0,01 до 30 мг/кг, от 0,01 до 20 мг/кг, от 0,01 до 10 мг/кг, от 0,01 до 5 мг/кг, от 0,01 до 4 мг/кг, от 0,01 до 3 мг/кг, от 0,01 до 2 мг/кг, от 0,01 до 1 мг/кг и от 0,01 до 0,1 мг/кг. Терапевтически эффективное количество, как описано в настоящей заявке, может быть равно любому значению в пределах вышеуказанного числового диапазона, включая конечные значения этого диапазона.
В другом аспекте в настоящей заявке раскрыт способ доставки полезной нагрузки субъекту, нуждающемуся в этом, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества конъюгированного соединения или его фармацевтически приемлемой соли, предусмотренных в настоящей заявке, или фармацевтической композиции, предусмотренной в настоящей заявке.
В другом аспекте в настоящей заявке раскрыт способ лечения заболевания у субъекта, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества конъюгированного соединения или его фармацевтически приемлемой соли, предусмотренных в настоящей заявке, или фармацевтической композиции, предусмотренной в настоящей заявке.
В некоторых вариантах осуществления заболевание представляет собой рак, включая без ограничения рак предстательной железы, рак молочной железы, рак легкого, рак почки, лейкоз, рак яичника, рак желудочно-кишечного тракта, рак матки, карциному эндометрия, рак печени, рак щитовидной железы, рак поджелудочной железы, рак толстой кишки, колоректальный рак, рак пищевода, рак кожи, лимфому и множественную миелому.
В некоторых вариантах осуществления раковые клетки форм рака характеризуются экспрессией рецепторов или антигенов клеточной поверхности, упомянутых в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления раковые клетки форм рака характеризуются высоким уровнем экспрессии (например, по данным Depmap (см.: https://depmap.org/portal/), экспрессия соответствующего гена составляет по меньшей мере 0, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более 10) рецепторов или антигенов клеточной поверхности, упомянутых в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления раковые клетки форм рака характеризуются высоким уровнем экспрессии FOLR1 и FOLH1, TRPV6 и FOLH1, GNRHR и FOLH1, SSTR2 и FOLH1, FOLR1 и SSTR2 или TRPV6 и FOLR1. В некоторых вариантах осуществления заболевание представляет собой заболевание иммунной системы, например аутоиммунное заболевание, включая без ограничения заболевание соединительной ткани, системный склероз, ревматоидный артрит и системную красную волчанку.
В некоторых вариантах осуществления заболевание представляет собой сердечно-сосудистое заболевание, включая без ограничения стенокардию, инфаркт миокарда, инсульт, сердечный приступ, гипертоническую болезнь сердца, ревматическую болезнь сердца, кардиомиопатию, аритмию и врожденный порок сердца.
В некоторых вариантах осуществления заболевание представляет собой метаболическое заболевание, включая без ограничения диабет, подагру, ожирение, гипогликемию, гипергликемию и дислипидемию.
В некоторых вариантах осуществления заболевание представляет собой неврологическое заболевание, включая без ограничения болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, травму головы, рассеянный склероз, головокружение, кому и эпилепсию.
В некоторых вариантах осуществления способ, предусмотренный в настоящей заявке, дополнительно включает введение одного или нескольких терапевтических средств в комбинации с конъюгированным соединением или его фармацевтически приемлемой солью или фармацевтической композицией. В некоторых вариантах осуществления терапевтические средства нацеливаются на противораковую терапевтическую мишень, индуцируют или усиливают иммунный ответ против рака или являются химиотерапевтическими средствами.
Настоящая заявка будет описана более подробно с помощью конкретных примеров. Следующие ниже примеры предлагаются только для иллюстративных целей и не предназначены для ограничения каким-либо образом настоящего изобретения. Специалист в данной области легко распознает множество некритических параметров, которые могут быть изменены или модифицированы для получения по существу тех же результатов.
ПРИМЕРЫ
Следующие ниже примеры предназначены для дополнительной иллюстрации настоящей заявки. Преимущества и признаки настоящей заявки станут понятны из описания. Однако эти иллюстративные материалы представлены лишь в качестве примера и не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящей заявки.
Пример 1. Получение конъюгированных соединений
Синтез конъюгированных соединений CB-20BK, CB-18G, CB-20B, CB-10S, CB-20C, FA-MMAE, CB-20AK, CB-1020, CB-1320 и CB-1820
1. 10 г смолы Rink Amide-AM (далее обозначаемой как "смола Rink", от Sunresin New Materials Co. Ltd., кат. № 183599-10-2) со степенью замещения 0,45 ммоль/г взвешивали и загружали в колонку для проведения твердофазной реакции; добавляли DCM и через растворитель барботировали газообразный азот для обеспечения набухания смолы в течение 30 минут; растворитель откачивали; защитные группы Fmoc на смоле удаляли с помощью DBLK, а затем смолу промывали 5 раз с помощью DMF. 4,79 г (9 ммоль) Fmoc-Lys(Dde)-OH и 1,47 г (10,8 ммоль) HOBt взвешивали и растворяли в DMF. К вышеупомянутому раствору при 0°C на ледяной бане добавляли 1,67 мл (10,8 ммоль) DIC и перемешивали для обеспечения активации в течение 5 минут. Раствор добавляли в вышеупомянутую реакционную колонку и проводили реакцию в течение 3 часов, а затем растворитель откачивали и смолу в реакционной колонке промывали 3 раза. Затем защитные группы Fmoc удаляли с помощью DBLK.
2. Вышеупомянутые операции повторяли и Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH и промежуточное соединение 108 последовательно конъюгировали в соответствии со структурами.
(Промежуточное соединение 108)
3. Защитные группы Dde удаляли дважды с помощью 2% гидразингидрата/DMF, каждый раз в течение 10 минут, а затем смолу промывали 5 раз с помощью DMF. Последовательно конъюгировали Fmoc-Glu-OtBu и птероевую кислоту. Наконец, смолу дважды конденсировали с метанолом и растворитель откачивали с получением 17,4 г защищенной пептидной смолы.
4. 17,4 г пептидной смолы, полученной на предыдущей стадии, добавляли в одногорлую колбу объемом 250 мл; 139 мл буфера для лизиса (TFA: H2O: TIS=95: 3: 2 (объемное соотношение)) предварительно получали и 2,1 г DTT взвешивали и добавляли к буферу для лизиса. Буфер для лизиса добавляли в вышеупомянутую колбу и смесь подвергали реакции при комнатной температуре в течение 2,5 часов и фильтровали; смолу продолжали промывать с помощью 30 мл TFA; вышеупомянутый фильтрат объединяли, и смесь добавляли к 834 мл абсолютного эфира с осаждением твердого вещества желтого цвета и центрифугировали с получением твердого вещества, которое промывали абсолютным эфиром и высушивали в вакууме с получением 6,4 г неочищенного продукта в виде твердого вещества желтого цвета и с выходом 93,4% и чистотой 82,3% согласно результатам HPLC. Продукт разделяли с помощью препаративной HPLC (условия: колонка C18, подвижная фаза A: 0,1% трифторуксусная кислота в воде, B: ацетонитрил, градиент элюирования: (15-25)%B, время элюирования: 60 минут; фракции собирали); и фракцию, содержащую соответствующий продукт, лиофилизировали с получением 4,73 г 20BK-SM09 с чистотой 98,8%.
5. 4,09 г (3,11 ммоль) Mc-Val-Cit-PAB-MMAE (LT1002) взвешивали и добавляли в одногорлую колбу объемом 1000 мл, а также добавляли 500 мл фосфатного буфера и 100 мл ацетонитрила; раствор перемешивали и поддерживали при pH=7,2 до получения прозрачного раствора; и добавляли 4,73 г (3,11 ммоль) промежуточного соединения 20BK-SM09 и обеспечивали протекание реакции в смеси при комнатной температуре в течение 2 часов, в течение которых реакцию контролировали с помощью HPLC. После завершения реакции смесь фильтровали и фильтрат разделяли с помощью препаративной HPLC (условия: колонка C18, подвижная фаза A: раствор бикарбоната аммония (pH=7,2), B: ацетонитрил, градиент элюирования: (25-35)%B, время элюирования: 60 минут; фракции собирали); фракцию, содержащую соответствующий продукт, лиофилизировали с получением 6,96 г продукта CB-20BK с чистотой 98,8% и выходом 78,8%.
Таким же образом можно получить конъюгированные соединения CB-18G, CB-20B, CB-10S, CB-20C, FA-MMAE (с показанной ниже структурой), CB-20AK (с показанной ниже структурой), CB-1020, CB-1320 и CB-1820, выполняя аналогичные стадии в вышеупомянутых способах.
(FA-MMAE)
(CB-20AK)
Синтез конъюгированных соединений CB-50S, CB-60S и CB-60SK
1. 10 г смолы Wang (от Sunresin New Materials Co. Ltd., кат. № 1365700-43-1) со степенью замещения 1,1 ммоль/г взвешивали и загружали в колонку для проведения твердофазной реакции; добавляли DMF и через растворитель барботировали газообразный азот для обеспечения набухания смолы в течение 30 минут; 14,3 г (22 ммоль) Fmoc-Arg(pbf)-OH, 3,56 г (26,4 ммоль) HOBt и 0,27 г (2,2 ммоль) DMAP взвешивали и растворяли в DMF; при 0°C на ледяной бане добавляли 4,1 мл (26,4 ммоль) DIC и перемешивали для обеспечения активации в течение 5 минут; раствор добавляли в реакционную колонку и проводили реакцию в течение 3 часов, а затем растворитель откачивали и смолу промывали 3 раза.
2. 10,4 мл уксусного ангидрида и 8,9 мл пиридина растворяли в 50 мл DMF и смешивали, а после промывки на вышеуказанных стадиях добавляли смолу; смесь блокировали при комнатной температуре в течение 5 часов и трижды промывали с помощью DMF; и смолу конденсировали с метанолом, а затем растворитель откачивали с получением Fmoc-Arg(pbf)-смолы Wang, степень замещения которой, как было определено, составляла 0,53 ммоль/г.
3. 3,8 г (2 ммоль) Fmoc-Arg(pbf)-смолы Wang (степень замещ. = 0,53 ммоль/г) взвешивали и загружали в реакционную колонку; смолу промывали 3 раза с помощью DMF, а затем оставляли набухать в течение 30 минут, что обеспечивали путем добавления DMF. Затем защитные группы Fmoc удаляли с помощью DBLK и смолу промывали 6 раз с помощью DMF. 2,0 г (6 ммоль) Fmoc-Pro-OH и 0,97 г (7,2 ммоль) HOBt взвешивали и растворяли в DMF; при 0°C на ледяной бане добавляли 1,1 мл (7,2 ммоль) DIC и перемешивали для обеспечения активации в течение 5 минут; смесь добавляли в реакционную колонку и проводили реакцию в течение 2 часов; а затем защитные группы Fmoc удаляли с помощью DBLK.
4. Вышеупомянутые операции повторяли и Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-пропаргил-Gly-OH, Fmoc-Glu-OtBu и птероевую кислоту последовательно конъюгировали в соответствии со структурами. Смолу дважды конденсировали с метанолом и растворитель откачивали с получением 8,4 г пептидной смолы.
5. 8,4 г пептидной смолы, полученной на предыдущей стадии, добавляли в одногорлую колбу объемом 250 мл; 67 мл буфера для лизиса (TFA: H2O: TIS=95: 3: 2 (объемное соотношение)) предварительно получали и 0,92 г DTT взвешивали и добавляли к буферу для лизиса. Буфер для лизиса добавляли в колбу и смесь подвергали реакции при комнатной температуре в течение 2,5 часов; смолу фильтровали и промывали с помощью 20 мл TFA; фильтрат объединяли, и смесь добавляли к 402 мл абсолютного эфира с осаждением твердого вещества желтого цвета и центрифугировали с получением твердого вещества, которое промывали абсолютным эфиром и высушивали в вакууме с получением 4,06 г неочищенного продукта в виде твердого вещества желтого цвета и с выходом 97,3% и чистотой 84,6% согласно результатам HPLC. Продукт разделяли с помощью препаративной HPLC (условия: колонка C18, подвижная фаза A: 0,1% трифторуксусная кислота в воде, B: ацетонитрил, градиент элюирования: (20-29)%B, время элюирования: 60 минут; фракции собирали); и фракцию, содержащую соответствующий продукт, лиофилизировали с получением 2,86 г 50S-SM09 с чистотой 97,6%.
6. 1,29 г (1,37 ммоль) LT1000N3 взвешивали и добавляли в одногорлую колбу объемом 500 мл, и добавляли 270 мл смешанного растворителя (CAN: H2O=1: 4) и 393 мг (2,74 ммоль) CuBr и перемешивали. Добавляли 2,86 г (1,37 ммоль) промежуточного соединения 50S-SM09 и обеспечивали протекание реакции в смеси при комнатной температуре в течение 2-3 часов, в течение которых реакцию контролировали с помощью HPLC. После завершения реакции смесь фильтровали и фильтрат разделяли с помощью препаративной HPLC (условия: колонка C18, подвижная фаза A: 0,1% трифторуксусная кислота в воде, B: ацетонитрил, градиент элюирования: (22-40)%B, время элюирования: 60 минут; фракции собирали); и фракцию, содержащую соответствующий продукт, лиофилизировали с получением 3,17 г CB-50S с чистотой 98,6% и выходом 76,4%.
Таким же образом можно получить конъюгированные соединения CB-60S и CB-60SK, выполняя аналогичные стадии в вышеупомянутых способах.
Синтез CB-20R
1. 5 г смолы Rink со степенью замещения 0,45 ммоль/г взвешивали и загружали в колонку для проведения твердофазной реакции; добавляли DCM и через растворитель барботировали газообразный азот для обеспечения набухания смолы в течение 30 минут; растворитель откачивали; защитные группы Fmoc на смоле удаляли с помощью DBLK, а затем смолу промывали 5 раз с помощью DMF. 2,4 г (4,5 ммоль) Fmoc-Lys(Dde)-OH и 0,74 г (5,4 ммоль) HOBt взвешивали и растворяли в DMF; при 0°C на ледяной бане добавляли 0,84 мл (5,4 ммоль) DIC и перемешивали для обеспечения активации в течение 5 минут; смесь добавляли в реакционную колонку и проводили реакцию в течение 3 часов; и растворитель откачивали и смолу промывали 3 раза. Затем защитные группы Fmoc удаляли с помощью DBLK.
2. Вышеупомянутые операции повторяли и Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH и промежуточное соединение 108 последовательно конъюгировали в соответствии со структурами.
3. Защитные группы Dde удаляли дважды с помощью 2% гидразингидрата/DMF, каждый раз в течение 10 минут, а затем смолу промывали 5 раз с помощью DMF. Конъюгировали сложный DOTA-трис(tBu)-эфир. Затем защитные группы Dde удаляли дважды с помощью 2% гидразингидрата/DMF, каждый раз в течение 10 минут, а затем смолу промывали 5 раз с помощью DMF. Последовательно конъюгировали Fmoc-Glu-OtBu и птероевую кислоту, и, наконец, смолу дважды конденсировали с метанолом и растворитель откачивали с получением 9,2 г защищенной пептидной смолы.
