Способ моделирования легкой формы гипергомоцистеинемии у крыс Российский патент 2024 года по МПК A61M25/01 A61K31/365 A61K31/195 A61P43/00 G09B23/28 

Изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной патобиохимии, и может использоваться для моделирования легкой формы гипергомоцистеинемии у самцов крыс.

Легкая форма гипергомоцистеинемии (концентрация гомоцистеина в сыворотке крови 15-30 мкмоль/л) является значимым фактором прогрессирования атеросклероза, ассоциирована с повышенным риском сердечно-сосудистых заболеваний, нарушением фертильности, снижением функции почек, остеопорозом и эндокринной патологии [1]. Поэтому в настоящее время имеется практическая потребность в поиске воспроизводимых экспериментальных моделей для изучения факторов, способных воздействовать на уровень гомоцистеина [1].

Известная модель гипергомоцистеинемии связанная с метониновой нагрузкой в течение 21 дня [2], но её ограничением является формируемая тяжелая форма экспериментальной гипергомоцистеинемии, а также значимая длительность.

Известен способ моделирования экспериментальной гипергомоцистеинемии связанный с метиониновой нагрузкой в течение 7 дней (RU 2 414 755 C1; RU 2 425 672 C1). Его ключевым ограничением является использование метионина, который должен метаболизироваться в печени с образованием гомоцистеина. При этом эффективность модели будет зависеть от функционального состояния печени.

Среди известных моделей с использованием D,L-гомоцистеина в виде добавления в питьевую воду или в виде парентерального введения требуется длительный срок введения - около месяца, что значительно увеличивает стоимость модели по сравнению с использованием L-метионина [3-5].

Задачей изобретения является разработка воспроизводимой модели легкой формы гипергомоцистеинемии у крыс не требующей длительного содержания животных, основанной на внутрижелудочном введении водного раствора D,L-гомоцистеина тиолактона.

Техническим результатом настоящего изобретения является разработка способа моделирования легкой формы гипергомоцистеинемии в эксперименте у крыс. К преимуществам предлагаемого способа относится воспроизведение легкой формы гипергомоцистеинемии у крыс стока Wistar за 7 суток, что позволяет сократить период содержания животных; точное дозирование D,L-гомоцистеина тиолактона на кг массы тела животного, что позволяет снизить расход используемых реактивов по сравнению с моделями, использующими добавление веществ в поилку; применение D,L-гомоцистеина тиолактона, не требующего предварительного метаболизма вещества в печени; простота реализации путем введения раствора вещества через зонд внутрижелудочно; минимизация рисков связанных с инфицированием и воспалением тканей в местах введения по сравнению с моделями с парентеральным введением растворов D,L-гомоцистеина тиолактона.

Внутрижелудочное введение через зонд водного раствора D,L-гомоцистеина тиолактона в суточной дозе 1 г/кг массы тела животного в 2 введения с интервалом в 7 часов в течение 7 суток на 8-й день модели сопровождается развитием увеличением концентрации гомоцистеина в сыворотке крови у крыс соответствующей легкой форме гипергомоцистеинемии.

Способ осуществляется следующим образом.

Эксперименты выполнены на половозрелых самцах крыс линии Wistar массой 410-430 г. Были исследованы три группы животных: контрольные животные - группа 1 (n=8), экспериментальные группа 2 (n=8), получавшая раствор D,L-гомоцистеина тиолактона в дозе 1 г/кг массы тела, и группа 3 (n=8), получавшая раствор D,L-гомоцистеина тиолактона в дозе 3 г/кг массы тела. Раствор для внутрижелудочного введения D,L-гомоцистеина тиолактона готовили ex tempore в воде, используемой для поилок животных. Водный раствор D,L-гомоцистеина тиолактона вводили 2 раза в день в суточной дозе 1 г/кг массы тела животного в 9.00 и в 16.00 на протяжении 7 дней.

По окончании введения D,L-гомоцистеина тиолактона, на 8 сутки от начала эксперимента животных наркотизировали, вскрывали брюшную полость, пересекали брюшную аорту и собирали кровь в пробирку с активатором свертывания. После центрифугирования содержание гомоцистеина в сыворотке крови экспериментальных животных оценивалось с помощью набора ELISA Kit for Homocysteine (Cloud-Clone Corp., Китай).

При статистической обработке данных рассчитывается медиана и квартили (25й, 75й). Различия считаются достоверными при р<0,05.

Пример конкретного выполнения.

Результаты проведенных экспериментов позволили установить, что ежедневное, в течение 7 суток, внутрижелудочное введение D,L-гомоцистеина тиолактона дважды в день в суточной дозе 1 г/кг массы тела не вызывает гибель экспериментальных животных.

