Нуклеотидная последовательность, кодирующая слитый белок, состоящий из растворимого экстраклеточного фрагмента человеческого IL-6R и константной части тяжелой цепи человеческого IgG4 Российский патент 2024 года по МПК C07K14/54 A61K47/68 C12N15/62 

Область техники

Изобретение относится к области биомолекулярной фармакологии, биотехнологии и генетической инженерии и касается молекул нуклеиновых кислот и кодируемых ими новых растворимых белков - функциональных антагонистов IL-6 человека, способных блокировать провоспалительный ответ, а также способа их получения. В основе изобретения лежит использование белка-рецептора IL-6R (Interleukin-6 receptor), в составе молекулы рецептора-ловушки.

Уровень техники

Цитокины включают класс белков, которые опосредуют воспаление и модулируют иммунитет. Одна группа цитокинов, интерлейкины, носит это название, поскольку считалось, что они опосредуют передачу сигналов между лейкоцитами (отсюда и название интерлейкины) (Dinarello, 2011). Цитокины играют решающую роль в развитии многих воспалительных заболеваний (Feldmann, 2008).

Хроническое воспаление лежит в основе широкого спектра аутоиммунных и воспалительных заболеваний, приводящих к системному поражению органов (например, при системной красной волчанке) или целенаправленному поражению органов (например, в случае ревматоидного артрита, воспалительных заболеваний кишечника, диабета 1 типа и астмы) (Feldmann, 2008). До того, как были открыты методы лечения посредством ингибирования противоопухолевого фактора некроза-α (TNFα), противовоспалительные средства включали широкий спектр иммунодепрессантов и нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП). Хотя эти терапевтические агенты зачастую эффективны в подавлении иммунных ответов, они часто связаны с развитием нежелательных побочных эффектов, также значительная доля пациентов не отвечает на лечение такими препаратами (Feldmann, 2008; Kaur, Bansal et al. 2020). По этим причинам поиск препаратов с новыми механизмами действия является актуальным.

Воспаление - это естественный защитный механизм организма, который включает миграцию лейкоцитов в поврежденные ткани для уничтожения триггера воспаления или поражения. Инфекционные и аллергические триггеры вызывают начальную фазу острого воспаления, которое, как считается, имеет ограниченный положительный эффект. Но продолжающееся острое воспаление приводит к хроническому воспалению, которое приводит к повреждению тканей. Острое воспаление характеризуется инфильтрацией нейтрофильных клеток, за которыми следуют моноцитарные клетки, тогда как хроническое воспаление характеризуется присутствием мононуклеарных клеток, таких как макрофаги и лимфоциты, в месте воспаления (Melnicoff, Horan et al., 1989)

Помимо рекрутирования этих клеток в очаге воспаления, во время воспалительных процессов также вырабатываются различные цитокины. Они действуют синергически и обладают перекрывающейся активностью, которая может проявляться при взаимодействии с их рецепторами и транслироваться в путях внутриклеточной передачи сигнала. Эти цитокины в основном включают интерлейкин-6 (IL-6), интерлейкин-1β (IL-1β), фактор некроза опухоли-α (TNF-α), интерферон-γ (IFN-γ) и трансформирующий фактор роста-β (TGF-β), которые стимулируют выработку белков острой фазы (APP) (Kushner, 1993).

Интерлейкин-6 (IL-6) представляет собой плейотропный провоспалительный цитокин, который активно участвует в воспалительных и иммуномодулирующих механизмах. Нарушение регуляции IL-6 связано с хроническим воспалением и многофакторными аутоиммунными нарушениями. Он стимулирует выработку так называемых белков острой фазы, действует как агент созревания В-лимфоцитов, стимулирует синтез и секрецию различных иммуноглобулинов и индуцирует пролиферацию Т-клеток. IL-6 не только вызывает реакции острой фазы, но также приводит к развитию специфических клеточных и гуморальных иммунных ответов, посредством влияния на конечную стадию дифференцировки B-клеток, секрецию иммуноглобулинов и активацию Т-клеток. Таким образом, IL-6 является важным модулятором перехода от острой фазы воспаления к хронической (Kaplanski, Marin et al., 2003). IL-6 выполняет свою биологическую роль посредством гексамерного комплекса, состоящего из самого IL-6, его рецептора IL-6R и гликопротеина 130 (IL-6/IL-6R/gp130). Этот комплекс, в свою очередь, активирует различные механизмы передачи сигналов (классические и транссигнальные) для выполнения различных биохимических функций. Интересно, что ни IL-6, ни IL-6R не обнаруживают значительного сродства к gp130 (Rose-John, 2012, Zunke and Rose-John, 2017). Высокой аффинностью к gp130 обладает комплекс IL-6 и IL-6R. В то время как gp130 присутствует на всех клетках организма, IL-6R преимущественно представлен на гепатоцитах и некоторых лейкоцитах. Однако IL-6R может быть отщеплен от клеточной мембраны с помощью протеолитического действия ADAM17, в результате чего образуется растворимый фрагмент рецептора IL-6R (sIL-6R) (Riethmueller et al., 2017). Интересно, что sIL-6R может связывать лиганд IL-6, а комплекс IL-6 и sIL-6R может связываться с gp130 на клетках, которые не экспрессируют IL-6R (Rose-John, 2012; Zunke and Rose-John, 2017). Такие клетки, которые не были бы чувствительны к IL-6, сенсибилизируются за счет взаимодействия IL-6/sIL-6R комплекса с gp130. Такой путь получил название транссигнального пути IL-6 (Zunke and Rose-John, 2017). Известно, что транссигнальный механизм активирует различные патологические пути, такие как JAK/STAT3, Ras/MAPK, PI3K-PKB/Akt, а также регуляцию CD4+ Т-клеток и уровня VEGF. Разбалансировка этой регуляции в конечном счёте может приводить к широкому спектру различных отклонений, включая различные иммуновоспалительные состояния и онкологические заболевания.

