СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ИЛИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ КОГНИТИВНОГО НАРУШЕНИЯ Российский патент 2024 года по МПК G01N33/68 C12Q1/68 C07K14/47 A61P25/28 

Область техники

Настоящее изобретение относится к способу диагностирования или определения риска развития когнитивного нарушения, независимо от его генеза, в том числе деменции. В соответствии с предложенным способом определяют уровни экспрессии специфичных биомаркеров в лимфоцитах крови и в буккальном эпителии. В одном из вариантов осуществления используют набор антител, специфично связывающих биомаркеры.

Уровень техники

Деменция (слабоумие) является распространенным признаком риска развития серьезных когнитивных нарушений различной этиологии (происхождения). Существующие способы клинической диагностики деменции часто носят умозрительный характер и не подкрепляются объективными биохимическими критериями развития этой патологии. Все более возрастающая распространенность деменции при различных нарушениях (нейродегенеративные расстройства, сосудистая патология головного мозга, наследственные аномалии, опухоли центральной нервной системы и т.п.) диктуют крайнюю необходимость разработки надежных маркеров для выявления деменции как патологического процесса, так и для скрининга групп риска с целью профилактики развития когнитивных нарушений [Bonomi C.G. et al., 2023; Deardorff W.J. et al., 2019; Pillai J.A., et al., 2013]. Разработка надежных объективных методов лабораторного определения биомаркеров деменции позволит своевременно выбирать оптимальный метод патогенетически обоснованной терапии, направленной на улучшение психосоматического здоровья пациентов, улучшения их социальной ориентации, а также создаст основу для разработки эффективных методов профилактики тяжелой нейродегенеративной патологии [Van Hulle С.et al., 2021].

В настоящее время существуют методики диагностики развития когнитивных нарушений, основанные на определении отдельных биомаркеров. Например, известен способ для диагностирования развития болезни Альцгеймера (БА), включающий иммуноцитохимическое определение уровня экспрессии тау-белка в лимфоцитах периферической крови человека с использованием соответствующего антитела [KVETNOY I.M., et al. 2000]. Также известно, что экспрессия белков митохондриального деления, родственного динамину белка 1 (Drp1), S-нитрозилированного Drp1 (SNO-Drp1) изменена в тканях головного мозга и фибробластах кожи у пациентов с болезнью Альцгеймера [WANG S. et al., 2012]. При этом в уровне техники отсутствуют сведения о комплексной оценке биомаркеров, обеспечивающей достоверную диагностику или определение риска развития когнитивного нарушения.

Предлагаемый способ диагностики или определения риска развития когнитивного нарушения был выявлен при изучении методом иммуноцитохимической идентификации экспрессии сигнальных молекул (молекулярных маркеров), вовлеченных в процесс нейродегенерации, в лимфоцитах периферической крови и клетках буккального эпителия у пациентов с деменцией, обусловленной болезнью Альцгеймера или другой нейрососудистой патологией, а также у волонтеров соответствующего возраста без подобной патологии.

Использование буккального эпителия как объекта для прижизненной диагностики нейродегенеративных заболеваний является перспективным направлением современной молекулярной диагностики благодаря удобству и информативности метода. Учитывая тот факт, что буккальный эпителий, подобно клеткам эпителия, головного мозга и кожи, в течение эмбриогенеза развивается из эктодермы, клетки буккального эпителия представляют собой потенциальную ткань, отражающую патологические изменения, развивающиеся в мозге [ЗУЕВ В.А. и др., 2018].

Раскрытие сущности изобретения

Изобретение относится к способу диагностики или определения риска развития когнитивного нарушения, независимо от его генеза, у субъекта, что включает: определение уровня экспрессии биологических молекулярных маркеров DRP1 и S100 в лимфоцитах крови и/или определение уровня экспрессии биомаркеров бета-амилоида, NF-kB, тау-протеина, клаудина и S100 в буккальном эпителии. При этом определение риска развития когнитивного нарушения основывается на различиях уровня экспрессии указанных биомаркеров, где изменение уровня экспрессии биомаркеров по сравнению с контрольным уровнем экспрессии тех же молекул у субъекта без деменции указывает на наличие или риск развития когнитивного нарушения.

Авторами настоящего изобретения разработана диагностическая панель для верификации экспрессии белков DRP1 и S100 в лимфоцитах крови; бета-амилоида, NF-kB, тау-протеина, клаудина и белка S100 в буккальном эпителии.

В соответствии с настоящим изобретением определяемые в периферических тканях, доступных для биопсии (лимфоциты крови и буккальный эпителий), уровни экспрессии сигнальных молекул, патогенетически связанных с возникновением деменции различного происхождения, применяются для выявления когнитивных нарушений.

Согласно настоящему изобретению результаты исследований позволяют рассматривать лимфоциты крови и буккальный эпителий как информативный биологический материал, легко и безопасно доступный для прижизненной персонализированной молекулярной диагностики нейродегенеративных заболеваний. Настоящее изобретение направлено на установление статистически значимых различий показателей экспрессии ряда конкретных биомаркеров, позволивших разработать диагностическую панель для молекулярной верификации деменции как патологического синдрома.

Изобретение касается способа диагностирования или определения риска развития когнитивного нарушения, независимо от его генеза, у субъекта, включающего:

a) определение уровня экспрессии биомаркеров DRP1 и S100 в лимфоцитах крови,

b) определение уровня экспрессии биомаркеров бета-амилоида, NF-kB, тау-протеина, клаудина и S100 в буккальном эпителии и

с) диагностирование или определение риска развития когнитивного нарушения на основании уровня экспрессии указанных биомаркеров, где изменение уровня экспрессии указанных биомаркеров по сравнению с контрольным уровнем экспрессии указанных биомаркеров у субъекта без деменции указывает на наличие или риск развития когнитивного нарушения.

Для осуществления данного способа разработана панель молекулярных биомаркеров для подтверждения подозрения на возникновение деменции независимо от ее генеза. Применение разработанной панели позволит значительно оптимизировать прижизненную персонифицированную диагностику, скрининг и мониторинг когнитивных нарушений.

