Нуклеотидная последовательность, кодирующая слитый белок, состоящий из растворимого внеклеточного фрагмента человеческого PDGFRa и константной части тяжелой цепи человеческого IgG4 Российский патент 2024 года по МПК C12N15/62 C07K14/47 C07K14/49 C12N15/63 C12N5/10 

Область техники

Изобретение относится к области биомолекулярной фармакологии, биотехнологии и генетической инженерии и касается молекул нуклеиновых кислот и кодируемых ими новых растворимых белков - функциональных антагонистов PDFRα (Platelet-derived growth factor receptor А) человека, способных блокировать сигнальные пути PDGFR, а также способа их получения.

Уровень техники

Сигнальный путь PDGFR является важным путем RTK (receptor tyrosine kinase, рецепторы с тирозин-киназной активностью), который активируется в различных опухолях и регулирует рост и васкуляризацию опухолевой ткани (Cavalcanti, Ignazzi, De Michele, & Caruso, 2019). Белки PDGFR являются трансмембранными рецепторами, которые способны димеризоваться и фосфорилироваться после связывания с лигандом PDGF (Kashishian, Kazlauskas, & Cooper, 1992), тем самым активируя различные нижележащие сигнальные пути, такие как PI3K/AKT/PKB (путь фосфатидилинозитол-3-киназы /протеинкиназы В), МАРК/ ERK (митоген-активируемая протеинкиназа/ внеклеточная сигнал-регулируемая киназа, JAK (янус-киназа), STAT (сигнальный путь преобразователей и активаторов транскрипции) и путь Notch (Huang et al., 2021; Zou et al., 2022).

К семейству тирозинкиназных рецепоторов PDGFR относятся два родственных рецептора: PDGFRα и PDGFRβ. Лиганды PDGF, связывающиеся с этими рецепторами, обладают различной специфичностью: в зависимости от конкретной изоформы PDGF будут образовываться различные гомо- или гетеродимеры рецепторов PDFRα и PDGFRβ (Reigstad, Varhaug, & Lillehaug, 2005). Пять изоформ PDGF различным и частично перекрывающимся образом экспрессируются в тканях. PDGF секретируются эндотелиальными клетками, макрофагами и эпителиальными клетками и присутствуют в тромбоцитах, высвобождаясь при дегрануляции. PDGF-C имеет большее структурное сходство с VEGF, чем с PDGF-B (Reigstad et al., 2003), в то время как VEGF имеет приблизительно 25% сходство последовательности со всеми PDGF, и, как сообщалось, связывает PDFRα, но не может эффективно его активировать (Pennock, Kazlauskas, et al., 2012).

Ингибирование PDGFR подавляет пролиферацию, метастазирование, инвазию и ангиогенез рака, а также улучшает действие противоопухолевых препаратов (Balamurugan et al., 2021; Thies et al., 2021). Существует ряд новых терапевтических стратегий, основанных на ингибировании пути PDGFR для лечения рака (Sun, Yue, Xu, & Ни, 2022). Передача сигналов PDGF также связана с фиброзными заболеваниями, которые включают прогрессирующее рубцевание и потерю функции ткани из-за пролиферации мезенхимальных клеток и отложения внеклеточного матрикса. Фиброз печени может развиваться по типу обратимой реакции в случае заживления ран после травмы, однако, если он становится хроническим, это может привести к циррозу печени с неблагоприятным прогнозом. Путь PDGFR считается одним из ключевых в инициации фиброза различного генеза (Zhao et al., 2022). Фиброз печени включает активацию звездчатых клеток печени и портальных фибробластов (Friedman, 2008, Gressner and Weiskirchen, 2006), пролиферация и миграция которых зависят от PDGF-B и -D (Borkham-Kamphorst et al., 2007, Pinzani et al., 1989). Однако экспрессия трансгенов PDGF-A или одиночной связи С в печени мышей также вызывала фиброз, который для PDGF-C также приводил к развитию опухолей (Thieringer et al., 2008). Повышенная экспрессия PDGF и PDGFR наблюдалась как в экспериментальных моделях, так и при заболеваниях человека (Borkham-Kamphorst et al., 2008).

Существует три основных подхода к ингибированию пути PDGF/PDGFR: 1) секвестрация лиганда нейтрализующими антителами, растворимыми внеклеточными частями рецепторов, действующими как ловушки лиганда, или аптамерами ДНК/РНК, 2) нарушение взаимодействия между лигандом и рецептором путем блокирования рецептора рецептор-специфическими антителами или низкомолекулярными ингибиторами, 3) использование низкомолекулярных ингибиторов для блокирования киназной активности PDGFR. Ниже более подробно рассматриваюся эти три направления.

