ПРИМЕНЕНИЯ ИММУНОКОНЪЮГАТОВ, МИШЕНЬЮ КОТОРЫХ ЯВЛЯЕТСЯ CD138 Российский патент 2015 года по МПК A61K39/395 A61P35/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к способам и схемам лечения, в частности, человека, которые включают введение иммуноконъюгатов, сконструированных так, что их мишенями являются клетки, экспрессирующие CD138. Настоящее изобретение также относится к противораковым комбинациям, содержащим их фармацевтические композиции и к их применению для лечения рака, содержащего клетки-мишени, которые экспрессируют CD138. Настоящее изобретение, в частности, относится к противораковым комбинациям, которые обладают синергизмом или другими неожиданными аддитивными эффектами лечения по сравнению с лечением, в которое включены менее чем все компоненты комбинации.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

CD138, который выполняет функцию рецептора для экстраклеточного матрикса, сверхэкспрессирован на клетках множественной миеломы (MM) и, как установлено, оказывает влияние на развитие и/или пролиферацию клеток ММ. CD138 также экспрессирован на клетках карциномы яичника, рака шейки матки (Numa et al., 2002), рака эндометрия (Choi et al., 2007), карциномы почки, желчного пузыря, переходноклеточной карциномы, рака желудка (Wiksten et al., 2008), аденокарциномы предстательной железы (Zellweger et al., 2003), карциномы молочной железы (Loussouarn et al., 2008), немелкоклеточной карциномы легкого (Shah et al., 2004), плоскоклеточного рака легкого (Toyoshima et al., 2001), клетках карциномы ободочной кишки и клеткам лимфомы Ходжкина и неходжкинской лимфомы, колоректальной карциномы (Hashimoto et al., 2008), гепатокарциномы (Li et al., 2005), хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL), рака поджелудочной железы (Conejo et al., 2000) и карциномы головы и шеи (Anttonen et al., 1999), помимо прочих.

Публикации и другие материалы, в том числе патенты, используемые в настоящем документе в качестве иллюстрации настоящего изобретения и, в частности, для дополнительного описания в отношении осуществления на практике, включены в качестве ссылки. Для удобства публикации упоминаются в тексте посредством указания имени автора и даты и/или перечислены в алфавитном порядке по имени автора в прилагаемом списке литературы.

Tassone et al. (2004) сообщили об отличном связывании мышиного IgG1 антитела B-B4 с антигеном CD138, экспрессированным на поверхности клеток MM. Tassone также сообщил о высокой цитотоксической активности иммуноконъюгата B-B4-DM1, который содержит майтансиноид DM1 в качестве эффекторной молекулы, по отношению к клеткам множественной миеломы (см. также публикацию заявки на патент США 20070183971).

Ikeda et al. (2008 и 2009) сообщили о многообещающих in vitro результатах и результатах, полученных при использовании иммуноконъюгата ВТ062, основанного на В-B4, в моделях с использованием ксенотрансплантатов.

Несмотря на то, что публикации Tassone et al. и Ikeda et al. вносят вклад в осуществление эффективного лечения MM и являющейся предметом обсуждения композиции, которая может использоваться при таком лечении, в данной области техники сохраняется ряд потребностей.

Сохраняется, в частности, необходимость в подходящих схемах лечения заболеваний, связанных с экспрессией CD138, включающих плазмапролиферативные нарушения, связанные с экспрессией CD138, такие как MM. Еще, в частности, сохраняется необходимость в схемах лечения, которые обеспечивают удержание токсичностей по отношению к неопухолевым клеткам, которые также экспрессируют CD138, на клинически допустимом уровне, либо посредством применения только определенных допустимых количеств иммуноконъюгата и/или посредством комбинирования иммуноконъюгата с цитотоксическими средствами, которые, как известно, являются эффективными против нарушения, о котором идет речь. Также существует потребность в схемах лечения, которые уменьшают потребность в лекарственных средствах, используемых для ослабления других симптомов заболевания.

Это изобретение удовлетворяет, в определенных вариантах осуществления, одну или более этих потребностей, а также другие потребности в данной области техники, которые станут очевидны квалифицированному специалисту после прочтения нижеприведенного описания.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение удовлетворяет одну или более вышеописанных потребностей посредством того, что относится к способам лечения заболевания, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения заболевания, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138, предусматривающим:

введение индивиду, при необходимости, в частности, человеку эффективного количества, которое, предпочтительно, является допустимым количеством, иммуноконъюгата, содержащего

по крайней мере один нацеливающий агент, например, сконструированное нацеливающее антитело, мишенями которого являются экспрессирующие CD138 клетки, и

по крайней мере одну эффекторную молекулу, причем указанный нацеливающий агент функционально связан с указанной эффекторной молекулой с образованием указанного иммуноконъюгата.

Предпочтительно, по крайней мере часть сконструированного нацеливающего антитела, или в альтернативном случае любого другого описанного в настоящем документе иммуноконъюгата, придает, предпочтительно, свойства изотипа IgG4.

В дополнительном варианте осуществления изобретением является иммуноконъюгат для лечения заболевания, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138, содержащий:

(i) по крайней мере один нацеливающий агент, мишенями которого являются экспрессирующие CD138 клетки, и

(ii) по крайней мере одну эффекторную молекулу,

причем нацеливающий агент функционально связан с эффекторной молекулой с образованием иммуноконъюгата, причем иммуноконъюгат должен вводиться в эффективном количестве, а эффективное количество является допустимым количеством.

Кроме того, в этом варианте осуществления изобретение относится к применению иммуноконъюгата для получения лекарственного средства для лечения заболевания, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138, содержащего:

(i) по крайней мере один нацеливающий агент, мишенями которого являются экспрессирующие CD138 клетки, и

(ii) по крайней мере одну эффекторную молекулу,

причем нацеливающий агент функционально связан с эффекторной молекулой с образованием иммуноконъюгата, причем иммуноконъюгат должен вводиться в эффективном количестве, а эффективное количество является допустимым количеством.

Иммуноконъюгат, предпочтительно, вводят индивиду в количестве, составляющем 5 мг/м²-200 мг/м² или фармакокинетически эквивалентном указанному количеству.

Другим предпочтительным вариантом осуществления является комбинированный препарат, состоящий из иммуноконъюгата и средства для лечения неблагоприятных побочных эффектов, для одновременного, раздельного или последовательного применения при лечении заболевания, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138, причем иммуноконъюгат содержит:

(i) по крайней мере один нацеливающий агент, мишенями которого являются экспрессирующие CD138 клетки, и

(ii) по крайней мере одну эффекторную молекулу,

причем нацеливающий агент функционально связан с эффекторной молекулой с образованием иммуноконъюгата, и причем иммуноконъюгат должен вводиться в количестве, фармакокинетически эквивалентном 5 мг/м² - 200 мг/м² иммуноконъюгата при его введении отдельно.

Дополнительно, этим дополнительным предпочтительным вариантом осуществления является применение иммуноконъюгата и средства для лечения неблагоприятных побочных эффектов для получения комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения при лечении заболевания, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138, причем иммуноконъюгат содержит:

(i) по крайней мере один нацеливающий агент, мишенями которого являются экспрессирующие CD138 клетки, и

(ii) по крайней мере одну эффекторную молекулу,

причем нацеливающий агент функционально связан с эффекторной молекулой с образованием иммуноконъюгата, и причем иммуноконъюгат должен вводиться в количестве, фармакокинетически эквивалентном 5 мг/м² - 200 мг/м² иммуноконъюгата при его введении отдельно.

В частности, иммуноконъюгат может вводиться индивиду в количестве, составляющем от 5 мг/м² или 10 мг/м² до менее 160 мг/м², предпочтительно, до 150 мг/м², 140 мг/м², 130 мг/м² или 120 мг/м².

Максимальная концентрация иммуноконъюгата в плазме индивида между 0 и 2 часами после завершения первого введения может составлять менее 50%, предпочтительно, менее 40%, более предпочтительно, менее 30%, еще более предпочтительно, менее 20% или даже менее 10% теоретической максимальной концентрации для указанного иммуноконъюгата.

Иммуноконъюгат может вводиться по крайней мере четыре раза, и максимальная концентрация иммуноконъюгата в плазме индивида между 0 и 2 часами после завершения каждого из указанных введений может составлять менее 55%, предпочтительно, менее 50%, более предпочтительно, менее 40%, еще более предпочтительно, менее 30%, менее 20% или даже менее 10% теоретической максимальной концентрации для указанного иммуноконъюгата.

Указанная максимальная концентрация может составлять менее 3 мкг/мл в случае введения 10 мг/м²; менее 8 мкг/мл в случае введения 20 мг/м², менее 15 мкг/мл в случае введения 40 мг/м², менее 25 мкг/мл в случае введения 80 мг/м², менее 30 мкг/мл в случае введения 120 мг/м².

Максимальная концентрация иммуноконъюгата после четвертого применения в плазме индивида между 0 и 2 часами после завершения первого введения может составлять менее 55%, предпочтительно, менее 50%, более предпочтительно, менее 40%, еще более предпочтительно, менее 30%, менее 20% или даже менее 10% теоретической максимальной концентрации для указанного иммуноконъюгата.

Указанная максимальная концентрация может составлять менее 14 мкг/мл в случае введения 20 мг/м², менее 15 мкг/мл в случае введения 40 мг/м² или менее 25 мкг/мл в случае введения 80 мг/м². Иммуноконъюгат может вводиться внутривенно. Иммуноконъюгат может вводиться внутривенно в повторной разовой дозе, и максимальная концентрация иммуноконъюгата в плазме индивида между 0 и 2 часами после завершения любого введения может составлять менее 55%, менее 50% или менее 40% теоретической максимальной концентрации для указанного иммуноконъюгата. Стабилизация заболевания может сохраняться в течение по крайней мере 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 циклов лечения (в течение по крайней мере 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30 недель). Состояние по крайней мере стабилизации заболевания может сохраняться в течение 5, 6, 7, 8, 9 или 10 циклов лечения иммуноконъюгатом в дозе 20 мг/м², и необязательно максимальная концентрация иммуноконъюгата в плазме индивида между 0 и 2 часами после завершения любого введения может составлять менее 55%, менее 50% или менее 40% теоретической максимальной концентрации для указанного иммуноконъюгата. В некоторых случаях незначительная ответная реакция может наблюдаться после вплоть до 8 циклов лечения.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения заболевания, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138, предусматривающему введение индивиду, при необходимости лечения, предпочтительно, человеку, эффективного количества иммуноконъюгата, содержащего

по крайней мере один нацеливающий агент, мишенью которого является экспрессированный на клеточной поверхности CD138, и

по крайней мере одну эффекторную молекулу, причем указанный нацеливающий агент функционально связан с указанной эффекторной молекулой с образованием указанного иммуноконъюгата, причем указанный иммуноконъюгат вводят

в дозе, предпочтительно, в повторной разовой дозе, составляющей не более чем приблизительно 10, 20, 30, 40, 80, 90, 100 или 120 мг/м²,

в средней суточной дозе, составляющей от приблизительно 400 мкг/м² до приблизительно 6 мг/м², в том числе приблизительно 500 мкг/м², приблизительно 1 мг/м², приблизительно 2 мг/м², приблизительно 3 мг/м², приблизительно 4 мг/м², и/или

в средней еженедельной дозе, составляющей от приблизительно 3 мг/м² до приблизительно 40 мг/м², в том числе приблизительно 5 мг/м², приблизительно 10 мг/м², приблизительно 15 мг/м², приблизительно 20 мг/м², приблизительно 25 мг/м², приблизительно 30 мг/м² или приблизительно 35 мг/м².

Указанные в настоящем описании способы могут обеспечить стабилизацию заболевания в течение приблизительно 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 100, 120, 140, 160, 180, 190, 200, 210 или более дней и/или в течение приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или более циклов лечения, каждый из которых длится приблизительно три недели.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения заболевания, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138, предусматривающему введение нуждающемуся индивиду, предпочтительно, человеку, эффективного количества иммуноконъюгата, содержащего

по крайней мере один нацеливающий агент, мишенью которого является экспрессированный на клеточной поверхности CD138, и

по крайней мере одну эффекторную молекулу, причем указанный нацеливающий агент функционально связан с указанной эффекторной молекулой с образованием указанного иммуноконъюгата,

причем у указанного индивида указанный CD138 экспрессирован на указанных клетках-мишенях и на не являющихся мишенями клетках, причем указанное введение приводит к среднему или медленному плазменному клиренсу, и причем указанные не являющиеся мишенями клетки, в частности, эпителиальные клетки, по существу не подвергаются воздействию.

Эффективное вводимое количество может составлять менее 200 мг/м² или менее чем количество, фармакокинетически эквивалентное 200 мг/м² при введении в сочетании со средством для лечения неблагоприятных побочных эффектов, и при этом указанное введение может приводить к ответной реакции у указанного индивида, предпочтительно, через менее чем 40, 30, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5 часов.

Указанное эффективное количество может составлять более чем 120 мг/м².

Указанные уровни экспрессии указанного CD138 на являющихся мишенями и не являющихся мишенями клетках (например, эпителиальных клетках) могут быть соизмеримыми.

Указанное эффективное количество может вводиться в виде, например, однократной дозы или повторной разовой дозы, или в виде многократных доз.

Указанное эффективное количество может вводиться в виде многократных доз, причем значение Cmax после каждого введения составляет более чем 55% теоретического значения Cmax.

Заболевание может сопровождаться болями в костях и/или осложнениями со стороны костей, и указанное введение указанного иммуноконъюгата или противораковой комбинации в соответствии с настоящим изобретением может уменьшить указанные боли в костях и/или осложнения со стороны костей, предпочтительно, до допустимого уровня. Введение лекарственного средства для уменьшения болей в костях и/или осложнений со стороны костей может быть прекращено или обычно вводимый базисный уровень может быть снижен на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%. Базисный уровень представляет собой уровень, обычно рекомендуемый для лечения симптомов, и его можно узнать из сопровождающих лекарственное средство инструкций в отношении применения, или он известен квалифицированному в области назначения лекарственных средств от боли специалисту. Например, уровень бисфосфонатов, например памидроната, который обычно вводят в дозе 90 мг каждые четыре недели, или золедроновой кислоты, которую обычно вводят в дозе 4 мг раз в месяц (Terpos et al., 2009), можно снизить на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% (или осуществлять введение с большими интервалами времени, которые соответствуют этому снижению), или их введение можно исключить.

Указанное введение может также привести к уровням FLC или M-белка, соответствующим по крайней мере стабилизации заболевания, незначительной ответной реакции или частичной ответной реакции у указанного индивида, предпочтительно, после первого введения.

Указанный иммуноконъюгат может содержать антигенсвязывающую область (ABR) антитела против CD138 и дополнительную область антитела, причем по крайней мере часть указанной дополнительной области антитела может быть частью антитела человека и может придавать указанные свойства изотипа IgG4.

Указанный иммуноконъюгат может содержать nBT062 или нацеливающее антитело, которое идентично по последовательности nBT062 по крайней мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, или может соответствовать BT062.

Индивидом может являться человек.

Способ может по существу состоять из введения фармацевтической композиции, содержащей указанный иммуноконъюгат и фармацевтически приемлемый носитель, причем активный ингредиент указанной композиции может по существу состоять из указанного иммуноконъюгата.

Любой из описанных в настоящем документе способов может привести к стабилизации заболевания, ответной реакции, в частности незначительной ответной реакции, частичной ответной реакции, очень хорошей частичной ответной реакции, полной ответной реакции с наложенными ограничениями или полной ответной реакции, стойкой в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 циклов лечения или дольше, причем каждый из указанных циклов лечения включает приблизительно 3 недели с введением указанного иммуноконъюгата в день 1 каждого указанного цикла лечения.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения заболевания, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138, предусматривающему

(i) идентификацию указанного заболевания как заболевания, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138, такое как множественная миелома, и как заболевание, не отвечающее, или плохо отвечающее, на лечение одним или несколькими цитотоксическими средствами, иммуномодуляторами, такими как леналидомид, и/или ингибиторами протеасом, такими как бортезомиб, и

(ii) введение, предпочтительно, внутривенно, указанному индивиду эффективного количества определенного в настоящем документе иммуноконъюгата в дозе, составляющей менее 200 мг/м² в случае введения указанного иммуноконъюгата отдельно, или указанного эффективного количества, которое фармакокинетически эквивалентно 200 мг/м² в случае введения с агентом для лечения побочных эффектов, в том числе возможных побочных эффектов,

причем индивид не отвечает, или плохо отвечает, на лечение одним или несколькими цитотоксическими средствами, иммуномодуляторами, такими как леналидомид, и/или ингибиторами протеасом, такими как бортезомиб, и причем осуществляют лечение указанного заболевания.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения заболевания, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138, предусматривающему

введение индивиду, при необходимости лечения и демонстрирующему высокие уровни sCD138, такие как более чем 50 нг/мл, более чем 60 нг/мл, более чем 70 нг/мл, более чем 80 нг/мл, более чем 100 нг/мл, более чем 150 нг/мл, более чем 200 нг/мл, более чем 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500 нг/мл, эффективного количества определенного в настоящем документе иммуноконъюгата, причем уже количество, составляющее 20 мг/м² или менее 40 мг/м², является эффективным для вызова ответной реакции, такой как незначительная ответная реакция. Указанная ответная реакция может быть следствием селективного связывания иммуноконъюгата. Указанный индивид может не отвечать, или плохо отвечать, на лечение цитотоксическими средствами, иммуномодуляторами, такими как леналидомид, и/или ингибиторами протеасом, такими как бортезомиб.

Сконструированное нацеливающее антитело может содержать антигенсвязывающую область (ABR) антитела против CD138 и дополнительную область антитела, причем по крайней мере часть указанной дополнительной области антитела является частью антитела человека и придает указанные свойства изотипа IgG4.

Заболеванием может быть множественная миелома, в частности, рецидивирующая или резистентная множественная миелома.

Указанное заболевание, при котором CD138 экспрессирован на клетках-мишенях, может быть также выбрано из группы, состоящей из почечно-клеточной карциномы, рака эндометрия, рака шейки матки, аденокарциномы предстательной железы, карциномы поджелудочной железы, рака желудка, рака мочевого пузыря, карциномы молочной железы, гепатокарциномы, колоректальной карциномы, карциномы ободочной кишки, плоскоклеточного рака, рака легкого, в частности, плоскоклеточного рака легкого, неходжкинской лимфомы, карциномы вилочковой железы, матки, мочевых путей и яичника.

В предпочтительных вариантах осуществления иммуноконъюгат однородно нацелен на экспрессирующие CD138 клетки-мишени.

В определенных вариантах осуществления сконструированное нацеливающее антитело по настоящему изобретению может

(i) по существу состоять из антигенсвязывающей области (ABR) нечеловеческого антитела против CD138 или

(ii) содержать антигенсвязывающую область (ABR) антитела против CD138, причем указанная антигенсвязывающая область является частью нечеловеческого антитела, и

дополнительную область антитела, причем по крайней мере часть указанной дополнительной области антитела является частью антитела человека.

ABR может содержать:

(a) CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащий аминокислотные остатки 99-111 SEQ ID NO:1, и

(b) CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащий аминокислотные остатки 89-97 SEQ ID NO:2, соответственно.

ABR может, кроме того, содержать:

(a) CDR1 и CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащие аминокислотные остатки 31-35 и 51-68 SEQ ID NO:1, и/или

(b) CDR1 и CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащие аминокислотные остатки 24-34 и 50-56 SEQ ID NO:2, соответственно.

Дополнительная область антитела может содержать:

(a) аминокислотные остатки 123-448 SEQ ID NO:1, и/или

(b) аминокислотные остатки 108-214 SEQ ID NO:2, соответственно, и их мутации, которые

(i) позволяют сохранить или уменьшить антителозависимую цитотоксичность и/или комплементзависимую цитотоксичность сконструированного нацеливающего антитела и/или

(ii) стабилизируют сконструированное нацеливающее антитело.

Антитело может содержать легкую цепь, идентичную по последовательности SEQ ID NO:2 по крайней мере на приблизительно 70%, более предпочтительно, 80%, 85% или 90%, и тяжелую цепь, идентичную по последовательности SEQ ID NO:1 по крайней мере на приблизительно 70%, более предпочтительно, 80%, 85% или 90%, и содержать антигенсвязывающие области, определенные выше.

Эффекторная молекула может быть присоединена к указанному сконструированному нацеливающему антителу посредством линкера. Линкер может включать дисульфидную связь. Эффекторная молекула (например, DM4) может обеспечить стерическое препятствие между нацеливающим антителом и эффекторной молекулой. Эффекторной молекулой может быть по крайней мере один майтансиноид (например, DM1, DM3 или DM4), таксан или CC1065, или его аналог.

Иммуноконъюгат может связывать CD138 с изменением нацеленности, составляющим менее чем 150%, 140%, 130%, 120%, 110%, 100%, 90%, 80%, 70%, 60% или 50%.

В определенных вариантах осуществления описанных в настоящем документе способов иммуноконъюгат может содержать:

нацеливающий агент, мишенью которого является CD138, содержащий

выделенный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина или ее части, причем указанная тяжелая цепь иммуноглобулина или ее часть идентична по последовательности SEQ ID NO:1 по крайней мере на 70%. Константная область указанной тяжелой цепи иммуноглобулина или ее указанной части может быть константной областью изотипа IgG4.

Нацеливающий агент иммуноконъюгата может содержать последовательность легкой цепи, идентичную SEQ ID NO:2 по крайней мере на приблизительно 70%. Нацеливающий агент иммуноконъюгата может также содержать последовательность тяжелой цепи, идентичную SEQ ID NO:1 по крайней мере на приблизительно 70%.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей любой из иммуноконъюгатов, определенных в данном документе, для подавления, задержки и/или предотвращения роста опухолей и/или распространения опухолевых клеток, и один или несколько фармацевтически приемлемых наполнителей.

Фармацевтическая композиция может содержать цитотоксические средства, определенные в настоящем документе.

Настоящее изобретение также относится к набору, содержащему, в отдельных контейнерах, указанную фармацевтическую композицию в одной или более лекарственных форм и, в отдельном контейнере, инструкции в отношении того, как вводить одну или более лекарственных форм индивиду, в частности, человеку, при необходимости, например, в виде повторной разовой дозы или другой схемы лечения, обсуждаемой в данном описании.

В частности, в одном из аспектов настоящего изобретения осуществляют введение любого из описанных в настоящем документе иммуноконъюгатов индивиду или применяют его к клеткам индивида, в частности, человека, для которого такое введение (применение) может быть эффективным. Иммуноконъюгат может также использоваться для получения лекарственного средства для лечения такого нарушения.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к иммуноконъюгату для лечения заболевания у индивида, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138, причем иммуноконъюгат содержит:

(i) по крайней мере один нацеливающий агент, мишенями которого являются экспрессирующие CD138 клетки, и

(ii) по крайней мере одну эффекторную молекулу,

причем нацеливающий агент функционально связан с эффекторной молекулой с образованием иммуноконъюгата, причем индивид не отвечает, или плохо отвечает, на лечение одним или несколькими цитотоксическими средствами, в том числе иммуномодуляторами и/или ингибиторами протеасом,

и причем иммуноконъюгат должен вводиться индивиду, предпочтительно, внутривенно, в количестве, составляющем 5 мг/м²-200 мг/м².

Кроме того, настоящее изобретение относится к применению иммуноконъюгата для получения лекарственного средства для лечения заболевания у индивида, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138, причем иммуноконъюгат содержит:

(i) по крайней мере один нацеливающий агент, мишенями которого являются экспрессирующие CD138 клетки, и

(ii) по крайней мере одну эффекторную молекулу,

причем нацеливающий агент функционально связан с эффекторной молекулой с образованием иммуноконъюгата, причем индивид не отвечает, или плохо отвечает, на лечение одним или несколькими цитотоксическими средствами, в том числе иммуномодуляторами и/или ингибиторами протеасом,

и причем иммуноконъюгат должен вводиться индивиду, предпочтительно, внутривенно, в количестве, составляющем 5 мг/м² - 200 мг/м².

Настоящее изобретение также относится к комбинированному препарату, состоящему из иммуноконъюгата и средства для лечения неблагоприятных побочных эффектов, для одновременного, раздельного или последовательного применения при лечении заболевания у индивида, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138, причем иммуноконъюгат содержит:

(i) по крайней мере один нацеливающий агент, мишенями которого являются экспрессирующие CD138 клетки, и

(ii) по крайней мере одну эффекторную молекулу,

причем нацеливающий агент функционально связан с эффекторной молекулой с образованием иммуноконъюгата,

причем индивид не отвечает, или плохо отвечает, на лечение одним или несколькими цитотоксическими средствами, в том числе иммуномодуляторами и/или ингибиторами протеасом, и причем иммуноконъюгат должен вводиться индивиду, предпочтительно, внутривенно, в количестве, фармакокинетически эквивалентном 5 мг/м² - 200 мг/м² иммуноконъюгата при его введении отдельно.

Кроме того, настоящее изобретение относится к применению иммуноконъюгата и средства для лечения неблагоприятных побочных эффектов для получения комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения при лечении заболевания у индивида, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138, причем иммуноконъюгат содержит:

(i) по крайней мере один нацеливающий агент, мишенями которого являются экспрессирующие CD138 клетки, и

(ii) по крайней мере одну эффекторную молекулу,

причем нацеливающий агент функционально связан с эффекторной молекулой с образованием иммуноконъюгата,

причем индивид не отвечает, или плохо отвечает, на лечение одним или несколькими цитотоксическими средствами, в том числе иммуномодуляторами и/или ингибиторами протеасом, и причем иммуноконъюгат должен вводиться индивиду, предпочтительно, внутривенно, в количестве, фармакокинетически эквивалентном 5 мг/м² - 200 мг/м² иммуноконъюгата при его введении отдельно.

Кроме того, настоящее изобретение относится к иммуноконъюгату для лечения заболевания у пациента, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138, причем иммуноконъюгат содержит:

(i) по крайней мере один нацеливающий агент, мишенями которого являются экспрессирующие CD138 клетки, и

(ii) по крайней мере одну эффекторную молекулу,

причем нацеливающий агент функционально связан с эффекторной молекулой с образованием иммуноконъюгата,

причем у пациента отмечаются уровни sCD138 в своей плазме, превышающие 50 нг/мл, и

причем, предпочтительно, иммуноконъюгат должен вводиться в количестве, эффективном для обеспечения по крайней мере незначительной ответной реакции.

Настоящее изобретение также относится к применению иммуноконъюгата для получения лекарственного средства для лечения заболевания, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138, причем иммуноконъюгат содержит:

(i) по крайней мере один нацеливающий агент, мишенями которого являются экспрессирующие CD138 клетки, и

(ii) по крайней мере одну эффекторную молекулу,

причем нацеливающий агент функционально связан с эффекторной молекулой с образованием иммуноконъюгата,

причем у пациента отмечаются уровни sCD138 в своей плазме, превышающие 50 нг/мл, и

причем, предпочтительно, иммуноконъюгат должен вводиться в количестве, эффективном для обеспечения по крайней мере незначительной ответной реакции.

В предпочтительном варианте осуществления иммуноконъюгат должен вводиться в количестве, составляющем по крайней мере 20 мг/м² и, более предпочтительно, по крайней мере 40 мг/м².

В предпочтительном варианте осуществления уровни sCD138, которые отмечаются у пациента, в плазме превышают 60 нг/мл, 70 нг/мл, 80 нг/мл, 100 нг/мл, 150 нг/мл, 200 нг/мл или 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 или 1500 нг/мл.

Настоящее изобретение также относится к противораковой комбинации, содержащей

по крайней мере одно цитотоксическое средство и по крайней мере один иммуноконъюгат, содержащий нацеливающий агент, мишенями которого являются экспрессирующие CD138 клетки, и

по крайней мере одну эффекторную молекулу, причем указанный нацеливающий агент функционально связан с эффекторной молекулой с образованием указанного иммуноконъюгата, причем

(a) комбинация характеризуется коэффициентом синергизма, более чем 1, более чем 1,1, более чем 1,2, более чем 1,3, более чем 1,4, или

(b) комбинация характеризуется коэффициентом синергизма, составляющим приблизительно 1, и эффекторная молекула и цитотоксическое средство имеют интерферирующие механизмы действия,

и причем указанная противораковая комбинация представляет собой фармацевтическую композицию или набор, содержащий по крайней мере одно цитотоксическое средство и по крайней мере один иммуноконъюгат в отдельных контейнерах.

Цитотоксическим средством может быть ингибитор протеасом, иммуномодулятор или антиангиогенное средство, ДНК-алкилирующее средство или смесь двух или более указанных средств.

Цитотоксическим средством может быть бортезомиб, талидомид, леналидомид, мелфалан или смесь двух или более указанных средств.

Эффекторная молекула и цитотоксическое средство противораковой комбинации могут иметь интерферирующие механизмы действия, и при этом эти механизмы действия, предпочтительно, включают ингибирование образования микротрубочек или индукция остановки клеточного цикла (мелфалан, бортезомиб и леналидомид или талидомид являются цитотоксическими средствами, которые вызывают остановку клеточного цикла). Альтернативно, они могут иметь не интерферирующие механизмы действия.

Если противораковая комбинация является частью фармацевтической композиции, фармацевтическая композиция может содержать по крайней мере один фармацевтически приемлемый наполнитель.

Противораковая комбинация может также быть частью набора, в котором по крайней мере одно цитотоксическое средство и по крайней мере один иммуноконъюгат хранятся в отдельных контейнерах.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения заболевания, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138, предусматривающему

введение пациенту, при необходимости, эффективного количества противораковой комбинации, упоминаемой в данном описании, или противораковой комбинации, содержащей по крайней мере одно цитотоксическое средство и по крайней мере один иммуноконъюгат, содержащий нацеливающий агент, мишенями которого являются экспрессирующие CD138 клетки, и по крайней мере одну эффекторную молекулу, причем указанный нацеливающий агент функционально связан с указанной эффекторной молекулой с образованием указанного иммуноконъюгата, и причем иммуноконъюгат преодолевает фенотип резистентности к указанному цитотоксическому средству у пациента.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения заболевания, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138, предусматривающему

введение пациенту, при необходимости, эффективного количества противораковой комбинации, упоминаемой в данном описании, и при этом иммуноконъюгат преодолевает фенотип резистентности.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения не являющегося плазмапролиферативным заболевания, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138, предусматривающему введение индивиду, при необходимости, или применение к клеткам указанного не являющегося плазмапролиферативным заболевания эффективного количества иммуноконъюгата, содержащего

по крайней мере один нацеливающий агент, мишенями которого являются экспрессирующие CD138 клетки, и

по крайней мере одну эффекторную молекулу, причем указанный нацеливающий агент функционально связан с указанной эффекторной молекулой с образованием указанного иммуноконъюгата,

причем у указанного индивида указанный CD138 экспрессирован на указанных клетках-мишенях и на не являющихся мишенями клетках на соизмеримых уровнях, или причем у указанного индивида указанный CD138 экспрессирован на указанных клетках-мишенях на уровнях, которые ниже таковых в случае указанных не являющихся мишенями клеток, экспрессирующих CD138.

Указанными не являющимися мишенями клетками, экспрессирующими CD138, могут быть эпителиальные клетки.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения не являющегося плазмапролиферативным заболевания, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138, предусматривающему введение индивиду, при необходимости, или применение к клеткам указанного не являющегося плазмапролиферативным заболевания эффективного количества иммуноконъюгата, содержащего

по крайней мере один нацеливающий агент, мишенями которого являются экспрессирующие CD138 клетки, и

по крайней мере одну эффекторную молекулу, причем указанный нацеливающий агент функционально связан с указанной эффекторной молекулой с образованием указанного иммуноконъюгата,

причем CD138 «слущивается» с клеток-мишеней указанного заболевания в течение периода времени, составляющего 24 часа, 2, 3, 4, 5, 6 дней.

Указанным заболеванием может быть карцинома молочной железы.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к комбинированному препарату, состоящему из по крайней мере одного цитотоксического средства и по крайней мере одного иммуноконъюгата, для одновременного, раздельного или последовательного применения при лечении заболевания у индивида, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138, причем иммуноконъюгат содержит:

(i) нацеливающий агент, мишенями которого являются экспрессирующие CD138 клетки, и

(ii) по крайней мере одну эффекторную молекулу,

причем нацеливающий агент функционально связан с по крайней мере одной эффекторной молекулой с образованием иммуноконъюгата, и

причем индивид имеет фенотип резистентности.

Кроме того, настоящее изобретение относится к применению по крайней мере одного цитотоксического средства и по крайней мере одного иммуноконъюгата для получения комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения при лечении заболевания у индивида, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138, причем иммуноконъюгат содержит:

(i) нацеливающий агент, мишенями которого являются экспрессирующие CD138 клетки, и

(ii) по крайней мере одну эффекторную молекулу,

причем нацеливающий агент функционально связан с по крайней мере одной эффекторной молекулой с образованием иммуноконъюгата, и

причем индивид имеет фенотип резистентности.

В предпочтительном варианте осуществления комбинация, состоящая из по крайней мере одного цитотоксического средства и по крайней мере одного иммуноконъюгата, характеризуется коэффициентом синергизма, более 1, более 1,1, более 1,2, более 1,3 или более 1,4. Альтернативно, комбинация, состоящая из по крайней мере одного цитотоксического средства и по крайней мере одного иммуноконъюгата, характеризуется коэффициентом синергизма, составляющим приблизительно 1, и эффекторная молекула и цитотоксическое средство имеют перекрывающиеся механизмы действия.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к иммуноконъюгату для лечения не являющегося плазмапролиферативным заболевания у индивида, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138, причем иммуноконъюгат содержит:

(i) по крайней мере один нацеливающий агент, мишенями которого являются экспрессирующие CD138 клетки, и

(ii) по крайней мере одну эффекторную молекулу,

причем нацеливающий агент функционально связан с эффекторной молекулой с образованием иммуноконъюгата, и

причем у индивида CD138 экспрессирован на клетках-мишенях на уровнях, которые соизмеримы с уровнями (эквивалентны), на которых CD138 экспрессирован на не являющихся мишенями клетках, или ниже указанных уровней.

Настоящее изобретение также относится к применению иммуноконъюгата для получения лекарственного средства для лечения не являющегося плазмапролиферативным заболевания у индивида, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138, причем иммуноконъюгат содержит:

(i) по крайней мере один нацеливающий агент, мишенями которого являются экспрессирующие CD138 клетки, и

(ii) по крайней мере одну эффекторную молекулу,

причем нацеливающий агент функционально связан с эффекторной молекулой с образованием иммуноконъюгата, и

причем у индивида CD138 экспрессирован на клетках-мишенях на уровнях, которые соизмеримы с уровнями (равны им), на которых CD138 экспрессирован на не являющихся мишенями клетках, или ниже указанных уровней.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения не являющегося плазмапролиферативным заболевания, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138, предусматривающему введение индивиду, при необходимости, или применение к клеткам указанного не являющегося плазмапролиферативным заболевания эффективного количества иммуноконъюгата, содержащего

по крайней мере один нацеливающий агент, мишенями которого являются экспрессирующие CD138 клетки, и

по крайней мере одну эффекторную молекулу, причем указанный нацеливающий агент функционально связан с указанной эффекторной молекулой с образованием указанного иммуноконъюгата, причем иммуноконъюгат вызывает ремиссию солидной опухоли.

Этой ремиссией может быть ремиссия с последующим промежутком времени без возобновления роста указанной опухоли (полная ремиссия). Этот промежуток времени может составлять более чем 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 недель, полгода или 1 год или больше.

Солидной опухолью может быть карцинома поджелудочной железы или карцинома молочной железы.

Заболеванием может быть почечно-клеточная карцинома, рак эндометрия, рак шейки матки, аденокарцинома предстательной железы, карцинома поджелудочной железы, рак желудка, рак мочевого пузыря, карцинома молочной железы, гепатокарцинома, колоректальная карцинома, карцинома ободочной кишки, плоскоклеточный рак, рак легкого, в частности, плоскоклеточный рак легкого, неходжкинская лимфома, карцинома вилочковой железы, матки, мочевых путей и яичника.

Солидной опухолью может быть карцинома молочной железы, которая является отрицательной по рецепторам эстрогена и/или отрицательной по рецепторам прогестерона.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг. 1 представлено в схематическом виде nBT062, к которому присоединены эффекторные молекулы.

Фиг. 2 является представлением BT062 в виде химической структуры.

На фиг. 3 представлено превращение ансамитоцина P-3 в майтансинол (стереохимия опущена ради упрощения).

На фиг. 4 представлена репрезентативная схема синтеза DM4.

На фиг. 5 представлено в схематическом виде конъюгирование антитела (nBT062 с DM4).

На фиг. 6 представлен анализ связывания nBT062-SPDB-DM4, nBT062-SPP-DM1, nBT062-SMCC-DM1 и антитела nBT062 с клетками OPM-2. Различные концентрации nBT062 и конъюгатов доставляли к клеткам, и с помощью анализа с использованием FACS определяли среднюю флуоресценцию.

На фиг. 7(A)-(D) отображена in vitro цитотоксичность конъюгатов nBT062-DMx по отношению к клеткам MOLP-8 (CD138⁺) и BJAB (CD138^-). Клетки культивировали в планшетах с плоским дном и инкубировали с указанными концентрациями иммуноконъюгатов в течение 5 дней. Реагент WST добавляли на дополнительные 3 часа для оценки жизнеспособности клеток. На фиг. 7(D) цитотоксическая активность nBT062-SPDB-DM4 исследована в присутствии блокирующего антитела (1 мкМ nBT062) или в его отсутствие.

На фиг. 8 представлены объемы опухолей для отдельных мышей, подвергнутых лечению (A) PBS, (B) антителом nBT062, (C) свободным DM4 или (D) ненацеливающим конъюгатом huC242-DM4, в динамике времени (дни) после инокуляции опухолевых клеток MOLP-8.

На фиг. 9 представлены объемы опухолей для отдельных мышей, подвергнутых лечению (A) PBS, (B) nBT062-SPDB-DM4, (C) B-B4-SPP-DM1 или (D) nBT062-SPP-DM1, в динамике времени (дни) после инокуляции опухолевых клеток MOLP-8.

На фиг. 10 отображен средний объем опухолей (± среднеквадратическое отклонение) ксенотрансплантатов клеток множественной миеломы MOLP-8 у мышей с SCID CB.17 в динамике времени (дни) после инокуляции.

На фиг. 11A и B показана противоопухолевая активность nBT062-DMx по отношению к CD138⁺ опухолевым клеткам MOLP-8 в модели большой опухоли MOLP-8 у мышей с SCID. Объем опухоли приведен как среднее значение (± среднеквадратическое отклонение) для каждой группы.

Фиг. 12 является графиком, отражающим противоопухолевую эффективность содержащих nBT062 конъюгатов DMx в модели на SCIDhu/INA-6 по отношению к клеткам множественной миеломы в среде костного мозга человека. В качестве показателя опухолевой массы был использован растворимый рецептор IL-6 человека, продуцируемый клетками множественной миеломы (shuIL-6R). Треугольник: nBT062-SPP-DM1, Квадрат: nBT062-SPDB-DM4; Ромб: контроль в виде носителя.

На фиг. 13 показано опосредованное nBT062-SPDB-DM4 уничтожение свидетеля in vitro. CD138-положительные клетки OPM2 и CD138-отрицательные клетки Namawla культивировали с nBT062-SPDB-DM4 в различных концентрациях, и определяли жизнеспособность клеток. Значения ОП₄₅₀ представляют собой показатель жизнеспособности клеток.

На фиг. 14 представлены кривые роста опухоли в модели на мыши с использованием ксенотрансплантата при однократной инъекции BT062. Дозы, отмеченные звездочкой (*), основаны на молекулярной массе связанного DM4.