4. 9,2 г пептидной смолы, полученной на предыдущей стадии, добавляли в одногорлую колбу объемом 250 мл; 74 мл буфера для лизиса (TFA: H2O: TIS=95: 3: 2 (объемное соотношение)) предварительно получали и 1,05 г DTT взвешивали и добавляли к буферу для лизиса. Буфер для лизиса добавляли в колбу и смесь подвергали реакции при комнатной температуре в течение 2,5 часов; смолу фильтровали и промывали с помощью 20 мл TFA; фильтрат объединяли, и смесь добавляли к 560 мл абсолютного эфира с осаждением твердого вещества желтого цвета и центрифугировали с получением твердого вещества, которое промывали абсолютным эфиром и высушивали в вакууме с получением 3,8 г неочищенного продукта в виде твердого вещества желтого цвета и с выходом 87,4% и чистотой 81,2% согласно результатам HPLC. Продукт разделяли с помощью препаративной HPLC (условия: колонка C18, подвижная фаза A: 0,1% трифторуксусная кислота в воде, B: ацетонитрил, градиент элюирования: (15-25)%B, время элюирования: 60 минут; фракции собирали); и фракцию, содержащую синтезированный продукт, лиофилизировали с получением 2,9 г 20R-SM09 с чистотой 97,8%.
5. Обеспечивали образование комплекса 20R-SM09 с радионуклидным ионом M с получением CB-20R. В частности, радиоактивную метку 177Lu (приблизительно 50 МБк) смешивали со 100 мкл 0,5 М натрий-ацетатного буфера (pH=5). Смешивали 40 мкл водного раствора 1 мM CB-20R, растворенного в 10% DMSO, 2 мкл насыщенного раствора аскорбиновой кислоты и 100 мкл раствора, содержащего 177Lu, и смесь нагревали до 95°C в течение 10 минут. Метку выявляли с помощью радио-HPLC (в течение 5 минут; 0%-100% ACN в воде; колонка C18).
Синтез соединения CR19425
1. Под защитой N2 в реакционную колбу добавляли 441,4 мг CR19420 (со структурой, показанной для приведенной выше стадии реакции) и 8,0 мл DMF, перемешивали, растворяли и охлаждали на ледяной бане; затем добавляли 459,2 мг HATU и 380 мкл DIPEA и перемешивали в течение получаса; а затем добавляли 500,0 мг CR19419 (со структурой, показанной для приведенной выше стадии реакции) и 190 мкл DIPEA, и смесь подвергали реакции при комнатной температуре до завершения реакции. После завершения реакции реакционный раствор выливали в водный раствор уксусной кислоты; твердое вещество осаждали и фильтровали, а осадок на фильтре промывали водным раствором уксусной кислоты и водой и высушивали в вакууме с получением 835,7 мг CR19421 (со структурой, показанной для приведенной выше стадии реакции) в виде коричневого порошка и с чистотой 90,0% согласно результатам HPLC и выходом 90,6%.
2. Под защитой N2 в реакционную колбу добавляли 835,7 мг CR19421 и 16 мл 10% раствора пиперидина в DMF и проводили реакцию при комнатной температуре в течение получаса. После завершения реакции реакционный раствор выливали в TFA/MTBE; твердое вещество осаждали и фильтровали, а осадок на фильтре промывали с помощью МТВЕ и высушивали в вакууме с получением 599,7 мг CR19422 (со структурой, показанной для приведенной выше стадии реакции) в виде серо-зеленого порошка с чистотой 84,7% согласно результатам HPLC и выходом 83,0%.
3. Под защитой N2 в реакционную колбу добавляли 599,7 мг CR19422, 586,7 мг CR19424 (со структурой, показанной для приведенной выше стадии реакции) и 15 мл DMF, перемешивали, растворяли и охлаждали на ледяной бане; затем добавляли 495,7 мг HATU и 410 мкл DIPEA и проводили реакцию при комнатной температуре. После завершения реакции реакционный раствор подвергали препаративной очистке и ацетонитрил удаляли при пониженном давлении из раствора чистого продукта; остаток экстрагировали смешанным растворителем на основе дихлорметана и метанола, концентрировали и высушивали с получением 674,9 мг CR19423 (со структурой, показанной для приведенной выше стадии реакции) в виде желтого порошка и с чистотой 88,4% согласно результатам HPLC и выходом 63,1%.
4. Под защитой N2 в реакционную колбу добавляли 14,8 мг CR19423, 3,0 мл буфера PBS (pH=6,6) и 3,0 мл ацетонитрила, перемешивали и растворяли; затем добавляли 32,9 мг CBSM09, и смесь доводили до pH 6,6-6,8 с помощью Na2HPO4 и проводили реакцию в течение получаса. После завершения реакции реакционный раствор подвергали препаративной очистке и чистый продукт лиофилизировали с получением 21,8 мг CR19425 в виде желтого порошка и с чистотой 95,6% согласно результатам HPLC и выходом 48,8%.
Синтез соединения CR19426
1. Под защитой N2 в реакционную колбу добавляли 25,2 мг CR19423, 3,0 мл буфера PBS (pH=6,6) и 3,0 мл ацетонитрила, перемешивали и растворяли; затем добавляли 55,5 мг 18G-SM09, и смесь доводили до pH 6,6-6,8 с помощью Na2HPO4 и проводили реакцию в течение получаса. После завершения реакции реакционный раствор подвергали препаративной очистке и чистый продукт лиофилизировали с получением 44,6 мг CR19426 в виде желтого порошка и с чистотой 95,4% согласно результатам HPLC и выходом 55,2%.
Синтез соединения CR19428
1. Под защитой N2 в реакционную колбу добавляли 486 мг CR19423, 3,0 мл буфера PBS (pH=6,6) и 3,0 мл ацетонитрила, перемешивали и растворяли; затем добавляли 712 мг 20BK-SM09, и смесь доводили до pH 6,6-6,8 с помощью Na2HPO4 и проводили реакцию в течение получаса. После завершения реакции реакционный раствор подвергали препаративной очистке и чистый продукт лиофилизировали с получением 508 мг CR19428 в виде желтого порошка и с чистотой 96,7% согласно результатам HPLC и выходом 42,3%.
Пример 2. Определение аффинности конъюгированных соединений по отношению к белкам-мишеням
1. Определение аффинности связывания CB-20BK с белком FOLR1
Приборы, материалы и реактивы для эксперимента
BIAcore T200 (GE)
Чип CM5 (GE, кат. № 29104988)
Буфер: 10-кратный буфер HBS-EP+ (GE, кат. № BR100669), разбавленный в 10 раз деионизированной водой перед применением.
Набор для иммобилизации посредством аминогруппы (GE, кат. № BR100050)
Реактивы для регенерации: 10 мM глицин 2,0 (GE, кат. № BR100355)
10 мM глицин 3,0 (GE, кат. № BR100357)
Стадии эксперимента
Эксперимент проводили в соответствии с инструкцией к BIAcore T200 (GE) для определения аффинности аналитов CB-20BK, CB-20AK, фолата (FA) и FA-MMAE по отношению к FOLR1. В ходе эксперимента чип CM5 конъюгировали с лигандом к FOLR1 (R&D System, кат. № 5646-FR). Результаты эксперимента показаны в таблице 4.
Таблица 4. Аффинность связывания CB-20BK и родственных соединений с FOLR1
"N/D" означает, что специфического связывания обнаружено не было.
В таблице 4 показано, что CB-20BK специфически связывается с FOLR1 с высокой аффинностью. Аффинность связывания CB-20BK с FOLR1 является в незначительной степени более слабой, чем аффинность связывания FA или FA-MMAE с FOLR1. CB-20AK не содержит фолатного фрагмента CB-20BK, и в эксперименте у него не было обнаружено способности к специфическому связыванию с FOLR1.
2. Определение аффинности связывания CB-20BK с белком FOLH1
Приборы, материалы и реактивы для эксперимента
GatorTM (Probe Life)
Зонд SA (Probe Life, кат. № 1906018)
Буфер: буфер Q (Probe Life), 10 мМ, pH=7,4
Стадии эксперимента
(1) Стадии синтеза аналита биотин-CB-20BK
1) 5,1 г смолы Rink со степенью замещения 0,45 ммоль/г взвешивали и загружали в колонку для проведения твердофазной реакции; добавляли DCM и барботировали газообразный азот для обеспечения набухания смолы в течение 30 минут; растворитель откачивали; защитные группы Fmoc удаляли с помощью DBLK, а затем смолу промывали 5 раз с помощью DMF. 2,45 г Fmoc-Lys(Dde)-OH и 0,75 г HOBt взвешивали и растворяли в DMF; при 0°C на ледяной бане добавляли 0,83 мл DIC для обеспечения активации в течение 5 минут; смесь добавляли в реакционную колонку и проводили реакцию в течение 3 часов; и растворитель откачивали и смолу промывали 3 раза. Затем защитные группы Fmoc удаляли с помощью DBLK.
2) Вышеупомянутые операции повторяли и Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH и промежуточное соединение 108 последовательно конъюгировали в соответствии со структурами.
3) Защитные группы Dde удаляли дважды с помощью 2% гидразингидрата/DMF, каждый раз в течение 10 минут, а затем смолу промывали 5 раз с помощью DMF. Последовательно конъюгировали Fmoc-Lys(биотин)-OH, Fmoc-Glu-OtBu и птероевую кислоту, и после конъюгирования птероевой кислоты смолу дважды промывали с помощью DMF; и, наконец, смолу конденсировали с метанолом и растворитель откачивали с получением 9,7 г защищенной пептидной смолы.
4) 9,7 г пептидной смолы, полученной на предыдущей стадии, добавляли в одногорлую колбу объемом 250 мл; 77,6 мл буфера для лизиса (TFA: H2O: TIS=95: 3: 2 (объемное соотношение)) предварительно получали и 1,1 г DTT взвешивали и добавляли к буферу для лизиса. Буфер для лизиса добавляли в колбу и смесь подвергали реакции при комнатной температуре в течение 2,5 часов; смолу фильтровали и промывали с помощью 20 мл TFA; фильтрат объединяли, и смесь добавляли к 466 мл метил-трет-бутилового эфира с осаждением твердого вещества желтого цвета и центрифугировали с получением твердого вещества, которое промывали метил-трет-бутиловым эфиром и высушивали в вакууме с получением 4,6 г твердого вещества желтого цвета с чистотой 83,2% согласно результатам HPLC. Продукт разделяли с помощью препаративной HPLC и лиофилизировали с получением 2,1 г биотин-20BK-SM09 с чистотой не менее 95%.
5) 500 мг Mc-Val-Cit-PAB-MMAE (LT1002) взвешивали и добавляли в одногорлую колбу объемом 250 мл, а также добавляли 65 мл фосфатного буфера и 20 мл ацетонитрила; раствор перемешивали и поддерживали при pH=7,2 до получения прозрачного раствора; и добавляли 785 мг промежуточного соединения биотин-20BK-SM09 и обеспечивали протекание реакции в смеси при комнатной температуре в течение 2 часов, в течение которых реакцию контролировали с помощью HPLC. После завершения реакции смесь фильтровали, разделяли с помощью препаративной HPLC и лиофилизировали с получением 723 мг биотин-CB-20BK с чистотой 96,8% и выходом 59,4%.
(2) Эксперимент проводили в соответствии с инструкцией к GatorTM (Probe Life) для определения аффинности связывания биотин-CB-20BK с FOLH1. В ходе эксперимента зонд SA связывается с лигандом биотин-CB-20BK, и аналитом является FOLH1 (Sino Biologicals, кат. № 15877-H07H). Результаты эксперимента показаны в таблице 5.
Таблица 5. Аффинность связывания CB-20BK с FOLH1
В таблице 5 показано, что CB-20BK связывается с FOLH1 с высокой аффинностью.
3. FOLH1 связывается с комплексом CB-20BK-FOLR1
Материалы и реактивы для эксперимента
BIAcore T200 (GE)
Чип CM5 (GE, кат. № 29104988)
Буфер: 10-кратный буфер HBS-EP+ (GE, кат. № BR100669), разбавленный в 10 раз деионизированной водой перед применением.
Набор для иммобилизации посредством аминогруппы (GE, кат. № BR100050)
Реактивы для регенерации: 10 мM глицин 2,0 (GE, кат. № BR100355)
10 мM глицин 3,0 (GE, кат. № BR100357)
Стадии эксперимента
Чип CM5 конъюгировали с лигандом, представляющим собой FOLR1 (R&D System, кат. № 5646-FR).
Аналит: CB-20BK, FA-MMAE и FOLH1 (Sino Biologicals, кат. № 15877-H07H).
Согласно руководству по эксплуатации BIAcore T200 (GE) FOLR1 конъюгировали с чипом CM5; при этом сначала загружали CB-20BK или FA-MMAE, а затем загружали FOLH1; и проводили обнаружение связывания FOLH1 с комплексом CB-20BK-FOLR1. Результаты эксперимента показаны в таблице 6.
Таблица 6. Связывание комплекса CB-20BK-FOLR1 с раствором FOLH1 при различных концентрациях
В таблице 6 показано, что в отношении раствора FOLH1 с высокой концентрацией, количество FOLH1, связанного с комплексом CB-20BK-FOLR1, значительно выше, чем количество FOLH1, связанного с комплексом FA-MMAE-FOLR1, что показывает непрерывную тенденцию к увеличению. Связывание FOLH1 с комплексом FA-MMAE-FOLR1 имеет тенденцию к насыщению при высокой концентрации. Этот эксперимент подтвердил, что CB-20BK может связываться с рецепторами FOLR1 и FOLH1 с высокой аффинностью.
Пример 3. Исследование связывания и эндоцитоза клетками-мишенями конъюгатов лигандов
1. Эксперимент по связыванию и эндоцитозу клетками конъюгированного соединения CB-20BK
Синтез меченых образцов Cy5-pep-20BK, Cy5-FA и Cy5-pep-20AK
(1) 2 г смолы Rink со степенью замещения 0,45 ммоль/г взвешивали и загружали в колонку для проведения твердофазной реакции; добавляли DCM и через растворитель барботировали газообразный азот для обеспечения набухания смолы в течение 30 минут; растворитель откачивали; защитные группы Fmoc удаляли с помощью DBLK, а затем смолу промывали 5 раз с помощью DMF. 0,96 г (1,8 ммоль) Fmoc-Lys(Dde)-OH и 0,3 г (2,2 ммоль) HOBt взвешивали и растворяли в DMF; при 0°C на ледяной бане добавляли 0,33 мл (2,2 ммоль) DIC и перемешивали для обеспечения активации в течение 5 минут; смесь добавляли в реакционную колонку и проводили реакцию в течение 3 часов; и растворитель откачивали и смолу промывали 3 раза. Затем защитные группы Fmoc удаляли с помощью DBLK.
(2) Вышеупомянутые операции повторяли и Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH и промежуточное соединение 108 последовательно конъюгировали в соответствии со структурами:
(3) Защитные группы Dde удаляли дважды с помощью 2% гидразингидрата/DMF, каждый раз в течение 10 минут, а затем смолу промывали 5 раз с помощью DMF. Последовательно конъюгировали Fmoc-Lys(Dde)-OH, Fmoc-Glu-OtBu и птероевую кислоту.
