КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ И ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ ДЕГЕНЕРАЦИИ ЖЕЛТОГО ПЯТНА Российский патент 2019 года по МПК A61K48/00 C07K14/71 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение в целом относится к способам лечения и предотвращения дегенерации желтого пятна у человека. В частности, настоящее изобретение относится к способам лечения или предотвращения дегенерации желтого пятна с использованием рецептора фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), Flt-1.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Возрастная дегенерация желтого пятна (AMD) представляет собой основную причину центральной необратимой слепоты у пожилых людей. Раннее клиническое проявление AMD включает субретинальное накопление дебриса (друз). У прогрессирующих пациентов развивается или географическая атрофия (GA), со значительной дегенерацией и атрофией клеток желтого пятна, или неоваскулярная AMD (nAMD), с хориоидальной неоваскуляризацией, возникающей на конечной стадии патологического процесса в попытке сохранить дегенерирующую сетчатку. Слепота возникает, когда после дегенерации пигментного эпителия сетчатки (RPE) желтого пятна атрофируются фоторецепторы.

Патогенез зависит от старения, экологических и генетических факторов риска, но молекулярный механизм, отвечающий за начало заболевания, главным образом остается неизвестным. Наиболее значимым генетическим фактором является миссенс-мутация, расположенная в гене иммунорегуляторного фактора комплемента H (CFH).

Патологическая неоваскуляризация, связанная с глазными нарушениями, такими как nAMD, опосредована повышающей регуляцией фактора роста эндотелия сосудов (VEGF). Показано, что ингибирование VEGF с использованием антител, растворимых рецепторов или аптамеров является многообещающим клиническим подходом для управления этими заболеваниями. Несмотря на то, что реализованы существенные улучшения в ведении AMD, существующие антагонисты VEGF требуют повторного интравитреального введения, что может обременять как пациента, так и лечащего врача.

Соответственно, сохраняется потребность в разработке способов лечения дегенерация желтого пятна у человека, которые являются менее обременительным и коммерчески жизнеспособным.

Настоящее изобретение основано на том открытии, что растворимые рецепторы Flt-1 способны лечить дегенерацию желтого пятна у субъектов-людей. Терапевтические результаты наблюдают в широком диапазоне доз, когда растворимые рецепторы доставляют с использованием rAAV-опосредованной доставки гена. Высокие дозы переносимы и дают терапевтические эффекты. Кроме того, авторы изобретения в настоящем документе продемонстрировали, что интравитреальная доставка однократной дозы всего лишь 2×10⁸ векторных геномов (vg), а также 2×10¹⁰ vg, приводила к значительному снижению субретинального и интраретинального текучего вещества через два месяца после инъекции.

Соответственно, в одном из вариантов осуществления изобретение направлено на способ лечения дегенерации желтого пятна у субъекта-человека, который включает введение в пораженный глаз субъекта композиции, которая содержит вирион рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), который содержит полинуклеотид, кодирующий растворимый белок, который содержит по меньшей мере один домен рецептора фактора роста эндотелия сосудов 1 (VEGFR-1 или Flt-1), способный модулировать активность VEGF, в котором приблизительно от 1×10⁷ приблизительно до 1×10¹³ вирионов rAAV доставляют в глаз.

В дополнительных вариантах осуществления изобретение направлено на способ лечения отека желтого пятна у субъекта-человека, который включает введение в пораженный глаз субъекта композиции, которая содержит вирион рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), который содержит полинуклеотид, который кодирует растворимый белок, который содержит по меньшей мере один домен VEGFR-1 (Flt-1), способный модулировать активность VEGF, в котором приблизительно от 1×10⁷ приблизительно до 1×10¹³ вирионов rAAV доставляют в глаз.

В вариантах осуществления приведенного выше способа приблизительно от 1×10⁷ приблизительно до 1×10¹²; от 1×10⁸ приблизительно до 1×10¹²; приблизительно от 1×10⁸ приблизительно до 1×10¹¹; приблизительно от 1×10⁸ приблизительно до 1×10¹⁰; приблизительно от 1×10⁸ приблизительно до 1×10⁹; приблизительно от 2×10⁷ приблизительно до 2×10¹²; приблизительно от 2×10⁸ приблизительно до 2×10¹²; приблизительно от 2×10⁸ приблизительно до 2×10¹¹; приблизительно от 2×10⁸ приблизительно до 2×10¹⁰; приблизительно от 2×10⁸ приблизительно до 2×10⁹; от 2×10⁹ приблизительно до 2×10¹⁰; приблизительно от 1×10¹⁰ приблизительно до 1×10¹³; приблизительно от 1×10¹⁰ приблизительно до 1×10¹²; приблизительно от 1×10¹⁰ приблизительно до 1×10¹¹; приблизительно от 2×10¹⁰ приблизительно до 1×10¹³; от 2×10¹⁰ приблизительно до 1×10¹²; приблизительно от 2×10¹⁰ приблизительно до 2×10¹²; приблизительно от 2×10¹⁰ приблизительно до 1×10¹¹; или приблизительно от 2×10¹⁰ приблизительно до 2×10¹¹ вирионов rAAV вводят в глаз. В некоторых вариантах осуществления приблизительно 1×10⁷, приблизительно 2×10⁷, приблизительно 6×10⁷, приблизительно 1×10⁸, приблизительно 2×10⁸, приблизительно 6×10⁸, приблизительно 1×10⁹, приблизительно 2×10⁹, приблизительно 6×10⁹, приблизительно 1×10¹⁰, приблизительно 2×10¹⁰, приблизительно 6×10¹⁰, приблизительно 1×10¹¹, приблизительно 2×10¹¹, приблизительно 6×10¹¹, приблизительно 1×10¹², приблизительно 2×10¹², приблизительно 6×10¹² или приблизительно 1×10¹³ вирионов rAAV вводят в глаз.

В дополнительных вариантах осуществления изобретение направлено на способ лечения дегенерации желтого пятна у субъекта-человека, который включает введение в пораженный глаз субъекта композиции, которая содержит вирион рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), который содержит полинуклеотид, который кодирует растворимый белок, который содержит по меньшей мере один домен VEGFR-1 (Flt-1), способный модулировать активность VEGF, в котором меньше чем приблизительно 2×10¹⁰ вирионов rAAV доставляют в глаз.

В дополнительных вариантах осуществления изобретение направлено на способ лечения отека желтого пятна у субъекта-человека, который включает введение в пораженный глаз субъекта композиции, которая содержит вирион рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), который содержит полинуклеотид, который кодирует растворимый белок, который содержит по меньшей мере один домен VEGFR-1 (Flt-1), способный модулировать активность VEGF, в котором меньше чем приблизительно 2×10¹⁰ вирионов rAAV доставляют в глаз.

В каком-либо из приведенных выше способов композиция дополнительно может содержать офтальмологически приемлемый наполнитель.

В дополнительных вариантах осуществления приведенных выше способов, одну интравитреальную инъекцию вирионов rAAV вводят в глаз.

В дополнительных вариантах осуществления растворимый белок содержит:

(a) по меньшей мере один домен Flt-1;

(b) мультимеризационный домен, полученный из тяжелой цепи иммуноглобулина; и

(c) линкер 5-25 аминокислотных остатков в длину, который соединяет (a) с (b),

где, когда экспрессируют растворимый белок, получают мультимер растворимого белка.

В каком-либо из приведенных выше способов по меньшей мере один домен содержит домен 2 из Flt-1.

В дополнительных вариантах осуществления мультимер представляет собой гомодимер.

В дополнительных вариантах осуществления мультимеризационный домен содержит Fc-область из IgG или ее активный фрагмент.

В определенных вариантах осуществления приведенных выше способов мультимеризационный домен содержит CH3 домен из IgG или его активный фрагмент.

В дополнительных вариантах осуществления мультимеризационный домен происходит из IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, например, из константной области тяжелой цепи IgG1.

В дополнительных вариантах осуществления линкер выбирают из группы, состоящей из:

gly₉ (SEQ ID № 1);

glu₉ (SEQ ID № 2);

ser₉ (SEQ ID № 3);

gly₅cyspro₂cys (SEQ ID № 4);

(gly₄ser)₃ (SEQ ID № 5);

SerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn (SEQ ID № 6);

ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn (SEQ ID № 7);

GlyAspLeuIleTyrArgAsnGlnLys (SEQ ID № 8); и

Gly₉ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn (SEQ ID № 9).

В других вариантах осуществления растворимый белок имеет формулу X-Y-Z, в которой X содержит IgG-подобный домен 2 из Flt-1, в которой Y представляет собой Gly₉ (SEQ ID № 1) и в которой Z представляет собой IgG Fc-область или CH3 область IgG.

В дополнительных вариантах осуществления мультимеризационный домен является гуманизированным.

В дополнительных вариантах осуществления растворимый белок содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (a) аминокислотной последовательности, изображенной на фиг. 2A-2B (SEQ ID № 11); (b) аминокислотной последовательности, изображенной на фиг. 6 (SEQ ID № 15); (c) аминокислотной последовательности, изображенной на фиг. 8 (SEQ ID № 17); (d) аминокислотной последовательности, изображенной на фиг. 12 (SEQ ID № 21); и (e) активного варианта (a), (b), (c) или (d), который обладает идентичностью последовательностей с ними по меньшей мере 90%.

В вариантах осуществления какого-либо из приведенных выше способов для лечения дегенерации желтого пятна, дегенерация желтого пятна представляет собой возрастную дегенерацию желтого пятна (AMD), такую как влажная AMD.

В дополнительных вариантах осуществления приведенных выше способов, способ включает уменьшение внутриглазного давления, толщины сетчатки, субретинальных текучих веществ, интраретинальных текучих веществ или тому подобного.

В дополнительных вариантах осуществления какого-либо из приведенных выше способов, вирион rAAV получают из серотипа AAV, выбранного из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVAAVrh8, AAVrh8R, AAV10, AAVrh10, AAV11 или AAV12.

В вариантах осуществления какого-либо из приведенных выше способов, приблизительно от 2×10⁸ до меньше чем 2×10¹⁰ вирионов rAAV доставляют в глаз, например, приблизительно до 2×10⁸ вирионов rAAV или приблизительно до 2×10⁹ вирионов rAAV.

Эти и другие варианты осуществления рассматриваемого изобретения без труда придут на ум специалистам в данной области ввиду раскрытия в настоящем документе.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

На фиг. 1 (SEQ ID № 10) представлена последовательность ДНК для слитного белка, который содержит Flt-1, который обозначают в настоящем документе «белок sFLT01».

На фиг. 2A-2B (SEQ ID № 11) представлена аминокислотная последовательность для белка sFLT01.

На фиг. 3 (номер доступа GenBank NM003376) (SEQ ID № 12) представлена последовательность ДНК, которая кодирует VEGF.

На фиг. 4 (номер доступа GenBank CAC19513) (SEQ ID № 13) представлена аминокислотная последовательность для VEGF.

На фиг. 5 (SEQ ID № 14) представлена последовательность ДНК для дополнительного слитного белка, который содержит растворимый Flt-1, соединенный линкером Gly₉ с VEGF мультимеризационным доменом, Ex3.

На фиг. 6 (SEQ ID № 15) представлена аминокислотная последовательность, кодируемая посредством последовательностью ДНК на фиг. 5 (SEQ ID № 14).

На фиг. 7 (SEQ ID № 16) представлена последовательность ДНК для дополнительного слитного белка, содержащего растворимый Flt-1, который соединен с помощью Gly₉ с VEGF мультимеризационным доменом, Ex3, и последовательность из CH3 области IgG1.

На фиг. 8 (SEQ ID № 17) представлена аминокислотная последовательность, кодируемая последовательностью ДНК с фиг. 7 (SEQ ID № 16).

На фиг. 9A-9B (номер доступа GenBank NM_002019) (SEQ ID № 18) представлена последовательность ДНК, которая кодирует репрезентативный белок рецептора Flt-1.

На фиг. 10A-10E (номер доступа GenBank P17948) (SEQ ID № 19) представлена аминокислотная последовательность репрезентативного белка рецептора Flt-1.

На фиг. 11 (SEQ ID № 20) представлена последовательность ДНК для слитного белка, содержащего Flt-1, который называют в настоящем документе «белок sFLT02», который содержит растворимый Flt-1, соединенный с помощью Gly₉ (SEQ ID № 1) с последовательностью из CH3 области IgG1.

На фиг. 12 (SEQ ID № 21) представлена аминокислотная последовательность для белка sFLT02.

На фиг. 13 (номер доступа Genbank Y14737) (SEQ ID № 22) представлена нуклеотидная последовательность тяжелой цепи лямбда IgG1.

На фиг. 14A-14B (SEQ ID № 23) представлена аминокислотная последовательность тяжелой цепи лямбда IgG1.

На фиг. 15A-15B представлены изменения относительно базового уровня (фиг. 15A) (как измеряют с помощью оптической когерентной томографии) субретинального и интраретинального текучего вещества в человеческом глазу, который лечили с использованием однократной дозы 2×10⁸ rAAV2-sFLT01 (фиг. 15B).

На фиг. 16A-16B представлены изменения относительно базового уровня (фиг. 16A) (как измеряют с помощью оптической когерентной томографии) субретинального и интраретинального текучего вещества в человеческом глазу, который лечили с использованием однократной дозы 2×10¹⁰ rAAV2-sFLT01 (фиг. 16B).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В практическом осуществлении настоящего изобретения применяют, если не указано иное, стандартные способы химии, биохимии, способы рекомбинантной ДНК и иммунологии, в пределах компетенции в данной области техники. Такие способы полностью описаны в литературе. См., например, Fundamental Virology, 2-е издание, том I & II (под редакцией B.N. Fields и D.M. Knipe); Handbook of Experimental Immunology, тома I-IV (под редакцией D.M. Weir и C.C. Blackwell, Blackwell Scientific Publications); T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., текущее дополнение); Methods In Enzymology (под редакцией S. Colowick и N. Kaplan, Academic Press, Inc.); Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., 4-е издание., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012); Current Protocols in Molecular Biology (под редакцией F.M. Ausubel, et al., 2003); серию Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); PCR 2: A Practical Approach (под редакцией M.J. MacPherson, B.D. Hames и G.R. Taylor, 1995); Antibodies, A Laboratory Manual (под редакцией Harlow и Lane, 1988); Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (R.I. Freshney, 6-е издание., J. Wiley and Sons, 2010); Oligonucleotide Synthesis (под редакцией M.J. Gait, 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (под редакцией J.E. Cellis, Academic Press, 1998); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, Plenum Press, 1998); Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (под редакцией A. Doyle, J.B. Griffiths и D.G. Newell, J. Wiley and Sons, 1993-8); Перенос гена Vectors for Mammalian Cells (под редакцией J.M. Miller и M.P. Calos, 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (под редакцией Mullis et al., 1994); Current Protocols in Immunology (под редакцией J.E. Coligan et al., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (под редакцией Ausubel et al., J. Wiley and Sons, 2002); Immunobiology (C.A. Janeway et al., 2004); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (под редакцией D. Catty., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (под редакцией P. Shepherd и C. Dean, Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); Antibodies (под редакцией M. Zanetti и J. D. Capra, Harwood Academic Publishers, 1995); и Cancer: Principles and Practice of Oncology (под редакцией V.T. DeVita et al., J.B. Lippincott Company, 2011).

Все публикации, патенты и патентные заявки, а также номера доступа, процитированные в настоящем документе, выше или ниже, включены, таким образом, посредством ссылки в полном объеме.

1. Определения

В описании настоящего изобретения использованы следующие термины, которые следует определять, как указано далее.

Следует отметить, что, как используют в этом описании и приложенной формуле изобретения, формы единственного числа включают формы множественного числа до тех пор, пока контекст явно не диктует иное. Таким образом, например, упоминание о «рецепторе Flt-1» включает смесь из двух или более таких рецепторов и т. п.

Как используют в настоящем документе, «возрастная дегенерация желтого пятна» или «AMD» включает раннюю, промежуточную и прогрессирующую AMD, а также включает как сухую AMD, такую как географическая атрофия, так и влажную AMD, также известную как неоваскулярная или экссудативная AMD. Эти состояния описаны более полно далее.

Как используют в настоящем документе, «отек желтого пятна» относится к накоплению текучего вещества внутри сетчатки, которое может вызывать отек или утолщение области желтого пятна глаза. Отек желтого пятна развивается, когда из кровеносных сосудов в сетчатке просачиваются текучие вещества. Патофизиология типично включает нестабильность сосудов и разрушение гематоретинального барьера. Кистовидный отек желтого пятна (CME), наиболее распространенный наблюдаемый тип, включает накопление текучего вещества в наружном плексиформном слое, которое вторично по отношению к анормальному перифовеальной капиллярной проницаемости сетчатки. Макула не функционирует должным образом, когда она отекла. Может иметь место потеря зрения от умеренной до тяжелой, но в некоторых случаях сохраняется периферическое зрение.

Термины «белок Flt-1» и «белок VEGF-R1» используют взаимозаменяемо в настоящем документе, и оно обозначают рецепторный белок, о котором известно, что он связывает VEGF. Термины «белок Flt-1» и «белок VEGF-R1» или нуклеотидная последовательность, кодирующая его, относится к белку или нуклеотидной последовательности, соответственно, которые получают из любого белка Flt-1, независимо от источника. Термины, как используют в настоящем документе, относятся к молекулам, способным связываться с VEGF и модулировать его активность, как измеряют в любом из известных тестов активности VEGF, включая те, которые дополнительно описаны в настоящем документе. Полноразмерная нуклеотидная последовательность и соответствующая аминокислотная последовательность репрезентативного белка Flt-1 представлены на фиг. 9A-9B (SEQ ID № 18) и 10A-10E (SEQ ID № 19), соответственно. Однако белок Flt-1, как определено в настоящем документе, не ограничен изображенными последовательностями, поскольку известно несколько таких рецепторов, и вариации в этих рецепторах будут встречаться между биологическими видами. Неограничивающие примеры дополнительных последовательностей белка Flt-1 можно найти по номерам доступа GenBank AF063657.2; BC039007.1; U01134.1; HD077716.1; X51602.1; EU360600.1; AK300392.1; EU826561.1; EU368830.1; AB385191.1; AK292936.1; AK309901.1; AB209050.1; BC029849.1; BC039007.1; NM_001160031.1; NM_001160030.1; NM_002019.4; NM_001159920.1.

Полноразмерные белки, с сигнальной последовательностью или без нее, и их фрагменты, а также белки с модификациями, такими как делеции, добавления и замены (или консервативные или неконсервативные по природе) в нативной последовательности, предназначены для применения по настоящему документу, при условии, что белок сохраняет желаемую активность. Такие активные варианты и фрагменты рассматривают как VEGF1 рецепторы в контексте настоящего изобретения. Модификации могут быть преднамеренными, как через сайт-специфический мутагенез, или могут быть случайными, такими как через мутации организмов-хозяев, которые продуцируют белки, или ошибки из-за ПЦР амплификации. Соответственно, активные белки, по существу гомологичные родительской последовательности, например, белки с 70...80...85...90...95...98...99% и т. д. идентичностью, которые сохраняют способность модулировать активность соответствующего лиганда, предусмотрены в настоящем документе для применения.

«Нативный» полипептид, такой как рецептор Flt-1, относится к полипептиду, который имеет ту же аминокислотную последовательность, что и соответствующая молекула, полученная из природы. Такие нативные последовательности можно выделять из природы или можно получать с помощью рекомбинантных или синтетических средств. Термин «нативная» последовательность, в частности, охватывает встречающиеся в природе усеченные или секретируемые формы конкретной молекулы (например, последовательность внеклеточного домена), встречающиеся в природе формы вариантов (например, формы с альтернативным сплайсингом) и встречающиеся в природе аллельные варианты полипептида. В различных вариантах осуществления изобретения нативные молекулы, описанные в настоящем документе, представляют собой зрелые или полноразмерные нативные последовательности, которые содержат полноразмерные аминокислотные последовательности, представленные на сопроводительных фиг. Однако, хотя некоторые из молекул, раскрытых на сопроводительных фиг., начинаются с остатков метионина, обозначенных как аминокислотное положение 1 на фиг., другие остатки метионина, расположенные или выше или ниже по направлению считывания относительно аминокислотного положения 1 на фиг., можно использовать в качестве начального аминокислотного остатка для конкретной молекулы. Альтернативно, в зависимости от используемой экспрессирующей системы, молекулы, описанные в настоящем документе, могут не содержать N-концевой метионин.