Из литературы известен однонуклеотидный полиморфизм (rs2228145) в гене IL-6R, который приводит к аминокислотной замене аспарагиновой кислоты 358 на аланин 358 (D358A) вблизи сайта расщепления IL-6R металлопротеазой ADAM17 (Zunke and Rose-John, 2017). Известно, что замена D358A приводит к более эффективному расщеплению IL-6R металлопротеазами и, следовательно, к повышению уровня sIL-6R примерно на 50% (Garbers et al., 2014). В нескольких генетических исследованиях было обнаружено, что минорная аллель rs2228145, приводящая к замене D358A, обеспечивает защиту от ишемической болезни сердца, ревматоидного артрита, других воспалительных заболеваний, а также диабета второго типа (Sarwar et al., 2012, Ferreira et al., 2013, Interleukin-6 Receptor Mendelian Randomisation Analysis (IL6R MR) Consortium., 2012). Несмотря на то, что механизм действия данной аллели все еще остается не до конца изученным, такие результаты были объяснены буферной активностью sIL-6R по отношению к связыванию IL-6 (Calabrese et al., 2014).

Участие IL-6 в патофизиологии таких заболеваний как рассеянный склероз, болезнь Альцгеймера, Ревматоидный артрит (РА), болезнь Кастлемана (БК), воспалительные заболевания кишечника и болезнь Крона делает его одной из важнейших мишеней для терапии. IL-6 также является основным цитокином в микроокружении опухоли, и известно, что его регуляция при раке нарушается. Он сверхэкспрессируется почти во всех типах опухолей, таких как рак молочной железы, рак простаты, карцинома яичников, рак поджелудочной железы, рак легких, почечно-клеточный рак, рак шейки матки и множественная миелома. IL-6 активирует сигнальные пути JAK/STAT3, Ras/MAPK и PI3K-PKB/Akt, которые, в свою очередь, регулируют многие генные продукты, вызывающие клеточную пролиферацию, дифференцировку, апоптоз, ангиогенез и метастазирование (Kaur, Bansal et al., 2020). Клинические исследования по использованию моноклональных антител против IL-6 (mAbs, BE-8 или CNTO 328) у пациентов, страдающих множественной миеломой, почечно-клеточным раком и B-лимфопролиферативными расстройствами, доказали эффективность этих моноклональных антител у всех пациентов. Таким образом, полагают, что терапия подавления IL-6 может быть полезна при лечении рака на ранних стадиях (Unver and McAllister, 2018).

Анти-IL-6 моноклональные антитела используются для лечения различных иммуновоспалительных заболеваний, резистентных к обычным лекарствам. Тоцилизумаб (человеческое анти-IL-6R антитело) и силтуксимаб (ингибитор IL-6) являются одобренными моноклональными антителами, которые используются для лечения БК, РА и системных ювенильных идиопатических заболеваний (Yoshizaki, Murayama et al/, 2018). Тоцилизумаб представляет собой гуманизированное моноклональное антитело против IL-6R, одобренное FDA для лечения РА и системного ювенильного идиопатического артрита. Он также одобрен в Японии для лечения БК и в настоящее время проходит фазу 2 исследований по оценке его эффективности при рецидивирующем полихондрите. Клинические исследования моноклональных антител против IL-6, таких как сирукумаб (CNTO136), олокизумаб (CP6038), PF-423691, силтуксимаб (CNTO328), элсилимомаб (BE-8), клазакизумаб (BMS945429), сарилумаб (REGN88) и MEDI5117 находятся на разных стадиях клинических исследований с целью установления их эффективности и безопасности при различных болезненных состояниях. Многие исследования показали, что эти моноклональные антитела демонстрируют благоприятные терапевтические эффекты при IL-6-опосредованных болезненных состояниях. Некоторые из этих моноклональных антител также достигли огромного коммерческого успеха, но их основными ограничениями остаются высокая стоимость, инвазивный путь введения, высокая степень иммуногенности, а также спектр других осложнений, осложняющий их использование во многих случаях. Следовательно, существует необходимость в разработке новых ингибиторов IL-6, обладающих низкой антигенностью и удобных для пациентов. В литературе сообщается о нескольких синтетических и встречающихся в природе молекулах как об ингибиторах IL-6. Они действуют посредством вмешательства в различные пути, участвующие в выработке IL-6 и путях передачи сигнала (Kaur, Bansal et al., 2020).