(4) Защитные группы Dde удаляли дважды с помощью 2% гидразингидрата/DMF, каждый раз в течение 10 минут, а затем смолу промывали 5 раз с помощью DMF; смолу конъюгировали с Cy5-COOH, а затем дважды промывали с помощью DMF; и, наконец, смолу дважды конденсировали с метанолом и растворитель откачивали с получением 3,6 г защищенной пептидной смолы.
(5) 3,6 г пептидной смолы, полученной на предыдущей стадии, добавляли в одногорлую колбу объемом 50 мл; 29 мл буфера для лизиса (TFA: H2O: TIS=95: 3: 2 (объемное соотношение)) предварительно получали и 0,4 г DTT взвешивали и добавляли к буферу для лизиса. Буфер для лизиса добавляли в колбу и смесь подвергали реакции при комнатной температуре в течение 2,5 часов; смолу фильтровали и промывали с помощью 8 мл TFA; фильтрат объединяли, и смесь добавляли к 173 мл абсолютного эфира с осаждением твердого вещества желтого цвета и центрифугировали с получением твердого вещества, которое промывали абсолютным эфиром и высушивали в вакууме с получением 1,9 г неочищенного продукта в виде твердого вещества синего цвета и с выходом 89,6% и чистотой 76,3% согласно результатам HPLC. Продукт разделяли с помощью препаративной HPLC (условия: колонка C18, подвижная фаза A: 0,1% трифторуксусная кислота в воде, B: ацетонитрил, градиент элюирования: (20-28)%B, время элюирования: 50 минут; фракции собирали); и фракцию, содержащую соответствующий продукт, лиофилизировали с получением 736 мг Cy5-pep-20BK с чистотой 93,4%.
Таким же образом можно получить соединения Cy5-FA и Cy5-pep-20AK, выполняя аналогичные стадии в вышеупомянутых способах.
(Cy5-pep-20BK)
(Cy5-pep-20AK)
(Cy5-FA)
Эксперимент по обнаружению связывания и эндоцитоза клетками для образцов Cy5-pep-20AK/Cy5-pep-20BK способом проточной цитометрии
Информация касательно образца: Cy5-pep-20AK и Cy5-pep-20BK.
Клеточные линии: клетки рака предстательной железы человека LNCaP, клетки рака предстательной железы человека Du145, клетки рака яичника человека SKOV3 и клетки рака легкого человека NCI-H460.
Основные реактивы: среда IMDM, фетальная бычья сыворотка, раствор пенициллин-стрептомицина, L-глутамин и PBS.
Выполняемые в рамках эксперимента процедуры
(1) Культура клеток: клетки обрабатывали трипсином, собирали и подсчитывали, а затем клетки добавляли в несколько флаконов для культивирования, содержащих полную среду; флаконы для культивирования помещали в инкубатор при 37°C, 5% CO2 для культивирования клеток, и, наконец, приблизительно 5 × 106 клеток собирали в центрифужную пробирку.
(2) Инкубирование образцов: Образцы Cy5-pep-20AK/Cy5-pep-20BK разбавляли до 8 нмоль/л с помощью PBS; суспензию клеток центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 минут; супернатант удаляли, а остаток один раз промывали с помощью PBS; клетки равномерно суспендировали и их количество поровну делили на разные центрифужные пробирки согласно схеме эксперимента; PBS удаляли центрифугированием; 200 мкл рабочего раствора образца добавляли в каждую пробирку и инкубировали при 37°C в течение 15, 30, 60 и 90 минут соответственно, и 1 пробирку, в которую был добавлен только PBS, использовали в качестве холостого контроля; при этом все операции проводили без воздействия света.
(3) Промывка и загрузка: рабочий раствор удаляли центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 минут, и клетки промывали 3 раза с помощью PBS, и добавляли соответствующее количество PBS для суспендирования клеток до 1 × 106 клеток/мл; проточный цитометр Beckman CytoFLEX включали заранее, чтобы завершить начальный процесс очистки; образцы клеток загружали последовательно, и флуоресценцию 10000 живых клеток считывали в канале APC; при этом все операции проводили без воздействия света.
(4) Анализ данных: получали абсолютное значение MFI (средней интенсивности флуоресценции) для флуоресценции APC каждого образца клеток, а также относительное значение MFI по сравнению с холостым контролем, и строили линейный график данных в соответствии с относительным значением MFI.
Результаты и анализ
Таблица 7. Уровни экспрессии FOLR1 и FOLH1 в разных клеточных линиях
(со ссылкой на данные Depmap, https://depmap.org/portal/)
Согласно данным Depmap, данные, соответствующие 0 или отрицательному результату, выражаются как "-", данные, составляющие 0,001-0,499, выражаются как "+/-", данные, составляющие 0,500-1,499, выражаются как "+", данные, составляющие 1,500-2,499, выражаются как "2+", и так далее.
Интенсивность флуоресценции клеток определяли соответственно через 15 минут, 30 минут, 60 минут и 90 минут инкубации, и результаты нанесены на график и показаны на фиг. 2A и 2B. Связывание и эндоцитоз клетками образца Cy5-pep-20BK можно увидеть на фигурах. По сравнению с клеточной линией DU145 с относительно низким уровнем экспрессии FOLR1 и клеточной линией NCI-H460 с относительно низким уровнем экспрессии FOLH1 клеточная линия LNCaP с относительно высоким уровнем экспрессии FOLR1 и клеточная линия SKOV3 с относительно высоким уровнем экспрессии FOLH1 характеризуются значительно более высокой интенсивностью флуоресценции CB-20BK, которое подвергалось связыванию и эндоцитозу. Поскольку Cy5-pep-20AK содержит только лиганд к FOLH1 и не содержит лиганда к FOLR1, представляющего собой FA, Cy5-pep-20AK демонстрирует высокий уровень связывания и эндоцитоза в случае клеток LNCaP с высоким уровнем экспрессии FOLH1 и демонстрирует средний уровень связывания и эндоцитоза в случае клеток SKOV3 с умеренным уровнем экспрессии FOLH1; в этих двух клеточных линиях уровень связывания и эндоцитоза для Cy5-pep-20AK был значительно ниже, чем для Cy5-pep-CB-20BK. Степень связывания и интернализации клетками конъюгата лиганда положительно коррелирует с уровнями экспрессии клеточных рецепторов.
2. Эксперимент по связыванию и эндоцитозу клетками однолигандного конъюгата Cy5-FA
Информация касательно образца: Cy5-FA
Клеточные линии: клетки рака шейки матки Hela, клетки рака яичника человека SKOV3 и клетки рака легкого человека A549.
Основные реактивы: среда IMDM, фетальная бычья сыворотка, раствор пенициллин-стрептомицина, L-глутамин, PBS и гистологическая среда, препятствующая гашению флуоресценции, содержащая DAPI.
Выполняемые в рамках эксперимента процедуры
(1) Клетки, растущие на покровных стеклах: покровные стекла помещали в 24-луночный планшет; клетки обрабатывали трипсином, собирали и подсчитывали, а затем клетки разбавляли полной средой для культивирования клеток до приблизительно 2 × 105 клеток/мл; 500 мкл разбавленного раствора клеток добавляли в каждую лунку 24-луночного планшета; и планшет помещали в инкубатор при 37°C, 5% CO2 на 48 часов для культивирования.
(2) Инкубация образцов: образец Cy5-FA разбавляли в среде IMDM до 73 нмоль/л; культуральную среду в 24-луночном планшете удаляли; 200 мкл рабочего раствора образца добавляли к покровным стеклам с клетками в каждой лунке и инкубировали при 37°C в течение 15, 30 и 60 минут соответственно, а 1 лунку, в которую добавляли только среду IMDM, использовали в качестве холостого контроля; при этом все операции проводили без воздействия света.
(3) Промывка и заливка: рабочий раствор в 24-луночном планшете удаляли и планшет промывали 3 раза предварительно нагретым PBS при 37°C; покровные стекла с клетками извлекали и 5 мкл гистологической среды, препятствующей гашению флуоресценции, содержащей DAPI, добавляли по каплям на предметные стекла, а затем накрывали покровными стеклами с клетками для завершения заливки; при этом все операции проводили без воздействия света.
(4) Интерпретация изображений для образцов. Флуоресцентный микроскоп Leica DM2500 включали для предварительного нагрева возбудителя флуоресценции в течение 15 минут; в одном положении фотографировали ядра клеток и флуоресцеин Cy5 в соответствующем канале флуоресценции и слияние изображений завершали с применением программного обеспечения.
Связывание и эндоцитоз клетками образца Cy5-FA через 15 минут и 30 минут можно увидеть на фиг. 3, а интенсивность флуоресценции в линиях клеток Hela и SKOV-3 с высоким уровнем экспрессии FOLR1 значительно выше, чем в линии клеток A549 с относительно низким уровнем экспрессии FOLR1. Степень связывания и интернализации клетками конъюгата лиганда положительно коррелирует с уровнями экспрессии клеточных рецепторов.
Пример 4. Эксперимент по подавлению размножения клеток в присутствии конъюгированных соединений
1. Эксперимент по подавлению размножения опухолевых клеток в присутствии CB-20BK
Информация касательно образца: CB-20BK.
Клеточные линии: клетки эпидермоидной карциномы полости рта человека KB, клетки рака молочной железы человека T-47D, клетки рака легкого человека NCI-H460, клетки аденокарциномы легкого человека CALU-3, клетки рака печени человека HuH-7 и клетки рака предстательной железы человека LNCaP.
Основные реактивы: среда IMDM, фетальная бычья сыворотка, раствор пенициллин-стрептомицина, L-глутамин и CCK8.
Выполняемые в рамках эксперимента процедуры
1) Посев клеток
Клетки подготавливали заранее, обрабатывали трипсином, собирали и подсчитывали; с помощью полной среды для культивирования клеток клетки KB разбавляли до 2,5 × 104 клеток/мл, клетки T-47D разбавляли до 1,3 × 104 клеток/мл, клетки NCI-H460 разбавляли до 3,5 × 104 клеток/мл, клетки CALU-3 разбавляли до 4,0 × 104 клеток/мл, клетки HuH-7 разбавляли до 3,0 × 104 клеток/мл и клетки LNCaP разбавляли до 8,0 × 104 клеток/мл; 100 мкл разбавленного раствора клеток добавляли в каждую лунку 96-луночных планшетов; и лунки с отрицательным контролем и холостым контролем подготавливали для каждого планшета. 96-луночные планшеты с добавленными клетками помещали в инкубатор при 37°C, 5% CO2 для культивирования в течение ночи.
2) Разбавление и добавление образцов
Образцы разбавляли культуральной средой до требуемых концентраций (см. таблицу 8). В каждую лунку 96-луночных планшетов, которые культивировали в течение ночи, добавляли 50 мкл разбавленных образцов, при этом обеспечивая по 3 повторности для лунок; подготавливали отрицательные контроли и холостые контроли; и планшеты помещали в инкубатор при 37°C, 5% CO2 на 72 часа для культивирования.
Таблица 8. Концентрация образца (CB-20BK) после разбавления
3) Проявление окрашивания и считывание планшета
В каждую лунку добавляли по 15 мкл (10% объема жидкости в лунке) обеспечивающего проявление цвета раствора из CCK-8; планшеты инкубировали при 37°C в течение подходящего времени (при этом следует стараться поддерживать значение OD в диапазоне 1,0-2,0); крышки 96-луночных планшетов снимали и планшеты считывали при 450 нм на считывающем устройстве для микропланшетов (Molecular Devices Spectra MAX Plus).
4) Обработка данных
Данные редактировали с помощью SoftMax Pro и строили кривую посредством метода четырехпараметрической подгонки.
5) Результаты эксперимента и их анализ
Согласно графику с кривыми, построенными посредством метода четырехпараметрической подгонки (фиг. 4A, где значение C соответствует IC50), CB-20BK оказывает подавляющий эффект в отношении роста и размножения линий опухолевых клеток KB, T-47D, NCI-H460, CALU-3, HuH-7 и LNCaP. Поскольку уровни экспрессии соответствующих рецепторов конъюгированных соединений в клетках являются разными, уровни подавления различаются. IC50 для клеточных линий T-47D, KB, LNCaP, HuH-7 и CALU-3 с относительно высоким уровнем экспрессии рецепторов значительно ниже, чем для клеточной линии NCI-H460 с относительно низким уровнем экспрессии рецепторов. CB-20BK демонстрирует корреляцию между эффектами подавления роста опухоли и уровнями экспрессии клеточных рецепторов.
2. Эксперимент по подавлению размножения линий опухолевых клеток LNCaP (клетки рака предстательной железы человека) и 22RV1 (клетки рака предстательной железы человека) конъюгированным соединением CB-20BK и родственными соединениями
Поскольку разные клетки имеют разную чувствительность к подавляющей клеточную пролиферацию токсичности полезной нагрузки в конъюгате лиганда, результаты количественного анализа иногда могут быть искажены. Выбирали серию клеточных линий с известными уровнями экспрессии рецепторов различных лигандов и тестировали в отношении ответа на подавляющие клеточную пролиферацию эффекты конъюгата лиганда и отдельной полезной нагрузки. Соотношение IC50 для отдельной полезной нагрузки и для конъюгата лиганда применительно к одной и той же клеточной линии использовали для устранения таких искажений результатов.
Родственные образцы: MMAE, CB-20BK, CB-20AK и FA-MMAE.
Выполняемые в рамках эксперимента процедуры Клетки LNCaP и 22RV1 подготавливали заранее, подсчитывали и высевали в 96-луночные планшеты для культивирования клеток при плотности клеток 4 × 104 клеток/мл и 2,0 × 104 клеток/мл соответственно (100 мкл/лунка); лунки с отрицательным контролем и холостым контролем подготавливали для каждого планшета. После культивирования адгезивных клеток в течение ночи разбавленные образцы, подлежащие тестированию, добавляли в количестве 50 мкл/лунка. Планшеты помещали в инкубатор при 37°C, 5% CO2 и культивировали в течение 68-72 часов. В каждую лунку добавляли по 15 мкл (10% объема жидкости в лунке) обеспечивающего проявление цвета раствора из CCK8; и планшеты инкубировали при 37°C в течение 45-70 минут, и каждый планшет считывали при 450 нм на считывающем устройстве для микропланшетов. Данные редактировали с помощью SoftMax Pro и строили кривую посредством метода подгонки по 4 параметрам. Расчетные данные представлены в таблице 9.
Таблица 9. Подавляющие эффекты MMAE, FA-MMAE, CB-20BK и CB-20AK в отношении пролиферации клеточных линий и уровни экспрессии генов рецепторов в клеточных линиях (со ссылкой на данные Depmap)
Из приведенной выше таблицы можно увидеть, что не имеется большой разницы в уровне экспрессии FOLR1 между LNCaP и 22RV1, а уровень экспрессии FOLH1 в случае LNCaP значительно выше, чем уровень экспрессии FOLH1 в случае 22RV1. CB-20BK (с лигандом к FOLH1 и лигандом к FOLR1) и CB-20AK (только с лигандом к FOLH1) оказывают подавляющие эффекты в отношении размножения обеих линий опухолевых клеток LNCaP и 22RV1. Подавляющие эффекты CB-20BK и CB-20AK в отношении клеток с разными уровнями экспрессии рецептора FOLH1 различаются. Соотношение IC50 для клеточной линии LNCaP с относительно высоким уровнем экспрессии рецептора FOLH1 в 2-4 раза выше, чем соотношение IC50 для клеточной линии 22RV1 с относительно низким уровнем экспрессии этого рецептора. FA-MMAE также оказывает подавляющий эффект в отношении размножения линий опухолевых клеток LNCaP и 22RV1. Поскольку уровень экспрессии FOLR1 в случае LNCaP и 22RV1 очень низкий, экспрессия в клетках LNCaP (уровень экспрессии гена FOLR1 составляет 0,3219 со ссылкой на данные Depmap) является слегка более высокой, чем в 22RV1 (уровень экспрессии гена FOLR1 составляет 0,0704 со ссылкой на данные Depmap), а соотношение IC50 для FA-MMAE между LNCaP и 22RV1 отличается только в 1,5 раза. Приведенные выше данные показывают, что подавляющие эффекты в отношении пролиферации клеток положительно коррелируют с уровнями экспрессии экспрессируемых клетками рецепторов FOLH1 и FOLR1.
