Способ взятия гистологического материала у лабораторных животных при помощи иглы для трепанобиопсии Российский патент 2024 года по МПК A61B10/02 G09B23/28 A61K31/115 A61K31/191 A61K31/155 A61P31/02 A61P43/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к патологической анатомии, экспериментальной онкологии и экспериментальной патологии, ветеринарии, а именно к технике забора гистологического материала.

Метод индукции опухолевого роста общепризнан в качестве классического для экспериментальной онкологии. Однако целенаправленная индукция конкретных типов опухолей требует правильного подбора вещества-канцерогена и, в некоторых случаях, создания проканцерогенного фона, например, в рамках индукции дисгормонального состояния. Зачастую одни и те же условия индукции канцерогенеза имеют отличающиеся результаты, что может быть связано с генетической и фенотипической гетерогенностью разных видов лабораторных животных или их селекционных линий, а также методов и способов введения канцерогена. Таким образом, возникает необходимость динамического наблюдения за патогенезом индуцированного патологического состояния, в том числе в рамках стадирования патологического процесса, оценки его биологического потенциала и кинетики опухолевого роста в каждом конкретном случае.

Традиционно гистологические характеристики индуцированного процесса изучают на биологическом материале, взятом у выведенных из эксперимента крыс. Такой подход хоть и дает возможность оценивать все доступные органы и ткани экспериментальной особи, однако позволяет провести только статический анализ патоморфологической картины, сложившейся на момент выведения лабораторного животного из эксперимента. Это создает препятствие на пути динамического изучения индуцированного в рамках эксперимента патологического процесса.

Для прижизненного забора ткани применяют пункционную биопсию, которая подразделяется на тонкоигольную и толстоигольную (трепанобиопсию, CORE-биопсию), эндоскопическую (трансдуоденальная, бронхоскопическая и др.), торакоскопическую, лапароскопическую и открытую: инцизионную и эксцизионную.

Выбор инструментария и техники взятия биоптата в том или ином случае диктуется особенностью патологического образования или участка, из которого производится забор материала для исследования. В рамках взятия материала из экспериментально индуцированных поверхностных образований наиболее целесообразным является применение толстоигольной биопсии (трепанобиопсии). Тонкоигольная биопсия удобна для аспирации содержимого патологических образований, содержащего отдельные клетки, что неинформативно в рамках изучения гистологии новообразования. В то же время применение инцизионной биопсии приводит к иссечению относительно крупного участка опухоли и может повлиять на дальнейший процесс канцерогенеза. Эксцизионная биопсия по определению лишает возможности проведения дальнейшего динамического наблюдения на конкретном исследуемом новообразовании.

Наиболее близким является метод, описанный Veridiana L. Daley, Charles Dye et al. (Daley VL, Dye C, Bogers SH, Akers RM, Rodriguez FC, Cant JP, Doelman J, Yoder P, Kumar K, Webster D, Hanigan MD. Bovine Mammary Gland Biopsy Techniques. J Vis Exp. 2018 Dec 23;(142). doi: 10.3791/58602. PMID: 30614491.), который принимается нами за прототип. В асептических условиях производился вертикальный разрез длиной 2-3 см посредством скальпеля. Далее применялись инструменты для CORE-биопсии и тонкоигольной биопсии. Инструмент для CORE-биопсии был прикреплен к беспроводной дрели и введен с помощью сверла по часовой стрелке в ткань молочной железы через ранее выполненный разрез. Инструмент для тонкоигольной биопсии вводился вручную в область разреза. После процедуры ассистент тампонировал место разреза стерильным полотенцем в течение 20–25 минут для достижения гемостаза. Далее накладывали хирургические скобы из нержавеющей стали для предотвращения расхождения краев раны. Скобы удаляли через 10 дней после операции.

Однако среди недостатков данного метода требуется выделить следующие: возможность применения только на достаточно крупном объекте (крупный рогатый скот); использование нескольких инструментов, что усложняет проведение процедуры; большой размер операционной раны, что увеличивает риск развития опасного кровотечения и инфицирования; выполнение манипуляции несколькими лицами; требование к герметизации раны посредством специальных хирургических скоб; длительный уход в послеоперационном периоде.

Технический результат заключается в разработке способа взятия гистологического материала у лабораторных животных с сохранением жизнеспособности особи и возможностью проведения повторных серийных биопсий.