Fc-слитые белки хорошо зарекомендовали себя в качестве терапевтических и профилактических средств. Полученные с помощью этой технологии белки имеют эффекторную часть, связанную с Fc-доменом, который заметно удлиняет период полувыведения белков из плазмы крови, что продлевает их терапевтическую активность, а также приводит к более медленному почечному клиренсу для молекул большего размера. Также, молекулы обладают довольно низкой иммуногенностью, так как составляющие их части представляют собой естественные белки организма человека. Вместе с тем, такие молекулы обладают значительным терапевтическим потенциалом, так как способны связывать необходимые лиганды и, таким образом, блокировать цепочки передачи сигналов. В последнее время ведется активная разработка терапевтических средств на основе Fc-слитых белков (см. например, RU2689522, 28.05.2019; WO2023063842, 20.04.2023 (RU2787060)).

Целью изобретения является разработка эффективных антагонистов IL-6 на основе технологии Fc-слитых белков.

Сущность изобретения

Задачей настоящего изобретения является расширение арсенала технических средств для лечения и предотвращении развития воспалительных и аутоиммуных заболеваний, опосредованных дисрегуляцией передачи сигнала IL-6. В частности, задача касается получения полипептидных препаратов - антагонистов патологического сигнального пути IL-6, обладающих высокой аффинностью к этому интерлейкину; также задача касается разработки нуклеотидных последовательностей, кодирующих такие полипептиды и являющихся экспрессионной основой для их получения.

Решение поставленной задачи осуществляется путем создания слитого белка IL-6R-hFc, являющегося антагонистом IL-6, в структуру которого входит IL-6R человека, представленный аминокислотами 20-361, соответствующих естественной последовательности IL-6R, несущего замену D358A, а также константная часть тяжелой цепи (Fc-фрагмент) IgG4 человека. При этом Fc-фрагмент IgG4 человека присоединен к фрагменту белка IL-6R с С-конца непосредственно или посредством линкерной последовательности. В некоторых частных вариантах осуществления изобретения линкерный пептид представляет собой дипептид RS.

В некоторых вариантах осуществления изобретения Fc-фрагмент IgG4 человека представлен аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3.

В некоторых вариантах осуществления изобретения слитый белок дополнительно включает сигнальную последовательность, локализованную на N-конце слитого белка. В частных вариантах изобретения сигнальная последовательность представлена в последовательности SEQ ID NO: 4.

В некоторых частных вариантах изобретения слитый белок имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 2.

Поставленная задача также решается путем создания изолированной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей такой слитый белок.

В некоторых частных вариантах осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты имеет последовательность SEQ ID NO: 5.

Указанная задача также решается путем создания экспрессирующего вектора, несущего нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности изолированной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей такой слитый белок, под контролем регуляторных элементов, необходимых для экспрессии данной нуклеотидной последовательности в клетке-хозяине; а также путем создания клетки-хозяина, включающей экспрессирующий вектор, описанный в настоящей заявке, обеспечивающей эффективную продукцию такого слитого белка с использованием вышеуказанной молекулы нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах воплощения изобретения в качестве таких клеток выступают клетки млекопитающих (в некоторых частных вариантах воплощения изобретения - клетки яичников китайских хомячков (CHO)).

Решение поставленной задачи может достигаться при применении вышеуказанного слитого белка для лечения широкого спектра воспалительных состояний и аутоиммунных заболеваний. Результатом изобретения является создание ингибитора IL-6, что достигается за счет использования фрагмента IL-6R(D358A) в составе слитого белка IL-6R-hFc, который является рецептором-ловушкой, направленной на связывание IL-6 и снижение патологической активации путей IL-6. Белок IL-6R(D358A)-hFc может вводиться пациенту в терапевтически эффективном количестве предпочтительно в составе фармацевтической композиции.

При осуществлении изобретения достигаются следующие технические результаты:

- создан вариант терапевтического агента на основе слитого (гибридного) белка IL-6R(D358A)-hFc, содержащего функциональную часть IL-6R, представленного фрагментом экстраклеточного домена, соответствующего положениям 20-361 последовательности SEQ ID NO: 1 с заменой D358A, слитую с константной частью (Fc-доменом) иммуноглобулина человека IgG4, и способного блокировать передачу сигнала IL-6 (провоспалительный ответ), а также разработаны нуклеотидные последовательности, кодирующие такие слитые белки и являющиеся экспрессионной основой для их получения;

- разработанный рекомбинантный полипептид имеет высокую степень безопасности терапевтического применения, основой которой являются особенности его конструкции, а именно: минимальная эффекторная функция для антителозависимой клеточной цитотоксичности (antibody-dependent cellular cytotoxicity - ADCC) и отсутствие комплемент-зависимой цитотоксичности (complement-dependent cytotoxicity - CDC), благодаря использованию константной части иммуноглобулина человека IgG4-изотипа;

- рекомбинантный полипептид также обладает потенциально улучшенными фармакокинетическими свойствами, благодаря включению в слитый белок только части экстраклеточного домена (ак 20-361 вместо ак 20-365) (а также, дополнительно, в некоторых предпочтительных вариантах изобретения, благодаря наличию фрагмента шарнирного участка PPCPSCP), что позволяет экстраклеточному домену белка IL-6R и Fc-домену, входящим в молекулу, действовать независимо друг от друга за счет обеспечения гибкости на данном участке.

Краткое описание рисунков

Фиг.1. Схема экспрессирующего вектора, содержащего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 5, кодирующую слитый белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.