3. Эксперимент по подавлению размножения линий опухолевых клеток PANC-1 (клетки рака поджелудочной железы человека) и CFPAC-1 (клетки рака поджелудочной железы человека) конъюгированным соединением CB-20BK и родственными соединениями
Родственные образцы: MMAE и CB-20BK.
Выполняемые в рамках эксперимента процедуры Клетки PANC-1 и CFPAC-1 подготавливали заранее, подсчитывали и высевали в 96-луночные планшеты для культивирования клеток при плотности клеток 4 × 104 клеток/мл (100 мкл/лунка); лунки с отрицательным контролем и холостым контролем подготавливали для каждого планшета. После культивирования адгезивных клеток в течение ночи разбавленные образцы, подлежащие тестированию, добавляли в количестве 50 мкл/лунка. Планшеты помещали в инкубатор при 37°C, 5% CO2 и культивировали в течение 68-72 часов. В каждую лунку добавляли по 15 мкл (10% объема жидкости в лунке) обеспечивающего проявление цвета раствора из CCK8; и планшеты инкубировали при 37°C в течение 45-70 минут, и каждый планшет считывали при 450 нм на считывающем устройстве для микропланшетов. Данные редактировали с помощью SoftMax Pro и строили кривую посредством метода подгонки по 4 параметрам. Расчетные данные представлены в следующей таблице.
Таблица 10. Подавляющие эффекты CB-20BK в отношении пролиферации клеточных линий и уровни экспрессии генов рецепторов в клеточных линиях
(со ссылкой на данные Depmap)
(MMAE)
(CB-20BK)
IC50 (CB-20BK)
Из таблицы 10 можно увидеть, что уровень экспрессии FOLH1 в случае CFPAC-1 очень низкий, а уровень экспрессии FOLR1 в случае CFPAC-1 значительно выше, чем в случае клеточной линии PANC1. CB-20BK оказывает подавляющий эффект в отношении размножения линий опухолевых клеток PANC-1 и CFPAC-1. Подавляющие эффекты в отношении клеток с разными уровнями экспрессии рецептора FOLR1 различаются. Соотношение IC50 для клеточной линии CFPAC-1 с относительно высоким уровнем экспрессии рецептора FOLR1 значительно выше, чем соотношение IC50 для PANC-1 с относительно низким уровнем экспрессии рецептора FOLR1, а подавляющие эффекты в отношении пролиферации клеток положительно коррелируют с уровнями экспрессии клеточного рецептора FOLR1.
Эксперименты 2 и 3 доказывают, что два лиганда в CB-20BK и их рецепторы (FOLR1 и FOLH1), экспрессируемые на клеточной поверхности, играют важную роль в подавлении соединением пролиферации опухолевых клеток.
4. Эксперимент по подавлению размножения опухолевых клеток в присутствии CB-20B
Информация касательно образца: CB-20B.
Клеточные линии: клетки рака легкого человека A549, клетки рака печени человека HuH-7, клетки эпидермоидной карциномы полости рта человека KB, клетки рака предстательной железы человека LNCaP, клетки рака предстательной железы человека DU145 и клетки рака молочной железы человека T-47D.
Основные реактивы: среда IMDM, фетальная бычья сыворотка, раствор пенициллин-стрептомицина, L-глутамин и CCK8.
Выполняемые в рамках эксперимента процедуры
1) Посев клеток
Клетки подготавливали заранее, обрабатывали трипсином, собирали и подсчитывали; клетки A549, клетки HuH-7, клетки KB и клетки DU145, разбавленные с помощью полной среды для культивирования клеток, высевали при плотности 2 × 104 клеток/мл, клетки T-47D высевали при плотности 1 × 105 клеток/мл и клетки LNCaP высевали при плотности 6 × 104 клеток/мл в 96-луночные планшеты; 100 мкл разбавленного раствора клеток добавляли в каждую лунку; и лунки с отрицательным контролем и холостым контролем подготавливали для каждого планшета. 96-луночные планшеты с добавленными клетками помещали в инкубатор при 37°C, 5% CO2 для культивирования в течение ночи.
2) Разбавление и добавление образцов
Образцы разбавляли культуральной средой до требуемых концентраций (см. таблицу 11). В каждую лунку 96-луночных планшетов, которые культивировали в течение ночи, добавляли 50 мкл разбавленных образцов, при этом обеспечивая по 3 повторности для лунок; подготавливали отрицательные контроли и холостые контроли; и планшеты помещали в инкубатор при 37°C, 5% CO2 на 72 часа для культивирования.
Таблица 11. Концентрация образца (CB-20B) после разбавления
3) Проявление окрашивания и считывание планшета
В каждую лунку добавляли по 15 мкл (10% объема жидкости в лунке) обеспечивающего проявление цвета раствора из CCK-8; планшеты инкубировали при 37°C в течение подходящего времени (при этом следует стараться поддерживать значение OD в диапазоне 1,0-2,0); крышки 96-луночных планшетов снимали и планшеты считывали при 450 нм на считывающем устройстве для микропланшетов (Molecular Devices Spectra MAX Plus).
4) Обработка данных
Данные редактировали с помощью SoftMax Pro и строили кривую посредством метода четырехпараметрической подгонки.
5) Результаты эксперимента и их анализ
Согласно графику с кривыми, построенными посредством метода четырехпараметрической подгонки (фиг. 4B, где значение C соответствует IC50), CB-20B оказывает подавляющий эффект в отношении роста и размножения линий опухолевых клеток A549, HuH-7, KB, LNcap, DU145 и T-47D. Поскольку уровни экспрессии соответствующих рецепторов конъюгированных соединений в клетках являются разными, уровни подавления различаются. IC50 для клеточных линий T-47D, LNcap, KB, HuH-7 и DU145 с относительно высоким уровнем экспрессии рецепторов значительно ниже, чем для клеточной линии A549 с относительно низким уровнем экспрессии рецепторов. CB-20B демонстрирует корреляцию между эффектами подавления роста опухоли и уровнями экспрессии клеточных рецепторов.
5. Эксперимент по подавлению размножения опухолевых клеток в присутствии CB-10S
Информация касательно образца: CB-10S.
Клеточные линии: клетки эпидермоидной карциномы полости рта человека KB, клетки рака легкого человека NCI-H460, клетки рака мочевого пузыря человека RT4, клетки рака молочной железы человека T-47D и клетки рака предстательной железы человека LNcap.
Основные реактивы: среда IMDM, фетальная бычья сыворотка, раствор пенициллин-стрептомицина, L-глутамин и CCK8.
Выполняемые в рамках эксперимента процедуры
1) Посев клеток
Клетки подготавливали заранее, обрабатывали трипсином, собирали и подсчитывали; с помощью полной среды для культивирования клеток клетки KB разбавляли до 3,5 × 104 клеток/мл, клетки LNCaP разбавляли до 8,0 × 104 клеток/мл, клетки T-47D разбавляли до 1,2 × 104 клеток/мл, клетки NCI-H460 разбавляли до 2,5 × 104 клеток/мл и клетки RT4 разбавляли до 1,2 × 104 клеток/мл; в каждую лунку 96-луночных планшетов добавляли 100 мкл разбавленного раствора клеток; и лунки с отрицательным контролем и холостым контролем подготавливали для каждого планшета. 96-луночные планшеты с добавленными клетками помещали в инкубатор при 37°C, 5% CO2 для культивирования в течение ночи.
2) Разбавление и добавление образцов
Образцы разбавляли культуральной средой до требуемых концентраций (см. таблицу 12). В каждую лунку 96-луночных планшетов, которые культивировали в течение ночи, добавляли 50 мкл разбавленных образцов, при этом обеспечивая по 3 повторности для лунок; подготавливали отрицательные контроли и холостые контроли; и планшеты помещали в инкубатор при 37°C, 5% CO2 на 72 часа для культивирования.
Таблица 12. Концентрация образца (CB-10S) после разбавления
3) Проявление окрашивания и считывание планшета
В каждую лунку добавляли по 15 мкл (10% объема жидкости в лунке) обеспечивающего проявление цвета раствора из CCK-8; планшеты инкубировали при 37°C в течение подходящего времени (при этом следует стараться поддерживать значение OD в диапазоне 1,0-2,0); крышки 96-луночных планшетов снимали и планшеты считывали при 450 нм на считывающем устройстве для микропланшетов (Molecular Devices Spectra MAX Plus).
4) Обработка данных
Данные редактировали с помощью SoftMax Pro и строили кривую посредством метода четырехпараметрической подгонки.
5) Результаты эксперимента и их анализ
Согласно графику с кривыми, построенными посредством метода четырехпараметрической подгонки (фиг. 4C, где значение C соответствует IC50), CB-10S оказывает подавляющий эффект в отношении роста и размножения линий опухолевых клеток KB, LNCaP, T-47D, RT4 и NCI-H460. Поскольку уровни экспрессии соответствующих рецепторов конъюгированных соединений в клетках являются разными, уровни подавления различаются. IC50 для клеточных линий KB, LNcap, T-47D и RT4 с относительно высоким уровнем экспрессии рецепторов значительно ниже, чем для клеточной линии NCI-H460 с относительно низким уровнем экспрессии рецепторов. CB-10S демонстрирует корреляцию между эффектами подавления роста опухоли и уровнями экспрессии клеточных рецепторов.
6. Эксперимент по подавлению размножения опухолевых клеток в присутствии CB-60S
Информация касательно образца: CB-60S.
Клеточные линии: клетки эпидермоидной карциномы полости рта человека KB, клетки рака молочной железы человека T-47D, клетки рака легкого человека NCI-H460, клетки аденокарциномы легкого человека CALU-3, клетки рака печени человека HuH-7 и клетки рака предстательной железы человека LNCaP.
Основные реактивы: среда IMDM, фетальная бычья сыворотка, раствор пенициллин-стрептомицина, L-глутамин и CCK8.
Выполняемые в рамках эксперимента процедуры
1) Посев клеток
Клетки подготавливали заранее, обрабатывали трипсином, собирали и подсчитывали; с помощью полной среды для культивирования клеток клетки KB разбавляли до 2,0 × 104 клеток/мл, клетки T-47D разбавляли до 1,5 × 104 клеток/мл, клетки NCI-H460 разбавляли до 2,0 × 104 клеток/мл, клетки CALU-3 разбавляли до 3,0 × 104 клеток/мл, клетки HuH-7 разбавляли до 4,0 × 104 клеток/мл и клетки LNCaP разбавляли до 8,0 × 104 клеток/мл; 100 мкл разбавленного раствора клеток добавляли в каждую лунку 96-луночных планшетов; и лунки с отрицательным контролем и холостым контролем подготавливали для каждого планшета. 96-луночные планшеты с добавленными клетками помещали в инкубатор при 37°C, 5% CO2 для культивирования в течение ночи.
2) Разбавление и добавление образцов
Образцы разбавляли культуральной средой до требуемых концентраций (см. таблицу 13). В каждую лунку 96-луночных планшетов, которые культивировали в течение ночи, добавляли 50 мкл разбавленных образцов, при этом обеспечивая по 3 повторности для лунок; подготавливали отрицательные контроли и холостые контроли; и планшеты помещали в инкубатор при 37°C, 5% CO2 на 72 часа для культивирования.
Таблица 13. Концентрация образца (CB-60S) после разбавления
3) Проявление окрашивания и считывание планшета
В каждую лунку добавляли по 15 мкл (10% объема жидкости в лунке) обеспечивающего проявление цвета раствора из CCK-8; планшеты инкубировали при 37°C в течение подходящего времени (при этом следует стараться поддерживать значение OD в диапазоне 1,0-2,0); крышки 96-луночных планшетов снимали и планшеты считывали при 450 нм на считывающем устройстве для микропланшетов (Molecular Devices Spectra MAX Plus).
4) Обработка данных
Данные редактировали с помощью SoftMax Pro и строили кривую посредством метода четырехпараметрической подгонки.
5) Результаты эксперимента и их анализ
Согласно графику с кривыми, построенными посредством метода четырехпараметрической подгонки (фиг. 4D, где значение C соответствует IC50), CB-60S оказывает подавляющий эффект в отношении роста и размножения линий опухолевых клеток KB, T-47D, NCI-H460, CALU-3, HuH-7 и LNCaP. Поскольку уровни экспрессии соответствующих рецепторов конъюгированных соединений в клетках являются разными, уровни подавления различаются. IC50 для клеточных линий LNCaP и HuH-7 с относительно высоким уровнем экспрессии рецепторов значительно ниже, чем для клеточных линий NCI-H460, KB, T-47D и CALU-3 с относительно низким уровнем экспрессии рецепторов. CB-60S демонстрирует корреляцию между эффектами подавления роста опухоли и уровнями экспрессии клеточных рецепторов.
7. Эксперимент по подавлению размножения опухолевых клеток в присутствии CB-60SK
Информация касательно образца: CB-60SK.
Клеточные линии: клетки эпидермоидной карциномы полости рта человека KB, клетки рака молочной железы человека T-47D, клетки рака легкого человека NCI-H460, клетки аденокарциномы легкого человека CALU-3, клетки рака печени человека HuH-7 и клетки рака предстательной железы человека LNCaP.
Основные реактивы: среда IMDM, фетальная бычья сыворотка, раствор пенициллин-стрептомицина, L-глутамин и CCK8.
Выполняемые в рамках эксперимента процедуры
1) Посев клеток
Клетки подготавливали заранее, обрабатывали трипсином, собирали и подсчитывали; с помощью полной среды для культивирования клеток клетки KB разбавляли до 2,5 × 104 клеток/мл, клетки T-47D разбавляли до 1,3 × 104 клеток/мл, клетки NCI-H460 разбавляли до 3,5 × 104 клеток/мл, клетки CALU-3 разбавляли до 4,0 × 104 клеток/мл, клетки HuH-7 разбавляли до 3,0 × 104 клеток/мл и клетки LNCaP разбавляли до 8,0 × 104 клеток/мл; 100 мкл разбавленного раствора клеток добавляли в каждую лунку; и лунки с отрицательным контролем и холостым контролем подготавливали для каждого планшета. 96-луночные планшеты с добавленными клетками помещали в инкубатор при 37°C, 5% CO2 для культивирования в течение ночи.
