ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА
[0001] По этой заявке испрашивается приоритет временной заявки на патент США № 62/325,819, поданной 21 апреля 2016 года, которая включена в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме.
ПРАВИТЕЛЬСТВЕННАЯ ПОДДЕРЖКА
[0002] Это изобретение выполнено при поддержке по гранту National Institutes of Health (NIH) № R21 ARO61583 и R01 AR051930, гранту Medical Research Council (UK) № G0801061, Research Service of the Department of Veterans Affairs and Dystrophic Epidermolysis Bullosa Research Association.
КРАТКОЕ РАСКРЫТИЕ
[0003] В настоящем описании раскрыты способы получения синтетической кожи. В некоторых вариантах осуществления способ может включать формирование искусственного дермального слоя, содержащего фибробласт. В некоторых вариантах осуществления способ может включать дубление по меньшей мере части дермального слоя, тем самым формируя синтетическую кожу. В некоторых вариантах осуществления фибробласт можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно может включать формирование искусственного эпидермального слоя. В некоторых вариантах осуществления эпидермальный слой может содержать кератиноцит. В некоторых вариантах осуществления способ может включать размещение эпидермального слоя на дермальном слое, тем самым формируя слоистую структуру. В некоторых вариантах осуществления кератиноцит может представлять собой кератиноцит млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления млекопитающее может представлять собой не являющееся человеком млекопитающее. В некоторых вариантах осуществления кератиноцит можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. В некоторых вариантах осуществления кератиноцит может экспрессировать KRT14, p63, DSG3, ITGB4, LAMA5, KRT5, TAp63, Lamb3, KRT18 или их сочетание. В некоторых вариантах осуществления слоистая структура дополнительно может содержать меланоцит. В некоторых вариантах осуществления меланоцит можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. В некоторых вариантах осуществления меланоцит может экспрессировать Sox-10, MITF-M, gp-100, DCT, TYR, MLANA или их сочетание. В некоторых вариантах осуществления синтетическая кожа может содержать пигмент. В некоторых вариантах осуществления меланоцит может представлять собой меланоцит млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления млекопитающим может быть человек. В некоторых вариантах осуществления фибробласт может экспрессировать CD10, CD73, CD44, CD90, коллаген I типа, коллаген III типа, пролил-4-гидроксилазу β или их сочетание. В некоторых вариантах осуществления фибробласт может представлять собой фибробласт млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления млекопитающее может представлять собой не являющееся человеком млекопитающее. В некоторых вариантах осуществления не являющееся человеком млекопитающее может представлять собой одно из примата, коровы, овцы, свиньи, лошади, собаки, кошки, грызуна или зайцеобразного. В некоторых вариантах осуществления фибробласт может представлять собой фибробласт не млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления не млекопитающее может представлять собой рыбу, птицу или рептилию. В некоторых вариантах осуществления эпидермальный слой дополнительно может содержать коллаген. В некоторых вариантах осуществления эпидермальный слой можно подвергать дополнительной обработке. В некоторых вариантах осуществления слоистая структура дополнительно может содержать коллаген. В некоторых вариантах осуществления слоистую структуру можно подвергать дополнительной обработке. В некоторых вариантах осуществления дермальный слой дополнительно может содержать коллаген. В некоторых вариантах осуществления дермальный слой можно подвергать дополнительной обработке. В некоторых вариантах осуществления обработку можно выбирать из группы, состоящей из консервации, вымачивания, мягчения, пикелевания, распикелевания, уменьшения толщины, додубления, смазывания, получения кожи краст, увлажнения, отжимания, стрижки, рехромирования, нейтрализации, окрашивания, жирования, заполнения, нарезания на полосы, увлажнения жирами, отбеливания, фиксации, разводки, сушки, кондиционирования, мятья, тяжки, шлифования, отделки, обработки маслами, обработки щеткой, грунтования, импрегнирования, опрыскивания, валкового покрывания, нанесения покрытия поливом, полирования, расплющивания, тиснения, утюжения, глазирования, мятья в барабане и любого их сочетания. В некоторых вариантах осуществления коллаген можно получать по меньшей мере отчасти с помощью продуцирующей коллаген клетки, можно добавлять отдельно или любое их сочетание. В некоторых вариантах осуществления продуцирующая коллаген клетка может содержать эпителиальную клетку, кератиноцит, фибробласт, корнеоцит, меланоцит, клетку Лангерганса, базальную клетку или их сочетание. В некоторых вариантах осуществления продуцирующая коллаген клетка может содержать эпителиальную клетку, где эпителиальная клетка может содержать сквамозную клетку, кубовидную клетку, цилиндрическую клетку, базальную клетку или их сочетание. В некоторых вариантах осуществления продуцирующая коллаген клетка может содержать кератиноцит, где кератиноцит может содержать эпителиальный кератиноцит, базальный кератиноцит, пролиферирующий базальный кератиноцит, дифференцированный надбазальный кератиноцит или их сочетание. В некоторых вариантах осуществления продуцирующая коллаген клетка может содержать гладкомышечную клетку. В некоторых вариантах осуществления синтетическая кожа дополнительно может содержать одно или несколько из кератина, эластина, желатина, протеогликана, протеогликана дерматансульфата, гликозаминогликана, фибронектина, ламинина, дерматопонтина, липида, жирной кислоты, углевода или их сочетания. В некоторых вариантах осуществления толщина дермального слоя может находиться в диапазоне от приблизительно 0,02 мм до приблизительно 5 мм. В некоторых вариантах осуществления толщина дермального слоя может находиться в диапазоне от приблизительно 0,1 мм до приблизительно 0,5 мм. В некоторых вариантах осуществления синтетическая кожа дополнительно может содержать первый дермальный слой и второй дермальный слой. В некоторых вариантах осуществления первый дермальный слой можно помещать на второй дермальный слой. В некоторых вариантах осуществления толщина эпидермального слоя может находиться в диапазоне от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 2 мм. В некоторых вариантах осуществления толщина эпидермального слоя может находиться в диапазоне от приблизительно 0,1 мм до приблизительно 0,2 мм. В некоторых вариантах осуществления синтетическая кожа дополнительно может содержать первый эпидермальный слой и второй эпидермальный слой. В некоторых вариантах осуществления синтетическая кожа дополнительно может содержать заменитель базальной мембраны. В некоторых вариантах осуществления заменитель базальной мембраны может находиться между эпидермальным слоем и дермальным слоем. В некоторых вариантах осуществления заменитель базальной мембраны может содержать высушенную бесклеточную амниотическую мембрану. В некоторых вариантах осуществления дермальный слой можно формировать на каркасе. В некоторых вариантах осуществления каркас может быть природным или синтетическим. В некоторых вариантах осуществления каркас может содержать шелк. В некоторых вариантах осуществления каркас может содержать хитозан. В некоторых вариантах осуществления каркас может содержать природный тканевой адгезив. В некоторых вариантах осуществления природный тканевой адгезив может содержать фибриновый клей. В некоторых вариантах осуществления каркас может содержаться отчасти в синтетической коже. В некоторых вариантах осуществления дермальный слой или эпидермальный слой можно культивировать in vitro. В некоторых вариантах осуществления дермальный слой можно культивировать in vitro. В некоторых вариантах осуществления дермальный слой можно культивировать с добавкой. В некоторых вариантах осуществления добавка может содержать одно или несколько из коллагена, фибрина, факторов роста, аскорбиновой кислоты, декстрансульфата или каррагенана. В некоторых вариантах осуществления добавка может представлять собой природную добавку. В некоторых вариантах осуществления добавка может представлять собой синтетическую добавку. В некоторых вариантах осуществления индуцированную плюрипотентную стволовую клетку можно получать через индуцированную экспрессию гена Oct3, Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc или их сочетания во зрелой соматической клетке. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере часть изделия из кожи можно формировать с помощью способов, раскрытых в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления изделие из кожи может содержать одно или несколько из ремешка часов, ремня, упаковки, туфли, ботинка, обуви, перчатки, одежды, багажа, сумки, клатча, портмоне, рюкзака, кошелька, седла, упряжи, плети, интерьера, экстерьера, обивки, книжного переплета, мебели, лампы, абажура лампы, скатерти, покрытия стены, покрытия пола, покрытия потолка, интерьера автомобиля, экстерьера автомобиля, интерьера лодки, экстерьера лодки, интерьера самолета, интерьера яхты, экстерьера яхты, наволочки, простыни, пододеяльника, ювелирного изделия, аксессуара, очков, солнцезащитных очков или потребительской электроники. В некоторых вариантах осуществления изделие из кожи может представлять собой ремешок часов. В некоторых вариантах осуществления изделие из кожи может представлять собой ремень. В некоторых вариантах осуществления изделие из кожи может представлять собой сумку. По меньшей мере приблизительно 2% клеток, содержащихся в синтетической коже, можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. По меньшей мере приблизительно 10% клеток, содержащихся в синтетической коже, можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. По меньшей мере приблизительно 50% клеток, содержащихся в синтетической коже, можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки.
[0004] В настоящем описании раскрыты способы получения синтетической кожи. В некоторых вариантах осуществления способ может включать размещение искусственного эпидермального слоя на искусственном дермальном слое, тем самым формируя слоистую структуру. В некоторых вариантах осуществления эпидермальный слой может содержать кератиноцит и дермальный слой может содержать фибробласт. В некоторых вариантах осуществления способ может включать дубление по меньшей мере части слоистой структуры, тем самым формируя синтетическую кожу. В некоторых вариантах осуществления фибробласт или кератиноцит можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. В некоторых вариантах осуществления кератиноцит может представлять собой кератиноцит млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления млекопитающее может представлять собой не являющееся человеком млекопитающее. В некоторых вариантах осуществления кератиноцит можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. В некоторых вариантах осуществления кератиноцит может экспрессировать KRT14, p63, DSG3, ITGB4, LAMA5, KRT5, TAp63, Lamb3, KRT18 или их сочетание. В некоторых вариантах осуществления слоистая структура дополнительно может содержать меланоцит. В некоторых вариантах осуществления меланоцит можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. В некоторых вариантах осуществления меланоцит может экспрессировать Sox-10, MITF-M, gp-100, DCT, TYR, MLANA или их сочетание. В некоторых вариантах осуществления синтетическая кожа может содержать пигмент. В некоторых вариантах осуществления меланоцит может представлять собой меланоцит млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления млекопитающим может быть человек. В некоторых вариантах осуществления фибробласт можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. В некоторых вариантах осуществления фибробласт может экспрессировать CD10, CD73, CD44, CD90, коллаген I типа, коллаген III типа, пролил-4-гидроксилазу β или их сочетание. В некоторых вариантах осуществления фибробласт может представлять собой фибробласт млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления млекопитающее может представлять собой не являющееся человеком млекопитающее. В некоторых вариантах осуществления не являющееся человеком млекопитающее может представлять собой одно из примата, коровы, овцы, свиньи, лошади, собаки, кошки, грызуна или зайцеобразного. В некоторых вариантах осуществления фибробласт может представлять собой фибробласт не млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления не млекопитающее может представлять собой рыбу, птицу или рептилию. В некоторых вариантах осуществления эпидермальный слой дополнительно может содержать коллаген. В некоторых вариантах осуществления эпидермальный слой можно подвергать дополнительной обработке. В некоторых вариантах осуществления слоистая структура дополнительно может содержать коллаген. В некоторых вариантах осуществления слоистую структуру можно подвергать дополнительной обработке. В некоторых вариантах осуществления дермальный слой дополнительно может содержать коллаген. В некоторых вариантах осуществления дермальный слой можно подвергать дополнительной обработке. В некоторых вариантах осуществления обработку можно выбирать из группы, состоящей из консервации, вымачивания, мягчения, пикелевания, распикелевания, уменьшения толщины, додубления, смазывания, получения кожи краст, увлажнения, отжимания, стрижки, рехромирования, нейтрализации, окрашивания, жирования, заполнения, нарезания на полосы, увлажнения жирами, отбеливания, фиксации, разводки, сушки, кондиционирования, мятья, тяжки, шлифования, отделки, обработки маслами, обработки щеткой, грунтования, импрегнирования, опрыскивания, валкового покрывания, нанесения покрытия поливом, полирования, расплющивания, тиснения, утюжения, глазирования, мятья в барабане и любого их сочетания. В некоторых вариантах осуществления коллаген можно получать по меньшей мере отчасти посредством продуцирующей коллаген клетки, можно добавлять отдельно или любое их сочетание. В некоторых вариантах осуществления продуцирующая коллаген клетка может включать эпителиальную клетку, кератиноцит, фибробласт, корнеоцит, меланоцит, клетку Лангерганса, базальную клетку или их сочетание. В некоторых вариантах осуществления продуцирующая коллаген клетка может содержать эпителиальную клетку, где эпителиальная клетка может включать сквамозную клетку, кубовидную клетку, цилиндрическую клетку, базальную клетку или их сочетание. В некоторых вариантах осуществления продуцирующая коллаген клетка может содержать кератиноцит, где кератиноцит может включать эпителиальный кератиноцит, базальный кератиноцит, пролиферирующий базальный кератиноцит, дифференцированный надбазальный кератиноцит или их сочетание. В некоторых вариантах осуществления продуцирующая коллаген клетка может содержать гладкомышечную клетку. В некоторых вариантах осуществления синтетическая кожа дополнительно может содержать одно или несколько из кератина, эластина, желатина, протеогликана, протеогликана дерматансульфата, гликозаминогликана, фибронектина, ламинина, дерматопонтина, липида, жирной кислоты, углевода или их сочетания. В некоторых вариантах осуществления толщина дермального слоя может находиться в диапазоне от приблизительно 0,02 мм до приблизительно 5 мм. В некоторых вариантах осуществления толщина дермального слоя может находиться в диапазоне от приблизительно 0,1 мм до приблизительно 0,5 мм. В некоторых вариантах осуществления синтетическая кожа дополнительно может содержать первый дермальный слой и второй дермальный слой. В некоторых вариантах осуществления первый дермальный слой можно помещать на второй дермальный слой. В некоторых вариантах осуществления толщина эпидермального слоя может находиться в диапазоне от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 2 мм. В некоторых вариантах осуществления толщина эпидермального слоя может находиться в диапазоне от приблизительно 0,1 мм до приблизительно 0,2 мм. В некоторых вариантах осуществления синтетическая кожа дополнительно может содержать первый эпидермальный слой и второй эпидермальный слой. В некоторых вариантах осуществления синтетическая кожа дополнительно может содержать заменитель базальной мембраны. В некоторых вариантах осуществления заменитель базальной мембраны может находиться между эпидермальным слоем и дермальным слоем. В некоторых вариантах осуществления заменитель базальной мембраны может содержать высушенную бесклеточную амниотическую мембрану. В некоторых вариантах осуществления дермальный слой можно формировать на каркасе. В некоторых вариантах осуществления каркас может быть природным или синтетическим. В некоторых вариантах осуществления каркас может содержать шелк. В некоторых вариантах осуществления каркас может содержать хитозан. В некоторых вариантах осуществления каркас может содержать природный тканевой адгезив. В некоторых вариантах осуществления природный тканевой адгезив может содержать фибриновый клей. В некоторых вариантах осуществления каркас может содержаться отчасти в синтетической коже. В некоторых вариантах осуществления дермальный слой или эпидермальный слой можно культивировать in vitro. В некоторых вариантах осуществления дермальный слой можно культивировать in vitro. В некоторых вариантах осуществления дермальный слой можно культивировать с добавкой. В некоторых вариантах осуществления добавка может содержать одно или несколько из коллагена, фибрина, факторов роста, аскорбиновой кислоты, декстрансульфата или каррагенана. В некоторых вариантах осуществления добавка может представлять собой природную добавку. В некоторых вариантах осуществления добавка может представлять собой синтетическую добавку. В некоторых вариантах осуществления индуцированную плюрипотентную стволовую клетку можно получать через индуцированную экспрессию гена Oct3, Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc или их сочетания во зрелой соматической клетке. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере часть изделия из кожи можно формировать с помощью способов, раскрытых в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления изделие из кожи может содержать одно или несколько из ремешка часов, ремня, упаковки, туфли, ботинка, обуви, перчатки, одежды, багажа, сумки, клатча, портмоне, рюкзака, кошелька, седла, упряжи, плети, интерьера, экстерьера, обивки, книжного переплета, мебели, лампы, абажура лампы, скатерти, покрытия стены, покрытия пола, покрытия потолка, интерьера автомобиля, экстерьера автомобиля, интерьера лодки, экстерьера лодки, интерьера самолета, интерьера яхты, экстерьера яхты, наволочки, простыни, пододеяльника, ювелирного изделия, аксессуара, очков, солнцезащитных очков или потребительской электроники. В некоторых вариантах осуществления изделие из кожи может представлять собой ремешок часов. В некоторых вариантах осуществления изделие из кожи может представлять собой ремень. В некоторых вариантах осуществления изделие из кожи может представлять собой сумку. По меньшей мере приблизительно 2% клеток, содержащихся в синтетической коже, можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. По меньшей мере приблизительно 10% клеток, содержащихся в синтетической коже, можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. По меньшей мере приблизительно 50% клеток, содержащихся в синтетической коже, можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки.
[0005] В настоящем описании раскрыты способы получения синтетической кожи. В некоторых вариантах осуществления способ может включать размещение искусственного эпидермального слоя на искусственном дермальном слое, тем самым формируя слоистую структуру. В некоторых вариантах осуществления эпидермальный слой может содержать кератиноцит и дермальный слой может содержать фибробласт. В некоторых вариантах осуществления способ может включать удаление по меньшей мере части эпидермального слоя из слоистой структуры для того, чтобы формировать удаленный продукт. В некоторых вариантах осуществления способ может включать дубление по меньшей мере части удаленного продукта, тем самым формируя синтетическую кожу. В некоторых вариантах осуществления фибробласт или кератиноцит можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. В некоторых вариантах осуществления кератиноцит может представлять собой кератиноцит млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления млекопитающее может представлять собой не являющееся человеком млекопитающее. В некоторых вариантах осуществления кератиноцит можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. В некоторых вариантах осуществления кератиноцит может экспрессировать KRT14, p63, DSG3, ITGB4, LAMA5, KRT5, TAp63, Lamb3, KRT18 или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления слоистая структура дополнительно может содержать меланоцит. В некоторых вариантах осуществления меланоцит можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. В некоторых вариантах осуществления меланоцит может экспрессировать Sox-10, MITF-M, gp-100, DCT, TYR, MLANA или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления синтетическая кожа может содержать пигмент. В некоторых вариантах осуществления меланоцит может представлять собой меланоцит млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления млекопитающим может быть человек. В некоторых вариантах осуществления фибробласт можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. В некоторых вариантах осуществления фибробласт может экспрессировать CD10, CD73, CD44, CD90, коллаген I типа, коллаген III типа, пролил-4-гидроксилазу β или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления удаленный продукт дополнительно может содержать коллаген. В некоторых вариантах осуществления удаленный продукт можно подвергать дополнительной обработке. В некоторых вариантах осуществления фибробласт может представлять собой фибробласт млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления млекопитающее может представлять собой не являющееся человеком млекопитающее. В некоторых вариантах осуществления не являющееся человеком млекопитающее может представлять собой одно из примата, коровы, овцы, свиньи, лошади, собаки, кошки, грызуна или зайцеобразного. В некоторых вариантах осуществления фибробласт может представлять собой фибробласт не млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления не млекопитающее может представлять собой рыбу, птицу или рептилию. В некоторых вариантах осуществления эпидермальный слой дополнительно может содержать коллаген. В некоторых вариантах осуществления эпидермальный слой можно подвергать дополнительной обработке. В некоторых вариантах осуществления слоистая структура дополнительно может содержать коллаген. В некоторых вариантах осуществления слоистую структуру можно подвергать дополнительной обработке. В некоторых вариантах осуществления дермальный слой дополнительно может содержать коллаген. В некоторых вариантах осуществления дермальный слой можно подвергать дополнительной обработке. В некоторых вариантах осуществления обработку можно выбирать из группы, состоящей из консервации, вымачивания, мягчения, пикелевания, распикелевания, уменьшения толщины, додубления, смазывания, получения кожи краст, увлажнения, отжимания, стрижки, рехромирования, нейтрализации, окрашивания, жирования, заполнения, нарезания на полосы, увлажнения жирами, отбеливания, фиксации, разводки, сушки, кондиционирования, мятья, тяжки, шлифования, отделки, обработки маслами, обработки щеткой, грунтования, импрегнирования, опрыскивания, валкового покрывания, нанесения покрытия поливом, полирования, расплющивания, тиснения, утюжения, глазирования, мятья в барабане и любого их сочетания. В некоторых вариантах осуществления коллаген можно получать по меньшей мере отчасти посредством продуцирующей коллаген клетки, можно добавлять отдельно или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления продуцирующая коллаген клетка может включать эпителиальную клетку, кератиноцит, фибробласт, корнеоцит, меланоцит, клетку Лангерганса, базальную клетку или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления продуцирующая коллаген клетка может содержать эпителиальную клетку, где эпителиальная клетка может включать сквамозную клетку, кубовидную клетку, цилиндрическую клетку, базальную клетку или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления продуцирующая коллаген клетка может содержать кератиноцит, где кератиноцит может включать эпителиальный кератиноцит, базальный кератиноцит, пролиферирующий базальный кератиноцит, дифференцированный надбазальный кератиноцит или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления продуцирующая коллаген клетка может содержать гладкомышечную клетку. В некоторых вариантах осуществления синтетическая кожа дополнительно может содержать одно или несколько из кератина, эластина, желатина, протеогликана, протеогликана дерматансульфата, гликозаминогликана, фибронектина, ламинина, дерматопонтина, липида, жирной кислоты, углевода или их сочетания. В некоторых вариантах осуществления толщина дермального слоя может находиться в диапазоне от приблизительно 0,02 мм до приблизительно 5 мм. В некоторых вариантах осуществления толщина дермального слоя может находиться в диапазоне от приблизительно 0,1 мм до приблизительно 0,5 мм. В некоторых вариантах осуществления синтетическая кожа дополнительно может содержать первый дермальный слой и второй дермальный слой. В некоторых вариантах осуществления первый дермальный слой можно помещать на второй дермальный слой. В некоторых вариантах осуществления толщина эпидермального слоя может находиться в диапазоне от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 2 мм. В некоторых вариантах осуществления толщина эпидермального слоя может находиться в диапазоне от приблизительно 0,1 мм до приблизительно 0,2 мм. В некоторых вариантах осуществления синтетическая кожа дополнительно может содержать первый эпидермальный слой и второй эпидермальный слой. В некоторых вариантах осуществления синтетическая кожа дополнительно может содержать заменитель базальной мембраны. В некоторых вариантах осуществления заменитель базальной мембраны может находиться между эпидермальным слоем и дермальным слоем. В некоторых вариантах осуществления заменитель базальной мембраны может содержать высушенную бесклеточную амниотическую мембрану. В некоторых вариантах осуществления дермальный слой можно формировать на каркасе. В некоторых вариантах осуществления каркас может быть природным или синтетическим. В некоторых вариантах осуществления каркас может содержать шелк. В некоторых вариантах осуществления каркас может содержать хитозан. В некоторых вариантах осуществления каркас может содержать природный тканевой адгезив. В некоторых вариантах осуществления природный тканевой адгезив может содержать фибриновый клей. В некоторых вариантах осуществления каркас может содержаться отчасти в синтетической коже. В некоторых вариантах осуществления дермальный слой или эпидермальный слой можно культивировать in vitro. В некоторых вариантах осуществления дермальный слой можно культивировать in vitro. В некоторых вариантах осуществления дермальный слой можно культивировать с добавкой. В некоторых вариантах осуществления добавка может содержать одно или несколько из коллагена, фибрина, факторов роста, аскорбиновой кислоты, декстрансульфата или каррагенана. В некоторых вариантах осуществления добавка может представлять собой природную добавку. В некоторых вариантах осуществления добавка может представлять собой синтетическую добавку. В некоторых вариантах осуществления индуцированную плюрипотентную стволовую клетку можно получать через индуцированную экспрессию гена Oct3, Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc или их сочетания во зрелой соматической клетке. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере часть изделия из кожи можно формировать с помощью способов, раскрытых в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления изделие из кожи может содержать одно или несколько из ремешка часов, ремня, упаковки, туфли, ботинка, обуви, перчатки, одежды, багажа, сумки, клатча, портмоне, рюкзака, кошелька, седла, упряжи, плети, интерьера, экстерьера, обивки, книжного переплета, мебели, лампы, абажура лампы, скатерти, покрытия стены, покрытия пола, покрытия потолка, интерьера автомобиля, экстерьера автомобиля, интерьера лодки, экстерьера лодки, интерьера самолета, интерьера яхты, экстерьера яхты, наволочки, простыни, пододеяльника, ювелирного изделия, аксессуара, очков, солнцезащитных очков или потребительской электроники. В некоторых вариантах осуществления изделие из кожи может представлять собой ремешок часов. В некоторых вариантах осуществления изделие из кожи может представлять собой ремень. В некоторых вариантах осуществления изделие из кожи может представлять собой сумку. По меньшей мере приблизительно 2% клеток, содержащихся в синтетической коже, можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. По меньшей мере приблизительно 10% клеток, содержащихся в синтетической коже, можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. По меньшей мере приблизительно 50% клеток, содержащихся в синтетической коже, можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки.
[0006] В настоящем описании раскрыта дубленая синтетическая кожа. В некоторых вариантах осуществления перед дублением дубленая синтетическая кожа может содержать искусственный дермальный слой, содержащий фибробласт. В некоторых вариантах осуществления фибробласт можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. В некоторых вариантах осуществления перед дублением, дубленая синтетическая кожа дополнительно может содержать искусственный эпидермальный слой. В некоторых вариантах осуществления эпидермальный слой дополнительно может содержать кератиноцит. В некоторых вариантах осуществления эпидермальный слой может находиться на дермальном слое, тем самым формируя слоистую структуру. В некоторых вариантах осуществления кератиноцит может представлять собой кератиноцит млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления млекопитающее может представлять собой не являющееся человеком млекопитающее. В некоторых вариантах осуществления кератиноцит можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. В некоторых вариантах осуществления кератиноцит может экспрессировать KRT14, p63, DSG3, ITGB4, LAMA5, KRT5, TAp63, Lamb3, KRT18 или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления слоистая структура дополнительно может содержать меланоцит. В некоторых вариантах осуществления меланоцит можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. В некоторых вариантах осуществления меланоцит может экспрессировать Sox-10, MITF-M, gp-100, DCT, TYR, MLANA или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления синтетическая кожа дополнительно может содержать пигмент. В некоторых вариантах осуществления меланоцит может представлять собой меланоцит млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления млекопитающее может представлять собой не являющееся человеком млекопитающее. В некоторых вариантах осуществления фибробласт может экспрессировать CD10, CD73, CD44, CD90, коллаген I типа, коллаген III типа, пролил-4-гидроксилазу β или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления фибробласт может представлять собой фибробласт млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления млекопитающее может представлять собой не являющееся человеком млекопитающее. В некоторых вариантах осуществления не являющееся человеком млекопитающее может представлять собой одно из примата, коровы, овцы, свиньи, лошади, собаки, кошки, грызуна или зайцеобразного. В некоторых вариантах осуществления фибробласт может представлять собой фибробласт не млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления не млекопитающее может представлять собой рыбу, птицу или рептилию. В некоторых вариантах осуществления эпидермальный слой дополнительно может содержать коллаген. В некоторых вариантах осуществления слоистая структура дополнительно может содержать коллаген. В некоторых вариантах осуществления дермальный слой дополнительно может содержать коллаген. В некоторых вариантах осуществления коллаген можно получать по меньшей мере отчасти посредством продуцирующей коллаген клетки, можно добавлять отдельно или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления продуцирующая коллаген клетка может включать эпителиальную клетку, кератиноцит, фибробласт, корнеоцит, меланоцит, клетку Лангерганса, базальную клетку или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления продуцирующая коллаген клетка может содержать эпителиальную клетку, где эпителиальная клетка может включать сквамозную клетку, кубовидную клетку, цилиндрическую клетку, базальную клетку или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления продуцирующая коллаген клетка может содержать кератиноцит, где кератиноцит включает эпителиальный кератиноцит, базальный кератиноцит, пролиферирующий базальный кератиноцит, дифференцированный надбазальный кератиноцит или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления продуцирующие коллаген клетки могут включать гладкомышечную клетку. В некоторых вариантах осуществления синтетическая кожа дополнительно может содержать одно или несколько из кератина, эластина, желатина, протеогликана, протеогликана дерматансульфата, гликозаминогликана, фибронектина, ламинина, дерматопонтина, липида, жирной кислоты, углевода или их сочетания. В некоторых вариантах осуществления толщина дермального слоя может находиться в диапазоне от приблизительно 0,02 мм до приблизительно 5 мм. В некоторых вариантах осуществления толщина дермального слоя может находиться в диапазоне от приблизительно 0,1 мм до приблизительно 0,5 мм. В некоторых вариантах осуществления синтетическая кожа дополнительно может содержать первый дермальный слой и второй дермальный слой. В некоторых вариантах осуществления первый дермальный слой может находиться на втором дермальном слое. В некоторых вариантах осуществления толщина эпидермального слоя может находиться в диапазоне от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 2 мм. В некоторых вариантах осуществления толщина эпидермального слоя может находиться в диапазоне от приблизительно 0,1 мм до приблизительно 0,2 мм. В некоторых вариантах осуществления синтетическая кожа дополнительно может содержать первый эпидермальный слой и второй эпидермальный слой. В некоторых вариантах осуществления синтетическая кожа может содержать заменитель базальной мембраны. В некоторых вариантах осуществления заменитель базальной мембраны может находиться между эпидермальным слоем и дермальным слоем. В некоторых вариантах осуществления заменитель базальной мембраны может содержать высушенную бесклеточную амниотическую мембрану. В некоторых вариантах осуществления дермальный слой можно формировать на каркасе. В некоторых вариантах осуществления каркас может быть природным или синтетическим. В некоторых вариантах осуществления каркас может содержать шелк. В некоторых вариантах осуществления каркас может содержать хитозан. В некоторых вариантах осуществления каркас может содержать природный тканевой адгезив. В некоторых вариантах осуществления природный тканевой адгезив может содержать фибриновый клей. В некоторых вариантах осуществления каркас может содержаться отчасти в дубленой синтетической коже. В некоторых вариантах осуществления дермальный слой или эпидермальный слой можно культивировать in vitro. В некоторых вариантах осуществления дермальный слой можно культивировать in vitro. В некоторых вариантах осуществления дубленая синтетическая кожа может содержаться в одном или нескольких из ремешка часов, ремня, упаковки, туфли, ботинка, обуви, перчатки, одежды, багажа, сумки, клатча, портмоне, рюкзака, кошелька, седла, упряжи, плети, интерьера, экстерьера, обивки, книжного переплета, мебели, лампы, абажура лампы, скатерти, покрытия стены, покрытия пола, покрытия потолка, интерьера автомобиля, экстерьера автомобиля, интерьера лодки, экстерьера лодки, интерьера самолета, интерьера яхты, экстерьера яхты, наволочки, простыни, пододеяльника, ювелирного изделия, аксессуара, очков, солнцезащитных очков или потребительской электроники. В некоторых вариантах осуществления дубленая синтетическая кожа может содержаться в ремешке часов. В некоторых вариантах осуществления дубленая синтетическая кожа может содержаться в ремне. В некоторых вариантах осуществления дубленая синтетическая кожа может содержаться в сумке. По меньшей мере приблизительно 2% клеток, содержащихся в дубленой синтетической коже, можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. По меньшей мере приблизительно 10% клеток, содержащихся в дубленой синтетической коже, можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. По меньшей мере приблизительно 50% клеток, содержащихся в дубленой синтетической коже, можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки.
