СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ ВИРУСНЫХ ВЕКТОРОВ Российский патент 2024 года по МПК C12N7/02 C12N15/86 

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

Настоящее изобретение относится к способам получения рекомбинантных вирусных векторов с высоким титром, более конкретно рекомбинантных AAV векторов, так что способы можно эффективно применять в масштабе, который является подходящим для практического применения методик генной терапии.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Доставка генов является перспективным способом лечения приобретенных и наследственных заболеваний. Был описан ряд систем на основе вируса для целей переноса генов, включая системы на основе аденоассоциированного вируса (AAV).

AAV обладают уникальными характеристиками, которые делают их привлекательными в качестве векторов для генной терапии. AAV заражают широкий спектр типов клеток. Однако они являются нетрансформирующимися и не участвуют в этиологии каких-либо заболеваний человека. Введение ДНК в реципиентные клетки-хозяева обычно приводит к долговременному сохранению и экспрессии ДНК без нарушения нормального метаболизма клетки.

Частицы AAV состоят из белкового капсида, содержащего три капсидных белка, VP1, VP2 и VP3, которые включают линейный одноцепочечный ДНК геном с размером ~4,7 тысяч нуклеотидов, содержащий гены Rep и Cap, фланкированные вирусными инвертированными концевыми повторами (ITR). Отдельные частицы упаковывают только одну цепь молекулы ДНК, но это может быть как плюс-цепь, так и минус-цепь. Частицы, содержащие любую из цепей, являются инфекционными, и репликация происходит посредством превращения родительской инфицирующей одиночной цепи в дуплексную форму и последующей амплификации, где одиночные цепи потомства вытесняются и упаковываются в капсиды.

AAV векторы могут быть сконструированы таким образом, что несут представляющую интерес гетерологичную нуклеотидную последовательность (например, выбранный ген, антисмысловую молекулу нуклеиновой кислоты, рибозим или тому подобное), удаляя внутреннюю часть генома AAV и вставляя представляющую интерес последовательность ДНК между ITR. ITR представляют собой единственные последовательности, необходимые в цис-положении для репликации и упаковки генома вектора, содержащего представляющую интерес гетерологичную нуклеотидную последовательность. Гетерологичная нуклеотидная последовательность также обычно связана с промоторной последовательностью, способной управлять экспрессией гена в клетках-мишенях пациента при определенных условиях. Сигналы терминации, такие как сайты полиаденилирования, обычно включены в вектор.

Продукты генов rep и cap AAV обеспечивают функции репликации и инкапсидации генома вектора, соответственно, и достаточно, чтобы они присутствовали в трансположении.

Несмотря на потенциальные преимущества генной терапии в качестве лечения генетических заболеваний человека, серьезные практические ограничения мешают ее широкому клиническому применению. В этом смысле необходимо производить большие количества частиц rAAV для получения клинически эффективных доз. Получение большого количества частиц с использованием существующей в настоящее время технологии требует большого количества клеток-продуцентов. В лабораторном масштабе потребуются тысячи флаконов культуры тканей. В коммерческом масштабе для достижения клинического применения необходимы более эффективные и интенсивные производственные платформы. Преимущества улучшения как количества продуцирующих клеток, так и выхода частиц на клетку будут очень значительными с точки зрения коммерческого производства.

Соответственно, при разработке рекомбинантных AAV векторов, таких как векторы для использования в генной терапии, существует потребность в способах, которые позволяют достичь высокого титра AAV вектора, чтобы эти способы можно было эффективно использовать в масштабе, подходящем для практического применения методик генной терапии.

В настоящем документе представлены способы достижения этих конкурирующих целей и продемонстрировано, что такие способы могут быть использованы для крупномасштабного получения препаратов на основе рекомбинантных AAV векторов.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что продукция рекомбинантного вируса, более конкретно продукция rAAV, может быть значительно улучшена посредством проведения повторных трансфекций. Как показано в приведенных ниже примерах, устойчивый уровень экспрессии гена с течением времени достигается при выполнении повторных раундов трансфекций, в отличие от обычного подхода, который предусматривает единственный раунд трансфекций.

Таким образом, согласно первому аспекту настоящее изобретение относится к способу получения рекомбинантного вирусного вектора, причем указанный способ предусматривает стадии:

a) совместной трансфекций подходящей клеточной культуры с по меньшей мере двумя плазмидными векторами, причем указанные плазмидные векторы содержат гетерологичную нуклеотидную последовательность и генные последовательности репликации и упаковки,

b) культивирования указанных клеток в условиях, обеспечивающих репликацию и упаковку вируса,

c) выделения вирусных векторов, полученных на стадии b), и сохранения клеток в клеточной культуре в условиях, обеспечивающих дальнейшее деление и рост,

d) повторной трансфекций клеток согласно стадии с) с плазмидными векторами согласно стадии а) и

e) повторного проведения стадий b) - с).

Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что комбинации оптимизированных плазмид для трансфекций приводит к более высокому выходу rAAV, чем продукция с применением стандартных плазмид, обычно используемых для продукции AAV вектора. Более того, как показано в приведенных ниже примерах, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что использование оптимизированных плазмид согласно настоящему изобретению приводит к более низкой обратной упаковке бактериальных последовательностей.

Таким образом согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу получения рекомбинантного AAV вектора, причем указанный способ предусматривает стадии:

а) совместной трансфекций подходящей клетки с

i) первым плазмидным вектором, содержащим гетерологичную нуклеотидную последовательность, фланкированную ITR,

ii) вторым плазмидным вектором, содержащим в направлении от 5' к 3' кодирующую область rep AAV, кодирующую область cap AAV и нуклеотидную последовательность, содержащую промоторную область р5 AAV, и

iii) третьим плазмидным вектором, содержащим аденовирусные хелперные функциональные элементы, включающие последовательности вирус-ассоциированной РНК (VA-RNA), Е2А и Е4, где указанная плазмида не содержит последовательности Е3, рТВ (Е2В), ITR Ad и протеазы,

b) культивирования указанной клетки в условиях, обеспечивающих репликацию и упаковку AAV, и

c) выделения AAV векторов, полученных на стадии b).

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что посредством применения комбинации оптимизированных плазмид при трансфекций обратная упаковка значительно уменьшается и достигается более высокий выход генома вектора.

Таким образом, согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к плазмидному вектору, содержащему:

a) гетерологичную нуклеотидную последовательность, фланкированную ITR, и

b) вставочную последовательность ДНК, расположенную вне указанных ITR и рядом с одним ITR, где указанная вставочная последовательность имеет длину от 4400 пар оснований до 4800 пар оснований, так что размер остова плазмиды составляет более 5 тысяч пар оснований, предпочтительно от 7000 пар оснований до 7500 пар оснований,

где указанный плазмидный вектор не содержит нуклеотидную последовательность F1Ori в последовательности остова.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к плазмидному вектору, содержащему аденовирусные хелперные функциональные элементы, включающие последовательности VA-RNA, Е2А и Е4, где указанная плазмида не содержит последовательности Е3, рТВ(Е2В), ITR Ad и протеазы.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Выходы AAV9-CAG-cohSgsh, экспрессируемого в общем геноме вектора, продуцируемом посредством тройной трансфекций с набором стандартных плазмид или набором оптимизированных плазмид.

Фиг. 2. Копии бактериальной последовательности, содержащейся в AAV9-CAG-cohSgsh, продуцируемые посредством тройной трансфекций с набором стандартных плазмид или набором оптимизированных плазмид.

Фиг. 3. Влияние оптимизированной плазмиды pcohSgsh-900 самой по себе или в комбинации с другими оптимизированными хелперными плазмидами (pRepCap9-809 и pAdhelper861) на выход AAV вектора (общий геном вектора (vg)).

Фиг. 4. Обратная упаковка бактериальных последовательностей. Влияние оптимизированной крупноразмерной плазмиды pcohSgsh-900 самой по себе или в комбинации с другими оптимизированными хелперными плазмидами (pRepCap9-809 и pAdhelper861).

Фиг. 5. Обратная упаковка бактериальных последовательностей. Влияние оптимизированной крупноразмерной плазмиды pcohSgsh-900 в комбинации с другими оптимизированными хелперными плазмидами (pRepCap9-809 и pAdhelper861).

Фиг. 6. Общий геном вектора, выделенный после временной трансфекций с плазмидой pohIDS-874. Клеточный лизис и общий геном вектора, выделенный в клеточном супернатанте после проведения нескольких раундов повторной трансфекций. Время выражено как часы после трансфекций (hpt).

Фиг. 7. Общий геном вектора, выделенный после временной трансфекций с плазмидой pohSGSH-900. Клеточный лизис и общий геном вектора, выделенный в клеточном супернатанте после проведения нескольких раундов повторной трансфекций. Время выражено как часы после трансфекций (hpt).

Депонирование микроорганизмов

Плазмида pAdHelper861 была задепонирована 5 декабря 2018 г. под номером доступа DSM 32965 в DSMZ Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур, Inhoffenstraβe 7 В, D-38124 Braunschweig, Федеративная Республика Германия.

Плазмида pcohSgsh-827 была задепонирована 5 декабря 2018 г. под номером доступа DSM 32966 в DSMZ - Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур, Inhoffenstraβe 7 В, D-38124 Braunschweig, Федеративная Республика Германия.

Плазмида pcohSgsh-900 была задепонирована 5 декабря 2018 г. под номером доступа DSM 32967 в DSMZ - Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур, Inhoffenstraβe 7 В, D-38124 Braunschweig, Федеративная Республика Германия.

Плазмида pohIDS-874 была задепонирована 5 декабря 2018 г. под номером доступа DSM 32968 в DSMZ - Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур, Inhoffenstraβe 7 В, D-38124 Braunschweig, Федеративная Республика Германия.

Плазмида pRepCap9-809 была задепонирована 5 декабря 2018 г. под номером доступа DSM 32969 в DSMZ - Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур, Inhoffenstraβe 7 В, D-38124 Braunschweig, Федеративная Республика Германия.

Определения

В контексте настоящего изобретения термин «вектор» относится к макромолекуле или ассоциации макромолекул, которые содержат полинуклеотид или ассоциированы с ним и которые могут использоваться для опосредования доставки полинуклеотида в клетку. Иллюстративные векторы включают, например, плазмиды, вирусные векторы, липосомы и другие носители для доставки генов.

Термины «аденоассоциированный вирус», «вирус AAV», «вирион AAV», «вирусная частица AAV» и «частица AAV», используемые в настоящем документе в качестве синонимов, относятся к вирусной частице, состоящей из по меньшей мере одного капсидного белка AAV (предпочтительно состоящей из всех капсидных белков определенного серотипа AAV) и инкапсулированного полинуклеотид а, соответствующего геному AAV. AAV дикого типа относится к вирусу, который принадлежит к роду Dependovirus, семейству Parvoviridae. Геном AAV дикого типа имеет длину приблизительно 4,7 тысяч нуклеотидов и состоит из одноцепочечной дезоксирибонуклеиновой кислоты (оцДНК), которая может быть смысловой или антисмысловой. Геном дикого типа включает инвертированные концевые повторы (ITR) на обоих концах цепи ДНК и три открытые рамки считывания (ORF). Ген rep ORF кодирует четыре белка Rep, необходимых для жизненного цикла AAV. Ген cap ORF содержит нуклеотидные последовательности, кодирующие капсидные белки: VP1, VP2 и VP3, которые взаимодействуют с образованием капсида икосаэдральный симметрии. Наконец, ORF ААР, которая перекрывается с ORF Сар, кодирует белок ААР, который, как оказалось, способствует сборке капсида. Если частица содержит гетерологичный полинуклеотид (т.е. полинуклеотид, отличный от генома AAV дикого типа, такой как трансген, который должен быть доставлен в клетку млекопитающего), фланкированный ITR AAV, то она обычно известна как «частица AAV вектора» или «вирусный AAV вектор», или «AAV вектор», или «рекомбинантные AAV векторы». Настоящее изобретение также относится к применению двухцепочечного AAV или самокомплементарного AAV, также называемых dsAAV или scAAV.

В контексте настоящего изобретения термин «ITR аденоассоциированного вируса» или «ITR AAV» относится к инвертированным концевым повторам, присутствующим на обоих концах цепи ДНК генома AAV. Последовательности ITR необходимы для эффективного размножения генома AAV. Еще одним свойством этих последовательностей является их способность образовывать шпильку. Эта характеристика способствует их саморегулированию, что обеспечивает независимый от примазы синтез второй цепи ДНК. Также было показано, что ITR необходимы как для интеграции ДНК AAV дикого типа в геном клетки-хозяина (например, в 19-ую хромосому человека для AAV серотипа 2), так и для освобождения от нее, а также для эффективной инкапсидации ДНК AAV в полностью собранную, устойчивую к дезоксирибонуклеазе частицу AAV. Последовательности ITR имеют длину приблизительно 145 пар оснований. Предпочтительно полные последовательности ITR используются в геноме вирусного AAV вектора, хотя допустима некоторая незначительная модификация этих последовательностей. Последовательность ITR дикого типа может быть изменена путем вставки, делеции или усечения до тех пор, пока ITR опосредует желаемые функции, например, репликацию, никование, упаковку вирусов, интеграцию и/или освобождение провирусов. Процедуры модификации этих последовательностей ITR хорошо известны в данной области техники. ITR может происходить из любого AAV дикого типа, включая без ограничения серотипы 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12, или любой другой AAV, известный или обнаруженный позже. AAV содержит два ITR, которые могут быть одинаковыми или разными. Кроме того, два ITR AAV могут быть из того же серотипа AAV, что и капсид AAV, или могут отличаться. Согласно предпочтительному варианту осуществления 5' и 3' ITR AAV происходят из AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV7, AAV8 и/или AAV9. Предпочтительно ITR происходят из AAV2, AAV8 и/или AAV9, причем AAV2 является особенно предпочтительным. Согласно одному варианту осуществления ITR AAV2 выбирают для образования псевдотипированного AAV (т.е. AAV, содержащий капсид и ITR, происходящие из различных серотипов).

В контексте настоящего изобретения выражение «рекомбинантный вирусный геном» относится к геному AAV, в котором по меньшей мере один посторонний полинуклеотид вставлен в геном AAV природного происхождения. Геном AAV согласно настоящему изобретению, как правило, содержит цис-действующие последовательности инвертированных 5'- и 3'-концевых повторов (ITR) и экспрессионную кассету. В контексте настоящего изобретения термин «rAAV вектор» относится к AAV вектору, содержащему полинуклеотидную последовательность, не происходящую из AAV (т.е. полинуклеотид, гетерологичный для AAV), как правило, представляющую интерес последовательность для генетической трансформации клетки. В предпочтительных конструкциях вектора согласно настоящему изобретению гетерологичный полинуклеотид фланкирован двумя последовательностями инвертированных концевых повторов AAV (ITR).

«AAV вирус» или «вирусная частица AAV» относится к вирусной частице, состоящей из по меньшей мере одного капсидного белка AAV (предпочтительно из всех капсидных белков AAV дикого типа) и инкапсидированного полинуклеотида. Если частица содержит гетерологичный полинуклеотид (т.е. полинуклеотид, отличный от генома AAV дикого типа, такой как трансген, который должен быть доставлен в клетку млекопитающего), ее обычно называют «частицей rAAV вектора» или просто «rAAV вектором».

«Упаковка» относится к серии внутриклеточных событий, которые приводят к сборке капсидных белков и инкапсидации генома вектора с образованием частицы AAV.

Гены «rep» и «сар» AAV относятся к полинуклеотидным последовательностям, кодирующим белки репликации и инкапсидации аденоассоциированного вируса. Они были обнаружены во всех исследованных серотипах AAV и описаны ниже и в данной области техники. Гены rep и cap AAV упоминаются в настоящем документе как «гены упаковки» AAV.

Термин «промотор CAG» относится к комбинации, образованной ранним энхансерным элементом цитомегаловируса, промотором (3-актина курицы и 3'-последовательностью сплайсинга, происходящей из гена бета-глобина кролика (См. Alexopoulou A, et al., ВМС Cell Biology 2008; 9(2): 1-11, Niwa et al, Gene. 1991 Dec 15; 108(2):193-9).

Термин «полинуклеотид» относится к полимерной форме нуклеотидов любой длины, включая дезоксирибонуклеотиды или рибонуклеотиды или их аналоги. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и аналоги нуклеотидов, и может прерываться ненуклеотидными компонентами. Если присутствуют, модификации нуклеотидной структуры могут быть внесены до или после сборки полимера. В контексте настоящего изобретения термин «полинуклеотид» относится взаимозаменяемо к двух- и одноцепочечным молекулам. Если не указано или не требуется иное, согласно любому варианту осуществления настоящего изобретения, описанному в настоящем документе, полинуклеотид охватывает как двухцепочечную форму, так и каждую из двух комплементарных одноцепочечных форм, которые, как известно или предсказано, образуют двухцепочечную форму.

«Ген» относится к полинуклеотиду, содержащему по меньшей мере одну открытую рамку считывания, который способен кодировать конкретный белок после транскрибирования и трансляции, или полинуклеотиду, содержащему по меньшей мере одну некодирующую РНК.

Термин «нуклеотидная последовательность» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, ДНК или РНК, содержащей дезоксирибонуклеотиды или рибонуклеотиды. Нуклеиновая кислота может быть двухцепочечной, одноцепочечной или содержать части как двухцепочечной, так и одноцепочечной последовательности.

Термин «кодировать» относится к генетическому коду, который определяет, как нуклеотидная последовательность транслируется в полипептид или белок. Порядок нуклеотидов в последовательности определяет порядок аминокислот в полипептиде или белке.

«Рекомбинантный», как применяется для полинуклеотида, означает, что полинуклеотидом является продукт различных комбинаций стадий клонирования, рестрикции или лигирования и других процедур, которые приводят к конструкции, которая отличается от полинуклеотида, встречающегося в природе. Рекомбинантным вирусом является вирусная частица, содержащая рекомбинантный полинуклеотид. Термины соответственно включают репликаты исходной полинуклеотидной конструкции и потомство исходной вирусной конструкции.

«Контрольный элемент» или «контрольная последовательность» представляет собой нуклеотидную последовательность, участвующую во взаимодействии молекул, которое способствует функциональной регуляции полинуклеотида, включая репликацию, дупликацию, транскрипцию, сплайсинг, трансляцию или расщепление полинуклеотида. Регулирование может влиять на частоту, скорость или специфичность процесса и может быть усиливающим или подавляющим по своей природе. Контрольные элементы, известные в данной области техники, включают, например, последовательности регуляции транскрипции, такие как промоторы и энхансеры. Промотор представляет собой область ДНК, способную в определенных условиях связывать РНК-полимеразу и инициировать транскрипцию кодирующей области, обычно расположенной ниже по ходу транскрипции (в 3'-направлении) от промотора.

«Функционально связанный» или «оперативно связанный» относится к соединению генетических элементов, при этом элементы находятся во взаимосвязи, позволяющей им действовать ожидаемым образом. Например, промотор функционально связан с кодирующей областью, если промотор помогает инициировать транскрипцию кодирующей последовательности. Между промотором и кодирующей областью могут быть промежуточные остатки до тех пор, пока сохраняется эта функциональная взаимосвязь.

«Экспрессионный вектор» представляет собой вектор, содержащий область, которая кодирует представляющий интерес полипептид, и используется для воздействия на экспрессию белка в намеченной клетке-мишени. Экспрессионный вектор также содержит контрольные элементы, функционально связанные с кодирующей областью, чтобы облегчить экспрессию белка в мишени. Комбинацию контрольных элементов и гена или генов, с которыми они функционально связаны для экспрессии, иногда называют «экспрессионной кассетой», большое количество которых известно и доступно в данной области техники или может быть легко сконструировано из компонентов, которые доступны в данной области техники.

«Гетерологичный» означает происходящий из объекта, генотипически отличного от остальной части объекта, с которым его сравнивают. Например, полинуклеотид, введенный методами генной инженерии в плазмиду или вектор, происходящий из другого вида, является гетерологичный полинуклеотидом. Промотор, удаленный из его нативной кодирующей последовательности и функционально связанный с кодирующей последовательностью, с которой он не обнаруживается в естественных условиях, является гетерологичный промотором. В частности, в контексте настоящего изобретения термин «гетерологичная нуклеотидная последовательность» включает кодирующие, а также некодирующие нуклеотидные последовательности.

«Генетическое изменение» относится к процессу, при котором генетический элемент вводят в клетку, кроме митоза или мейоза. Элемент может быть гетерологичным для клетки или может быть дополнительной копией или улучшенной версией элемента, уже присутствующего в клетке. Генетическое изменение можно осуществить, например, путем трансфекций клетки рекомбинантной плазмидой или другим полинуклеотидом в ходе любого процесса, известного в данной области техники, такого как электропорация, осаждение фосфатом кальция или контакт с комплексом полинуклеотид-липосома. Генетическое изменение также может быть выполнено, например, путем трансдукции или инфицирования ДНК или РНК вирусом или вирусным вектором. Предпочтительно генетический элемент вводят в хромосому или минихромосому в клетке, однако, любое изменение, которое изменяет фенотип и/или генотип клетки и ее потомства, охватывается этим термином.

Термины «полипептид», «пептид» и «белок» используются взаимозаменяемо в настоящем документе для обозначения полимеров аминокислот любой длины. Термины также охватывают аминокислотный полимер, который был модифицирован, например, образование дисульфидной связи, гликозилирование, липидирование или конъюгация с вносящим метку компонентом.