На фиг. 15 показана полная ремиссия ксенотрансплантированной карциномы поджелудочной железы у мышей, подвергнутых лечению BT062, в сравнение с контролем.

На фиг. 16 показана полная ремиссия ксенотрансплантированной карциномы молочной железы у мышей, подвергнутых лечению BT062, в сравнение с контролем.

На фиг. 17 иллюстрируется быстрый плазменный клиренс в случае доз, находящихся в пределах 40 мг/м² - 120 мг/м², в то время как более высокие дозы, проиллюстрированные в настоящем документе дозой, составляющей 160 мг/м², демонстрируют плазменный клиренс, более близкий к ожидаемому значению.

На фиг. 18 сравнивается профиль BT062 в плазме с таковым у макак, подвергнутых лечению такими же дозами. Сравнение уточняет, что быстрый плазменный клиренс при низких дозах нельзя предположить на основе имеющихся моделей на животных, и, как представляется, является специфичным для людей.

На фиг. 19 представлены измеренные значения Cmax BT062 по сравнению с теоретическими значениями Cmax.

На фиг. 20 и 21 показано, что значения Cmax являются, как правило, сходными на протяжении нескольких циклов лечения.

Фиг. 22 проясняет, что быстрый плазменный клиренс нельзя объяснить буферным эффектом, вызываемым растворимым CD138.

На фиг. 23 отображена диаграмма лечения человека различными дозами BT062, вводимыми в ходе указанных циклов лечения, причем каждый цикл лечения длился 21 день, и соответствующую дозу вводили в день 1 каждого цикла.

На фиг. 24 представлен уровень M-белка в моче, определенный в случае пациента, получающего 20 мг/м² с трехнедельными интервалами. Показаны дни с -5 по 205.

На фиг. 25 представлен уровень M-белка в сыворотке, определенный в случае пациента, получающего 40 мг/м² с трехнедельными интервалами. Показаны дни с -21 по 119.

На фиг. 26 представлен уровень FLC каппа, определенный в случае пациента, получающего 160 мг/м² с трехнедельными интервалами. Показаны дни с -21 по 101.

На фиг. 27 показана концентрация BT062 в плазме в группе пациентов, получивших дозу 20 мг/м².

На фиг. 28 представлен эффект комбинированной терапии на средний объем опухоли (TV) в модели на мышах с использованием ксенотрансплантата. Результаты доказывают эффекты комбинации BT062 и леналидомида.

На фиг. 29 представлен эффект комбинированной терапии на средний объем опухоли (TV) в модели на мышах с использованием ксенотрансплантата. Результаты доказывают эффекты комбинации BT062 и Велкаде.

На фиг. 30 представлен эффект комбинированной терапии на средний объем опухоли (TV) в модели на мышах с использованием ксенотрансплантата. Результаты доказывают эффекты комбинации BT062 и мелфалана.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ РАЗЛИЧНЫХ И ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к введению индивидам, при необходимости, в частности, человеку (пациентам), иммуноконъюгатов, содержащих нацеливающие на CD138 агенты, описанные в данном описании, и доставке эффекторной молекулы (молекул) иммуноконъюгатов к сайтам-мишеням, и высвобождению эффекторной молекулы (молекул) в сайте-мишени или у такого сайта, в частности, являющихся мишенями клеток, тканей и/или органов. Конкретнее, настоящее изобретение относится к иммуноконъюгатам, содержащим такие нацеливающие на CD138 агенты и сильнодействующие молекулы-эффекторы, которые присоединены к нацеливающим агентам. Эффекторные молекулы могут быть активированы в результате расщепления и/или диссоциации от являющейся нацеливающим агентом части иммуноконъюгата в или у сайта-мишени. Иммуноконъюгаты могут вводиться отдельно или в виде части противораковой комбинации, которая содержит цитотоксическое средство, такое как, но без ограничения, ингибитор протеасом (например, бортезомиб), иммуномодулирующее средство/антиангиогенное средство (например, талидомид или леналидомид), ДНК-алкилирующее средство (например, мелфалан) или кортикостероид (например, дексаметазон), причем противораковая комбинация вызывает синергетические эффекты или другие неожиданные аддитивные эффекты при лечении рака относительно иммуноконъюгата, используемого отдельно при монотерапии, цитотоксического средства, используемого отдельно при монотерапии, или их обоих.

Иммуноконъюгаты по настоящему изобретению могут вводиться индивиду, при необходимости лечения, или применяться к клеткам, выделенным из такого индивида, нуждающегося в лечении. Эффекторная молекула или молекулы может высвобождаться из иммуноконъюгата в результате расщепления/диссоциации в или у являющейся мишенью клетки, ткани и/или органа.

В одном из примеров иммуноконъюгат BT062, мишенями которого являются экспрессирующие CD138 клетки благодаря антителу nBT062 и который содержит DM4 в качестве эффекторной молекулы, вводили пациенту с рецидивирующей/резистентной множественной миеломой четыре раза в количестве 80 мг/м² в виде повторных разовых доз, причем продолжительность каждого цикла лечения составляла 21 дней, при этом единственную дозу/на цикл вводили в день 1 цикла. В этом примере иммуноконъюгат вводили пациенту внутривенно, вследствие чего он мог в большей степени концентрироваться в и/или у опухолевых клеток. С помощью измерения концентрации BT062 в плазме было выявлено, что на начальном этапе измерений (вплоть до 2 часов после завершения введения) значения Cmax для BT062 были значительно ниже теоретически рассчитанного значения, тогда как неблагоприятные побочные эффекты не наблюдались, что наводит на мысль о том, что BT062 концентрируется в опухоли-мишени, а не присоединяется беспорядочно к являющемуся мишенью и не являющемуся мишенью CD138. «Буферный эффект», являющийся следствием sCD138, можно было исключить (см. фиг. 20).

В другом примере иммуноконъюгат BT062 вводили пациенту с рецидивирующей/резистентной множественной миеломой десять раз в количестве, составляющем 20 мг/м², каждый раз в виде повторных разовых доз, причем продолжительность каждого цикла лечения составляла 21 дней, при этом единственную дозу/на цикл вводили в день 1 цикла. В этом примере иммуноконъюгат вводили пациенту внутривенно, вследствие чего он мог в большей степени концентрироваться в и/или у опухолевых клеток. Не создавались дополнительные способы высвобождения эффекторной молекулы из иммуноконъюгата. Десять циклов лечения хорошо переносились, и в случае этих циклов лечения могла быть достигнута по крайней мере стабилизация заболевания.

В другом примере иммуноконъюгат BT062 вводили пациенту с рецидивирующей множественной миеломой четыре раза в количестве, составляющем 160 мг/м², в виде повторных разовых доз, причем продолжительность каждого цикла лечения составляла 21 дней, при этом единственную дозу/на цикл вводили в день 1 цикла. В этом примере иммуноконъюгат вводили пациенту внутривенно, вследствие чего он мог в большей степени концентрироваться в и/или у опухолевых клеток. При этой концентрации плазменный клиренс был все еще ниже теоретического значения Cmax, но не в той степени, которая констатировалась при использовании более низких доз. Однако можно было наблюдать сильное снижение уровня FLC в сыворотке после лишь одного лечения. Частичную ответную реакцию можно было констатировать после 2-ого, 3-ого и 4-ого цикла лечения.

В определенных схемах лечения введение лекарственного средства, которое уменьшает боль и/или осложнения со стороны костей, можно было прекратить, поскольку боль у пациента ослабевала в результате введения иммуноконъюгата. В результате избегали побочных эффектов, связанных с этими лекарственными средствами (включающими бисфосфонаты и другое лекарственное средство от остеопороза), таких как остеонекроз челюсти.

В еще одном примере вместе с составляющей 10 мг суточной пероральной дозой иммуномодулирующего средства леналидомида пациенту с рецидивирующей множественной миеломой четыре раза вводят иммуноконъюгат BT062 в количестве, составляющем 120 мг/м², в виде повторных разовых доз, причем продолжительность каждого цикла лечения составляет 21 дней, при этом единственную дозу/на цикл вводят в день 1 цикла. В этом примере иммуноконъюгат вводят пациенту внутривенно, вследствие чего он может в большей степени концентрироваться в и/или у опухолевых клеток.

В другом примере иммуноконъюгат BT062 вводят пациенту, страдающему опухолью поджелудочной железы, в виде повторных разовых доз, причем продолжительность каждого цикла лечения составляет 21 дней, при этом единственную дозу/на цикл вводят в день 1 цикла. В этом примере иммуноконъюгат вводят пациенту внутривенно, вследствие чего он может в большей степени концентрироваться в и/или у опухолевых клеток.

CD138 или синдекан-1 (также описанный как SYND1; SYNDECAN; SDC; SCD1; антиген CD138, номер доступа в SwissProt: P18827 человека) является мембранным гликопротеином, который присутствует, как сначала было описано, на клетках эпителиального происхождения и, как впоследствии установлено, на гемопоэтических клетках (Sanderson, 1989). CD138 имеет длинный экстраклеточный домен, который связывается с растворимыми молекулами (например, факторами роста EGF, FGF, HGF) и нерастворимыми молекулами (например, с компонентами экстраклеточного матрикса: коллагеном и фибронектином) благодаря гепарансульфатным цепям (Langford, 1998; Yang, 2007) и выполняет функцию рецептора для экстраклеточного матрикса. CD138 также опосредует межклеточную адгезию благодаря гепаринсвязывающим молекулам, экспрессируемым адгезивными клетками. Было установлено, что CD138 играет роль корецептора факторов роста клеток миеломы (Bisping, 2006). В результате исследований дифференциации плазматических клеток было установлено, что CD138 должен также считаться дифференцировочным антигеном (Bataille, 2006).

При злокачественном гемопоэзе CD138 в высокой степени экспрессирован на большей части клеток ММ, клеток карциномы яичника, карциномы почки, карциномы желчного пузыря, карциномы молочной железы, рака предстательной железы, рака легкого, карциномы ободочной кишки и клеток лимфомы Ходжкина и неходжкинской лимфомы, хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL) (Horvathova, 1995), острого лимфобластного лейкоза (ALL), острого миелобластного лейкоза (AML) (Seftalioglu, 2003(a); Seftalioglu, 2003(b)), сарком твердых тканей, карцином ободочной кишки, а также других гематологических злокачественных новообразований и солидных опухолей, которые экспрессируют CD138 (Carbone et al., 1999; Sebestyen et al., 1999; Han et al., 2004; Charnaux et al., 2004; O'Connell et al., 2004; Orosz and Kopper, 2001). Экспрессия CD138 также связана с различными типами злокачественных опухолей желудочно-кишечного тракта (Conejo et al., 2000). Как продемонстрировано в таблице 1, ряд линий озлокачественных клеток является связанным с экспрессией/сверхэкспрессией CD138.

Таблица 1:
Экспрессия CD138 в различных линиях клеток. Применительно к MM было установлено, что чувствительность к BT062 коррелирует с более высокой экспрессией CD138 (RFI= относительный показатель флуоресценции). Линия клеток Происхождение Чувствительность Экспрессия CD138     IC₅₀ (нМ) RFI* рецепторы/клетку NCI-H929 MM 0,38 502 788752 PC-3 рак предстательной железы 0,79 541 195671 U266 MM 1,59 617 782987 MOLP-2 MM 1,78 425 161064 SK-BR-3 карцинома молочной железы 2,72 485 444350 LNCaP рак предстательной железы 7,39 179 23388 CAPAN-2 карцинома поджелудочной железы 15,51 328 n.d. PANC-1 карцинома поджелудочной железы 36,38 34 18085 T47D карцинома молочной железы 89,28 217 42264 Jurkat Т-клеточная лимфома 39,00 n.d. 0

Наблюдаемая чувствительность, например, линий клеток карциномы молочной железы и линий клеток карциномы поджелудочной железы была значительно ниже таковой линий клеток MM. Тем не менее, как описано в разделе экспериментальных данных, на моделях на мышах с использованием ксенотрансплантатов клеток пациентов с раком молочной железы и раком поджелудочной железы были получены не только сопоставимые, но значительно лучшие результаты, чем на сравнимых моделях ММ с использованием ксенотрансплантатов. В обоих случаях можно было, в конечном счете, достичь полной ремиссии, в то время как сравнимые модели MM продемонстрировали заметную задержку роста опухолей, но не полную ремиссию.

В то время как при раке поджелудочной железы, как представляется, нет различия в экспрессии мРНК синдекана-1 между опухолью начальной стадии и запущенной опухолью, при раке молочной железы, как сообщалось, CD138 может утрачиваться со временем, отражением чего служит слабое иммуногистохимическое (IHC) окрашивание или его отсутствие. Об утрате экспрессии CD138 сообщалось, и ее часто увязывали со смещением экспрессии, т.е. de novo экспрессией в окружающей строме (Loussouarn, 2008). В результате со временем можно ожидать меньше мишеней для нацеливающих на CD138 агентов.

Другими видами рака, которые являются, как было установлено, положительными по экспрессии CD138, являются многие аденокарциномы яичника, переходноклеточные карциномы мочевого пузыря, паренхиматозноклеточные карциномы почки, плоскоклеточные раки легкого и раки матки (см., например, Davies et al., 2004; Barbareschi et al., 2003; Mennerich et al., 2004; Anttonen et al., 2001; Wijdenes, 2002).

Лечение активной (симптоматичной) множественной миеломы и родственных плазмапролиферативных нарушений, несомненно, выступает в качестве примера заболеваний, которые можно лечить с помощью иммуноконъюгатов по настоящему изобретению.

Плазмапролиферативные нарушения, как используются в настоящем документе, означают относящиеся к плазматическим клеткам нарушения и/или гематологические нарушения, такие как MGUS, SMM, активная (симптоматичная) MM, макроглобулинемия Вальденстрема, единичная пламацитома, системный AL-амилоидоз и POEMS-синдром.

Множественная миелома (MM) относится к злокачественной пролиферации плазматических клеток, которая обычно возникает в костном мозге, в которую вовлечена в основном костная система пациента и которая проявляет клинические признаки, связанные с конкретными сайтами поражения болезнью и нарушениями в образовании белков плазматических клеток. Заболевание обычно характеризуется многочисленными диффузными очагами или узелковыми скоплениями анормальных или злокачественных плазматических клеток в костном мозге различных костей (особенно черепа), что является причиной пальпируемых опухолей костей, и изредка в сайтах вне костной системы. При радиологическом исследовании костные поражения могут иметь характерный вид «пробитых пробойником» очагов. Вовлеченные в миелому клетки обычно продуцируют анормальные белки и/или анормальные уровни белков в сыворотке и моче. Развитие болезни обычно происходит от моноклональной гаммапатии неопределенной значимости (MGUS) до вялотекущей («тлеющей») множественной миеломы (SMM) до активной множественной миеломы (MM). Симптомы этих заболеваний варьируют, но могут включать гиперкальцемию, почечную недостаточность, усталость, анемию, боль в костях, спонтанные переломы, увеличенную частоту или продолжительность инфекции, или анормальный цвет или запах мочи. Когда настоящее изобретение относится к множественной миеломе, оно относится к MGUS, вялотекущей множественной миеломе (SMM) и активной множественной миеломе (MM), а также к другим злокачественным пролиферациям плазматических клеток, которые могут, в конечном счете, развиться в активную MM.

MGUS, клинически доброкачественное заболевание, предшествующее MM, является более часто встречающимся заболеванием, чем ММ, имея место у 1% популяции старше 50 лет и 3% людей старше 70 лет (Greipp and Lust, 1995). Важно отличить пациентов с MGUS от пациентов с MM, поскольку можно благополучно осуществлять наблюдение пациентов с MGUS без прибегания к терапии. Однако во время длительного врачебного наблюдения у 59 пациентов из 241 пациентов с MGUS (24,5%) наблюдался переход к развитию MM или родственного нарушения (см. Kyle et al., 1993).

Термин «гаммапатия» относится к первичному нарушению синтеза иммуноглобулинов у пациента.

Моноклональная гаммапатия относится к любой группе нарушений, которые обычно связаны с пролиферацией одного клона лимфоидных или плазматических клеток и характеризуются присутствием моноклонального иммуноглобулина в сыворотке или моче пациента (обычно заметного после электрофореза сывороточных белков (SPEP) в виде одного пика).

Сообщалось, что вялотекущая MM (SMM) предшествует возникновению симптоматичной множественной миеломы у пожилых. Вялотекущую множественную миелому часто рассматривают в качестве прогрессирующей стадии MGUS, даже во время прогрессирования при множественной миеломе, развившейся из вялотекущей множественной миеломы, обычно отсутствуют остеолитические очаги или другие главные признаки симптоматичной множественной миеломы.

Клинические симптомы MM включают анемию, гиперкальцемию, почечную недостаточность и литические поражения костей. Различия в течении и тяжести болезни, по мере того как она развивается от моноклональной гаммапатии неопределенной значимости (MGUS) до вялотекущей множественной миеломы (SMM) до активной множественной миеломы (MM), представлены в таблице 2 ниже. В таблице также суммированы способы выявления, диагностирования и контролирования этих заболеваний. Такие симптомы и способы известны квалифицированным в данной области техники специалистам.

Таблица 2.         Сравнение клинических признаков MM, SMM или MGUS Признак ММ SMM MGUS         Плазматические клетки костного мозга >=10% >=10% <10% Сывороточный М-белок >=3 г/дл >=3 г/дл <3 г/дл Белок Бенс-Джонса >=1 г/24 ч <1 г/24 ч <1 г/24 ч Белок в моче присутствует присутствует присутствует Анемия обычно может быть отсутствует

  присутствует     Гиперкальцемия, почечная недостаточность может присутствовать отсутствует отсутствует Литические поражения костей обычно присутствует отсутствует отсутствует         ММ = множественная миелома       SMM= вялотекущая множественная миелома     MGUS= моноклональная гаммапатия неопределенной значимости                   Отнесение к стадии согласно тяжести и клиническим признакам множественной миеломы                 Стадии прогрессирования заболевания               Стадия I (активная ММ)       Относительно малое число раковых клеток распространено по всему телу. Число эритроцитов и количества кальция в крови являются нормальными. В кости опухоли (плазмацитомы) не обнаруживаются. Количество М-белка в крови или моче является очень низким. Симптомов заболевания может не быть.         Стадия II (активная ММ)       Умеренное число раковых клеток распространено по всему телу.          

Стадия III (активная ММ)       Относительно большое число раковых клеток распространено по всему телу. Может отмечаться одно или более из следующего:
Уменьшение числа эритроцитов, что является причиной анемии.
Количество кальция в крови являются очень высоким, поскольку кости являются поврежденными.
Обнаруживается более трех опухолей костей (плазмацитом). В крови или моче обнаруживаются очень высокие уровни М-белка.         Клинические признаки ММ               Гиперкальцемия       Почечная недостаточность       Анемия               Моноклональный белок               SPEP (электрофорез сывороточных белков)     SPIEP (иммуноэлектрофорез сывороточных белков)   Иммуноэлектрофорез белков мочи (белок Бенс-Джонса)         Диагностирование ММ     >10% плазматических клеток в костном мозге или скоплений при биопсии или плазмацитома Моноклональный белок     >3 г/дл М-белка в сыворотке или     М-белок в моче    

Активную множественную миелому (MM) обычно устанавливают клинически по пролиферации злокачественных плазматических клеток в костном мозге пациента. Эти неопластические плазматические клетки продуцируют иммуноглобулины и развиваются из B-лимфоцитов. Иммуноглобулины, продуцируемые плазматическими клетками, можно выявить в сыворотке крови и/или моче пациента с помощью исследования с использованием электрофореза.

Как указано в таблице 2, измерение сывороточного M-белка является важным способом установления различных стадий MM.

«M-белок» относится к моноклональному белку, который обычно наблюдается в виде узкой полосы в геле после электрофореза или аномальной дуги при иммуноэлектрофорезе. Она отражает рост однородного иммуноглобулина, продуцируемого клетками клона, возникающими из одной общей клетки, например, моноклонального иммуноглобулина, который характеризуется тяжелой цепью одного класса и подкласса и легкой цепью одного типа (также называемого M-пик и более широко парапротеином).

С помощью «электрофореза сывороточных белков» (SPE или SPEP) и «электрофореза с иммунофиксацией» (IFE) можно выявить моноклональный иммуноглобулин, который продуцируется при нескольких плазмапролиферативных нарушениях, включающих множественную миелому (MM). Вплоть до 61% этих выявлений по всей популяции не связаны с клиническими симптомами, позволяя диагностировать моногаммапатию неопределенной значимости (MGUS). Однако с помощью SPE и IFE не выявляются все моноклональные иммуноглобулины, в частности, когда секретируются лишь легкие цепи.

Эти «свободные молекулы легких цепей» (FLC) содержат легкие цепи λ и κ. Плазматические клетки продуцируют один из пяти типов тяжелых цепей вместе с молекулами либо κ, либо λ. В нормальных условиях наблюдается избыточная на приблизительно 40% продукция свободных легких цепей относительно синтеза тяжелых цепей. Плазматические клетки секретируют свободные легкие цепи (FLC, каппа или лямбда) помимо интактных молекул иммуноглобулинов, и уровни легких цепей в сыворотке определяются относительными скоростями синтеза (κ>λ) и выведения почками (κ>λ). В присутствии моноклонального иммуноглобулина отношения κ:λ могут быть либо выше, либо ниже нормального диапазона, в зависимости от класса вовлеченной FLC. Полупериод существования в сыворотке FLC составляет 2-6 часов, по сравнению с 5 днями для IgA, 6 днями для IgM и 21 днем для IgG. Таким образом, измерение уровней FLC в сыворотке позволяет гораздо быстрее оценить ответную реакцию опухоли на терапию, чем измерение интактного иммуноглобулина. Так же измерения FLC в сыворотке делают возможной более раннее выявление рецидива.

Не являющиеся плазмапролиферативными заболевания также связаны с экспрессией CD138.

Карцинома поджелудочной железы

Большинство случаев охватывает экзокринный тип. Большая часть этих экзокринных типов рака представляют аденокарциномы протоков (дополнительные более редкие подтипы включают кистозные опухоли, опухоли из ацинарных клеток и саркому). Эндокринный рак поджелудочной железы представляет собой гормонпродуцирующую опухоль.

Карцинома in situ относится к ранней стадии рака, когда ее распространение ограничивается слоем клеток, в котором она возникла. В случае рака молочной железы in situ означает, что распространение раковых клеток остается ограниченным протоками (карцинома протоков in situ) или дольками (карцинома долек in situ). Нет их прорастаний в более глубокие ткани молочной железы или распространений на другие органы организма, и иногда их называют неинвазивными или прединвазивными раками молочной железы.

Инвазивная (инфильтрующая) карцинома

Экзокринные клетки и эндокринные клетки поджелудочной железы образуют полностью отличные типы опухолей.

Экзокринные опухоли

Вне всяких сомнений эти опухоли являются самым распространенным видом рака поджелудочной железы, и в большинстве случаев экзокринные опухоли поджелудочной железы являются злокачественными. Приблизительно 95% экзокринных раков поджелудочной железы являются аденокарциномами (аденокарцинома представляет собой рак, который возникает из гландулоцитов). Этот вид рака обычно возникает в протоках поджелудочной железы, но иногда он развивается из клеток, продуцирующих ферменты поджелудочной железы (ацинарноклеточные карциномы).

Менее часто встречающие типы экзокринных раков протоков поджелудочной железы включают аденоплоскоклеточные раки, плоскоклеточные раки и гигантоклеточные карциномы.

Эндокринные опухоли

Эндокринные опухоли поджелудочной железы являются редко встречающимися. Как группа, они известны как нейроэндокринные опухоли поджелудочной железы (NET) или изредка как опухоли из островковых клеток. Существует несколько подтипов опухолей из островковых клеток. Каждая названа в соответствии с типом гормонпродуцирующей клетки, из которой она возникла.

Основной системой, используемой для характеристики стадий экзокринных раков поджелудочной железы, является система TNM Американского объединенного онкологического комитета (AJCC), созданная Американским обществом борьбы с раковыми заболеваниями (ACS). Система TNM для определения стадии содержит 3 ключевые дозы информации.

T характеризует размер первичной опухоли(ей), определяемый в сантиметрах (см), и то, распространился ли рак внутри поджелудочной железы или на или расположенные поблизости органы. Различают TX, T0, T1, T2, T3 и T4, причем больший номер означает прогрессирование заболевания.

N характеризует распространение на расположенные поблизости (регионарные) лимфатические узлы. Степени N включают NX, NO и N1.

M указывает на то, произошло ли метастазирование (распространение) рака в другие органы организма. (Самыми распространенными местами распространения рака поджелудочной железы являются печень, легкие и брюшина - зона вокруг органов пищеварительной системы.) Степени M включают MX, MO и M1.

После определения степеней T, N и M эту информацию объединяют для определения стадии, процесс, называемый классифицированием стадии.

Стадия 0 (Tis, NO, MO): Распространение опухоли ограничивается верхними слоями клеток протоков поджелудочной железы, и опухоль не инвазировала более глубокие ткани. Нет ее распространения вне поджелудочной железы. Эти опухоли иногда называют карциномой поджелудочной железы in situ или интраэпителиальной неоплазией III поджелудочной железы (Panln III).

Стадия IA (T1, N0, M0): Распространение опухоли ограничивается поджелудочной железой, и ее размер составляет менее 2 см. Нет ее метастазирования в расположенные поблизости лимфатические узлы или в удаленные места.

Стадия IB (T2, N0, M0): Распространение опухоли ограничивается поджелудочной железой, и ее размер составляет больше 2 см. Нет ее метастазирования в расположенные поблизости лимфатические узлы или в удаленные места.

Стадия IIA (T3, N0, M0): Рост опухоли происходит вне поджелудочной железы, но не в больших кровеносных сосудах. Она не дала метастазы в расположенные поблизости лимфатические узлы или в удаленные места.

Стадия IIB (T1-3, N1, M0): Либо распространение опухоли ограничивается поджелудочной железы, либо ее рост происходит вне поджелудочной железы, но она не врастает в расположенные поблизости большие кровеносные сосуды или основные нервы. Она дала метастазы в расположенные поблизости лимфатические узлы, но не в удаленные места.

Стадия III (T4, любая степень N, M0): Рост опухоли происходит вне поджелудочной железы в расположенных поблизости больших кровеносных сосудах или основных нервах. Возможно ее метастазирование в расположенные поблизости лимфатические узлы. Нет ее метастазирования в удаленные места.

Стадия IV (любая степень T, любая степень N, M1): Метастазирования рака в удаленные места.

Другие факторы, хоть и не являющиеся формально частью системы TNM, также важны при определении прогноза (перспективы). Степень рака (насколько анормальными кажутся клетки под микроскопом) иногда регистрируют по шкале от G1 до G4, при этом раки G1 кажутся весьма правдоподобно нормальными клетками и имеют наилучший прогноз.

В случае пациентов, подвергшихся хирургическому вмешательству, другим важным фактором является степень резекции - была ли удалена вся опухоль. Иногда это регистрируют по шкале от RO (в случае удаления всей видимой и микроскопической опухоли) до R2 (когда некоторую часть видимой опухоли нельзя было удалить).

С практической точки зрения часто невозможно точно определить, насколько далеко распространился рак, без хирургического вмешательства. По этой причине врачи часто используют простую системы определения стадии, которая разбивает раки на группы на основе то, существует ли вероятность их удаления хирургическим способом. Эти группы названы операбельными, местнораспространенными (неоперабельными) и метастатическими раками. Эти термины могут использоваться для характеристики как экзокринных, так и эндокринных раков поджелудочной железы.

Операбельный: Если рак присутствует лишь в поджелудочной железе (или отмечается его распространение чуть ниже ее) и хирург может удалить всю опухоль, ее называют операбельной.

Местнораспространенный (неоперабельный): Если нет метастазирования рака в удаленные органы, но рак все-таки невозможно полностью удалить с помощью хирургического вмешательства, его называют местнораспространенным. Часто причиной невозможности удаления рака является то, что слишком много его присутствует в близко расположенных кровеносных сосудах.

Метастатический: в случае метастазирования рака в удаленные органы его называют метастатическим. Хирургическое вмешательство может быть все-таки осуществлено, но целью будет ослабление симптомов, а не излечение рака.

Стадии нейроэндокринных раков поджелудочной железы, наподобие таковых в случае экзокринных раков поджелудочной железы, не устанавливаются. Взамен, статистические данные разбиваются на различные стадии: локализованные (только в поджелудочной железе), регионарные (распространение на расположенные поблизости лимфатические узлы или ткани) и удаленные (метастазирование в удаленные места, такие как печень).

Опухоли мочевого пузыря распределяют по группам согласно тому, как раковые клетки выглядят под микроскопом. Вне всяких сомнений переходноклеточная карцинома (также называемая уротелиальной карциномой) является самым распространенным типом рака мочевого пузыря. Внутри этой группы существуют также подтипы. Они названы в зависимости от формы клеток, и того, имеют ли они тенденцию к метастазированию и инвазии других органов. (Если они способны врастать глубже в стенку мочевого пузыря, их называют инвазивными, если не способны, их называют неинвазивными.) Эти опухоли подразделяют на степени злокачественности на основе того, как клетки выглядят под микроскопом. Если клетки кажутся еще как бы нормальными клетками, рак называют раком низкой степени злокачественности. Когда клетки кажутся очень анормальными, рак имеет высокую степень злокачественности. Типы рака низкой степени злокачественности имеют тенденцию к более медленному росту и имеют лучший исход, чем типы рака высокой степени злокачественности.

В это определение также включены плоскоклеточный рак (редко встречающийся; обычно инвазивный); аденокарцинома (редко встречающаяся; почти все являются инвазивными); мелкоклеточный рак (редкий). В это определение также включены другие редкие типы рака мочевого пузыря.

Также устанавливают стадии рака мочевого пузыря:

Стадия 0a (Ta, N0, M0):

Рак представляет собой неинвазивную папиллярную карциному. Он растет по направлению к полому центру мочевого пузыря, но не врастает в мышечную или соединительную ткань стенки мочевого пузыря. Нет метастазирования в лимфатические узлы или удаленные места.

Стадия 0is (Tis, N0, M0):

Рак представляет собой плоскостную форму неинвазивной карциномы, также известную как плоскостная карцинома in situ (CIS). Рак врастает лишь в выстилающий слой мочевого пузыря. Нет как его роста по направлению внутрь полой части мочевого пузыря, так и инвазии мышечной или соединительной ткани стенки мочевого пузыря. Нет метастазирования в лимфатические узлы или удаленные места.

Стадия I (T1, N0, M0):

Рак врос в слой соединительной ткани под выстилающим слоем мочевого пузыря без врастания в толстый слой мышечной ткани в стенке мочевого пузыря. Нет метастазирования рака в лимфатические узлы или удаленные места.

Стадия II (T2, N0, M0):

Отмечается врастание рака в толстый мышечный слой стенки мочевого пузыря, но он не проходит полностью через мышцу с достижением слоя жировой ткани, которая окружает мочевой пузырь. Нет метастазирования в лимфатические узлы или удаленные места.

Стадия III (T3 или T4a, N0, M0):

Отмечается полное прорастание рака через стенку мочевого пузыря в слой жировой ткани, которая окружает мочевой пузырь (T3). Возможно метастазирование в предстательную железу, матку или влагалище (T4a). Нет врастания в стенку тазовой или брюшной полости. Нет метастазирования рака в лимфатические узлы или удаленные места.

Стадия IV (T4b, N0, M0) или (любая степень T, N1-3, M0) или (любая степень T, любая степень N, M1):

Отмечается распространение рака через стенку мочевого пузыря на стенку тазовой или брюшной полости (T4b) и/или метастазирование в лимфатические узлы (N1-3) и/или удаленные места, такие как кости, печень или легкие (M1).

Типы карциномы желчного пузыря

Более чем 9 из 10 типов рака желчного пузыря представляют собой аденокарциномы. Аденокарцинома является раком, который начинается в клетках со свойствами, подобными таковым железистых клеток, которые выстилают множество внутренних и внешних поверхностей тела (в том числе внутреннее пространство пищеварительной системы). Тип аденокарциномы желчного пузыря, заслуживающий особого упоминания, называется папиллярной аденокарциномой или просто папиллярным раком. Они являются раками желчного пузыря, клетки которых расположены в пальцевидных проекциях при обзоре под микроскопом. Обычно папиллярные рака не способны врастать в печень или расположенные поблизости лимфатические узлы. Имеется тенденция к тому, что они имеют лучший прогноз (перспективу), чем большинство других типов аденокарцином желчного пузыря. Приблизительно 6% раков желчного пузыря являются папиллярными аденокарциномами. Существуют другие типы рака, которые могут развиться в желчном пузыре, такие как аденоплоскоклеточный рак, плоскоклеточный рак и мелкоклеточный рак, но они являются редко встречающимися.

На основе системы TNM AJCC различают следующие стадии карцином желчного пузыря.

Стадия 0: Tis, N0, M0: Небольшая злокачественная опухоль существует лишь в эпителиальном слое желчного пузыря. Она не распространена вне желчного пузыря.

Стадия IA: T1(a или b), N0, M0: Опухоль врастает в собственную пластинку (T1a) или мышечный слой (T1b). Она не распространена вне желчного пузыря.

Стадия IB: T2, N0, M0: Опухоль врастает в окружающую мышцы фиброзную ткань. Она не распространена вне желчного пузыря.

Стадия IIA: T3, N0, M0: Опухоль распространяется через серозный слой и/или прямо врастает в печень и/или другую расположенную поблизости структуру. Она не распространена на лимфатические узлы или ткани или органы далеко от желчного пузыря.

Стадия IIB: T1-T3, N1, M0: Помимо любого роста в желчном пузыре, опухоль распространена на расположенные поблизости лимфатические узлы (N1). Она не распространена на ткани или органы далеко от желчного пузыря.

Стадия III: T4, любая степень N, M0: Опухоль инвазирует основные кровеносные сосуды, являющиеся основными в печени, или достигла более одного расположенного поблизости органа, отличного от печени. Возможно ее метастазирование в лимфатические узлы. Она не распространена на ткани или органы далеко от желчного пузыря.

Стадия IV: любая степень T, любая степень N, M1: Опухоль распространена на ткани или органы далеко от желчного пузыря.

Карцинома молочной железы

Аденокарцинома относится обычно к типу карциному, которая возникает в железистой ткани (ткани, которая продуцирует и секретирует вещество). Применительно к раку молочной железы протоки и дольки молочной железы являются железистой тканью, поэтому раки, возникающие в этих зонах, часто называют аденокарциномами. Существует несколько типов рака молочной железы, хотя некоторые из них являются довольно редкими. В некоторых случаях единичная опухоль молочной железы может содержать комбинацию этих типов или содержать смесь инвазивного и in situ рака.

Карцинома протоков in situ (DCIS; также известная как внутрипроточная карцинома) является самым распространенным типом неинвазивного рака молочной железы.

Инвазивная (или инфильтрующая) карцинома протоков (IDC) является самым распространенным типом рака молочной железы. Инвазивная (или инфильтрующая) карцинома протоков (IDC) возникает в молочном протоке молочной железы, пробивается через стенку протока и врастает в жировую ткань молочной железы. В этот момент времени она может быть способна к распространению (метастазированию) на другие части тела через лимфатическую систему и кровоток. Приблизительно 8 из 10 инвазивных раков молочной железы являются инфильтрующими карциномами протоков. У пациентов с IDC выявлена экспрессия CD138 (Loussouarn et al., 2008).

Термин «трижды отрицательный рак молочной железы» характеризует раки молочной железы (обычно инвазивные карциномы протоков), клетки которых не имеют рецепторов эстрогена и рецепторов прогестерона и не имеют избыточного количества белка HER2 на своих поверхностях. Трижды отрицательные раки молочной железы имеют тенденцию к более быстрому росту и распространению, чем большинство других типов рака молочной железы. Поскольку опухолевые клетки не имеют этих определенных рецепторов, ни гормонотерапия, ни лекарственные средства, мишенью которых является HER2, не являются эффективными против этих типов рака (хотя химиотерапия может все-таки применяться при необходимости).

Некоторые другие типы рака молочной железы, которые подпадают под термин «карцинома молочной железы» представляют собой воспалительный рак молочной железы, медуллярный рак молочной железы, метастатическую карциному, слизеобразующий рак, тубулярную карциному, папиллярную карциному, аденокистозную карциному, листовидную цистосаркому.

Хирургическое вмешательство, облучение или химиотерапия представляют собой стандартные противораковые лечения. Иногда применяется гормонотерапия. Гормонотерапия является формой системной терапии. Чаще всего она используется в качестве дополнительной терапии для помощи в уменьшении риска рецидива рака после хирургического вмешательства, хотя она может также использоваться в качестве неоадъювантного лечения. Ее также используют для лечения рака, который возвращается после лечения или дает метастазы. Эстроген активирует рост приблизительно 2 из 3 типа рака молочной железы - тех, которые содержат рецепторы эстрогена (ER-положительных раков) и/или рецепторы прогестерона (PR-положительных раков). Поэтому несколько способов блокирования эффекта эстрогена или снижения уровней эстрогена используются для лечения ER-положительных и PR-положительных раков молочной железы. Однако гормонотерапия является неэффективной для пациентов, у которых нет ER или PR.

Карцинома молочной железы также подчиняется такой системе определения стадий.

Стадия 0: Атипичные клетки не распространены вне протоков или долек продуцирующих молоко органов, на окружающую ткань молочной железы. Названная карциномой in situ, она делиться на два типа: «карциному протоков in situ» (DCIS), которая является очень ранним раком, весьма поддающимся лечению и способным к сохранению, и «карциному долек in situ» (LCIS), которая не является раком, а показателем, который позволяет идентифицировать женщину, подверженную увеличенному риску развития рака молочной железы.

Стадия I: Размер злокачественной опухоли составляет не более двух сантиметров (приблизительно дюйм), и она не распространена на окружающие лимфатические узлы или вне молочной железы.

Стадия II: Эта стадия разделяется на две группы согласно размеру опухоли и тому, распространена ли она на лимфатические узлы.

Рак молочной железы стадии II A - размер опухоли составляет менее двух сантиметров, и она дала метастазы в вплоть до трех сопутствующих подмышечных лимфатических узлов. Или опухоль выросла до размера, превышающего два сантиметра, но меньше пяти сантиметров, и не распространена на окружающие лимфатические узлы.

Рак молочной железы стадии II B - опухоль выросла до размера между двумя и пятью сантиметрами, и дала метастазы в вплоть до трех сопутствующих подмышечных лимфатических узлов. Или размер опухоли превышает пять сантиметров, но она не распространена на окружающие лимфатические узлы.

Стадия III: Эта стадия также разделяется на две группы.

Рак молочной железы стадии III A - размер опухоли превышает два сантиметра, но меньше пяти сантиметров, и она дала метастазы в вплоть до девяти сопутствующих подмышечных лимфатических узлов.

Рак молочной железы стадии III B - рак дал метастазы в ткани вблизи молочной железы, включающие кожу, стенку грудной клетки, ребра, мышцы или лимфатические узлы в стенке грудной клетки или выше ключицы.

Стадия IV: На этой стадии рак дал метастазы в другие органы или ткани, такие как печень, легкие, головной мозг, скелетная система или лимфатические узлы вблизи ключицы.

Рак легкого

Существует 4 типа нейроэндокринных опухолей легкого, а именно, крупноклеточная нейроэндокринная карцинома, атипичная карциноидная опухоль, типичная карциноидная опухоль и мелкоклеточный рак легкого. Карциноидные опухоли являются опухолями, которые возникают из клеток диффузной нейроэндокринной системы. Типичные и атипичные карциноидные опухоли кажутся разными под микроскопом. Типичные карциноиды растут медленно и лишь редко распространяются за пределами легких, и приблизительно 9 из 10 карциноидов легкого являются типичными карциноидами.