Под «внеклеточным доменом» понимают форму рецепторного полипептида, которая содержит весь внеклеточный домен или его фрагмент и не содержит весь трансмембранный домен или его часть, и также может быть лишена цитоплазматического домена. Типично, когда используют в настоящем изобретении, внеклеточный домен по существу не содержит ни трансмембранный, ни цитоплазматический домены. Как правило, внеклеточный домен содержит меньше чем 10% от таких трансмембранных и/или цитоплазматических доменов, меньше чем 5% от этих доменов, меньше чем 1% или меньше чем 0,5% от таких доменов. Трансмембранные домены для рецепторов, описанных в настоящем документе, можно идентифицировать в соответствии с критериями, которые обычно используют в данной области для идентификации гидрофобных доменов, например, с использованием стандартных графиков гидрофобности, таких как те, которые вычисляют с использованием способа Кайта-Дулитла, Kyte et al., J. Mol. Biol. (1982) 157:105-132.

Как изложено выше, рецепторы для использования в настоящем изобретении могут содержать или могут не содержать нативную сигнальную последовательность. Приблизительные местоположения сигнальных пептидов рецепторов, описанных в настоящем документе, приведены в описании и на сопроводительных фиг. Однако следует отметить, что C-концевая граница сигнального пептида может варьировать, типично не больше чем приблизительно на 5 аминокислот в любую сторону от C-концевой границы сигнального пептида, как описано в настоящем документе. C-концевую границу сигнального пептида можно идентифицировать в соответствии с критериями, которые обычно используют в данной области, например, как описано в Nielsen et al., Prot. Eng. (1997) 10:1-6 и von Heinje et al., Nucl. Acids. Res. (1986) 14:4683-4690. Кроме того, также принимают во внимание, что в некоторых случаях отщепление сигнальной последовательности от секретируемого полипептида происходит не полностью однородно, что ведет к больше чем одной секретируемой частице. Эти зрелые полипептиды, в которых отщепление сигнального пептида происходит в пределах не больше чем приблизительно 5 аминокислот по любую сторону от C-концевой границы сигнального пептида, как идентифицировано в настоящем документе, и полинуклеотиды, кодирующие их, предусмотрены настоящим изобретением.

Под «вариантом» понимают активный полипептид, как определено в настоящем документе, который обладает по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью аминокислотных последовательностей с соответствующей полноразмерной нативной последовательностью, полипептид, который не содержит сигнальный пептид, внеклеточный домен полипептида, с сигнальным пептидом или без него, или какой-либо другой фрагмент полноразмерной полипептидной последовательности, как описано в настоящем документе. Такие варианты полипептидов включают, например, полипептиды, в которых один или несколько аминокислотных остатков добавляют или удаляют на N- и/или C-конце полноразмерной нативной аминокислотной последовательности. В вариантах осуществления определенный вариант будет обладать по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью аминокислотных последовательностей, альтернативно по меньшей мере приблизительно 81% идентичностью аминокислотных последовательностей, альтернативно по меньшей мере приблизительно 82% идентичностью аминокислотных последовательностей, альтернативно по меньшей мере приблизительно 83% идентичностью аминокислотных последовательностей, альтернативно по меньшей мере приблизительно 84% идентичностью аминокислотных последовательностей, альтернативно по меньшей мере приблизительно 85% идентичностью аминокислотных последовательностей, альтернативно по меньшей мере приблизительно 86% идентичностью аминокислотных последовательностей, альтернативно по меньшей мере приблизительно 87% идентичностью аминокислотных последовательностей, альтернативно по меньшей мере приблизительно 88% идентичностью аминокислотных последовательностей, альтернативно по меньшей мере приблизительно 89% идентичностью аминокислотных последовательностей, альтернативно по меньшей мере приблизительно 90% идентичностью аминокислотных последовательностей, альтернативно по меньшей мере приблизительно 91% идентичностью аминокислотных последовательностей, альтернативно по меньшей мере приблизительно 92% идентичностью аминокислотных последовательностей, альтернативно по меньшей мере приблизительно 93% идентичностью аминокислотных последовательностей, альтернативно по меньшей мере приблизительно 94% идентичностью аминокислотных последовательностей, альтернативно по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью аминокислотных последовательностей, альтернативно по меньшей мере приблизительно 96% идентичностью аминокислотных последовательностей, альтернативно по меньшей мере приблизительно 97% идентичностью аминокислотных последовательностей, альтернативно по меньшей мере приблизительно 98% идентичностью аминокислотных последовательностей и альтернативно по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью аминокислотных последовательностей с соответствующей полноразмерной нативной последовательностью. В вариантах осуществления, полипептиды вариантов составляют по меньшей мере приблизительно 10 аминокислот в длину, например, по меньшей мере приблизительно 20 аминокислот в длину, например, по меньшей мере приблизительно 30 аминокислот в длину, альтернативно по меньшей мере приблизительно 40 аминокислот в длину, альтернативно по меньшей мере приблизительно 50 аминокислот в длину, альтернативно по меньшей мере приблизительно 60 аминокислот в длину, альтернативно по меньшей мере приблизительно 70 аминокислот в длину, альтернативно по меньшей мере приблизительно 80 аминокислот в длину, альтернативно по меньшей мере приблизительно 90 аминокислот в длину, альтернативно по меньшей мере приблизительно 100 аминокислот в длину, альтернативно по меньшей мере приблизительно 150 аминокислот в длину, альтернативно по меньшей мере приблизительно 200 аминокислот в длину, альтернативно по меньшей мере приблизительно 300 аминокислот в длину или больше. Варианты включают замены, которые являются консервативными или неконсервативными по природе. Например, полипептид, представляющий интерес, может содержать приблизительно до 5-10 консервативных или неконсервативных аминокислотных замен или даже приблизительно до 15-25 или 50 консервативных или неконсервативных аминокислотных замен или любое число между 5 и 50, при условии, что желаемая функция молекулы остается интактной.

«Гомология» относится к проценту идентичности между двумя полинуклеотидными или двумя полипептидными фрагментами. Две ДНК или две полипептидные последовательности «по существу гомологичны» друг другу, когда последовательности демонстрируют по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80-85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95-98% идентичности последовательностей, по меньшей мере приблизительно 99% или какой-либо процент между ними при определенной длине молекул. Как используют в настоящем документе, по существу гомологичные также относится к последовательностям, которые демонстрируют полную идентичность с точно определенной ДНК или полипептидной последовательностью.

В целом, «идентичность» относится к строгому соответствию нуклеотида с нуклеотидом или аминокислоты с аминокислотой из двух полинуклеотидных или полипептидных последовательностей, соответственно. Способы определения процента идентичность хорошо известны в данной области. Например, процент идентичность можно определять с помощью прямого сравнения информации о последовательности между двумя молекулами посредством выравнивания последовательностей, подсчета точного числа совпадений между двумя выровненными последовательностями, деления на длину более короткой последовательности и умножения результата на 100. Легко доступные компьютерные программы можно использовать для помощи в анализе, такие как ALIGN, Dayhoff, M.O. in Atlas of Protein Sequence and Structure, под редакцией M.O. Dayhoff, 5 Suppl. 3:353 358, National Biomedical Research Foundation, Washington, DC, которые адаптируют алгоритм локальной гомологии Смита-Вотермана (Advances in Appl. Math. 2:482 489, 1981) для анализа пептидов. Программы для определения идентичности нуклеотидных последовательностей доступны в Wisconsin Sequence Analysis Package версии 8 (доступен в Genetics Computer Group, Madison, WI) например, программы BESTFIT, FASTA и GAP, которые также основаны на алгоритме Смита-Вотермана. Эти программы легко использовать с параметрами по умолчанию, рекомендованными производителем и описанными в Wisconsin Sequence Analysis Package, который упомянут выше. Например, процент идентичности конкретной нуклеотидной последовательности и эталонной последовательности можно определять с использованием алгоритма гомологии Смита-Вотермана с использованием оценочной таблицы и штрафа за пропуск шести нуклеотидных положений.

Другой способ установления процента идентичность в контексте по настоящему изобретению состоит в использовании пакета программ MPSRCH, авторское право на который принадлежит University of Edinburgh, разработчики John F. Collins и Shane S. Sturrok, и который распространяет IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). Из этого комплекта пакетов можно использовать алгоритм Смита-Вотермана, где для оценочной таблицы используют параметры по умолчанию (например, штраф за открытие пропуска 12, штраф за продолжение пропуска 1 и пропуск 6). В генерируемых данных значение «Match» отражает «идентичность последовательностей». Другие подходящие программы для вычисления процента идентичность или сходства между последовательностями в целом известны в данной области, например, другой программой выравнивания является BLAST, используемая с параметрами по умолчанию. Например, BLASTN и BLASTP можно использовать с использованием следующих параметров по умолчанию: genetic code=standard; filter=none; strand=both; cutoff=60; expect=10; matrix=BLOSUM62; descriptions=50 sequences; sort by=HIGH SCORE; Data base=non redundant, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+Swiss protein+Spupdate+PIR. Детали в отношении этих программ хорошо известны в данной области.

Альтернативно, гомологию можно определять посредством гибридизации полинуклеотидов в условиях, которые образуют стабильные дуплексы между гомологичными областями, после чего следует расщепление с использованием одноцепочечной специфичной нуклеазы(нуклеаз) и определение размера расщепленных фрагментов. Последовательности ДНК, которые по существу гомологичны, можно идентифицировать в эксперименте по саузерн-гибридизации, например, при строгих условиях, как определено для этой конкретной системы. Определение подходящих условий гибридизации известно специалистам в данной области. См., например, Sambrook et al., выше; DNA Cloning, выше; Nucleic Acid Hybridization, выше.

Под термином «вырожденный вариант» понимают полинуклеотид, содержащий изменения в его последовательности нуклеиновой кислоты, который кодирует полипептид, имеющий ту же аминокислотную последовательность, что и полипептид, кодируемый полинуклеотидом, из которого получают вырожденный вариант.

«Кодирующая последовательность» или последовательность, которая «кодирует» выбранный полипептид, представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которую транскрибируют (в случае ДНК) и транслируют (в случае мРНК) в полипептид, когда помещают под управление подходящих регуляторных последовательностей. Границы кодирующей последовательности определяет инициирующий кодон на 5ʹ (амино) конце и терминирующий трансляцию кодон на 3ʹ (карбокси) конце. Последовательность терминации транскрипции может быть расположена 3ʹ относительно кодирующей последовательности.

Под «вектором» понимают какой-либо генетический элемент, такой как плазмида, фаг, транспозон, космида, хромосома, вирус, вирион и т. д., который способен к репликации, когда связан с надлежащими управляющими элементами, и который может переносить последовательности генов в клетки. Таким образом, термин включает носители для клонирования и экспрессии, а также вирусные векторы.

Под «рекомбинантным вектором» понимают вектор, который содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, которая способна к экспрессии в клетке.

«Рекомбинантный вирусный вектор» относится к рекомбинантному полинуклеотидному вектору, который содержит одну или несколько гетерологичных последовательностей (т. е., последовательность нуклеиновой кислоты не вирусного происхождения). В случае рекомбинантных AAV векторов, рекомбинантную нуклеиновую кислоту фланкирует по меньшей мере одна, в вариантах осуществления две, последовательности инвертированных концевых повторов (ITR).

«Рекомбинантный AAV вектор (rAAV вектор)» относится к полинуклеотидному вектору, который содержит одну или несколько гетерологичных последовательностей (т. е., последовательность нуклеиновой кислоты не AAV происхождения), которые фланкированы по меньшей мере одной, в вариантах осуществления двумя, последовательностями инвертированных концевых повторов AAV (ITR). Такие rAAV векторы можно реплицировать и упаковывать в инфекционные вирусные частицы, когда присутствуют в клетке-хозяине, которую инфицировали подходящим вирусом-помощником (или которая экспрессирует подходящие хелперные функции) и которая экспрессирует продукты генов rep и cap AAV (т. е. белки Rep и Cap AAV). Когда rAAV вектор встраивают в более крупный полинуклеотид (например, в хромосому или в другой вектор, такой как плазмида, используемая для клонирования или трансфекции), тогда rAAV вектор можно обозначать как «провектор», который можно «спасать» посредством репликации и заключения в капсид в присутствии упаковывающих функций AAV и подходящих хелперных функциях. rAAV вектор может быть в любой из множества форм, включая, в качестве неограничивающих примеров, плазмиды, линейные искусственные хромосомы, находящиеся в комплексе с липидами, инкапсулированные в липосомы, и заключенные в капсид вирусной частицы, в частности AAV частицы. rAAV вектор можно упаковывать в капсид вируса AAV для того, чтобы создавать «рекомбинантную аденоассоциированную вирусную частицу (rAAV частицу)».

Под «рекомбинантным вирусом» понимают вирус, который генетически измене, например, посредством добавления или инсерции конструкции гетерологичной нуклеиновой кислоты в частицу.

Термин «трансфекция» используют, чтобы отослать к накоплению инородной ДНК клеткой, и клетка «трансфицирована», когда экзогенная ДНК введена внутрь клеточной мембраны. Множество способов трансфекции в целом известно в данной области. См., например, Graham et al. (1973) Virology, 52:456, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, и Chu et al. (1981) Gene 13:197. Такие способы можно использовать для того, чтобы вводить одну или несколько экзогенных молекул в подходящие клетки-хозяева.

Термин «гетерологичный», когда он относится к последовательностям нуклеиновой кислоты, таким как кодирующие последовательности и управляющие последовательности, обозначает последовательности, которые обычно не соединены вместе, и/или обычно не связаны с конкретной клеткой. Таким образом, «гетерологичная» область конструкции нуклеиновой кислоты или вектора представляет собой сегмент нуклеиновой кислоты внутри другой молекулы нуклеиновой кислоты или прикрепленный к ней, который не находят ассоциированной с другой молекулой в природе. Например, гетерологичная область конструкции нуклеиновой кислоты может содержать кодирующую последовательность, фланкированную последовательностями, которые не находят ассоциированными с кодирующей последовательностью в природе. Другой пример гетерологичной кодирующей последовательности представляет собой конструкцию, где саму кодирующую последовательность не находят в природе (например, синтетические последовательности, которые содержат кодоны, отличные от нативного гена). Аналогичным образом, клетку, трансформированную конструкцией, которая обычно не присутствует в клетке, следует рассматривать как гетерологичную для целей данного изобретения. Аллельная вариация или встречающиеся в природе мутационные события, не дают начала гетерологичной ДНК, как используют в настоящем документе.

Последовательность «нуклеиновой кислоты» относится к последовательности ДНК или РНК. Термин охватывает последовательности, которые содержат какие-либо из известных аналогов оснований для ДНК и РНК, такие как, но не ограничиваясь этим, 4-ацетилцитозин, 8-гидрокси-N6-метиладенозин, азиридинилцитозин, псевдоизоцитозин, 5-(карбоксигидроксилметил)урацил, 5-фторурацил, 5-бромурацил, 5 карбоксиметиламинометил-2-тиоурацил, 5-карбоксиметил аминометилурацил, дигидроурацил, инозин, N6-изопентениладенин, 1-метиладенин, 1-метилпсевдоурацил, 1-метилгуанин, 1-метилинозин, 2,2-диметилгуанин, 2-метиладенин, 2-метилгуанин, 3-метилцитозин, 5-метилцитозин, N6-метиладенин, 7-метилгуанин, 5-метиламинометилурацил, 5-метоксиаминометил-2-тиоурацил, β-D-маннозилквеуозин, 5ʹ-метоксикарбонилметилурацил, 5-метоксиурацил, 2-метилтио-N6-изопентениладенин, сложный метиловый эфир урацил-5-оксиуксусной кислоты, урацил-5-оксиуксусная кислота, оксибутоксозин, псевдоурацил, квеуозин, 2-тиоцитозин, 5-метил-2-тиоурацил, 2-тиоурацил, 4-тиоурацил, 5-метилурацил, сложный метиловый эфир -урацил-5-оксиуксусной кислоты, урацил-5-оксиуксусная кислота, псевдоурацил, квеуозин, 2-тиоцитозин и 2,6-диаминопурин.

Термин «управляющие последовательности» ДНК относится в совокупности к последовательностям промоторов, сигналам полиаденилирования, последовательностям терминации транскрипции, регуляторным доменам, расположенным выше по направлению считывания, участкам начала репликации, внутренним участкам связывания рибосомы («IRES»), энхансерам и т. п., которые совместно обеспечивают репликацию, транскрипцию и трансляцию кодирующей последовательности в клетке-реципиенте. Не все эти управляющие последовательности всегда должны присутствовать, при условии, что выбранная кодирующая последовательность способна к репликации, транскрипции и трансляции в подходящей клетке-хозяине.

Термин «промотор» используют в настоящем документе в его обычном значении, чтобы отослать к нуклеотидной области, содержащей регуляторную последовательность ДНК, в которой регуляторную последовательность извлекают из гена, который способен связывать РНК полимеразу и инициировать транскрипцию кодирующей последовательности, лежащей ниже по направлению считывания (3ʹ-направление). Транскрипционные промоторы могут включать «индуцибельные промоторы» (когда экспрессию полинуклеотидной последовательности, функционально связанной с промотором, индуцируют с помощью анализируемого вещества, кофактора, регуляторного белка и т. д.), «репрессируемые промоторы» (когда экспрессию полинуклеотидной последовательности, функционально связанной с промотором, индуцируют с помощью анализируемого вещества, кофактора, регуляторного белка и т. д.) и «конститутивные промоторы».

«Функционально связанный» относится к расположению элементов, при котором компоненты, описанные таким образом, имеют возможность выполнять свою обычную функцию. Таким образом, управляющие последовательности, функционально связанные с кодирующей последовательностью, способны осуществлять экспрессию кодирующей последовательности. Управляющие последовательности не обязательно должны быть смежными с кодирующей последовательностью, при условии, что они выполняют функцию управления ее экспрессией. Таким образом, например, промежуточные нетранслируемые, но транскрибируемые последовательности могут присутствовать между промоторной последовательностью и кодирующей последовательностью и промоторную последовательность все еще можно считать «функционально связанной» с кодирующей последовательностью.

Термин «мультимеризационный домен» как используют в контексте по настоящему изобретению, предназначен для обозначения части молекулы, с которой соединяется конкретный рецептор Flt-1, или непосредственно или через «линкерный домен». Мультимеризационный домен может представлять собой полипептидный домен, который облегчает взаимодействие двух или более мультимеризационных доменов и/или доменов рецептора sFlt-1.

Например, мультимеризационный домен может представлять собой последовательность иммуноглобулина, такую как константная область иммуноглобулина, лейциновая молния, гидрофобная область, гидрофильная область, полипептид, который содержит свободный тиол, который образует межмолекулярную дисульфидную связь между двумя или более мультимеризационными доменами или, например, домен «вырост-в-полость», описанный, например, в патенте США 5731168, включенном в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме. Выросты конструируют, например, посредством замены небольших боковых цепей аминокислот из области контакта первого полипептида на более крупную боковую цепь (например, тирозин или триптофан). Компенсирующие полости идентичного или схожего с выростами размера необязательно создают в области контакта второго полипептида посредством замены больших боковых цепей аминокислот на более мелкие (например, аланин или треонин).

Следовательно, в аспектах, мультимеризационный домен предусматривает ту часть молекулы, которая облегчает или допускает формирование димеров, триммеров и т. п. из мономерных доменов. В аспектах, мультимеризационные домены представляют собой домены константной области иммуноглобулина.

«Иммуноглобулины» (Ig) представляют собой белки, в целом гликопротеины, которые представляют собой антитела или антителоподобные молекулы, которые не обладают антигенной специфичность. Иммуноглобулины обычно представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины приблизительно 150000 Да, состоящие из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (H) цепей. Каждая легкая цепь соединена с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, хотя число дисульфидных связей варьирует среди тяжелых цепей иммуноглобулинов различных изотипов. Каждая тяжелая и легкая цепь также имеет регулярно разнесенные межцепные дисульфидные мостики. Каждая тяжелая цепь имеет амино (N) концевой вариабельный домен (VH), после которого следуют карбокси (C) концевые константные домены. Каждая легкая цепь имеет вариабельный N-концевой домен (VL) и C-концевой константный домен; константный домен легкой цепи (CL) выровнен с первым константным доменом (CH1) тяжелой цепи, а вариабельный домен легкой цепи выровнен с вариабельным доменом тяжелой цепи. В соответствии с определением домена полипептидных цепей иммуноглобулинов, легкие (L) цепи имеют два конформационно схожих домена VL и CL; и тяжелые цепи имеют четыре домена (VH, CH1, CH2 и CH3), каждый из которых имеет один межцепной дисульфидный мостик.