«Выделенная» плазмида, вирус или другое вещество относится к препарату вещества, лишенному по меньшей мере некоторых из других компонентов, которые также могут присутствовать, когда вещество или подобное вещество встречается в природе или изначально получено. Таким образом, например, выделенное вещество может быть получено с использованием методики очистки для обогащения его из смеси-источника. Обогащение можно измерить на абсолютной основе, как например, масса по объему раствора, или его можно измерить по отношению ко второму, потенциально интерферирующему веществу, присутствующему в смеси-источнике. Возрастающее обогащение согласно вариантам осуществления настоящего изобретения становится все более предпочтительным. Таким образом, например, 2-кратное обогащение является предпочтительным, 10-кратное обогащение является более предпочтительным, 100-кратное обогащение является более предпочтительным, 1000-кратное обогащение является даже более предпочтительным.

«Индивидуум» или «субъект», получающий лечение в соответствии с настоящим изобретением, относится к позвоночным животным, в частности, представителям видов млекопитающих, и включает без ограничения домашних животных, спортивных животных и приматов, включая людей.

«Лечение» индивидуума или клетки представляет собой вмешательство любого типа при попытке изменить естественное развитие заболевания индивидуума или клетки в момент начала лечения. Например, лечение индивидуума может быть предпринято для уменьшения или ограничения патологии, вызванной любым патологическим состоянием, включая (без ограничения) наследственный или индуцированный генетический дефицит, инфекцию, вызванную вирусным, бактериальным или паразитарным организмом, неопластическое или апластическое состояние или дисфункцию иммунной системы, такую как аутоиммунитет или иммуносупрессия. Лечение предусматривает (без ограничения) введение композиции, такой как фармацевтическая композиция, и введение совместимых клеток, обработанных композицией. Лечение можно проводить либо профилактически, либо терапевтически, то есть либо до, либо после начала патологического события или контакта с этиологическим агентом.

Термин «эффективное количество» относится к количеству вещества, достаточному для достижения намеченной цели. Например, эффективным количеством экспрессионного вектора для увеличения активности сульфамидазы является количество, достаточное для уменьшения накопления гликозаминогликанов. «Терапевтически эффективное количество» экспрессионного вектора для лечения заболевания или нарушения представляет собой количество экспрессионного вектора, достаточное для уменьшения или устранения симптомов заболевания или нарушения. Эффективное количество данного вещества будет варьироваться в зависимости от таких факторов, как природа вещества, способ введения, размер и вид животного, получающего вещество, и цель введения вещества. Эффективное количество в каждом индивидуальном случае может быть определено эмпирически квалифицированным специалистом в соответствии со способами, установленными в данной области техники.

Термин «генная терапия» относится к передаче представляющего интерес генетического материала (например, ДНК или РНК) хозяину для лечения или профилактики генетического или приобретенного заболевания или состояния. Представляющий интерес генетический материал кодирует продукт (например, белковый полипептид, пептид или функциональную РНК), получение которого in vivo желательно. Например, представляющий интерес генетический материал может кодировать фермент, гормон, рецептор или полипептид терапевтического значения.

Подробное раскрытие настоящего изобретения

Задача настоящего изобретения состоит в обеспечении способов получения препаратов рекомбинантных вирусных векторов с высоким титром, в частности, рекомбинантных аденоассоциированных вирусных векторов (rAAV), так что способы можно эффективно применять в масштабе, который является подходящим для практического применения методик генной терапии.

Как показано в примерах настоящего изобретения, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что продукция rAAV может быть значительно улучшена посредством проведения повторных раундов трансфекций, т.е. путем повторных трансфекций, клеточной культуры плазмидными векторами, используемыми для тройной или двойной трансфекций.

Таким образом, согласно первому аспекту настоящее изобретение относится к способу получения рекомбинантного вирусного вектора, причем указанный способ предусматривает стадии:

a) совместной трансфекций подходящей клеточной культуры с по меньшей мере двумя плазмидными векторами, причем указанные плазмидные векторы содержат гетерологичную нуклеотидную последовательность и генные последовательности репликации и упаковки,

b) культивирования указанных клеток в условиях, обеспечивающих репликацию и упаковку вируса,

c) выделения вирусных векторов, полученных на стадии b), и сохранения клеток в клеточной культуре в условиях, обеспечивающих дальнейшее деление и рост,

d) повторной трансфекций клеток согласно стадии с) с плазмидными векторами согласно стадии а) и

e) повторного проведения стадий b) - с).

Согласно конкретному варианту осуществления настоящего изобретения указанный рекомбинантный вирусный вектор выбран из группы, состоящей из аденовируса, аденоассоциированного вируса (AAV), альфавируса, флавивируса, вируса простого герпеса (HSV), вируса кори, рабдовируса, ретровируса, лентивируса, вируса ньюкаслской болезни (NDV), поксвируса и пикорнавируса. Согласно конкретному варианту осуществления указанный вирусный вектор представляет собой ретровирусный вектор, аденовирусный вектор или AAV вектор.

Согласно предпочтительному варианту осуществления указанный вирусный вектор представляет собой AAV вектор.

AAV согласно настоящему изобретению включают любой серотип из известных серотипов AAV. В целом, разные серотипы AAV имеют геномные последовательности со значительной гомологией, обеспечивая идентичный ряд генетических функций, продуцируют вирионы, которые по существу эквивалентны в физическом и функциональном отношении, и реплицируются и собираются с помощью практически идентичных механизмов. В частности, AAV согласно настоящему изобретению может принадлежать серотипу 1 аденоассоциированного вируса AAV (AAV1), AAV2, AAV3 (включая типы 3А и 3В), AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV птиц, AAV крупного рогатого скота, AAV собак, AAV лошадей, AAV овец и любому другому AAV. Примеры последовательностей генома различных серотипов AAV можно найти в литературе или в опубликованных базах данных, таких как GenBank. См. номера доступа в GenBank AF028704.1 (AAV6), NC006260 (AAV7), NC006261 (AAV8) и АХ753250.1 (AAV9). Согласно предпочтительному варианту осуществления AAV вектор согласно настоящему изобретению относится к серотипу, выбранному из группы, состоящей из серотипов AAV2, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 и AAVrh10. Согласно предпочтительному варианту осуществления указанный AAV вектор согласно настоящему изобретению представляет собой серотип 9.

Согласно конкретному варианту осуществления настоящее изобретение относится к способу получения рекомбинантного AAV вектора, причем указанный способ предусматривает стадии:

а) совместной трансфекций подходящей клеточной культуры с по меньшей мере двумя плазмидными векторами, причем указанные векторы содержат гетерологичную нуклеотидную последовательность, фланкированную ITR, генные последовательности rep AAV и cap AAV и последовательности аденовирусных хелперных функциональных элементов,

b) культивирования указанных клеток в условиях, обеспечивающих репликацию и упаковку AAV,

c) выделения AAV векторов, полученных на стадии b), и сохранения клеток в клеточной культуре в условиях, обеспечивающих дальнейшее деление и рост,

d) повторной трансфекций клеток согласно стадии с) с плазмидными векторами согласно стадии а) и

e) повторного проведения стадий b) - с).

Как описано в данной области техники, генетический материал может быть введен в клетки с использованием любого из многообразия средств трансформации или трансдукции таких клеток. В качестве иллюстрации такие методики включают, например, трансфекцию бактериальными плазмидами. Действительно, плазмидные векторы согласно стадии а) способа согласно настоящему изобретению могут быть введены в клетку с использованием многообразия способов трансфекций. Такие способы трансфекций были описаны в данной области техники и включают, например, соосаждение фосфатом кальция, прямую микроинъекцию в культивируемые клетки, электропорацию, опосредованный липосомами перенос генов, опосредованную липидами трансфекцию или доставку нуклеиновой кислоты с использованием высокоскоростных микрочастиц. Другие подходящие среды для трансфекций включают фосфат стронция, поликатионные полимеры, например, Superfect (QIAGEN™), липосомы и катионные полимеры, такие как полиэтиленимин (PEI). Согласно предпочтительному варианту осуществления плазмидные векторы согласно способу согласно настоящему изобретению трансфицируют с применением PEL В этом случае получают комплексы PEI/ДНК путем добавления PEI к плазмидной ДНК перед ее добавлением в клеточную культуру.

Любой из этих способов можно использовать для введения одного или нескольких экзогенных фрагментов ДНК, таких как векторные конструкции, в подходящие клетки-хозяева. Как правило, экзогенная ДНК должна проходить через плазматическую мембрану клетки-хозяина для того, чтобы подвергаться воздействию механизмов транскрипции и репликации клетки.

Полученная клетка может быть временно трансфицирована экзогенной молекулой нуклеиновой кислоты, т.е. экзогенная ДНК не будет интегрирована в геном трансфицированной клетки, а скорее будет существовать эписомально. В качестве альтернативы полученная клетка может быть стабильно трансфицирована, т.е. молекула нуклеиновой кислоты станет ковалентно связанной с геномом клетки-хозяина или будет сохраняться и реплицироваться как эписомальная единица, которая может передаваться клеткам-потомкам (например, способная к внехромосомной репликации с достаточной скоростью).

Согласно способу согласно настоящему изобретению плазмидные векторы, подлежащие трансфекций, содержат гетерологичную нуклеотидную последовательность, фланкированную ITR, генные последовательности rep AAV и cap AAV и последовательности аденовирусных хелперных функциональных элементов.

Гетерологичная нуклеотидная последовательность или полинуклеотид обычно представляет интерес из-за способности придавать функцию клетке-мишени в контексте генной терапии, например, функцию повышающей или понижающей регуляции экспрессии определенного фенотипа. Такой гетерологичный полинуклеотид или «трансген» обычно имеет длину, достаточную для обеспечения желаемой функции или кодирующей последовательности.

Если в намеченной клетке-мишени желательна транскрипция гетерологичного полинуклеотида, он может быть функционально связан с его собственным промотором или с гетерологичный промотором, в зависимости, например, от желаемого уровня и/или специфичности транскрипции внутри клетки-мишени, как известно в данной области техники. Различные типы промоторов и энхансеров являются подходящими в этом контексте. Конститутивные промоторы обеспечивают постоянный уровень генной транскрипции и являются предпочтительными, когда желательно, чтобы терапевтический полинуклеотид экспрессировался на постоянной основе. Индуцибельные промоторы обычно проявляют низкую активность в отсутствие индуктора и активируются в присутствии индуктора. Они могут быть предпочтительными, когда экспрессия желательна только в определенные моменты времени или в определенных местах, или когда желательно регулировать уровень экспрессии с помощью индуцирующего агента. Промоторы и энхансеры также могут быть тканеспецифическими, то есть они проявляют свою активность только в определенных типах клеток, предположительно из-за генных регуляторных элементов, обнаруживаемых в этих клетках уникальным образом.

Иллюстративными примерами промоторов являются поздний промотор SV40 из вируса обезьян 40, энхансерный/промоторный элемент бакуловируса в форме многогранника, тимидинкиназа вируса простого герпеса (HSV tk), немедленный ранний промотор из цитомегаловируса (CMV), ранний энхансер CMV/промотор β-актина курицы, (CAG) и различные ретровирусные промоторы, включая элементы LTR. Индуцибельные промоторы включают индуцируемые ионами тяжелых металлов промоторы (такие как промотор вируса опухоли молочной железы мыши (mMTV) или промоторы различных гормонов роста) и промоторы фага Т7, которые активны в присутствии РНК-полимеразы Т7. В качестве иллюстрации примеры тканеспецифических промоторов включают промоторы различных сурфактантных белков (для экспрессии в легких), промоторы миозина (для экспрессии в мышцах) и промоторы альбумина или hAAT α1-антитрипсина человека (для экспрессии в печени). Большое количество других промоторов известно и общедоступно в данной области техники, и последовательности многих таких промоторов доступны в базах данных последовательностей, таких как база данных GenBank. Согласно предпочтительному варианту осуществления используют промотор CAG.

Когда трансляция также желательна в намеченной клетке-мишени, гетерологичный полинуклеотид предпочтительно также будет содержать контрольные элементы, которые облегчают трансляцию (как например, сайт связывания рибосом или «RBS» и/или сигнал полиаденилирования). Соответственно, гетерологичный полинуклеотид, как правило, содержит по меньшей мере одну кодирующую область, функционально связанную с подходящим промотором, и может также содержать, например, функционально связанный энхансер, сайт связывания рибосом и поли-А сигнал. Гетерологичный полинуклеотид может содержать одну кодирующую область или более чем одну кодирующую область под контролем одних и тех же или различных промоторов. Весь блок, содержащий комбинацию контрольных элементов и кодирующей или некодирующей области, часто упоминается как экспрессионная кассета. Согласно конкретному варианту осуществления гетерологичный полинуклеотид согласно способу согласно настоящему изобретению содержит поли-А сигнал.

Гетерологичный полинуклеотид встраивают с помощью рекомбинантных способов в геномную кодирующую область AAV или предпочтительно на ее место и, как правило, фланкируют на обеих сторонах областями инвертированных концевых повторов (ITR) AAV. В качестве альтернативы применяют векторные конструкции только с одним ITR. Согласно конкретному варианту осуществления указанная гетерологичная нуклеотидная последовательность фланкирована двумя ITR.

Учитывая предел размера инкапсидации частиц AAV, встраивание большого гетерологичного полинуклеотида в геном требует удаления части последовательности AAV. Удаление одного или нескольких генов AAV желательно в любом случае, чтобы снизить вероятность образования репликационно-компетентного AAV («RCA»). Соответственно, кодирующие или промоторные последовательности rep, cap или обоих предпочтительно удаляют, поскольку функции, обеспечиваемые этими генами, могут быть обеспечены в транс-положении.

Согласно одному варианту осуществления гетерологичная нуклеотидная последовательность фланкирована ITR AAV, и гены упаковки AAV, которые должны быть обеспечены в транс-положении, вводят в клетку-хозяин в отдельных векторных плазмидах.

Ген rep экспрессируется из двух промоторов, р5 и р19, и продуцирует четыре белка, обозначаемые Rep78, Rep68, Rep52 и Rep40. Только Rep78 и Rep68 необходимы для репликации дуплексной ДНК AAV, но Rep52 и Rep40, как оказалось, необходимы для накопления потомственной одноцепочечной ДНК. Rep68 и Rep78 специфически связываются со шпилечной конформацией ITR AAV и обладают несколькими ферментными активностями, необходимыми для разрешения репликации на конце AAV. Rep78 и Rep68 также проявляют плейотропную регуляторную активность, включая положительную и отрицательную регуляцию генов AAV и экспрессию из некоторых гетерологичных промоторов, а также ингибирующие эффекты на рост клеток.

Ген cap кодирует капсидные белки VP1, VP2 и VP3. Эти белки имеют общую перекрывающуюся последовательность, но VP1 и VP2 содержат дополнительные аминоконцевые последовательности, транскрибируемые из промотора р40 с использованием альтернативных кодонов инициации. Все три белка необходимы для эффективной продукции капсида.

Упаковка AAV вектора в вирусные частицы все еще зависит от присутствия подходящего хелперного вируса для AAV или обеспечения хелперных функциональных элементов вируса. В соответствии со способом согласно настоящему изобретению генные последовательности хелперных функциональных элементов вируса включают в плазмидные векторы. Присутствие значительных количеств инфекционного хелперного вируса в препарате AAV векторов является проблематичным, поскольку препарат предназначен для применения для введения человеку.

Согласно конкретному варианту осуществления способа согласно настоящему изобретению трансфекцию проводят с применением двух плазмидных векторов, где один из указанных плазмидных векторов содержит гетерологичную нуклеотидную последовательность, фланкированную ITR, а второй плазмидный вектор содержит генные последовательности rep AAV и cap AAV и последовательности аденовирусных хелперных функциональных элементов. Согласно предпочтительному варианту осуществления указанный второй плазмидный вектор содержит в направлении от 5' к 3' кодирующую область rep AAV, кодирующую область cap AAV и нуклеотидную последовательность, содержащую промоторную область р5 AAV.

Согласно предпочтительному варианту осуществления способа согласно настоящему изобретению трансфекцию проводят с применением трех плазмидных векторов, т.е. клетки-хозяева трижды трансфицируют по меньшей мере одним вектором, кодирующим представляющую интерес гетерологичную нуклеотидную последовательность, по меньшей мере одним вектором, кодирующим гены rep и cap AAV, и по меньшей мере одним вектором, кодирующим аденовирусные вспомогательные функциональные элементы.

Выбор подходящим образом измененных клеток можно проводить любым способом, известным в данной области техники. Например, полинуклеотидные последовательности, используемые для изменения клетки, можно вводить одновременно с или функционально связанными с одним или несколькими детектируемыми или селектируемыми маркерами, как известно в данной области техники. В качестве примера можно использовать ген устойчивости к лекарственному средству в качестве селектируемого маркера. Затем можно отбирать и выращивать устойчивые к лекарственному средству клетки, а затем тестировать на экспрессию желаемой последовательности, т.е. упакованного продукта гена или продукта гетерологичного полинуклеотида, в зависимости того, что является подходящим. Тестирование на приобретение, локализацию и/или поддержание введенного полинуклеотида можно проводить с использованием способов на основе гибридизации ДНК (таких как саузерн-блоттинг и другие методики, известные в данной области техники). Тестирование экспрессии можно легко проводить с помощью нозерн-блоттинга РНК, экстрагированной из генетически измененных клеток, или с помощью непрямой иммунофлуоресценции для соответствующего продукта гена.

Согласно стадии b) способа согласно настоящему изобретению трансфицированные клетки, таким образом, культивируют в условиях, обеспечивающих репликацию и упаковку вирусного вектора. Согласно конкретному варианту осуществления клетки культивируют в условиях, обеспечивающих репликацию и упаковку rAAV.

Несколько критериев влияют на выбор клеток для применения для продукции частиц rAAV, как описано в настоящем документе. Более предпочтительными клетками и клеточными линиями являются те, которые можно легко выращивать в культуре, чтобы облегчить крупномасштабное производство препаратов рекомбинантных AAV векторов. Если желательно крупномасштабное производство, выбор способа получения также будет влиять на выбор клетки-хозяина. Например, некоторые способы получения и сосуды или камеры для культуры предназначены для роста прилипающих или прикрепляющихся клеток, тогда как другие предназначены для роста клеток в суспензии. В последнем случае клетка-хозяин, таким образом, предпочтительно будет адаптирована или приспособлена к росту в суспензии. Согласно настоящему изобретению желательно крупномасштабное производство rAAV.

Многообразие клеточных линий предлагается для применения для крупномасштабного производства rAAV. Особенно подходящими для клеточной культуры rAAV являются клеточные линии 293 эмбриональных клеток почек человека (HEK), либо прикрепляющиеся, либо отобранные для роста в суспензии. Примеры других подходящих клеточных линий для продуцирования rAAV включают: клетки Vero, клетки HeLa и клеточные линии СНО. В контексте настоящего изобретения термин «клеточная линия» относится к популяции клеток, способных к непрерывному или продолжительному росту и делению in vitro. Часто клеточные линии представляют собой клональные популяции, происходящие из одной клетки-предшественника. В данной области техники известно, что спонтанные или индуцированные изменения могут происходить в кариотипе в ходе хранения или переноса таких клональных популяций. Следовательно, клетки, происходящие из клеточной линии, могут не быть в точности идентичными предковым клеткам или культурам. Тем не менее термин «клеточная линия» включает такие варианты.

Сразу после выбора клеточной линии выбранное устройство для культивирования клеток засевают клетками с плотностью, подходящей для поддержания клеточной культуры. Плотность клеток, используемых для засева конкретного устройства, будет зависеть от размера устройства. Для выращивания клеток в выбранном устройстве для культивирования можно использовать различные объемы. Объем используемой среды будет варьироваться в зависимости от размера устройства для культивирования, используемого для выращивания клеток культуры. Могут использоваться крупномасштабные способы получения, такие как суспензионная культура. Затем частицы AAV собирают и выделяют из клеток, используемых для их получения.

Клетки культивируют в условиях, обеспечивающих репликацию AAV и упаковку rAAV вектора. Время культивирования предпочтительно регулируют, чтобы соответствовать пиковым уровням продукции. Предпочтительно продуцируются по меньшей мере 100 вирусных частиц на клетку, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 1000 на клетку, еще более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 10000 на клетку. Предпочтительно по меньшей мере 0,5×10⁶, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 1×10⁶, даже больше предпочтительно по меньшей мере приблизительно 2×10⁶ RU/мл AAV векторов получают на 2×10⁵ клеток в ходе периода культивирования.

Согласно настоящему изобретению можно использовать различные среды для роста для достижения крупномасштабного роста клеток и продукции AAV. Выбор среды для роста варьируется в зависимости от типа культивируемых клеток. Согласно конкретному варианту осуществления указанными клетками являются клетки млекопитающих. Согласно предпочтительному варианту осуществления указанная клетка представляет собой клеточную линию 293 эмбриональных клеток почек человека (HEK). Более конкретно, указанными клетками являются клетки, подходящие для роста в суспензии.

Для культивирования прикрепляемых клеток используются роллерные флаконы (цилиндрические колбы для культур тканей, вращающиеся с заданной скоростью), чтобы обеспечить необходимую поверхность для прикрепления клеток. Альтернативно, микроносители также являются подходящей системой для поддержки прикрепляемых клеточных культур. Для культивирования суспензионных клеток наиболее подходящими системами являются биореакторы с мешалкой, поскольку они позволяют получать культуры с высокой плотностью клеток, которые, в свою очередь, могут обеспечивать большие количества rAAV после очистки.

Согласно конкретному варианту осуществления настоящего изобретения используется биореактор с движением колебательного типа. Согласно другому конкретному варианту осуществления также может быть использован биореактор с мешалкой. Как только клеточная культура в реакторе достигает заданной точки, проводят трансфекцию клеток, как указано выше.

Согласно способу согласно настоящему изобретению стадия с) предусматривает выделение AAV векторов, полученных на стадии b), и поддержание клеток в клеточной культуре в условиях, обеспечивающих дальнейшее деление и рост. Согласно предпочтительному варианту осуществления способа стадию b) проводят посредством культивирования указанной клетки в суспензии во встряхиваемой жидкой среде.

