ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЕ ВЕЩЕСТВО SRFM КАК БИОМАРКЕР КРОВИ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ НАРУШЕНИЙ И ЗАБОЛЕВАНИЙ ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2024 года по МПК G01N33/50 G01N33/68 

Изобретение относится к медицине, медицинской диагностике и касается применения физиологически активного химического вещества с брутто-формулой C21H31N7O9 (химическое наименование в соответствие с номенклатурой ИЮПАК (4S,7S,10S,13S)-4-((1H-имидазол-4-ил)метил)-13-карбамоил-10-(2-карбоксиэтил)-7-метил-2,5,8,11-тетраоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-овая кислота) и точной молекулярной массой 525.218328 атомных единиц массы, именуемой здесь и далее, как SRFM, в качестве биомаркера крови для диагностики нейродегенеративных нарушений и заболеваний человека, основанное на измерениях концентрации SRFM в плазме крови пациента.

Вещество SRFM характеризуется хорошей растворимостью в воде (более 20 мл/мл); средний коэффициент гидрофобности SRFM составляет (GRAVY, Grand Average of Hydropathy) h=-2.1 (расчетная величина по шкале Уимли-Уайта, где отрицательные величины коэффициента означают гидрофильность молекулы, а положительные величины коэффициента означают гидрофобные молекулы). Количество тяжелых атомов в молекуле SRFM составляет 37, расчетный объем молекулы V(mol)=586 Å, расчетная топологическая площадь полярной поверхности S(t)=117 Ź (¹расчеты площади и объема приведены в соответствие с рекомендациями в Ertl Р, Rohde В, Selzer P. Fast calculation of molecular polar surface area as a sum of fragment-based contributions and its application to the prediction of drug transport properties. J Med Chem. 2000 Oct 5;43(20):3714-7. doi: 10.1021/jm000942e). Изоэлектрическая точка SRFM находится в пределах pI=4.14 - 4.24, максимальный суммарный заряд поверхности молекулы Z^0p=+2 достигается при рН<1.0, минимальный суммарный заряд поверхности молекулы Z^0m=-3 достигается при рН>12.0. Суммарный поверхностный заряд SRFM при нейтральном (рН=7.0) составляет Z⁰ⁿ=1.9. Вещество в протонированной форме характеризуется следующим распределением изотопомеров (указаны изотопомеры с вкладом не менее 1.0%): 526.2262=100%; 527.22323=2.5%; 527.22956=22.7%; 528.23044=1.8%; 528.23291=2.5%.

Предшествующий уровень техники

Из патента РФ №2742355 известно, что модификации ДНК в виде 5-метилцитозина (5mC) и недавно идентифицированного 5-гидроксиметилцитозина (5hmC) представляют две главные эпигенетические метки, обнаруженные в геноме млекопитающих, и они влияют на широкий круг биологических процессов от регуляции генов до нормального развития. Выявление аномальных изменений 5mC и 5hmC в бесклеточной ДНК (cfDNA, бкДНК) может составлять неинвазивный подход к диагностике широкого круга заболеваний, в том числе рака, нейродегенеративных, воспалительных и др.

Недостатком данного изобретения является низкий уровень 5hmC, а также применение сложного метода секвенирования данных маркеров.

Из патента РФ №2687483 известно, что можно применять внеклеточные нуклеосомы, включающей основание ДНК, нуклеотид или нуклеозид, в качестве биомаркера в диагностике рака, кардиомиопатии, системной красной волчанки, колита, хронического обструктивного заболевания легких, болезни Крона (Crohn) и ревматоидного артрита. Основание ДНК может быть выбрано из 5-метилцитозина или 5-гидроксиметилцитозина.

Недостатком данного изобретения является ограниченный круг диагностированных заболеваний и сложная процедура выделения и подготовки образцов.

Известен ряд способов диагностирования болезни Альцгеймера (БА) по различным биомаркерам.

В работе (Florentinus-Mefailoski, A., Bowden, P., Scheltens, P., Killestein, J., Teunissen, С, & Marshall, J. G. (2021). The plasma peptides of Alzheimer's disease. Clinical Proteomics, 18(1), 1-26.) сравнивают уровень эндогенных трипептидов, в том числе и при болезни Альцгеймера, с образцами релевантной контрольной группы в плазме крови. Пептиды были извлечены из образцов плазмы крови EDTA пациентов с БА и образцов контрольной группы в ступенчатом градиенте ацетонитрила для случайного и независимого отбора проб методом масс-спектрометрии LC-ESI-MS/MS с помощью набора надежных и чувствительных линейных квадрупольных ионных ловушек.

Анализ показал увеличение цитоплазматических белков и белков, участвующих в альтернативном сплайсинге, в экзоцитозе, в регуляции клеточного цикла, митохондриальных функций или метаболизма и апоптоза. Увеличение средней интенсивности предшественников пептидов из типичных белков плазмы, таких как DISCI, EXOSC5, UBE2G1, SMIM19, NXNL1, PANO, EIF4G1, KIR3DP1, MED25, MGRN1, OR8B3, MGC24039, POLR1A, SYTL4, RNF111, IREB2, ANKMY2, SGKL, SLC25A5, СНМР3 среди прочих были связаны с БА. Трипептиды из С-терминального участка белка DISCI с аминокислотной последовательностью MPGGGPQGAPAAAGGGGVSHRAGSRDCLPPAACFR и ARQCGLDSR показали более высокую частоту и самую высокую интенсивность при БА по сравнению со всеми другими заболеваниями и контролем.

В патенте US 2022308073А1 раскрыто исследование, в котором в качестве биомаркера крови при БА оценивают уровень флотиллина в сыворотке крови. При этом выявлено значительное снижение уровня флотиллина в сыворотке крови у пациентов с БА. Более того, в результате проверки полезности флотиллина с использованием клинических образцов было продемонстрировано, что уровень флотиллина в сыворотке крови является высокоспецифичным маркером БА и чрезвычайно актуален для раннего выявления БА.