Технический результат, достигаемый при использовании настоящего изобретения, заключается в достоверном определении развития или риска развития когнитивного нарушения.

Термин «когнитивное нарушение» при использовании здесь относится к любым формам нарушения когнитивных функций, включая снижение памяти или умственной работоспособности по сравнению с исходным уровнем (индивидуальной нормой), деменцию. Обычно деменция включает форму сосудистой деменции и нейродегенеративной деменции. Различные типы деменции описаны как амилоидопатия (болезнь Альцгеймера), таупатия (болезнь телец Леви, болезнь Кройцфельда-Якоба, синдром Пика) и синуклеопатия (болезнь Паркинсона).

Болезнь Альцгеймера представляет собой хроническое прогрессирующее нейродегенеративное заболевание.

При использовании здесь термин «диагностика» или «диагностирование» означает идентификацию наличия или отсутствия характеристик патологических состояний. В отношении целей настоящего изобретения «диагностика» или «диагностирование» означает определение развития или риска развития когнитивного нарушения.

При использовании здесь термин «биомаркер» означает вещество, способное показывать состояние заболевания. В контексте настоящего изобретения, направленного на диагностику когнитивных нарушений, «биомаркер» означает полипептиды, гликопротеины, мРНК или других веществ, количества которых повышаются или снижаются у пациентов, страдающих когнитивными нарушениями или имеющих склонность к когнитивным нарушениям по сравнению с нормальными здоровыми субъектами.

Используемыми в настоящем изобретении биомаркерами являются DRP1 и S100 в лимфоцитах крови и бета-амилоид, NF-kB, тау-белок, клаудин и S100 в буккальном эпителии.

DRP1 представляет собой динамин-1-подобный белок, являющейся ГТФазой, которая регулирует деление митохондрий. Динамин-1-подобный белок кодируется геном DNM1L и является частью семейства белков суперсемейства динаминов.

Обозначение «S100» относится к группе кальций-связывающих белков с низким молекулярным весом.

Бета-амилоид (Аβ или Abeta) обозначает пептиды из 36-43 аминокислот, которые являются основным компонентом амилоидных бляшек. Формы из 40 и 42 аминокислот бета амилоида (Abeta (1-40) и Abeta (1-42)) в цереброспинальной жидкости известны в качестве потенциальных биомаркеров болезни Альцгеймера.

NF-kB обозначает ядерный фактор «каппа-би NF-κВ» - транскрипционный фактор, контролирующий экспрессию генов иммунного ответа, апоптоза и клеточного цикла.

Тау-белок (тау-протеин, tau-протеин, τ-протеин, англ. microtubule-associated protein tau, МАРТ) принадлежит к группе белков, ассоциированных с микротрубочками (MAP).

Клаудины представляют собой семейство небольших (20-24/27 килодальтон (кДа)) транс мембранных белков, которые наряду с окклюдином являются важнейшими компонентами плотных контактов.

Дополнительные биомаркеры, уровни экспрессии которых также могут определяться при осуществлении настоящего изобретения, включают CD34, эндотелии-1, PTEN индуцированная киназа 1 (PINK), RAGE (специфичный рецептор конечного продукта, расширенного гликозилирования, AGER), синуклеин (SNCA).

Лимфоциты крови и буккальный эпителий являются информативным биологическим материалом, легко и безопасно доступным для прижизненной персонализированной молекулярной диагностики нейродегенеративных заболеваний. Использование буккального эпителия более предпочтительно, учитывая возможность получения его образцов неинвазивным путем и более широкий спектр верификации в нем молекулярных биомаркеров.

Буккальный эпителий представляет собой эпителий внутренней стороны щеки. При использовании здесь термин «кровь» включает цельную кровь, сыворотку и плазму.

В соответствии с настоящим изобретением для определения уровней экспрессии биомаркеров используют любые известные методики, включая, но не ограничиваясь этим, ПЦР, микрочипы или иммуноанализ. В некоторых вариантах осуществления уровень экспрессии биомаркера определяют путем измерения уровня мРНК или белка.

Предпочтительно биомаркеры анализируют с помощью иммуноанализа, хотя специалистам в данной области хорошо известны и другие методы. Присутствие или количество маркера обычно определяют с использованием антител, специфичных для каждого маркера, и обнаружения специфического связывания. Можно использовать любой подходящий иммуноанализ, например, иммуноферментный анализ (ELISA), иммуноцитохимический анализ (ИЦХ), радиоиммунный анализ (РИА) и т.п.Специфическое иммунологическое связывание антитела с биомаркером можно обнаружить прямо или косвенно. Прямые метки включают флуоресцентные или люминесцентные метки, металлы, красители, радионуклиды и т.п., прикрепленные к антителу. Косвенные метки включают различные ферменты, хорошо известные в данной области, такие как щелочная фосфатаза, пероксидаза хрена и т.п.

При использовании в настоящем описании термин «антитело» означает иммуноглобулин, специфично связывающийся с антигенной областью биомолекулы. В отношении цели настоящего изобретения, антитело специфично связывается с биомаркером. Антитело может представлять собой поликлональное антитело, моноклональное антитело и рекомбинантное антитело. Кроме того, антитело по настоящему изобретению включает функциональные фрагменты молекул антитела, как и полные формы, имеющие две полноразмерных легких цепи и две полноразмерных тяжелых цепи. Функциональный фрагмент молекул антитела означает фрагмент, сохраняющий, по меньшей мере, функцию связывания антигена, и включает Fab, F(ab')₂, Fv, и аналогичные фрагменты.

При использовании в настоящем описании, термин «комплекс антиген-антитело» означает продукт связывания биомаркера с антителом, распознающим его.

При использовании здесь термины «белок» и «протеин» взаимозаменяемы.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 представляет распределение удельного веса лимфоцитов с экспрессией бета-амилоида в зависимости от группы сравнения (* - уровень значимости р<0.01 при сравнении с группой волонтеров).

Фиг. 2 представляет распределение удельного веса клеток с экспрессией бета-амилоида в буккальном эпителии в зависимости от группы сравнения.

Фиг. 3 представляет распределение удельного веса лимфоцитов с экспрессией CD34 в зависимости от группы сравнения.