Определения и термины

Следующие термины и определения применяются в данном документе, если иное не указано явно. Ссылки на методики, используемые при описании данного изобретения, относятся к хорошо известным методам, включая изменения этих методов и замену их эквивалентными методами, известными специалистам.

В документах данного изобретения термины «включает», «включающий» и т.п., а также «содержит», «содержащий» и т.п. интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего» (или «содержит, помимо всего прочего»). Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».

Термины «полипептид», «белок» и «пептид» используют в настоящем документе взаимозаменяемо, и все они означают полимер из аминокислотных остатков. Эти термины также могут использоваться в настоящем описании взаимозаменяемо при обозначении конечного продукта, получаемого в результате экспрессии в клетке-хозяине последовательности нуклеиновой кислоты.

Под «слитым белком» («гибридным белком», «рекомбинантным белком», «слитым полипептидом», «рекомбинантным полипептидом», «гибридной конструкцией») понимают конструкцию из двух или более частей полипептидной природы, ковалентно связанных между собой, образующейся в результате экспрессии рекомбинантной молекулы ДНК, в которой соединены друг с другом в одной рамке считывания кодирующие участки, соответственно, двух или нескольких разных генов или их фрагментов.

Термин «изолированный» («выделенный») имеет свое общепринятое значение, известное среднему специалисту в данной области техники, и при использовании в отношении выделенной нуклеиновой кислоты или выделенного полипептида используется без ограничения для обозначения нуклеиновой кислоты или полипептида, которые, благодаря человеку, существуют отдельно от своего нативного окружения и поэтому не являются продуктом природы. Выделенная нуклеиновая кислота или полипептид могут существовать в очищенной форме или могут существовать в ненативном окружении, в таком как, например, клетка-хозяин.

Термин «синонимичная замена» относится к нуклеотидной последовательности, имеющей последовательность нуклеотидов, которая может отличаться от референсной последовательности нуклеиновой кислоты на одну или более замен, которые не ведут к изменению аминокислотной последовательности белка, кодируемой данной молекулой нуклеиновой кислоты. В связи с тем, что генетический код является «вырожденным», то есть различные по нуклеотидной последовательности триплеты могут кодировать одну и ту же аминокислоту, синонимичные замены в нуклеотидной последовательности не приводят к изменению аминокислотной последовательности белка.

Термин «рецептор-ловушка» (от англ. Decoy ligand, также трап) относится к гибридным белкам, состоящим из внеклеточного домена молекулы (рецептора) и Fc-домена иммуноглобулина. Внеклеточный домен рецептора отвечает за связывание мишени, а Fc-домен осуществляет димеризацию гибридного белка. Последнее необходимо для увеличения эффективности связывания и обеспечения большей стабильности высокомолекулярного комплекса. В рамках настоящего изобретения «рецептор-ловушка» состоит из функционального фрагмента человеческого белка IL-6R(D358A) и константной части тяжелой цепи IgG4 человека.

Термин «лечение» означает излечение, замедление, остановку, либо реверсию прогрессирования заболевания или нарушения. В настоящем документе «лечение» также означает смягчение симптомов, ассоциированных с заболеванием или нарушением.

Термин «профилактика», «предотвращение», «превентивная терапия» охватывает устранение факторов риска, а также профилактическое лечение субклинических стадий заболевания у человека, направленное на уменьшение вероятности возникновения клинических стадий заболевания. Пациенты для профилактической терапии отбираются на основе факторов, которые, на основании известных данных, влекут увеличение риска возникновения клинических стадий заболевания по сравнению с общим населением. К профилактической терапии относится а) первичная профилактика и б) вторичная профилактика. Первичная профилактика определяется как профилактическое лечение у пациентов, клиническая стадия заболевания у которых ещё не наступила. Вторичная профилактика - это предотвращение повторного наступления того же или близкого клинического состояния заболевания.

Термин «уменьшение риска» охватывает терапию, которая снижает частоту возникновения клинической стадии заболевания. Примерами уменьшения риска заболевания является первичная и вторичная профилактика заболевания.

Под «терапевтически/профилактически эффективным количеством (терапевтической дозой)» подразумевается количество лекарственного средства, вводимого пациенту, при котором у него с наибольшей вероятностью проявится ожидаемый терапевтический (профилактический) эффект. Точное требуемое количество может меняться от субъекта к субъекту в зависимости от многочисленных факторов, таких как тяжесть заболевания, возраст, масса тела, общее состояние организма, комбинированное лечение с другими препаратами и др. Введение лекарственного средства по изобретению субъекту, нуждающемуся в лечении и/или профилактике заболевания или состояния, осуществляется в дозе, достаточной для достижения терапевтического эффекта. При проведении лечения и/или профилактики введение может осуществляться как разово, так и несколько раз в день, чаще в виде курсового введения на протяжении времени, достаточного для достижения терапевтического эффекта (от нескольких дней до недели, нескольких недель и до месяцев), при этом курсы введения лекарственного средства могут проводиться повторно. В частности, при среднетяжелых формах заболевания разовая доза, кратность и/или длительность введения лекарственного средства по изобретению могут быть увеличены. Предпочтительно слитый белок по изобретению вводят пациенту в составе фармацевтической композиции, включающей, помимо активного компонента, фармацевтически приемлемые носители и/или наполнители.

Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.

Подробное описание изобретения

В настоящем изобретении предлагаются конструкции ДНК, кодирующие слитые белки (рекомбинантные полипептиды) - антагонисты IL-6, блокирующие провоспалительный ответ, индуцируемый IL-6.

В частности, изобретение относится к нуклеотидным конструкциям, кодирующим полипептиды, содержащие IL-6R(D358A), слитые с константной частью (Fc-доменом) иммуноглобулина человека IgG4, IL-6R(D358A)-hFc.

Естественная последовательность белка IL-6R человека состоит из 468 аминокислот (ак) (SEQ ID NO: 1). В состав нативного белка входит сигнальный пептид (1-19 ак SEQ ID NO: 1), экстраклеточный домен (20-365 ак SEQ ID NO: 1), трансмембранный домен (366-386 ак SEQ ID NO: 1) и цитоплазматический домен (387-468 ак SEQ ID NO: 1).

Согласно изобретению, слитый белок - антагонист IL-6, содержит фрагмент экстраклеточного домена белка IL-6R, представленного аминокислотной последовательностью, соответствующей положениям 20-361 последовательности SEQ ID NO: 1 с заменой D358A (Asp358Ala).

Терапевтические блокаторы IL-6 (в основном представляющие собой антитела) уже известны для лечения некоторых аутоиммунных заболеваний, однако системная блокировка неизбежно нейтрализует и защитные функции этого цитокина от инфекций. Предлагаемые антагонисты IL-6, представленные слитыми белками по изобретению, учитывают особенности молекулярных сигнальных механизмов в клетках-мишенях и различия в функции IL-6 в зависимости от типов клеток, его продуцирующих. Наличие в рекомбинантным белке замены, соответствующей мутации D358A, способно обеспечить противовоспалительный ответ, потенциально опосредованный через особенности взаимодействия с gp130 или за счет буферной активности IL-6R(D358A)-hFc по отношению к связыванию IL-6.

Благодаря константной части тяжелой цепи (Fc-фрагмента) IgG4-изотипа человека, входящей в рекомбинантный белок, разработанные гибридные конструкции обладают только минимальной эффекторной функцией антитело-зависимой клеточной цитотоксичности и не обладают комплемент-зависимой цитотоксичностью, что снижает возможный риск воспалительных реакций и сенсибилизацию при использовании терапевтического агента на основе слитого (гибридного) белка IL-6R(D358A)-hFc.

Еще одном преимуществом рекомбинантного белка по изобретению является структура шарнирного участка: включение в слитый белок только части экстраклеточного домена (ак 20-361 вместо ак 20-365) позволило исключить из области, граничащей с шарнирным участком аминокислоты, которые приводят к неструктурированности и снижению растворимости молекулы белка в целом. Одновременное с этим включение в конструкцию фрагмента шарнирного участка PPCPSCP константной части тяжелой цепи IgG4 человека, представленного ак 1-7 SEQ ID NO: 3, позволяет обеспечить необходимый поворот и жесткость без излишней неструктурированности. Таким образом, благодаря особенностям конструкции, рекомбинантный полипептид по изобретению обладает потенциально улучшенными фармакокинетическими свойствами, благодаря тому что экстраклеточный домен белка IL-6R и Fc-домен, входящие в молекулу, могут действовать независимо друг от друга за счет увеличения гибкости на данном участке.

В рамках настоящего изобретения в процессе разработки новых полипептидных препаратов - ингибиторов действия IL-6 было осуществлено клонирование последовательности, соответствующей функциональной части IL-6R и ее слияние в одной рамке считывания с последовательностью, кодирующей константную часть тяжелой цепи IgG4 человека посредством линкерной последовательности. Слитый белок IL-6R(D358A)-hFc по изобретению также может необязательно содержать сигнальную последовательность, которая может включать любую последовательность, известную квалифицированному специалисту в области управления секрецией полипептида или белка из клетки, и включать природные или синтетические последовательности. Обычно сигнальная последовательность размещается на N-конце слитого белка по настоящему изобретению. В частных вариантах изобретения сигнальная последовательность представлена SEQ ID NO: 4.

Слитый белок (рекомбинантный полипептид), являющийся объектом настоящего изобретения, может быть получен следующим образом.

Растворимые рекомбинантные полипептиды-антагонисты IL-6 производят в результате экспрессии кодирующих их нуклеотидных последовательностей в эукариотических клеточных линиях, с последующей очисткой синтезированных рекомбинантных белков при помощи аффинной, ионобменной или гидрофобной хроматографии, применяемых по отдельности или в различных сочетаниях друг с другом, а также при помощи иных способов очистки белков. Соответствующие нуклеотидные последовательности получают при помощи комбинирования участков ДНК, кодирующих выбранные домены IL-6R, несущие замену D358A, с последовательностью ДНК, кодирующей Fc-фрагмент IgG4 человека. В некоторых частных вариантах изобретения молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие такие полипептиды-антагонисты IL-6, имеют нуклеотидную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 5.