В патенте KR20200024004A раскрыта возможность обеспечения диагностики БА по образцам плазмы крови. Для этого используют пептид, содержащий одну или более аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из последовательностей с номерами от 1 до 5. Пептид специфически связывается с антителом IgM, уровень которого повышен в крови пациента с деменцией Альцгеймера. Таким образом, обеспечивается диагностика БА по образцам крови.

В патенте US 2017219611 А1 раскрыт набор, содержащий реагенты для обнаружения одного или нескольких биомаркеров, выбранных из панели биомаркеров в образце ткани или образце жидкости организма, при этом указанная панель биомаркеров содержит по меньшей мере один из следующих биомаркеров: транстиретин (TTR), кластерин, цистатин С (CST3), альфа-1 кислый гликопротеин (A1AcidG), белок межклеточной адгезии 1 (ICAM1), фактор комплемента С4 (С4), фактор пигментного эпителия (PELF); альфа-1 антитрипсин (А1АТ); хемокин RANTES, аполипопротеин С-III (АроС3); ингибитор активатора плазминогена типа 1 (PAI 1), С-реактивный белок (CRP), катепсин D (CTSD), аполипопротеин Е (АроЕ).

Также дополнительно панель биомаркеров содержит один или несколько следующих биомаркеров: альфа-2-макроглобулин (А2М), сывороточный амилоид Р (SAP), специфичный рецептор конечного продукта гликозилирования (sRAGE), нейронспецифическая енолаза (NSE), фактор комплемента Н (CFH), белок-предшественник бета-амилоида (А4), церулоплазмин, молекула адгезии нервных клеток (NCAM), аполипопротеин A1 (ApoA1), Aβ42, нейротропный фактор мозга (BDNF), бета-2 микроглобулин (В2М), васкулярный фактор клеточной адгезии (VCAM-1).

В работе (Алесенко А.В. и др. Церамиды - потенциальные биомаркеры болезни Альцгеймера. Психиатрия №1(2014), стр. 13-21) раскрывается использование в качестве биомаркера БА, в том числе и на ранней стадии, содержание церамидов в крови. Обнаружено, что содержание церамидов в крови на ранней стадии БА понижено, тогда как в мозге и спинномозговой жидкости повышено. Определение корреляции между изменениями церамидов в крови и в цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) у пациентов с БА, особенно на ранней стадии заболевания, позволят использовать их в качестве биомаркеров БА и, возможно, в качестве мишеней для лекарственных средств нового поколения.

В статье (Клюшник Т.П. и др. Потенциальные маркеры болезни Альцгеймера, ассоциированные с воспалением. Психиатрия №1(2014), стр. 28-34) раскрыты исследования клинико-биологических взаимосвязей между рядом воспалительных факторов и особенностями состояния пациентов с БА (стадия заболевания, выраженность снижения когнитивных функций) с целью возможного использования их в качестве потенциальных маркеров. При этом рассматриваются не только «классические» медиаторы воспаления - цитокины (на примере ИЛ-6), но также секреторные белки нейтрофилов, в первую очередь - лейкоцитарная эластаза (ЛЭ), а также миелопероксидаза (МПО) и лактоферрин (ЛФ), принимающие участие в развертывании воспалительных реакций.

В плазме крови пациентов с болезнью Альцгеймера выявлено достоверное снижение активности/уровня секреторных белков нейтрофилов - ЛЭ, МПО и ЛФ, которое сочетается с увеличением уровня провоспалительного цитокина ИЛ-6. Повышение уровня ИЛ-6, коррелирующее с тяжестью заболевания, подтверждает вероятную роль воспаления в патогенезе. Предположительно, выявленное снижение активности/уровня секреторных белков отражает снижение функциональной (дегрануляционной) активности нейтрофилов и может иметь отношение к снижению фагоцитарной функции, которая наблюдается у пациентов, страдающих БА. Такие же явления наблюдаются у пациентов с ревматоидным артритом.

В работе (Григорьева В.Н. и др. «Ликворологические биомаркеры болезни альцгеймера (обзор)». Медицинский альманах. №2(67) 2001, стр. 22 32) представлен обзор научных публикаций, касающиеся использования определяемых в цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) биомаркеров БА для ранней диагностики и прогнозирования темпов развития этого заболевания. Классическими ликворологическими биомаркерами БА продолжают считаться сниженное содержание в ЦСЖ бета-амилоидного пептида длиной 42 аминокислотных остатка (Аβ42) или уменьшенное отношение Аβ42/Аβ40, а также повышенное содержание в ЦСЖ фосфорилированного тау-белка. Идентифицирован ряд дополнительных потенциальных ликворологических индикаторов БА.

Из потенциальных биомаркеров нейродегенерации наиболее перспективными для ранней диагностики БА и прогнозирования ее течения считаются визинин подобный белок-1 и легкая цепь нейрофиламента (NfL). Наряду с этим, получено много доказательств диагностической и прогностической ценности биомаркеров синаптической дисфункции нейрогранина, синаптосом ассоциированного белка-25, синаптотагмина-1 и связанного с ростом белка-43.

Некоторые биомаркеры, связанные с нейровоспалением, такие как хитиназа-3-подобный белок и програнулин, оказались перспективными как для скрининговой диагностики БА на доклинической и преддементной стадиях, так и для объективизации тяжести ее течения.

