Способ моделирования умеренной формы гипергомоцистеинемии у крыс Российский патент 2024 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной патобиохимии, и может использоваться для моделирования умеренной формы гипергомоцистеинемии у самцов крыс.

Принято разделять формы гипергомоцистеинемии по тяжести в зависимости от концентрации гомоцистеина сыворотки крови: легкая форма при уровне 15–30 мкмоль/л, умеренная форма при 31–100 мкмоль/л, тяжелая форма при содержании >100 мкмоль/л [1].

Для исследования роли повышенного уровня гомоцистеина в крови в развитии заболеваний и патологических состояний к настоящему времени разработано несколько подходов к моделированию экспериментальной гипергомоцистеинемии[2].

Известны подходы связанные с использованием нагрузки L-метионином, L-гомоцистеином, D,L-гомоцистеином тиолактоном в виде добавления в пищу или в виде добавления веществ в поилку [2]. Недостатком моделей является сложность дозирования вещества, что значимо при использовании L-гомоцистеина и D,L-гомоцистеина, которые отличаются большей стоимостью по сравнению с L-метионином. Это ограничивает использование моделей на неполовозрелых животных с низкой массой тела, адаптивные возможности которых отличны от половозрелых особей.

Модели связанные с метиониновой нагрузкой патобиохимически будут отличаться от моделей с использованием L-гомоцистеина и D,L-гомоцистеина из-за обязательного предварительного метаболизма L-метионина[RU 2 414 755 C1 от 19.10.2009].

Другими направлениями являются диеты с дефицитом холина, фолатов, витамина В₁₂ и/или витамина B6 [3]. Недостатком данных моделей являются множественные нарушения биохимических процессов, так как холин и витамины группы В (B₆,B₉,B₁₂) принимают участие не только в превращениях цикла обмена метионина.

Также имеется сведения об использовании мышей специальных линий - например, BALB/c, Apoe−/−, C57BL/6 [4]. Недостаток моделей c использованием специальных линий животных – необходимость использования специальных линий мышей, что является сравнительно дорогостоящим подходом, не подходящим для исследования только лишь повышенного уровня гомоцистеина, так как генетические дефекты приводят к косвенном множественным изменениям в модельном организме.

Среди моделей с нагрузкой L-гомоцистеином и D,L-гомоцистеином выделяют модели связанные с введением веществ в пищу, растворением их в питьевой воде, парентеральное введение.

Каждый из этих подходов имеет значимое ограничение. Так введение веществ в пищу является крайне дорогостоящим и трудно отслеживаемым. Недостатком моделей с введением L-гомоцистеина и D,L-гомоцистеина тиолактона через питьевую воду (через поилку) является необходимость использования клеток с одним животным для точного определения потребленной жидкости, что способно вызывать стресс у животных, при этом отсутствует возможность обеспечить фиксирование регулярного потребления одного и того же объема жидкости, что снижает воспроизводимость модели[5].

К недостаткам моделей с использованием растворов L-гомоцистеина или D,L-гомоцистеина для парентерального введения являются риски стресса для животного и риски воспалительных и инфекционных осложнений [6].

Использование внутрижелудочного введения позволяет точно дозировать объем вводимого вещества. D,L-гомоцистеина тиолактон значительно менее дорогой в использовании реагент по сравнению с применением водного раствора L-гомоцистеина, при этом растворение D,L-гомоцистеина тиолактон в водном растворе сопровождается гидролизом лактона с высвобождением гомоцистеина, что позволяет оценивать непосредственно токсические эффекты гомоцистеина [7,8,9].

При этом среди известных моделей с использованием D,L-гомоцистеина требуется длительный срок введения – около месяца, что значительно увеличивает стоимость модели по сравнению с использованием L-метионина [7-9].

Задачей изобретения является разработка легко воспроизводимой и непродолжительной модели умеренной формы гипергомоцистеинемии у крыс, основанной на внутрижелудочном введении водного раствора D,L-гомоцистеина тиолактона рассчитанного на массу животного.