Разработка селективных терапвтических антител, секвестирующих PDGF, проблематична за счет того, что существует функциональная избыточность в активации PDGFR их лигандами. Кроме того, PDFRα и PDGFRβ составляют группу рецепторных тирозинкиназ класса III, близких по структуре и функциям к рецепторам клеточной поверхности Kit, FLT3 и CSF1R (Blume-Jensen and Hunter, 2001). Имеются также структурные сходства с тирозинкиназами класса IV и класса V, что еще более затрудняет разработку специфических низкомолекулярных ингибиторов, нацеленных именно на PDGFR путь.

Более перспективным путем разработки селектичных ингибиторов PDGFR являются PDGFR-блокирующие антитела. Оларатумаб (IMC-3G3, Lartruvo™) представляет собой рекомбинантное моноклональное антитело IgG1 человека против PDFRα, которое специфически связывается с PDFRα, блокируя связывание PDGF-AA, PDGF-BB и PDGF-CC и активацию рецептора без перекрестного взаимодействия с PDGFRβ (Loizos et al., 2005). Оларатумаб снижает пролиферацию некоторых моделей опухолей как in vitro, так и in vivo (Gerber et al., 2012, Loizos et al., 2005, Matei et al., 2006, Russell et al., 2010, Stock et al., 2007).

Основываясь на результатах исследования Ib/II фазы распространенной саркомы мягких тканей, где комбинированная терапия оларатумабом и доксорубицином показала значимое улучшение средней общей выживаемости на 11,8 месяцев по сравнению с монотерапией доксорубицином (Тар et al., 2016), оралатумаб получил первое глобальное одобрение для лечения саркомы мягких тканей в США в октябре 2016 г. (Shirley, 2017). В настоящее время он проходит подтверждающие международные клинические испытания фазы III для лечения саркомы мягких тканей (исследование ANNOUNCE: NCT02451943), а также получил условное одобрение для использования в ЕС (Европейское агентство по лекарственным средствам, 2016 г.) для лечения пациентов с запущенной саркомой мягких тканей, которые не поддаются радикальному лечению с помощью хирургического вмешательства или лучевой терапии. Однако, несмотря на многообещающие результаты доклинических исследований ксенотрансплантатов глиобластомы и лейомиосаркомы (Loizos et al., 2005), оралатумаб оказался неэффективным для лечения других солидных опухолей, таких как глиома, рак предстательной железы или рак яичников. Более того, два исследования фазы II оларатумаба были прекращены: исследование распространенного немелкоклеточного рака легкого (NCT00918203) и нерезектабельных и/или метастатических стромальных опухолей желудочно-кишечного тракта (GIST) (NCT01316263), в которых не наблюдалось явного влияния на выживаемость без прогрессирования у пациентов без мутаций PDFRα (Wagner et al., 2017). В июне 2017 г. было начато новое исследование фазы I/II, в ходе которого проверялось влияние оралатумаба в комбинации с наб-паклитакселом и гемцитабином у пациентов с метастатическим раком поджелудочной железы (NCT03086369).

Эффективным подходом к блокированию передачи сигналов PDGFR является использование низкомолекулярных соединений, которые могут проникать в клетки и блокировать его ферментативную активность. Большинство современных противоопухолевых препаратов для ингибирования киназной активности PDGFR основаны на многоцелевых малых молекулах, которые в совокупности называются ингибиторами тирозинкиназы (ИТК, TKI, tyrosine kinase inhibitors), среди которых иматиниб был первым, одобренным для клинического применения в 2001 году (Iqbal и Iqbal)., 2014). Эти препараты связываются с АТФ-связывающим карманом киназ, таким образом конкурируя с АТФ и останавливая активацию и передачу сигналов рецептором. Из-за консервативной структуры кармана АТФ ингибитор обычно подавляет киназы и за пределами предполагаемой мишени. Кроме того, неблагоприятный клеточный ответ на лечение ИТК, такой как активация ингибитора апоптоза XIAP иматинибом, активация FAKn р130 Cas AbI-независимым образом с помощью иматиниба и нилотиниба (Frolov et al., 2016), также будет формировать ответ на ИТК и может объяснить неспособность лекарств ингибировать онкогенную трансформацию. К другим препаратам этого класса относятся нилотиниб, дазатиниб, понатиниб, сунитиниб. Примечательно, что все ИТК имеют несколько мишеней, и не существует селективного ингибитора, блокирующего только PDGFR.

Fc-слитые белки хорошо зарекомендовали себя в качестве терапевтических и профилактических средств. Полученные с помощью этой технологии протеины имеют большой терапевтический потенциал, так как они связаны с Fc-доменом, который заметно удлиняет период полувыведения белков из плазмы крови, что продлевает терапевтическую активность, а также приводит к более медленному почечному клиренсу для молекул большего размера. В последнее время ведется активная разработка терапевтических средств на основе Fc-слитых белков (см. например, RU 2689522, 28.05.2019; WO 2023063842, 20.04.2023).