В зависимости от аминокислотной последовательности константного (C) домена тяжелых цепей, иммуноглобулины можно относить к различным классам. Существует пять основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. Класс иммуноглобулинов можно дополнительно подразделять на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, IgA1 и IgA2. Каждая тяжелая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (VH), за которым следует определенное число константных доменов. Легкие цепи антител от какого-либо вида позвоночных можно отнести к одному из двух четко определенных типов, называемых каппа (K) или лямбда (λ), основываясь на аминокислотной последовательности их константных доменов.

Термин «Fc-область» относится к C-концевой (константной) области тяжелой цепи иммуноглобулина. Fc-область может представлять собой нативную последовательность Fc-область или вариант Fc-области. Несмотря на то, что границы Fc-области тяжелой цепи иммуноглобулина могут варьировать, Fc-область тяжелой цепи IgG человека может тянуться от аминокислотного остатка в положении Cys226, или от Pro230, карбокси-конца полноразмерного IgG1 человека. Fc-область иммуноглобулина обычно содержит два константных домена, CH2 и CH3. Последний остаток, лизин, в тяжелой цепи IgG1 может, но не обязательно, присутствовать в качестве концевого остатка в Fc в зрелом белке. Одна Fc-область тяжелой цепи IgG1 человека определена под номером доступа NCBI P01857.

«Домен CH2» Fc-области IgG1 человека (также обозначаемый как домен «Cy2») обычно идет приблизительно от аминокислоты 231 приблизительно до аминокислоты 340 в полноразмерном IgG, но от Pro111 до Lys223 в Fc-области тяжелой цепи IgG человека.

«Домен CH3» содержит остатки, расположенные ближе к C-концу относительно домена CH2 в Fc-области IgG1 человека (т. е. приблизительно от аминокислотного остатка 341 приблизительно до аминокислотного остатка 447 в полноразмерном IgG, но от Gly224 до Lys330 в Fc-области тяжелой цепи IgG человека).

«Шарнирную область» в целом определяют как фрагмент от Glu216 до Pro230 в полноразмерном IgG1 человека (Burton, Molec. immunol. (1985) 22:161-206), но от Glu99 до Pro110 в Fc-области тяжелой цепи IgG человека. Шарнирные области других изотипов IgG можно выравнивать с последовательностью IgG1 посредством размещения первого и последнего остатков цистеина, образующих S-S связи между тяжелыми цепями, в тех же положениях.

«Меньшую шарнирную область» Fc-области обычно определяют как фрагмент из остатков, расположенных непосредственно ближе к C-концу относительно шарнирной области, т. е. остатков с 233 до 239 полноразмерного IgG1 человека.

«Нативная последовательность Fc-области» содержит аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности Fc-области, найденной в природе. Нативные последовательности Fc-области человека включают, но не ограничиваясь этим, Fc-область IgG1 человека (не-A и аллотипы); Fc-область IgG2 человека; Fc-область IgG3 человека; и Fc-область IgG4 человека, а также их варианты, встречающиеся в природе. Нативные Fc-области от других видов, такие как Fc-области мыши, также хорошо известны.

«Функциональная Fc-область» обладает «эффекторной функцией» нативной Fc-области. Образцовые «эффекторные функции» включают связывание C1q; комплементзависимую цитотоксичность; связывание Fc-рецептора; антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; понижающую регуляцию рецепторов клеточной поверхности (например, B-клеточный рецептор; BCR) и т. д. Для таких эффекторных функций типично необходимо комбинировать Fc-область со связывающим доменом (т. е., VEGF лигандом в настоящем документе), и их можно оценивать с использованием различных анализов, известных в данной области. Fc-область может представлять собой Fc-область человека, например, нативную последовательность Fc-области человека, такую как IgG1 человека (A и не-A аллотипы), Fc-область IgG2, IgG3 или IgG4. Такие последовательности известны. См., например, публикацию PCT № WO01/02440, включенную в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.

Термин «трансген» относится к полинуклеотиду, который вводят в клетку и который способен к транскрипции в РНК и, необязательно, трансляции и/или экспрессии при подходящих условиях. В аспектах, это придает желаемое свойство клетке, в которую его ввели, или иным образом ведет к желаемому терапевтическому или диагностическому результату (например, к транскрипции в молекулу, которая приносит желаемый терапевтический или диагностический результат).

Термины «геномные частицы (gp)», «геномные эквиваленты» или «копии генома», как используют в отношении вирусного титра, относятся к числу вирионов, содержащих рекомбинантный ДНК геном AAV, независимо от инфекционности или функциональности. Число геномных частиц в конкретном препарате вектора можно измерять с помощью таких процедур, как описано в примерах в настоящем документе или, например, у Clark et al. (1999) Hum. Gene Ther., 10:1031-1039; Veldwijk et al. (2002) Mol. Ther., 6:272-278.

Термины «инфекционная единица (iu)», «инфекционная частица» или «репликационная единица», как используют в отношении вирусного титра, относятся к числу инфекционных и способных к репликации рекомбинантных AAV векторных частиц, как измеряют с помощью анализа инфекционных центров, также известного как анализ репликационных центров, как описано, например, у McLaughlin et al. (1988) J. Virol., 62:1963-1973.

Термин «трансдуцирующая единица (tu)», как используют в отношении вирусного титра, относится к числу инфекционных рекомбинантных AAV векторных частиц, которые ведут к продуцированию функционального продукта трансгена, как измеряют в таких функциональных анализах, как описано в примерах в настоящем документе, или например, у Xiao et al. (1997) Exp. Neurobiol., 144:113-124; или у Fisher et al. (1996) J. Virol., 70:520-532 (анализ LFU).

Последовательность «инвертированного концевого повтора» или «ITR» представляет собой термин, хорошо известный в данной области и относится к относительно коротким последовательностям, которые находят на концах вирусных геномов и которые находятся в противоположной ориентации.

Последовательность «AAV инвертированного концевого повтора (ITR)», термин, хорошо известный в данной области, представляет собой приблизительно 145-нуклеотидную последовательность, которая присутствует на обоих концах нативного одноцепочечного генома AAV. Самые внешние 125 нуклеотидов ITR могут быть представлены в любой из двух альтернативных ориентаций, что ведет к гетерогенности между различными AAV геномами и между двумя концами одного AAV генома. Самые внешние 125 нуклеотидов также содержат несколько более коротких областей самокомплементарности (обозначаемых области A, Aʹ, B, Bʹ, C, Cʹ и D), что делает возможным образование пар внутри цепи в этой части ITR.

«Последовательность концевого разрешения» или «trs» представляет собой последовательность в области D из AAV ITR, которую расщепляют белки rep AAV во время репликации вирусной ДНК. Мутантная последовательность концевого разрешения устойчива к расщеплению белками rep AAV.

«Вирус-помощник» для AAV относится к вирусу, который делает возможной репликацию и упаковку AAV (который является дефектным парвовирусом) и в клетке-хозяине. Вирус-помощник обеспечивает «хелперные функции», которые делают возможной репликацию AAV. Идентифицировано множество таких вирусов-помощников, в том числе аденовирусы, герпесвирусы и поксвирусы, такие как вирус осповакцины. Аденовирусы охватывают множество различных подгрупп, хотя аденовирус 5 типа подгруппы C (Ad5) является наиболее широко используемым. Множество аденовирусов человека, млекопитающих, не относящихся к человеку, и птиц известно и доступно в таких депозитариях, как ATCC. Вирусы семейства герпесов, которые также доступны в таких депозитариях, как ATCC, включают, например, вирусы простого герпеса (HSV), вирусы Эпштейна-Барр (EBV), цитомегаловирусы (CMV) и вирусы псевдобешенства (PRV). Примеры аденовирусных хелперных функций для репликации AAV включают функции E1A, функции E1B, функции E2A, функции VA и функции E4orf6.

Препарат rAAV является, так сказать, «по существу не содержащим» вирус-помощник, если соотношение инфекционных AAV частиц и инфекционных частиц вируса-помощника составляет по меньшей мере приблизительно 10²:1; по меньшей мере приблизительно 10⁴:1, по меньшей мере приблизительно 10⁶:1; или по меньшей мере приблизительно 10⁸:1. Препараты также могут не содержать эквивалентные количества белков вируса-помощника (т. е., белков, как они присутствовали бы в результате такого уровня вируса-помощника, если примеси частиц вируса-помощника, указанные выше, присутствовали бы в разрушенной форме). Контаминацию вирусными и/или клеточными белками в целом можно наблюдать как присутствие полос, окрашенных кумаси, на SDS гелях (например, появление полос, отличных от тех, что соответствуют капсидным белкам AAV VP1, VP2 и VP3).

Термин «модулировать» обозначает изменять (например, осуществлять повышающую регуляцию, понижающую регуляцию или иное управление) уровень пути передачи сигнала. Клеточные процессы под управлением сигнальной трансдукции включают, но не ограничиваясь этим, транскрипцию специфичных генов, нормальные клеточные функции, такие как метаболизм, пролиферация, дифференциация, адгезия, апоптоз и выживаемость, а также анормальные процессы, такие как трансформирование, блокирование дифференциации и метастазирования.

«Активный» или «активность» в целях настоящего изобретения относится к формам полипептида рецептора Flt-1, которые сохраняют биологическую активность (ингибирующую или стимулирующую) соответствующего нативного или встречающегося в природе полипептида. Активность может быть больше чем, равна или меньше чем наблюдаемая для соответствующего нативного или встречающегося в природе полипептида. Как изложено выше, активность включает модулирование уровня пути передачи сигнала VEGF у субъекта, страдающего дегенерацией желтого пятна.

Под «выделенной», когда говорят о нуклеотидной последовательности, понимают, что указанная молекула присутствует при существенном отсутствии других биологических макромолекул того же типа. Таким образом, «выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует конкретный полипептид», относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая по существу не содержит другие молекулы нуклеиновой кислоты, которые не кодируют рассматриваемый полипептид; однако, молекула может содержать некоторые дополнительные основания или фрагменты, которые не оказывают нежелательного влияния на базовые характеристики композиции.

С целью описания относительного положения нуклеотидных последовательностей в конкретной молекуле нуклеиновой кислоты на всем протяжении данной заявки, например, когда конкретная нуклеотидная последовательность описана как расположенная «выше по направлению считывания», «ниже по направлению считывания», «3-штрих (3ʹ)» или «5-штрих (5ʹ)» относительно другой последовательности, следует понимать, что это представляет собой положение последовательностей в «смысловой» или «кодирующей» нити молекулы ДНК, которую обозначают как стандартную в данной области.

Термин «очищенный» относится к выделению вещества (соединения, полинуклеотида, белка, полипептида, полипептидной композиции) так, что вещество, представляющее интерес, содержит преобладающий процент образца, в котором оно находится. Типично в образце в значительной степени очищенный компонент содержит 50%, 80-85%, 90-99%, например, по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% образца. Способы очистки полинуклеотидов и полипептидов, представляющих интерес, хорошо известны в данной области и включают, например, ионообменную хроматографию, аффинную хроматографию и осаждение в соответствии с плотностью.

Термины «субъект», «индивидуум» или «пациент» используют взаимозаменяемо в настоящем документе, и они относятся к позвоночному, например, млекопитающему. Млекопитающие включают, но не ограничиваясь этим, мышей, грызунов, обезьян, человека, сельскохозяйственных животных, спортивных животных и домашних животных.

Термины «эффективное количество» или «терапевтически эффективное количество» композиции или средства, как предусмотрено в настоящем документе, относятся к количеству композиции или средства, достаточному для того, чтобы обеспечивать желаемый ответ, такой как модулирование VEGF в глазу или снижение, предотвращение или замедление прогрессирования физических изменений в глазу, связанных с дегенерацией желтого пятна, или снижение, предотвращение или замедление прогрессирования симптомов, манифестируемых им (например, накопление друз, анормальный рост кровеносных сосудов в глазу, анормальная утечка текучих веществ, крови и белков в глазу и т. п.). Точное требуемое количество будет варьировать от субъекта к субъекту, в зависимости от биологического вида, возраста, и общего состояния субъекта, тяжести состояния, подлежащего лечению, и конкретной макромолекулы, представляющей интерес, способа введения и т. п. Подходящее «эффективное» количество в любом индивидуальном случае может определять специалист в данной области, используя стандартные эксперименты. См., например, Lim, J. (2012) Age-Related Macular Degeneration, CRC Press, Boca Raton; Kanski et al. (2011) Clinical Ophthalmology: A Systematic Approach, Elsevier Saunders

«Лечение» или «лечить» дегенерацию желтого пятна включает: (1) предотвращение заболевания, т. е., предотвращение развития заболевания или обусловливание возникновения заболевания с меньшей интенсивностью у субъекта, который может быть подвержен или предрасположен к заболеванию, но еще не испытывает или не проявляет симптомы заболевания, (2) ингибирование заболевания, т. е., торможение развития, предотвращении или замедление прогрессирования или обращение состояния заболевания, (3) облегчение симптомов заболевания, т. е., снижение числа симптомов, испытываемых субъектом, или (4) снижение, предотвращение или замедление прогрессирования физических изменений в глазу, связанных с дегенерацией желтого пятна. Лечение включает, но не ограничиваясь этим, снижение накопления друз, анормального роста кровеносных сосудов в глазу, анормальной утечки текучих веществ, крови и белков в глазу и т. п. Лечение можно обнаруживать, например, посредством мониторинга скорости и количества потери фоторецепторов (палочек и колбочек) в центральной части глаза, посредством мониторинга скорости потери зрения и остроты зрения с максимальной коррекцией (BCVA), посредством мониторинга скорости и количества атрофии слоя пигментного эпителия сетчатки (и хориокапилляров) под сетчаткой, посредством мониторинга количества друз (клеточного дебриса), которые накапливаются между сетчаткой и хориоидом, посредством мониторинга анормального роста кровеносных сосудов в глазу и мониторинга количества анормальной утечки текучих веществ, крови и белков в глазу.

Диапазоны, предоставленные в настоящем документе, понимают как сокращение для всех значений в диапазоне. Например, диапазон от 1 до 50 понимают как включающий любое число, комбинацию чисел или частичный диапазон из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50.

Пока не определено иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют те же значения, которые обыкновенно понимает специалист в области, к которой относится это раскрытие. Несмотря на то, что любые способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, что описаны в настоящем документе, можно использовать при практическом осуществлении или тестировании настоящего изобретения, далее описаны образцовые способы, устройства и материалы. Все технические и патентные публикации, цитируемые в настоящем документе, включены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме. Ничто в настоящем документе не следует толковать как признание того, что изобретение не имеет права относить к более ранней дате такое раскрытие посредством предшествующего изобретения.

Следует понимать, что всем числовым обозначениям предшествует термин «приблизительно», несмотря на то, что не всегда это указано явно. Также следует понимать, что реактивы, описанные в настоящем документе, лишь являются образцовыми и их эквиваленты известны в данной области, несмотря на то, что это не всегда указано явно.

2. СПОСОБЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Прежде чем описывать настоящее изобретение подробно, следует понимать, что это изобретение не ограничено конкретными составами или параметрами процессов, которые по существу, конечно, могут меняться. Также следует понимать, что терминология, используемая в настоящем документе, служит только цели описания конкретных вариантов осуществления изобретения и не предназначена в качестве ограничения.

Следует принимать во внимание, что изобретение не следует толковать как ограниченное примерами, описанными в настоящем документе. Способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, что описаны в настоящем документе, можно использовать при практическом осуществлении настоящего изобретения, и изобретение следует толковать как включающее какие-либо и все применения, предусмотренные в настоящем документе, и все вариации эквивалентов в пределах навыков среднего специалиста.

Центральным для настоящего изобретения является открытие того, что доставка гена в человеческий глаз с использованием конструкций, кодирующих растворимый белок, содержащий по меньшей мере один домен VEGFR-1 (Flt-1), способный модулировать активность VEGF (также в настоящем документе обозначают как «растворимый белок Flt-1» или «растворимый рецептор Flt-1»), служит для того, чтобы модулировать соответствующие пути передачи сигнала, и значительно снижает симптомы дегенерации желтого пятна. В аспектах, изобретение включает введение доз ниже тех, о которых сообщали ранее в качестве эффективных у приматов, не являющихся человеком. См., например, Lukason et al., Molecular Ther. (2011) 19:260-265. Таким образом, введение растворимых белков Flt-1 предоставляет эффективный способ лечения и предотвращения дегенерации желтого пятна у человека. Способы, описанные в настоящем документе, можно использовать отдельно или в комбинации с традиционной терапией (например, антагонисты PDGF, антагонисты PDGF-R, ингибиторы пути комплемента).

В вариантах осуществления, растворимый белок, используемый в данных способах, представляет собой слитный белок, который содержит по меньшей мере один домен Flt-1 или его активную часть, соединенную с мультимеризационным доменом, или непосредственно или через линкер, например, соединенную с константной областью иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления растворимый белок содержит домен 2 или его части и/или удлиненные фрагменты, связанные с мультимеризационным доменом, или непосредственно или через линкер. Линкеры могут включать последовательности из 5-25 аминокислотных остатков в длину. Репрезентативные мультимеризационные домены включают, но не ограничиваясь этим, Fc-область IgG или ее части и CH3 область IgG или ее части.

Рецептор может присутствовать или выше по направлению считывания или ниже по направлению считывания от области иммуноглобулина. Типично, при экспрессии in vivo слитный белок получают в мультимерной форме. Мультимер может представлять собой димер, триммер и т. д.

Для того чтобы дополнительно понять изобретение, далее предоставлено более подробное обсуждение, касающееся дегенерации желтого пятна, рецепторов Flt-1, слитных конструкций рецептор-иммуноглобулин, а также различных способов доставки генов для использования в настоящем изобретении.

Дегенерация желтого пятна

Как изложено выше, в настоящем изобретении используют рецепторы Flt-1 для того, чтобы ингибировать активность VEGF и тем самым лечить, предотвращать, облегчать и/или предотвращать или задерживать прогрессирование дегенерации желтого пятна. В определенных вариантах осуществления индивидууму с риском развития дегенерации желтого пятна вводят количество, эффективно задерживающее или предотвращающее заболевание.

Идентифицировано по меньшей мере три формы дегенерации желтого пятна. (1) Атрофическая, неэкссудативная сухая форма AMD, также известная как центральная географическая атрофия, возникает приблизительно у 85-90% пациентов с дегенерацией желтого пятна. Сухая форма AMD типично является результатом атрофии слоя пигментного эпителия сетчатки (и предположительно хориокапилляров) под сетчаткой и вызывает потерю зрения через потерю фоторецепторов (палочек и колбочек) в центральной части глаза. Дополнительно может иметь место накопление клеточных обломков (называемых друзами) между сетчаткой и хориоидом. (2) Влажная форма AMD, также известная как неоваскулярная или экссудативная AMD, представляет более тяжелую форму AMD. Влажная форма AMD типично отличается анормальным ростом кровеносных сосудов в глазу, при котором из патологических кровеносных сосудов вытекают текучие вещества и кровь. Она может вызывать потерю зрения из-за анормального роста кровеносных сосудов из хориокапилляров через мембрану Бруха в субретинальное пространство, в конечном итоге приводя к вытеканию крови и белков под макулу. Кровотечение, вытекание и рубцевание из-за этих кровеносных сосудов в конечном итоге вызывает необратимое повреждение фоторецепторов, формирование рубцов в макуле и относительно быструю потерю зрения, если остается без лечения. (3) ARMD, связанная с отслоением пигментного эпителия (PED), возникает меньше чем у 5% пациентов и ведет к отслоению сетчатки.

