Способ увеличения продолжительности хранения производственного 146S иммуногенного компонента антигена вируса ящура Российский патент 2024 года по МПК A61K39/135 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и производству вакцинных препаратов, а именно было разработано для увеличения продолжительности хранения производственного 146S иммуногенного компонента антигена вируса ящура.

Одной из самых сложных задач в разработке белковых препаратов является борьба с физической и химической неустойчивостью белков. В последние три десятилетия было проведено множество исследований, охватывающих детальное изучение процессов упаковывания и разворачивания белковых молекул, механизмы химической и физической неустойчивости белков и различные способы их стабилизации [1-9].

При длительном хранении суспензий инактивированного антигена культурального вируса ящура отмечается значительное снижение концентрации 146S иммуногенных компонентов антигена за счет диссоциирования вирионов до 12S компонента с сопутствующим снижением иммуногенности готового препарата. Стабильность вирионов в сырье для противоящурных вакцин оценивают по степени сохранности 146S иммуногенного компонента антигена с использованием серологических методов количественного определения 146S и 12S частиц.

Вирусные белки могут быть стабилизированы за счет изменения их структуры, либо посредством преобразования среды, в которой они находятся. Структурные перестройки сопровождаются изменением внутренней энергии системы [10]. Существуют различные подходы к внутренней стабилизации нативных белков. Так, при увеличении внутренней гидрофобности протеинов повышается эффективность фолдинга и стабильности молекулы. Стабильность нативных белков также определяется количеством водородных связей между аминокислотами в составе протеина, особенно в критических точках [11-15]. Увеличение количества внутримолекулярных связей при формировании вторичной структуры белка также играет ключевую роль для дальнейшей стабилизации системы. Рост плотности заряда молекулы белка, по данным исследователей, дестабилизирует его [14]. Таким образом, механизмы внутренней стабилизации протеинов вызывают преобразования в пространственном расположении белковых молекул, что, в свою очередь, влечет за собой нежелательное изменение их биологических функций.

Для сохранения требуемой конфигурации и повышения стабильности белков исследователи предлагают использование механизмов внешней стабилизации, которые заключаются в усилении протеинстабилизирующих сил и ликвидации денатурирующих факторов. По данным ранее проведенных испытаний, стабильность полных вирусных частиц возможно увеличить благодаря использованию различных консервантов, в частности, ди- и полисахаров, полиолов, сывороточных белков, сурфактантов, ПЭГов. При этом следует отметить, что стабилизирующий эффект этих наполнителей сильно отличается друг от друга [1-9].

Защиту белковых молекул от денатурации и конформационных изменений обеспечивают дисахара, которые предотвращают разворачивание спиралей белка, образуя с его молекулами стабильные водородные связи. Из Сахаров рекомендуют применять сахарозу, трегалозу, декстрозу, маннит и маннозилглицерат [10]. По данным Arakawa et al. (1984) [11], для достижения стабилизирующего эффекта в белковых системах требуется использование сахарозы с концентрацией не менее 0,3 М. Timasheff et al. (1993) [12] предлагают применение 1 М сахарозы для защиты белковых молекул от диссоциации. Для стабилизации также применяют комплекс из лактозы, сахарозы, трегалозы и маннита [2]. Другие авторы обеспечивают стабильностьбелков за счет применения 20% декстрозы или 50% глицерина, а также 5% маннита в готовом продукте [6-8].

Для стабилизации полных частиц вируса ящура зарубежные исследователи применяли комплексы из сахарозы и бычьего сывороточного альбумина (BSA) [11-13]. Так, для длительного сохранения 146S иммуногенного компонента антигена вируса ящура штамма «O₁/Манисса» оптимально подходит использование смеси, состоящей из 30% сахарозы и 1% BSA. Для стабилизации 146S антигена вируса ящура штамма «А №2029/Турция/2006» действенно применение смеси из 30% сахарозы и 0,3% BSA, для штаммов «А₂₂ Ирак 24/64», «Азия-1 №1946 /Шамир Израиль/89» -30% сахарозы и 1% BSA [2-4].

По данным исследователей, окислительной деградации белковых молекул препятствуют также многоатомные спирты, а именно этиленгликоль и глицерол [9].

Некоторые исследователи отмечают, что не все белки могут стабилизироваться под влиянием Сахаров и полиолов [12]. Кроме того, не всегда рекомендуется использовать именно дисахара, поскольку их функциональные группы могут взаимодействовать с аминогруппами белков.