Технический результат достигается тем, что лабораторному животному выполняют общую анестезию ингаляционным методом с помощью диэтилового эфира, затем двукратно проводят обработку операционного поля 0,5 % об. спиртовым раствором хлоргексидина биглюконата с помощью марлевой салфетки, после чего иглу с фиксированным мандреном, предназначенную для трепанобиопсии, размерами 14 G х 85 мм, вводят в исследуемый участок тканей животного до ограничителя, далее мандрен отводят от желобка фиксатора на 1,5-2 см, после чего ткань исследуемого участка прижимают большим пальцем свободной руки к игле, в то время как рука, удерживающая иглу, начинает вращательное движение таким образом, что происходит срезание тканей кромкой иглы, затем иглу извлекают таким образом, что по извлечении в области головки иглы остается столбик тканей, гистотопографически соответствующий слоям исследуемого участка, затем лабораторному животному производят гемостаз в области вмешательства, и накладывают асептическую повязку.

ИЗОБРЕТЕНИЕ ПОЯСНЯЕТСЯ ФИГУРАМИ (Фиг. 1-6)

На фиг. 1 – Крыса линии Wistar, введенная в наркоз. Забор биоптата относится к третьей серии (12-я неделя от начала индукции канцерогенеза);

На фиг. 2 – Осуществление прокола опухолевого узла. Отверстие иглы перекрыто посредством фиксации мандрена в желобке фиксатора с целью предотвращения попадания тканей в процессе прокола;

На фиг. 3 – Прокол осуществляется до настраиваемого ограничителя, необходимого для более точного определения глубины прокола;

На фиг. 4 – Полученные столбики гистологического материала помещаются в гистологическую кассету, изнутри покрытую биопсийной поролоновой прокладкой, смоченной в 70 % об. этиловом спирте, с целью предотвращения потери материала;

На фиг. 5 – Обзорное поле зрения столбчатых биоптатов, полученных по предложенному способу. Окраска гематоксилином и эозином, гистотопографическая съемка;

На фиг. 6 – Гистоморфология индуцированной опухоли молочной железы. Биоптат, исследованный по предложенному способу. Гематоксилин и эозин, ув. х100.

Способ осуществляется следующим образом, лабораторному животному выполняют общую анестезию ингаляционным методом с помощью диэтилового эфира, затем двукратно проводят обработку операционного поля 0,5 % об. спиртовым раствором хлоргексидина биглюконата с помощью марлевой салфетки, после чего иглу с фиксированным мандреном, предназначенную для трепанобиопсии, размерами 14 G х 85 мм, вводят в исследуемый участок тканей животного до ограничителя, далее мандрен отводят от желобка фиксатора на 1,5-2 см, после чего ткань исследуемого участка прижимают большим пальцем свободной руки к игле, в то время как рука, удерживающая иглу, начинает вращательное движение таким образом, что происходит срезание тканей кромкой иглы, затем иглу извлекают таким образом, что по извлечении в области головки иглы остается столбик тканей, гистотопографически соответствующий слоям исследуемого участка, затем лабораторному животному производят гемостаз в области вмешательства, и накладывают асептическую повязку, затем в зависимости от цели и задач исследования, например, в случае продолжения индукции роста опухоли или в условиях динамического наблюдения за кинетикой роста, определяют последующее количество процедур по забору биоптата, либо выполняют вышеуказанные действия однократно. Полученный столбик помещают в гистологическую кассету на биопсийную прокладку, смоченную в 70 % об. растворе этилового спирта.

С целью предотвращения утраты биоптата на него можно наносить 1 % об. спиртовой раствор эозина капельным способом, что в последующем маркирует исследуемый материал и предотвращает потерю образца.

Далее кассету помещают в емкость с 10 % об. раствором формалина, таким образом производят фиксацию гистологического материала, после чего выполняют гистологическое препарирование, окрашивают полученные гистологические препараты и проводят их микроскопию.

Полученный столбчатый гистологический препарат соответствует гистотопографии исследуемого участка тканей, органа или образования.

ПРИМЕРЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ СПОСОБА.