Согласно конкретному варианту осуществления способа согласно настоящему изобретению на стадии b) продуцированные AAV секретируются в супернатант клеточной культуры. Таким образом, согласно стадии с) способа согласно настоящему изобретению rAAV собирают из супернатанта, а клетки сохраняют в клеточной культуре для дальнейшего деления и роста. Затем отработанную среду или супернатант собирают вместе с продуцированными таким образом rAAV, поскольку, как показано в примерах ниже, AAV секретируются в супернатант клеточной культуры без необходимости в клеточном лизисе.

Согласно конкретному варианту осуществления клеточную среду клеточной культуры заменяют перед проведением повторной трансфекций, т.е. перед стадией d). Согласно конкретному варианту осуществления замену клеточной среды осуществляют центрифугированием. Согласно предпочтительному варианту осуществления замену среды осуществляют перфузией. Согласно более предпочтительному варианту осуществления непрерывную замену среды проводят посредством перфузии. Более предпочтительно, указанная культуральная среда автоматически заменяется перфузионной системой. Посредством этой системы культура пополняется свежей средой, а бесклеточный супернатант удаляется с помощью устройства для удержания клеток. Этот процесс предпочтительно проводят при постоянной скорости собираемого потока. В этом отношении, согласно предпочтительному варианту осуществления, к оставшимся клеткам добавляют новую свежую культуральную среду, чтобы обеспечить их дальнейшее деление и рост. Постоянное добавление питательных веществ и удаление токсичных метаболитов позволяет перфузионным культурам достигать и поддерживать высокую плотность клеток в течение многих недель.

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что возможно повторно трансфицировать оставшиеся клетки в клеточной культуре плазмидными векторами, как описано выше для стадии а), чтобы продлить продукцию AAV. В этом смысле большее количество rAAV продуцируется с использованием клеток, оставшихся в устройстве для культивирования клеток, которым позволяют дальше делиться и расти. Таким образом, авторы настоящего изобретения обнаружили, что путем проведения повторных раундов трансфекций продукция rAAV может быть увеличена по времени с использованием той же клеточной культуры. Более того, как можно увидеть в примерах настоящего изобретения, авторы настоящего изобретения обнаружили, что при выполнении этих замен среды AAV секретируются в супернатант клеточной культуры без необходимости клеточного лизиса и могут быть собраны каждый раз при проведении замены среды перед каждым раундом повторной трансфекций. Еще одним преимуществом предложенного способа является то, что rAAV выделяют из супернатанта, что является преимуществом с точки зрения очистки, поскольку клетки не нужно лизировать для сбора AAV и, таким образом, происходит меньшее загрязнение ДНК клетки-хозяина и белком клетки-хозяина.

Следовательно, способ согласно настоящему изобретению предусматривает стадию d) повторной трансфекций оставшихся клеток согласно стадии с) с плазмидными векторами согласно стадии а).

Согласно стадии d) способа согласно настоящему изобретению повторную трансфекцию или повторные раунды трансфекций проводят в клеточной культуре, в отличие от обычного подхода временной экспрессии генов (TGE), который предусматривает один раунд трансфекций без замены среды.

Более того, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что указанные стадии повторной трансфекций и выделения можно повторять более двух раз с применением одной и той же клеточной культуры. Согласно конкретному варианту осуществления способа согласно настоящему изобретению стадии d), b) и с) повторяют по меньшей мере еще один раз после стадии выделения с). Согласно другому конкретному варианту осуществления стадии d), b) и с) повторяют по меньшей мере дважды после стадии выделения с). Согласно более конкретному варианту осуществления стадии d), b) и с) повторяют по меньшей мере три раза после стадии выделения с). Согласно предпочтительному варианту осуществления стадии d), b) и с) повторяют по меньшей мере четыре раза после стадии выделения с). Согласно более конкретному варианту осуществления стадии d), b) и с) повторяют от одного до трех раз после стадии выделения с). Согласно более конкретному варианту осуществления стадии d), b) и с) повторяют от одного до двух раз после стадии выделения с). Согласно предпочтительному варианту осуществления способ согласно настоящему изобретению предусматривает один повтор стадий d), b) и с) после стадии выделения с). Согласно предпочтительному варианту осуществления способа согласно настоящему изобретению стадии d), b) и с) повторяют еще один раз после стадии выделения с).

Как указано ранее, согласно конкретному варианту осуществления способа согласно настоящему изобретению непрерывную замену среды проводят посредством перфузии. Согласно предпочтительному варианту осуществления каждый раз, когда трансфекция должна быть проведена, перфузию останавливают. Это позволяет плазмидным векторам проникать в клетку. Согласно более предпочтительному варианту осуществления перфузию останавливают на период времени по меньшей мере 1,5 часа, более предпочтительно по меньшей мере 2 часа, более предпочтительно по меньшей мере 3 часа, даже более предпочтительно по меньшей мере 4 часа. Согласно предпочтительному варианту осуществления существует минимальный интервал времени между каждым раундом повторной трансфекций. Согласно более предпочтительному варианту осуществления указанные повторные трансфекций проводят после интервала времени по меньшей мере 36 часов, более предпочтительно по меньшей мере 48 часов.

Согласно другому конкретному варианту осуществления указанный способ предусматривает дополнительную стадию лизиса клеток в супернатанте после завершения всех раундов повторной трансфекций и выделения.

Из уровня техники известно несколько хорошо известных методик, которые можно использовать для разрушения клеток или клеточного лизиса. Хотя для разрушения клеток можно использовать замораживание-оттаивание и/или обработку ультразвуком, такие методики не очень подходят для крупномасштабных препаратов. Таким образом, в этом отношении предпочтительны механические методики лизиса. Детергенты и другие химические агенты также можно применять для опосредования или облегчения лизиса. Было обнаружено, что обработка лизатов нуклеазами (такими как бензоназа) помогает снизить вязкость и улучшить фильтруемость. Осветление, например, с помощью микрофильтрации для отделения вектора от по меньшей мере некоторой части клеточного дебриса, также полезно для выделения и очистки. Согласно конкретному варианту осуществления настоящего изобретения указанная стадия лизиса согласно способу согласно настоящему изобретению предусматривает применение нуклеазы, более предпочтительно указанной нуклеазой является бензоназа.

Согласно конкретному варианту осуществления способа согласно настоящему изобретению собранный супернатант, содержащий rAAV согласно настоящему изобретению, как описано выше, дополнительно обрабатывают, чтобы очистить rAVV. В этом отношении, согласно другому конкретному варианту осуществления, способ проводят в биореакторе, соединенном с удерживающей клетки мембраной, так что клетки удерживаются внутри реакторной системы, в то время как AAV собирают посредством мембраны в чистом супернатанте, свободном от клеточного дебриса, и, следовательно, значительно упрощая очистку.

Для того чтобы они были особенно полезными для получения AAV для генной терапии, наиболее желательно, чтобы способы были «масштабируемыми», т.е. применимы в сочетании с крупномасштабными производственными устройствами и методиками.

В качестве иллюстрации, AAV могут быть загружены в положительно заряженную анионообменную колонку, как например, N-заряженная амино- или иминосмола (как например, POROS или любой DEAE, ТМАЕ, третичный или четвертичный амин или смола на основе PEI) или отрицательно заряженную катионообменную колонку (как, например, HS, SP, СМ или любая катионная смола на основе сульфо-, фосфо- или карбокси-). Колонку можно промыть буфером. Колонку можно элюировать градиентом увеличения концентрации NaCl или градиентом уменьшения значения рН, и фракции могут быть собраны и проанализированы на наличие AAV и/или загрязнителей.

Вместо или предпочтительно в дополнение к описанным выше методикам анионного и катионного обмена, можно использовать другие методики на основе межмолекулярных ассоциаций, опосредованных свойствами, отличными от заряда, как это известно в данной области техники. Такие другие методики включают межмолекулярные ассоциации на основе пар лиганд-рецептор (такие как взаимодействия антитело-антиген или лектин-углевод), а также разделения на основе других признаков молекул, как например, хроматография на молекулярном сите на основе размера и/или формы.

Пул фракций, содержащих AAV, элюированные из колонки, как описано выше, может быть сконцентрирован и очищен фильтрацией в тангенциальном потоке (TFF). Препарат фильтруют через мембрану, а продукт задерживают. Задержанное вещество можно подвергнуть диафильтрации с использованием мембраны с последовательными промывками подходящим буфером. Конечный образец весьма обогащен продуктом, его можно фильтровать и хранить для использования.

Трансфекция векторными плазмидами может происходить в день проведения посева клеток или может проводиться в первый, второй, третий, четвертый или пятый день после посева клеток в зависимости от плотности посева клеток.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения выбранные клетки-хозяева подвергают тройной трансфекций по меньшей мере одним вектором, кодирующим представляющую интерес гетерологичную нуклеотидную последовательность, по меньшей мере один вектор, кодирующий гены rep и cap AAV, и по меньшей мере одним вектором, кодирующим аденовирусные вспомогательные функциональные элементы. Согласно конкретному варианту осуществления тройную трансфекцию проводят с применением PEI трансфекций.

Упаковка последовательностей остова плазмиды (обратная упаковка) в ходе продукции rAAV посредством временной трансфекций является распространенной проблемой, хорошо известной в данной области техники. В контексте настоящего изобретения термин «обратная упаковка» относится к инкапсидации остова плазмиды, содержащей ITR, вместо гетерологичной последовательности. Действительно, для AAV векторов преобладающими видами упакованных примесей ДНК являются последовательности плазмиды, соседние с ITR, фланкирующими экспрессионную кассету, вероятно, генерируемые обратной упаковкой из ITR. Присутствие этих частиц в препаратах rAAV может представлять проблему безопасности для клинических применений.

Как показано в приведенном ниже примере 1, комбинация оптимизированных плазмид для трансфекций приводит к более высокому выходу, чем продукция со стандартными плазмидами, обычно используемыми для продукции AAV вектора, и более низкой обратной упаковке бактериальных последовательностей. В частности, авторы настоящего изобретения обнаружили, что когда клетки трансфицируют тремя плазмидными векторами, где первый плазмидный вектор i) содержит гетерологичную нуклеотидную последовательность, фланкированную ITR, и вставочную последовательность ДНК, расположенную вне указанных ITR, где указанная вставочная последовательность имеет длину от 4400 пар оснований до 4800 пар оснований, так что размер остова плазмиды составляет более 5 тысяч пар оснований, второй плазмидный вектор ii) содержит в направлении от 5' к 3' кодирующую область rep AAV, кодирующую область cap AAV и нуклеотидную последовательность, содержащую промоторную область р5 AAV, и третий плазмидный вектор iii) содержит аденовирусные хелперные функциональные элементы, включая последовательности VA-RNA, Е2А и Е4, где указанная плазмида не содержит последовательности Е3, рТВ(Е2В), ITR Ad и протеазы, продукция rAAV значительно повышается. В этом отношении, согласно показанным далее результатам, выход AAV увеличивается в три раза, когда комбинацию этих трех оптимизированных плазмид используют вместо комбинации стандартных плазмид. Более того, обратная упаковка также значительно снижается по сравнению с тройной трансфекцией с использованием стандартных плазмид, хорошо известных специалистам в данной области техники, т.е. некрупноразмерной плазмиды, содержащей гетерологичную нуклеотидную последовательность, вектора pRepCap, например, вектора pRepCap2, и плазмиды, содержащей аденовирусные последовательности, необходимые для продукции AAV (VA-RNA, Е2А и Е4). Как упоминается ранее, оптимизированная хелперная плазмида, используемая согласно настоящему изобретению, содержит аденовирусные хелперные функциональные элементы, включающие последовательности VA-RNA, Е2А и Е4, необходимые для продукции AAV. Указанная плазмида была модифицирована таким образом, что она не содержит последовательности, включающие последовательности Е3, рТВ(Е2В) и ITR Ad.

Как ясно показано на Фиг. 3, применение оптимизированной плазмиды, содержащей гетерологичную нуклеотидную последовательность, где указанной плазмидой является крупноразмерная плазмида, содержащая вставочную последовательность ДНК, не улучшает выход генома вектора при применении в комбинации с неоптимизированными плазмидами, т.е. со стандартными векторами, используемыми для тройной трансфекций. Таким образом, применение оптимизированной крупноразмерной плазмиды самой по себе не приводит к улучшению выхода генома вектора посредством тройной трансфекций.

Однако комбинация этой оптимизированной крупноразмерной плазмиды с оптимизированной плазмидой, содержащей аденовирусные хелперные функциональные элементы (pAdhelper861), или оптимизированной плазмидой, содержащей кодирующую область rep AAV и кодирующую область cap AAV (pRepCap9-809), улучшила выход генома вектора (см. Фиг. 3). Кроме того, когда три оптимизированных вектора объединены, выход генома вектора значительно увеличивается (см. Фиг. 3).

Более того, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили уменьшение обратной упаковки бактериальных последовательностей при проведении совместной трансфекций оптимизированной крупноразмерной плазмиды (pcohSgsh-900) либо с одной, либо с обоими оптимизированными хелперными плазмидами pRepCap9-809 и/или pAdhelper861 (Фиг. 4). В частности, применение тройной комбинации этих оптимизированных плазмид приводит к большему уменьшению обратной упаковки (Фиг. 4 и 5). Действительно, снижение процента бактериальных последовательностей посредством использования оптимизированных хелперных плазмид (pAdhelper861) и/или (pRepCap9-809) было более выраженным при совместной трансфекций с оптимизированной плазмидой, содержащей крупноразмерный остов (pcohSgsh-900) (Фиг. 5).

В контексте настоящего изобретения термин «крупноразмерный остов» относится к остову плазмиды с размеров, выраженным в парах оснований, выше предела инкапсидации AAV векторов (приблизительно 4700 пар оснований).

Согласно предпочтительному варианту осуществления указанный второй плазмидный вектор, применяемый в способе согласно настоящему изобретению, содержит кодирующие области Rep2 AAV и Сар9 AAV. Согласно предпочтительному варианту осуществления указанный плазмидный вектор представляет собой pRepCap-809 с номером доступа DSM 32969, как представлено в SEQ ID NO: 5.

Таким образом, согласно конкретному варианту осуществления способа согласно настоящему изобретению, на стадии а) применяют следующие три плазмидных вектора:

i) первый плазмидный вектор, содержащий гетерологичную нуклеотидную последовательность, фланкированную ITR, и вставочную последовательность ДНК, расположенную вне указанных ITR, где указанная вставочная последовательность имеет длину от 4400 пар оснований до 4800 пар оснований, так что размер остова плазмиды составляет более 5 тысяч пар оснований,

ii) второй плазмидный вектор, содержащий в направлении от 5' к 3' кодирующую область rep AAV, кодирующую область cap AAV и нуклеотидную последовательность, содержащую промоторную область р5 AAV, и

iii) третий плазмидный вектор, содержащий аденовирусные хелперные функциональные элементы, включающие последовательности VA-RNA, Е2А и Е4, где указанная плазмида не содержит последовательности Е3, рТВ(Е2В), ITR Ad и протеазы.

Согласно конкретному варианту осуществления вставочная последовательность ДНК расположена рядом с одним из ITR в первом плазмидном векторе, содержащем гетерологичную нуклеотидную последовательность.

Согласно другому конкретному варианту осуществления размер остова плазмиды составляет от 7000 пар оснований до 7500 пар оснований. Согласно более конкретному варианту осуществления размер остова плазмиды составляет от 7000 пар оснований до 7200 пар оснований.

Согласно предпочтительному варианту осуществления указанный первый плазмидный вектор не содержит нуклеотидную последовательность F1Ori в последовательности остова.

Согласно более предпочтительному варианту осуществления указанный первый плазмидный вектор представляет собой pcohSgsh-900 с номером доступа DSM 32967, как представлено в SEQ ID NO: 2.

Согласно другому варианту осуществления способа согласно настоящему изобретению возможно проводить повторную трансфекцию оставшихся клеток в клеточной культуре с двумя плазмидными векторами, так что продукция AAV может быть пролонгирована, как пояснено выше.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу согласно настоящему изобретению, в котором на стадии а) применяют следующие два плазмидных вектора:

i) первый плазмидный вектор, содержащий гетерологичную нуклеотидную последовательность, фланкированную ITR, и вставочную последовательность ДНК, расположенную вне указанных ITR, предпочтительно рядом с одним ITR, где указанная вставочная последовательность имеет длину от 4400 пар оснований до 4800 пар оснований, так что размер остова плазмиды составляет более 5 тысяч пар оснований, предпочтительно от 7000 пар оснований до 7500 пар оснований, более предпочтительно от 7000 пар оснований до 7200 пар оснований, и

ii) второй плазмидный вектор, содержащий кодирующую область гер AAV, кодирующую область cap AAV, нуклеотидную последовательность, содержащую промоторную область р5 AAV, и аденовирусные хелперные функциональные элементы, включающие последовательности VA-RNA, Е2А и Е4, где указанная плазмида не содержит последовательности Е3, рТВ(Е2В), ITR Ad и протеазы.

Согласно другому конкретному варианту осуществления указанный второй плазмидный вектор содержит в направлении от 5' к 3' аденовирусные хелперные функциональные элементы, включающие последовательности VA-RNA, Е2А и Е4, кодирующую область rep AAV, кодирующую область cap AAV, нуклеотидную последовательность, содержащую промоторную область р5 AAV.

Согласно конкретному варианту осуществления указанный первый плазмидный вектор не содержит нуклеотидную последовательность F1Ori в последовательности остова.

Согласно другому конкретному варианту осуществления указанный второй плазмидный вектор содержит кодирующие области Rep2 AAV и Сар9 AAV.

Как указано ранее, комбинация оптимизированных плазмид для трансфекций приводит к более высокому выходу, чем продукция со стандартными плазмидами, обычно используемыми для продукции AAV вектора, и более низкой обратной упаковке бактериальных последовательностей.

В приведенных ниже примерах показано, что когда продукцию rAAV проводят с применением i) плазмидного вектора, содержащего гетерологичную нуклеотидную последовательность, фланкированную ITR, ii) плазмидного вектора, содержащего в направлении от 5' к 3' кодирующую область rep AAV, кодирующую область cap AAV и нуклеотидную последовательность, содержащую промоторную последовательность р5 AAV, и iii) плазмидного вектора, содержащего аденовирусные хелперные функциональные элементы, включающие последовательности VA-RNA, Е2А и Е4, где указанная плазмида не содержит последовательности Е3, рТВ(Е2В), ITR Ad и протеазы, обратная упаковка значительно уменьшается, и, более того, продуктивность увеличивается по сравнению со стандартными плазмидами, используемыми для продукции AAV посредством тройной трансфекций.

Таким образом, согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу получения рекомбинантного AAV вектора, причем указанный способ предусматривает стадии:

а) совместной трансфекций подходящей клетки с

i) первым плазмидным вектором, содержащим гетерологичную нуклеотидную последовательность, фланкированную ITR,

ii) вторым плазмидным вектором, содержащим в направлении от 5' к 3' кодирующую область rep AAV, кодирующую область cap AAV и нуклеотидную последовательность, содержащую промоторную область р5 AAV, и

iii) третьим плазмидным вектором, содержащим аденовирусные хелперные функциональные элементы, включающие последовательности VA-RNA, Е2А и Е4, где указанная плазмида не содержит последовательности Е3, рТВ(Е2В), ITR Ad и протеазы,

b) культивирования указанной клетки в условиях, обеспечивающих репликацию и упаковку AAV, и

c) выделения AAV векторов, полученных на стадии b).

Согласно предпочтительному варианту осуществления указанный первый плазмидный вектор i) характеризуется тем, что размер остова плазмиды составляет более 5000 пар оснований, предпочтительно от 7000 пар оснований до 7500 пар оснований, более предпочтительно от 7000 пар оснований до 7200 пар оснований, и тем, что содержит вставочную последовательность ДНК, расположенную вне указанных ITR, предпочтительно рядом с одним из ITR, и где указанная вставочная последовательность имеет длину от 4400 пар оснований до 4800 пар оснований. Согласно более предпочтительному варианту осуществления указанный первый плазмидный вектор i) не содержит нуклеотидную последовательность F1Ori в последовательности остова. Согласно более предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения указанной первой плазмидой является pcohSgsh-900 с номером доступа DSM 32967, как представлено в SEQ ID NO: 2.

Согласно другом предпочтительному варианту осуществления указанный второй плазмидный вектор ii) содержит кодирующие области AAV Rep2 и AAV Сар9. Согласно предпочтительному варианту осуществления указанным плазмидным вектором является pRepCap-809 с номером доступа DSM 32969, как представлено в SEQ ID NO: 5.

Согласно другом предпочтительному варианту осуществления указанный третий плазмидный вектор iii) представляет собой pAdHelper861 с номером доступа DSM 32965, как представлено в SEQ ID NO: 6.

Как указано выше, согласно другому конкретному варианту осуществления настоящего изобретения стадию b) проводят посредством культивирования указанной клетки в суспензии во встряхиваемой жидкой среде.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится также к плазмидному вектору, содержащему:

a) гетерологичную нуклеотидную последовательность, фланкированную ITR, и

b) вставочную последовательность ДНК, расположенную вне указанных ITR и рядом с одним ITR, где указанная вставочная последовательность имеет длину от 4400 пар оснований до 4800 пар оснований, более предпочтительно от 4500 пар оснований до 4700 пар оснований, даже более предпочтительно от 4600 пар оснований до 4700 пар оснований, так что размер остова плазмиды составляет более 5 тысяч пар оснований, предпочтительно от 7000 пар оснований до 7500 пар оснований, более предпочтительно от 7000 пар оснований до 7200 пар оснований,

где указанный плазмидный вектор не содержит нуклеотидную последовательность F1Ori в последовательности остова. Согласно более предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения указанная плазмида представляет собой pcohSgsh-900 с номером доступа DSM 32967, как представлено в SEQ ID NO: 2.