Результаты определения концентрации гомоцистеина в сыворотке крови позволили установить достоверное повышение уровня гомоцистеина в группе экспериментальных животных. Значения концентрации гомоцистеина статистически значимо отличались от таковых в контрольной группе животных (таблица 1). Степень тяжести гомоцистеинемии устанавливали на основании широко используемой классификации, где легкой форме соответствует уровень 16-30 мкмоль/л, умеренной форме - 31-100 мкмоль/л, тяжелой форме - более 100 мкмоль/л [1,6]. Введение D,L-гомоцистеина тиолактона в дозе 1 г/кг массы тела животного в сутки переносилось хорошо, все животные группы 2 были живы на 8й день. Введение D,L-гомоцистеина тиолактона в дозе 3 г/кг массы тела животного в сутки сопровождалось токсическими проявлениями: начиная с 3-го дня введения животные становились вялыми, малоподвижными, отказывались от пищи, с 4-го дня отмечалось нарушение стула по типу диареи, с 6-го дня отмечалось падение животных, до выведения из эксперимента выжило лишь 37,5% животных. При вскрытии животных группы 3 отмечалось значительное увеличение желудка в размере, отечность и гиперемия слизистой желудка и кишечника, что, очевидно, отражало прямое токсическое действие на слизистую желудочно-кишечного тракта D,L-гомоцистеина тиолактона в дозе 3 г/кг массы тела животного.

Таблица 1. Уровень гомоцистеина в исследуемых группах.

Группа Уровень гомоцистеина, мкмоль/л Контрольные животные (группа 1) 5,4 [5,2;6,3] Экспериментальная гипергомоцистеинемия 1 г/кг массы тела животного (группа 2) 26,5 [18,7;27,9]* Экспериментальная гипергомоцистеинемия 3 г/кг массы тела животного (группа 3) 30,45[28,96;32,15]*

Примечание: знаком * обозначены статистические отличия показателей экспериментальных группа относительно показателей контрольных животных при p<0,05.

Таким образом, экспериментальную модель гипергомоцистеинемии с помощью внутрижелудочного введения D,L-гомоцистеина тиолактона в дозе 1 г/кг 2 раз в сутки в течение 7 дней следует признать экспериментальной моделью легкой формы гипергомоцистеинемии, которая может быть использована для изучения эффектов различных групп фармакологических препаратов и биологически активных веществ при данной модели патологии.

1. Tinelli C, Di Pino A, Ficulle E, Marcelli S, Feligioni M. Hyperhomocysteinemia as a Risk Factor and Potential Nutraceutical Target for Certain Pathologies. Front Nutr. 2019 Apr 24;6:49. doi: 10.3389/fnut.2019.00049.

2. Медведев, Д. В. Способ моделирования тяжелой формы гипергомоцистеинемии у крыс / Д. В. Медведев, В. И. Звягина, М. А. Фомина // Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова. 2014; 22(4): 42-46. - EDN TILOMP

3. Raksha N, Maievskyi O, Dzevulska I, Kaminsky R, Samborska I, Savchuk O, Kovalchuk О. PROTEOLYTIC ACTIVITY IN THE HEART OF RATS WITH HYPERHOMOCYSTEINEMIA. Wiad Lek. 2022;75(4 pt 1):831-835. doi: 10.36740/WLek202204115.

4. Nechiporuk V, Nebesna Z, Didyk N, Mazur O, Korda M. MICROSCOPIC CHANGES OF THE KIDNEY IN EXPERIMENTAL HYPERHOMOCYSTEINEMIA ON THE BACKGROUND OF HYPER- AND HYPOTHYROIDISM. Georgian Med News. 2022;(323):116-122.

5. Yin YL, Chen Y, Ren F, Wang L, Zhu ML, Lu JX, Wang QQ, Lu CB, Liu C, Bai YP, Wang SX, Wang JZ, Li P. Nitrosative stress induced by homocysteine thiolactone drives vascular cognitive impairments via GTP cyclohydrolase 1 S-nitrosylation in vivo. Redox Biol. 2022;58:102540. doi: 10.1016/j.redox.2022.102540.

6. Al Mutairi F. Hyperhomocysteinemia: Clinical Insights. J Cent Nerv Syst Dis. 2020;12:1179573520962230. doi: 10.1177/1179573520962230.

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной кардиофармакологии. Крысам внутрижелудочно через зонд вводят водный раствор D,L-гомоцистеина тиолактона в суточной дозе 1 г/кг массы тела животного. Препарат вводят 2 раза в сутки в 9.00 и 16.00 на протяжении 7 дней. Способ позволяет создать легко воспроизводимую модель легкой формы гипергомоцистеинемии с сокращенным сроком воспроизведения и количеством реактивов, минимизирует риски, связанные с инфицированием и воспалением тканей в местах введения препарата, не вызывает гибель экспериментальных животных, что дает возможность использовать модель для изучения эффектов различных групп фармакологических препаратов и биологически активных веществ. 1 табл., 1 пр.

Способ моделирования легкой формы гипергомоцистеинемии у крыс, включающий внутрижелудочное введение через зонд водного раствора D,L-гомоцистеина тиолактона, отличающийся тем, что данное вещество вводят 2 раза в сутки в 9.00 и 16.00 на протяжении 7 дней в суточной дозе 1 г/кг массы тела животного.