1. Для эксперимента были взяты 20 взрослых нерожавших самок крыс линии Wistar, которым подкожно в область проекции молочных желез (в правые паховые и левые абдоминальные) вводили канцероген антраценового ряда 1 категории, а именно ДМБА (9,10-диметил-1,2-бензантрацен). Лабораторные животные были предварительно гиперэстрогенизированы посредством внутримышечного введения синтетического эстрогена для создания дисгормонального фона, способствующего развитию новообразования молочной железы. Кратность внутримышечного введения синтетического эстрогена равнялась 1 раз в неделю курсом 6 недель в дозе 1 мл. Кратность интрамаммарного введения канцерогена равнялась 1 раз в неделю курсом 6 недель в дозе 0,5 мл. На промежуточных этапах индукции канцерогенеза у части крыс (5 особей), выбранных в отдельную группу способом случайного отбора, были взяты участки развивающейся опухоли по предложенному способу. Лабораторному животному выполнили общую анестезию ингаляционным методом с помощью диэтилового эфира, затем двукратно провели обработку операционного поля 0,5 % об. спиртовым раствором хлоргексидина биглюконата с помощью марлевой салфетки.

После чего иглу с фиксированным мандреном, предназначенную для трепанобиопсии, размерами 14 G х 85 мм, ввели в исследуемый участок тканей животного до ограничителя, далее мандрен отвели от желобка фиксатора на 1,5-2 см, после чего ткань исследуемого участка прижали большим пальцем свободной руки к игле, в то время как рука, удерживающая иглу, начала вращательное движение таким образом, что произошло срезание тканей кромкой иглы, затем иглу извлекли таким образом, что по извлечении в области головки иглы остался столбик тканей, гистотопографически соответствующий слоям исследуемого участка.

Затем лабораторному животному произвели гемостаз в области вмешательства, и наложили асептическую повязку, а полученный столбик ткани поместили в гистологическую кассету на биопсийную прокладку, смоченную в 70 % об. растворе этилового спирта.

Далее кассету поместили в емкость с 10 % об. раствором формалина, таким образом произвели фиксацию гистологического материала, после чего выполнили гистологическое препарирование и окрасили полученные гистологические препараты гематоксилином и эозином.

Таким образом произвели забор гистологического материала трехкратно на разных сроках канцерогенеза. Первый забор был произведен на 4-ю неделю от начала индукции канцерогенеза, второй – на 8-ю, третий на 12-ю неделю. В качестве образца для гистологического контроля интактной молочной железы был взят материал у контрольной группы крыс.

На гистологическом материале серийных биоптатов, взятых у взрослых нерожавших самок крыс линии Wistar, был гистологически верифицирован процесс индуцированного канцерогенеза, представляющего собой разрастание опухолевой ткани строения умеренно дифференцированной аденокарциномы молочной железы; непосредственно была оценена его стадийность и динамика отдельных морфологических характеристик, в частности прогностически значимых факторов, таких как биологический потенциал опухоли и кинетика опухолевого роста.

2. Для эксперимента по оценке периневрального роста мягкотканной опухоли были взяты 10 крыс-самцов линии Wistar. Производилась инъекция 0,5 мл ДМБА в область проекции левого большеберцового нерва. Кратность введения составляла 1 инъекция в течение 7 недель. После чего производили динамическое наблюдение за ростом опухоли в исследуемой области. Общая длительность наблюдения составила 2 месяца. Динамика роста опухолевого узла оценивалась в конце первого месяца наблюдения (28 дней с момента последней инъекции), в середине второго месяца наблюдения (42 дня) и в конце (56 дней). В соответствующие дни был взят биоптат из области проекции опухолевого узла по собственному способу. Лабораторному животному выполнили общую анестезию ингаляционным методом с помощью диэтилового эфира, затем двукратно провели обработку операционного поля 0,5 % об. спиртовым раствором хлоргексидина биглюконата с помощью марлевой салфетки.

После чего, иглу с фиксированным мандреном, предназначенную для трепанобиопсии, размерами 14 G х 85 мм, ввели в исследуемый участок тканей животного до ограничителя, далее мандрен отвели от желобка фиксатора на 1,5-2 см, после чего ткань исследуемого участка прижали большим пальцем свободной руки к игле, в то время как рука, удерживающая иглу, начала вращательное движение таким образом, что произошло срезание тканей кромкой иглы, затем иглу извлекли таким образом, что по извлечении в области головки иглы остался столбик тканей, гистотопографически соответствующий слоям исследуемого участка.