[0007] В настоящем описании раскрыта дубленая синтетическая кожа. В некоторых вариантах осуществления перед дублением дубленая синтетическая кожа может содержать слоистую структуру. В некоторых вариантах осуществления слоистая структура может содержать искусственный дермальный слой. В некоторых вариантах осуществления дермальный слой может содержать фибробласт. В некоторых вариантах осуществления слоистая структура может содержать искусственный эпидермальный слой. В некоторых вариантах осуществления эпидермальный слой может содержать кератиноцит. В некоторых вариантах осуществления фибробласт или кератиноцит можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. В некоторых вариантах осуществления фибробласт можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. В некоторых вариантах осуществления кератиноцит может представлять собой кератиноцит млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления млекопитающее может представлять собой не являющееся человеком млекопитающее. В некоторых вариантах осуществления кератиноцит можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. В некоторых вариантах осуществления кератиноцит может экспрессировать KRT14, p63, DSG3, ITGB4, LAMA5, KRT5, TAp63, Lamb3, KRT18 или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления слоистая структура дополнительно может содержать меланоцит. В некоторых вариантах осуществления меланоцит можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. В некоторых вариантах осуществления меланоцит может экспрессировать Sox-10, MITF-M, gp-100, DCT, TYR, MLANA или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления синтетическая кожа дополнительно может содержать пигмент. В некоторых вариантах осуществления меланоцит может представлять собой меланоцит млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления млекопитающее может представлять собой не являющееся человеком млекопитающее. В некоторых вариантах осуществления фибробласт может экспрессировать CD10, CD73, CD44, CD90, коллаген I типа, коллаген III типа, пролил-4-гидроксилазу β или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления фибробласт может представлять собой фибробласт млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления млекопитающее может представлять собой не являющееся человеком млекопитающее. В некоторых вариантах осуществления не являющееся человеком млекопитающее может представлять собой одно из примата, коровы, овцы, свиньи, лошади, собаки, кошки, грызуна или зайцеобразного. В некоторых вариантах осуществления фибробласт может представлять собой фибробласт не млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления не млекопитающее может представлять собой рыбу, птицу или рептилию. В некоторых вариантах осуществления эпидермальный слой дополнительно может содержать коллаген. В некоторых вариантах осуществления слоистая структура дополнительно может содержать коллаген. В некоторых вариантах осуществления дермальный слой дополнительно может содержать коллаген. В некоторых вариантах осуществления коллаген можно получать по меньшей мере отчасти посредством продуцирующей коллаген клетки, можно добавлять отдельно или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления продуцирующая коллаген клетка может включать эпителиальную клетку, кератиноцит, фибробласт, корнеоцит, меланоцит, клетку Лангерганса, базальную клетку или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления продуцирующая коллаген клетка может содержать эпителиальную клетку, где эпителиальная клетка может включать сквамозную клетку, кубовидную клетку, цилиндрическую клетку, базальную клетку или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления продуцирующая коллаген клетка может содержать кератиноцит, где кератиноцит включает эпителиальный кератиноцит, базальный кератиноцит, пролиферирующий базальный кератиноцит, дифференцированный надбазальный кератиноцит или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления продуцирующие коллаген клетки могут содержать гладкомышечную клетку. В некоторых вариантах осуществления синтетическая кожа дополнительно может содержать одно или несколько из кератина, эластина, желатина, протеогликана, протеогликана дерматансульфата, гликозаминогликана, фибронектина, ламинина, дерматопонтина, липида, жирной кислоты, углевода или их сочетания. В некоторых вариантах осуществления толщина дермального слоя может находиться в диапазоне от приблизительно 0,02 мм до приблизительно 5 мм. В некоторых вариантах осуществления толщина дермального слоя может находиться в диапазоне от приблизительно 0,1 мм до приблизительно 0,5 мм. В некоторых вариантах осуществления синтетическая кожа дополнительно может содержать первый дермальный слой и второй дермальный слой. В некоторых вариантах осуществления первый дермальный слой может находиться на втором дермальном слое. В некоторых вариантах осуществления толщина эпидермального слоя может находиться в диапазоне от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 2 мм. В некоторых вариантах осуществления толщина эпидермального слоя может находиться в диапазоне от приблизительно 0,1 мм до приблизительно 0,2 мм. В некоторых вариантах осуществления синтетическая кожа дополнительно может содержать первый эпидермальный слой и второй эпидермальный слой. В некоторых вариантах осуществления синтетическая кожа может содержать заменитель базальной мембраны. В некоторых вариантах осуществления заменитель базальной мембраны может находиться между эпидермальным слоем и дермальным слоем. В некоторых вариантах осуществления заменитель базальной мембраны может содержать высушенную бесклеточную амниотическую мембрану. В некоторых вариантах осуществления дермальный слой можно формировать на каркасе. В некоторых вариантах осуществления каркас может быть природным или синтетическим. В некоторых вариантах осуществления каркас может содержать шелк. В некоторых вариантах осуществления каркас может содержать хитозан. В некоторых вариантах осуществления каркас может содержать природный тканевой адгезив. В некоторых вариантах осуществления природный тканевой адгезив может содержать фибриновый клей. В некоторых вариантах осуществления каркас может содержаться отчасти в дубленой синтетической коже. В некоторых вариантах осуществления дермальный слой или эпидермальный слой можно культивировать in vitro. В некоторых вариантах осуществления дермальный слой можно культивировать in vitro. В некоторых вариантах осуществления дубленая синтетическая кожа может содержаться в одном или нескольких из ремешка часов, ремня, упаковки, туфли, ботинка, обуви, перчатки, одежды, багажа, сумки, клатча, портмоне, рюкзака, кошелька, седла, упряжи, плети, интерьера, экстерьера, обивки, книжного переплета, мебели, лампы, абажура лампы, скатерти, покрытия стены, покрытия пола, покрытия потолка, интерьера автомобиля, экстерьера автомобиля, интерьера лодки, экстерьера лодки, интерьера самолета, интерьера яхты, экстерьера яхты, наволочки, простыни, пододеяльника, ювелирного изделия, аксессуара, очков, солнцезащитных очков или потребительской электроники. В некоторых вариантах осуществления дубленая синтетическая кожа может содержаться в ремешке часов. В некоторых вариантах осуществления дубленая синтетическая кожа может содержаться в ремне. В некоторых вариантах осуществления дубленая синтетическая кожа может содержаться в сумке. По меньшей мере приблизительно 2% клеток, содержащихся в дубленой синтетической коже, можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. По меньшей мере приблизительно 10% клеток, содержащихся в дубленой синтетической коже, можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. По меньшей мере приблизительно 50% клеток, содержащихся в дубленой синтетической коже, можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки.
[0008] В настоящем описании раскрыта дубленая синтетическая кожа. В некоторых вариантах осуществления перед дублением дубленая синтетическая кожа может содержать удаленный продукт, содержащий слоистую структуру. В некоторых вариантах осуществления слоистая структура может содержать искусственный дермальный слой. В некоторых вариантах осуществления дермальный слой может содержать фибробласт. В некоторых вариантах осуществления слоистая структура может содержать искусственный эпидермальный слой. В некоторых вариантах осуществления эпидермальный слой может содержать кератиноцит. В некоторых вариантах осуществления часть эпидермального слоя можно удалять. В некоторых вариантах осуществления фибробласт или кератиноцит можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. В некоторых вариантах осуществления удаленный продукт дополнительно может содержать коллаген. В некоторых вариантах осуществления фибробласт можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. В некоторых вариантах осуществления кератиноцит может представлять собой кератиноцит млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления млекопитающее может представлять собой не являющееся человеком млекопитающее. В некоторых вариантах осуществления кератиноцит можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. В некоторых вариантах осуществления кератиноцит может экспрессировать KRT14, p63, DSG3, ITGB4, LAMA5, KRT5, TAp63, Lamb3, KRT18 или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления слоистая структура дополнительно может содержать меланоцит. В некоторых вариантах осуществления меланоцит можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. В некоторых вариантах осуществления меланоцит может экспрессировать Sox-10, MITF-M, gp-100, DCT, TYR, MLANA или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления синтетическая кожа дополнительно может содержать пигмент. В некоторых вариантах осуществления меланоцит может представлять собой меланоцит млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления млекопитающее может представлять собой не являющееся человеком млекопитающее. В некоторых вариантах осуществления фибробласт может экспрессировать CD10, CD73, CD44, CD90, коллаген I типа, коллаген III типа, пролил-4-гидроксилазу β или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления фибробласт может представлять собой фибробласт млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления млекопитающее может представлять собой не являющееся человеком млекопитающее. В некоторых вариантах осуществления не являющееся человеком млекопитающее может представлять собой одно из примата, коровы, овцы, свиньи, лошади, собаки, кошки, грызуна или зайцеобразного. В некоторых вариантах осуществления фибробласт может представлять собой фибробласт не млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления не млекопитающее может представлять собой рыбу, птицу или рептилию. В некоторых вариантах осуществления эпидермальный слой дополнительно может содержать коллаген. В некоторых вариантах осуществления слоистая структура дополнительно может содержать коллаген. В некоторых вариантах осуществления дермальный слой дополнительно может содержать коллаген. В некоторых вариантах осуществления коллаген можно получать по меньшей мере отчасти посредством продуцирующей коллаген клетки, можно добавлять отдельно или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления продуцирующая коллаген клетка может включать эпителиальную клетку, кератиноцит, фибробласт, корнеоцит, меланоцит, клетку Лангерганса, базальную клетку или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления продуцирующая коллаген клетка может содержать эпителиальную клетку, где эпителиальная клетка может включать сквамозную клетку, кубовидную клетку, цилиндрическую клетку, базальную клетку или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления продуцирующая коллаген клетка может включать кератиноцит, где кератиноцит включает эпителиальный кератиноцит, базальный кератиноцит, пролиферирующий базальный кератиноцит, дифференцированный надбазальный кератиноцит или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления продуцирующие коллаген клетки могут включать гладкомышечную клетку. В некоторых вариантах осуществления синтетическая кожа дополнительно может содержать одно или несколько из кератина, эластина, желатина, протеогликана, протеогликана дерматансульфата, гликозаминогликана, фибронектина, ламинина, дерматопонтина, липида, жирной кислоты, углевода или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления толщина дермального слоя может находиться в диапазоне от приблизительно 0,02 мм до приблизительно 5 мм. В некоторых вариантах осуществления толщина дермального слоя может находиться в диапазоне от приблизительно 0,1 мм до приблизительно 0,5 мм. В некоторых вариантах осуществления синтетическая кожа дополнительно может содержать первый дермальный слой и второй дермальный слой. В некоторых вариантах осуществления первый дермальный слой может находиться на втором дермальном слое. В некоторых вариантах осуществления толщина эпидермального слоя может находиться в диапазоне от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 2 мм. В некоторых вариантах осуществления толщина эпидермального слоя может находиться в диапазоне от приблизительно 0,1 мм до приблизительно 0,2 мм. В некоторых вариантах осуществления синтетическая кожа дополнительно может содержать первый эпидермальный слой и второй эпидермальный слой. В некоторых вариантах осуществления синтетическая кожа может содержать заменитель базальной мембраны. В некоторых вариантах осуществления заменитель базальной мембраны может находиться между эпидермальным слоем и дермальным слоем. В некоторых вариантах осуществления заменитель базальной мембраны может содержать высушенную бесклеточную амниотическую мембрану. В некоторых вариантах осуществления дермальный слой можно формировать на каркасе. В некоторых вариантах осуществления каркас может быть природным или синтетическим. В некоторых вариантах осуществления каркас может содержать шелк. В некоторых вариантах осуществления каркас может содержать хитозан. В некоторых вариантах осуществления каркас может содержать природный тканевой адгезив. В некоторых вариантах осуществления природный тканевой адгезив может содержать фибриновый клей. В некоторых вариантах осуществления каркас может содержаться отчасти в дубленой синтетической коже. В некоторых вариантах осуществления дермальный слой или эпидермальный слой можно культивировать in vitro. В некоторых вариантах осуществления дермальный слой можно культивировать in vitro. В некоторых вариантах осуществления дубленая синтетическая кожа может содержаться в одном или нескольких из ремешка часов, ремня, упаковки, туфли, ботинка, обуви, перчатки, одежды, багажа, сумки, клатча, портмоне, рюкзака, кошелька, седла, упряжи, плети, интерьера, экстерьера, обивки, книжного переплета, мебели, лампы, абажура лампы, скатерти, покрытия стены, покрытия пола, покрытия потолка, интерьера автомобиля, экстерьера автомобиля, интерьера лодки, экстерьера лодки, интерьера самолета, интерьера яхты, экстерьера яхты, наволочки, простыни, пододеяльника, ювелирного изделия, аксессуара, очков, солнцезащитных очков или потребительской электроники. В некоторых вариантах осуществления дубленая синтетическая кожа может содержаться в ремешке часов. В некоторых вариантах осуществления дубленая синтетическая кожа может содержаться в ремне. В некоторых вариантах осуществления дубленая синтетическая кожа может содержаться в сумке. По меньшей мере приблизительно 2% клеток, содержащихся в дубленой синтетической коже, можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. По меньшей мере приблизительно 10% клеток, содержащихся в дубленой синтетической коже, можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. По меньшей мере приблизительно 50% клеток, содержащихся в дубленой синтетической коже, можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки.
[0009] В настоящем описании раскрыты искусственные эпидермальные слои. В некоторых вариантах осуществления искусственный эпидермальный слой может содержать клетку волосяного фолликула и меланоцит. В некоторых вариантах осуществления искусственный эпидермальный слой может содержать клетку волосяного фолликула. В некоторых вариантах осуществления искусственный эпидермальный слой может содержать меланоцит. В некоторых вариантах осуществления меланоцит можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. В некоторых вариантах осуществления клетка волосяного фолликула может включать клетку дермального сосочка, внешнюю клетку влагалища корня или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления меланоцит может представлять собой меланоцит млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления эпидермальный слой дополнительно может содержать кератиноцит. В некоторых вариантах осуществления кератиноцит можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. В некоторых вариантах осуществления кератиноцит может экспрессировать KRT14, p63, DSG3, ITGB4, LAMA5, KRT5, TAp63, Lamb3, KRT18 или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления кератиноцит может представлять собой кератиноцит млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления млекопитающее может представлять собой не являющееся человеком млекопитающее. В некоторых вариантах осуществления млекопитающим может быть млекопитающее человек. В некоторых вариантах осуществления не являющееся человеком млекопитающее может представлять собой одно из примата, коровы, овцы, свиньи, лошади, собаки, кошки, грызуна или зайцеобразного. В некоторых вариантах осуществления фибробласт может представлять собой фибробласт не млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления не млекопитающее может представлять собой рыбу, птицу или рептилию. В некоторых вариантах осуществления меланоцит может экспрессировать Sox-10, MITF-M, gp-100, DCT, TYR, MLANA или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления эпидермальный слой может содержать волосяной фолликул. По меньшей мере приблизительно 2% клеток, содержащихся в искусственном эпидермальном слое, можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. По меньшей мере приблизительно 10% клеток, содержащихся в искусственном эпидермальном слое, можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. По меньшей мере приблизительно 50% клеток, содержащихся в искусственном эпидермальном слое, можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки.
[0010] В настоящем описании раскрыты слоистые структуры. В некоторых вариантах осуществления слоистая структура может содержать искусственный эпидермальный слой. В некоторых вариантах осуществления эпидермальный слой может содержать клетку волосяного фолликула. В некоторых вариантах осуществления слоистая структура может содержать искусственный дермальный слой. В некоторых вариантах осуществления дермальный слой может содержать фибробласт. В некоторых вариантах осуществления фибробласт можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. В некоторых вариантах осуществления фибробласт может экспрессировать CD10, CD73, CD44, CD90, коллаген I типа, коллаген III типа, пролил-4-гидроксилазу β или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления эпидермальный слой дополнительно может содержать кератиноцит. В некоторых вариантах осуществления кератиноцит можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. В некоторых вариантах осуществления кератиноцит может экспрессировать KRT14, p63, DSG3, ITGB4, LAMA5, KRT5, TAp63, Lamb3, KRT18 или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления клетка волосяного фолликула может представлять собой клетку дермального сосочка, внешнюю клетку влагалища корня или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления эпидермальный слой дополнительно может содержать меланоцит. В некоторых вариантах осуществления меланоцит можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. В некоторых вариантах осуществления меланоцит может экспрессировать Sox-10, MITF-M, gp-100, DCT, TYR, MLANA или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления слоистая структура может быть пигментированной. В некоторых вариантах осуществления эпидермальный слой может быть расслаиваемым. В некоторых вариантах осуществления слоистая структура может содержать заменитель базальной мембраны. В некоторых вариантах осуществления заменитель базальной мембраны может находиться между эпидермальным слоем и дермальным слоем. В некоторых вариантах осуществления заменитель базальной мембраны может содержать высушенную бесклеточную амниотическую мембрану. В некоторых вариантах осуществления слоистая структура дополнительно может содержать каркас. В некоторых вариантах осуществления каркас может быть природным или синтетическим. В некоторых вариантах осуществления каркас может содержать шелк. В некоторых вариантах осуществления каркас может содержать хитозан. В некоторых вариантах осуществления дермальный слой может находиться на каркасе. В некоторых вариантах осуществления слоистая структура может содержать один или несколько компонентов, выбранных из группы, состоящей из кератина, эластина, желатина, протеогликана, протеогликана дерматансульфата, гликозаминогликана, фибронектина, ламинина, дерматопонтина, липида, жирной кислоты, углевода или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления слоистая структура дополнительно может содержать два или больше дермальных слоев. В некоторых вариантах осуществления слоистая структура дополнительно может содержать волосяной фолликул. В некоторых вариантах осуществления слоистая структура дополнительно может содержать мех. По меньшей мере приблизительно 2% клеток, содержащихся в слоистой структуре, можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. По меньшей мере приблизительно 10% клеток, содержащихся в слоистой структуре, можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. По меньшей мере приблизительно 50% клеток, содержащихся в слоистой структуре, можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки.
[0011] В настоящем описании раскрыты способы получения слоистой структуры. В некоторых вариантах осуществления способ может включать размещение искусственного эпидермального слоя, содержащего клетку волосяного фолликула, на искусственном дермальном слое, содержащем клетку, дифференцированную из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки, тем самым формируя слоистую структуру. В некоторых вариантах осуществления клетка, дифференцированная из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки, может представлять собой фибробласт, меланоцит, кератиноцит или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления клетка, дифференцированная из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки, может представлять собой фибробласты. В некоторых вариантах осуществления фибробласт может экспрессировать CD10, CD73, CD44, CD90, коллаген I типа, коллаген III типа, пролил-4-гидроксилазу β или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления эпидермальный слой дополнительно может содержать кератиноцит. В некоторых вариантах осуществления кератиноцит можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. В некоторых вариантах осуществления кератиноцит может экспрессировать KRT14, p63, DSG3, ITGB4, LAMA5, KRT5, TAp63, Lamb3, KRT18 или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления клетка волосяного фолликула может включать клетку дермального сосочка, внешнюю клетку влагалища корня или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления эпидермальный слой дополнительно может содержать меланоцит. В некоторых вариантах осуществления меланоцит можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. В некоторых вариантах осуществления меланоцит может экспрессировать Sox-10, MITF-M, gp-100, DCT, TYR, MLANA или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления дермальный слой можно культивировать с добавкой. В некоторых вариантах осуществления добавка может содержать коллаген, фибрин, факторы роста, аскорбиновую кислоту, декстрансульфат, каррагенан или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления добавка может представлять собой природную добавку. В некоторых вариантах осуществления добавка может представлять собой синтетическую добавку. В некоторых вариантах осуществления дермальный слой можно культивировать на каркасе. В некоторых вариантах осуществления каркас может быть природным или синтетическим. В некоторых вариантах осуществления каркас может содержать шелк. В некоторых вариантах осуществления каркас может содержать хитозан. В некоторых вариантах осуществления дермальный слой можно помещать на каркас. В некоторых вариантах осуществления эпидермальный слой может быть расслаиваемым. В некоторых вариантах осуществления дермальный слой можно культивировать на втором дермальном слое. В некоторых вариантах осуществления дермальный слой можно культивировать in vivo. В некоторых вариантах осуществления дермальный слой можно не культивировать на коллагеновом матриксе. В некоторых вариантах осуществления толщина дермального слоя может находиться в диапазоне от приблизительно 0,02 мм до приблизительно 5 мм. В некоторых вариантах осуществления толщина дермального слоя может находиться в диапазоне от приблизительно 0,1 мм до приблизительно 0,5 мм. В некоторых вариантах осуществления толщина эпидермального слоя может находиться в диапазоне от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 2 мм. В некоторых вариантах осуществления толщина эпидермального слоя может находиться в диапазоне от приблизительно 0,1 мм до приблизительно 0,2 мм. По меньшей мере приблизительно 2% клеток, содержащихся в слоистой структуре, можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. По меньшей мере приблизительно 10% клеток, содержащихся в слоистой структуре, можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. По меньшей мере приблизительно 50% клеток, содержащихся в слоистой структуре, можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки.
[0012] В настоящем описании раскрыты слоистые структуры. В некоторых вариантах осуществления слоистая структура может содержать искусственный эпидермальный слой, содержащий клетку волосяного фолликула и кератиноцит или меланоцит; искусственный дермальный слой, содержащий фибробласт, где фибробласт, кератиноцит или меланоцит можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки, где меланоцит экспрессирует Sox-10, MITF-M, gp-100, DCT, TYR, MLANA или их комбинацию, где фибробласт экспрессирует CD10, CD73, CD44, CD90, коллаген I типа, коллаген III типа, пролил-4-гидроксилазу β или их комбинацию, где кератиноцит экспрессирует KRT14, p63, DSG3, ITGB4, LAMA5, KRT5, TAp63, Lamb3, KRT18 или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления слоистая структура может содержать искусственный эпидермальный слой. В некоторых вариантах осуществления эпидермальный слой может содержать клетку волосяного фолликула. В некоторых вариантах осуществления эпидермальный слой может содержать кератиноцит или меланоцит. В некоторых вариантах осуществления слоистая структура может содержать искусственный дермальный слой. В определенном варианте осуществления дермальный слой может содержать фибробласт. В некоторых вариантах осуществления фибробласт, кератиноцит или меланоцит можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. В некоторых вариантах осуществления меланоцит может экспрессировать Sox-10, MITF-M, gp-100, DCT, TYR, MLANA или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления фибробласт может экспрессировать CD10, CD73, CD44, CD90, коллаген I типа, коллаген III типа, пролил-4-гидроксилазу β или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления кератиноцит может экспрессировать KRT14, p63, DSG3, ITGB4, LAMA5, KRT5, TAp63, Lamb3, KRT18 или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления толщина дермального слоя может находиться в диапазоне от приблизительно 0,02 мм до приблизительно 5 мм. В некоторых вариантах осуществления толщина дермального слоя может находиться в диапазоне от приблизительно 0,1 мм до приблизительно 0,5 мм. В некоторых вариантах осуществления толщина эпидермального слоя может находиться в диапазоне от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 2 мм. В некоторых вариантах осуществления толщина эпидермального слоя может находиться в диапазоне от приблизительно 0,1 мм до приблизительно 0,2 мм. По меньшей мере приблизительно 2% клеток, содержащихся в слоистой структуре, можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. По меньшей мере приблизительно 10% клеток, содержащихся в слоистой структуре, можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. По меньшей мере приблизительно 50% клеток, содержащихся в слоистой структуре, можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки.
[0013] В настоящем описании раскрыт искусственный эпидермальный слой. Искусственный эпидермальный слой может содержать роговой слой. Искусственный эпидермальный слой может содержать зернистый слой. Искусственный эпидермальный слой может содержать шиповатый слой. Искусственный эпидермальный слой может содержать базальный слой. В некоторых вариантах осуществления роговой слой, зернистый слой, шиповатый слой или базальный слой можно организовать, как изображено на фиг. 6A или фиг. 8A. Толщина рогового слоя может находиться в диапазоне от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 0,05 мм. Толщина зернистого слоя может находиться в диапазоне от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 0,15 мм. Толщина шиповатого слоя может находиться в диапазоне от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 0,15 мм. Толщина указанного базального слоя может находиться в диапазоне от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 0,15 мм. Толщина рогового слоя может находиться в диапазоне от приблизительно 4% до приблизительно 20% искусственного эпидермального слоя. Толщина зернистого слоя может находиться в диапазоне от приблизительно 4% до приблизительно 60% искусственного эпидермального слоя. Толщина шиповатого слоя может находиться в диапазоне от приблизительно 4% до приблизительно 40% искусственного эпидермального слоя. Толщина базального слоя может находиться в диапазоне от приблизительно 4% до приблизительно 40% искусственного эпидермального слоя. По меньшей мере приблизительно 2% клеток, содержащихся в искусственном эпидермальном слое, можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. По меньшей мере приблизительно 10% клеток, содержащихся в искусственном эпидермальном слое, можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки. По меньшей мере приблизительно 50% клеток, содержащихся в искусственном эпидермальном слое, можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки.
ВКЛЮЧЕНИЕ ПО ССЫЛКЕ
[0014] Все публикации, патенты и патентные заявки, упомянутые в этом описании, включены в настоящее описание посредством ссылки в той же степени, как если бы каждую индивидуальную публикацию, патент или патентную заявку конкретно и индивидуально указывали для включения по ссылке.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
[0015] Новые признаки, описанные в настоящем описании, изложены с конкретикой в приложенной формуле изобретения. Более хорошего понимания признаков и преимуществ признаков, описанных в настоящем описании, можно достичь, обратившись к следующему подробному описанию, в котором изложены иллюстративные примеры, в которых используют принципы признаков, описанных в настоящем описании, и сопроводительным рисункам, на которых:
[0016] Фиг. 1 иллюстрирует схему получения синтетической кожи.
[0017] Фиг. 2A-2F иллюстрируют слоистую структуру. На фиг. 2A изображена слоистая структура, содержащая эпидермальный слой и дермальный слой на каркасе. На фиг. 2B изображена слоистая структура, содержащая эпидермальный слой, заменитель базальной мембраны и дермальный слой на каркасе. На фиг. 2C изображена слоистая структура, содержащая эпидермальный слой и несколько дермальных слоев на каркасе. На фиг. 2D изображена слоистая структура, содержащая эпидермальный слой, заменитель базальной мембраны и несколько дермальных слоев на каркасе. На фиг. 2E изображена слоистая структура, содержащая эпидермальный слой, заменитель базальной мембраны и несколько дермальных слоев. На фиг. 2F изображена слоистая структура, содержащая эпидермальный слой и несколько дермальных слоев.
[0018] Фиг. 3 иллюстрирует развитие слоистой структуры.