Для стабилизации белковых молекул применяют также неионогенные поверхностно-активные вещества (ПАВ), в частности, Tween-20, Tween-80, тритон Х-100, Pluronic F68, Pluronic F127 [5]. Из широкого спектра сурфактантов наиболее часто применяют Tween-20, который может препятствовать химической деградации протеинов за счет взаимодействия с белковыми сайтами денатурации. Следует отметить, что не все сурфактанты способны стабилизировать белковые молекулы в суспензии. Кроме того, некоторые ПАВ, в частности, Tween-80, могут быть загрязнены алкилированными пероксидами, которые ускоряют процесс окисления белков [2,5,15].

При этом все эти соединения не позволяют хранить антиген вируса ящура без разрушения более 4 месяцев при температуре 4-8°С.Из представленных способов увеличения сохранности антигена вируса ящура наиболее близким прототипом является комплекс из 30% сахарозы и 1% BSA [9]. Однако, данный способ имеет существенный недостаток - не обеспечивает длительную сохранность антигена вируса ящура. Спустя 1 месяц хранения в данных условиях наблюдается разрушение 146S иммуногенного компонента антигена вируса ящура и увеличение 12S частиц на 30-50%. Кроме того, сахароза и BSA являются питательными компонентами для микрофлоры, что повышает риски роста бактерий и грибов в готовом препарате.

В связи с этим целесообразно провести разработку способа увеличения продолжительности хранения производственного антигена вируса ящура. Для решения поставленной задачи требуется подобрать комплекс соединений с определенным содержанием активных соединений, что даст возможность увеличить продолжительность хранения производственного 146S антигена вируса ящура без разрушения иммуногенного компонента для изготовления вакцинных препаратов и не будет повышать риски микробной контаминации конечного продукта.

В настоящее время для подавления агрегации некоторых белков используются современные низкомолекулярные соединения, такие как циклодекстрины [6, 7]. Они являются природными циклическими олигосахарами, включающими 6, 7, 8 α-D-глюкозильные остатки. Гидроксильные группы у второго и третьего атомов углерода образуют прочные внутримолекулярные водородные связи, которые стабилизируют форму молекулы и обуславливают низкую растворимость циклодекстринов (ЦД) в воде [14]. Растворимость β-ЦД в воде составляет 1,6 г/л. Для повышения их растворимости в водной среде проводят химическую модификацию вторичных гидроксильных групп, что вызывает разрыввнутримолекулярных водородных связей и многократно повышает гидрофильность.

Для увеличения продолжительности хранения 146S антигена вируса ящура до 4 лет предлагается использовать модифицированное производное циклодекстрина - 2-гидроксипропил-β-циклодекстрин (ГПЦД). Данный сахарид обладает способностью связываться с остатками ароматических аминокислот в частично развернутых формах белковых молекул, что вызывает подавление процесса агрегации. ГПЦД стабилен в щелочной среде и подвергается гидролизу до глюкозы в сильнокислой среде [7].

Благодаря наличию гидрофобной полости и полярной поверхности ГПЦД в водных растворах образует комплексы с неполярными соединениями (масляными эмульсиями) за счет гидрофобных взаимодействий. Представленное соединение нашло применение в фармацевтической сфере для стабилизации белковых комплексов, является хорошо растворимым агентом и безопасным при парентеральном введении [6].

В фармацевтической промышленности для косметических препаратов применяют полиэтиленгликоль (ПЭГ), однако, чаще всего, с высоким молекулярным весом, в частности, ПЭГ-6000 [16]. По своей природе, данные соединения являются гидрофобными веществами, которые формируют связи с гидрофобными боковыми цепями протеина. Для стабилизации антигена вируса ящура предлагается добавление в суспензию низкомолекулярного ПЭГ-300, поскольку, по литературным данным, он обладает самой высокой гидрофобностью из широкого спектра ПЭГов (ПЭГ-300, ПЭГ-400, ПЭГ-1000, ПЭГ-4000). Точный механизм стабилизации белковых молекул с помощью ПЭГ не известен [5].

Известен водный раствор будесонида противовоспалительного действия, который содержит будесонид, пропиленгликоль, полиэтиленоксид, бензойную кислоту, янтарную кислоту, трилон Б, нипазол, тиомочевину и воду. Раствор может дополнительно содержать 2-гидроксипропил-β-циклодекстрина. Изобретение обеспечивает стабильность в течение 2 лет при сохранении терапевтического действия [17].

