СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ КЛЕТОК, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ХИМЕРНЫЙ АНТИГЕННЫЙ РЕЦЕПТОР Российский патент 2024 года по МПК C12N5/783 C07K14/705 A61K39/00 A61K35/17 G01N33/569 

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Данная заявка заявляет приоритет по предварительной заявке на патент США 62/726155, поданной 31 августа 2018 года, предварительной заявке на патент США 62/773679, поданной 30 ноября 2018 года, и предварительной заявке на патент США 62/858482, поданной 7 июня 2019 года, полное содержание каждой из которых включено в данный документ посредством ссылки.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был подан в электронном виде в формате ASCII и настоящим включен посредством ссылки во всей своей полноте. Указанная копия в формате ASCII, созданная 16 августа 2019 года, имеет название N2067-7153WO_SL.txt, и ее размер составляет 260532 байта.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится в общем к способам получения иммунных эффекторных клеток (например, T-клеток или NK-клеток), сконструированных таким образом, чтобы они экспрессировали химерный антигенный рецептор (CAR), и композициям, содержащим их.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Терапия на основе адоптивного переноса клеток (ACT) с использованием Т-клеток, в особенности T-клеток, трансдуцированных с помощью химерных антигенных рецепторов (CAR), показала перспективность в нескольких исследованиях в отношении гемобластоза. Производство генетически модифицированных T-клеток в настоящее время является сложным процессом. Существует потребность в способах и процессах для обеспечения улучшения в отношении получения продукта, представляющего собой средство терапии на основе клетки, экспрессирующей CAR, повышения качества продукта и максимального увеличения терапевтической эффективности продукта.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способам получения иммунных эффекторных клеток (например, T-клеток или NK-клеток), сконструированных таким образом, чтобы они экспрессировали CAR, и композиций, созданных с применением таких способов. Также раскрыты способы применения таких композиций для лечения заболевания, например рака, у субъекта.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении описан способ получения популяции клеток (например, T-клеток), которые экспрессируют химерный антигенный рецептор (CAR), при этом способ включает: (i) приведение в контакт (например, связывание) популяции клеток (например, T-клеток, например T-клеток, выделенных из замороженного или свежего продукта, полученного в результате лейкафереза) со средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу на поверхности клеток; (ii) приведение в контакт популяции клеток (например, T-клеток) с молекулой нуклеиновой кислоты (например, молекулой ДНК или РНК), кодирующей CAR, с получением таким образом популяции клеток (например, T-клеток), содержащих указанную молекулу нуклеиновой кислоты, и (iii) сбор популяции клеток (например, T-клеток) для хранения (например, повторное составление популяции клеток в среде для криоконсервирования) или введения, где: (a) стадию (ii) проводят вместе со стадией (i) или не позже чем через 20 часов после начала стадии (i), например не позже чем через 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18 часов после начала стадии (i), например не позже чем через 18 часов после начала стадии (i), и стадию (iii) проводят не позже чем через 26 часов после начала стадии (i), например не позже чем через 22, 23, 24 или 25 часов после начала стадии (i), например не позже чем через 24 часа после начала стадии (i); (b) стадию (ii) проводят вместе со стадией (i) или не позже чем через 20 часов после начала стадии (i), например не позже чем через 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18 часов после начала стадии (i), например не позже чем через 18 часов после начала стадии (i), и стадию (iii) проводят не позже чем через 30 часов после начала стадии (ii), например не позже чем через 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 часов после начала стадии (ii); или (c) популяцию клеток из стадии (iii) не размножали или размножали до увеличения количества клеток на не более чем 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, или 40%, например не более чем 10%, например, согласно оценке по числу живых клеток, по сравнению с популяцией клеток в начале стадии (i). В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты на стадии (ii) представляет собой молекулу ДНК. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты на стадии (ii) представляет собой молекулу РНК. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты на стадии (ii) находится в вирусном векторе, например вирусном векторе, выбранном из лентивирусного вектора, аденовирусного вектора или ретровирусного вектора. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты на стадии (ii) находится в невирусном векторе. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты на стадии (ii) находится в плазмиде. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты на стадии (ii) не находится в каком-либо векторе. В некоторых вариантах осуществления стадия (ii) включает осуществление трансдукции популяции клеток (например, T-клеток) c помощью вирусного вектора, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR. В некоторых вариантах осуществления стадию (ii) проводят вместе со стадией (i). В некоторых вариантах осуществления стадию (ii) проводят не позже чем через 20 часов после начала стадии (i). В некоторых вариантах осуществления стадию (ii) проводят не позже чем через 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18 часов после начала стадии (i). В некоторых вариантах осуществления стадию (ii) проводят не позже чем через 18 часов после начала стадии (i). В некоторых вариантах осуществления стадию (iii) проводят не позже чем через 26 часов после начала стадии (i). В некоторых вариантах осуществления стадию (iii) проводят не позже чем через 22, 23, 24 или 25 часов после начала стадии (i). В некоторых вариантах осуществления стадию (iii) проводят не позже чем через 24 часа после начала стадии (i). В некоторых вариантах осуществления стадию (iii) проводят не позже чем через 30 часов после начала стадии (ii). В некоторых вариантах осуществления стадию (iii) проводят не позже чем через 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 часов после начала стадии (ii).

В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток из стадии (iii) не размножают. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток из стадии (iii) размножают до увеличения количества клеток на не более чем 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, или 40%,, например, согласно оценке по числу живых клеток, по сравнению с популяцией клеток в начале стадии (i). В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток из стадии (iii) размножают до увеличения количества клеток на не более чем 10%, например, согласно оценке по числу живых клеток, по сравнению с популяцией клеток в начале стадии (i).

В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, представляет собой средство, которое стимулирует CD3. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует костимулирующую молекулу, представляет собой средство, которое стимулирует CD28, ICOS, CD27, HVEM, LIGHT, CD40, 4-1BB, OX40, DR3, GITR, CD30, TIM1, CD2, CD226 или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует костимулирующую молекулу, представляет собой средство, которое стимулирует CD28. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, выбрано из антитела (например, однодоменного антитела (например, антитела на основе вариабельного домена тяжелой цепи), пептитела, Fab-фрагмента или scFv), малой молекулы или лиганда (например, существующего в природе, рекомбинантного или химерного лиганда). В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует костимулирующую молекулу, выбрано из антитела (например, однодоменного антитела (например, антитела на основе вариабельного домена тяжелой цепи), пептитела, Fab-фрагмента или scFv), малой молекулы или лиганда (например, существующего в природе, рекомбинантного или химерного лиганда). В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, не содержит гранулу. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует костимулирующую молекулу, не содержит гранулу. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, содержит антитело к CD3. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует костимулирующую молекулу, содержит антитело к CD28. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, содержит антитело к CD3, ковалентно присоединенное к коллоидной полимерной наноматрице. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует костимулирующую молекулу, содержит антитело к CD28, ковалентно присоединенное к коллоидной полимерной наноматрице. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и средство, которое стимулирует костимулирующую молекулу, содержат T Cell TransAct^TM.

В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, не содержит гидрогель. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует костимулирующую молекулу, не содержит гидрогель. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, не содержит альгинат. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует костимулирующую молекулу, не содержит альгинат.

В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, содержит гидрогель. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует костимулирующую молекулу, содержит гидрогель. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, содержит альгинат. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует костимулирующую молекулу, содержит альгинат. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, или средство, которое стимулирует костимулирующую молекулу, содержат MagCloudz™ от Quad Technologies.

В некоторых вариантах осуществления стадия (i) обеспечивает повышение процентной доли клеток, экспрессирующих CAR, в популяции клеток из стадии (iii), например, популяция клеток из стадии (iii) демонстрирует более высокую процентную долю клеток, экспрессирующих CAR (например, выше на по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50 или 60%), по сравнению с клетками, полученными способом без стадии (i), в остальном аналогичным данному способу.

В некоторых вариантах осуществления процентная доля необученных клеток, например необученных Т-клеток, например CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T-клеток, в популяции клеток из стадии (iii), является такой же, как процентная доля необученных клеток, например необученных Т-клеток, например CD45RA+ CD45RO- CCR7+ клеток, в популяции клеток в начале стадии (i). В некоторых вариантах осуществления процентная доля необученных клеток, например необученных Т-клеток, например CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T-клеток, в популяции клеток из стадии (iii), отличается на не более чем 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12% от процентной доли необученных клеток, например необученных Т-клеток, например CD45RA+ CD45RO- CCR7+ клеток, в популяции клеток в начале стадии (i). В некоторых вариантах осуществления процентная доля необученных клеток, например необученных Т-клеток, например CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T-клеток, в популяции клеток из стадии (iii), отличается на не более чем 5 или 10% от процентной доли необученных клеток, например необученных Т-клеток, например CD45RA+ CD45RO- CCR7+ клеток, в популяции клеток в начале стадии (i).

В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (iii) демонстрирует более высокую процентную долю необученных клеток, например необученных Т-клеток, например CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T-клеток (например, выше на по меньшей мере 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35 или 40%), по сравнению с клетками, полученными способом, в котором стадию (iii) проводят через более чем 26 часов после начала стадии (i), например более чем 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 дней после начала стадии (i), в остальном аналогичным данному способу. В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (iii) демонстрирует более высокую процентную долю необученных клеток, например необученных Т-клеток, например CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T-клеток (например, выше на по меньшей мере 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, или 40%), по сравнению с клетками, полученными способом, который дополнительно включает после стадии (ii) и до стадии (iii) размножение популяции клеток (например, T-клеток) in vitro в течение более чем 3 дней, например в течение 5, 6, 7, 8 или 9 дней, в остальном аналогичным данному способу.

В некоторых вариантах осуществления процентная доля центральных клеток памяти, например центральных Т-клеток памяти, например центральных CD95+ Т-клеток памяти, в популяции клеток из стадии (iii) является такой же, как процентная доля центральных клеток памяти, например центральных T-клеток памяти, например центральных CD95+ Т-клеток памяти, в популяции клеток в начале стадии (i). В некоторых вариантах осуществления процентная доля центральных клеток памяти, например центральных T-клеток памяти, например центральных CD95+ Т-клеток памяти, в популяции клеток из стадии (iii), отличается на не более чем 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12% от процентной доли центральных клеток памяти, например центральных T-клеток памяти, например центральных CD95+ Т-клеток памяти, в популяции клеток в начале стадии (i). В некоторых вариантах осуществления процентная доля центральных клеток памяти, например центральных T-клеток памяти, например центральных CD95+ Т-клеток памяти, в популяции клеток из стадии (iii), отличается на не более чем 5 или 10% от процентной доли центральных клеток памяти, например центральных T-клеток памяти, например центральных CD95+ Т-клеток памяти, в популяции клеток в начале стадии (i).

В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (iii) демонстрирует более низкую процентную долю центральных клеток памяти, например центральных T-клеток памяти, например центральных CD95+ Т-клеток памяти (например, ниже на по меньшей мере 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35 или 40%), по сравнению с клетками, полученными способом, в котором стадию (iii) проводят через более чем 26 часов после начала стадии (i), например более чем 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 дней после начала стадии (i), в остальном аналогичным данному способу. В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (iii) демонстрирует более низкую процентную долю центральных клеток памяти, например центральных T-клеток памяти, например центральных CD95+ Т-клеток памяти (например, ниже на по меньшей мере 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35 или 40%), по сравнению с клетками, полученными способом, который дополнительно включает после стадии (ii) и до стадии (iii) размножение популяции клеток (например, T-клеток) in vitro в течение более чем 3 дней, например в течение 5, 6, 7, 8 или 9 дней, в остальном аналогичным данному способу.

В некоторых вариантах осуществления процентная доля стволовых T-клеток памяти, например CD45RA+CD95+IL-2-рецептор-β+CCR7+CD62L+ T-клеток, в популяции клеток из стадии (iii) является повышенной по сравнению с процентной долей стволовых T-клеток памяти, например CD45RA+CD95+IL-2-рецептор-β+CCR7+CD62L+ T-клеток, в популяции клеток в начале стадии (i). В некоторых вариантах осуществления процентная доля стволовых T-клеток памяти, экспрессирующих CAR, например CD45RA+CD95+IL-2-рецептор-β+CCR7+CD62L+ T-клеток, экспрессирующих CAR, в популяции клеток из стадии (iii) является повышенной по сравнению с процентной долей стволовых T-клеток памяти, экспрессирующих CAR, например CD45RA+CD95+IL-2-рецептор-β+CCR7+CD62L+ T-клеток, экспрессирующих CAR, в популяции клеток в начале стадии (i). В некоторых вариантах осуществления процентная доля стволовых T-клеток памяти, например CD45RA+CD95+IL-2-рецептор-β+CCR7+CD62L+ T-клеток, в популяции клеток из стадии (iii) является более высокой, чем процентная доля стволовых T-клеток памяти, например CD45RA+CD95+IL-2-рецептор-β+CCR7+CD62L+ T-клеток, среди клеток, полученных способом, в котором стадию (iii) проводят через более чем 26 часов после начала стадии (i), например более чем 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 дней после начала стадии (i), в остальном аналогичным данному способу. В некоторых вариантах осуществления процентная доля стволовых T-клеток памяти, экспрессирующих CAR, например CD45RA+CD95+IL-2-рецептор-β+CCR7+CD62L+ T-клеток, экспрессирующих CAR, в популяции клеток из стадии (iii) выше, чем процентная доля стволовых T-клеток памяти, экспрессирующих CAR, например CD45RA+CD95+IL-2-рецептор-β+CCR7+CD62L+ T-клеток, экспрессирующих CAR, среди клеток, полученных способом, в котором стадию (iii) проводят через более чем 26 часов после начала стадии (i), например более чем 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, или 12 дней после начала стадии (i), в остальном аналогичным данному способу. В некоторых вариантах осуществления процентная доля стволовых T-клеток памяти, например CD45RA+CD95+IL-2-рецептор-β+CCR7+CD62L+ T-клеток, в популяции клеток из стадии (iii) является более высокой, чем процентная доля стволовых T-клеток памяти, например CD45RA+CD95+IL-2-рецептор-β+CCR7+CD62L+ T-клеток, среди клеток, полученных способом, который дополнительно включает после стадии (ii) и до стадии (iii) размножение популяции клеток (например, T-клеток) in vitro в течение более чем 3 дней, например в течение 5, 6, 7, 8 или 9 дней, в остальном аналогичным данному способу. В некоторых вариантах осуществления процентная доля стволовых T-клеток памяти, экспрессирующих CAR, например CD45RA+CD95+IL-2-рецептор-β+CCR7+CD62L+ T-клеток, экспрессирующих CAR, в популяции клеток из стадии (iii) является более высокой, чем процентная доля стволовых T-клеток памяти, экспрессирующих CAR, например CD45RA+CD95+IL-2-рецептор-β+CCR7+CD62L+ T-клеток, экспрессирующих CAR, среди клеток, полученных способом, который дополнительно включает после стадии (ii) и до стадии (iii) размножение популяции клеток (например, T-клеток) in vitro в течение более чем 3 дней, например в течение 5, 6, 7, 8 или 9 дней, в остальном аналогичным данному способу.