[0019] Фиг. 4A-4C иллюстрируют сравнительный анализ кожи (фиг. 4A), нативной кожи (фиг. 4B) и эпидермального эквивалента (фиг. 4C).
[0020] Фиг. 5A-5C иллюстрируют сравнительный анализ рогового слоя нативной кожи и эпидермального эквивалента. На фиг. 5A приведено изображение эпидермальной поверхности. На фиг. 5B приведено изображение корнеодесмосомы. На фиг. 5C приведено изображение CDSN/Hoechst.
[0021] Фиг. 6A-6E иллюстрируют сравнительный анализ зернистого слоя нативной кожи и эпидермального эквивалента. На фиг. 6A изображено окрашивание Loricrin (LOR). На фиг. 6B изображен эпидермальный градиент Ca++, зафиксированный при трансмиссионной электронной микроскопии в виде электронноплотных преципитатов. На фиг. 6C изображена оценка целостности барьера проницаемости посредством перфузии лантана. Фиг. 6D иллюстрирует, что белок плотного контакта 1/zonula occludens-1 (TJP1/ZO-1) заякоривает тяжи белков плотного контакта, которые могут представлять собой фибриллярные структуры в липидом бислое, с актиновым цитоскелетом. Фиг. 6E иллюстрирует, что мономеры филагрина (FLG), тандемно образующие кластеры большого 350 кДа белка-предшественника, известного как профилагрин, присутствуют в кератогиалиновых гранулах в клетках SG.
[0022] Фиг. 7A-7C иллюстрирует формирование липидного бислоя в нативной коже и эпидермальном эквиваленте, как оценивали с использованием TEM. На фиг. 7A изображена нормальная секреция липидов на границе SC и SG. На фиг. 7B изображены ламеллярные тельца в SG. На фиг. 7C изображена нормальная морфология липидного бислоя (LB) нативной кожи.
[0023] Фиг. 8A-8C иллюстрирует сравнительный анализ маркеров надбазальных слоев нативной кожи и эпидермального эквивалента, в том числе кератина 10 (KRT10; фиг. 8A), кератина 1 (KRT1; фиг. 8B), десмоколлина 1 (DCL1; фиг. 8C), маркеров надбазальных слоев. На фиг. 8D изображены десмосомы в нативной коже in vivo и в эпидермальных эквивалентах, созданных in vitro.
[0024] Фиг. 9A-9C иллюстрируют сравнительный анализ базального слоя нативной кожи и эпидермального эквивалента. MKI67 (фиг. 9A), маркер пролиферации, кератин 14 (KRT14; фиг. 9B) и фактор транскрипции TP63 (фиг. 9C) демонстрируют типичное распределение в базальном слое в нативной кожи in vivo (слева на изображении) и в эпидермальных эквивалентах, созданных in vitro. На фиг. 9D изображены полудесмосомы в нативной коже in vivo и в эпидермальных эквивалентах созданных in vitro.
[0025] На фиг. 10A-10F иллюстрируют сравнительный анализ компонентов внеклеточного матрикса базальной мембраны. На фиг. 10A изображена экспрессия интегрина β1. На фиг. 10B изображена экспрессия фибронектина. На фиг. 1°C изображена экспрессия коллагена IV. На фиг. 10D изображена экспрессия коллагена VI. Га фиг. 10E изображена экспрессия коллагена VII. На фиг. 10F изображена экспрессия ламинина 5.
[0026] Фиг. 11A-11I иллюстрирует структурный анализ эквивалента кожи полной толщины (FSE). На фиг. 11A и 11B изображены срезы FSE, которые показывают выраженные клеточные слои эпидермиса при увеличении 2600× (фиг. 11A) и увеличении 5200× (фиг. 11B). На фиг. 11C изображена поверхность FSE при увеличении 900×. На фиг. 11D-1F изображены продольные срезы дермального каркаса с находящимися на нем дермальными фибробластами и богатым внеклеточным матриксом при увеличении 91× (фиг. 11D), увеличении 162× (фиг. 11E) и увеличении 405× (фиг. 11F). На фиг. 11G-11I изображены дермальные каркасы с находящимися на них дермальными фибробластами и богатым внеклеточным матриксом при увеличении 80× (фиг. 11G), увеличении 695× (фиг. 11H) и увеличении 2700× (фиг. 11I).
[0027] Фиг. 12A-12R иллюстрируют динамику конструирования дермального эквивалента. На фиг. 12A-12I изображены сутки 2 после высевания дермальных фибробластов на каркас при увеличении 36× (фиг. 12A), увеличении 695× (фиг. 12B), увеличении 1470× (фиг. 12C), увеличении 7750× (фиг. 12D), увеличении 2320× (фиг. 12E), увеличении 2420× (фиг. 12F), увеличении 6560× (фиг. 12G), увеличении 17000× (фиг. 12H) и увеличении 22000× (фиг. 12I). На фиг. 12J-12R изображены сутки 7 после высевания дермальных фибробластов на каркас при увеличении 64× (фиг. 12J), увеличении 100× (фиг. 12K), увеличении 364× (фиг. 12L), увеличении 82× (фиг. 12M), увеличении 253× (фиг. 12N), увеличении 3940× (фиг. 12O), увеличении 5550× (фиг. 12P), увеличении 9440× (фиг. 12Q) и увеличении 21680× (фиг. 12R).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ РАСКРЫТИЯ
[0028] Несколько аспектов для иллюстрации описано далее со ссылкой на образцовые применения. Следует понимать, что многие конкретные подробности, зависимости и способы изложены для обеспечения полного понимания признаков, описанных в настоящем описании. Однако средний специалист в релевантной области без труда узнает, что признаки, описанные в настоящем описании, можно реализовать на практике без одной или нескольких конкретных подробностей или с использованием других способов. Признаки, описанные в настоящем описании, не ограничены проиллюстрированным порядком действий или событий, поскольку некоторые действия могут происходить в другом порядке и/или одновременно с другими действиями или событиями, пока иное не указано конкретно. Кроме того, не все проиллюстрированные действия или события необходимы для выполнения способа в соответствии с признаками, описанными в настоящем описании.
[0029] Терминология, используемая в настоящем описании, служит только цели описания конкретных случаев и не предназначена в качестве ограничения. Как используют в настоящем описании, формы единственного числа предназначены также включать формы множественного числа, пока контекст явно не указывает на иное. Кроме того, в той мере, в которой термины «включающий», «включает», «имеющий», «имеет», «с» или их варианты используют в подробном описании и/или формуле изобретения, такие термины предназначены в качестве включающих таким образом, который схож с термином «содержащий».
[0030] В этом раскрытии термин «около» или «приблизительно» может обозначать диапазон вплоть до 10% от заданного значения. В этом раскрытии термин «по существу» относится к чему-то, что можно осуществлять в большой степени или мере.
[0031] Как используют в настоящем описании, термин «плюрипотентная стволовая клетка» может относиться к любой клетке-предшественнику, которая обладает способностью формировать любую зрелую клетку.
[0032] Как используют в настоящем описании, термин «эмбриональные стволовые клетки» или «ES клетки» или «ESC» может относиться к клеткам-предшественникам, которые обладают способностью формировать любую зрелую клетку.
[0033] Как используют в настоящем описании, термин «индуцированные плюрипотентные стволовые клетки» или «iPS клетки» или «iPSC» может относиться к типу плюрипотентных стволовых клеток, искусственно полученных из не плюрипотентной клетки (например, зрелой соматической клетки). Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки могут быть идентичны эмбриональным стволовым клеткам по способности формировать любую зрелую клетку, но не получены из эмбриона. В некоторых случаях, IPSC клетки, раскрытые в настоящем описании, могут представлять собой IPSC клетки.
[0034] Как используют в настоящем описании, термин «синтетическая кожа» может обозначать, что эквиваленты кожи, описанные в настоящем описании, могут служить в качестве эквивалента кожи для любого млекопитающего или не млекопитающего. Варианты осуществления можно реализовать на практике у человека и не относящихся к человеку млекопитающих, таких как не являющиеся человеком приматы и представители видов коров, овец, свиней, лошадей, собак и кошек, а также грызунов, таких как мыши, крысы и морские свинки, представители семейства зайцеобразных, включая кролика; и не млекопитающих, таких как рыбы, в том числа акула и хвостокол, птицы, включая страуса, и рептилии, включая ящериц, змей и крокодилов. Конкретная синтетическая кожа млекопитающего, которую формируют, может зависеть от источника клеток, используемых в вариантах осуществления, описанных в настоящем описании, например, кератиноцитов и фибробластов, например, когда кератиноциты и фибробласты коровы используют для того, чтобы формировать эквивалент кожи, можно формировать синтетическую кожу коровы.
ОБЗОР
[0035] В настоящем описании раскрыты синтетическая кожа, искусственные эпидермальные слои, искусственные дермальные слои, слоистые структуры, продукты, выполненные из них, и способы их получения. В определенных случаях, в настоящем описании раскрыта синтетическая кожа. В некоторых случаях, синтетическая кожа содержит один или множество слоев. В некоторых случаях, один или множество слоев содержат клетки, где указанные клетки культивируют in vitro. В некоторых случаях, способы, описанные в настоящем описании, предусматривают высокопропускные способы, которые можно надежно, точно и воспроизводимо масштабировать вплоть до коммерческих уровней получения синтетической кожи. Преимущества синтетической кожи, сконструированного эпидермального эквивалента, сконструированного эквивалента кожи полной толщины и способов их получения, раскрытых в настоящем описании, включают, но не ограничиваясь этим, получение специализированных тканей воспроизводимым, высокопропускным и легко масштабируемым образом с привлекательными внешним видом, текстурой, толщиной и долговечностью. Как используют в настоящем описании, эквивалент кожи полной толщины может содержать по меньшей мере один дермальный слой и по меньшей мере один эпидермальный слой. Как используют в настоящем описании, эквивалент кожи полной толщины и полный эквивалент кожи можно использовать взаимозаменяемо.
[0036] Синтетическая кожа, раскрытая в настоящем описании, может содержать слой искусственного дермального слоя, содержащий фибробласт, и искусственный эпидермальный слой, содержащий кератиноцит. Дермальный слой и эпидермальный слой могут формировать слоистую структуру. Синтетическая кожа может содержать одну или несколько слоистых структур. Синтетическую кожу можно дубить и дополнительно обрабатывать. Клетки, формирующие синтетический слой, можно дифференцировать из стволовых клеток, например, индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC). Дермальный слой можно помещать на каркасе, таком как шелк, чтобы добиваться природной толщины и текстуры кожи.
[0037] Также в настоящем описании раскрыты способы получения синтетической кожи. Способ может включать формирование слоистой структуры, содержащей искусственный дермальный слой и искусственный эпидермальный слой, и дубление слоистой структуры. Способы также могут включать дополнительную обработку искусственных дермальных слоев и эпидермальных слоев, например, чтобы добиваться природной толщины и текстуры кожи.
СИНТЕТИЧЕСКАЯ КОЖА
[0038] Синтетическая кожа может содержать один или несколько слоев клеток. Например, синтетическая кожа может содержать одно или несколько из: дермального слоя, эпидермального слоя и базальной мембраны или заменителя базальной мембраны. Синтетическая кожа дополнительно может содержать гиподерму, чешуйку, чешую, остеодерму или их комбинацию. В некоторых случаях, синтетический слой содержит эквивалент кожи полной толщины. Такой эквивалент кожи полной толщины может содержать любой один или комбинацию слоев, раскрытых в настоящем описании. Часть одного или нескольких слоев клеток в синтетической коже можно удалять, например, посредством стрижки. В некоторых случаях, синтетическую кожу можно дубить. Дубление можно осуществлять после формирования одного или нескольких слоев клеток или слоистых структур. Дубление можно осуществлять после по меньшей мере после того, как часть слоя клеток можно удалять с синтетической кожи. В некоторых случаях, синтетическую кожу можно дополнительно обрабатывать. В некоторых случаях, синтетическая кожа может содержать клетку волосяного фолликула и меланоцит. Клетку волосяного фолликула и/или меланоцит можно дифференцировать из стволовой клетки (например, iPSC).
[0039] В некоторых вариантах осуществления дубленая синтетическая кожа может содержать слоистую структуру. Слоистая структура может содержать искусственный дермальный слой, содержащий фибробласт. Слоистая структура также может содержать искусственный эпидермальный слой, содержащий кератиноцит. В некоторых случаях, слоистая структура может содержать искусственный дермальный слой, содержащий фибробласт, и искусственный эпидермальный слой, содержащий кератиноцит. В некоторых случаях, фибробласт или кератиноцит можно дифференцировать из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки.
[0040] В некоторых случаях, дубленая синтетическая кожа может содержать по меньшей мере часть дермального слоя. В некоторых случаях, дубленая синтетическая кожа не содержит дермальный слой. В некоторых случаях, дермальный слой можно удалять.
Дермальный слой
[0041] Синтетическая кожа может содержать дермальный слой (например, искусственный дермальный слой). Дермальный слой может представлять собой сконструированный эквивалент дермы, например, искусственный дермальный слой, формируемый in vitro.
[0042] Дермальный слой может содержать клетки соединительной ткани. Например, дермальный слой может содержать фибробласты. Фибробласты в дермальном слое могут экспрессировать один или несколько маркеров, включая в качестве неограничивающих примеров, кластер дифференцировки 10 (CD10), кластер дифференцировки 73 (CD73), кластер дифференцировки 44 (CD44), кластер дифференцировки 90 (CD90), коллаген I типа, коллаген III типа и пролил-4-гидроксилазу β фибробластов. В некоторых случаях, дермальный слой также содержит клетки других типов, таких как клетки иммунной системы, макрофаги, адипоциты или их комбинацию.
[0043] Дермальный слой дополнительно может содержать компоненты матрикса в дополнение к клеткам. Примеры компонентов матрикса включают, но не ограничиваясь этим, любое одно или несколько из коллагена, эластина и экстрафибриллярного матрикса, внеклеточного гелеобразного вещества, в первую очередь состоящего из гликозаминогликанов (например, гиалуроновой кислоты), протеогликанов и гликопротеинов.
[0044] Дермальный слой может содержать опору матрикса. Опора матрикса может представлять собой каркас. Опора матрикса может содержать сжатые коллагеновые гели. Альтернативами чистому коллагеновому матриксу может быть сетка из полигликолевой кислоты, например, как описано в Hansbrough et al., J. Burn Care Rehabil., 15:346-53 (1994), или коллагеновый и гликозаминогликановый матрикс, покрытый мембраной из силастика (C-GAG), например, как описано в Burke et al., Ann. Surg., 194:413- 420 (1981), или различные биополимеры, например, хитозан, как описано в Kellouche et al., Biochem Biophys Res Commun., 363:472-478 (2007). В некоторых случаях матрикс можно засевать фибробластами, например, чтобы давать начало органотипическим моделям. Дерму природного происхождения из кожи аллогенного трупа также можно использовать с листами кератиноцитов. В вариации этого способа можно использовать лиофилизированное производное дермы из трупной кожи, чтобы поддерживать листы кератиноцитов.
[0045] Толщину кожи можно приводить в таких единицах, как миллиметры, унции или айроны. (Одна унция равна 1/64 дюйма или 0,0156 дюйма или 0,396 мм. Один айрон равен 1/48 дюйма или 0,0208 дюйма или 0,53 мм.)
[0046] Толщину дермального слоя можно конструировать для соответствия функции или использованию синтетической кожи. Дермальный слой может иметь толщину от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 50 мм. Например, дермальный слой может иметь толщину от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 10 мм, от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 8 мм, от приблизительно 0,01 до приблизительно 5 мм, от приблизительно 0,02 до приблизительно 5 мм, от приблизительно 0,05 до приблизительно 5 мм, от приблизительно 0,1 до приблизительно 5 мм, от приблизительно 0,1 до приблизительно 2 мм, от приблизительно 0,1 до приблизительно 1 мм, от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,8 мм или от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,5 мм. Например, дермальный слой может иметь толщину от приблизительно 0,02 мм до 5 мм. Например, дермальный слой может иметь толщину от приблизительно 0,1 мм до 0,5 мм. Например, дермальный слой может иметь толщину от приблизительно 0,2 мм до 0,5 мм. В некоторых случаях, толщина дермального слоя может составлять по меньшей мере 0,001 мм, 0,01 мм, 0,02 мм, 0,04 мм, 0,08 мм, 0,1 мм, 0,2 мм, 0,4 мм, 0,8 мм, 1 мм, 2 мм, 4 мм, 8 мм или 10 мм. В некоторых случаях, толщина дермального слоя может составлять самое большее 50 мм, 40 мм, 20 мм, 10 мм, 8 мм, 4 мм, 2 мм, 1 мм, 0,8 мм, 0,4 мм, 0,2 мм, 0,1 мм, 0,08 мм, 0,04 мм, 0,02 мм или 0,01 мм. В некоторых вариантах осуществления дермальный слой может иметь толщину по меньшей мере приблизительно 50 мм.
[0047] Длину дермального слоя можно конструировать для соответствия функции или использованию синтетической кожи. Дермальный слой может иметь длину от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 50 м. Например, дермальный слой может иметь длину от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 10 мм, от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 8 мм, от приблизительно 0,01 до приблизительно 5 мм, от приблизительно 0,02 до приблизительно 5 мм, от приблизительно 0,05 до приблизительно 5 мм, от приблизительно 0,1 до приблизительно 5 мм, от приблизительно 0,1 до приблизительно 2 мм, от приблизительно 0,1 до приблизительно 1 мм, от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,8 мм, или от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,5 мм. Например, дермальный слой может иметь длину от приблизительно 0,02 мм до 5 мм. Например, дермальный слой может иметь длину от приблизительно 0,1 мм до 0,5 мм. Например, дермальный слой может иметь длину от приблизительно 0,2 мм до 0,5 мм. В некоторых случаях, длина дермального слоя может составлять по меньшей мере 0,001 мм, 0,01 мм, 0,02 мм, 0,04 мм, 0,08 мм, 0,1 мм, 0,2 мм, 0,4 мм, 0,8 мм, 1 мм, 2 мм, 4 мм, 8 мм или 10 мм. В некоторых случаях, длина дермального слоя может составлять самое большее 50 мм, 40 мм, 20 мм, 10 мм, 8 мм, 4 мм, 2 мм, 1 мм, 0,8 мм, 0,4 мм, 0,2 мм, 0,1 мм, 0,08 мм, 0,04 мм, 0,02 мм или 0,01 мм. В некоторых вариантах осуществления дермальный слой может иметь длину по меньшей мере приблизительно 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 700, 1000 мм. В некоторых вариантах осуществления дермальный слой может иметь длину по меньшей мере приблизительно 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 см. В некоторых вариантах осуществления дермальный слой может иметь длину по меньшей мере приблизительно 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 м.
[0048] Ширину дермального слоя можно конструировать для соответствия функции или использованию синтетической кожи. Дермальный слой может иметь ширину от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 50 м. Например, дермальный слой может иметь ширину от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 10 мм, от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 8 мм, от приблизительно 0,01 до приблизительно 5 мм, от приблизительно 0,02 до приблизительно 5 мм, от приблизительно 0,05 до приблизительно 5 мм, от приблизительно 0,1 до приблизительно 5 мм, от приблизительно 0,1 до приблизительно 2 мм, от приблизительно 0,1 до приблизительно 1 мм, от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,8 мм, или от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,5 мм. Например, дермальный слой может иметь ширину от приблизительно 0,02 мм до 5 мм. Например, дермальный слой может иметь ширину от приблизительно 0,1 мм до 0,5 мм. Например, дермальный слой может иметь ширину от приблизительно 0,2 мм до 0,5 мм. В некоторых случаях, ширина дермального слоя может составлять по меньшей мере 0,001 мм, 0,01 мм, 0,02 мм, 0,04 мм, 0,08 мм, 0,1 мм, 0,2 мм, 0,4 мм, 0,8 мм, 1 мм, 2 мм, 4 мм, 8 мм или 10 мм. В некоторых случаях, ширина дермального слоя может составлять самое большее 50 мм, 40 мм, 20 мм, 10 мм, 8 мм, 4 мм, 2 мм, 1 мм, 0,8 мм, 0,4 мм, 0,2 мм, 0,1 мм, 0,08 мм, 0,04 мм, 0,02 мм или 0,01 мм. В некоторых вариантах осуществления дермальный слой может иметь ширину по меньшей мере приблизительно 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 700, 1000 мм. В некоторых вариантах осуществления дермальный слой может иметь ширину по меньшей мере приблизительно 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 см. В некоторых вариантах осуществления дермальный слой может иметь ширину по меньшей мере приблизительно 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 м.
[0049] Синтетическая кожа может содержать один или несколько дермальных слоев. Например, синтетическая кожа может иметь по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 40, 60, 80 или 100 дермальных слоев. Когда синтетическая кожа содержит больше чем один дермальный слой, дермальный слой можно помещать на другой дермальный слой. Например, синтетическая кожа может содержать два дермальных слоя, например, первый дермальный слой и второй дермальный слой. Первый дермальный слой можно помещать на второй дермальный слой.
[0050] Дермальный слой может быть расслаиваемым, например, имеющим множество подслоев. Подслои могут иметь различные композиции, например, различные концентрации волокон. Подслои дермального слоя могут иметь различные толщины и плотности. Например, дермальный слой может иметь сосочковый дермальный слой, сетчатый дермальный слой или любую их комбинацию. Сосочковый дермальный слой может содержать рыхлую ареолярную соединительную ткань и/или рыхло расположенные волокна, например, коллагеновые волокна. Сетчатый дермальный слой может содержать плотную нерегулярную соединительную ткань, в том числе коллагеновые волокна и дермальные эластические волокна.
[0051] Дермальный слой может содержать свободный коллагеновый матрикс или решетку, которые могут быть сократимыми во всех направлениях и гомогенными. Фибробласты, и где это применимо клетки дермы других типов, можно распределять в непрерывном коллагеновом геле. Эквивалент дермы может содержать по меньшей мере один матрикс из коллагена I типа, в котором распределяют фибробласты. Также он может содержать другие составляющие внеклеточного матрикса. Составляющая внеклеточного матрикса может включать коллагены, например, коллаген IV, ламинины, энтактин, фибронектин, протеогликаны, гликозаминогликаны или гиалуроновую кислоту. Дермальный слой может содержать коллаген IV типа и ламинин, энтактин или их комбинацию. Концентрации этих различных составляющих можно корректировать. Например, концентрация ламинина может составлять от приблизительно 1% до приблизительно 15% конечного объема. Например, концентрация коллагена IV может составлять от приблизительно 0,3% до приблизительно 4,5% конечного объема. Например, концентрация энтактина может составлять от приблизительно 0,05% до приблизительно 1% конечного объема. Используемый коллаген может представлять собой коллаген, происходящий от коровы, из хвоста крысы или от рыбы или из любого другого источника природного коллагена или коллагена, получаемого посредством генетической инженерии, который делает возможным сокращение в присутствии фибробластов. В некоторых вариантах осуществления коллаген может быть из не природного источника. Матрикс может представлять собой гель из коллагена, который может не натянутый, полученный посредством горизонтального и вертикального сокращения, что не подразумевает предпочтительной организации фибробластов. Такой матрикс, также называемый «свободным», может не прилипать к опоре, и его объемы можно модифицировать без ограничения, придавая ему различные толщины и диаметры. Толщина эквивалента дермы может составлять по меньшей мере 0,05 см и в некоторых случаях от приблизительно 0,05 до 2 см. Толщину также можно увеличивать, не вредя благоприятным свойствам эквивалента кожи или синтетической кожи. В некоторых случаях, толщина может составлять от приблизительно 3 мм до приблизительно 20 см или больше.
Эпидермальный слой
[0052] Синтетическая кожа может содержать эпидермальный слой (например, искусственный эпидермальный слой). Эпидермальный слой может представлять собой сконструированный эквивалент эпидермиса, например, искусственный эпидермальный слой, формируемый in vitro.
[0053] Эпидермальный слой может содержать клетки одного или нескольких типов, в том числе кератиноциты, меланоциты, клетки Лангерганса, клетки Меркеля и воспалительные клетки. Например, эпидермальный слой может содержать кератиноциты. Кератиноциты в эпидермальном слое могут включать эпителиальные кератиноциты, базальные кератиноциты, пролиферирующие базальные кератиноциты, дифференцированные надбазальные кератиноциты или любую их комбинацию.
[0054] В некоторых случаях, эпидермальный слой содержит по меньшей мере базальные кератиноциты, например, кератиноциты, которые не дифференцированы. Эпидермальный слой дополнительно может содержать частично дифференцированные кератиноциты, а также полностью дифференцированные кератиноциты. В одном или нескольких эпидермальных слоях в синтетической коже может иметь место переход от недифференцированных базальных кератиноцитов к полностью дифференцированным кератиноцитам по мере продвижения от дермально-эпидермального соединения, где расположены базальные кератиноциты.
[0055] Базальные кератиноциты могут экспрессировать полудесмосомы, которые служат для того, чтобы помогать скреплять эпидермальный и дермальный слои вместе. Базальные кератиноциты также могут служить для регенерации кожи. Эпидермальный слой в синтетической коже в настоящем описании может иметь базальные кератиноциты, которые выполняют эти функции. Таким образом, синтетическая кожа, содержащая такие базальные кератиноциты, может быть способна к регенерации. Другие различия между базальными кератиноцитами и дифференцированными кератиноцитами в одном или нескольких эпидермальных слоях в синтетической коже могут состоять в том, что E- и P-кадгерины присутствуют в эпидермальных кератиноцитах вдоль зоны базальной мембраны (BMZ), но кератиноциты, которые дифференцированы и локализованы вдали от BMZ, экспрессируют только E-кадгерин.
[0056] Базальные кератиноциты эпидермального слоя могут выстраиваться в слой при непосредственном контакте с дермальным слоем, выполняя функцию границы между дифференцированными кератиноцитами и фибробластами. В альтернативных случаях, имеют место пропуски между базальными кератиноцитами и дермальным слоем. Кроме того, могут иметь место пропуски между базальными кератиноцитами и другими базальными кератиноцитами, что оставляет пропуски между дифференцированными кератиноцитами и дермальным слоем. В этих последних случаях, где имеют место пропуски между базальными или дифференцированными кератиноцитами и дермальным слоем, дермальный и эпидермальный слои не находятся в единообразном контакте друг с другом, но находятся смежно друг с другом. Они смежны в том отношении, что может иметь место в целом текучее вещество, но по существу не другие материалы, находящиеся между, такие как слои клеток, коллаген, матрикс или другая опора между дермальным и эпидермальным слоями.
[0057] Кератиноциты в эпидермальном слое могут экспрессировать один или несколько маркеров. Такие маркеры включают, но не ограничиваясь этим, кератин 14 (KRT14), опухолевый белок p63 (p63), десмоглеин 3 (DSG3), интегрин, β4 (ITGB4), ламинин, α5 (LAMA5), кератин 5 (KRT5), изоформу опухолевого белка p63 (например, TAp63), ламинин, β3 (LAMB3) и кератин 18 (KRT18).
[0058] Толщину эпидермального слоя можно конструировать для соответствия функции или использованию синтетической кожи. Эпидермальный слой может иметь толщину от приблизительно 0,001 мм до приблизительно 10 мм. Например, эпидермальный слой может иметь толщину от приблизительно 0,005 мм до приблизительно 10 мм, от приблизительно 0,005 мм до приблизительно 5 мм, от приблизительно 0,005 мм до приблизительно 2 мм, от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 10 мм, от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 5 мм, от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 2 мм, от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 1, от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 0,8 мм, от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 0,4 мм, от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 0,2 мм, от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 0,1 мм, от приблизительно 0,05 мм до приблизительно 0,4 мм, от приблизительно 0,05 мм до приблизительно 0,2 мм, от приблизительно 0,05 мм до приблизительно 0,1 мм, от приблизительно 0,1 мм до приблизительно 0,4 мм, от приблизительно 0,1 мм до приблизительно 0,2 мм, от приблизительно 0,08 мм до приблизительно 1 мм, или от приблизительно 0,05 мм до приблизительно 1,5 мм. Например, эпидермальный слой может иметь толщину от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 2 мм. Например, эпидермальный слой может иметь толщину от приблизительно 0,1 мм до приблизительно 0,22 мм. В некоторых случаях, толщина эпидермального слоя может составлять по меньшей мере 0,001 мм, 0,01 мм, 0,02 мм, 0,04 мм, 0,08 мм, 0,1 мм, 0,2 мм, 0,4 мм, 0,8 мм, 1 мм, 2 мм, 4 мм, 8 мм или 10 мм. В некоторых случаях, толщина дермального слоя может составлять самое большее 50 мм, 40 мм, 20 мм, 10 мм, 8 мм, 4 мм, 2 мм, 1 мм, 0,8 мм, 0,4 мм, 0,2 мм, 0,1 мм, 0,08 мм, 0,04 мм, 0,02 мм или 0,01 мм. В некоторых случаях, значения толщины, описанные в настоящем описании, могут представлять собой толщину эпидермального слоя и заменителя базальной мембраны.