С целью лечения различают два основных типа рака легкого, которые очень по-разному лечатся, а именно, мелкоклеточный рак легкого (SCLC) и немелкоклеточный рак легкого (NSCLC). Если рак имеет признаки обоих типов, его называют смешанным мелкоклеточным/крупноклеточным раком.

Приблизительно 10%-15% всех типов рака легкого являются мелкоклеточным типом. Другими названиями SCLC являются овсяно-клеточный рак и мелкоклеточная недифференцированная карцинома.

Этот рак часто начинается в бронхах около центра грудной клетки. Хотя раковые клетки являются мелкими, они могут быстро делиться, образовывать большие опухоли и распространяться на лимфатические узлы и другие органы во всем организме. Хирургическое вмешательство редко является вариантом лечения и никогда не является единственным назначенным лечением. Лечение включает цитотоксические средства, такие как лекарственные средства, которые прекращают широко распространенную болезнь.

Существуют 3 подтипа NSCLC, а именно плоскоклеточный рак; аденокарцинома; крупноклеточная (недифференцированная) карцинома.

Определение стадий немелкоклеточного рака легкого

Используемой для определения стадии немелкоклеточного рака легкого системой является система AJCC (Американского объединенного онкологического комитета). Стадии изображают с использованием римских цифр от 0 до IV (0-4). Некоторые стадии, кроме того, подразделены на A и B. Как правило, чем меньше номер, тем меньше распространен рак. Больший номер, такой как стадия IV (4), означает более запущенный рак.

Соответствующая система определения стадии, включающая стадии I-IV, была также разработана для плоскоклеточного рака (рака головы и шеи). Раки стадии I являются небольшими, локализованными и обычно излечимыми, раки стадий II и III обычно являются местнораспространенными и/или распространенными на локальные лимфатические узлы, и раки стадии IV обычно являются метастатическими (распространены на удаленные части тела) и, как правило, считаются неоперабельными.

Применительно к настоящему изобретению лечение предусматривает профилактику или замедление прогрессирования, стабилизацию состояния заболевания, уменьшение проявление болезни или ослабление одного или более симптомов нарушения, связанного с клетками, экспрессирующими CD-138. Таким образом, лечение включает профилактику или замедление увеличения тяжести или ремиссию нарушения. В случае MM обычно лишь пациенты с активной ММ стадии II или III получают основное лечение (за пациентами с заболеванием стадии I или пациентами с SMM сначала лишь наблюдают с интервалами в 3-6 месяца), лечение в соответствии с настоящим изобретением не только включает лечение, например, активной стадии MM, но также включает лечение форм болезненных состояний, которые предшествуют обычно подвергаемого лечению болезненного состояния. В частности, лечение также включает предупреждение прогрессирования от одного болезненного состояния к следующему: в случае MM этим прогрессированием будет, например, прогрессирование от MGUS до SMM и от SMM до стадии I активной ММ или другой стадии MM. В случае раков поджелудочной железы экзокринного типа этим прогрессированием будет, например, прогрессирование от стадии I до стадии II, включающее любое ухудшение, отображаемое группами, установленными AJCC внутри стадий, например от IA до IB. Однако термин также включает сохранение существующего состояния, например, чтобы сохранить стабильное заболевание, и, как обсуждается ниже, вызов определенных ответных реакций у подвергаемого лечению пациента. Лечение пациента также является успешным, если у пациента выявляется наблюдаемое и/или измеряемое уменьшение или отсутствие, среди прочего, одного или более из следующего: уменьшение числа раковых клеток или отсутствие раковых клеток; уменьшение размера опухоли; задержка (т.е. замедление до некоторой степени и, предпочтительно, прекращение) инфильтрации раковых клеток в периферические органы, в том числе распространения рака на мягкую ткань и кость; задержка (т.е. замедление до некоторой степени и, предпочтительно, прекращение) метастазирования опухоли; подавление, в определенной степени, роста опухоли и/или ослабление в определенной степени одного или нескольких симптомов, связанных с конкретным раком; снижение заболеваемости и смертности и улучшение результатов, связанных с качеством жизни. В общем эффект определенного лечения на болезненное состояние можно контролировать, в случае MM, посредством измерения уровней M-белка в сыворотке и/или моче пациента и/или уровней FLC в сыворотке и/или моче пациента. В случае других нарушений, связанных с клетками, экспрессирующими CD-138, определяют другие параметры для оценки эффекта лечения в соответствии с настоящим изобретением. CRP является параметром неспецифического воспаления для клинического контролирования рака. К примеру, в случае рака поджелудочной железы релевантными параметрами, которые можно определить, являются СА 19-9 (углеводный антиген 19.9, онкомаркер, часто находящийся на более высоком уровне при раке поджелудочной железы), билирубин или C-реактивный белок. Кроме того, используются получения изображений с помощью, например, сонографии, компьютерной томографии (СТ), магнитно-резонансной томографии (MRT). В случае рака головы и шеи используются биомаркеры, которые зависят от типа опухоли (например, SCC для плоскоклеточного рака, NSE для клеток Меркеля, CEA); в случае карциномы молочной железы в качестве маркеров могут использоваться экспрессия CA 15-3Her₂ и экспрессия кадгеринов, тогда как лечение контролируют с помощью сывороточных маркеров, таких как нейронспецифическая эндолаза (NSE).

Тесты на специфичный для опухоли мочевого пузыря антиген (BTA) и NMP22 могут использоваться вместе с цистоскопией (используя тонкую трубку с источником освещения для осмотра мочевого пузыря) при диагностировании заболевания у симптоматичных индивидов. Эти тесты также используются для слежения за некоторыми пациентами после лечения, хотя цистоскопия и цитологическое исследование мочи (используя микроскоп для поиска раковых клеток в моче) все-таки рекомендуют в качестве стандартных исследований для диагностирования и последующего врачебного наблюдения. Тесты на BTA и NMP22 часто используют между цистоскопиями. Нормальные значения могут позволить проводить цистоскопию менее часто. Однако эти тесты не могут заменить цитологическое исследование мочи и цистоскопию.

В случае запущенного рака мочевого пузыря некоторые из используемых для других раков маркеров, таких как CEA, CA 125, CA 19-9 и TPA, могут находиться на более высоком уровне и могут использоваться для слежения за пациентами во время и после лечения. В случае рака легкого нет общепризнанных маркеров, CEA или NSE могут находиться на более высоком уровне.

Известно, что с опухолевых клеток, таких как клетки миеломы или клетки карциномы молочной железы, слущивается CD138. Потеря поверхностного CD138 связана с плохим прогнозом при миеломе. Высокие уровни растворимого CD138 также были выявлены при других онкологических признаках, таких как рак головы и шеи или легкого (Anttonen et al. 1999). Потеря поверхностного синдекана-1 коррелирует с EMT (эпителиально-мезенхимальным переходом), этот процесс характеризует трансформацию злокачественной клетки в менее или слабо дифференцированную клетку, ассоциируемую с инвазионной способностью и стадией метастазирования. Например, о нем сообщалось для метастатического рака молочной железы (Loussouarn et al., 2008).

Эффективное количество агента, в частности, иммуноконъюгата или фармацевтической композиции, содержащей иммуноконъюгат, в соответствии с настоящим изобретением относится к количеству, необходимому для «лечения» заболевания или нарушения у индивида, в частности, человека (пациента). В случае рака, такого как MM, эффективное количество агента может уменьшать число раковых клеток; уменьшать размер опухоли; задерживать (т.е. замедлять до некоторой степени и, предпочтительно, прекращать) инфильтрацию раковых клеток в периферические органы; задерживать (т.е. замедлять до некоторой степени и, предпочтительно, прекращать) метастазирование опухоли; подавлять, в определенной степени, рост опухоли и/или ослаблять в определенной степени один или несколько симптомов, связанных с раком. См. приведенное в настоящем документе определение «лечение».

«Количество, фармакокинетически эквивалентное», например, 200 мг/м², относится к количеству иммуноконъюгата, которое приводит к фармакокинетике, одинаковой с таковой, наблюдаемой при использовании доз 200 мг/м², при введении иммуноконъюгата в сочетании, в том числе совместном введении со средством для лечения фактически существующих, в том числе возможных, неблагоприятных побочных эффектов в основном на не являющиеся мишенями клетки, которые также экспрессируют CD138. Эти эквивалентные количества могут быть до некоторой степени меньше чем 200 или до некоторой степени больше чем 200, в зависимости от другого агента. Включены, например, эффективные количества, составляющие менее чем 160, менее чем 170, менее чем 180, менее чем 190 и менее чем 210, менее чем 220, менее чем 230 и менее чем 240 мг/м². Например, квалифицированный в данной области техники специалист мог бы ожидать, что совместное введение с кортикостероидами или с антибиотиками сделает возможными чуть более высокие дозы иммуноконъюгата даже в случае побочных эффектов на кожу, которые могут быть, однако, легко установлены квалифицированным в данной области техники специалистом.

Для оценки успеха введения лекарственного средства, в настоящем документе иммуноконъюгата (его способности к вызову функциональной ответной реакции, т.е. его эффективности), различают различные «ответные реакции» на введение.

Что касается MM и других плазмапролиферативных заболеваний различают следующие ответные реакции.

Термин «полная ответная реакция» (CR) относится к отсутствию иммунофиксации сыворотки и мочи и исчезновению любых плазмоклеточных опухолей мягких тканей, и <5% плазматических клеток в костном мозге.

Термин «полная ответная реакция с наложенными ограничениями» (sCR) относится к определенной выше CR плюс нормальное отношение FLC и отсутствие клональных клеток в костном мозге при иммуногистохимическом или иммунофлуоресцентном исследовании.

Термин «очень хорошая частичная ответная реакция» (VGPR) относится к M-компоненту сыворотки и мочи, выявляемому при иммунофиксации, но не в результате электрофореза, или уменьшению на ≥90% или больше уровня сывороточного M-компонента плюс содержание M-компонента в моче, составляющее <100 мг/24 ч.

Термин «частичная ответная реакция» (PR) относится к уменьшению на ≥50% уровня М-белка в сыворотке и уменьшению количества М-белка в моче, собранной за 24 ч, на ≥90% или до <200 мг/24 ч; если М-белок в сыворотке и моче не определяется, вместо относящихся к М-белку критериев требуется уменьшение на ≥50% различия между уровнями вовлеченных и не вовлеченных FLC; если М-белок в сыворотке и моче не определяется, а также не определяются свободные легкие цепи в сыворотке, вместо М-белка требуется уменьшение на ≥50% содержания плазматических клеток в костном мозге, при условии, что исходное процентное содержание составляло ≥30%; помимо указанных выше критериев, в случае их нахождения на исходном уровне, также требуется уменьшение на ≥50% размера плазмоклеточных опухолей мягких тканей (Durie et al., 2006).

Термин «незначительная ответная реакция» (MR) по отношению к пациентам с рецидивирующей/резистентной миеломой относится в контексте настоящего изобретения к уменьшению на ≥ 25%, но <49% уровня М-белка в сыворотке и уменьшению количества М-белка в моче, собранной за 24 ч, на 50-89%, которое все-таки превышает 200 мг/24 ч; помимо указанных выше критериев, в случае их нахождения на исходном уровне, также требуется уменьшение на 25-49% размера плазмоклеточных опухолей мягких тканей, отсутствию увеличения размера или числа литических поражений костей (возникновение компрессионного перелома не исключает ответную реакцию).

Однако ответная реакция, хотя формально не отнесенная к определенному классу, также включает уменьшение по крайней мере на 30%, предпочтительно, по крайней мере 40% или 50% уровней FLC в сыворотке. Это имеет особое значение в случаях, когда М-белок невозможно измерить.

Что касается плазмапролиферативных заболеваний по настоящему изобретению термин «стабилизация заболевание» (SD) относится к не удовлетворению критериям для CR, VGPR, PR или прогрессирования заболевания, в то время как термин «прогрессирование заболевание» (PD) относится к составляющему 25% от наименьшей величины реакции увеличению любого одного или более из следующего:

- M-компонента сыворотки (абсолютное увеличение должно быть ≥ 0,5 г/100 мл); и/или

- M-компонента мочи (абсолютное увеличение должно быть ≥ 200 мг/24 ч); и/или

- только в случае пациентов без определяемых уровней М-белка в сыворотке и моче: различию между уровнями вовлеченных и не вовлеченных FLC (абсолютное увеличение должно быть > 100 мг/л);

- процентного содержания плазматических клеток в костном мозге (абсолютный % должен быть ≥10%);

- определенному образованию новых повреждений костей или плазмоклеточных опухолей мягких тканей или определенному увеличению размера существующих повреждений костей или плазмоклеточных опухолей мягких тканей;

- развитию гиперкальцемии (скорректированное содержание кальция в сыворотке >11,5 мг/100 мл), которое может объясняться только плазмапролиферативным нарушением.

Термин «рецидивирующая миелома» относится в данном случае к форме активной MM у индивида, при этом указанный индивид подвергся по крайней мере одной предшествующей схеме лечения, которая не удовлетворяет критериям для рецидивирующей/резистентной миеломы.

Термин «резистентная миелома» обычно относится к состоянию заболевания, когда число плазматических клеток продолжает увеличиваться даже, несмотря на проведение лечения, т.е. заболевание было признано, в момент оценки, невосприимчивым к назначенной схеме лечения.

Термин «рецидивирующая/резистентная миелома» относится к рецидиву заболевания при нахождении на терапии спасения или прогрессированию в пределах 60 дней от самой последней терапии.

Термин «фенотип резистентности» включает любой тип резистентной миеломы, т.е. резистентную и рецидивирующую/резистентную миелому.

Термин «рецидивирующая или резистентная миелома» охватывает рецидивирующую, резистентную и рецидивирующую/резистентную миелому.

В клиническом испытании, обсуждаемом подробнее ниже, до участия в исследовании индивидов подвергали лечению по крайней мере одним иммуномодулятором и ингибитором протеосом, которое было неуспешным. Заболевание считалось резистентным к лечению, если индивид проявлял прогрессирование заболевания (PD) при его нахождении на предшествующей схеме.

Термин «прогрессирование до», например, «активной MM» по отношению к пациентам с SMM относится в контексте настоящего изобретения к фактам прогрессирования на основе критериев IMWG (Международной рабочей группы по миеломным болезням) для прогрессирования заболевания при MM, и считается, что с лежащим в основе нарушением клональной пролиферации плазматической клетки связано любое одно или более из следующего: образование новых плазмоклеточных опухолей мягких тканей или развитие новых повреждений костей, гиперкальцемия (>11 мг/100 мл), снижение уровня гемоглобина до ≥2 г/100 мл и уровень креатина в сыворотке ≥2 мг/100 мл (Kyle & Rajkumar, 2009).

В патогенез множественной миеломы вовлечено связывание миеломных клеток, благодаря молекулам адгезии на клеточной поверхности, со стромальными клетками костного мозга (BMSC), а также экстраклеточным матриксом (ECM). Это связывание инициирует и, следовательно, на него может быть, в конечном счете, возложена ответственность за, рост клеток множественной миеломы, резистентность к лекарственным средствам и миграцию клеток MM в среду костного мозга (Munshi et al., 2008). В частности, адгезия клеток множественной миеломы к ECM, через синдекан-1 (CD138) к коллагену типа I, индуцирует экспрессию матриксной металлопротеиназы 1, вызывая тем самым резорбцию кости и инвазию опухоли (Hideshima et al., 2007). Взаимодействия между клетками множественной миеломы и микросредой костного мозга приводят к активации плеотропно-пролиферативного и антиапоптозного каскада.

Для пациентов с множественной миеломой, а также для пациентов, страдающих другими заболеваниями, которые сопровождаются болями в костях, существует ряд поддерживающих лечений для лечения этого и других симптомов. Подходящие лекарственные средства включают бисфосфонаты (например, памидронат, золедроновую кислоту), которые могут замедлить повреждение костей. Было установлено, что эти агенты способны к уменьшению остеолитических очагов в костях и предотвращению переломов (Ludwig et al., 2007). Их в основном вводят через вену для уменьшения риска осложнений со стороны костей, вроде переломов, и для понижения анормально высоких уровней кальция в крови (гиперкальцемии). Данные говорят о том, что бисфосфонаты ослабляют боль в костях, связанную с MM. Пациенты могут также подвергаться хирургическому вмешательству, если их кости являются слабыми или сломанными. В одном из вариантов осуществления иммуноконъюгаты уменьшают, в частности, уменьшают до допустимого уровня, боли в костях и/или осложнения со стороны костей, такие как остеонекроз. Уменьшение до допустимого уровня включает, в частности, возможность прекращения введения лекарственного средства, которое ослабляет эти боли или нацелено на уменьшение указанных осложнений со стороны костей. Бисфосфонаты, такие как памидронат, золедроновая кислота и клодронат, обычно вводят для уменьшения осложнений со стороны костей, таких как остеонекроз, у пациентов с MM и, тем самым, для ослабления болей в костях, связанных с указанными осложнениями. Типичные бисфосфонаты включают, для орального введения, FOSOMAX, BONIVA, ACTONEL, DIDRONEL и SKELID, для внутривенного введения, BONEFOS, AREDIA и ZOMETA.

Уменьшение боли в костях и/или осложнений со стороны костей в соответствии с настоящим изобретением может иметь следствием уменьшение количества вводимого пациенту лекарственного средства против боли и/или количества любых лекарственных средств, которые вводят для нейтрализации этих осложнений. Этим уменьшением может быть уменьшение (i) относительно ранее вводимого количества, когда указанный пациент (а) подвергался лечению указанного заболевания, вызывающего боль в костях и/или осложнения со стороны костей, которое отличается от лечений в соответствии с настоящим изобретением, или (b) не подвергался лечению, или (ii) относительно количества, вводимого другому пациенту, страдающему тем же заболеванием и находящемуся на приблизительно той же стадии заболевания. Предпочтительно, такое уменьшение является уменьшением на приблизительно 10%, приблизительно 20%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90% и, предпочтительно, полным прекращением введения лекарственного средства. Когда последнее достигнуто, т.е. когда пациент не нуждается в каком-либо лекарственном средстве против болей в костях и/или осложнений со стороны костей в результате введения иммуноконъюгата в соответствии с настоящим изобретением либо отдельно, либо в виде части противораковой комбинации в соответствии с настоящим изобретением, говорят, что введение указанного иммуноконъюгата уменьшило боль в костях и/или осложнения со стороны костей до допустимого уровня. В результате неблагоприятные побочные эффекты, являющиеся следствием лекарственного средства, вводимого для уменьшения боли в костях и/или осложнений со стороны костей, должны уменьшаться или аннулироваться.

После хоминга клеток множественной миеломы в стромальном компартменте костного мозга адгезия между клетками множественной миеломы и BMSC активирует экспрессию множества цитокинов, вроде интерлейкина-6 (IL-6), и инсулиноподобного фактора-1 роста (IGF-1), которые обладают ангиогенными и ускоряющими рост опухоли активностями (Hideshima et al., 2007). Инициируемые этими цитокинами каскады передачи сигналов, в конечном счете, приводят к резистентности клеток MM к общепринятым терапиям (Anderson et al., 2000; Hideshima et al., 2006).

В гемопоэтическом компартменте нормального человека экспрессия CD138 ограничивается плазматическими клетками (Wijdenes, 1996; Chilosi, 1999), и CD138 не экспрессирован на лимфоцитах, моноцитах, гранулоцитах периферической крови и эритроцитах. В частности, CD34⁺ стволовые клетки и клетки-предшественники не экспрессируют CD138, и мАт против CD138 не влияют на количество колониеобразующих единиц в культурах гемопоэтических стволовых клеток (Wijdenes, 1996). В негемапоэтических компартментах CD138, главным образом, экспрессирован на простом и слоистом эпителии в легком, печени, коже, почке и кишке. Наблюдалось лишь слабое окрашивание эндотелиальных клеток (Bernfield, 1992; Vooijs, 1996). Сообщалось, что CD138 существует в полиморфных формах в клетках лимфомы человека (Gattei, 1999).

Сообщалось, что моноклональные антитела B-B4, BC/B-B4, B-B2, DL-101, 1D4, MI15, 1.BB.210, 2Q1484, 5F7, 104-9, 281-2, в частности, B-B4, являются специфичными в отношении CD138. Из них B-B4, 1D4 и MI15 распознавали как интактную молекулу, так и коровый белок CD138 и, как установлено, распознавали либо одни и те же, либо близкородственные эпитопы (Gattei, 1999). В результате предшествующих исследований сообщалось, что B-B4 не распознает растворимый CD138, а лишь CD138 в мембраносвязанной форме (Wijdenes, 2002).

Первоначальное антитело против CD138 было получено Diaclone SAS (Besancon, Франция) в виде родительского мАт мыши B-B4, созданного в результате иммунизации линией клеток множественной миеломы человека U266, используя стандартную гибридомную технологию (Clement, 1995; Wijdenes, 1996). B-B4 связывается с линейным эпитопом между остатками 90-93 корового белка синдекана-1 человека (CD138) (Wijdenes, 1996; Dore, 1998). В соответствии с характером экспрессии CD138 установлено, что B-B4 сильно взаимодействовало с линией плазматических клеток RPMI8226, но не взаимодействует с эндотелиальными клетками. Также в соответствии с характером экспрессии CD138 B-B4 также взаимодействовало с линиями эпителиальных клеток A431 (происходящими из кератиноцитов) и HepG2 (происходящими из гепатоцитов). Иммунотоксин B-B4-сапонин был также в высокой степени токсичным по отношению к линии плазматических клеток RPMI8226, фактически значительно более токсичным, чем свободный сапонин. Однако из двух исследованных линий эпителиальных клеток B-B4-сапонин продемонстрировал токсичность лишь по отношению к линии клеток A431, хотя в исследовании клоногенной способности B-B4-сапонин не продемонстрировал ингибиторный в отношении образования отростков клеток A431 эффект (Vooijs, 1996). Другие исследователи сообщили об отсутствии специфичности по отношению к опухолям MM-ассоциированных антигенов (Couturier, 1999).

B-B4, ковалентно присоединенный к майтансиноиду DM1, продемонстрировал избирательную цитотоксичность по отношению к линиям клеток и клеткам множественной миеломы, а также противораковую активность в моделях с использованием ксенотрансплантатах клеток множественной миеломы человека на мышах с SCID (Tassone, 2004).

В настоящем изобретении используется термин «опухолевая клетка», который включает раковые клетки, а также предраковые клетки, которые могут образовывать или могут не образовывать часть солидной опухоли.

Нацеливающий агент в соответствии с настоящим изобретением способен к связыванию с молекулой, экспрессируемой клеткой-мишенью, и содержит пептиды и не являющиеся пептидами агенты. В частности, нацеливающие агенты в соответствии с настоящим изобретением содержат нацеливающие антитела и не являющиеся иммуноглобулинами нацеливающие молекулы, которые могут быть основаны на не являющихся иммуноглобулинами белках, содержащих, но без ограничения, молекулы AFFILIN®, ANTICALINS® и AFFIBODIES®. Не являющиеся иммуноглобулинами нацеливающие молекулы также содержат непептидные нацеливающие молекулы, такие как нацеливающие ДНК- и РНК-олигонуклеотиды (аптамеры), а также физиологические лиганды, в частности лиганды антигена, о котором идет речь, такого как CD138.

Нацеливающее антитело в соответствии с настоящим изобретением представляет собой природное антитело и основывается на нем, или является созданным синтетически или с помощью генетической инженерии, и связывается с антигеном на представляющей интерес клетке или клетках (клетке(ах)-мишени). Нацеливающее антитело в соответствии с настоящим изобретением содержит моноклональное антитело, поликлональное антитело, полиспецифическое антитело (например, биспецифическое антитело) или фрагмент антитела. Разработка нацеливающего антитела может быть нацелена, например, на увеличение его аффинности к клеткам-мишеням (Ross, 2003) или уменьшение его иммуногенности. Нацеливающее антитело может быть присоединено к липосомному препарату, содержащему эффекторные молекулы (Carter, 2001). Фрагмент антитела содержит часть интактного антитела, предпочтительно, антигенсвязывающую или вариабельную область интактного антитела. Примеры фрагментов антител в соответствии с настоящим изобретением включают Fab-, Fab'-, F(ab')₂- и Fv-фрагменты, а также диатела; антитела с единичными доменами (dAb) (Ward, 1989; патент США 6005079); линейные антитела; одноцепочечные молекулы антител и полиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. В антителе в виде одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv) вариабельные области тяжелой и легкой цепи (VH and VL) могут быть соединены с помощью короткого аминокислотного линкера, имеющего, например, последовательность (глицин₄серин)_n, который обладает гибкостью, достаточной для допуска формирования двумя доменами функционального антигенсвязывающего кармана. Добавление различных сигнальных последовательностей может создать возможность для более точного нацеливания нацеливающего антитела. Добавление константной области легкой цепи (CL) может обеспечить димеризацию через образование дисульфидных связей, что дает увеличение стабильности и авидности. Вариабельные области для конструирования scFv могут, в случае наличия мАт против представляющей интерес мишени, быть получены с помощью ОТ-ПЦР, с помощью которой получают копии вариабельных областей на основе мРНК, экстрагированной из родительской гибридомы. Альтернативно, scFv могут быть созданы de novo с помощью технологии фагового дисплея (Smith, 2001). Предполагается, что используемый в настоящем документе термин «функциональный фрагмент», при использовании в отношении нацеливающего антитела, относится к части нацеливающего антитела, которая способна к специфическому связыванию антигена, который специфически связывается упоминаемым антителом. Биспецифическое антитело в соответствии с настоящим изобретением может, например, иметь по крайней мере одно плечо, реактивное по отношению к ткани-мишени, и одно плечо, реактивное по отношению к линкерной составляющей (публикация заявки на патент США 20020006379). Биспецифическое антитело в соответствии с настоящим изобретением может также связываться с более чем одним антигеном на клетке-мишени (Carter, 2001). Антитело в соответствии с настоящим изобретением может быть модифицированным в результате, например, введения остатков цистеина для введения тиольных групп (Olafsen, 2004).

В соответствии с настоящим изобретением нацеливающее антитело может происходить из любого источника и может быть, но без ограничения, верблюжьим антителом, мышиным антителом, химерным человеческим/мышиным антителом или химерным человеческим/обезьяньим антителом, в частности, таким химерным человеческим/мышиным антителом, как nBT062.

Гуманизированные антитела являются антителами, которые содержат последовательности, происходящие из антитела человека и из нечеловеческого антитела, и также находятся в пределах объема настоящего изобретения. Подходящие способы гуманизации антител включают пересадку CDR (пересадку определяющих комплементарность участков) (EP 0239400; WO 91/09967; патенты США 5530101 и 5585089), венирование или изменение поверхности (EP 0592106; EP 0519596; Padlan, 1991; Studnicka et al., 1994; Roguska et al., 1994), перетасовку цепей (патент США 5565332) и Delmmunosation^TM (Biovation, LTD). При пересадке CDR мышиные определяющие комплементарность участки (CDR) из, например, мАт B-B4 пересаживают в каркасные области вариабельных областей человека, которые затем соединяют с константными областями человека, для создания человеческого антитела B-B4 (hB-B4). В настоящее время клинически применяются несколько антител, подвергнутых гуманизации с помощью пересадки CDR, в том числе MYLOTARG (Sievers et al., 2001) и HECEPTIN (Pegram et al., 1998).

В случае технологии изменения поверхности используется сочетание молекулярного моделирования, статистического анализа и мутагенеза для изменения не относящихся к CDR поверхностей вариабельных областей антитела, чтобы они напоминали поверхности известных антител мишеневого хозяина. Стратегии и способы изменения поверхности антител и другие способы уменьшения иммуногенности антител у отличного хозяина раскрыты, например, в патенте США 5639641. Антитела человека можно получить множеством известных в данной области техники способов, включающих способы фагового дисплея. См. также патенты США 4444887, 4716111, 5545806 и 5814318 и публикации международных заявок на патенты WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 и WO 91/10741.

Нацеливающие антитела, которые подверглись какой-либо неприродной модификации, такие как химерные человеческие/мышиные антитела или химерные человеческие/обезьяньи антитела, гуманизированные антитела или антитела, которые были разработаны, например, для увеличения их аффинности в отношении клеток-мишеней или уменьшения их иммуногенности, а также фрагменты антител, в частности, функциональные фрагменты таких нацеливающих антител, которые подверглись какой-либо неприродной модификации, диатела, антитела с единственным доменом, линейные антитела, одноцепочечные молекулы антител и полиспецифические антитела упоминаются в настоящем документе как сконструированные нацеливающие антитела.

Химеризированные антитела сохраняют связывающую область антитела (ABR или Fab-область), являющегося нечеловеческим, например, антитела мыши, на котором они основаны, в то время как константные области могут обеспечиваться за счет, например, антитела человека. Обычно химеризация и/или замена константных областей антитела не будет влиять на аффинность антитела, поскольку при этой замене области антитела, вносящие вклад в связывание антигена, не затрагиваются. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения сконструированное, в частности, химеризированное, антитело по настоящему изобретению может иметь более высокую аффинность связывания (выражаемой значениями K_D), чем соответствующее нечеловеческое антитело, на котором оно основано. В частности, антитело nBT062 и основанные на нем антитела могут иметь более высокую аффинность связывания, чем B-B4 мыши.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения иммуноконъюгаты, содержащие эти сконструированные/химеризированные антитела, также демонстрируют эту более высокую аффинность антитела. В определенных вариантах осуществления эти иммуноконъюгаты могут также демонстрировать другие преимущественные свойства, такие как большая степень уменьшения опухолевой массы, чем в случае их содержащих B-B4 аналогов. В предпочтительном варианте осуществления сконструированные, в частности, химеризированные, нацеливающие антитела демонстрируют аффинности связывания, которые характеризуются константами диссоциации K_D (нМ), составляющими менее чем 1,6, менее чем 1,5 или приблизительно или менее чем 1,4, в то время как их мышиные аналоги характеризуются константами диссоциации K_D (нМ), составляющими приблизительно или более чем 1,6. Иммуноконъюгаты, содержащие нацеливающие агенты, такие как нацеливающие антитела, могут характеризоваться константами диссоциации K_D (нМ), составляющими менее чем 2,6, менее чем 2,5, менее чем 2,4, менее чем 2,3, менее чем 2,2, менее чем 2,1, менее чем 2,0, менее чем или приблизительно 1,9, в то время как иммуноконъюгаты, содержащие антитела-аналоги мыши, могут характеризоваться константами диссоциации K_D (нМ), составляющими приблизительно или более чем 2,6 (сравните таблицу 9, Материалы и методы).

Основные молекулы антител являются бифункциональной структурой, в которой вариабельные области связываются с антигеном, в то время как остающиеся константные области могут вызвать антигеннезависимые ответы. Константные области определяют основные классы антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. Эти классы можно далее подразделить на подклассы (изотипы). Например, класс IgG содержит четыре изотипа, а именно IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, которые определяют константные области. Известно, что из различных классов антител человека лишь IgG1, IgG2, IgG3 и IgM человека эффективно активируют систему комплемента. Несмотря на то, что константные области не образуют антигенсвязывающие сайты, компоновка константных областей и шарнирной области может придавать молекуле сегментную гибкость, которая позволяет ей связываться с антигеном.

Различные изотипы IgG могут связываться с рецепторами для Fc на таких клетках, как моноциты, B-клетки и NK-клетки, активируя тем самым выброс клетками цитокинов. Различные изотипы могут также активировать комплемент, вызывая локальное или системное воспаление. В частности, различные изотипы IgG могут связываться с FcγR в различной степени. FcγR являются группой поверхностных гликопротеинов, относящихся к суперсемейству Ig и представленных в основном на лейкоцитах. Гликопротеины FcγR подразделяют на три класса, обозначенных FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) и FcγRIII (CD16). В то время как IgG1, IgG2 и IgG3 сильно связываются с множеством этих классов гликопротеинов FcγR, IgG4 проявляет намного более слабое связывание. В частности, IgG4 является веществом со средним связыванием с FcγRI, которое приводит к относительно низкой ADCC (антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности) или даже ее отсутствию, и не связывается с FcγRIIIA или FcγRIIA. IgG4 также является веществом со слабым связыванием с FcγRIIB, который является ингибиторным рецептором. Кроме того, IgG4 опосредует лишь слабую фиксацию комплемента или не опосредует ее и слабую комплементзависимую цитотоксичность (CDC) или не опосредует ее. Применительно к настоящему изобретению IgG4 может специфическим образом использоваться для предотвращения Fc-опосредованного взаимодействия с FcR в печени, поскольку он проявляет отсутствие взаимодействия с FcRγII на LSEC (синусоидальных эндотелиальных клетках печени), отсутствие или слабое взаимодействие с FcRγI-III на клетках Купфера (макрофагах) и отсутствие взаимодействия с FcRγIII на NK-клетках печени. Определенные мутации, приводящие к дальнейшему уменьшению какой-либо CDC, также являются частью настоящего изобретения. Установлено, что, например, мутации остатков в положениях 327, 330 и 331 IgG4 уменьшают ADCC (антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность) и CDC (Amour, 1999; Shields, 2001). Одна или несколько мутаций, которые стабилизуют антитело (также упоминаемые в настоящем документе как «стабилизирующие мутации»), также являются частью настоящего изобретения. Эти мутации включают, в частности, мутации с заменой лейцина на глютаминовую кислоту в CH2-области IgG4 и замены серина на пролин в остове шарнирной области IgG4. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения эти мутации уменьшают количество неполных молекул до менее 10%, менее 5% и, предпочтительно, менее 2% или 1%. Кроме того, полупериод in vivo существования стабилизированных таким образом молекул мог бы быть увеличенным, составляя несколько дней, в том числе 1, 2, 3, 4 или более чем 5 дней (Schuurman, 1999).

Когда настоящее изобретение относится к иммуноконъюгату, содержащему сконструированное нацеливающее антитело, придающее свойства изотипа IgG4, это означает, что сконструированное нацеливающее антитело демонстрирует значительно уменьшенную аффинность к экспрессирующим рецептор для Fc клеткам по сравнению с аффинностью антител изотипа IgG1. Предпочтительно, когда эти свойства придает отличная от ABR дополнительная область антитела, которая представляет собой целое или часть антитела человека. Результатом является значительно уменьшенная (более чем на 90% относительно его аналога - изотипа IgG1) способность к индукции CDC или ADCC по сравнению со способностью к индукции CDC или ADCC, обычно наблюдаемой при использовании антител изотипа IgG1, или ее полное отсутствие. Это свойство можно определить в основанных на клетках исследованиях при использовании сконструированного нацеливающего антитела в его неконъюгированной форме. CDC и ADCC можно определить различными способами, такими как способ, описанный в Cancer Immunol. Immunother., 36, 373 (1993), или исследование токсичности по отношению к клеткам GUAVA. Общим преимуществом иммуноконъюгатов, содержащих по крайней мере часть сконструированного нацеливающего антитела, придающую свойства изотипа IgG4, является увеличение специфичности связывания и уменьшенная токсичность. Также уменьшенная в результате аффинность к рецепторам для Fc увеличивает антигенспецифическую нацеленность на опухолевые клетки, что приводит к уменьшенной токсичности по отношению к отрицательным по CD138 клеткам.

Нацеливающие агенты, содержащие нацеливающие антитела, раскрытые в данном описании, можно также охарактеризовать или специфицировать на основе аффинности их связывания с антигеном, в частности, CD138. Предпочтительные аффинности связывания нацеливающих агентов, таких как нацеливающие антитела, характеризуются константами диссоциации K_D (нМ), составляющими менее чем 1,6, менее чем 1,5 или приблизительно или менее чем 1,4. В случае иммуноконъюгатов, содержащих указанные нацеливающие агенты, такие как нацеливающие антитела, предпочтительными являются константы диссоциации K_D (нМ), составляющие менее чем 1,6, менее чем 1,5 или менее чем 2,5, менее чем 2,4, менее чем 2,3, менее чем 2,2, менее чем 2,1, менее чем 2,0, менее чем или приблизительно 1,9.

Антигенсвязывающая область (ABR) в соответствии с настоящим изобретением будет изменяться на основе типа используемого нацеливающего антитела или сконструированного нацеливающего антитела. Во встречающемся в природе антителе и в большинстве химерных и гуманизированных антител антигенсвязывающая область состоит из легкой цепи и первых двух доменов тяжелой цепи. Однако в содержащем тяжелые цепи антителе, лишенном легких цепей, антигенсвязывающая область будет состоять из, например, лишь первых двух доменов тяжелой цепи, в то время как в одноцепочечных антителах (ScFv), в одной полипептидной цепи которых объединены вариабельные домены легкой и тяжелой цепей молекулы антитела, ABR обеспечивается лишь одной полипептидной молекулой. Fab-фрагменты обычно получают посредством расщепления папаином и содержат одну легкую цепь и часть тяжелой цепи, и, следовательно, включают ABR с лишь одним сайтом объединения с антигеном. С другой стороны, диатела представляют собой небольшие фрагменты антител с двумя антигенсвязывающими областями. Однако в контексте настоящего изобретения антигенсвязывающей областью нацеливающего антитела или сконструированного нацеливающего антитела является любая область, которая в первую очередь определяет специфичность связывания нацеливающего антитела или сконструированного нацеливающего антитела.

Если говорится, что ABR или другая область нацеливающего антитела является областью «определенного антитела», например, человеческого или нечеловеческого антитела, это означает в контексте настоящего изобретения, что ABR либо идентична соответствующей встречающейся в природе ABR, либо основана на ней. ABR основана на встречающейся в природе ABR, если она обладает специфичностью связывания встречающейся в природе ABR. Однако такая ABR может включать, например, точечные мутации, вставки, делеции или посттрансляционную модификацию, такую как гликозилирование. Такая ABR может быть, в частности, идентична по последовательности, встречающейся в природе ABR на более чем 70%, более чем 80%, более чем 90%, предпочтительно, более чем 95%, более чем 98% или более чем 99%.

nBT062 (см. также фиг. 1) является химерным мышиным/человеческим антителом изотипа IgG4, а именно химеризированным вариантом B-B4. Этот химеризированный вариант B-B4 был создан для уменьшения ответа в виде продукции HAMA (человеческих антимышиных антител), при сохранении функциональности связывающей области антитела B-B4 в отношении CD138. Как ни удивительно, результаты, полученные с использованием иммуноконъюгата, содержащего это сконструированное нацеливающее антитело, были намного более однородными (вариация результатов была уменьшенной). Прокол для получения nBT062 конкретизирован ниже. Клетки яичника китайского хомячка, экспрессирующие nBT062, были депонированы в DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1, D-38124 Braunschweig 11 декабря 2007. Идентификационным номером является DSM ACC2875. Специфичное для CD138 химерное антитело, основанное на B-B4, в общем, называют в настоящем документе c-B-B4.

Аминокислотная последовательностей обеих, тяжелой и легкой, цепей была предсказана на основе трансляции нуклеотидной последовательности для nBT062. Аминокислотные последовательности, предсказанные для тяжелой цепи и легкой цепи, представлены в таблице 3. Предсказанные вариабельные области выделены жирным шрифтом, предсказанные CDR подчеркнуты.