В некоторых вариантах осуществления медианное значение показателя GeneSetScore (активируемые в TEM относительно подавляемых в TSCM) популяции клеток из стадии (iii) является приблизительно таким же, как медианное значение показателя GeneSetScore (активируемые в TEM относительно подавляемых в TSCM) популяции клеток в начале стадии (i), или отличается от него на не более чем (например, является выше на не более чем) приблизительно 25, 50, 75, 100 или 125%. В некоторых вариантах осуществления медианное значение показателя GeneSetScore (активируемые в TEM относительно подавляемых в TSCM) популяции клеток из стадии (iii) является более низким (например, ниже на по меньшей мере приблизительно 100, 150, 200, 250 или 300%), чем медианное значение показателя GeneSetScore (активируемые в TEM относительно подавляемых в TSCM) клеток, полученных способом, в котором стадию (iii) проводят через более чем 26 часов после начала стадии (i), например более чем 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 дней после начала стадии (i), в остальном аналогичным данному способу. В некоторых вариантах осуществления медианное значение показателя GeneSetScore (активируемые в TEM относительно подавляемых в TSCM) популяции клеток из стадии (iii) является более низким (например, ниже на по меньшей мере приблизительно 100, 150, 200, 250 или 300%), чем медианное значение показателя GeneSetScore (активируемые в TEM относительно подавляемых в TSCM) клеток, полученных способом, который дополнительно включает после стадии (ii) и до стадии (iii) размножение популяции клеток (например, T-клеток) in vitro в течение более чем 3 дней, например в течение 5, 6, 7, 8 или 9 дней, в остальном аналогичным данному способу. В некоторых вариантах осуществления медианное значение показателя GeneSetScore (активируемые в Treg относительно подавляемых в Teff) популяции клеток из стадии (iii) является приблизительно таким же, как медианное значение показателя GeneSetScore (активируемые в Treg относительно подавляемых в Teff) популяции клеток в начале стадии (i), или отличается от него на не более чем (например, является повышенным на не более чем) приблизительно 25, 50, 100, 150 или 200%. В некоторых вариантах осуществления медианное значение показателя GeneSetScore (активируемые в Treg относительно подавляемых в Teff) популяции клеток из стадии (iii) является более низким (например, ниже на по меньшей мере приблизительно 50, 100, 125, 150 или 175%), чем медианное значение показателя GeneSetScore (активируемые в Treg относительно подавляемых в Teff) клеток, полученных способом, в котором стадию (iii) проводят через более чем 26 часов после начала стадии (i), например более чем 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, или 12 дней после начала стадии (i), в остальном аналогичным данному способу. В некоторых вариантах осуществления медианное значение показателя GeneSetScore (активируемые в Treg относительно подавляемых в Teff) популяции клеток из стадии (iii) является более низким (например, ниже на по меньшей мере приблизительно 50, 100, 125, 150 или 175%), чем медианное значение показателя GeneSetScore (активируемые в Treg относительно подавляемых в Teff) клеток, полученных способом, который дополнительно включает после стадии (ii) и до стадии (iii) размножение популяции клеток (например, T-клеток) in vitro в течение более чем 3 дней, например в течение 5, 6, 7, 8 или 9 дней, в остальном аналогичным данному способу. В некоторых вариантах осуществления медианное значение показателя GeneSetScore (подавление функции "стволовости") популяции клеток из стадии (iii) является приблизительно таким же, как медианное значение показателя GeneSetScore (подавление функции "стволовости") популяции клеток в начале стадии (i), или отличается от него на не более чем (например, является повышенным на не более чем) приблизительно 25, 50, 100, 150, 200 или 250%. В некоторых вариантах осуществления медианное значение показателя GeneSetScore (подавление функции "стволовости") популяции клеток из стадии (iii) является более низким (например, ниже на по меньшей мере приблизительно 50, 100 или 125%), чем медианное значение показателя GeneSetScore (подавление функции "стволовости") клеток, полученных способом, в котором стадию (iii) проводят через более чем 26 часов после начала стадии (i), например более чем 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 дней после начала стадии (i), в остальном аналогичным данному способу. В некоторых вариантах осуществления медианное значение показателя GeneSetScore (подавление функции "стволовости") популяции клеток из стадии (iii) является более низким (например, ниже на по меньшей мере приблизительно 50, 100 или 125%), чем медианное значение показателя GeneSetScore (подавление функции "стволовости") клеток, полученных способом, который дополнительно включает после стадии (ii) и до стадии (iii) размножение популяции клеток (например, T-клеток) in vitro в течение более чем 3 дней, например в течение 5, 6, 7, 8 или 9 дней, в остальном аналогичным данному способу. В некоторых вариантах осуществления медианное значение показателя GeneSetScore (активируемые при гипоксии) популяции клеток из стадии (iii) является приблизительно таким же, как медианное значение показателя GeneSetScore (активируемые при гипоксии) популяции клеток в начале стадии (i), или отличается от него на не более чем (например, является повышенным на не более чем) приблизительно 125, 150, 175 или 200%. В некоторых вариантах осуществления медианное значение показателя GeneSetScore (активируемые при гипоксии) популяции клеток из стадии (iii) является более низким (например, ниже на по меньшей мере приблизительно 40, 50, 60, 70 или 80%), чем медианное значение показателя GeneSetScore (активируемые при гипоксии) клеток, полученных способом, в котором стадию (iii) проводят через более чем 26 часов после начала стадии (i), например более чем 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 дней после начала стадии (i), в остальном аналогичным данному способу. В некоторых вариантах осуществления медианное значение показателя GeneSetScore (активируемые при гипоксии) популяции клеток из стадии (iii) является более низким (например, ниже на по меньшей мере приблизительно 40, 50, 60, 70 или 80%), чем медианное значение показателя GeneSetScore (активируемые при гипоксии) клеток, полученных способом, который дополнительно включает после стадии (ii) и до стадии (iii) размножение популяции клеток (например, T-клеток) in vitro в течение более чем 3 дней, например в течение 5, 6, 7, 8 или 9 дней, в остальном аналогичным данному способу. В некоторых вариантах осуществления медианное значение показателя GeneSetScore (активируемые при аутофагии) популяции клеток из стадии (iii) является приблизительно таким же или отличается на не более чем (например, является повышенным на не более чем) приблизительно 180, 190, 200, или 210% от медианного значения показателя GeneSetScore (активируемые при аутофагии) популяции клеток в начале стадии (i). В некоторых вариантах осуществления медианное значение показателя GeneSetScore (активируемые при аутофагии) популяции клеток из стадии (iii) является более низким (например, ниже на по меньшей мере 20, 30 или 40%) чем медианное значение показателя GeneSetScore (активируемые при аутофагии) клеток, полученных способом, в котором стадию (iii) проводят через более чем 26 часов после начала стадии (i), например более 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 дней после начала стадии (i), в остальном аналогичным данному способу. В некоторых вариантах осуществления медианное значение показателя GeneSetScore (активируемые при аутофагии) популяции клеток из стадии (iii) является более низким (например, ниже на по меньшей мере 20, 30 или 40%) чем медианное значение показателя GeneSetScore (активируемые при аутофагии) клеток, полученных способом, который дополнительно включает после стадии (ii) и до стадии (iii) размножение популяции клеток (например, T-клеток) in vitro в течение более чем 3 дней, например в течение 5, 6, 7, 8 или 9 дней, в остальном аналогичным данному способу.

В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (iii) после инкубации с клеткой, экспрессирующей антиген, распознаваемый CAR, секретирует IL-2 на более высоком уровне (например, выше в по меньшей мере 2, 4, 6, 8, 10, 12 или 14 раз), чем клетки, полученные способом, в котором стадию (iii) проводят через более чем 26 часов после начала стадии (i), например более чем 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 дней после начала стадии (i), в остальном аналогичным данному способу, или клетки, полученные способом, который дополнительно включает после стадии (ii) и до стадии (iii) размножение популяции клеток (например, T-клеток) in vitro в течение более чем 3 дней, например в течение 5, 6, 7, 8 или 9 дней, в остальном аналогичным данному способу, например, согласно оценке с применением способов, описанных в примере 8 в отношении фиг. 29C-29D.

В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (iii) после введения in vivo персистирует дольше или размножается на более высоком уровне (например, выше на по меньшей мере 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 или 90%) (например, согласно оценке с применением способов, описанных в примере 1 в отношении фиг. 4C) по сравнению с клетками, полученными способом, в котором стадию (iii) проводят через более чем 26 часов после начала стадии (i), например более чем 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 дней после начала стадии (i), в остальном аналогичным данному способу. В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (iii) после введения in vivo персистирует дольше или размножается на более высоком уровне (например, выше на по меньшей мере 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, или 90%) (например, согласно оценке с применением способов, описанных в примере 1 в отношении фиг. 4C) по сравнению с клетками, полученными способом, который дополнительно включает после стадии (ii) и до стадии (iii) размножение популяции клеток (например, T-клеток) in vitro в течение более чем 3 дней, например в течение 5, 6, 7, 8 или 9 дней, в остальном аналогичным данному способу.

В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (iii) после введения in vivo демонстрирует более сильную противоопухолевую активность (например, более сильную противоопухолевую активность при низкой дозе, например дозе не более 0,15×10⁶, 0,2×10⁶, 0,25×10⁶ или 0,3×10⁶ жизнеспособных клеток, экспрессирующих CAR), чем клетки, полученные способом, в котором стадию (iii) проводят через более чем 26 часов после начала стадии (i), например более чем 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 дней после начала стадии (i), в остальном аналогичным данному способу, или клетки, полученные способом, который дополнительно включает после стадии (ii) и до стадии (iii) размножение популяции клеток (например, T-клеток) in vitro в течение более чем 3 дней, например в течение 5, 6, 7, 8 или 9 дней, в остальном аналогичным данному способу.

В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (iii) не увеличивается в количестве, например, согласно оценке по числу живых клеток, по сравнению с популяцией клеток в начале стадии (i). В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (iii) уменьшается по сравнению с числом живых клеток в популяции клеток в начале стадии (i), например, согласно оценке числа живых клеток. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток из стадии (iii) размножают до увеличения количества клеток на не более чем 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, или 40%, например не более чем 10%, например, согласно оценке по числу живых клеток, по сравнению с популяцией клеток в начале стадии (i). В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток из стадии (iii) не размножали или размножали до увеличения количества клеток, обеспечиваемого за менее чем 0,5, 1, 1,5 или 2 часа, например менее чем 1 или 1,5 часа, по сравнению с популяцией клеток в начале стадии (i).

В некоторых вариантах осуществления стадии (i) и (ii) проводят в средах для клеток (например, бессывороточных средах), содержащих IL-2, IL-15 (например, hetIL-15 (IL15/sIL-15Ra)), IL-6 (например, IL-6/sIL-6Ra), ингибитор LSD1 или ингибитор MALT1. В некоторых вариантах осуществления стадии (i) и (ii) проводят в средах для клеток (например, бессывороточных средах), содержащих IL-7, IL-21 или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления стадии (i) и (ii) проводят в средах для клеток (например, бессывороточных средах), содержащих IL-2, IL-15 (например, hetIL-15 (IL15/sIL-15Ra)), IL-21, IL-7, IL-6 (например, IL-6/sIL-6Ra), ингибитор LSD1, ингибитор MALT1 или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления стадию (i) проводят в средах для клеток (например, бессывороточных средах), содержащих IL-2, IL-15 (например, hetIL-15 (IL15/sIL-15Ra)), IL-6 (например, IL-6/sIL-6Ra), ингибитор LSD1 или ингибитор MALT1. В некоторых вариантах осуществления стадию (ii) проводят в средах для клеток (например, бессывороточных средах), содержащих IL-2, IL-15 (например, hetIL-15 (IL15/sIL-15Ra)), IL-6 (например, IL-6/sIL-6Ra), ингибитор LSD1 или ингибитор MALT1. В некоторых вариантах осуществления стадию (i) проводят в средах для клеток (например, бессывороточных средах), содержащих IL-7, IL-21 или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления стадию (ii) проводят в средах для клеток (например, бессывороточных средах), содержащих IL-7, IL-21 или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления стадию (i) проводят в средах для клеток (например, бессывороточных средах), содержащих IL-2, IL-15 (например, hetIL-15 (IL15/sIL-15Ra)), IL-21, IL-7, IL-6 (например, IL-6/sIL-6Ra), ингибитор LSD1, ингибитор MALT1 или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления стадию (ii) проводят в средах для клеток (например, бессывороточных средах), содержащих IL-2, IL-15 (например, hetIL-15 (IL15/sIL-15Ra)), IL-21, IL-7, IL-6 (например, IL-6/sIL-6Ra), ингибитор LSD1, ингибитор MALT1 или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления среда для клеток представляет собой бессывороточную среду, содержащую заменитель сыворотки. В некоторых вариантах осуществления заменитель сыворотки представляет собой заменитель сыворотки для иммунных клеток (ICSR) CTS™.