Молекулы Flt-1 и слитные конструкции

В настоящем изобретении используют растворимые формы рецепторов Flt-1 для того, чтобы модулировать активность VEGF и тем самым лечить, предотвращать, облегчать и/или предотвращать или задерживать прогрессирование дегенерации желтого пятна. В аспектах настоящего изобретения используют слитные конструкции рецептор Flt-1-иммуноглобулин. Нативная молекула, а также ее активные фрагменты и аналоги, которые сохраняют способность связывать VEGF и модулировать активность лиганда, как измеряют в любом из множества известных анализов и животных моделей, включая те, что дополнительно описаны в настоящем документе, пригодны для использования в настоящем изобретении. Например, анализы связывания VEGF известны и описаны у Pechan et al., Gene Ther (2009) 16:10-16) и в патенте США № 7928072, включенном в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.

Аминокислотная последовательность и нуклеотидная последовательность, кодирующая репрезентативный полноразмерный рецептор Flt-1 человека, представлены на фиг. 9A-9B (SEQ ID № 18) и 10A-10E (SEQ ID № 19), соответственно. Белок рецептора Flt-1 имеет внеклеточную часть, находящуюся в положениях 27-758 на фиг. 10A-10E, которая содержит семь Ig-подобных доменов. Аминокислоты 1-26 на фиг. 10A-10E представляют сигнальную последовательность. Семь Ig-подобных доменов расположены в остатках с номерами 32-123, 151-214, 230-327, 335-421, 428-553, 556-654 и 661-747, соответственно, на фиг. 10A-10E. Этот белок Flt-1 кодирует последовательность ДНК, представленная под номером доступа GenBank NM_002019 (фиг. 9A-9B, SEQ ID № 18).

В вариантах осуществления молекулы Flt-1, используемые в настоящем изобретении, содержат Ig-подобный домен 2 Flt-1. Какую-либо часть молекулы Flt-1 можно использовать при условии, что молекула сохраняет способность модулировать активность VEGF; однако, в некоторых вариантах осуществления молекула Flt-1 может не содержать все или часть доменов 1 и 3. Домен 2 Flt-1 находится в положениях 151-214 на фиг. 10A-10E. Однако, Flt-1 компонент данных слитных конструкций может содержать, например, какую-либо последовательность аминокислот, находящихся между доменами 1 и 2, доменами 2 и 3 и т. д. в Flt-1, например, какую-либо последовательность аминокислот, соответствующую аминокислотной последовательности, находящейся между положениями 124-229 на фиг. 10A-10E, такую как аминокислотная последовательность, начинающаяся в каком-либо одном из положений 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 136...140...145...150, 151, 152, 153, 154, 155...160...165...170, вплоть до аминокислоты 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229 и т. д. на фиг. 10A-10E. В вариантах осуществления Flt-1 компонент слитных конструкций, описанных в настоящем документе, содержит аминокислоты 132-226 с фиг. 10A-10E. Flt-1 компонент также может содержать части каких-либо других доменов, присутствующих во внеклеточной области белка Flt-1, включая части доменов 1 и 3, или даже делеции домена 2, при условии сохранения желаемой активности. В определенных вариантах осуществления домены 1 и 3 не присутствуют во всей своей полноте.

Кроме того, растворимые белки по изобретению могут содержать дополнительный полипептид/фрагменты. Например, растворимые белки по изобретению могут содержать весь VEGFR2 или его части, например, любые из различных доменов VEGFR2, включая без ограничения домены 1, 2 и/или 3 VEGFR2, а также конструкции с удаленным одним или несколькими этими доменами или их частями. См., например, Holash et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2002) 99:11393-11398 и патент США № 7378095, включенный в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме, для описаний слитных конструкций VEGFR2 и гибридных слитных конструкций доменов из VEGFR2 с доменами Flt-1.

Конкретные слитные конструкции по настоящему изобретению включают Ig-подобный домен 2 Flt-1 с последовательностью, как представлено в положениях 24-118 на фиг. 2A-2B, 6, 8 и 12, которые соответствуют аминокислотам 132-226 на фиг. 10A-10E, или частью или вариантом последовательности, которые сохраняют способность модулировать VEGF. В некоторых вариантах осуществления слитные белки также связываются с плацентарным фактором роста.

Сигнальная последовательность также может быть представлена и соединена с N-концом растворимого белка (например, последовательность Ig-подобного домена 2 Flt-1). Сигнальная последовательность может содержать всю нативную сигнальную последовательность или ее часть, например, всю последовательность, находящуюся в положениях 1-26 на фиг. 10A-10E или ее часть. В слитных конструкциях, представленных на фиг. 2A-2B (SEQ ID № 11), 6 (SEQ ID № 15), 8 (SEQ ID № 17) и 12 (SEQ ID № 21), присутствует сигнальная последовательность из 23 аминокислот (аминокислоты 1-23 на фиг. 2A-2B, 6, 8 и 12). Эта последовательность гомологична нативной сигнальной последовательности белка Flt-1. Альтернативно может присутствовать гетерологичная сигнальная последовательность. В данной области известно множество таких последовательностей, которые найдут применение в настоящем документе. Неограничивающие примеры сигнальных пептидов включают те, которые присутствуют в секретируемых белках, таких как гормон роста человека, бычий гормон роста, бычий проальбумин, проинсулин человека, интерферон-γ человека, α-фибриноген человека, тяжелая цепь IgG человека, амилаза крысы, α-фетопротеин мыши, лизоцим курицы и белок зеин 22,1 кукурузы обыкновенной, нейротрофический фактор, полученный из головного мозга, инсулиноподобный фактор роста 1 и β-глюкуронидаза.

Как изложено выше, Flt-1 часть слитной конструкции соединяют с мультимеризационным доменом или непосредственно или через линкерный фрагмент. Мультимеризационный домен может представлять собой последовательность иммуноглобулина, такую как константная область иммуноглобулина, лейциновая молния, гидрофобная область, гидрофильная область, полипептид, содержащий свободный тиол, который образует межмолекулярную дисульфидную связь между двумя или более мультимеризационными доменами или, например, домен «вырост-в-полость», описанный, например, в патенте США 5731168, включенном в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме. Мультимеризационный домен предусматривает, что часть молекулы, которая способствует или делает возможным формирование димеров, триммеров и т. п., формирует мономерные домены.

Мультимеризационные домены будут обуславливать миграцию по меньшей мере 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% мономерных слитных белков в неденатурирующем полиакриламидном геле со скоростью, подходящей для мультимера. Гликозилирование может влиять на миграцию белка в геле. Несмотря на то, что здесь представлены конкретные последовательности, также можно использовать варианты, такие как аллельные варианты. Типично такие варианты будут иметь по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 97%, 98% или 99% идентичности с раскрытой последовательностью.

Мультимеризацию можно анализировать, например, с использованием восстанавливающих и невосстанавливающих гелей. Мультимеризацию также можно анализировать посредством обнаружения увеличенной аффинности связывания белка с его лигандом/рецептором. В связи с этим можно использовать анализ поверхностного плазмонного резонанса BiaCore™. Этот анализ обнаруживает изменения массы посредством измерения изменения показателя преломления в водном слое вблизи поверхности чипа с датчиком. Любой известный в данной области способ можно использовать для того, чтобы обнаруживать мультимеризацию.

В аспектах, мультимеризационные домены получают из молекул иммуноглобулинов, включая в качестве неограничивающих примеров области из тяжелой цепи, домены константной области иммуноглобулина, Fc-области и т. п. Можно использовать последовательности Fc-части тяжелой цепи лямбда IgG1 или IgG2, например, только CH3, например, аминокислоты 371-477 на фиг. 14A-14B, или часть или удлиненные фрагменты CH3, или оба домена CH2 и CH3, например, аминокислоты 247-477 на фиг. 14A-14B, или их части или удлиненные фрагменты.

Способы получения частей молекулы иммуноглобулина хорошо известны в данной области. Например, Fc-часть молекулы иммуноглобулина можно получать посредством расщепления целых молекул антител с использованием фермента папаина. Другие средства также можно использовать для получения этих частей. Белковую последовательность тяжелой цепи лямбда IgG1, см., например, по номеру доступа Genbank Y14737 и на фиг. 13 (SEQ ID № 22) и 14A-14B (SEQ ID № 23), где представлены ДНК и аминокислотная последовательность, соответственно. Можно использовать другие Fc-области, например, из IgG других типов и из антител IgA, IgM, IgD или IgE. Также можно использовать VEGF мультимеризационную область. Последовательность ДНК, которая кодирует VEGF, представлена под номером доступа GenBank NM003376 и на фиг. 3 (SEQ ID № 12). Аминокислотная последовательность VEGF представлена под номером доступа GenBank CAC19513 и на фиг. 4 (SEQ ID № 13). VEGF мультимеризационная область, кодируемая экзоном 3 VEGF (VEGF Ex3), находится приблизительно в аминокислотных остатках 75-88 белка VEGF (фиг. 4) и содержит аминокислотную последовательность Pro-Ser-Cys-Val-Pro-Leu-Met-Arg-Cys-Gly-Gly-Cys-Cys-Asn (SEQ ID № 7).

Несмотря на то, что можно использовать множество различных линкерных фрагментов, которые могут быть функционально эквивалентными, в аспектах настоящего изобретения используют линкер из 9 остатков глицина. Другие линкеры могут состоять, например, из 5-100 аминокислотных остатков, 5-75 аминокислотных остатков, 5-50 аминокислотных остатков, 5-25 аминокислотных остатков, 5-20 аминокислотных остатков, 5-15 аминокислотных остатков, 5-10 аминокислотных остатков или 5-9 аминокислотных остатков. Примеры эффективных линкеров включают:

gly₉ (SEQ ID № 1);

glu₉ (SEQ ID № 2);

ser₉ (SEQ ID № 3);

gly₅cyspro₂cys (SEQ ID № 4);

(gly₄ser)₃ (SEQ ID № 5);

SerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn (SEQ ID № 6);

ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn (SEQ ID № 7);

GlyAspLeuIleTyrArgAsnGlnLys (SEQ ID № 8); и

Gly₉ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn (SEQ ID № 9).

Другие полипептидные линкеры, которые можно использовать, включают полиглицин различной длины, содержащий 5, 7 или 30 остатков. Дополнительно, в качестве линкера можно использовать другие части Flt-1, например, домен 3 из Flt-1 или его части или удлиненные фрагменты, например, аминокислоты 235-336 на фиг. 10A-10E.

Линкерные фрагменты также можно получать из других полимеров, таких как полиэтиленгликоль. Такие линкеры могут иметь от 10 до 1000, 10-500, 10-250, 10-100 или 10-50 мономерных звеньев этиленгликоля. Подходящие полимеры должны иметь размер, схожий с размером, занимаемым подходящим диапазоном аминокислотных остатков. Полимер типичного размера будет обеспечивать расстояние приблизительно 10-25 ангстремов.

Образцовые формы слитного белка, используемые в изобретении, представлены на фиг. 2A-2B (SEQ ID № 11), 6 (SEQ ID № 15), 8 (SEQ ID № 17) и 12 (SEQ ID № 21), их кодируют полинуклеотидные последовательности, представленные на фиг. 1 (SEQ ID № 10), 5 (SEQ ID № 14), 7 (SEQ ID № 16) и 11 (SEQ ID № 20), соответственно. Такие последовательности описаны в патенте США № 7928072, включенном в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.

Слитная конструкция, представленная на фиг. 2A-2B (SEQ ID № 11), обозначенная «белок sFLT01» в настоящем документе, содержит в порядке от N-конца к C-концу сигнальную последовательность, находящуюся в положениях 1-23 на фиг. 2A-2B; Ig-подобный домен 2 Flt-1 плюс удлиненные фрагменты этого домена, находящиеся в положениях 24-118 на фиг. 2A-2B (соответствуют аминокислотам 132-226 на фиг. 10A-10E); последовательность из девяти глицинов, находящуюся в положениях 119-127 на фиг. 2A-2B; и остатки IgG1-Fc CH2/CH3 в положениях 128-358 на фиг. 2A-2B.

Слитная конструкция, представленная на фиг. 6 (SEQ ID № 15) содержит в порядке от N-конца к C-концу сигнальную последовательность, находящуюся в положениях 1-23 на фиг. 6; Ig-подобный домен 2 Flt-1 плюс удлиненные фрагменты этого домена, находящиеся в положениях 24-118 на фиг. 6 (соответствуют аминокислотам 132-226 на фиг. 10A-10E); последовательность из девяти глицинов, находящуюся в положениях 119-127 на фиг. 6; и VEGF мультимеризационный домен в положениях 128-141 на фиг. 6.

Фиг. 8 (SEQ ID № 17) содержит в порядке от N-конца к C-концу сигнальную последовательность, находящуюся в положениях 1-23 на фиг. 8; Ig-подобный домен 2 Flt-1 плюс удлиненные фрагменты этого домена, находящиеся в положениях 24-118 на фиг. 8 (соответствуют аминокислотам 132-226 на фиг. 10A-10E); последовательность из девяти глицинов, находящуюся в положениях 119-127 на фиг. 8; VEGF мультимеризационный домен в положениях 128-141 на фиг. 8; и последовательность из области CH2/CH3 IgG в положениях 142-247 на фиг. 8.

На фиг. 12 (SEQ ID № 21) представлена слитная конструкция, названная в настоящем документе «sFLT02», которая содержит в порядке от N-конца к C-концу сигнальную последовательность, находящуюся в положениях 1-23 на фиг. 12; Ig-подобный домен 2 Flt-1 плюс удлиненные фрагменты этого домена, находящиеся в положениях 24-118 на фиг. 12 (соответствуют аминокислотам 132-226 на фиг. 10A-10E); последовательность из девяти глицинов, находящуюся в в положениях 119-127 на фиг. 12; и остатки CH2/CH3 IgG, находящиеся в положениях 128-233 на фиг. 12.

Несмотря на то, что здесь рассмотрены конкретные последовательности, также можно использовать варианты, такие как аллельные варианты. Типично такие варианты имеют по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 97%, 98% или 99% идентичности с раскрытой последовательностью и сохраняют функции, описанные в настоящем документе, включая мультимеризацию и способность связывать VEFG.

Полинуклеотиды, кодирующие рецепторы Flt-1 и их слитные конструкции для использования в настоящем изобретении, можно получать с использованием стандартных способов молекулярной биологии. Например, полинуклеотидные последовательности, кодирующие описанные выше молекулы можно получать с использованием рекомбинантных способов, например, посредством скрининга кДНК и геномных библиотек из клеток, экспрессирующих ген, или посредством доставки гена из вектора, о котором известно, что он его содержит. Ген, представляющий интерес, вместо клонирования также можно получать синтетически на основании известных последовательностей. Молекулы можно конструировать с использованием подходящих кодонов для конкретной последовательности. После этого полную последовательность собирают из перекрывающихся олигонуклеотидов, полученных стандартными способами и собранных в полную кодирующую последовательность. См., например, Edge, Nature (1981) 292:756; Nambair et al., Science (1984) 223:1299; и Jay et al., J. Biol. Chem. (1984) 259:6311.

Таким образом, конкретные нуклеотидные последовательности можно получать из векторов, несущих желаемые последовательности или синтезированные полностью или частично с использованием различных способов синтеза олигонуклеотидов, известных в данной области, таких как способы сайт-специфического мутагенеза и полимеразной цепной реакции (ПЦР), где это применимо. См., например, Sambrook, выше. Один способ получения нуклеотидных последовательностей, кодирующих желаемые последовательности, опосредован отжигом комплементарных наборов перекрывающихся синтетических олигонуклеотидов, полученных в стандартном автоматизированном синтезаторе полинуклеотидов, после чего следует лигирование с использованием подходящей ДНК лигазы и амплификация лигированной нуклеотидной последовательности через ПЦР. См., например, Jayaraman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:4084 4088. Дополнительно, можно использовать олигонуклеотид-направленный синтез (Jones et al., Nature (1986) 54:75 82), олигонуклеотид-направленный мутагенез уже существующих нуклеотидных участков (Riechmann et al., Nature (1988) 332:323 327 и Verhoeyen et al., Science (1988) 239:1534 1536), и ферментативное заполнение пропущенных олигонуклеотидов с использованием T4 ДНК полимеразы (Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86:10029 10033) для того, чтобы предоставлять молекулы для использования в рассматриваемых способах.

После получения полинуклеотид, кодирующий рецептор, можно соединять с мультимеризационным доменом или непосредственно или через линкерный фрагмент, как описано выше.

Конструкции можно доставлять субъекту с использованием рекомбинантных вирусных векторов, как дополнительно описано далее.

Способы доставки генов

Конструкции sFlt-1, такие как те, что описаны выше, можно доставлять рассматриваемому субъекту с использованием любого из нескольких способов доставки генов. Несколько способов доставки генов известны в данной области. В целом, рекомбинантные векторы формулируют в фармацевтические композиции, как описано ниже, и вводят субъекту с использованием способов трансдукции или in vivo или ex vivo. При трансдукции ex vivo, желаемую клетку-реципиента удаляют из субъекта, трансдуцируют рекомбинантным вектором и повторно вводят субъекту. Альтернативно, можно использовать сингенные или ксеногенные клетки, когда эти клетки не вызывают неподходящего иммунного ответа у субъекта.

Описаны подходящие способы доставки и введения трансдуцированных клеток субъекту. Например, клетки можно трансдуцировать in vitro посредством объединения рекомбинантных векторов с клетками субъекта, например, в подходящих средах, и скрининга тех клеток, которые несут ДНК, представляющую интерес, с использованием общепринятых способов, таких как саузерн-блоттинг и/или ПЦР, или с использованием селективных маркеров.

Разработано множество систем на основе вирусов для переноса генов в клетки млекопитающих или in vivo или ex vivo. Например, ретровирусы предоставляют удобную платформу для систем доставки генов. Выбранный ген можно вставлять в вектор и упаковывать в ретровирусные частицы с применением известных в данной области способов. Рекомбинантный вирус затем можно выделять и доставлять в клетки субъекта или in vivo или ex vivo. Описано множество ретровирусных систем. См., например, патент США № 5219740; Miller and Rosman, BioTechniques (1989) 7:980-990; Miller, A.D., Human Gene Therapy (1990) 1:5 14; Scarpa et al., Virology (1991) 180:849-852; Burns et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90:8033-8037; и Boris Lawrie and Temin, Cur. Opin. Genet. Develop. (1993) 3:102-109. Ретровирусные векторы мышей с дефектом репликации представляют собой широко используемые векторы для переноса генов. Ретровирусы лейкоза мышей содержат одноцепочечную РНК, образующую комплекс с ядерным коровым белком и ферментами полимеразами (pol), которые заключены в белковый кор (gag) и окружены гликопротеиновой оболочкой (env), которая определяет спектр организмов-хозяев. Геномная структура ретровирусов содержит гены gag, pol, и env, заключенные в длинные 5ʹ- и 3ʹ-концевые повторы (LTR). В ретровирусных векторных системах используют тот факт, что минимальный вектор, содержащий 5ʹ и 3ʹ LTR, и сигнал упаковки являются достаточными для того, чтобы сделать возможным упаковку, инфицирование и интегрирование вектора в клетки-мишени при условии, что вирусные структурные белки поступают в транс в упаковывающей клеточной линии. Фундаментальные преимущества ретровирусных векторов для переноса генов включают эффективное инфицирование и экспрессию генов в большинстве типов клеток, точное интегрирование одной копии вектора в хромосомную ДНК клетки-мишени и простоту обращения с ретровирусным геномом.

Также описано множество аденовирусных векторов. в отличие от ретровирусов, которые встраиваются в геном организма-хозяина, аденовирусы персистируют вне хромосом, таким образом минимизируя риски, связанные с инсерционным мутагенезом (Haj Ahmad and Graham, J. Virol. (1986) 57:267-274; Bett et al., J. Virol. (1993) 67:5911-5921; Mittereder et al., Human Gene Therapy (1994) 5:717-729; Seth et al., J. Virol. (1994) 68:933-940; Barr et al., Gene Therapy (1994) 1:51-58; Berkner, K.L. BioTechniques (1988) 6:616-629; и Rich et al., Human Gene Therapy (1993) 4:461-476). Аденовирусные векторы для использования в рассматриваемых способах описаны более подробно далее.

