Способ диагностики протеолитических нарушений при невынашивании беременности Российский патент 2024 года по МПК G01N33/68 G01N33/573 

Изобретение относится к области клинической медицины и позволяет диагностировать протеолитические нарушения в тканях хориона, путем биохимической оценки состояния эластаза-ингибитороной системы, как ведущий патогенетический механизм невынашивания беременности (НБ) идиопатиче-ского генеза.

Актуальность предлагаемого способа связана с высокой частотой ранних репродуктивных потерь, особенно идиопатических, на долю которых приходится около 50%. (Малышкина А.И., Григушкина Е.В., Таланова И.Е. Факторы риска угрозы прерывания беременности у женщин с привычным невынашиванием: анализ анкетного опроса 353 беременных женщин. Гинекология. 2022; 24 (2): 126-131. dol: 10.26442/20795696.2022.2.201342). Многообразие этиологических факторов и патогенетических механизмов НБ не позволяет разработать единый алгоритм обследования и лечения женщин с ранними потерями плода. Поиск биохимических маркеров, способных определять ведущий патогенетический механизм ранней потери беременности становится приоритетными направлениями, как в научных исследованиях, так в работе практикующих врачей акушеров - гинекологов (Бушмелева Н.Н., Вахрушева Ю.Н. Этиопатогенетический аспект ранних репродуктивных потерь при совершенствовании организации медицинской помощи женщинам (аналитический обзор) // Социальные аспекты здоровья населения Электронное издание. - 2020. - №66 (5). - Режим доступа: http://vestnik.mednet.ru/content/view/l 199/30/lang,ru/. - Дата обращения: 05.12.2021).

В последние годы активно обсуждается и изучается роль протеолиза в регулировании таких важных физиологических процессов, как ангиогенез, ми-тотическое деление клеток и трансляция ДНК, апоптоз, а также в потенцировании различных воспалительных заболеваний. В настоящее время установлено, что продукты протеолитической активности являются универсальными маркерами ряда заболеваний (Al-Majid S., Waters Н. The biological mechanisms of cancer-related skeletal muscle wasting: the role of progressive resistance exercise // Biol. Res. Nurs. 2008. Vol.10, №1. P. 7-20)

Полиморфноядерные лейкоциты (ПЯЛ) играют важную роль, как клетки первичной защиты при воспалительных реакциях. ПЯЛ в периферической крови циркулируют от нескольких часов до нескольких дней, но при наличии воспалительного очага могут активно мигрировать в ткани. Лейкоцитарная эластаза (ЛЭ) - протеиназа, которая локализуется в азурофильных цитоплаз-матических гранулах ПЯЛ и относится к эффекторным молекулам воспаления, а проникновение эластазы во внеклеточное пространство рассматривается, как основное звено патогенеза многих воспалительных заболеваний. Ряд исследований предполагают, что ЛЭ можно использовать, как маркер «скрытой» инфекции репродуктивной системы (Wang Q, Que С, Chen G. Effects of leukocyte elastase in semen on sperm quality. Medicine (Baltimore). 2022 Oct 14; 101(41): e31111. doi: 10.1097/MD.0000000000031111). Активность ЛЭ находится как под контролем протеиназных ингибиторов плазмы, так и тканевых ингибиторов. Нарушение этого баланса пользу ЛЭ является неблагоприятным прогнозом развития ряда патологических, в том числе критических состояний, связанных с разрушением множества функционально значимых белков (Состояние эластаза-ингибитороной системы у детей в норме и при отдельных патологических состояниях: монография / Н.С. Парамонова, Л.Н. Турина, О.А. Волкова, А.А. Карчевский, Л.Н. Синица; под редакцией Н.С. Парамоновой. -Гродно: ГрГМУ, 2017. - 132 с.).

Таким образом, в случаях, когда патогенетический механизм ранней потери беременности остается не установленным, весьма ценным представляется оценка протеолитических нарушений и их патологического влияния на процесс гестации. Оценка значений маркеров протеолиза эластазо-ингибитор-ной системы - лейкоцитарной эластазы и ее протеиназного ингибитора альфа 2-макроглобулина (α - 2МГ) и секреторного ингибитора протеиназы лейкоцитов (SLPI) в тканях хориона даст возможность определить новые патогенен-тические пути ранних потерь беременности при идиопатическом невынашивании.