Фиг. 4 представляет распределение удельного веса клеток с экспрессией CD34 в буккальном эпителии в зависимости от группы сравнения.

Фиг. 5 представляет распределение удельного веса клеток с экспрессией клаудина в лимфоцитах в зависимости от группы сравнения (* - уровень значимости р<0.01 при сравнении с группой волонтеров).

Фиг. 6 представляет распределение удельного веса клеток с экспрессией клаудина в буккальном эпителии в зависимости от группы сравнения (* - уровень значимости р<0.01 при сравнении с группой волонтеров).

Фиг. 7 представляет распределение удельного веса лимфоцитов с экспрессией белка DRP1 в зависимости от группы сравнения.

Фиг. 8 представляет распределение удельного веса клеток с экспрессией белка DRP1 в буккальном эпителии в зависимости от группы сравнения.

Фиг. 9 представляет распределение удельного веса лимфоцитов с экспрессией эндотелина-1 в зависимости от группы сравнения.

Фиг. 10 представляет распределение удельного веса клеток с экспрессией эндотелина-1 в буккальном эпителии в зависимости от группы сравнения.

Фиг. 11 представляет распределение удельного веса клеток с экспрессией NF-kB в лимфоцитах в зависимости от группы сравнения (* - уровень значимости р<0.01 при сравнении с группой волонтеров).

Фиг. 12 представляет распределение удельного веса клеток с экспрессией NF-kB в буккальном эпителии в зависимости от группы сравнения.

Фиг. 13 представляет распределение удельного веса лимфоцитов с экспрессией PINK в зависимости от группы сравнения (* - уровень значимости р<0.01 при сравнении с группой волонтеров, ** - уровень значимости р<0.01 при сравнении группы пациентов с сосудистой деменцией с группой пациентов с болезнью Альцгеймера).

Фиг. 14 представляет распределение удельного веса клеток с экспрессией PINK в буккальном эпителии в зависимости от группы сравнения.

Фиг. 15 представляет распределение удельного веса лимфоцитов с экспрессией RAGE в зависимости от группы сравнения (* - уровень значимости р<0.01 при сравнении с группой волонтеров, ** - уровень значимости р<0.01 при сравнении сосудистой деменции с болезнью Альцгеймера).

Фиг. 16 представляет распределение удельного веса клеток с экспрессией RAGE в буккальном эпителии в зависимости от группы сравнения (* - уровень значимости р<0.01 при сравнении с группой волонтеров).

Фиг. 17 представляет распределение удельного веса лимофоцитов с экспрессией S100 в зависимости от группы сравнения (* - уровень значимости р<0.01 при сравнении с группой волонтеров).

Фиг. 18 представляет распределение удельного веса клеток с экспрессией S100 в буккальном эпителии зависимости от группы сравнения.

Фиг. 19 представляет распределение удельного веса клеток с экспрессией синуклеина в лимфоцитах зависимости от группы сравнения (* - уровень значимости р<0.01 при сравнении с группой волонтеров, ** - уровень значимости р<0.01 при сравнении сосудистой деменции с болезнью Альцгеймера).

Фиг. 20 представляет распределение удельного веса клеток с экспрессией синуклеина в буккальном эпителии по полу в зависимости от группы сравнения.

Фиг. 21 представляет распределение удельного веса лимфоцитов с экспрессией тау-протеина в зависимости от группы сравнения (* - уровень значимости р<0.01 при сравнении с группой волонтеров).

Фиг. 22 представляет распределение удельного веса клеток с экспрессией тау-протеина в буккальном эпителии в зависимости от группы сравнения.

Осуществление изобретения

Отбор участников исследования проводился с учетом критериев включения и исключения из исследования путем формирования когорт с проведением экспертной клинической оценки нейропсихических особенностей и геронтологического статуса участников исследования, экспертной оценки медицинских документов, характеризующих состояние здоровья участников исследования. Методология подбора участников исследования заключалась в экспертной оценке медицинской документации (в т.ч. анализ диагнозов, анамнестических данных, результатов биохимических, функциональных, томографических исследований, психометрических тестов), оценке гериатрического статуса на основе комплексной гериатрической оценки и при необходимости дополнительного дообследования и тестирования по рекомендациям экспертов. В результате предварительных экспертиз отобрано 203 участника исследования.

Критериями включения в основную группу определены: возраст 50 лет и старше, наличие клинических проявлений объективизированных когнитивных расстройств различного генеза (болезнь Альцгеймера или деменция сосудистого генеза).

Критерии исключения из основной группы: наличие онкологических и гематологических заболеваний вне ремиссии, наличие состояний, требующих экстренной медицинской помощи, отказ участника исследования или его законного представителя от участия в исследовании.

Критериями включения в группу волонтеров (контроль) определены: возраст 50 лет и старше, отсутствие когнитивных расстройств додементного и дементного уровней.

Критерии исключения из контрольной группы: наличие онкологических и гематологических заболеваний вне ремиссии, наличие состояний, требующих экстренной медицинской помощи, отказ участника исследования от участия в исследовании.

Общая численность обследованных составила 203 человека, из них 53 (26,1%) мужчин и 150 (73,9%) женщин. Все обследуемые были разделены на три группы:

1) группа пациентов с клинически диагностированной болезнью Альцгеймера (57 человек, из них 21,0% мужчин и 79,0% женщин);

2) группа пациентов с клинически диагностированной сосудистой деменцией (100 человек, из них 26,0% мужчин и 74,0% женщин);

3) обследуемые волонтеры без клинических проявлений психоневрологических расстройств (46 человек, из них 32,6% мужчин и 67,4% женщин).

Средний возраст обследуемых пациентов суммарно во всех группах составил 84,6±7,6 (с болезнью Альцгеймера - 77,0±12,2 лет, с сосудистой деменцией - 79,7±9,8 лет, 61,7±7,6 у волонтеров).

Применен метод динамического формирования когорт, предусматривающий формирование и переформирование групп и подгрупп в исследовании исходя из варианта когнитивных расстройств и наличия сопутствующей патологии, что позволяет проводить корреляционный анализ в отношении участников с различными вариантами когнитивных расстройств смешанного генеза.