[0059] Длину эпидермального слоя можно конструировать для соответствия функции или использованию синтетической кожи. Эпидермальный слой может иметь длину от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 50 м. Например, эпидермальный слой может иметь длину от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 10 мм, от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 8 мм, от приблизительно 0,01 до приблизительно 5 мм, от приблизительно 0,02 до приблизительно 5 мм, от приблизительно 0,05 до приблизительно 5 мм, от приблизительно 0,1 до приблизительно 5 мм, от приблизительно 0,1 до приблизительно 2 мм, от приблизительно 0,1 до приблизительно 1 мм, от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,8 мм, или от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,5 мм. Например, эпидермальный слой может иметь длину от приблизительно 0,02 мм до 5 мм. Например, эпидермальный слой может иметь длину от приблизительно 0,1 мм до 0,5 мм. Например, эпидермальный слой может иметь длину от приблизительно 0,2 мм до 0,5 мм. В некоторых случаях, длина эпидермального слоя может составлять по меньшей мере 0,001 мм, 0,01 мм, 0,02 мм, 0,04 мм, 0,08 мм, 0,1 мм, 0,2 мм, 0,4 мм, 0,8 мм, 1 мм, 2 мм, 4 мм, 8 мм или 10 мм. В некоторых случаях, длина эпидермального слоя может составлять самое большее 50 мм, 40 мм, 20 мм, 10 мм, 8 мм, 4 мм, 2 мм, 1 мм, 0,8 мм, 0,4 мм, 0,2 мм, 0,1 мм, 0,08 мм, 0,04 мм, 0,02 мм или 0,01 мм. В некоторых вариантах осуществления эпидермальный слой может иметь длину по меньшей мере приблизительно 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 700, 1000 мм. В некоторых вариантах осуществления эпидермальный слой может иметь длину по меньшей мере приблизительно 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 см. В некоторых вариантах осуществления эпидермальный слой может иметь длину по меньшей мере приблизительно 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 м.
[0060] Ширину эпидермального слоя можно конструировать для соответствия функции или использованию синтетической кожи. Эпидермальный слой может иметь ширину от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 50 м. Например, эпидермальный слой может иметь ширину от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 10 мм, от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 8 мм, от приблизительно 0,01 до приблизительно 5 мм, от приблизительно 0,02 до приблизительно 5 мм, от приблизительно 0,05 до приблизительно 5 мм, от приблизительно 0,1 до приблизительно 5 мм, от приблизительно 0,1 до приблизительно 2 мм, от приблизительно 0,1 до приблизительно 1 мм, от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,8 мм, или от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,5 мм. Например, эпидермальный слой может иметь ширину от приблизительно 0,02 мм до 5 мм. Например, эпидермальный слой может иметь ширину от приблизительно 0,1 мм до 0,5 мм. Например, эпидермальный слой может иметь ширину от приблизительно 0,2 мм до 0,5 мм. В некоторых случаях, ширина эпидермального слоя может составлять по меньшей мере 0,001 мм, 0,01 мм, 0,02 мм, 0,04 мм, 0,08 мм, 0,1 мм, 0,2 мм, 0,4 мм, 0,8 мм, 1 мм, 2 мм, 4 мм, 8 мм или 10 мм. В некоторых случаях, ширина эпидермального слоя может составлять самое большее 50 мм, 40 мм, 20 мм, 10 мм, 8 мм, 4 мм, 2 мм, 1 мм, 0,8 мм, 0,4 мм, 0,2 мм, 0,1 мм, 0,08 мм, 0,04 мм, 0,02 мм или 0,01 мм. В некоторых вариантах осуществления эпидермальный слой может иметь ширину по меньшей мере приблизительно 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 700, 1000 мм. В некоторых вариантах осуществления эпидермальный слой может иметь ширину по меньшей мере приблизительно 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 см. В некоторых вариантах осуществления эпидермальный слой может иметь ширину по меньшей мере приблизительно 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 м.
[0061] Синтетическая кожа может содержать один или несколько эпидермальных слоев. Например, синтетическая кожа может иметь по меньшей мере приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 40, 60, 80 или 100 эпидермальных слоев. Когда синтетическая кожа содержит больше чем один эпидермальный слой, один эпидермальный слой можно помещать на другой эпидермальный слой. Например, синтетическая кожа может содержать два эпидермальных слоя, например, первый эпидермальный слой и второй эпидермальный слой. Первый эпидермальный слой можно помещать на второй эпидермальный слой.
[0062] Эпидермальный слой может быть расслаиваемым, например, имеющим множество подслоев. Подслои могут иметь различные клеточные композиции, например, кератиноциты различных типов. Подслои эпидермального слоя могут иметь различные толщины и/или плотности. Например, эпидермальный слой может иметь один или несколько из ороговевающего слоя (рогового слоя), прозрачного/просвечивающего слоя (блестящий слой), гранулярного слоя (зернистого слоя), шиповидного слоя (шиповатого слоя), базального/зародышевого слоя (базального слоя/герминативного) или любой их комбинации. В некоторых случаях, эпидермальный слой содержит функциональный эпидермальный барьер проницаемости (например, организованные липидные бислои в роговом слое). В некоторых случаях, роговой слой, блестящий слой, зернистый слой, шиповатый слой или базальный слой/герминативный может иметь толщину от приблизительно 0,0001 мм до приблизительно 5 мм. В некоторых случаях, роговой слой, блестящий слой, зернистый слой, шиповатый слой или базальный слой/герминативный могут иметь толщину по меньшей мере приблизительно 0,001 мм, 0,01 мм, 0,02 мм, 0,04 мм, 0,08 мм, 0,1 мм, 0,15 мм, 0,2 мм, 0,4 мм, 0,8 мм, 1 мм, 2 мм, 4 мм, 8 мм или 10 мм. В некоторых случаях, роговой слой, блестящий слой, зернистый слой, шиповатый слой или базальный слой/герминативный, могут иметь толщину самое большее приблизительно 50 мм, 40 мм, 20 мм, 10 мм, 8 мм, 4 мм, 2 мм, 1 мм, 0,8 мм, 0,4 мм, 0,2 мм, 0,15 мм, 0,1 мм, 0,08 мм, 0,04 мм, 0,02 мм или 0,01 мм.
[0063] Эпидермальный слой дополнительно может содержать клетки, продуцирующие пигменты, например, меланин. Такие пигмент-продуцирующие клетки могут представлять собой меланоциты. Меланоциты в эпидермальном слое могут экспрессировать один или несколько маркеров. Такие маркеры могут включать, но не ограничиваясь этим, содержащий SRY-бокс ген 10 (Sox-10), ассоциированный с микрофтальмией фактор транскрипции (MITF-M), белок премеланосом (gp-100), допахромтаутомеразу (DCT), тирозиназу (TYR) и мелан A (MLANA).
Клетки в синтетической коже
[0064] Синтетическая кожа может содержать клетки в дермальном слое и эпидермальном слое, раскрытых в настоящем описании. В некоторых случаях, синтетическая кожа также содержит клетки волосяного фолликула, клетки эндотелия, клетки дермального сосочка, клетки иммунной системы (такие как лимфоциты, дендритные клетки, макрофаги или клетки Лангерганса), адипоциты, нервные клетки и их смесь.
[0065] Одна или несколько клеток в синтетической коже могут представлять собой генетически сконструированные клетки. Термин «генетически сконструированный» может относиться к искусственному изменению нуклеиновой кислоты, содержащейся в клетке. Следовательно, генетически сконструированные клетки могут включать клетки, содержащие инсерцию, делецию и/или замену одного или нескольких нуклеотидов в геноме клетки, а также изменения, включая введение самореплицирующихся внехромосомных нуклеиновых кислот, вставленных в клетку. Генетически сконструированные клетки также включают те, в которых транскрипция одного или нескольких генов изменена, например, увеличена или уменьшена.
[0066] В некоторых случаях, синтетическая кожа имеет по меньшей мере один из компонентов нативной кожи, таких как меланоциты, волосяные фолликулы, потовые железы и нервные окончания. В определенных случаях, синтетическую кожу может отличать от нормальной нативной кожи отсутствие по меньшей мере одного из этих компонентов. В некоторых случаях, проявляя аномальные фенотипы или имея по меньшей мере одну клетку с измененным генотипом, синтетическая кожа может включать все эти компоненты.
[0067] В определенном случае дополнительные компоненты можно добавлять в синтетическую кожу. Такие дополнительные компоненты могут включать миоэпителиальные клетки, клетки протоков, секреторные клетки, альвеолярные клетки, клетки Лангерганса, клетки Меркеля, сращения, молочные железы или любую их смесь. В некоторых случаях, синтетическая кожа содержит одно или несколько из: нервных клеток, соединительной ткани (включая кость, хрящ, клетки, дифференцирующиеся в формирующие кость клетки и хондроциты, и лимфатические ткани), эпителиальных клеток (включая клетки эндотелия, которые образуют выстилки в полостях и сосудах или каналах, экзокринные секреторные эпителиальные клетки, эпителиальные абсорбирующие клетки, ороговевающие эпителиальные клетки и секреционные клетки внеклеточного матрикса) и недифференцированных клеток (таких как эмбриональные клетки, стволовые клетки и другие клетки-предшественники).
[0068] Синтетическая кожа может содержать волосяные фолликулы. Волосяной фолликул может содержать одну или несколько структур, в том числе сосочек, матрикс, влагалище корня, утолщение, воронку, мышцы, поднимающие волос, сальные железы и апокринные потовые железы. Волосяной фолликул может содержать одну или несколько клеток волосяного фолликула, в том числе клетку дермального сосочка, внешнюю клетку влагалища корня или любую их комбинацию. В некоторых случаях, волосяной фолликул может находиться в эпидермальных слоях. В некоторых случаях, волосяной фолликул может находиться в дермальном слое. Клетки волосяных фолликулов можно дифференцировать из предшественника, например, стволовой клетки, такой как iPSC. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере приблизительно 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% клеток волосяного фолликула можно дифференцировать из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток.
[0069] В некоторых вариантах осуществления синтетическая кожа может быть лишена волос, кровеносных сосудов, сальных желез, волосяных фолликулов, сальных желез, нервов или их комбинации.
[0070] В некоторых случаях, синтетическая кожа может содержать волосы, например, в одной или нескольких слоистых структурах. Например, синтетическая кожа может содержать мех. Волосы (например, мех) могут быть природными, синтетическими или их комбинацией. Волосы (например, мех) можно выращивать из клеток в синтетической коже или добавлять в синтетическую кожу из экзогенного источника. В других случаях синтетическая кожа может не иметь какие-либо волосы.
Стволовые клетки
[0071] Одну или несколько клеток в синтетической коже можно дифференцировать из клеток-предшественников, таких как стволовые клетки. Например, фибробласты в синтетической коже можно дифференцировать из стволовых клеток. Например, кератиноциты в синтетической коже можно дифференцировать из стволовых клеток. Например, меланоциты в синтетической коже можно дифференцировать из стволовых клеток. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере приблизительно 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% клеток, раскрытых в настоящем описании, можно дифференцировать из стволовых клеток. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере приблизительно 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% фибробластов можно дифференцировать из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере приблизительно 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% кератиноцитов можно дифференцировать из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере приблизительно 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% клеток меланоцитов можно дифференцировать из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток.
[0072] Стволовые клетки могут представлять собой эмбриональные стволовые клетки (ESC), зрелые стволовые клетки (т. е. соматические стволовые клетки) или индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC). В некоторых вариантах осуществления стволовая клетка может представлять собой тотипотентные, плюрипотентные или мультипотентные, например, зрелые стволовые клетки и стволовые клетки пуповинной крови). Эмбриональные стволовые клетки можно получать из оплодотворенных эмбрионов в возрасте меньше одной недели. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки можно получать через индуцированную экспрессию одного или нескольких из генов Oct3, Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc в любой соматической клетке (например, зрелой соматической клетке), такой как фибробласт. В некоторых случаях один или несколько других генов также можно индуцировать для перепрограммирования соматической клетки в индуцированную плюрипотентную стволовую клетку. Примеры таких генов включают NANOG, UTF1, LIN28, SALL4, NR5A2, TBX3, ESSRB, DPPA4, SV40LT, REМ2, MDМ2 и циклин D1.
[0073] Различные способы доставки можно использовать для того, чтобы модулировать экспрессию генов для перепрограммирования соматической клетки в iPSC. Образцовые способы доставки включают доставку депротеинизированной ДНК, аденовирусную, электрическую доставку, химическую доставку, механическую доставку, системы на основе полимеров, микроинъекцию, ретровирусы (например, ретровирусы, полученные из MMLV) и лентивирусы (например, разрезаемые лентивирусы). В некоторых случаях, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки можно получать в соответствии с протоколом, как описано в Takahashi et al., Cell. 2007 Nov 30;131(5):861-72 (2007), или в Yu et al., Science 318, 1917-1920 (2007) (2007). В определенном случае, соматические клетки (например, зрелые соматические клетки) трансфицируют вирусными векторами, такими как ретровирусные векторы, которые содержат гены Oct3, Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc. В некоторых случаях, вирус Сендай используют в качестве системы доставки, например, вирус Сендай, полученный в ID Pharma Co., Ltd., Japan.
Источники клеток
[0074] Синтетическая кожа может содержать клетки, получаемые у животных одного или нескольких биологических видов. Например, клетки в синтетической коже можно получать у млекопитающих, птиц, рептилий, амфибий, рыб, беспозвоночных или любой их комбинации.
[0075] Синтетическая кожа может содержать клетки, получаемые у млекопитающих, например, клетки млекопитающих, или не млекопитающих. Млекопитающее может представлять собой не являющееся человеком млекопитающее. Не являющееся человеком млекопитающее может представлять собой антилопу, медведя, бобра, бизона, борова, верблюда, карибу, кошку, крупный рогатый скот, оленя, собаку, слона, лося, лисицу, жирафа, козу, зайца, лошадь, каменного козла, кенгуру, льва, ламу, рысь, норку, марала, вола, пекари, свиньи, кролика, носорога, тюленя, овцу, белку, тигра, кита, волка, яка или зебру. В некоторых случаях, млекопитающее может представлять собой примата, корову, овцу, свинью, лошадь, собаку, кошку, грызуна или зайцеобразное. Не млекопитающее может представлять собой рыбу, птицу или рептилию. В некоторых случаях, млекопитающим может быть человек. В некоторых вариантах осуществления человек может быть знаменитостью. Как используют в настоящем описании, термин «знаменитость» можно определять как человека, который привлекает внимание общества за счет печальной славы или общей известности по предыдущей активности. «Знаменитость» можно ассоциировать с определенными индустриями, включая в качестве неограничивающих примеров профессиональный и любительский спорт, развлечения, музыку, кино, бизнес, печатные и электронные средства массовой информации, политику и т. п.
[0076] Синтетическая кожа может содержать клетки, получаемые от других биологических видов. В некоторых случаях клетки получают у птиц, таких как курица, утка, эму, гусь, куропатки, страуса, фазана, голубя, перепелки или индюшки. В некоторых случаях, клетки получают у рептилий, таких как черепаха, змея, крокодил или аллигатор. В некоторых случаях, клетки получают у амфибий, таких как лягушка, жаба, саламандра или тритон. В некоторых случаях, клетки получают у рыб, таких как хамса, лаврак, сом, карп, треска, угорь, камбала, фугу, групер, пикша, палтус, сельдь, макрель, махи-махи, скат манта, марлин, исландский берикс, окунь, щука, сайда, лосось, сардина, акула, золотистый окунь, солея, хвостокол, рыба-меч, тиляпия, форель, тунец или желтый судак.
[0077] В некоторых случаях, все клетки в синтетической коже получают у одного и того же биологического вида. Например, все клетки в синтетической коже могут представлять собой клетки коровы. В других случаях, синтетическая кожа содержит клетки, получаемые от нескольких биологических видов. Например, синтетическая кожа может содержать клетки коровы и клетки аллигатора. В некоторых случаях, синтетическая кожа содержит клетки, получаемые от по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 10 биологических видов.
[0078] Предшественники клеток в синтетической коже также можно получать из источников, описанных в настоящем описании. Например, стволовые клетки (например, iPSC), соматические клетки (например, подлежащие перепрограммированию в iPSC), первичные клетки, используемые в синтетических клетках, клетках дермального слоя, клетках эпидермального слоя или любых клетках в синтетической, и их предшественники можно получать из источников, описанных в настоящем описании.
[0079] Любая клетка может представлять собой живую клетку или погибшую клетку. Когда имеет место несколько клеток, клетки могут представлять собой живую клетку, могут представлять собой погибшую клетку или любую их комбинацию.
Слоистая структура
[0080] Синтетическая кожа может содержать одну или несколько слоистых структур. Слоистую структуру можно формировать посредством размещения слоя первого типа на слое второго типа. Слой первого типа и слой второго типа могут представлять собой одно и то же или различное. В некоторых случаях, слоистую структуру можно формировать посредством размещения эпидермального слоя на дермальном слое. Например, слоистую структуру можно формировать посредством размещения эпидермального слоя на дермальном слое, с заменителем базальной мембраны между.
[0081] Слоистая структура может содержать два или больше слоев. В некоторых случаях слоистая структура содержит по меньшей мере 2, 3, 4, 5 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 500 или 1000 слоев. В некоторых случаях, слоистая структура содержит по меньшей мере 2, 3, 4, 5 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 500 или 1000 слоев первого типа и по меньшей мере 2, 3, 4, 5 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40 или 50 слоев второго типа. Например, слоистая структура может содержать по меньшей мере 2, 3, 4, 5 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 500 или 1000 дермальных слоев и по меньшей мере 2, 3, 4, 5 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 500 или 1000 слоев эпидермального слоя.
[0082] Слоистая структура может содержать клетки одного или нескольких типов, описанных в настоящем описании. Например, слоистая структура может содержать клетки в дермальном слое, такие как фибробласты, клетки в эпидермальном слое, такие как кератиноциты, или любую их комбинацию. В некоторых случаях, слоистая структура дополнительно содержит клетки, отличные от фибробластов и кератиноцитов. Например, слоистая структура может содержать меланоциты.
[0083] Слоистая структура может иметь толщину от приблизительно 0,001 мм до приблизительно 100 мм. Например, слоистая структура может иметь толщину от приблизительно 0,005 мм до приблизительно 50 мм, от приблизительно 0,005 до приблизительно 10, от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 10 мм, от приблизительно 0,02 до приблизительно 5 мм, от приблизительно 0,05 до приблизительно 5 мм, от приблизительно 0,1 до приблизительно 5 мм, от приблизительно 0,1 до приблизительно 2 мм, от приблизительно 0,1 до приблизительно 1 мм или от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,5 мм. В некоторых случаях, толщина слоистой структуры может составлять по меньшей мере 0,001 мм, 0,01 мм, 0,02 мм, 0,04 мм, 0,08 мм, 0,1 мм, 0,2 мм, 0,4 мм, 0,8 мм, 1 мм, 2 мм, 4 мм, 8 мм, 10 мм, 20 мм, 40 мм, 60 мм, 80 мм или 100 мм. В некоторых случаях, толщина слоистой структуры может составлять самое большее 100 мм, 50 мм, 40 мм, 20 мм, 10 мм, 8 мм, 4 мм, 2 мм, 1 мм, 0,8 мм, 0,4 мм, 0,2 мм, 0,1 мм, 0,08 мм, 0,04 мм, 0,02 мм или 0,01 мм. В некоторых вариантах осуществления слоистая структура может иметь толщину по меньшей мере приблизительно 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 мм.
[0084] Длину слоистой структуры можно конструировать для соответствия функции или использованию синтетической кожи. Слоистая структура может иметь длину от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 50 м. Например, слоистая структура может иметь длину от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 10 мм, от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 8 мм, от приблизительно 0,01 до приблизительно 5 мм, от приблизительно 0,02 до приблизительно 5 мм, от приблизительно 0,05 до приблизительно 5 мм, от приблизительно 0,1 до приблизительно 5 мм, от приблизительно 0,1 до приблизительно 2 мм, от приблизительно 0,1 до приблизительно 1 мм, от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,8 мм, или от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,5 мм. Например, слоистая структура может иметь длину от приблизительно 0,02 мм до 5 мм. Например, слоистая структура может иметь длину от приблизительно 0,1 мм до 0,5 мм. Например, слоистая структура может иметь длину от приблизительно 0,2 мм до 0,5 мм. В некоторых случаях, длина слоистой структуры может составлять по меньшей мере 0,001 мм, 0,01 мм, 0,02 мм, 0,04 мм, 0,08 мм, 0,1 мм, 0,2 мм, 0,4 мм, 0,8 мм, 1 мм, 2 мм, 4 мм, 8 мм или 10 мм. В некоторых случаях, длина слоистой структуры может составлять самое большее 50 мм, 40 мм, 20 мм, 10 мм, 8 мм, 4 мм, 2 мм, 1 мм, 0,8 мм, 0,4 мм, 0,2 мм, 0,1 мм, 0,08 мм, 0,04 мм, 0,02 мм или 0,01 мм. В некоторых вариантах осуществления слоистая структура может иметь длину по меньшей мере приблизительно 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 700, 1000 мм. В некоторых вариантах осуществления слоистая структура может иметь длину по меньшей мере приблизительно 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 см. В некоторых вариантах осуществления слоистая структура может иметь длину по меньшей мере приблизительно 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 м.
[0085] Ширину слоистой структуры можно конструировать для соответствия функции или использованию синтетической кожи. Слоистая структура может иметь ширину от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 50 м. Например, слоистая структура может иметь ширину от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 10 мм, от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 8 мм, от приблизительно 0,01 до приблизительно 5 мм, от приблизительно 0,02 до приблизительно 5 мм, от приблизительно 0,05 до приблизительно 5 мм, от приблизительно 0,1 до приблизительно 5 мм, от приблизительно 0,1 до приблизительно 2 мм, от приблизительно 0,1 до приблизительно 1 мм, от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,8 мм, или от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,5 мм. Например, слоистая структура может иметь ширину от приблизительно 0,02 мм до 5 мм. Например, слоистая структура может иметь ширину от приблизительно 0,1 мм до 0,5 мм. Например, слоистая структура может иметь ширину от приблизительно 0,2 мм до 0,5 мм. В некоторых случаях, ширина слоистой структуры может составлять по меньшей мере 0,001 мм, 0,01 мм, 0,02 мм, 0,04 мм, 0,08 мм, 0,1 мм, 0,2 мм, 0,4 мм, 0,8 мм, 1 мм, 2 мм, 4 мм, 8 мм или 10 мм. В некоторых случаях, ширина слоистой структуры может составлять самое большее 50 мм, 40 мм, 20 мм, 10 мм, 8 мм, 4 мм, 2 мм, 1 мм, 0,8 мм, 0,4 мм, 0,2 мм, 0,1 мм, 0,08 мм, 0,04 мм, 0,02 мм или 0,01 мм. В некоторых вариантах осуществления слоистая структура может иметь ширину по меньшей мере приблизительно 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 700, 1000 мм. В некоторых вариантах осуществления слоистая структура может иметь ширину по меньшей мере приблизительно 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 см. В некоторых вариантах осуществления слоистая структура может иметь ширину по меньшей мере приблизительно 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 м.
[0086] Слоистая структура может содержать фибробласты и кератиноциты в любом соотношении из по меньшей мере приблизительно 50:1, 40:1, 30:1, 29:1, 28:1, 27:1, 26:1, 25:1, 24:1, 23:1, 22:1, 21:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:10 или 1:100. В некоторых случаях, соотношение фибробластов и кератиноцитов может составлять от приблизительно 20:1 до приблизительно 3:1, от приблизительно 20:1 до приблизительно 4:1, от приблизительно 20:1 до приблизительно 5:1, от приблизительно 20:1 до приблизительно 10:1 или от приблизительно 20:1 до приблизительно 15:1.
[0087] Слоистая структура может содержать фибробласты и меланоциты в любом соотношении из по меньшей мере приблизительно 50:1, 40:1, 30:1, 29:1, 28:1, 27:1, 26:1, 25:1, 24:1, 23:1, 22:1, 21:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:10 или 1:100. В некоторых случаях, соотношение фибробластов и меланоцитов может составлять от приблизительно 20:1 до приблизительно 3:1, от приблизительно 20:1 до приблизительно 4:1, от приблизительно 20:1 до приблизительно 5:1, от приблизительно 20:1 до приблизительно 10:1 или от приблизительно 20:1 до приблизительно 15:1.
[0088] Слоистая структура может содержать кератиноциты и меланоциты в любом соотношении по меньшей мере приблизительно 50:1, 40:1, 30:1, 29:1, 28:1, 27:1, 26:1, 25:1, 24:1, 23:1, 22:1, 21:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:10 или 1:100. В некоторых случаях, соотношение кератиноцитов и меланоцитов может составлять от приблизительно 20:1 до приблизительно 3:1, от приблизительно 20:1 до приблизительно 4:1, от приблизительно 20:1 до приблизительно 5:1, от приблизительно 20:1 до приблизительно 10:1 или от приблизительно 20:1 до приблизительно 15:1.
[0089] Клетки одного типа в слоистой структуре могут составлять самое большее 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 10%, 5% или 1% от общей клеточной популяции в слоистой структуре. Клетки одного типа в слоистой структуре могут составлять приблизительно по меньшей мере 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% от общей клеточной популяции в слоистой структуре. Например, фибробласты в слоистой структуре могут составлять приблизительно по меньшей мере 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% от общей клеточной популяции в слоистой структуре.
Синтетическая кожа
[0090] Синтетическую кожу можно формировать с помощью одной или нескольких слоистых структур. Например, синтетическую кожу можно формировать с помощью по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 слоистых структур.
[0091] Синтетическая кожа может быть разной толщины. Например, синтетическая кожа может иметь толщину, имеющую сходство с природной кожей. В некоторых случаях, синтетическая кожа может иметь толщину от приблизительно 0,001 мм до приблизительно 100 мм. Например, слоистая структура может иметь толщину от приблизительно 0,005 мм до приблизительно 50 мм, от приблизительно 0,005 до приблизительно 10, от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 10 мм, от приблизительно 0,1 до приблизительно 5 мм, от приблизительно 0,5 мм до приблизительно 5 мм, от приблизительно 0,5 мм до приблизительно 3 мм, от приблизительно 0,8 мм до приблизительно 3 мм, от приблизительно 0,8 мм до приблизительно 2 мм, от приблизительно 0,8 мм до приблизительно 1,8 мм, от приблизительно 0,8 мм до приблизительно 1,6 мм, от приблизительно 0,9 мм до приблизительно 1,4 мм, от приблизительно 1 мм до приблизительно 1,5 мм, от приблизительно 1 мм до приблизительно 1,4 мм, или от приблизительно 1 мм до приблизительно 1,3 мм. В некоторых случаях, толщина синтетической кожи может составлять по меньшей мере 0,001 мм, 0,01 мм, 0,02 мм, 0,04 мм, 0,08 мм, 0,1 мм, 0,2 мм, 0,4 мм, 0,8 мм, 1 мм, 2 мм, 4 мм, 8 мм, 10 мм, 20 мм, 40 мм, 60 мм, 80 мм или 100 мм. В некоторых случаях, толщина синтетической кожи может составлять самое большее 100 мм, 50 мм, 40 мм, 20 мм, 10 мм, 8 мм, 4 мм, 2 мм, 1 мм, 0,8 мм, 0,4 мм, 0,2 мм, 0,1 мм, 0,08 мм, 0,04 мм, 0,02 мм или 0,01 мм. В некоторых случаях, толщина синтетической кожи может составлять приблизительно 1,2 мм.
[0092] Синтетическая кожа может иметь длину от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 50 м. Например, синтетическая кожа может иметь длину от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 10 мм, от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 8 мм, от приблизительно 0,01 до приблизительно 5 мм, от приблизительно 0,02 до приблизительно 5 мм, от приблизительно 0,05 до приблизительно 5 мм, от приблизительно 0,1 до приблизительно 5 мм, от приблизительно 0,1 до приблизительно 2 мм, от приблизительно 0,1 до приблизительно 1 мм, от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,8 мм, или от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,5 мм. Например, синтетическая кожа может иметь длину от приблизительно 0,02 мм до 5 мм. Например, синтетическая кожа может иметь длину от приблизительно 0,1 мм до 0,5 мм. Например, синтетическая кожа может иметь длину от приблизительно 0,2 мм до 0,5 мм. В некоторых случаях, длина синтетической кожи может составлять по меньшей мере 0,001 мм, 0,01 мм, 0,02 мм, 0,04 мм, 0,08 мм, 0,1 мм, 0,2 мм, 0,4 мм, 0,8 мм, 1 мм, 2 мм, 4 мм, 8 мм или 10 мм. В некоторых случаях, длина синтетической кожи может составлять самое большее 50 мм, 40 мм, 20 мм, 10 мм, 8 мм, 4 мм, 2 мм, 1 мм, 0,8 мм, 0,4 мм, 0,2 мм, 0,1 мм, 0,08 мм, 0,04 мм, 0,02 мм или 0,01 мм. В некоторых вариантах осуществления синтетическая кожа может иметь длину по меньшей мере приблизительно 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 700, 1000 мм. В некоторых вариантах осуществления синтетическая кожа может иметь длину по меньшей мере приблизительно 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 см. В некоторых вариантах осуществления синтетическая кожа может иметь длину по меньшей мере приблизительно 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 м.