Согласно другому конкретному аспекту настоящее изобретение относится к хелперному плазмидному вектору, содержащему аденовирусные последовательности Е2, Е4 и VA-RNA, где указанный плазмидный вектор не содержит последовательности Е3, рТВ(Е2В), ITR Ad и протеазы. Более конкретно, эта плазмида содержит область с размером 731 пар оснований, которая включает гены VA, область с размером 5346 пар оснований, которая содержит ген Е2А, и гены Е4 и их регуляторные области включены в фрагмент с размером 3181 пар оснований. Остов плазмиды содержит бактериальный ориджин репликации с высоким числом копий. Согласно более предпочтительному варианту осуществления настоящее изобретение относится к плазмидному вектору SEQ ID NO: 6, который соответствует pAdHelper861, задепонированному под номером доступа DSM 32965.

Применение rAAV для генной терапии

Вирусные векторы rAAV согласно настоящему изобретению можно использовать для введения индивидууму в целях генной терапии. Подходящие заболевания для генной терапии включают без ограничения заболевания, вызванные вирусными, бактериальными или паразитарными инфекциями, различными злокачественными новообразованиями и гиперпролиферативными состояниями, аутоиммунными состояниями и врожденными дефицитами. Согласно предпочтительному варианту осуществления rAAV векторы, полученные согласно способу согласно настоящему изобретению, применяют для лечения лизосомных болезней накопления (LSDs). Более предпочтительно, указанные векторы полезны для лечения мукополисахаридозов (MPS). Согласно предпочтительному варианту осуществления указанная гетерологичная нуклеотидная последовательность представляет собой последовательность, которая кодирует фермент, полезный для лечения MPS. В частности, указанная последовательность выбрана из группы, состоящей из α-L-идуронидазы человека, гепарансульфамидазы человека, N-сульфоглюкозаминсульфогидролазы человека, альфа N-ацетилглюкозаминидазы человека, гепаран-α-глюкозаминида человека, N-ацетилтрансферазы человека, идуронат-2-сульфатазы человека (IDS), N-ацетилглюкозамин-6-сульфатазы человека, галактоза-6-сульфаьсульфатазы человека, β-галактозидазы человека, N-ацетилгалактозамин-4-сульфатазы человека, β-глюкуронидазы и гиалуронидазы человека.

Генную терапию можно проводить для повышения уровня экспрессии конкретного белка внутри клетки или секретируемого клеткой. Векторы согласно настоящему изобретению можно использовать для генетического изменения клеток либо для маркировки гена, либо для замены отсутствующего или дефектного гена, либо для встраивания терапевтического гена. Альтернативно, в клетку может быть введен полинуклеотид, который снижает уровень экспрессии. Это может быть использовано для подавления нежелательного фенотипа, такого как продукт гена, амплифицируемого или сверхэкспрессируемого в ходе злокачественного новообразования, или гена, введенного или сверхэкспрессируемого в ходе микробной инфекции. Уровни экспрессии могут быть снижены путем введения терапевтического полинуклеотида, содержащего последовательность, способную, например, образовывать стабильный гибрид либо с целевым геном, либо с транскриптом РНК (антисмысловая терапия), способного действовать как рибозим для расщепления релевантной мРНК или способного действовать как ловушка для продукта целевого гена.

Фармацевтические композиции могут поставляться в виде жидких растворов или суспензий, эмульсий или твердых форм, подходящих для растворения или суспендирования в жидкости перед применением. Носитель представляет собой, например, воду или забуференный физиологический раствор с консервантом или без него.

Фармацевтические композиции могут быть лиофилизированы для повторного суспендирования в момент введения или могут быть в виде раствора. Согласно предпочтительному варианту осуществления фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению представляет собой суспензию для инъекций. Затем готовый продукт готовят в подходящем буфере, заполняют им флаконы и хранят до использования.

Хотя это и не требуется, фармацевтические композиции необязательно могут поставляться в виде стандартной лекарственной формы, подходящей для введения точного количества.

После приведенного описания настоящего изобретения в общих чертах далее приведены примеры, облегчающие понимание настоящего изобретения, которые представлены в качестве иллюстрации и никоим образом не предназначены для ограничения настоящего изобретения.

Примеры

При практическом осуществлении настоящего изобретения будут использоваться, если не указано иное, стандартные методы молекулярной биологии, вирусологии, культивирования клеток животных и биохимии, которые находятся в пределах компетенции специалиста в данной области техники. Такие методы полностью описаны в литературе.

Пример 1. Тройная трансфекция с применением стандартных плазмидных векторов по сравнению с оптимизированными векторами

1.1. Описание плазмид

Плазмида pcohSgsh-827 (SEQ ID NO: 1)

Плазмида, содержащая кодон-оптимизированную кДНК с размером 1512 пар оснований, которая кодирует N-сульфоглюкозаминсульфогидролазу человека, под контролем промотора С AG с размером 1756 пар оснований, и фрагмент, соответствующий рА b-глобина кролика, с размером 519 пар оснований. Эти три элемента фланкированы последовательностями ITR AAV 2. Размер остова плазмиды составляет 3156 пар оснований (стандартный размер остова), и остов содержит ген резистентности к ампициллину с размером 966 пар оснований, бактериофаговый ориджин репликации с размером 514 пар оснований и бактериальный ориджин репликации с высоким числом копий с размером 589 пар оснований.

Плазмида pcohSgsh-900 (SEQ ID NO: 2)

Крупноразмерная плазмида, содержащая кодон-оптимизированную кДНК с размером 1512 пар оснований, которая кодирует N-сульфоглюкозаминсульфогидролазу человека, под контролем промотора CAG с размером 1756 пар оснований, и фрагмент, соответствующий рА b-глобина кролика, с размером 519 пар оснований. Эти три элемента фланкированы последовательностями ITR AAV 2. Размер остова плазмиды составляет 7073 пар оснований, и остов содержит ген резистентности к канамицину с размером 1043 пар оснований, бактериальный ориджин репликации с высоким числом копий с размером 589 пар оснований и дополнительно содержит случайную последовательность с размером 4657 пар оснований.

Плазмида pohIDS-874 (SEQ ID NO: 3)

Крупноразмерная плазмида, содержащая кодон-оптимизированную кДНК с размером 1653 пар оснований, которая кодирует идуронат-2-сульфатазу человека под контролем промотора CAG с размером 1756 пар оснований, и фрагмент, соответствующий рА b-глобина кролика, с размером 519 пар оснований. Эти три элемента фланкированы последовательностями ITR AAV 2. Размер остова плазмиды составляет 7073 пар оснований, и остов содержит ген резистентности к канамицину с размером 1043 пар оснований, бактериальный ориджин репликации с высоким числом копий с размером 589 пар оснований и дополнительно содержит случайную последовательность с размером 4657 пар оснований.

Плазмида pRepCap9-808 (SEQ ID NO: 4)

Плазмида, кодирующая белки rep2 и сар9 с промотором Р5 в его исходном положении. Эта плазмида включает фрагмент, соответствующий гену Rep AAV2, с размером 1866 пар оснований, за которым следует последовательность с размером 2211 пар оснований, кодирующая ген Cap AAV9. Промотор Р5 AAV2 с размером 130 пар оснований расположен в его исходном положении выше по ходу транскрипции от гена Rep.Остов плазмиды содержит ген резистентности к ампициллину и бактериальный ориджин репликации с высоким числом копий.

Плазмида pRepCap9-809 (SEQ ID NO: 5)

Плазмида, кодирующая белки rep2 и сар9 с промотором Р5 после гена Сар9. Эта плазмида включает фрагмент, соответствующий гену Rep AAV2, с размером 1866 пар оснований, за которым следует последовательность с размером 2211 пар оснований, кодирующая ген Cap AAV9. Последовательность с размером 130 пар оснований, соответствующая промотору Р5 AAV2, расположена ниже по ходу транскрипции от гена Сар. Остов плазмиды содержит ген резистентности к канамицину и бактериальный ориджин репликации с высоким числом копий.

Плазмида рХХ6

Плазмида, содержащая аденовирусные последовательности (Е2, Е4 и VA-RNA), которые необходимы для продукции AAV. Остов плазмиды содержит ген резистентности к ампициллину и бактериальный ориджин репликации с высоким числом копий (Xiao et al. J Virol. 1998 Mar; 72(3): 2224-2232). Плазмида pXX6-80 происходит из рХХ6, где был изменен только остов. Карта и последовательность рХХ6-80 хорошо описаны в литературе.

Плазмида pAdHelper861 (SEQ ID NO: 6)

Плазмида, содержащая аденовирусные последовательности (Е2, Е4 и VA-RNA), которые необходимы для продукции AAV. Она содержит область с размером 731 пар оснований, которая включает гены VA, область с размером 5346 пар оснований, которая включает гены Е2А, и гены Е4 и их регуляторные области включены в фрагмент с размером 3181 пар оснований. Остов плазмиды содержит ген резистентности к канамицину и бактериальный ориджин репликации с высоким числом копий.

1.2. Получение вектора AAV9-CAG-cohSgsh посредством тройной трансфекций

Материалы и способы

Векторы AAV9-CAG-cohSgsh получали посредством временной тройной трансфекций с применением PEI-MAX в качестве трансфицирующего агента, как описано ранее (Ayuso Е, et al. Gene Ther. 2010 Apr; 17(4):503-10). Кратко, прилипающие клетки HEK293 при конфлюентности трансфицировали эквимолярными количества трех плазмид: pcohSgsh-827, pRepCap9-808 и рХХ6 (стандартные плазмиды) или pcohSgsh-900, pRepCap9-809 и pAdHelper861 (оптимизированные плазмиды). PEI-MAX применяли при соотношении PEI:ДНК, равном 2:1. Клетки собирали через 72 часа после трансфекций и лизировали посредством трех циклов замораживания и оттаивания с высвобождением rAAV векторов изнутри клеток (см. Пример 2 ниже). Продукция rAAV векторов с применением суспензионных клеток HEK293 также была описана (Joshua С Grieger, et al. Mol Ther. 2016 Feb; 24(2):287-297).

Геномы векторов оценивали количественно с помощью кПЦР Taqman, как описано ранее (Ayuso et al., цитируется выше), с использованием праймеров и зонда, специфичных для последовательности поли-А бета-глобина кролика, присутствующей в экспрессионной кассете. Кроме того, обратную упаковку определяли количественно с помощью кПЦР Taqman с использованием праймеров и зонда, специфичных для последовательности промотора резистентности к антибиотикам, присутствующей во всех используемых остовах плазмид.

Статистический анализ проводили с применением GraphPad Prism 7.00.

Результаты

Получение рекомбинантных векторов AAV9 AAV9-CAG-cohSgsh путем тройной трансфекции с использованием оптимизированных плазмид, как описано выше, приводит к более высокому выходу, чем продукция со стандартными плазмидами, обычно используемыми для получения вектора AAV (Фиг. 1).

Векторы AAV9-CAG-cohSgsh, полученные посредством тройной трансфекции оптимизированными плазмидами, приводят к более низкой обратной упаковке бактериальных последовательностей, чем обратная упаковка, полученная со стандартными плазмидами, обычно используемыми для продукции AAV (Фиг. 2).

Применение оптимизированной плазмиды, содержащей гетерологичную нуклеотидную последовательность, где указанная плазмида представляет собой крупноразмерную плазмиду, содержащую вставочную последовательность ДНК (pcohSgsh-900), не улучшает выход генома вектора при использовании для тройной трансфекции в комбинации с неоптимизированными плазмидами, т.е. со стандартными векторами, используемыми для тройных трансфекции. Таким образом, использование только одной оптимизированной крупноразмерной плазмиды не приводит к улучшению выхода генома вектора путем тройной трансфекции (Фиг. 3).

Однако комбинация этой оптимизированной крупноразмерной плазмиды с оптимизированной плазмидой, содержащей аденовирусные хелперные функциональные элементы, (pAdhelper861) или оптимизированной плазмидой, содержащей кодирующую область rep AAV и кодирующую область cap AAV, (pRepCap9-809) улучшает выход генома вектора (см. Фиг. 3). Кроме того, когда три оптимизированных вектора присутствуют в комбинации, выход генома вектора значительно увеличивается (см. Фиг. 3).

Более того, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что происходит уменьшение обратной упаковки бактериальных последовательностей при совместной трансфекции оптимизированной крупноразмерной плазмидой (pcohSgsh-900) либо с одной, либо с обеими оптимизированными хелперными плазмидами pRepCap9-809 и/или pAdhelper861 (Фиг. 4). В частности, применение тройной комбинации этих оптимизированных плазмид приводит к большему уменьшению обратной упаковки (Фиг. 4 и 5). Действительно, уменьшение процента бактериальных последовательностей посредством применения оптимизированных хелперных плазмид (pAdhelper861 и/или pRepCap9-809) было более выраженным при совместной трансфекции с оптимизированной плазмидой, содержащей крупноразмерный остов (pcohSgsh-900) (Фиг. 5).

Пример 2. Тройная трансфекция и увеличенная генная экспрессия (EGE)

2.1. Клеточная линия, среды и условия культивирования

Используемой клеточной линией была бессывороточная адаптированная для суспензии клеточная линия HEK 293 (НЕK 293SF-3F6), предоставленная Biotechnology Research Institute of National Research Council of Canada (Монреаль, Канада). Клетки культивировали в среде Freestyle F17 (Invitrogen, Carlsbad, СА) с добавлением 8 мМ Glutamax, 0,1% Pluronic1 (Invitrogen) и 0,05 нг/л IGF. Клетки хранили обычным образом в одноразовых поликарбонатных колбах Эрленмейера объемом 125 мл (Corning, Steuben, NY) в 20 мл культуральной среды. Колбы встряхивали при 130 оборотах в минуту, используя орбитальный встряхиватель (Kuhner shakers, Switzerland), помещенный в инкубатор, поддерживаемый при 37°С в увлажненной атмосфере с 5% СО₂ в воздухе. Количество и жизнеспособность клеток определяли с помощью Nucleocounter NC-3000 (Chemometec, Denmark).

2.2. Временная трансфекция (TGE)

Суспензионные клетки HEK 293 временно трансфицировали с использованием PEIPro (Polysciences, Warrington, РА). Клетки HEK 293 высеивали при 0,5×10⁶ клеток/мл в одноразовые колбы объемом 125 мл, выращивали до 2×10⁶ клеток/мл и трансфицировали с использованием 0,76 мкг pAdHelper861/мл культуры, 0,77 мкг pRepCap9-809/мл культуры и 0,38 мкг pohIDS-874/мл или 0,38 мкг pcohSgsh-900/мл культуры, при использовании массового соотношения ДНК и PEI, равного 1:2. Комплексы PEI/ДНК получали путем быстрого добавления PEI к ДНК, оба разбавленных в свежей культуральной среде для достижения одинакового объема (объем сложной смеси составлял 5% от общего объема культуры, подлежащей трансфекции). Смесь инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре, обеспечивая образование комплекса перед добавлением в клеточную культуру.

2.3. Стратегия увеличенной генной экспрессии для гена coh-IDS

Стратегия получения увеличенной генной экспрессии (EGE) состоит в проведении повторных раундов трансфекций с достижением с течением времени устойчивого уровня экспрессии гена, в отличие от обычного подхода TGE, который предусматривает единственный раунд трансфекции. После первой трансфекции с использованием тех же плазмид и условий, которые описаны выше в части 2.2., раунды повторной трансфекции выполняли каждые 48 часов с использованием тех же концентраций плазмид и PEI после полной замены среды, выполненной центрифугированием (при 300xg в течение 5 минут). При выполнении этих замен среды AAV секретируются в супернатант культуры и могут быть собраны каждый раз при замене среды перед каждым проведением повторной трансфекции.

Результаты показывают (см. Фиг. 3) 3-кратное увеличение общего геном вектора, собранного из супернатанта при выполнении стратегии EGE. Общий геном вектора, выделенный после серии (однократная трансфекция), составлял геном вектора 8Е11, полученный после клеточного лизиса. Общий геном вектора, выделенный после стратегии EGE, составлял геном вектора 2,5Е12 из супернатанта, что является преимуществом с точки зрения очистки, поскольку клетки не нужно лизировать для сбора AAV, и, таким образом, ожидается меньшее загрязнение ДНК клетки-хозяина и белком клетки-хозяина.

2.4. Стратегия увеличенной генной экспрессии для гена coh-Sgsh

Стратегию EGE протестировали для гена coh-Sgsh, как пояснено выше в части 2.3.

Результаты показывают (см. Фиг. 4) 1,7-кратное увеличение общего геном вектора, собранного из супернатанта при выполнении стратегии EGE. Общий геном вектора, выделенный после серии (однократная трансфекция), составлял геном вектора 1,9Е12, полученный после клеточного лизиса. Общий геном вектора, выделенный после стратегии EGE, составлял геном вектора 3,18Е12 из супернатанта. Продукцию AAV проводили согласно подобным моделям, что и для phIDS (см. часть 2.3 выше), таким образом, подтверждая общую применимость стратегии EGE.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ЭСТЕВ ФАРМАСЬЮТИКАЛС, С.A

УНИВЕРСИТАТ АУТОНОМА ДЕ БАРСЕЛОНА

<120> СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ ВИРУСНЫХ ВЕКТОРОВ

<130> ESTA-1818-WO

<150> EP19382220.2

<151> 2019-03-28

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7771

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Плазмида pcohSgsh-827

<400> 1

gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt 60

tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca actccatcac 120

taggggttcc ttgtagttaa tgattaaccc gccatgctac ttatctactc gacattgatt 180

attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga 240

gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg 300

cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg 360

acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca 420

tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc 480

ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc 540

tattaccatg gtcgaggtga gccccacgtt ctgcttcact ctccccatct cccccccctc 600

cccaccccca attttgtatt tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga tgggggcggg 660

gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag 720

gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc 780

gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgg gagtcgctgc 840

gcgctgcctt cgccccgtgc cccgctccgc cgccgcctcg cgccgcccgc cccggctctg 900

actgaccgcg ttactcccac aggtgagcgg gcgggacggc ccttctcctc cgggctgtaa 960

ttagcgcttg gtttaatgac ggcttgtttc ttttctgtgg ctgcgtgaaa gccttgaggg

1020

gctccgggag ggccctttgt gcggggggag cggctcgggg ggtgcgtgcg tgtgtgtgtg

1080

cgtggggagc gccgcgtgcg gctccgcgct gcccggcggc tgtgagcgct gcgggcgcgg

1140

cgcggggctt tgtgcgctcc gcagtgtgcg cgaggggagc gcggccgggg gcggtgcccc

1200

gcggtgcggg gggggctgcg aggggaacaa aggctgcgtg cggggtgtgt gcgtgggggg

1260

gtgagcaggg ggtgtgggcg cgtcggtcgg gctgcaaccc cccctgcacc cccctccccg

1320

agttgctgag cacggcccgg cttcgggtgc ggggctccgt acggggcgtg gcgcggggct

1380

cgccgtgccg ggcggggggt ggcggcaggt gggggtgccg ggcggggcgg ggccgcctcg

1440

2

ggccggggag ggctcggggg aggggcgcgg cggcccccgg agcgccggcg gctgtcgagg

1500

cgcggcgagc cgcagccatt gccttttatg gtaatcgtgc gagagggcgc agggacttcc

1560

tttgtcccaa atctgtgcgg agccgaaatc tgggaggcgc cgccgcaccc cctctagcgg

1620

gcgcggggcg aagcggtgcg gcgccggcag gaaggaaatg ggcggggagg gccttcgtgc

1680

gtcgccgcgc cgccgtcccc ttctccctct ccagcctcgg ggctgtccgc ggggggacgg

1740

ctgccttcgg gggggacggg gcagggcggg gttcggcttc tggcgtgtga ccggcggctc

1800

tagagcctct gctaaccatg ttcatgcctt cttctttttc ctacagctcc tgggcaacgt

1860

gctggttatt gtgctgtctc atcattttgg caaagaattg attaattcga gcgaacgcgt

1920

gccaccatga gctgccctgt gcccgcctgt tgtgccctgc tgctggtgct gggactgtgc

1980

agagccagac cccggaacgc tctgctgctg ctggccgacg atggcggatt tgagagcggc

2040

gcctacaaca acagcgccat tgccacccct catctggacg ccctggccag aagaagcctg

2100

ctgttccgga acgccttcac cagcgtgtcc agctgcagcc ctagcagagc ttccctgctg

2160

acaggcctgc cccagcatca gaatggcatg tacggcctgc accaggatgt gcatcacttc

2220

aacagcttcg acaaagtgcg gagcctgcca ctgctcctgt cacaggctgg cgtgagaacc

2280

ggcatcatcg gcaagaaaca cgtgggcccc gagacagtgt accccttcga cttcgcctac

2340

accgaagaga acggcagcgt gctgcaggtc ggccggaaca tcacccggat caagctgctc

2400

gtgcggaagt ttctccagac ccaggacgac cggcccttct tcctgtacgt ggccttccac

2460

gaccctcaca gatgcggcca cagccagccc cagtacggca ccttctgcga gaagttcggc

2520

aacggcgaga gcggcatggg cagaatcccc gactggaccc cccaggcata cgaccctctg

2580

gacgtgctgg tgccctactt cgtgcccaac acccctgccg ccagagctga tctggccgcc

2640

cagtacacca ccgtgggcag aatggatcag ggcgtgggcc tggtgctgca ggaactgagg

2700

gacgctggcg tgctgaacga caccctggtc atcttcacct ccgacaacgg catcccattc

2760

cccagcggcc ggaccaatct gtactggccc ggcacagccg aacctctgct ggtgtccagc

2820

cccgagcacc ctaagagatg gggccaggtg tccgaggcct acgtgtccct gctggacctg

2880

acccccacca tcctggactg gttcagcatc ccctacccca gctacgccat ctttggaagc

2940

aagaccatcc acctgaccgg cagatctctg ctgcctgccc tggaagctga gcctctgtgg

3000

gccaccgtgt tcggcagcca gagccaccac gaagtgacca tgagctaccc catgcggagc

3060

gtgcagcacc ggcacttccg gctggtgcac aacctgaact tcaagatgcc cttcccaatc

3120

gaccaggact tttacgtgtc ccccaccttc caggacctgc tgaacagaac cacagccggc

3180

cagcccaccg gctggtacaa ggacctgcgg cactactact accgggccag atgggagctg

3240

tacgacagaa gccgggaccc ccacgagaca cagaacctgg ccaccgaccc cagattcgcc

3300

cagctcctgg aaatgctgcg ggaccagctg gccaagtggc agtgggagac acacgaccct

3360

tgggtctgcg ctcccgacgg cgtgctggaa gagaagctgt ccccccagtg ccagccactg

3420

cacaacgagc tgtgatgaga attcgagctc ggtacccggg aatcaattca ctcctcaggt

3480

gcaggctgcc tatcagaagg tggtggctgg tgtggccaat gccctggctc acaaatacca

3540

ctgagatctt tttccctctg ccaaaaatta tggggacatc atgaagcccc ttgagcatct

3600

3

gacttctggc taataaagga aatttatttt cattgcaata gtgtgttgga attttttgtg

3660

tctctcactc ggaaggacat atgggagggc aaatcattta aaacatcaga atgagtattt

3720

ggtttagagt ttggcaacat atgcccatat gctggctgcc atgaacaaag gttggctata

3780

aagaggtcat cagtatatga aacagccccc tgctgtccat tccttattcc atagaaaagc

3840

cttgacttga ggttagattt tttttatatt ttgttttgtg ttattttttt ctttaacatc

3900

cctaaaattt tccttacatg ttttactagc cagatttttc ctcctctcct gactactccc

3960

agtcatagct gtccctcttc tcttatggag atccctcgac ctgcagccca agctgtagat

4020

aagtagcatg gcgggttaat cattaactac aaggaacccc tagtgatgga gttggccact

4080

ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgggcgac caaaggtcgc ccgacgcccg