По той причине, что зачастую причины деменции у конкретных пациентов носят смешанный характер, при отборе участников исследования и формирования когорт проводилась экспертная оценка случаев когнитивных расстройств и комплексное гериатрическое обследование для исключения псевдодементных ситуаций.

При отборе волонтеров как потенциальных участников контрольной группы также проводилось экспертное психометрическое обследование, так как у них могли быть додементные (доклинические) когнитивные расстройства при отсутствии жалоб и клинически значимых проявлений, что не позволяло включать их в контрольную группу.

Потенциальная полифакторность дементных расстройств и наличие смешанных форм у одного участника не позволило сформировать стабильные группы для исследования, а требовало подхода динамического формирования групп и подгрупп среди участников.

Для исследования были использованы клетки внемозговых тканей, доступные для биопсии, а именно лимфоцитов периферической крови и клетки буккального эпителия.

Выбор таких тканей определялся не только малоинвазивной доступностью для прижизненного исследования путем взятия биопсии, но, прежде всего, способностью лимфоцитов периферической крови и клеток буккального эпителия продуцировать большое количество биологически активных молекул (цитокины, биогенные амины, регуляторные пептиды и другие), которые участвуют в механизме развития (патогенезе) когнитивных нарушений.

Был применен иммуноцитохимический (ИЦХ) метод для верификации экспрессии следующих сигнальных молекул: tau-протеин, бета-амилоид, альфа-синуклеин, DRP1, CD34, эндотелин-1, PINK, NF-kB, RAGE, S100, клаудин. Результаты ИЦХ-метода оценивались методом световой микроскопии, а сравнительная количественная оценка экспрессии сигнальных молекул проводилась с использованием морфометрии и компьютерного анализа микроскопических изображений. Статистическая обработка результатов исследования проводилась в несколько этапов. Все вычисления осуществляли в свободной программной среде R. На первом этапе, для устранения ошибок измерения и подсчета, выявляли значения, резко отличающиеся из общей выборки (выбросы). Выбросы определяли на основе межквартильного размаха (IQR): к ним относили наблюдения со значениями менее Q1-1.5*IQR и более Q3+1.5*IQR. В том случае, когда выбросы признавали за ошибку измерения, данные заменялись на средние значения. На этом же этапе проводили проверку на соответствие нормальному закону распределения с помощью критерия Шапиро-Уилка (Shapiro-Wilk's test). На втором этапе в случае, если данные соответствовали нормальному закону распределения (только для возраста в группах сравнения), типичное значение представляли в виде среднего значения и стандартного отклонения (М±σ), а сравнение групп осуществляли с помощью критерия Стьюдента. При несоответствии данных нормальному закону распределения (все экстенсивные показатели, характеризующие удельный вес клеток с экспрессией маркеров), типичное значение представляли в виде медианы, разброс характеризовали межквартильным интервалом Me(Q1-Q3), 95% доверительный интервал рассчитывали по методу Уилсона (Wilson). Сравнение групп осуществляли с помощью критерия Манн-Уитни. При парном сравнении нулевую гипотезу отклоняли при уровне значимости критерия менее 0,05. При множественном попарном сравнении (три группы) нулевую гипотезу отклоняли при уровне значимости критерия менее 0,01.

Основные результаты проведенного исследования приводятся ниже в Примерах 1-12.

По результатам исследования установлено, что показатели экспрессии белка DRP1 в лимфоцитах крови достоверно выше, а показатели экспрессии бета-амилоида, NF-kB и тау-протеина в буккальном эпителии статистически значимо ниже у пациентов с болезнью Альцгеймера и сосудистой деменцией, чем среди здоровых волонтеров.

Показатели экспрессии клаудина в буккальном эпителии статистически значимо ниже у пациентов с сосудистой деменцией по сравнению с волонтерами.

Показатели экспрессии белка S100 в лимфоцитах крови статистически значимо выше, а в буккальном эпителии, наоборот, достоверно ниже у пациентов с болезнью Альцгеймера по сравнению с группой волонтеров.

Статистически значимые различия показателей экспрессии белков DRP1 и S100 в лимфоцитах крови; бета-амилоида, NF-kB, тау-протеина, клаудина и белка S100 в буккальном эпителии позволили разработать диагностическую панель для молекулярной верификации деменции как патологического синдрома, независимо от механизма ее возникновения.

Пример 1. Бета-амилоид

Лимфоциты крови. Удельный вес лимфоцитов с экспрессией бета-амилоида был наибольшим (5,8% (1,1%-10,5%)) в группе с болезнью Альцгеймера, на втором месте (4,0% (0%-8,9%) - в группе с сосудистой деменцией и на третьем (3,1% (0%-10%)) - среди волонтеров (Фиг. 1).

Как видно из Фиг. 1, не было установлено статистически значимых различий в экспрессии бета-амилоида в лимфоцитах в группах сравнения. Распределение удельного веса лимфоцитов с экспрессией бета-амилоида по полу в зависимости от группы сравнения представлено в Табл. 1.

Из данных, представленных в Табл. 1, видно, что во всех группах сравнения различия у мужчин и женщин в экспрессии бета-амилоида в лимфоцитах находятся в границах статистической погрешности.

Буккальный эпителий. Удельный вес клеток с экспрессией бета-амилоида в буккальном эпителии был наибольшим (60,7% (50%-67,9%) среди волонтеров, на втором месте (45,9% (31,3%-60%)) в группе с сосудистой деменцией и на третьем (41,4% (27,6%-54,3%)) в группе с заболеванием Альцгеймера (Фиг. 2).

Как видно из Фиг. 2, площадь экспрессии бета-амилоида в буккальном эпителии у больных Альцгеймером и группы с сосудистой деменцией были статистически значимо ниже, чем среди волонтеров.

Распределение удельного веса клеток с экспрессией бета-амилоида в буккальном эпителии по полу в зависимости от группы сравнения представлено в Табл. 2.

Из данных, представленных в Табл. 2 видно, что во всех группах сравнения различия у мужчин и женщин в экспрессии бета-амилоида в буккальном эпителии находятся в границах статистической погрешности.