Целью изобретения является разработка эффективных антагонистов PDFRα на основе технологии Fc-слитых белков.

Сущность изобретения

Задачей настоящего изобретения является расширение арсенала технических средств для лечения онкологических и фиброзных заболеваний. В частности, задача касается получения новых высокоэффективных полипептидных препаратов - антагонистов PDFRα, обладающих высокой аффинностью к лигандам рецептора PDFRα; также задача касается разработки нуклеотидных последовательностей, кодирующих такие полипептиды и являющихся экспрессионной основой для их получения.

Решение поставленной задачи осуществляется путем создания слитого белка PDFRα -hFc, являющегося антагонистом PDFRα, в структуру которого входит (а) фрагмент растворимой внеклеточной части белка PDFRα человека, представленный аминокислотами 24-528 SEQ ID NO: 1 и включающий пять иммуноглобулин-подобных повторов С2 типа, входящих в естественную последовательность PDFRα, а также (б) константная часть тяжелой цепи (Fc-фрагмент) IgG4 человека. Слитый PDFRα-hFc белок не содержит тирозинкиназного домена PDFRα, а также других внутриклеточных доменов PDFRα. При этом Fc-фрагмент IgG4 человека присоединен к фрагменту белка PDFRα с С-конца непосредственно или посредством линкерной последовательности. В некоторых вариантах осуществления изобретения Fc-фрагмент IgG4 человека соединен с фрагментом белка PDFRα безлинкерно. В некоторых других вариантах осуществления изобретения Fc-фрагмент IgG4 человека соединен с фрагментом белка PDFRα через линкерный пептид. В некоторых частных вариантах осуществления изобретения линкерный пептид представляет собой дипептид RS.

В некоторых вариантах осуществления изобретения слитый белок дополнительно включает сигнальную последовательность, локализованную на N-конце слитого белка.

В некоторых вариантах осуществления изобретения слитый белок имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.

Поставленная задача также решается путем создания изолированной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей такой слитый белок.

В некоторых частных вариантах осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты имеет последовательность SEQ ID NO: 3.

Указанная задача также решается путем создания экспрессирующего вектора, несущего нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности изолированной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей такой слитый белок, под контролем регуляторных элементов, необходимых для экспрессии данной нукпеотидной последовательности в клетке-хозяине; а также путем создания клетки-хозяина, включающей экспрессирующий вектор, описанный в настоящей заявке, обеспечивающей эффективную продукцию такого слитого белка с использованием вышеуказанной молекулы нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах воплощения изобретения в качестве таких клеток выступают клетки млекопитающих (в некоторых частных вариантах воплощения изобретения - клетки яичников китайского хомячка (СНО)).

Решение поставленной задачи может достигаться при применении вышеуказанного слитого белка для лечения широкого спектра онкологических и фиброзных заболеваний человека, где требуется ингибирование тирозинкиназной активности PDFRα. Результатом изобретения является создание селективного ингибитора PDGFR, что достигается за счет использования экстраклеточной части PDFRα в составе PDFRα-hFc, которая является лигандом-ловушкой, направленной на снижение способности лигандов PDGF взаимодествовать с клеточным рецептором PDFRα и активировать передачу сигнала. Белок PDFRα-hFc может вводиться пациенту в терапевтически эффективном количестве предпочтительно в составе фармацевтической композиции. Исходя из состава молекулы, разработанные гибридные конструкции обладают только минимальной эффекторной функцией антитело-зависимой клеточной цитотоксичности и не обладают комплемент-зависимой цитотоксичностью, что снижает возможный риск воспалительных реакций и сенсибилизацию при использовании терапевтического агента на основе слитого (гибридного) белка PDFRα-hFc.

При осуществлении изобретения достигаются следующие технические результаты: - создан вариант терапевтического агента на основе слитого (гибридного) белка PDFRα-hFc, содержащего функциональные домены экстра клеточной части PDFRα, слитые с константной частью (Fc-доменом) иммуноглобулина человека IgG4, и способного блокировать тирозинкиназную активность PDGFR путей, а также разработаны нуклеотидные последовательности, кодирующие такие слитые белки и являющиеся экспрессионной основой для их получения.

Краткое описание рисунков

Фиг. 1. Схема экспрессирующего вектора, содержащего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3, кодирующую слитый белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.

Определения и термины

Следующие термины и определения применяются в данном документе, если иное не указано явно. Ссылки на методики, используемые при описании данного изобретения, относятся к хорошо известным методам, включая изменения этих методов и замену их эквивалентными методами, известными специалистам.