Техническим результатом настоящего изобретения является разработка способа моделирования умеренной формы гипергомоцистеинемии в эксперименте у крыс. К преимуществам предлагаемого способа относится воспроизведение умеренной формы гипергомоцистеинемии у крыс стока Wistar за 14 суток, что позволяет сократить период содержания животных; точное дозирование D,L-гомоцистеина тиолактона на кг массы тела животного, что позволяет снизить расход используемых реактивов по сравнению с моделями, использующими добавление веществ в поилку; применение D,L-гомоцистеина тиолактона, не требующего предварительного метаболизма вещества в печени; простота реализации путем введения раствора вещества через зонд внутрижелудочно; минимизация рисков связанных с инфицированием и воспалением тканей в местах введения по сравнению с моделями с парентеральным введением растворов D,L-гомоцистеина тиолактона.

Внутрижелудочное введение через зонд водного раствора D,L-гомоцистеина тиолактона в суточной дозе 1 г/кг массы тела животного в 2 введения с интервалом в 7 часов в течение 14 суток на 15-й день модели сопровождается развитием увеличением концентрации гомоцистеина в сыворотке крови у крыс соответствующего умеренной форме гипергомоцистеинемии.

Способ осуществляется следующим образом.

Эксперименты выполнены на половозрелых самцах крыс линии Wistar массой 320-390 г. Были исследованы две группы животных: группа 1 - контрольные животные (n=8) экспериментальные группа 2 (n=8), получавшая раствор D,L-гомоцистеина тиолактона в дозе 1 г/кг массы тела в течение 7 дней, и группа 3 (n=8), получавшая раствор D,L-гомоцистеина тиолактона в дозе 1 г/кг массы тела в течение 14 дней. Раствор для внутрижелудочного введения D,L-гомоцистеина тиолактона готовили ex tempore в воде, используемой для поилок животных. Водный раствор D,L-гомоцистеина вводили 2 раза в день (в 9.00 и 16.00) в суточной дозе 1 г/кг массы тела животного на протяжении 7 дней для группы 2 и в суточной дозе 1 г/кг массы тела животного на протяжении 14 дней для группы 3.

По окончании введения метионина, на 8-е сутки для группы 2 и 15-е сутки для группы 3 от начала эксперимента животных наркотизировали, вскрывали брюшную полость, пересекали брюшную аорту и собирали кровь в пробирку с активатором свертывания. После центрифугирования содержание гомоцистеина в сыворотке крови экспериментальных животных оценивалось с помощью набора ELISA Kit for Homocysteine (Cloud-CloneCorp., Китай).

При статистической обработке данных рассчитывается медиана и квартили (25й, 75й). Различия считаются достоверными при р<0,05.

Пример конкретного выполнения.

Результаты проведенных экспериментов позволили установить, что ежедневное, в течение 7 и 14 суток, внутрижелудочное введение D,L-гомоцистеина тиолактона дважды в день в суточной дозе 1 г/кг массы тела животных не вызывает гибель экспериментальных животных.

Результаты определения концентрации гомоцистеина в сыворотке крови позволили установить достоверное повышение уровня гомоцистеина в группах экспериментальных животных. Значения концентрации гомоцистеина статистически значимо отличались от таковых в контрольной группе животных (таблица 1). Степень тяжести гомоцистеинемии устанавливали на основании широко используемой классификации, где легкой форме соответствует уровень 16-30 мкмоль/л, умеренной форме – 31-100 мкмоль/л, тяжелой форме – более 100 мкмоль/л [1]. Только в группе животных получавших D,L-гомоцистеина тиолактон в суточной дозе 1 кг/мг массы тела животного в течение 14 суток удалось зафиксировать уровень гомоцистеина сыворотки крови соответствующий умеренной форме.

Таблица 1. Уровень гомоцистеина в исследуемых группах.

Группа Уровень гомоцистеина Контрольные животные (группа 1) 5,4 [5,2;6,3] Экспериментальная гипергомоцистеинемия 1 г/кг массы тела животного 7 суток (группа 2) 26,5 [18,7;27,9]* Экспериментальная гипергомоцистеинемия 1 г/кг массы тела животного 14 суток (группа 3) 42,4 [36,9;47,5]*

Примечание: знаком * обозначены статистические отличия показателей экспериментальных группа относительно показателей контрольных животных при p<0,05.