Пример 2. Белок CD34

Лимфоциты крови. Удельный вес лимфоцитов с экспрессией белка CD34 был наибольшим (6,3% (2,1%-10,4%)) в группе пациентов с болезнью Альцгеймера, на втором месте (5,7% (0%-7,7%)) среди волонтеров и на третьем (4,2% (0%-15,9%) в группе с сосудистой деменцией (Фиг. 3).

Как видно из Фиг. 3, не было установлено статистически значимых различий в показателях удельного веса лимфоцитов с экспрессией CD34 в группах сравнения.

Распределение удельного веса лимфоцитов с экспрессией CD34 по полу в зависимости от группы сравнения представлено в Табл. 3.

Из данных, представленных в Табл. 3 видно, что во всех группах сравнения различия в экспрессии CD34 в лимфоцитах у мужчин и женщин статистически незначимы.

Буккальный эпителий. Удельный вес клеток с экспрессией белка CD34 в буккальном эпителии был наибольшим (18,8% (9,8%-23,1%) в группе с сосудистой деменцией, на втором месте (16,0% (11,1%-22,6%)) в группе пациентов с болезнью Альцгеймера и на третьем (15,9% (10,3%-28,8%)) среди волонтеров (Фиг. 4).

Как видно из Фиг. 4, не было установлено статистически значимых различий в показателях удельного веса клеток с экспрессией CD34 в буккальном эпителии в группах сравнения.

Распределение удельного веса клеток с экспрессией CD34 в буккальном эпителии по полу в зависимости от группы сравнения представлено в Табл. 4.

Из данных, представленных в Табл. 4 видно, что во всех группах сравнения различия в экспрессии CD34 в буккальном эпителии у мужчин и женщин статистически незначимы.

Пример 3. Клаудин

Лимфоциты крови. Удельный вес лимфоцитов с экспрессией клаудина был наибольшим (9,1% (4%-19,7%)) в группе с сосудистой деменцией, на втором месте (8,5% (2,4%-25%) среди волонтеров и на третьем (4,9% (0%-8,1%)) в группе пациентов с болезнью Альцгеймера (Фиг. 5).

Как видно из Фиг. 5, не было установлено статистически значимых различий в показателях удельного веса лимфоцитов с экспрессией клаудина в группах сравнения.

Распределение удельного веса клеток с экспрессией клаудина в лимфоцитах по полу в зависимости от группы сравнения представлено в Табл. 5.

Из данных, представленных в Табл. 5 видно, что во всех группах сравнения различия в экспрессии клаудина в лимфоцитах у мужчин и женщин статистически незначимы.

Буккальный эпителий. Удельный вес клеток с экспрессией клаудина в буккальном эпителии был наибольшим (52,8% (46,9%-57,1%)) среди волонтеров, на втором месте (45,9% (33,3%-55,2%)) в группе с заболеванием Альцгеймера и на третьем (44,2% (40%-46,8%) в группе с сосудистой деменцией (Фиг. 6).

Как видно из Фиг. 6, статистически значимые снижение показателя удельного веса клеток с экспрессией клаудина в буккальном эпителии в группе сосудистой деменцией по сравнению с волонтерами.

Распределение удельного веса клеток с экспрессией клаудина в буккальном эпителии по полу в зависимости от группы сравнения представлено в Табл. 6.

Из данных, представленных в Табл. 6 видно, что во всех группах сравнения различия вэкспрессии клаудина в буккальном эпителии у мужчин и женщин статистически незначимы.

Пример 4. Белок DRP1

Лимфоциты крови. Удельный вес лимфоцитов с экспрессией белка DRP1 был наибольшим (5,9% (2,4%-8,3%) в группе с сосудистой деменцией, на втором месте (5,6% (2,7%-8,2%) в группе с заболеванием Альцгеймера и на третьем (1,2% (0,9%-2,2%) среди волонтеров (Фиг. 7).

Из Фиг. 7 видно статистически значимое увеличение удельного веса лимфоцитов с экспрессией белка DRP1 у пациентов с болезнью Альцгеймера и сосудистой деменцией по сравнению с волонтерами.

Распределение удельного веса лимфоцитах с экспрессией белка DRP1 по полу в зависимости от группы сравнения представлено в Табл. 7.

Из данных, представленных в Табл. 7 видно, что во всех группах сравнения различия в экспрессии белка DRP1 в лимфоцитах у мужчин и женщин статистически незначимы.

Буккальный эпителий. Удельный вес клеток с экспрессией белка DRP1 в буккальном эпителии был наибольшим (36,1% (15,4%-46,9%) в группе с заболеванием Альцгеймера, на втором месте (29,4% (18,2%-46,2%) среди волонтеров и на третьем (28,6% (17,9%-50%) в группе с сосудистой деменцией (Фиг. 8).

Как видно из Фиг. 8 не было установлено статистически значимых различий в показателях относительной DRP1 в буккальном эпителии экспрессии в группах сравнения.

Распределение удельного веса клеток с экспрессией DRP1 в буккальном эпителии по полу в зависимости от группы сравнения представлено в Табл. 8.

Из данных, представленных в Табл. 8 видно, что во всех группах сравнения различия в экспрессии DRP1 в буккальном эпителии у мужчин и женщин статистически незначимы.

Пример 5. Эндотелин-1

Лимфоциты крови. Удельный вес лимфоцитов с экспрессией эндотелина-1 был наибольшим в группе с заболеванием Альцгеймера (7,2% (4,3%-14,3%), на втором месте в группе с сосудистой деменцией (5,8% (2,4%-12,0%) и на третьем среди волонтеров (5,8% (2,2%-15,0%) (Фиг. 9).

Как видно из Фиг. 9, не было установлено статистически значимых различий в удельном весе лимфоцитов с экспрессией эндотелина-1 в группах сравнения.

Распределение удельного веса лимфоцитов с экспрессией эндотелина-1 по полу в зависимости от группы сравнения представлено в Табл. 9.

Из данных, представленных в Табл. 9 видно, что во всех группах сравнения различия в экспрессии эндотелина-1 в лимфоцитах у мужчин и женщин статистически незначимы.