Также указанная задача решается путем создания экспрессирующего вектора, содержащего данную молекулу нуклеиновой кислоты под контролем регуляторных элементов, необходимых для экспрессии данной нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине. В предпочтительных вариантах изобретения в качестве клетки-хозяина, включающей такой экспрессирующий вектор, могут выступать клетки яичников китайских хомячков CHO (например, клеточные линии CHO-К1 или CHO DG44), адаптированные для производства терапевтических белков. В настоящем изобретении экспрессирующий вектор предпочтительно подбирается для экспрессии гетерологичных последовательностей в клетках млекопитающих, но в некоторых вариантах изобретения экспрессирующий вектор может быть выбран для экспрессии в других системах, таких как, например, клетки насекомых, дрожжевые или бактериальные клетки. Соответственно, каждый экспрессирующий вектор имеет свой набор регуляторных элементов, позволяющих проводить экспрессию гетерологичной последовательности (продукта) в клетке-хозяине, таких как промоторы и/или энхансеры, последовательности Козак, polyA последовательности и другие регуляторные последовательности. А также может иметь последовательности, кодирующие лидерные (сигнальные) пептиды, обеспечивающие секрецию рекомбинантных полипептидов во внеклеточную среду. Терминация синтеза белка с заданной изолированной последовательности нуклеиновой кислоты определяется добавлением к ней с 3’-конца в одной рамке считывания одного или нескольких стоп-кодонов.

После трансфекции вектора в клетки эукариотической клеточной линии происходит синтез рекомбинантного полипептида и его секреция в культуральную бессывороточную среду. Полученный рекомбинантный полипептид очищают из среды при помощи, как правило, аффинной хроматографии на белок протеин-A или белок протеин-G, однако могут использоваться и другие методы очистки белков.

Нижеследующие примеры приведены в целях раскрытия характеристик настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.

Пример 1. Конструирование плазмид

Для конструирования плазмид с заявляемыми нуклеотидными последовательностями была использована последовательность, кодирующая белок человека IL-1RA, полученная из плазмиды RG221874 (OriGene, IL-6R, Human Tagged ORF clone). Последовательность, кодирующая IL-6R, была использована для клонирования. Для клонирования участка, соответствующему аминокислотам 20-361 для SEQ ID NO: 2 были подобраны следующие праймеры:

IL-6R_F: TTAGAATTCGCTGGCCCCAAGGCGCTGC (SEQ ID NO:6)

IL-6R_R: TATAGATCTTGAAGAAGAAGCTTGCACTGGGAGG (SEQ ID NO:7)

Проведена ПЦР со следующими условиями: 98°С 1 мин, 30 циклов (98°С 10 сек, 65°С 10 сек, 72°С 2 мин), 72°С 5 мин. Компоненты реакции: полимераза - Phusion (Thermo), буфер, содержащий Mg2+ для Phusion-полимеразы (Thermo), по 10 пкмоль каждого из праймеров и 0,25 мM смеси трифосфатов нуклеотидов (Thermo). Амплификацию осуществляли с последовательности RG221874 (Origene). После ПЦР: ПЦР продукт очищали набором для очистки ПЦР продуктов GeneJet PCR purification kit (Fermentas). Концентрация и соответствие предсказанному молекулярному весу проверяли при помощи гель-электрофореза в 1% агарозе (ТАЕ буфер). Полученные ПЦР продукты были использованы для дальнейшего конструирования.

Для клонирования целевых последовательностей использовался вектор pFUSE-hIgG4e-Fc2 (InvivoGen), который позволяет получить слитые с Fc-доменом IgG4 последовательности и проводить исследование их свойств. В один из праймеров был включен сайт рестрикции EcoRI (IL-6R_F), а в другой сайт рестрикции BglII (IL-6R_R), что после амплификации и рестрикции позволило получить фрагмент ДНК липкими EcoRI, BglII концами. Вектор и ПЦР-продукт обрабатывали рестриктазами EcoRI (Thermo) и BglII (Thermo) в течение 1 часа при 37°С, затем очищали с помощью GeneJet PCR purification kit (Fermentas) и лигировали, используя 1 Ед (ME) лигазы (Thermo) по протоколу производителя. Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E. coli XL1-Blue и высевали на среду LB, содержащую зеоцин.

Чашки инкубировали в термостате в течение ночи при 37°C. На следующий день проверяли по 20 колоний из каждой лигазной смеси на присутствие нужной вставки, для этого часть колонии разводили в 20 мкл воды и кипятили в течение 5 минут. После охлаждения смесь откручивали и использовали 1 мкл в качестве матрицы в реакции ПЦР. ПЦР осуществляли при помощи Taq ДНК-полимеразы (Fermentas) и праймеров PROMF2 и FC. Присутствие вставки проверяли после электрофореза ПЦР продуктов. Из двух колоний, содержащих вставку, выделяли плазмидную ДНК, верифицировали длины рестрикционных фрагментов при помощи рестрикции с эндонуклеазами EcoRI и HindIII и секвенировали c использованием праймеров PROMF2 и FC на секвенаторе Applied Biosystems 3500 по инструкции производителя, используя праймеры PROMF2 (прямой) и FC (обратный).

PROMF2: GCCTGACCCTGCTTGCTCAACT (SEQ ID NO: 8)

FC: CTCACGTCCACCACCACGCA (SEQ ID NO: 9)

Сконструированная в результате плазмида, содержащая целевые нуклеотидные последовательности, показана на Фиг. 1.