В документах данного изобретения термины «включает», «включающий» и т.п., а также «содержит», «содержащий» и т.п.интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего» (или «содержит, помимо всего прочего»). Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».

Термин «и/или» означает один, несколько или все перечисленные элементы.

Термин «необязательный» / «необязательно» (или «опциональный» / «опционально»), используемый в данном документе, означает, что описываемое впоследствии событие или обстоятельство может, но не обязательно, произойти, и что описание включает случаи, когда событие или обстоятельство происходит, и случаи, в которых оно не происходит.

Термины «полипептид», «белок» и «пептид» используют в настоящем документе взаимозаменяемо, и все они означают полимер из аминокислотных остатков. Эти термины также могут использоваться в настоящем описании взаимозаменяемо при обозначении конечного продукта, получаемого в результате экспрессии в клетке-хозяине последовательности нуклеиновой кислоты.

Под «слитым белком» («гибридным белком», «рекомбинантным белком», «слитым полипептидом», «рекомбинантным полипептидом», «гибридной конструкцией») понимают конструкцию из двух или более частей полипептидной природы, ковалентно связанных между собой, образующейся в результате экспрессии рекомбинантной молекулы ДНК, в которой соединены друг с другом в одной рамке считывания кодирующие участки, соответственно, двух или нескольких разных генов или их фрагментов.

Термины «PDFRα», «PDFRα» и «PDGFR-альфа» - взаимозаменяемы и относятся к рецептору тромбоцитарного фактора роста А (от англ. Platelet-derived growth factor receptor А).

Сокращение «ак» означает «аминокислоты».

Термин «изолированный» («выделенный») имеет свое общепринятое значение, известное среднему специалисту в данной области техники, и при использовании в отношении выделенной нуклеиновой кислоты или выделенного полипептида используется без ограничения для обозначения нуклеиновой кислоты или полипептида, которые, благодаря человеку, существуют отдельно от своего нативного окружения и поэтому не являются продуктом природы. Выделенная нуклеиновая кислота или полипептид могут существовать в очищенной форме или могут существовать в ненативном окружении, в таком как, например, клетка-хозяин.

Термин «синонимичная замена» относится к нукпеотидной последовательности, имеющей последовательность нуклеотидов, которая может отличаться от референсной последовательности нуклеиновой кислоты на одну или более замен, которые не ведут к изменению аминокислотной последовательности белка, кодируемой данной молекулой нуклеиновой кислоты. В связи с тем, что генетический код является «вырожденным», то есть различные по нукпеотидной последовательности триплеты могут кодировать одну и ту же аминокислоту, синонимичные замены в нукпеотидной последовательности не приводят к изменению аминокислотной последовательности белка.

Термин «лиганд-ловушка» (от англ. Decoy ligand, также трап) относится к гибридным белкам, состоящим из внеклеточного домена лиганда молекулы-мишени (рецептора) и Fc-домена иммуноглобулина. Внеклеточный домен лиганда отвечает за связывание мишени, а Fc-домен осуществляет димеризацию гибридного белка. Последнее необходимо для увеличения эффективности связывания и обеспечения большей стабильности высокомолекулярного комплекса. В рамках настоящего изобретения «лиганд-ловушка» состоит из определенных фрагментов растворимого внеклеточного фрагмента человеческого белка PDFRα-hFc и константной части тяжелой цепи IgG4 человека.

Термин «лечение» означает излечение, замедление, остановку, либо реверсию прогрессирования заболевания или нарушения. В настоящем документе «лечение» также означает смягчение симптомов, ассоциированных с заболеванием или нарушением.

Под «терапевтически эффективным количеством (терапевтической дозой)» подразумевается количество лекарственного средства, вводимого пациенту, при котором у него с наибольшей вероятностью проявится ожидаемый терапевтический эффект. Точное требуемое количество может меняться от субъекта к субъекту в зависимости от многочисленных факторов, таких как тяжесть заболевания, возраст, масса тела, общее состояние организма, комбинированное лечение с другими препаратами и др. Введение лекарственного средства по изобретению субъекту, нуждающемуся в лечении и/или профилактике заболевания или состояния, осуществляется в дозе, достаточной для достижения терапевтического эффекта. При проведении лечения и/или профилактики введение может осуществляться как разово, так и несколько раз в день, чаще в виде курсового введения на протяжении времени, достаточного для достижения терапевтического эффекта (от нескольких дней до недели, нескольких недель и до месяцев), при этом курсы введения лекарственного средства могут проводиться повторно. В частности, при среднетяжелых формах заболевания разовая доза, кратность и/или длительность введения лекарственного средства по изобретению могут быть увеличены. Предпочтительно слитый белок по изобретению вводят пациенту в составе фармацевтической композиции, включающей, помимо активного компонента, фармацевтически приемлемые носители и/или наполнители.

Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.

Подробное описание изобретения

В настоящем изобретении предлагаются конструкции ДНК, кодирующие слитые белки (рекомбинантные полипептиды) - антагонисты PDFRα, блокирующие сигнальный путь PDFRα.

В частности, изобретение относится к нуклеотидным конструкциям, кодирующим полипептиды, содержащие экстраклеточную часть PDFRα (включающую пять иммуноглобулин-подобных повторов С2 типа), слитую с константной частью (Fc-доменом) иммуноглобулина человека IgG4, PDFRα-hFc.

Естественная последовательность белка PDFRα человека состоит из 1089 аминокислот (ак) (SEQ ID NO: 1). В состав нативного белка входит сигнальный пептид (1-23 ак SEQ ID N0:1), пять иммуноглобулин-подобных повторов С2 типа (24-113, 117-201, 202-306, 319-410, 414-517 ак), трансмембранный домен (529-549 ак), тирозинкиназный домен (593-954 ак). В составе белка выделяется экстраклеточная (внеклеточная) часть (24-528 ак SEQ ID NO: 1) и цитоплазматическая часть (550-1089 ак SEQ ID NO: 1).

В рамках настоящего изобретения в процессе разработки новых полипептидных препаратов - ингибиторов тирозинкиназной активности PDFRα было осуществлено клонирование последовательности, соответствующей экстраклеточному домену PDFRα и содержащей пять иммуноглобулин-подобных повторов С2 типа и ее слияние в одной рамке считывания с последовательностью, кодирующей константную часть тяжелой цепи IgG4 человека как непосредственно (т.е. безлинкерно), так и посредством линкерной последовательности. Слитый белок PDFRα-hFc по изобретению также может необязательно содержать сигнальную последовательность, которая может включать любую последовательность, известную квалифицированному специалисту в области управления секрецией полипептида или белка из клетки, и включать природные или синтетические последовательности. Обычно сигнальная последовательность размещается на N-конце слитого белка по настоящему изобретению.

Слитый белок (рекомбинантный полипептид), являющийся объектом настоящего изобретения, может быть получен следующим образом.

Растворимые рекомбинантные полипептиды-антагонисты PDFRα производят в результате экспрессии кодирующих их нуклеотидных последовательностей в эукариотических клеточных линиях, с последующей очисткой синтезированных рекомбинантных белков при помощи аффинной, ионобменной или гидрофобной хроматографии, применяемых по отдельности или в различных сочетаниях друг с другом, а также при помощи иных способов очистки белков. Соответствующие нуклеотидные последовательности получают при помощи комбинирования участков ДНК, кодирующих выбранные домены PDFRα, с последовательностью ДНК, кодирующей Fc-фрагмент IgG4 человека. В некоторых частных вариантах изобретения молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие такие полипептиды-антагонисты PDFRα, имеют нуклеотидную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 3.

Также указанная задача решается путем создания экспрессирующего вектора, содержащего данную молекулу нуклеиновой кислоты под контролем регуляторных элементов, необходимых для экспрессии данной нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине. В предпочтительных вариантах изобретения в качестве клетки-хозяина, включающей такой экспрессирующий вектор, могут выступать клетки яичников китайского хомячка СНО (например, клеточные линии СНО-К1 или СНО DG44), адаптированные для производства терапевтических белков. В настоящем изобретении экспрессирующий вектор предпочтительно подбирается для экспрессии гетерологичных последовательностей в клетках млекопитающих, но в некоторых вариантах изобретения экспрессирующий вектор может быть выбран для экспрессии в других системах, таких как, например, клетки насекомых, дрожжевые или бактериальные клетки. Соответственно, каждый экспрессирующий вектор имеет свой набор регуляторных элементов, позволяющих проводить экспрессию гетерологичной последовательности (продукта) в клетке-хозяине, таких как промоторы и/или энхансеры, последовательности Козак, polyA последовательности и другие регуляторные последовательности. А также может иметь последовательности, кодирующие лидерные (сигнальные) пептиды, обеспечивающие секрецию рекомбинантных полипептидов во внеклеточную среду. Терминация синтеза белка с заданной изолированной последовательности нуклеиновой кислоты определяется добавлением к ней с 3'-конца в одной рамке считывания одного или нескольких стоп-кодонов.

После трансфекции вектора в клетки эукариотической клеточной линии происходит синтез рекомбинантного полипептида и его секреция в культуральную бессывороточную среду. Полученный рекомбинантный полипептид очищают из среды при помощи, как правило, аффинной хроматографии на белок протеин-А или белок протеин-G, однако могут использоваться и другие методы очистки белков.