[0093] Синтетическая кожа может иметь ширину от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 50 м. Например, синтетическая кожа может иметь ширину от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 10 мм, от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 8 мм, от приблизительно 0,01 до приблизительно 5 мм, от приблизительно 0,02 до приблизительно 5 мм, от приблизительно 0,05 до приблизительно 5 мм, от приблизительно 0,1 до приблизительно 5 мм, от приблизительно 0,1 до приблизительно 2 мм, от приблизительно 0,1 до приблизительно 1 мм, от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,8 мм, или от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,5 мм. Например, синтетическая кожа может иметь ширину от приблизительно 0,02 мм до 5 мм. Например, синтетическая кожа может иметь ширину от приблизительно 0,1 мм до 0,5 мм. Например, синтетическая кожа может иметь ширину от приблизительно 0,2 мм до 0,5 мм. В некоторых случаях, ширина синтетической кожи может составлять по меньшей мере 0,001 мм, 0,01 мм, 0,02 мм, 0,04 мм, 0,08 мм, 0,1 мм, 0,2 мм, 0,4 мм, 0,8 мм, 1 мм, 2 мм, 4 мм, 8 мм или 10 мм. В некоторых случаях, ширина синтетической кожи может составлять самое большее 50 мм, 40 мм, 20 мм, 10 мм, 8 мм, 4 мм, 2 мм, 1 мм, 0,8 мм, 0,4 мм, 0,2 мм, 0,1 мм, 0,08 мм, 0,04 мм, 0,02 мм или 0,01 мм. В некоторых вариантах осуществления синтетическая кожа может иметь ширину по меньшей мере приблизительно 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 700, 1000 мм. В некоторых вариантах осуществления синтетическая кожа может иметь ширину по меньшей мере приблизительно 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 см. В некоторых вариантах осуществления синтетическая кожа может иметь ширину по меньшей мере приблизительно 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 м.
Заменитель базальной мембраны
[0094] Синтетическая кожа дополнительно может содержать заменитель базальной мембраны. Заменитель базальной мембраны может находиться между двумя слоями клеток, например, между дермальным слоем и эпидермальным слоем. Заменитель базальной мембраны может представлять собой дермально-эпидермальное соединение, схожее с тем, которое существует in vivo, со структурной точки зрения и/или с биохимической точки зрения. С биохимической точки зрения, заменитель базальной мембраны может содержать компоненты базальной мембраны, плотной пластинки, светлой пластинки и подбазальной зоны, такие как коллаген IV, коллаген VII, ламинин 5, энтактин фибронектин или любую их комбинацию.
[0095] Заменитель базальной мембраны в синтетической коже может представлять собой базальную мембрану мочевого пузыря (UBM), базальную мембрану печени (LBM), амнион, хорион, аллотрансплантат перикарда, аллотрансплантат бесклеточной дермы, амниотическую мембрану, вартонов студень или любую их комбинацию. Например, заменитель базальной мембраны может представлять собой высушенную бесклеточную амниотическую мембрану. В определенных случаях, заменитель базальной мембраны может представлять собой полимер, например, нанополимер. Например, заменитель базальной мембраны может представлять собой нановолокнистый полигидроксибутират-согидроксивалерат (PHBV), как описано в Bye et al., Journal of Biomaterials and Tissue Engineering, том 4, 1-7, 2014.
Каркас
[0096] Слой клеток (например, дермальный слой), слоистую структуру или синтетическую кожу можно помещать на каркасе. Каркас может обеспечивать определенную прочность (например, сопротивление разрыву), упругость или и то и другое. В некоторых случаях, часть каркаса или каркас целиком может содержаться в синтетической коже. В других случаях, каркас может не содержаться в синтетической коже. После содействия формированию слоя в синтетической коже, каркас можно удалять из конечного продукта синтетической кожи. В определенных случаях, каркас, содержащийся в синтетической коже, может разрушаться после определенного периода времени. Каркас, описанный в настоящем описании, может содержать трабекулярный паттерн.
[0097] Каркас можно выполнять из природных материалов, синтетических материалов или их комбинации. Примеры каркасов включают каркас, формируемый с использованием сети, выполненной из биоабсорбируемого синтетического полимера, каркас, формируемый посредством прикрепления нейлоновой сети к кремниевой пленке, каркас, имеющий двухслойную структуру коллагеновой губки и кремниевого листа, каркас, формируемый с использованием губки из ателоколлагена, выполненной в виде листа, каркас, формируемый посредством стыковки губок из коллагена, имеющих различные размеры пор, и бесклеточные дермальные матриксы (ADM), формируемые с использованием фибринового клея или аллогенной кожи, которая сделана бесклеточной.
[0098] Каркас может содержать природные вещества, такие как коллаген (например, коллагеновый матрикс), природный адгезив (например, фибриновый клей, холодный клей, клей животного происхождения, клей из альбумина крови, казеиновый клей или овощной клей, такой как крахмальный и декстриновый клей). В некоторых случаях, каркас содержит шелк. Например, каркас можно выполнять из шелка. В некоторых вариантах осуществления каркас может содержать, волокна фиброина шелка, целлюлозные, хлопковые, ацетатные, акриловые, латексные волокна, лен, нейлон, вискозу, бархат, модакриловый, сложный олефиновый полиэфир, саран, виньон, шерсть, джут, пеньку, бамбук, льняное полотно или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления каркас может содержать волокна. В некоторых вариантах осуществления волокна могут представлять собой волокна шелка, хлопка, шерсти, льна, целлюлозы, извлеченной, в частности, из древесины, овощей или водорослей, полиамид, модифицированную целлюлозу (вискозу, ацетат, в частности ацетат вискозы), поли-п-фенилентерефталамид, акриловые волокна, например, таковые из полиметилметакрилата или из поли-2-гидроксиэтилметакрилата, волокна из полиолефина, например, волокна из полиэтилена или полипропилена, стекла, диоксида кремния, арамида, углерода, например, в форме графита, поли(тетрафторэтилена), нерастворимого коллагена, сложных полиэфиров, поливинилхлорида или поливинилиденхлорида, поливинилового спирта, полиакрилонитрила, хитозана, полиуретана, поли(уретан-мочевины) или полиэтиленфталата, и волокна, формируемые из смеси полимеров, такие как те, которые указаны выше, такие как полиамидные/полиэфирные волокна или любую их комбинацию.
[0099] Каркас может содержать полимеры. Полимер может представлять собой биополимер. Биополимер может включать, но не ограничиваясь этим, хитин, хитозан, эластин, коллаген, кератин или полигидроксиалканоат. Полимеры могут быть биоразрушаемыми, биостабильным или представлять собой их комбинации. Полимер в каркасе может представлять собой природные полимеры. Образцовые природные полимеры включают полисахариды, такие как альгинат, целлюлоза, декстран, пуллулан, полигиалуроновую кислоту, хитин, поли(3-гидроксиалканоат), поли(3-гидроксиоктаноат) или поли(3-гидроксижирную кислоту). В некоторых случаях, каркас также содержит химические производные природных полимеров. Такие химические производные могут содержать замещения и/или добавления химических групп, таких как алкил, алкилен, гидроксилирование, окисление, а также другие модификации, известные специалистам в данной области. Природные полимеры также можно выбирать из белков, таких как коллаген, зеин, казеин, желатин, глютен и альбумин сыворотки. Полимером в каркасе могут быть биоразрушаемые синтетические полимеры, в том числе поли α-оксикислоты, такие как поли-L-молочная кислота (PLA), полигликолевая кислота (PGA) или их сополимеры (например, поли-D,L-молочная когликолевая кислота (PLGA)) и гиалуроновая кислота.
[00100] Каркас может быть биоабсорбируемым. Биоабсорбируемый каркас может представлять собой не цитотоксическую структуру или вещество, которые способны содержать или нести живые клетки и удерживать их в желаемой конфигурации в течение определенного периода времени. Термин «биоабсорбируемый» может относиться к любому материалу, который организм может разрушать до нетоксичных побочных продуктов, которые выводятся из организма или подвергаются метаболизму в нем. Образцовые биоабсорбируемые материалы для каркаса включают, поли(молочную кислоту), поли(гликолевую кислоту), поли(триметиленкарбонат), поли(диметилтриметиленкарбонат), поли(аминокислоты), поли(карбонат)ы, получаемые из тирозина, поли(карбонат)ы, поли(капролактон), поли(парадиоксанон), сложные поли(эфиры), поли(эфирамиды), поли(ангидриды), сложные поли(ортоэфиры), коллаген, желатин, сывороточный альбумин, белки, полисахариды, мукополисахариды, углеводы, гликозаминогликаны, поли(этиленгликоли), поли(пропиленгликоли), сложные поли(акрилатные эфиры), сложные поли(метакрилатные эфиры), поли(виниловый спирт), гиалуроновую кислоту, хондроитинсульфат, гепарин, дерматансульфат, версикан, сополимеры и смеси полимеров и олигомеров, содержащих биоабсорбируемые связи.
[00101] Каркас может быть различной толщины. Например, каркас может иметь толщину, которая может быть подходящей для формирования слоя клеток. Например, каркас может иметь толщину от приблизительно 0,1 мм до приблизительно 10 мм, например, от приблизительно 0,1 мм до приблизительно 5 мм, от приблизительно 0,1 мм до приблизительно 4 мм, от приблизительно 0,1 мм до приблизительно 3 мм, от приблизительно 0,1 мм до приблизительно 2 мм, до приблизительно 0,1 мм до приблизительно 1 мм, от приблизительно 0,2 мм до приблизительно 1 мм, от приблизительно 0,3 мм до приблизительно 1 мм, от приблизительно 0,4 мм до приблизительно 1 мм, от приблизительно 0,5 мм до приблизительно 1 мм, от 0,3 мм до приблизительно 1,5 мм, от приблизительно 0,4 мм до приблизительно 1,2 мм, от приблизительно 0,6 мм до приблизительно 1,2 мм или от приблизительно 0,7 мм до приблизительно 1,5 мм. Например, каркас может иметь толщину от приблизительно 0,5 мм до 1 мм. В некоторых случаях, каркас может быть по меньшей мере 0,1 мм, 0,2 мм, 0,3 мм, 0,4 мм, 0,5 мм, 0,8 мм, 1 мм, 2 мм, 3 мм, 4 мм, или 5 мм в толщину. В некоторых случаях, каркас может быть самое большее 0,5 мм, 0,8 мм, 1 мм, 2 мм, 3 мм, 4 мм, 5 мм, 6 мм, 7 мм, 8 мм, 9 мм или 10 мм толщину. В некоторых вариантах осуществления каркас может иметь длину и/или ширину слоя клеток, подлежащего размещению и/или выращиванию на каркасе. В некоторых вариантах осуществления каркас может иметь длину и/или ширину слоя клеток, описанного в настоящем описании.
[00102] Каркас может иметь определенную площадь поверхности на поверхности синтетической кожи. Например, каркас может иметь площадь поверхности от приблизительно 0,1 мм2 до приблизительно 100 мм2, от приблизительно 0,1 мм2 до приблизительно 95 мм2, от приблизительно 0,1 мм2 до приблизительно 90 мм2, от приблизительно 0,1 мм2 до приблизительно 85 мм2, от приблизительно 0,1 мм2 до приблизительно 80 мм2, от приблизительно 0,1 мм2 до приблизительно 75 мм2, от приблизительно 0,1 мм2 до приблизительно 70 мм2, от приблизительно 0,1 мм2 до приблизительно 65 мм2, от приблизительно 0,1 мм2 до приблизительно 60 мм2, от приблизительно 0,1 мм2 до приблизительно 55 мм2, от приблизительно 0,1 мм2 до приблизительно 50 мм2, от приблизительно 0,1 мм2 до приблизительно 45 мм2, от приблизительно 0,1 мм2 до приблизительно 40 мм2, от приблизительно 0,1 мм2 до приблизительно 35 мм2, от приблизительно 0,1 мм2 до приблизительно 30 мм2, от приблизительно 0,1 мм2 до приблизительно 25 мм2, от приблизительно 0,1 мм2 до приблизительно 20 мм2, от приблизительно 0,1 мм2 до приблизительно 15 мм2, от приблизительно 0,1 мм2 до приблизительно 10 мм2, от приблизительно 0,1 мм2 до приблизительно 5 мм2 или от приблизительно 0,1 мм2 до приблизительно 1 мм2. В некоторых случаях каркас может иметь площадь поверхности от приблизительно 0,1 см2 до приблизительно 100 см2, от приблизительно 0,1 см2 до приблизительно 95 см2, от приблизительно 0,1 см2 до приблизительно 90 см2, от приблизительно 0,1 см2 до приблизительно 85 см2, от приблизительно 0,1 см2 до приблизительно 80 см2, от приблизительно 0,1 см2 до приблизительно 75 см2, от приблизительно 0,1 см2 до приблизительно 70 см2, от приблизительно 0,1 см2 до приблизительно 65 см2, от приблизительно 0,1 см2 до приблизительно 60 см2, от приблизительно 0,1 см2 до приблизительно 55 см2, от приблизительно 0,1 см2 до приблизительно 50 см2, от приблизительно 0,1 см2 до приблизительно 45 см2, от приблизительно 0,1 см2 до приблизительно 40 см2, от приблизительно 0,1 см2 до приблизительно 35 см2, от приблизительно 0,1 см2 до приблизительно 30 см2, от приблизительно 0,1 см2 до приблизительно 25 см2, от приблизительно 0,1 см2 до приблизительно 20 см2, от приблизительно 0,1 см2 до приблизительно 15 см2, от приблизительно 0,1 см2 до приблизительно 10 см2, от приблизительно 0,1 см2 до приблизительно 5 см2, или от приблизительно 0,1 см2 до приблизительно 1 см2. В некоторых случаях, каркас может иметь площадь поверхности от приблизительно 0,1 м2 до приблизительно 100 м2, от приблизительно 0,1 м2 до приблизительно 95 м2, от приблизительно 0,1 м2 до приблизительно 90 м2, от приблизительно 0,1 м2 до приблизительно 85 м2, от приблизительно 0,1 м2 до приблизительно 80 м2, от приблизительно 0,1 м2 до приблизительно 75 м2, от приблизительно 0,1 м2 до приблизительно 70 м2, от приблизительно 0,1 м2 до приблизительно 65 м2, от приблизительно 0,1 м2 до приблизительно 60 м2, от приблизительно 0,1 м2 до приблизительно 55 м2, от приблизительно 0,1 м2 до приблизительно 50 м2, от приблизительно 0,1 м2 до приблизительно 45 м2, от приблизительно 0,1 м2 до приблизительно 40 м2, от приблизительно 0,1 м2 до приблизительно 35 м2, от приблизительно 0,1 м2 до приблизительно 30 м2, от приблизительно 0,1 м2 до приблизительно 25 м2, от приблизительно 0,1 м2 до приблизительно 20 м2, от приблизительно 0,1 м2 до приблизительно 15 м2, от приблизительно 0,1 м2 до приблизительно 10 м2, от приблизительно 0,1 м2 до приблизительно 5 м2 или от приблизительно 0,1 м2 до приблизительно 1 м2.
[00103] В некоторых случаях, каркас может иметь площадь поверхности по меньшей мере приблизительно 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 75 или 100 мм2. В некоторых случаях, каркас может иметь площадь поверхности по меньшей мере приблизительно 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 75 или 100 см2. В некоторых случаях, каркас может иметь площадь поверхности по меньшей мере приблизительно 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 75 или 100 м2.
[00104] Альтернативно, слой клеток можно не формировать на каркасе. Например, дермальный слой можно не формировать на каркасе (например, коллагеновом матриксе). В определенных случаях, синтетическая кожа не содержит каркас.
Пигменты
[00105] Синтетическая кожа может содержать один или несколько пигментов. Одна или несколько структур слоев синтетической кожи могут быть пигментированы. Пигмент в синтетической коже может представлять собой природный пигмент, получаемый в клетках, образующих синтетическую кожу. Например, пигмент может представлять собой меланин, в том числе эумеланин (например, коричневый эумеланин и черный эумеланин), феомеланин, нейромеланин или любую их комбинацию. Пигмент в синтетической коже может представлять собой экзогенный пигмент, такой как пигментный краситль кожи.
Коллаген
[00106] Синтетическая кожа может содержать коллаген. Коллаген может относиться к любому члену семейства коллагенов по меньшей мере 28 различных типов. Коллагены можно охарактеризовать с помощью повторяющегося триплета аминокислот, -(Gly-X-Y)n-, так чтобы приблизительно одна треть аминокислотных остатков в коллагене представляют собой глицин. X может представлять собой пролин и Y может представлять собой гидроксипролин. Таким образом, структура коллагена может иметь сдвоенные триплетные звенья пептидных цепей различной длины. Синтетическая кожа может содержать коллаген от одного или нескольких видов. В некоторых случаях синтетическая кожа содержит коллаген от различных животных. Различные животные могут продуцировать коллаген различного аминокислотного состава, что может вести к различным свойствам (и различиям в получаемой коже). Мономеры коллагеновых волокон можно получать из α-цепей приблизительно 1050 аминокислот в длину с тем, чтобы тройная спираль принимала форму стержня приблизительно 300 нм в длину и диаметром приблизительно 1,5 нм.
[00107] Синтетическая кожа может содержать коллаген одного или нескольких типов. Коллаген, содержащийся в синтетической коже, может включать фибриллярные коллагены, нефибриллярные коллагены или их комбинацию. Фибриллярные коллагены включают коллагены I типа, II типа, III типа, V типа и XI типа. Нефибриллярные коллагены включают коллагены, ассоциированные с фибриллами, с нарушенными тройными спиралями (например, IX типа, XII типа, XIV типа, XVI типа и XIX типа), коллагены с короткой цепью (например, VIII типа и X типа), коллагены базальной мембраны (IV типа), мультиплексин (множественные домены тройных спиралей с перерывами) (например, XV типа и XVIII типа), коллагены MACIT (мембраноассоциированные коллагены с прерывающимися тройными спиралями) (например, XIII типа и XVII типа).
[00108] Коллаген может содержаться в одной или нескольких частях синтетической кожи. Например, коллагены могут содержаться в одном или нескольких дермальных слоях, одном или нескольких эпидермальных слоях или их сочетании, в синтетической коже. Например, коллагены могут содержаться в одной или нескольких слоистых структурах в синтетической коже. В некоторых случаях, когда часть синтетической кожи можно удалять во время процесса, коллаген также может содержаться в удаленном продукте.
[00109] Коллаген в синтетической коже может быть из одного или нескольких источников. Например, коллаген можно получать посредством продуцирующих коллаген клеток в синтетической коже. Например, коллаген можно добавлять отдельно в кожу. В некоторых случаях, синтетическая кожа содержит коллаген, продуцируемый с помощью продуцирующих коллаген клеток, и коллагены, добавляемые отдельно.
[00110] По меньшей мере часть коллагена в синтетической коже можно получать посредством продуцирующих коллаген клеток. Такие продуцирующие коллаген клетки могут содержаться в синтетической коже. Образцовые продуцирующие коллаген клетки включают эпителиальные клетки, фибробласты, кератиноциты, корнеоциты, меланоциты, клетки Лангерганса, базальные клетки, гладкомышечные клетки или их комбинацию. Эпителиальные клетки могут включать сквамозные клетки, кубовидные клетки, цилиндрические клетки, базальные клетки или их комбинацию. Фибробласты могут включать дермальные фибробласты. Кератиноциты могут включать эпителиальные кератиноциты, базальные кератиноциты, пролиферирующие базальные кератиноциты, дифференцированные надбазальные кератиноциты или их комбинацию. Коллаген в синтетической коже можно получать посредством продуцирующих коллаген клеток одного или нескольких типов.
Дополняющие средства
[00111] Синтетическая кожа дополнительно может содержать одно или несколько дополняющих средств. Такие дополняющие средства могут усиливать коммерческую привлекательность (например, внешний вид, цвет или запах). Образцовые дополняющие средства включают минералы, волокно, жирные кислоты и аминокислоты, белки. Дополняющее средство может представлять собой отдушку.
[00112] Дополняющие средства могут включать одно или несколько из: матриксных белков, протеогликанов, антиоксидантов, перфторуглеродов и факторов роста. Фактор роста может представлять собой белок, полипептид или комплекс полипептидов, в том числе цитокины (например, которые продуцирует клетка и которые могут влиять на нее саму и/или различные другие близлежащие или отдаленные клетки). Факторы роста могут влиять на рост и/или дифференцировку клеток конкретных типов, или в отношении развития или в ответ на множество физиологических или средовых стимулов. Некоторые, но не все, факторы роста представляют собой гормоны. Образцовые факторы роста включают инсулин, инсулиноподобный фактор роста (IGF), фактор роста нервов (NGF), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), фактор роста кератиноцитов (KGF), факторы роста фибробластов (FGF), в том числе основный FGF (bFGF), тромбоцитарные факторы роста (PDGF), в том числе PDGF-AA и PDGF-AB, фактор роста гепатоцитов (HGF), трансформирующий фактор роста α (TGF-α), трансформирующий фактор роста β (TGF-β), в том числе TGFpi и TGFP3, эпидермальный фактор роста (EGF), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), гранулоцитарныцй колониестимулирующий фактор (G-CSF), интерлейкин-6 (IL-6), IL-8 и т. п. Другие полипептиды или молекулы (например, заживляющие средства; ферменты, такие как разрушающие матрикс ферменты и ингибиторы разрушающих матрикс ферментов (например, TIMP), антибиотики и противогрибковые средства), также можно добавлять в синтетическую кожу.
[00113] Дополняющие средства также могут включать консерванты, известные в данной области. Образцовые консерванты включают противомикробные консерванты, такие как пропионат кальция, нитрат натрия, нитрит натрия, сульфиты (например, диоксид серы, бисульфат натрия, гидросульфит калия и т. д.), этилендиаминтетрауксусную кислоту динатрия (EDTA), антиоксидант, такой как бутилированный гидроксианизол (BHA) и бутилированный гидрокситолуол (BHT).
[00114] В определенных случаях, синтетическая кожа может содержать внеклеточный матрикс или соединительную ткань. Например, синтетическая кожа дополнительно может содержать коллаген, кератин, эластин, желатин, протеогликан, протеогликан дерматансульфат, гликозаминогликан, фибронектин, ламинин, дерматопонтин, липид, жирную кислоту, углевод и их комбинацию.
Паттерн синтетической кожи
[00115] Синтетическая кожа может иметь паттерн. Например, на синтетическую кожу можно наносить паттерн после паттерна кожи животного, выбранного из антилопы, медведя, бобра, бизона, борова, верблюда, карибу, кошки, крупного рогатого скота, оленя, собаки, слона, лося, лисицы, жирафа, козы, зайца, лошади, каменного козла, кенгуру, льва, ламы, рыси, норки, марала, вола, пекари, свиньи, кролика, тюленя, овцы, белки, тигра, кита, волка, яка, зебры, черепахи, змеи, крокодила, аллигатора, динозавра, лягушки, жабы, саламандры, тритона, курицы, утки, эму, гуся, куропатки, страуса, фазана, голубя, перепелки, индюшки, хамсы, лаврака, сома, карпа, трески, угря, камбалы, фугу, групера, пикши, палтуса, сельди, макрели, махи-махи, ската манта, марлина, исландского берикса, окуня, щуки, сайды, лосося, сардины, акулы, золотистого окуня, солеи, хвостокола, рыбы-меч, тиляпии, форели, тунца, желтого судака и их комбинации. Паттерн может представлять собой паттерн кожи вымышленного животного, выбранного из дракона, единорога, грифона, сирены, феникса, сфинкса, циклопов, сатира, Медусы, Пегаса, Цербера, Тифона, горгоны, Харибды, эмпусы, химеры, Минотавра, Кита, гидры, кентавра, феи, русалки, лохнесского чудовища, снежного человека, буревестника, йети, чупакабры и их комбинации.
[00116] Синтетическую кожу можно выполнять так, чтобы она воспроизводила традиционную кожу, шкуру или продукты кожи животного и параметры дизайна (например, типы клеток, дополняющие средства, размер, геометрическая форма). В некоторых случаях, синтетическая кожа содержит слой клеток, который отличается композицией, которая может быть по существу схожа с традиционной кожей, шкурой или продуктами кожи животного. Например, такой слой может отличаться композицией, которая может представлять собой по существу приблизительно на 60-80% водное текучее вещество, приблизительно на 14%-35% белок, приблизительно на 1%-25% жир. В некоторых случаях выстраивают кератиноциты слоя клеток. Например, кератиноциты можно выстраивать посредством приложения электрического поля. Например, кератиноциты можно выстраивать посредством приложения механического стиула, такого как циклическое растяжение и релаксирование подложки. В некоторых случаях, выстроенные (например, электро-ориентированные и механо-ориентированные) кератиноциты имеют по существу одну и ту же ориентацию друг по отношению к другу, как можно найти во многих кожных тканях животных.
Изделия из кожи
[00117] Синтетическая кожа в настоящем описании может представлять собой по меньшей мере часть изделия из кожи. Например, синтетическую кожу можно использовать в качестве заменителя природной кожи в изделии из кожи. Образцовые изделия из кожи включают ремешок часов, ремень, пояс, упаковку, туфлю, ботинок, обувь, перчатку, одежду (например, верхние части, нижние части и верхнюю одежду), багаж, сумку (например, сумочку с плечевым ремнем или без него), клатч, портмоне, монетницу, бумажник, ключницу, чехол для кредитных карт, футляр для ручки, рюкзак, кейс, кошелек, седло, упряжь, плеть, товары для путешествий (например, сундук, чемодан, дорожную сумку, косметичку или туалетный набор), вещмешки, портфель, сумку для документов, папку, дипломат, изделие для питомца (например, поводок или ошейник), охотничье или рыбацкое изделие (например, чехол оружия, ножны или кобура для огнестрельного оружия), стационарное изделие (например, бювар, обложку книги, футляр камеры, футляр для очков, портсигар, футляр для сигар, футляр для ювелирных украшений или чехол мобильного телефона), спортивное изделие (например, мяч, например, мяч для баскетбола, английского футбола или американского футбола), интерьер здания, экстерьер здания, обивку, книжный переплет, мебель, лампу, абажур лампы, скатерть, покрытие стены, покрытие пола, покрытие потолка, интерьер автомобиля, экстерьер автомобиля, интерьер лодки, экстерьер лодки, интерьер самолета, интерьер яхты, экстерьер яхты, наволочку, простыню, пододеяльник, ювелирное изделие, аксессуар, очки, солнцезащитные очки или потребительскую электронику. Например, изделие из кожи может представлять собой браслет часов. Например, изделие из кожи может представлять собой ремень. Например, изделие из кожи может представлять собой сумку.
Кожный трансплантат
[00118] Синтетическую кожу или ее части также можно использовать в качестве кожного трансплантата, например, аллотрансплантата или ксенотрансплантата для трансплантации субъекту. Например, синтетическая кожа, дермальный слой, эпидермальный слой и/или слоистая структура могут быть источником кожного трансплантата для аллотрансплантата или ксенотрансплантата. В некоторых случаях, синтетическую кожу, дермальный слой, эпидермальный слой и/или слоистую структуру можно получать с использованием клеток, генетически модифицированных для того, чтобы снижать иммунное отторжение у реципиента трансплантата.
СПОСОБЫ
[00119] Также в настоящем описании раскрыты способы получения синтетической кожи. Способы могут включать формирование искусственного дермального слоя, формирование искусственного эпидермального слоя или их комбинацию. Способы дополнительно могут включать дубление по меньшей мере части искусственного дермального слоя и/или искусственного эпидермального слоя. Клетки в синтетической коже, например, те, что в дермальном слое и/или эпидермальном слое, можно дифференцировать из стволовых клеток (например, iPSC). Способы в настоящем описании дополнительно могут включать дифференцирование стволовых клеток (например, iPSC) в клетки в синтетической коже, например, клетки в дермальном слое и/или эпидермальном слое. В определенных случаях, способы включают размещение первого слоя клеток (например, эпидермального слоя) на втором слое клеток (например, дермальном слое), тем самым формируя слоистую структуру, и дубление по меньшей мере части слоистой структуры. В некоторых случаях, способы дополнительно могут включать удаление по меньшей мере части первого слоя клеток (например, эпидермального слоя).
Формирование слоев клеток
[00120] Слой клеток можно формировать посредством получения множества многоклеточных тел, содержащих клетки одного или нескольких типов, и расположения таких многоклеточных тел для того, чтобы формировать слой клеток. Например, слой клеток можно формировать посредством смежного расположения множества многоклеточных тел, где многоклеточные тела сливают для того, чтобы формировать плоский слой.
[00121] Для формирования слоя клеток может требоваться каркас. Слой клеток можно формировать посредством расположения множества многоклеточных тел на каркасе. Например, стадия формирования может включать расположение или размещение многоклеточных тел на несущей подложке, которая позволяет многоклеточным телам сливаться для того, чтобы формировать слой (например, по существу плоский слой). В некоторых случаях многоклеточные тела или слои располагают горизонтально и/или вертикально смежно друг с другом. Альтернативно, для формирования слоя клеток может не требоваться каркас.
[00122] Слои клеток можно формировать посредством встраивания клеток в среду или гель. В некоторых случаях, дермальные слои можно формировать с использованием фибробластов, встроенных в гель из коллагена I или фибрина. Среды других типов также можно использовать. Например, среда может содействовать секреции фибробластами достаточного количества внеклеточного матрикса, чтобы сделать возможным протяженное сохранение эпидермиса без необходимости коллагеновых гелей.