В статье (Leuzy A. et al. Blood-based biomarkers for Alzheimer's disease. EMBO Mol Med. 2022; 14(1): el4408. doi: 10.15252/emmm.202114408.) раскрыта возможность измерения в крови уровня фосфорилированного тау-белка, который является лучшим маркером-кандидатом при симптоматической БА (т.е. продромальной БА и БА деменции) и доклинической БА в сочетании с тестом на соотношение Аβ42/Аβ40. Хотя изменение концентрации легкой цепи нейрофиламента (NfL) в крови не является специфичным для пациентов с диагнозом БА, этот показатель представляется многообещающим для выявления нейродегенерации и потенциально может быть использован для выявления эффектов терапии, модифицирующей заболевание.

В статье (Hampel Н. et al. Blood-based biomarkers for Alzheimer disease: mapping the road to the clinic. Nature-Reviews-Neurology, 2018, 14(11), 639-652) раскрыта возможность обнаружения биомаркеров БА с помощью масс-спектрометрии даже при незначительных изменениях в концентрациях белков. Перспективные внеклеточные и внутриклеточные кандидаты на получение статуса биомаркера:

- Амилоид-β (Аβ); пептиды Аβ, в частности Аβ1-42, участвуют в патогенезе болезни Альцгеймера (AD). Соотношение Аβ1-42 к Аβ1-40, по-видимому, является наиболее перспективным биомаркером в крови. Первым шагом в генерации пептидов Аβ является расщепление белка-предшественника амилоида β-секретазой-1 (ВАСЕ1). Измерение активности ВАСЕ1 в крови может быть необходимым для прогнозирования прогрессирования от умеренных когнитивных нарушений до деменции с БА;

Фосфорилированный тау-белок является основным компонентом интранейронных нейрофибриллярных клубков при БА. Считается, что аномальное фосфорилирование тау-белка обусловлено пептидами Аβ. Уровни изоформ тау-белка в крови могут быть использованы в качестве предиктора будущего снижения когнитивных способностей;

- Легкая цепь нейрофиламента (NfL) - это аксональный белок, который высвобождается в интерстициальную жидкость головного мозга после повреждения нейронов или аксонов (отростков, или нейритов). Уровни NfL в крови повышены при БА и других нейродегенеративных заболеваниях; следовательно, NfL в крови может быть использован в качестве биомаркера нейродегенерации.

Применение физиологически активного вещества SRFM с брутто-формулой C21H31N7O9, а именно (4S,7S,10S,13S)-4-((1H-имидазол-4-ил)метил)-13-карбамоил-10-(2-карбоксиэтил)-7-метил-2,5,8,11-тетраоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-овая кислота), в качестве биомаркера крови для диагностики болезни Альцгеймера (БА) посредством измерения концентрация SRFM в крови пациентов не раскрыта в проанализированном уровне техники. Более того, из уровня техники неизвестно, что именно падение уровня концентрации физиологически активного вещества SRFM в крови пациента ассоциировано с прогрессированием деменции от мягкого когнитивного снижения (МКС) до ранних стадий болезни Альцгеймера.

На сегодняшний день известен ряд способов диагностирования болезни Паркинсона (БП) по различным биомаркерам.

Из патента РФ №2722666 известен способ ранней диагностики БП, отличающийся тем, что проводят определение активности альфа-2-макроглобулина (α2-МГ) в слезе каждого глаза и при ее величине более 22 нмоль/м*мин хотя бы в одном глазе и наличии асимметрии значений этого показателя между глазами более чем на 10 нмоль/мл*мин диагностируют БП.

Из патента РФ №2775261 известен способ ранней доклинической диагностики болезни Паркинсона, предусматривающий следующие стадии:

1) измерение в слезной жидкости у пациента без нарушения двигательной функции концентрации биомаркеров, представляющих собой норадреналин, адреналин и дофамин;

2) сравнение измеренных значений концентрации указанных биомаркеров со значениями концентрации аналогичных биомаркеров у добровольцев того же возраста без неврологических болезней.

Если в слезной жидкости пациента одновременно концентрация норадреналина и дофамина выше, а концентрация адреналина ниже по сравнению с контролем того же возраста без неврологических болезней, то это позволяет диагностировать у пациента доклиническую стадию БП. Измерение концентрации указанных биомаркеров проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией (ВЭЖХ-ЭД).

Применение физиологически активного вещества SRFM в качестве биомаркера у пациентов с диагнозом БП посредством измерения его концентрация в крови не раскрыта в проанализированном уровне техники.

Из патента РФ №2567665 известен способ диагностики нейродегенеративных заболевания у индивидуума, в котором определяют уровень двухцепочечной РНК-зависимой протеинкиназы (PKR) в биологическом образце индивидуума, в частности в образце цереброспинальной жидкости и на основании этого делают вывод, страдает ли индивидуум нейродегенеративным заболеванием.

В статье (Goutman SA et al. Recent advances in the diagnosis and prognosis of amyotrophic lateral sclerosis. Lancet Neurol, 2022, 21(5), 480-493) показана возможность диагностики бокового амиотрофического склероза (БАС) с использованием следующих биомаркеров: фосфорилированная тяжелая цепь нейрофиламента (NfH) в спинномозговой жидкости и легкая цепь нейрофиламента (NfL) в плазме, сыворотке или спинномозговой жидкости. Концентрации фосфорилированного NfH и концентрации NfL повышены у лиц с боковым амиотрофическим склерозом по сравнению со здоровыми людьми из контрольной группы. Более высокие концентрации NfL и фосфорилированного NfH коррелируют с более агрессивным течением заболевания. Однако, из статьи (Gafson AR et al. Neurofilaments: neurobiological foundations for biomarker applications. Brain 2020; 143: 1975-98) известно, что повышенные концентрации нейрофиламентов характерны для нейродегенеративных заболеваний в целом, поэтому эти биомаркеры несмотря на свою диагностическую значимость для БАС не обладают достаточной специфичностью, но могут быть использованы в сочетании с другими методами диагностики БАС.