Дополнительно, для доставки генов разработаны различные аденоассоциированные вирусные (AAV) векторные системы. AAV векторы можно легко конструировать с использованием способов, хорошо известных в данной области. См., например, патенты США №№ 5173414 и 5139941; международные публикации №№ WO 92/01070 (опубликована 23 января 1992 года) и WO 93/03769 (опубликована 4 марта 1993 года); Lebkowski et al., Molec. Cell. Biol. (1988) 8:3988-3996; Vincent et al., Vaccines 90 (1990) (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, B.J. Current Opinion in Biotechnology (1992) 3:533-539; Muzyczka, N. Current Topics in Microbiol. and Immunol. (1992) 158:97-129; Kotin, R.M. Human Gene Therapy (1994) 5:793-801; Shelling and Smith, Gene Therapy (1994) 1:165-169; и Zhou et al., J. Exp. Med. (1994) 179:1867-1875. AAV векторные системы также описаны более подробно ниже.

Дополнительные вирусные векторы, которые найдут применение для доставки молекул нуклеиновой кислоты, представляющих интерес, включают те, которые получены из семейства поксвирусов, включая вирус осповакцины и поксвирус птиц. В качестве примера, рекомбинантные вирусы осповакцины, экспрессирующие определенные гены, можно сконструировать следующим образом. ДНК, кодирующую конкретный полипептид, сначала встраивают в подходящий вектор с тем, чтобы он находился смежно с промотором вируса осповакцины и фланкирующими последовательностями ДНК вируса осповакцины, такими как последовательность, кодирующая тимидинкиназу (TK). Затем этот вектор используют для того, чтобы трансфицировать клетки, которые одновременно инфицируют вирусом осповакцины. Гомологичная рекомбинация служит для того, чтобы вставлять промотор вируса осповакцины плюс ген, кодирующий определенный белок, в вирусный геном. Получаемый TK рекомбинант можно отбирать посредством культивирования клеток в присутствии 5-бромдезоксиуридина и сбора вирусных бляшек, устойчивых к нему.

Альтернативно, поксвирусы птиц, такие как вирус оспы кур и вирус оспы канареек, также можно использовать для того, чтобы доставлять гены. Использование вектора из поксвируса птиц, в частности, желательно у человека и других видов млекопитающих, поскольку элементы рода вирусов оспы птиц могут продуктивно реплицироваться только у восприимчивых видов птиц и, следовательно, не инфекционны в клетках млекопитающих. В данной области известны способы получения рекомбинантных поксвирусов птиц, в которых используют генетическую рекомбинацию, как описано выше в отношении получения вирусов осповакцины. См., например, WO 91/12882; WO 89/03429; и WO 92/03545.

Молекулярные конъюгированные векторы, такие как аденовирусные химерные векторы, описанные у Michael et al., J. Biol. Chem. (1993) 268:6866-6869 и Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:6099-6103, также можно использовать для доставки генов.

Члены рода альфавирусов, такие как, но не ограничиваясь этим, векторы, полученные из вируса Синдбис и вируса леса Семлики, также найдут применение в качестве вирусных векторов для доставки полинуклеотида, кодирующего слитную конструкцию. Описание векторов, полученных из вируса Синдбис, которые можно использовать при практическом осуществлении данных способов, см. у Dubensky et al., J. Virol. (1996) 70:508 519; и в международных публикациях №№ WO 95/07995 и WO 96/17072.

Альтернативно, конструкции Flt-1 можно доставлять без использования вирусных векторов, например, с использованием систем доставки нуклеиновых кислот, основанных на плазмидах, как описано в патентах США №№ 6413942; 6214804; 5580859; 5589466; 5763270; и 5693622, все включены в настоящий документ посредством ссылки во всей их полноте. Плазмиды должны содержать ген, представляющий интерес, который функционально связан с управляющими элементами, которые управляют экспрессией белкового продукта in vivo. Такие управляющие элементы хорошо известны в данной области.

Аденовирусные системы доставки генов

В одном из вариантов осуществления рассматриваемого изобретения нуклеотидную последовательность, кодирующую рецептор Flt-1, например, слитные конструкции, описанные выше, вставляют в экспрессирующий вектор на основе аденовируса. Аденовирусный геном представляет собой линейную двухцепочечную молекулу ДНК приблизительно из 36000 пар оснований с концевым белком 55 кДа, ковалентно связанным с 5ʹ-концом каждой цепи. Аденовирусная («Ad») ДНК содержит идентичные инвертированные концевые повторы («ITR») приблизительно 100 пар оснований с точной длиной в зависимости от серотипа. Вирусные участки начала репликации расположены внутри ITR точно на концах генома. Синтез ДНК происходит в два этапа. Сначала происходит репликация с замещением цепи, в которой создается дочерняя дуплексная молекула и родительская замещенная цепь. Замещенная цепь является одноцепочечной и может формировать промежуточную структуру «сковорода с ручкой», которая делает возможной инициацию репликации и создание дочерней дуплексной молекулы. Альтернативно, репликация может происходить с обоих концов генома одновременно, избегая необходимости формировать структуру «сковорода с ручкой».

Во время цикла продуктивной инфекции экспрессия вирусных генов происходит в две фазы: ранняя фаза, которая представляет собой период вплоть до репликации вирусной ДНК, и поздняя фаза, которая совпадает с инициацией репликации вирусной ДНК. Во время ранней фазы происходит экспрессия только ранних продуктов генов, кодируемых областями E1, E2, E3 и E4, которые несут множество функций, которые подготавливают клетку к синтезу вирусных структурных белков. Во время поздней фазы происходит экспрессия поздних продуктов вирусных генов в дополнение к продуктам ранних генов и выключение синтеза ДНК и белков клетки-хозяина. Следовательно, клетка становится специализированной для продукции вирусной ДНК и вирусных структурных белков.

Область E1 аденовируса представляет собой первую область, экспрессируемую после инфекции клетки-мишени. Эта область состоит из двух транскрипционных единиц, генов E1A и E1B. Основные функции продуктов гена E1A состоят в том, чтобы индуцировать покоящиеся клетки ко вхождению в клеточный цикл и возобновлять синтез клеточной ДНК и транскрипционно активировать ген E1B и другие ранние области (E2, E3, E4). Трансфекция зародышевых клеток только геном E1A может индуцировать неограниченную пролиферацию (иммортализацию), но не ведет к полной трансформации. Однако экспрессия E1A в большинстве случаев ведет к индукции запрограммированной гибели клеток (апоптозу) и только изредка к иммортализации. Совместная экспрессия гена E1B необходима для того, чтобы предотвращать индукцию апоптоза, и для возникновения полной морфологической трансформации. В устойчивых бессмертных клеточных линиях высокий уровень экспрессии E1A может вызывать полную трансформацию в отсутствие E1B.

Кодируемые E1B белки помогают E1A в перенаправлении клеточных функций для того, чтобы сделать возможным репликацию вируса. Белки E1B 55 кДа и E4 33 кДа, которые образуют комплекс, который по существу локализован в ядре, осуществляют функцию ингибирования синтеза белков организма-хозяина и облегчения экспрессии вирусных генов. Их основное влияние состоит в установлении избирательного транспорта вирусной мРНК из ядра в цитоплазму, которому сопутствует начало поздней фазы инфекции. Белок E1B 21 кДа важен для правильного временного контроля цикла продуктивной инфекции и тем самым предотвращает преждевременную смерть клетки-хозяина прежде завершения жизненного цикла вируса.

Векторы на основе аденовирусов экспрессируют пептидные продукты генов на высоких уровнях. Аденовирусные векторы имеют высокие эффективности инфекционности, даже при низких титрах вируса. Дополнительно, вирус является полностью инфекционным в виде безклеточного вириона, так что инъекция клеточных линий продуцентов не требуется. Аденовирусные векторы достигают длительной экспрессии гетерологичных генов in vivo. Аденовирус не связан с тяжелой патологией человека, вирус может инфицировать широкий спектр клеток и имеете широкий спектр организмов-хозяев, вирус можно получать в большом количестве при относительной простоте и у вирус можно создавать дефект репликации посредством делеций в ранней области 1 («E1») вирусного генома. Таким образом, экстенсивно использовали векторы, получаемые из аденовирусов человека, в которых по меньшей мере удалена область E1 и заменена на ген, представляющий интерес, в экспериментах по генной терапии в доклинической и клинической фазе.

Аденовирусные векторы для использования в настоящем изобретении получают из любого из множества серотипов аденовирусов, включая, без ограничения, любой из более чем 40 штаммов серотипов аденовируса, таких как серотипы 2, 5, 12, 40 и 41. Аденовирусные векторы, используемые в настоящем документе, имеют дефект репликации и содержат ген, представляющий интерес, под управлением подходящего промотора, такого как любой из промоторов, рассмотренных далее со ссылкой на аденоассоциированный вирус. Например, в патенте США № 6048551, включенном в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме, описаны аденовирусные векторы с дефектом репликации, которые содержат ген человека для противовоспалительного цитокина IL-10, а также векторы, которые содержат ген для противовоспалительного цитокина IL-1ra, под управлением промотора вируса саркомы Рауса (RSV), которые названы Ad.RSVIL-10 и Ad.RSVIL-1ra, соответственно.

Специалисты в данной области могут использовать другие рекомбинантные аденовирусы, получаемые из любого из серотипов аденовирусов и с использованием различных систем промоторов.

Например, в патенте США № 6306652, включенном в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме, описаны аденовирусные векторы с последовательностями E2A, которые содержат мутацию hr и мутацию ts125, называемую ts400, для предотвращения гибели клеток за счет сверхэкспрессии E2A, а также векторы с последовательностями E2A, которые содержат только мутацию hr, под управлением индуцибельного промотора, и векторы с последовательностями E2A, которые содержат мутацию hr и мутацию ts125 (ts400), под управлением индуцибельного промотора.

Кроме того, «минимальные» аденовирусные векторы, как описано в патенте США № 6306652, найдут применение в настоящем изобретении. Такие векторы сохраняют по меньшей мере часть вирусного генома, которая необходима для капсидирования генома в вирусные частицы (сигнал капсидирования), а также по меньшей мере одну копию по меньшей мере функциональной части или производного ITR. Упаковки минимального аденовирусного вектора можно добиваться посредством совместной инфекции с вирусом-помощником или, альтернативно, с использованием системы содействия репликации с дефектом упаковывания, как описано в патенте США № 6306652.

Другие эффективные векторы на основе аденовирусов для доставки гена, представляющего интерес, включают «выпотрошенный» (зависящий от помощника) аденовирус, у которого удалена подавляющая часть вирусного генома (Wu et al., Anesthes. (2001) 94:1119-1132). Такие «выпотрошенные» аденовирусные векторы по существу не создают вирусных белков, таким образом позволяя генной терапии, обеспечиваемой вирусом, успешно протекать в течение года после одного введения (Parks, R.J., Clin. Genet. (2000) 58:1-11; Tsai et al., Curr. Opin. Mol. Ther. (2000) 2:515-523), и устраняют мешающее воздействие иммунной системы. Кроме того, удаление вирусного генома создает пространство для инсерции управляющих последовательностей, которые обеспечивают регуляцию экспрессии с помощью системно вводимых лекарственных средств (Burcin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96:355-360), добавляя как безопасности, так и управления экспрессией белка, обеспечиваемой вирусом. Эти и другие рекомбинантные аденовирусы найдут применение в данных способах.

Аденоассоциированнные вирусные системы доставки генов

Аденоассоциированный вирус (AAV) успешно использовали для того, чтобы доставлять гены для генной терапии. Геном AAV представляет собой линейную, одноцепочечную молекулу ДНК, которая содержит приблизительно 4681 нуклеотид. Геном AAV в целом содержит внутренний неповторяющийся геном, фланкированный с каждого конца инвертированными концевыми повторами (ITR). The ITR представляют собой приблизительно 145 пар оснований (п. о.) в длину. ITR имеют множество функций, в том числе предоставление точек начала репликации ДНК и сигналы упаковки для вирусного генома. Внутренняя неповторяющаяся часть генома содержит две большие открытые рамки считывания, известные как гены репликации (rep) и капсида (cap) AAV. Гены rep и cap кодируют вирусные белки, которые позволяют вирусу реплицироваться и упаковываться в вирион. В частности, с области rep AAV происходит экспрессия семейства по меньшей мере из четырех вирусных белков, Rep 78, Rep 68, Rep 52 и Rep 40, названных в соответствии с их кажущейся молекулярной массой. Область cap AAV кодирует по меньшей мере три белка, VP1, VP2, и VP3.

AAV сконструирован для того, чтобы доставлять гены, представляющие интерес, посредством удаления внутренней неповторяющейся части генома AAV (т. е., генов rep и cap) и инсерции гетерологичного гена (в этом случае, гена, кодирующего рецептор или слитную конструкцию Flt-1) между ITR. Гетерологичный ген типично функционально соединяют с гетерологичным промотором (конститутивным, обладающим клеточной специфичностью или индуцибельным), который способен управлять экспрессией гена в клетках-мишенях пациента в подходящих условиях. Также могут содержаться сигналы терминации, такие как сайты полиаденилирования.

AAV представляет собой вирус, зависящий от помощника; то есть, для него необходима совместная инфекция с вирусом-помощником (например, аденовирусом, герпесвирусом или вирусом осповакцины), чтобы формировать вирионы AAV. В отсутствие совместной инфекции с вирусом-помощником, AAV переходит в латентное состояние, в котором вирусный геном встраивается в хромосому клетки-хозяина, но образование инфекционных вирионов не происходит. Последующая инфекция вирусом-помощником «спасает» встроенный геном, позволяя ему реплицироваться и упаковывать свой геном в инфекционный вирион AAV. Хотя AAV может инфицировать клетки различных биологических видов, вирус-помощник должен относиться к тому же биологическому виду, что и клетка-хозяин. Таким образом, например, AAV человека будет реплицироваться в клетках собаки, совместно инфицированных аденовирусом собаки.

Рекомбинантные вирионы AAV, содержащие ген, представляющий интерес, можно получать с использованием множества принятых в данной области способов, описанных более полно далее. AAV дикого типа и вирусы-помощники можно использовать для того, чтобы обеспечивать необходимые репликативные функции для получения вирионов rAAV (см., например, патент США № 5139941, включенный в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме). Альтернативно, плазмиду, содержащую гены хелперных функций, в комбинации с инфекцией одним из хорошо известных вирусов-помощников, можно использовать в качестве источника репликативных функций (см. например, патент США № 5622856 и патент США № 5139941, оба включены в настоящий документ посредством ссылки во всей их полноте). Аналогичным образом, плазмиду, содержащую гены вспомогательных функций можно использовать в комбинации с инфекцией AAV дикого типа, чтобы обеспечивать необходимые репликативные функции. Каждого из этих трех подходов, когда используют в комбинации с rAAV вектором, достаточно для получения вирионов rAAV. Для получения вирионов rAAV специалист в данной области также может использовать другие подходы, хорошо известные в данной области.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения используют способ тройной трансфекции (подробно описанный в патенте США № 6001650, в полном объеме включенном в настоящий документ посредством ссылки) для получения вирионов rAAV, поскольку этот способ не требует использования инфекционного вируса-помощника, что позволяет получать вирионы rAAV без присутствия любого поддающегося обнаружению вируса-помощника. Это осуществляют с использованием трех векторов для получения вирионов rAAV: вектор AAV хелперной функции, вектор вспомогательной функции и rAAV экспрессирующий вектор. Однако специалист в данной области примет во внимание, что последовательности нуклеиновой кислоты, кодируемые этими векторами, можно предоставлять в двух или более векторах в различных комбинациях.

Как изложено в настоящем документе, вектор AAV хелперной функции кодирует последовательности «AAV хелперной функции» (т. е., rep и cap), эта функция в транс для продуктивной репликации и капсидирования AAV. Вектор AAV хелперной функции может поддерживать эффективное продуцирование AAV вектора без создания каких-либо поддающихся обнаружению вирионов AAV дикого типа (т. е., вирионов AAV, содержащих функциональные гены rep и cap). Пример такого вектора, pHLP19, описан в патенте США № 6001650, включенном в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме. Гены rep и cap вектора AAV хелперной функции можно получать из какого-либо из известных серотипов AAV, как изложено выше. Например, вектор AAV хелперной функции может иметь ген rep, полученный из AAV 2, и ген cap, полученный из AAV 6; специалист в данной области примет во внимание, что возможны другие комбинации генов rep и cap, определяющим признаком является способность поддерживать продуцирование вирионов rAAV.

Вектор вспомогательной функции кодирует нуклеотидные последовательности для полученных не из AAV вирусных и/или клеточных функций, от которых зависит репликация AAV (т. е., «вспомогательные функции»). Вспомогательные функции включают те функции, которые необходимы для репликации AAV, включая, без ограничения, те фрагменты, которые участвуют в активации транскрипции генов AAV, сплайсинге мРНК AAV, зависящем от этапа, репликации ДНК AAV, синтезе продуктов экспрессии cap и сборке капсида AAV. Вспомогательные функции на основе вирусов можно получать из любого из хорошо известных вирусов-помощников, таких как аденовирус, герпесвирус (отличный от вируса простого герпеса 1 типа) и вирус осповакцины. В вариантах осуществления используют плазмиду вспомогательной функции pLadeno5 (подробности касательно pLadeno5 описаны в патенте США № 6004797, включенном в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме). Эта плазмида обеспечивает полный набор аденовирусных вспомогательных функций для продукции AAV вектора, но не содержит компоненты, необходимые для того, чтобы формировать компетентный для репликации аденовирус.

Для дополнительного понимания AAV ниже приведено более детализированное обсуждение, касающееся рекомбинантных AAV экспрессирующих векторов и AAV хелперных и вспомогательных функций.

Рекомбинантные AAV экспрессирующие векторы

Рекомбинантные AAV (rAAV) экспрессирующие векторы конструируют с использованием известных способов, чтобы по меньшей мере предоставлять в виде функционально связанных компонентов в направлении транскрипции управляющие элементы, в том числе область инициации транскрипции, полинуклеотид, представляющий интерес, и область терминации транскрипции. Управляющие элементы выбирают так, чтобы они были функциональными в клетке, представляющей интерес, например, в клетке млекопитающего. Получаемую конструкцию, которая содержит функционально связанные компоненты, связывают (5ʹ и 3ʹ) с функциональными последовательностями ITR AAV.

Нуклеотидные последовательности областей ITR AAV известны. Последовательность AAV 2 см., например, в Kotin, R.M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Berns, K.I. «Parvoviridae and their Replication» в Fundamental Virology, 2-е издание, (под редакцией B.N. Fields и D.M. Knipe). ITR AAV, используемые в векторах по изобретению, не обязательно имеют нуклеотидную последовательность дикого типа и могут быть изменены, например, посредством инсерции, делеции или замены нуклеотидов. Дополнительно, ITR AAV можно получать из любого из нескольких серотипов AAV, в том числе, без ограничения, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh8, AAVrh8R, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12 и т. п. Кроме того, 5ʹ и 3ʹ ITR, которые фланкируют выбранную нуклеотидную последовательность в AAV экспрессирующем векторе, не обязательно являются идентичными или полученными из того же серотипа AAV или изолята, при условии, что они функционируют, как предусмотрено, т. е., чтобы сделать возможным вырезание и спасение последовательности, представляющей интерес, из генома клетки-хозяина или вектора и чтобы сделать возможным встраивание молекулы ДНК в геном клетки-реципиента, когда продукты гена Rep AAV присутствуют в клетке.

Подходящие полинуклеотидные молекулы для использования в AAV векторах имеют размер меньше чем приблизительно 5 тысяч нуклеотидов (т. н.). Выбранную полинуклеотидную последовательность функционально связывают с управляющими элементами, которые управляют ее транскрипцией или экспрессией у субъекта in vivo. Такие управляющие элементы могут содержать управляющие последовательности, обычно связанные с выбранным геном. Альтернативно можно использовать гетерологичные управляющие последовательности. Эффективные гетерологичные управляющие последовательности в целом включат те, которые получают из последовательностей, кодирующих гены млекопитающих или вирусов. Примеры включают, но не ограничиваясь этим, специфичный промотор енолазы нейронов, промотор GFAP, ранний промотор SV40, LTR промотор вируса опухоли молочной железы мыши; главный поздний промотор аденовируса (Ad MLP); промотор вируса простого герпеса (HSV), промотор цитомегаловируса (CMV), такой как область предраннего промотора CMV (CMVIE), промотор вируса саркомы Рауса (RSV), синтетические промоторы, гибридные промоторы и т. п. Кроме того, последовательности, получаемые из невирусных генов, таких как ген металлотионеина мыши, также найдут применение в настоящем документе. Такие промоторные последовательности коммерчески доступны, например, в Stratagene (San Diego, CA).