Буккальный эпителий. Удельный вес клеток с экспрессией эндотелина-1 в буккальном эпителии был наибольшим (37,5% (14,3%-57,7%)) в группе с сосудистой деменцией, на втором месте (35,4% (8,8%-66,7%)) среди волонтеров и на третьем (29,6% (15,6%-44,7%)) в группе пациентов с болезнью Альцгеймера (Фиг. 10).

Как видно из Фиг. 10, не было установлено статистически значимых различий в показателях удельного веса клеток с экспрессией эндотелина-1 в буккальном эпителии в группах сравнения.

Распределение удельного веса клеток с экспрессией эндотелина-1 в буккальном эпителии по полу в зависимости от группы сравнения представлено в Табл. 10.

Из данных, представленных в Табл. 10 видно, что во всех группах сравнения различия в экспрессии эндотелина-1 в буккальном эпителии у мужчин и женщин статистически незначимы.

Пример 6. Транскрипционный фактор NF-kB

Лимфоциты крови. Удельный вес клеток с экспрессией NF-kB в лимфоцитах был наибольшим (4,0% (1,2%-8,2%) в группе с сосудистой деменцией, на втором месте (3,9% (0%-7,2%) в группе с заболеванием Альцгеймера и на третьем (2,6% (0,8%-10,3%) среди волонтеров (Фиг. 11).

Как видно из Фиг. 11, не было установлено статистически значимых различий в показателях удельного веса клеток с экспрессией NF-kB в лимфоцитах в группах сравнения.

Распределение удельного веса лимфоцитов с экспрессией NF-kB по полу в зависимости от группы сравнения представлено в Табл. 11.

Из данных, представленных в Табл. 11 видно, что во всех группах сравнения различия в экспрессии NF-kB в лимфоцитах у мужчин и женщин статистически незначимы.

Буккальный эпителий. Удельный вес клеток с экспрессией NF-kB в буккальном эпителии был наибольшим (79,2% (61,5%-81,3%)) среди волонтеров, на втором месте (54,3% (21,4%-57,1%)) в группе с сосудистой деменцией и на третьем (47,1% (33,3%-69,6%)) в группе пациентов с болезнью Альцгеймера (Фиг. 12).

Из Фиг. 12 видно, что показатели удельного веса клеток с экспрессией экспрессии NF-kB в буккальном эпителии статистически значимо ниже в группе с болезнью Альцгеймера и сосудистой деменции по сравнению с волонтерами.

Распределение удельного веса клеток с экспрессией NF-kB в буккальном эпителии по полу в зависимости от группы сравнения представлено в Табл. 12.

Из данных, представленных в Табл. 12 видно, что во всех группах сравнения различия в экспрессии NF-kB в буккальном эпителии у мужчин и женщин статистически незначимы.

Пример 7. PTEN индуцированная киназа 1 (PINK)

Лимфоциты крови. Удельный вес лимфоцитов с экспрессией PINK был наибольшим (10,6% (7,7%-15,4%) в группе с сосудистой деменцией, на втором месте (7,4% (3,3%-13,2%) в группе с заболеванием Альцгеймера и на третьем (3,6% (0%-7,8%) среди волонтеров (Фиг. 13).

Как видно из Фиг. 13 не было установлено статистически значимых различий в показателях удельного веса клеток с экспрессией PINK в лимфоцитах в группах сравнения.

Распределение удельного веса лимфоцитов с экспрессией PINK по полу в зависимости от группы сравнения представлено в Табл. 13.

Из данных, представленных в Табл. 13 видно, что во всех группах сравнения различия в экспрессии PINK в лимфоцитах у мужчин и женщин статистически не значимы.

Буккальный эпителий. Удельный вес клеток с экспрессией PINK в буккальном эпителии был наибольшим (86,1% (81,2%-90,7%) среди волонтеров, на втором месте (85,6% (76,6%-91,3%) в группе с сосудистой деменцией и на третьем (57,7% (25%-84%) в группе с заболеванием Альцгеймера (Фиг. 14).

Как видно из Фиг. 14, удельный вес клеток с экспрессией PINK в буккальном эпителии среди больных Альцгеймером статистически значимо ниже как среди волонтеров, так и сосудистой деменции.

Распределение удельного веса клеток с экспрессией PINK в буккальном эпителии по полу в зависимости от группы сравнения представлено в Табл. 14.

Из данных, представленных в Табл. 14 видно, что во всех группах сравнения различия в экспрессии PINK в буккальном эпителии у мужчин и женщин статистически незначимы.

Пример 8. Белок RAGE

Лимфоциты крови. Удельный вес лимфоцитов с экспрессией RAGE был наибольшим (6,9% (2,6%-15,8%) в группе с сосудистой деменцией, на втором месте (2,1% (0%-2,8%) в группе с заболеванием Альцгеймера и на третьем (0,6% (0%-2%) среди волонтеров (Фиг. 15).

Как видно из Фиг. 15 не было установлено статистически значимых различий в показателях удельного веса клеток с экспрессией RAGE в лимфоцитах в группах сравнения.

Распределение удельного веса лимфоцитов с экспрессией RAGE по полу в зависимости от группы сравнения представлено в Табл. 15.

Из данных, представленных в Табл. 15 видно, что во всех группах сравнения различия в экспрессии RAGE в лимфоцитах у мужчин и женщин статистически незначимы.

Буккальный эпителий. Удельный вес клеток с экспрессией RAGE в буккальном эпителии был наибольшим (64,2% (21,8%-77,1%) в группе с сосудистой деменцией, на втором месте (41,4% (10%-70,8%) среди волонтеров и на третьем (0,0% (0%-14,3%) в группе пациентов с болезнью Альцгеймера (Фиг. 16).

Как видно из Фиг. 16, удельный вес клеток с экспрессией RAGE в буккальном эпителии при болезни Альцгеймера была статистически значимо ниже, как у волонтеров, так и при сосудистой деменции.

Распределение удельного веса клеток с экспрессией RAGE в буккальном эпителии по полу в зависимости от группы сравнения представлено в Табл. 16.

Из данных, представленных в Табл. 16 видно, что во всех группах сравнения различия в экспрессии RAGE в буккальном эпителии у мужчин и женщин статистически незначимы.