2) Разбавление и добавление образцов
Образцы разбавляли культуральной средой до требуемых концентраций (см. таблицу 14). В каждую лунку 96-луночных планшетов, которые культивировали в течение ночи, добавляли 50 мкл разбавленных образцов, при этом обеспечивая по 3 повторности для лунок; подготавливали отрицательные контроли и холостые контроли; и планшеты помещали в инкубатор при 37°C, 5% CO2 на 72 часа для культивирования.
Таблица 14. Концентрация образца (CB-60SK) после разбавления
3) Проявление окрашивания и считывание планшета
В каждую лунку добавляли по 15 мкл (10% объема жидкости в лунке) обеспечивающего проявление цвета раствора из CCK-8; планшеты инкубировали при 37°C в течение подходящего времени (при этом следует стараться поддерживать значение OD в диапазоне 1,0-2,0); крышки 96-луночных планшетов снимали и планшеты считывали при 450 нм на считывающем устройстве для микропланшетов (Molecular Devices Spectra MAX Plus).
4) Обработка данных
Данные редактировали с помощью SoftMax Pro и строили кривую посредством метода четырехпараметрической подгонки.
5) Результаты эксперимента и их анализ
Согласно графику с кривыми, построенными посредством метода четырехпараметрической подгонки (фиг. 4E, где значение C соответствует IC50), CB-60SK оказывает подавляющий эффект в отношении роста и размножения линий опухолевых клеток KB, T-47D, NCI-H460, CALU-3, HuH-7 и LNCaP. Поскольку уровни экспрессии соответствующих рецепторов конъюгированных соединений в клетках являются разными, уровни подавления различаются. IC50 для клеточных линий LNCaP и HuH-7 с относительно высоким уровнем экспрессии рецепторов значительно ниже, чем для клеточных линий T-47D, NCI-H460, CALU-3 и KB с относительно низким уровнем экспрессии рецепторов. CB-60SK демонстрирует корреляцию между эффектами подавления роста опухоли и уровнями экспрессии клеточных рецепторов.
8. Эксперимент по подавлению размножения опухолевых клеток в присутствии CB-18G
Информация касательно образца: CB-18G.
Клеточные линии: клетки рака легкого человека A549, клетки рака шейки матки человека Hela, клетки мелкоклеточного рака легкого SCLC-21H, клетки остеосаркомы человека U-2 OS, клетки рака молочной железы человека T-47D и клетки рака легкого человека NCI-H460.
Основные реактивы: среда IMDM, фетальная бычья сыворотка, раствор пенициллин-стрептомицина, L-глутамин и CCK8.
Выполняемые в рамках эксперимента процедуры
1) Посев клеток
Клетки подготавливали заранее, обрабатывали трипсином, собирали и подсчитывали; клетки A549, клетки Hela, клетки SCLC-21H и клетки U-2 OS, разбавленные с помощью полной среды для культивирования клеток, высевали при плотности 2 × 104 клеток/мл, а клетки T-47D и клетки NCI-H460 высевали при плотности 3 × 104 клеток/мл в 96-луночные планшеты; в каждую лунку 96-луночных планшетов добавляли 100 мкл разбавленного раствора клеток; и лунки с отрицательным контролем и холостым контролем подготавливали для каждого планшета. 96-луночные планшеты с добавленными клетками помещали в инкубатор при 37°C, 5% CO2 для культивирования в течение ночи.
2) Разбавление и добавление образцов
Образцы разбавляли культуральной средой до требуемых концентраций (см. таблицу 15). В каждую лунку 96-луночных планшетов, которые культивировали в течение ночи, добавляли 50 мкл разбавленных образцов, при этом обеспечивая по 3 повторности для лунок; подготавливали отрицательные контроли и холостые контроли; и планшеты помещали в инкубатор при 37°C, 5% CO2 на 72 часа для культивирования.
Таблица 15. Концентрация образца (CB-18G) после разбавления
3) Проявление окрашивания и считывание планшета
В каждую лунку добавляли по 15 мкл (10% объема жидкости в лунке) обеспечивающего проявление цвета раствора из CCK-8; планшеты инкубировали при 37°C в течение подходящего времени (при этом следует стараться поддерживать значение OD в диапазоне 1,0-2,0); крышки 96-луночных планшетов снимали и планшеты считывали при 450 нм на считывающем устройстве для микропланшетов (Molecular Devices Spectra MAX Plus).
4) Обработка данных
Данные редактировали с помощью SoftMax Pro и строили кривую посредством метода четырехпараметрической подгонки.
5) Результаты эксперимента и их анализ
Согласно графику с кривыми, построенными посредством метода четырехпараметрической подгонки (фиг. 4F, где значение C соответствует IC50), CB-18G оказывает подавляющий эффект в отношении роста и размножения линий опухолевых клеток A549, Hela, SCLC-21H, U-2 OS, T-47D и NCI-H460. Поскольку уровни экспрессии соответствующих рецепторов конъюгированных соединений в клетках являются разными, уровни подавления различаются. IC50 для клеточной линии Hela с относительно высоким уровнем экспрессии рецепторов значительно ниже, чем для клеточной линии NCI-H460 с относительно низким уровнем экспрессии рецепторов. CB-18G демонстрирует корреляцию между эффектами подавления роста опухоли и уровнями экспрессии клеточных рецепторов.
9. Эксперимент по подавлению размножения опухолевых клеток в присутствии CB-50S
Информация касательно образца: CB-50S.
Клеточные линии: клетки эпидермоидной карциномы полости рта человека KB, клетки рака легкого человека NCI-H460, клетки рака мочевого пузыря человека RT4, клетки рака молочной железы человека T-47D и клетки рака предстательной железы человека LNCaP.
Основные реактивы: среда IMDM, фетальная бычья сыворотка, раствор пенициллин-стрептомицина, L-глутамин и CCK8.
Выполняемые в рамках эксперимента процедуры
1) Посев клеток
Клетки подготавливали заранее, обрабатывали трипсином, собирали и подсчитывали; с помощью полной среды для культивирования клеток клетки KB разбавляли до 3,5 × 104 клеток/мл, клетки LNCaP разбавляли до 8,0 × 104 клеток/мл, клетки T-47D разбавляли до 1,2 × 104 клеток/мл, клетки NCI-H460 разбавляли до 2,5 × 104 клеток/мл и клетки RT4 разбавляли до 1,2 × 105 клеток/мл; в каждую лунку 96-луночных планшетов добавляли 100 мкл разбавленного раствора клеток; и лунки с отрицательным контролем и холостым контролем подготавливали для каждого планшета. 96-луночные планшеты с добавленными клетками помещали в инкубатор при 37°C, 5% CO2 для культивирования в течение ночи.
2) Разбавление и добавление образцов
Образцы разбавляли культуральной средой до требуемых концентраций (см. таблицу 16). В каждую лунку 96-луночных планшетов, которые культивировали в течение ночи, добавляли 50 мкл разбавленных образцов, при этом обеспечивая по 3 повторности для лунок; подготавливали отрицательные контроли и холостые контроли; и планшеты помещали в инкубатор при 37°C, 5% CO2 на 72 часа для культивирования.
Таблица 16. Концентрация образца (CB-50S) после разбавления
3) Проявление окрашивания и считывание планшета
В каждую лунку добавляли по 15 мкл (10% объема жидкости в лунке) обеспечивающего проявление цвета раствора из CCK-8; планшеты инкубировали при 37°C в течение подходящего времени (при этом следует стараться поддерживать значение OD в диапазоне 1,0-2,0); крышки 96-луночных планшетов снимали и планшеты считывали при 450 нм на считывающем устройстве для микропланшетов (Molecular Devices Spectra MAX Plus).
4) Обработка данных
Данные редактировали с помощью SoftMax Pro и строили кривую посредством метода четырехпараметрической подгонки.
5) Результаты эксперимента и их анализ
Согласно графику с кривыми, построенными посредством метода четырехпараметрической подгонки (фиг. 4G, где значение C соответствует IC50), CB-50S оказывает подавляющий эффект в отношении роста и размножения линий опухолевых клеток KB, LNCaP, T-47D, RT4 и NCI-H460. Поскольку уровни экспрессии соответствующих рецепторов конъюгированных соединений в клетках являются разными, уровни подавления различаются. IC50 для клеточных линий KB, LNcap, T-47D и RT4 с относительно высоким уровнем экспрессии рецепторов значительно ниже, чем для клеточной линии NCI-H460 с относительно низким уровнем экспрессии рецепторов. CB-50S демонстрирует корреляцию между эффектами подавления роста опухоли и уровнями экспрессии клеточных рецепторов.
10. Эксперимент по подавлению размножения опухолевых клеток в присутствии конъюгированного соединения CB-1020
Цель эксперимента: тестирование на подавляющие эффекты CB-1020 и родственных соединений в отношении размножения линий опухолевых клеток LNCaP (клеток рака предстательной железы человека), SK-BR-3 (клеток рака молочной железы человека), NCI-H226 (клеток рака легкого человека), CFPAC-1 (клеток рака поджелудочной железы) и PANC-1 (клеток рака поджелудочной железы).
Родственные образцы: MMAE и CB-1020.
Выполняемые в рамках эксперимента процедуры Клетки LNCaP, SK-BR-3, NCI-H226, CFPAC-1 и PANC-1 подготавливали заранее и подсчитывали; с помощью культуральной среды (IMDM+10% FBS+1-кратный L-глутамин+1-кратный P/S) клетки LNCaP, SK-BR-3 и CFPAC-1 разбавляли до 4 × 104 клеток/мл, клетки NCI-H226 разбавляли до 2,0 × 104 клеток/мл и клетки PANC-1 разбавляли до 3,0 × 104 клеток/мл; разбавленный раствор клеток высевали в 96-луночные планшеты по 100 мкл/лунка; и лунки с отрицательным контролем и холостым контролем подготавливали для каждого планшета. После культивирования адгезивных клеток в течение ночи разбавленные образцы, подлежащие тестированию, добавляли в количестве 50 мкл/лунка. Планшеты помещали в инкубатор при 37°C, 5% CO2 и культивировали в течение 68-72 часов. В каждую лунку добавляли по 15 мкл (10% объема жидкости в лунке) обеспечивающего проявление цвета раствора из CCK8; и планшеты инкубировали при 37°C в течение 45-70 минут, и каждый планшет считывали при 450 нм на считывающем устройстве для микропланшетов. Данные редактировали с помощью SoftMax Pro и строили кривую посредством метода подгонки по 4 параметрам. Данные представлены в следующей таблице.
Таблица 17. Подавляющие эффекты CB-1020 в отношении пролиферации клеточных линий и уровни экспрессии генов рецепторов в клеточных линиях
(со ссылкой на данные Depmap)
(MMAE)
(CB-1020)
Из приведенной выше таблицы можно видеть, что как LNCaP, так и SK-BR-3 экспрессируют TRPV6 и FOLRH1, при этом LNCap характеризуется относительно более высоким уровнем экспрессии этих двух рецепторов. NCI-H226, CFPAC-1 и PANC-1 экспрессируют эти два рецептора на низком или пониженном уровне. CB-1020 оказывает подавляющий эффект в отношении роста и размножения линий опухолевых клеток LNCaP, SK-BR-3, NCI-H226, CFPAC-1 и PANC-1. Соотношение IC50 CB-1020 для клеточной линии LNCaP с относительно высоким уровнем экспрессии двух рецепторов является более высоким, чем соотношение IC50 для клеточной линии SK-BR-3 со средним уровнем экспрессии рецепторов; при этом соотношение IC50 для SK-BR-3 является более высоким, чем соотношения IC50 для CFPAC-1 с относительно низким уровнем экспрессии рецепторов и для клеточных линий NCI-H226 и PANC-1 с пониженным уровнем экспрессии двух рецепторов. Подавляющий эффект в отношении пролиферации клеток положительно коррелирует с уровнем экспрессии двух данных рецепторов в клетках.
11. Эксперимент по подавлению размножения опухолевых клеток в присутствии конъюгированного соединения CB-1320
Цель эксперимента: тестирование на подавляющие эффекты CB-1320 и родственных соединений в отношении размножения линий опухолевых клеток LNCaP (клеток рака предстательной железы человека), SK-BR-3 (клеток рака молочной железы человека), MDA-MB-468 (клеток рака молочной железы человека) и CFPAC-1 (клеток рака поджелудочной железы).
Родственные образцы: MMAE и CB-1320.
Выполняемые в рамках эксперимента процедуры Клетки LNCaP, SK-BR-3, MDA-MB-468 и CFPAC-1 подготавливали заранее и подсчитывали; с помощью культуральной среды (IMDM+10% FBS+1-кратный L-глутамин+1-кратный P/S) клетки LNCaP, SK-BR-3, MDA-MB-468 и CFPAC-1 разбавляли до 4 × 104 клеток/мл; разбавленный раствор клеток высевали в 96-луночные планшеты по 100 мкл/лунка; и лунки с отрицательным контролем и холостым контролем подготавливали для каждого планшета. После культивирования адгезивных клеток в течение ночи разбавленные образцы, подлежащие тестированию, добавляли в количестве 50 мкл/лунка. Планшеты помещали в инкубатор при 37°C, 5% CO2 и культивировали в течение 68-72 часов. В каждую лунку добавляли по 15 мкл (10% объема жидкости в лунке) обеспечивающего проявление цвета раствора из CCK8; и планшеты инкубировали при 37°C в течение 45-70 минут, и каждый планшет считывали при 450 нм на считывающем устройстве для микропланшетов. Данные редактировали с помощью SoftMax Pro и строили кривую посредством метода подгонки по 4 параметрам. Конкретные данные показаны в следующей таблице.
Таблица 18. Подавляющие эффекты CB-1320 в отношении пролиферации клеточных линий и уровни экспрессии генов рецепторов в клеточных линиях
(со ссылкой на данные Depmap)
(MMAE)
(CB-1320)
Из приведенной выше таблицы можно увидеть, что уровни экспрессии GNRHR для 4 клеточных линий примерно эквивалентны, а уровень экспрессии FOLH1 в случае LNCaP значительно выше, чем для других клеточных линий. CB-1320 оказывает подавляющий эффект в отношении размножения 4 линий опухолевых клеток. Подавляющие эффекты CB-1320 в отношении клеток с разными уровнями экспрессии рецептора FOLH1 различаются. Соотношение IC50 для клеточной линии LNCaP с относительно высоким уровнем экспрессии рецептора FOLH1 значительно выше, чем соотношение IC50 для других клеточных линий с относительно низким уровнем экспрессии этого рецептора.
12. Эксперимент по подавлению размножения опухолевых клеток в присутствии конъюгированного соединения CB-1820
Цель эксперимента: тестирование на подавляющие эффекты CB-1820 и родственных соединений в отношении размножения линий опухолевых клеток LNCaP (клеток рака предстательной железы человека), MDA-MB-468 (клеток рака молочной железы человека), CFPAC-1 (клеток рака поджелудочной железы) и PANC-1 (клеток рака поджелудочной железы).
Родственные образцы: MMAE и CB-1820.