AAV экспрессирующий вектор, который несет полинуклеотидную молекулу, представляющую интерес, связанную с ITR AAV, можно сконструировать посредством непосредственной инсерции выбранной последовательности(последовательностей) в AAV геном, из который вырезаны главные открытые рамки считывания («ORF») AAV. Другие части AAV генома также можно удалять при условии, что достаточная часть ITR остается для того, чтобы сделать возможным функцию репликации и упаковывающую функцию. Такие конструкции можно конструировать с использованием способов, хорошо известных в данной области. См., например, патенты США №№ 5173414 и 5139941; международные публикации №№ WO 92/01070 (опубликована 23 января 1992 года) и WO 93/03769 (опубликована 4 марта 1993 года); Lebkowski et al. (1988) Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996; Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:533-539; Muzyczka (1992) Current Topics in Microbiol. And Immunol. 158:97-129; Kotin (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Shelling and Smith (1994) Gene Therapy 1:165-169; и Zhou et al. (1994) J. Exp. Med. 179:1867-1875.

Альтернативно, ITR AAV можно вырезать из вирусного генома или из AAV вектора, содержащего их, и сливать 5ʹ и 3ʹ относительно выбранной конструкции нуклеиновой кислоты, которая присутствует в другом векторе, используя стандартные способы лигирования, такие как те, которые описаны в Sambrook et al., выше. Например, лигирование можно выполнять в 20 мМ Tris-Cl pH 7,5, 10 мМ MgCl₂, 10 мМ DTT, 33 мкг/мл BSA, 10 мМ-50 мМ NaCl и одном из 40 мкМ АТФ, 0,01-0,02 (Weiss) единицы T4 ДНК лигазы при 0°C (для лигирования «липких концов») или 1 мМ АТФ, 0,3-0,6 (Weiss) единицы T4 ДНК лигазы при 14°C (для лигирования «тупых концов»). Межмолекулярное лигирование «липких концов» обычно осуществляют при концентрациях общей ДНК 30-100 мкг/мл (общая концентрация концов 5-100 нМ). AAV векторы, которые содержат ITR, описаны, например, в патенте США № 5139941. В частности, в нем описано несколько AAV векторов, которые доступны в American Type Culture Collection («ATCC») под номерами доступа 53222, 53223, 53224, 53225 и 53226.

Для целей изобретения подходящие клетки-хозяева для получения вирионов rAAV из AAV экспрессирующих векторов включают микроорганизмы, клетки дрожжей, клетки насекомых и клетки млекопитающих, которые можно использовать или которые использованы в качестве реципиентов гетерологичной молекулы ДНК и которые способны расти, например, в суспензионной культуре, биореакторе или тому подобном. Термин включает потомство исходной клетки, которую трансфицировали. Таким образом, «клетка-хозяин», как используют в настоящем документе, в целом относится к клетке, которую трансфицировали экзогенной последовательностью ДНК. Клетки из стабильной клеточной линии человека 293 (легко доступна, например, в American Type Culture Collection под номером доступа ATCC CRL1573) можно использовать при практическом осуществлении настоящего изобретения. В частности, клеточная линия человека 293 представляет собой линию эмбриональных клеток почки человека, которую трансформировали фрагментами ДНК аденовируса 5 типа (Graham et al. (1977) J. Gen. Virol. 36:59) и которая экспрессирует аденовирусные гены E1a и E1b (Aiello et al. (1979) Virology 94:460). Клеточную линию 293 легко трансфицировать, и она предоставляет особенно удобную платформу, в которой можно продуцировать вирионы rAAV.

AAV хелперные функции

Клетки-хозяева, содержащие описанные выше AAV экспрессирующие векторы, нужно делать способными обеспечивать AAV хелперные функции для репликации и капсидирования нуклеотидных последовательностей, фланкированных посредством ITR AAV, чтобы продуцировать вирионы rAAV. AAV хелперные функции в целом представляют собой кодирующие последовательности, полученные из AAV, которые можно экспрессировать для того, чтобы предоставлять продукты генов AAV, которые, в свою очередь, функционируют в транс для продуктивной AAV репликации. AAV хелперные функции используют в настоящем документе для дополнения необходимых AAV функций, которые отсутствуют в AAV экспрессирующих векторах. Таким образом, AAV хелперные функции включают одну или обе главных ORF AAV, а именно кодирующие области rep и cap или их функциональных гомологи.

Под «кодирующей областью rep AAV» понимают принятую на данном уровне техники область генома AAV, которая кодирует белки репликации Rep 78, Rep 68, Rep 52 и Rep 40. Показано, что эти продукты экспрессии Rep обладают многими функциями, включая распознавание, связывание и одноцепочечный разрыв в точке начала репликации ДНК AAV, активность хеликазы ДНК и модуляцию транскрипции с промоторов AAV (или других гетерологичных промоторов). Продукты экспрессии Rep в совокупности необходимы для репликации генома AAV. Описание кодирующей области rep AAV, см., например, у Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129; и Kotin, R.M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801. Подходящие гомологи кодирующей области rep AAV включают ген rep герпесвируса 6 человека (HHV 6), о котором также известно, что он опосредует репликацию ДНК AAV 2 (Thomson et al. (1994) Virology 204:304-311).

Под «кодирующей областью cap AAV» понимают принятую на данном уровне техники область генома AAV, которая кодирует белки капсида VP1, VP2 и VP3, или ее функциональные гомологи. Эти продукты экспрессии Cap обеспечивают упаковывающие функции, которые в совокупности необходимы для упаковки вирусного генома. Описание кодирующей области cap AAV, см., например, у Muzyczka, N. и Kotin, R.M. (выше).

AAV хелперные функции вводят в клетку-хозяина посредством трансфекции клетки-хозяина конструкции AAV помощника или до или одновременно при трансфекции AAV экспрессирующего вектора. Конструкции AAV помощника, таким образом, используют для того, чтобы обеспечивать по меньшей мере временную экспрессию генов rep и/или cap AAV, чтобы дополнять недостающие функции AAV, которые необходимы для продуктивной инфекции AAV. Конструкции AAV помощника не содержат ITR AAV и не могут ни реплицироваться, ни упаковываться.

Эти конструкции могут быть в форме плазмиды, фага, транспозона, космиды, вируса или вириона. Описано множество конструкций AAV помощника, например, широко используемые плазмиды pAAV/Ad и pIM29+45, которые кодируют продукты экспрессии Rep и Cap. См., например, Samulski et al. (1989) J. Virol. 63:3822 3828; и McCarty et al. (1991) J. Virol. 65:2936 2945. Описано множество других векторов, которые кодируют продукты экспрессии Rep и/или Cap. См., например, патент США № 5139941.

AAV вспомогательные функции

Клетку-хозяина (или упаковывающую клетку) также следует делать способной обеспечивать функции, получаемые не из AAV, или «вспомогательные функции», чтобы продуцировать вирионы rAAV. Вспомогательные функции представляют собой вирусные и/или клеточные функции, получаемые не из AAV, от которых зависит репликация AAV. Таким образом, вспомогательные функции включают по меньшей мере те белки и РНК не из AAV, которые необходимы для репликации AAV, включая те, которые участвуют в активации транскрипции генов AAV, сплайсинге мРНК AAV, специфичном для определенного этапа, репликации ДНК AAV, синтезе продуктов экспрессии Cap и сборке капсида AAV. Вспомогательные функции на основе вирусов можно получать из каких-либо известных вирусов-помощников.

В частности, вспомогательные функции можно вводить и затеем экспрессировать в клетках-хозяевах с использованием способов, известных специалистам в данной области. Типично, вспомогательные функции обеспечивают посредством инфекции клеток-хозяев неродственным вирусом-помощником. Известно множество подходящих вирусов-помощников, включая аденовирусы; герпесвирусы, такие как вирус простого герпеса 1 и 2 типов; и вирусы осповакцины. В настоящем документе также найдут применение такие невирусные вспомогательные функции, как те, которые обеспечивает синхронизация клеток с использованием какого-либо из множества известных средств. См., например, Buller et al. (1981) J. Virol. 40:241 247; McPherson et al. (1985) Virology 147:217 222; Schlehofer et al. (1986) Virology 152:110 117.

Альтернативно, вспомогательные функции можно обеспечивать, используя вектор вспомогательной функции, как определено выше. См., например, патент США № 6004797 и международную публикацию № WO 01/83797, включенные в настоящий документ посредством ссылки во всей их полноте.

Последовательности нуклеиновой кислоты, обеспечивающие вспомогательные функции, можно получать из природных источников, например, из генома частиц аденовирусов, или конструировать с использованием рекомбинантных или синтетических способов, известных в данной области. Как изложено выше, продемонстрировано, что полное восполнение аденовирусных генов не необходимо для вспомогательных хелперных функций. В частности, показано, что мутантные аденовирусы, неспособные к репликации ДНК и синтезу поздних генов, допускают репликацию AAV. Ito et al., (1970) J. Gen. Virol. 9:243; Ishibashi et al, (1971) Virology 45:317. Аналогичным образом, показано, что мутанты в пределах областей E2B и E3 поддерживают репликацию AAV, что показывает, что области E2B и E3 вероятно не вовлечены в предоставление вспомогательных функций. Carter et al., (1983) Virology 126:505. Однако, аденовирусы, дефективные в области E1 или имеющие делецию области E4, не способны поддерживать репликацию AAV. Таким образом, области E1A и E4 вероятно необходимы для репликации AAV, непосредственно или опосредованно. Laughlin et al., (1982) J. Virol. 41:868; Janik et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1925; Carter et al., (1983) Virology 126:505. Другие охарактеризованные мутанты Ad включают: E1B (Laughlin et al. (1982), выше; Janik et al. (1981), выше; Ostrove et al., (1980) Virology 104:502); E2A (Handa et al., (1975) J. Gen.Virol. 29:239; Strauss et al., (1976) J. Virol. 17:140; Myers et al., (1980) J. Virol. 35:665; Jay et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2927; Myers et al., (1981) J. Biol. Chem. 256:567); E2B (Carter, Adeno Associated Virus Helper Functions, в I CRC Handbook of Parvoviruses (P. Tijssen ed., 1990)); E3 (Carter et al. (1983), выше); и E4 (Carter et al.(1983), выше; Carter (1995)). Несмотря на то, что исследования вспомогательных функций, предоставляемых аденовирусами, имеющими мутации в кодирующей области E1B, дали противоречащие результаты, Samulski et al., (1988) J. Virol. 62:206 210, сообщали, что E1B55k необходим для продуцирования вирионов AAV, тогда как E1B19k не необходим. Кроме того, в международной публикации WO 97/17458 и Matshushita et al., (1998) Gene Therapy 5:938 945 описаны векторы вспомогательных функций, кодирующие различные гены Ad. Векторы вспомогательных функций могут содержать кодирующую область аденовирусной VA РНК, кодирующую область ORF6 E4 аденовируса, кодирующую область E2A 72 кДа аденовируса, кодирующую область E1A аденовируса и область E1B аденовируса, не содержащую интактную кодирующую область E1B55k. Такие векторы описаны в международной публикации № WO 01/83797.

Как следствие инфекции клетки-хозяина вирусом-помощником или трансфекции клетки-хозяина вектором вспомогательной функции, происходит экспрессия вспомогательных функций, которые трансактивируют конструкцию AAV помощника для того, чтобы продуцировать белки Rep и/или Cap AAV. Продукты экспрессии Rep исключают рекомбинантную ДНК (в том числе ДНК, представляющую интерес) из AAV экспрессирующего вектора. Белки Rep также служат для того, чтобы копировать геном AAV. Экспрессированные белки Cap собираются в капсиды и происходит упаковка рекомбинантного генома AAV в капсиды. Таким образом, происходит продуктивная репликация AAV и упаковка ДНК в вирионы rAAV. «Рекомбинантный вирион AAV» или «вирион rAAV» определяют в настоящем документе как инфекционный вирус с дефектом репликации, который включает белковую оболочку AAV, которая капсидирует гетерологичную нуклеотидную последовательность, представляющую интерес, которую с обеих сторон фланкируют ITR AAV.

После репликации рекомбинантного AAV, вирионы rAAV можно очищать от клетки-хозяина с использованием различных стандартных способов очистки, таких как колоночная хроматография, градиенты CsCl и т. п. Например, можно использовать множество стадий очистки на колонке, например, очистку на анионообменной колонке, аффинной колонке и/или катионообменной колонке. См., например, международную публикацию № WO 02/12455. Кроме того, если инфекцию используют для того, чтобы экспрессировать вспомогательные функции, остаточный вирус-помощник можно инактивировать, с применением известных способов. Например, аденовирус можно инактивировать нагревом до температур приблизительно 60°C, например, в течение 20 минут или больше. Эта обработка эффективно инактивирует только вирус-помощник, поскольку AAV чрезвычайно термостабилен, тогда как аденовирус-помощник термолабилен.

Затем получаемые вирионы rAAV, содержащие нуклеотидную последовательность, представляющую интерес, можно использовать для доставки гена с использованием способов, описанных далее.

rAAV частицы

В некоторых вариантах осуществления вирусная частица представляет собой рекомбинантную AAV частицу, которая содержит нуклеиновую кислоту, содержащую трансген, фланкированный одним или двумя ITR. Нуклеиновая кислота заключена в капсид в AAV частице. AAV частица также содержит белки капсида. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит кодирующую белок последовательность(последовательности), представляющую интерес (например, терапевтический трансген), функционально связанные компоненты в направлении транскрипции, управляющие последовательности, в том числе последовательности инициации и терминации транскрипции, тем самым формируя экспрессирующую кассету. Экспрессирующую кассету фланкирует на 5ʹ- и 3ʹ-конце по меньшей мере одна функциональная последовательность ITR AAV. Под «функциональными последовательностями ITR AAV» понимают, что последовательност ITR функционируют, как предусмотрено, для спасения, репликации и упаковки вириона AAV. См. Davidson et al., PNAS, 2000, 97(7)3428-32; Passini et al., J. Virol., 2003, 77(12):7034-40; и Pechan et al., Gene Ther., 2009, 16:10-16, все они включены в настоящий документ в полном объеме посредством ссылки. Для практического осуществления некоторых аспектов изобретения, рекомбинантные векторы содержат по меньшей мере все из последовательностей AAV, неотъемлемых для капсидирования и физических структур для инфекции rAAV. ITR AAV для использования в векторах по изобретению не обязательно имеют нуклеотидную последовательность дикого типа (например, как описано в Kotin, Hum. Gene Ther., 1994, 5:793-801) и могут быть изменены посредством инсерции, делеции или замены нуклеотидов или ITR AAV можно получать из любого из нескольких серотипов AAV. В настоящее время известно больше чем 40 серотипов AAV и продолжается идентификация новых серотипов и вариантов существующих серотипов. См. Gao et al., PNAS, 2002, 99(18): 11854-6; Gao et al., PNAS, 2003, 100(10):6081-6; и Bossis et al., J. Virol., 2003, 77(12):6799-810. Использование любого серотипа AAV считают входящим в объем настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления rAAV вектор представляет собой вектор, полученный из серотипа AAV, в том числе, без ограничения, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AA6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh.8, AAVrh.10, AAV11, AAV12 или тому подобное. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота в AAV содержит ITR из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AA6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh.8, AAVrh10, AAV11, AAV12 или тому подобного. В дополнительных вариантах осуществления rAAV частица содержит белки капсида из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AA6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh.8, AAVrh.10, AAV11, AAV12 или тому подобного. В дополнительных вариантах осуществления rAAV частица содержит белки капсида серотипа AAV из клад A-F (Gao, et al. J. Virol. 2004, 78(12):6381).

Различные серотипы AAV используют для того, чтобы оптимизировать трансдукцию конкретных клеток-мишеней или нацелено воздействовать на конкретные типы клеток внутри конкретной целевой ткани (например, пораженной ткани). rAAV частица может содержать вирусные белки и вирусные нуклеиновые кислоты того же асеротип или смешанного серотипа. Любая комбинация серотипов AAV для продуцирования rAAV частицы предусмотрена в настоящем документе, как если бы каждая комбинация была в явной форме указана в настоящем документе.

Самодополняющие AAV вирусные геномы

В некоторых аспектах изобретение относится к вирусным частицам, содержащим рекомбинантный самодополняющий геном. AAV вирусные частицы с самодополняющими геномами и способы использования самодополняющих AAV геномов описаны в патентах США №№ 6596535; 7125717; 7765583; 7785888; 7790154; 7846729; 8093054; и 8361457; и у Wang Z., et al., (2003) Gene Ther 10:2105-2111, каждое из которых включено в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме. rAAV, содержащий самодополняющий геном, будет быстро формировать двухцепочечную молекулу ДНК посредством его частично дополняющих последовательностей (например, дополняющие кодирующие и некодирующие цепи трансгена). В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к AAV вирусной частице, которая содержит AAV геном, в которой rAAV геном содержит первую гетерологичную полинуклеотидную последовательность (например, кодирующую цепь терапевтического трансгена) и вторую гетерологичную полинуклеотидную последовательность (например, некодирующую или антисмысловую цепь терапевтического трансгена), в котором первая гетерологичная полинуклеотидная последовательность может формировать внутрицепные пары оснований со второй полинуклеотидной последовательностью вдоль всей или большей части ее длины. В некоторых вариантах осуществления первая гетерологичная полинуклеотидная последовательность и вторая гетерологичная полинуклеотидная последовательность соединяют с помощью последовательности, которая облегчает образование пар оснований внутри цепи; например, структуру шпильки ДНК. Структуры шпильки известны в данной области, например, в молекулах миРНК. В некоторых вариантах осуществления первую гетерологичную полинуклеотидную последовательность и вторую гетерологичную полинуклеотидную последовательность соединяют с помощью мутантного ITR (например, правого ITR). Мутантный ITR содержит делецию области D, которая содержит последовательность концевого разрешения. Как результат, при репликации AAV вирусного генома белки rep не будут расщеплять вирусный геном по мутантному ITR и по существу рекомбинантный вирусный геном, содержащий следующее в порядке от 5ʹ к 3ʹ, будет упаковываться в вирусный капсид: ITR AAV, первая гетерологичная полинуклеотидная последовательность, содержащая регуляторные последовательности, мутантный ITR AAV, второй гетерологичный полинуклеотид в обратной ориентации по отношению к первому гетерологичному полинуклеотиду, и третий ITR AAV.

Получение rAAV векторов

В данной области известно множество способов получения rAAV векторов, включая трансфекцию, получение стабильной клеточной линии и инфекционные гибридные вирусные продуцирующие системы, которые включают гибриды аденовирус-AAV, гибриды герпесвирус-AAV и гибриды бакуловирус-AAV. Для всех rAAV продуцирующих культур для получения rAAV вирусных частиц необходимы: 1) подходящие клетки-хозяева, в том числе, например, полученные от человека клеточные линии, такие как клетки HeLa, A549 или 293, или полученные от насекомых клеточные линии, такие как SF-9, в случае бакуловирусных продуцирующих систем; 2) подходящая функция вируса-помощника, обеспечиваемая аденовирусом дикого типа или мутантным аденовирусом (таким как температурочувствительный аденовирус), вирусом герпеса, бакуловирусом или плазмидной конструкцией, обеспечивающей хелперные функции; 3) гены rep и cap AAV и продукты генов; 4) трансген (такой как терапевтический трансген), фланкированный по меньшей мере одной последовательностью ITR AAV; и 5) подходящие среды и компоненты сред, чтобы поддерживать продуцирование rAAV. Подходящие среды, известные в данной области, можно использовать для получения rAAV векторов. Эти среды включают, без ограничения, среды, производимые в Hyclone Laboratories и JRH, в том числе модифицированную среду Игла (MEM), модифицированную Дульбекко среду Игла (DMEM), специальные составы, такие как те, которые описаны в патенте США № 6566118, и среды Sf-900 II SFM, как описано в патенте США № 6723551, каждое включено в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме, в частности, с учетом специальных составов сред для использования в получении рекомбинантных AAV векторов.