Известен раствор стабилизирующего дигидрокверцетина, в состав которого входят дигидрокверцетин в количестве 0,1-30,0 мас. %, 2-гидроксипропил-бета-циклодекстрин в количестве 0,01-25,0 мас. %, пропиленгликоль и/или глицерин, и/или ПЭГ 400 в количестве 1,0-70,0 мас. %, пищевые органические кислоты или их водорастворимые соли в количестве 0,1-3,0 мас. %), углеводы в количестве 0,01-30,0 мас. % и дистиллированную воду. Заявленное изобретение обеспечивает получение раствора дигидрокверцетина для длительного хранения [18].

Известна фармацевтическая композиция в форме раствора для инъекций, обладающая ноотропной активностью, и способ ее получения [19]. Раствор готовят путем растворения фенотропила и 2-гидроксипропил-β-циклодекстрина в воде для инъекций с последующей фильтрацией, предпочтительно через фильтр с размерами пор не более - 0,3 мкм и последующей термической стерилизацией. Недостатком данной формы является использование спирта этилового в составе инъекционного раствора. Использование спирта может привести к нежелательным побочным эффектам, кроме того, этиловый спирт относится к горючим веществам и его использование может привести к возгоранию, т.к. при запайке ампул используется открытое пламя.

Известен водорастворимый в форме порошка комплекс включения ДГК и бета-циклодекстрин с молярным соотношением компонентов 1:1 [20]. Комплекс получают взаимодействием ДГК с бета-циклодекстрином в водной деионизированной среде с последующей кристаллизацей полученного продукта. Полученный комплекс хранят в виде порошка, который перед использованием растворяют в физиологическом растворе в заданной концентрации. Способ получения водорастворимого комплекса многостадиен, дорог и не решает проблемы длительного хранения комплекса в водных растворах.

Недостатками всех перечисленных решений являются нестабильность 2-гидроксипропил-β-циклодекстрина при длительных сроках хранения в растворителях (спирт, вода и др.) и высокие, небезопасные для здоровья концентрации поверхностно-активных веществ (Твин-80 и др.) [20, 21].

Задачей настоящего изобретения является разработка способа увеличения продолжительности хранения производственного 146S иммуногенного компонента антигена вируса ящура с целью устранения вышеуказанных недостатков.

Данная задача решена благодаря разработки способа увеличения продолжительности хранения производственного 146S иммуногенного компонента антигена вируса ящура с применением комплекса, состоящего из стерильного 2-гидроксипропил-β-циклодекстрина с концентрацией 0,7% и полиэтиленгликоля-300 с концентрацией 1,2% в готовом препарате антигена.

Разработанный способ дает возможность при хранении 146S иммуногенного компонента антигена вируса ящура до 4 лет при температуре 4-8°С: 1) увеличить время хранения производственного 146S иммуногенного компонента антигена вируса ящура до 4 лет, что в 12 раз дольше по сравнению с прототипом; 2) сохранять 146S иммуногенный компонент антигена вируса ящура с потерей за 4 года не более, чем на 3%; 3) предотвращать распад полных вирусных частиц до 12S компонента на 97%.

Сущность изобретения отражена на графических изображениях:

Фиг. 1 - Содержание (в %) 146S иммуногенного компонента антигена вируса ящура в готовом антигене через 4 года хранения при температуре 4-8°С при использовании прототипного и разработанного способов сохранности иммуногенного компонента антигена (предлагаемого изобретения).

Фиг. 2 - График антигенного профиля штамма «А/Иран/2018» вируса ящура до внесения стабилизатора (1) и спустя 4 года при хранении при температуре 4-8°С (2). Примечание: А - прототипный способ, Б -разработанный способ, красным цветом показан график для 146S иммуногенного компонента антигена вируса ящура.

Фиг. 3 - График антигенного профиля штамма «О/Кения/2017» вируса ящура до внесения стабилизатора (1) и спустя 4 года при хранении при температуре 4-8°С (2). Примечание: А - прототипный способ, Б -разработанный способ, красным цветом показан график для 146S иммуногенного компонента антигена вируса ящура.

Фиг. 4 - График антигенного профиля штамма «Азия-1 №2356/Пакистан/2018» вируса ящура до внесения стабилизатора (1) и спустя 4 года при хранении при температуре 4-8°С (2). Примечание: А -прототипный способ, Б - разработанный способ, красным цветом показан график для 146S иммуногенного компонента антигена вируса ящура.