Формирование многоклеточных тел
[00123] Существуют различные пути создания многоклеточных тел, обладающих характеристиками, описанными в настоящем описании. В некоторых случаях многоклеточное тело можно изготавливать из клеточной массы, содержащей множество клеток, например, с желаемой плотностью и вязкостью клеток. В дополнительных случаях клеточной массе можно придавать желаемую геометрическую форму и формировать многоклеточное тело через созревание (например, инкубацию). В некоторых случаях, удлиненное многоклеточное тело можно получать посредством придания клеточной массе, содержащей множество клеток, удлиненной геометрической формы (например, цилиндра). В дополнительных случаях, клеточную массу можно инкубировать в контролируемом окружении для того, чтобы сделать возможным адгезию и/или слипание клеток друг с другом для того, чтобы формировать удлиненное многоклеточное тело. Например, многоклеточное тело можно получать посредством придания геометрической формы клеточной массе, содержащей множество живых клеток, в устройстве, которое удерживает клеточную массу в трехмерной форме. В некоторых случаях, клеточную массу можно инкубировать в контролируемом окружении, при этом ее можно удерживать в трехмерной геометрической форме в течение времени, достаточного для получения тела, которое имеет достаточную когезию для поддержания себя на плоской поверхности, как раскрыто в настоящем описании.
[00124] Клеточную массу можно предоставлять посредством: (A) смешивания клеток или клеточных агрегатов (клеток одного или нескольких типов) и клеточной культуральной среды (например, в предварительно определяемом соотношении), чтобы получать клеточную суспензию, и (B) уплотнения клеточной суспензии для получения клеточной массы с желаемой плотностью и вязкостью клеток. Уплотнения можно достигать многими способами, например, посредством концентрирования конкретной клеточной суспензии, которая является результатом клеточной культуры для достижения желаемой концентрации (плотности) клеток, вязкости и консистенции, необходимых для клеточной массы. В некоторых случаях, относительно разведенную клеточную суспензию из клеточной культуры можно центрифугировать в течение определенного времени для достижения концентрации клеток в осадке, которая допускает придание геометрической формы в формочке. Тангенциальное поточное фильтрование («TFF») представляет собой другой подходящий способ концентрирования или уплотнения клеток. В некоторых случаях, соединения комбинируют с клеточной суспензией, чтобы придавать необходимые экструзионные свойства. Подходящие соединения включают, коллаген, гидрогели, Matrigel, нановолокна, самособирающиеся нановолокна, желатин и фибриноген. Один или несколько компонентов ECM (или производных компонентов ECM) также можно включать посредством ресуспендирования клеточного осадка в одном или нескольких физиологически приемлемых буферах, содержащих компоненты ECM (или производные компонентов ECM) и повторного центрифугирования получаемой клеточной суспензии для того, чтобы формировать клеточную массу.
[00125] Различные способы можно использовать для придания геометрической формы клеточной массе. Например, в конкретном варианте осуществления клеточную массу можно формовать или сжимать вручную (например, после концентрирования/уплотнения), чтобы достигать желаемой геометрической формы. В качестве дополнительного примера, клеточную массу можно подхватывать (например, аспирировать) предварительно сформированным инструментом, таким как микропипетка (например, капиллярная пипетка), который придает геометрическую форму клеточной массе, чтобы она соответствовала внутренней поверхности инструмента. Геометрическая форма сечения микропипетки (например, капиллярной пипетки) альтернативно может представлять собой круглую, квадратную, прямоугольную, треугольную или другую не круглую форму поперечного сечения. В некоторых вариантах осуществления клеточной массе можно придавать геометрическую форму посредством ее размежения в предварительно сформированной формочке, такой как пластмассовая формочка, металлическая формочка или гелевая формочка. В некоторых вариантах осуществления центробежное литье или непрерывное литье можно использовать для придания геометрической формы клеточной массе.
[00126] Кроме того, можно проводить созревание клеточной массы. В некоторых случаях, клеточную массу можно инкубировать приблизительно при 37°C в течение определенного периода времени (который может зависеть от типа клеток), чтобы содействовать адгезии и/или когезии. Альтернативно или кроме того, клеточную массу можно содержать в присутствии клеточной культуральной среды, содержащей факторы и/или ионы, чтобы содействовать адгезии и/или когезии.
Расположение многоклеточных тел на несущей подложке для формирования слоев
[00127] Многоклеточные тела можно располагать на несущей подложке для получения желаемой трехмерной структуры (например, по существу плоского слоя). Например, многоклеточные тела можно вручную размещать в контакте друг с другом, осаждать на место посредством экструзии из пипетки, сопла или иглы или располагать в в контакте с помощью автоматизированного устройства, такого как биофабрикатор.
[00128] Несущая подложка может быть проницаемой для текучих веществ, газов и питательных веществ и позволяет клеточными культуральным средам контактировать со всеми поверхностями многоклеточных тел и/или слоев во время расположения и последующего слияния. В некоторых случаях, несущую подложку можно выполнять из природных биоматериалов, таких как коллаген, фибронектин, ламинин и другой внеклеточный матрикс. В некоторых случаях, несущую подложку можно выполнять из синтетических биоматериалов, таких как гидроксиапатит, альгинат, агароза, полигликолевая кислота, полимолочная кислота и их сополимеры. В некоторых случаях, несущая подложка может быть твердой, полутвердой или представлять собой комбинацию твердых и полутвердых элементов носителя. В некоторых случаях, несущая подложка может быть плоской для того, чтобы содействовать получению плоских слоев. В некоторых случаях, несущая подложка может быть поднята или возвышаться над непроницаемой поверхностью, такой как часть окружения клеточной культуры (например, чашка Петри, колба клеточной культуры и т. д.) или биореактор. Проницаемая поднятая несущая подложка может вносить вклад в предотвращение преждевременной гибели клеток, способствует усилению клеточного роста и облегчает слияние многоклеточных тел для того, чтобы формировать слои.
[00129] Когда сборку слоя завершают, тканевую культуральную среду можно выливать поверх конструкции. В некоторых случаях, тканевая культуральная среда проникает в пространства между многоклеточными телами, чтобы поддерживать клетки в многоклеточных телах. Многоклеточным телам в трехмерной конструкции можно позволять сливаться друг с другом, чтобы получать слой (например, по существу плоский) для использования в формировании синтетической кожи. Термины «сливать», «слитый» или «слияние» может обозначать, что между клетками прилегающих многоклеточных тел может возникать адгезия и/или когезия, или непосредственно через взаимодействия между белками клеточных поверхностей или опосредованно через взаимодействия клеток с компонентами ECM или производными компонентов ECM. Слитый слой может быть полностью слитым, а эти многоклеточные тела стали по существу непрерывными. Альтернативно, слитый слой может быть по существу слитым или частично слитым, и в клетках многоклеточных тел возникла адгезия и/или когезия в такой мере, которая необходима для того, чтобы сделать возможным перемещение интактного слоя и манипулирование им.
[00130] Многоклеточные тела могут сливаться для того, чтобы формировать слой в окружении клеточной культуры (например, чашки Петри, колбы клеточной культуры или биореактора). В некоторых случаях многоклеточные тела сливают для того, чтобы формировать слой в окружении при условиях, подходящих для того, чтобы содействовать росту типов клеток, включенных в многоклеточные тела. В некоторых случаях, слияние имеет место в течение приблизительно 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 и 60 минут, и прирастает в них. В других случаях, слияние имеет место в течение приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 и 48 часов, и прирастает в них. В других случаях, слияние имеет место в течение приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12 и 14 суток, и прирастает в них. В дополнительных случаях, слияние имеет место в течение от приблизительно 2 часов до приблизительно 24 часов. Факторы, релевантные для времени слияния, могут включать тип клеток, соотношение типов клеток, условия культивирования и присутствие дополняющих средств, таких как факторы роста.
[00131] Когда слияние слоя завершают, слой и несущую подложку можно отделять. В других случаях, слой и несущую подложку разделяют, когда слияние слоя завершают по существу или завершают частично, но клетки слоя имеют адгезию и/или когезию друг с другом в такой степени, которая необходима для того, чтобы сделать возможным перемещение, манипулирование и укладку слоя в стопку без разрушения его на части. Слой и несущую подложку можно отделять через стандартные процедуры для плавления, растворения или разрушения несущей подложки. В некоторых случаях, несущую подложку можно растворять, например, с помощью измерения температуры, света или других стимулов, которые не оказывают нежелательного влияния на слой. В определенных случаях, несущую подложку можно выполнять из гибкого материала и отслаивать от слоя. Отделенный слой можно переносить в биореактор для дальнейшего созревания. В некоторых случаях, отделенный слой зреет и дополнительно сливается после встраивания в сконструированную кожу, шкуру или продукт кожи животного.
[00132] Альтернативно, слой и несущую подложку можно не отделять. Несущую подложку подвергают разложению или биоразложению до упаковки, заморозки, продажи или потребления собранной сконструированной кожи, шкуры или продукта кожи животного.
[00133] Слой клеток можно формировать в течение определенного периода времени. В некоторых случаях, слой клеток, например, эпидермальный слой или дермальный слой, можно формировать в пределах 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 120, 300 суток. В некоторых случаях, дермальный слой можно формировать от приблизительно 1 до 15 суток, например, от 5 до 10 суток или от 10 до 12 суток. В некоторых случаях, дермальный слой можно формировать от приблизительно 5 до 25 суток, например, от 14 до 15 суток.
[00134] Настоящее раскрытие предусматривает способы создания усовершенствованной барьерной функции синтетической кожи. В некоторых случаях, способы включают предоставление кератиноцитов и сред для культивирования, содержащих аскорбиновую кислоту и линолевую кислоту; и культивирование кератиноцитов в таких условиях, что можно формировать синтетическую кожу, имеющую усовершенствованную барьерную функцию. В некоторых случаях, условия культивирования включают культивирование приблизительно при 50-95% влажности, например, приблизительно 75% влажности. В некоторых случаях, аскорбиновую кислоту можно предоставлять в концентрации от приблизительно 10 до 100 мкг/мл. В других случаях, линолевую кислоту можно предоставлять в концентрации от приблизительно 5 до 80 мкМ. Настоящее раскрытие не ограничено синтетической кожей, формируемой из конкретного источника кератиноцитов. В действительности, синтетическую кожу можно формировать из различных первичных и бессмертных кератиноцитов, включая в качестве неограничивающих примеров клетки Near-Diploid Immortalized Keratinocytes (NIKS). В других случаях, кератиноциты экспрессируют экзогенный Kruppel-подобный фактор (GKLF) дикого типа или его вариант. В других случаях, кератиноциты получают из двух различных источников. В других случаях синтетическая кожа имеет электрическую емкость поверхности от приблизительно 40 до приблизительно 240 пФ. В некоторых предпочтительных случаях, эквивалент кожи имеет электрическую емкость поверхности от приблизительно 80 до приблизительно 120 пФ. В других предпочтительных случаях, содержание церамидов 5, 6 и 7 в эквиваленте кожи может составлять от приблизительно 20 до приблизительно 50% от общего содержания церамидов. В других предпочтительных случаях содержание церамида 2 в эквиваленте кожи может составлять от приблизительно 10 до приблизительно 40% от общего содержания церамидов. В других случаях, настоящее раскрытие предусматривает эквивалент кожи, полученный способом, который описан только что.
Расположение слоев для формирования слоистой структуры
[00135] Несколько слоев клеток можно располагать для того, чтобы формировать слоистую структуру, таким образом получая синтетическую кожу, описанную в настоящем описании. В некоторых случаях, дермальные слои и эпидермальные слои формируют отдельно и собирают посредством размещения эпидермальных слоев поверх дермальных слоев (например, когда и эпидермальный слой и дермальный слой полностью сформированы). В некоторых случаях, эпидермальный слой можно выращивать поверх дермального слоя. В определенных случаях, базальную мембрану или заменитель базальной мембраны можно помещать между дермальным слоем и эпидермальным слоем. Например, слои клеток можно вручную размещать в контакте друг с другом или располагать на месте с помощью автоматизированного компьютеризованного устройства, такого как биофабрикатор, в соответствии с компьютерным скриптом.
[00136] Перед сборкой нескольких слоев клеток можно осуществлять одну или несколько стадий контроля качества. Например, можно осуществлять Trans Epithelial Electrical Resistance (TEER) на эпидермисе перед размещением на дерме (например, 0 сутки), после чего следует гистологический анализ (например, минимум 3-5 суток). При использовании способов, предусмотренных в настоящем описании, риск ненадлежащим образом сформированной слоистой структуры или эквивалентов кожи полной толщины может быть низким.
[00137] Несколько слоев клеток можно собирать различными способами. В некоторых случаях, эпидермальный слой и дермальный слой (с заменителем базальной мембраны или без него) помещают на каркасе (например, шелке), например, чтобы достигать толщины и прочности при растяжении как у природной кожи. В некоторых случаях, эпидермальный слой и несколько дермальных слоев (с заменителем базальной мембраны или без него) собирают без использования каркаса. Такая сборка позволяет достигать толщины и прочности при растяжении, которые походят на природную кожу. В некоторых случаях, эпидермальный слой и несколько дермальных слоев (с заменителем базальной мембраны или без него) помещают на каркасе (например, шелке) достигать толщины и прочности при растяжении, которые походят на природную кожу.
[00138] В некоторых вариантах осуществления химические, механические тесты, тесты на эффективность, прочность, долговечность, влажность, размеры или их комбинацию можно осуществлять на одном или нескольких слоях клеток, синтетической коже, искусственных эпидермальных слоях, искусственных дермальных слоях, слоистых структурах, продуктах, получаемых из них. В некоторых вариантах осуществления химические, механические тесты, тесты на эффективность, прочность, долговечность, влажность, размеры или их комбинацию можно осуществлять с использованием нестандартного теста. В некоторых вариантах осуществления химические, механические тесты, тесты на эффективность, прочность, долговечность, влажность, размеры или их комбинацию можно осуществлять с использованием стандартного теста. В некоторых вариантах осуществления тест можно осуществлять по инструкциям и/или как принято и/или ратифицировано и/или разработано в International Standards Organization (ISO), European standards body (CEN), ASTM International or by the International Union of Leather Technicians and Chemists (IULTCS). В некоторых вариантах осуществления тест в любой одной из таблиц с 1 до 11 или любую его вариацию можно осуществлять с использованием любого одного или нескольких соответствующих способов или любых их вариаций.
Таблица 1
Таблица 2
Таблица 3
Таблица 4
Таблица 5
Таблица 6
Таблица 7
Таблица 8
Таблица 9
Таблица 10
Таблица 11
[00139] В некоторых вариантах осуществления продукты кожи могут иметь физические свойства, схожие с настоящей кожей. В некоторых вариантах осуществления синтетическая кожа, раскрытая в настоящем описании, или продукт кожи, выполненный из нее, может прочность при растяжении, как измеряют посредством ASTM D-2209-95, по меньшей мере приблизительно 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000 фунтов/дюйм2. В некоторых вариантах осуществления синтетическая кожа, раскрытая в настоящем описании, или продукт кожи, выполненный из нее, может прочность при растяжении, как измеряют посредством ASTM D-2209-95, меньше чем приблизительно 5000, 4000, 3000, 2000, 1900, 1800, 1700, 1600, 1500, 1400, 1300, 1200, 1100, 1000, 950, 900, 850, 800, 750, 700, 650, 600, 550, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 фунтов/дюйм2.
[00140] В некоторых вариантах осуществления синтетическая кожа, раскрытая в настоящем описании, или продукт кожи, выполненный из нее, может иметь прорезь по меньшей мере приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 фунтов, как измеряют посредством ASTM-D2212-94. В некоторых вариантах осуществления синтетическая кожа, раскрытая в настоящем описании, или продукт кожи, выполненный из нее, может иметь прорезь меньше чем приблизительно 200, 150, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 фунтов, как измеряют посредством ASTM-D2212-94. В некоторых вариантах осуществления синтетическая кожа, раскрытая в настоящем описании, или продукт кожи, выполненный из нее, может иметь стежок по меньшей мере приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 при измерении в соответствии с ASTM-D4705-93. В некоторых вариантах осуществления синтетическая кожа, раскрытая в настоящем описании, или продукт кожи, выполненный из нее, может иметь стежок меньше чем приблизительно 200, 150, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1. В некоторых вариантах осуществления синтетическая кожа, раскрытая в настоящем описании, или продукт кожи, выполненный из нее, может иметь значения прорези и стежка по меньшей мере приблизительно 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 фунтов при измерении в соответствии с соответствующими им тестами. В некоторых вариантах осуществления синтетическая кожа, раскрытая в настоящем описании, или продукт кожи, выполненный из нее, может иметь перегиб Bally по меньшей мере приблизительно 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 15000, 20000, 25000, 30000, 35000, 40000, 45000, 5000055000, 60000, 65000, 70000, 80000, как измеряют посредством ASTM D6182.
[00141] Несколько слоев клеток можно собирать для того, чтобы формировать синтетическую кожу (например, эквивалент кожи полной толщины). Синтетическая кожа может содержать верхнюю часть, среднюю часть и нижнюю часть. Верхняя часть может содержать эпидермальный слой. Например, верхняя часть может представлять однослойный эпидермальный слой. Средняя часть может содержать заменитель базальной мембраны. В некоторых случаях, средняя часть не содержит заменитель базальной мембраны. Например, средняя часть может содержать слой незначительной толщины. Нижняя часть может иметь один или несколько дермальных слоев. В некоторых случаях, нижняя часть имеет один дермальный слой, расположенный на каркасе (например, шелке). В некоторых случаях, нижняя часть имеет несколько дермальных слоев (например, вплоть до 5 слоев) без любого каркаса. В некоторых случаях нижняя часть имеет несколько дермальных слоев, расположенных стопкой друг поверх друга и размещенных на каркасе (например, шелке).
[00142] Адгезионная способность между эпидермальным и дермальным слоями может быть достаточно высокой, чтобы противостоять расщеплению слоев. В некоторых случаях, клеточные слои можно собирать посредством адгезии к каркасу. Природные или синтетические адгезивы можно использовать для сборки. Природный адгезив может представлять собой фибриновый клей, холодный клей, животный клей (например, костный клей, рыбный клей, мездровый клей, клей из копыт, клей из кожи кролика, мясной клей), клей из альбумина крови, казеиновый клей, растительный клей (например, крахмальный, декстриновый клей, канадский бальзам, канифолевый клей, Cocconia, аравийскую камедь, клей для почтовых марок, латекс, клейстер, метилцеллюлозу, слизь, резорциновую смолу или мочевиноформальдегидную смолу) или любую их комбинацию. Синтетический адгезив может представлять собой акрилонитрил, цианоакрилат (например, н-бутил-2-цианоакрилатный клей), акриловый, резорциновый клей, эпоксидные смолы, эпоксидную мастику, этиленвинилацетат, фенолформальдегидную смолу, полиамидные, полиэфирные смолы, полиэтилен, полипропилен, полисульфиды, полиуретан, поливинилацетат (включая белый клей (например, клей Элмера) и желтый столярный клей (алифатическая смола), поливиниловый спирт, поливинилхлорид (PVC), поливинилхлоридную эмульсию (PVCE), поливинилпирролидоновый резиновый цемент, силиконы и стирол-акриловый сополимер. Например, сборку можно осуществлять с использованием фибринового клея. Например, сборку можно осуществлять с использованием н-бутил-2-цианоакрилатного клея.
[00143] В некоторых случаях, слои клеток (например, по существу плоские слои) располагают стопкой для того, чтобы формировать синтетическую кожу. Слой клеток может иметь ориентацию, определяемую с помощью размещения, паттерна или ориентации многоклеточных тел. В некоторых случаях, каждый слой можно укладывать в стопку с конкретной ориентацией относительно несущей подложки и/или одного или нескольких других слоев. Например, один или несколько слоев можно укладывать в стопку с ориентацией, которая включает вращение относительно несущей подложки и/или слоя снизу, где вращение моет составлять между 0,1 и 180°, например, приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 и 180° или их приращения. В других случаях, все слои ориентируют по существу аналогичным образом.
[00144] Когда расположение слоев стопкой завершают, слоям в трехмерной конструкции можно позволять сливаться друг с другом для получения синтетической кожи. В некоторых случаях, слои сливаются в окружении клеточной культуры (например, чашке Петри, колбе клеточной культуры, биореакторе и т. д.). В некоторых случаях, слияние имеет место в течение приблизительно 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 и 60 минут и их приращений. В других случаях, слияние имеет место в течение между 1 и 48 часами, например, в течение приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 и 48 часов и их приращений. Например, слияние может иметь место в течение от приблизительно 2 часов до приблизительно 24 часов.
Условия культивирования
[00145] Клетки и слои клеток можно культивировать при различных условиях клеточных культур. Клетки или слои клеток можно культивировать in vitro. Например, дермальный слой и/или эпидермальный слой можно культивировать in vitro. Альтернативно, клетки или слои клеток можно культивировать in vivo. Например, дермальный слой и/или эпидермальный слой можно культивировать in vivo.
[00146] Клетки и слои клеток можно культивировать с одной или несколькими добавками. Одна или несколько добавок могут представлять собой природные добавки, синтетические добавки или их комбинацию. В некоторых случаях, добавка может представлять собой дополняющее средство. В некоторых случаях, одна или несколько добавок индуцируют получение и сборку внеклеточного матрикса из фибробластов iPSC происхождения, таким образом улучшая природный внешний вид синтетической кожи. Образцовые добавки могут включать компоненты ECM, такие как коллаген и фибрин, факторы роста, низкомолекулярные соединения, такие как аскорбиновая кислота или тому подобное, макромолекулы, такие как декстрансульфат, каррагенан или тому подобное.
[00147] Слои клеток можно культивировать при определенной влажности воздуха. Например, слои клеток (например, дермальные слои или эпидермальные слои) можно культивировать при влажности от приблизительно 20% до приблизительно 100%. Например, влажность может составлять от приблизительно 40% до приблизительно 100%, от приблизительно 50% до приблизительно 95%, от приблизительно 45% до приблизительно 90%, от приблизительно 55% до приблизительно 95%, от приблизительно 60% до приблизительно 90%, от приблизительно 70% до приблизительно 80%, от приблизительно 71% до приблизительно 79%, от приблизительно 72% до приблизительно 78%, от приблизительно 73% до приблизительно 77%, от приблизительно 74% до приблизительно 76%, от приблизительно 60% до приблизительно 70%, от приблизительно 65% до приблизительно 75%, от приблизительно 70% до приблизительно 80%, от приблизительно 75% до приблизительно 85%, от приблизительно 80% до приблизительно 90%, от приблизительно 85% до приблизительно 95% или от приблизительно 90% до приблизительно 100%, от приблизительно 40% до приблизительно 60%, от приблизительно 45% до приблизительно 55%, от приблизительно 46% до приблизительно 54%, от приблизительно 47% до приблизительно 53%, от приблизительно 48% до приблизительно 52%, от приблизительно 48% до приблизительно 53%, от приблизительно 49% до приблизительно 54% или от приблизительно 47% до приблизительно 51%.
Обработка кожи
Дубление
[00148] Способы в настоящем описании могут включать дубление по меньшей мере части синтетической кожи, например, по меньшей мере части дермального слоя и/или эпидермального слоя в синтетической коже. Дубление может делать синтетическую кожу похожей на природную кожу, которая может представлять собой прочный и гибкий материал, создаваемый посредством дубления сырых шкур и кожи животных, часто шкур крупного рогатого скота. Дубление в настоящем описании может относиться к процессу обработки кож животных для получения выделанной кожи. Дубление можно осуществлять различными путями, в том числе растительным дублением (например, с использованием танина), хромовым дублением (солями хрома, в том числе сульфатом хрома), альдегидным дублением (с использованием соединений глутаральдегида или оксазолидина), синтанами (синтетическими танинами с использованием ароматических полимеров), бактериальным окрашиванием и т. п.
[00149] Дубление можно осуществлять для того, чтобы превращать белки в шкуре/коже в стабильный материал, который не будет гнить, при этом позволяя материалу оставаться гибким. Хром можно использовать в качестве дубильного материала. pH слоя клеток или слоистую структуру можно корректировать (например, снижать; например, до pH приблизительно 2,8-3,2) для усиления дубления; после дубления pH можно повышать («защелачивание» до слегка более высокого уровня, например, pH приблизительно 3,8-4,2).
[00150] Дубление можно осуществлять в слоях клеток, например, дермальных слоях и эпидермальных слоях. Дубление также можно осуществлять в слоистых структурах, например, слоистых структурах содержащих по меньшей мере дермальный слой и по меньшей мере эпидермальный слой. В определенных случаях, дубление также можно осуществлять на синтезированной коже. Например, дубление можно осуществлять после формирования слоев клеток, например, дермальных слоев или эпидермальных слоев. Например, дубление можно осуществлять после формирования слоистых структур.
[00151] Дубление можно осуществлять посредством модификации материала внеклеточного матрикса (ECM). Дубление можно осуществлять посредством модификации коллагена в ECM. Дубление можно осуществлять с использованием дубильного средства, например, сульфата хрома (III) ([Cr(H2O)6]2(SO4)3). Сульфат хрома (III) можно растворять для получения катиона гексааквахрома (III), [Cr(H2O)6]3+, который при более высоком pH подвергается процессам, называемым оляцией, с образованием соединений полихрома (III), которые проявляют активность при дублении, представляя собой сшивки коллагеновых субъединиц. Некоторые лиганды включают сульфат-анион, карбоксильные группы коллагена, аминогруппы из боковых цепей аминокислот, а также маскирующие средства. Маскирующими средствами могут быть карбоновые кислоты, такие как уксусная кислота, используемые для подавления формирования цепей полихрома (III). Маскирующие средства могут позволять дубильщику дополнительно увеличивать pH для увеличения реакционной способности коллагена без ингибирования проникновения комплексов хрома (III). Дубление может увеличивать пространство между белковыми цепями в коллагене (например, от 10 до 17 ангстремов), в соответствии со сшивкой частицами полихрома того сорта, который возникает при оляции и оксоляции. Хром может сшивать коллаген. Кожа хромового дубления может содержать между приблизительно 4% и 5% хрома. Эффективность этого можно охарактеризовать по увеличенной водно-тепловой стабильности кожи и ее стойкости к усадке в нагретой воде. Другие дубильные средства можно использовать для дубления слоистого тела и модификации коллагена.
[00152] Дубление также можно осуществлять с использованием других минералов. В некоторых случаях, дубление можно осуществлять с использованием средства на основе квасцов, солей циркония, титана, железа или их комбинации.
Дополнительная обработка
[00153] Слои клеток, слоистые структуры и синтетическую кожу, получаемые в настоящем описании, можно дополнительно обрабатывать после дубления. В некоторых случаях, способы, предусмотренные в настоящем описании, дополнительно включают одну или несколько стадий обработки кожи (например, те, которые используют при традиционном формировании кожи). Примеры стадий обработки включают: консервирование, вымачивание, золение, сгонку волоса, мездрение, раздвоение, обеззоливание, повторное золение, мягчение, удаление жира, завивку, отбеливание, окрашивание, пикелевание, распикелевание, дубление, повторное дубление (например, если окраска утеряна во время обработки), уменьшение толщины, додубление, смазывание, получение кожи краст, увлажнение, отжимание, стрижку, рехромирование, нейтрализацию, окрашивание, жирование, заполнение, нарезание на полосы, увлажнение жирами, отбеливание, фиксирование, разводку, сушку, кондиционирование, мятье (например, сухое мятье), тяжку, шлифование, отделку, обработку маслами, обработку щеткой, грунтование, импрегнирование, опрыскивание, валковое покрывание, нанесение покрытия поливом, полирование, расплющивание, тиснение, утюжение, глазирование и мятье в барабане.
[00154] Синтетической коже можно придавать определенную геометрическую форму посредством, например, контроля числа, размера и расположения многоклеточных тел и/или слоев, используемых для конструирования кожи шкуры или выделанной кожи животного. В других случаях, коже, шкуре или выделанной коже животного можно придавать геометрическую форму посредством, например, резания, прессования, формовки или тиснения. Синтетической коже можно придавать геометрическую форму, которая походит на традиционную кожу, шкуру или продукт кожи животного.
[00155] Способы в настоящем описании могут включать удаление части синтетической кожи, получаемой в настоящем описании. В некоторых случаях, способ включает удаление по меньшей мере части эпидермального слоя для того, чтобы формировать удаленный продукт. Например, удаление может представлять собой стрижку.
Пигментация
[00156] Способы в настоящем описании могут включать пигментирование синтетической кожи. В некоторых случаях, пигментацию можно осуществлять посредством введения продуцирующих пигменты клеток (например, меланоцитов) в синтетическую кожу. В некоторых случаях, синтетическая кожа содержит функциональные живые меланоциты. Меланоциты могут иметь местоположение, схожее с таковым в коже человека. В некоторых случаях, меланоциты могут конститутивно продуцировать меланин. В некоторых случаях, меланин можно переносить в кератиноциты. В некоторых случаях, меланоциты получают при стимуляции, например, UV излучением или с помощью активных средств, вызывающих пигментацию, таких как α-меланоцитостимулирующий гормон (aMSH), эндотелин 1 (ET1), фактор стволовых клеток (SCF), простагландины E2 и F2α (PGE2, PGF2α), основной фактор роста фибробластов (bFGF) или фактор роста нервов (NGF).
Дифференцировка клеток-предшественников в клетки в синтетической коже
[00157] Клетки в эпидермальных слоях, такие как кератиноциты и меланоциты, а также клетки в дермальных слоях, такие как фибробласты, можно получать, например, дифференцировать, из клеток-предшественников, таких как iPSC. В другом случае, первичные клетки или культивируемые клетки, получаемые из первичных клеток, можно использовать для того, чтобы формировать слои клеток для создания синтетической кожи.