В некоторых вариантах осуществления вышеуказанные способы перед стадией (i) дополнительно включают (iv) получение свежего продукта, полученного в результате лейкафереза (или альтернативного источника гемопоэтической ткани, такого как продукт, представляющий собой свежую цельную кровь, продукт, представляющий собой свежий костный мозг, или свежий продукт, полученный в результате биопсии или удаления опухоли или органа (например, свежий продукт, полученный в результате тимэктомии)), от некоторой организации, например лаборатории, больницы или медицинского учреждения.

В некоторых вариантах осуществления вышеуказанные способы перед стадией (i) дополнительно включают (v) выделение популяции клеток (например, T-клеток, например CD8+ и/или CD4+ T-клеток), приводимых в контакт на стадии (i), из свежего продукта, полученного в результате лейкафереза (или альтернативного источника гемопоэтической ткани, такого как продукт, представляющий собой свежую цельную кровь, продукт, представляющий собой свежий костный мозг, или свежий продукт, полученный в результате биопсии или удаления опухоли или органа (например, свежий продукт, полученный в результате тимэктомии)). В некоторых вариантах осуществления стадию (iii) проводят не позже чем через 35 часов после начала стадии (v), например не позже чем через 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 или 35 часов после начала стадии (v), например не позже чем через 30 часов после начала стадии (v). В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток из стадии (iii) не размножают или размножают до увеличения количества клеток на не более чем 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или 40%, например не более чем 10%, например, согласно оценке по числу живых клеток, по сравнению с популяцией клеток в конце стадии (v).

В некоторых вариантах осуществления вышеуказанные способы перед стадией (i) дополнительно включают получение криоконсервированных T-клеток, выделенных из продукта, полученного в результате лейкафереза (или альтернативного источника гемопоэтической ткани, такого как криоконсервированные T-клетки, выделенные из цельной крови, костного мозга или продукта, полученного в результате биопсии или удаления опухоли или органа (например, продукта, полученного в результате тимэктомии)), от некоторой организации, например лаборатории, больницы или медицинского учреждения.

В некоторых вариантах осуществления вышеуказанные способы перед стадией (i) дополнительно включают (iv) получение криоконсервированного продукта, полученного в результате лейкафереза (или альтернативного источника гемопоэтической ткани, такого как продукт, представляющий собой криоконсервированную цельную кровь, продукт, представляющий собой криоконсервированный костный мозг, или криоконсервированный продукт, полученный в результате биопсии или удаления опухоли или органа (например, криоконсервированный продукт, полученный в результате тимэктомии)), от некоторой организации, например лаборатории, больницы или медицинского учреждения.

В некоторых вариантах осуществления вышеуказанные способы перед стадией (i) дополнительно включают (v) выделение популяции клеток (например, T-клеток, например CD8+ и/или CD4+ T-клеток), приводимых в контакт на стадии (i), из криоконсервированного продукта, полученного в результате лейкафереза (или альтернативного источника гемопоэтической ткани, такого как продукт, представляющий собой криоконсервированную цельную кровь, продукт, представляющий собой криоконсервированный костный мозг, или криоконсервированный продукт, полученный в результате биопсии или удаления опухоли или органа (например, криоконсервированный продукт, полученный в результате тимэктомии)). В некоторых вариантах осуществления стадию (iii) проводят не позже чем через 35 часов после начала стадии (v), например не позже чем через 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 или 35 часов после начала стадии (v), например не позже чем через 30 часов после начала стадии (v). В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток из стадии (iii) не размножают или размножают до увеличения количества клеток на не более чем 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или 40%, например не более чем 10%, например, согласно оценке по числу живых клеток, по сравнению с популяцией клеток в конце стадии (v).

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении описан способ получения популяции клеток (например, T-клеток), которые экспрессируют химерный антигенный рецептор (CAR), при этом способ включает: (1) приведение в контакт популяции клеток (например, T-клеток, например T-клеток, выделенных из замороженного продукта, полученного в результате лейкафереза) с цитокином, выбранным из IL-2, IL-7, IL-15, IL-21, IL-6 или их комбинации (2) приведение в контакт популяции клеток (например, T-клеток) с молекулой нуклеиновой кислоты (например, молекулой ДНК или РНК), кодирующей CAR, с получением таким образом популяции клеток (например, T-клеток), содержащих указанную молекулу нуклеиновой кислоты, и (3) сбор популяции клеток (например, T-клеток) для хранения (например, повторное составление популяции клеток в среде для криоконсервирования) или введения, где (a) стадию (2) проводят вместе со стадией (1) или не позже чем через 5 часов после начала стадии (1), например не позже чем через 1, 2, 3, 4 или 5 часов после начала стадии (1), и стадию (3) проводят не позже чем через 26 часов после начала стадии (1), например не позже чем через 22, 23, 24 или 25 часов после начала стадии (1), например не позже чем через 24 часа после начала стадии (1), или (b) популяцию клеток из стадии (3) не размножают или размножают до увеличения количества клеток на не более чем 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или 40%, например не более чем 10%, например, согласно оценке по числу живых клеток, по сравнению с популяцией клеток в начале стадии (1). В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты на стадии (2) представляет собой молекулу ДНК. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты на стадии (2) представляет собой молекулу РНК. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты на стадии (2) находится в вирусном векторе, например вирусном векторе, выбранном из лентивирусного вектора, аденовирусного вектора или ретровирусного вектора. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты на стадии (2) находится в невирусном векторе. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты на стадии (2) находится в плазмиде. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты на стадии (2) не находится в каком-либо векторе. В некоторых вариантах осуществления стадия (2) включает осуществление трансдукции популяции клеток (например, T-клеток) c помощью вирусного вектора, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR.

В некоторых вариантах осуществления стадию (2) проводят вместе со стадией (1). В некоторых вариантах осуществления стадию (2) проводят не позже чем через 5 часов после начала стадии (1). В некоторых вариантах осуществления стадию (2) проводят не позже чем через 1, 2, 3, 4 или 5 часов после начала стадии (1). В некоторых вариантах осуществления стадию (3) проводят не позже чем через 26 часов после начала стадии (1). В некоторых вариантах осуществления стадию (3) проводят не позже чем через 22, 23, 24 или 25 часов после начала стадии (1). В некоторых вариантах осуществления стадию (3) проводят не позже чем через 24 часа после начала стадии (1).

В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (3) не увеличивается в количестве, например, согласно оценке по числу живых клеток, по сравнению с популяцией клеток в начале стадии (1). В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (3) увеличивается в количестве на не более чем 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, или 40%,, например, согласно оценке по числу живых клеток, по сравнению с популяцией клеток в начале стадии (1). В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (3) увеличивается в количестве на не более чем 10%, например, согласно оценке по числу живых клеток, по сравнению с популяцией клеток в начале стадии (1).

В некоторых вариантах осуществления стадия (1) включает приведение в контакт популяции клеток (например, T-клеток) с IL-2. В некоторых вариантах осуществления стадия (1) включает приведение в контакт популяции клеток (например, T-клеток) с IL-7. В некоторых вариантах осуществления стадия (1) включает приведение в контакт популяции клеток (например, T-клеток) с IL-15 (например, hetIL-15 (IL15/sIL-15Ra)). В некоторых вариантах осуществления стадия (1) включает приведение в контакт популяции клеток (например, T-клеток) с IL-21. В некоторых вариантах осуществления стадия (1) включает приведение в контакт популяции клеток (например, T-клеток) с IL-6 (например, IL-6/sIL-6Ra). В некоторых вариантах осуществления стадия (1) включает приведение в контакт популяции клеток (например, T-клеток) с IL-2 и IL-7. В некоторых вариантах осуществления стадия (1) включает приведение в контакт популяции клеток (например, T-клеток) с IL-2 и IL-15 (например, hetIL-15 (IL15/sIL-15Ra)). В некоторых вариантах осуществления стадия (1) включает приведение в контакт популяции клеток (например, T-клеток) с IL-2 и IL-21. В некоторых вариантах осуществления стадия (1) включает приведение в контакт популяции клеток (например, T-клеток) с IL-2 и IL-6 (например, IL-6/sIL-6Ra). В некоторых вариантах осуществления стадия (1) включает приведение в контакт популяции клеток (например, T-клеток) с IL-7 и IL-15 (например, hetIL-15 (IL15/sIL-15Ra)). В некоторых вариантах осуществления стадия (1) включает приведение в контакт популяции клеток (например, T-клеток) с IL-7 и IL-21. В некоторых вариантах осуществления стадия (1) включает приведение в контакт популяции клеток (например, T-клеток) с IL-7 и IL-6 (например, IL-6/sIL-6Ra). В некоторых вариантах осуществления стадия (1) включает приведение в контакт популяции клеток (например, T-клеток) с IL-15 (например, hetIL-15 (IL15/sIL-15Ra)) и IL-21. В некоторых вариантах осуществления стадия (1) включает приведение в контакт популяции клеток (например, T-клеток) с IL-15 (например, hetIL-15 (IL15/sIL-15Ra)) и IL-6 (например, IL-6/sIL-6Ra). В некоторых вариантах осуществления стадия (1) включает приведение в контакт популяции клеток (например, T-клеток) с IL-21 и IL-6 (например, IL-6/sIL-6Ra). В некоторых вариантах осуществления стадия (1) включает приведение в контакт популяции клеток (например, T-клеток) с IL-7, IL-15 (например, hetIL-15 (IL15/sIL-15Ra)) и IL-21.

В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (3) демонстрирует более высокую процентную долю необученных клеток среди клеток, экспрессирующих CAR (например, выше на по меньшей мере 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, или 40%), по сравнению с клетками, полученными способом, который дополнительно включает приведение в контакт популяции клеток, например, с антителом к CD3, в остальном аналогичным данному способу.

В некоторых вариантах осуществления процентная доля необученных клеток, например необученных Т-клеток, например CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T-клеток, в популяции клеток из стадии (3), является такой же, как процентная доля необученных клеток, например необученных Т-клеток, например, CD45RA+ CD45RO- CCR7+ клеток, в популяции клеток в начале стадии (1). В некоторых вариантах осуществления процентная доля необученных клеток, например необученных Т-клеток, например CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T-клеток, в популяции клеток из стадии (3), отличается на не более чем 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12% от процентной доли необученных клеток, например необученных Т-клеток, например CD45RA+ CD45RO- CCR7+ клеток, в популяции клеток в начале стадии (1). В некоторых вариантах осуществления процентная доля необученных клеток, например необученных Т-клеток, например CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T-клеток, в популяции клеток из стадии (3), отличается на не более чем 5 или 10% от процентной доли необученных клеток, например необученных Т-клеток, например CD45RA+ CD45RO- CCR7+ клеток, в популяции клеток в начале стадии (1). В некоторых вариантах осуществления процентная доля необученных клеток, например необученных Т-клеток, например CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T-клеток, в популяции клеток из стадии (3) является повышенной по сравнению с процентной долей необученных клеток, например необученных Т-клеток, например CD45RA+ CD45RO- CCR7+ клеток, в популяции клеток в начале стадии (1). В некоторых вариантах осуществления процентная доля необученных клеток, например необученных Т-клеток, например CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T-клеток, в популяции клеток из стадии (3) является повышенной на по меньшей мере 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20% по сравнению с процентной долей необученных клеток, например необученных Т-клеток, например CD45RA+ CD45RO- CCR7+ клеток, в популяции клеток в начале стадии (1). В некоторых вариантах осуществления процентная доля необученных клеток, например необученных Т-клеток, например CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T-клеток, в популяции клеток из стадии (3) является повышенной на по меньшей мере 10 или 20% по сравнению с процентной долей необученных клеток, например необученных Т-клеток, например CD45RA+ CD45RO- CCR7+ клеток, в популяции клеток в начале стадии (1).

В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (3) демонстрирует более высокую процентную долю необученных клеток, например необученных Т-клеток, например CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T-клеток (например, выше на по меньшей мере 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, или 40%) по сравнению с клетками, полученными способом, в котором стадию (3) проводят через более чем 26 часов после начала стадии (1), например более 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 дней после начала стадии (1), в остальном аналогичным данному способу. В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (3) демонстрирует более высокую процентную долю необученных клеток, например необученных Т-клеток, например CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T-клеток (например, выше на по меньшей мере 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35 или 40%), по сравнению с клетками, полученными способом, который дополнительно включает после стадии (2) и до стадии (3) размножение популяции клеток (например, T-клеток) in vitro в течение более чем 3 дней, например в течение 5, 6, 7, 8 или 9 дней, в остальном аналогичным данному способу.