Таблица 3.
Предсказанная аминокислотная последовательность nBT062   - Предсказанная последовательность тяжелой цепи nBT062 (SEQ ID NO:1):     C-концевой лизин подвержен отсечению и может присутствовать вследствие неполного в определенной степени отсечения. (K) в  

круглых скобках не является частью SEQ ID NO:1.   - Предсказанная последовательность легкой цепи nBT062 (SEQ ID NO:2):    

Таблица 4
Представлено сравнение обычных определений CDR по Kabat и Chothia и предсказанных CDR для nBT062. Определение CDR по Kabat nBT062 Легкая цепь CDR1: остатки 24-34 CDR1: остатки 24-34   CDR2: остатки 50-56 CDR2: остатки 50-56   CDR3: остатки 89-97 CDR3: остатки 89-97       Тяжелая цепь CDR1: остатки 31-35 CDR1: остатки 31-35   CDR2: остатки 50-56 CDR2: остатки 51-68   CDR3: остатки 95-102 CDR3: остатки 99-111       Определение CDR по Chothia nBT062 Легкая цепь CDR1: остатки 26-32 CDR1: остатки 24-34   CDR2: остатки 50-52 CDR2: остатки 50-56   CDR3: остатки 91-96 CDR3: остатки 89-97       Тяжелая цепь CDR1: остатки 26-32 CDR1: остатки 31-35

  CDR2: остатки 52-56 CDR2: остатки 51-68   CDR3: остатки 96-102 CDR3: остатки 99-111

Могут также использоваться полностью человеческие антитела. Эти антитела можно отобрать посредством метода с использованием фагового дисплея, в котором CD138 или антигенная детерминанта используется для селективного связывания с фагом, экспрессирующим, например, вариабельные области B-B4 (см., Krebs, 2001). Полезным является сочетание этого метода с метолом созревания аффинности для увеличения аффинности антитела. Все упоминаемые в настоящем документе антитела являются выделенными антителами (см. публикацию заявки на патент США 20090175863).

В одном из вариантов осуществления нацеливающее антитело, в его неконъюгированной форме, подвергается умеренной или слабой интернализации. Умеренная интернализация представляет интернализацию на от приблизительно 30% до приблизительно 75% относительно полной интернализации антитела, слабая интернализация представляет интернализацию на от приблизительно 0,01% до вплоть приблизительно 30% после инкубации в течение 3 часов при 37ºC. В другом предпочтительном варианте осуществления нацеливающее антитело, например, антитела B-B4, BC/B-B4, B-B2, DL-101, 1D4, MI15, 1.BB.210, 2Q1484, 5F7, 104-9, 281-2, в частности, B-B4, связывается с CD138. Гибридомные клетки, которые были созданы посредством гибридизации клеток миеломы SP02/0 с клетками селезенки мышей Balb/c, были депонированы в DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1, D-38124 Braunschweig 1 декабря 2007. Идентификационным номером этих экспрессирующих B-B4 гибридомных клеток является DSM ACC2874. В другом варианте осуществления нацеливающее антитело по существу не связывается с представленным не на клеточной поверхности CD138. Если, в контексте настоящего изобретения, название конкретного антитела объединено с термином «нацеливающее антитело», например, «нацеливающее антитело nBT062», это означает, что это нацеливающее антитело обладает специфичностью связывания антитела nBT062. Если говорится, что нацеливающее антитело «основано на» конкретном антителе, это означает, что это нацеливающее антитело обладает специфичность связывания этого антитела, но может принимать любую форму в соответствии с вышеприведенным описанием нацеливающего антитела. Когда, в контексте настоящего изобретения, название конкретного антигена объединено с термином «нацеливающее антитело», например, «нацеливающее на CD138 антитело», это означает, что это нацеливающее антитело обладает специфичность связывания с CD138. Если в контексте настоящего изобретения говорится, что, например, нацеливающее антитело выполняет что-либо «селективно», например, «селективно взаимодействует с представленным на клеточной поверхности CD138», или «является селективным в отношении чего-либо», это означает, что существует значительная селективность (т.е. более высокая аффинность к CD138-положительным клеткам, чем к CD138-отрицательным клеткам), в случае предоставленного примера, в отношении представленного на клеточной поверхности CD138 по сравнению с любым другим представленным на клеточной поверхности антигеном. Неблагоприятные побочные эффекты в конкретной среде могут быть в значительной степени уменьшены или даже аннулированы благодаря этой селективности.

«Не являющиеся иммуноглобулинами нацеливающие молекулы» в соответствии с настоящим изобретением включают нацеливающие молекулы, происходящие из не являющихся иммуноглобулинами белков, а также непептидные нацеливающие молекулы. Предполагается, что небольшие не являющиеся иммуноглобулинами белки, которые включены в это определение, имеют специфические аффинности, особенно, к представленному на поверхности CD138. Эти небольшие не являющиеся иммуноглобулинами белки включают сконструированные на основе каркасной структуры молекулы, такие как молекулы Affilin®, которые имеют относительно небольшую молекулярную массу, например, между 10 кДа и 20 кДа. Подходящие каркасные структуры включают, например, гамма кристаллин. Эти молекулы, в своем природном состоянии, не обладают активностью специфического связывания с молекулами-мишенями. Посредством создания белковых поверхностей посредством локально установленной рандомизации подвергающихся воздействию растворителя аминокислот создают полностью новые связывающие сайты. Прежние не связывающие белки превращаются, таким образом, в белки со специфическим связыванием. Можно, в частности, разработать такие молекулы, которые связываются с такой мишенью, как CD138, и создают возможность для специфической доставки одной или более эффекторных молекул (см. scil Proteins GmbH на сайте www.scilproteins.com, 2004). Другой тип не являющихся иммуноглобулинами нацеливающих молекул происходит из липокалинов и включает, например, ANTICALIN®, структура которых напоминает до некоторой степени структуру иммуноглобулинов. Однако липокалины состоят из одной полипептидной цепи из 160-180 аминокислотных остатков. Связывающему карману липокалинов можно придать новую форму для распознавания представляющей интерес молекулы с высокой аффинностью и специфичностью (см., например, Beste et al., 1999). Искусственные бактериальные рецепторы, такие как те, которые продаются под товарным знаком Affibody® (Affibody AB), также находятся в пределах объема настоящего изобретения. Эти искусственные бактериальные рецепторные молекулы являются небольшими, простыми белками и могут состоять из трехспирального узла на основе каркасной структуры одного из IgG-связывающих доменов белка A (Staphylococcus aureus). Эти молекулы обладают способностями к связыванию, схожими с таковыми многих иммуноглобулинов, но являются значительно более маленькими, имея молекулярную массу, часто не превышающую 10 кДа, а также относительно стабильными. Подходящие искусственные бактериальные рецепторные молекулы описаны, например, в патентах США 5831012, 6534628 и 6740734.

Другие «не являющиеся иммуноглобулинами нацеливающие молекулы» представляют собой физиологические лиганды антигена, о котором идет речь. Физиологические лиганды CD138 включают, например, но без ограничения, ADAMTS4 (агреканазу-1), антитромбин-3, bFGF, катепсин G, CCL5 (RANTES), CCL7, CCL11, CCL17, CD44, коллагены (тип 1 коллагена, тип 2 коллагена, тип 3 коллагена, тип 4 коллагена, тип 5 коллагена, тип 6 коллагена), CXCL1, эластазу, gp120, HGF [фактор роста гепатоцитов], ламинин-1, ламинин-2, ламинин-5, мидкин, MMP-7, нейтрофильную эластазу и плейотрофин (HBNF, HBGF-8). Непептидные нацеливающие молекулы включают, но без ограничения, ДНК и РНК-олигонуклеотиды, которые связываются с CD138 (аптамеры).

«Эффекторной молекулой» в соответствии с настоящим изобретением является молекула или ее производное или аналог, которая присоединена к нацеливающему агенту, в частности, нацеливающему антителу и/или сконструированному нацеливающему антителу, и которая проявляет желаемый эффект, например, вызывает апоптоз или другой тип гибели клеток, или длительную остановку клеточного цикла клетки(ок)-мишени(ей). Эффекторные молекулы в соответствии с настоящим изобретением включают молекулы, которые проявляют желаемые эффекты в клетке-мишени, и включают, но без ограничения, цитотоксические средства, содержащие низкомолекулярные цитотоксические средства (с молекулярной массой, которая меньше чем 1500 Да, предпочтительно, меньше чем 1400, меньше чем 1200, меньше чем 1000, меньше чем 800, меньше чем 700, меньше чем 600, меньше чем 500, меньше чем 300, но обычно больше чем 120 Да). В соответствии с настоящим изобретением эти цитотоксические средства являются обычно небелковоподобными биологическими цитотоксическими средствами и содержат другое цитотоксическое средство, состоящее из по крайней мере 5 атомов C, 10 атомов C, предпочтительно, более 12 атомов C, часто более 20 атомов C и иногда более 30, 40 или 50 атомов C и обычно по крайней мере одной циклической структуры, такой как бензольное кольцо, которое часто является замещенным, или индуцируют, после введения, продукцию такого другого средства. Однако часто соединительные циклические структуры являются частью этих молекул. Эти небелковоподобные биологические цитотоксические средства могут включаться в ДНК (ДНК-интеркаляторы) или алкилировать ДНК, ингибируют образование микротрубочек, являются ингибиторами митоза, ингибиторами ферментов, вовлеченных в поддержание структурной целостности ДНК, например, деацетилируют гистоны, или ингибиторами ферментов, которые иначе являются необходимыми для жизни клетки, и вызывают нарушение клеточного метаболизма. Эффекторы можно также отнести к категориям радионуклидов, модификаторов биологических ответов, порообразующих агентов, рибонуклеаз, белков каскадов передачи апоптозных сигналов с индуцирующими апоптоз активностями, антисмысловых олигонуклеотидов, антиметастатических агентов, антиоксидантов, антител или цитокинов, а также их функциональных производных или аналогов/фрагментов.

Токсины могут включать бактериальные токсины, такие как, но без ограничения, дифтерийный токсин или экзотоксин А, токсины растений, такие как, но без ограничения, рицин, другие алкалоиды и полифенолы, микотоксины, такие как альфа аманитин или более особо аматоксины и фаллотоксины. Токсины могут быть не только бактериального происхождения, но также происходить из грибов, растений, позвоночных и беспозвоночных, при этом все эти токсины могут быть генетически или химически модифицированными. Кроме того, токсины могут также быть токсинами окружающей среды, такими как, но без ограничения, метилртуть. Эффекторными молекулами могут быть белки, такие как белки каскадов передачи апоптозных сигналов с индуцирующими апоптоз активностями, включающие, но без ограничения, Гранзим B, Гранзим A, Каспазу-3, Каспазу-7, Каспазу-8, Каспазу-9, усеченный Bid (tBid), Bax и Bak. Токсинами могут также быть доластатины-10 и -15, являющиеся небольшими пептидами, выделенными из морского зайца Dolabella auricularia, которые, как установлено, взаимодействуют с тубулином.

Таблица 5
Представлены примеры низкомолекулярных цитотоксических средств, которые могут выполнять функцию эффекторных молекул. Эффектор Молекулярная масса (г/моль [Да]) Доксорубицин 564 Даунорубицин 528 Винбластин 811 Доцетаксел 808 Паклитаксел 854 Эпотилон В 508 Вориностат 264 Неокарзиностатин 660 Калихеамицин γ1 1368 Эсперамицин 1342 Метотрексат 454 Компоненты силимарина 482 Мазопрокол 302 Аминолевулиновая кислота 132 Милтефосин 407 Галлат эпигаллокатехина 459

(EGCG)   Псорален 186 Мелфалан 304

В предпочтительном варианте осуществления эффекторная молекула увеличивает внутреннюю эффекторную доставку иммуноконъюгата, в частности, когда природная форма антитела, на которой основано нацеливающее антитело иммуноконъюгата, является слабо интернализуемой. В другом предпочтительном варианте осуществления эффектор, в своей природной форме, является неизбирательным. В определенных вариантах осуществления эффектор, в своей природной форме, обладает высокой неизбирательной токсичностью, в том числе системной токсичностью. «Нативной формой» эффекторной молекулы настоящего изобретения является эффекторная молекула до ее присоединения к нацеливающему агенту с образованием иммуноконъюгата. В другом предпочтительном варианте осуществления неизбирательная токсичность эффекторной молекулы по существу устраняется после конъюгации с нацеливающим агентом. В другом предпочтительном варианте осуществления эффекторная молекула вызывает в клетке-мишени, при ее достижении, ее гибель и остановку клеточного цикла, в то числе длительную остановку клеточного цикла.

Эффекторная молекула в соответствии с настоящим изобретением содержит, но без ограничения, антинеопластические агенты, в частности, внутриклеточные химиотерапевтические средства, которые определены ниже.

Предпочтительно низкомолекулярными цитотоксическими средствами (см. вышеприведенное описание таких средств) могут быть антимитотические агенты, конкретнее, воздействующие на тубулин агенты, которые включают ингибиторы полимеризации тубулина, такие как майтансиноиды, доластатины (и производные, такие как ауристатин) и криптофицин, и сильнодействующие лекарственные средства таксоиды (таксаны) (Payne, 2003). В это определение небольшого высокоцитотоксичного лекарственного средства включены, кроме того, другие вносящие помехи в функционирование тубулина агенты, такие как эпотилоны (например, иксабепилон) и производные колхицина (вносящие помехи в функционирование тубулина агенты описаны ниже).

Эффекторная молекула, которая является майтансиноидом, содержит майтансиноиды любого происхождения, в том числе, но без ограничения, синтетический майтансинол и аналог и производное майтансинола.

Майтансин является природным продуктом, сначала выделенным из кустарника Эфиопии Maytenus serrata (Remillard, 1975; патент США 3896111). Это лекарственное средство ингибирует полимеризацию тубулина, что приводит к блокировке митоза и гибели клеток (Remillard, 1975; Bhattacharyya, 1977; Kupchan, 1978). Цитотоксичность майтансина в 200-1000 раз выше, чем таковая при клиническом применении противораковых средств, воздействующих на полимеризацию тубулина, таких как алкалоиды барвинка или таксол. Однако клинические испытания майтансина показали, что в его случае нет терапевтического окна из-за его высокой системной токсичности. Майтансин и майтансиноиды являются высокоцитотоксичными, но их клиническое применение при лечении рака значительно ограничивалось их тяжелыми системными побочными эффектами, в основном объясняемыми их слабой селективностью в отношении опухолей. Клинические испытания с использованием майтансина продемонстрировали серьезные неблагоприятные эффекты на центральную нервную систему и желудочно-кишечный тракт.

Майтансиноиды были также выделены из других растений, содержащих ткань семени Trewia nudiflora (патент США 4418064).

Некоторые микробы также продуцируют майтансиноиды, такие как майтансинол и сложные эфиры майтансинола и C-3 кислот (патент США 4151042).

Настоящее изобретение относится к майтансиноидам любого происхождения, в том числе синтетическому майтансинолу и аналогам майтансинола, которые описаны, например, в патентах США 4137230, 4248870, 4256746, 4260608, 4265814, 4294757, 4307016, 4308268, 4308269, 4309428, 4313946, 4315929, 4317821, 4322348, 4331598, 4361650, 4362663, 4364866, 4371533, 4424219 и 4151042.

В предпочтительном варианте осуществления майтансиноид представляет собой содержащий тиольную группу(ы) майтансиноид и предпочтительнее является полученным в соответствии со способами, описанными в патенте США 6333410, выданном Chari et al., или в Chari et al. (Chari, 1992).

DM-1 (N²-деацетил-N²-(3-меркапто-1-оксопропил)-майтансин) является предпочтительной эффекторной молекулой применительно к настоящему изобретению. DM1 является в 3-10 раз цитотоксичнее майтансина и был превращен в пролекарство посредством его соединения через образование дисульфидной связи(ей) с моноклональным антителом, направленным против опухолевоспецифичного антигена. Некоторые из этих конъюгатов (иногда называемых «активируемыми опухолями пролекарствами» (TAP)) не являются цитотоксичными в кровяном компартменте, поскольку они активируются после соединения с клетками-мишенями и подвергаются интернализации, высвобождая, тем самым, лекарственное средство (Blattler, 2001). Несколько конъюгатов антитело-DM1 было разработано (Payne, 2003) и подвергнуто оценке в клинических испытаниях. Например, в случае пациентов с колоректальным раком лечение huC242-DM1 хорошо переносилось, не вызывало какого-либо определяемого иммунного ответа и характеризовалось длительным периодом времени циркуляции (Tolcher, 2003).

Другие особенно предпочтительные майтансиноиды, такие как, но без ограничения, майтансиноиды N^2'-деацетил-N^2'-(4-меркапто-1-оксопентил)-майтансин, также называемый «DM3», и N^2'-деацетил-N^2'-(4-метил-4-меркапто-1-оксопентил)-майтансин), также называемый «DM4», включают боковую цепь, которая содержит стерически затрудненную тиольную связь. Синтез DM4 представлен на фиг. 3 и 4 и описывается в настоящем документе в другом месте. DM4 отличается от DM1 и DM3 тем, что он содержит метильные группы у своего αC. Это приводит к стерическому затруднению при присоединении DM4 посредством линкера, в частности, но без ограничения, линкера, содержащего дисульфидную связь, к нацеливающему агенту, такому как nBT062. Широкий спектр майтансиноидов, содержащих стерически затрудненную тиольную группу (имеющих один или два заместителя, в частности, являющихся алкилами заместителя, таких как являющиеся метилами заместители DM4) раскрыт в заявке на патент США 2004/0235840, опубликованной 25 ноября 2004, которая включена в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме. Стерическое затруднение, обеспечиваемое алкильными группами, такими как метильные группы, у атома углерода рядом с атомом серы DM3 и DM4, может влиять на скорость внутриклеточного расщепления иммуноконъюгата. Следовательно, вариабельная алкильная единица может оказывать влияние на активность, эффективность и безопасность/токсичность in vitro и in vivo.

Как сообщалось Goldmahker et al. в публикации заявки на патент № 2006/0233814, такое затруднение индуцирует алкилирование (например, метилирование) свободного лекарственного средства после его высвобождения у своей мишени. Алкилирование может увеличить устойчивость лекарственного средства, что создает возможность для проявления так называемого эффекта свидетеля. Однако, как будет понятно квалифицированному в данной области техники специалисту, другие эффекторные молекулы, содержащие такие заместители, как алкильные группы, в положениях, которые приводят к стерическому затруднению при присоединении эффектора к нацеливающему агенту посредством линкера, являются частью настоящего изобретения (публикация заявки на патент США 2004/0235840). Предпочтительно, когда такое затруднение индуцирует химическую модификацию, такую как алкилирование свободного лекарственного средства с увеличением его общей устойчивости, которая позволяет лекарственному средству не только вызывать гибель клеток или длительную остановку клеточного цикла в случае экспрессирующих CD138 опухолевых клеток, но, необязательно, также воздействовать на вспомогательные клетки, которые, например, поддерживают или защищают опухоль от лекарственных средств, в частности, на клетки стромы опухоли и сосудистой сети опухоли, и которые обычно не экспрессируют CD138, для уменьшения или аннулирования их поддерживающей или защитной функции.

Майтансин был подвергнут оценке в клинических испытаниях фазы I и фазы II, спонсируемых Национальным институтом рака (NCI), под IND #11857 (предоставленных FDA 19 сентября 1975). У пациентов с гематологическими злокачественными новообразованиями отмечались как полные, так и частичные ответные реакции, и частичные ответные реакции отмечались у пациентов с широким спектром солидных опухолей (Blum and Kahlert, 1978, Issell and Crooke, 1978, Chabner et al., 1978, Eagan et al., 1978, Cabanillas et al., 1978). Однако отмечались значительные токсичности, в том числе тошнота, рвота, понос, повышения функционирования печени, вялость и периферические невропатии (см. Maytansine IND #11857, Annual Report, February, 1984; Blum and Kahlert., 1978, Issell and Crooke, 1978, Chabner et al., 1978). Токсические эффекты препятствовали дальнейшей разработке.

Класс вносящих помехи в функционирование тубулина агентов включает таксаны (Payne 2003), особенно сильнодействующие таксаны и те, которые содержат тиольные или дисульфидные группы. Таксаны являются ядовитыми для митотического веретена веществами, которые ингибируют деполимеризацию тубулина, приводя к увеличению скорости сборки микротрубочек и гибели клеток. Таксаны, которые находятся в объеме настоящего изобретения, описаны, например, в патентах США 6436931, 6340701, 6706708 и публикациях заявок на патенты США 20040087649, 20040024049 и 20030004210. Другие таксаны описаны, например, в патенте США 6002023, в патенте США 5998656, в патенте США 5892063, в патенте США 5763477, в патенте США 5705508, в патенте США 5703247 и в патенте США 5367086. Как будет понятно квалифицированному в данной области техники специалисту, ПЭГилированные таксаны, такие как те, которые описаны в патенте США 6596757, также находятся в пределах объема настоящего изобретения.

Настоящее изобретение включает, кроме того, воздействующие на ДНК молекулы-эффекторы, конкретнее, интеркаляторы, такие как антрациклины и производные (даунорубицин, валрубицин, доксорубицин, акларубицин, эпирубицин, идарубицин, амрубицин, пирарубицин, зорубицин) и антраценедионы, такие как происходящие из Streptomyces вещества (актиномицин, митомицин, блеомицин, актиномицин) или амсакрин.

Конкретнее, эффекторная молекула может представлять собой ДНК-алкилирующие средства вроде, и конкретнее, азотистого иприта и аналогов (например, Циклофосфамида, Мелфалана, Эстрамустина), Алкилсульфонатов, Нитрозомочевин, Азиридинов, Гидразинов, Этилениминов и других веществ, таких как Тренимон и Митобронитол (аналога маннита). В частности, предпочтительными ДНК-алкилирующими средствами являются аналоги или производные CC-1065 (патенты США 5475092, 5585499, 6716821) и дуокармицин.

CC-1065 является сильным противораковым антибиотиком, выделенным из культур Streptomyces zelensis, и, как установлено, является крайне цитотоксичным in vitro (патент США 4169888). В пределах объема настоящего изобретения находятся, например, аналоги или производные CC-1065, описанные в патентах США 5475092, 5585499 и 5739350. Как будет без труда понятно квалифицированному в данной области техники специалисту, модифицированные аналоги или производные CC-1065, описанные в патенте США 5846545, и пролекарства аналогов или производных CC-1065, описанные, например, в патенте США 6756397, также находятся в пределах объема настоящего изобретения. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения аналоги или производные CC-1065 могут, например, быть синтезированными, как описано в патенте США 6534660.

Кроме того, включены другие ДНК-алкилирующие молекулы-эффекторы, такие как вещества на основе платины (например, карбоплатин, недаплатин, оксалиплатин, триплатин, сатраплатин).

Из воздействующих на ДНК молекул-эффекторов также включены, ингибиторы топоизомеразы I и II, такие как происходящие из Camptotheca вещества (белотекан, топотекан) и Подофиллотоксин и производные (этопозид, тенипозид).

Дальнейший подкласс воздействующих на ДНК молекул-эффекторов включает антиметаболиты, такие как аналоги фолиевой кислоты (метотрексат, известный как ингибитор дигидрофолатредуктазы) или Аминоптерин. Также включены метаболиты, вносящие помехи в метаболизм пуринов или пиримидинов, в частности, ингибитор аденозиндезаминазы (пентостатин) или ингибитор галогенированный/рибонуклеотидредуктазы (кладрибин, клофарабин), тиопурин и тиазофурин. Дополнительные антиметаболиты включают ингибитор ДНК-полимеразы (цитарабин), ингибитор рибонуклеотидредуктазы (гемцитабин) и гипометилирующие агенты (азацитидин, децитабин) и ингибиторы рибонуклеотидредуктазы. Включены также сшивающие ДНК вещества более общего применения, такие как цисплатин.

Эффекторной молекулой в соответствии с настоящим изобретением могут быть противоопухолевые антибиотики, получившие определение модифицирующих или повреждающих ДНК молекул-эффекторов, содержащие антибиотики энедиины, такие как калихеамицин, которые включают, например, гамма 1I, N-ацетилкалихеамицин и другие производные калихеамицина. Калихеамицин связывается специфическим в отношении последовательности образом с малой бороздкой ДНК, претерпевает перестройку и экспонирует свободные радикалы, приводя к разрыву двухцепочечной ДНК, вызывая апоптоз и гибель клеток. Один пример эффекторной молекулы в виде калихеамицина, которая может использоваться применительно к настоящему изобретению, описан в патенте США 5053394. Это соединение используется в иммуноконъюгатах с моноклональными антителами, получивших в публикации названия гемтузумат озогамицин и инотузумаб озогамицин.

Подгруппа энедиина включает хромопротеины эсперамицин и неокарзиностатин, в частности, Трабектедин, который также отнесен к категории повреждающего ДНК агента, названные противоопухолевыми антибиотиками. Трабектедин вызывает расщепление остова ДНК и может быть выделен из асцидии (также известный как эктеинасцидин 743 или ET-743) и продается ZELITA и JOHNSON & JOHNSON под товарным знаком YONDELIS.

Другой группой предпочтительных эффекторных молекул являются вещества, такие как, но без ограничения, токсины, воздействующие на клеточный метаболизм. В частности, частью настоящего изобретения являются ингибиторы ферментов, такие как, но не только, олаприб, или более предпочтительные ингибиторы протеасом (например, бортезомиб) и протеинкиназ, или ингибиторы липоксигеназ, такие как мазопрокол. Также включены антагонисты рецепторов, такие как, но без ограничения, антагонист рецептора эндотелина A (например, атрасентан), или половые стероидные гормоны, такие как тестолактон, вносящие помехи в метаболизм эстрона. Кроме того, включены вещества, мешающие функционированию рецепторов эстрогена, такие как полифенолы растительного происхождения, например, но не только, изофлавоноиды, стильбены, силимарин, гликозиды фенилпропаноиды, называемые фитоэстрогенами.

Подходящими в качестве эффекторных молекул также являются вещества, воздействующие на клеточный метаболизм, такие как вещества, используемые для фотодинамической или лучевой терапии, содержащие, но без ограничения, производные порфиринов, например, δ-Аминолевулиновую кислоту. Эфапроксирал является радиосенсибилизатором, который увеличивает уровни кислорода посредством снижения сродства гемоглобина к кислороду. Кроме того, включены ретиноиды (первого, второго и третьего поколения), в частности Третиноин (ATRA), полностью транс-ретиноевая кислота, которая используется для лечения острого промиелоцитарного лейкоза (APML), продаваемая для этого заболевания ROCHE под товарным знаком VESANOID. Ретиноиды являются классом химических соединений, которые являются химически родственными витамину A, проявляя разнообразные действия, например, активацию генов-супрессоров опухолей. В настоящее время они используются для лечения рака кожи и воспалительных кожных заболеваний.

В другом предпочтительном варианте осуществления эффекторные молекулы могут воздействовать на пути передачи сигналов, такие как, но без ограничения, кальциевая сигнализация. Примерами являются триоксид мышьяка или триметилтина хлорид, последний из двух названных является высокотоксичным оловоорганическим соединением.

В настоящее изобретение также включены эффекторные молекулы, оказывающие влияние на механизмы резистентности к лекарственным средствам, которые могут включать, например, активность против множественной лекарственной резистентности (через ингибирование P-гликопротеина). В качестве не ограничивающих примеров могут служить бициклические гетероароматические соединения и производные.

Другой класс эффекторных молекул может включать вещества, или конкретнее белки, вносящие помехи в пути передачи апоптозных сигналов, включающие, но без ограничения, антисмысловые олигонуклеотиды, конкретнее, олигодезоксинуклеотиды, такие как Облимерсен (INN, фирменное название Genasense; также известный как Augmerosen и антисмысловой по отношению к bcl-2 олигодезоксинуклеотид G3139), который является антисмысловым олигодезоксирибонуклеотидом, фактически исследованным в качестве возможного лечения для нескольких типов рака, включающих хронический лимфоцитарный лейкоз, B-клеточную лимфому и рак молочной железы. Было выдвинуто предположение, что это соединение может уничтожать раковые клетки посредством блокирования продукции Bcl-2 и придания им большей чувствительности к химиотерапии. Дальнейших класс индуцирующих апоптоз веществ, которые могут выполнять функцию эффекторных молекул, включает полифенолы из растений, такие как, но без ограничения, силимарины, которые способы вносить помехи в функционирование регуляторов клеточного цикла и белков, вовлеченных в апоппоз.

Другие эффекторные молекулы могут включать ферменты, такие как, но без ограничения, аспарагиназа или другие ферменты с антинеопластическими активностями.

Являющаяся лекарственным средством эффекторная молекула в соответствии с настоящим изобретением может также быть противопротозойным средством, таким как Милтефосин.

В другом варианте осуществления эффекторные молекулы могут представлять собой полифенолы из растений, такие как, но без ограничения, псоралены и их гидроксиметаболиты.

Полифенолы из растений, такие как флавоноиды, танины (проантоцианидины), стилбеноиды, куркуминоиды и лиганды, обладающие одной из вышеупомянутых противоопухолевых активностей (например, индуцирующей апоппоз, остановку клеточного цикла) или дополнительной активностью, такой как акцептирование свободных радикалов, металлохелатирующая активность, вносящая помехи в функционирование рецепторов эстрогена активность, антиоксидантная активность, активность ферментов, вносящих помехи в метаболизм лекарственных средств), также являются возможными эффекторными молекулами. Конкретнее, псоралены и их гидроксиметаболиты, которые способны к включению в ДНК, действуя как металлохелаторы, обладающие антиоксидантными и цитопротективными свойствами, являются предпочтительными эффекторными молекулами. Особенно предпочтительными являются резерватол и полигидроксилированное производное и флавоноиды, такие как катехины и эпикатехины, конкретнее эпигаллокатехин-3-О-галлат, которые могут действовать как антиоксиданты.

Также возможна широкая классификации эффекторных молекул в соответствии с их механизмом действия:

Антинеопластические средства и иммуномодулирующие средства (код L01 в соответствии с АТС), в частности «внутриклеточные химиотерапевтические средства»

ATC: Анатомо-терапевтически-химическая классификационная система (WHO)

1) Антимитотические вещества, или молекулы, воздействующие на микротрубочки (тубулинсвязывающие агенты), такие как алкалоиды барвинка и аналоги (алкалоиды барвинка (винбластин, винкристин, винфлунин, виндесин, винорелбин) и таксаны (паклитаксел, ларотаксел, доцетаксел), доластатины (и производные, например, ауристатин) и криптофицин, майтансины и производные колхицина, эпотилоны (например, иксабепилон).

2) Вещества, оказывающие влияние на репликацию ДНК

a) интеркаляторы, такие как антрациклины (даунорубицин, валрубицин, доксорубицин, акларубицин, эпирубицин, идарубицин, амрубицин, пирарубицин, зорубицин) и антраценедионы, такие как происходящие из Streptomyces вещества (актиномицин, митомицин, блеомицин, дактиномицин) или амсакрин;

b) алкилирующие агенты, такие как азотистый иприт, нитрозомочевины, алкилсульфонаты, азиридины, гидразины (прокарбазин), триазены, эпоксиды, этиленимины, алтретамин, митобронитол, дуокармицин и аналоги/стереоизомеры, тренимон, эстрамустин, CC-1065;

c) агенты, вроде алкилирующих, такие как платина (например, карбоплатин, недаплатин, оксалиплатин, триплатин тетранитрат, сатраплатин);

d) специфические ингибиторы топоизомеразы I, такие как происходящие из Camptotheca вещества (белотекан, топотекан);

e) специфические ингибиторы топоизомеразы II, такие как подофиллотоксин и производные (этопозид, тенипозид);

f) антиметаболиты, воздействующие на синтез ДНК/РНК в результате внесения помех в метаболизм

- фолиевой кислоты, такие как ингибиторы дигидрофолатредуктазы (например, аминоптерин, метотрексат), ингибитор тимидилатсинтазы;

- пуринов, такие как ингибитор аденозиндезаминазы (пентостатин) или ингибитор галогенированный/рибонуклеотидредуктазы (кладрибин, клофарабин), тиопурин, тиазофурин;

- пиримидинов, такие как ингибитор ДНК-полимеразы (цитарабин), ингибитор рибонуклеотидредуктазы (гемцитабин), гипометилирующий агент (азацитидин, децитабин);

- дезоксирибонуклеотидов, такие как ингибитор рибонуклеотидредуктазы - гидроксикарбамид;

g) другие сшивающие ДНК агенты, такие как соединения на основе платины (например, цисплатин).

3) Другие вносящие помехи в функционирование ДНК вещества, например, противоопухолевые/цитотоксические антибиотики, такие как Эльсамицин А, дополнительные антибиотики, такие как СС-1065, и подкласс антибиотиков, таких как энедиин бактериального происхождения калихеамицин или хромопротеин энедиин Эсперамицин (крайне токсичный сплайсирующий ДНК агент) или Неокарзиностатин (Другими членами группы антибиотиков - неокарзиностатина являются макромомицин, актиноксантин, кедарцидин и мадуропептин) или Трабектедин (вызывает расщепление остова ДНК).

4) Токсины, воздействующие на клеточный метаболизм, например, ингибиторы HSP90, Лонидамид (ингибирует как дыхание, так и гликолиз, приводя к уменьшению клеточного АТФ)

a) ингибиторы ферментов, например олаприб (ингибитор PARP), ингибитор CDK (алвоциниб), ингибиторы протеасом (бортезомиб) и протеинкиназ, мазопрокол (ингибитор липоксигеназ);

b) антагонисты рецепторов, такие как тутин (антагонист рецептора глицина (растительный токсин), атрасентан, рецептор ретиноида X (Бексаротен), половые стероидные гормоны, такие как тестолактон, мешающие функционированию рецепторов эстрогена вещества;

c) фотосенсибилизаторы или другие соединения, используемые для фотодинамической терапии (форфимер натрий), производные порфиринов, например δ-Аминолевулиновая кислота;

d) радиосенсибилизатор, такой как Эфапроксирал, который увеличивает уровни кислорода посредством снижения сродства гемоглобина к кислороду;

e) вещества, воздействующие на пути передачи сигналов, например, кальциевую сигнализацию, такие как триоксид мышьяка и триметилтина хлорид;

f) другие вещества, вносящие помехи в метаболизм, такие как ретиноиды и производные, Третиноин (ATRA).

5) Соединения, оказывающие влияние на эпигенетический процесс, такие как ингибиторы HDAC (например, панобиностат, вориностат, вальпроевая кислота, MGCD0103 (моцетиностат), которые находятся в настоящее время на стадии клинического испытания для кожной T-клеточной лимфомы, острого миелоидного лейкоза, лимфомы Ходжкина или фолликулярной лимфомы).

6) Соединения, оказывающие влияние на механизмы резистентности к лекарственным средствам, такие как бициклические гетероароматические соединения, которые ингибируют P-гликопротеин.

7) Вещества, индуцирующие передачи апоптозных сигналов/механизмы апоптоза, включают белки, а также антисмысловые олигодезоксинуклеотиды, такие как Облимерсен (фирменное название Genasense).

8) Ферменты, такие как аспарагиназа.

9) Противопротозойные средства, такие как Милтефосин.

10) Полифенолы из растений, такие как флавоноиды, танины (проантоцианидины), стилбеноиды, куркуминоиды и лиганды, обладающие одной из вышеупомянутых противоопухолевых активностей (например, индуцирующей апоптоз, остановку клеточного цикла) или дополнительной активностью, такой как акцептирование свободных радикалов, металлохелатирующая активность, мешающая функционированию рецепторов эстрогена активность, антиоксидантная активность, активность ферментов, вносящих помехи в метаболизм лекарственных средств). Конкретнее, псоралены и их гидроксиметаболиты, резерватол и полигидроксилированные производные, флавоноиды, такие как катехины и эпикатехины, конкретнее эпигаллокатехин-3-О-галлат.

11) Дополнительные природные вещества и производные, такие как экзотоксин А, дифтерийный токсин и их производные, причем производные могут быть химически или генетически модифицированными.

Эффекторные молекулы можно также распределить по категориям в соответствии с классом веществ, к которому они относятся, например, неорганические соединения, ароматические соединения, соединения на основе металлов, связанные с клеточным метаболизмом белки, ферменты, пептиды, олигонуклеотиды, такие как антисмысловые нуклеотиды, бактериальные токсины, происходящие из растений токсины и полифенолы, такие как танины, флавоноиды и кумарины, а также терпеноиды, алкалоиды, противоопухолевые антибиотики (например, антибиотики энедиины), микотоксины, токсины из беспозвоночных, а также позвоночных, токсины окружающей среды.

Иммуноконъюгат в соответствии с настоящим изобретением содержит по крайней мере один нацеливающий агент, в частности, нацеливающее антитело, и одну эффекторную молекулу. Иммуноконъюгат может включать дополнительные молекулы, например, для стабилизации. В случае иммуноконъюгатов термин «конъюгат» обычно используется для обозначения функциональной связи нацеливающего агента с одной или несколькими эффекторными молекулами и, как предполагается, не относится исключительно к какому-либо типу функциональной связи, и, в частности, не ограничивается химической «конъюгацией». При условии, что нацеливающий агент способен к связыванию с сайтом-мишенью, а присоединенный эффектор функционирует в достаточной степени, как намечено, в частности, после доставки к сайту-мишени, любой способ присоединения будет подходящим. Способы конъюгирования в соответствии с настоящим изобретением включают, но без ограничения, прямое присоединение эффекторной молекулы к нацеливающему антителу, с или без предварительной модификацией(и) эффекторной молекулы и/или нацеливающего антитела, или присоединение через линкеры. Функционально линкеры можно подразделить, например, на неустойчивые к кислотам линкеры, светочувствительные линкеры, расщепляемые ферментами линкеры, такие как линкеры, которые могут расщеплять пептидазы. Во многих вариантах осуществления настоящего изобретения расщепляемые линкеры являются предпочтительными. Такие расщепляемые линкеры могут расщепляться в условиях, которые существуют в клеточной среде, в частности, внутриклеточной среде, и которые не оказывают вредный эффект на лекарственное средство, высвободившееся при расщеплении. Низкие pH, такие как pH 4-5, поскольку они существуют в определенных внутриклеточных отделах, будут приводить к расщеплению неустойчивых к кислотам линкеров, в то время как светочувствительные линкеры будут расщепляться, например, под действием ультракрасного излучения. Однако линкеры, расщепляемые под действием/в физиологических условий(ях), существующих в большинстве клеток, являются предпочтительными и упоминаются в настоящем документе как физиологически расщепляемые линкеры. Соответственно, дисульфидные линкеры являются предпочтительными во многих вариантах осуществления настоящего изобретения. Эти линкеры являются расщепляемыми благодаря дисульфидному обмену, который может иметь место в физиологических условиях. Предпочтительные гетеробифункциональные линкеры включают, но без ограничения, N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP) (см., например, Carlsson et al. (1978)), N-сукцинимидил-4-(2-пиридилдитио)бутаноат (SPDB) (см., например, патент США 4563304), N-сукцинимидил-4-(2-пиридилдитио)пентаноат (SPP) (см., например, номер в системном реестре CCA - 341498-08-6), N-сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC) (см., например, Yoshitake et al. (1979)) и N-сукцинимидил-4-метил-4-[2-(5-нитропиридил)-дитио]пентаноат (SMNP) (см., например, патент США 4563304). Самыми предпочтительными для применения в композиции настоящего изобретения молекулами линкеров являются SPP, SMCC и SPDB.