Пример 2. Продукция гибридного белка

Для продукции гибридного белка проводилась временная трансфекция клеток CHO сконструированной плазмидой, кодирующей гибридный белок.

Линию клеток СНО культивировали на среде Dynamis, с добавлением Glutamax (6 мМ), Anticlumping reagent B (0,5%) и зеоцина (500 мкг/мл). Культивирование осуществляли в шейкере-СО₂-инкубаторе Multitron Cell (Infors, Швейцария) в атмосфере 5%-ного СО₂ при температуре 37 °С и относительной влажности 95% в колбах Эрнленмейера (Сorning, США) объемом 125 мл (перемешивание 120 об/мин).

Для трансфекции клеток CHO выделяли особо чистую («transfection grade») плазмидную ДНК с помощью набора EndoFree Plasmid MaxiKit (Qiagen) по протоколу фирмы-производителя. Линеаризацию сконструированной плазмиды осуществляли по сайту NotI (Thermo). Для трансфекции добавляли 20 мкг линеаризованной плазмиды на 100 мкл клеточной суспензии с концентрацией 5х107 клеток/мл. Электропорация проводилась по протоколу: 3 импульса по 1130 В продолжительностью 20 мс.

Селекцию трансфицированных клеток начинали через 48 часов после трансфекции путем добавления антибиотика зеоцина в концентрации 500 мкг/мл и продолжали ее при дальнейших пересевах.

Продукцию белка анализировали при помощи стандартного гель-электрофореза в полиакриамидном геле (SDS-PAGE). Секретируемый гибридный белок визуализировали с использованием кроличьих антител против человечьего Fc-домена (Jackson Immunoresearch, США). Также целевой белок IL-6R(D358A)-hFc из культуральной жидкости очищали путем FPLC хроматографии на колонке HiTrap ProteinA HP (Cytiva) и оценивали методом гель-электрофореза. При культивировании данных пулов была подтверждена продукция слитых полипептидов IL-6R(D358A)-hFc и их секреция в культуральной жидкости.

Таким образом, в результате проведенных исследований разработана нуклеотидная последовательность, кодирующая слитый белок IL-6R(D358A)-hFc и являющаяся экспрессионной основой для его получения, а также получен слитый белок IL-6R(D358A)-hFc, содержащий фрагмент экстраклеточного домена IL-6R(D358A), слитый с константной частью (Fc-доменом) иммуноглобулина человека IgG4, способный эффективно блокировать IL-6, который может быть использован в терапии и предотвращении развития воспалительных и аутоиммунных заболеваний. Данное изобретение обладает рядом улучшенных свойств по сравнению с аналогами и поэтому расширяет круг имеющихся кандидатов для лечения и предотвращения развития (снижения риска развития) воспалительных и аутоиммунных заболеваний, особенно ишемической болезни сердца, ревматоидного артрита, диабета второго типа, в патогенезе которых участвует IL-6.

Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3"

fileName="IL-6R(D358A)-hFc.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.3.0" productionDate="2023-11-27">

<ApplicantFileReference>4103252</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">Общество с ограниченной

ответственностью &quot;Пальмира Биофарма&quot; </ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>&quot;PALMIRA BIOPHARMA&quot; Limited Liability

Company</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">НУКЛЕОТИДНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ,

КОДИРУЮЩАЯ СЛИТЫЙ БЕЛОК, СОСТОЯЩИЙ ИЗ РАСТВОРИМОГО ЭКСТРАКЛЕТОЧНОГО

ФРАГМЕНТА ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО IL-6R И КОНСТАНТНОЙ ЧАСТИ ТЯЖЕЛОЙ ЦЕПИ

ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО IgG4</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>9</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>468</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..468</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>MLAVGCALLAALLAAPGAALAPRRCPAQEVARGVLTSLPGDSVTLTCPG

VEPEDNATVHWVLRKPAAGSHPSRWAGMGRRLLLRSVQLHDSGNYSCYRAGRPAGTVHLLVDVPPEEPQL

SCFRKSPLSNVVCEWGPRSTPSLTTKAVLLVRKFQNSPAEDFQEPCQYSQESQKFSCQLAVPEGDSSFYI

VSMCVASSVGSKFSKTQTFQGCGILQPDPPANITVTAVARNPRWLSVTWQDPHSWNSSFYRLRFELRYRA

ERSKTFTTWMVKDLQHHCVIHDAWSGLRHVVQLRAQEEFGQGEWSEWSPEAMGTPWTESRSPPAENEVST

PMQALTTNKDDDNILFRDSANATSLPVQDSSSVPLPTFLVAGGSLAFGTLLCIAIVLRFKKTWKLRALKE

GKTSMHPPYSLGQLVPERPRPTPVLVPLISPPVSPSSLGSDNTSSHNRPDARDPRSPYDISNTDYFFPR<

/INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>588</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..588</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>MYRMQLLSCIALSLALVTNSLAPRRCPAQEVARGVLTSLPGDSVTLTCP