Нижеследующие примеры приведены в целях раскрытия характеристик настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.

Пример 1. Конструирование плазмид

Для конструирования плазмид с заявляемыми нуклеотидными последовательностями была использована последовательность, кодирующая белок человека DII4, полученная из плазмиды RG211740 (OriGene, PDFRα, Human Tagged ORF clone). Фрагмент PDFRα был выбран на основе биоинформатического анализа последовательности и соответствующая кодирующая его нуклеотидная последовательность была использована для последующего клонирования. Для клонирования участка, соответствующему аминокислотам 24-528 SEQ ID NO: 1, (с целью получения в дальнейшем SEQ ID NO: 2) были подобраны следующие праймеры:

PDGFRA_S: p-CCAGCTTTCATTACCCTCTATCCTT (SEQ ID NO: 4)

PDGFRA_R: TAAGATCTAGCCACCGTGAGTTCAGAACGCA (SEQ ID NO: 5)

Проведена ПЦР со следующими условиями: 98°С 1 мин, 30 циклов (98°С 10 сек, 63°С 10 сек, 72°С 2 мин), 72°С 5 мин. Компоненты реакции: полимераза - Phusion (Thermo), буфер, содержащий Mg2+ для Phusion-полимеразы (Thermo), по 10 пкмоль каждого из праймеров и 0,25 мМ смеси трифосфатов нуклеотидов (Thermo). Амплификацию осуществляли с последовательности RG211740 (Origene). После ПЦР: ПЦР продукт очищали набором для очистки ПЦР продуктов GeneJet PCR purification kit (Fermentas). Концентрация и соответствие предсказанному молекулярному весу проверяли при помощи гель-электрофореза в 1% агарозе (ТАЕ буфер). Полученные ПЦР продукты были использованы для дальнейшего конструирования.

Для клонирования целевых последовательностей использовался вектор pFUSE-hIgG4e-Fc2 (InvivoGen), который позволяет получить слитые с Fc-доменом IgG4 последовательности и проводить исследование их свойств. В один из праймеров был включен сайт рестрикции Bglll (PDGFRA_R), что после амплификации и рестрикции позволило пулучить фрагмент ДНК с одним липким (Bglll) сайтом и одним тупым. Вектор обрабатывали рестриктазами EcoRV и Bglll (Thermo), а ПЦР-продукт обрабатывали рестриктазой Bglll (Thermo) в течение 1 часа при 37°С, затем очищали с помощью GeneJet PCR purification kit (Fermentas) и лигировали, используя 1 Ед (ME) лигазы (Thermo) по протоколу производителя. Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки Е, coli XL1-Blue и высевали на среду LB, содержащую зеоцин.

Чашки инкубировали в термостате в течение ночи при 37°С. На следующий день проверяли по 20 колоний из каждой лигазной смеси на присутствие нужной вставки, для этого часть колонии разводили в 20 мкл воды и кипятили в течение 5 минут. После охлаждения смесь откручивали и использовали 1 мкл в качестве матрицы в реакции ПЦР. ПЦР осуществляли при помощи Taq ДНК-полимеразы (Fermentas) и праймеров PROMF2 и FRAT2. Присутствие вставки проверяли после электрофореза ПЦР продуктов. Из двух колоний, содержащих вставку, выделяли плазмидную ДНК, верифицировали длины рестрикционных фрагментов при помощи рестрикции с эндонуклеазами EcoRI и HindiII и секвенировали с использованием праймеров PROMF2 и FC на секвенаторе Applied Biosystems 3500 по инструкции производителя, используя праймеры PROMF2 (прямой) и FC (обратный).

PROMF2: GCCTGACCCTGCTTGCTCAACT (SEQ ID NO: 6)

FRAT2: CGAGGCACTGCTCACTTCCAAGA (SEQ ID NO: 7)

FC: CTCACGTCCACCACCACGCA (SEQ ID NO: 8)

Сконструированная в результате плазмида, содержащая целевые нуклеотидные последовательности, показана на Фиг. 1.

Таким образом, в результате проведенных исследований разработана нуклеотидная последовательность, кодирующая слитый белок PDFRα-hFc и являющиеся экспрессионной основой для его получения, а также получен слитый белок PDFRα-hFc, содержащий функциональные домены экстра клеточной части PDFRα, слитые с константной частью (Fc-доменом) иммуноглобулина человека IgG4, способный эффективно блокировать тирозинкиназную активность PDGFR путей, который может быть использован в терапии онкологических и фиброзных заболеваний.

Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="PDGFRa.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.3.0"

productionDate="2023-08-09">

<ApplicantFileReference>496234</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">Общество с ограниченной

ответственностью &quot;Пальмира Биофарма&quot; </ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>&quot;PALMIRA BIOPHARMA&quot; Limited Liability

Company</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">НУКЛЕОТИДНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ,

КОДИРУЮЩАЯ СЛИТЫЙ БЕЛОК, СОСТОЯЩИЙ ИЗ РАСТВОРИМОГО ВНЕКЛЕТОЧНОГО

ФРАГМЕНТА ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО PDGFRa И КОНСТАНТНОЙ ЧАСТИ ТЯЖЕЛОЙ ЦЕПИ

ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО IgG4</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>8</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>1089</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..1089</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>MGTSHPAFLVLGCLLTGLSLILCQLSLPSILPNENEKVVQLNSSFSLRC

FGESEVSWQYPMSEEESSDVEIRNEENNSGLFVTVLEVSSASAAHTGLYTCYYNHTQTEENELEGRHIYI

YVPDPDVAFVPLGMTDYLVIVEDDDSAIIPCRTTDPETPVTLHNSEGVVPASYDSRQGFNGTFTVGPYIC

EATVKGKKFQTIPFNVYALKATSELDLEMEALKTVYKSGETIVVTCAVFNNEVVDLQWTYPGEVKGKGIT

MLEEIKVPSIKLVYTLTVPEATVKDSGDYECAARQATREVKEMKKVTISVHEKGFIEIKPTFSQLEAVNL

HEVKHFVVEVRAYPPPRISWLKNNLTLIENLTEITTDVEKIQEIRYRSKLKLIRAKEEDSGHYTIVAQNE

DAVKSYTFELLTQVPSSILDLVDDHHGSTGGQTVRCTAEGTPLPDIEWMICKDIKKCNNETSWTILANNV

SNIITEIHSRDRSTVEGRVTFAKVEETIAVRCLAKNLLGAENRELKLVAPTLRSELTVAAAVLVLLVIVI

ISLIVLVVIWKQKPRYEIRWRVIESISPDGHEYIYVDPMQLPYDSRWEFPRDGLVLGRVLGSGAFGKVVE

GTAYGLSRSQPVMKVAVKMLKPTARSSEKQALMSELKIMTHLGPHLNIVNLLGACTKSGPIYIITEYCFY

GDLVNYLHKNRDSFLSHHPEKPKKELDIFGLNPADESTRSYVILSFENNGDYMDMKQADTTQYVPMLERK

EVSKYSDIQRSLYDRPASYKKKSMLDSEVKNLLSDDNSEGLTLLDLLSFTYQVARGMEFLASKNCVHRDL

AARNVLLAQGKIVKICDFGLARDIMHDSNYVSKGSTFLPVKWMAPESIFDNLYTTLSDVWSYGILLWEIF

SLGGTPYPGMMVDSTFYNKIKSGYRMAKPDHATSEVYEIMVKCWNSEPEKRPSFYHLSEIVENLLPGQYK

KSYEKIHLDFLKSDHPAVARMRVDSDNAYIGVTYKNEEDKLKDWEGGLDEQRLSADSGYIIPLPDIDPVP

EEEDLGKRNRHSSQTSEESAIETGSSSSTFIKREDETIEDIDMMDDIGIDSSDLVEDSFL</INSDSeq_

sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>754</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..754</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>MYRMQLLSCIALSLALVTNSIQLSLPSILPNENEKVVQLNSSFSLRCFG

ESEVSWQYPMSEEESSDVEIRNEENNSGLFVTVLEVSSASAAHTGLYTCYYNHTQTEENELEGRHIYIYV

PDPDVAFVPLGMTDYLVIVEDDDSAIIPCRTTDPETPVTLHNSEGVVPASYDSRQGFNGTFTVGPYICEA

TVKGKKFQTIPFNVYALKATSELDLEMEALKTVYKSGETIVVTCAVFNNEVVDLQWTYPGEVKGKGITML

EEIKVPSIKLVYTLTVPEATVKDSGDYECAARQATREVKEMKKVTISVHEKGFIEIKPTFSQLEAVNLHE

VKHFVVEVRAYPPPRISWLKNNLTLIENLTEITTDVEKIQEIRYRSKLKLIRAKEEDSGHYTIVAQNEDA

VKSYTFELLTQVPSSILDLVDDHHGSTGGQTVRCTAEGTPLPDIEWMICKDIKKCNNETSWTILANNVSN

IITEIHSRDRSTVEGRVTFAKVEETIAVRCLAKNLLGAENRELKLVAPTLRSELTVARSYGPPCPPCPAP

EFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRV

VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGF

YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS

LSPGK</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>2262</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..2262</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atgtacaggatgcaactcctgtcttgcattgcactaagtcttgcacttg