В нейротравматологии биохимические маркеры используют в дополнение к клинико-инструментальным методам и способам нейромониторинга и нейровизуализации для более точного определения тяжести первичных и вторичных повреждений мозга, эффективности проводимого лечения и оценки прогноза исходов лечения пострадавших с черепно-мозговой травмой (Sosnovsky Е.А., Puras J.V., Talypov А.Е. Biochemical markers of head injury. Russian journal of neurosurgery. 2014;(2):83-91. (In Russ.)). В статье (Mondello S et al. Blood-Based Protein Biomarkers for the Management of Traumatic Brain Injuries in Adults Presenting to Emergency Departments with Mild Brain Injury: A Living Systematic Review and Meta-Analysis. Journal of Neurotrauma, 2017, 38 (8), 1086-1106) описаны биомаркеры черепно-мозговой травмы (ЧМТ), для которых доступны многообещающие научные доказательства аналитической и клинической достоверности и которые, следовательно, могут быть быстро перенесены в клиническую практику: кальций-связывающий белок S100 В (S100B), глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP), нейрон-специфическая энолаза (NSE), убиквитин С-концевая гидролаза-L1 (UCH-L1), а также тау-белки и белки нейрофиламента.

Недостатком всех вышеперечисленных способов диагностики болезней с применением биомаркеров являются узкоспециализированная диагностическая направленность биомаркеров, которая выявляет одно или несколько специфических заболеваний человека.

Таким образом, техническая проблема, на решение которой направлено настоящее изобретение, связанное с измерением концентрации физиологически активного вещества SRFM с брутто-формулой C21H31N7O9, а именно (4S,7S,10S,13S)-4-((1H-имидазол-4-ил)метил)-13-карбамоил-10-(2-карбоксиэтил)-7-метил-2,5,8,11-тетраоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-овая кислота), в плазме крови индивидуума, заключается в диагностировании широкого круга нейродегенеративных нарушений и заболеваний, что позволяет заблаговременно принять меры по их лечению.

Технический результат изобретения заключается в применении физиологически активного вещества SRFM, как биомаркера для диагностики нейродегенеративных нарушений и болезней человека, основанное на измерениях концентрации SRFM в плазме крови пациента. Изобретение позволяет как диагностировать текущее нейродегенеративное нарушение или заболевание, так и выявлять такие нарушения или болезни на ранних стадиях развития, в том числе протекающие бессимптомно, и позволяет заблаговременно принять меры по их лечению.

Для реализации настоящего изобретения проводится мониторинг значений концентрации SRFM в плазме крови у индивидуума. Уровень концентрации SRFM в плазме крови у индивидуума с диагностированным нарушением или заболеванием определяется достоверно ниже по сравнению с уровнем концентрации SRFM в плазме крови у здорового индивидуума.

Если значение концентрации SRFM в плазме крови у индивидуума падает со временем, то диагностируется нейродегенеративное нарушение или протекающей патологический процесс, в том числе бессимптомно.

Диагностика с помощью применения физиологически активного вещества SRFM включает нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, синдром мягкого когнитивного снижения (МКС), синдром бокового амиотрофического склероза (БАС), а также наличие нейродегенеративных нарушений при черепно-мозговых травмах (ЧМТ).

Для каждого из этих типов заболеваний и нарушений концентрация SRFM в плазме крови индивидуума будет достоверно ниже нормы, определяемой у здорового индивидуума. При осложненном течении данных заболеваний и нарушений концентрация SRFM в плазме крови индивидуума может падать ниже пределов детекции (регистрации сигнала SRFM), что характеризует тяжесть протекающего заболевания.

Применение SRFM как биомаркера позволяет диагностировать наличие патологического процесса у индивидуума по достоверному снижению концентрации SRFM по сравнению с референсным значением и заблаговременно принять меры по определению типа заболевания и его дальнейшему лечению.

Референсным значением в соответствие с определением Медицинского Словаря для профессиональных медицинских работников (Medical Dictionary for the Health Professions and Nursing. Farlex Partner Medical Dictionary. (2012), ссылка: https://medical-dictionary.thefreedictionary.com/reference+value) называют такое значение или такой набор значений лабораторного теста, который наблюдается у 95% группы людей с определенным состоянием здоровья. Референсные значения используются для интерпретации результатов теста и состояния здоровья человека. Референсные значения теста представляют собой нормальный диапазон значений для конкретного результата теста, состояния, симптома или поведения и может отличаться в зависимости от возраста, роста, пола, этнической принадлежности или культуры пациента.

Регулярный мониторинг концентрации SRFM в плазме крови позволяет определить риск развития патологического процесса. Если концентрация SRFM в плазме крови падает с течением времени (месяцы, годы), то у индивидуума выявляется скрытый или выраженный патологический процесс, который следует диагностировать и принять меры к его устранению. Таким образом, концентрация норма концентрации SRFM будет снижаться при развитии нейродегенеративных нарушений и заболеваний центральной нервной системы.

Снижение уровня SRFM в плазме крови у индивидуума по сравнению с референсным значением более чем на 20% считается показателем вероятности наличия патологического процесса и требует дальнейшего мониторинга концентрации SRFM во времени.

Снижение уровня SRFM в плазме крови у индивидуума по сравнению с референсным значением двухкратно и более считается показателем высокой вероятности наличия патологического процесса и необходимости дальнейшего мониторинга концентрации SRFM во времени. Обычно, но необязательно, такое снижение концентрации SRFM уже сопровождается клинической симптоматикой.