Выполняемые в рамках эксперимента процедуры Клетки LNCaP, MDA-MB-468, CFPAC-1 и PANC-1 подготавливали заранее и подсчитывали; с помощью культуральной среды (IMDM+10% FBS+1-кратный L-глутамин+1-кратный P/S) клетки LNCaP, MDA-MB-468 и CFPAC-1 разбавляли до 4 × 104 клеток/мл и клетки PANC-1 разбавляли до 3,0 × 104 клеток/мл; разбавленный раствор клеток высевали в 96-луночные планшеты по 100 мкл/лунка; и лунки с отрицательным контролем и холостым контролем подготавливали для каждого планшета. После культивирования адгезивных клеток в течение ночи разбавленные образцы, подлежащие тестированию, добавляли в количестве 50 мкл/лунка. Планшеты помещали в инкубатор при 37°C, 5% CO2 и культивировали в течение 68-72 часов. В каждую лунку добавляли по 15 мкл (10% объема жидкости в лунке) обеспечивающего проявление цвета раствора из CCK8; и планшеты инкубировали при 37°C в течение 45-70 минут, и каждый планшет считывали при 450 нм на считывающем устройстве для микропланшетов. Данные редактировали с помощью SoftMax Pro и строили кривую посредством метода подгонки по 4 параметрам. Конкретные данные показаны в следующей таблице.
Таблица 19. Подавляющие эффекты CB-1820 в отношении пролиферации клеточных линий и уровни экспрессии генов рецепторов в клеточных линиях
(со ссылкой на данные Depmap)
(MMAE)
(CB-1820)
Из приведенной выше таблицы можно увидеть, что уровни экспрессии SSTR2 для LNCap, MDA-MB-468, CFPAC-1 и PANC-1 примерно эквивалентны, а уровень экспрессии FOLH1 в случае LNCaP значительно выше, чем уровень экспрессии FOLH1 для других клеточных линий. CB-1820 оказывает подавляющий эффект в отношении размножения 4 линий опухолевых клеток. Подавляющие эффекты CB-1820 в отношении клеток с разными уровнями экспрессии рецептора FOLH1 различаются. Соотношение IC50 для клеточной линии LNCaP с относительно высоким уровнем экспрессии данного рецептора значительно выше, чем соотношение IC50 для других клеточных линий с относительно низким уровнем экспрессии данного рецептора, а подавляющие эффекты в отношении пролиферации клеток положительно коррелируют с уровнями экспрессии клеточного рецептора FOLH1.
13. Эксперимент по подавлению размножения опухолевых клеток в присутствии конъюгированных соединений CR19425, CR19426 и CR19428
Цель эксперимента: тестирование на подавляющие эффекты CR19428, CR19425, CR19426 и родственных соединений в отношении размножения линий опухолевых клеток NCI-H226 (клеток рака легкого человека), CFPAC-1 (клеток рака поджелудочной железы человека) и MDA-MB-468 (клеток рака молочной железы человека).
Родственные образцы: SN-38, Dxd0017, CR19428, CR19425 и CR19426.
Выполняемые в рамках эксперимента процедуры Клетки NCI-H226, CFPAC-1 и MDA-MB-468 подготавливали заранее и подсчитывали; клетки MDA-MB-468 и CFPAC-1 высевали при плотности 2 × 104 клеток/мл (100 мкл/лунка), а клетки NCI-H226 высевали при плотности 1 × 104 клеток/мл (100 мкл/лунка) в 96-луночные планшеты; и лунки с отрицательным контролем и холостым контролем подготавливали для каждого планшета. После культивирования адгезивных клеток в течение ночи разбавленные образцы, подлежащие тестированию, добавляли в количестве 50 мкл/лунка. Планшеты помещали в инкубатор при 37°C, 5% CO2 и культивировали в течение 68-72 часов. В каждую лунку добавляли по 15 мкл (10% объема жидкости в лунке) обеспечивающего проявление цвета раствора из CCK8; и планшеты инкубировали при 37°C в течение 45-70 минут, и каждый планшет считывали при 450 нм на считывающем устройстве для микропланшетов. Данные редактировали с помощью SoftMax Pro и строили кривую посредством метода подгонки по 4 параметрам. Конкретные данные показаны в следующей таблице.
Таблица 20. Подавляющие эффекты CR19428, CR19425 и CR19426 в отношении пролиферации клеточных линий
(SN-38)
(Dxd0017)
(CR19428)
(CR19425)
(CR19426)
Пример 5. Фармакодинамическое исследование конъюгированных соединений, проводимое на CDX-моделях
1. Фармакодинамическое исследование 1 для CB-20BK, проводимое на CDX-моделях
1) Подготовка образцов
Лиофилизированный порошок CB-20BK взвешивали, растворяли в PBS и получали в виде маточного раствора образца, и маточный раствор разбавляли физиологическим солевым раствором для инъекций до раствора образца с рабочей концентрацией для последующего применения.
2) Создание CDX-модели
Основные клеточные линии: клетки эпидермоидной карциномы полости рта человека KB, клетки рака поджелудочной железы человека MIA PaCa-2, клетки рака молочной железы человека HCC1954, клетки аденокарциномы легкого человека CALU-3 и клетки рака предстательной железы человека DU145.
Создание модели. Клетки восстанавливали, культивировали, собирали, подсчитывали и подкожно путем инъекции вводили в правую боковую область бестимусных мышей BALB/c. Когда опухоль вырастала и увеличивалась до 80-160 мм3, проводили распределение по группам и введение, или быстро увеличивающиеся опухолевые массы переносили и путем инъекции вводили мышам с целью осуществления их наращивания.
3) Распределение по группам, введение и наблюдение
Распределение по группам. Когда опухоль вырастала в среднем до приблизительно 80-160 мм3, проводили распределение по группам и предусматривали контрольную по отношению к модели группу и группы с введением для разных доз.
Введение. Введение мышам выполняли путем инъекции в хвостовую вену.
Наблюдение и измерение, выполняемые в рамках эксперимента. После инокуляции опухоли традиционным образом осуществляли мониторинг эффектов роста опухоли и обработки в отношении нормальных показателей поведения животных, в частности, включая активность экспериментальных животных, статус приема пищи и потребления жидкости, набор или потерю веса (при измерении веса дважды в неделю), а также в отношении других аномальных состояний, связанных с глазами, волосяным покровом и т. д.
Вес мышей, а также значения размера по длинной оси (а) и размера по короткой оси (b) для опухолевой массы измеряли дважды в неделю. Формула для расчета объема опухоли (TV) представляет собой: TV=1/2 × a × b2.
4) Результаты эксперимента и их анализ
По изменениям значений объема опухоли у мышей (фиг. 5A-5E) можно видеть, что CB-20BK характеризуется хорошим подавляющим эффектом по отношению к CDX-моделям опухолей на основе клеточных линий KB, MIA PaCa-2, HCC1954, CALU-3 и DU145 у мышей.
2. Фармакодинамическое исследование 2 для CB-20BK, проводимое на CDX-моделях
Цель эксперимента: проведение фармакодинамического исследования конъюгированного соединения CB-20BK на модели подкожного ксенотрансплантата (CDX) гуманизированных клеточных линий LNCaP, DU145 и NCI-H460.
Основные CDX-модели: LNCaP, DU145 и NCI-H460.
Схема эксперимента
Получали клетки или массу опухолевой ткани и подкожно инокулировали в переднюю правую боковую область бестимусных мышей BALB/c. Когда объем опухоли увеличивался до 80-160 мм3, проводили рандомизированное распределение по группам и предусматривали контрольную по отношению к модели группу и группы с введением. Введение мышам выполняли с первого дня распределения по группам, при этом вводимую дозу корректировали в соответствии с последним измеренным значением веса. Введение мышам выполняли путем инъекции в хвостовую вену при вводимом объеме 10 мкл/г. После распределения по группам и введения осуществляли мониторинг эффектов роста опухоли и обработки в отношении нормальных показателей поведения животных, в частности, включая активность экспериментальных животных, статус приема пищи и потребления жидкости, статус набора или потери веса, а также в отношении других аномальных состояний, связанных с глазами, волосяным покровом и т. д. После распределения по группам и введения вес мышей измеряли дважды в неделю для расчета скорости изменения веса; в то же время размер опухоли по длинной и короткой оси измеряли штангенциркулем и рассчитывали объем опухоли, относительную скорость пролиферации клеток опухоли, степень подавления объема опухоли и другие показатели. Формула для расчета объема опухоли представляет собой TV=0,5 a × b2, где a представляет собой размер опухоли по длинной оси, и b представляет собой размер опухоли по короткой оси.
Таблица 21. Подавляющие эффекты CB-20BK в отношении роста в CDX-моделях и уровни экспрессии генов рецепторов в каждой модели
(со ссылкой на данные, полученные от Crown Bioscience Inc.)
Из приведенной выше таблицы можно увидеть, что тестируемый образец CB-20BK демонстрирует различные величины степени подавляющих эффектов в отношении роста опухоли при схеме введения через хвостовую вену. По отношению к CDX-моделям на основе гуманизированных клеточных линий LNCaP, DU145 и NCI-H460 тестируемый образец обладает определенным эффектом подавления роста опухоли при сравнении с группой отрицательного контроля. В случае модели на основе LNCaP с двойной экспрессией FOLR1 и FOLH1 тестируемый образец, который вводили в день 1, день 8 и день 15 (D1, D8 и D15) в дозе 3 мг/кг, характеризуется значением TGI 95,68%, при этом демонстрирует превосходный эффект подавления роста опухоли, который значительно превосходит таковой в случае моделей на основе DU145 и NCI-H460 с относительно низким уровнем экспрессии FOLR1 и FOLH1. Подавляющий эффект в отношении роста опухоли характеризуется определенной степенью корреляции с уровнем экспрессии клеточных рецепторов.
3. Эксперимент 1 по подавлению роста опухоли для конъюгированного соединения CB-20BK, проводимый на PDX-моделях на основе ксенотрансплантата HuPrime®
Цель эксперимента. Фармакодинамическое исследование конъюгированного соединения CB-20BK, проводимое на PDX-моделях.
Основные модели: LU1206, LU1380 и LU0367.
Схема эксперимента. Получали массу опухолевой ткани и подкожно инокулировали в переднюю правую боковую область бестимусных мышей BALB/c. Когда объем опухоли увеличивался до 80-160 мм3, проводили рандомизированное распределение по группам и предусматривали контрольную по отношению к модели группу и группы с введением. Введение мышам выполняли с первого дня распределения по группам, при этом вводимую дозу корректировали в соответствии с последним измеренным значением веса. Введение мышам выполняли путем инъекции в хвостовую вену при вводимом объеме 10 мкл/г и вводимой дозе 3 мг/кг. После распределения по группам и введения осуществляли мониторинг эффектов роста опухоли и обработки в отношении нормальных показателей поведения животных, в частности, включая активность экспериментальных животных, статус приема пищи и потребления жидкости, статус набора или потери веса, а также в отношении других аномальных состояний, связанных с глазами, волосяным покровом и т. д. После распределения по группам и введения вес мышей измеряли дважды в неделю для расчета скорости изменения веса; в то же время размер опухоли по длинной и короткой оси измеряли штангенциркулем и рассчитывали объем опухоли, относительную скорость пролиферации клеток опухоли, степень подавления объема опухоли и другие показатели. Формула для расчета объема опухоли представляет собой TV=0,5 a × b2, где a представляет собой размер опухоли по длинной оси, и b представляет собой размер опухоли по короткой оси.
Таблица 22. Подавляющие эффекты CB-20BK в отношении роста в PDX-моделях рака легкого и уровни экспрессии генов рецепторов в каждой модели
(со ссылкой на данные, полученные от Crown Bioscience Inc.)
Из данных в таблице 22 можно увидеть, что тестируемый образец CB-20BK (3 мг/кг) демонстрирует определенный противоопухолевый эффект в случае PDX-моделей на основе гуманизированных клеток рака легкого LU1206, LU1380 и LU0367. Значение TGI для модели на основе LU1206 с двойной экспрессией FOLR1 и FOLH1 составляет 90,89%, а значения TGI для моделей LU1380 и LU0367 с одиночной экспрессией составляют 30,02% и 71,34% соответственно. В эксперименте по подавлению роста опухоли подавляющий эффект в отношении роста опухоли характеризуется определенной степенью корреляции с уровнем экспрессии клеточных рецепторов.
4. Эксперимент 2 по подавлению роста опухоли для конъюгированного соединения CB-20BK, проводимый на PDX-моделях на основе ксенотрансплантата HuPrime®
Цель эксперимента. Фармакодинамическое исследование конъюгированного соединения CB-20BK, проводимое на PDX-моделях.
Основные модели: BR1283 и BR0438.
Схема эксперимента. Получали массу опухолевой ткани и подкожно инокулировали в переднюю правую боковую область бестимусных мышей BALB/c. Когда объем опухоли увеличивался до 80-160 мм3, проводили рандомизированное распределение по группам и предусматривали контрольную по отношению к модели группу и группы с введением. Введение мышам выполняли с первого дня распределения по группам, при этом вводимую дозу корректировали в соответствии с последним измеренным значением веса. Введение мышам выполняли путем инъекции в хвостовую вену при вводимом объеме 10 мкл/г и вводимой дозе 3 мг/кг. После распределения по группам и введения осуществляли мониторинг эффектов роста опухоли и обработки в отношении нормальных показателей поведения животных, в частности, включая активность экспериментальных животных, статус приема пищи и потребления жидкости, статус набора или потери веса, а также в отношении других аномальных состояний, связанных с глазами, волосяным покровом и т. д. После распределения по группам и введения вес мышей измеряли дважды в неделю для расчета скорости изменения веса; в то же время размер опухоли по длинной и короткой оси измеряли штангенциркулем и рассчитывали объем опухоли, относительную скорость пролиферации клеток опухоли, степень подавления объема опухоли и другие показатели. Формула для расчета объема опухоли представляет собой TV=0,5 a × b2, где a представляет собой размер опухоли по длинной оси, и b представляет собой размер опухоли по короткой оси.
Таблица 23. Подавляющие эффекты CB-20BK в отношении роста в PDX-моделях рака молочной железы и уровни экспрессии генов рецепторов в каждой модели
(со ссылкой на данные, полученные от Crown Bioscience Inc.)
Из приведенной выше таблицы можно увидеть, что значения TGI для тестируемого образца CB-20BK в дозе 3 мг/кг применительно к моделям BR1283 и BR0438 с двойной экспрессией FOLR1 и FOLH1 составляют 96,49% и 70,74% соответственно, демонстрируя превосходный эффект подавления роста опухоли. Более того, TGI для CB-20BK является более высоким в случае BR1283 с более высоким уровнем экспрессии FOLR1 и FOLH1.
5. Фармакодинамическое исследование CB-20B, проводимое на CDX-моделях
1) Подготовка образцов
Лиофилизированный порошок CB-20B взвешивали, растворяли в PBS и получали в виде маточного раствора образца, и маточный раствор разбавляли физиологическим солевым раствором для инъекций до раствора образца с рабочей концентрацией для последующего применения.
2) Создание CDX-модели
Основные клеточные линии: клетки эпидермоидной карциномы полости рта человека KB, клетки рака легкого человека PC-9 и клетки рака предстательной железы человека DU145.
Создание модели. Клетки восстанавливали, культивировали, собирали, подсчитывали и подкожно путем инъекции вводили в правую боковую область бестимусных мышей BALB/c. Когда опухоль вырастала и увеличивалась до 80-160 мм3, проводили распределение по группам и введение, или быстро увеличивающиеся опухолевые массы переносили и путем инъекции вводили мышам с целью осуществления их наращивания.