GVEPEDNATVHWVLRKPAAGSHPSRWAGMGRRLLLRSVQLHDSGNYSCYRAGRPAGTVHLLVDVPPEEPQ

LSCFRKSPLSNVVCEWGPRSTPSLTTKAVLLVRKFQNSPAEDFQEPCQYSQESQKFSCQLAVPEGDSSFY

IVSMCVASSVGSKFSKTQTFQGCGILQPDPPANITVTAVARNPRWLSVTWQDPHSWNSSFYRLRFELRYR

AERSKTFTTWMVKDLQHHCVIHDAWSGLRHVVQLRAQEEFGQGEWSEWSPEAMGTPWTESRSPPAENEVS

TPMQALTTNKDDDNILFRDSANATSLPVQASSSRSPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE

VTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGL

PSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL

DSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>224</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..224</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>PPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPE

VQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQ

PREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTV

DKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>MYRMQLLSCIALSLALVTNS</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>1764</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..1764</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q10">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atgtacaggatgcaactcctgtcttgcattgcactaagtcttgcacttg

tcacgaattcgctggccccaaggcgctgccctgcgcaggaggtggcgagaggcgtgctgaccagtctgcc

aggagacagcgtgactctgacctgcccgggggtagagccggaagacaatgccactgttcactgggtgctc

aggaagccggctgcaggctcccaccccagcagatgggctggcatgggaaggaggctgctgctgaggtcgg

tgcagctccacgactctggaaactattcatgctaccgggccggccgcccagctgggactgtgcacttgct

ggtggatgttccccccgaggagccccagctctcctgcttccggaagagccccctcagcaatgttgtttgt

gagtggggtcctcggagcaccccatccctgacgacaaaggctgtgctcttggtgaggaagtttcagaaca

gtccggccgaagacttccaggagccgtgccagtattcccaggagtcccagaagttctcctgccagttagc

agtcccggagggagacagctctttctacatagtgtccatgtgcgtcgccagtagtgtcgggagcaagttc

agcaaaactcaaacctttcagggttgtggaatcttgcagcctgatccgcctgccaacatcacagtcactg

ccgtggccagaaacccccgctggctcagtgtcacctggcaagacccccactcctggaactcatctttcta

cagactacggtttgagctcagatatcgggctgaacggtcaaagacattcacaacatggatggtcaaggac

ctccagcatcactgtgtcatccacgacgcctggagcggcctgaggcacgtggtgcagcttcgtgcccagg

aggagttcgggcaaggcgagtggagcgagtggagcccggaggccatgggcacgccttggacagaatccag

gagtcctccagctgagaacgaggtgtccacccccatgcaggcacttactactaataaagacgatgataat

attctcttcagagattctgcaaatgcgacaagcctcccagtgcaagcttcttcttcaagatctcccccat

gcccatcatgcccagcacctgagttcctggggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaagga

cactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgag

gtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagt

tcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagta

caagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcag

ccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctga

cctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaa

caactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtg

gacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccact

acacacagaagagcctctccctgtctccgggtaaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="6">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>28</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..28</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q12">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ttagaattcgctggccccaaggcgctgc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="7">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>34</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..34</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q14">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tatagatcttgaagaagaagcttgcactgggagg</INSDSeq_seque

nce>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="8">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q16">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gcctgaccctgcttgctcaact</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="9">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q18">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ctcacgtccaccaccacgca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к слитому белку - антагонисту IL-6. Указанный слитый белок содержит фрагмент экстраклеточного домена белка IL-6R, представленного аминокислотной последовательностью, соответствующей положениям 20-361 последовательности SEQ ID NO: 1 с заменой D358A, и Fc-фрагмент IgG4 человека, присоединенный к фрагменту белка IL-6R с С-конца безлинкерно или посредством линкерной последовательности. Настоящее изобретение также относится к изолированной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный слитый белок, экспрессирующему вектору и клетке. Настоящее изобретение обеспечивает высокую степень безопасности терапевтического применения указанного белка и его потенциально улучшенные фармакокинетические свойства. 4 н. и 7 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 пр.

1. Слитый белок - антагонист IL-6, содержащий

фрагмент экстраклеточного домена белка IL-6R, представленного аминокислотной последовательностью, соответствующей положениям 20-361 последовательности SEQ ID NO: 1 с заменой D358A,

и Fc-фрагмент IgG4 человека, присоединенный к фрагменту белка IL-6R с С-конца безлинкерно или посредством линкерной последовательности.

2. Слитый белок по п.1, в котором Fc-фрагмент IgG4 человека представлен аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3.

3. Слитый белок по любому из пп.1, 2, в котором Fc-фрагмент IgG4 человека соединен с фрагментом белка IL-6R через линкерный пептид RS.

4. Слитый белок по любому из пп.1-3, дополнительно включающий сигнальную последовательность, локализованную на N-конце слитого белка.

5. Слитый белок по п.4, в котором сигнальная последовательность представлена SEQ ID NO: 4.

6. Слитый белок по п.1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.

7. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок по любому из пп.1-6.

8. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты по п.7, имеющая последовательность SEQ ID NO: 5.

9. Экспрессирующий вектор, имеющий в своем составе последовательность нуклеиновой кислоты по любому из пп.7, 8 под контролем регуляторных элементов, необходимых для ее экспрессии в клетке-хозяине.

10. Клетка, способная экспрессировать слитый белок по любому из пп.1-6, не являющаяся эмбриональной клеткой человека и трансфицированная экспрессирующим вектором по п.9.

11. Клетка по п.10, представляющая собой клетку яичников китайского хомячка (СНО).