Измерение концентрации физиологически активного вещества SRFM в крови основано на применении метода ВЭЖХ-МС с детектированием ионов SRFM и его характеристических фрагментов (Фиг. 1, 2). Пробоподготовка заключается в выделении вещества SRFM из плазмы крови. Предварительно в пробу плазмы крови добавляют химически идентичный молекуле SRFM, но отличный по изотопной композиции, внутренний стандарт (Фиг. 1А и 1Б) в известной концентрации до конечной концентрации от 500 пг/мл до 1000 пг/мл. К образцу плазму крови с внутренним стандартом добавляют семь объемов смеси органический растворителей (метанол, ацетонитрил и вода в объемных отношениях 7:2:1) и инкубируют в течение 10 минут при температуре 40°С в течение 10 минут. Затем полученную взвесь центрифугируют при 15000 g при температуре 10°С в течение 10 минут, полученную надосадочную жидкость (органический слой) переносят к 5 мл охлажденного 2,5% водного раствора гидроксида аммония для получения первичного экстракта. Из полученного раствора экстрагируют SRFM вместе с внутренним стандартом (Фиг. 1 и Фиг. 2) метод твердофазной экстракции на смешанном анион-обменном крупнопористом носителе (количеств носителя не должно быть менее 30 мг), который предварительно кондиционируют последовательно в метаноле, затем в ацетонитриле, затем в воде (все растворители однократно по 1 мл), затем сенсибилизируют в 2 мл водного раствора 2,5% гидроксида аммония (не охлажденный), после чего наносят первичный экстракт на сенсибилизированный носитель. Затем носитель промывают последовательно в 1 мл 2,5% гидроксида аммония (не охлажденный), в 1 мл воды, в 2 мл 60% метанола (охлажденного). Носитель немного подсушивают при -5 мм рт.ст., а затем проводят элюция SRFM и внутреннего стандарта в 700 мкл 3% муравьиной кислоты в ацетонитриле. Полученный экстракт переводится в водную фазу через выпаривание органической фазы (ацетонитрила) под вакуумом при температуре не выше 45°С, затем восстановленный в водном растворе 0,5% муравьиной кислоты сухой остаток можно использовать для ВЭЖХ-МС анализа. Нижним пределом количественного обнаружения SRFM в условиях ВЭЖХ-МС является 25 пг/мл, нижним пределом обнаружения сигнала (предел детекции) является 10 пг/мл.

Возможны другие варианты измерения концентрации вещества SRFM в плазме крови и методики пробоподготовки без отклонения от основных аспектов изобретения и позволяющих достоверно определять концентрацию SRFM в диапазоне от 0 до 5000 пикограммов на миллилитр (пг/мл). Специалисту в данной области техники будет понятно, что изменения могут быть сделаны в вариантах осуществления, конкретно описанных в данной заявке, и все эти варианты, модификации и усовершенствования находятся в пределах объема и сущности изобретения.

Неожиданно было обнаружено, что применение вещества SRFM как биомаркера возможно только у человека и, предположительно, у высших приматов, поскольку только у человека SRFM обнаруживается как в норме, так и при патологии, в отличии от других млекопитающих, в частности грызунов, Зайцевых, псовых, кошачьих и др.

В проведенном исследовании установлено отсутствие физиологически активного вещества SRFM в крови здоровых мышей и крыс дикого типа, кроликов, а также в крови трансгенных мышей линии APP/PS1 с повышенной экспрессией бета-амилоида человека и используемых в качестве животной модели болезни Альцгеймера.

Таким образом, физиологически активное вещество SRFM не присутствует в крови исследованных лабораторных животных, и данные животные не представляют ценности для диагностики или прогноза патологических состояний и биологических процессов, связанных с секрецией SRFM.

Было определено, что концентрация SRFM в плазме крови здоровых людей находится в диапазоне 237-771 пг/мл в возрастной группе от 31 до 50 полных лет и на уровне 135-495 пг/мл в возрастной группе от 51 до 80 полных лет (Таблица 1). Широкий разброс значений может быть обусловлен вариацией возраста, генетикой, перенесенными ранее заболеваниями, образом жизни и другими биологическими и социокультурными факторами, поэтому физиологические пределы концентрации вещества SRFM в крови могут быть больше и составлять от 1 до 5000 пг/мл.

Определение концентрации SRFM в плазме крови двух возрастных групп (от 31 года до 50 полных лет и от 51 года до 80 полных лет) здоровых людей обусловлен особенностями дебюта, проявления и манифестации нейродегенеративных заболеваний и нарушений. Так, болезнь Альцгеймера (БА) и болезнь Паркинсона (БП) проявляются в возрасте после 60 лет и лишь у 5% - 10% людей дебют может проявляться в более раннем возрасте, однако в таком случае чаще всего он обусловлен наследственными причинами (данные по всему миру от Национального Института Старения (США) NIH National Institute on Aging в последней редакции от 14 апреля 2022 года и Медицинского Институт Джона Хопкинса (США)). В тоже время возраст диагностики и дебюта бокового амиотрофического склероза (БАС) составляет от 40 лет и в некоторых случаях (до 10%) даже ранее этого возраста (данные специалистов Национальной Клиники Специальной Хирургии США (HSS, Hospital for Special Surgery of the USA), дата доступа 02 марта 2023 года, ссылка https://www.hss.edu/condition-list_amyotrophic-lateral-sclerosis.asp) и Медицинского Институт Джона Хопкинса (США), дата доступа 02 марта 2023 года, ссылка https://www.hopkinsmedicine.org/health/conditions-and-diseases/amYotrophic-lateral-sclerosis-als). Причины черепно-мозговых травм (ЧМТ) лежат за пределами возрастных ограничений, так как они возникают в следствие либо механических травм и повреждение, либо как следствие инфекционных заболеваний, в том числе, перенесенных субклинических инфекций. Таким образом, ЧМТ охватывает широкий круг возрастных групп и укладывается в общий диапазон от 31 до 80 лет целевой потенциальной аудитории.