В настоящее время существует способ диагностики невынашивания беременности, основанный на гистологическом исследовании удаленных тканей (М. Берстон «Гистохимия ферментов», пер. с англ. - М.: 1965; Р. Лилли «Па-тогистологическая техника и практическая гистохимия», пер. с англ. - М.: 1969; Э. Пирс «Гистохимия», пер. с англ. - М.: 1962; А.П. Авцына «Принципы и методы гистоцито-химического анализа в патологии». - Л., 1971; О.И. Топчиева, В.А. Прянишникова, З.П. Жемкова. «Биопсия эндометрия» - М.: Медицина, 1978). Недостатками гистологического способа являются: сложность технического исполнения; длительность исследования до выдачи окончательного заключения (10-14 дней), не позволяет определять ведущие патогенетические изменения, субъективность исследования.

Предложен способ ранней диагностики невынашивания беременности (Патент РФ №2077729, 1997 г.), который позволяет диагностировать угрозу невынашивания беременности у женщин на доклиническом этапе. Однако способ не позволяет говорить о ведущем патогенетическом механизме прерывания беременности.

За прототип предлагаемого изобретения был взят способ диагностики оксидативного стресса при невынашивании беременности (Патент RU 2797679 С1, 07.06.2023 г.) позволяющий определять оксидативный стресс, как ведущий патогенетический механизм НБ. Недостатком прототипа является его низкая специфичность в отношении нарушений процессов протеолиза клеток, жизненно важных для плода.

Цель предлагаемого изобретения заключается в повышении достоверности и информативности диагностики патогенетических механизмов НБ.

Технический результат достигается тем, что в тканях хориона, полученных в результате спонтанного абортуса или путем инструментального выскабливания полости матки, методом иммуноферментного анализа, одномоментно определяют уровень лейкоцитарной эластазы, альфа 2 - макроглобулина и секреторного ингибитора протеиназы лейкоцитов, при значениях уровня эластазы более 64 нг/мл, уровня альфа 2 - макроглобулина более 7,08 нг/мл и уровня секреторного ингибитора протеиназы лейкоцитов не более 81,2 пг/мл диагностируют протеолитические нарушения при невынашивании беременности.

Способ осуществляется следующим образом. Ткань хориона получают в результате выскабливания полости матки или самопроизвольного абортуса, отмывают в физиологическом растворе, гомогенизируют и центрифугируют 15 мин при 3000-5000 об/мин. В полученном супернатанте методом иммуноферментного анализа одномоментно определяют лейкоцитарную эластазу, альфа 2 - макроглобулин и уровень секреторного ингибитора протеиназы лейкоцитов.

Лейкоцитарную эластазу определяли количественным методом с помощью прямого иммуноферментного анализа с использованием микропланшетного фотометра Stat Fax 4200 (США), аналитического набора Human Elastase НК 319 (BioVender, Чехия) версия 04-04 с диапазоном измерения: 0.39-25 нг/мл и чувствительностью: 0.39 нг/мл.

Альфа 2 - макроглобулин определяли количественным методом с помощью прямого иммуноферментного анализа с использованием микропланшетного фотометра Stat Fax 4200 (США), аналитического набора Imunodiagnostik а 2 -Microglobulin ELISA Kit (BioVender, Чехия) с диапазоном измерения: от 16,13 до 297,07 нг/мл.

Уровень секреторного ингибитора протеиназы лейкоцитов (SLPI) определяли количественным методом с помощью прямого иммуноферментного анализа с использованием микропланшетного фотометра Stat Fax 4200 (США), аналитического набора Human SLPI НК 316 (BioVender, Чехия) с диапазоном измерения: 20-5000 пг/мл, чувствительность 20 пг/мл.

Предлагаемый способ был успешно апробирован в гинекологических отделениях ГБУЗ АО «Клинический родильный дом» г. Астрахань, АО ГБУЗ АМОКБ г. Астрахань, женской консультации «Клинического родильного дома» г. Астрахани в 2020-2022 гг.