Затем лабораторному животному произвели гемостаз в области вмешательства, и наложили асептическую повязку, а полученный столбик ткани поместили в гистологическую кассету на биопсийную прокладку, смоченную в 70 % об. растворе этилового спирта.

Далее кассету поместили в емкость с 10 % об. раствором формалина, таким образом произвели фиксацию гистологического материала, после чего выполнили гистологическое препарирование и окрасили полученные гистологические препараты гематоксилином и эозином.

Таким образом произвели забор гистологического материала трехкратно на разных сроках канцерогенеза (28, 42, 56 дни наблюдения после окончания 7-недельной процедуры индукции роста саркомы).

На гистологическом материале серийных биоптатов, взятых у взрослых самцов крыс линии Wistar, был гистологически верифицирован процесс индуцированного канцерогенеза, представляющего собой разрастание опухолевой ткани строения плеоморфной рабдомиосаркомы (фибросаркомоподобный вариант) G2; непосредственно была оценена его стадийность и динамика отдельных морфологических характеристик, в частности процесс прогрессии периневральной инвазии, а также общая кинетика опухолевого роста.

Данная методика забора биопсии новообразования позволяет оценивать патологический процесс в динамике, а также оценивать стадийность процесса на промежуточных этапах индукции, что позволяет оценить биологический потенциал опухоли и кинетику ее роста. Полученный результат может быть использован в создании серийных микропрепаратов, которые в дальнейшем будут использованы в качестве материала для исследования морфологических особенностей той или иной индуцированной патологии.

Способ необходим для забора биологического материала у лабораторных животных для последующего гистологического препарирования и исследования, что полезно в рамках проведения экспериментов с лабораторными животными, а именно для изучения динамики исследуемого патологического процесса на живой особи, оценки биологического потенциала индуцированных новообразований и возможности выявления стадийности патогенеза исследуемого патологического процесса и кинетики опухолевого роста, что значимо с позиций фундаментальной и экспериментальной медицины и онкологии.

Способ позволяет производить забор гистологического материала у живых, введенных в наркоз лабораторных животных, что дает возможность оценивать динамику патологического процесса у отдельных особей в течение неограниченного рамками времени эксперимента.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к патологической анатомии, онкологии и ветеринарии. После проведения ингаляционной анестезии двукратно обрабатывают операционное поле 0,5 % об. спиртовым раствором хлоргексидина биглюконата. Иглу с фиксированным мандреном, предназначенную для трепанобиопсии, вводят в исследуемый участок тканей животного до ограничителя. Мандрен отводят от желобка фиксатора на 1,5-2 см. Ткань исследуемого участка прижимают большим пальцем свободной руки к игле, в то время как рука, удерживающая иглу, начинает вращательное движение, таким образом, что происходит срезание тканей кромкой иглы. Иглу извлекают таким образом, что по извлечении в области головки иглы остается столбик тканей, гистотопографически соответствующий слоям исследуемого участка. Производят гемостаз в области вмешательства и накладывают асептическую повязку. Способ обеспечивает сохранение жизнеспособности особи и возможность проведения повторных серийных биопсий, дает возможность оценивать динамику патологического процесса у отдельных особей в течение неограниченного рамками времени эксперимента. 6 ил., 2 пр.

Способ взятия гистологического материала у лабораторных животных при помощи иглы для трепанобиопсии, включающий взятие гистологического материала в виде столбика ткани с помощью полой иглы, отличающийся тем, что лабораторному животному выполняют общую анестезию ингаляционным методом с помощью диэтилового эфира, затем двукратно проводят обработку операционного поля 0,5 % об. спиртовым раствором хлоргексидина биглюконата с помощью марлевой салфетки, после чего иглу с фиксированным мандреном, предназначенную для трепанобиопсии, размерами 14 G × 85 мм, вводят в исследуемый участок тканей животного до ограничителя, далее мандрен отводят от желобка фиксатора на 1,5-2 см, после чего ткань исследуемого участка прижимают большим пальцем свободной руки к игле, в то время как рука, удерживающая иглу, начинает вращательное движение, таким образом, что происходит срезание тканей кромкой иглы, затем иглу извлекают таким образом, что по извлечении в области головки иглы остается столбик тканей, гистотопографически соответствующий слоям исследуемого участка, затем лабораторному животному производят гемостаз в области вмешательства и накладывают асептическую повязку.