Подходящие культуральные среды для получения rAAV по настоящему изобретению могут быть с добавлением сыворотки или рекомбинантных белков, полученных из сыворотки, на уровне 0,5%-20% (об./об. или масс./об.). Альтернативно, как известно в данной области, rAAV векторы можно получать в бессывороточных условиях, которые также можно обозначать как среды без продуктов, полученных от животных. Специалист в данной области может принимать во внимание, что коммерческие или специальные среды, разработанные для того, чтобы поддерживать продуцирование rAAV векторов, также могут быть с добавлением одного или нескольких компонентов клеточных культур, известных в данной области, включая без ограничения глюкозу, витамины, аминокислоты и/или факторы роста, чтобы увеличивать титр rAAV в продуцирующих культурах.

rAAV продуцирующие культуры можно выращивать в различных условиях (в широком температурном диапазоне, в течение времени различной длительности и т. п.), подходящих для конкретной используемой клетки-хозяина. Как известно в данной области, rAAV продуцирующие культуры включают культуры, зависящие от прикрепления, которые можно культивировать в подходящих для прикрепления сосудах, таких как, например, вращающиеся флаконы, фильтры из полых волокон, микроносители и биореакторы с наполнителем или с псевдоожиженным слоем. Продуцирующие rAAV вектор культуры также могут включать клетки-хозяева, адаптированные к суспензии, такие как клетки HeLa, 293 и SF-9, которые можно культивировать различными способами, включая, например, вращающиеся колбы, биореакторы с перемешиваемым резервуаром и одноразовые системы, такие как система с мешком Wave.

rAAV векторные частицы по изобретению можно собирать из rAAV продуцирующих культур посредством лизиса клеток-хозяев продуцирующей культуры или посредством сбора отработанной среды из продуцирующей культуры, при условиях, что клетки культивируют в условиях, о которых известно в данной области, что они обуславливают высвобождение rAAV частиц в среды из интактных клеток, как описано более полно в патенте США № 6566118). Подходящие способы лизиса клеток также известны в данной области и включают, например, множество цикло замораживания/размораживания, обработку ультразвуком, микрофлюидизацию и обработку химическими веществами, такими как детергенты и/или протеазы.

Очистка rAAV векторов

При сборе rAAV продуцирующие культуры по настоящему изобретению могут содержать одно или несколько из следующего: (1) белки клетки-хозяина; (2) ДНК клетки-хозяина; (3) плазмидную ДНК; (4) вирус-помощник; (5) белки вируса-помощника; (6) ДНК вируса-помощника; и (7) компоненты среды, в том числе, например, белки сыворотки, аминокислоты, трансферрины и другие низкомолекулярные белки. Кроме того, rAAV продуцирующие культуры дополнительно содержат rAAV частицы, имеющие AAV капсид серотипа, выбранного из группы, состоящей из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12 или тому подобного.

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления урожай rAAV продуцирующей культуры осветляют для того, чтобы удалять дебрис клеток-хозяев. В некоторых вариантах осуществления урожай продуцирующей культуры осветляют посредством фильтрования через ряд объемных фильтров, включая, например, Millipore Millistak+ HC Pod Filter марки DOHC, Millipore Millistak+ HC Pod Filter марки A1HC и 0,2 мкм фильтр Filter Opticap XL1O Millipore Express SHC Hydrophilic Membrane. Осветления также можно достигать с помощью других различных стандартных способов, известных в данной области, таких как, центрифугирование или фильтрование через любой фильтр из ацетата целлюлозы с размером пор 0,2 мкм или более, известный в данной области.

В некоторых вариантах осуществления урожай rAAV продуцирующей культуры дополнительно обрабатывают с использованием Benzonase^® для того, чтобы расщеплять любую высокомолекулярную ДНК, присутствующую в продуцирующей культуре. В некоторых вариантах осуществления расщепление с использованием Benzonase^® осуществляют в стандартных условиях, известных в данной области, в том числе, например, конечная концентрация 1-2,5 единицы/мл Benzonase^® при температуре в диапазоне от окружающей до 37°C в течение периода от 30 минут до нескольких часов.

rAAV частицы можно выделять или очищать с использованием одной или нескольких из следующих стадий очистки: центрифугирование, проточное анионообменное фильтрование, тангенциальное поточное фильтрование (TFF) для концентрирования rAAV частиц, захват rAAV с помощью хроматографии на апатите, тепловая инактивация вируса-помощника, захват rAAV с помощью хроматографии гидрофобного взаимодействия, замена буфера с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC), нанофильтрование и захват rAAV с помощью анионообменной хроматографии. Эти стадии можно использовать отдельно, в различных комбинациях или в различных последовательностях. В некоторых вариантах осуществления способ включает все стадии в порядке, как описано ниже. Способы очистки rAAV частиц можно найти, например, в патентах США №№ 6989264 и 8137948 и в WO 2010/148143.

Композиции и доставка

После получения, рецептор sFlt-1 или векторы (или вирионы), кодирующие его, например, слитные конструкции, описанные выше, формулируют в композиции, подходящие для прямой доставки в глаз для того, чтобы лечить дегенерацию желтого пятна. Если генная терапия является желательной, композиции содержат достаточный генетический материал для того, чтобы продуцировать терапевтически эффективное количество Flt-1, представляющего интерес, например, количество, достаточное для того, чтобы связываться с и опосредовать эффекты соответствующего сигнального пути или чтобы снижать или облегчать симптомы рассматриваемого состояния заболевания, или количество, достаточное для того, чтобы давать желаемый эффект. Подходящие дозы также зависят от состояния субъекта, которое лечат, возраста, тяжести состояния, которое лечат, способа введения, среди других факторов. Подходящее эффективное количество может легко определять специалист в данной области.

Таким образом, «терапевтически эффективное количество» будет попадать в относительно широкий диапазон, который можно определять через клинические исследования. Например, для инъекции вирионов rAAV in vivo терапевтически эффективная доза будет составлять порядка приблизительно от 10⁶ до 10¹⁵ векторных геномов (vg) рекомбинантного вируса, например, от 10⁸ до 10¹⁴ vg, например, от 10⁸ до 10¹² vg, например, от 10⁸ до 10¹⁰ vg, от 10⁸ до 10⁹ vg или какое-либо цилое число между, такое как 0,5×10⁸ vg...1×10⁸ vg...1,5×10⁸ vg...2×10⁸ vg...5×10⁸ vg...1×10⁹ vg...2×10⁹ vg...3×10⁹ vg...5×10⁹ vg...6×10⁹ vg...1×10¹⁰ vg...2×10¹⁰ vg...5×10¹⁰ vg...1×10¹¹ vg...5×10¹¹ vg...1×10¹² vg...5×10¹² vg и т. д.

В аспектах, композиции также содержат офтальмологически приемлемые эксципиенты. Композиции можно формулировать в виде растворов, гелей, мазей, суспензий, сухого порошка для восстановления наполнителем перед использованием или в виде других подходящих и хорошо переносимых офтальмологических систем доставки. Такие эксципиенты включают любое фармацевтическое средство, подходящее для прямой доставки в глаз, которые можно вводить без чрезмерной токсичности. Фармацевтически приемлемые эксципиенты включают, но не ограничиваясь этим, сорбит, какое-либо из различных соединений TWEEN и жидкости, такие как вода, физиологический раствор, глицерин и этанол. Туда могут входить фармацевтически приемлемые соли, например, соли неорганических кислот, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты, сульфаты и т. п.; и соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты, бензоаты и т. п. Дополнительно, вспомогательные вещества, такие как увлажняющие или эмульгирующие средства, pH буферные вещества и т. п., могут присутствовать в таких наполнителях. Тщательное обсуждение фармацевтически приемлемых эксципиентов доступно в REMINGTONʹS PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991).

Введение можно выполнять в одной дозе, непрерывно или через промежутки на всем протяжении курса лечения. Способы определения наиболее эффективного средства введения хорошо известны специалистам в данной области и варьируют вместе с вектором, композицией терапии, клетками-мишенями и субъектом, подлежащим лечению. Однократное и множественное введения можно осуществлять при уровне дозы и паттерне, которые выбирает лечащий врач.

Если вводят множество доз, первый вводимый состав может быть таким же, как и последующие составы, или отличаться от них. Таким образом, например, первое введение может быть в форме AAV вириона и второе введение в форме аденовирусного вектора, плазмидной ДНК, AAV вириона, субъединичной вакцинной композиции или тому подобное. Кроме того, последующая доставка также может быть такой же, как второй вариант доставки, или отличаться от него.

Следует понимать, что больше чем один трансген можно экспрессировать с помощью доставленного рекомбинантного вектора. Альтернативно, отдельные векторы, каждый экспрессирует один или несколько различных трансгенов, также можно доставлять субъекту, как описано в настоящем документе. Таким образом, множество трансгенов можно доставлять параллельно или последовательно. Кроме того, также предусмотрено, что векторы, доставляемые с помощью способов по настоящему изобретению, объединяют с другими подходящими композициями и терапиями. Например, могут присутсововать другие соединения для лечения дегенерации желтого пятна.

Как изложено выше, для доставки конструкций рецептора sFlt-1 в глаз (через генную терапию или белковую терапию), введение типично является локальным. Это обладает преимуществом ограничения количества материала (белка или ДНК), который нужно вводить, и ограничения системных побочных эффектов. Можно использовать многие возможные варианты доставки, включая в качестве неограничивающих примеров: местное введение на роговицу с помощью генной пушки; субконъюктивальную инъекцию, внутрикамерную инъекцию, через глазные капли на роговицу, инъекцию в переднюю камеру через височный край роговицы, внутристромальную инъекцию, нанесение на роговицу в комбинации с электрическими импульсами, внутрироговичную инъекцию, субретинальную инъекцию, интравитреальную инъекцию (например, инъекцию в переднюю, среднюю или заднюю часть стекловидного тела), и внутриглазную инъекцию. Альтернативно клетки можно трансфицировать или трансдуцировать ex vivo и доставлять посредством внутриглазной имплантации. См., Auricchio, Mol. Ther. (2002) 6:490-494; Bennett, Nature Med. (1996) 2:649-654, 1996; Borras, Experimental Eye Research (2003) 76:643-652; Chaum, Survey of Ophthalmology (2002) 47:449-469; Campochiaro, Expert Opinions in Biological Therapy (2002) 2:537-544; Lai, Gene Therapy (2002) 9:804-813; Pleyer, Progress in Retinal and Eye Research (2003) 22:277-293.

Таким образом, офтальмологические составы вводят в какой-либо форме, подходящей для введения глазных лекарственных средств, например, дозированных форм, подходящих для топического введения, раствора или суспензии для введения в виде глазных капель, глазных примочек или инъекции, мази, геля, липосомной дисперсии, коллоидной суспензии микрочастиц или тому подобного или в глазной вставке, например, в необязательно биоразрушаемой полимерной матрице с контролируемым высвобождением. Глазную вставку имплантируют в конъюнктиву, склеру, плоскую часть, передний сегмент или задний сегмент глаза. Импланты обеспечивают контролируемое высвобождение состава на поверхность глаза, типично замедленное высвобождение в течение длительного периода времени. Дополнительно, в вариантах осуществления, состав полностью состоит из компонентов, которые встречаются в природе, и/или в виде GRAS («Generally Regarded as Safe») согласно U.S. Food and Drug Administration.

Можно использовать комбинацию лечения белками и нуклеиновыми кислотами. Например, пациенту можно вводить слитный белок в соответствии с изобретением. Если наблюдают благоприятный ответ, тогда молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую слитный белок, можно вводить для длительного эффекта. Альтернативно, белок и нуклеиновую кислоту можно вводить одновременно или приблизительно одновременно.

Лечение дозами может представлять собой схему с однократной дозой или схему с множеством доз. Кроме того, субъекту можно вводить столько доз, сколько зависит от ситуации. Специалист в данной области может легко определять подходящее число доз.

В аспектах, композиции, описанные в настоящем документе, используют в любом из способов, описанных в настоящем документе.

Наборы по изобретению

Изобретение также относится к наборам. В определенных вариантах осуществления наборы по изобретению содержат один или несколько контейнеров, содержащих очищенный рецептор sFlt-1, слитные конструкции, содержащие его, рекомбинантные векторы, кодирующие его, или AAV вирионы/rAAV векторы, кодирующие его. В вариантах осуществления, наборы содержат офтальмологически приемлемые эксципиенты. Наборы также могут содержать устройства доставки, подходящие для доставки в глаз. Наборы дополнительно могут содержать подходящий набор инструкций, обычно письменных инструкций, касающихся использования набора и его содержимого в каком-либо из способов, описанных в настоящем документе.

Наборы могут содержать компоненты в какой-либо удобной подходящей упаковке. Например, если нуклеиновая кислота, белок, вектор или вирион предоставлены в виде сухого состава (например, лиофилизированного или сухого порошка), можно использовать сосуд с эластичной пробкой с тем, чтобы векторы можно было ресуспендировать посредством инъекции текучего вещества через эластичную пробку. Для жидких составов можно использовать ампулы с неэластичными съемными закрывающими средствами (например, запаянное стекло) или эластичными пробками. Также предусмотрены упаковки для использования в комбинации с конкретным устройством (например, шприцом).

Инструкции в целом содержат информацию в отношении дозы,, режима дозирования и пути введения для предполагаемого способа использования. Контейнеры могут представлять собой стандартные дозы, упаковки без деления на дозы (например, упаковки с множеством доз) или субстандартные дозы. Инструкции, поставляемые в наборах по изобретению, типично представляют собой письменные инструкции на этикетке или вкладыше в упаковку (например, лист бумаги, включенный в набор), но машиночитаемые инструкции (например, инструкции, находящиеся на диске магнитного или оптического накопителя) также предусмотрены.

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Далее приведены примеры конкретных вариантов осуществления для выполнения настоящего изобретения. Примеры предложены только в целях иллюстрации и не предназначены для того, чтобы ограничивать объем настоящего изобретения каким-либо образом.

Предприняты усилия для того, чтобы обеспечить точность в отношении используемых чисел (например, количество, температура и т. д.), но, конечно, следует принимать во внимание некоторые экспериментальные ошибки и отклонения.

Материалы и способы

Конструкция растворимого вектора

На фиг. 1 (SEQ ID № 10) и 2A-2B (SEQ ID № 11) представлены последовательности ДНК и белка для слитного белка, названного «sFLT01». Эта конструкция содержит в порядке от N-конца к C-концу сигнальную последовательность, находящуюся в положениях 1-23 на фиг. 2A-2B; Ig-подобный домен 2 Flt-1 плюс удлиненные фрагменты этого домена, находящиеся в положениях 24-118 на фиг. 2A-2B; последовательность из девяти глицинов, находящуюся в положениях 119-127 на фиг. 2A-2B; и остатки CH2/CH3 IgG1-Fc в положениях 128-358 на фиг. 2A-2B.

ДНК клонировали в плазмиду pCBA(2)-int-BGH, которая содержит промотор гибридного β-актина курицы (CBA) и сигнальную последовательность полиаденилирования бычьего гормона роста (поли A BGH). Xu et al., Hum. Gene. Ther. (2001) 12:563-573.

Затем sFLT01 экспрессирующую кассету целиком клонировали в превирусный плазмидный вектор pAAVSP70, содержащий инвертированные концевые повторы AAV2 (ITR). Ziegler et al, Mol. Ther. (2004) 9:231-240. Полный размер получаемого AAV генома в плазмиде sp70.BR/sFLT01, включая область, фланкированную с помощью ITR, составлял 4,6 т. н.

Рекомбинантный вектор AAV2-sFLT01 продуцировали посредством тройной трансфекции клеток 293 с использованием плазмид-помощников p5rep-Δ-CMVcap и pHelper (Stratagene, La Jolla, CA, USA), и очищали в соответствии с протоколом, используя стадию градиента йодиксанола и колонку HiTrap Heparin (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ, USA) в системе AKTA FPLC (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ). Vincent et al, J. Virol. (1997) 71:1897-1905; Zolotukhin et al., Methods (2002) 28:158-167.

Вирусные титры определяли с использованием анализа в реальном времени TaqMan PCR (ABI Prism 7700; Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) с праймерами, специфичными к поли A последовательности BGH.

Интравитреальная инъекция

Для примера 1, самок яванского макака (Macaca fascicularis) 2,1-2,8 кг седировали кетамином и диазепамом. Перед введением глаз очищали местный антисептиком повидон-йод и промывали стерильным физиологическим раствором. Мидриатическое средство (1% тропикамид) и местный анестетик (пропаракаин) закапывали в каждый глаз с инъекцией. Расширитель века вставляли для того, чтобы держать веки открытыми во время процедуры, а глазное яблоко отводили. Иглу 27 калибра шприца с дозой вставляли через склеру и плоскую часть приблизительно на 4 мм позади края роговицы. Иглу направляли позади хрусталика в одно из трех местоположений: переднее стекловидное тело смежно с периферической сетчаткой, среднее стекловидное тело или заднее стекловидное тело смежно с макулой. AAV вектор инъецировали в общем объеме 50 мкл или 100 мкл.

Индукция хориоидальной неоваскуляризации (CNV).

CNV индуцировали у приматов после введения тестового изделия для того, чтобы дать достаточно времени для достижения пиковой экспрессии трансгена. Диодный лазер с длиной волны 532 нм (Iridex Corp., Mountain View, CA) и адаптер щелевой лампы использовали для разрушения мембраны Бруха, чтобы индуцировать CNV. В области желтого пятна помещали девять ожогов по паттерну сетки 3×3 с использованием лазера того же типа, работая с размером пятна 75 мкм при 500-700 мВт в течение 100-200 миллисекунд.

Оценка CNV

Утечку из CNV повреждений у обезьян оценивали через 2, 3 и 4 недели после индукции лазером с помощью ангиографии с флуоресцеином. Седированным животным инъецировали краситель флуоресцеин (10% флуоресцеин натрия, приблизительно 0,1 мл/кг) и дно глаза визуализировали в несколько моментов времени после инъекции красителя для того, чтобы осуществлять мониторинг артериальной и венозной фазы. Фундоскопические изображения собирали и анализировали на присутствие протекающей CNV в каждом месте ожога.

Пример 1

Эффект AAV2-sFLT01 у не являющихся человеком приматов

Проводили два исследования у не являющихся человеком приматов (NHP) для того, чтобы определять эффект интравитреально введенного AAV2-sFLT01. В первом исследовании (исследование A), яванских макаков лечили интравитреально с использованием 2×10⁸ или 2×10⁹ vg AAV2-sFLT01. Контралатеральный контрольный глаз лечили той же дозой AAV2 вектора, который не кодирует трансген (AAV2-Null). Лазерную индукцию CNV проводили через 6 недель после введения вектора. Максимальную степень CNV обнаруживали при ангиографии с флуоресцеином в 3 неделю, следовательно, это являлось моментом времени, который использовали для оценки эффекта лечения. Число протекающих повреждений сравнивали между глазом, который лечили AAV2-sFLT01, и контралатеральным контрольным глазом (таблица 1). Ни одна из групп лечения sFLT01 не демонстрировала статистически значимое снижение протекающих повреждений CNV по сравнению с AAV2-Null контрольными глазами.

Во втором исследовании (исследовании B) 2×10¹⁰ vg AAV2-sFLT01 или AAV2-Null доставляли интравитреально, тогда как контралатеральный глаз оставляли нетронутым лечением. Лазерную индукцию CNV в обоих глазах проводили через 22 недели после введения вектора. Все шесть глаз, которые лечили AAV2-sFLT01, демонстрировали значительное снижение количества CNV протекания по сравнению с нетронутыми контралатеральными контрольными глазами, причем только 7% ожогов, которые лечили AAV2-sFLT01, демонстрируют протекающую CNV, тогда как 56% ожогов в контрольном глазу протекали. Это различие статистически значимо (p<0,0001), как определяют с помощью точного критерия Фишера. Глаза, которые лечили контрольным вектором AAV2-Null, не демонстрировали снижение CNV по сравнению с контрольными глазами, которые не лечили.

Таблица 1. Результаты двух исследований эффектов у NHP

Исследование Доза (vg)/ Положение инъектата Лазерная индукция (недели после введения) Средняя экспрессия sFLT01 (нг/мл) Процентная доля протекающих повреждений Число животных Глаз, который лечили Контрольный глаз A 2×10⁸ 6 26 28% 50% 2 2×10⁹ 6 190 67% 67% 4 B 2×10¹⁰ 22 1,833 7% 56% 6 2×10¹⁰/ Центральное стекловидное тело
Пустой вектор 22 нет данных 63% 48% 3

Ипсилатеральный глаз из исследования A получал вектор AAV2-sFLT01, тогда как контралатеральный контрольный глаз получал вектор AAV2-Null, за шесть недель до лазерной индукции CNV. В исследовании B ипсилатеральный глаз получал вектор AAV2-sFLT01, когда как контралатеральный гла оставался нетронутым лечением, за шесть недель до лазерной индукции CNV в обоих глазах. Усредненный уровень экспрессии sFLT01 во время лазерной индукции представлен в таблице.