Обследовано 80 женщин, из которых 40 пациенток с диагнозом неразвивающаяся беременность и самопроизвольный выкидыш на сроке 5-9 недель гестации составили основную группу исследования. В группу контроля вошли 40 женщины, решивших прервать беременность по желанию в аналогичные сроки. Всем женщинам наряду с клинико-лабораторным обследованием согласно приказа МЗ РФ от 20.10.2020 №1130н "Об утверждении Порядка оказания медицинской помощи по профилю "акушерство и гинекология", проводилось УЗИ органов малого таза трансвагинальным доступом, молочных желез, цитологическое исследование эндо - экзоцервикса, а также исследование тканей хориона заявленным способом. Результаты апробации приводятся ниже.

Пример №1

Беременная Р., 1982 года рождения, поступила в гинекологическое отделение 5/10/21 г. с диагнозом: Беременность в сроке 8 недель гестации (на артифициальный аборт).

Жалоб при поступлении не предъявляет.

Менструальная и репродуктивная функции: менструации с 13 лет по 4 дня, регулярные, умеренные, цикл 33 дней. Последние менструации 2/12/21 г. В анамнезе: роды - 1, аборты - 2. Соматический анамнез не отягощен. Объективно:

P.V. Наружные половые органы развиты правильно, слизистая влагалища не изменена. Тело матки увеличено до 8 недель беременности, мягкое, безболезненное. Придатки с обеих сторон без особенностей. Параметрии свободны. Выделений из п\путей нет.

УЗИ от 21.12.21 г. - матка размерами 54×46×48 мм, увеличена до 5 недель беременности, контуры четкие, ровные, структура неоднородная. В полости матки плодное яйцо КТР - 0,45 мм, СВД -15 мм, сердцебиение плода определяется. Правый яичник 30x21 мм, левый яичник - 18×25 мм. Проведено полное клинико-лабораторное обследование согласно приказа МЗ РФ от 20.10.2020 №1130н "Об утверждении Порядка оказания медицинской помощи по профилю "акушерство и гинекология". Отклонений от нормы в результатах исследования не выявлено.

Забор материала: ткань хориона получали путем вакуум-аспирации полости матки.

Результат гистологического исследования постабортного материала №123098: децидуальная ткань, ворсин хориона, что характерно для прогрессирующей маточной беременности.

Работа с полученным материалом велась согласно ранее представленным методикам.

В результате исследования получены результаты маркеров эластазо-ингибиторной системы:

уровень лейкоцитарной эластазы в тканях хориона 50,2 нг/мл уровень альфа 2 - магроглобулина в тканях хориона 6,77 нг/мл показатель уровня секреторного ингибитора протеиназы лейкоцитов в тканях хориона 258,1 пг/мл, соответствующие физиологическим значениям для нормально прогрессирующей беременности.

Пример №2

Беременная О., 1988 года рождения, поступила в гинекологическое отделение 13/03/22 г. с диагнозом: Неразвивающаяся беременность в сроке 6 недель гестации по типу гибели эмбриона, с целью прерывания беременности по медицинским показаниям.

Жалобы при поступлении на задержку менструации, сукровичные выделения из половых путей в течение суток.

Менструальная и репродуктивная функции не нарушены: менструации с 15 лет по 5 дней, регулярные, умеренные, цикл 25 дней. Дата последних менструаций 3/02/22 г.

В анамнезе: 1 аборт. В 2008 году - лапаротомия, цистэктомия. Соматический анамнез: железо дефицитная анемия легкой степени.

Объективно:

P.V. Наружные половые органы развиты правильно, слизистая влагалища не изменена. Тело матки увеличено до 5 недель, мягкое, безболезненное. Придатки с обеих сторон без особенностей. Параметрии свободны. Выделения -сукровичные.

УЗИ органов малого таза от 10.03.22 г. - матка размерами 62×52×52 мм, увеличена до 5 недель беременности, контуры четкие, ровные, структура неоднородная. М-эхо 12 мм. В полости матки деформированное плодное яйцо КТР -4,7 мм, СВД - 3 мм сердцебиение плода не определяется. Правый яичник 37×31 мм, левый яичник - 24×20 мм.