4140

ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gctgcattaa tgaatcggcc

4200

aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact

4260

cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac

4320

ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa

4380

aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg

4440

acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa

4500

gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc

4560

ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac

4620

gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac

4680

cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg

4740

taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt

4800

atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa

4860

cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct

4920

cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga

4980

ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg

5040

ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct

5100

tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt

5160

aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc

5220

tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg

5280

gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag

5340

atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt

5400

tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag

5460

ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt

5520

ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca

5580

tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg

5640

ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat

5700

ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta

5760

4

tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca

5820

gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct

5880

taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat

5940

cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa

6000

agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt

6060

gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa

6120

ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa

6180

ccattattat catgacatta acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc tttcgtctcg

6240

cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag acggtcacag

6300

cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttg

6360

gcgggtgtcg gggctggctt aactatgcgg catcagagca gattgtactg agagtgcacc

6420

atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc aggcgattcc

6480

aacatccaat aaatcataca ggcaaggcaa agaattagca aaattaagca ataaagcctc

6540

agagcataaa gctaaatcgg ttgtaccaaa aacattatga ccctgtaata cttttgcggg

6600

agaagccttt atttcaacgc aaggataaaa atttttagaa ccctcatata ttttaaatgc

6660

aatgcctgag taatgtgtag gtaaagattc aaacgggtga gaaaggccgg agacagtcaa

6720

atcaccatca atatgatatt caaccgttct agctgataaa ttcatgccgg agagggtagc

6780

tatttttgag aggtctctac aaaggctatc aggtcattgc ctgagagtct ggagcaaaca

6840

agagaatcga tgaacggtaa tcgtaaaact agcatgtcaa tcatatgtac cccggttgat

6900

aatcagaaaa gccccaaaaa caggaagatt gtataagcaa atatttaaat tgtaagcgtt

6960

aatattttgt taaaattcgc gttaaatttt tgttaaatca gctcattttt taaccaatag

7020

gccgaaatcg gcaaaatccc ttataaatca aaagaataga ccgagatagg gttgagtgtt

7080

gttccagttt ggaacaagag tccactatta aagaacgtgg actccaacgt caaagggcga

7140

aaaaccgtct atcagggcga tggcccacta cgtgaaccat caccctaatc aagttttttg

7200

gggtcgaggt gccgtaaagc actaaatcgg aaccctaaag ggagcccccg atttagagct

7260

tgacggggaa agccggcgaa cgtggcgaga aaggaaggga agaaagcgaa aggagcgggc

7320

gctagggcgc tggcaagtgt agcggtcacg ctgcgcgtaa ccaccacacc cgccgcgctt

7380

aatgcgccgc tacagggcgc gtactatggt tgctttgacg agcacgtata acgtgctttc

7440

ctcgttagaa tcagagcggg agctaaacag gaggccgatt aaagggattt tagacaggaa

7500

cggtacgcca gaatcctgag aagtgttttt ataatcagtg aggccaccga gtaaaagagt

7560

ctgtccatca cgcaaattaa ccgttgtcgc aatacttctt tgattagtaa taacatcact

7620

tgcctgagta gaagaactca aactatcggc cttgctggta atatccagaa caatattacc

7680

gccagccatt gcaacggaat cgccattcgc cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc

7740

gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc a 7771

<210> 2

<211> 11255

5

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Плазмида pcohSgsh-900

<400> 2

attacgccag ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg 60

ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa 120

ctccatcact aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctactcg 180

acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc 240

atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa 300

cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac 360

tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca 420

agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg 480

gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt 540

agtcatcgct attaccatgg tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc 600

ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat 660

gggggcgggg gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg 720

cggggcgagg cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc 780

ttttatggcg aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg 840

agtcgctgcg cgctgccttc gccccgtgcc ccgctccgcc gccgcctcgc gccgcccgcc 900

ccggctctga ctgaccgcgt tactcccaca ggtgagcggg cgggacggcc cttctcctcc 960

gggctgtaat tagcgcttgg tttaatgacg gcttgtttct tttctgtggc tgcgtgaaag

1020

ccttgagggg ctccgggagg gccctttgtg cggggggagc ggctcggggg gtgcgtgcgt

1080

gtgtgtgtgc gtggggagcg ccgcgtgcgg ctccgcgctg cccggcggct gtgagcgctg

1140

cgggcgcggc gcggggcttt gtgcgctccg cagtgtgcgc gaggggagcg cggccggggg

1200

cggtgccccg cggtgcgggg ggggctgcga ggggaacaaa ggctgcgtgc ggggtgtgtg

1260

cgtggggggg tgagcagggg gtgtgggcgc gtcggtcggg ctgcaacccc ccctgcaccc

1320

ccctccccga gttgctgagc acggcccggc ttcgggtgcg gggctccgta cggggcgtgg

1380

cgcggggctc gccgtgccgg gcggggggtg gcggcaggtg ggggtgccgg gcggggcggg

1440

gccgcctcgg gccggggagg gctcggggga ggggcgcggc ggcccccgga gcgccggcgg

1500

ctgtcgaggc gcggcgagcc gcagccattg ccttttatgg taatcgtgcg agagggcgca

1560

gggacttcct ttgtcccaaa tctgtgcgga gccgaaatct gggaggcgcc gccgcacccc

1620

ctctagcggg cgcggggcga agcggtgcgg cgccggcagg aaggaaatgg gcggggaggg

1680

ccttcgtgcg tcgccgcgcc gccgtcccct tctccctctc cagcctcggg gctgtccgcg

1740

gggggacggc tgccttcggg ggggacgggg cagggcgggg ttcggcttct ggcgtgtgac

1800

cggcggctct agagcctctg ctaaccatgt tcatgccttc ttctttttcc tacagctcct

1860

gggcaacgtg ctggttattg tgctgtctca tcattttggc aaagaattga ttaattcgag

1920

cgaacgcgtg ccaccatgag ctgccctgtg cccgcctgtt gtgccctgct gctggtgctg

1980

6

ggactgtgca gagccagacc ccggaacgct ctgctgctgc tggccgacga tggcggattt

2040

gagagcggcg cctacaacaa cagcgccatt gccacccctc atctggacgc cctggccaga

2100

agaagcctgc tgttccggaa cgccttcacc agcgtgtcca gctgcagccc tagcagagct

2160

tccctgctga caggcctgcc ccagcatcag aatggcatgt acggcctgca ccaggatgtg

2220

catcacttca acagcttcga caaagtgcgg agcctgccac tgctcctgtc acaggctggc

2280

gtgagaaccg gcatcatcgg caagaaacac gtgggccccg agacagtgta ccccttcgac

2340

ttcgcctaca ccgaagagaa cggcagcgtg ctgcaggtcg gccggaacat cacccggatc

2400

aagctgctcg tgcggaagtt tctccagacc caggacgacc ggcccttctt cctgtacgtg

2460

gccttccacg accctcacag atgcggccac agccagcccc agtacggcac cttctgcgag

2520

aagttcggca acggcgagag cggcatgggc agaatccccg actggacccc ccaggcatac

2580

gaccctctgg acgtgctggt gccctacttc gtgcccaaca cccctgccgc cagagctgat

2640

ctggccgccc agtacaccac cgtgggcaga atggatcagg gcgtgggcct ggtgctgcag

2700

gaactgaggg acgctggcgt gctgaacgac accctggtca tcttcacctc cgacaacggc

2760

atcccattcc ccagcggccg gaccaatctg tactggcccg gcacagccga acctctgctg

2820

gtgtccagcc ccgagcaccc taagagatgg ggccaggtgt ccgaggccta cgtgtccctg

2880

ctggacctga cccccaccat cctggactgg ttcagcatcc cctaccccag ctacgccatc

2940

tttggaagca agaccatcca cctgaccggc agatctctgc tgcctgccct ggaagctgag

3000

cctctgtggg ccaccgtgtt cggcagccag agccaccacg aagtgaccat gagctacccc

3060

atgcggagcg tgcagcaccg gcacttccgg ctggtgcaca acctgaactt caagatgccc

3120

ttcccaatcg accaggactt ttacgtgtcc cccaccttcc aggacctgct gaacagaacc

3180

acagccggcc agcccaccgg ctggtacaag gacctgcggc actactacta ccgggccaga

3240

tgggagctgt acgacagaag ccgggacccc cacgagacac agaacctggc caccgacccc

3300

agattcgccc agctcctgga aatgctgcgg gaccagctgg ccaagtggca gtgggagaca

3360

cacgaccctt gggtctgcgc tcccgacggc gtgctggaag agaagctgtc cccccagtgc

3420

cagccactgc acaacgagct gtgatgagaa ttcgagctcg gtacccggga atcaattcac

3480

tcctcaggtg caggctgcct atcagaaggt ggtggctggt gtggccaatg ccctggctca

3540

caaataccac tgagatcttt ttccctctgc caaaaattat ggggacatca tgaagcccct

3600

tgagcatctg acttctggct aataaaggaa atttattttc attgcaatag tgtgttggaa

3660

ttttttgtgt ctctcactcg gaaggacata tgggagggca aatcatttaa aacatcagaa

3720

tgagtatttg gtttagagtt tggcaacata tgcccatatg ctggctgcca tgaacaaagg

3780

ttggctataa agaggtcatc agtatatgaa acagccccct gctgtccatt ccttattcca

3840

tagaaaagcc ttgacttgag gttagatttt ttttatattt tgttttgtgt tatttttttc

3900

tttaacatcc ctaaaatttt ccttacatgt tttactagcc agatttttcc tcctctcctg

3960

actactccca gtcatagctg tccctcttct cttatggaga tccctcgacc tgcagcccaa

4020

gctgtagata agtagcatgg cgggttaatc attaactaca aggaacccct agtgatggag

4080

ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc

4140

7

cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag ctgcattaat

4200

gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc

4260

tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg

4320

cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag

4380

gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc

4440

gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag

4500

gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga

4560

ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc

4620

atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg

4680

tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt

4740

ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca

4800

gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca

4860

ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag

4920

ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca

4980

agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg

5040

ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa

5100

aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta

5160

tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag

5220

cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga

5280

tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accggggtta acgcgaattt

5340

taacaaaata ttaacgctta caatttaggt ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc

5400

cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc

5460

tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga ttgaacagga tggcctgcat

5520

gcgggtagcc cggcagcgtg ggtggaacgt ctgtttggct atgattgggc gcagcagacc

5580

attggctgct ctgatgcggc ggtgtttcgt ctgagcgcgc agggtcgtcc ggtgctgttt

5640

gtgaaaaccg atctgagcgg tgcgctgaac gagctgcagg atgaagcggc gcgtctgagc

5700

tggctggcca ccaccggtgt tccgtgtgcg gcggtgctgg atgtggtgac cgaagcgggc

5760

cgtgattggc tgctgctggg cgaagtgccg ggtcaggatc tgctgtctag ccatctggcg

5820

ccggcagaaa aagtgagcat tatggcggat gccatgcgtc gtctgcatac cctggacccg

5880

gcgacctgtc cgtttgatca tcaggcgaaa catcgtattg aacgtgcgcg tacccgtatg

5940

gaagcgggcc tggtggatca ggatgatctg gatgaagaac atcagggcct ggcaccggca

6000

gagctgtttg cgcgtctgaa agcgagcatg ccggatggcg aagatctggt ggtgacccat

6060

ggtgatgcgt gcctgccgaa cattatggtg gaaaatggcc gttttagcgg ctttattgat

6120

tgcggccgtc tgggcgtggc ggatcgttat caggatattg cgctggccac ccgtgatatt

6180

gcggaagaac tgggcggcga atgggcggat cgttttctgg tgctgtatgg cattgcggca

6240

ccggatagcc agcgtattgc gttttatcgt ctgctggatg aatttttcta ataactgtca

6300

8

gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaaca

6360

attggatggg caattggata tcgtcatctt tgagacacaa tctcccacct cactggaatt

6420

tagttcctgc tataattagc cttcctcata agttgcacta cttcagcgtc ccatatgcac

6480

ccttaccacg aagacaggtt tgtccaatcc catattgcga ccttggcagg gggttcgcaa

6540

gtcccacccg aaacgttgct gaaggctcag gtttctgagc gacaaaaggt taatacgcga

6600

gttcccgctc ataacctgga ccgaatgcgg aatcatgcat cgttccactg tgtttgtctc

6660

atgtaggacg ggcgcaaagc atacttagtt caatcttgaa taccttatat tattgtacac

6720

ctaccggtca ccagccaaca atgtgcggac ggcgttgcaa ctttcagggc ctaatctgac

6780

cgttgtagat accgcactct gggcaatacg aggtaatgcc agtcacccag tgtcgaacaa

6840

cacctgacct aacggtaaga ggctcacata atggctctgc cggcgtgccc agggtatatt

6900

aggtcagcat cagatggact gacatgaatc tttacaccga agcggaaacg ggtgcgtgga

6960

ctagcgagga gcaaacgaaa attcctggcc tgcttgatgt ctcgtaatct tcttagagat

7020

ggacgaaatg tttcacgacc taggaaaagg tcgccctaca aaatagattt gcgttactct

7080

cttcatagga tccccggtgt agcgaaagat caaggcgacc ctaggtagca accgccggct

7140

tcggcggtaa ggtatcactc aagaagcaga ctcagtaaga cacggtctag ctgactgtct

7200

atcgcctagg tcaaataggg agctttgatt ctgcatgtcc agctttagat tcactttagc

7260

gcgcagatct gggtcgagat aaaatcacca gtacccaaga ccaggggggc tcgccgcgtt

7320

ggctaatcct ggtacatctt gtaatgaata ttcagtagaa aatttgtgtt agaaggacga

7380

gtcaccatgt accaaaagcg ataacgatcg gtgggagtat tcattgtggt gaagacgctg

7440

ggtttacgtg ggaaaggtgc ttgtgtccca acaggctagg atataatgct gaagcccttc

7500

cccaagcgtt cagggtggga tttgctacaa cttccgagtc caacgtgtcc gtgttcatgt

7560

tatatatgca caaggccgag aattggacgt agctttcgtg ttagtacgta gcatggtcac

7620

acaagcacag tagatcctgc ccgcgcatcc tatatattaa gttaattcta atggaatacg

7680

atgacatgtg gatgggcagt ggccggttgt tacacgccta ccgcgatgct gaatgacccg

7740

gactaaagtg gcgaaaatta tggcgtgtga cccgttatgc tccagttcgg tcagtgggtc

7800

attgcaagta gtcgattgca ttgtcaatct ccgagtgatt tagcgtgaca gccgcaggga

7860

acccataaaa tgcgatcgta gtccatccga tcgtacatag aaatgagggt ccccatacgc

7920

ccacgcacct gttcactcgt cgtttgcatt taagagccgc acgaaccaca gagcataaag

7980

aggacctcta gctcctttac aaagtggggt cgaccgatcg cttgcgcaac ttgtgaagtg

8040

tctaccatcc ctaagcccat ttcccgcata ttaacccctg attgtatccg catctgatgc

8100

taccgtggtt gagttagcgt cgagcacgcg ggacttattg catgagtaga gttgactaag

8160

agccgttaga tggctcgctg agctaatagt tgccgacaga tcgtcaagat tagaaaacgg

8220

ttgtagcatt atcggaggtt ctctaactag tatcgatagc cgtgtcttca ctgtgccgcg

8280

gctacctatc gcctgaaaac cagttggtgt taaggggtcc cctgtccagg acgccaccgg

8340

tagtgagaca tacacgttcg ttgggttcac cgcggtcgga cctgagtgca ccaaggacac

8400

actgcagctc cgacccctac tgtcgagaaa tttgtatccc gcccccgcag cttgccagct

8460

9

ctttcagtat catggagccc atggttgaat gagtccaata acgaacttcg acatgataaa

8520

atccccccct cgcgacttcc agagaagaag actactgact tgagcgttcc cagcacttca

8580

gccaaggaag ttaccaattt tttgtttccg aatgacaccg gtctccttgc gggtagatcg

8640

ccgaccgcag aacttacgag ccaggggaaa cagtaaggcc taattaggta aagggagtaa

8700

gtgctcgaac gcttcagatg taaccatata cttacgctgg atcttctccc gcgaatttta

8760

accctcacca actacgagat ttgaggtaaa ccaaataagc acgtagtggc gctatccgac

8820

tgttcccaaa ttgtaactta tcgttccgtg aaggccagag ttacttcccg gccctttcca

8880

tgcgcgcacc ataccctcct agttccccgg ttatctctcc gaggagggag tgagcgatcc

8940

tccgtttacg ttttgttacc aatgacgtag ctatgtattt tgtacaggtt gccaacgggt

9000

ttcacaattc acagatagtg gggtacccgg caaagggcct atatttgcgg tccaacttag

9060

gcgtaaacta cgatggtacc tactcagacc cagctcgcgc ggcgtaaata acgcactcat

9120

cccagctgat tctcggcgat ctacgcagcg acatgattat caacagctgt ctggcagctc

9180

taatctttta ccatggtcgt aaaagcctcc aagagttaga tcatacctaa cgccacaaaa

9240

gtgacacgac gccgatgggt accggacttt aggtgcacca cagttcggta agggagaggc

9300

cctgcggcgt acttcatttt gtatatgcaa cgtgcccaag tggcgccagg caagtctcag

9360

ctggttcctg tgttagctgc aggctaggca tgggagctga ttgaacatgg gttgggggcc

9420

tcgaaccgtc gaggacccca tagtacgttt aaacccaagt agggcagcct atagtttgaa

9480

gcagtactat ttcagggggg gagccctcat ggtctcttct actgatgact caacacgcta

9540

gggacgtgaa gtcgattcct tcgatggtta taaatcaaag gctcagagtg cagtctggag

9600

cgcccatcta acggtacgca tctcgattgc tcggtcgcct ttcacactcc gcgaaaattc

9660

ataccgctca ttcactaggt tgcgaagcct acactgatat atgaatccaa gctagagcag

9720

ggctcttaaa attcggagtt gtagatgctc aatactccaa tcggtttttt cgtgcaccac

9780

cgcgggtggc tgacaagggt ttgacatcga gaaacaaggc agttccgggc tgaaagtagc

9840

gccgggtaag gtacgcgcct ggtatggcag gactatgaag ccaatacaaa ggctacatcc

9900

tcactcgggt ggacggaaac gcagaattat ggttactttt tggatacgtg aaacatgtcc

9960

catggtagcc caaagacttg ggagtctatc acccctaggg cccatttctg gatatagacg

10020

ccaggttgaa tccgtatttg gaggtacgat ggatcagtct gggtgggacg tgctccattt

10080

ataccctgcg caggctggac cgaggaccgc aagatgcgac ggtgcacaag taattgacaa

10140

caaaccatcg tgttttcatt atggtaccag gatcttcaag ccgagtcaat caagctcgga

10200

ttacagtgtt taccgcgtct tgcggttact cacaaactgt aatccaccac aagtcaagcc

10260

attgcctctc tgagacgccg tatgaattaa tatgtaaact ttgcgcgggt tcactgcgat

10320

ccgttcagtc tcgtccaagg gcacaatcga attcccattt gtatgttcgg ctaacttcta

10380

cccatccccc gaagtttagc aggtcgtgag gtgtcatgga ggctctcgtt catcccgtgg

10440

gacatcgttt aaacgccttg ataaagcacc ccgctcgggt gtagcagaga agacgcctac

10500

tgaattgtgc gatccctcca cctcagctaa ggtagctacc aatatttagt tttttagcct

10560

tgcgacagac ctcctactta gattgccacg cattgagcta gcgagtcagc gataagcatg

10620

10

acgcgctttc aagcgtcgcg agtatgtgaa ccaaggctcc ggacaggact atatacttgg

10680

gtttgatctc gccccgacaa ctgcaaacct caacatttat agattataag gttagccgaa

10740

attgcacgtg gtggcgcccg ccgactgctc cccgagtgtg gctctttgat ctgacaacgc

10800

gcgacctcca tcgcggccga ttgtttctgc ggaccatgtc gtcctcatag tttgggcatg

10860

tttccgttgt aggagtgaag ccacttagct ttgcgccgta gtcccaatga aaaacctatg

10920

gactttgttt tgggtagcat caggaatctg aaccctgtga atgtgggggt cgcgcgcata

10980

gacctttatc tccggttcaa gttaggcatg aggctgtcga cccctaatca gtgaggccac

11040

cgagtaaaag agtctgtcca tcacgcaaat taaccgttgt cgcaatactt ctttgattag

11100

taataacatc acttgcctga gtagaagaac tcaaactatc ggccttgctg gtaatatcca

11160

gaacaatatt accgccagcc attgcaacgg aatcgccatt cgccattcag gctgcgcaac

11220

tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct tcgct 11255

<210> 3

<211> 11396

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Плазмида pohIDS-874

<400> 3

attacgccag ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg 60

ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa 120

ctccatcact aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctactcg 180

acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc 240

atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa 300

cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac 360

tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca 420

agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg 480

gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt 540

agtcatcgct attaccatgg tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc 600

ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat 660

gggggcgggg gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg 720

cggggcgagg cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc 780

ttttatggcg aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg 840

agtcgctgcg cgctgccttc gccccgtgcc ccgctccgcc gccgcctcgc gccgcccgcc 900

ccggctctga ctgaccgcgt tactcccaca ggtgagcggg cgggacggcc cttctcctcc 960

gggctgtaat tagcgcttgg tttaatgacg gcttgtttct tttctgtggc tgcgtgaaag

1020

ccttgagggg ctccgggagg gccctttgtg cggggggagc ggctcggggg gtgcgtgcgt

1080

gtgtgtgtgc gtggggagcg ccgcgtgcgg ctccgcgctg cccggcggct gtgagcgctg

1140

cgggcgcggc gcggggcttt gtgcgctccg cagtgtgcgc gaggggagcg cggccggggg

1200

11

cggtgccccg cggtgcgggg ggggctgcga ggggaacaaa ggctgcgtgc ggggtgtgtg

1260

cgtggggggg tgagcagggg gtgtgggcgc gtcggtcggg ctgcaacccc ccctgcaccc

1320

ccctccccga gttgctgagc acggcccggc ttcgggtgcg gggctccgta cggggcgtgg

1380

cgcggggctc gccgtgccgg gcggggggtg gcggcaggtg ggggtgccgg gcggggcggg

1440

gccgcctcgg gccggggagg gctcggggga ggggcgcggc ggcccccgga gcgccggcgg

1500

ctgtcgaggc gcggcgagcc gcagccattg ccttttatgg taatcgtgcg agagggcgca

1560

gggacttcct ttgtcccaaa tctgtgcgga gccgaaatct gggaggcgcc gccgcacccc

1620

ctctagcggg cgcggggcga agcggtgcgg cgccggcagg aaggaaatgg gcggggaggg

1680

ccttcgtgcg tcgccgcgcc gccgtcccct tctccctctc cagcctcggg gctgtccgcg

1740

gggggacggc tgccttcggg ggggacgggg cagggcgggg ttcggcttct ggcgtgtgac

1800

cggcggctct agagcctctg ctaaccatgt tcatgccttc ttctttttcc tacagctcct

1860

gggcaacgtg ctggttattg tgctgtctca tcattttggc aaagaattga ttaattcgag

1920

cgaacgcgtg ccaccatgcc cccacctaga accggaagag gattgctctg gctcggactt

1980

gtgctgtcca gcgtgtgtgt ggccctgggc tcggaaaccc aggccaacag caccaccgac

2040

gccctgaatg tgctgctgat tatcgtggac gatctccggc cttcgctggg ctgctacggg

2100

gataagctgg tccgctcccc gaatatcgac caactggctt cacatagcct gcttttccaa

2160

aacgcattcg cccaacaagc cgtgtgcgcc ccgagccgcg tgtctttcct caccggccgg

2220

cgccctgata ctacccggct ctacgacttc aacagctact ggagagtgca cgcaggaaac

2280

ttctccacca ttcctcagta ctttaaggag aacggttacg tcaccatgag cgtggggaag

2340

gtgttccacc ctggaatttc ctccaaccac accgacgact cgccatactc ctggtccttt

2400

cccccttacc acccatcatc cgagaagtac gagaacacca agacgtgcag gggcccagac

2460

ggggaactgc acgcgaacct cctctgcccg gtcgatgtgc tggatgtgcc cgaaggcacc

2520

ctccctgaca aacagagcac cgaacaggcc atccagctcc tcgagaagat gaaaacttca

2580

gcctccccgt tctttctggc cgtgggatac cacaagccgc atatcccctt ccggtaccca

2640

aaggagttcc agaagctgta cccgctggag aacattaccc tggctcctga tcccgaagtg

2700

ccggacggcc tgccgcccgt ggcatacaac ccttggatgg acatccgcca gagggaggat

2760

gtgcaagccc tgaacatctc cgtgccatac ggtccgatcc cggtcgactt ccagcggaag

2820

attaggcagt catatttcgc gtccgtgtcc tacttggaca ctcaggtcgg acgcctcctc

2880

tccgctctcg acgatctgca gctggccaac tcgaccatta tcgcgttcac ctcggaccat

2940

ggttgggctc tgggcgaaca cggagaatgg gccaagtaca gcaatttcga tgtcgcgact

3000

cacgtgcccc tgatcttcta cgtgcccgga cgcacagcca gcttgcctga agcgggggaa

3060

aagctgttcc cttacctgga tcccttcgac tccgcctctc aacttatgga gccaggcaga

3120

cagtcgatgg acctggtgga actcgtgtca ctgttcccta ccctcgccgg tctggccgga

3180

cttcaggtcc cgcctcggtg cccggtgccg tccttccacg tggagctgtg tcgcgaggga

3240

aagaacctcc tgaaacactt ccggttccgc gacctggagg aagatcccta cttgccgggc

3300

aacccgagag aacttatcgc atactcccag taccctcgcc cctccgacat cccgcagtgg

3360

12

aactccgaca agccgagcct gaaggacatt aagatcatgg ggtactccat ccggactatt

3420

gactatcggt acactgtgtg ggtcgggttc aacccagatg agtttctggc caacttctcc

3480

gatatccatg ccggagagct gtacttcgtg gactcggacc cgctgcagga ccacaacatg

3540

tacaacgact cacagggcgg cgacctgttc cagttgctga tgccctgaga attcgagctc

3600

ggtacccggg aatcaattca ctcctcaggt gcaggctgcc tatcagaagg tggtggctgg

3660

tgtggccaat gccctggctc acaaatacca ctgagatctt tttccctctg ccaaaaatta

3720

tggggacatc atgaagcccc ttgagcatct gacttctggc taataaagga aatttatttt

3780

cattgcaata gtgtgttgga attttttgtg tctctcactc ggaaggacat atgggagggc

3840

aaatcattta aaacatcaga atgagtattt ggtttagagt ttggcaacat atgcccatat

3900

gctggctgcc atgaacaaag gttggctata aagaggtcat cagtatatga aacagccccc

3960

tgctgtccat tccttattcc atagaaaagc cttgacttga ggttagattt tttttatatt

4020

ttgttttgtg ttattttttt ctttaacatc cctaaaattt tccttacatg ttttactagc

4080

cagatttttc ctcctctcct gactactccc agtcatagct gtccctcttc tcttatggag

4140

atccctcgac ctgcagccca agctgtagat aagtagcatg gcgggttaat cattaactac

4200

aaggaacccc tagtgatgga gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag

4260

gccgggcgac caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag

4320

cgagcgcgca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg

4380

ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag

4440

cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag

4500

gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc

4560

tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc

4620

agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc

4680

tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt

4740

cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg

4800

ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat

4860

ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag

4920

ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt

4980

ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc

5040

cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta

5100

gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag

5160

atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga

5220

ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa

5280

gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa

5340

tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc

5400

ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga

5460

taccggggtt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgctt acaatttagg tggcactttt

5520

13

cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat

5580

ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg

5640

attgaacagg atggcctgca tgcgggtagc ccggcagcgt gggtggaacg tctgtttggc

5700

tatgattggg cgcagcagac cattggctgc tctgatgcgg cggtgtttcg tctgagcgcg

5760

cagggtcgtc cggtgctgtt tgtgaaaacc gatctgagcg gtgcgctgaa cgagctgcag

5820

gatgaagcgg cgcgtctgag ctggctggcc accaccggtg ttccgtgtgc ggcggtgctg

5880

gatgtggtga ccgaagcggg ccgtgattgg ctgctgctgg gcgaagtgcc gggtcaggat

5940

ctgctgtcta gccatctggc gccggcagaa aaagtgagca ttatggcgga tgccatgcgt

6000

cgtctgcata ccctggaccc ggcgacctgt ccgtttgatc atcaggcgaa acatcgtatt

6060

gaacgtgcgc gtacccgtat ggaagcgggc ctggtggatc aggatgatct ggatgaagaa

6120

catcagggcc tggcaccggc agagctgttt gcgcgtctga aagcgagcat gccggatggc

6180

gaagatctgg tggtgaccca tggtgatgcg tgcctgccga acattatggt ggaaaatggc

6240

cgttttagcg gctttattga ttgcggccgt ctgggcgtgg cggatcgtta tcaggatatt

6300

gcgctggcca cccgtgatat tgcggaagaa ctgggcggcg aatgggcgga tcgttttctg

6360

gtgctgtatg gcattgcggc accggatagc cagcgtattg cgttttatcg tctgctggat

6420

gaatttttct aataactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa

6480

cttcattttt aatttaaaac aattggatgg gcaattggat atcgtcatct ttgagacaca

6540

atctcccacc tcactggaat ttagttcctg ctataattag ccttcctcat aagttgcact

6600

acttcagcgt cccatatgca cccttaccac gaagacaggt ttgtccaatc ccatattgcg

6660

accttggcag ggggttcgca agtcccaccc gaaacgttgc tgaaggctca ggtttctgag

6720

cgacaaaagg ttaatacgcg agttcccgct cataacctgg accgaatgcg gaatcatgca

6780

tcgttccact gtgtttgtct catgtaggac gggcgcaaag catacttagt tcaatcttga

6840

ataccttata ttattgtaca cctaccggtc accagccaac aatgtgcgga cggcgttgca

6900

actttcaggg cctaatctga ccgttgtaga taccgcactc tgggcaatac gaggtaatgc

6960

cagtcaccca gtgtcgaaca acacctgacc taacggtaag aggctcacat aatggctctg

7020

ccggcgtgcc cagggtatat taggtcagca tcagatggac tgacatgaat ctttacaccg

7080

aagcggaaac gggtgcgtgg actagcgagg agcaaacgaa aattcctggc ctgcttgatg

7140

tctcgtaatc ttcttagaga tggacgaaat gtttcacgac ctaggaaaag gtcgccctac

7200

aaaatagatt tgcgttactc tcttcatagg atccccggtg tagcgaaaga tcaaggcgac

7260

cctaggtagc aaccgccggc ttcggcggta aggtatcact caagaagcag actcagtaag

7320

acacggtcta gctgactgtc tatcgcctag gtcaaatagg gagctttgat tctgcatgtc

7380

cagctttaga ttcactttag cgcgcagatc tgggtcgaga taaaatcacc agtacccaag

7440

accagggggg ctcgccgcgt tggctaatcc tggtacatct tgtaatgaat attcagtaga

7500

aaatttgtgt tagaaggacg agtcaccatg taccaaaagc gataacgatc ggtgggagta

7560

ttcattgtgg tgaagacgct gggtttacgt gggaaaggtg cttgtgtccc aacaggctag

7620

gatataatgc tgaagccctt ccccaagcgt tcagggtggg atttgctaca acttccgagt

7680

14

ccaacgtgtc cgtgttcatg ttatatatgc acaaggccga gaattggacg tagctttcgt

7740

gttagtacgt agcatggtca cacaagcaca gtagatcctg cccgcgcatc ctatatatta

7800

agttaattct aatggaatac gatgacatgt ggatgggcag tggccggttg ttacacgcct

7860

accgcgatgc tgaatgaccc ggactaaagt ggcgaaaatt atggcgtgtg acccgttatg

7920

ctccagttcg gtcagtgggt cattgcaagt agtcgattgc attgtcaatc tccgagtgat

7980

ttagcgtgac agccgcaggg aacccataaa atgcgatcgt agtccatccg atcgtacata

8040

gaaatgaggg tccccatacg cccacgcacc tgttcactcg tcgtttgcat ttaagagccg

8100

cacgaaccac agagcataaa gaggacctct agctccttta caaagtgggg tcgaccgatc

8160

gcttgcgcaa cttgtgaagt gtctaccatc cctaagccca tttcccgcat attaacccct

8220

gattgtatcc gcatctgatg ctaccgtggt tgagttagcg tcgagcacgc gggacttatt

8280

gcatgagtag agttgactaa gagccgttag atggctcgct gagctaatag ttgccgacag

8340

atcgtcaaga ttagaaaacg gttgtagcat tatcggaggt tctctaacta gtatcgatag

8400

ccgtgtcttc actgtgccgc ggctacctat cgcctgaaaa ccagttggtg ttaaggggtc

8460

ccctgtccag gacgccaccg gtagtgagac atacacgttc gttgggttca ccgcggtcgg

8520

acctgagtgc accaaggaca cactgcagct ccgaccccta ctgtcgagaa atttgtatcc

8580

cgcccccgca gcttgccagc tctttcagta tcatggagcc catggttgaa tgagtccaat

8640

aacgaacttc gacatgataa aatccccccc tcgcgacttc cagagaagaa gactactgac

8700

ttgagcgttc ccagcacttc agccaaggaa gttaccaatt ttttgtttcc gaatgacacc

8760

ggtctccttg cgggtagatc gccgaccgca gaacttacga gccaggggaa acagtaaggc

8820

ctaattaggt aaagggagta agtgctcgaa cgcttcagat gtaaccatat acttacgctg

8880

gatcttctcc cgcgaatttt aaccctcacc aactacgaga tttgaggtaa accaaataag

8940

cacgtagtgg cgctatccga ctgttcccaa attgtaactt atcgttccgt gaaggccaga

9000

gttacttccc ggccctttcc atgcgcgcac cataccctcc tagttccccg gttatctctc

9060

cgaggaggga gtgagcgatc ctccgtttac gttttgttac caatgacgta gctatgtatt

9120

ttgtacaggt tgccaacggg tttcacaatt cacagatagt ggggtacccg gcaaagggcc

9180

tatatttgcg gtccaactta ggcgtaaact acgatggtac ctactcagac ccagctcgcg

9240

cggcgtaaat aacgcactca tcccagctga ttctcggcga tctacgcagc gacatgatta

9300

tcaacagctg tctggcagct ctaatctttt accatggtcg taaaagcctc caagagttag

9360

atcataccta acgccacaaa agtgacacga cgccgatggg taccggactt taggtgcacc

9420

acagttcggt aagggagagg ccctgcggcg tacttcattt tgtatatgca acgtgcccaa

9480

gtggcgccag gcaagtctca gctggttcct gtgttagctg caggctaggc atgggagctg

9540

attgaacatg ggttgggggc ctcgaaccgt cgaggacccc atagtacgtt taaacccaag

9600

tagggcagcc tatagtttga agcagtacta tttcaggggg ggagccctca tggtctcttc

9660

tactgatgac tcaacacgct agggacgtga agtcgattcc ttcgatggtt ataaatcaaa

9720

ggctcagagt gcagtctgga gcgcccatct aacggtacgc atctcgattg ctcggtcgcc

9780

tttcacactc cgcgaaaatt cataccgctc attcactagg ttgcgaagcc tacactgata

9840

15

tatgaatcca agctagagca gggctcttaa aattcggagt tgtagatgct caatactcca

9900

atcggttttt tcgtgcacca ccgcgggtgg ctgacaaggg tttgacatcg agaaacaagg

9960

cagttccggg ctgaaagtag cgccgggtaa ggtacgcgcc tggtatggca ggactatgaa

10020

gccaatacaa aggctacatc ctcactcggg tggacggaaa cgcagaatta tggttacttt

10080

ttggatacgt gaaacatgtc ccatggtagc ccaaagactt gggagtctat cacccctagg

10140

gcccatttct ggatatagac gccaggttga atccgtattt ggaggtacga tggatcagtc

10200

tgggtgggac gtgctccatt tataccctgc gcaggctgga ccgaggaccg caagatgcga

10260

cggtgcacaa gtaattgaca acaaaccatc gtgttttcat tatggtacca ggatcttcaa

10320

gccgagtcaa tcaagctcgg attacagtgt ttaccgcgtc ttgcggttac tcacaaactg

10380

taatccacca caagtcaagc cattgcctct ctgagacgcc gtatgaatta atatgtaaac

10440

tttgcgcggg ttcactgcga tccgttcagt ctcgtccaag ggcacaatcg aattcccatt

10500

tgtatgttcg gctaacttct acccatcccc cgaagtttag caggtcgtga ggtgtcatgg

10560

aggctctcgt tcatcccgtg ggacatcgtt taaacgcctt gataaagcac cccgctcggg

10620

tgtagcagag aagacgccta ctgaattgtg cgatccctcc acctcagcta aggtagctac

10680

caatatttag ttttttagcc ttgcgacaga cctcctactt agattgccac gcattgagct

10740

agcgagtcag cgataagcat gacgcgcttt caagcgtcgc gagtatgtga accaaggctc

10800

cggacaggac tatatacttg ggtttgatct cgccccgaca actgcaaacc tcaacattta

10860

tagattataa ggttagccga aattgcacgt ggtggcgccc gccgactgct ccccgagtgt

10920

ggctctttga tctgacaacg cgcgacctcc atcgcggccg attgtttctg cggaccatgt

10980

cgtcctcata gtttgggcat gtttccgttg taggagtgaa gccacttagc tttgcgccgt

11040

agtcccaatg aaaaacctat ggactttgtt ttgggtagca tcaggaatct gaaccctgtg

11100

aatgtggggg tcgcgcgcat agacctttat ctccggttca agttaggcat gaggctgtcg

11160

acccctaatc agtgaggcca ccgagtaaaa gagtctgtcc atcacgcaaa ttaaccgttg

11220

tcgcaatact tctttgatta gtaataacat cacttgcctg agtagaagaa ctcaaactat

11280

cggccttgct ggtaatatcc agaacaatat taccgccagc cattgcaacg gaatcgccat

11340

tcgccattca ggctgcgcaa ctgttgggaa gggcgatcgg tgcgggcctc ttcgct 11396

<210> 4

<211> 6630

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Плазмида pRepCap9-808

<400> 4

ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60

attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120

gatagggttg agtggccgct acagggcgct cccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt 180