tcacgaattcgatccagctttcattaccctctatccttccaaatgaaaatgaaaaggttgtgcagctgaa

ttcatccttttctctgagatgctttggggagagtgaagtgagctggcagtaccccatgtctgaagaagag

agctccgatgtggaaatcagaaatgaagaaaacaacagcggcctttttgtgacggtcttggaagtgagca

gtgcctcggcggcccacacagggttgtacacttgctattacaaccacactcagacagaagagaatgagct

tgaaggcaggcacatttacatctatgtgccagacccagatgtagcctttgtacctctaggaatgacggat

tatttagtcatcgtggaggatgatgattctgccattataccttgtcgcacaactgatcccgagactcctg

taaccttacacaacagtgagggggtggtacctgcctcctacgacagcagacagggctttaatgggacctt

cactgtagggccctatatctgtgaggccaccgtcaaaggaaagaagttccagaccatcccatttaatgtt

tatgctttaaaagcaacatcagagctggatctagaaatggaagctcttaaaaccgtgtataagtcagggg

aaacgattgtggtcacctgtgctgtttttaacaatgaggtggttgaccttcaatggacttaccctggaga

agtgaaaggcaaaggcatcacaatgctggaagaaatcaaagtcccatccatcaaattggtgtacactttg

acggtccccgaggccacggtgaaagacagtggagattacgaatgtgctgcccgccaggctaccagggagg

tcaaagaaatgaagaaagtcactatttctgtccatgagaaaggtttcattgaaatcaaacccaccttcag

ccagttggaagctgtcaacctgcatgaagtcaaacattttgttgtagaggtgcgggcctacccacctccc

aggatatcctggctgaaaaacaatctgactctgattgaaaatctcactgagatcaccactgatgtggaaa

agattcaggaaataaggtatcgaagcaaattaaagctgatccgtgctaaggaagaagacagtggccatta

tactattgtagctcaaaatgaagatgctgtgaagagctatacttttgaactgttaactcaagttccttca

tccattctggacttggtcgatgatcaccatggctcaactgggggacagacggtgaggtgcacagctgaag

gcacgccgcttcctgatattgagtggatgatatgcaaagatattaagaaatgtaataatgaaacttcctg

gactattttggccaacaatgtctcaaacatcatcacggagatccactcccgagacaggagtaccgtggag

ggccgtgtgactttcgccaaagtggaggagaccatcgccgtgcgatgcctggctaagaatctccttggag

ctgagaaccgagagctgaagctggtggctcccaccctgcgttctgaactcacggtggctagatcttatgg

tcccccatgcccaccatgcccagcacctgagttcctggggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaa

cccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaag

accccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcggga

ggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggc

aaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagcca

aagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggt

cagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcag

ccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggc

taaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgca

caaccactacacacagaagagcctctccctgtctccgggtaaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>25</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ccagctttcattaccctctatcctt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>31</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..31</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q10">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>taagatctagccaccgtgagttcagaacgca</INSDSeq_sequence

>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="6">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q12">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gcctgaccctgcttgctcaact</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="7">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q14">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cgaggcactgctcacttccaaga</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="8">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q16">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ctcacgtccaccaccacgca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, а именно к рекомбинантным слитым белкам - антагонистам PDGFRα, состоящим из фрагмента растворимой внеклеточной части белка PDGFRα человека и Fc-фрагмента IgG4 человека, соединенных линкерной последовательностью RS. Также раскрыты нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные белки, векторы экспрессии, содержащие указанные нуклеиновые кислоты, и клетки, экспрессирующие данные слитые белки. Получаемые рекомбинантные белки эффективны для блокирования тирозинкиназной активности PDGFR-путей. 4 н. и 4 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 пр.

1. Слитый белок - антагонист PDGFRα, состоящий из фрагмента растворимой внеклеточной части белка PDGFRα человека, представленного аминокислотной последовательностью, соответствующей положениям 24-528 последовательности SEQ ID NO: 1, и Fc-фрагмента IgG4 человека, присоединенного к фрагменту белка PDGFRα с С-конца посредством линкерной последовательности RS.

2. Слитый белок по п. 1, дополнительно включающий сигнальную последовательность, локализованную на N-конце слитого белка.

3. Слитый белок по п. 1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.

4. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок по любому из пп. 1-3.

5. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты по п. 4, имеющая последовательность SEQ ID NO: 3.

6. Экспрессирующий вектор, имеющий в своем составе последовательность нуклеиновой кислоты по любому из пп. 4, 5 под контролем регуляторных элементов, необходимых для ее экспрессии в клетке-хозяине.

7. Клетка, способная экспрессировать слитый белок по любому из пп. 1-3, не являющаяся эмбриональной клеткой человека и трансфецированная экспрессирующим вектором по п. 6.

8. Клетка по п. 7, представляющая собой клетку яичников китайского хомячка (СНО).