В сумме, интравитреальное введение геннотерапевтического AAV2 вектора, кодирующего растворимый рецептор для VEGF, приводило к трансдукции клеток сетчатки с дозозависимой экспрессией продукта трансгена в глазу примата, не являющегося человеком. Экспрессию впервые измеряли уже через три недели после введения и обнаруживали, что она относительно стабильна относительно последнего момента времени измерения (23 недели).

Эффект наблюдали в NHP модели для семи из восьми животных, у которых уровни экспрессии sFLT01 составляли выше 100 нг/мл в водянистой влаге, что подсказывает, что может иметь место пороговое значение sFLT01, которого следует достигать для того, чтобы вызывать изменение в неоваскуляризации в этой модели. Все шесть животных, которых лечили с использованием 2×10¹⁰ vg, которых облучали лазером через 22 недели после введения вектора, имели сниженную CNV по сравнению с контрольными глазами.

Пример 2

Эффект AAV2-sFLT01 у человека

Исследования с повышением дозы проводили у человека для того, чтобы оценивать безопасность, переносимость и эффект одной интравитреальной инъекции AAV2-sFLT01. AAV2-sFLT01 получали как описано выше. Пациенты, которые участвовали в исследовании, являлись пациентами с неоваскулярной AMD на конечной стадии. Критерии допуска в исследование включали следующее:

- Хориоидальная неоваскулярная мембрана (CNV), вторичная для AMD, как подтверждали с помощью медицинской истории пациента и документированного диагноза CNV.

- Расстояние при остроте зрения с максимальной коррекцией (BCVA) 20/100 или хуже на исследуемом глазу.

- Сопутствующий глаз должен иметь расстояние при BCVA 20/400 или лучше.

- Исследуемый глаз, т. е., глаз, который получал AAV2-sFLT01, имел наихудшую CVA (по сравнению с сопутствующим глазом).

- Субфовеальный дисковидный рубец в исследуемом глазу для части исследования с повышением дозы. Пациенты могли иметь или могли не иметь рубцы желтого пятна в исследуемом глазу для второй части исследования (фаза с максимальной переносимой дозой (MTD)). Кроме того, пациенты, введенные во вторую часть исследования, должны демонстрировать восприимчивость к анти-VEGF терапии в пределах 12 месяцев до скрининга и после самого недавнего лечения пациента анти-VEGF терапией.

- Отмеченное присутствие внутри- или субретинального текучего вещества.

- Достаточная дилатация зрачка, чтобы позволить тщательное зрительное обследование и тестирование.

Критерии исключения представляли собой следующее:

- CNV в исследуемом глазу по какой-либо причине, отличной от AMD.

- История состояний в исследуемом глаз во время скрининга, которые могут изменять остроту зрения или препятствовать тестированию при исследовании.

- Активная неконтролируемая глаукома.

- Наличие каких-либо внутриглазных хирургических вмешательств в исследуемом глазу в пределах 3 месяцев от включения или имеют место известные или вероятные кандидаты на внутриглазное хирургическое вмешательство (включая хирургическую операцию на катаракте) в исследуемом глазу в пределах 1 года от лечения.

- Острая или хроническая инфекция в исследуемом глазу.

- История воспаления в исследуемом глазу или текущее воспаление в любом глазу.

- Какое-либо противопоказание для интравитреальной инъекции.

- Получал фотодинамическую терапию в исследуемом глазу в пределах 60 суток или лазерную фотокоагуляцию в пределах 14 суток перед скринингом.

- В настоящее время использует или использовал ранибизумаб (Lucentis^®), бевацизумаб (Авастин™), или пегаптаниб натрия (Macugen^®) в пределах 1 месяца перед скринингом.

- В настоящее время использует или использовал афлиберцепт (Eylea^®) в пределах 4 месяцев перед скринингом.

- В настоящее время использование любых периокулярных (исследуемый глаз), интравитреальных (исследуемый глаз) или системных (пероральных или внутривенных) стероидов в пределах 3 месяцев перед скринингом.

- Любая активная герпетическая инфекция, в частности, активные повреждения в глазу или на лице.

- Любое значительное плохо контролируемое заболевание, которое может исключать соблюдение исследования и последующее наблюдение.

- Текущее или предшествующее использование любого лекарственного средства, для которого известна токсичность для сетчатки или зрительного нерва.

- Предыдущее лечение с использованием любого глазного или системного продукта переноса гена.

- Принимал какой-либо исследовательский продукт в пределах 120 суток перед скринингом.

В первой части исследования четырем отдельным группам пациентов вводили фиксированный объем 100 мкл с различными дозами AAV2-sFLT01 следующим образом. (1) Группа 1 получала одну интравитреальную инъекцию в один глаз 2×10⁸ vg; (2) Группа 2 получала одну интравитреальную инъекцию в один глаз 2×10⁹ vg; (3) Группа 3 получала одну интравитреальную инъекцию в один глаз 6×10⁹ vg; (4) Группа 4 получала одну интравитреальную инъекцию в один глаз 2×10¹⁰ vg.

Определяли, что эти дозы являются безопасными и хорошо переносимыми. В частности, не наблюдали ограничивающую дозу токсичность (DLT) и не достигали MTD.

Для того чтобы определять эффект AAV2-sFLT01, измеряли изменения количества субретинального и интраретинального текучего вещества относительно базового уровня с помощью оптической когерентной томографии (OCT). Дополнительно BCVA измеряли как были уровни белка sFLT01 в водном текучем веществе через пункцию передней камеры.

К удивлению, пациент, который получал одну интравитреальную инъекцию 2×10⁸ vg, демонстрировал значительное снижение субретинального и интраретинального текучего вещества, как измеряли посредством OCT. См. фиг. 15A и 15B.

Во второй часть исследования, одну интравитреальную инъекцию с наибольшей дозой, использованной в первом исследовании (2×10¹⁰ vg), давали различным пациентам. Эта доза также приводила к значительному снижению субретинального и интраретинального текучего вещества, как измеряли посредством OCT, через два месяца после инъекции. См. фиг. 16A и 16B.

В таблице 2 представлено множество ожидаемых пациентов, отвечающих на лечение, и пациентов, не отвечающих на лечение. Ожидаемый пациент, отвечающий на лечение, охарактеризован как пациент, от которого ожидали, что он продемонстрирует ответ на анти-VEGF лечение, основываясь на характеристиках его базового уровня. Тогда ожидаемые пациенты, отвечающие на лечение, охарактеризованы следующим образом: пациенты, полностью отвечающие на лечение: пациенты, которые демонстрировали устойчивый ответ, сухую сетчатку и возвращение к нормальной анатомии сетчатки без необходимости дополнительного лечения. Пациент, частично отвечающий на лечение: пациенты, которые демонстрировали некоторое снижение текучего вещества. Пациент, не отвечающий на лечение: эффект не наблюдали.

Таблица 2

Биологическая активность

N=19^a ОЖИДАЕМЫЙ ПАЦИЕНТ, ОТВЕЧАЮЩИЙ НА ЛЕЧЕНИЕ (N=11) ОЖИДАЕМЫЙ ПАЦИЕНТ, НЕ ОТВЕЧАЮЩИЙ НА ЛЕЧЕНИЕ (N=7) Пациент, отвечающий на лечение 4^b 0 Пациент, частично отвечающий на лечение 2 0 Пациент, не отвечающий на лечение 5 7

a. Один пациент не поддавался оценке.

b. Среди четырех пациентов, полностью отвечающих на лечение: один - три года, один - два года, один - один год и один - 18 недель.

Как показано в таблице 2, шесть из одиннадцати ожидаемых пациентов, отвечающих на лечение, демонстрировали по меньшей мере частичный ответ на лечение.

Таким образом, описаны способы лечения дегенерации желтого пятна, а также композиции, содержащие рецепторы sFlt-1 и их слитные конструкции. Несмотря на то, что варианты осуществления рассматриваемого изобретения описаны в некоторых деталях, понятно, что можно создавать очевидные вариации, не отступая от сущности и объема изобретения, как определено в настоящем документе.

Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной биологии. Предложено применение вириона рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), который содержит полинуклеотид, который кодирует растворимый белок, который содержит домен VEGFR-1 (Flt-1), способный модулировать активность VEGF, при получении композиции для лечения дегенерации желтого пятна у субъекта-человека посредством доставки не более 2×10⁹ вирионов rAAV в глаз страдающего указанным заболеванием субъекта. Изобретение может быть использовано для лечения в офтальмологии. 6 н. и 47 з. п. ф-лы, 16 ил., 2 табл., 2 пр.

1. Применение вириона рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), который содержит полинуклеотид, который кодирует растворимый белок, который содержит домен VEGFR-1 (Flt-1), способный модулировать активность VEGF, при получении композиции для лечения дегенерации желтого пятна у субъекта-человека посредством доставки не более 2×10⁹ вирионов rAAV в глаз страдающего указанным заболеванием субъекта.

2. Применение по п. 1, в котором снижают внутриглазное давление, толщину сетчатки, субретинальные текучие вещества или интраретинальные текучие вещества.

3. Применение вириона рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), который содержит полинуклеотид, который кодирует растворимый белок, который содержит домен VEGFR-1 (Flt-1), способный модулировать активность VEGF, при получении композиции для лечения отека желтого пятна у субъекта-человека посредством доставки не более 2×10⁹ вирионов rAAV в глаз страдающего указанным заболеванием субъекта.

4. Применение по п. 3, в котором уменьшают внутриглазное давление, толщину сетчатки, субретинальные текучие вещества или интраретинальные текучие вещества.

5. Применение по п. 1 или 3, в котором от 1×10⁸ до 1×10⁹ или от 2×10⁸ до 2×10⁹ вирионов rAAV доставляют в глаз.

6. Применение по п. 1 или 3, в котором 1×10⁷, 2×10⁷, 6×10⁷, 1×10⁸, 2×10⁸, 6×10⁸, 1×10⁹ или 2×10⁹ вирионов rAAV доставляют в глаз.

7. Применение по п. 1 или 3, в котором композиция дополнительно содержит офтальмологически приемлемый наполнитель.

8. Применение по пп. 1 или 3, в котором одну интравитреальную инъекцию вирионов rAAV доставляют в глаз.

9. Применение по п. 1 или 3, в котором растворимый белок содержит:

(a) домен Flt-1;

(b) мультимеризационный домен, полученный из тяжелой цепи иммуноглобулина; и

(c) линкер 5-25 аминокислотных остатков в длину, соединяющий (a) с (b),

в котором, когда экспрессируют растворимый белок, получают мультимер растворимого белка.

10. Применение по п. 1 или 3, в котором домен Flt-1 содержит домен 2 из Flt-1.

11. Применение по п. 9, в котором мультимер представляет собой гомодимер.

12. Применение по п. 9, в котором мультимеризационный домен содержит Fc-область из IgG или ее активный фрагмент.

13. Применение по п. 9, в котором мультимеризационный домен содержит CH3 домен из IgG или его активный фрагмент.

14. Применение по п. 9, в котором мультимеризационный домен происходит из IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.

15. Применение по п. 14, в котором мультимеризационный домен происходит из константной области тяжелой цепи IgG1.

16. Применение по п. 9, в котором линкер выбирают из группы, состоящей из:

gly₉ (SEQ ID № 1);

glu₉ (SEQ ID № 2);

ser₉ (SEQ ID № 3);

gly₅cyspro₂cys (SEQ ID № 4);

(gly₄ser)₃ (SEQ ID № 5);

SerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn (SEQ ID № 6);

ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn (SEQ ID № 7);

GlyAspLeuIleTyrArgAsnGlnLys (SEQ ID № 8); и

Gly₉ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn (SEQ ID № 9).

17. Применение по п. 9, в котором растворимый белок имеет формулу X-Y-Z, в которой X содержит IgG-подобный домен 2 из Flt-1, в которой Y представляет собой Gly9 и в которой Z представляет собой Fc-область IgG или область CH3 IgG.

18. Применение по п. 9, в котором мультимеризационный домен является гуманизированным.

19. Применение по п. 9, в котором растворимый белок содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (a) аминокислотной последовательности SEQ ID № 11; (b) аминокислотной последовательности SEQ ID № 15; (c) аминокислотной последовательности SEQ ID № 17; (d) аминокислотной последовательности SEQ ID № 21 и (e) активного варианта (a), (b), (c) или (d), который обладает по меньшей мере 90% идентичностью последовательностей с ними.

20. Применение по п. 1 или 2, в котором дегенерация желтого пятна представляет собой возрастную дегенерацию желтого пятна (AMD).

21. Применение по п. 20, в котором дегенерация желтого пятна представляет собой влажную AMD.

22. Применение по любому одному из пп. 1-3, 11-19 или 21, в котором вирион rAAV получают из серотипа AAV, выбранного из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh8, AAVrh8R, AAV10, AAVrh10, AAV11 или AAV12.

23. Применение по п. 22, в котором вирион rAAV получают из AAV2.

24. Способ лечения дегенерации желтого пятна у субъекта-человека, который включает введение в пораженный глаз субъекта композиции, которая содержит вирион рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), который содержит полинуклеотид, который кодирует растворимый белок, который содержит домен VEGFR-1 (Flt-1), способный модулировать активность VEGF, где от 1×10⁷ до 1×10¹³ вирионов rAAV доставляют в глаз.

25. Способ по п. 24, в котором способ включает уменьшение внутриглазного давления, толщины сетчатки, субретинальных текучих веществ или интраретинальных текучих веществ.

26. Способ лечения отека желтого пятна у субъекта-человека, который включает введение в пораженный глаз субъекта композиции, которая содержит вирион рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), который содержит полинуклеотид, который кодирует растворимый белок, который содержит домен VEGFR-1 (Flt-1), способный модулировать активность VEGF, где от 1×10⁷ до 1×10¹³ вирионов rAAV доставляют в глаз.

27. Способ по п. 26, в котором способ включает уменьшение внутриглазного давления, толщины сетчатки, субретинальных текучих веществ или интраретинальных текучих веществ.

28. Способ по любому одному из пп. 24-27, в котором от 1×10⁷ до 1×10¹²; от 1×10⁸ до 1×10¹²; от 1×10⁸ до 1×10¹¹; от 1×10⁸ до 1×10¹⁰; от 1×10⁸ до 1×10⁹; от 2×10⁷ до 2×10¹²; от 2×10⁸ до 2×10¹²; от 2×10⁸ до 2×10¹¹; от 2×10⁸ до 2×10¹⁰; от 2×10⁸ до 2×10⁹; от 2×10⁹ до 2×10¹⁰; от 1×10¹⁰ до 1×10¹³; от 1×10¹⁰ до 1×10¹²; от 1×10¹⁰ до 1×10¹¹; от 2×10¹⁰ до 1×10¹³; от 2×10¹⁰ до 1×10¹²; от 2×10¹⁰ до 2×10¹²; от 2×10¹⁰ до 1×10¹¹ или от 2×10¹⁰ до 2×10¹¹ вирионов rAAV вводят в глаз.

29. Способ по любому одному из пп. 24-28, в котором 1×10⁷, 2×10⁷, 6×10⁷, 1×10⁸, 2×10⁸, 6×10⁸, 1×10⁹, 2×10⁹, 6×10⁹, 1×10¹⁰, 2×10¹⁰, 6×10¹⁰, 1×10¹¹, 2×10¹¹, 6×10¹¹, 1×10¹², 2×10¹², 6×10¹² или 1×10¹³ вирионов rAAV вводят в глаз.

30. Способ лечения дегенерации желтого пятна у субъекта-человека, который включает введение в пораженный глаз субъекта композиции, которая содержит вирион рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), который содержит полинуклеотид, который кодирует растворимый белок, который содержит домен VEGFR-1 (Flt-1), способный модулировать активность VEGF, где меньше чем 2×10¹⁰ вирионов rAAV доставляют в глаз.

31. Способ по п. 30, в котором способ включает уменьшение внутриглазного давления, толщины сетчатки, субретинальных текучих веществ или интраретинальных текучих веществ.

32. Способ лечения отека желтого пятна у субъекта-человека, который включает введение в пораженный глаз субъекта композиции, которая содержит вирион рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), который содержит полинуклеотид, который кодирует растворимый белок, который содержит домен VEGFR-1 (Flt-1), способный модулировать активность VEGF, где меньше чем 2×10¹⁰ вирионов rAAV доставляют в глаз.

33. Способ по п. 32, в котором способ включает уменьшение внутриглазного давления, толщины сетчатки, субретинальных текучих веществ или интраретинальных текучих веществ.

34. Способ по любому одному из пп. 30-33, в котором от 2×10⁸ до меньше чем 2×10¹⁰ вирионов rAAV доставляют в глаз.

35. Способ по любому одному из пп. 30-33, в котором до 2×10⁸ вирионов rAAV доставляют в глаз.

36. Способ по любому одному из пп. 30-33, в котором до 2×10⁹ вирионов rAAV доставляют в глаз.

37. Способ по любому одному из пп. 24-36, в котором композиция дополнительно содержит офтальмологически приемлемый наполнитель.

38. Способ по любому одному из пп. 24-37, в котором одну интравитреальную инъекцию вирионов rAAV вводят в глаз.

39. Способ по любому одному из пп. 24-38, в котором растворимый белок содержит:

(a) домен Flt-1;

(b) мультимеризационный домен, полученный из тяжелой цепи иммуноглобулина; и

(c) линкер 5-25 аминокислотных остатков в длину, соединяющий (a) с (b),

в котором, когда экспрессируют растворимый белок, получают мультимер растворимого белка.

40. Способ по любому одному из пп. 24-39, в котором домен содержит домен 2 из Flt-1.

41. Способ по п. 39 или 40, в котором мультимер представляет собой гомодимер.

42. Способ по любому одному из пп. 39-41, в котором мультимеризационный домен содержит Fc-область из IgG или ее активный фрагмент.

43. Способ по любому одному из пп. 39-42, в котором мультимеризационный домен содержит домен CH3 из IgG или его активный фрагмент.

44. Способ по любому одному из пп. 39-43, в котором мультимеризационный домен происходит из IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.

45. Способ по п. 44, в котором мультимеризационный домен происходит из константной области тяжелой цепи IgG1.

46. Способ по любому одному из пп. 39-45, в котором линкер выбирают из группы, состоящей из:

gly₉ (SEQ ID № 1);

glu₉ (SEQ ID № 2);

ser₉ (SEQ ID № 3);

gly₅cyspro₂cys (SEQ ID № 4);

(gly₄ser)₃ (SEQ ID № 5);

SerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn (SEQ ID № 6);

ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn (SEQ ID № 7);

GlyAspLeuIleTyrArgAsnGlnLys (SEQ ID № 8); и

Gly₉ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn (SEQ ID № 9).

47. Способ по любому одному из пп. 39-45, в котором растворимый белок имеет формулу X-Y-Z, в которой X содержит IgG-подобный домен 2 из Flt-1, в которой Y представляет собой Gly₉ и в которой Z представляет собой Fc-область IgG или область CH3 IgG.

48. Способ по любому одному из пп. 39-47, в котором мультимеризационный домен является гуманизированным.

49. Способ по любому одному из пп. 39-48, в котором растворимый белок содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (a) аминокислотной последовательности SEQ ID № 11; (b) аминокислотной последовательности SEQ ID № 15; (c) аминокислотной последовательности SEQ ID № 17; (d) аминокислотной последовательности SEQ ID № 21 и (e) активного варианта (a), (b), (c) или (d), который обладает по меньшей мере 90% идентичностью последовательностей с ними.

50. Способ по любому одному из пп. 24, 25, 28-31 и 34-39, в котором дегенерация желтого пятна представляет собой возрастную дегенерацию желтого пятна (AMD).

51. Способ по п. 50, в котором дегенерация желтого пятна представляет собой влажную AMD.

52. Способ по любому одному из предшествующих пунктов, в котором вирион rAAV получают из серотипа AAV, выбранного из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh8, AAVrh8R, AAV10, AAVrh10, AAV11 или AAV12.

53. Способ по п. 52, в котором вирион rAAV получают из AAV2.