Проведено полное клинико-лабораторное обследование согласно приказа МЗ РФ от 20.10.2020 №1130н "Об утверждении Порядка оказания медицинской помощи по профилю "акушерство и гинекология", в дополнение исключены все известные факторы невынашивания. Отклонений от нормы в результатах исследования не выявлено. Выполнена вакуум-аспирация полости матки. Результат гистологического исследования №0197709: децидуальная ткань, ворсины хориона с лимфоцитарной инфильтрацией, погибшее плодное яйцо Результат цитогенетического исследования №165 а - Кариопит 46ХХ, численных хромосомных аномалий у плода не обнаружено.

Забор и исследование полученного материала проводилось аналогично, см. пример №1

В результате исследования получены результаты маркеров эластазо-ингибиторной системы:

показатель уровня лейкоцитарной эластазы в тканях хориона 64 нг/мл уровень альфа 2-магроглобулина в тканях хориона 7,08 нг/мл показатель уровня секреторного ингибитора протеиназы лейкоцитов в тканях хориона 81,2 пг/мл, установлено нарушение баланса эластаза-ингибиторной системы в сторону повышения протеолитической активности, как ведущий патогенетический механизм невынашивания беременности.

Пример №3

Пациентка С., 1986 года рождения, поступила в гинекологическое отделение 22/03/22 г. диагнозом: неразвивающаяся беременность в сроке 7 недель гестации по типу анэмбрионии, с целью прерывания беременности по медицинским показаниям.

Жалоб при поступлении не предъявляет.

Менструальная и репродуктивная функции: менструации с 11 лет по 5 дня, регулярные, умеренные, цикл 28 дней. Последние менструации 1\02\22 г. В анамнезе: роды - 2, аборты - 0, выкидыши - 0. Соматический анамнез не отягощен.

Объективно:

P.V. Наружные половые органы развиты правильно, слизистая влагалища не изменена. Тело матки увеличено до 5, мягкое, безболезненное. Придатки с обеих сторон без особенностей. Параметрии свободны. Выделения из п\путей слизистые

УЗИ от 22.03.22 г. - матка размерами 62×62×58 мм, увеличена до 6 недель беременности, контуры четкие, ровные, структура неоднородная. М-эхо 16 мм. В полости плодное яйцо, желточный мешок в диаметре до 3,7 см, эмбрион не определяется. Правый яичник 37×31 мм, левый яичник - 24×20 мм. Проведено полное клинико-лабораторное обследование согласно приказа МЗ РФ от 20.10.2020 №1130н "Об утверждении Порядка оказания медицинской помощи по профилю "акушерство и гинекология". Отклонений от нормы в результатах исследования не выявлено. Выполнена вакуум-аспирация содержимого полости матки.

Результат гистологического исследования №02913467: децидуальная ткань, ворсины хориона, маточная беременность

Результат цитогенетического исследования №118\а Кариотип Кариотип: 47, XY+21

Заключение: патологический кариотип. Синдром Дауна

Забор и исследование полученного материала проводилось аналогично, см. пример №1 показатель уровня лейкоцитарной эластазы в тканях хориона 25,4 мг/мл уровень альфа 2- магроглобулина в тканях хориона 6, 29 мг/мл показатель уровня секреторного ингибитора протеиназы лейкоцитов в тканях хориона 350,77 пг/мл

На основании проведенных исследований установлен ведущий патогенетический механизм неудачной гестации - хромосомные аберрации.

Пример №4

Пациентка С., 1981 года рождения, поступила в гинекологическое отделение 26/05/22 г. диагнозом: неполный самопроизвольный выкидыш в сроке 8 недель гестации

Жалобы при поступлении на обильные кровянистые выделения из п\путей Менструальная и репродуктивная функции не нарушены: менструации с 12 лет по 5 дней, регулярные, умеренные, цикл 28 дней. Дата последних менструаций 23/02/22 г.