Пример 9. Белок S100

Лимфоциты крови. Удельный вес лимфоцитов с экспрессией белка S100 был наибольшим (11,7% (0%-22,4%) в группе пациентов с болезнью Альцгеймера, на втором месте (8,0% (0%-18,8%) в группе с сосудистой деменцией и на третьем (3,7% (0%-12,1%) среди волонтеров (Фиг. 18).

Как видно из Фиг. 17, удельный вес лимфоцитов с экспрессией S100 был статистически значимо выше у больных Альцгеймером по сравнению с группой волонтеров.

Распределение удельного веса лимфоцитов с экспрессией S100 по полу в зависимости от группы сравнения представлено в Табл. 17.

Из данных, представленных в Табл. 17 видно, что во всех группах сравнения различия в экспрессии S100 в лимфоцитах у мужчин и женщин статистически незначимы.

Буккальный эпителий. Удельный вес клеток с экспрессией S100 в буккальном эпителии был наибольшим (84,2% (76,2%-88%)) среди волонтеров, на втором месте (72,8% (67,9%-92,3%)) в группе с сосудистой деменцией и на третьем (59,9% (45,7%-78,3%)) в группе пациентов с болезнью Альцгеймера (Фиг. 18).

Как видно из Фиг. 18 удельный вес клеток с экспрессией S100 в буккальном эпителии среди пациентов с болезнью Альцгеймера был статистически значимо ниже, чем среди группы волонтеров.

Распределение удельного веса клеток с экспрессией S100 в буккальном эпителии по полу в зависимости от группы сравнения представлено в Табл. 18.

Из данных, представленных в Табл. 18 видно, что во всех группах сравнения различия в экспрессии S100 в буккальном эпителии у мужчин и женщин статистически незначимы.

Пример 10. Синуклеин

Лимфоциты крови. Удельный вес лимфоцитов с экспрессией синуклеина был наибольшим (15,8% (4,9%-25%) среди волонтеров, на втором месте (9,9% (4,7%-16,7%) в группе с болезнью Альцгеймера и на третьем (9,7% (5,5%-16,9%) в группе с сосудистой деменцией (Фиг. 19).

Как видно из Фиг. 19 не было установлено статистически значимых различий в показателях удельного веса лимфоцитов с экспрессией синуклеина в группах сравнения.

Распределение удельного веса клеток с экспрессией синуклеина в лимфоцитах по полу в зависимости от группы сравнения представлено в Табл. 19.

Из данных, представленных в Табл. 19 видно, что во всех группах сравнения различия в экспрессии синуклеина в лимфоцитах у мужчин и женщин статистически незначимы.

Буккальный эпителий. Удельный вес клеток с экспрессией синуклеина в буккальном эпителии был наибольшим (32,1% (10,3%-50%) в группе с сосудистой деменцией, на втором месте (31,0% (17,2%-50%) среди волонтеров и на третьем (5,3% (0%-13%)) в группе пациентов с болезнью Альцгеймера (Фиг. 20).

Как видно из Фиг. 20 удельный вес клеток с экспрессией синуклеина в буккальном эпителии у пациентов с болезнью Альцгеймера статистически значимо ниже, чем в группе с сосудистой деменцией и волонтерами.

Распределение удельного веса клеток с экспрессией синуклеина в буккальном эпителии по полу в зависимости от группы сравнения представлено в Табл. 20.

Из данных, представленных в Табл. 20 видно, что во всех группах сравнения различия в экспрессии синуклеина в буккальном эпителии у мужчин и женщин статистически незначимы.

Пример 11. Тау-протеин

Лимфоциты крови. Удельный вес лимфоцитов с экспрессией тау-протеина был наибольшим (8,7% (1,3%-15,2%) среди волонтеров, на втором месте (7,5% (0,5%-19,7%) в группе с сосудистой деменцией и на третьем (6,9% (2,9%-14,8%) в группе пациентов с болезнью Альцгеймера (Фиг. 21).

Как видно из Фиг. 21, не было установлено статистически значимых различий в удельном весе лимфоцитов с экспрессией тау-протеина в группах сравнения.

Распределение удельного веса лимфоцитов с экспрессией тау-протеина по полу в зависимости от группы сравнения представлено в Табл. 21.

Из данных, представленных в Табл. 21 видно, что во всех группах сравнения различия в экспрессии тау-протеина в лимфоцитах у мужчин и женщин статистически незначимы.

Буккальный эпителий. Удельный вес клеток с экспрессией тау-протеина в буккальном эпителии был наибольшим (69,6% (53,1%-85,7%) среди волонтеров, на втором месте (62,5% (45,5%-71,4%) в группе с сосудистой деменцией и на третьем (58,8% (47,6%-67,9%) в группе пациентов с болезнью Альцгеймера (Фиг. 22).

Как видно из Фиг. 22 удельный вес клеток с экспрессией тау-протеина в буккальном эпителии в группах пациентов с болезнью Альцгеймера и сосудистой деменцией была статистически значимо ниже, чем у волонтеров.

Распределение удельного веса клеток с экспрессией тау-протеина в буккальном эпителии по полу в зависимости от группы сравнения представлено в Табл. 22.

Из данных, представленных в Табл. 22 видно, что во всех группах сравнения различия в экспрессии тау-протеина в буккальном эпителии у мужчин и женщин статистически незначимы.

Проведенные исследования позволили верифицировать в периферических тканях, доступных для биопсии (лимфоциты крови и буккальный эпителий) экспрессию сигнальных молекул, патогенетически связанных с возникновением деменции различного происхождения. При этом для разработки заявляемого изобретения были идентифицированы и обоснованы основные молекулярные биомаркеры, позволяющие выявлять когнитивные нарушения и дифференцировать различные виды деменции по механизму их развития.

Пример 12. Интегральная диагностика

Для подтверждения подозрения на возникновение деменции (независимо от ее генеза болезнь Альцгеймера или сосудистая патология) у группы пациентов А (48 человек) измерены уровни экспрессии панели биомаркеров, а именно уровни экспрессии белков DRP1 и S100 в лимфоцитах периферической крови и бета-амилоида, NF-kB, тау-протеина, клаудина и белка S100 в буккальном эпителии. Сводные данные приведены в Табл.23.