Фиг. 5 - График антигенного профиля штамма «8АТ-1/Нигерия/2015» вируса ящура до внесения стабилизатора (1) и спустя 4 года при хранении при температуре 4-8°С (2). Примечание: А - прототипный способ, Б -разработанный способ, красным цветом показан график для 146S иммуногенного компонента антигена вируса ящура.

Сущность изобретения заключается в применении комплекса стабилизирующих соединений, а именно, стерильного 2-гидроксипропил-Р-циклодекстрина с концентрацией 0,7% и полиэтиленгликоля-300 с концентрацией 1,2% в готовом препарате антигена, для увеличения сохранности во времени производственного 146S иммуногенного компонента антигена вируса ящура.

Заявляемый способ основан на внесении в готовый антиген вируса ящура комплекса стабилизирующих соединений, а именно, стерильного 2-гидроксипропил-β-циклодекстрина с концентрацией 0,7% иполиэтиленгликоля-3 00 с концентрацией 1,2% в готовом препарате антигена, что обеспечивает сохранность 146S иммуногенного компонента вируса ящура при температуре 4-8°С с потерей за 4 года не более, чем на 3%.

В научных публикациях показана необходимость увеличения срока хранения антигена вируса ящура без значительного разрушения важнейшего 146S иммуногенного компонента антигена [6, 8, 9]. В настоящее время доступно несколько соединений и их комплексов, отраженных выше, но при этом их применение не обеспечивает длительную сохранность антигена. Сведений об аналогах предлагаемого способа увеличения продолжительности хранения производственного 146S иммуногенного компонента антигена вируса ящура авторами не обнаружено.

Разработанный способ увеличения продолжительности хранения производственного 146S иммуногенного компонента антигена вируса ящура по сравнению с прототипом отличается применением комплекса соединений, который ранее не применяли для стабилизации производственного 146S иммуногенного компонента антигена вируса ящура.

В отличие от прототипа разработанный способ позволяет сохранять 146S иммуногенный компонент антигена вируса ящура при температуре 4-8°С с потерей за 4 года не более, чем на 3%. Прототипный способ дает возможность стабилизировать антиген вируса ящура в указанных температурных условиях не более, чем на 4 месяца.

Разработанный способ предусматривает внесение в готовый антиген вируса ящура комплекса стабилизирующих соединений, а именно, стерильного 2-гидроксипропил-Р-циклодекстрина с концентрацией 0,7% и полиэтил енгликоля-300 с концентрацией 1,2% в готовом препарате антигена, что обеспечивает сохранность 146S иммуногенного компонента вируса ящура при температуре 4-8°С до 4 лет. Таким образом, актуально применять предложенный способ для увеличения продолжительности хранения производственного 146S иммуногенного компонента антигена вируса ящура.

Ключевым элементом заявляемого способа является применение комплекса стабилизаторов в эффективном количестве для увеличения продолжительности хранения производственного 146S иммуногенного компонента антигена вируса ящура.

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что новизна и изобретательский уровень заявляемого изобретения заключается в применении стерильного 2-гидроксипропил-β-циклодекстрина с концентрацией 0,7% и полиэтил енгликоля-300 с концентрацией 1,2% в готовом препарате антигена, что обеспечивает сохранность 146S иммуногенного компонента антигена вируса ящура при температуре 4-8°С до 4 лет.

Технический результат изобретения заключается в том, что разработанный способ дает возможность увеличить срок сохранности важнейшего 146S иммуногенного компонента антигена вируса ящура при температуре 4-8°С до 4 лет.

Для увеличения времени сохранности важнейшего 146S иммуногенного компонента антигена вируса ящура, в антиген добавляют комплекс стерильного 2-гидроксипропил-β-циклодекстрина с концентрацией 0,7% и полиэтиленгликоля-300 с концентрацией 1,2% в готовом препарате антигена.

Для этого на первом этапе работы делают навески 2-гидроксипропил-β-циклодекстрина и полиэтиленгликоля-300 для требуемого объема антигена, учитывая необходимые концентрации стабилизаторов в готовом антигенном препарате. После приготовления навесок компоненты вносят в антиген, перемешивают и пропускают суспензию антигена через стерилизующий фильтр диаметром 0,22 мкм. Водородный показатель антигена находится в диапазоне 7,5-7,6.