Другие подходящие линкеры могут включать «нерасщепляемые связи», такие как, но без ограничения, сульфосукцинимидилмалеимидометилциклогексанкарбоксиксилат (SMCC), который является гетеробифункциональным линкером, способным соединять соединения с SH-содержащими соединениями. Бифункциональные и гетеробифункциональные молекулы линкеров, такие как направленные на углеводы гетеробифункциональные линкерные молекулы, такие как гидразид S-(2-тиопиридил)-L- цистеина (TPCH), также находятся в пределах объема настоящего изобретения (Vogel, 2004). Эффекторную молекулу, такую как майтансиноид, можно конъюгировать с нацеливающим антителом благодаря двустадийному реакционному процессу, включающему в качестве первой стадии модификацию нацеливающего антитела с помощью сшивающего агента, такого как N-сукцинимидил-пиридилдитиопропионат (SPDP), для введения дитиопиридильных групп в нацеливающее антитело. На второй стадии реакционноспособный майтансиноид, содержащий тиольную группу, такой как DM1, может быть добавлен к модифицированному антителу, в результате чего происходит замещение тиопиридильных групп в модифицированном антителе и продукция конъюгата цитотоксический майтансиноид/антитело, которые связаны дисульфидной связью (патент США 5208020). Однако в пределах объема настоящего изобретения также находятся одностадийные процессы конъюгации, такие как тот, который раскрыт в публикации заявки на патент США 20030055226, поданной Chari et al. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения к нацеливающему антителу присоединяют множество эффекторных молекул одного и того же или отличного типа. Как обсуждается в настоящем документе в другом месте, природа используемых линкеров может оказывать влияние на уничтожение свидетеля (Kovtun et al., 2006). См. также обсуждение фиг. 13. См. также патенты СЩА 5208030, 5416064, 6333410, 6441163, 6716821, 6913748, 7276497 и заявку на патент США 2005/0169933 ради способа приготовления иммуноконъюгатов.

Аналоги или производные CC-1065 можно конъюгировать с нацеливающим агентом посредством, например, групп для сопряжения ПЭГ, как описано в патенте США 6716821.

Калихеамицины можно конъюгировать с нацеливающими антителами посредством линкеров (патент США 5877296 и патент США 5773001) или в соответствии со способами конъюгации, раскрытыми в патенте США 5712374 и патенте США 5714586. Другой предпочтительный способ приготовления содержащих калихеамицины конъюгатов описан в публикации заявки на патент США 20040082764. Иммуноконъюгаты по настоящему изобретению могут принимать форму рекомбинантных слитых белков.

Функциональную связь в форме присоединения с использованием линкера или без такого использования называют в настоящем документе «функциональным присоединением».

Термин «иммуноконъюгат, по существу состоящий из определенных компонентов», означает в контексте настоящего изобретения, что антитело/иммуноконъюгат состоит из заданных компонентов и любых дополнительных материалов или компонентов, которые не оказывают в существенной степени влияние на основные характеристики антитела.

На фиг. 9(C) и (D) демонстрируются различия в однородности нацеливания/связывания между иммуноконъюгатами, содержащими антитело BB4 мыши (BB4-SPP-DM1; фиг. 9C) и сконструированное на его основе нацеливающее антитело nBT062 (nBT062-SPP-DM1; фиг. 9D). Как можно понять из этих графиков, результаты, полученные с использованием иммуноконъюгата, содержащего сконструированное нацеливающее антитело, являются значительно более однородными, чем таковые, полученные с использованием иммуноконъюгатов, содержащих антитело мыши. Это достойно особого внимания, поскольку связывающая область антитела ВВ4 не была модифицирована в случае nBT062. Таким образом, иммуноконъюгат, содержащий связывающую область антитела мыши, но не другие части антитела мыши, продемонстрировал свойства, которые значительно превосходят результаты, которые мог бы ожидать квалифицированный в данной области техники специалист.

Некоторые из иммуноконъюгатов по настоящему изобретению содержат эффекторную молекулу, которая является стерически затрудненной, и содержат расщепляемый линкер (HICL - затрудненный иммуноконъюгат, содержащий расщепляемый линкер). Незатрудненный аналог (UI: незатрудненный иммуноконъюгат) иммуноконъюгата, содержащего сконструированное нацеливающее антитело против CD138, присоединенное к эффекторной молекуле посредством расщепляемого линкера (CL), описывается в настоящем документе как UICL. UICL является эквивалентным HICL иммуноконъюгатом, содержащим сконструированное нацеливающее антитело, в котором однако эффекторная молекула не является стерически затрудненной. Примерами пары HICL/UICL являются BT062 и nBT062-SPP-DM1. Незатрудненный аналог такого иммуноконъюгата, который содержит нерасщепляемый линкер, (UINCL) относится к эквивалентному иммуноконъюгату, содержащему сконструированное нацеливающее антитело, в котором эффекторная молекула не является стерически затрудненной и который содержит нерасщепляемый линкер. Для BT062 (nBT062-SPDB-DM4) примером такого незатрудненного аналога, содержащего нерасщепляемый линкер (UNICL) мог бы быть nBT062-SMCC-DM1.

Ингибирующая рост опухоли активность иммуноконъюгата является относительным показателем. Он характеризует ингибирующую рост опухоли активность конъюгата относительно активности иммуноконъюгата с наибольшей эффективностью, активность которого принимают за 100%. Например, если активность иммуноконъюгата с наибольшей эффективностью, скажем, BT062, который вызывает задержку роста опухоли (TGD), составляющую 32 дня, принять за 100%, активность, например, nBT062-DM1, который демонстрирует задержку роста опухоли (TGD), составляющую 18 дней, рассчитывают следующим образом:

Ингибирующая рост опухоли активность = 100X (TGD_nBT062-DM1/TGD_BT062),

в общем виде:

Ингибирующая рост опухоли активность = 100X (TGD_{образец}/TGD_{стандарт}).

В таблице 6 представлены соответствующие примеры результатов, отображенных на фиг. 11B.

Таблица 6:
Задержка роста опухоли (TGD) и активность в % nBT062-DMx по отношению к ксенотрансплантатам опухолевых клеток MOLP-8 у мышей с SCID на основе групп, получающих лечение в дозе 450 мкг/кг.   TGD*(дни) Активность в %** PBS 0 0 nBT062-SMCC-DM1 18 56 BT062 32 100 nBT062-SPP-DM1 13 40 (*) Задержка роста опухоли в днях (TGD) в виде среднего периода времени в днях для достижения в подвергаемой лечению группе заданного размера (160 мм³) минус средний период времени для достижения в контрольной группе этого заданного размера.
(**) Ингибирующая рост опухоли активность = 100X (TGD_{образец}/TGD_BT062). Активность BT062, как установлено, составляет 100%.

В предоставленном в таблице 6 примере BT062 обусловливает ингибирующую рост опухоли активность, которая превышает на 60% таковую его незатрудненного аналога (nBT062-SPP-DM1), и ингибирующую рост опухоли активность, которая превышает на 44% таковую его незатрудненного аналога - иммуноконъюгата, содержащего нерасщепляемый линкер (nBT062-SMCC-DM1).

Как обсуждалось выше, некоторые лекарственные средства, такие как майтансиноиды, хоть и эффективные, являются высокотоксичными, уничтожающими в своей природной, т.е. неконъюгированной, форме клетки неизбирательно. Связывание цитотоксичного майтансиноида с антителом может сохранять лекарственное средство в неактивной форме до достижения им клетки-мишени (Lambert 2005). Несколько конъюгатов антитело-майтансиноид были подвергнуты клиническому испытанию.

Были проведены испытания фазы I и II IMGN901 (huN901-DM1, BB-10901) в отношении лечения CD56-положительных солидных опухолей (мелкоклеточного рака легкого и нейроэндокринных раков). В этих испытаниях IMGN901 вводили в течение 4 недель подряд каждые 6 недель, и он хорошо переносился (Fossella et al., 2005, Lorigan et al., 2006, McCann et al., 2007, Carter and Senter, 2008, Johnson et al. 2008). Являющаяся антителом часть иммуноконъюгата, huN901, продемонстрировала значительную активность CDC или ADCC. Тот же иммуноконъюгат исследовался в отношении лечения CD56-положительной множественной миеломы. В испытании фазы I с помощью введения IMGN901 в течение 2 недель подряд каждые 3 недели пациентам с CD56-положительной множественной миеломой, в случае которых общепризнанное лечение множественной миеломы было неуспешным, было представлено предварительное доказательство безопасности, а также клинической эффективности. Согласно протоку восемнадцать пациентов получили IMGN901 (каждые 3 пациента в дозе 40, 60, 75, 90, 112 и 140 мг/м²/неделю). Как сообщалось, предварительные фармакокинетические результаты показывают приблизительно линейную связь между введением дозы и измеренной максимальной концентрацией в сыворотке. Вызывающая интерес клиническая активность отмечалась вместе с профилем приемлемой безопасности. Подтвержденная незначительная ответная реакция (MR) была документирована в случае 3 подвергнутых интенсивному лечению пациентов (каждый 1 пациент в дозе 60, 90 и 112 мг/м²/неделю), используя Европейские критерии для трансплантата костного мозга. Долговременное стабильное заболевание было запротоколировано в дозах, составляющих 60, 90, 112 и 140 мг/м²/неделю (Chanan-Khan et al., 2007, Chanan-Khan et al., 2008). IMGN901 также исследуется в испытании фазы I на солидных опухолях. Иммуноконъюгат вводят ежедневно в течение 3 дней каждые 3 недели. Ориентировочная клиническая активность была отмечена у пациентов с мелкоклеточным раком легкого, карциномой из клеток Меркеля и другими солидными опухолями. Проводится увеличение дозы.

MLN2704 (huJ591-DM1) исследуется в отношении лечения устойчивого к кастрации рака предстательной железы (Milowsky et al., 2006, Brand and Tolcher 2006). В испытании фазы I MLN2704 на пациентах с прогрессирующим, метастатическим, устойчивым к кастрации раком предстательной железы исследовали профиль безопасности, фармакокинетику, иммуногенность и противоопухолевую активность MLN2704 при введении один раз каждые четыре недели. Результаты показали, что терапевтические дозы MLN2704 могут вводиться безопасно на циклической основе (Galsky et al., 2008). Были проведены параллельные испытания с использованием другого DM1-иммуноконъюгата, а именно биватузумаба мертансина, мишенью которого является CD44v6, который экспрессирован на клетках карцином головы и шеи и других солидных опухолей. В клиническом испытании с использованием схемы самого плотного введения (еженедельного введения) связывание с CD44v6 на кератиноцитах кожи опосредовало серьезную кожную токсичность со смертельным исходом у одного пациента, который привел к прекращению программы разработки биватузумаба мертансина (Tijink et al., 2006, Sauter et al., 2007, Rupp et al., 2007, Riechelmann et al., 2008).

CD44v6 не только экспрессирован на различных раковых клетках, но также в нормальной ткани кожи и напоминает в этом отношении CD138, который также представлен не только на раковых клетках, но и в нормальной ткани кожи. Неожиданно, было установлено, что BT062 демонстрирует клиническую эффективность без недопустимых побочных эффектов, вроде кожной токсичности, обнаруженной в случае биватузумаба мертансина. См. фиг. 23, на которой демонстрируется, что повторные разовые дозы BT062, составляющие вплоть до 160 мг/м², приводили к по крайней мере стабилизации заболевания с поддающимися коррекции побочными эффектами. Отображенные на фиг. 23 результаты также показывают, что 10 повторных разовых доз 20 мг/м² каждая (лечение в течение более 6 месяцев), 5 повторных разовых доз 40 мг/м² каждая, 5 повторных разовых доз 80 мг/м² каждая, 6 повторных разовых доз 160 мг/м² каждая и однократная доза 200 мг/м², за которой следовали 6 повторных разовых доз 160 мг/м² каждая (следовательно, суммарная доза = 1160 мг/м²) хорошо переносились (все еще продолжается лечение пациентов, соотносимых с 003-005 и 002-012 и 002-011).

CD138 также экспрессирован на нормальных клетках крови и других клетках, таких как эпителиальные клетки, разрушение которых могло бы привести к недопустимым побочным эффектам. Независимо от этого, ограничивающая дозу токсичность по отношению к нераковым/неопухолевым клеткам, экспрессирующим CD138, любого типа не была установлена в схемах лечения, отображенных на фиг. 23, вплоть до 120 мг/м², в то время как максимально допустимая доза (MTD), как было определено в этом исследовании, составляет 160 мг/м², а максимальная вводимая доза (MAD), как определено, составляет 200 мг/м². Дозы между 160 мг/м² и 200 мг/м² не проверялись. Более высокие дозы обычно не назначались ввиду ограничивающих дозу токсичностей (DLT) при 200 мг/м². Однако экспериментально обнаружено, что доза DLT, тем не менее, являлась допустимой при введении с последующими более низкими дозами, такими как дозы, составляющие 160 мг/м². Клинически незначимую токсичность по отношению к нераковым/неопухолевым клеткам, экспрессирующим CD138 (не являющимся мишенями клеткам, экспрессирующим CD138), называют в настоящем документе «клинически допустимой токсичностью» или «допустимой токсичностью» по отношению к таким клеткам и соответствующему органу(ам). Соответствующее количество вводимого иммуноконъюгата упоминают в настоящем документе как «допустимое количество». Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения иммуноконъюгат проявляет клинически допустимую токсичность по отношению к таким не являющимся мишенями клеткам, экспрессирующим CD138, в частности эпителиальным клеткам, экспрессирующим CD138, которые не выявляются с помощью BT062 в модели на мыши с использованием ксенотрансплантата вследствие специфичности для человека.

Клинически допустимая токсичность означает, что имеет место неблагоприятная ответная реакция до поддающегося коррекции или допустимого уровня. Неблагоприятную ответную реакцию определяют как нежелательный эффект, резонно связанный с использованием лекарственного средства, в настоящем документе иммуноконъюгата, который может возникать как часть фармакологического действия лекарственного средства, или его возникновение может быть непредсказуемым. Это определение не включает все неблагоприятные явления, наблюдаемые во время использования лекарственного средства, а лишь те, в случае которых есть некоторое основание считать, что существует причинная связь между лекарственным средством и возникновением неблагоприятного явления. Неблагоприятные ответные реакции могут включать признаки и симптомы, изменения лабораторных параметров и изменения других показателей важной функции организма, таких как основные показатели жизнедеятельности организма и ЭКГ.

Если говорится, что на клетку, такую как не являющаяся мишенью клетка, особенно не являющаяся мишенью клетка (неопухолевая клетка), экспрессирующая CD138, «по существу не оказывает влияние» введение, в частности, введение определенной дозы, соединения, такого как иммуноконъюгат, это означает, что любое взаимодействие, которое такое соединение осуществило с указанной не являющейся мишенью клеткой, не привело или привело к поддающейся коррекции/допустимой неблагоприятной ответной реакции.

Испытания фазы I иммуноконъюгированной формы трастузумаба (T-DM1) в отношении лечения сверхэкспрессирующего HER2, метастатического рака молочной железы проведены для исследования безопасности и фармакокинетики T-DM1, вводимого еженедельно или один раз каждые 3 недели. В обоих испытаниях AE степени ≥ 2, связанные с T-DM1, были нечастными и поддающимися коррекции. Объективные ответы опухолей наблюдались в или ниже MTD (Burris et. al., 2006, Krop et al., 2007, Beeram et al., 2008, Holden et al., 2008). Было начато испытание фазы II, в котором исследуется T-DM1 на HER2-положительном, метастатическом раке молочной железы при введении один раз каждые 3 недели (Beeram et al., 2008, Carter and Senter, 2008, Holden et al., 2008). Проводится клиническое испытание фазы III, в котором оценивается T-DM1 на HER2-положительном, метастатическом раке молочной железы, в случае которого требуется лечение второй линии, и клинические испытания фазы II, в которых оценивается T-DM1 на HER2-положительном, метастатическом раке молочной железы, в случае которого требуется лечение первой, второй и третьей линий. Планируется клиническое испытание фазы Ib в сочетании с пертузумабом на пациентах с HER2-положительным, метастатическим раком молочной железы, который прогрессировал в течение основанного на герцептине лечения. Были завершены три клинических испытания фазы I с использованием кантузумаба мертансина, DM1-конъюгата антитела huC242, мишенью которого является антиген, обнаруживаемый на клетках колоректальных раков и других экспрессирующих C242 раков. Установлено, что лечение huC242-DM1, вводимым на еженедельной основе, а также один раз в 3 недели является безопасным и переносимым (Rowinsky et al., 2002, Tolcher et al., 2003, Helft et al., 2004).

В четырех испытаниях исследуются иммуноконъюгаты, в которых используется содержащий тиольные группы майтансиноид DM4, который также является компонентом BT062.

Аналог кантузумаба мертансина, IMGN242 (huC242-DM4), был исследован в испытании фазы I на индивидах с экспрессирующим Ag Can раком (Tolcher et al., 2006). Индивиды получали однократную внутривенную инфузии IMGN242 раз в 3 недели с использованием дозы, колеблющейся 18-297 мг/м². Ограничивающая дозу токсичность проявлялась у 2 из 6 индивидов, подвергнутых лечению на уровне дозы, составляющем 223 мг/м², во время второго цикла их лечения. Лекарственное средство хорошо переносилось на уровне 168 мг/м² и не индуцировало какую-либо определяемую ответную реакции в виде продукции антител (Mita et al., 2007). Основываясь на первых, касающихся безопасности результатах испытания фазы I, было начато испытание фазы II для оценки IMGN242 в отношении лечения экспрессирующего Аг Can рака желудка в дозе, составляющей 168 мг/м² (Sankhala et al., 2007). Сорок пять пациентов были подвергнуты лечению IMGN242 в двух клинических испытаниях. Основываясь на безопасности и тщательных клинических фармакокинетических (PK)/фармакодинамических (PD) исследованиях, в испытание фазы II были внесены изменения для лечения пациентов с низкими уровнями Ag Can в плазме в дозе, составляющей 126 мг/м², и пациентов с высокими уровнями Аг Can в плазме в дозе 168 мг/м² (Qin et al. 2008). Также было проведено испытание фазы I с использованием антитела huMy9-6, конъюгированного с DM4 (AVE9633), в отношении лечения индивидов с CD33-положительным острым миелоидным лейкозом (AML). Схема лечения состояла из внутривенных инфузий раз в 3 недели, используя диапазон доз 15-260 мг/м². Ни сопутствующая миелосупрессия, ни ответные реакции не отмечались в испытании с использованием разовой дозы (Giles et al., 2006). Второе испытание фазы I, в котором исследовался AVE9633 с использованием схемы лечения, состоящей из внутривенных инфузий в день 1 и день 8 28-дневного цикла, также показало, что AVE9633 хорошо переносился, и представило доказательство антилейкозной активности, в том числе у 1 индивида полной ответной реакции (недостаточная тромбоцитарная реакция в зависимости от трансфузии), длящейся в течение по крайней мере 4 месяцев (Legrand et al., 2007). Два дополнительных DM4-иммуноконъюгата (SAR3419 и BIIB015) стали составной частью клинических испытаний фазы I.

Также из данных о других иммуноконъюгатах, таких как Милотарг, мишенью которого является CD33, известно, что активность иммуноконъюгата может не быть достаточной для лечения пациентов с использованием низких доз. Эта проблема ослаблялась посредством, например, введения рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека (rhG-CSF) для сенсибилизации экспрессирующих CD33 клеток-мишеней (Fianchi et al., Annals of Oncology 2008 19(1): 128-134).

Вышеприведенные испытания показывают, что ответные реакции на различные иммуноконъюгаты, в частности содержащие майтансиноид (такой как DM1 или DM4) иммуноконъюгаты, широко варьируют. Испытания BT062 на являющихся людьми индивидах показало допустимую токсичность по отношению к нераковым клеткам, экспрессирующим CD138, в различных дозах для стабилизации заболевания, особенно в дозах вплоть до 160 мг/м².

Описываемый в настоящем документе иммуноконъюгат может вводиться в сочетании с цитотоксическими средствами. Эти комбинации называют в настоящем документе противораковыми комбинациями.

В настоящее время множество комбинаций, в частности, лекарственных средств против миеломы исследуются в клинических испытаниях. Целью использования комбинации является обычно любое из следующего: увеличение эффективности, преодоление фенотипа резистентности, например, у клеток миеломы, уменьшение побочных эффектов вследствие использования более низких концентраций одного из членов комбинации или его комбинации. Установлено, что использованием низкой дозы, например, леналидомида плюс низкая доза дексаметазона снижает токсичность (Rajkumar et al., 2010).

Особенно на пациентах с рецидивирующей или резистентной множественной миеломой исследуются и исследовались несколько комбинаций лекарственных средств.

Стандартным примером комбинированной химиотерапии служит тройная комбинация винкристина, дексаметазона, доксорубицина (схема VAD).

Ингибиторы протеасом, такие как бортезомиб, комбинировали с лекарственными средствами против миеломы, такими как мелфалан и преднизон (VMP). Эта комбинация приводила к составляющей 16% степени полной ответной реакции и составляющей 89% степени ответной реакции в общем (Mateos et al., 2006).

Бортезомиб был разрешен для использования в комбинации с липосомным доксорубицином для пациентов с рецидивами или резистентностью (Ning et al., 2007).

Бортезомиб исследуется в нескольких клинических испытаниях в отношении использования в сочетании с дексаметазоном, мелфаланом, преднизоном и/или талидомидом.

Бортезомиб также исследуется в сочетании с липосомным доксорубицином, циклофосфамидом и дексаметазоном на пациентах с множественной миеломой. В настоящее время исследуются комбинации с Вориностатом, нацеленные на возращение чувствительности к бортезомиб у пациентов, которые являются резистентными к этому лекарственному средству.

Талидомид, который вводится перорально, комбинировали с мелфаланом/преднизоном (MPT) (Facon et al., 2006) или дексаметазоном или бендамустином (Ponisch et al., 2008).

Кроме того, леналидомид, иммуномодулятор, использованный в комбинации с дексаметазоном, приводил к удлиненному периоду времени до прогрессирования опухолей и увеличению выживаемости по сравнению с дексаметазоном отдельно (Weber et al., 2006). На пациентах с недавно диагностированными заболеваниями был также исследован леналидомид в комбинации с дексаметазоном (Rajkumar et al., 2005), а также в комбинации с мелфаланом/преднизоном (RMP) (Palumbo et al., 2006).

В публикации заявки на патент США 2010/0028346, поданной Lutz et al., описывается синергетические эффекты комбинаций некоторых иммуноконъюгатов с химиотерапевтическими средствами.

Применительно к настоящему изобретению одной целью применений комбинаций является уменьшение эффективных доз иммуноконъюгата настоящего изобретения, уменьшение их побочных эффектов и открытие новых терапевтических окон с допустимыми побочными эффектами. Другой целью является уменьшение эффективной дозы ранее используемых цитотоксических средств, таких как Велкаде или леналидомид, и, предпочтительно, уменьшение побочных эффектов этих средств. Аналогично дозировкам, положительные последствия включают, но без ограничения, пролонгирование лечения, более высокие дозы, другие схемы применения, лучшие и более длительные ответные реакции на лечение.

Пациентам, проявляющим фенотип резистентности к таким лекарственным средствам, как леналидомид, мелфалан (проводимое исследование), можно было бы придать снова чувствительность посредством использования иммуноконъюгатов в соответствии с настоящим изобретением.

Термин «цитотоксические средства» включает «цитотоксические/противораковые средства», содержащие химиотерапевтические средства, в частности, химиотерапевтические средства, которые обычно используются в случае быстро делящихся клеток, а именно:

- алкилирующие агенты, такие как азотистый иприт (например, мелфалан, циклофосфамид, мехлоретамин, урамустин, хлорамбуцил, ифосфамид) или нитрозомочевины (например, кармустин, ломустин, стрептозоцин), или алкилсульфонаты;

- агенты, вроде алкилирующих, такие как цисплатин, карбоплатин, недаплатин, оксалиплатин или неклассические алкилирующие агенты, такие как тетразины, дакарбазин, прокарбазин, алтретамин;

- антрациклины, такие как доксорубицин и липосомный доксорубицин (DOXIL);

- алкалоиды, такие как винкристин.

Термин «цитотоксические средства» также включает иммуномодуляторы (ImiD), такие как талидомид (или аналоги), леналидомид (CC-5013), помалидомид, актимид, которые используются для лечения миеломы ввиду их плейотропных иммуномодулирующих свойств. Они обычно проявляют противовоспалительную активность посредством ингибирования продукции TNF-альфа, но также проявляют антиангиогенную активность и иммуномодулирующие свойства, такие как костимуляция T-клеток и влияние на регуляторные T-клетки (Quach et al., 2010).

Термин «цитотоксическое средство» также включает стероиды, такие как, но без ограничения, дексаметазон и преднизон, а также ингибиторы протеасом, такие как бортезомиб (Велкаде) или карфилзомиб, который вызывает активацию запрограммированной гибели клеток в неопластических клетках, зависящую от подавления путей проапоптоза. Дополнительные сильнодействующие цитотоксические средства включают этопозид, который ингибирует фермент топоизомеразу II, цитарабин, который, после преобразования, повреждает ДНК, когда клеточный цикл находится в S-фазе (синтез ДНК), и поэтому, в частности, воздействует на быстро делящиеся клетки, такие как раковые клетки. Кроме того, ингибирующие образование микротрубочек агенты, такие как алкалоиды барвинка, таксаны (описанные выше в связи с эффекторными молекулами), могут также выполнять функцию цитотоксических средств в соответствии с настоящим изобретением.

В определение также включены ингибиторы киназ, такие как сорафениб, или ингибиторы HDAC (гистондеацетилазы), такие как ромидепсин, а также ингибирующие рост агенты, антигормальные средства, антиангиогенные агенты, кардиопротекторы, иммуностимулирующие средства, иммуносупрессоры, ингибиторы ангиогенеза, ингибиторы протеин/тирозинкиназ (PTK).

В это определение, кроме того, включены цитотоксические средства на основе антител, содержащие иммуноконъюгаты и антитела, которые обладают признанным в данной области техники цитотоксическим эффектом. Антитело против CD40 является предпочтительным антителом. Другие антитела включают, но без ограничения, например, AVASTIN (бевацизумаб) или MYELOMACIDE (милатузумаб).

Таломид (α-(N-фталимидо)глутаримид; талидомид) является иммуномодулятором. Эмпирической формулой талидомида является C₁₃H₁₀N₂O₄, а грамм-молекулярный вес составляет 258,2. Номером CAS талидомида является 50-35-1. Как представляется, он характеризуется множеством действий, в том числе способностью к ингибированию роста и выживания клеток миеломы различными путями и к ингибированию роста новых кровеносных сосудов.

Леналидомид (REVLIMID) является производным талидомида, представляющим иммуномодуляторы (ImiD) второго поколения, которые сначала разрабатывались как ингибиторы TNF-альфа. Эффекты леналидомида включают остановку роста или апоптоз, аннулирование адгезии миеломных клеток к стромальным клеткам костного мозга и модулирование цитокинов, активирующих рост клеток, их выживание и лекарственную резистентность миеломных клеток (Morgan et al., 2006). Леналидомид является эффективным в случае пациентов, резистентных к талидомиду. Помимо эффектов на клетки иммунной системы, ImiD, такие как леналидомид, как считалось, вызывают остановку клеточного цикла в G0/G1 фазе. Кроме того, предполагается, что ImiD ингибируют экспрессию рецепторов клеточной адгезии (VLA-4, VLA-5, CD138) (Quach et al., 2010). Можно было бы ожидать, что ингибирование экспрессии CD138 вызовет уменьшение связывания любого нацеливающего на CD138 агента, такого как BT062, с клетками-мишенями.

Ингибиторы протеасом можно подразделить на дальнейшие подгруппы:

a) производные встречающихся в природе пептидов, которые имеют С-концевую эпоксикетонную структуру, производные бета-лактона, аклациномицин A, лактацистин, кластолактацистин; и

b) синтетические ингибиторы (включающие альдегиды модифицированных пептидов, альфа, бета-эпоксикетонные структуры, винилсульфоны, радикалы борной кислоты, пинаколовые эфиры. Предпочтительным ингибитором протеасом настоящего изобретения является бортезомиб (PS 341; Велкаде, см. обсуждение ниже). В качестве одного из предложенных механизмов выдвигается, что ингибитор протеасом может предотвращать деградацию проапоптозных факторов, делая возможной активацию запрограммированной гибели клеток в неопластических клетках, зависящую от подавления путей проапоптоза. Кроме того, бортезомиб вызывает остановку клеточного цикла в G2/M (Wang et al., 2009). Таким образом, действие бортезомиба может интерферировать с таковым антимитотических агентов, которые являются частью иммуноконъюгата настоящего изобретения, например, эффектом майтансиноида DM4, который также оказывает действие на этой фазе клеточного цикла. Кроме того, на расщепление PARP (поли(АДФ-рибозо)полимеразы), которое происходит при апоптозе, также оказывает влияние как DM4, так и бортезомиб. Соответственно, комбинация иммуноконъюгата, содержащая антимитотический агент и ингибитор протеасом, проявляющий свойства бортезомиба, не соответствует общим основным принципам, изложенным ранее, для достижения синергетических эффектов (Takimoto et al., 2009).

Велкаде (бортезомид) является ингибитором протеасом, используемым для лечения множественной миеломы. Считается, что Велкаде действует на клетки миеломы с вызовом гибели клеток и/или действует опосредованно с ингибированием роста и выживания миеломных клеток посредством действия на микросреду костного мозга. Без ограничения какой-либо конкретной теорией или механизмом действия, Велкаде, таким образом, нарушает нормальные клеточные процессы, вызывая ингибирования протеасом, которое активирует апоптоз.

Дексаметазон является синтетическим глюкокортикоидным гормоном стероидной природы, который действует как противовоспалительное вещество и иммуносупрессант. После введения страдающим раком пациентам дексаметазон может нейтрализовать побочные эффекты противораковой терапии. Дексаметазон может также назначаться отдельно или вместе с другими противораковыми средствами, включающими талидомид, леналидомид, бортезомиб, адриамицин или винкристин.

Используемые для лечения вещества, которые могут использоваться в комбинации с BT062, также включают иммуномодуляторы (например, талидомид, и леналидомид, и помалидомид), ингибиторы протеасом (например, бортезомиб и карфилзомиб), стероиды (например, дексаметазон), алкилирующие агенты и химиотерапию в высокой дозе, комбинации (например, мелфалан и преднизон (MP), винкристин, доксорубицин (адриамицин) и дексаметазон (VAD)), и бисфосфонаты.

Термин «в комбинации с» не ограничивается введением в точно одно и то же время. Вместо этого, термин включает назначение иммуноконъюгата по настоящему изобретению и другой схемы (например, лучевой терапии) или агента, в частности, цитотоксических агентов, упомянутых выше, последовательно или с временными интервалами из условия, что они могут действовать вместе, чтобы принести пользу (например, увеличение активности, уменьшение побочных эффектов), превосходящую таковую при лечении либо только иммуноконъюгатом по настоящему изобретению, либо только, например, другим агентом или агентами. Предпочтительно, когда иммуноконъюгат и другой агент или агенты действуют аддитивно, и особенно предпочтительно, когда они действуют синергетически. Такие молекулы соответственно предоставляются в количествах, которые являются эффективными для намеченной цели. Квалифицированный практикующий врач может определить эмпирически, или при принятии во внимание фармакокинетики и механизмов действия агентов, соответствующую дозу или дозы каждого терапевтического средства, а также соответствующие выборы времени и способы введения. Как используется в контексте настоящего изобретения, «совместное введение» относится к введению в то же время, что и иммуноконъюгат, часто в комбинированной лекарственной форме.

Синергетические эффекты, которые являются эффектами двух компонентов, таких как иммуноконъюгат и цитотоксическое средство, превышают строго аддитивный эффект. Этим синергетическим эффектам мог бы противодействовать ряд факторов, дополнительно обсуждаемых ниже.

Синергизм рассчитывают следующим образом (Yu et al., 2001; Gunaratnam et al., 2009):

Коэффициент (r)=ожидаемый FTV (комбинация)/зарегистрированный FTV (комбинация)

FTV: относительный объем опухоли = средний объем опухоли (исследуемой)/средний объем опухоли (контрольной)

Коэффициент > 1 рассматривается как синергетический, тогда как r<1 означает менее чем аддитивный.

Коэффициент (r), в случае превышения 1, также называют в настоящем документе «коэффициентом синергизма».

Коэффициент активности является другим показателем эффектов комбинации. Этот коэффициент основан на Log₁₀ гибели клеток

Log₁₀ гибели клеток = (T-C)/T_d×3,32

где (T-C) или задержка роста опухоли, является средним временем в днях, требуемым для достижения заданного размера (600 мм³) опухолями подвергнутой лечению группы (T) и контрольной группы (C). T_d является временем, требуемым для увеличения вдвое среднего объема опухоли у контрольных мышей, а 3,32 является числом делений клеток на log клеточного роста (Bissery et al., 1991). Log₁₀ гибели клеток, превышающий 2,8, означает, что комбинация является высокоактивной, log₁₀ гибели клеток, составляющий 2,0-2,8, означает, что комбинация является очень активной, log₁₀ гибели клеток, составляющий 1,3-1,9, означает, что комбинация является активной, log₁₀ гибели клеток, составляющий 0,7-1,2, означает, что комбинация является умеренно активной, а log₁₀ гибели клеток, составляющий менее 0,7, означает, что комбинация является неактивной.

Выбор членов для комбинации лекарственных средств

Был разработан ряд основных принципов для проектирования схем комбинированной химиотерапии (Takimoto, 2006). Следование этим основным принципам будет, как правило, увеличивать шансы, что конкретная комбинация достигнет по крайней мере одного из трех самых важных теоретических преимуществ комбинированной химиотерапии над терапией с использованием одного агента:

1) максимизации уничтожения клеток при минимизации токсичностей у хозяина при использовании агентов с не интерферирующими ограничивающими дозу токсичностями;

2) увеличения диапазона активности лекарственного средства по отношению к опухолевым клеткам с эндогенной резистентностью к конкретным типам терапии; и

3) предотвращения или замедления образования вновь резистентных опухолевых клеток.

Рекомендуемые принципы, которые принимают во внимание в случае выбора агентов для использования в схемах комбинированной терапии, включают:

a) выбор лекарственных средств, которые, как известно, вызывают полную ремиссию в виде одиночных агентов,

b) выбор лекарственных средств с различными механизмами действия и с аддитивными или синергетическими цитотоксическими эффектами,

c) выбор лекарственных средств с отличными ограничивающими дозу токсичностями,

d) выбор лекарственных средств с отличными характерами резистентности для минимизации перекрестной резистентности.

Также лекарственные средства следует вводить в их оптимальной дозе и по оптимальной схеме (e), а введение следует осуществлять с постоянными интервалами, тогда как период без лечения должен быть по возможности коротким для создания возможности для восстановления нормальной ткани (f) (Takimoto et al., 2009).

Синергетическим эффектам или просто аддитивным эффектам может противодействовать ряд факторов. Например, компоненты противораковой комбинации могли бы инактивировать друг друга, например, в результате связывания друг с другом. Дополнительно, механизм действия одного компонента противораковой комбинации мог бы интерферировать с механизмом действия другого компонента. Например, леналидомид ингибирует экспрессию рецепторов клеточной адгезии, таких как CD138, который является мишенью иммуноконъюгата настоящего изобретения (Quach et al., 2010). Ингибитор протеасом бортезомиб вызывает остановку клеточного цикла в G2/M (Wang et al., 2009), на которую также влияют антимитотические агенты. Таким образом, если эффекторной молекулой иммуноконъюгата является майтансиноид, он и ботезомид будут иметь общую мишень для действия, что считается неблагоприятным.

Дозы, пути введения и рекомендуемое применение цитотоксических средств в соответствии с настоящим изобретением, которые широко использовались при лечении рака, известны в данной области техники и были описаны в такой литературе, как Physician's Desk Reference (PDR) (Настольный справочник врача). В PDR описаны дозы средств, которые использовались при лечении различных типов рака. Схемы введения доз и дозы этих цитотоксических средств, которые являются эффективными, будут зависеть от конкретного типа рака, подвергаемого лечению, степени заболевания и других факторов, известных квалифицированному в данной области техники врачу, и могут быть определены врачом. В изданном в 2006 Настольном справочнике врача (PDR) описан механизм действия и предпочтительные дозы лечения и схемы введения доз для талидомида (стр. 979-983), Велкаде (стр. 2102-2106) и мелфалана (стр. 976-979). Квалифицированный в данной области специалист может сделать критический обзор PDR, используя один или более следующих параметров, для определения схемы введения доз и доз химиотерапевтических средств и конъюгатов, которые могут использоваться в соответствии с идеями этого изобретения. Эти параметры включают:

1. Подробный индекс согласно a) производителю, b) продуктам (согласно названию компании или названию лекарственного средства - зарегистрированной торговой марке), c) индексу класса (например, «ингибиторы протеасом», «ДНК-алкилирующие средства», «мелфалан» и т.д.), d) генетическому/химическому индексу (не являющимся торговыми марками обычным названиям лекарственных средств).

2. Цветовые образы лекарственных средств.

3. Информация о продукте, в соответствии с этикетированием согласно FDA, включающая a) химическую информацию, b) функционирование/действие, c) показания и противопоказания, d) испытание-исследование, побочные эффекты, предупреждения.

Как будет понятно квалифицированному в данной области техники специалисту, аминокислотная последовательность являющейся предпочтительным сконструированным нацеливающим антителом части иммуноконъюгата, nBT062, может варьировать без утраты функциональной возможности, состоящей в нацеливании на CD138, являющейся антителом части. Это, в частности, верно, когда сохранены CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащий аминокислотные остатки 99-111 SEQ ID NO:1, и CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащий аминокислотные остатки 89-97 SEQ ID NO:2, соответственно антигенсвязывающей области (ABR). Преимущественно, когда также сохранены CDR1 и CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащие аминокислотные остатки 31-35 и 51-68 SEQ ID NO:1, и/или (b) CDR1 и CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащие аминокислотные остатки 24-34 и 50-56 SEQ ID NO:2, соответственно антигенсвязывающей области (ABR).

Термин «идентичность последовательностей» относится к степени идентичности нуклеотидных последовательностей или аминокислотных последовательностей. Обычно последовательности совмещают для получения совпадения наибольшего порядка. «Идентичность», как таковая, имеет общепризнанное значение в данной области техники, и ее можно рассчитать, используя опубликованные методы (см., например, Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; и Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991). Несмотря на то, что существует целый ряд способов для определения идентичности между двумя полинуклеотидными или полипептидными последовательностями, термин «идентичность» хорошо известен квалифицированным специалистам (Carillo, H. & Lipton, D., SIAM J Applied Math 48:1073 (1988)).

Идентична ли какая-либо конкретная молекула нуклеиновой кислоты по крайней мере на 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% иди 99%, например, последовательности нуклеиновой кислоты nBT062, или ее части, можно определить обычным способом, используя известные компьютерные программы, такие как программное обеспечение DNAsis (Hitachi Software, San Bruno, Calif.), для первоначального совмещения последовательностей, а затем программное обеспечение для последовательностей ДНК/белков ESEE версии 3.0 (cabot@trog.mbb.sfu.ca) для совмещения множества последовательностей.

Идентична ли аминокислотная последовательность по крайней мере на 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, например, SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2, или ее части, можно определить обычным способом, используя известные компьютерные программы, такие как программа BESTFIT (Wisconsin Sequence Analysis Package, версия 8 для Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711). В BESTFIT используется алгоритм для локальной гомологии Smith и Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981), для отыскания участка наибольшей гомологии между двумя последовательности.

При использовании DNAsis, ESEE, BESTFIT или любой другой программы для совмещения последовательностей, чтобы определить, идентична ли конкретная последовательность, например, на 95% стандартной последовательности в соответствии с настоящим изобретением, параметры устанавливают так, что процент идентичности рассчитывают по всей длине ссылочной последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности, и допускаются бреши в гомологии, которые составляют вплоть до 5% от общего числа нуклеотидов в ссылочной последовательности.

Если, в контексте настоящего изобретения, упоминается определенная идентичность последовательностей вместе с комбинацией остатков конкретной последовательности, эта идентичность последовательностей относится к сумме всех определенных остатков.