В некоторых вариантах осуществления процентная доля центральных клеток памяти, например центральных Т-клеток памяти, например центральных CD95+ Т-клеток памяти, в популяции клеток из стадии (3) является такой же, как процентная доля центральных клеток памяти, например центральных T-клеток памяти, например центральных CD95+ Т-клеток памяти, в популяции клеток в начале стадии (i). В некоторых вариантах осуществления процентная доля центральных клеток памяти, например центральных T-клеток памяти, например центральных CD95+ Т-клеток памяти, в популяции клеток из стадии (3) отличается на не более чем 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12% от процентной доли центральных клеток памяти, например центральных T-клеток памяти, например центральных CD95+ Т-клеток памяти, в популяции клеток в начале стадии (i). В некоторых вариантах осуществления процентная доля центральных клеток памяти, например центральных T-клеток памяти, например центральных CD95+ Т-клеток памяти, в популяции клеток из стадии (3) отличается на не более чем 5 или 10% от процентной доли центральных клеток памяти, например центральных T-клеток памяти, например центральных CD95+ Т-клеток памяти, в популяции клеток в начале стадии (i). В некоторых вариантах осуществления процентная доля центральных клеток памяти, например центральных T-клеток памяти, например центральных CD95+ Т-клеток памяти, в популяции клеток из стадии (3) является сниженной по сравнению с процентной долей центральных клеток памяти, например центральных T-клеток памяти, например центральных CD95+ Т-клеток памяти, в популяции клеток в начале стадии (1). В некоторых вариантах осуществления процентная доля центральных клеток памяти, например центральных T-клеток памяти, например центральных CD95+ Т-клеток памяти, в популяции клеток из стадии (3) является сниженной на по меньшей мере 10 или 20% по сравнению с процентной долей центральных клеток памяти, например центральных T-клеток памяти, например центральных CD95+ Т-клеток памяти, в популяции клеток в начале стадии (1). В некоторых вариантах осуществления процентная доля центральных клеток памяти, например центральных T-клеток памяти, например центральных CD95+ Т-клеток памяти, в популяции клеток из стадии (3) является сниженной на по меньшей мере 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20% по сравнению с процентной долей центральных клеток памяти, например центральных T-клеток памяти, например центральных CD95+ Т-клеток памяти, в популяции клеток в начале стадии (1).

В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (3) демонстрирует более низкую процентную долю центральных клеток памяти, например центральных T-клеток памяти, например центральных CD95+ Т-клеток памяти (например, ниже на по меньшей мере 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, или 40%), по сравнению с клетками, полученными способом, в котором стадию (3) проводят через более чем 26 часов после начала стадии (1), например более 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 дней после начала стадии (1), в остальном аналогичным данному способу. В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (3) демонстрирует более низкую процентную долю центральных клеток памяти, например центральных T-клеток памяти, например центральных CD95+ Т-клеток памяти (например, ниже на по меньшей мере 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, или 40%), по сравнению с клетками, полученными способом, который дополнительно включает после стадии (2) и до стадии (3) размножение популяции клеток (например, T-клеток) in vitro в течение более чем 3 дней, например в течение 5, 6, 7, 8 или 9 дней, в остальном аналогичным данному способу.

В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (3) после введения in vivo персистирует дольше или размножается на более высоком уровне (например, выше на по меньшей мере 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 или 90%) (например, согласно оценке с применением способов, описанных в примере 1 в отношении фиг. 4C) по сравнению с клетками, полученными способом, в котором стадию (3) проводят через более чем 26 часов после начала стадии (1), например более чем 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 дней после начала стадии (1), в остальном аналогичным данному способу. В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (3) после введения in vivo персистирует дольше или размножается на более высоком уровне (например, выше на по меньшей мере 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, или 90%) (например, согласно оценке с применением способов, описанных в примере 1 в отношении фиг. 4C) по сравнению с клетками, полученными способом, который дополнительно включает после стадии (2) и до стадии (3) размножение популяции клеток (например, T-клеток) in vitro в течение более чем 3 дней, например в течение 5, 6, 7, 8 или 9 дней, в остальном аналогичным данному способу.

В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (3) не увеличивается в количестве, например, согласно оценке по числу живых клеток, по сравнению с популяцией клеток в начале стадии (1). В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (3) увеличивается в количестве на не более чем 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, или 40%,, например, согласно оценке по числу живых клеток, по сравнению с популяцией клеток в начале стадии (1). В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (3) увеличивается в количестве на не более чем 10%, например, согласно оценке по числу живых клеток, по сравнению с популяцией клеток в начале стадии (1). В некоторых вариантах осуществления число живых клеток в популяции клеток из стадии (3) уменьшается по сравнению с числом живых клеток в популяции клеток в начале стадии (1), например, согласно оценке по числу живых клеток.

В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (3) не увеличивается в количестве по сравнению с популяцией клеток в начале стадии (1), например, согласно оценке по числу живых клеток. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток из стадии (3) размножали до увеличения количества клеток, обеспечиваемого за менее чем 0,5, 1, 1,5 или 2 часа, например менее чем 1 или 1,5 часа, по сравнению с популяцией клеток в начале стадии (1).

В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток не приводят в контакт in vitro со средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу на поверхности клеток, или если приводят в контакт, стадия приведения в контакт длится менее 2 часов, например не более 1 или 1,5 часа. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, представляет собой средство, которое стимулирует CD3 (например, антитело к CD3). В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует костимулирующую молекулу, представляет собой средство, которое стимулирует CD28, ICOS, CD27, HVEM, LIGHT, CD40, 4-1BB, OX40, DR3, GITR, CD30, TIM1, CD2, CD226 или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует костимулирующую молекулу, представляет собой средство, которое стимулирует CD28. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, или средство, которое стимулирует костимулирующую молекулу, выбрано из антитела (например, однодоменного антитела (например, антитела на основе вариабельного домена тяжелой цепи), пептитела, Fab-фрагмента или scFv), малой молекулы или лиганда (например, существующего в природе, рекомбинантного или химерного лиганда).

В некоторых вариантах осуществления стадии (1) и/или (2) проводят в средах для клеток, содержащих не более 5, 4, 3, 2, 1 или 0% сыворотки. В некоторых вариантах осуществления стадии (1) и/или (2) проводят в средах для клеток, содержащих не более 2% сыворотки. В некоторых вариантах осуществления стадии (1) и/или (2) проводят в средах для клеток, содержащих приблизительно 2% сыворотки. В некоторых вариантах осуществления стадии (1) и/или (2) проводят в средах для клеток, содержащих ингибитор LSD1 или ингибитор MALT1. В некоторых вариантах осуществления стадию (1) проводят в средах для клеток, содержащих не более 5, 4, 3, 2, 1 или 0% сыворотки. В некоторых вариантах осуществления стадию (1) проводят в средах для клеток, содержащих не более 2% сыворотки. В некоторых вариантах осуществления стадию (1) проводят в средах для клеток, содержащих приблизительно 2% сыворотки. В некоторых вариантах осуществления стадию (2) проводят в средах для клеток, содержащих не более 5, 4, 3, 2, 1 или 0% сыворотки. В некоторых вариантах осуществления стадию (2) проводят в средах для клеток, содержащих не более 2% сыворотки. В некоторых вариантах осуществления стадию (2) проводят в средах для клеток, содержащих приблизительно 2% сыворотки. В некоторых вариантах осуществления стадию (1) проводят в средах для клеток, содержащих ингибитор LSD1 или ингибитор MALT1. В некоторых вариантах осуществления стадию (2) проводят в средах для клеток, содержащих ингибитор LSD1 или ингибитор MALT1.

В некоторых вариантах осуществления вышеуказанные способы перед стадией (i) дополнительно включают (iv) получение свежего продукта, полученного в результате лейкафереза (или альтернативного источника гемопоэтической ткани, такого как продукт, представляющий собой свежую цельную кровь, продукт, представляющий собой свежий костный мозг, или свежий продукт, полученный в результате биопсии или удаления опухоли или органа (например, свежий продукт, полученный в результате тимэктомии)), от некоторой организации, например лаборатории, больницы или медицинского учреждения.

В некоторых вариантах осуществления вышеуказанные способы перед стадией (i) дополнительно включают (v) выделение популяции клеток (например, T-клеток, например CD8+ и/или CD4+ T-клеток), приводимых в контакт на стадии (i), из свежего продукта, полученного в результате лейкафереза (или альтернативного источника гемопоэтической ткани, такого как продукт, представляющий собой свежую цельную кровь, продукт, представляющий собой свежий костный мозг, или свежий продукт, полученный в результате биопсии или удаления опухоли или органа (например, свежий продукт, полученный в результате тимэктомии)). В некоторых вариантах осуществления стадию (iii) проводят не позже чем через 35 часов после начала стадии (v), например не позже чем через 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 или 35 часов после начала стадии (v), например не позже чем через 30 часов после начала стадии (v). В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток из стадии (iii) не размножают или размножают до увеличения количества клеток на не более чем 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или 40%, например не более чем 10%, например, согласно оценке по числу живых клеток, по сравнению с популяцией клеток в конце стадии (v).

В некоторых вариантах осуществления вышеуказанные способы перед стадией (i) дополнительно включают получение криоконсервированных T-клеток, выделенных из продукта, полученного в результате лейкафереза (или альтернативного источника гемопоэтической ткани, такого как криоконсервированные T-клетки, выделенные из цельной крови, костного мозга или продукта, полученного в результате биопсии или удаления опухоли или органа (например, продукта, полученного в результате тимэктомии)), от некоторой организации, например лаборатории, больницы или медицинского учреждения.

В некоторых вариантах осуществления вышеуказанные способы перед стадией (i) дополнительно включают (iv) получение криоконсервированного продукта, полученного в результате лейкафереза (или альтернативного источника гемопоэтической ткани, такого как продукт, представляющий собой криоконсервированную цельную кровь, продукт, представляющий собой криоконсервированный костный мозг, или криоконсервированный продукт, полученный в результате биопсии или удаления опухоли или органа (например, криоконсервированный продукт, полученный в результате тимэктомии)), от некоторой организации, например лаборатории, больницы или медицинского учреждения.

В некоторых вариантах осуществления вышеуказанные способы перед стадией (i) дополнительно включают (v) выделение популяции клеток (например, T-клеток, например CD8+ и/или CD4+ T-клеток), приводимых в контакт на стадии (i), из криоконсервированного продукта, полученного в результате лейкафереза (или альтернативного источника гемопоэтической ткани, такого как продукт, представляющий собой криоконсервированную цельную кровь, продукт, представляющий собой криоконсервированный костный мозг, или криоконсервированный продукт, полученный в результате биопсии или удаления опухоли или органа (например, криоконсервированный продукт, полученный в результате тимэктомии)). В некоторых вариантах осуществления стадию (iii) проводят не позже чем через 35 часов после начала стадии (v), например не позже чем через 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 или 35 часов после начала стадии (v), например не позже чем через 30 часов после начала стадии (v). В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток из стадии (iii) не размножают или размножают до увеличения количества клеток на не более чем 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или 40%, например не более чем 10%, например, согласно оценке по числу живых клеток, по сравнению с популяцией клеток в конце стадии (v).

В некоторых вариантах осуществления популяция клеток в начале стадии (i) или стадии (1) была обогащена клетками, экспрессирующими IL6R (например, клетками, которые являются положительными в отношении IL6Rα и/или IL6Rβ). В некоторых вариантах осуществления популяция клеток в начале стадии (i) или стадии (1) содержит не менее 40, 45, 50, 55, 60, 65 или 70% клеток, экспрессирующих IL6R (клеток, которые являются положительными в отношении IL6Rα и/или IL6Rβ).

В некоторых вариантах осуществления стадии (i) и (ii) или стадии (1) и (2) проводят в средах для клеток, содержащих IL-15 (например, hetIL-15 (IL15/sIL-15Ra)). В некоторых вариантах осуществления IL-15 обеспечивает повышение способности популяции клеток к размножению, например, через 10, 15, 20 или 25 дней. В некоторых вариантах осуществления IL-15 обеспечивает повышение процентной доли клеток, экспрессирующих IL6Rβ, в популяции клеток.

В некоторых вариантах осуществления вышеуказанных способов способы осуществляют в закрытой системе. В некоторых вариантах осуществления все из отделения, активации, трансдукции, инкубации и промывания Т-клеток проводят в закрытой системе. В некоторых вариантах осуществления вышеуказанных способов способы проводят в отдельных устройствах. В некоторых вариантах осуществления отделение, активацию, трансдукцию, инкубацию и промывание Т-клеток проводят в отдельных устройствах.

В некоторых вариантах осуществления вышеуказанных способов способы дополнительно включают добавление вспомогательного вещества или реагента, усиливающего трансдукцию, в среду для культуры клеток для увеличения эффективности трансдукции. В некоторых вариантах осуществления вспомогательное вещество или реагент, усиливающий трансдукцию, содержит катионный полимер. В некоторых вариантах осуществления вспомогательное вещество или реагент, усиливающий трансдукцию, выбраны из LentiBOOST^TM (Sirion Biotech), вектофусина-1, F108, гексадиметринбромида (Polybrene), PEA, Pluronic F68, Pluronic F127, Synperonic или LentiTrans™. В некоторых вариантах осуществления вспомогательное вещество представляет собой LentiBOOST^TM (Sirion Biotech).

В некоторых вариантах осуществления вышеуказанных способов обеспечение трансдукции популяции клеток (например, T-клеток) c помощью вирусного вектора предусматривает подвергание популяции клеток и вирусного вектора действию центробежной силы в условиях, при которых повышается эффективность трансдукции. В одном варианте осуществления клетки подвергают трансдукции с помощью спинокуляции.

В некоторых вариантах осуществления вышеуказанных способов клетки (например, T-клетки) активируют и подвергают трансдукции в колбе для культуры клеток, содержащей газопроницаемую мембрану в основании, которая предоставляет возможность работы с большими объемами среды без существенного снижения уровня газообмена. В некоторых вариантах осуществления рост клетки достигается путем предоставления доступа, например по существу непрерывного доступа, к питательным веществам посредством конвекции.

В некоторых вариантах осуществления вышеуказанных способов CAR содержит антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен.