Таким образом, моделирование гипергомоцистеинемии с помощью внутрижелудочного введения D,L-гомоцистеина тиолактона в дозе 1 г/кг 2 раз в сутки в течение 14 дней следует признать экспериментальной моделью умеренной формы гипергомоцистеинемии, которая может быть использована для изучения эффектов различных групп фармакологических препаратов и биологически активных веществ при данной модели патологии.

Источники информации

1. Refsum H, Smith AD, Ueland PM, Nexo E, Clarke R, McPartlin J, Johnston C, Engbaek F, Schneede J, McPartlin C, Scott JM. Facts and recommendations about total homocysteine determinations: an expert opinion. Clin Chem. 2004 Jan;50(1):3-32. doi: 10.1373/clinchem.2003.021634.

2. Dayal S, Lentz SR. Murine models of hyperhomocysteinemia and their vascular phenotypes. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2008 Sep;28(9):1596-605. doi: 10.1161/ATVBAHA.108.166421.

3. Dayal S, Devlin AM, McCaw RB, Liu ML, Arning E, Bottiglieri T, Shane B, Faraci FM, Lentz SR. Cerebral vascular dysfunction in methionine synthase-deficient mice. Circulation. 2005 Aug 2;112(5):737-44. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.104.529248.

4. Zhou J, Møller J, Ritskes-Hoitinga M, Larsen ML, Austin RC, Falk E. Effects of vitamin supplementation and hyperhomocysteinemia on atherosclerosis in apoE-deficient mice. Atherosclerosis. 2003 Jun;168(2):255-62. doi: 10.1016/s0021-9150(03)00138-2.

5. Yin YL, Chen Y, Ren F, Wang L, Zhu ML, Lu JX, Wang QQ, Lu CB, Liu C, Bai YP, Wang SX, Wang JZ, Li P. Nitrosative stress induced by homocysteine thiolactone drives vascular cognitive impairments via GTP cyclohydrolase 1 S-nitrosylation in vivo. Redox Biol. 2022; 58:102540. doi: 10.1016/j.redox.2022.102540.

6. Matté C, Monteiro SC, Calcagnotto T, Bavaresco CS, Netto CA, Wyse AT. In vivo and in vitro effects of homocysteine on Na+, K+-ATPase activity in parietal, prefrontal and cingulate cortex of young rats. Int J Dev Neurosci. 2004 Jun;22(4):185-90. doi: 10.1016/j.ijdevneu.2004.05.007.

7. Медведев, Д. В. Способ моделирования тяжелой формы гипергомоцистеинемии у крыс / Д. В. Медведев, В. И. Звягина, М. А. Фомина // Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова. 2014; 22(4): 42-46. EDN TILOMP

8. Raksha N, Maievskyi O, Dzevulska I, Kaminsky R, Samborska I, Savchuk O, Kovalchuk О. PROTEOLYTIC ACTIVITY IN THE HEART OF RATS WITH HYPERHOMOCYSTEINEMIA. Wiad Lek. 2022;75(4 pt 1):831-835. doi: 10.36740/WLek202204115.

9. Nechiporuk V, Nebesna Z, Didyk N, Mazur O, Korda M. MICROSCOPIC CHANGES OF THE KIDNEY IN EXPERIMENTAL HYPERHOMOCYSTEINEMIA ON THE BACKGROUND OF HYPER- AND HYPOTHYROIDISM. Georgian Med News. 2022 Feb;(323):116-122.

Изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной патобиохимии, и может использоваться для моделирования умеренной формы гипергомоцистеинемии у крыс. Для этого внутрижелудочно вводят через зонд половозрелым самцам крыс стока Wistar водный раствор D,L-гомоцистеина тиолактона 2 раза в сутки, в 9.00 и в 16.00, на протяжении 14 дней в суточной дозе 1 г/кг массы тела животного. Изобретение обеспечивает создание легковоспроизводимой модели экспериментальной умеренной формы гипергомоцистеинемии у крыс. 1 табл., 1 пр.

Способ моделирования умеренной формы гипергомоцистеинемии у самцов крыс, включающий внутрижелудочное введение через зонд половозрелым крысам стока Wistar водного раствора D,L-гомоцистеина тиолактона 2 раза в сутки, в 9.00 и в 16.00, на протяжении 14 дней в суточной дозе 1 г/кг массы тела животного.