gggaagggcg tttcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt 240

gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg 300

16

acggccagtg agcgcgacgt aatacgactc actatagggc gaattggcgg aaggccgtca 360

aggccgcatc ccggggcggc cgcgaggtcc tgtattagag gtcacgtgag tgttttgcga 420

cattttgcga caccatgtgg tcacgctggg tatttaagcc cgagtgagca cgcagggtct 480

ccattttgaa gcgggaggtt tgaacgcgca gccgccatgc cggggtttta cgagattgtg 540

attaaggtcc ccagcgacct tgacgagcat ctgcccggca tttctgacag ctttgtgaac 600

tgggtggccg agaaggaatg ggagttgccg ccagattctg acatggatct gaatctgatt 660

gagcaggcac ccctgaccgt ggccgagaag ctgcagcgcg actttctgac ggaatggcgc 720

cgtgtgagta aggccccgga ggcccttttc tttgtgcaat ttgagaaggg agagagctac 780

ttccacatgc acgtgctcgt ggaaaccacc ggggtgaaat ccatggtttt gggacgtttc 840

ctgagtcaga ttcgcgaaaa actgattcag agaatttacc gcgggatcga gccgactttg 900

ccaaactggt tcgcggtcac aaagaccaga aatggcgccg gaggcgggaa caaggtggtg 960

gatgagtgct acatccccaa ttacttgctc cccaaaaccc agcctgagct ccagtgggcg

1020

tggactaata tggaacagta tttaagcgcc tgtttgaatc tcacggagcg taaacggttg

1080

gtggcgcagc atctgacgca cgtgtcgcag acgcaggagc agaacaaaga gaatcagaat

1140

cccaattctg atgcgccggt gatcagatca aaaacttcag ccaggtacat ggagctggtc

1200

gggtggctcg tggacaaggg gattacctcg gagaagcagt ggatccagga ggaccaggcc

1260

tcatacatct ccttcaatgc ggcctccaac tcgcggtccc aaatcaaggc tgccttggac

1320

aatgcgggaa agattatgag cctgactaaa accgcccccg actacctggt gggccagcag

1380

cccgtggagg acatttccag caatcggatt tataaaattt tggaactaaa cgggtacgat

1440

ccccaatatg cggcttccgt ctttctggga tgggccacga aaaagttcgg caagaggaac

1500

accatctggc tgtttgggcc tgcaactacc gggaagacca acatcgcgga ggccatagcc

1560

cacactgtgc ccttctacgg gtgcgtaaac tggaccaatg agaactttcc cttcaacgac

1620

tgtgtcgaca agatggtgat ctggtgggag gaggggaaga tgaccgccaa ggtcgtggag

1680

tcggccaaag ccattctcgg aggaagcaag gtgcgcgtgg accagaaatg caagtcctcg

1740

gcccagatag acccgactcc cgtgatcgtc acctccaaca ccaacatgtg cgccgtgatt

1800

gacgggaact caacgacctt cgaacaccag cagccgttgc aagaccggat gttcaaattt

1860

gaactcaccc gccgtctgga tcatgacttt gggaaggtca ccaagcagga agtcaaagac

1920

tttttccggt gggcaaagga tcacgtggtt gaggtggagc atgaattcta cgtcaaaaag

1980

ggtggagcca agaaaagacc cgcccccagt gacgcagata taagtgagcc caaacgggtg

2040

cgcgagtcag ttgcgcagcc atcgacgtca gacgcggaag cttcgatcaa ctacgcagac

2100

aggtaccaaa acaaatgttc tcgtcacgtg ggcatgaatc tgatgctgtt tccctgcaga

2160

caatgcgaga gaatgaatca gaattcaaat atctgcttca ctcacggaca gaaagactgt

2220

ttagagtgct ttcccgtgtc agaatctcaa cccgtttctg tcgtcaaaaa ggcgtatcag

2280

aaactgtgct acattcatca tatcatggga aaggtgccag acgcttgcac tgcctgcgat

2340

ctggtcaatg tggatttgga tgactgcatc tttgaacaat aaatgactta aaccaggtat

2400

ggctgccgat ggttatcttc cagattggct cgaggacaac cttagtgaag gaattcgcga

2460

17

gtggtgggct ttgaaacctg gagcccctca acccaaggca aatcaacaac atcaagacaa

2520

cgctcgaggt cttgtgcttc cgggttacaa ataccttgga cccggcaacg gactcgacaa

2580

gggggagccg gtcaacgcag cagacgcggc ggccctcgag cacgacaagg cctacgacca

2640

gcagctcaag gccggagaca acccgtacct caagtacaac cacgccgacg ccgagttcca

2700

ggagcggctc aaagaagata cgtcttttgg gggcaacctc gggcgagcag tcttccaggc

2760

caaaaagagg cttcttgaac ctcttggtct ggttgaggaa gcggctaaga cggctcctgg

2820

aaagaagagg cctgtagagc agtctcctca ggaaccggac tcctccgcgg gtattggcaa

2880

atcgggtgca cagcccgcta aaaagagact caatttcggt cagactggcg acacagagtc

2940

agtcccagac cctcaaccaa tcggagaacc tcccgcagcc ccctcaggtg tgggatctct

3000

tacaatggct tcaggtggtg gcgcaccagt ggcagacaat aacgaaggtg ccgatggagt

3060

gggtagttcc tcgggaaatt ggcattgcga ttcccaatgg ctgggggaca gagtcatcac

3120

caccagcacc cgaacctggg ccctgcccac ctacaacaat cacctctaca agcaaatctc

3180

caacagcaca tctggaggat cttcaaatga caacgcctac ttcggctaca gcaccccctg

3240

ggggtatttt gacttcaaca gattccactg ccacttctca ccacgtgact ggcagcgact

3300

catcaacaac aactggggat tccggcctaa gcgactcaac ttcaagctct tcaacattca

3360

ggtcaaagag gttacggaca acaatggagt caagaccatc gccaataacc ttaccagcac

3420

ggtccaggtc ttcacggact cagactatca gctcccgtac gtgctcgggt cggctcacga

3480

gggctgcctc ccgccgttcc cagcggacgt tttcatgatt cctcagtacg ggtatctgac

3540

gcttaatgat ggaagccagg ccgtgggtcg ttcgtccttt tactgcctgg aatatttccc

3600

gtcgcaaatg ctaagaacgg gtaacaactt ccagttcagc tacgagtttg agaacgtacc

3660

tttccatagc agctacgctc acagccaaag cctggaccga ctaatgaatc cactcatcga

3720

ccaatacttg tactatctct caaagactat taacggttct ggacagaatc aacaaacgct

3780

aaaattcagt gtggccggac ccagcaacat ggctgtccag ggaagaaact acatacctgg

3840

acccagctac cgacaacaac gtgtctcaac cactgtgact caaaacaaca acagcgaatt

3900

tgcttggcct ggagcttctt cttgggctct caatggacgt aatagcttga tgaatcctgg

3960

acctgctatg gccagccaca aagaaggaga ggaccgtttc tttcctttgt ctggatcttt

4020

aatttttggc aaacaaggaa ctggaagaga caacgtggat gcggacaaag tcatgataac

4080

caacgaagaa gaaattaaaa ctactaaccc ggtagcaacg gagtcctatg gacaagtggc

4140

cacaaaccac cagagtgccc aagcacaggc gcagaccggc tgggttcaaa accaaggaat

4200

acttccgggt atggtttggc aggacagaga tgtgtacctg caaggaccca tttgggccaa

4260

aattcctcac acggacggca actttcaccc ttctccgctg atgggagggt ttggaatgaa

4320

gcacccgcct cctcagatcc tcatcaaaaa cacacctgta cctgcggatc ctccaacggc

4380

cttcaacaag gacaagctga actctttcat cacccagtat tctactggcc aagtcagcgt

4440

ggagatcgag tgggagctgc agaaggaaaa cagcaagcgc tggaacccgg agatccagta

4500

cacttccaac tattacaagt ctaataatgt tgaatttgct gttaatactg aaggtgtata

4560

tagtgaaccc cgccccattg gcaccagata cctgactcgt aatctgtaat tgcttgttaa

4620

18

tcaataaacc gtttaatttc tagagcggcc gccccgggct gggcctcatg ggccttccgc

4680

tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaaca tggtcatagc

4740

tgtttccttg cgtattgggc gctctccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc

4800

gttcgggtaa agcctggggt gcctaatgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta

4860

aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa

4920

atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc

4980

cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt

5040

ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca

5100

gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg

5160

accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat

5220

cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta

5280

cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct

5340

gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac

5400

aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa

5460

aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa

5520

actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt

5580

taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca

5640

gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca

5700

tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc

5760

ccagtgctgc aatgataccg cgagaaccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa

5820

accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc

5880

agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca

5940

acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat

6000

tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag

6060

cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac

6120

tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt

6180

ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt

6240

gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc

6300

tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat

6360

ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca

6420

gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga

6480

cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg

6540

gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg

6600

ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac 6630

<210> 5

<211> 6684

19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Плазмида pRepCap9-809

<400> 5

ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60

attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120

gatagggttg agtggccgct acagggcgct cccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt 180

gggaagggcg tttcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt 240

gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg 300

acggccagtg agcgcgacgt aatacgactc actatagggc gaattgaagg aaggccgtca 360

aggccgcatg atatctgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tgatatcggg 420

tcccggggcg gccgccgcag ggtctccatt ttgaagcggg aggtttgaac gcgcagccgc 480

catgccgggg ttttacgaga ttgtgattaa ggtccccagc gaccttgacg agcatctgcc 540

cggcatttct gacagctttg tgaactgggt ggccgagaag gaatgggagt tgccgccaga 600

ttctgacatg gatctgaatc tgattgagca ggcacccctg accgtggccg agaagctgca 660

gcgcgacttt ctgacggaat ggcgccgtgt gagtaaggcc ccggaggccc ttttctttgt 720

gcaatttgag aagggagaga gctacttcca catgcacgtg ctcgtggaaa ccaccggggt 780

gaaatccatg gttttgggac gtttcctgag tcagattcgc gaaaaactga ttcagagaat 840

ttaccgcggg atcgagccga ctttgccaaa ctggttcgcg gtcacaaaga ccagaaatgg 900

cgccggaggc gggaacaagg tggtggatga gtgctacatc cccaattact tgctccccaa 960

aacccagcct gagctccagt gggcgtggac taatatggaa cagtatttaa gcgcctgttt

1020

gaatctcacg gagcgtaaac ggttggtggc gcagcatctg acgcacgtgt cgcagacgca

1080

ggagcagaac aaagagaatc agaatcccaa ttctgatgcg ccggtgatca gatcaaaaac

1140

ttcagccagg tacatggagc tggtcgggtg gctcgtggac aaggggatta cctcggagaa

1200

gcagtggatc caggaggacc aggcctcata catctccttc aatgcggcct ccaactcgcg

1260

gtcccaaatc aaggctgcct tggacaatgc gggaaagatt atgagcctga ctaaaaccgc

1320

ccccgactac ctggtgggcc agcagcccgt ggaggacatt tccagcaatc ggatttataa

1380

aattttggaa ctaaacgggt acgatcccca atatgcggct tccgtctttc tgggatgggc

1440

cacgaaaaag ttcggcaaga ggaacaccat ctggctgttt gggcctgcaa ctaccgggaa

1500

gaccaacatc gcggaggcca tagcccacac tgtgcccttc tacgggtgcg taaactggac

1560

caatgagaac tttcccttca acgactgtgt cgacaagatg gtgatctggt gggaggaggg

1620

gaagatgacc gccaaggtcg tggagtcggc caaagccatt ctcggaggaa gcaaggtgcg

1680

cgtggaccag aaatgcaagt cctcggccca gatagacccg actcccgtga tcgtcacctc

1740

caacaccaac atgtgcgccg tgattgacgg gaactcaacg accttcgaac accagcagcc

1800

gttgcaagac cggatgttca aatttgaact cacccgccgt ctggatcatg actttgggaa

1860

ggtcaccaag caggaagtca aagacttttt ccggtgggca aaggatcacg tggttgaggt

1920

ggagcatgaa ttctacgtca aaaagggtgg agccaagaaa agacccgccc ccagtgacgc

1980

20

agatataagt gagcccaaac gggtgcgcga gtcagttgcg cagccatcga cgtcagacgc

2040

ggaagcttcg atcaactacg cagacaggta ccaaaacaaa tgttctcgtc acgtgggcat

2100

gaatctgatg ctgtttccct gcagacaatg cgagagaatg aatcagaatt caaatatctg

2160

cttcactcac ggacagaaag actgtttaga gtgctttccc gtgtcagaat ctcaacccgt

2220

ttctgtcgtc aaaaaggcgt atcagaaact gtgctacatt catcatatca tgggaaaggt

2280

gccagacgct tgcactgcct gcgatctggt caatgtggat ttggatgact gcatctttga

2340

acaataaatg acttaaacca ggtatggctg ccgatggtta tcttccagat tggctcgagg

2400

acaaccttag tgaaggaatt cgcgagtggt gggctttgaa acctggagcc cctcaaccca

2460

aggcaaatca acaacatcaa gacaacgctc gaggtcttgt gcttccgggt tacaaatacc

2520

ttggacccgg caacggactc gacaaggggg agccggtcaa cgcagcagac gcggcggccc

2580

tcgagcacga caaggcctac gaccagcagc tcaaggccgg agacaacccg tacctcaagt

2640

acaaccacgc cgacgccgag ttccaggagc ggctcaaaga agatacgtct tttgggggca

2700

acctcgggcg agcagtcttc caggccaaaa agaggcttct tgaacctctt ggtctggttg

2760

aggaagcggc taagacggct cctggaaaga agaggcctgt agagcagtct cctcaggaac

2820

cggactcctc cgcgggtatt ggcaaatcgg gtgcacagcc cgctaaaaag agactcaatt

2880

tcggtcagac tggcgacaca gagtcagtcc cagaccctca accaatcgga gaacctcccg

2940

cagccccctc aggtgtggga tctcttacaa tggcttcagg tggtggcgca ccagtggcag

3000

acaataacga aggtgccgat ggagtgggta gttcctcggg aaattggcat tgcgattccc

3060

aatggctggg ggacagagtc atcaccacca gcacccgaac ctgggccctg cccacctaca

3120

acaatcacct ctacaagcaa atctccaaca gcacatctgg aggatcttca aatgacaacg

3180

cctacttcgg ctacagcacc ccctgggggt attttgactt caacagattc cactgccact

3240

tctcaccacg tgactggcag cgactcatca acaacaactg gggattccgg cctaagcgac

3300

tcaacttcaa gctcttcaac attcaggtca aagaggttac ggacaacaat ggagtcaaga

3360

ccatcgccaa taaccttacc agcacggtcc aggtcttcac ggactcagac tatcagctcc

3420

cgtacgtgct cgggtcggct cacgagggct gcctcccgcc gttcccagcg gacgttttca

3480

tgattcctca gtacgggtat ctgacgctta atgatggaag ccaggccgtg ggtcgttcgt

3540

ccttttactg cctggaatat ttcccgtcgc aaatgctaag aacgggtaac aacttccagt

3600

tcagctacga gtttgagaac gtacctttcc atagcagcta cgctcacagc caaagcctgg

3660

accgactaat gaatccactc atcgaccaat acttgtacta tctctcaaag actattaacg

3720

gttctggaca gaatcaacaa acgctaaaat tcagtgtggc cggacccagc aacatggctg

3780

tccagggaag aaactacata cctggaccca gctaccgaca acaacgtgtc tcaaccactg

3840

tgactcaaaa caacaacagc gaatttgctt ggcctggagc ttcttcttgg gctctcaatg

3900

gacgtaatag cttgatgaat cctggacctg ctatggccag ccacaaagaa ggagaggacc

3960

gtttctttcc tttgtctgga tctttaattt ttggcaaaca aggaactgga agagacaacg

4020

tggatgcgga caaagtcatg ataaccaacg aagaagaaat taaaactact aacccggtag

4080

caacggagtc ctatggacaa gtggccacaa accaccagag tgcccaagca caggcgcaga

4140

21

ccggctgggt tcaaaaccaa ggaatacttc cgggtatggt ttggcaggac agagatgtgt

4200

acctgcaagg acccatttgg gccaaaattc ctcacacgga cggcaacttt cacccttctc

4260

cgctgatggg agggtttgga atgaagcacc cgcctcctca gatcctcatc aaaaacacac

4320

ctgtacctgc ggatcctcca acggccttca acaaggacaa gctgaactct ttcatcaccc

4380

agtattctac tggccaagtc agcgtggaga tcgagtggga gctgcagaag gaaaacagca

4440

agcgctggaa cccggagatc cagtacactt ccaactatta caagtctaat aatgttgaat

4500

ttgctgttaa tactgaaggt gtatatagtg aaccccgccc cattggcacc agatacctga

4560

ctcgtaatct gtaattgctt gttaatcaat aaaccgttta attaggacta gtgaggtcct

4620

gtattagagg tcacgtgagt gttttgcgac attttgcgac accatgtggt cacgctgggt

4680

atttaagccc gagtgagcac gcagggtctc cattttgaag cgggaggttt gaacgcgcag

4740

ccgccctcca ttttgtctag agcggccgcc ccgggctggg cctcatgggc cttcctttca

4800

ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaacatgg tcatagctgt

4860

ttccttgcgt attgggcgct ctccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt

4920

cgggtaaagc ctggggtgcc taatgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa

4980

aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc

5040

gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc

5100

ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg

5160

cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt

5220

cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc

5280

gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc

5340

cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag

5400

agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg

5460

ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa

5520

ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag

5580

gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact

5640

cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa

5700

attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt

5760

attagaaaaa ttcatccagc agacgataaa acgcaatacg ctggctatcc ggtgccgcaa

5820

tgccatacag caccagaaaa cgatccgccc attcgccgcc cagttcttcc gcaatatcac

5880

gggtggccag cgcaatatcc tgataacgat ccgccacgcc cagacggccg caatcaataa

5940

agccgctaaa acggccattt tccaccataa tgttcggcag gcacgcatca ccatgggtca

6000

ccaccagatc ttcgccatcc ggcatgctcg ctttcagacg cgcaaacagc tctgccggtg

6060

ccaggccctg atgttcttca tccagatcat cctgatccac caggcccgct tccatacggg

6120

tacgcgcacg ttcaatacga tgtttcgcct gatgatcaaa cggacaggtc gccgggtcca

6180

gggtatgcag acgacgcatg gcatccgcca taatgctcac tttttctgcc ggcgccagat

6240

ggctagacag cagatcctga cccggcactt cgcccagcag cagccaatca cggcccgctt

6300

22

cggtcaccac atccagcacc gccgcacacg gaacaccggt ggtggccagc cagctcagac

6360

gcgccgcttc atcctgcagc tcgttcagcg caccgctcag atcggttttc acaaacagca

6420

ccggacgacc ctgcgcgctc agacgaaaca ccgccgcatc agagcagcca atggtctgct

6480

gcgcccaatc atagccaaac agacgttcca cccacgctgc cgggctaccc gcatgcaggc

6540

catcctgttc aatcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt

6600

gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc

6660

gcacatttcc ccgaaaagtg ccac 6684

<210> 6

<211> 11584

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Плазмида pAdHelper861

<400> 6

ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60

attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120

gatagggttg agtggccgct acagggcgct cccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt 180