3) Распределение по группам, введение и наблюдение
Распределение по группам. Когда опухоль вырастала в среднем до приблизительно 80-160 мм3, проводили распределение по группам и предусматривали контрольную по отношению к модели группу и группы с введением для разных доз.
Введение. Введение мышам выполняли путем инъекции в хвостовую вену.
Наблюдение и измерение, выполняемые в рамках эксперимента. После инокуляции опухоли традиционным образом осуществляли мониторинг эффектов роста опухоли и обработки в отношении нормальных показателей поведения животных, в частности, включая активность экспериментальных животных, статус приема пищи и потребления жидкости, набор или потерю веса (при измерении веса дважды в неделю), а также в отношении других аномальных состояний, связанных с глазами, волосяным покровом и т. д.
Вес мышей, а также значения размера по длинной оси (а) и размера по короткой оси (b) для опухолевой массы измеряли дважды в неделю. Формула для расчета объема опухоли (TV) представляет собой: TV=1/2 × a × b2.
4) Результаты эксперимента и их анализ
По изменениям значения объема опухоли у мышей (фиг. 6A-6C) можно видеть, что CB-20B характеризуется хорошим подавляющим эффектом по отношению к CDX-моделям опухолей на основе клеточных линий KB, PC-9 и DU145 у мышей.
6. Фармакодинамическое исследование CB-18G, проводимое на CDX-моделях
1) Подготовка образцов
Лиофилизированный порошок CB-18G взвешивали, растворяли в PBS и получали в виде маточного раствора образца, и маточный раствор разбавляли физиологическим солевым раствором для инъекций до раствора образца с рабочей концентрацией для последующего применения.
2) Создание CDX-модели
Основные клеточные линии: клетки эпидермоидной карциномы полости рта человека KB, клетки рака легкого человека PC-9, клетки аденокарциномы легкого человека SPC-A1, клетки аденокарциномы легкого человека CALU-3 и клетки рака предстательной железы человека DU145.
Создание модели. Клетки восстанавливали, культивировали, собирали и подсчитывали, и раствор клеток подкожно путем инъекции вводили в правую боковую область бестимусных мышей BALB/c. Когда опухоль вырастала и увеличивалась до 80-160 мм3, проводили распределение по группам и введение, или быстро увеличивающиеся опухолевые массы переносили и путем инъекции вводили мышам с целью осуществления их наращивания.
3) Распределение по группам, введение и наблюдение
Распределение по группам. Когда опухоль вырастала в среднем до приблизительно 80-160 мм3, проводили распределение по группам и предусматривали контрольную по отношению к модели группу и группы с введением для разных доз.
Введение. Введение мышам выполняли путем инъекции в хвостовую вену.
Наблюдение и измерение, выполняемые в рамках эксперимента. После инокуляции опухоли традиционным образом осуществляли мониторинг эффектов роста опухоли и обработки в отношении нормальных показателей поведения животных, в частности, включая активность экспериментальных животных, статус приема пищи и потребления жидкости, набор или потерю веса (при измерении веса дважды в неделю), а также в отношении других аномальных состояний, связанных с глазами, волосяным покровом и т. д.
Вес мышей, а также значения размера по длинной оси (а) и размера по короткой оси (b) для опухолевой массы измеряли дважды в неделю. Формула для расчета объема опухоли (TV) представляет собой: TV=1/2 × a × b2.
4) Результаты эксперимента и их анализ
По изменениям значений объема опухоли у мышей (фиг. 7A-7E) можно видеть, что CB-18G характеризуется хорошим подавляющим эффектом по отношению к CDX-моделям опухолей на основе клеточных линий KB, PC-9, SPC-A1, CALU-3 и DU145 у мышей.
7. Эксперимент по подавлению роста опухоли для конъюгированных соединений CB-1020, CB-1320 и CB-1820, проводимый на модели подкожного ксенотрансплантата (CDX) на основе гуманизированных клеточных линий HPAF-II, NCI-H226 и SCLC-21H
Цель эксперимента. Фармакодинамическое исследование конъюгатов лигандов CB-1020, CB-1320 и CB-1820, проводимое на CDX-моделях
Основные CDX-модели: HPAF-II (клетки рака поджелудочной железы человека), NCI-H226 (клетки рака легкого человека) и SCLC-21H (клетки мелкоклеточного рака легкого).
Схема эксперимента
Получали клетки или массу опухолевой ткани и подкожно инокулировали в переднюю правую боковую область бестимусных мышей BALB/c. Когда объем опухоли увеличивался до 80-160 мм3, проводили рандомизированное распределение по группам и предусматривали контрольную по отношению к модели группу и группы с введением. Введение мышам выполняли с первого дня распределения по группам, при этом вводимую дозу корректировали в соответствии с последним измеренным значением веса. Введение мышам выполняли путем инъекции в хвостовую вену при вводимом объеме 10 мкл/г. После распределения по группам и введения осуществляли мониторинг эффектов роста опухоли и обработки в отношении нормальных показателей поведения животных, в частности, включая активность экспериментальных животных, статус приема пищи и потребления жидкости, статус набора или потери веса, а также в отношении других аномальных состояний, связанных с глазами, волосяным покровом и т. д. После распределения по группам и введения вес мышей измеряли дважды в неделю для расчета скорости изменения веса; в то же время размер опухоли по длинной и короткой оси измеряли штангенциркулем и рассчитывали объем опухоли, относительную скорость пролиферации клеток опухоли, степень подавления объема опухоли и другие показатели. Формула для расчета объема опухоли представляет собой TV=0,5 a × b2, где a представляет собой размер опухоли по длинной оси, и b представляет собой размер опухоли по короткой оси.
Таблица 24. Подавляющие эффекты CB-1020, CB-1320 и CB-1820 в отношении роста в CDX-моделях и уровни экспрессии генов рецепторов в каждой модели (со ссылкой на данные, полученные от Crown Bioscience Inc.)
(CB-1020)
(CB-1320)
(CB-1820)
CB-1020 оказывает очевидный эффект подавления роста опухоли в моделях подкожного ксенотрансплантата на основе гуманизированных клеточных линий HPAF-II; CB-1320 оказывает очевидный эффект подавления роста опухоли в моделях подкожного ксенотрансплантата на основе клеточных линий NCI-H226 и SCLC-21H; и CB-1820 оказывает очевидный эффект подавления роста опухоли в моделях подкожного ксенотрансплантата на основе клеточных линий SCLC-21H.
8. Эксперимент по подавлению роста опухоли для конъюгированного соединения CR19428, проводимый на модели подкожного ксенотрансплантата (CDX) на основе гуманизированных клеточных линий CALU-3, SCLC-21H и SPC-A1
Схема эксперимента. Получали массу опухолевой ткани и подкожно инокулировали в переднюю правую боковую область бестимусных мышей BALB/c. Когда объем опухоли увеличивался до 80-160 мм3, проводили рандомизированное распределение по группам и предусматривали контрольную по отношению к модели группу и группы с введением. Введение мышам выполняли с первого дня распределения по группам, при этом вводимую дозу корректировали в соответствии с последним измеренным значением веса. Введение мышам выполняли путем инъекции в хвостовую вену при вводимом объеме 10 мкл/г, и введение проводили два раза в неделю в течение 3 последовательных недель. После распределения по группам и введения осуществляли мониторинг эффектов роста опухоли и обработки в отношении нормальных показателей поведения животных, в частности, включая активность экспериментальных животных, статус приема пищи и потребления жидкости, статус набора или потери веса, а также в отношении других аномальных состояний, связанных с глазами, волосяным покровом и т. д. После распределения по группам и введения вес мышей измеряли дважды в неделю для расчета скорости изменения веса; в то же время размер опухоли по длинной и короткой оси измеряли штангенциркулем и рассчитывали объем опухоли, относительную скорость пролиферации клеток опухоли, степень подавления объема опухоли и другие показатели. Формула для расчета объема опухоли представляет собой TV=0,5 a × b2, где a представляет собой размер опухоли по длинной оси, и b представляет собой размер опухоли по короткой оси.
Таблица 25. Подавляющие эффекты CR19428 в PDX-моделях рака легкого
CR-19428 представляет собой конъюгат лекарственного средства на основе лигандов FOLR1 и FOLH1 и полезной нагрузки Dxd. Из приведенной выше таблицы можно видеть, что конъюгат лекарственного средства обладает очевидным эффектом подавления роста опухоли в моделях подкожного ксенотрансплантата на основе гуманизированных клеточных линий CALU-3, SCLC-21H и SPC-A1.
9. Исследование эффективности конъюгированного соединения CBP-1018, проводимое на модели рака легкого на основе клеток LU2505 (PDX-модели)
В этом эксперименте использовали PDX-модель рака легкого на основе LU2505 3-го поколения (от пациентов женского пола из Азии), которая представляет собой модель быстрорастущей опухоли. Бестимусным мышам BALB/c подкожно переносили опухоли, а когда объем опухоли достигал приблизительно 150 мм3, проводили распределение на следующие группы: группы, получавшие тестируемый образец в низкой, средней и высокой дозах, контрольную группу, получавшую низкомолекулярный MMAE, контрольную группу, получавшую нацеливающий полипептид 20BK-SM09, и группу холостого контроля (всего 6 групп, по 8 мышей в группе); введение мышам выполняли в день 1, день 8 и день 15 после распределения по группам; и наблюдение продолжали в течение 14 дней после последнего введения. Действующим веществом тестируемого образца CBP-1018 является CB-20BK, при этом образец получают путем смешивания CB-20BK со вспомогательными материалами и их последующей лиофилизации.
Таблица 26. Фармакодинамические результаты в отношении CBP-1018 для инъекции, выполняемой по отношению к моделям рака легкого на основе LU2505 (первый эксперимент)
/контрольный образец
(мг/кг)
(г)
(мм3)
TGI%
(мг)
Примечания. 1) Ввиду требований гуманного обращения с животными животные в группе должны подвергаться эвтаназии, когда средний объем опухоли в группе достигает 2000 мм3, что обуславливает разное время ее выполнения для каждой группы. 2) Данные относительно веса, объема опухоли и степени подавления роста опухоли представляют собой данные, полученные в день 22 (D22).
Как показано в таблице 26 и на фиг. 8A,
животные во всех группах не характеризовались наличием аномальных клинических проявлений и случаев гибели после введения; и при этом вес животных в каждой группе медленно увеличивался.
Животных в группе холостого контроля, группе, получавшей 20BK-SM09, и группе, получавшей CBP-1018 в низкой дозе, подвергали эвтаназии в день 22, день 22 и день 26 (D26), поскольку средний объем опухоли превышал 2000 мм3. Следовательно, данные относительно веса, объема опухоли и степени подавления роста опухоли в таблице 26 являются данными, полученными в D22.
Эффективность CBP-1018 для инъекций характеризуется очевидной корреляцией с дозой, при этом CBP-1018 для инъекций было неэффективным в группе, получавшей низкую дозу, и эффективным в группе, получавшей среднюю дозу, и группе, получавшей высокую дозу. Опухоль в группе, получавшей высокую дозу, была полностью излечена в день 19 (D19), и каких-либо признаков роста опухоли не наблюдалось в день 29 (D29).
Группа, получавшая полипептид 20BK-SM09, не продемонстрировала очевидного эффекта подавления роста опухоли, позволяя предположить, что одного нацеливающегося полипептида недостаточно для получения явного противоопухолевого эффекта.
Группа, получавшая MMAE, продемонстрировала явный эффект подавления роста опухоли. Эквимолярное количество MMAE содержится в дозе MMAE, составляющей 0,375 мг/кг, и в дозе CBP-1018, составляющей 1,5 мг/кг. Из сравнения можно увидеть, что эффект подавления роста опухоли для CBP-1018 в дозе 1,5 мг/кг значительно превосходит таковой в группе, получавшей MMAE, что свидетельствует о преимуществе нацеливания с помощью лиганда (степень подавления роста опухоли: 82,60% по сравнению с 48,97%).
10. Исследование эффективности конъюгированного соединения CBP-1018, проводимое на модели рака легкого на основе клеток LU1206 (PDX-модели)
В этом эксперименте использовали PDX-модель рака легкого на основе LU1206 5-го поколения (от пациентов женского пола из Азии), которая представляет собой модель быстрорастущей опухоли. Бестимусным мышам BALB/c подкожно переносили опухоли, а когда объем опухоли достигал приблизительно 150 мм3, проводили распределение на следующие группы: группы, получавшие тестируемый образец в низкой, средней и высокой дозах, контрольную группу, получавшую низкомолекулярный MMAE, контрольную группу, получавшую нацеливающий полипептид 20BK-SM09, и группу холостого контроля (всего 6 групп, по 8 мышей в группе); введение мышам выполняли в день 1, день 8 и день 15 после распределения по группам; и наблюдение продолжали в течение 14 дней после последнего введения.
Таблица 27. Фармакодинамические результаты в отношении CBP-1018 для инъекции, выполняемой по отношению к моделям рака легкого на основе LU1206 (первый эксперимент)
(мг/кг)
(г)
(мм3)
Степень подавления роста опухоли
(%)
(мг)
Степень подавления
(%)
Как показано в таблице 27 и на фиг. 8B,
животные во всех группах не характеризовались наличием аномальных клинических проявлений и случаев гибели после введения, и при этом всех животных подвергали эвтаназии в день 29. Вес животных в каждой группе по сути оставался неизменным и несколько превышал вес в первый день введения.
Эффективность CBP-1018 для инъекций характеризуется очевидной корреляцией с дозой, при этом CBP-1018 для инъекций было неэффективным в группе, получавшей низкую дозу (со степенью подавления роста опухоли 8,08%), и эффективным в группе, получавшей среднюю дозу, и в группе, получавшей высокую дозу, со степенью подавления роста опухоли 75,21% и 97,42% соответственно. Разница в эффективности между группой, получавшей низкую дозу, и группой, получавшей среднюю дозу, является относительно большой.
Группа, получавшая полипептид 20BK-SM09, не продемонстрировала очевидного эффекта подавления роста опухоли, позволяя предположить, что одного нацеливающегося полипептида недостаточно для получения явного противоопухолевого эффекта в этой модели.
Группа, получавшая MMAE, продемонстрировала явный эффект подавления роста опухоли. Эквимолярное количество MMAE содержится в дозе MMAE, составляющей 0,375 мг/кг, и в дозе CBP-1018, составляющей 1,5 мг/кг. Из сравнения можно увидеть, что эффект подавления роста опухоли для CBP-1018 в дозе 1,5 мг/кг значительно превосходит таковой в группе, получавшей MMAE, что свидетельствует о преимуществе нацеливания с помощью лиганда (степень подавления объема опухоли: 75,21% по сравнению с 36,03%; степень подавления величины веса опухоли: 78,38% по сравнению с 54,53%).
11. Распределение в тканях у мышей с опухолями (PDX-модель на основе LU2505)
12 самкам мышей с опухолями, которым инокулировали опухолевую массу модели рака легкого на основе клеток LU2505 HuPrime®, и 12 здоровым самцам бестимусных мышей BALB/c вводили 1,5 мг/140 мкКи/кг [3H]CBP-1018 (с изотопной меткой на MMAE) путем однократной инъекции в хвостовую вену. Через 0,5 часа, 2 часа, 6 часов и 24 часа соответственно 3 самцов мышей и 3 самок мышей помещали в индукционную камеру и анестезировали путем ингаляции соответствующего количества диоксида углерода; и кровь собирали с помощью сердечной пункции, а затем немедленно проводили эвтаназию для сбора образцов.