[00158] Можно использовать различные способы дифференцировки iPSC в клетки в синтетической коже, например, кератиноциты, меланоциты или фибробласты. В некоторых случаях, дифференцировку iPSC в кератиноциты и построение трехмерного эпидермиса из кератиноцитов, полученных из iPSC, можно осуществлять с использованием способа, описанного в Petrova et al., 3D In vitro model of a functional epidermal permeability barrier from human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2014 Apr 24;2(5):675-89. В других случаях слои клеток можно формировать с использованием первичных клеток. Например, построение трехмерного эпидермиса из первичных кератиноцитов можно осуществлять с использованием способа, описанного в Sun R et al., Lowered humidity produces human epidermal equivalents with enhanced barrier properties. Tissue Eng Part C Methods. 2015 Jan;21(1):15-22.
[00159] В некоторых случаях, способы, описанные в настоящем описании, предусматривают высокопропускные способы, которые допускают надежное, точное и воспроизводимое масштабирование вплоть до коммерческих уровней получения синтетической кожи. Преимущества синтетической кожи, сконструированного эпидермального эквивалента, сконструированного эквивалента кожи полной толщины и способов их получения, раскрытых в настоящем описании, включают, но не ограничиваясь этим, получение специализированных тканей воспроизводимым, высокопропускным и легко масштабируемым образом с привлекательным внешним видом, текстурой, толщиной и долговечностью. В некоторых вариантах осуществления способы, описанные в настоящем описании, позволяют получать увеличенный выход одного или нескольких из эпидермального слоя, дермального слоя, слоистой структуры или синтетической кожи. В некоторых вариантах осуществления увеличенный выход может составлять по меньшей мере приблизительно 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или приблизительно 15-кратный выход по сравнению со сравнимым способом. В некоторых вариантах осуществления способы, раскрытые в настоящем описании, снижают стоимость изготовления синтетической кожи, искусственных эпидермальных слоев, искусственных дермальных слоев, слоистых структур и продуктов, получаемых из них. В некоторых вариантах осуществления способы, раскрытые в настоящем описании, позволяют получать синтетическую кожу, искусственные эпидермальные слои, искусственные дермальные слои, слоистые структуры и продукты, получаемые из них, однородной толщины. В некоторых вариантах осуществления синтетическая кожа, искусственные эпидермальные слои, искусственные дермальные слои, слоистые структуры и продукты, получаемые из них, могут иметь по существу однородную толщину, длину и/или ширину. В некоторых вариантах осуществления клетки в любом одном или нескольких из эпидермальных слоев, дермальных слоев, слоистых структур можно распределять гомогенно. В некоторых вариантах осуществления клетки в любом одном или нескольких из эпидермальных слоев, дермальных слоев, слоистых структур можно распределять гетерогенно.
Сравнительный анализ эпидермального эквивалента
[00160] Фиг. 4A-4C. иллюстрируют сравнительный анализ тонкой выделанной кожи, нативной кожи и эпидермального эквивалента. Фиг. 4A иллюстрирует FESEM продольных срезов нативной кожи и тонкой выделанной кожи. На фиг. 4A представлены отчетливые морфологические структуры эпидермиса (e) и дермы (d). Дубление перманентно изменяет структуру кожи. Границы между отдельными клетками в эпидермисе становятся неразличимыми. Удаление влаги заставляет пучки коллагена в дерме становиться более компактными и прочными. Увеличение: 1000×.
[00161] Фиг. 4B приведены FESEM изображения. В одном случае на фиг. 4B изображено, что и поверхность тонкой выделанной кожи и поверхность эпидермальных эквивалентов имеют схожи гладкий внешний вид, указывающий на то, что они вероятно вызывают сравнимый тактильный опыт (на ощупь). Увеличение: 2000×.
[00162] На фиг. 4C изображена FESEM продольных срезов тонкой выделанной кожи и эпидермального эквивалента. Перед дублением, подобно эпидермису нативной кожи фиг. 4A, отдельные слои клеток различимы в эпидермальном эквиваленте. Поскольку коллаген в дерме может отвечать главным образом за прочность кожи при растяжении, коллагеновые пучки могут давать коже толщину и долговечность (вставка), но могут не давать сенсорный опыт, который может полностью зависеть от внешних слоев эпидермиса.
[00163] Фиг. 5A-5C иллюстрируют сравнительный анализ рогового слоя (SC; ороговевающий слой) нативной кожи и эпидермального эквивалента. На фиг. 5A приведены FESEM изображения, показывающие поверхность эпидермальных эквивалентов, которая выглядит более гладкой, чем поверхность нативной кожи, что может быть обусловлено контролируемым окружением клеточной культуры. Фиг. 5B иллюстрирует, используя TEM, корнеодесмосомы (стрелки), принципиальные «механические» соединения в SC, которые можно обнаруживать в виде областей повышенной электронной плотности в эпидермальных эквивалентах. Фиг. 5C иллюстрирует, что клетки в SG могут синтезировать и экскретировать корнеодесмозин (CDSN) во внеклеточные пространства, незадолго до начала ороговения. CDSN может встраиваться в межклеточные части SG десмосом, которые заняты кадгеринами, и таким образом может формировать корнеодесмосомы. Стрелки указывают на аналогичным образом выровненные точечные скопления CDSN в SC нативной кожи и эпидермального эквивалента, которые вероятно представляют корнеодесмосомы. SC - роговой слой; SG - зернистый слой; SS - шиповатый слой.
[00164] Фиг. 6A-6E иллюстрируют сравнительный анализ зернистого слоя (SG - гранулярный слой) нативной кожи и эпидермального эквивалента. Фиг. 6A иллюстрирует окрашивание Loricrin (LOR). LOR представляет собой основной белковый компонент ороговевающей оболочки клетки, и его может экспрессировать гранулярный слой ороговевающего эпителия. Схожий профиль экспрессии LOR (темно-коричневый пигмент на окрашенных гематоксилином-эозином тканевые срезы, показан стрелками) в SG обнаруживали как в эпидермисе нативной кожи (левая сторона изображения), так и в эпидермальном эквиваленте (правая сторона изображения). d - дерма; ГЭ - гематоксилин и эозин; SB - базальный слой; SC - роговой слой; SG - зернистый слой; SS - шиповатый слой; * - фильтровальная мембрана Transwell. На фиг. 6B эпидермальный градиент Ca++ может быть представлен при трансмиссионной электронной микроскопии как электронноплотные преципитаты. Отложения Ca++ присутствовали в SG и отсутствовали в SC как в нативной коже in vivo (левая сторона изображения), так и в эпидермальных эквивалентах, созданных in vitro (правая сторона изображения). SG - зернистый слой; SS - шиповатый слой. На фиг. 6C, целостность барьера проницаемости оценивали по перфузии лантана. Лантан визуализировали в виде электронноплотных отложений во внеклеточных пространствах жизнеспособных SG, демонстрирующих, что лантан и, по расширению, вода и другие небольшие ионы могут проходить между кератиноцитами в этом слое. В отличие от этого, лантан не может проникать дальше в SC по той причине, что функционирующий липидный барьер блокирует его движение вверх. Эпидермальный эквивалент, созданный in vitro, демонстрировал в равной мере функциональный барьер проницаемости, как нативная кожа. SG - зернистый слой; SS - шиповатый слой. Фиг. 6D иллюстрирует, что белок плотного контакта 1/zonula occludens-1 (TJP1/ZO-1) заякоривает белковые тяжи плотного контакта, которые представляют собой фибриллоподобные структуры в липидном бислое, в актиновом цитоскелете. Стрелки указывают на аналогичным образом выровненные ярко-зеленые ассоциированные с клеточными мембранами скопления of TJP1/ZO-1 в SG нативной кожи in vivo (левая сторона изображения) и эпидермальных эквивалентов, созданных in vitro (правая сторона изображения). SC - роговой слой; SG - зернистый слой; SS - шиповатый слой. Фиг. 6E иллюстрирует, что мономеры филагрина (FLG), образующие тандемные кластеры в виде большого 350 кДа белка-предшественника, известного как профилагрин, присутствуют в кератогиалиновых гранулах в клетках SG. Стрелки указывают на аналогичным образом выровненные ярко-красные гранулы и ассоциированные с клеточными мембранами скопления FLG в SG нативной кожи in vivo (левая сторона изображения) и эпидермальных эквивалентах, созданных in vitro (правая сторона изображения). SC - роговой слой; SG - зернистый слой; SS - шиповатый слой.
[00165] Фиг. 7A-7C иллюстрируют формирование липидного бислоя в нативной коже и эпидермальных эквивалентах, которые оценивали с использованием TEM. На фиг. 7A белые стрелки указывают на нормальную секрецию липидов на границе SC и SG как в нативной коже in vivo (левая сторона изображения), так и в эпидермальных эквивалентах, созданных in vitro (правая сторона изображения). На фиг. 7B ламеллярные тельца (белые стрелки) видны в SG как нативной кожи in vivo (левая сторона изображения), так и эпидермальных эквивалентов, созданных in vitro (правая сторона изображения). На фиг. 7C изображена морфология нормального липидного бислоя (LB) нативной кожи in vivo (левая сторона изображения). Липидные бислои в эпидермальных эквивалентах, созданных in vitro (правая сторона изображения), имели схожий внешний вид. SC - роговой слой.
[00166] Фиг. 8A-8D иллюстрируют сравнительный анализ маркеров надбазальных слоев нативной кожи и эпидермального эквивалента. Фиг. 8A, фиг. 8B и фиг. 8C кератин 10 (KRT10), кератин 1 (KRT1), десмоколлин 1 (DCL1), маркеры надбазальных слоев, шиповатого слоя (SS) и зернистого слоя (SG), имеют схожий профиль экспрессии в нативной коже in vivo (левая сторона изображения) и эпидермальных эквивалентах, созданных in vitro (правая сторона изображения), как продемонстрировано посредством иммуногистохимии (KRT10; темно-коричневый пигмент на окрашенных ГЭ тканевых срезах, на который указывают стрелки) и иммунофлуоресценции (окрашивание красным цитоплазмы /KRT1/ и красным клеточной мембраны /DCL1/, на которое указывают стрелки). d - дерма; ГЭ - гематоксилин и эозин; SB - базальный слой; SC - роговой слой; SG - зернистый слой; SS - шиповатый слой; * - фильтровальная мембрана Transwell. На фиг. 8D десмосомы (стрелки) четко обнаружены как в нативной коже in vivo, так и эпидермальных эквивалентах, созданных in vitro. SS - шиповатый слой.
[00167] Фиг. 9A-9D иллюстрируют сравнительный анализ базального слоя (SB - базальный слой) нативной кожи и эпидермального эквивалента. По отношению к фиг. 9A, фиг. 9B, фиг. 9C и фиг. 9D, MKI67, маркер пролиферации, кератин 14 (KRT14) и фактор транскрипции TP63 демонстрируют типичное распределение в базальном слое как в нативной коже in vivo (левая сторона изображения), так и в эпидермальных эквивалентах, созданных in vitro (правая сторона изображения), как продемонстрировано посредством иммуногистохимии (MKI67; темно-коричневый пигмент на окрашенных ГЭ тканевых срезах, на который указывают стрелки) и иммунофлуоресценции (окрашивание зеленым цитоплазмы /KRT14/ и белым ядер /TP63/, на которое указывают стрелки). Полудесмосомы (стрелки) четко обнаружены как в нативной коже in vivo, так и в эпидермальных эквивалентах, созданных in vitro. BM - базальная мембрана; Cy - цитоплазма; d - дерма; ГЭ - гематоксилин и эозин; SB - базальный слой; SS - шиповатый слой; TM - фильтровальная мембрана Transwell.
[00168] Фиг. 10A-10F иллюстрируют сравнительный анализ компонентов внеклеточного матрикса базальной мембраны. Базальную мембрану (BM) можно формировать из конденсированных сетей белков внеклеточного матрикса (ECM), которые могут обеспечивать необходимый структурный каркас на дермально-эпидермальном соединении. Интегрин β1 регулирует несколько функций эпителиальных клеток посредством соединения клеток с ECM, и он может быть ключевым для поддержания BM в дермально-эпидермальном соединении. На фиг. 10A интегрин β1 демонстрирует типичное распределение в базальном слое как в нативной коже in vivo (левая сторона изображения), так и в эпидермальных эквивалентах, созданных in vitro (правая сторона изображения), как указывают стрелки (окрашивание, ассоциированное с клеточной мембраной) и острия стрелок (на кончиках клеток, выступающих через отверстия в мембране Transwell). BM - базальная мембрана; d - дерма; SB - базальный слой; SS - шиповатый слой; SG - зернистый слой; TM - мембрана Transwell.
[00169] Фибронектин может играть роль в клеточной адгезии. Фиг. 10B иллюстрирует, что в нативной коже in vivo (левая сторона изображения) фибронектин может экспрессироваться главным образом в дерме, и относительно немного его можно обнаруживать в области BM. Аналогичным образом, в эпидермальных эквивалентах, созданных in vitro (правая сторона изображения), фибронектин можно обнаруживать на кончиках клеток, выступающих через отверстия в мембране Transwell (красные острия стрелок). d - дерма; SB - базальный слой; SS - шиповатый слой; SG - зернистый слой; TM - мембрана Transwell.
[00170] Механическую опору, которую обеспечивает BM, можно предоставлять с помощью коллагена IV или, в случае эпидермальных эквивалентов, каркаса. На фиг. 10C, как показывают острия стрелок, экспрессия коллагена IV имеет схожий лоскутный паттерн в нативной коже in vivo (левая сторона изображения) с эпидермальными эквивалентами, созданными in vitro (правая сторона изображения). BM - базальная мембрана; d - дерма; SB - базальный слой; SS - шиповатый слой; SG - зернистый слой; TM - мембрана Transwell.
[00171] Коллаген VI может играть роль в клеточной адгезии, и может ассоциироваться с фибронектином. В нативной коже in vivo (левая сторона изображения) коллаген VI может экспрессировать главным образом дерма, и относительно немного его можно обнаруживать в области BM, как на фиг. 10D. Аналогичным образом, в эпидермальных эквивалентах, созданных in vitro (правая сторона изображения), коллаген VI можно обнаруживать на кончиках клеток, выступающих через отверстия в мембране Transwell (острия стрелок), фиг. 10D. BM - базальная мембрана; d - дерма; SB - базальный слой; SS - шиповатый слой; SG - зернистый слой; TM - мембрана Transwell.
[00172] Коллаген VII может заякоривать базальную мембрану для фибрилл коллагена I и III в дерме. На фиг. 10E, как указывают острия стрелок, экспрессия коллагена VII имеет схожий лоскутный паттерн в нативной коже in vivo (левая сторона изображения) с эпидермальными эквивалентами, созданными in vitro (правая сторона изображения). BM - базальная мембрана; d - дерма; SB - базальный слой; SS - шиповатый слой; SG - зернистый слой; TM - мембрана Transwell.
[00173] Ламинин 5 (состав цепей α3β3γ2) может представлять собой основной компонент заякоривающих филаментов и может быть важен для начальной сборки BM in vivo. На фиг. 10F, как указывают острия стрелок, экспрессия ламинина 5 имеет схожий паттерн в нативной коже in vivo (левая сторона изображения) с эпидермальными эквивалентами, созданными in vitro (правая сторона изображения). В дополнение к его повышенному относительному содержанию в эпидермальных эквивалентах, следы ламинина 5 можно видеть на клеточных мембранах клеток базального слоя (стрелки). BM - базальная мембрана; d - дерма; SB - базальный слой; SS - шиповатый слой; SG - зернистый слой; TM - мембрана Transwell.
[00174] Фиг. 11A-11I иллюстрируют структурный анализ эквивалента кожи полной толщины (FSE). На фиг. 11A и 11B представлены срезы FSE, которые представляют отчетливые клеточные слои эпидермиса при увеличении 2600× (фиг. 11A) и увеличении 5200× (фиг. 11B). На фиг. 11C изображена поверхность FSE при увеличении 900×, которая имеет гладкий внешний вид, схожий с тонкой выделанной кожей, что указывает на то, что FSE может вызывать сравнимый тактильный опыт (на ощупь). На фиг. 11D-1F изображены продольные срезы дермального каркаса с находящимися там дермальными фибробластами и богатым внеклеточным матриксом при увеличении 91× (фиг. 11D), увеличении 162× (фиг. 11E) и увеличении 405× (фиг. 11F). На фиг. 11G-11I изображены дермальные каркасы с находящимися там дермальными фибробластами и богатым внеклеточным матриксом при увеличении 80× (фиг. 11G), увеличении 695× (фиг. 11H) и увеличении 2700× (фиг. 11I).
[00175] Фиг. 12A-12R иллюстрируют динамику конструирования дермального эквивалента. На фиг. 12A-12I изображены сутки 2 после высевания дермальных фибробластов на каркас при увеличении 36× (фиг. 12A), увеличении 695× (фиг. 12B), увеличении 1470× (фиг. 12C), увеличении 7750× (фиг. 12D), увеличении 2320× (фиг. 12E), увеличении 2420× (фиг. 12F), увеличении 6560× (фиг. 12G), увеличении 17000× (фиг. 12H) и увеличении 22000× (фиг. 12I). Клетки могут начинать мигрировать в полые структуры каркаса и секретировать внеклеточный матрикс. На фиг. 12J-12R изображены сутки 7 после высевания дермальных фибробластов на каркас при увеличении 64× (фиг. 12J), увеличении 100× (фиг. 12K), увеличении 364× (фиг. 12L), увеличении 82× (фиг. 12M), увеличении 253× (фиг. 12N), увеличении 3940× (фиг. 12O), увеличении 5550× (фиг. 12P), увеличении 9440× (фиг. 12Q) и увеличении 21680 (фиг. 12R). Продольные (фиг. 12J-12L) и поперечные срезы (фиг. 12M-12R) могут демонстрировать более плотные клетки и более богатый внеклеточный матрикс, причем некоторые области имеют почти полную обструкцию полой структуры каркаса (фиг. 12M-12P).
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Дифференцировка iPSC в кератиноциты
[00176] Для того чтобы индуцировать дифференцировку, недифференцированные iPSC переносят в окружение атмосферы 20% O2 и обрабатывают с использованием mTESR1 или других базальных сред плюрипотентных стволовых клеток с добавлением 1 мМ ATRA (Sigma-Aldrich) и 25 нг/мл BMP4 (R&D) в течение 7 суток (индуцирование).
[00177] Для того чтобы выбирать клетки, у которых рано определена их эктодермальная судьба, клетки собирают и пересевают на свежеприготовленный 3D HDF ECM или ECM другого типа с плотностью 5-10×103 клеток на см2 и растят в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла/Ham F12 (3:1; Life Technologies) или кератиноцитных средах с добавлением заменителя сыворотки, такого как лизат тромбоцитов человека, и с 1 мМ ATRA и 25 нг/мл BMP4 в течение дополнительных 7 суток (отбор).
[00178] Для обогащения предполагаемыми эпидермальными предшественниками, можно использовать быструю адгезию к чашкам, покрытым коллагеном IV типа, и быстро прилипающие клетки культивируют в определенной кератиноцитной SFM или другой кератиноцитной среде с добавлением 1 мМ ATRA в течение 7 суток (обогащение). После этого клетки культивируют в среде EpiLife (Life Technologies) или другой кератиноцитной среде в течение дополнительных 7 суток (размножение) перед конечным сбором и анализом.
Пример 2. Дифференцировка индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в линию дифференцировки кератиноцитов
Покрытие тканевых культуральных чашек с использованием Geltrex и Col
[00179] Процедуру можно осуществлять в боксе биологической безопасности с использованием асептических способов. Подобно Matrigel, матрикс Geltrex быстро затвердевает при комнатной температуре (RT). Создают аликвоты каждой новой партии матрикса по прибытии и используют предварительно охлажденные кончики пипеток, штативы и пробирки при работе с реактивом. Аликвоты 50, 100 и 200 мкл получают и хранят при -80°C. Geltrex используют в разведениях 1:100.
[00180] Следующую процедуру покрывания можно описывать для 60 мм тканевой культуральной чашки. Если использованию подлежит более крупная чашка, объем покрывающего раствора корректируют соответственно. 1. Удаляют 50 мкл аликвоту Geltrex из морозильника -80°C и помещают ее на лед в боксе биологической безопасности. 2. Добавляют 5 мл холодной стерильной DMEM/F12 в 15 мл коническую пробирку. 3. Используют 1 мл стеклянную пипетку, берут 1 мл холодной DMEM/F12 из 15 мл конической пробирки, подготовленной на стадии 2, и добавляют в замороженный Geltrex. Аккуратно пипетируют для оттаивания и растворения Geltrex. Переносят растворенный Geltrex в остальную DMEM/F12 в 15 мл конической пробирке, подготовленной на стадии 2. Пипетируют для смешивания разведенного Geltrex. 4. Добавляют 50 мкл стокового раствора ColI 3 мг/мл в разведенный Geltrex со стадии 3. Пипетируют для смешивания разведенного Geletrex с ColI. Добавляют 4 мл покрывающего раствора в чашку 60 мм. Постукивают или завихряют чашку, чтобы обеспечивать покрывание всей поверхности. 5. Чашку инкубируют с содержащим Geltrex/ColI раствором при 37°C в тканевом культуральном инкубаторе в течение по меньшей мере 1 ч. 6. По завершении покрывания, покрывающий раствор оставляют в чашке и переходят к высеванию iPSC, как описано в следующем подразделе. Альтернативно, аспирируют покрывающий раствор и добавляют 2 мл свежей DMEM/F12 в покрытую чашку для того, чтобы предотвращать ее высыхание перед высевом клеток.
Высевание iPSC для дифференцировки
[00181] Подготавливают одну 60 мм тканевую культуральную чашку iPSC без кормушек, выращенных до конфлюентности ~ 70%. Исследуют клетки под микроскопом для того, чтобы подтверждать отсутствие контаминации и сохранение их недифференцированного фенотипа. Если клетки находятся в стрессе или гибнут, они начинают дифференцироваться, представляя себя в качестве областей «булыжников» с более крупными полиморфными клетками, и их не следует использовать для дифференцировки в кератиноциты.
[00182] Для дифференцировки iPSC в кератиноциты, 1:8 соотношение дробления iPSC. 1. Предварительно нагревают среду N2B27 и диспазу в водяной бане 37°C. 2. Используя микроскоп, подтверждают, что колонии готовы для пассирования. Аккуратно аспирируют среду из чашки. Добавляют 2 мл 1×PBS, завихряют чашку для промывания клеток и аккуратно аспирируют PBS. 3. Добавляют 1 мл диспазы и возвращают чашку в тканевой культуральный инкубатор 37°C на 3-5 мин. 4. Пока клетки инкубируют с диспазой, аккуратно аспирируют покрывающий раствор Geltrex/ColI (или DMEM/F12) со стадии 6 в процедуре покрывания Geltrex/ColI и добавляют 4 мл полной среды N2B27 в покрытую чашку. 5. После 3~5 мин инкубирования с диспазой подтверждают, что клетки готовы для сбора, посредством поиска закатанных или сложенных краев вокруг колоний. 6. Чашку переносят в бокс биологической безопасности и осторожно аспирируют диспазу. После обработки диспазой, колонии очень непрочно прикрепляют к поверхности чашки, и они могут отслаиваться, если используют чрезмерное усилие. 7. Аккуратно добавляют 2 мл в простую DMEM/F12. Аспирируют среду и повторяют промывание 3 раза. 8. Добавляют 2 мл полной N2B27 в чашку и аккуратно соскребают колонии с чашки. Переносят клетки из чашки в 15 мл коническую пробирку и добавляют 6 мл полной N2B27, доводя общий объем клеточной суспензии до 8 мл. 9. Аккуратно перемешивают клеточную суспензию, чтобы разрушать большие группы клеток. Переносят 1 мл клеточной суспензии в покрытую чашку, подготовленную на стадии 3 данного подраздела. Выбрасывают или повторно высевают оставшиеся клетки с использованием условий, установленных для данной лаборатории. 10. Переносят вновь высеянные клетки в инкубатор и аккуратно встряхивают чашку назад и вперед и из стороны в сторону для того, чтобы распространять клетки равномерно. Инкубируют клетки в течение ночи в тканевом культуральном инкубаторе 37°C.
Дифференцировка iPSC с использованием RA и BMP4
[00183] Дифференцировку и субкультивирование кератиноцитов, полученных из iPSC, следует проводить в боксе биологической безопасности с использованием асептических способов. Исследуют новую чашку через сутки после пассирования для того, чтобы подтверждать успешное прикрепление iPSC. Если iPSC начинают образовывать колонии, переходят к следующему протоколу дифференцировки.
[00184] 1. Предварительно нагревают полную DKSFM (с антибиотиками и добавкой DKSFM) в водяной бане 37°C. 2. Добавляют 5 мл предварительно нагретой DKSFM с предыдущей стадии в 15 мл коническую пробирку, добавляют 5 мкл RA 1 мМ для достижения конечной рабочей концентрации 1 мкМ и 5 мкл BMP4 мкг/мл для достижения конечной рабочей концентрации 25 нг/мл, хорошо перемешивают. 3. Аспирируют среду N2B27 из чашки с высеянными iPSC, промывают один раз в 4 мл 1×PBS и добавляют 4 мл DKSFM, содержащей RA 1 мкМ и BMP4 25 нг/мл, из стадии выше. Это сутки 1 процедуры дифференцировки. 4. Переносят клетки в инкубатор и инкубируют в течение 48 ч. 5. Заменяют среду на свежую DKSFM, содержащую RA 1 мкМ и BMP4 25 нг/мл, после 48 ч инкубации. Переносят клетки в инкубатор на другие 48 ч. 6. После второго раунда 48 ч индуцирования (сутки 4 дифференцировки) среду заменяют на полную DKSFM без RA и BMP4. Инкубируют клетки в инкубаторе в течение 10 суток в полной DKSFM, меняя среду через день. 7. В сутки 14 дифференцировки получают полную среду CnT-07 посредством добавления антибиотиков и предоставленных добавок, предварительно нагревают среду. К этим суткам большинство клеток в переросшей колонии iPSC начинают проявлять фенотип наподобие эпителиального. 8. Аспирируют DKSFM из дифференцированных клеток и заменяют на 4 мл полной CnT-07. Инкубируют клетки в тканевом культуральном инкубаторе в течение еще 10 суток, меняя полную CnT-07 через день.
Быстрое прикрепление и культивирование кератиноцитов, полученных из iPSC
[00185] В сутки 24 дифференцировки многие клетки, которые мигрируют далеко от переросшей колонии iPSC, проявляют кератиноцитоподобный фенотип и начинают экспрессировать p63, основной регулятор, необходимый для коммитирования эктодермы по пути кератиноцитов, и Krt14. К этим суткам 60 мм чашка, используемая для дифференцировки iPSC, полностью конфлюэнтна и нуждается в пассировании. Для обогащения кератиноцитами, полученными из iPSC, во время пассирования, дифференцированную культуру iPSC быстро прикрепляют к чашкам, покрытым ColI/ColIV. Вплоть до четырех 100 мм тканевых культуральных чашек, покрытых ColI/ColIV, используют для того, чтобы осуществлять процедуру быстрого прикрепления из одной 60 мм чашки, содержащей дифференцированные iPSC. Если использованию подлежит только одна 100 мм чашка, высевают одну четвертую дифференцированной культурыв iPSC для процедуры быстрого прикрепления.
Покрывание чашек с использованием ColI и ColIV
[00186] Процедуру можно осуществлять в боксе биологической безопасности с использованием асептических способов. 1. Восстанавливают порошок ColIV до концентрации 2 мг/мл в стерильной 0,25% ледяной уксусной кислоте. Растворяют в течение нескольких часов при 2~8°C, иногда завихряя. Делают аликвоты и хранят их при -20°C. 2. Оттаивают аликвоту стокового раствора ColIV (2 мг/мл) очень медленно посредством размещения флакона в ведерке со льдом и поддерживают его при 4°C в течение нескольких часов. 3. Ресуспендируют стоковый раствор ColIV в подходящем объеме (5 мл на каждую 100 мм чашку) стерильной 0,25% ледяной уксусной кислоты до конечной рабочей концентрации 7 мкг/мл. Добавляют подходящий объем стокового раствора ColI, чтобы достигать конечной рабочей концентрации ColI 30 мкг/мл. Чашки покрывают с использованием 5 мл рабочего раствора, чтобы покрывать 100 мм чашку. Инкубируют чашки при комнатной температуре в боксе биологической безопасности в течение 1 часа. 4. Аспирируют жидкость из покрытых чашек, промывают чашки один раз в 5 мл стерильного 1×PBS и один раз в 5 мл ddH2O. 5. Промытые чашки сушат на воздухе в боксе биологической безопасности. Чашки используют непосредственно или запечатывают их в Parafilm и хранят при 4°C вплоть до 6 месяцев. Чтобы использовать предварительно сохраненную чашку, покрытую ColIV, оставляют чашку нагреваться при комнатной температуре в боксе биологической безопасности в течение по меньшей мере 1 часа перед высеванием клеток.