Как обсуждалось выше, BT062 является иммуноконъюгатом, содержащим нацеливающее на CD138 химерное антитело nBT062, которое присоединено посредством линкера, в настоящем документе SPDB, к цитостатическому производному майтансиноида DM4. Химическая структура BT062 представлена на фиг. 1 и 2. Иммуноконъюгаты, содержащие nBT062 и являющуюся майтансиноидом эффекторную молекулу, часто описывают с учетом их линкера и являющегося майтансиноидом эффектора, например, nBT062-SMCC-DM1 представляет собой иммуноконъюгат, содержащий nBT062, SMCC («нерасщепляемый линкер», содержащих тиоэфирную связь) и DM1 в качестве эффектора. В общем, иммуноконъюгат, содержащий nBT062 и эффекторную молекулу, можно также описать как nBT062-линкер-эффектор или просто nBT062-эффектор (nBT062N, где N является любым эффектором, описанным в настоящем документе (см. также публикацию заявки на патент США 20090232810)).

В одном из вариантов осуществления BT062 связывается с CD138-положительными клетками множественной миеломы. После осуществления клеткой-мишенью интернализации и/или высвобождения иммуноконъюгата, DM4 отделяется от нацеливающей молекулы, в результате чего восстанавливается первоначальная цитотоксическая активность DM4. Таким образом, BT062 обеспечивает являющуюся нацеленным антителом полезную нагрузку (TAP), причем функциональное присоединение DM4 к nBT062 сохраняет цитотоксическое средство в неактивной форме до достижения им экспрессирующей CD138 клетки-мишени/интернализации его в такую клетку.

Данные неклинических исследований, в которых изучается цитотоксичность BT062 на клетках множественной миеломы и моделях на животных, обсуждаемых в данном описании, показывают, что BT062 обладает весьма значительной антимиеломной активностью в дозах, которые хорошо переносятся, в модели на мышах.

Проводится открытое исследование фазы I с увеличением дозы, с использованием повторной разовой дозы на пациентах с рецидивирующей или рецидивирующей/резистентной множественной миеломой.

Описываемые в настоящем документе иммуноконъюгаты можно вводить любым путем, в том числе внутривенно, парентерально, перорально, внутримышечно, подоболочно или в виде аэрозоля. Способ доставки будет зависеть от желаемого эффекта. Квалифицированный специалист без труда выберет наилучший путь введения в случае конкретного лечения в соответствии с настоящим изобретением. Соответствующая доза будет зависеть от пути введения и показанного лечения и может быть без труда установлена квалифицированным специалистом с учетом находящихся в обращении протоколов лечения.

Фармацевтические композиции, содержащие иммуноконъюгат по настоящему изобретению и/или любое дополнительное цитотоксическое средств в качестве активных ингредиентов, можно приготовить в соответствии с общепринятыми фармацевтическими методами приготовления. См., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th Ed. (1985, Mack Publishing Co., Easton, Pa.). Обычно эффективные количества активных ингредиентов будут смешивать с фармацевтически приемлемым носителем. Носитель может принимать широкий спектр форм в зависимости от формы препарата, желаемой для введения, например, внутривенного, перорального, парентерального, подоболочечного, чрескожного или с помощью аэрозоля.

Противораковые комбинации по настоящему изобретению могут, предпочтительно, быть либо в форме фармацевтических композиций, либо в форме наборов, содержащих компоненты противораковой комбинации в различных контейнерах. Компоненты набора обычно вводят в сочетании друг с другом, часто осуществляют их совместное введение либо в комбинированной лекарственной форме, либо в отдельных лекарственных формах. Такие наборы могут также содержать, например, другие компоненты, устройство для введения компонентов или комбинации, устройство для объединения компонентов и/или инструкции в отношении того, как применять и вводить компоненты.

Для орального введения иммуноконъюгат и/или цитотоксическое средство можно составить в твердые или жидкие препараты, такие как капсулы, пилюли, таблетки, лепешки, расплавы, порошки, суспензии или эмульсии. При приготовлении композиций в лекарственной форме для перорального применения может использоваться любая из обычных фармацевтических сред, такая как, например, вода, гликоли, масла, спирты, корригенты, консерванты, красители, суспендирующие агенты и т.п. в случае жидких препаратов для перорального применения (таких как, например, суспензии, эликсиры и растворы); или такие носители, как крахмалы, сахара, разбавители, грануляторы, смазывающие вещества, связующие вещества, дезинтеграторы и т.п. в случае твердых препаратов для перорального применения (таких как, например, порошки, капсулы и таблетки). Из-за легкости их введения таблетки и капсулы представляют самую преимущественную форму единицы дозирования для перорального применения, в случае которой очевидно используются твердые фармацевтические носители. При желании таблетки могут иметь сахарное покрытие или энтеросолюбильное покрытие, наносимое с помощью стандартных методов. Чтобы проходить через желудочно-кишечный тракт, активный агент должен быть устойчивым. При необходимости, подходящие агенты для существенного прохода могут использоваться и могут включать фосфолипиды или производные лецитина, описанные в литературе, а также липосомы, микрочастицы (в том числе микросферы и макросферы).

Для парентерального введения иммуноконъюгат и/или цитотоксическое средство можно растворить в фармацевтическом носителе и вводить в виде либо раствора, либо суспензии. Наглядными примерами подходящих носителей являются вода, солевой раствор, забуференный фосфатом солевой раствор (PBS), растворы декстрозы, растворы фруктозы, этанол или масла животного, растительного или синтетического происхождения. Носитель может также содержать другие ингредиенты, например, консерванты, суспендирующие вещества, солюбилизаторы, буферы и т.п. Когда неконъюгированный нацеливающий агент и/или иммуноконъюгат, и/или цитотоксическое средство вводят интрацеребровентрикулярно или подоболочечно, они могут также растворяться в спинномозговой жидкости.

Вводимые индивиду дозы могут указываться как количество на площадь поверхности индивида (который включает человека, а также животных). Такому индивиду может вводиться доза в количествах, предпочтительно, но не исключительно, от приблизительно 5 мг/м² до приблизительно 300 мг/м², в том числе приблизительно 10 мг/м², приблизительно 20 мг/м², приблизительно 40 мг/м², приблизительно 50 мг/м², приблизительно 60 мг/м², приблизительно 80 мг/м², приблизительно 100 мг/м², приблизительно 120 мг/м², приблизительно 140 мг/м², приблизительно 150 мг/м², приблизительно 160 мг/м² и приблизительно 200 мг/м². Подходяще, когда иммуноконъюгаты вводят один раз или в течение ряда лечений. В схеме с использованием многократных доз эти количества могут вводиться раз в день, раз в неделю и раз в две недели. Ударные дозы с использованием однократной высокой дозы или, альтернативно, более низкие дозы, которые вводят непосредственно одну за другой, за которыми следуют дозы, спланированные во время с большими интервалами, являются предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения. В предпочтительном варианте осуществления для индивида выборы времени введения доз регулируют так, чтобы прошло достаточно времени до второго и/или любого последующего лечения, чтобы предшествующая доза заметно подверглась метаболизму, но количество иммуноконъюгата, присутствующее в системе индивида, все-таки ингибировало, задерживало и/или предотвращало рост опухоли. Приводимая в качестве примера схема с использованием «повторных разовых доз» включает введение доз иммуноконъюгата, составляющих приблизительно 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180 или 200 мг/м², раз в три недели. Альтернативно, за первоначальной высокой дозой, составляющей, например, 160 мг/м², может следовать вводимая один раз, два или три раза в неделю поддерживающая доза, составляющая, например, приблизительно 20 мг/м². Квалифицированный в данной области техники специалист может без труда установить другие комбинации. Однако могут применяться другие схемы введения доз. Успех этой терапии легко отследить с помощью известных методов и исследований. Дозы могут варьировать, среди прочего, в зависимости от того, вводятся ли они с превентивной или терапевтической целью, курса любой предшествующей терапии, истории болезни пациента, состояния болезни у пациента, опухолевой массы у пациента, генетической предрасположенности пациента, сопутствующих заболеваний у пациента, стадии заболевания после первого лечения и ответной реакции на нацеливающей агент/иммуноконъюгат, побочных эффектов, испытываемых пациентом, и усмотрения лечащего врача.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к схеме введения низких доз с быстрым плазменным клиренсом, а в другом варианте осуществления - к схеме введения низких доз без быстрого плазменного клиренса в случае введения иммуноконъюгатов, изложенных в данном документе. В первой схеме предоставляется обычно менее чем 160 мг/м², предпочтительно, не более чем приблизительно 120 мг/м², не более чем приблизительно 100 мг/м², не более чем приблизительно 80 мг/м², в том числе не более чем приблизительно 40 мг/м², более предпочтительно, не более чем приблизительно 20 мг/м², еще более предпочтительно, не более чем приблизительно 10 мг/м² за запланированный трехнедельный промежуток (цикл). Диапазон 10 мг/м²-120 мг/м² пересчитывается в среднюю суточную дозу, составляющую от приблизительно 475 мкг/м² до приблизительно 5,71 мг/м², или среднюю еженедельную дозу, оставляющую от приблизительно 3,33 мг/м² до приблизительно 40 мг/м². Таким образом, частью настоящего изобретения являются средние суточные дозы, составляющие от приблизительно 400 мкг/м² до приблизительно 5,71 мг/м², в том числе приблизительно 500 мкг/м², приблизительно 1 мг/м², приблизительно 2 мг/м² и приблизительно 3 мг/м², 4 мг/м², 5 мг/м², а значит средняя еженедельная доза, составляющая от приблизительно 3 мг/м² до приблизительно 40 мг/м², в том числе приблизительно 5 мг/м², приблизительно 10 мг/м², приблизительно 15 мг/м², приблизительно 20 мг/м², приблизительно 25 мг/м², 30 мг/м² или 35 мг/м². Эта схема введения низких доз сопровождается быстрым плазменным клиренсом на ранней стадии элиминации, т.е. завершается в любое время во время введения вплоть до двух часов после введения. Тем, что отличает эту схему введения низких доз от других схем введения низких доз, является быстрый плазменный клиренс, который характеризуется измеряемой Cmax во время этого периода, которая, предпочтительно, составляет менее чем 55%, менее чем 50%, менее чем 40% или менее чем 30% теоретического значения Cmax.

Схемы введения низких доз, на более высоких уровнях, сопровождаются менее быстрым плазменным клиренсом, т.е. плазменным клиренсом, который превышает 55%, часто 60%, 70%, 80% или 90% теоретического значения Cmax, который называют в настоящем документе средним (равен или > 55%, но < 80% теоретического значения Cmax) или медленным плазменным клиренсом (равен или >80% теоретического значения Cmax). При этих клиренсах было, как ни удивительно, установлено, что, несмотря на относительно высокую концентрацию иммуноконъюгата в плазме, эти схемы введения все-таки сопровождались допустимыми токсичностями. И это несмотря на тот факт, что уровни экспрессии CD138 на не являющихся мишенями клетках, которые экспрессируют CD138, например, клетках необходимых для жизни органов, таких как эпителий, которые не являются мишенью какого-либо лечения, являются также относительно высокими (иммуногистохимические анализы с использованием антитела против CD138 - BB4 показали, что реактивность этого антитела в отношении эпителия соответствовала таковой в отношении плазматических клеток у пациентов с MM (публикация заявки на патент США 20070183971)). Уровни экспрессии CD138 на являющихся мишенями и не являющихся мишенями клетках, которые получают равные оценки (например, плюс три в вышеприведенном примере) в иммуногистохимических анализах, называют в настоящем документе соизмеримыми уровнями экспрессии и являются частью настоящего изобретения. В альтернативном варианте осуществления уровни экспрессии на клетках-мишенях были фактически всякий раз ниже таковых на эпителии (например, плюс один или плюс два в сравнение с плюс три для эпителия). Некоторые опухолевые клетки-мишени демонстрируют смешанные уровни экспрессии, например, некоторые клетки имеют уровень экспрессии, составляющий плюс два, а некоторые - уровень экспрессии, составляющий плюс три. Среднее значение для представительного числа клеток (например, 100 случайно отобранных клеток) будет определять, подпадают ли эти опухолевые клетки-мишени, от которых идет речь, под определение имеющих уровни экспрессии, которые соизмеримы или ниже таковых на эпителии. В этих схемах лечения обычно предоставляется больше 120 мг/м², но меньше 200 мг/м² за запланированный трехнедельный промежуток (цикл), что пересчитывается в среднюю суточную дозу, составляющую от приблизительно 5,71 мг/м² до приблизительно 9,52 мг/м², или в среднюю еженедельную дозу, составляющую от приблизительно 40 мг/м² до приблизительно 66,67 мг/м².

Что касается пациента 001-006, достойным внимание является то, что прогрессирование заболевание у этого пациента отмечалось лишь после завершения лечения, что отражает эффективность введения BT062 (фиг. 25).

Повторная разовая доза относится к последовательности введений, при этом введение, следующее за введением, как считается, является независимым от этого предшествующего введения. Таким образом, в контексте настоящего изобретения, уровень иммуноконъюгата в крови индивида может считаться одинаковым после каждого введения. Каждый раз, когда вводится иммуноконъюгат, предполагается, что первоначально в крови присутствуют одинаковые уровни иммуноконъюгата.

Интервалы между введениями «разовых доз» повторных разовых доз устанавливают в соответствии с теоретически рассчитанным полупериодом существования изотипа иммуноконъюгата, в случае BT062, IgG4.

В общем, полупериод существования терапевтических антител зависит, главным образом, от характеристик антитела/его структурных особенностей (например, связывания с рецепторами Fc) и мишени. Например, аффинность связывания Fc-части с неонатальным рецептором FcRn оказывает влияние на полупериод существования. В результате связывания с FcRn в эндосомах антитело спасается от деградации в лизосомах и возвращается в кровоток, что пролонгирует полупериод существования. Для IgG4 сообщали о полупериоде существования, составляющем 15,6 (±4,5) дней (Alyanakian et al., 2003; Salfeld et al., 2007). В упоминаемом в настоящем документе исследовании была выбрана «повторная разовая доза», которая характеризуется трехнедельными интервалами между введениями. Однако в случае повторных разовых доз альтернативные интервалы составляют приблизительно три недели, приблизительно четыре недели, а также приблизительно пять или приблизительно шесть недель. Упоминание «приблизительно» в связи с тремя неделями относится к ±96 часам, а в связи с четырьмя - шестью неделями - к ±120 часам.

Успех терапии легко отследить с помощью известных методов и исследований. Дозы могут варьировать, среди прочего, в зависимости от того, вводятся ли они с превентивной или терапевтической целью, курса любой предшествующей терапии, истории болезни пациента, состояния болезни у пациента, опухолевой массы у пациента, генетической предрасположенности пациента, сопутствующих заболеваний у пациента, стадии заболевания после первого лечения и ответной реакции на нацеливающей агент/иммуноконъюгат, побочных эффектов, испытываемых пациентом, и усмотрения лечащего врача.

Преимущества схемы введения низких доз являются обширными. Однако, вероятно, самым значительным преимуществом является минимизация риска побочных эффектов. Несмотря на то, что иммуноконъюгаты обычно позволяют точно отличить клетки-мишени от нормальных клеток, что приводит к меньшим токсическим побочным эффектам, чем большинство обычных химиотерапевтических средств, многие иммуноконъюгаты все-таки не полностью свободны от побочных эффектов. Несмотря на превосходное нацеливание, представляющий интерес антиген обычно также экспрессирован на нераковых клетках, разрушение которых во время терапии может привести к неблагоприятным побочным эффектам. В случае CD138 антиген представлен, в частности, на эпителиальных клетках. Также иммуноконъюгат мог бы подвергаться процессированию внутри тела, которое не относится к процессированию в или у клетке-мишени, и некоторый процент эффекторной молекулы мог бы высвобождаться в местах, удаленных от клеток-мишеней, приводя к токсическим побочным эффектам.

Неожиданно, было установлено, что иммуноконъюгат по настоящему изобретению является эффективным в низких дозах при проявлении клинически допустимых токсичностей. Низкие дозы в настоящем изобретении относятся к дозам вплоть до 200 мг/м². В дозах вплоть до по крайней мере 120 мг/м², но в любом случае дозах, меньших 160 мг/м², исследуемый иммуноконъюгат по настоящему изобретению также продемонстрировал быстрый плазменный клиренс у человека.

В таблицах 7 и 8 представлен зарегистрированный клиренс.

Таблица 7
Концентрации в плазме после завершения инфузии и средние значения для эффективной Cmax BT062 в плазме, полученной у пациентов, получивших разовую дозу/повторную разовую дозу BT062 (первый и четвертый циклы). Повторное введение доз в циклах, составляющих 21 дней каждый. Значения Cmax были получены между 0 и 2 часами после инфузии. Циклы введения: цикл 1: день 1, цикл 2: день 22; цикл 3: день 43; цикл 4: день 64 и т.д. Доза ВТ062 (мг/м²) Уровень ВТ062 (мкг/мл) в плазме человека Теоретическая Cmax Среднее значение для эффективной Cmax (цикл 1) (наименьшее; наибольшее) Среднее значение для эффективной Cmax (цикл 4) (наименьшее; наибольшее); 10 7 1,11 данных нет в наличии 20 14 2,9
(1,66; 4,44) 7,06
(6,79; 7,34) 40 27 4,31
(0,97; 9,86) 2,51
(1,02; 3,68) 80 54 18,8
(13,4; 23,6) 14,2
(7,4; 21) 120 81 21,4
(15,1; 28,7) данных нет в наличии 160 109 81,2
(73,7; 85,5) 77,4 200 136 82,0
(68,0; 102,4) данных нет в наличии

Таблица 8
Средние значения для эффективной Cmax BT062 в плазме, полученной у пациентов, получивших разовую дозу/повторную разовую дозу BT062 (первый и четвертый циклы). Повторное введение доз в циклах, составляющих 21 дней каждый. Максимальные значения были получены в пределах первых 2 часов после инъекции. Значения Cmax были получены между 0 и 2 часами после инфузии. Эффективная Cmax указана в процентах от теоретически рассчитанной Cmax. Циклы введения: цикл 1: день 1, цикл 2: день 22; цикл 3: день 43; цикл 4: день 64 и т.д. Доза ВТ062 Уровень ВТ062 (мкг/мл) в плазме человека Теоретическая Эффективный Процент от Эффективный Процент от (мг/м²) Cmax Cmax
(цикл 1) теоретического Cmax (n) Cmax
(цикл 4) теоретического Cmax (n) 10 7 1,1 15% (3) n.a. n.a. 20 14 2,9 20% (4) 7,06 49% (2) 40 27 4,31 16% (3) 2,51 9% (3) 80 54 18,8 34% (3) 14,2 26% (2) 120 81 21,4 26,5 (3) n.a. n.a. 160 109 81,2 74,5% (4) 77,4 71%(1) 200 136 82,0 60% (3) n.a. n.a. n.a. данных нет в наличии
n: число пациентов

Теоретическую Cmax рассчитывали, исходя из следующих допускаемых параметров:

Площадь поверхности тела пациента - 1,9 м²

Вес пациента - 70 кг

Объем плазмы пациента - 40 мл/кг

(Вводимая доза×площадь поверхности)/вест тела

Объем плазмы

Хотя полупериод существования BT062 в плазме человека, подвергнутых лечению, оказался значительно меньше полупериода существования в плазме, зарегистрированного у яванских макак, (дни) и в плазме человека ex vivo (14 дней), иммуноконъюгат все-таки продемонстрировал эффективность у человека, даже при введениях только 20 мг/м². Этот факт говорит об увеличенной нацеленности на опухоль и связывании с опухолевыми клетками, что приводит к увеличенной эффективности. Это свойство иммуноконъюгатов настоящего изобретения, вероятно, является следствием изотипа IgG4 антитела/нацеливающей молекулы.

Как отмечено выше, необычный быстрый плазменных клиренс у повергнутых лечению пациентов с MM наблюдался на ранней стадии элиминации (во время инфузии и от приблизительно 0 до 2 часов после инфузии), за которой следовала обычно нормальная конечная стадия элиминации, на уровнях доз вплоть до 120 мг/м², тогда как в случае всех 4 пациентов, подвергнутых лечению в дозах 160 мг/м² и 200 мг/м² (3 пациента), наблюдался более типичный профиль клиренса, хотя клиренс был все-таки ниже теоретического значения Cmax. Кроме того, в схемах введения, например, 20, 40, 80 и 120 мг/м², которые продемонстрировали быстрый плазменный клиренс на ранней стадии элиминации, наблюдался не только быстрый плазменный клиренс на ранней стадии элиминации, но обнаруживалась ответная реакция (уменьшение M-белка в моче), в том числе ответные реакции, которые проявлялись в уменьшении M-белка в моче на более чем 50% после повторных разовых доз (фиг. 24).

На фиг. 17 иллюстрируется быстрый плазменный клиренс в случае доз, колеблющихся 40 мг/м² - 120 мг/м², в то время как в случае более высоких доз, иллюстрируемых в настоящем документе дозой, составляющей 160 мг/м², демонстрировался плазменный клиренс, более близкий к теоретическому значению. См. фиг. 27 для плазменного клиренса, наблюдаемого в составляющей 20 мг/м² дозе. На фиг. 18 сравнивается профиль BT062 в плазме с таковым у макак, подвергнутых лечению соизмеримыми дозами. Сравнение уточняет, что вывод о быстром плазменном клиренсе при низких дозах нельзя сделать на основе имеющихся моделей на животных, и, как представляется, является специфичным для людей. Фиг. 22 проясняет, что быстрый плазменный клиренс нельзя объяснить буферным эффектом, вызываемым растворимым CD138. На фиг. 19 представлены измеренные значения Cmax BT062 по сравнению с теоретическими значениями Cmax.

В более высоких дозах, например, 160 мг/м², которые являются, однако, относительно низкими дозами по сравнению со схемами введения других иммуноконъюгатов, профили клиренса на конечной стадии были ближе к нормальным, т.е. ближе к теоретическим значениям Cmax. Однако можно было наблюдать быстрое уменьшение FLC в сыворотке после лишь одного введения, которое проявлялось в частичной ответной реакции после 2-го, 3-го и 4-го введения (фиг. 26).

Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к схеме введения низких доз, такой как схема с использованием повторной разовой дозы, при этом наблюдается ответная реакция, предпочтительно, по крайней мере MR, предпочтительно, VGPR, CR, sCR или PR.

Настоящее изобретение также относится к схеме лечения с использованием низких доз, такой как схема введения повторных разовых доз, при этом стабилизация заболевания достигается в течение множества циклов лечения, длящихся более чем 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 или более недель.

Аналоги и производные

Квалифицированному в области терапевтических средств, таких как цитотоксические средства, специалисту будет совершенно понятно, что каждый из таких средств, которые описаны в данном описании, можно модифицировать так, что получаемое в результате соединение будет все еще сохранять специфичность и/или активность исходного соединения. Квалифицированному специалисту будет также понятно, что многие из этих соединений могут использоваться вместо терапевтических средств, описанных в данном описании. Поэтому терапевтические средства настоящего изобретения включают аналоги и производные описанных в настоящем документе соединений.

С целью иллюстрации применений иммуноконъюгатов теперь будут приведены и проиллюстрированы некоторые не ограничивающие практические применения.

Материалы и методы

Конструирование химерного антитела (cB-B4: nBT062)

B-B4

В этих экспериментах использовали антитело B-B4 мыши, охарактеризованное ранее (Wijdenes et al., Br J Haematol., 94 (1996), 318).

Клонирование и экспрессия B-B4 и cB-B4/nBT062

Стандартные методы рекомбинантных ДНК были выполнены, как подробно описано в учебниках, например в J. Sambrook; Molecular Cloning, A Laboratory Manual; 2nd Ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, США, или как рекомендовано в инструкции производителя в случаях применения наборов. Клонирование с использованием ПЦР и модификация мышиных вариабельных областей были выполнены с использованием стандартной методики для ПЦР. Были использованы праймеры, указанные в соответствующем разделе «Результы».

Экспрессия cB-B4/nBT062

Находящиеся в экспоненциальной фазе роста клетки COS, культивируемые в среде DMEM, дополненной 10% FCS, 580 мкг/мл L-глютамина, 50 Единицами/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина, собирали с помощью обработки трипсином и центрифугирования и промывали в PBS. Клетки ресуспендировали в PBS до конечной концентрации, составляющей 1×10⁷ клеток/мл. 700 мкл суспензии клеток COS переносили в кювету Gene Pulser и смешивали с ДНК векторов для экспрессии тяжелой цепи и легкой цепи каппа (10 мкг каждого или 13 мкг Supervector). Клетки подвергали электропорации при 1900 В, 25 мкФ, используя датчик импульсов Bio-Rad Gene Pulser. Трансформированные клетки культивировали в DMEM, пополненной 10% не содержащей гамма-глобулины FBS, 580 мкг/мл L-глютамина, 50 Единицами/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина, в течение 72 ч до сбора содержащих антитело супернатантов культур клеток.

ELISA с использованием захвата для определения уровней экспрессии cB-B4/nBT062

96-луночные планшеты покрывали 100 мкл аликвотами 0,4 мкг/мл козьего антитела против IgG человека, разведенного в PBS (4ºC, в течение ночи). Планшеты трижды промывали 200 мкл/лунку буфера для промывки (PBS+0,1% Tween-20). Лунки блокировали 0,2% BSA, 0,02% Tween-20 в PBS, перед добавлением 200 мкл супернатантов культур клеток, содержащих секретируемое антитело (инкубация при 37ºC в течение одного часа). Лунки промывали шесть раз буфером для промывки, до детектирования связанного антитела с помощью козьего антитела против легкой цепи каппа человека, конъюгированного с пероксидазой.

Очистка cB-B4/nBT062 из супернатантов культур клеток

Антитело cB-B4 очищали из супернатантов трансформированных клеток COS 7, используя набор Protein A ImmunoPure Plus (Pierce, Rockford, IL), в соответствии с рекомендациями производителя.

Анализ связывания cB-B4 и конкурентный анализ

Анализы связывающей активности B-B4 и cB-B4 по отношению к CD138 выполняли, используя набор для sCD138 Diaclone (Besancon, Франция), в соответствии с рекомендациями производителя, с учетом изменений, описанных в разделе «Результаты».

Приготовление РНК и синтез кДНК

Клетки гибридомы, продуцирующей B-B4, выращивали и подвергали обработке, используя набор Qiagen Midi (Hilden, Германия) для выделения РНК, следуя протоколу производителя. Приблизительно 5 мкг РНК B-B4 подвергали обратной транскрипции для получения кДНК для B-B4, используя набор для синтеза первой цепи Amersham Biosciences (Piscataway, NJ), следуя протоколу производителя.

Клонирование кДНК для иммуноглобулина B-B4

кДНК для тяжелой цепи иммуноглобулина (IgH) амплифицировали с помощью ПЦР, используя специфичный для IgH праймер MHV7 (5'-ATGGGCATCAAGATGGAGTCACAGACCCAGG-3') [SEQ ID NO:3] и специфичный для константной области IgG1 праймер MHCG1 (5'-CAGTGGATAGACAGATGGGGG-3') [SEQ ID NO:4]. Аналогично, кДНК для легкой цепи иммуноглобулина (IgL) амплифицировали с использованием трех различных, специфичных для Igκ праймеров MKV2 (5'-ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTG-3') [SEQ ID NO:5], MKV4 (5'-ATGAGGGCCCCTGCTCAGTTTTTTGGCTTCTTG-3') [SEQ ID NO:6] и MKV9 (5'-ATGGTATCCACACCTCAGTTCCTTG-3') [SEQ ID NO:7], каждый в комбинации с праймером MKC (5'-ACTGGATGGTGGGAAGATGG-3') [SEQ ID NO:8]. Все продукты амплификации непосредственно лигировали с вектором pCR2.1-TOPO, используя набор для клонирования TOPO-TA (Invitrogen, Carlsbad, CA) в соответствии с инструкцией производителя.

Бактерии E. coli TOP10 (Invitrogen), трансформированные лигированными конструкциями на основе вектора pCR2.1, отбирали на чашках с агаром с LB-ампициллином-Xgal. Мелкомасштабные культуры засевали одиночными белыми колониями, выращивали в течение ночи, и плазмиды выделяли, используя набор QIAprep Spin Miniprep в соответствии с инструкцией производителя.

Определение последовательности кДНК

Плазмиды секвенировали, используя набор BigDye Termination v3.O Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (ABI, Foster City, CA). Каждую отобранную плазмиду секвенировали в обоих направлениях с использованием 1210 и 1233 праймеров, циклируемых в устройстве для ПЦР GeneAmp9600. Электрофоретический анализ последовательности выполняли в капиллярном секвенаторе ABI.

Полный цикл ОТ-ПЦР, клонирования и анализа последовательности ДНК был повторен для получения трех полностью независимых наборов информации, касающейся последовательности каждой цепи иммуноглобулина.

Последовательность ДНК для Vκ В-В4

Синтез первой цепи выполняли в трех независимых реакциях. Продукты ПЦР, созданные с использованием праймеров MKC и MKV2 (последовательностей, приведенных выше), были лигированы в вектор pCR2.1-TOPO в соответствии с инструкцией производителя. Клоны от каждой независимой группы реакций ОТ-ПЦР секвенировали в обоих направлениях. Последовательность продукта, затравкой для которого служил MKV2, была весьма схожа со стерильными транскриптами каппа, берущими начало от партнера по слиянию с миеломными клетками, такого как MOPC-21, SP2 и Ag8 (Carroll et al., Mol Immunol., 25 (1988), 991; Cabilly et al., Gene, 40 (1985); 157), и была поэтому проигнорирована.

Продукты ПЦР, полученные, используя MKC с праймерами MKV4 и MKV9, были похожи друг на друга и отличались лишь в положениях колебаний нуклеотидов в кодонах в пределах специфичного для лидерной последовательности праймера.

Последовательность ДНК для VH В-В4

Синтез первой цепи выполняли в трех независимых реакциях, и продукты ПЦР клонировали и определяли последовательность каждого продукта синтеза 1-й цепи. Секвенировали пять клонов от каждой реакции синтеза 1-й цепи.

Конструирование векторов для экспрессии химерного cB-B4

Конструирование векторов для экспрессии химерного антитела включает добавление подходящей лидерной последовательности к VH и Vκ, которой предшествовал рестрикционный сайт для BamHI и последовательность Kozak. Консенсусная последовательность Kozak важна для эффективной трансляции последовательности вариабельной области. Она определяет правильный кодон AUG, с которого рибосома может начать трансляцию, и одним самым важным основанием является аденин (или менее, предпочтительно, гуанин) в положении -3, 5' от инициирующего кодона AUG. Лидерную последовательность в виде самой схожей последовательности выбирают в базе данных Kabat (Kabat et al., NIH National Technical Information Service, 1991). Эти добавления закодированы внутри прямых (For) праймеров (оба из которых имеют последовательность 5'-AGAGAAGCTTGCCGCCACCATGATTGCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCC-3' [SEQ ID NO:9]; рестрикционный сайт подчеркнут; последовательность Kozak выделена жирным шрифтом). Кроме того, конструирование векторов для экспрессии химерного антитела включает встраивание 5'-фрагмента константной области гамма-1 человека, вплоть до природного рестрикционного сайта для ApaI, граничащего с 3' концом J-области B-B4, а в случае легкой цепи - добавление донорного сайта сплайсинга и рестрикционного сайта для HindIII. Последовательность донорного сайта сплайсинга важна для правильного в рамке считывания присоединения вариабельной области к соответствующей ей константной области, благодаря исключению интрона V:C при сплайсинге. Интрон каппа + CK кодируются в экспрессионной конструкции 3' от последовательности для Vκ В-В4. Так же CH гамма-4 кодируется в экспрессионной конструкции 3' от последовательности для VH В-В4.

Гены VH и Vκ В-В4 сначала тщательно анализировали для идентификации любых нежелательных донорных сайтов сплайсинга, акцепторных сайтов сплайсинга, последовательностей Kozak и на присутствие любых дополнительных рестрикционных сайтов для субклонирования, которые могли бы позже внести помехи в субклонирование и/или экспрессию функционального целого антитела. В последовательности Vκ был обнаружен нежелательный сайт для HindIII, который в силу необходимости был удален с помощью сайт-направленного мутагенеза посредством ПЦР без изменения аминокислотной последовательности. Для этих реакций были использованы олигонуклеотидные праймеры BT03 (5'-CAACAGTATAGTAAGCTCCCTCGGACGTTCGGTGG-S') [SEQ ID NO:10] и BT04 (5'-CCACCGAACGTCCGAGGGAGCTTACTATACTGTTG-S') [SEQ ID NO:11], и мутагенез был выполнен в соответствии с протоколом для набора Stratagene (La JoIIa, CA) Quickchange Mutagenesis Kit.

Праймеры для химеризации цепи каппа

Определенную лидерную последовательность для Vκ B-B4, независимую от последовательности праймера для ПЦР, совмещали с лидерными последовательностями мыши из базы данных Kabat. Ближайшим аналогом лидерной последовательности для VH В-В4 был VK-10 ARS-A (Sanz et al., PNAS, 84 (1987), 1085). Эта лидерная последовательность будет правильно разрезаться по предсказаниям с использованием алгоритма SignaIP (Nielsen et al., Protein Eng, 10 (1997); 1). Праймеры CBB4KFor (см. выше) и g2258 (5'-CGCGGGATCCACTCACGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCCTCC-3' [SEQ ID NO:12]; рестрикционный сайт подчеркнут) были сконструированы для создания продукта ПЦР, содержащего эту полную лидерную последовательность, область Vκ B-B4 и рестрикционные сайты для HindIII и BamHI на концах, для клонирования в вектор экспрессии pKN100. Прямой праймер, CBB4K, вводит рестрикционный сайт для HindIII, сайт инициации трансляции Kozak и лидерную последовательность VK-10 ARS-A. Обратный праймер g2258 вводит донорный сайт сплайсинга и рестрикционный сайт для BamHI. Результирующий фрагмент клонировали в рестрикционные сайты HindIII/BamHI pKN100.

Праймеры для химеризации тяжелой цепи

Определенную лидерную последовательность VH В-В4, независимую от последовательности праймера для ПЦР, совмещали с лидерными последовательностями мыши из базы данных Kabat. Ближайшим аналогом лидерной последовательности для Vκ B-B4 был VH17-1A (Sun et al., PNAS, 84 (1987), 214). Эта лидерная последовательность будет правильно разрезаться по предсказаниям с использованием алгоритма SignaIP. Праймеры cBB4HFor (см. выше) и g22949 (5'-CGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGACTGAGGTTCC-3' [SEQ ID NO:13]; рестрикционный сайт подчеркнут) были сконструированы для создания продукта ПЦР, содержащего лидерную последовательность VH17-1A, VH-область В-В4 и рестрикционные сайты для HindIII и ApaI на концах, для клонирования в вектор экспрессии pG4D200. Прямой праймер cBBHFor вводит рестрикционный сайт для HindIII, сайт инициации трансляции Kozak и лидерную последовательность VH17-1A. Обратный праймер g22949 вводит 5'-конец С-области гамма-4 и природный рестрикционный сайт для ApaI. Результирующий фрагмент клонировали в рестрикционные сайты HindIII/ApaI pG4D200, получая в результате вектор pG4D200cBB4.

Продукция антитела cBB4

Оттаивали один флакон с клетками COS 7, и их выращивали в среде DMEM, дополненной 10% фетальной сыворотки Clone I и антибиотиками. Спустя одну неделю клетки (0,7 мл в концентрации 10⁷ клеток/мл) подвергали электропорации с использованием pG4D200cBB4 плюс pKN100cBB4 (10 мкг каждой ДНК) или без использования ДНК. Клетки засевали в 8 мл среды для роста и инкубировали в течение 4 дней. Электропорацию повторяли несколько раз.

Детектирование химерного антитела

Сэндвич-ELISA использовали для определения концентраций антитела в супернатантах COS 7. Транзиторно трансформированные клетки COS 7 секретировали приблизительно 6956 нг/мл антитела (не представленные данные).

Связывающая активность cB-B4

Для оценки связывающей активности cB-B4 в супернатантах культур клеток COS 7 использовали набор для sCD138 Diaclone, твердофазный сэндвич-ELISA. Лунки предоставленного титрационного микропланшета покрывали моноклональным антителом, специфичным для sCD138. Во время первой инкубации sCD138 и биотинилированное антитело B-B4 (био-B-B4) одновременно инкубировали вместе с рядом разведений немеченого исследуемого антитела (B-B4 или cB-B4).

Концентрации био-B-B4 в этом анализе были уменьшены для достижения конкуренции с низкими концентрациями немеченого антитела (концентрация cB-B4 в супернатантах культур клеток COS 7 были иначе слишком низкими для достижения достаточной конкуренции). Результаты этого анализа показали, что оба антитела обладают одинаковой специфичность в отношении CD138 (не представленные данные).

Очистка cB-B4

Химерное B-B4 очищали из супернатантов культур клеток COS 7, используя набор Protein A ImmunoPure Plus (Pierce), в соответствии с рекомендацией производителя (не представленные данные).

Определение K _D : сравнение nBT062/BB4

Очистка растворимого CD138

Растворимый антиген CD138 из супернатанта культуры клеток U-266 очищали с помощью FPLC, используя 1 мл колонку «HiTrap NHS-activated HP», с которой было связано B-B4. Супернатант культуры клеток загружали в буфере PBS pH 7,4 в колонку, и позже антиген CD138 подвергали элюированию 50 мМ триэтиламином pH 11 с использованием 2-мл фракций. Подвергшийся элюированию CD138 сразу же нейтрализовали с помощью 375 мкл 1 M Трис-HCl, pH 3 для предотвращения структурных и/или функциональных нарушений.

Биотинилирование CD138

Сульфо-NHS-LC (Pierce) использовали для мечения CD138. NHS-активированные биотины эффективно реагируют с первичными аминогруппами, подобными остаткам лизина, в буферах с pH 7-9 с образованием стабильных амидных связей.

Для биотинилирования CD138 50 мкл CD138 обессоливали, используя центрифужную колонку для обессоливания белков (Pierce). Реагент для биотинилирования (EZ-Link Sulfo NHS-LC-Biotin, Pierce) растворяли в охлажденной на льду деионизированной H₂O до конечной концентрации, составляющей 0,5 мг/мл. Реагент для биотинилирования и раствор реагента для захвата смешивали, получая 12-кратный молярный избыток реагента для биотинилирования по сравнению с реагентом для захвата (50 пмоль CD138 на 600 пмоль реагента для биотинилирования), и инкубировали 1 ч при комнатной температуре при легком встряхивании пробирки. Несвязанный реагент для биотинилирования удаляли с использованием колонок для обессоливания белков.

Иммобилизация bCD138

Сенсорный чип (SENSOR CHIP SA, BIACORE AB), используемый в анализе BIACORE, предназначен для связывания биотинилированных молекул в случае исследования взаимодействий в системах BIACORE. Поверхность состоит из матрицы в виде карбоксиметилированного декстрана, на которой предварительно иммобилизован стрептавидин и которая готова к высокоаффинному захвату биотинилированных лигандов. Иммобилизацию bCD138 на сенсорном чипе SA осуществляли, используя скорость подачи, составляющую 10 мкл/мин, при ручной инъекции. Поверхность чипа обрабатывали с использованием трех последовательных 1-минутных инъекций 1 M NaCl в 50 мМ NaOH. Затем в течение 1 минуты осуществляли инъекцию биотинилированного CD138.