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен связывается с антигеном, выбранным из CD19, CD20, CD22, BCMA, мезотелина, EGFRvIII, GD2, Tn-антигена, sTn-антигена, Tn-O-гликопептидов, sTn-O-гликопептидов, PSMA, CD97, TAG72, CD44v6, CEA, EPCAM, KIT, IL-13Ra2, легумана, GD3, CD171, IL-11Ra, PSCA, MAD-CT-1, MAD-CT-2, VEGFR2, антигена Y системы Льюис, CD24, PDGFR-бета, SSEA-4, рецептора фолиевой кислоты альфа, ERBB (например, ERBB2), Her2/neu, MUC1, EGFR, NCAM, эфрина B2, CAIX, LMP2, sLe, HMWMAA, o-ацетил-GD2, рецептора фолиевой кислоты бета, TEM1/CD248, TEM7R, FAP, легумаина, E6 или E7 HPV, ML-IAP, CLDN6, TSHR, GPRC5D, ALK, полисиаловой кислоты, Fos-родственного антигена, эластазы нейтрофилов, TRP-2, CYP1B1, белка спермы 17, бета-субъединицы хорионического гонадотропина человека, AFP, тиреоглобулина, PLAC1, globoH, RAGE1, MN-CA IX, обратной транскриптазы теломеразы человека, кишечной карбоксилэстеразы, мутантного варианта hsp 70-2, NA-17, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, NY-ESO-1, GPR20, Ly6k, OR51E2, TARP, GFRα4 или пептида любого из этих антигенов, презентированного на MHC. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен предусматривает последовательность CDR, VH, VL, scFv или CAR, раскрытую в данном документе. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен предусматривает VH и VL, где VH и VL соединены линкером, необязательно где линкер содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 63 или 104.

В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен предусматривает трансмембранный домен белка, выбранного из альфа-, бета- или дзета-цепи T-клеточного рецептора, CD28, CD3-эпсилон, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 и CD154. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен предусматривает трансмембранный домен CD8. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую трансмембранный домен, где последовательность нуклеиновой кислоты предусматривает последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 17 или последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней.

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен присоединен к трансмембранному домену с помощью шарнирной области. В некоторых вариантах осуществления шарнирная область содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2, 3 или 4, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую шарнирную область, где последовательность нуклеиновой кислоты предусматривает последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 13, 14 или 15 или последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней.

В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен предусматривает первичный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления первичный сигнальный домен содержит функциональный сигнальный домен, полученный из CD3-дзета, TCR-дзета, FcR-гамма, FcR-бета, CD3-гамма, CD3-дельта, CD3-эпсилон, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 (ICOS), FcεRI, DAP10, DAP12 или CD66d. В некоторых вариантах осуществления первичный сигнальный домен предусматривает функциональный сигнальный домен, полученный из CD3-дзета. В некоторых вариантах осуществления первичный сигнальный домен содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9 или 10, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую первичный сигнальный домен, где последовательность нуклеиновой кислоты предусматривает последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 20 или 21 или последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней.

В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен предусматривает костимулирующий сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления костимулирующий сигнальный домен предусматривает функциональный сигнальный домен, полученный из молекулы MHC класса I, белкового рецептора TNF, иммуноглобулиноподобного белка, рецептора цитокина, интегрина, сигнальной молекулы активации лимфоцитов (белка SLAM), активирующего рецептора NK-клеток, BTLA, лиганда Toll-подобного рецептора, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, 4-1BB (CD137), B7-H3, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8-альфа, CD8-бета, IL2R-бета, IL2R-гамма, IL7R-альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD28-OX40, CD28-4-1BB или лиганда, который специфично связывается с CD83. В некоторых вариантах осуществления костимулирующий сигнальный домен предусматривает функциональный сигнальный домен, полученный из 4-1BB. В некоторых вариантах осуществления костимулирующий сигнальный домен содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую костимулирующий сигнальный домен, где последовательность нуклеиновой кислоты предусматривает последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 18 или последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней.

В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен предусматривает функциональный сигнальный домен, полученный из 4-1BB, и функциональный сигнальный домен, полученный из CD3-дзета. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7 (или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней) и аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9 или 10 (или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней). В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7 и аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9 или 10.

В некоторых вариантах осуществления CAR дополнительно содержит лидерную последовательность, предусматривающую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении описана популяция клеток, экспрессирующих CAR (например, аутогенных или аллогенных T-клеток или NK-клеток, экспрессирующих CAR), полученных любым из вышеуказанных способов или любым другим способом, раскрытым в данном документе. В некоторых вариантах осуществления в данном документе раскрыта фармацевтическая композиция, содержащая популяцию клеток, экспрессирующих CAR, раскрытую в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель.

В некоторых вариантах осуществления в конечном продукте на основе CAR-клеток, изготовленном с применением способов, описанных в данном документе, общее количество гранул (например, гранул с антителами к CD4, гранул с антителами к CD8 и/или гранул TransACT) составляет не более 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 или 0,5% от общего количества гранул, добавляемых во время процесса изготовления.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении описана популяция клеток, экспрессирующих CAR (например, аутогенных или аллогенных T-клеток или NK-клеток, экспрессирующих CAR), предусматривающая одну или несколько из следующих характеристик: (a) приблизительно одинаковая процентная доля необученных клеток, например необученных Т-клеток, например CD45RO- CCR7+ T-клеток, по сравнению с процентной долей необученных клеток, например необученных Т-клеток, например CD45RO- CCR7+ клеток, в той же популяции клеток до применения в отношении них конструирования для обеспечения экспрессии CAR; (b) изменение количества необученных клеток, например необученных Т-клеток, например CD45RO- CCR7+ T-клеток, находящееся в пределах от приблизительно 5% до приблизительно 10%, например, по сравнению с процентной долей необученных клеток, например необученных Т-клеток, например CD45RO- CCR7+ T-клеток, в той же популяции клеток до применения в отношении них конструирования для обеспечения экспрессии CAR; (c) повышенная процентная доля необученных клеток, например необученных Т-клеток, например CD45RO- CCR7+ T-клеток, например повышенная в по меньшей мере 1,2, 1,4, 1,6, 1,8, 2,0, 2,2, 2,4, 2,6, 2,8 или 3 раза, по сравнению с процентной долей необученных клеток, например необученных Т-клеток, например CD45RO- CCR7+ T-клеток, в той же популяции клеток до применения в отношении них конструирования для обеспечения экспрессии CAR; (d) приблизительно одинаковая процентная доля центральных клеток памяти, например центральных T-клеток памяти, например CCR7+CD45RO+ T-клеток, по сравнению с процентной долей центральных клеток памяти, например центральных T-клеток памяти, например CCR7+CD45RO+ T-клеток, в той же популяции клеток до применения в отношении них конструирования для обеспечения экспрессии CAR; (e) изменение количества центральных клеток памяти, например центральных T-клеток памяти, например CCR7+CD45RO+ T-клеток, находящееся в пределах от приблизительно 5% до приблизительно 10% по сравнению с процентной долей центральных клеток памяти, например центральных T-клеток памяти, например CCR7+CD45RO+ T-клеток, в той же популяции клеток до применения в отношении них конструирования для обеспечения экспрессии CAR; (f) сниженная процентная доля центральных клеток памяти, например центральных T-клеток памяти, например CCR7+CD45RO+ T-клеток, например сниженная на по меньшей мере 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50% по сравнению с процентной долей центральных клеток памяти, например центральных T-клеток памяти, например CCR7+CD45RO+ T-клеток, в той же популяции клеток до применения в отношении них конструирования для обеспечения экспрессии CAR; (g) приблизительно одинаковая процентная доля стволовых T-клеток памяти, например CD45RA+CD95+IL-2-рецептор-β+CCR7+CD62L+ T-клеток, по сравнению с процентной долей стволовых T-клеток памяти, например CD45RA+CD95+IL-2-рецептор-β+CCR7+CD62L+ T-клеток, в той же популяции клеток до применения в отношении них конструирования для обеспечения экспрессии CAR; (h) изменение количества стволовых T-клеток памяти, например CD45RA+CD95+IL-2-рецептор-β+CCR7+CD62L+ T-клеток, находящееся в пределах от приблизительно 5% до приблизительно 10% по сравнению с процентной долей стволовых T-клеток памяти, например CD45RA+CD95+IL-2-рецептор-β+CCR7+CD62L+ T-клеток, в той же популяции клеток до применения в отношении них конструирования для обеспечения экспрессии CAR; или (i) повышенная процентная доля стволовых T-клеток памяти, например CD45RA+CD95+IL-2-рецептор-β+CCR7+CD62L+ T-клеток, по сравнению с процентной долей стволовых T-клеток памяти, например CD45RA+CD95+IL-2-рецептор-β+CCR7+CD62L+ T-клеток, в той же популяции клеток до применения в отношении них конструирования для обеспечения экспрессии CAR.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении описана популяция клеток, экспрессирующих CAR (например, аутогенных или аллогенных T-клеток или NK-клеток, экспрессирующих CAR), где (a) медианное значение показателя GeneSetScore (активируемые в TEM относительно подавляемых в TSCM) популяции клеток является приблизительно таким же, как медианное значение показателя GeneSetScore (активируемые в TEM относительно подавляемых в TSCM) той же популяции клеток до применения в отношении них конструирования для обеспечения экспрессии CAR, или отличается от него на не более чем (например, является повышенным на не более чем) приблизительно 25, 50, 75, 100 или 125%; (b) медианное значение показателя GeneSetScore (активируемые в Treg относительно подавляемых в Teff) популяции клеток является приблизительно таким же, как медианное значение показателя GeneSetScore (активируемые в Treg относительно подавляемых в Teff) популяции клеток до применения в отношении них конструирования для обеспечения экспрессии CAR, или отличается от него на не более чем (например, является повышенным на не более чем) приблизительно 25, 50, 100, 150 или 200%; (c) медианное значение показателя GeneSetScore (подавление функции "стволовости") популяции клеток является приблизительно таким же, как медианное значение показателя GeneSetScore (подавление функции "стволовости") популяции клеток до применения в отношении них конструирования для обеспечения экспрессии CAR, или отличается от него на не более чем (например, является повышенным на не более чем) приблизительно 25, 50, 100, 150, 200 или 250%; (d) медианное значение показателя GeneSetScore (активируемые при гипоксии) популяции клеток является приблизительно таким же, как медианное значение показателя GeneSetScore (активируемые при гипоксии) популяции клеток до применения в отношении них конструирования для обеспечения экспрессии CAR, или отличается от него на не более чем (например, является повышенным на не более чем) приблизительно 125, 150, 175 или 200%; или (e) медианное значение показателя GeneSetScore (активируемые при аутофагии) популяции клеток является приблизительно таким же, как например, повышен на не более чем как медианное значение показателя GeneSetScore (активируемые при аутофагии) популяции клеток до применения в отношении них конструирования для обеспечения экспрессии CAR, например, или отличается от него на не более чем (например, является повышенным на не более чем) приблизительно 180, 190, 200 или 210%.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении описан способ усиления иммунного ответа у субъекта, включающий введение популяции клеток, экспрессирующих CAR, раскрытой в данном документе, или фармацевтической композиции, раскрытой в данном документе, субъекту, с обеспечением таким образом усиления иммунного ответа у субъекта.

В некоторых вариантах осуществления в данном документе раскрыт способ лечения рака у субъекта, включающий введение популяции клеток, экспрессирующих CAR, раскрытой в данном документе, или фармацевтической композиции, раскрытой в данном документе, субъекту, с обеспечением таким образом лечения рака у субъекта. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой солидный рак, например, выбранный из одного или нескольких из мезотелиомы, злокачественной мезотелиомы плевры, немелкоклеточного рака легкого, мелкоклеточного рака легкого, плоскоклеточного рака легкого, крупноклеточного рака легкого, рака поджелудочной железы, аденокарциномы протоков поджелудочной железы, аденокарциномы пищевода, рака молочной железы, глиобластомы, рака яичника, колоректального рака, рака предстательной железы, рака шейки матки, рака кожи, меланомы, рака почки, рака печени, рака головного мозга, тимомы, саркомы, карциномы, рака матки, рака почки, рака желудочно-кишечного тракта, уротелиального рака, рака глотки, рака головы и шеи, рака прямой кишки, рака пищевода или рака мочевого пузыря или их метастазов. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой гемобластоз, например, выбранный из хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL), лимфомы из клеток мантийной зоны (MCL), множественной миеломы, острого лимфоидного лейкоза (ALL), лимфомы Ходжкина, B-клеточного острого лимфоидного лейкоза (BALL), T-клеточного острого лимфоидного лейкоза (TALL), мелкоклеточного лимфоцитарного лейкоза (SLL), B-клеточного пролимфоцитарного лейкоза, новообразования из бластных плазмоцитоидных дендритных клеток, лимфомы Беркитта, диффузной В-крупноклеточной лимфомы (DLBCL), DLBCL, ассоциированной с хроническим воспалением, хронического миелоидного лейкоза, миелопролиферативных новообразований, фолликулярной лимфомы, фолликулярной лимфомы у детей, волосатоклеточного лейкоза, мелкоклеточной или крупноклеточной фолликулярной лимфомы, злокачественных лимфопролиферативных состояний, MALT-лимфомы (экстранодальной лимфомы маргинальной зоны из лимфоидной ткани слизистых оболочек), лимфомы маргинальной зоны, миелодисплазии, миелодиспластического синдрома, неходжкинской лимфомы, плазмобластной лимфомы, новообразования из плазмоцитоидных дендритных клеток, макроглобулинемии Вальденстрема, лимфомы маргинальной зоны селезенки, лимфомы/лейкоза селезенки, диффузной мелкоклеточной B-клеточной лимфомы красной пульпы селезенки, варианта волосатоклеточного лейкоза, лимфоплазмоцитарной лимфомы, болезни тяжелых цепей, плазмоклеточной миеломы, солитарной плазмоцитомы кости, внекостной плазмоцитомы, нодальной лимфомы маргинальной зоны, нодальной лимфомы маргинальной зоны у детей, первичной кожной лимфомы из клеток центра фолликула, лимфоматоидного гранулематоза, первичной медиастинальной (тимусной) крупноклеточной B-клеточной лимфомы, внутрисосудистой крупноклеточной B-клеточной лимфомы, ALK+ крупноклеточной B-клеточной лимфомы, крупноклеточной B-клеточной лимфомы, возникающей при HHV8-ассоциированной многоочаговой болезни Кастельмана, первичной выпотной лимфомы, B-клеточной лимфомы, острого миелоидного лейкоза (AML) или неклассифицируемой лимфомы.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение второго терапевтического средства субъекту. В некоторых вариантах осуществления второе терапевтическое средство представляет собой противораковое терапевтическое средство, например средство химиотерапии, радиотерапии или иммунорегулирующей терапии. В некоторых вариантах осуществления второе терапевтическое средство представляет собой IL-15 (например, hetIL-15 (IL15/sIL-15Ra)).