Определяют концентрацию общего вирусного белка и строят антигенный профиль для определенного штамма вируса ящура с помощью количественного варианта реакции связывания комплемента (РСК) всоответствии с требованиями методических рекомендаций [22, 23] сразу после внесения стабилизатора и далее спустя каждые 4 месяца хранения при температуре 4-8°С в течение 4 лет.

Делают заключение о степени сохранности 146S иммуногенного компонента антигена вируса ящура (в %) и отражают полученные результаты в виде процента (DP, degree of preservation) 146S иммуногенного компонента антигена с применением формулы:

где - концентрация 146S иммуногенного компонента антигена после хранения в течение определенного промежутка времени,

C_146S - концентрация 146S иммуногенного компонента антигена на момент начала хранения при определенных условиях.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Приготовление антигена вируса ящура разных вакцинных штаммов для длительной сохранности 146S иммуногенного компонента с применением прототипного и разработанного (предлагаемого изобретения) способов.

В соответствии с протоколом разработанного способа готовили навески 2-гидроксипропил-β-циклодекстрина и полиэтиленгликоля-300 для каждой партии по 1 л антигена вируса ящура четырех следующих штаммов: «А/Иран/2018», «О/Кения/2017», «Азия-1 №2356/Пакистан/2018» и «SAT-1/Нигерия/2015», учитывая необходимые концентрации стабилизаторов в готовом антигенном препарате, а именно для 2-гидроксипропил-β-циклодекстрина - 0,7%, для полиэтиленгликоля - 300 - 1,2%.

После приготовления навесок компоненты вносили в антиген, перемешивали и пропускали вирусные суспензии антигенов через стерилизующий фильтр диаметром 0,22 мкм. Водородный показатель антигена составлял 7,52-7,55 для указанных штаммов вируса ящура.

В соответствии с протоколом прототипного способа четыре партии антигена указанных выше штаммов параллельно смешивали с сахарозой (30% от массы антигена) и бычьим сывороточным альбумином (1% от массы антигена).

Приготовленные антигены (8 образцов) хранили при температуре 4-8°С в течение 4 лет.

Пример 2. Исследование стабильности производственного 146S иммуногенного компонента антигена вируса ящура разных штаммов при использовании прототипного и разработанного (предлагаемого изобретения) способов.

Образцы антигенов вируса ящура, полученные в примере 1, исследовали в РСК для определения концентрации общего вирусного белка, строили антигенный профиль для каждого штамма вируса ящура сразу после внесения стабилизатора и далее спустя каждые 4 месяца хранения при температуре 4-8°С в течение 4 лет.

Делали заключение о степени сохранности 146S иммуногенного компонента антигена вируса ящура с использованием прототипного и разработанного способов и с применением следующей формулы:

где - концентрация 146S иммуногенного компонента после хранения в течение определенного промежутка времени,

C_146S - концентрация 146S иммуногенного компонента на момент начала хранения при определенных условиях.

Результаты исследования отражены в таблицах 1, 2 и на фиг. 1, из которых видно, что применение прототипного способа позволяет сохранить 146S иммуногенный компонент антигена вируса ящура через 4 месяца в указанных температурных условиях. Спустя 8 месяцев 146S антиген разрушается среднем на 15%, через 4 года - на 98%. Таким образом, прототипный способ не обеспечивает сохранения 146S иммуногенного компонента антигена вируса ящура на длительный срок.

Благодаря использованию разработанного способа (предлагаемое изобретение) производственный 146S иммуногенный компонент антигена каждого из указанных выше вакцинных штаммов вируса ящура при хранении при температуре 4-8°С в течение 4 лет разрушается только на 3%. Таким образом, разработанный способ (предлагаемое изобретение) позволяет сохранить производственный 146S иммуногенный компонент антигена на 97%. Графики антигенного профиля указанных штаммов вируса ящура по итогам хранения в течение 4 лет при температуре 4-8°С представлены на фиг. 2-5 и подтверждают полученные результаты. Из фиг. 2-5 видно, что 146S иммуногенный компонент антигена вируса ящура, представленный красным цветом, сохранялся спустя 4 года при использовании комплекса стабилизаторов разработанного способа. В случае прототипа наблюдалось разрушение 146S иммуногенного компонента и заметное увеличение «хвостовой» части графика антигенного профиля (12S компонент, свидетельствующий о разрушении антигена).