Таблица 28. Общая радиоактивность в различных тканях в разные моменты времени после однократного внутривенного введения [3H]CBP-1018
Из приведенной выше таблицы можно увидеть, что распределение в тканях животных не демонстрирует разницы между самцами и самками; причем после введения лекарственное средство в основном распределяется в почках, цельной крови (в основном распределяется в плазме крови), печени и легких; при этом во всех тканях наивысшая концентрация достигается через 0,5 часа, а затем лекарственное средство быстро элиминируется, при этом наиболее медленная элиминация происходит в печени и опухоли; и медленная элиминация в опухоли может объяснить преимущества CBP-1018 с точки зрения эффективности.
12. Эксперимент по экскреции у крыс
Шести нормальным крысам SD, половина из которых являлась самцы и половина самками, вводили 0,75 мг/70 мкКи/кг [3H]CBP-1018 путем однократной инъекции в хвостовую вену. Через определенные промежутки времени такие образцы, как моча, фекалии, раствор для промывки/очистки клеток и тушки целых крыс, собирали до введения и через 0-168 часов после введения, и такие образцы, как желчь, моча, фекалии и раствор для промывки/очистки клеток BDC-крыс, собирали перед введением и через 0-72 часа после введения. Вышеупомянутые образцы криоконсервировали в низкотемпературном холодильнике (от -10°C до -30°C).
К каждому образцу добавляли соответствующее количество сцинтилляционной жидкости и однородно перемешивали, а затем измеряли уровень радиоактивности с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика. Уровень радиоактивности, измеренный в таких образцах, как желчь, моча, фекалии, раствор для промывки/очистки клеток и тушки, использовали для расчета процентного содержания при данной дозе. Уровень радиоактивности в образце плазмы крови использовали для расчета общего уровня радиоактивности в каждом грамме образца. Основные фармакокинетические параметры общего уровня радиоактивности плазмы крови рассчитывали с помощью программного обеспечения WinNonLin (версия 7.0, Pharsight) в соответствии с некомпартментной моделью.
Таблица 29. Результаты исследования баланса масс на целых крысах после введения
(%)
(%)
(%)
(%)
(%)
(n=3 самки и 3 самца)
Из приведенной выше таблицы можно увидеть, что CBP-1018 в основном выводится с мочой, что составляет приблизительно 57% от общей введенной дозы, а количество, выводимое с фекалиями, составляет менее 25%. Полученный результат, демонстрирующий то, что экскреция главным образом происходит с мочой через почки, согласуется с обнаружением высокого уровня распределения в почках при распределении в тканях бестимусных мышей.
13. Стабильность в плазме крови
CBP-1008 (его действующее вещество представляет собой LDC10B, описанное в WO 2017025047 A1, и CBP-1008 получают путем смешивания LDC10B со вспомогательными материалами и их лиофилизации; WO 2017025047A1 включен посредством ссылки во всей своей полноте) и CBP-1018 в концентрации 1 мкг/мл, 10 мкг/мл и 100 мкг/мл инкубировали с плазмой крови представителей разных видов при 37°C в течение 2 часов для наблюдения за стабильностью этих двух соединений. Результаты демонстрируют (в таблице 30), что CBP-1018 является стабильным в плазме крови представителей разных видов, и его остаточное процентное содержание после 2 часов инкубации составляет более 90% относительно концентрации в 0 часов. Однако CBP-1008 является стабильным только в плазме крови крыс (с остаточным содержанием 87,92% - 91,82%) и не является стабильным в плазме крови других видов, характеризуясь остаточным содержанием, составляющим только 0,751% - 24,52%.
Результаты экспериментов свидетельствуют, что стабильность CBP-1018 в плазме крови выше, чем у CBP-1008.
Таблица 30. Обобщенные данные относительно стабильности в плазме крови для CBP-1008 и CBP-1018 при различных концентрациях у представителей разных видов
(% относительно 0 часов)
Примечания.
1) Данные в таблице представляют собой процентное значение концентрации соединения в плазме крови после инкубации плазмы крови в течение 2 часов относительно 0 часов.
2) Поскольку данные в таблице получены в результате двух экспериментов, фактические цифры после запятой в десятичной дроби не являются состоятельными. Для прослеживаемости и подлинности данные в отчете упомянуты непосредственно без обеспечения однородности.
14. Период полужизни в PK-исследовании
Согласуясь со сравнением стабильности в плазме крови, фармакокинетический период полужизни CBP-1018 (приблизительно 1 час) является значительно более продолжительным, чем таковой для CBP-1008 (приблизительно 20 минут) у крыс и яванских макаков, позволяя предположить, что CBP-1018 является более стабильным, чем CBP-1008.
Таблица 31. Сравнение периода полужизни (в часах) CBP-1008 и CBP-1018 в PK-исследовании у крыс
Группа изобретений относится к области биомедицинской химии. Предложены конъюгированные соединения или их фармацевтически приемлемые соли, в которых полезная нагрузка конъюгирована по меньшей мере с одной из нацеливающих молекул. Нацеливающими молекулами являются фрагмент, представляющий собой синергетическую молекулу, которая связывается с молекулой, выбранной из группы, состоящей из FOLR1, TRPV6, SSTR2 и GNRHR, и фрагмент, представляющий собой лиганд к простатспецифическому мембранному антигену. В другом варианте конъюгат содержит фрагмент, представляющий собой лиганд формулы (I), или P10, а синергетическая молекула связывается с молекулой FOLR1. Также предложены фармацевтическая композиция, способ доставки полезной нагрузки субъекту, способ лечения заболевания, где способы включают введение субъекту терапевтически эффективного количества конъюгированного соединения или его фармацевтически приемлемой соли или фармацевтической композиции. Изобретения позволяют усилить аффинность и специфичность нацеливания лекарственных соединений, тем самым доставляя пациенту высокоэффективные химиотерапевтические средства, расширяя терапевтическое окно таких средств и избегая побочных эффектов. 6 н. и 31 з.п. ф-лы, 8 ил., 31 табл., 5 пр.
1. Конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль для доставки полезной нагрузки субъекту, нуждающемуся в этом, содержащее указанную полезную нагрузку и две нацеливающие молекулы, где указанная полезная нагрузка конъюгирована по меньшей мере с одной из нацеливающих молекул, где двумя нацеливающими молекулами соответственно являются фрагмент, представляющий собой синергетическую молекулу, и фрагмент, представляющий собой лиганд к простатспецифическому мембранному антигену, где указанная синергетическая молекула представляет собой низкомолекулярное соединение или полипептид, которая связывается с молекулой, выбранной из группы, состоящей из FOLR1, TRPV6, SSTR2 и GNRHR,
где полезная нагрузка выбрана из группы, состоящей из низкомолекулярного соединения, нуклеотида, пептида и белка;
лиганд к простатспецифическому мембранному антигену представляет собой антитело, аптамер или низкомолекулярное соединение, который способен специфически распознавать и связываться с простатспецифическим мембранным антигеном.
2. Конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль по п. 1, где лиганд к простатспецифическому мембранному антигену имеет следующую структуру:
.
3. Конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль по п. 1, где лиганд к простатспецифическому мембранному антигену имеет следующую структуру:
.
4. Конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль по п. 1, где лиганд к простатспецифическому мембранному антигену имеет следующую структуру:
.
5. Конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль по п. 1, где лиганд к простатспецифическому мембранному антигену имеет следующую структуру:
.
6. Конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-5, где синергическая молекула представляет собой P10, фрагмент, представляющий собой лиганд, представленный формулой (I):
,
или фрагмент, представляющий собой лиганд, имеющий структуру:
.
7. Конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль для доставки полезной нагрузки субъекту, нуждающемуся в этом, содержащее указанную полезную нагрузку и две нацеливающие молекулы, где указанная полезная нагрузка конъюгирована по меньшей мере с одной из нацеливающих молекул, где двумя нацеливающими молекулами соответственно являются фрагмент, представляющий собой синергетическую молекулу, и фрагмент, представляющий собой лиганд, представленный формулой (I), и где указанная синергетическая молекула представляет собой низкомолекулярное соединение или полипептид, которая связывается с молекулой FOLR1,
где полезная нагрузка выбрана из группы, состоящей из низкомолекулярного соединения, нуклеотида, пептида и белка,
8. Конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль для доставки полезной нагрузки субъекту, нуждающемуся в этом, содержащее указанную полезную нагрузку и две нацеливающие молекулы, где указанная полезная нагрузка конъюгирована по меньшей мере с одной из нацеливающих молекул, где двумя нацеливающими молекулами соответственно являются фрагмент, представляющий собой синергетическую молекулу, и P10, где P10 имеет аминокислотную последовательность Cys-Lys-Glu-Phe-Leu-His-Pro-Ser-Lys-Val-Asp-Leu-Pro-Arg, и где указанная синергетическая молекула представляет собой низкомолекулярное соединение или полипептид, которая связывается с молекулой FOLR1, и полезная нагрузка представляет собой камптотецин или любое его производное.
9. Конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-8, где синергетическая молекула представляет собой фолат или его аналог.
10. Конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль по п. 9, где аналог фолата выбран из группы, состоящей из 5-метилтетрагидрофолата, 5-формилтетрагидрофолата, метотрексата и 5,10-метилентетрагидрофолата.
11. Конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль по п. 1 или 7, содержащие одну, две, три, четыре или более полезных нагрузок.
12. Конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль по п. 1 или 7, где полезная нагрузка представляет собой низкомолекулярное соединение.
13. Конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль по п. 12, где низкомолекулярное соединение выбрано из группы, состоящей из камптотецина и любого его производного, дактиномицина и любого его производного, ауристатина и любого его производного, майтанзина и любого его производного, радионуклидного комплекса, ингибитора циклооксигеназы-2, паклитаксела и любого его производного, эпотилона и любого его производного, блеомицина и любого его производного, пликамицина и любого его производного и митомицина C.
14. Конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль по п. 13, где низкомолекулярное соединение представляет собой камптотецин или любое его производное, ауристатин или любое его производное, радионуклидный комплекс или ингибитор циклооксигеназы-2.
15. Конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-14, где полезная нагрузка связана с по меньшей мере одной из нацеливающих молекул посредством линкера.
16. Конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль по п. 15, где линкер представляет собой пептидный линкер, дисульфидный линкер, pH-зависимый линкер или комбинацию вышеупомянутых линкеров.
17. Конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль по п. 16, где пептидный линкер является расщепляемым при нахождении в определенной физиологической среде за счет расщепления протеазой или восстановления.
18. Конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль по п. 16 или 17, где пептидный линкер выбран из группы, состоящей из цистеина, лизина, лизина-лизина, валина-цитруллина, фенилаланина-лизина, валина-лизина, цистеина-лизина, цистеина-глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты-аспарагиновой кислоты и аспарагиновой кислоты-аспарагиновой кислоты-лизина, и необязательно карбоновая кислота в вышеупомянутых аминокислотах является амидированной.
19. Конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль по п. 16, где дисульфидный линкер выбран из группы, состоящей из DMDS, MDS, DSDM и NDMDS.
20. Конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль по п. 16, где pH-зависимый линкер представляет собой цис-аконитовый ангидрид.
21. Конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль по п. 15, где линкер характеризуется следующими структурами:
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
или линкер представляет собой комбинацию вышеупомянутых структур и пептидного линкера.
22. Конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль по любому из пп. 1-21, где две нацеливающие молекулы связаны друг с другом посредством спейсера.
23. Конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль по п. 22, где спейсер содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-14, Arg-Arg, Ala-Ser-Asn, Ala-Ala-Ala, Ser-Ser-Arg, Pro-Arg и Pro-Leu-Gly.
24. Конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль по п. 1, где конъюгированное соединение выбрано из группы, состоящей из следующих соединений:
(20R-SM09) и
(CB-20R), где M представляет собой радионуклид.
25. Конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль по п. 6, где конъюгированное соединение представляет собой
26. Конъюгированное соединение или его фармацевтически приемлемая соль по п. 7, где конъюгированное соединение представляет собой
27. Фармацевтическая композиция для доставки полезной нагрузки субъекту, нуждающемуся в этом, содержащая терапевтически эффективное количество конъюгированного соединения или его фармацевтически приемлемой соли по любому из пп. 1-26 и фармацевтически приемлемый носитель.
28. Фармацевтическая композиция по п. 27, где композиция вводится внутривенно, подкожно, перорально, внутримышечно или интравентрикулярно.
29. Способ доставки полезной нагрузки субъекту, нуждающемуся в этом, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества конъюгированного соединения или его фармацевтически приемлемой соли по любому из пп. 1-26 или фармацевтической композиции по п. 27 или 28.
30. Способ лечения заболевания у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества конъюгированного соединения или его фармацевтически приемлемой соли по любому из пп. 1-26 или фармацевтической композиции по п. 27 или 28, где заболевание выбрано из группы, состоящей из рака, заболевания иммунной системы, сердечно-сосудистого заболевания, метаболического заболевания и неврологического заболевания.
31. Способ по п. 30, где рак выбран из группы, состоящей из рака предстательной железы, рака молочной железы, рака легкого, рака почки, лейкоза, рака яичника, рака желудочно-кишечного тракта, рака матки, карциномы эндометрия, рака печени, рака толстой кишки, рака щитовидной железы, рака поджелудочной железы, колоректального рака, рака пищевода, рака яичка, рака кожи, лимфомы и множественной миеломы.
32. Способ по п. 29, где заболевание иммунной системы представляет собой аутоиммунное заболевание.
33. Способ по п. 32, где аутоиммунное заболевание выбрано из группы, состоящей из заболевания соединительной ткани, системного склероза, ревматоидного артрита и системной красной волчанки.
34. Способ по п. 30, где сердечно-сосудистое заболевание выбрано из группы, состоящей из стенокардии, инфаркта миокарда, инсульта, сердечного приступа, гипертонической болезни сердца, ревматической болезни сердца, кардиомиопатии, аритмии и врожденного порока сердца.
35. Способ по п. 30, где метаболическое заболевание выбрано из группы, состоящей из диабета, подагры, ожирения, гипогликемии, гипергликемии и дислипидемии.
36. Способ по п. 30, где неврологическое заболевание выбрано из группы, состоящей из болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, болезни Хантингтона, травмы головы, рассеянного склероза, головокружения, комы и эпилепсии.
37. Способ по любому из пп. 30-36, где способ дополнительно включает введение одного или нескольких терапевтических средств в комбинации с конъюгированным соединением или его фармацевтически приемлемой солью или фармацевтической композицией.
| EDER M | |||
| et al | |||
| "Preclinical evaluation of a bispecific low-molecular heterodimer targeting both PSMA and GRPR for improved PET imaging and therapy of prostate cancer", THE PROSTATE, 1 May 2014, v.74, no.6, p.659-668, DOI: 10.1002/PROS.22784 | |||
| CN 107412794 A, 01.12.2017 | |||
| CN 106466484 A, 01.03.2017 | |||
| Контрольный аппарат для общего пользования ключами от различных помещений | 1932 |
|
SU28805A1 |