Хотя при осуществлении на практике или тестировании настоящего изобретения можно применять способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в данном документе, ниже описываются подходящие способы и материалы. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие литературные источники (например, идентификационные номера последовательностей в базах данных), упоминаемые в данном документе, включены посредством ссылки во всей своей полноте. Например, все последовательности из GenBank, Unigene и Entrez, упоминаемые в данном документе, например, в любой таблице в данном документе, включены посредством ссылки. Если для одного гена или белка представлены ссылки на несколько номеров доступа последовательностей, охватываются все варианты последовательности.

Кроме того, материалы, способы и примеры являются исключительно иллюстративными и не предполагаются как ограничивающие. Заголовки, подзаголовки или пронумерованные или обозначенные буквами элементы, например (a) (b) (i) и т. д., представлены исключительно для удобства прочтения. Использование заголовков или пронумерованных или обозначенных буквами элементов в данном документе не требует того, чтобы стадии или элементы проводились в алфавитном порядке, или того, чтобы стадии или элементы обязательно были отделены друг от друга. Другие признаки, цели и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из описания и графических материалов, а также из формулы изобретения.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1A-1I. Когда очищенные T-клетки инкубировали с цитокинами, необученные клетки представляли собой преобладающую популяцию, которая подверглась трансдукции. Фиг. 1A представляет собой диаграмму, которая демонстрирует иллюстративный способ с использованием цитокина. Фиг. 1B представляет собой пару графиков, которые демонстрируют процентные доли CD3+ CAR+ клеток в каждый указанный момент времени после трансдукции. Фиг. 1C представляет собой ряд диаграмм, которые демонстрируют трансдукцию внутри популяции CD3+CCR7+CD45RO- в популяциях, стимулированных гранулами с антителами к CD3/CD28 (слева), по сравнению с популяциями только с цитокином (справа) у двух независимых доноров. В образце, называемом "Short stim IL7+IL15" на фиг. 1C, клетки стимулировали гранулами в течение 2 дней и затем их удаляли в присутствии IL7 и IL15. Фиг. 1D, 1E и 1F представляют собой ряд графиков, построенных по данным проточной цитометрии, которые демонстрируют трансдукцию субпопуляций Т-клеток, культивированных с IL2 (фиг. 1D), IL15 (фиг. 1E) и IL7+IL15 (фиг. 1F) каждый день в течение трехдневного периода времени. Фиг. 1G представляет собой ряд графиков, построенных по данным проточной цитометрии, которые демонстрируют дифференцировку T-клеток в день 0 (слева) и в день 1 (справа) для CCR7 и CD45RO после стимуляции с помощью IL2 (верхняя правая панель) или IL-15 (нижняя правая панель). Фиг. 1H и 1I представляют собой ряд диаграмм, которые демонстрируют процентные доли CD3+CCR7+RO- клеток, CD3+CCR7+RO+ клеток, CD3+CCR7-RO+ клеток и CD3+CCR7-RO- клеток в день 0 или после 24-часовой инкубации с указанными цитокинами.

Фиг. 2A-2D. CART, полученные с помощью стимуляции цитокином в течение одного дня, были функциональными. Фиг. 2A. Очищенные T-клетки подвергали трансдукции при MOI, составляющей 1, и при всех протестированных условиях применения цитокинов процентные доли клеток, экспрессирующих CAR, наблюдаемые в день 1 и день 10, были подобными. CART получали через один день и размножали посредством гранул с антителами к CD3/CD28 после сбора в течение 9 дней с имитацией условий in vivo. Фиг. 2A представляет собой пару графиков, которые демонстрируют средние процентные доли CD3+ CAR+ клеток при каждом из условий для CART дня 1 (слева) и CART дня 10 (справа). Фиг. 2B. Потенциал цитотоксичности у CART дня 1 после размножения измеряли с применением Nalm6 в качестве клеток-мишеней. Фиг. 2B представляет собой диаграмму, которая демонстрирует % уничтожения CD19-положительных клеток Nalm6 с помощью CART при каждом из условий. CART, которые размножали с применением гранул с антителами к CD3/CD28, в день 10 обозначены как "день 10". Все другие образцы представляли собой CART дня 1. Фиг. 2C. Тестировали секрецию IFNg размноженными CART дня 1 в ответ на клетки-мишени Nalm6. Фиг. 2C представляет собой диаграмму, которая демонстрирует количество секреции IFN-гамма CART при каждом из условий в присутствии CD19-положительных или CD19-отрицательных клеток-мишеней. Фиг. 2D. Пролиферативный потенциал CART дня 1 тестировали путем измерения уровня инкорпорации EDU. Фиг. 2D представляет собой диаграмму, которая демонстрирует средние процентные доли EDU-положительных клеток при каждом из условий. Подобно фиг. 2B, CART дня 10 обозначены как "день 10", и все другие образцы представляли собой CART дня 1.

Фиг. 3A-3B. Влияние MOI и композиции среды на трансдукцию в день 0. Фиг. 3A. Очищенные T-клетки подвергали трансдукции при MOI в диапазоне от 1 до 10 в присутствии IL15, IL2+IL15, IL2+IL7 или IL7+IL15. Независимо от применяемого цитокина, наблюдали линейное повышение уровня осуществления трансдукции. Фиг. 3A представляет собой ряд диаграмм, где отображена зависимость процентных долей CD3+ CAR+ клеток от MOI при каждом из протестированных условий. Фиг. 3B. Композиция среды влияла на уровень осуществления трансдукции в способе с использованием цитокина. Фиг. 3B представляет собой пару графиков, которые демонстрируют процентные доли CD3+ CAR+ клеток в день 1 (слева) или день 8 (справа) при каждом из протестированных условий. "2,50" обозначает MOI, составляющую 2,50. "5,00" обозначает MOI, составляющую 5,00.

Фиг. 4A-4D. CART-клетки, полученные через 24 часа, могут обеспечивать устранение опухоли. Фиг. 4A. Очищенные T-клетки подвергали трансдукции с помощью CAR19 и собирали через 24 часа. Фиг. 4A представляет собой ряд графиков, построенных по данным проточной цитометрии, которые демонстрируют уровень трансдукции T-клеток с CAR19, которые культивировали с IL2, IL15 и IL7+IL15, что иллюстрирует уровень трансдукции при каждом из условий применения цитокинов. Фиг. 4B. Диаграмма, которая демонстрирует среднюю жизнеспособность, которая превышала 80% при всех протестированных условиях. Фиг. 4C. Уровень размножения CART дня 1 в периферической крови является повышенным in vivo по сравнению с их аналогами дня 10. Для каждого из условий в ходе тестирования определяли процентную долю живых CD45+CD11b-CD3+CAR+ клеток в указанные моменты времени после инфузии. CART дня 10 обозначены как "D10 1e6" или "D10 5e6", и все другие образцы представляли собой CART дня 1. Фиг. 4D. CART дня 1 могли обеспечивать устранение опухоли in vivo, хотя с замедленной кинетикой по сравнению с CART дня 10. Фиг. 4D представляет собой диаграмму, которая демонстрирует суммарный поток в указанные моменты времени после инокуляции опухоли при каждом из протестированных условий. CART вводили через 4 дня после инокуляции опухоли. CART дня 10 обозначены как "5e6 d. 10", и все другие образцы представляли собой CART дня 1.

Фиг. 5A-5B. Способ с использованием цитокина был масштабируемым. Фиг. 5A. T-клетки обогащали на CliniMACS^® Prodigy^® и B-клеточный компартмент уменьшали до менее 1%. Фиг. 5A представляет собой ряд графиков, построенных по данным проточной цитометрии, которые демонстрируют уровень окрашивания клеток антителом к CD3 (слева) или антителом к CD19 и антителом к CD14 (справа) для клеток из лейкопака (снизу) или клеток после обогащения в отношении CD4+CD8+ (снизу). Фиг. 5B. Очищенные T-клетки из замороженных образцов, полученных путем афереза, подвергали трансдукции с помощью CAR19 либо в 24-луночном планшете, либо в мягком контейнере PL30, после обогащения. CART собирали через 24 часа. Фиг. 5B представляет собой ряд графиков, построенных по данным проточной цитометрии, которые демонстрируют уровень окраски на CD3 и CAR у клеток, изготовленных в присутствии либо IL2, либо hetIL-15 (IL15/sIL-15Ra).

Фиг. 6A-6C. CART, изготовленные посредством способа с использованием активации, продемонстрировали лучшую противоопухолевую эффективность in vivo. Фиг. 6A и 6B представляют собой диаграммы, где отображена зависимость опухолевой нагрузки от указанного момента времени после имплантации опухоли. "d.1" обозначает CART, изготовленные с применением способа с использованием активации. "d.9" обозначает CART, изготовленные с использованием традиционного протокола 9-дневного размножения, служащие в качестве положительного контроля в данном исследовании. Фиг. 6C представляет собой ряд иллюстративных изображений, которые демонстрируют биолюминесценцию у мышей.

Фиг. 7A-7B. Обогащение клетками, экспрессирующими IL6Rα и IL6Rβ, осуществляли в популяции менее дифференцированных T-клеток. Свежие T-клетки окрашивали для определения указанных антигенов поверхности и изучали в отношении уровней экспрессии IL6Rα и IL6Rβ в субпопуляциях CD4 (фиг. 7A) и CD8 (фиг. 7B) T-клеток.

Фиг. 8A и 8B. Обогащение клетками, экспрессирующими как IL6Rα, так и IL6Rβ, осуществляли в популяции менее дифференцированных T-клеток. Свежие T-клетки окрашивали для определения указанных антигенов поверхности и изучали в отношении уровней экспрессии указанных антигенов поверхности в субпопуляциях CD4 (фиг. 8A) и CD8 (фиг. 8B) T-клеток.

Фиг. 9. Клетки, экспрессирующие IL6Rα, экспрессировали маркеры поверхности менее дифференцированных Т-клеток. Свежие T-клетки окрашивали для определения указанных антигенов поверхности и изучали в отношении уровней экспрессии различных антигенов поверхности в субпопуляциях клеток, экспрессирующих IL6Rα на высоком, среднем и низком уровне.

Фиг. 10. Клетки, экспрессирующие IL6Rβ, экспрессировали маркеры поверхности менее дифференцированных Т-клеток. Свежие T-клетки окрашивали для определения указанных антигенов поверхности и изучали в отношении уровней экспрессии различных антигенов поверхности в субпопуляциях клеток, экспрессирующих IL6Rβ на высоком, среднем и низком уровне.

Фиг. 11. После осуществления контакта TCR с его лигандом происходило подавление экспрессии IL6Rα, но не IL6Rβ. T-клетки активировали гранулами с антителами к αCD3αCD28 в день 0 и затем изучали в отношении уровней экспрессии IL6Rα и IL6Rβ в указанные моменты времени.

Фиг. 12. Кратность увеличения количества T-клеток, обработанных цитокином, после осуществления контакта TCR с его лигандом. T-клетки активировали гранулами с антителами к αCD3αCD28 в день 0 в присутствии указанных цитокинов и затем отслеживали числа клеток в указанные моменты времени.

Фиг. 13A и 13B. Обработка с помощью IL2, IL7 и IL15 не влияла на размер и жизнеспособность клеток после осуществления контакта TCR с его лигандом. T-клетки активировали гранулами с антителами к αCD3αCD28 в день 0 в присутствии указанных цитокинов и затем отслеживали размер (фиг. 13A) и жизнеспособность (фиг. 13B) клеток в указанные моменты времени.

Фиг. 14. Кинетика экспрессии различных молекул поверхности на CD4 T-клетках после обработки цитокином. T-клетки активировали гранулами с антителами к αCD3αCD28 в день 0 в присутствии указанных цитокинов и затем изучали в отношении уровня экспрессии различных молекул поверхности с помощью проточной цитометрии в указанные моменты времени.

Фиг. 15. Кинетика экспрессии различных молекул поверхности на CD8 T-клетках после обработки цитокином. T-клетки активировали гранулами с антителами к αCD3αCD28 в день 0 в присутствии указанных цитокинов и затем изучали в отношении уровня экспрессии различных молекул поверхности с помощью проточной цитометрии в указанные моменты времени.

Фиг. 16. Экспрессия IL6Rβ была в основном ограниченной на субпопуляциях T-клеток, экспрессирующих CD27, после осуществления контакта TCR с его лигандом. T-клетки активировали гранулами с антителами к αCD3αCD28 в день 0 в присутствии указанных цитокинов и затем изучали в отношении уровня экспрессии IL6Rβ с помощью проточной цитометрии в день 15.

Фиг. 17. Экспрессия IL6Rβ была в основном ограниченной на субпопуляциях T-клеток, не экспрессирующих CD57, после осуществления контакта TCR с его лигандом. T-клетки активировали гранулами с антителами к αCD3αCD28 в день 0 в присутствии указанных цитокинов и затем изучали в отношении уровня экспрессии IL6Rβ с помощью проточной цитометрии в день 25.