В проведенном исследовании концентрация SRFM в плазме крови у пациентов в возрасте от 62 до 84 лет с диагнозом болезни Альцгеймера определялся в диапазоне 39-111 пг/мл (Таблица 2). На умеренной стадии развития болезни Альцгеймера уровень SRFM в плазме крови определялся в диапазоне 67-111 пг/мл. На тяжелой стадии развития болезни Альцгеймера концентрация SRFM в плазме крови определялся в диапазоне 39-83 пг/мл. При этом концентрация SRFM в плазме крови недементных добровольцев в возрасте от 51 до 80 лет определялся в диапазоне от 135 до 495 пг/мл.

Таким образом, показано, что концентрация SRFM в крови дементных пациентов с прижизненным диагнозом болезни Альцгеймера значительно снижена по сравнению с недементными добровольцами из симметричной возрастной когорты, и при этом возможно выявить степень тяжести данного заболевания.

В проведенном исследовании концентрация SRFM у пациентов с диагнозом болезнь Паркинсона в возрасте от 55 до 77 лет составлял от 35 до 101 пг/мл (Таблица 3). При этом концентрация SRFM в плазме крови недементных добровольцев в возрасте от 51 до 80 лет составлял от 135 до 495 пг/мл.

Таким образом, показано, что концентрация SRFM в крови пациентов с прижизненным диагнозом болезни Паркинсона значительно снижена по сравнению с недементными добровольцами из симметричной возрастной когорты.

В проведенном исследовании концентрация SRFM у пациентов с диагнозом бокового амиотрофического склероза (БАС) в возрасте от 31 до 47 лет составляла от 51 до 118 пг/мл (Таблица 4). У пациентов на II стадии БАС уровень концентрации SRFM был выше 90 пг/мл, а у пациентов на III и IVa стадиях БАС этот уровень не превышал 76 пг/мл. При этом уровень SRFM в плазме крови здоровых добровольцев в возрасте от 31 до 50 лет составил от 237 до 771 пг/мл.

Таким образом, показано, что концентрация физиологически активного вещества SRFM в крови пациентов с клиническим диагнозом БАС значительно снижена по сравнению со здоровыми добровольцами, и при этом имеется различие в уровне концентрации SRFM между стадиями заболевания чем выше стадия БАС, тем меньше уровень SRFM.

В проведенном исследовании концентрация SRFM у пациентов с черепно-мозговыми травмами в возрасте от 32 до 68 лет составляла от 61 до 98 пг/мл (Таблица 5).

При этом концентрация SRFM в плазме крови здоровых добровольцев в возрасте от 31 до 73 лет составляла 135 до 771 пг/мл.

Таким образом, показано, что концентрация SRFM в крови пациентов с черепно-мозговыми травмами значительно снижена по сравнению со здоровыми добровольцами.

В проведенном исследовании четырех пациентов с первоначальным диагнозом синдрома мягкого когнитивного снижения (МКС) определяли концентрацию вещества SRFM в образцах плазмы крови на протяжении пяти лет каждые полгода (всего 10 визитов с допустимым окном в 20 (двадцать) календарных дней, или ±10 (десять) календарных дней от даты очередного планового визита). Через пять лет двум пациентам из этой когорты был поставлен диагноз болезни Альцгеймера, другие два пациента оставались с диагнозом МКС. Из анализа изменения концентрации вещества SRFM в плазме крови пациентов с диагнозом МКС с течением времени (Таблица 6) установлено, что монотонное падение концентрации SRFM в крови пациентов ассоциировано с прогрессированием деменции от мягкого когнитивного снижения (МКС) до ранних стадий болезни Альцгеймера. Таким образом, по уровню SRFM можно выявить динамику развития заболевания и тяжесть его течения.

Описание фигур

Фиг. 1. Измерения уровня SRFM методом ВЭЖХ-МС в плазме крови. (А) композитный сигнал внутреннего стандарта с двумя замещенными изотопами [¹³С₂] атома углерода ([¹³C₂]-SRFM) и физиологически активного вещества SRFM, зарегистрированные в пробе плазмы крови ЭДТА-2К⁺ пациента ПЕА (идентификатор пациента LFM0643G004, возраст 60 лет, Ж) в режиме мониторинга множественных реакций (SRM). Концентрация внутреннего стандарта [¹³C₂]-SRFM, внесенного в пробу перед началом аналитической подготовки, составляла C_s=1 нг/мл; измеренная концентрация вещества SRFM в пробе плазмы крови пациента LFM0643G004 составила C_e=0.789 нг/мл. (Б) спектр фрагментных ионов b1, b2, b3 и a1 внутреннего стандарта [¹³C₂]-SRFM со сдвигом массы Δm=2.0067 u. (В) и соответствующих фрагментных ионов вещества [¹³C₂]-SRFM в плазме крови пациента.

Фиг. 2. Хроматограммы изолированного ионного тока родительского иона внутреннего стандарта [¹³C₂]-SRFM с m/z=528.2329 и зарядом z=1⁺ в концентрации C_s=1 нг/мл и родительского иона вещества SRFM с m/z=526.2256 и зарядом z=1⁺ в концентрации C_e=0.789 нг/мл, измеренной в пробе плазмы крови пациента LFM0643G004.

Изобретение иллюстрируется нижеприведенными примерами, но не ограничивается ими.

Пример 1. Определение концентрации SRFM в плазме крови здоровых добровольцев.

Забор венозной крови проводили у здоровых добровольцев (возрастные группы от 31 до 50 полных лет и от 51 до 80 полных лет; возрастной интервал генерализованной выборки от 31 до 80 полных лет) и затем готовили аликвоты плазмы крови (ЭДТА-2К⁺), которые замораживали для длительного хранения.

Регистрацию сигнала SRFM в плазме крови (ЭДТА-2К⁺) проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС) в режиме положительной электростатической ионизации и тандемного или адресного сканирования по прекурсорному и фрагментным ионам. Количественную оценку проводили по площади или высоте хроматографического пика изолированного ионного тока прекурсорного иона или базового фрагментного иона-квантора вещества SRFM в плазме крови и соответствующего ему внутреннего стандарта [¹³C₂]-SRFM, химически идентичного SRFM, но отличающегося по изотопному составу из-за включения двух изотопов [¹³С₂] атома углерода, то есть отличного от физиологически активного вещества [¹³C₂]-SRFM на +2.00671 атомных единиц массы (Фиг. 1, 2).