gggaagggcg tttcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt 240

gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg 300

acggccagtg agcgcgacgt aatacgactc actatagggc gaattgaagg aaggccgtca 360

aggccgcatg cggccgcagt actatccgta gatgtacctg gacatccagg tgatgccggc 420

ggcggtggtg gaggcgcgcg gaaagtcgcg gacgcggttc cagatgttgc gcagcggcaa 480

aaagtgctcc atggtcggga cgctctggcc ggtcaggcgc gcgcaatcgt tgacgctcta 540

gaccgtgcaa aaggagagcc tgtaagcggg cactcttccg tggtctggtg gataaattcg 600

caagggtatc atggcggacg accggggttc gagccccgta tccggccgtc cgccgtgatc 660

catgcggtta ccgcccgcgt gtcgaaccca ggtgtgcgac gtcagacaac gggggagtgc 720

tccttttggc ttccttccag gcgcggcggc tgctgcgcta gcttttttgg ccactggccg 780

cgcgcagcgt aagcggttag gctggaaagc gaaagcatta agtggctcgc tccctgtagc 840

cggagggtta ttttccaagg gttgagtcgc gggacccccg gttcgagtct cggaccggcc 900

ggactgcggc gaacgggggt ttgcctcccc gtcatgcaag accccgcttg caaattcctc 960

cggaaacagg gacgagcccc ttttttgctt ttcccagatg catccggtgc tgcggcagat

1020

gcgcccccct cctcagcagc ggcaagagca agagcagcgg cagacatgca gggcaccctc

1080

ccctcctcct accgcgtcag gaggggcgac atcctcgcga ggtacccaac tccatgctca

1140

acagtcccca ggtacagccc accctgcgtc gcaaccagga acagctctac agcttcctgg

1200

agcgccactc gccctacttc cgcagccaca gtgcgcagat taggagcgcc acttcttttt

1260

gtcacttgaa aaacatgtaa aaataatgta ctagagacac tttcaataaa ggcaaatgct

1320

tttatttgta cactctcggg tgattattta cccccaccct tgccgtctgc gccgtttaaa

1380

aatcaaaggg gttctgccgc gcatcgctat gcgccactgg cagggacacg ttgcgatact

1440

23

ggtgtttagt gctccactta aactcaggca caaccatccg cggcagctcg gtgaagtttt

1500

cactccacag gctgcgcacc atcaccaacg cgtttagcag gtcgggcgcc gatatcttga

1560

agtcgcagtt ggggcctccg ccctgcgcgc gcgagttgcg atacacaggg ttgcagcact

1620

ggaacactat cagcgccggg tggtgcacgc tggccagcac gctcttgtcg gagatcagat

1680

ccgcgtccag gtcctccgcg ttgctcaggg cgaacggagt caactttggt agctgccttc

1740

ccaaaaaggg cgcgtgccca ggctttgagt tgcactcgca ccgtagtggc atcaaaaggt

1800

gaccgtgccc ggtctgggcg ttaggataca gcgcctgcat aaaagccttg atctgcttaa

1860

aagccacctg agcctttgcg ccttcagaga agaacatgcc gcaagacttg ccggaaaact

1920

gattggccgg acaggccgcg tcgtgcacgc agcaccttgc gtcggtgttg gagatctgca

1980

ccacatttcg gccccaccgg ttcttcacga tcttggcctt gctagactgc tccttcagcg

2040

cgcgctgccc gttttcgctc gtcacatcca tttcaatcac gtgctcctta tttatcataa

2100

tgcttccgtg tagacactta agctcgcctt cgatctcagc gcagcggtgc agccacaacg

2160

cgcagcccgt gggctcgtga tgcttgtagg tcacctctgc aaacgactgc aggtacgcct

2220

gcaggaatcg ccccatcatc gtcacaaagg tcttgttgct ggtgaaggtc agctgcaacc

2280

cgcggtgctc ctcgttcagc caggtcttgc atacggccgc cagagcttcc acttggtcag

2340

gcagtagttt gaagttcgcc tttagatcgt tatccacgtg gtacttgtcc atcagcgcgc

2400

gcgcagcctc catgcccttc tcccacgcag acacgatcgg cacactcagc gggttcatca

2460

ccgtaatttc actttccgct tcgctgggct cttcctcttc ctcttgcgtc cgcataccac

2520

gcgccactgg gtcgtcttca ttcagccgcc gcactgtgcg cttacctcct ttgccatgct

2580

tgattagcac cggtgggttg ctgaaaccca ccatttgtag cgccacatct tctctttctt

2640

cctcgctgtc cacgattacc tctggtgatg gcgggcgctc gggcttggga gaagggcgct

2700

tctttttctt cttgggcgca atggccaaat ccgccgccga ggtcgatggc cgcgggctgg

2760

gtgtgcgcgg caccagcgcg tcttgtgatg agtcttcctc gtcctcggac tcgatacgcc

2820

gcctcatccg cttttttggg ggcgcccggg gaggcggcgg cgacggggac ggggacgaca

2880

cgtcctccat ggttggggga cgtcgcgccg caccgcgtcc gcgctcgggg gtggtttcgc

2940

gctgctcctc ttcccgactg gccatttcct tctcctatag gcagaaaaag atcatggagt

3000

cagtcgagaa gaaggacagc ctaaccgccc cctctgagtt cgccaccacc gcctccaccg

3060

atgccgccaa cgcgcctacc accttccccg tcgaggcacc cccgcttgag gaggaggaag

3120

tgattatcga gcaggaccca ggttttgtaa gcgaagacga cgaggaccgc tcagtaccaa

3180

cagaggataa aaagcaagac caggacaacg cagaggcaaa cgaggaacaa gtcgggcggg

3240

gggacgaaag gcatggcgac tacctagatg tgggagacga cgtgctgttg aagcatctgc

3300

agcgccagtg cgccattatc tgcgacgcgt tgcaagagcg cagcgatgtg cccctcgcca

3360

tagcggatgt cagccttgcc tacgaacgcc acctattctc accgcgcgta ccccccaaac

3420

gccaagaaaa cggcacatgc gagcccaacc cgcgcctcaa cttctacccc gtatttgccg

3480

tgccagaggt gcttgccacc tatcacatct ttttccaaaa ctgcaagata cccctatcct

3540

gccgtgccaa ccgcagccga gcggacaagc agctggcctt gcggcagggc gctgtcatac

3600

24

ctgatatcgc ctcgctcaac gaagtgccaa aaatctttga gggtcttgga cgcgacgaga

3660

agcgcgcggc aaacgctctg caacaggaaa acagcgaaaa tgaaagtcac tctggagtgt

3720

tggtggaact cgagggtgac aacgcgcgcc tagccgtact aaaacgcagc atcgaggtca

3780

cccactttgc ctacccggca cttaacctac cccccaaggt catgagcaca gtcatgagtg

3840

agctgatcgt gcgccgtgcg cagcccctgg agagggatgc aaatttgcaa gaacaaacag

3900

aggagggcct acccgcagtt ggcgacgagc agctagcgcg ctggcttcaa acgcgcgagc

3960

ctgccgactt ggaggagcga cgcaaactaa tgatggccgc agtgctcgtt accgtggagc

4020

ttgagtgcat gcagcggttc tttgctgacc cggagatgca gcgcaagcta gaggaaacat

4080

tgcactacac ctttcgacag ggctacgtac gccaggcctg caagatctcc aacgtggagc

4140

tctgcaacct ggtctcctac cttggaattt tgcacgaaaa ccgccttggg caaaacgtgc

4200

ttcattccac gctcaagggc gaggcgcgcc gcgactacgt ccgcgactgc gtttacttat

4260

ttctatgcta cacctggcag acggccatgg gcgtttggca gcagtgcttg gaggagtgca

4320

acctcaagga gctgcagaaa ctgctaaagc aaaacttgaa ggacctatgg acggccttca

4380

acgagcgctc cgtggccgcg cacctggcgg acatcatttt ccccgaacgc ctgcttaaaa

4440

ccctgcaaca gggtctgcca gacttcacca gtcaaagcat gttgcagaac tttaggaact

4500

ttatcctaga gcgctcagga atcttgcccg ccacctgctg tgcacttcct agcgactttg

4560

tgcccattaa gtaccgcgaa tgccctccgc cgctttgggg ccactgctac cttctgcagc

4620

tagccaacta ccttgcctac cactctgaca taatggaaga cgtgagcggt gacggtctac

4680

tggagtgtca ctgtcgctgc aacctatgca ccccgcaccg ctccctggtt tgcaattcgc

4740

agctgcttaa cgaaagtcaa attatcggta cctttgagct gcagggtccc tcgcctgacg

4800

aaaagtccgc ggctccgggg ttgaaactca ctccggggct gtggacgtcg gcttaccttc

4860

gcaaatttgt acctgaggac taccacgccc acgagattag gttctacgaa gaccaatccc

4920

gcccgccaaa tgcggagctt accgcctgcg tcattaccca gggccacatt cttggccaat

4980

tgcaagccat caacaaagcc cgccaagagt ttctgctacg aaagggacgg ggggtttact

5040

tggaccccca gtccggcgag gagctcaacc caatcccccc gccgccgcag ccctatcagc

5100

agcagccgcg ggcccttgct tcccaggatg gcacccaaaa agaagctgca gctgccgccg

5160

ccacccacgg acgaggagga atactgggac agtcaggcag aggaggtttt ggacgaggag

5220

gaggaggaca tgatggaaga ctgggagagc ctagacgagg aagcttccga ggtcgaagag

5280

gtgtcagacg aaacaccgtc accctcggtc gcattcccct cgccggcgcc ccagaaatcg

5340

gcaaccggtt ccagcatggc tacaacctcc gctcctcagg cgccgccggc actgcccgtt

5400

cgccgaccca accgtagatg ggacaccact ggaaccaggg ccggtaagtc caagcagccg

5460

ccgccgttag cccaagagca acaacagcgc caaggctacc gctcatggcg cgggcacaag

5520

aacgccatag ttgcttgctt gcaagactgt gggggcaaca tctccttcgc ccgccgcttt

5580

cttctctacc atcacggcgt ggccttcccc cgtaacatcc tgcattacta ccgtcatctc

5640

tacagcccat actgcaccgg cggcagcggc agcggcagca acagcagcgg ccacacagaa

5700

gcaaaggcga ccggatagca agactctgac aaagcccaag aaatccacag cggcggcagc

5760

25

agcaggagga ggagcgctgc gtctggcgcc caacgaaccc gtatcgaccc gcgagcttag

5820

aaacaggatt tttcccactc tgtatgctat atttcaacag agcaggggcc aagaacaaga

5880

gctgaaaata aaaaacaggt ctctgcgatc cctcacccgc agctgcctgt atcacaaaag

5940

cgaagatcag cttcggcgca cgctggaaga cgcggaggct ctcttcagta aatactgcgc

6000

gctgactctt aaggactagt ttcgcgccct ttctcaaatt taagcgcgaa aactacgtca

6060

tctccagcgg ccacacccgg cgccagcacc tgtcgtcagc gccattatga gcaaggaaat

6120

tcccacgccc tacatgtgga gttaccagcc acaaatggga cttgcggctg gagctgccca

6180

agactactca acccgaataa actacatgag cgcgggaccc cacatgatat cccgggtcaa

6240

cggaatccgc gcccaccgaa accgaattct cttggaacag gcggctatta ccaccacacc

6300

tcgtaataac cttaatcccc gtagttggcc cgctgccctg gtgtaccagg aaagtcccgc

6360

tcccaccact gtggtacttc ccagagacgc ccaggccgaa gttcagatga ctaactcagg

6420

ggcgcagctt gcgggcggct ttcgtcacag ggtgcggtcg cccgggtcgc gagtttaaac

6480

tacacaggaa acaggagaca caactccaag tgcatactct atgtcatttt catgggactg

6540

gtctggccac aactacatta atgaaatatt tgccacatcc tcttacactt tttcatacat

6600

tgcccaagaa taaagaatcg tttgtgttat gtttcaacgt gtttattttt caattgcaga

6660

aaatttcaag tcatttttca ttcagtagta tagccccacc accacatagc ttatacagat

6720

caccgtacct taatcaaact cacagaaccc tagtattcaa cctgccacct ccctcccaac

6780

acacagagta cacagtcctt tctccccggc tggccttaaa aagcatcata tcatgggtaa

6840

cagacatatt cttaggtgtt atattccaca cggtttcctg tcgagccaaa cgctcatcag

6900

tgatattaat aaactccccg ggcagctcac ttaagttcat gtcgctgtcc agctgctgag

6960

ccacaggctg ctgtccaact tgcggttgct taacgggcgg cgaaggagaa gtccacgcct

7020

acatgggggt agagtcataa tcgtgcatca ggatagggcg gtggtgctgc agcagcgcgc

7080

gaataaactg ctgccgccgc cgctccgtcc tgcaggaata caacatggca gtggtctcct

7140

cagcgatgat tcgcaccgcc cgcagcataa ggcgccttgt cctccgggca cagcagcgca

7200

ccctgatctc acttaaatca gcacagtaac tgcagcacag caccacaata ttgttcaaaa

7260

tcccacagtg caaggcgctg tatccaaagc tcatggcggg gaccacagaa cccacgtggc

7320

catcatacca caagcgcagg tagattaagt ggcgacccct cataaacacg ctggacataa

7380

acattacctc ttttggcatg ttgtaattca ccacctcccg gtaccatata aacctctgat

7440

taaacatggc gccatccacc accatcctaa accagctggc caaaacctgc ccgccggcta

7500

tacactgcag ggaaccggga ctggaacaat gacagtggag agcccaggac tcgtaaccat

7560

ggatcatcat gctcgtcatg atatcaatgt tggcacaaca caggcacacg tgcatacact

7620

tcctcaggat tacaagctcc tcccgcgtta gaaccatatc ccagggaaca acccattcct

7680

gaatcagcgt aaatcccaca ctgcagggaa gacctcgcac gtaactcacg ttgtgcattg

7740

tcaaagtgtt acattcgggc agcagcggat gatcctccag tatggtagcg cgggtttctg

7800

tctcaaaagg aggtagacga tccctactgt acggagtgcg ccgagacaac cgagatcgtg

7860

ttggtcgtag tgtcatgcca aatggaacgc cggacgtagt catatttcct gaagcaaaac

7920

26

caggtgcggg cgtgacaaac agatctgcgt ctccggtctc gccgcttaga tcgctctgtg

7980

tagtagttgt agtatatcca ctctctcaaa gcatccaggc gccccctggc ttcgggttct

8040

atgtaaactc cttcatgcgc cgctgccctg ataacatcca ccaccgcaga ataagccaca

8100

cccagccaac ctacacattc gttctgcgag tcacacacgg gaggagcggg aagagctgga

8160

agaaccatgt tttttttttt attccaaaag attatccaaa acctcaaaat gaagatctat

8220

taagtgaacg cgctcccctc cggtggcgtg gtcaaactct acagccaaag aacagataat

8280

ggcatttgta agatgttgca caatggcttc caaaaggcaa acggccctca cgtccaagtg

8340

gacgtaaagg ctaaaccctt cagggtgaat ctcctctata aacattccag caccttcaac

8400

catgcccaaa taattctcat ctcgccacct tctcaatata tctctaagca aatcccgaat

8460

attaagtccg gccattgtaa aaatctgctc cagagcgccc tccaccttca gcctcaagca

8520

gcgaatcatg attgcaaaaa ttcaggttcc tcacagacct gtataagatt caaaagcgga

8580

acattaacaa aaataccgcg atcccgtagg tcccttcgca gggccagctg aacataatcg

8640

tgcaggtctg cacggaccag cgcggccact tccccgccag gaaccatgac aaaagaaccc

8700

acactgatta tgacacgcat actcggagct atgctaacca gcgtagcccc gatgtaagct

8760

tgttgcatgg gcggcgatat aaaatgcaag gtgctgctca aaaaatcagg caaagcctcg

8820

cgcaaaaaag aaagcacatc gtagtcatgc tcatgcagat aaaggcaggt aagctccgga

8880

accaccacag aaaaagacac catttttctc tcaaacatgt ctgcgggttt ctgcataaac

8940

acaaaataaa ataacaaaaa aacatttaaa cattagaagc ctgtcttaca acaggaaaaa

9000

caacccttat aagcataaga cggactacgg ccatgccggc gtgaccgtaa aaaaactggt

9060

caccgtgatt aaaaagcacc accgacagct cctcggtcat gtccggagtc ataatgtaag

9120

actcggtaaa cacatcaggt tgattcacat cggtcagtgc taaaaagcga ccgaaatagc

9180

ccgggggaat acatacccgc aggcgtagag acaacattac agcccccata ggaggtataa

9240

caaaattaat aggagagaaa aacacataaa cacctgaaaa accctcctgc ctaggcaaaa

9300

tagcaccctc ccgctccaga acaacataca gcgcttccac agcggcagcc ataacagtca

9360

gccttaccag taaaaaagaa aacctattaa aaaaacacca ctcgacacgg caccagctca

9420

atcagtcaca gtgtaaaaaa gggccaagtg cagagcgagt atatatagga ctaaaaaatg

9480

acgtaacggt taaagtccac aaaaaacacc cagaaaaccg cacgcgaacc tacgcccaga

9540

aacgaaagcc aaaaaaccca caacttcctc aaatcgtcac ttccgttttc ccacgttacg

9600

taacttccca ttttaagaaa actacaattc ccaacacata caagttactc cgccctaaaa

9660

cgttaacgcg gccgcctggg cctcatgggc cttcctttca ctgcccgctt tccagtcggg

9720

aaacctgtcg tgccagctgc attaacatgg tcatagctgt ttccttgcgt attgggcgct

9780

ctccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cgggtaaagc ctggggtgcc

9840

taatgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt

9900

ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg

9960

cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc

10020

tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc

10080

27

gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc

10140

aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac

10200

tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt

10260

aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct

10320

aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc

10380

ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt

10440

ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg

10500

atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc

10560

atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa

10620

tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt attagaaaaa ttcatccagc

10680

agacgataaa acgcaatacg ctggctatcc ggtgccgcaa tgccatacag caccagaaaa

10740

cgatccgccc attcgccgcc cagttcttcc gcaatatcac gggtggccag cgcaatatcc

10800

tgataacgat ccgccacgcc cagacggccg caatcaataa agccgctaaa acggccattt

10860

tccaccataa tgttcggcag gcacgcatca ccatgggtca ccaccagatc ttcgccatcc

10920

ggcatgctcg ctttcagacg cgcaaacagc tctgccggtg ccaggccctg atgttcttca

10980

tccagatcat cctgatccac caggcccgct tccatacggg tacgcgcacg ttcaatacga

11040

tgtttcgcct gatgatcaaa cggacaggtc gccgggtcca gggtatgcag acgacgcatg

11100

gcatccgcca taatgctcac tttttctgcc ggcgccagat ggctagacag cagatcctga

11160

cccggcactt cgcccagcag cagccaatca cggcccgctt cggtcaccac atccagcacc

11220

gccgcacacg gaacaccggt ggtggccagc cagctcagac gcgccgcttc atcctgcagc

11280

tcgttcagcg caccgctcag atcggttttc acaaacagca ccggacgacc ctgcgcgctc

11340

agacgaaaca ccgccgcatc agagcagcca atggtctgct gcgcccaatc atagccaaac

11400

agacgttcca cccacgctgc cgggctaccc gcatgcaggc catcctgttc aatcatactc

11460

ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata

11520

tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg

11580

ccac 11584

<---

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ получения рекомбинантного AAV вектора. Осуществляют совместную трансфекцию подходящей клеточной культуры с по меньшей мере двумя плазмидными векторами. Первый плазмидный вектор имеет размер остова плазмиды более 5000 пар оснований, предпочтительно от 7000 пар оснований до 7500 пар оснований и содержит гетерологичную нуклеотидную последовательность, фланкированную ITR, и вставочную последовательность ДНК, расположенную вне указанных ITR, предпочтительно рядом с одним ITR, где указанная вставочная последовательность имеет длину от 4400 пар оснований до 4800 пар оснований. Второй плазмидный вектор, содержащий в направлении от 5’ к 3’ кодирующую область rep AAV, кодирующую область cap AAV и нуклеотидную последовательность, содержащую промоторную область p5 AAV. Культивируют указанные клетки в условиях, обеспечивающих репликацию и упаковку AAV. Выделяют AAV векторов и сохраняют клетки в клеточной культуре в условиях, обеспечивающих дальнейшее деление и рост. Описан плазмидный вектор, содержащий: гетерологичную нуклеотидную последовательность, фланкированную ITR, и вставочную последовательность ДНК, расположенную вне указанных ITR и рядом с одним ITR, где указанная вставочная последовательность имеет длину от 4400 пар оснований до 4800 пар оснований, так что размер остова плазмиды составляет более 5 тысяч пар оснований, предпочтительно от 7000 пар оснований до 7500 пар оснований, где указанный плазмидный вектор не содержит нуклеотидную последовательность F1Ori в последовательности остова, и где указанный плазмидный вектор представляет собой pcohSgsh-900, как представлено в SEQ ID NO: 2. Также описан плазмидный вектор, содержащий аденовирусные хелперные функциональные элементы, включающие последовательности VA-RNA, E2A и E4, где указанная плазмида не содержит последовательности E3, pTB(E2B), ITR Ad и протеазы, и где указанный плазмидный вектор представляет собой pAdHelper-8615, как представлено в SEQ ID NO: 6. Изобретение расширяет арсенал средств получения рекомбинантных вирусных векторов. 4 н. и 9 з.п. ф-лы, 7 ил., 1 табл., 2 пр.

1. Способ получения рекомбинантного AAV вектора, причем указанный способ

предусматривает стадии:

a) совместной трансфекции подходящей клеточной культуры с по меньшей мере двумя плазмидными векторами:

i) первым плазмидным вектором, характеризующимся тем, что размер остова плазмиды составляет более 5000 пар оснований, предпочтительно от 7000 пар оснований до 7500 пар оснований, и содержащим гетерологичную нуклеотидную последовательность, фланкированную ITR, и вставочную последовательность ДНК, расположенную вне указанных ITR, предпочтительно рядом с одним ITR, где указанная вставочная последовательность имеет длину от 4400 пар оснований до 4800 пар оснований; и

ii) вторым плазмидным вектором, содержащим в направлении от 5’ к 3’ кодирующую область rep AAV, кодирующую область cap AAV и нуклеотидную последовательность, содержащую промоторную область p5 AAV,

b) культивирования указанных клеток в условиях, обеспечивающих репликацию и упаковку AAV,

c) выделения AAV векторов, полученных на стадии b), и сохранения клеток в клеточной культуре в условиях, обеспечивающих дальнейшее деление и рост,

d) повторной трансфекции клеток согласно стадии c) с плазмидными векторами согласно

стадии a) и

e) повторного проведения стадий b) - c).

2. Способ по п.1, где на стадии (a) проводится совместная трансфекция третьего плазмидного вектора, где указанный третий плазмидный вектор содержит аденовирусные хелперные функциональные элементы, включающие последовательности VA-RNA, E2A и E4, и где указанная плазмида не содержит последовательности E3, pTB(E2B), ITR Ad и протеазы.

3. Способ по любому из пп. 1 или 2, где на стадии b) AAV секретируются в супернатант клеточной культуры.

4. Способ по любому из пп. 1 - 3, где клеточную среду клеточной культуры заменяют перед стадией d).

5. Способ по п. 4, где замену клеточной среды проводят посредством перфузии.

6. Способ по любому из пп. 1 - 5, где стадии d), b) и c) повторяют по меньшей мере еще один

раз после стадии выделения c).

7. Способ по любому из пп. 1 - 6, где стадию b) проводят посредством культивирования

указанной клетки в суспензии во встряхиваемой жидкой среде.

8. Способ по любому из пп. 1 - 7, где указанный первый плазмидный вектор не содержит

нуклеотидную последовательность F1Ori в последовательности остова.

9. Способ получения рекомбинантного AAV вектора, причем указанный способ

предусматривает стадии:

a) совместной трансфекции подходящей клетки с

i) первым плазмидным вектором, содержащим гетерологичную нуклеотидную

последовательность, фланкированную ITR, где указанный первый плазмидный вектор

характеризуется тем, что размер остова плазмиды составляет более 5000 пар оснований,

предпочтительно от 7000 пар оснований до 7500 пар оснований, и что содержит вставочную

последовательность ДНК, расположенную вне указанных ITR, предпочтительно рядом с

одним ITR, где указанная вставочная последовательность имеет длину от 4400 пар

оснований до 4800 пар оснований,

ii) вторым плазмидным вектором, содержащим в направлении от 5’ к 3’ кодирующую

область rep AAV, кодирующую область cap AAV и нуклеотидную последовательность,

содержащую промоторную область p5 AAV, и

iii) третьим плазмидным вектором, содержащим аденовирусные хелперные функциональные элементы, включающие последовательности VA-RNA, E2A и E4, где

указанная плазмида не содержит последовательности E3, pTB(E2B), ITR Ad и протеазы,

b) культивирования указанной клетки в условиях, обеспечивающих репликацию и упаковку

AAV, и

c) выделения AAV векторов, полученных на стадии b).

10. Способ по п. 9, где указанный первый плазмидный вектор i) не содержит нуклеотидную

последовательность F1Ori в последовательности остова.

11. Способ по любому из пп. 9 или 10, где указанный второй плазмидный вектор (ii) содержит кодирующие области Rep2 AAV и Cap9 AAV.

12. Плазмидный вектор, содержащий:

a) гетерологичную нуклеотидную последовательность, фланкированную ITR, и

b) вставочную последовательность ДНК, расположенную вне указанных ITR и рядом с

одним ITR, где указанная вставочная последовательность имеет длину от 4400 пар оснований до 4800 пар оснований, так что размер остова плазмиды составляет более 5 тысяч пар оснований, предпочтительно от 7000 пар оснований до 7500 пар оснований, где указанный плазмидный вектор не содержит нуклеотидную последовательность F1Ori в последовательности остова, и где указанный плазмидный вектор представляет собой pcohSgsh-900, как представлено в SEQ ID NO: 2.

13. Плазмидный вектор, содержащий аденовирусные хелперные функциональные

элементы, включающие последовательности VA-RNA, E2A и E4, где указанная плазмида

не содержит последовательности E3, pTB(E2B), ITR Ad и протеазы, и где указанный плазмидный вектор представляет собой pAdHelper-861, как представлено в SEQ ID NO: 6.