Фиг. 18. T-клетки, обработанные общей γ-цепью цитокинов, продуцировали функциональные цитокины в день 25. T-клетки активировали гранулами с антителами к αCD3αCD28 в день 0 в присутствии указанных цитокинов и затем изучали в отношении процентных долей T-клеток, продуцирующих IL2, IFNγ и TNFα, с помощью проточной цитометрии в день 25.

Фиг. 19A и 19B. Экспрессия CAR для BCMA в день 1 с применением ARM при MOI=2,5 в T-клетках от двух здоровых доноров. Фиг. 19A представляет собой панель гистограмм, которые демонстрируют уровень экспрессии CAR для BCMA, измеренный с помощью проточной цитометрии. Фиг. 19B представляет собой таблицу, в которой перечислены реагенты/условия, применяемые в анализе с помощью проточной цитометрии.

Фиг. 20A, 20B и 20C. Кинетика экспрессии CAR in vitro со дня 1 по день 4 в клетках, изготовленных с применением способа ARM. CAR стабильно экспрессировались в день 3. Фиг. 20A представляет собой панель гистограмм, которые демонстрируют уровень экспрессии CAR в указанные моменты времени, измеренный с помощью проточной цитометрии. Фиг. 20B и 20C представляют собой графики, которые демонстрируют % CAR+ и значения MFI во времени, соответственно.

Фиг. 21A и 21B. Исследование с сортировкой in vivo в модели на мышах с ксенотрансплантатом множественной миеломы KMS-11-luc. Каждая мышь получала 1,5E6 продукта на основе CART дня 1. Фиг. 21A представляет собой панель гистограмм, которые демонстрируют уровень экспрессии CAR в CART-клетках в день 1 и день 7. Фиг. 21B представляет собой диаграмму, которая демонстрирует кинетику опухоли (уровень BLI) после обработки с помощью CART.

Фиг. 22A, 22B и 22C. Исследование с сортировкой CAR для BCMA in vivo с применением титрования дозы в модели на мышах с ксенотрансплантатом множественной миеломы KMS-11-luc. Фиг. 22A представляет собой панель гистограмм, которые демонстрируют уровень экспрессии CAR в день 1 и день 3. Фиг. 22B представляет собой диаграмму, которая демонстрирует кинетику поглощения опухоли после обработки с помощью CART с применением двух разных доз: дозы 1,5e5 CAR+ T-клеток и дозы 5e4 CAR+ T-клеток. Дозы CAR+ клеток нормализовали на основе уровня экспрессии CAR в день 3. Фиг. 22C представляет собой диаграмму, которая демонстрирует кинетику веса тела в течение данного исследования.

Фиг. 23A, 23B и 23C. Фиг. 23A и 23B представляют собой графики, которые демонстрируют процентную долю T-клеток, экспрессирующих CAR на их поверхности клеток (фиг. 23A), и среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) CD3+CAR+ клеток (фиг. 23B), наблюдаемую во времени (результаты повторов эксперимента усредняли по значениям двух панелей для проточной цитометрии, показанных на фиг. 23C). Фиг. 23C представляет собой панель графиков, построенных по данным проточной цитометрии, которые демонстрируют стратегию гейтирования для экспрессии CAR на поверхности жизнеспособных CD3+ клеток, исходя из данных UTD-образцов. Числа на графике указывают процент CAR-положительных клеток.

Фиг. 24A и 24B. Фиг. 24A представляет собой диаграмму, которая демонстрирует полную композицию исходного материала (продукт Prodigy^®) и полную композицию при сборе в различные моменты времени после начала культивирования. Субпопуляции необученных клеток (n), центральных клеток памяти (cm), эффектoрных клеток памяти (em) и эффектoрных клеток (eff) определяли по экспрессии на их поверхности CD4, CD8, CCR7 и CD45RO или отсутствию таковой. Композиция CD4 указана. Для каждого момента времени левый столбик демонстрирует композицию клеток общей популяции CD3+ (смешанной популяции), и правый столбик демонстрирует композицию клеток фракции CAR+. Фиг. 24B представляет собой панель графиков, построенных по данным проточной цитометрии, которые демонстрируют стратегию гейтирования, применяемую к живым CD3+ объектам для определения общей эффективности трансдукции (верхний ряд), композиции CD4/CD8 (средний ряд) и субпопуляциям клеток памяти (нижний ряд) среди общей популяции CD3+ (смешанной популяции) и фракции CAR+.

Фиг. 25. Кинетика субпопуляций T-клеток, экспрессирующих CAR на поверхности, во времени, выраженная в виде числа жизнеспособных клеток в соответствующих субпопуляциях.

Фиг. 26. Выход жизнеспособных клеток (число жизнеспособных клеток, полученных на выходе при сборе, по сравнению с числом жизнеспособных клеток, использованных для посева) через 12-24 часа после начала культивирования, согласно определению при подсчетах перед промывкой.

Фиг. 27. Жизнеспособность CART, полученных посредством способа быстрого изготовления, собранных через 12-24 часа после начала культивирования, согласно определению перед промывкой и после промывки во время сбора.

Фиг. 28A, 28B, 28C и 28D. Фиг. 28A представляет собой диаграмму, которая демонстрирует композицию исходного материала (лейкопак от здорового донора; LKPK) и продукта, обогащенного T-клетками, что было проанализировано с помощью проточной цитометрии. Числа указывают % исходных (живых, одиночных клеток). T: T-клетки; моно: моноциты; B: B-клетки; CD56 (NK): NK-клетки. Фиг. 28B представляет собой панель графиков, построенных по данным проточной цитометрии, которые демонстрируют стратегию гейтирования на живых CD3+ объектах, применяемую для определения уровня трансдукции (прямое рассеяние, FSC, относительно CAR) и субпопуляций T-клеток (CD4 относительно CD8 и CCR7 относительно CD45RO). Для ARM-CAR для CD19 (CD19-CART-клетки, изготовленные с применением способа быстрого изготовления с активированием (ARM)) и TM-CAR для CD19 (CD19-CART-клетки, изготовленные с применением способа традиционного изготовления (TM)), левые нижние панели представляют собой смешанные культуры, в то время как правые панели представляют собой CAR+ T-клетки. "ARM-UTD" и "TM-UTD" относится к нетрансдуцированным T-клеткам (UTD), изготовленным согласно способам ARM и TM соответственно. Числа в квадрантах указывают % исходной популяции. Коробочки на графиках TM-UTD и TM-CAR для CD19 указывают смещение к фенотипу T_CM в способе TM. Коробочки на графиках для ARM-UTD и ARM-CAR для CD19 указывают на сохранение клеток необученного типа при применении способа ARM. NA: не применимо. Фиг. 28C представляет собой диаграмму, которая демонстрирует полную композицию T-клеток ARM-CAR для CD19 и TM-CAR для CD19. Композиция показана для "смешанной популяции" и популяций "CAR+", где применимо. Процентная доля соответствующих популяций относится к % исходных или CD3+, или CAR+CD3+, если применимо. Указан % CD4 клеток соответствующих смешанной популяции или популяции CAR+. LKPK: исходный материал в виде лейкопака; 4 и 8: CD4+ и CD8+ соответственно; eff: эффектoрная клетка; em: эффектoрная клетка памяти; cm: центральная клетка памяти; n: клетка необученного типа. Данные иллюстрируют 3 полномасштабных цикла с 3 разными здоровыми донорами (n= 3) и несколько мелкомасштабных циклов, которые применяли для оптимизации способа. Фиг. 28D представляет собой таблицу, которая демонстрирует процентные доли, показанные на фиг. 28C.

Фиг. 29A, 29B, 29C и 29D. Концентрация цитокина в супернатантах культуры клеток. IFN-γ (фиг. 29A и 29B) и IL-2 (фиг. 29C и 29D). Фиг. 29A и 29C. TM-CAR для CD19, ARM-CAR для CD19 и соответствующие UTD объекты культивировали совместно с NALM6-WT (ALL), TMD-8 (DLBCL) или без раковых клеток (отдельно T-клетки). Супернатант собирали через 48 ч. Фиг. 29B и 29D. ARM-CAR для CD19 культивировали совместно с NALM6-WT, NALM6-19KO (CD19-отрицательным) или отдельно. Супернатант собирали через 24 ч или 48 ч. Для дополнительной оценки антиген-специфической секреции цитокинов, ARM-CAR для CD19 культивировали отдельно в течение 24 ч, промывали и затем культивировали совместно с клетками-мишенями в течение 24 ч. Показанные данные получены для T-клеток 2 здоровых доноров и они иллюстрируют 2 эксперимента с тремя донорами в общем.

Фиг. 30A, 30B и 30C. Фиг. 30A представляет собой диаграмму, на которой показана модель на мышах с ксенотрансплантатом для исследования противоопухолевой активности ARM-CAR для CD19. Фиг. 30B представляет собой панель графиков, построенных по данным проточной цитометрии, которые демонстрируют определение экспрессии CAR на ARM-CAR для CD19 клетках из индикаторного флакона. ARM-CAR для CD19 клетки культивировали в течение периода времени, описанного на фигуре, до анализа с помощью проточной цитометрии. Гейтирование для экспрессии CAR проводили на основе окрашивания изотипического контроля (Iso). Фиг. 30C представляет собой диаграмму, которая демонстрирует эффективность ARM-CAR для CD19 in vivo в модели на мышах с ксенотрансплантатом. NSG-мышам вводили линию NALM6, полученную из пре-B-клеток при ALL, экспрессирующую люциферазу в качестве репортерного гена; опухолевая нагрузка выражена в виде общей люминесценции тела (фотонов/с), изображенной в виде средней опухолевой нагрузки с доверительным интервалом, составляющей 95%. В день 7 после инокуляции опухоли, мышей обрабатывали с помощью ARM-CAR для CD19 или TM-CAR для CD19 в соответствующих дозах (число жизнеспособных CAR+ T-клеток). Исследование группы ARM-CAR для CD19 с высокой дозой остановили в день 33 из-за начала X-GVHD. Носитель (PBS) и нетрансдуцированные T-клетки (UTD) служили в качестве отрицательных контролей. Количество мышей составляло n=5 для всех групп, кроме n=4 для группы с дозой ARM-UTD 1×10⁶ и групп со всеми дозами TM-CAR для CD19. Пять исследований с ксенотрансплантатами проводили с CART-клетками, полученными от 5 разных здоровых доноров, три из которых включены к сравнению с TM-CAR для CD19.

Фиг. 31A, 31B, 31C и 31D. Уровни цитокинов в плазме крови у мышей, несущих опухоль из NALM6, обработанных с помощью ARM-CAR для CD19 или TM-CAR для CD19 при соответствующих дозах CART-клеток. У мышей отбирали кровь, и уровень цитокинов в плазме крови измеряли посредством MSD-анализа. IFN-γ (фиг. 31A и 31B) и IL-2 (фиг. 31C и 31D) показаны для мышей, обработанных с помощью CAR-T (фиг. 31A и 31C) или ARM- и TM-UTD-клеток (фиг. 31B и 31D). Столбики в пределах каждой из доз представляют средний уровень цитокина в пределах группы в разные моменты времени (начиная слева: день 4, 7, 10, 12, 16, 19, 23, 26). Горизонтальные столбики и числа указывают кратное изменение при сравнении ARM-CAR для CD19 (группа с дозой 1×10⁶) и TM-CAR для CD19 (группа с дозой 0,5×10⁶), описанное в тексте: 3-кратное для IFN-γ; и 10-кратное для IL-2. Для групп, исключенных из эксперимента из-за опухолевой нагрузки или потери веса тела, последние моменты времени не показаны. Уровни цитокинов в плазме крови измеряли для 2 исследований. no tum: опухоль отсутствует.

Фиг. 32. Динамика концентраций общих и CAR+ T-клеток у мышей, несущих опухоль из NALM6, обработанных носителем, представляющим собой PBS, UTD, TM-CAR для CD19 или ARM-CAR для CD19. Образцы крови отбирали в день 4, 7, 14, 21 и 28 после введения CART-клеток. Концентрации общих T-клеток (CD3+, сверху) и CAR+ Т-клеток (CD3+CAR+, снизу) анализировали с помощью проточной цитометрии в установленные моменты времени, и они изображены в виде среднего количества клеток с доверительным интервалом, составляющим 95%.

Фиг. 33A и 33B. Уровни белка IL-6 в супернатантах трех совместно культивируемых культур клеток в пг/мл. Совместно культивированные клетки ARM-CAR для CD19/K562 (фиг. 33A) или совместно культивированные клетки TM-CAR для CD19/K562 (фиг. 33B) в течение 6 или 24 часов инкубировали в разных соотношениях (1:1 и 1:2,5), затем добавляли к клеткам THP-1, дифференцированным с помощью PMA, на дополнительных 24 часа. Показаны результаты совместного культивирования CART-клеток с K562-CD19 клетками, совместного культивирования CART-клеток с K562-мезотелиновыми клетках и отдельно CART-клеток. Соотношения 1:5 не показаны для ясности. Столбики, обозначенные ARM-CAR для CD19 отдельно и TM-CAR для CD19 отдельно, представляют культуры CAR-T-клеток (6 ч., 24 ч.) без клеток-мишеней. Среднее+SEM, повторности n= 1 (TM-CAR для CD19) и n= 3 (ARM-CAR для CD19).

Фиг. 34A, 34B и 34C. Способ ARM обеспечивает сохранение функции "стволовости" у T-клеток CAR для BCMA+. CART-клетки с PI61, R1G5 и BCMA10, изготовленные с применением способа ARM, оценивали в отношении экспрессии CAR при размораживании (фиг. 34A) и через 48 ч. после размораживания (фиг. 34B). Маркеры CCR7/CD45RO также оценивали для продукта через 48 ч. после размораживания (фиг. 34C). Показанные данные являются одной иллюстрацией двух проведенных экспериментов с применением T-клеток двух доноров.