Определение K _D различных антител с использованием BIACORE

В программном обеспечении BIACORE C используются заранее заданные маски, так называемые «Мастера» для различных экспериментов, в которых лишь определенные установки могут быть изменены. Поскольку BIACORE C был первоначально разработан для определения концентраций, нет мастера, предназначенного для выполнения определений аффинности. Однако с помощью соответствующих установок мастер для «неспецифического связывания» мог использоваться для определения констант степеней аффинности и поэтому использовался для определения K_D. Используя этот мастер, измерения осуществляли в двух проточных ячейках, и стадия диссоциации посредством выполнения «Регенерации 1» с использованием подвижного буфера для BIACORE была установлена на 90 сек. «Регенерацию 2», которая равнозначна действительной регенерации, выполняли с помощью 10 мМ глицин-HCl pH 2,5. После этой стадии лиганд CD138 был снова в своем способном к связыванию состоянии. Во время всей процедуры HBS-EP использовался в качестве подвижного буфера и буфера для разведения. Для определения связывания различных антител (~150 кДа) с CD138 анализировали ассоциацию и диссоциацию при различных концентрациях (100, 50, 25, 12,5, 6,25 и 3,13 нМ). Константы диссоциативного равновесия определяли посредством расчета констант скоростей ka и kd. Потом рассчитывали значения K_D аналитов по отношению kd и ka с использованием программного обеспечения BIAevaluation. Результаты представлены в таблице 9.

Таблица 9
Сравнительный анализ значений K_D nBT062 и B-B4. Приведены среднеквадратические отклонения для средних значений K_D. Антитело Аффинность K_D (нМ) Среднее значение K_D (нМ) nBT062 1,4
1,4
1,5 1,4±0,06 B-B4 1,7
1,7
1,6 1,6±0,06 nBT062-SPDB-DM4 1,9
1,9
1,9 1,9±0,00 B-B4-SPP-DW1 2,6
2,7
2,6 2,6±0,06

Обсуждение

Средние значения K_D для каждого антитела рассчитывали на основе трех независимых экспериментов. Результаты показывают, что во всех определениях nBT062 демонстрирует слегка меньшие значения K_D по сравнению с B-B4 (средние значения K_D составляли 1,4 и 1,6 нМ, соответственно).

Приготовление иммуноконъюгатов

nBT062-DM1 и huC242-DM1

Содержащий тиольные группы майтансиноид DM1 синтезировали из продукта брожения, вызванного микробами, ансамитоцина P-3, как описано ранее Chari (Chari et al., Cancer Res. 1 (1992), 127). Приготовление гуманизированного C242 (huC242) (Roguska et al., PNAS, 91 (1994), 969) было описано ранее. Конъюгаты антитело-лекарственное средство готовили, как описано ранее (Liu et al., PNAS, 93 (1996), 8618). В среднем 3,5 молекулы DM1 было связано с каждой молекулой антитела.

nBT062-DM4

BT062 представляет собой конъюгат антитело-лекарственное средство, состоящий из цитотоксического средства майтансиноида, DM4, связанного благодаря дисульфидным связям посредством линкера с химеризированным моноклональным антителом nBT062. Майтансиноиды являются антимитотическими веществами, которые ингибируют полимеризацию тубулина и сборку микротрубочек (Remillard et al., Science 189 (1977), 1002). Химическая структура и схематическое представление BT062 (nBT062-DM4) представлены на фиг. 1 и 2.

Синтез DM4

DM4 готовят на основе широко известного производного майтансинола (Kupchan et al., J. Med. Chem., 21 (1978), 31). Майтансинол готовят посредством восстановительного расщепления сложноэфирной составляющей продукта брожения, вызванного микробами, ансамитоцина P3, гидридом лития триметоксиалюминием (см. фиг. 3).

DM4 синтезируют посредством ацилирования майтансинола с помощью N-метил-N-(4-метилдитиопентаноил)-L-аланина (боковой цепи DM4) в присутствии дициклогексилкарбодиимида (DCC) и хлорида цинка для получения дисульфидсодержащего майтансиноида DM4-SMe. DM4-SMe восстанавливают с помощью дитиотрейтола (DTT) для получения желаемого содержащего тиольные группы майтансиноида DM4 (см. фиг. 4 ради схемы процесса синтеза DM4).

Иммуноконъюгат BT062

Процедура для приготовления nBT062-DM4 очерчена на фиг. 5. Антитело nBT062 модифицируют с помощью N-сукцинимидил-4-(2-пирилдитио)бутирата (линкера SPDB) для введения дитиопиридильных групп. DM4 смешивают с модифицированным антителом в концентрации, превышающей таковую эквивалентов дитиопиридильных групп. Конъюгат BT062 образуется в результате реакции дисудьфидного обмена между тиольной группой DM4 и дитиопиридильными группами, введенными в антитело посредством линкера. Очистка с помощью хроматографии и диафильтрации удаляет низкомолекулярные вещества, участвующие в реакции (DM4), и продукты реакции (тиопиридин), а также агрегаты конъюгированного антитела, для получения не расфасованной массы лекарственного вещества.

Анализ с использованием FACS и анализы цитотоксичности с использованием WST

Анализ с использованием FACS

Клетки OPM-2 являются линиями лейкозных плазматических клеток, демонстрирующими высокую экспрессию CD138. Клетки OPM-2 инкубировали с nBT062, nBT062-SPDB-DM4, nBT062-SPP-DM1 или nBT062-SMCC-DM1 при различных концентрациях (указанных на фиг. 6). Клетки отмывали и связанные с CD138 антитела или конъюгаты детектировали, используя флуоресцентно меченное второе антитело в анализе с использованием FACS. Строили график зависимости средней флуоресценции, измеренной в этих экспериментах, от концентрации антитела.

Анализ жизнеспособности клеток

CD138⁺ клетки MOLP-8 засевали в планшеты с плоским дном в количестве 3000 клеток/лунку. Контрольные CD138^- клетки BJAB засевали в количестве 1000 клеток/лунку. Клетки обрабатывали nBT062-SPDB-DM4, nBT062-SPP-DM1 или nBT062-SMCC-DM1 в различных концентрациях (указанных на фиг. 7) в течение пяти дней. Реагент WST (водорастворимую тетразолиевую соль, ROCHE) добавляли для определения жизнеспособности клеток в соответствии с инструкцией производителя (ROCHE). Реагент инкубировали в течение 7,5 ч в случае клеток MOLP-8 и в течение 2 ч в случае клеток BJAB. Долю находящихся в живых клеток рассчитывали на основе оптических плотностей, измеренных в считывающем устройстве для микропланшетов, используя стандартные процедуры.

Обсуждение

Связывание nBT062-SPDB-DM4, nBT062-SPP-DM1, nBT062-SMCC-DM1 или nBT062 анализировали с использованием FACS. CD138⁺ OPM-2 в качестве клеток-мишеней инкубировали с nBT062 или иммуноконъюгатами, и связанными с клетками молекулы детектировали, используя флуоресцентно меченное второе антитело. На фиг. 6 представлен график зависимости средней флуоресценции в качестве показателя количества связанного с клетками антитела от концентраций различных антител или конъюгатов. Результаты показывают, что nBT062-SPDB-DM4, nBT062-SPP-DM1 и nBT062-SMCC-DM1 проявляют очень схожие характеристики связывания. Кроме того, результаты убедительно говорят о том, что на характеристики связывания неконъюгированного антитела не влияют конъюгированные токсины.

В анализах жизнеспособности клеток была исследована цитотоксическая активность антитела по отношению к клеткам-мишеням CD138⁺ MOLP-8 и по отношению к контрольным клеткам В-лимфобластомы CD138^- BJAB. Обе линии клеток засевали в планшеты с плоским дном и инкубировали с увеличивающимися концентрациями иммуноконъюгатов. Неконъюгированное антитело использовали в качестве контроля. Цитотоксическую активность исследовали через пять дней после добавления иммуноконъюгатов с помощью использования реагента WST с целью определения жизнеспособности клеток. На фиг. 7 (A)-(C) представлен график зависимости доли находящихся в живых клеток относительно контрольных клеток, обработанных контролем в виде носителя, от увеличивающихся концентраций иммуноконъюгатов. Результаты показывают, что цитотоксические активности nBT062-SPDB-DM4, nBT062-SPP-DM1 и nBT062-SMCC-DM1 по отношению к клеткам MOLP-8 являются очень схожими. Как и ожидалось, иммуноконъюгаты не уничтожали контрольные CD138^- клетки BJAB, что означает, что все иммуноконъюгаты действуют через клеточноспецифическое связывание с CD138. В экспериментах конкурентного связывания, в которых клетки MOLP-8 предварительно инкубировали с молярным избытком неконъюгированного nBT062, предварительная инкубация существенно блокировала цитотоксичность nBT062-SPDB-DM4, обеспечивая дальнейшее доказательство того, что иммуноконъюгаты уничтожают клетки благодаря специфическому связыванию с CD138 на клеточной поверхности (фиг. 7 (D)).

Эксперименты на мышах с использованием ксенотрансплантатов

Для оценки значимости нацеливания на CD138 для противоопухолевой активности конъюгатов антитело-майтансиноид, содержащих человеческий/мышиный химерный вариант антитела B-B4, nBT062, были выполнены эксперименты на мышах с использованием ксенотрансплантатов. Были приготовлены два варианта конъюгатов nBT062-майтансиноид, которые могут отличаться по химической стойкости их дисульфидных связей (nBT062-SPP-DM1 и nBT062-SPDB-DM4). Противоопухолевую активность этих конъюгатов антитело-лекарственное средство сравнивали с активностью конъюгата B-B4-SPP-DM1 (содержащего родительское антитело vsib), а также неконъюгированного свободного майтансиноида (DM4), природного немодифицированнного антитела nBT062 и ненацеливающего (нерелевантного) конъюгата IgG1-майтансиноид. Конъюгаты оценивали в модели с использованием ксенотрансплантатов CD138-положительных клеток множественной миеломы человека (MOLP-8) на мышах с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID).

У этих мышей (самок мышей с SCID CB.17) подкожные опухоли порождали посредством инокуляции суспензии клеток MOLP-8. Лечение с помощью однократной внутривенной болюсной инъекции проводили, когда объемы опухолей достигали среднего значения 113 мм³. Дважды в неделю отслеживали изменения объема опухоли и веса тела. Эксперименты проводили в течение 68 дней после инокуляции опухолевых клеток.

Эксперименты А на мышах с использованием ксенотрансплантатов

Мыши

Самок мышей с SCID CB.17 возрастом пять недель получали из Charles River Laboratories.

Линии опухолевых клеток человека

MOLP-8, линия клеток множественной миеломы человека, была доставлена из ATCC. Клетки MOLP-8, которые экспрессируют антиген CD138 на своей клеточной поверхности и образуют ксенотрансплантированные опухоли у мышей с SCID, поддерживали в среде RPM1-1640, дополненной 4 мМ L-глютамином (Biowhittaker, Walkersville, MD), 10% фетальной бычьей сыворотки (Hyclone, Logan, Utah) и 1% стрептомицина/пенициллина, при 37ºC в увлажненной атмосфере, которая содержала 5% CO₂.

ЧАСТЬ I

Рост опухолей у мышей

Каждой мыши инокулировали 1×10⁷ клеток MOLP-8 подкожно в зону под правым плечом. Общий объем, в котором отношение бессывороточной среды к матригелю (BD Bioscience, Bedford, MA) составляло 1/1 (в объемом отношении), составлял 0,2 мл на каждую мышь. До лечения ксенотрансплантированные опухоли контролировали ежедневно, и им позволяли укорениться. Объем опухоли достигал приблизительно 113 мм³ через приблизительно 11 после инокуляции опухолевых клеток. Доля мышей с SCID CB.17, акцептировавших опухоль, составляла 100%.

Спустя одиннадцать дней после инокуляции опухоли было отобрано 42 мышей на основе объемов опухолей и веса тела. Объем опухоли находится в диапазоне 68,2-135,9 мм³. Сорок две мыши были случайным образом разделены на семь групп (A-G), включающих каждая шесть мышей, на основе объема опухоли.

Каждая из шести мышей группы A получила 200 мкл PBS в качестве являющегося носителем контроля. Каждая из шести мышей группы B получила 13,8 мг/кг неконъюгированного антитела nBT062. Эта доза эквивалента количеству являющего антителом nBT062 компонента в 250 мкг/кг связанного с антителом майтансиноида. Отношение молекулярной массы майтансиноида к таковой антитела nBT062 в молекуле конъюгата составляет приблизительно 1/55. Каждая мышь группы C получила 250 мкг/кг DM4. Каждая мышь группы D получила 250 мкг/кг huC242-DM4. Каждая мышь в группах E, F и G получила 250 мкг/кг nBT062-SPDB-DM4, B-B4-SPP-DM1 и nBT062-SPP-DM1, соответственно.

Все агенты вводили внутривенно в виде однократной болюсной инъекции через латеральную хвостовую вену с помощью 1-мл шприца, оснащенного иглой размером 27, ½ дюйма. Перед введением маточные растворы антитела nBT062, nBT062-SPDB-DM4 и nBT062-SPP-DM1 разбавляли стерильным PBS до концентраций, составляющих 2 мг/мл, 28,1 мкг/мл и 28,1 мкг/мл, соответственно, так что инъецируемый объем в случае каждой мыши находился между 120 и 220 мкл.

ЧАСТЬ II

Во второй группе экспериментов клетки MOLP-8 (1,5×10⁷ клеток на каждую мышь), суспендированные в 50:50 смеси бессывороточной среды и матригеля, инъецировали подкожно в зону под правым плечом в объеме 100 мкл. Объемы опухолей достигали приблизительно 80 мм³ в день 11, а среднее значение у контролей составляло приблизительно 750 мм³ в день 25 после инокуляции клеток. Период времени до увеличения вдвое опухоли по оценкам составлял 4,58 дней. Каждая мышь контрольной группы (n=6) получила 0,2 мл стерильного PBS, вводимого в латеральную хвостовую вену (в.в.) в виде болюсной инъекции. Все дозы для лечения основывались на конъюгированном майтансиноиде. Девять групп (n=6) подвергали лечению с помощью однократной внутривенной инъекции nBT062-SMCC-DM1, nBT062-SPDB-DM4 или nBT062-SPP-DM1, каждый в дозах 450, 250 и 100 мкг/кг. Дополнительная группа (n=6) получила 250 мкг/кг nBT062-SMCC-DM1 при повторном введении доз (еженедельно в течение пяти недель). Мышей разделяли в случайном порядке на одиннадцать групп (n=6) по объему опухоли, используя программу LabCat. Объемы опухолей колебались 40,0-152,5 мм³. Мышам вводили дозы на основе индивидуального веса тела.

Размер опухоли измеряли дважды в неделю в трех измерениях, используя систему LabCat (Tumor Measurement and Tracking, Innovative Programming Associated, Inc., Princeton, NJ). Объем опухоли в мм³ рассчитывали, используя методику, описанную Tomayko et al. (Tomayko et al., 1989):

Объем=длина×ширину×высоту×1/2

Log₁₀ гибели клеток рассчитывали по формуле, описанной Bissery et al. (Bissery et al., 1991).

Log₁₀ гибели клеток=(T-C)/T_d×3,32

где (T-C), или задержка роста опухоли, является средним временем в днях, требуемым для достижения заданного размера (600 мм³) опухолями подвергнутой лечению группы (T) и контрольной группы (C). T_d является временем, требуемым для увеличения вдвое среднего объема опухоли у контрольных мышей, а 3,32 является числом делений клеток на log клеточного роста.

Результаты

Рост опухоли у отдельных мышей представлен на фиг. 8 и 9. Средний (± среднеквадратическое отклонение) рост опухоли для каждой группы представлен на фиг. 10.

По сравнению с ростом опухоли у подвергнутых лечению PBS животных лечение антителом nBT062, неконъюгированным свободным DM4 или нерелевантным ненацеливающим конъюгатом huC242-DM4 не приводило к какому-либо значимому подавлению роста опухоли.

Все три нацеливающих на CD138 конъюгата, nBT062-SPDB-DM4, B-B4-SPP-DM1 и nBT062-SPP-DM1, в дозе, составляющей 250 мкг/кг, приводили к заметной задержке роста опухоли. Основываясь на средних объемах опухолей, измеренных в подвергнутых лечению группах, содержащий DM4 конъюгат nBT062-SPDB-DM4 был самым активным конъюгатом, в то время как конъюгат nBT062-SPP-DM1 продемонстрировал слегка увеличенную активность по сравнению с его мышиным аналогом B-B4-SPP-DM1 (фиг. 10). Результаты, полученные для отдельных мышей, показывают, кроме того, что противоопухолевая активность, достигаемая с помощью B-B4-SPP-DM1, является более неоднородной и поэтому менее предсказуемой, чем этот показатель у мышей, подвергнутых лечению nBT062-SPP-DM1. Исходя из однородности противоопухолевой активности, другой конъюгат, в котором используется nBT062 в качестве нацеливающего антитела, nBT062-SPDB-DM4 вел себя схоже с nBT062-SPP-DM1.

Снижение веса тела не наблюдали в любой подвергнутой лечению группе, что говорит о том, что лечения хорошо переносились.

Обсуждение

Результаты исследования трех нацеливающих на CD138 конъюгатов у экспериментальных животных показывают значимость нацеленной доставки для противораковой активности. В то время как содержащие майтансиноид конъюгаты человеческого/мышиного химерного антитела nBT062 и мышиного антитела B-B4 демонстрируют значительную активность, определенную по log гибели клеток, на рост опухоли не оказывало значительное влияние лечение неконъюгированным DM4, немодифицированным природным антителом huBT062 или ненацеливающим контрольным конъюгатом (huC242-DM4).

Иммуноконъюгат, приготовленный на основе человеческого/мышиного химерного антитела, nBT062-SPP-DM1, обеспечил немного более высокую противоопухолевую активность, чем конъюгат, приготовленный на основе его мышиного аналога, B-B4-SPP-DM1. Кроме того, лечение nBT062-SPP-DM1 и nBT062-SPDB-DM4 приводило к более однородным ответным реакциям у отдельных мышей, чем лечение B-B4-SPP-DM1. Большая вариация связывания в случае B-B4-SPP-DM1 служит объяснением того, что измерение среднего (± среднеквадратическое отклонение) объема опухолей- ксенотрансплантатов клеток множественной миеломы человека MOLP-8 у мышей с SCID CB.17 в динамике времени (дней) после инокуляции фактически обусловило относительно большие результирующие значения для B-B4-SPP-DM1, чем для nBT062-SPP-DM1 (не представленные данные). Это свойство иммуноконъюгатов, в которых используется nBT062 в качестве нацеливающего антитела, представляется полезным особенно в случае терапевтического применения конъюгатов.

Наконец, самым сильным из содержащих майтансиноид конъюгатов, после однократного внутривенного введения, в моделях с использованием ксенотрансплантатов клеток MOLP-8 на мышах с SCID был nBT062-SPDB-DM4.

Уничтожение свидетеля (анализ жизнеспособности клеток)

CD138⁺ клетки OPM2 и CD138^- клетки Namalwa засевали в планшеты с круглым дном, либо в отдельные лунки, либо в виде сокультуры. Клетки обрабатывали nBT062-SPDB-DM4 в концентрациях, колеблющихся 1×10^-8 - 1×10^-9 М. Долю находящихся в живых клеток определяли, используя реагент WST (водорастворимую тетразолиевую соль, ROCHE) в соответствии с инструкцией производителя (ROCHE). Долю находящихся в живых клеток рассчитывали на основе оптических плотностей, измеренных в считывающем устройстве для микропланшетов, используя стандартные процедуры.

Обсуждение

Уничтожение свидетеля - не являющихся мишенями клеток в непосредственной близости (присутствующих в лунках с круглым дном) от клеток множественной миеломы при лечении nBT062-SPDB-DM4 анализировали в in vitro исследовании, в котором CD138-положительные клетки OPM2 культивировали в сокультуре с CD138-отрицательными клетками Namawla (фиг. 13). Как правило, в то время как CD138-положительные клетки эффективно уничтожались с помощью nBT062-SPDB-DM4, этот конъюгат не оказывал воздействие на CD138-отрицательные клетки. При сокультивировании в лунках с круглым дном, однако, nBT062-SPDB-DM4 также уничтожал отрицательные по антигену клетки в непосредственной близости от положительных по антигену клеток (эффект, который часто называют уничтожением свидетеля). Kovtun et al. (2006) говорили, что уничтожение свидетеля, опосредуемое содержащими майтансиноид конъюгатами, происходит лишь в непосредственной близости от положительных по антигену клеток. Kovtun et al. (2006), публикация которых включена в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме, также говорят о значимости линкера иммуноконъюгата. In vivo уничтожение свидетеля может вносить вклад в 1) уничтожение опухолевых клеток, которые неоднородно экспрессируют CD138, 2) разрушение микросреды в опухоли посредством уничтожения клеток стромы опухоли и 3) предотвращение отбора CD138-отрицательных, резистентных к nBT062-SPDB-DM4 клеток.

Эффект свидетеля имеет особое значение, если активность иммуноконъюгата ослабляет являющийся мишенью антиген, который экспрессируется в опухолях неоднородно. В этом случае конкретная клетка опухоли экспрессирует, если вообще экспрессирует, антиген не в том количестве, которое могло бы сделать возможным эффективное прямое нацеливание и уничтожение указанной клетки соответствующим иммуноконъюгатом. Противоопухолевая эффективность nBT062-SPDB-DM4 в отношении CD138-отрицательных клеток в сокультуре с CD138-положительными клетками сделала ясным, что присутствие клеток-мишеней оказывает, в определенных случаях, влияние на цитотоксическую активность nBT062-SPDB-DM4 по отношению к не являющимся мишенями клеткам.

Эксперименты В на мышах с использованием ксенотрансплантатов

В этой группе экспериментов восьмидесяти пяти мышам инокулировали клетки MOLP-8 (1,5×10⁷ клеток/мышь) подкожно в правое плечо. Доля мышей, акцептировавших опухоль, составляла 100%. Шестьдесят шесть мышей с SCID, имеющих большие опухоли MOLP-8 со средним объемом опухоли, составляющем приблизительно 80 мм³, разделяли в случайном порядке на одиннадцать групп лечения (n=6). Мышей лечили с помощью однократной дозы одного из трех конъюгатов (nBT062-SMCC-DM1, nBT062-SPDB-DM4 или nBT062-SPP-DM1). Дополнительная группа получила пять еженедельных доз nBT062-SMCC-DM1, а контрольная группа получила однократную дозу PBS. Средние объемы опухолей представлены на фиг. 11A. Эффект дозы устанавливали для каждого конъюгата. Средний объем опухоли, составляющий 750 мм³ у подвергнутых лечению PBS животных, достигался в день 25. Время до увеличения опухоли вдвое, определенное с помощью наилучшей подгонки к линейной кривой регрессии на линейном графике log роста контрольной опухоли, составило 4,58 дней. Животные, подвергнутые лечению nBT062-SPDB-DM4 в дозе 450 мкг/кг, имели наибольшее значение log гибели клеток (LCK=2,89), за которыми следовали животные, подвергнутые лечению nBT062-SMCC-DM1 при еженедельном введении дозы 250 мкг/кг (LCK=2,1; см. таблицу 10). Сравнение кривых среднего роста опухоли для подвергнутых лечению групп с помощью анализа ANOVA с использованием критерия множественного сравнения Дуннета, выявило значимое различие между подвергнутой лечению PBS контрольной группой и группами, подвергнутыми лечению 450 мкг/кг nBT062-SPDB-DM4 (p<0,01), 250 мкг/кг nBT062-SPDB-DM4 (p<0,05) и пятью еженедельными дозами по 250 мкг/кг nBT062-SMCC-DM1 (p<0,05). Частичная или полная регрессия опухоли не имела место ни в одной из подвергнутых лечению групп за исключением одного животного, получавшего 450 мкг/кг nBT062-SPDB-DM4, у которого отмечалась частичная регрессия опухоли до дня 85 после инокуляции.

Таблица 10.
Значения log гибели клеток (LCK) в качестве показателя противоопухолевой активности различных конъюгатов nBT062-DMx в различных схемах введения доз. Обратитесь к разделу «Материалы и методы» для информации в отношении расчета значений LCK. Исследуемый Доза LCK Введение доз материал (мкг/кг)     PBS     однократная доза nBT062-SMCC-DM1 450 0,85 однократная доза nBT062-SMCC-DM1 250 0,53 однократная доза nBT062-SMCC-DM1 100 0 однократная доза nBT062-SPDB-DM4 450 2,89 однократная доза nBT062-SPDB-DM4 250 1,05 однократная доза nBT062-SPDB-DM4 100 0,39 однократная доза nBT062-SPP-DM1 450 0,8 однократная доза nBT062-SPP-DM1 250 0,39 однократная доза nBT062-SPP-DM1 100 0,2 однократная доза nBT062-SMCC-DM1 250 2,1 еженедельно в течение 5 недель

In vivo эффективность nBT062-SPDB-DM4 и nBT062-SPP-DM1 в среде костного мозга (ВМ)

Приготовление мышей с SCID, имеющих имплантаты костей человеческого эмбриона

Трубчатые кости человеческого эмбриона (костную стружку человеческого эмбриона) имплантировали в верхнюю часть тела мышей с SCID CB17 (SCID-hu), как описано ранее (Urashima et al., 1997) и, таким образом, предусмотрено для модели хоминга клеток MM человека в клетках BM человека на мыши.

Схемы лечения (мыши SCID-hu/INA-6)

Спустя 4 недели после имплантации кости 2,5×10⁶ клеток INA-6 в конечном объеме 100 мкл среды для культивирования клеток RPMI-1640 инъецировали непосредственно в полость кости с костным мозгом человека у мышей SCID-hu, описанных выше. Увеличение уровней растворимого рецептора IL-6 человека (shuIL-6R), который выбрасывается клетками INA-6, использовали в качестве параметра роста клеток MM и тяжести заболевания.

У мышей обнаруживался на определяемом уровне shuIL-6R в сыворотке через приблизительно 4 недели после инъекции клеток INA-6, и затем мыши получали 0,176 мг конъюгата или являющегося носителем контроля благодаря инъекции в хвостовую вену еженедельно в течение 7 недель. После каждого лечения отбирали образцы крови, и в них определяли уровни shuIL-6R с помощью иммуноферментного твердофазного анализа (ELISA, R&D Systems, Minneapolis, MN). Результаты отображены на фиг. 12.

Обсуждение

Интерлейкин 6 (IL-6) является фактор роста и выживания для клеток множественной миеломы. INA-6 является линией зависимых от IL-6 миеломных клеток человека, для пролиферации которой также необходимы стромальные клетки костного мозга (BMSC). Линия клеток INA-6 продуцирует растворимый рецептор IL-6 (shuIL-6R). Увеличение уровней shuIL-6R может использоваться в качестве параметра роста клеток MM и тяжести заболевания.

Таким образом, мыши sCID-hu/INA-6 обеспечивают модель для клеток множественной миеломы, растущих в нормальной для них среде - костном мозге. Опухолевые клетки этой модели, которые непосредственно взаимодействуют с костным мозгом человека, очень напоминают ситуацию у пациентов, у которых рост опухолевых клеток также активируется присутствием стромальных клеток. Поскольку клетки INA-6 выбрасывают растворимый рецептор интерлейкина-6 человека (shuIL-6R), концентрации этого белка в сыворотке могут использоваться в качестве показателя опухолевой клеточной массы у этих мышей. In vivo эффективности nBT062-SPDB-DM4 и nBT062-SPP-DM1 были исследованы в этой среде.

Лечение мышей SCIDhu/INA-6 с помощью еженедельных внутривенных введений nBT062-SPDB-DM4 или nBT062-SPP-DM1 в течение семи недель вызвало действенную регрессию опухоли, выявленную по уменьшению уровней shuIL-6R в сыворотке относительно контролей, что указывает на значительную эффективность конъюгатов даже в среде костного мозга человека, которая отражает релевантную ситуацию у пациентов (фиг. 12).

Дозы для мышей

Для определения соответствующих доз мышам однократно вводили BT062 в дозах, составляющих 100, 250 и 450 мкг/кг (на основе концентрации DM4), когда средний объем опухоли достигал 80 м³ (фиг. 14). Дозы представлены как концентрация конъюгированного DM4 (1 мкг DM4 равен приблизительно 55 мкг белка антитела). Противоопухолевая эффективность была дозозависимой, при этом наибольшая из проверенных доз (450 мкг/кг) приводила к значению log гибели клеток (LCK), составляющему 2,9 (сравните также таблицу 10). Животные набирали вес на всем протяжении исследования, что означает, что лечение не было токсичным для мышей.

Фиг. 14 указывает на 250 мкг/кг в качестве первой эффективной дозы у мышей, которая пересчитывается в сравнимую дозу для людей, составляющую 166 мг/м².

Показание: карцинома поджелудочной железы/молочной железы и другая карцинома - модели с использованием ксенотрансплантатов

Общая постановка эксперимента

В соответствии с анализом экспрессии CD138 (иммуногистохимическим анализом на ранжированных микрорядах опухолевых тканей) были отобраны опухоли-кандидаты из коллекции первичных опухолей, т.е. происходящих от пациентов опухолей. После подкожной трансплантации и ускорения опухолей (время индукции - 30 дней) внутривенно инъецировали иммуноконъюгат BT062 в 2 различных концентрациях майтансиноида DM4: 450 мкг/кг и 250 мкг/кг (каждая на основе молекулярной массы связанного DM4 (1 мг DM4 конъюгировано с 52 мг антитела, что равняется общей массе - 53 мг; 450 мкг/кг DM4=23,850 мкг). Иммуноконъюгат вводили раз в неделю в течение 10 недель (в случае лечения мышей, которым была имплантирована опухоль поджелудочной железы) и 5 недель (в случае лечения мышей, которым была имплантирована опухоль молочной железы).

Пример 1: Карцинома поджелудочной железы

Опухолевую ткань поджелудочной железы (PAXF 736 (Kuesters et al., 2006)) имплантировали (билатерально) мышам NMRI. Имплантированная опухоль происходила из первичной карциномы поджелудочной железы пациента (слабо дифференцированной с инфильтрующим ростом аденокарциномы (экзокринной карциномы)). Побочные эффекты не наблюдались. Опухоль этого пациента была идентифицирована как ткань с высокой экспрессией CD138 с помощью иммуногистохимических исследований. Однако CD138 не экспрессировался в степени, сравнимой с таковой в случае миеломатозных плазматических клеток у пациентов с множественной миеломой, что определено на линиях озлокачественных клеток с помощью окрашивания поверхности при использовании проточной цитометрии.

Лечение BT062 начинали после достижения опухолями размера, составляющего приблизительно 6-8 мм в диаметре (минимум 5 мм). Диаметры опухолей измеряли дважды в неделю. Объемы опухолей рассчитывали по формуле a*b*b/2, где «a» является самой длинной осью, а «b» - перпендикулярной к ней осью. Ингибирование увеличения объема опухоли в исследуемых группах относительно контрольной группы, подвергнутой лечению носителем, рассчитывали как отношение средних относительных объемов опухолей (T/C).

Подавление роста опухоли к конкретному дню (T/C в %) рассчитывали на основе отношения среднего значения RTV (относительного объема опухоли) в исследуемой группе к таковому в контрольной группе, умноженного на 100%.

T/C(День_х) =   Средний относительный объем опухоли в исследуемой группе к дню _х
Средний относительный объем опухоли в контрольной группе к дню_х ×100

В результате этого еженедельного введения ВТ062 объем опухоли мог быть значительно уменьшен. Как можно видеть на фиг. 28, наблюдалась дозозависимая частичная и полная ремиссия. На этой фигуре показано, что при использовании дозы, составляющей 23,85 мг/кг, полной ремиссии можно было достичь через 28 дней после имплантации опухоли, в то время как при использовании дозы, составляющей 13,25 мг/кг, полной ремиссии можно было достичь через 35 дней после имплантации опухоли. Примечательно, что спустя 52 дня все мыши в случае обоих схем введения все еще оставались живыми (8/8), в то время как составляющее восемь количество мышей контрольной группы сократилось до 1. Значение T/C ниже 10% означает полную ремиссию (CR) (Bissery et al., 1991). Согласно этому критерию в обеих группах, подвергнутых лечению, достигалась CR, что отражает полную ремиссию, которая достигалась с помощью BT062. Существенно, что на стадии наблюдения без осуществления лечения возобновление роста опухоли не выявлялось, что подтверждает полное излечение в этой модели.

Таблица 11:
Объем опухоли в модели на мыши с использованием ксенотрансплантатов рака поджелудочной железы Относительный объем опухоли (%) День 52: среднее значение (±) Диапазон T/C (%) Контроль 2055 2055   BT062-DM4;
13,25 мг/кг 0 (±1,0) 0-3,5 0,0 BT062-DM4;
23,85 мг/кг 0 (±1,0) 0-0,1 0,0

Пример 2: Карцинома молочной железы

Мышам NMRI (“nude”) имплантировали (билатерально) первичную опухоль молочной железы пациента (идентифицированную благодаря иммуногистохимическому (IHC) анализу как резко-положительная по CD138). Метастазирование в кожу карциномы молочной железы вступило в фазу M1. Она являлась опухолью, которая не реагировала на герцептин (низкий уровень Her₂ со средней экспрессией). Опухоль была отрицательной по рецепторам эстрогена и отрицательной по рецепторам прогестерона. Опухоли, которые должны были имплантироваться, отбирали в соответствии с результатами при IHC окрашивании (сильной, однородной экспрессией CD138, выявляемой с помощью BT062, тройной отрицательностью (отсутствием экспрессии рецепторов гормонов - эстрогена и прогестерона); экспрессией Her₂ с оценкой 2 или меньше (рассматривающейся как не реагирующая на герцептин).

Лечение BT062 начинали после достижения опухолями размера, составляющего приблизительно 6-8 мм в диаметре (минимум 5 мм). Диаметры опухолей измеряли дважды в неделю. Объемы опухолей рассчитывали по формуле a*b*b/2, при этом «a» является самой длинной осью, а «b» - перпендикулярной к ней осью. Ингибирование увеличения объема опухоли в исследуемых группах относительно контрольной группы, подвергнутой лечению носителем, рассчитывали как отношение средних относительных объемов опухолей (T/C).

Объем опухоли можно было значительно уменьшить с помощью еженедельного введения BT062. Наблюдалась дозозависимая частичная и полная ремиссия. Иммуноконъюгат хорошо переносился, не оказывая влияние на вес тела после каждой инъекции. В случае обеих подвергнутых лечению групп было получено значение T/C ниже 10%, отражающее полную ремиссию, достигнутую в результате введения BT062. Как можно видеть на фиг.YYY, противоопухолевый эффект (т.е. полная ремиссия) был достигнут спустя 21 день, что может считаться быстрым ответом на ВТ062. По сравнению с моделью карциномы поджелудочной железы продолжительность лечения можно было сократить наполовину (5 недель вместо 10 дней), и низкая доза, составляющая 13,25 мг/кг, было уменьшена до 4 мг/кг для достижения схожего эффекта, а именно полной ремиссии и не возобновления роста опухоли. Более короткий период лечения в случае карциномы молочной железы был неожиданным, поскольку при гистохимическом анализе уровень экспрессии CD138 был схожим. Таким образом, на основе уровня экспрессии CD138 нельзя делать выводы, касающиеся общей рекомендации в отношении продолжительности лечения. Спустя 21 день все мыши в случае обеих подвергнутых лечению групп, а также контрольной группы все еще оставались живыми. В период наблюдения без осуществления лечения (спустя 39 дней после последнего введения иммуноконъюгата) возобновление роста опухоли не выявлялось, что подтверждает полное излечение.

Таблица 12a
Объем опухоли в модели на мыши с использованием ксенотрансплантатов карциномы молочной железы Относительный объем опухоли (%) Среднее значение (день 21) Диапазон T/C Контроль (PBS) 533 (±149,5) 339-878   BT062-DM4;
13,25 мг/кг/4 мг/кг 0 (±0,02) 0-0,1 0,0 BT062-DM4;
23,85 мг/кг 0 (±1,75) 0-6,6 0,0

Таблица 12b
Экспрессия CD138 на клетках карциномы молочной железы в сравнение с эпителиальными клетками Образцы тканей FFPE Оценка окрашивания (мембраны) 0,25 мкг/мл 0,05 мкг/мл Опухоль молочной железы, метастатическая, -061909-13 3 однородное 2-3 однородное Опухоль молочной железы, неопределенное состояние, -061909-12 2-3 однородное 1-2 неоднородное Опухоль молочной железы, метастатическая, -061909-09 3 неоднородное 2 фокальное Опухоль молочной железы, первичная, -111904-4 3 неоднородное 1-3 неоднородное Опухоль молочной железы, первичная, -111904-1 3 неоднородное 1 неоднородное Образец 1 нормальной кожи 3 однородное 3 однородное Образец 1 нормальной кожи 3 однородное 3 однородное

Пример 3: Карцинома мочевого пузыря

Мышам NMRI (“nude”) имплантируют опухоль мочевого пузыря (идентифицированную благодаря иммуногистохимическому анализу как резко-положительная по CD138), а именно переходноклеточную карциному.

Лечение BT062 начинают после достижения опухолями размера, составляющего приблизительно 5 мм. Диаметры опухолей измеряют дважды в неделю. Объемы опухолей рассчитывают по формуле a*b*b/2, при этом «a» является самой длинной осью, а «b» - перпендикулярной к ней осью. Ингибирование увеличения объема опухоли в исследуемых группах относительно контрольной группы, подвергнутой лечению носителем, рассчитывают как отношение средних относительных объемов опухолей (T/C).

Объем опухоли значительно уменьшается, к чему и стремятся, в результате еженедельного введения BT062. Следят за любой дозозависимой частичной и полной ремиссией.

Пример 4: Карцинома легкого

Мышам NMRI (“nude”) имплантируют карциному легкого (идентифицированную благодаря иммуногистохимическому анализу как резко-положительная по CD138).

Лечение BT062 начинают после достижения опухолями размера, составляющего приблизительно 5 мм. Диаметры опухолей измеряют дважды в неделю. Объемы опухолей рассчитывают по формуле a*b*b/2, при этом «a» является самой длинной осью, а «b» - перпендикулярной к ней осью. Ингибирование увеличения объема опухоли в исследуемых группам относительно контрольной группы, подвергнутой лечению носителем, рассчитывают как отношение средних относительных объемов опухолей (T/C).

Объем опухоли значительно уменьшается, к чему и стремятся, в результате еженедельного введения BT062. Следят за любой дозозависимой частичной и полной ремиссией.

Преклинические исследования токсичности

Модели на мышах с использованием ксенотрансплантатов являются идеальными для определения, являются ли эффективными иммуноконъюгаты по настоящему изобретению применительно к раку, смоделированному на мыши. Однако, поскольку в этих моделях отсутствует соответствующая врожденная экспрессия CD138, они не могут служить в качестве надежной модели для исследований токсичности и поэтому не могут использоваться для определения в достаточной степени допустимых количеств иммуноконъюгатов по настоящему изобретению.

В случае яванских макак и макак-резус также не было установлено, что BT062 связывается с какими-либо родственными CD138 антигенами, но эти макаки являются в настоящее время самым подходящим видом животных для токсикологических исследований BT062, который известен. Поэтому ожидается, что профиль токсичности BT062 у мышей и макак будет обусловлен не нацеленными эффектами цитотоксического компонента конъюгата (DM4).

Были проведены исследования токсичности однократной дозы, удовлетворяющие требованиям GLP, на яванских макаках и мышах CD-1. Эти исследования были предназначены для установления доз, которые приводят к сильной токсичности, и доз, которые не вызывают (или вызывают минимальные) неблагоприятные эффекты у животных, чтобы установить возможные токсичности у людей и определить безопасную начальную дозу для клинического испытания фазы I, в котором используется однократная болюсная инфузия BT062.