В анамнезе:2 неразвивающиеся беременности в сроках 5 и 7 недель

Соматический анамнез: без особенностей

Объективно:

P.V. Наружные половые органы развиты правильно, слизистая влагалища не изменена. В зеркалах в области цервикального канала части плода. Тело матки увеличено до 7 недель, мягкое. Придатки с обеих сторон без особенностей. Параметрии свободны. Выделения - кровянистые, обильные. УЗИ органов малого таза от 26.05.22 г. - матка размерами 60×72×62 мм, увеличена до 6-7 недель беременности, контуры четкие, ровные, структура неоднородная. М-эхо 12 мм. В полости матки ткани хориона. Правый яичник 37×31 мм, левый яичник - 24×20 мм.

Проведено полное клинико-лабораторное обследование согласно приказа МЗ РФ от 20.10.2020 №1130н "Об утверждении Порядка оказания медицинской помощи по профилю "акушерство и гинекология". Отклонений от нормы в результатах исследования не выявлено. Выполнена вакуум-аспирация полости матки.

Результат гистологического исследования №9298345: децидуальная ткань, ворсины хориона с лимфоцитарной инфильтрацией

Результат цитогенетического исследования №170 а - Кариопит 46ХХ, численных хромосомных аномалий у плода не обнаружено.

Забор и исследование полученного материала проводилось аналогично, см. пример №1 показатель уровня лейкоцитарной эластазы в тканях хориона 109,4 мг/мл уровень альфа 2- магроглобулина в тканях хориона 12,3 мг/мл показатель уровня секреторного ингибитора протеиназы лейкоцитов в тканях хориона 35,4 мг/мл, установлено нарушение баланса эластаза-ингибиторной системы в сторону повышения протеолитической активности, как ведущий патогенетический механизм невынашивания беременности.

Таким образом, предлагаемый способ дает возможность в короткие сроки, на малом объеме биологического материала проводить оценку протеолитических нарушений, в частности эластаза-ингибитороной системы при патологии репродуктивного процесса (особенно НБ идиопатического генеза). Комплексное исследование состояния баланса эластаза-ингибиторной системы позволит установить диагностические критерии НБ и разработать новые способы коррекции нарушений в системе протеолиза с целью улучшения репродуктивных исходов.

Заявляемый способ отличается малой инвазивностью, технической простотой выполнения, является информативным и достоверным для диагностики нарушений баланса эластаза-ингибиторной системы, как ведущего патогенетического механизма НБ. Легко выполним в условиях женской консультации, стационарных ЛПУ.

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и может быть использовано для диагностики протеолитических нарушений при невынашивании беременности путем иммуноферментного анализа тканей хориона. В тканях хориона, полученных в результате спонтанного абортуса или путем инструментального выскабливания полости матки, одномоментно определяют уровень лейкоцитарной эластазы, альфа 2 - макроглобулина и секреторного ингибитора протеиназы лейкоцитов. При значениях уровня эластазы более 64 нг/мл, уровня альфа 2 - макроглобулина более 7,08 нг/мл и уровня секреторного ингибитора протеиназы лейкоцитов не более 81,2 пг/мл диагностируют протеолитические нарушения при невынашивании беременности. Способ обеспечивает возможность повышения достоверности и информативности диагностики патогенетических механизмов невынашивания беременности за счет определения уровня лейкоцитарной эластазы, альфа 2 - макроглобулина и секреторного ингибитора протеиназы лейкоцитов в тканях хориона. 4 пр.

Способ диагностики протеолитических нарушений при невынашивании беременности путем иммуноферментного анализа тканей хориона, отличающийся тем, что в тканях хориона, полученных в результате спонтанного абортуса или путем инструментального выскабливания полости матки, одномоментно определяют уровень лейкоцитарной эластазы, альфа 2 - макроглобулина и секреторного ингибитора протеиназы лейкоцитов, при значениях уровня эластазы более 64 нг/мл, уровня альфа 2 - макроглобулина более 7,08 нг/мл и уровня секреторного ингибитора протеиназы лейкоцитов не более 81,2 пг/мл диагностируют протеолитические нарушения при невынашивании беременности.