Пример 3. Определение влияния комплекса стабилизаторов в антигене на организм крупного рогатого скота, для которого предназначена противоящурная вакцина, изготовленная с применением данного антигена (исследование безвредности комплекса стабилизаторов в применяемых концентрациях).

Контроль безвредности продукта на крупный рогатый скот проводили путем внутримышечного введения вакцины, приготовленной на основе антигена с добавлением комплекса стабилизаторов в указанных выше количествах, в дозе 6,0 см³. В опыте использовали 10 голов крупного рогатого скота. Срок наблюдения составлял 10 суток. После иммунизации температура тела животных повышалась до 41,5-41,8°С и удерживалась на этом уровне в течение 1 суток, что является нормальным [24].

По результатам исследований изготовленная вакцина против ящура культуральная инактивированная сорбированная была безвредна. Все животные в период наблюдения оставались клинически здоровыми, при патологоанатомическом анализе некроза тканей на месте введения вакцины не обнаружено.

Основным преимуществом предлагаемого изобретения является возможность увеличить время хранения производственного 146S иммуногенного компонента антигена вируса ящура при температуре 4-8°С до 4 лет, что в 12 раз дольше по сравнению с прототипом; сохранять 146S иммуногенный компонент антигена вируса ящура при температуре 4-8°С с потерей за 4 года не более, чем на 3%; предотвращать распад полных вирусных частиц до 12S компонента по итогам 4 лет хранения при температуре 4-8°С на 97%. Предложенный комплекс стабилизаторов с указанными выше концентрациями в составе вакцины против ящура является безвредным для крупного рогатого скота, для которого предназначена данная вакцина.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Способ увеличения продолжительности хранения производственного 146S иммуногенного компонента антигена вируса ящура»:

1. Boctor A.M. Enhancement of the stability of thrombin by polyols: microcalorimetric studies / Boctor A.M., Mehta S.C. // J. Pharm. Pharmacol. - 1992. - V. 44(7).-P. 600-603.

2. Kendrick B. Detergent Stabilization of Proteins against Surface and Freezing Denaturation // Pharm. Res. - 1997. - V.12. - 85 p.

3. Herman, A.C. Characterization, formulation, and stability of Neupogen (Filgrastim), a recombinant human granulocytecolony stimulating factor. In Formulation, characterization and stability of protein drugs (ed. R. Pearlman andYJ. Wang) / Herman, A.C., Boone, T.C., Lu, H.S. // Plenum Press, New York. -1996.-P. 303-328.

4. Remmele, R.L. Interleukin-1 receptor (IL-1R) liquid formulation development using differential scanning calorimetry / Remmele, R.L., Nightlinger, N.S., Srinivasan, S., Gombotz, W.R. // Pharm. Res. - V. 15. - P. 200-208.

5. Wang W. Instability, stabilization, and formulation of liquid protein pharmaceuticals / Int. J. Pharm. 1999 Aug 20. - V. 185(2). - P. 129-188.

6. Otzen, D.E. Structural basis for cyclodextrins' suppression of human growth hormone aggregation / Otzen, D.E., Knudsen, B.R., Larsen, K.L., Wimmer, R. // Protein Sci. - 2002. - V. 11. - P. 1779 - 1787.

7. Nomura, Y. Thermoresponsive controlled association of protein with a dynamic nanogel of hydrophobized polysaccharide and cyclodextrin: heat shock protein-like activity of artificial molecular chaperone / Nomura, Y., Sasaki, Y., Takagi, M., Narita, Т., Aoyama, Y., Akiyoshi, K. // Biomacromolecules. - 2005. - V.6. - P. 447-452.

8. Kamerzell T.J. Protein-excipient interactions: mechanisms and biophysical characterization applied to protein formulation development / Kamerzell T.J., Esfandiary R., Joshi S.B., Middaugh C.R., Volkin D.B // Adv Drug Deliv Rev. - 2011 Oct. - V. 63(13). - P. 1118-1159.

9. Harmsen M.M. Stabilizing effects of excipients on dissociation of intact (146S) foot-and-mouth disease virions into 12S particles during storage as oil-emulsion vaccine / Harmsen M.M., Fijten H.P., Westra D.F., Dekker A // Vaccine. - 2015. - V. 33(21). - P. 2477-2484.

10. Querol, E. Analysis of protein conformational thermostability / Querol, E., Perez-Pons, J. A. // Protein Eng. - 1996. - V. 9. - P. 265-271.