У всех пациентов группы А выявлено статистически значимое повышение показателей экспрессии белка DRP1 и белка S100 в лимфоцитах крови и/или снижение экспрессии бета-амилоида, NF-kB, тау-протеина, клаудина и белка S100 в буккальном эпителии по сравнению с установленными референсными значениями, что свидетельствует о наличии серьезных когнитивных нарушений/деменции у обследуемого пациента.

Полученные результаты подтверждены другими методами диагностики, включая психологические тесты по краткой шкале оценки психического статуса (MMSE), компьютерную томографию и ангиографию сосудов головного мозга.

Для всех пациентов группы А установлена высокая вероятность возникновения когнитивных нарушений (все пациенты группы А по шкале MMSE имели результаты ниже 27 баллов). У части пациентов (15 человек) диагностирована высокая вероятность развития болезни Альцгеймера, у 6 человек установлена начальная стадия болезни Альцгеймера (по шкале MMSE 20-23 балла), у 5 человек - стадия умеренной деменции (по шкале MMSE 11-19 баллов). У части пациентов из 18 человек установлена высокая вероятность развития сосудистой деменции, причем у 10 человек подтвердили патологию кровеносных сосудов головного мозга ангиографией сосудов головного мозга и компьютерной томографией.

Источники информации

1. Bonomi CG, Assogna M, Di Donna MG, Bemocchi F, De Lucia V, Nuccetelli M, Fiorelli D, Loizzo S, Mercuri NB, Koch G, Martorana A, Motta C. Cerebrospinal Fluid sTREM-2, GFAP, and β-S100 in Symptomatic Sporadic Alzheimer's Disease: Microglial, Astrocytic, and APOE Contributions Along the Alzheimer's Disease Continuum. J Alzheimers Dis. 2023; 6. doi: 10.3233/JAD-221010.

2. Deardorff WJ, Grossberg GT. Behavioral and psychological symptoms in Alzheimer's dementia and vascular dementia. Handb Clin Neurol. 2019; 165: 5-32. doi: 10.1016/B978-0-444-64012-3.00002-2.

3. Kvetnoy I.M. et al. Tau-protein expression in human blood lymphocytes: a promising marker and suitable sample for life-time diagnosis of Alzheimer's disease. Neuro Endocrinol Lett. 2000; 21(4), p. 313-318.

4. Pillai JA, Cummings JL. Clinical trials in predementia stages of Alzheimer disease. Med Clin North Am. 2013; 97(3): 439-57. doi: 10.1016/j.mcna.2013.01.002.

5. Van Hulle C, Jonaitis EM, Betthauser TJ, Batrla R, Wild N, Kollmorgen G, Andreasson U, Okonkwo O, Bendlin BB, Asthana S, Carlsson CM, Johnson SC, Zetterberg H, Blennow K. An examination of a novel multipanel of CSF biomarkers in the Alzheimer's disease clinical and pathological continuum. Alzheimers Dement. 2021; 17(3): 431-445. doi: 10.1002/alz.12204.

6. Wang S. et al. Mitochondrial fission proteins in peripheral blood lymphocytes are potential biomarkers for Alzheimer's disease. Eur J Neurol. 2012, 19(7), p. 1015-1022.

7. Зуев В.А, Дятлова A.C., Линькова H.C., Кветная Т.В. Экспрессия Аβ42, τ-протеина, Р16, Р53 в буккальном эпителии: перспективы диагностики болезни Альцгеймера и темпа старения организма. Бюллетень Экспериментальной Биологии и Медицины, 2018, Том 166, Номер 11, с. 627-631.

8. Казаров, Р.Л. и др. Оптимизация оперативного лечения в пожилом и старческом возрасте больных поверхностным раком мочевого пузыря. Успехи геронтологии, 2009, Том 22, Номер 4, с. 695-699.

Изобретение относится к диагностике или определению риска развития когнитивного нарушения, независимо от его генеза, у субъекта. Предложен способ диагностирования или определения риска развития когнитивного нарушения, представляющего собой деменцию, у субъекта. Определяют уровни экспрессии биомаркеров DRP1 и S100 в лимфоцитах крови и уровни экспрессии биомаркеров бета-амилоида, NF-kB, тау-протеина, клаудина и S100 в буккальном эпителии. Статистически значимое повышение показателей экспрессии белка DRP1 и белка S100 в лимфоцитах крови и снижение экспрессии бета-амилоида, NF-kB, тау-протеина, клаудина и белка S100 в буккальном эпителии по сравнению с контрольными уровнями экспрессии указанных биомаркеров у субъекта без деменции указывает на наличие или риск развития когнитивного нарушения. Изобретение обеспечивает достоверную диагностику или определение риска развития когнитивного нарушения. 3 з.п. ф-лы, 22 ил., 23 табл., 12 пр.

1. Способ диагностирования или определения риска развития когнитивного нарушения, представляющего собой деменцию, у субъекта, включающий:

a) определение уровня экспрессии биомаркеров DRP1 и S100 в лимфоцитах крови,

b) определение уровня экспрессии биомаркеров бета-амилоида, NF-kB, тау-протеина, клаудина и S100 в буккальном эпителии и

c) диагностирование или определение риска развития когнитивного нарушения на основании уровней экспрессии указанных биомаркеров,

где статистически значимое повышение показателей экспрессии белка DRP1 и белка S100 в лимфоцитах крови и снижение экспрессии бета-амилоида, NF-kB, тау-протеина, клаудина и белка S100 в буккальном эпителии по сравнению с контрольными уровнями экспрессии указанных биомаркеров у субъекта без деменции указывает на наличие или риск развития когнитивного нарушения.

2. Способ по п. 1, где деменция представляет собой сосудистую деменцию или болезнь Альцгеймера.

3. Способ по п. 1, где экспрессию указанных биомаркеров определяют иммуноцитохимическим методом.

4. Способ по п. 3, где при проведении иммуноцитохимического метода применяют набор антител, специфических к указанным биомаркерам.