Исследование острой токсичности на мышах

Исследование токсичности однократной дозы было выполнено на мышах с использованием BT062, вводимого с помощью однократной внутривенной болюсной инъекции в дозах, находящихся в диапазоне 60-255 мг/м² (20-85 мг/кг). Наибольшая, не вызывающая сильную токсичность дозой (HNSTD) BT062 у мышей составляла 45 мг/кг (135 мг/м²), при этом оценочная STD₁₀ составляла 57 мг/кг (171 мг/м²).

Исследование острой токсичности на макаках

Исследование токсичности однократной дозы было выполнено на яванских маках с использованием BT062, вводимого внутривенно в дозах, находящихся в диапазоне 48-336 мг/м² (4-28 мг/кг).

HNSTD BT062 у яванских макак составляла 12 мг/кг (144 мг/м²).

Испытания BT062 на людях

Применительно к настоящему изобретению у являющихся людьми индивидов отмечались достаточные ответные реакции на схему введения низких доз. Это отмечалось даже в случае отсутствия каких-либо дополнительных лечений, которые могли бы компенсировать возможные вариации экспрессии на качественном или количественном уровне CD138 на клетках-мишенях (сравните MYLOTARG). Хотя модели на мышах продемонстрировали, что BT062 обладает очень значительной антимиеломной активностью в дозах, которые хорошо переносятся мышами, эффективность была значительно выше в относительно более высоких дозах (см. фиг. 14), ставя вопрос, как более высокие дозы будут переноситься являющимися людьми индивидами, которые экспрессируют CD138 на широком спектре неопухолевых клеток.

Научное исследование фазы I

Это исследование выполняют для исследования эффектов (хороших и плохих) и для определения MTD (максимально допустимой дозы) BT062 для лечения пациентов с рецидивирующей или рецидивирующей/резистентной множественной миеломой.

До настоящего времени было привлечено к участию 26 пациентов. По крайней 11 из 26 пациентов проявили уменьшение прогрессирования заболевания, как представлено, в результате получения по крайней мере четвертого цикла лечения, в то время как 4 пациента все еще подвергаются лечению. Испытание проводится в различных местах, при этом группы из 3 и 4 пациентов подвергаются лечению с использованием различных уровней доз (10 мг/м², 20 мг/м², 40 мг/м², 80 мг/м², 120 мг/м², 160 мг/м², 200 мг/м²) в течение где-то 1-10 циклов лечения (см. фиг. 23). Как будет понятно квалифицированному в данной области техники специалисту, большее число циклов лечения, такое как 10-50, 10-100, 10-200 или более, является возможным и находится в пределах объема настоящего изобретения.

Прогрессирование заболевание уменьшалось с помощью относительно низких уровней доз, а именно 20 мг/м², 40 мг/м², 80 мг/м² и 120 мг/м², при этом один пациент на 2-м уровне доз, составляющем 20 мг/м², демонстрировал отсутствие прогрессирования заболевания в течение 10 циклов лечения, каждый длящийся 21 день. См. фиг. 23, где в случае образцов пациентов 001-001, 003-001, 002-002, 002-003, 002-004, 003-003, 001-005, 001-006, 001-008, 001-009, 004-001, 001-011, 004-002 и 001-012 наблюдалось, что заболевание, в конечном счете, прогрессировало, хотя можно было наблюдать стабилизацию заболевания и ответные реакции, в том числе незначительные и частичные ответные реакции. В случае образца пациента 001-006 доза была приемлемой.

На этих уровнях доз, как описано выше (см. таблицы 7 и 8), также обнаруживался быстрый плазменный клиренс BT062. Некоторые фармакокинетические профили этих схем введения низких доз представлены на фиг. 17. На фиг. 18 представлено сравнение профилей BT062 в плазме людей с таковыми в плазме макак. График слева показывает различия при введении дозы 120 мг/м², в то время как графики справа (160 мг/м²) демонстрируют значительно меньшие различия.

Также вводились дозы, составляющие 160 мг/м² и 200 мг/м². Доза, составляющая 160 мг/м², была определена как MTD, и исследование в этой группе было расширено. Доза, составляющая 200 мг/м², была определена как MAD. Ограничивающие дозу токсичности (DLT) определяли с использованием оценки в соответствии с NCI CTCAE v3.0 (August 09, 2006, http://ctep.cancer.gov). Специфичные для этого исследования критерии для DLT перечислены ниже.

Негематологические:

- Алопеция, любой степени, не считается DLT;

- Тошнота и рвота степени 3-4, длящиеся больше 3 дней несмотря на оптимальное противорвотное средство.^а

- Понос степени 3-4, длящийся больше 3 дней несмотря на оптимальное противодиарейное средство.^а

a. Оптимальное лечение против поноса и рвоты определялось каждым исследователем.

Гематологические:

- Нейтропения степени 4, длящаяся больше 5 дней.

- Нейтропения степени 3 или большей степени с температурой, превышающей или равной 101ºF, при 2 повторных определениях, разделенных 4 часами.

- Тромбоцитопения степени 4

- Тромбоцитопения степени 3 или большей степени с кровотечением и необходимостью использования трансфузии тромбоцитов.

- Нейтропения степени 3, тромбоцитопения степени 3 не считаются DLT.

Все неблагоприятные явления (AE) оценивались в соответствии с NCI-CTCAE v3.0.

В случае AE, не перечисленных в NCI-CTCAE v3.0, тяжесть оценивалась исследователем в соответствии с этими критериями. Допустимыми были лишь степень 1 и степень 2 при условии, что в случае степени 1 (легкой) требуется минимальное лечение или не требуется лечение, и нет препятствования ежедневным активностям пациента, а степень 2 (умеренная) приводит к низкому уровню неудобства или беспокойства, вызванного терапевтическими мерами. Умеренные явления могут привести к некоторой степени препятствования функционированию пациента.

AE степени 3 (тяжелые) и степени 4 (угрожающие жизни), которые, как считалось, относятся к BT062, считались недопустимыми и определялись как DLT, если не определялись иначе с помощью специфичных для этого исследования критериев.

В это время пациенты, от которых получены образцы 003-005, 002-012 и 002-011, все еще участвовали в исследовании.

Пациенты, от которых получены образцы 002-003, 001-002 и 002-008, были выведены из исследования.

Как показано на фиг. 23, повторные разовые дозы схемы, составляющие 10 мг/м², 20 мг/м², 40 мг/м², 80 мг/м², 120 мг/м², 160 мг/м², 200 мг/м², вводили раз в 21 день, что означает в день 1, день 22, день 43, день 64, день 85, день 106 и т.д. Заболевание контролировалось и будет контролироваться посредством оценки врачом гематологических показателей, клинических симптомов и клинических биохимических показателей, а также с помощью измерения уровней M-белка в сыворотке и моче пациентов в (г/дл) и уровней свободных легких цепей (FLC) в сыворотке пациентов в динамике времени.

Оценка иммуноглобулинов

При скрининге исследовали количество антител Ig, в том числе определяли подгруппы IgG.

Количественный анализ M-белка и анализ свободных легких цепей в сыворотке

Сначала ответную реакцию на лечение оценивали в день 1 циклов 1-3 лечения посредством количественного анализа М-белка, используя иммуноэлектрофорез (IEP) и электрофорез с иммунофиксацией (IFE), из сыворотки и сбора мочи за 24 часа. В случае цикла лечения 3 и выше количественный анализ M-белка выполняли при посещении в день 15, чтобы иметь в наличии результаты для оценки ответной реакции до начало следующего цикла лечения. Общую количественную оценку иммуноглобулинов выполняли вместе с количественным анализом M-белка.

Образцы сыворотки использовали для выполнения анализов FLC с целью обследования страдающих множественной миеломой пациентов без детектируемых уровней M-белка (характеризующейся отсутствием секреции/незначительной секрецией миеломой) и создания возможности для выявления ранней ответной реакции на лечение. Поэтому анализы FLC в сыворотке выполняли в день 1, 2, 3 и 8 1-го цикла лечения, в день 2, 3, 8 и 15 цикла 4, а также в день 1, 8 и 15 всех остальных циклов лечения. M-белок и FLC исследовали при скрининге и при посещении в момент завершения исследования. Оценки в день 1 цикла 1 служили в качестве значений исходного уровня.

Таблица 13
Представлены исследования, сделанные в отношении М-белка в моче/сыворотке, и измерения FLC в сыворотке у выбранных пациентов. Доза (мг/м²) Фиг. Измерения М-белка в моче/сыворотке и измерения FLC 20 Фиг.24 - Уровень М-белка в моче, сниженный после 3-ого цикла лечения в течение приблизительно 17 недель и увеличенный после 9-ого цикла лечения
- Относящиеся к М-белку критерии для незначительной ответной реакции, достигнутые после 8-ого цикла лечения
- Снижение уровня М-белка в моче от исходного уровня на более 50% и с дня 42 (3-ого цикла лечения) на более 75%
- Прогрессирование заболевания после цикла 10
- Уровень М-белка в сыворотке между 0,06 и 0,1 г/дл (определяемый как не измеряемый) 40 Фиг.25 - Стабильное заболевание в течение 14 недель
- Уровень М-белка в моче, сниженный после 1-ого цикла лечения и стабильный в течение 14 недель
- Прогрессирование заболевания, наблюдаемое     после проведения лечения, в начале цикла 6 (день 105)
- Уровень М-белка в моче, увеличенный с 0 при скрининге до максимального значения, составляющего приблизительно 16 мг/24 ч (определяемый как не измеряемый) 160 Фиг.26 - Уровень FLC в сыворотке, увеличенный в период скрининга, длящийся от дня -21 до дня 1 лечения
- Уровень FLC в сыворотке, подвергшийся снижению вскоре после 1-ого цикла лечения, которое уже почти равно снижению на 25% в день 8
- По сравнению с исходным уровнем уровни FLC являются сниженными на приблизительно 40% во время 1-ого цикла и на более 50% после 2-ого, 3-ого и 4-ого цикла лечения
- Относящиеся к FLC критерии для частичной ответной реакции достигаются очень рано
- Прогрессирование заболевания после завершения 4-ого цикла лечения
- Уровень М-белка в сыворотке, являющийся не измеряемым = 0; Уровень М-белка в моче, сниженный с исходного уровня 140 мг/24 ч до 120 мг/24 ч до 2-ого цикла лечения) (определяемый как не измеряемый)→ не     характеризующаяся секрецией миелома.

Определение BT062 и DM4 из плазмы

Для оценки фармакокинетических свойств вводимого в однократной дозе BT062, после внутривенного введения BT062, был выполнен протяженный отбор образцов во время первого цикла лечения. Такую же оценку осуществляли во время 4-ого цикла лечения. В меньшей протяженности образцы плазмы были также получены в день 1 и 8 всех остальных циклов лечения, а также при посещении в момент завершения исследования и последующего врачебного наблюдения.

Определение «слущенного» CD138 и HAPA

Все образцы плазмы до введения дозы были подвергнуты оценке в отношении уровней слущенного/растворимого CD138 (sCD138) для изучения возможной связи между уровнями sCD138 и противоопухолевой активностью. Эти измерения также позволили установить, что значения Cmax ниже ожидаемых не зависят от количества sCD138, присутствующего до введения BT062 (см. фиг. 22). Образцы плазмы до введения дозы, отобранные в день 1 каждого цикла лечения, и образцы, отобранные при посещении в момент завершения исследования и последующего врачебного наблюдения, были подвергнуты оценке в отношении наличия гуморальных реакций против BT062 (лекарственного продукта) посредством определения антител человека против этого продукта (HAPA).

Зарегистрированные определения «слущенного» CD138

У пациентов с миеломой можно зарегистрировать высокие уровни SCD138, и они могли бы служить прогнозным показателем в случае страдающих миеломой пациентов (Maisnar et al., 2005).

Пациенты с MGUS и MM могут демонстрировать высокие уровни растворимого CD138 одновременно с более высокими уровнями β2-микроглобулина и повышенным содержание плазматических клеток в костном мозге (Aref et al., 2003).

Использовался набор для определения растворимого CD138. Неожиданно, было установлено, что в случае подвергнутого лечению ВТ062 в дозе 20 мг/м² пациента 003-003 он продемонстрировал незначительную ответную реакцию, что касается уровней M-белка в моче, хотя этот пациент продемонстрировал высокие уровни sCD138 до начала лечения.

Значения растворимого CD138 были определены у различных индивидов.

Таблица 14
Пациент 003-003 (доза 20 мг/м²) продемонстрировал очень высокие значения sCD138. Тем не менее, у этого пациента была достигнута незначительная ответная реакция, касающаяся уровня M-белка. Индивид sCD138 (нг/мл) 002-003 61,3 001-002 196 002-004 56,7 003-003 2583 Среднее значение 724,1

ИССЛЕДОВАНИЯ КОМБИНАЦИЙ

Возможные кандидаты, являющиеся антимиеломными средствами, были подвергнуты оценке в качестве включаемых в комбинацию партнеров для BT062 на линиях клеток.

Исследования линий клеток

Исследованиям комбинаций в моделях на мышах с использованием ксенотрансплантатов предшествовали исследования на линиях клеток. Определение синергизма в различных линиях клеток было выполнено в соответствии с Chou и Tallay (1984), используя анализ среднего эффекта. В этом случае рассчитывали значения IC₅₀ для цитотоксических эффектов для каждого лекарственного средства и каждой линии клеток, а затем отношения IC₅₀ для каждой пары лекарственных средств. Затем клетки подвергали воздействию ряда разведений либо этих смесей лекарственных средств, либо лекарственных средств самих по себе. Экспериментальные данные анализировали, используя программное обеспечение CompuSyn (ComboSyn, Inc., Paramus, NJ). Индексы комбинации (CI) для каждого независимого эксперимента рассчитывали или представляли отдельно. В этом анализе CI, который меньше 1, равен 1 и больше 1, означает синергизм, аддитивность и антагонизм, соответственно. В соответствии с классификацией T.C. Chou (CompuSyn. User's guide, 2004), автора способа, шкала синергизма и антагонизма является следующей:

Индекс комбинации Описание < 0,1 Очень сильный синергизм 0,1-0,3 Сильный синергизм 0,3-0,7 Синергизм 0,7-0,85 Умеренный синергизм 0,85-0,9 Слабый синергизм 0,9-1,1 Почти аддитивный эффект 1,1-1,2 Слабый антагонизм 1,2-1,45 Умеренный антагонизм 1,45-3,3 Антагонизм 3,3-10 Сильный антагонизм > 10 Очень сильный антагонизм

Таблица 15
Оценки синергетических эффектов, полученные на линиях клеток в соответствии со способом Chou и Talalay (1984).   Клетки Лекарственное средство RPMI 8226 MOLP8 U266 Бортезомиб Аддитивный Слабо антагонистический Антагонистический Талидомид От аддитивного до синергетического От аддитивного до слабо антагонистического Антагонистический Леналидомид Синергетический От аддитивного до синергетического От слабо до умеренно антагонистического Мелфалан От аддитивного до синергетического От слабо до умеренно антагонистического От аддитивного до слабо синергетического Дексаметазон Не определенный Аддитивный Аддитивный

В этом примере использовали линии клеток MOLP 8 для комбинации BT062 с бортезомибом, талидомидом, леналидомидом, мелфаланом и дексаметазоном.

Комбинация с талидомидом или бортезомибом не привела ни к синергетическому, ни к аддитивному эффекту, а точнее привела к антагонистическому эффекту. В противоположность этим исследованиям на культурах клеток комбинация с бортезомибом была синергетической в описываемой ниже модели с использованием ксенотрансплантата.

Возможные кандидаты, являющиеся антимиеломными средствами, были подвергнуты оценке в качестве включаемых в комбинацию партнеров для BT062 в исследованиях с использованием ксенотрансплантатов клеток множественной миеломы человека MOLP8.

Пример 1

Антимиеломный эффект комбинированного лечения BT062 и леналидомидом

Самкам мышей с SCID подкожно инокулировали клетки миеломы человека MOLP 8. Лечение BT062 отдельно или в комбинации с леналидомидом начинали через 11 дней после инокуляции опухолевых клеток. BT062 использовали в концентрациях, составляющих 100 мкг, 200 мкг и 400 мкг, отдельно и в комбинации с леналидомидом, который вводили внутрибрюшинно в дозе 100 мг/кг в дни 1-5 и дни 8-12. Контрольная группа животных получила забуференный фосфатом солевой раствор (PBS) при использовании той же схемы и пути введения. Рост опухоли отслеживали посредством измерения размера опухоли и рассчитывали по формуле длина×ширину×высоту×1/2, при этом измерения осуществляли в дни 10, 14, 18 и 21.

Синергизм рассчитывали следующим образом (Yu et al., 2001; Gunaratnam et al., 2009):

Коэффициент (r)=ожидаемый FTV (комбинация)/зарегистрированный FTV (комбинация)

FTV: относительный объем опухоли = средний объем опухоли (исследуемой)/средний объем опухоли (контрольной)

Коэффициент > 1 рассматривается как синергетический, тогда как r < 1 означает менее чем аддитивный.

Коэффициент (r), в случае превышения 1, также называют в настоящем документе «коэффициентом синергизма».

Как можно понять из таблицы 15, синергизм обнаруживался спустя 28 дней в концентрациях BT062, составляющих 200 мкг и 400 мкг.

Таблица 17
Комбинация леналидомида с BT062: эффекты в различных дозах Агент Доза при каждой инъекции Суммарная доза T/C(%) (день 17) Регрессии Оставшиеся в живых без опухолей, день 77 Результаты частичные полные PBS (0,2 мл) - - 0/6 0/6 0/6   ВТ062 100 мкг/кг 100 мкг/кг 35 0/6 0/6 0/6 Активная ВТ062 200 мкг/кг 200 мкг/кг 14 0/6 0/6 0/6 Активная ВТ062 400 мкг/кг 400 мкг/кг 9 4/6 1/6 0/6 Высоко
активная Леналидомид 100 мг/кг 1 г/кг 31 0/6 0/6 0/6 Активная ВТ062 100 мкг/кг 100 мкг/кг 19 0/6 0/6 0/6 Активная Леналидомид 100 мг/кг 1 г/кг ВТ062 200 мкг/кг 200 мкг/кг 12 2/6 0/6 0/6 Активная Леналидомид 100 мг/кг 1 г/кг ВТ062 400 мкг/кг 400 мкг/кг 6 5/6 4/6 0/6 Высоко Активная Леналидомид 100 мг/кг 1 г/кг

На фиг. 28 представлен эффект комбинированной терапии на средний объем опухоли (TV) в модели на мышах с использованием ксенотрансплантата. Результаты доказывают аддитивные эффекты комбинации. Пожалуйста, обратитесь к таблице 16 для коэффициента синергизма.

Пример 2

Антимиеломный эффект комбинированного лечения BT062 и Велкаде

Велкаде был подвергнут оценке в качестве возможного партнера для ВТ062, включаемого в комбинацию лекарственных средств против множественной миеломы, в исследованиях с использованием ксенотрансплантатов клеток множественной миеломы человека MOLP8 (IMGN Inc.). Лечение BT062 сами по себе или в комбинации с Велкаде начинали через 11 дней после имплантации опухолевых клеток. BT062 использовали в концентрациях, составляющих 100 мкг, 200 мкг и 400 мкг, отдельно и в комбинации с Велкаде, который вводили в дозе 1 мг/кг в дни 1, 4, 8 и 11. Контрольная группа животных получила забуференный фосфатом солевой раствор (PBS) при использовании той же схемы и пути введения. Рост опухоли отслеживали посредством измерения размера опухоли и рассчитывали по формуле длина×ширину×высоту×1/2, при этом измерения осуществляли в дни 10, 14, 17, 21, 24 и 28, соответственно.

Синергизм рассчитывали, как в примере 1 исследований комбинации.

Как можно понять из таблицы 18, синергизм обнаруживается в случае комбинации BT062 с Велкаде в день 25 во всех схемах дозирования BT062. Приведенные в литературе значения R являются даже большими (Yu et al., 2001).

Таблица 19
Комбинация Велкаде с BT062: эффекты в различных дозах Агент Доза при каждой инъекции Дни лечения (TX, день начала лечения = день 10 после инокуляции) T/C(%) (T-C)
в днях Log гибели клеток Регрессии Оставшиеся в живых без опухолей, день 67 Результаты частичные полные PBS (0,2 мл) День 1 - - - 0/6 0/6 0/6   BT062 100 мкг/кг День 1 43 5,5 0,5 0/6 0/6 0/6 Неактивная BT062 200 мкг/кг День 1 11 14,5 1,3 1/6 0/6 0/6 Активная BT062 400 мкг/кг День 1 7 31,5 2,8 4/6 2/6 0/6 Высоко активная Велкаде 1 мг/кг Дни 1, 4, 8, 11 100 0,5 0,0 0/6 0/6 0/6 Неактивная BT062 100 мкг/кг День 1 20 10,5 0,9 1/6 0/6 0/6 Активная Велкаде 1 мг/кг Дни 1, 4, 8, 11 BT062 200 мкг/кг День 1 7 23,5 2,1 4/6 1/6 0/6 Высоко активная Велкаде 1 мг/кг Дни 1, 4, 8, 11 BT062 400 мкг/кг День 1 7 36,5 3,2 6/6 0/6 0/6 Высоко активная

На фиг. 29 представлен эффект комбинированной терапии на средний объем опухоли (TV) в модели на мышах с использованием ксенотрансплантата. Результаты показывают, что в используемой модели лечение Велкаде отдельно не оказывало эффект на объем опухоли. Комбинация с ВТ062 обусловила синергетические эффекты. Пожалуйста, обратитесь к таблице 18 для коэффициента синергизма.

Пример 3: BT062/мелфалан

Клетки RPMI были имплантированы подкожно мышам «nude». Мышей подвергали рандомизации, когда общий объем опухоли достигал приблизительно 100 мм³. BT062 инъецировали внутривенно в 2 различных концентрациях: 400 мкг/кг и 100 мкг/кг; каждая на основе молекулярной массы связанного DM4. PBS служил в качестве отрицательного контроля. Использовали 8 мышей в каждой группе, каждая мышь с одной опухолью (односторонняя имплантация). Осуществляли еженедельное введение доз BT062, а затем спустя один день после инъекции ВТ062 вводили мелфалан раз в неделю (3 мг/кг) внутрибрюшинно. Результаты представлены на фиг. 30.

После предоставления вышеприведенного описания квалифицированному специалисту станут очевидными многие другие признаки, модификации и улучшения. Поэтому считается, что такие другие признаки, модификации и улучшения являются частью этого изобретения, объем которого должен определяться кратким изложением сущности изобретения и следующей формулой изобретения.

Список литературы

·

Группа изобретений относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использована для лечения заболевания, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138. Для этого вводят нуждающемуся пациенту эффективное количество иммуноконъюгата, содержащего по крайней мере одно нацеливающее антитело, мишенями которого являются клетки, экспрессирующие CD138, и по крайней мере одну эффекторную молекулу, где указанное нацеливающее антитело функционально связано с указанной эффекторной молекулой с образованием указанного иммуноконъюгата, где по меньшей мере одно нацеливающее антитело содержит тяжелую цепь, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности SEQ ID NO: 1, и легкую цепь, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности SEQ ID NO: 2, и где указанный пациент имеет фенотип резистентности. Группа изобретений относится также к противораковой комбинации и противораковому набору, содержащему вышеуказанный иммуноконъюгат. Применение иммуноконъюгата в сочетании с цитотоксическим средством приводит к аддитивному синергетическому противораковому эффекту. 6 н. и 55 з.п. ф-лы, 3 пр., 30 ил., 19 табл.

1. Способ лечения заболевания, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138, предусматривающий:
введение нуждающемуся пациенту эффективного количества иммуноконъюгата, содержащего
по крайней мере одно нацеливающее антитело, мишенями которого являются клетки, экспрессирующие CD138, и
по крайней мере одну эффекторную молекулу, где указанное нацеливающее антитело функционально связано с указанной эффекторной молекулой с образованием указанного иммуноконъюгата,
где по меньшей мере одно нацеливающее антитело содержит тяжелую цепь, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности SEQ ID NO: 1, и легкую цепь, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности SEQ ID NO: 2, и
где указанный пациент имеет фенотип резистентности.

2. Способ по п. 1, где иммуноконъюгат вводят индивиду в количестве, составляющем 5 мг/м²-200 мг/м², или фармакокинетически эквивалентном 5 мг/м²-200 мг/м², если вводят в сочетании со средством для лечения неблагоприятных побочных эффектов.

3. Способ по п. 1 или 2, где максимальная концентрация иммуноконъюгата в плазме индивида между 0 и 2 часами после завершения первого введения составляет менее 50%, предпочтительно, менее 40%, более предпочтительно, менее 30%, еще более предпочтительно, менее 20% или даже менее 10% теоретической максимальной концентрации указанного иммуноконъюгата.

4. Способ по п. 3, в котором иммуноконъюгат вводят по крайней мере четыре раза, и максимальная концентрация иммуноконъюгата в плазме индивида между 0 и 2 часами после завершения каждого из указанных введений составляет менее 55%, предпочтительно, менее 50%, более предпочтительно, менее 40%, еще более предпочтительно, менее 30%, менее 20% или даже менее 10% теоретической максимальной концентрации указанного иммуноконъюгата.

5. Способ по п. 1, где указанный иммуноконъюгат вводят
в дозе, предпочтительно, в повторной разовой дозе, составляющей не более чем приблизительно 10, 20, 30, 40, 80, 90, 100 или 120 мг/м²,
в средней суточной дозе, составляющей от приблизительно 400 мкг/м² до приблизительно 6 мг/м², в том числе приблизительно 500 мкг/м², приблизительно 1 мг/м², приблизительно 2 мг/м², приблизительно 3 мг/м², приблизительно 4 мг/м², приблизительно 5 мг/м², и/или
в средней еженедельной дозе, составляющей от приблизительно 3 мг/м² до приблизительно 40 мг/м², в том числе приблизительно 5 мг/м², приблизительно 10 мг/м², приблизительно 15 мг/м², приблизительно 20 мг/м², приблизительно 25 мг/м², приблизительно 30 мг/м² или приблизительно 35 мг/м².

6. Способ по п. 1, где в течение приблизительно 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 100, 120, 140, 160, 180, 190, 200, 210 или более дней сохраняется стабилизация заболевания.

7. Способ по п. 1, где в течение приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 циклов лечения, каждый из которых длится приблизительно три недели, сохраняется стабилизация заболевания.

8. Способ по п. 7, где в течение 5, 6, 7, 8, 9 или 10 циклов лечения в дозе 20 мг/м² сохраняется по крайней мере стабилизация заболевания.

9. Способ по п. 8, где незначительная ответная реакция наблюдается после вплоть до 8 циклов лечения.

10. Способ по п. 1, где указанный способ приводит к стабилизации заболевания, ответной реакции, в частности незначительной ответной реакции, частичной ответной реакции, очень хорошей частичной ответной реакции, полной ответной реакции с наложенными ограничениями или полной ответной реакции, стойкой в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 циклов лечения или дольше, причем каждый указанный цикл лечения включает приблизительно 3 недели с введением указанного иммуноконъюгата в день 1 каждого указанного цикла лечения, или в течение 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 77 или 82 дней, соответственно.

11. Способ по п. 1, где иммуноконъюгат вводят индивиду в количестве, составляющем от 5 мг/м² или 10 мг/м² до менее 160 мг/м², предпочтительно, до 150 мг/м², 140 мг/м², 130 мг/м² или 120 мг/м².

12. Способ по п. 3, где указанная максимальная концентрация составляет менее 3 мкг/мл в случае введения 10 мг/м²; менее 8 мкг/мл в случае введения 20 мг/м², менее 15 мкг/мл в случае введения 40 мг/м², менее 25 мкг/мл в случае введения 80 мг/м², менее 30 мкг/мл в случае введения 120 мг/м².

13. Способ по п. 4, где указанная максимальная концентрация составляет менее 14 мкг/мл в случае введения 20 мг/м², менее 15 мкг/мл в случае введения 40 мг/м² или менее 25 мкг/мл в случае введения 80 мг/м².

14. Способ по п. 1, где у указанного пациента указанный CD138 экспрессирован на указанных клетках-мишенях и на клетках, не являющихся мишенями, где указанное введение приводит к среднему или медленному плазменному клиренсу иммуноконъюгата, и где указанные клетки, не являющиеся мишенями, экспрессирующие CD138, в частности эпителиальные клетки, по существу не подвергаются воздействию.

15. Способ по п. 14, где уровни экспрессии CD138 на указанных являющихся мишенями и клетках, не являющихся мишеневыми, экспрессирующих CD138, являются соизмеримыми.

16. Способ по п. 14 или 15, где эффективное вводимое количество составляет менее 200 мг/м² или менее чем количество, фармакокинетически эквивалентное 200 мг/м² при введении в комбинации со средством для лечения неблагоприятных побочных эффектов, и в котором указанное введение приводит к ответной реакции у указанного индивида, предпочтительно, через менее чем 40, 30, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5 часов.

17. Способ по п. 16, где указанное эффективное количество составляет более чем 120 мг/м².

18. Способ по п. 14, в котором указанное эффективное количество вводят в виде однократной дозы, повторной разовой дозы или в виде многократных доз.

19. Способ по п. 18, в котором значение Cmax после каждого введения составляет более чем 55% теоретического значения Cmax.

20. Способ по п. 14, в котором указанное введение приводит к уровням FLC или М-белка, соответствующим по крайней мере стабилизации заболевания, незначительной ответной реакции или частичной ответной реакции у указанного индивида, предпочтительно, после первого введения.

21. Способ по п. 1, в котором указанный иммуноконъюгат содержит антигенсвязывающую область (ABR) антитела против CD138 и дополнительную область антитела, причем по крайней мере часть указанной дополнительной области антитела является частью антитела человека и придает указанные свойства изотипа IgG4.

22. Способ по п. 21, где нацеливающее антитело является сконструированным антителом.

23. Способ по п. 21, где указанный иммуноконъюгат содержит nBT062 или нацеливающее антитело, идентичное по последовательности nBT062 по крайней мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, или соответствует ВТ062.

24. Способ по п. 1, который по существу предусматривает введение фармацевтической композиции, содержащей указанный иммуноконъюгат и фармацевтически приемлемый носитель, причем активный ингредиент указанной композиции по существу состоит из указанного иммуноконъюгата.

25. Способ по п. 1, где иммуноконъюгат вводят внутривенно.

26. Способ по п. 25, где иммуноконъюгат вводят внутривенно в повторной разовой дозе.

27. Способ по п. 1, где указанным заболеванием является плазмапролиферативное нарушение, связанное с экспрессией CD138, такое как множественная миелома, в частности рецидивирующая или резистентная множественная миелома.

28. Способ по п. 1 или 27, где указанное заболевание представляет собой рецидивирующую или резистентную множественную миелому.

29. Способ по п. 1 или 2, в котором указанное заболевание, при котором CD138 экспрессирован на клетках-мишенях, выбрано из группы, состоящей из почечно-клеточной карциномы, рака эндометрия, рака шейки матки, аденокарциномы предстательной железы, карциномы поджелудочной железы, рака желудка, рака мочевого пузыря, карциномы молочной железы, гепатокарциномы, колоректальной карциномы, карциномы ободочной кишки, плоскоклеточного рака, рака легкого, в частности плоскоклеточного рака легкого, неходжкинской лимфомы, карциномы вилочковой железы, матки, мочевых путей и яичника.

30. Способ по п. 1, в котором заболевание сопровождается болями в костях и/или осложнениями со стороны костей, и указанное введение указанного иммуноконъюгата уменьшает указанные боли в костях и/или осложнения со стороны костей, предпочтительно, до допустимого уровня.

31. Способ по п. 1, в котором пациент получает лечение по меньшей мере одним цитотоксическим средством.

32. Способ по п. 31, где по меньшей мере одно цитотоксическое средство представляет собой ингибитор протеасом, иммуномодулятор или антиангиогенное средство, ДНК-алкилирующее средство или смесь двух или более указанных средств.

33. Способ по п. 31 или 32, где по меньшей мере одно цитотоксическое средство представляет собой бортезомиб, талидомид, помалидомид, леналидомид, мелфалан или смесь двух или более указанных средств.

34. Способ лечения заболевания, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138, предусматривающий
введение нуждающемуся пациенту эффективного количества иммуноконъюгата, содержащего
по крайней мере одно нацеливающее антитело, мишенями которого являются клетки, экспрессирующие CD138, и
по крайней мере одну эффекторную молекулу, где указанное нацеливающее антитело функционально связано с указанной эффекторной молекулой с образованием указанного иммуноконъюгата,
где по меньшей мере одно нацеливающее антитело содержит тяжелую цепь, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности SEQ ID NO: 1, и легкую цепь, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности SEQ ID NO: 2, и
причем индивид не отвечает, или плохо отвечает, на лечение одним или несколькими цитотоксическими средствами, и где проводят лечение указанного заболевания.

35. Способ по п.34, где введение является внутривенным.

36. Способ лечения заболевания, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138, предусматривающий
введение пациенту, нуждающемуся в лечении и демонстрирующему высокие уровни sCD138, такие как более чем 50 нг/мл, более чем 60 нг/мл, более чем 70 нг/мл, более чем 80 нг/мл, более чем 100 нг/мл, более чем 150 нг/мл, более чем 200 нг/мл, более чем 200, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500 нг/мл, эффективного количества иммуноконъюгата, содержащего
по крайней мере одно нацеливающее антитело, мишенями которого являются клетки, экспрессирующие CD138, и
по крайней мере одну эффекторную молекулу, где указанное нацеливающее антитело функционально связано с указанной эффекторной молекулой с образованием указанного иммуноконъюгата,
где по меньшей мере одно нацеливающее антитело содержит тяжелую цепь, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности SEQ ID NO: 1, и легкую цепь, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности SEQ ID NO: 2, и
причем количество, составляющее ниже 20 мг/м² или ниже 40 мг/м², является эффективным для вызова ответной реакции, такой как незначительная ответная реакция, где указанный индивид не отвечает или отвечает слабо на лечение цитотоксическими средствами.

37. Способ по п. 36, где больной демонстрирует высокие уровни sCD138, превышающие 1000 нг/мл.

38. Способ по п. 36, в котором указанная ответная реакция является следствием селективного связывания иммуноконъюгата.

39. Способ по п. 34 или 36, в котором один или несколько цитотоксических средств включают иммуномодуляторы, такие как леналидомид, и/или ингибиторы протеасом, такие как бортезомиб.

40. Способ по п. 34 или 36, где пациент получал лечение цитотоксическим средством.

41. Способ по п. 40, где по меньшей мере одно цитотоксическое средство представляет собой ингибитор протеасом, иммуномодулятор или антиангиогенное средство, ДНК-алкилирующее средство или смесь двух или более указанных средств.

42. Способ по п. 41, где цитотоксическое средство представляет собой бортезомиб, талидомид, помалидомид, леналидомид, мелфалан или смесь двух или более указанных средств.

43. Противораковая комбинация, содержащая
по крайней мере одно цитотоксическое средство и по крайней мере один иммуноконъюгат, содержащий нацеливающее антитело, мишенями которого являются клетки, экспрессирующие CD138, и
по крайней мере одну эффекторную молекулу, где указанное нацеливающее антитело функционально связано с указанной эффекторной молекулой с образованием указанного иммуноконъюгата, где
(a) комбинация характеризуется коэффициентом синергизма более 1, более 1,1, более 1,2, более 1,3, более 1,4, или
(b) комбинация характеризуется значением Log₁₀ гибели клеток, превышающим 2, или
(с) комбинация характеризуется коэффициентом синергизма, составляющим приблизительно 1, и эффекторная молекула и цитотоксическое средство имеют интерферирующие механизмы действия,
и где по меньшей мере одно нацеливающее антитело содержит тяжелую цепь, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности SEQ ID NO: 1, и легкую цепь, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности SEQ ID NO: 2.

44. Противораковая комбинация по п. 43, в которой цитотоксическим средством является ингибитор протеасом, иммуномодулятор или антиангиогенное средство, ДНК-алкилирующее средство или смесь двух или более указанных средств.

45. Противораковая комбинация по п. 43, в которой цитотоксическим средством является бортезомиб, талидомид, леналидомид, мелфалан или смесь двух или более указанных средств.

46. Противораковая комбинация по п. 43, в которой нацеливающим антителом является сконструированное нацеливающее антитело, мишенями которого являются клетки, экспрессирующие CD138.

47. Противораковая комбинация по п. 46, в которой сконструированное нацеливающее антитело содержит ABR антитела против CD138 и дополнительную область антитела, где по крайней мере часть указанной дополнительной области антитела является частью антитела человека и придает свойства изотипа IgG4.

48. Противораковая комбинация по п. 47, в которой указанный иммуноконъюгат содержит nBT062 или нацеливающее антитело, идентичное по последовательности nBT062 по крайней мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, или соответствует ВТ062.

49. Противораковая комбинация по п. 43, в которой эффекторная молекула и цитотоксическое средство имеют интерферирующие механизмы действия, и где эти механизмы действия, предпочтительно, включают ингибирование образования микротрубочек или индукцию остановки клеточного цикла.

50. Противораковая комбинация по п. 49, в которой указанным интерферирующим механизмом действия является индукция остановки клеточного цикла, а указанным цитотоксическим средством является мелфалан, бортезомиб, леналидомид или талидомид.

51. Противораковая комбинация по п. 43, в которой эффекторная молекула и цитотоксическое средство имеют не интерферирующие механизмы действия.

52. Противораковая комбинация по п. 43, которая является фармацевтической композицией, содержащей по крайней мере один фармацевтически приемлемый наполнитель.

53. Противораковый набор, содержащий комбинацию по п.43 и инструкции, где один контейнер имеет по меньшей мере один иммуноконъюгат, а второй контейнер имеет по крайней мере одно цитотоксическое средство.

54. Способ лечения пролиферативного заболевания, связанного с клетками-мишенями, экспрессирующими CD138, у пациента с фенотипом резистентности, предусматривающий:
введение пациенту эффективного количества противораковой комбинации по любому из пп. 43-53 или противораковой комбинации, содержащей по крайней мере одно цитотоксическое средство и по крайней мере один иммуноконъюгат, содержащий нацеливающее антитело, мишенями которого являются клетки, экспрессирующие CD138, и по крайней мере одну эффекторную молекулу, причем указанное нацеливающее антитело функционально связано с указанной эффекторной молекулой с образованием указанного иммуноконъюгата, и где по меньшей мере одно нацеливающее антитело содержит тяжелую цепь, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности SEQ ID NO: 1, и легкую цепь, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности SEQ ID NO: 2.

55. Способ по п. 54, в случае которого CD138 «слущивается» с указанных клеток-мишеней указанного заболевания в течение периода времени, составляющего 24 часа, 2, 3, 4, 5, 6 дней.

56. Способ по п. 55, в котором указанным заболеванием является карцинома молочной железы.

57. Способ по п. 54, в котором иммуноконъюгат вызывает ремиссию солидной опухоли.

58. Способ по п. 57, в котором солидной опухолью является карцинома поджелудочной железы или карцинома молочной железы.

59. Способ по п. 57, в котором за указанной ремиссией следует промежуток времени без возобновления роста указанной опухоли.

60. Способ по п. 54, в котором указанным заболеванием является почечно-клеточная карцинома, рак эндометрия, рак шейки матки, аденокарцинома предстательной железы, карцинома поджелудочной железы, рак желудка, рак мочевого пузыря, карцинома молочной железы, гепатокарцинома, колоректальная карцинома, карцинома ободочной кишки, плоскоклеточный рак, рак легкого, в частности плоскоклеточный рак легкого, неходжкинская лимфома, карцинома вилочковой железы, матки, мочевых путей или яичника.

61. Способ по п. 57, в котором опухолью является карцинома молочной железы, которая является отрицательной по рецепторам эстрогена и/или отрицательной по рецепторам прогестерона, и/или резистентной к герцептину.