Выделение физиологически активного вещества SRFM проводили из плазмы крови, предварительно добавив в нее внутренний стандарт [¹³C₂]-SRFM в известной концентрации (в пределах от 100 пг/мл до 1000 пг/мл). Выделение SRFM вместе с внутренним стандартом [¹³C₂]-SRFM осуществляли последовательно путем жидкостной экстракции в смеси растворителей (метанол, ацетонитрил, вода) и твердофазной экстракции на смешанном анион-обменном крупнопористом носителе с конечной элюцией в закисленном органическом растворителе (ацетонитриле). Полученный экстракт переводили в водную фазу через выпаривание органической фазы под вакуумом, затем восстановленный в слабом кислом водном растворе сухой остаток использовали для ВЭЖХ-МС анализа.

Таким образом, аликвоту плазмы крови после необходимых лабораторных процедур, направленных на получение обогащенной по веществу SRFM фракции, анализировали количественным методом масс-спектрометрии с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии и внутреннего стандарта с включением изотопов атома углерода.

Было определено, что концентрация SRFM в исследованных образцах (N=30) составляла от 135 до 771 пг/мл (Таблица 1). Погрешность всех измерений составляла не более 10% на нижних уровнях измерение (от 25 до 100 пг/мл) и не более 5% на средних и верхних уровнях измерений (более 100 пг/мл, но менее 5000 пг/мл).

Пример 2. Концентрация SRFM в крови пациентов с диагнозом болезнь Альцгеймера.

С использованием количественного метода анализа концентрации физиологически активного вещества SRFM в соответствии с Примером 1 установлено, что у десяти пациентов с диагнозом болезни Альцгеймера в возрасте от 62 до 84 лет уровень концентрации SRFM составил от 39 до 111 пг/мл (Таблица 2). При этом у пациентов на умеренной стадии болезни Альцгеймера уровень концентрации SRFM составлял от 67 до 111 пг/мл, а у пациентов с тяжелой стадией (Таблица 2) этот уровень составлял от 39 до 83 пг/мл.

Аналогичный анализ концентрации SRFM в крови пятнадцати здоровых добровольцев в возрасте от 51 года до 80 лет выявил, что у таких добровольцев концентрация SRFM составляла от 135 до 495 пг/мл.

Таким образом, показано, что концентрация SRFM в крови дементных пациентов с прижизненным диагнозом болезни Альцгеймера значительно снижена по сравнению с недементными добровольцами из симметричной возрастной когорты, и при этом имеется существенное различие между пациентами с болезнью Альцгеймера на умеренной и тяжелой стадиях заболевания.

Таблица 2. Концентрация SRFM в плазме крови пациентов (N=10) с диагнозом болезни Альцгеймера (на умеренной (N=5) и тяжелой стадиях (N=5)) и симметричных по возрасту здоровых добровольцев (N=15). Гомогенность по возрасту между группами F=1.355, р=0.257.

Пример 3. Концентрация SRFM в крови пациентов с диагнозом болезнь Паркинсона.

С использованием количественного метода анализа концентрации SRFM в соответствии с Примером 1 установлено, что у девяти пациентов с диагнозом болезни Паркинсона в возрасте от 55 до 77 лет уровень концентрации SRFM составил от 35 до 101 пг/мл (Таблица 3). Аналогичный анализ концентрации SRFM в крови пятнадцати недементных добровольцев в возрасте от 51 года до 80 лет выявил, что концентрация SRFM составляла от 135 до 495 пг/мл.

Таким образом, показано, что концентрация SRFM в крови пациентов с прижизненным диагнозом болезни Паркинсона значительно снижена по сравнению с недементными добровольцами из симметричной возрастной когорты.

Пример 4. Концентрация SRFM в крови пациентов с диагнозом бокового амиотрофического склероза (БАС).

С использованием количественного метода анализа концентрации SRFM в соответствии с Примером 1 установлено, что у десяти пациентов с диагнозом БАС в возрасте от 31 до 47 лет уровень концентрации SRFM составил от 51 до 108 пг/мл (Таблица 4). При этом у пациентов на II стадии БАС (N=5) уровень концентрации SRFM был выше 90 пг/мл, а у пациентов на III и IVa стадиях БАС (N=5) этот уровень не превышал 76 пг/мл.

Аналогичный анализ концентрации SRFM в крови пятнадцати здоровых добровольцев в возрасте от 31 до 50 лет выявил, что у таких добровольцев концентрация SRFM составляла от 237 до 771 пг/мл.

Таким образом, показано, что концентрация SRFM в крови пациентов с диагнозом БАС значительно снижена по сравнению со здоровыми добровольцами, и при этом имеется различие в уровне концентрации SRFM между стадиями заболевания: чем выше стадия БАС, тем меньше уровень SRFM.

Пример 5. Концентрация SRFM в крови пациентов с черепно-мозговыми травмами (ЧМТ).

С использованием количественного метода анализа концентрации SRFM в соответствии с Примером 1 установлено, что у двенадцати пациентов с ЧМТ в возрасте от 32 до 68 лет уровень концентрации SRFM составлял от 61 до 98 пг/мл (Таблица 5).

Аналогичный анализ концентрации SRFM в крови восемнадцати здоровых добровольцев в возрасте от 31 до 73 лет выявил, что у таких добровольцев концентрация SRFM составляла от 135 до 771 пг/мл.