11. Arakawa К, Tonooka M, Goto H, Sakamoto K. Membrane stabilizing action of NCO-650 and its congeners. Jpn J Pharmacol. 1984 Nov;36(3):311-8. doi: 10.1254/jjp.36.311. PMID: 6441049.

12. Timasheff SN. The control of protein stability and association by weak interactions with water: how do solvents affect these processes? Annu Rev Biophys Biomol Struct. 1993;22:67-97. doi: 10.1146/annurev.bb.22.060193.000435. PMID: 8347999.

13. Hingerty B. Topography of cyclodextrin inclusion complexes. 8. Crystal and molecular structure of the a-cyclodextrin-methanol-pentahydrate complex. Disorder in a hydrophobic cage / Hingerty В., Saenger W. // J. Amer. Chem. Soc. - 1976. - V. 98. - P. 3357-3365.

14. Manning M.C. Stability of protein pharmaceuticals / Manning M.C., Patel K., Borchardt R.T. // Pharm Res. - 1989. - V. 6. - P. 903-918.

15. Mozhaev, V.V. Structure-stability relationships in proteins: new approaches to stabilizing enzymes / Mozhaev, V.V., Martinek, K. // Review. Enzyme and Microbial Technology. - 1984. - V.6. - P. 50-59.

16. Szejtli J. Introduction and general overview of cyclodextrin chemistry / Chemical Reviews. 1998. - V. 98, №5. - P. 1747-1748.

17. Патент РФ №2 180 217, 21.03.2000. Стабильный водный раствор противовоспалительного действия, содержащий будесонид // Гирева Н.Н., Гущин И.С., Орлов А.Е., Павлов В.М., Скачилова С.Я., Чучалин А.Г.

18. Патент РФ №2 498 801, 14.08.2012. Раствор стабилизированного дигидрокверцитина // Сидляров Д. П. и др.

19. Патент №2 414 898, 18.09.2009. Фармацевтическая композиция в форме раствора для инъекций, обладающая ноотропной активностью, и способ ее получения // Гаврилин Михаил Витальевич, Дуккардт Людмила Николаевна, Хартюнова Елена Игоревна, Сенченко Сергей Петрович, Дьякова Ирина Николаевна.

20. Патент №2 396 077, 27.04.2009. Водораствориемое комплексное соединение включения дигирокверцетина-Р-циклодекстрин и способ его получения // Коротеев М.В., Казиев Г.З.

21. Tataurov A.V. Predicting ultraviolet spectrum of single stranded and double stranded deoxyribonucleic acids / A.V. Tataurov, Y. You, R. Owczarzy // Biophys. Chem. - 2008. - Vol. 133 (1-3). - P. 66-70.

22. Бондаренко А.Ф. Качественный и количественный иммунохимический анализ вирусных белков. - Суздаль, 1994. - 92 с.

23. Лозовой Д. А. Методические рекомендации по определению концентрации 146S, 75S, 12S компонентов вакцинных штаммов культурального вируса ящура в реакции связывания комплемента (РСК) / Д.А. Лозовой, Д.В. Михалишин, В.А. Стариков, А.А. Шишкова, М.И. Доронин и др. - Владимир, ФГБУ «ВНИИЗЖ», 2017. - 44 с.

24. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. - Paris, 2022. - Chapter 3.1.17.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к производству вакцинных препаратов. Предложен способ увеличения продолжительности хранения производственного 146S иммуногенного компонента антигена вируса ящура. В способе применен комплекс стерильного 2-гидроксипропил-β-циклодекстрина с концентрацией 0,7% и полиэтиленгликоля-300 с концентрацией 1,2%, который вводят в готовый препарат антигена. Способ позволяет

увеличить время хранения производственного 146S иммуногенного компонента антигена вируса ящура до 4 лет при температуре 4-8°С, предложенный комплекс стабилизаторов с указанными выше концентрациями в составе вакцины против ящура является безвредным для крупного рогатого скота, для которого предназначена данная вакцина. 5 ил., 2 табл., 3 пр.

Способ увеличения продолжительности хранения производственного 146S иммуногенного компонента антигена вируса ящура, предусматривающий внесение в готовый препарат антигена вируса ящура комплекса 2-гидроксипропил-β-циклодекстрина с концентрацией 0,7% и полиэтиленгликоля-300 с концентрацией 1,2%, перемешивание и пропуск вирусной суспензии антигенов через стерилизующий фильтр диаметром 0,22 мкм.