Быстрое прикрепление кератиноцитов, полученных из iPSC
[00187] 1. В сутки 24 дифференцировки предварительно нагревают полную CnT-07, аккутазу и чашку(и), покрытую ColI/ ColIV. 2. Промывают клетки в 1×PBS, добавляют 2 мл аккутазы и инкубируют в тканевом культуральном инкубаторе в течение 5 мин. Под микроскопом подтверждают, что клетки начинают открепляться. 3. Добавляют 3 мл полной Cnt-07, пипетируют для перемещения клеток и собирают клеточную суспензию в 15 мл коническую пробирку. Центрифугируют клетки на 260×g в течение 5 мин и аспирируют супернатант. Ресуспендируют пеллет в 10 мл полной среды Cnt-07, повторяют центрифугирование на 260×g в течение 5 мин и аспирируют супернатант. 4. Ресуспендируют пеллет в 4 мл полной Cnt-07, пипетируют для разрушения групп клеток на отдельные клетки. 5. Добавляют 9 мл полной среды Cnt-07 в каждую чашку, покрытую ColI/ColIV, и переносят 1 мл клеточной суспензии с вышеуказанной стадии 4 в каждую чашку, покрытую ColI/ColIV. Оставляют клетки прикрепляться к покрытой чашке при комнатной температуре в течение 15-30 мин. 6. Осторожно аспирируют среду с плавающими клетками (они представляют собой недифференцированные или частично дифференцированные iPSC). Не трогают прикрепленные клетки (они представляют собой Krt14-положительные клетки, полученные из iPSC). Добавляют 10 мл свежей полной среды Cnt-07 в чашку с прикрепленными клетками. Оставляют клетки расти в тканевом культуральном инкубаторе 37°C, меняя среду через день. Пассируют клетки при необходимости с аккутазой в CnT-07 или EpiLife (в добавкой EDGS) на чашках, покрытых ColI. После пассирования 2 или 3 и последующей стадии быстрого прикрепления культура должна состоять из ~90% Krt14-положительных клеток, демонстрирующих кератиноцитоподобный фенотип. Кератиноцитоподобный фенотип получаемой культуры можно верифицировать с помощью стандартных иммунофлуоресцентных анализов на экспрессию Krt14 и по способности восстанавливать нормальный расслаиваемый эпидермис в органотипических культурах.
Пример 3. Получение эпидермального слоя из первичных кератиноцитов
[00188] Первичные кератиноциты выделяют из одной неонатальной крайней плоти и выращивают в 0,07 мМ Ca2+ среде 154CF (Life Technologies) с добавлением мужской ростовой добавки для кератиноцитов. Суспензию кератиноцитов первого пассирования (2,21×105/см2 вставка) высевают на Cellstart CTS (Life Technologies) (или другой субстрат ECM), покрытый PET, 0,4-мм вставки (EMD Millipore) в средах CnT-07 (CELLnTEC) или средах CnT-Prime (CELLnTEC) в соответствии с протоколом производителя.
[00189] Сутки 3 (D3) после высевания, среды переключают на CnT-02-3D (CELLnTEC) или CnT-3D Barrier (CELLnTEC). В сутки 4, HEE экспонируют воздуху посредством подачи CnT-02-3D или CnT-3D Barrier на нижнюю часть вставки. Начиная с суток 4, в HEE ежедневно подают CnT-02-3D или CnT-3D Barrier до сбора. HEE выращивают во влажном (при 100% RH) или сухом инкубаторе (при 50% RH) при 37°C и 5% CO2. Гидрометр с циферблатом (Fisher Scientific) используют для того, чтобы измерять влажность в инкубаторе. Низкую влажность в инкубаторе поддерживают посредством удаления корыта с водой.
[00190] Для того чтобы управлять возможными изменениями осмолярности, среды обновляют ежедневно. При использовании этого протокола не обнаруживают значимые изменения осмолярности, как измеряют с помощью Micro Osmometer (Precision Systems). Вставки с 12 лунками используют для измерений трансэпителиального электрического сопротивления (TEER), световой микроскопии и электронной микроскопии, тогда как вставки с 6 лунками используют для измерения трансэпидермальных потерь воды (TEWL) и иммуноблоттинга.
Пример 4. Культивирование эпидермального слоя
[00191] Кератиноциты высевают с плотностью 2,0-2,5×105 клеток/см2 полиэтилентерефталатной (PET) мембраны со вставками с порами 0,4 мкм (EMD Millipore; № по каталогу: MCHT12H48) в средах CnT-07 (CELLnTEC) или средах CnT-Prime (CELLnTEC).
[00192] Сутки 3 (D3) после высевания, среды переключают на CnT-02-3D (CELLnTEC) или CnT-3D Barrier (CELLnTEC). В сутки 4 клетки экспонируют воздуху посредством подачи CnT-02-3D CnT-3D Barrier на нижнюю часть вставки. Начиная с суток 4, в эпидермальный слой ежедневно подают CnT-02-3D или CnT-3D Barrier до сбора в сутки 14.
Пример 5. Получение несущей подложки
[00193] Для того чтобы получать 2% раствор агарозы, 2 г агарозы с ультранизкой температурой плавления (LMP) растворяют в 100 мл ультрачистой воды/буферного раствора (1:1, об./об.). Буферный раствор необязательно может представлять собой PBS (фосфатно-солевой буфер Дульбекко 1×) или HBSS (сбалансированный солевой раствор Хэнкса 1×). Раствор агарозы можно помещать в стакан, содержащий теплую воду (выше 80°C) и держать на конфорке до полного растворения агарозы. Раствор агарозы остается жидким до тех пор, пока температура выше 36°C. Ниже 36°C происходит фазовый переход, возрастает вязкость и, наконец, агароза образует гель.
[00194] Для того чтобы получать агарозную несущую подложку, 10 мл жидкой 2% агарозы (температура >40°C) можно располагать в 10 см диаметр чашке Петри и равномерно распределять для того, чтобы формировать однородный слой. Агарозу оставляют образовывать гель при 4°C в холодильнике.
Пример 6. Получение синтетической кожи, содержащей фибробласты, кератиноциты и меланоциты
[00195] Общие черты протокола могут представлять собой следующее: a) приведение фибробластов и раствора коллагена в контакт, затем инкубирование в течение достаточного периода времени для получения сжатого коллагенового матрикса, в котором распределяют фибробласты, образующие эквивалент дермы, b) засевание, смесью кератиноцитов и меланоцитов, эквивалента дермы, полученного в a), и погружение культуры в жидкую среду, c) погружение всей культуры (кератиноциты и меланоциты, высеянные на эквивалент дермы), полученной в b), и продолжение культивирования на границе раздела воздух-жидкость до получения многослойного эквивалента эпидермиса, содержащего меланоциты, на эквиваленте дермы, содержащем фибробласты в коллагеновом матриксе, которые составляют эквивалент кожи.
[00196] Стадию a) можно осуществлять с коллагеном I типа, в частности полученным от коровы, или смесью коллагенов I и III (приблизительно 30% относительно конечного объема решетки) в гомогенной суспензии. Благоприятно, туда добавляют другие составляющие, такие как ламинин (в частности, от 1% до 15% относительно конечного объема), коллаген IV (в частности, от 0,3% до 4,5% относительно конечного объема) и/или энтактин (в частности, от 0,05% до 1% относительно конечного объема) с тем, чтобы получать гомогенную суспензию. Фибробласты получают из кожи. Их культивируют в подходящей среде и затем суспендируют перед смешиванием с суспензией коллагена и факторов роста. Смесь инкубируют в течение 1-6 суток, предпочтительно в течение 4 или 5 суток, при температуре приблизительно 37°C, в целом от 36°C до 37,5°C. Благоприятно, смесь инкубируют на опоре, которая не допускает ее адгезии, в частности, которая предотвращает адгезию смеси к краям опоры; такую опору, в частности, можно получать посредством предшествующей обработки ее поверхности, например, посредством покрывания указанной поверхности альбумином или сывороткой коровы. Таким образом, получают коллагеновый гель, который свободно сжимается в нескольких направлениях, при этом высвобождая питательную среду, и в который встроены фибробласты.
[00197] Для того чтобы осуществлять стадию b), можно использовать кератиноциты, происходящие из кожи, предпочтительно из зрелой кожи. Кератиноциты размножают перед высеванием в соответствии со способом Rheinwald и Green (Cell, том 6, 331-344, 1975) посредством культивирования на опоре-кормушке, состоящей из фибробластов 3T3, в подходящей среде, известной специалистам в данной области, в присутствии факторов роста, в частности, аминокислот, сыворотки, токсина холеры, инсулина, трийодотиронина и pH буферного раствора. В частности, такая среда для культивирования, в частности, может содержать по меньшей мере один митогенный фактор роста для кератиноцитов (например, эпидермальный фактор роста (EGF) и/или фактор роста кератиноцитов (KGF), в частности KGF), инсулин, гидрокортизон и, необязательно, антибиотик (например: гентамицин, амфотерицин B).
[00198] Меланоциты могут представлять собой меланоциты, происходящие из кожи молодого или зрелого животного. Их размножают посредством культивирования в подходящей среде, в отсутствие форболового эфира, состоящей из основной среды, такой как DMEM/F12 или MCDB153, с добавлением меланоцит-специфических факторов роста (таких, например, как bFGF, SCF, ET-1, ET3 или αMSH), и в частности в среде М2 (Promocell) или в других средах, таких как М254 (Cascades Biologics™).
[00199] Клеточные суспензии меланоцитов и кератиноцитов получают из этих культур и смешивают с тем, чтобы получать смешанные суспензии кератиноцитов/меланоцитов. Соотношение меланоцитов/кератиноцитов может составлять от 1:10 до 2:1 и в целом составляет приблизительно 1:1. Эту смешанную суспензию располагают на эквиваленте дермы. Эквивалент дермы благоприятно прикрепляют к опоре через биологический материал, такой как коллаген. Суспензию меланоцитов/кератиноцитов располагают в кольце или любом эквивалентном средстве для поддержания ее на ограниченной части поверхности. Жидкую питательную среду добавляют таким образом, чтобы покрывать смесь клеток. Эта среда содержит факторы роста, известные специалистам в данной области, в частности EGF и/или KGF. Среду заменяют регулярно и культивирование продолжают в виде погружения, в целом в течение периода от 2 до 10 суток, в частности от 5 до 8 суток, и приблизительно 7 суток. Среда содержит KGF, начиная со 2 суток погружения, и в идеале начиная с 4 суток погружения.
[00200] Затем кожу, известным per se образом, погружают с тем, чтобы достигать дифференцировки кератиноцитов и формирования расслаиваемого эквивалента эпидермиса. Эту стадию c), соответствующую культуре в виде погружения на границе раздела воздух-жидкость, продолжают до получения дифференцированной структуры, в целом приблизительно 7 суток. Однако стадию c) можно продолжать в течение более длительного периода времени, например, в течение приблизительно 28 суток, при этом одновременно сохраняя эквивалент кожи, обладающих благоприятными характеристиками, которые определены выше в тексте. Питательную среду для культивирования обновляют регулярно. Эквивалент кожи впоследствии удаляют с тем, чтобы выполнять необходимые тесты.
Пример 7. Индуцирование формирования фолликулов в культивируемых образцах кожи
[00201] Размноженные клетки DP смешивают с культивируемыми клетками ORS, промывают и осторожно ресуспендируют в 20 мл стерильного фосфатно-солевого буфера (PBS, Sigma) при подходящих плотностях клеток. Культивируемые клетки DP и ORS, используемые в каждом эксперименте, получают от различных доноров, поскольку различная длительность культивирования для клеток DP и ORS не позволяет получать клетки двух типов от одного донора. Клеточную суспензию медленно инъецируют в дерму кусков культивируемой кожи через 1 сутки после стабилизации культуры.
Пример 8. Культивирование популяций клеток волосяного фолликула
[00202] Волосяные фолликулы получают из затылочной области. Клетки дермальных сосочков (DP) получают и культивируют, как описано в Randall et al., A comparison of the culture and growth of dermal papilla cells from hair follicles from non-balding and balding (androgenetic alopecia) scalp. Br J Dermatol 1996: 134: 437-444).
[00203] В кратком изложении, DP волосяных фолликулов выделяют под препаровальным микроскопом и переносят индивидуально в 24-луночный тканевой культуральный планшет (Sarstedt). Клеточную культуру осуществляют в DMEM с добавлением 15% FCS (Sigma). После инициации клеточной пролиферации, клетки культивируют до конфлюентности и размножают для двух пассирований. Для выделения внешних клеток влагалища корня (ORS), среднюю часть волосяных фолликулов, содержащих утолщенную область, иссекают и подвергают мягкой трипсинизации. По меньшей мере клетки 10 волосяных фолликулов используют для каждой культуры. Получаемые клетки промывают два раза в среде RPMI-1640 (Sigma) и осуществляют культивирование клеток в стандартной среде для кератиноцитов (Epilife, Sigma). Клетки собирают после 1 недели культивирования.
Пример 9. Дубление эквивалентов кожи полной толщины
[00204] Эквиваленты кожи полной толщины дубят посредством хромового дубления. Первая стадия представляет собой обработку льдом и серной кислотой. Это раскрывает ткань, так что она может принимать хром. Затем добавляют хром вместе с оксидом магния.
[00205] Процесс опускает уровень pH эквивалентов кожи полной толщины до приблизительно 3. После того как хромом проработали эквиваленты кожи полной толщины, вводят дубильную жидкость, которая поднимает уровень pH до приблизительно 4. После этого следует теплая водяная баня и затем валковое прессование для того, чтобы удалять чрезмерную жидкость. Затем, конечная стадия состоит в том, чтобы применять обработку поверхности в случае необходимости и затем сушить эквиваленты кожи полной толщины, при этом растягивая, и затем повторно прессовать по завершении.
Пример 10. Протокол дубления X-tan
[00206] Эквиваленты кожи полной толщины можно дубить с использованием процедуры X-tan. Перед дублением, эквивалент кожи полной толщины золили, что включает стадии вымачивания эквивалента кожи, добавления субстрата, корректировки pH и промывания. Затем эквивалент кожи обеззоливали посредством промывания эквивалента кожи, добавления предварительного обеззоливающего буфера, обеззоливания эквивалента кожи и промывания. Затем эквивалент кожи дубили посредством увлажнения, добавления дубильного субстрата, корректировки pH до pH, способствующего дублению, выполнения циклов фиксации и фиксации и жирования для получения дубленного эквивалента кожи.
Пример 11. Эквиваленты кожи полной толщины
[00207] Матрикс из коллагена I типа (содержащий 0,5×106 фибробластов, полученных из iPSC) можно располагать на полиэтилентерефталатных мембранах (BD Biosciences) и оставлять для полимеризации. После инкубации полимеризованного матрикса в течение приблизительно 7 суток, 1×106 кератиноцитов, полученных из iPSC, и 0,1×106 меланоцитов, полученных из iPSC, можно высевать на матрикс и инкубировать в течение дополнительных 7 суток. Композитную культуру можно поднимать на границу раздела воздух-жидкость и питать снизу для того, чтобы индуцировать эпидермальную дифференцировку. Эквиваленты кожи полной толщины можно собирать приблизительно через 14 суток и быстро замораживать в LN2 или заделывать в воск. Для количественного определения меланина
Пример 12. Иммуноокрашивание замороженного среза
[00208] Фиксация: ткани можно фиксировать в 3,8% параформальдегиде/фосфатно-солевом буфере (PBS), pH 7,2-7,6 в течение 30 минут. Образцы можно промывать три раза 5 минут в PBS. Образцы тканей можно инфильтрировать серией градиентов стерильной сахарозы (10% сахароза в течение ночи, 15% сахароза в течение 6-8 часов, 30% сахароза в течение ночи и наконец в 30% сахарозе, смешанной 1:1 с соединением с оптимальной температурой резания (OCT) в течение ночи), при вращении при 4°C. Образцы можно вделывать в OCT и замораживать в парах жидкого азота. Криоблоки можно хранить при -80°C.
[00209] Резание срезов: за сутки до резания, криоблоки можно переносить на -20°C в течение ночи. Срезы (10 мкм) можно получать с использованием стандартного криостата. Срезы можно держать при -20°C до обработки.
[00210] Обработка: можно включать контрольные инкубации. Сыворотки до иммунизации или неиммунные антитела совпадающего изотипа можно использовать вместо первичных антител. Срезы можно погружать в 90% холодный ацетон в течение 10 минут или 0,2% Triton X-100/PBS в течение 5 минут, чтобы обнажать антигены. Образцы можно промывать три раза 5 минут в PBS. Неспецифическую реакционную способность антител блокировали посредством погружения срезов в 5% BSA с 0,1% Triton X-100 в течение 1 ч. Затем срезы можно инкубировать в течение ночи при 4°C со смесью двух антител: i) 2,5 мкг/мл целого IgG осла ChromPure (в целях блокирования; все вторичные антитела можно получать у осла); ii) 1 мкг/мл подходящего первичного антитела. Срезы можно споласкивать три раза 5 минут в PBS. Срезы можно инкубировать в течение от 30 до 60 мин при комнатной температуре с подходящим видоспецифическим вторичным антителом, полученным у осла и конъюгированным с красным или зеленым флуорофоров. Срезы можно промывать три раза 5 минут в PBS. Затем срезы можно инкубировать в течение 10 минут с 10 мкг/мл Hoechst 33342 при комнатной температуре. Срезы можно промывать 3 раза 5 минут в PBS.
[00211] Визуализация: образцы можно закреплять с использованием среды Vectashield (Vector) и образцы можно визуализировать с использованием эпифлуоресцентного микроскопа (Zeiss), оборудованного подходящими фильтрами.
Пример 13. Иммуноокрашивание срезов, погруженных в парафин
[00212] Фиксация: ткани можно фиксировать в 3,8% параформальдегиде/фосфатно-солевом буфере (PBS), pH 7,2-7,6 в течение 30 минут. Образцы можно промывать три раза 5 минут в PBS. Образцы тканей можно дегидратировать в серии с возрастающим содержанием этанола (50%, 70%, 2×100%; 20 мин каждое) и осветлителем (ксилол, 2 × 20 мин). Образцы можно перфузировать парафиновым воском при 65°C 2×1 час и заделывать в парафиновые блоки. Парафиновые блоки можно хранить при комнатной температуре до последующего использования.
[00213] Резание срезов: нарезали ткань толщиной 5 мкм с использованием стандартного микротома. Срезы можно хранить при комнатной температуре до обработки.
[00214] Обработка: можно включать контрольные инкубации. Сыворотки до иммунизации или неиммунные антитела совпадающего изотипа можно использовать вместо первичных антител. Срезы можно регидратировать в восходящей серии ксилол/этанол 2× ксилол, 2× 100% этанол и 1× 70% и 50%; 10 мин каждое. Затем срезы можно быстро споласкивать водопроводной водой. Затем срезы можно окрашивать гематоксилином в течение 5 минут. Затем срезы можно промывать в dH2O до прозрачного раствора. Срезы можно окрашивать 0,5% эозином в течение 10 минут. Затем срезы можно споласкивать быстро в водопроводной воде. Неспецифическую реакционную способность антител блокировали посредством погружения срезов в 5% BSA в течение 1 ч. Затем срезы можно инкубировать в течение ночи при 4°C в смеси двух антител: i) 2,5 мкг/мл целого IgG осла ChromPure (для целей блокирования; все вторичные антитела получают у осла); ii) 1 мкг/мл подходящего первичного антитела. Срезы можно промывать три раза 5 минут в PBS. Срезы можно инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре с подходящим видоспецифическим вторичным антителом, полученным у осла и конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP). Срезы можно промывать три раза 5 минут в PBS.
[00215] Визуализация: образцы можно инкубировать в наборе с субстратом 3,3'-диаминобензидином (DAB) (VectorLaboratories) в соответствии с протоколом производителя. DAB дает коричневую окраску. Если хлорид никеля добавляют в раствор субстрата, может возникать серо-черная окраска. Образцы можно дегидратировать в серии с возрастающим содержанием этанола (50%, 70%, 2×100%; 10 мин каждое) и осветлителе (ксилол, 2×10 мин). Образцы можно закреплять в заливочной среде и визуализировать с использованием фазово-контрастного микроскопа (Zeiss), оборудованного цифровой камерой.
Пример 14. Полевая эмиссионная сканирующая электронная микроскопия (FESEM)
[00216] Фиксация: образцы можно фиксировать в течение 24 часов при 4°C с использованием 4% параформальдегида и 2% глутаральдегида в буфере какодилата натрия 0,1 M (pH 7,4) и помещать в буфер какодилата натрия 0,1 M и поддерживать при 4°C перед дополнительной обработкой.
[00217] Обработка: образцы можно подвергать последующей фиксации в течение 1 часа с использованием 1% водного OsO4. После дегидратации в серии с возрастающим содержанием этанола (50%, 70%, 2×100%; 10 мин каждое), образцы можно высушивать до критической точки с использованием жидкого CO2 в аппарате Tousimis Autosamdri-815B, устанавливать с использованием двухсторонней медной ленты на 15 мм алюминиевые крепления и покрывать напылением 40 ангстремов золота-палладия с использованием Denton DeskII Sputter Coater.
[00218] Визуализация: срезы дублирующих образцов можно устанавливать на низкопрофильные 45/90° SEM крепления для анализа внутренней морфологии. Визуализацию можно осуществлять с использованием Zeiss Sigma FESEM (Carl Zeiss Microscopy, Thornwood, NY), работающего на 2-3 кВ, используя обнаружение inLens Secondary Electron (SE), а также обнаружение смешанного сигнала InLens/SE2 (75/25%) при рабочем расстоянии 3-5 мм. Изображения можно захватывать в TIFF с использованием разрешения для хранения 2048×1536 и алгоритма снижения шумов линейным усреднением.
[00219] Обработка: предварительно высушенные образцы (т. е. кожу) можно резать до определенного размера и покрывать напылением 40 ангстремов золота-палладия с использованием Denton DeskII Sputter Coater.
[00220] Визуализация: срезы дублирующих образцов можно устанавливать на низкопрофильные 45/90° SEM крепления для анализа внутренней морфологии. Визуализацию осуществляли с использованием Zeiss Sigma FESEM (Carl Zeiss Microscopy, Thornwood, NY), работающего на 2-3 кВ, используя обнаружение inLens Secondary Electron (SE), а также обнаружение смешанного сигнала InLens/SE2 (75/25%) при рабочем расстоянии 3-5 мм. Изображения можно захватывать в TIFF с использованием разрешения для хранения 2048×1536 и алгоритма снижения шумов линейным усреднением.
Пример 15. Трансмиссионная электронная микроскопия (TEM)
[00221] Фиксация: образцы можно фиксировать 30 минут при 4°C в 2% глутаральдегиде и 2% параформальдегиде с 0,06% хлоридом кальция в буфере какодилата натрия 0,1 M pH 7,4. Затем образцы можно помещать в буфер какодилата натрия 0,1 M и поддерживать при 4°C перед дополнительной обработкой.
[00222] Обработка: затем образцы можно промывать и помещать в 0,2% тетроксид рутения (для визуализации липидных бислоев) или 1,5% тетроксид осмия с ферроцианидом калия 1,5%, в 0,1 M какодилате натрия, pH 7,4, при комнатной температуре в темноте в течение 45 минут. После споласкивания в буфере, образцы можно дегидратировать в ступенчатой этаноловой серии (50%, 70%, 2×100%; 10 мин каждое) и впоследствии заделывать в эпоксидную смолу низкой вязкости.
[00223] Визуализация: полутонкие срезы можно окрашивать 1% толуидиновым синим с 1% азуром II в 1% растворах буры и наблюдать под фазово-контрастным микроскопом (Zeiss). Ультратонкие срезы можно получать и окрашивать водным насыщенным 3% уранилацетатом и/или контрастировать в 2,5% цитрате свинца на непокрытых никелевых решетках. Ультратонкие срезы можно наблюдать под электронным микроскопом Zeiss 10 A, который работает на 60 кВ. Изображения можно захватывать в TIFF.
[00224] Цитохимия захвата ионов (градиент Ca++):
[00225] Фиксация: для ультраструктурной локализации Ca++ образцы можно фиксировать в 2% параформальдегиде, 2% глутаральдегиде, 0,09 M оксалате калия, содержащем 0,04 M сахарозу. Впоследствии образцы можно фиксировать в течение ночи при 4°C,
[00226] Обработка: образцы можно подвергать последующей фиксации в 1% тетроксиде осмия, содержащем 2% пироантимонат калия, pH 7,4, в течение 2 ч при 4°C в темноте. Затем образцы тканей можно промывать в щелочной воде (pH 10) и переносить в растворы этанола (50%, 70%, 2×100%; 10 мин каждое) для дегидратации и заделывания в эпоксидную смолу низкой вязкости.
[00227] Визуализация: ультратонкие срезы можно получать и окрашивать водным насыщенным 3% уранилацетатом и/или контрастировать в 2,5% цитрате свинца на непокрытых никелевых решетках. Ультратонкие срезы можно наблюдать под электронным микроскопом Zeiss 10 A, который работает на 60 кВ. Изображения можно захватывать в TIFF.
[00228] Перфузия лантана:
[00229] Фиксация: путь перфузии оценивали у всех субъектов посредством погружения образцов в 4% нитрат лантана в 0,05 M Tris буфере, содержащем 2% глутаральдегид, 1% параформальдегид, pH 7,4, в течение 1 часа при комнатной температуре.
[00230] Обработка: образцы можно промывать и помещать в 1,5% тетроксид осмия с 1,5% ферроцианидом калия, в 0,1 M какодилате натрия, pH 7,4, при комнатной температуре в темноте в течение 45 минут. После промывания в какодилатном буфере, образцы можно дегидратировать в ступенчатой этаноловой серии (50%, 70%, 2×100%; 10 минут каждое) и впоследствии заделывать в эпоксидную смолу низкой вязкости.
[00231] Визуализация: ультратонкие срезы можно получать и окрашивать водным насыщенным 3% уранилацетатом и/или контрастировать в 2,5% цитрате свинца на непокрытых никелевых решетках. Ультратонкие срезы можно наблюдать под электронным микроскопом Zeiss 10 A, который работает на 60 кВ. Изображения можно захватывать в TIFF.
[00232] Хотя некоторые варианты осуществления показаны и описаны в настоящем описании, такие варианты осуществления предоставлены только в качестве примера. Многие вариации, изменения и замены теперь видны специалистам в данной области, не отступая от раскрытия, предоставленного в настоящем описании. Следует понимать, что можно использовать различные альтернативные варианты осуществления, описанные в настоящем описании.
Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения in vitro кожи для применения в кожаном изделии. Проводят контактирование фибробласта с каркасом, содержащим целлюлозу или ее модифицированный вариант. Инкубируют указанные фибробласты на каркасе при температуре от 6 до 37,5°C и времени инкубации от 2 до 6 недель, причем фибробласт секретирует коллаген. Проводят дубление по меньшей мере части указанного коллагена с формированием тем самым кожи in vitro. Таким образом формируют искусственный дермальный слой, содержащий фибробласт. 13 з.п. ф-лы, 12 ил., 11 табл., 15 пр.
1. Способ получения in vitro кожи для применения в кожаном изделии, включающий:
a) формирование искусственного дермального слоя, содержащего фибробласт, причем указанное формирование включает:
i) контактирование указанного фибробласта с каркасом;
ii) инкубацию указанных фибробластов на указанном каркасе в условиях, включающих температуру от приблизительно 36°C до приблизительно 37,5°C и время инкубации от приблизительно 2 недель до приблизительно 6 недель, причем фибробласт секретирует коллаген; и
b) дубление по меньшей мере части указанного коллагена с формированием тем самым указанной кожи in vitro, в которой указанный каркас содержит целлюлозу или ее модифицированный вариант.
2. Способ по п.1, дополнительно включающий формирование искусственного эпидермального слоя.
3. Способ по п.2, в котором указанный искусственный эпидермальный слой содержит кератиноцит.
4. Способ по п.3, дополнительно включающий размещение указанного искусственного эпидермального слоя на указанном искусственном дермальном слое с формированием тем самым слоистой структуры.
5. Способ по п.4, в котором указанная слоистая структура содержит меланоцит.
6. Способ по любому из пп.2-5, в котором указанный искусственный эпидермальный слой, указанная слоистая структура или указанный искусственный дермальный слой дополнительно содержит коллаген.
7. Способ по п.6, в котором указанный коллаген получают по меньшей мере отчасти посредством продуцирующей коллаген клетки, добавляют отдельно или любой их комбинацией.
8. Способ по любому из пп.1-7, в котором указанная кожа in vitro дополнительно содержит одно или несколько из кератина, эластина, желатина, протеогликана, протеогликана дерматансульфата, гликозаминогликана, фибронектина, ламинина, дерматопонтина, липида, жирной кислоты, углевода или их комбинации.
9. Способ по любому из пп.1-7, в котором толщина указанного искусственного дермального слоя находится в диапазоне от приблизительно 0,02 мм до приблизительно 5 мм.
10. Способ по любому из пп.2-9, в котором толщина указанного искусственного эпидермального слоя находится в диапазоне от приблизительно 0,01 мм до приблизительно 2 мм.
11. Способ по любому из пп.1-10, в котором указанная кожа in vitro дополнительно содержит заменитель базальной мембраны.
12. Способ по п.11, в котором указанный заменитель базальной мембраны находится между указанным искусственным эпидермальным слоем и указанным искусственным дермальным слоем.
13. Способ по любому из пп.1-12, в котором дубление включает обработку указанной по меньшей мере части указанного искусственного дермального слоя серной кислотой, хромом или дубильной жидкостью.
14. Способ по любому из пп.1-13, где указанная целлюлоза или ее модифицированный вариант содержат вискозу.
| US 2013255003 A1, 10.03.2013 | |||
| WO 2014201406 A1, 18.12.2014 | |||
| WANG Y | |||
| et al | |||
| Biomimetic fibroblast-loaded artificial dermis with "sandwich" structure and designed gradient pore sizes promotes wound healing by favoring granulation tissue formation and wound re-epithelialization, Acta Biomaterialia, 2016, 30, pp | |||
| Котел | 1921 |
|
SU246A1 |