Таким образом, показано, что концентрация SRFM в крови пациентов с ЧМТ значительно снижена по сравнению со здоровыми добровольцами, и при этом имеется различие в уровне концентрации SRFM между стадиями заболевания: чем выше стадия БАС, тем меньше уровень SRFM.

Пример 6. Уровень секреции SRFM во времени (лонгитудинальное исследование) в крови пациентов с синдромом мягкого когнитивного снижения (МКС).

С использованием метода ВЭЖХ-МС аналогично Примеру 1 определяли концентрации SRFM во времени в плазме крови у пациентов с синдромом МКС.

Были отобраны четверо пациентов с установленным синдромом МКС, которых наблюдали в течение 5 лет (10 визитов) с интервалом 6 месяцев (с допустимым окном в 20 дней от даты очередного планового визита). Во время каждого планового визита у каждого пациента проводили измерение концентрации циркулирующего в плазме крови SRFM и наличие прогрессирования синдрома МКС. Оценивали память, внимание, концентрация, восприятие информации, логическое мышление и др.

У двух пациентов (LFM0163G001, LFM0163G003) с синдромом МКС при их осмотре когнитивные функции не снижались с течением времени на протяжении 5 лет обследования (Таблица 6). При этом у пациента LFM0163G001 уровень SRFM упал с 141 до 120 пг/мл за все время наблюдения. У пациента LFM0163G003 уровень SRFM упал с 125 до 96 пг/мл. Изменения уровня SRFM для пациентов составило не более 20% за каждые 6 месяцев наблюдения.

У двух пациентов (LFM0163G002, LFM0163G004) с синдромом МКС при их осмотрах на протяжении 5 лет когнитивные функции были снижены по сравнению с контрольным (первым визитом) обследованием, при этом уровень секреции SRFM падал более чем на 20% между обследованиями. Через 2 года исследования в 2019 году пациентам был поставлен диагноз болезнь Альцгеймера (G30.0 по МКБ-10), а уровень SRFM за это время снизился двухкратно для пациента LFM0163G002 и полуторакратно для пациента LFM0163G004. Причем уровень секреции SRFM продолжил снижаться при дальнейшем наблюдении, а на полугодовых осмотрах (визитах) наблюдалось прогрессирующее снижение когнитивных функций.

Таким образом, по изменению уровня SRFM можно выявить динамику развития заболевания и тяжесть его течения.

Пример 7. Уровень SRFM в крови лабораторных животных.

С использованием метода ВЭЖХ-МС в соответствии с Примером 1 определяли концентрации SRFM в плазме крови лабораторных животных четырех экспериментальных групп, в каждой из которых самки и самцы были представлены в равных пропорциях (50% самок и 50% самцов): здоровые мыши (N=6), крысы (N=6), кролики (N=6) породы Советская Шиншилла и группа трансгенных мышей линии APP/PS1 (N=6) с повышенной экспрессией бета-амилоида человека и используемых в качестве животной модели болезни Альцгеймера.

В каждой из четырех групп экспериментальных животных уровень SRFM оказался ниже нижнего предела количественного обнаружения (ниже 25 пг/мл).

Таким образом, физиологически активное вещество SRFM не присутствует в крови исследованных лабораторных животных, и данные животные не представляют ценности для диагностики или прогноза патологических состояний и биологических процессов, ассоциированных с секрецией SRFM.

Изобретение относится к медицине, медицинской диагностике и касается применения вещества (4S,7S,10S,13S)-4-((1H-имидазол-4-ил)метил)-13-карбамоил-10-(2-карбоксиэтил)-7-метил-2,5,8,11-тетраоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-овая кислота (SRFM) как биомаркера крови для диагностики нейродегенеративных нарушений и заболеваний человека путём измерений концентрации SRFM в плазме крови индивидуума. Уровень концентрации SRFM в плазме крови у индивидуума с диагностированным заболеванием достоверно ниже по сравнению с уровнем концентрации SRFM в плазме крови у здорового индивидуума. Если значение концентрации SRFM в плазме крови у индивидуума падает со временем, то диагностируется нейродегенеративное нарушение или протекающей патологический процесс, в том числе бессимптомно. Технический результат: эффективная диагностика нейродегенеративных нарушений и заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, синдром мягкого когнитивного снижения, синдром бокового амиотрофического склероза, черепно-мозговые травмы, в том числе на ранних стадиях и протекающих бессимптомно. 5 з.п. ф-лы, 2 ил., 6 табл., 7 пр.

1. Применение вещества (4S,7S,10S,13S)-4-((1H-имидазол-4-ил)метил)-13-карбамоил-10-(2-карбоксиэтил)-7-метил-2,5,8,11-тетраоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-овая кислота (SRFM) как биомаркера крови для диагностики нейродегенеративных нарушений и заболеваний человека путём измерений концентрации SRFM в плазме крови индивидуума.

2. Применение по п. 1, в котором диагностику проводят путем сравнения измеренного значения концентрации SRFM в плазме крови пациента с референсным значением концентрации SRFM в плазме крови в норме.

3. Применение по п. 1 или 2, в котором референсное значение концентрации SRFM в плазме крови в норме находится в диапазоне от 135 до 771 пикограммов в миллилитре.

4. Применение по п. 2 или 3, в котором сниженный уровень SRFM в плазме крови у индивидуума по сравнению с указанным референсным значением концентрации SRFM в плазме крови в норме является показателем вероятности наличия патологического процесса.

5. Применение по любому из пп. 2-4, в котором снижение концентрации SRFМ в плазме крови у индивидуума, установленное в результате мониторинга концентрации SRFM в плазме крови в течение года или более, до концентрации ниже указанного референсного значения концентрации SRFM в плазме крови в норме является признаком нейродегенеративного процесса.

6. Применение по п. 1, в котором нейродегенеративные нарушения и заболевания представляют собой болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, синдром мягкого когнитивного снижения, синдром бокового амиотрофического склероза, черепно-мозговые травмы.