Фиг. 35A и 35B. посредством способа TM в основном получали центральные T-клетки памяти (TCM) (CD45RO+/CCR7+), в то время как популяция необученного типа T-клеток почти исчезала среди CAR+T-клеток при использовании способа TM. CART-клетки с PI61, R1G5 и BCMA10, изготовленные с применением способа TM, оценивали в отношении экспрессии CAR в день 9 (фиг. 35A). Маркеры CCR7/CD45RO также оценивали для продукта через 9 дней после размораживания (фиг. 35B). Показанные данные являются одной иллюстрацией двух проведенных экспериментов с применением T-клеток двух доноров.

Фиг. 36A, 36B, 36C и 36D. Полученные с помощью ARM T-клетки с CAR для BCMA демонстрируют BCMA-специфическую активацию и секретируют IL2 и IFN-γ на более высоких уровнях. Концентрации IL-2 и IFN-γ в супернатантах культуры клеток. CART-клетки с PI61, R1G5 и BCMA10, изготовленные с применением способа ARM или TM, и соответствующие UTD совместно культивировали с KMS-11 при соотношении 2,5:1. Супернатанты собирали через 20 ч. Для продуктов ARM концентрации IFN-γ показаны на фиг. 36A, и концентрации IL-2 показаны на фиг. 36B. Для продуктов TM концентрации IFN-γ показаны на фиг. 36C, и концентрации IL-2 показаны на фиг. 36D. Показанные данные являются одной иллюстрацией двух проведенных экспериментов с применением T-клеток двух доноров.

Фиг. 37A, 37B и 37C. Данные секвенирования РНК одной клетки для изначальной клетки (фиг. 37A), клетки дня 1 (фиг. 37B) и клетки дня 9 (фиг. 37C). Диаграммы "nGene" демонстрируют число экспрессируемых генов на клетку. Диаграммы "nUMI" демонстрируют число уникальных молекулярных идентификаторов (UMI) на клетку.

Фиг. 38A, 38B, 38C и 38D. По результатам метода нелинейного снижения размерности и визуализации многомерных переменных (TSNE) строили графики сравнения изначальной клетки (фиг. 38A), клетки дня 1 (фиг. 38B) и клетки дня 9 (фиг. 38C) в отношении сигнатуры пролиферации, которую определяли на основе экспрессии генов CCNB1, CCND1, CCNE1, PLK1 и MKI67. Каждая точка представляет собой клетку в этом образце. Клетки показанные в светло-сером цвете не экспрессируют гены пролиферации, при этом клетки темного цвета экспрессируют один или несколько генов пролиферации. Фиг. 38D представляет собой скрипичный график, который демонстрирует распределение баллов набора генов для набора генов, состоящего из генов, которые характеризуют покоящееся состояние T-клеток относительно таковых, которые характеризуют активированное состояние T-клеток, для клетки дня 1, клетки дня 9 и изначальных клеток. На фиг. 38D более высокий балл набора генов (активируемые в покоящемся состоянии относительно подавляемых в активированном состоянии) указывает на увеличение выраженности фенотипа покоящихся Т-клеток, при этом более низкий балл набора генов (активируемые в покоящемся состоянии относительно подавляемых в активированном состоянии) указывает на увеличение выраженности фенотипа активированных T-клеток. Изначальные клетки в основном были в большинстве своем в покоящемся состоянии по сравнению с клетками дня 1 и дня 9. Клетки дня 1 демонстрируют наибольший балл набора генов активации.

Фиг. 39A, 39B, 39C, 39D и 39E. Анализ набора генов для изначальных клеток, клеток дня 1 и клеток дня 9. На фиг. 39A более высокий балл набора генов для набора генов, "активируемые в TEM относительно подавляемых в TSCM", указывает на увеличение количества эффекторных Т-клеток памяти (TEM) в рассматриваемом образце, при этом более низкий балл набора генов указывает на увеличение количества T-клеток памяти, представляющих собой стволовые клетки (TSCM). На фиг. 39B более высокий балл набора генов для набора генов "активируемые в Treg относительно подавляемых в Teff" указывает на увеличение выраженности фенотипа регуляторных Т-клеток (Treg), при этом более низкий балл набора генов указывает на увеличение выраженности фенотипа эффектoрных Т-клеток (Teff). На фиг. 39C более низкий балл набора генов для набора генов "подавление функции "стволовости"" указывает на увеличение выраженности фенотипа "стволовости". На фиг. 39D более высокий балл набора генов для набора генов "активируемые при гипоксии" указывает на увеличение выраженности фенотипа, характерного для гипоксии. На фиг. 39E более высокий балл набора генов для набора генов "активации аутофагии" указывает на увеличение выраженности фенотипа, характерного для аутофагии. Клетки дня 1 выглядели подобно изначальным клеткам в отношении сигнатур памяти, сигнатур подобности стволовым клеткам и сигнатур дифференцировки. Клетки дня 9, с другой стороны, демонстрируют более высокую степень метаболического стресса.

Фиг. 40A, 40B и 40C. Анализ генного кластера для изначальных клеток. Фиг. 40A-40C представляют собой скрипичные графики, которые демонстрируют баллы набора генов из анализа набора генов четырех кластеров изначальных клеток. Каждая точка, лежащая на скрипичных графиках, на фиг. 40A-40C, представляет балл набора генов клетки. На фиг. 40A более высокий балл набора генов для набора генов "активируемые в Treg относительно подавляемых в Teff" указывает на увеличение количества клеток фенотипа Treg, при этом более низкий балл набора генов для набора генов "активируемые в Treg относительно подавляемых в Teff" указывает на увеличение количества клеток фенотипа Teff. На фиг. 40B более высокий балл набора генов для набора генов "постепенно активируемых при дифференцировки клеток памяти" указывает на увеличение количества позднего фенотипа Т-клеток памяти, при этом более низкий балл набора генов для набора генов "постепенно активируемых при дифференцировке в клетки памяти" указывает на увеличение выраженности фенотипа ранних Т-клеток памяти. На фиг. 40C более высокий балл набора генов для набора генов "активируемые в TEM относительно подавляемых в TN" указывает на увеличение выраженности фенотипа эффекторных Т-клеток памяти, при этом более низкий балл набора генов для набора генов "активируемые в TEM относительно подавляемых в TN" указывает на увеличение выраженности фенотипа необученных Т-клеток памяти. Показано, что клетки в кластере 3 находились в состоянии более поздних, более дифференцированных Т-клеток памяти по сравнению с клетками в кластере 1 и кластере 2, которые находились в состоянии более ранних, менее дифференцированных Т-клеток памяти. Оказалось, что кластер 0 находится в промежуточном состоянии Т-клетки. Взятые вместе, эти данные демонстрируют, что присутствует значительный уровень гетерогенности в пределах изначальных клеток.

Фиг. 41A, 41B и 41C. Секвенирование TCR и измерение разнообразия клонотипов. Клетки дня 9 характеризовались более плосковершинным распределением частот клонотипов (выше разнообразие).

Фиг. 42 представляет собой блок-схему, которая демонстрирует план тестирования фазы I клинического испытания T-клеток с CAR для BCMA, изготовленных с применением способа ARM, у взрослых пациентов с рецидивирующей и/или рефрактерной множественной миеломой.

Фиг. 43 представляет собой диаграмму, которая демонстрирует результаты FACS-анализов уровня экспрессии CAR для BCMA клетками, полученными посредством способа ARM, в разные моменты времени сбора после добавления вируса в присутствии или отсутствии AZT при двух разных концентрациях (30 мкМ и 100 мкМ). Добавляли лентивирусный вектор через 1 ч., до обработки AZT во время активации и посева клеток.

Фиг. 44A и 44B представляют собой графики, которые демонстрируют результаты оценки ARM-BCMA CAR в отношении экспрессии CAR при размораживании (фиг. 44A) и через 48 ч. после размораживания и маркеров CCR7/CD45RO в продукте через 48 ч. после размораживания, а также TM-BCMA CAR дня 9 (фиг. 44B). Показанные данные являются одной иллюстрацией двух проведенных экспериментов с применением T-клеток от двух доноров.

Фиг. 45A и 45B представляют собой графики, которые демонстрируют концентрации цитокинов в супернатантах культуры клеток. ARM-BCMA CAR и TM-BCMA CAR и соответствующие UTD культивировали совместно с KMS-11. Супернатант собирали через 24 ч. Показанные данные являются одной иллюстрацией двух проведенных экспериментов с применением T-клеток от двух доноров.

Фиг. 46 представляет собой диаграмму, которая демонстрирует схематично представленное исследование эффективности ксенотрансплантата для тестирования ARM-BCMA.

Фиг. 47 представляет собой диаграмму сравнения эффективности ARM-BCMA CAR с эффективностью TM-BCMA CAR в модели с ксенотрансплантатом. NSG-мышам вводили KMS11, представляющую собой линию клеток MM, экспрессирующую люциферазу в качестве репортерного гена. Опухолевая нагрузка выражена в виде общей люминесценции тела (фотонов/с) и изображена в виде среднего опухолевой нагрузки +SEM. В день 8 после инокуляции опухоли, мышей обрабатывали с помощью ARM-BCMA CAR или TM-BCMA CAR в соответствующих дозах (число жизнеспособных CAR+ T-клеток). Носитель (PBS) и UTD-T-клетки служили в качестве отрицательных контролей. Количество мышей составляло n=5 для всех групп, кроме n=4 для групп, обработанных клетками с CAR для BCMA, полученными посредством способа ARM, (1e4 клеток), PBS и UTD.

Фиг. 48A, 48B и 48C представляют собой графики, которые демонстрируют кинетику IFN-γ в плазме крови мыши, обработанной с помощью ARM-BCMA CAR или TM-BCMA CAR. Уровни IFN-γ в плазме крови мышей, несущих опухоль из KMS11-luc, обработанных с помощью UTD, ARM-BCMA CAR или TM-BCMA CAR при соответствующих дозах CAR-T. Все уровни IFN-γ изображены в виде среднего ± SEM. У мышей отбирали кровь, и уровень цитокинов в плазме крови измеряли с помощью анализа Meso Scale Discovery (MSD).

Фиг. 49 представляет собой диаграмму, которая демонстрирует клеточную кинетику ARM-BCMA CAR и TM-BCMA CAR in vivo. Клеточная кинетика в периферической крови мышей, несущих опухоль из KMS11, обработанных с помощью TM UTD, ARM UTD, ARM-BCMA CAR и TM-BCMA CAR при разных дозах. Число клеток выражено в виде среднего число клеток +SD. В день 8 после инокуляции опухоли, мышей обрабатывали с помощью ARM-BCMA CAR или TM-BCMA CAR в соответствующих дозах (число жизнеспособных CAR+ T-клеток). Носитель (PBS) и UTD-T-клетки служили в качестве отрицательных контролей. Образцы крови брали в дни 7, 14 и 21 после введения CAR-T и анализировали с помощью проточной цитометрии в установленные моменты времени. Количество мышей составляло n=5 для всех групп, кроме n=4 для групп, обработанных клетками с CAR для BCMA, полученными посредством способа ARM (1e4 клеток), PBS и UTD

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Определения

Если не указано иное, то все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понятно специалисту средней квалификации в области техники, к которой относится настоящее изобретение.

Форма единственного числа относится к одному или нескольким (т. e. по меньшей мере одному) грамматическим объектам настоящей заявки. В качестве примера, "элемент" означает один элемент или несколько элементов.

Подразумевается, что термин "приблизительно" в отношении измеряемой величины, такой как количество, временной промежуток и т. п., охватывает вариации на ± 20%, или в некоторых случаях на ± 10%, или в некоторых случаях на ± 5%, или в некоторых случаях на ± 1%, или в некоторых случаях на ± 0,1% от указанного значения, поскольку такие вариации являются допустимыми для осуществления раскрытых способов.

Композиции и способы по настоящему изобретению охватывают полипептиды и нуклеиновые кислоты, имеющие указанные последовательности или последовательности, практически идентичные или сходные с ними, например, последовательности, идентичные на по меньшей мере 85%, 90%, 95% или больше с указанной последовательностью. В контексте аминокислотной последовательности термин "практически идентичный" используется в данном документе для обозначения первой аминокислотной последовательности, которая содержит достаточное или минимальное количество аминокислотных остатков, которые являются i) идентичными аминокислотным остаткам во второй аминокислотной последовательности после их выравнивания или ii) их консервативными заменами, так что первая и вторая аминокислотные последовательности могут иметь один и тот же структурный домен и/или одну и ту же функциональную активность, например аминокислотные последовательности, которые содержат общий структурный домен, который характеризуется по меньшей мере приблизительно 85%, 90%. 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью с эталонной последовательностью, например последовательностью, представленной в данном документе.

В контексте нуклеотидной последовательности термин "практически идентичная" используется в данном документе для обозначения первой последовательности нуклеиновой кислоты, которая содержит достаточное или минимальное количество нуклеотидов, которые идентичны нуклеотидам во второй последовательности нуклеиновой кислоты после их выравнивания, так что первая и вторая нуклеотидные последовательности кодируют полипептид, характеризующийся одной и той же функциональной активностью, или кодируют один и тот же структурный домен полипептида или одну и ту же функциональную активность полипептида, например, нуклеотидные последовательности, характеризующиеся по меньшей мере приблизительно 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью с эталонной последовательностью, например, последовательностью, представленной в данном документе.

Термин "вариант" относится к полипептиду, который имеет практически идентичную аминокислотную последовательность с эталонной аминокислотной последовательностью или кодируется практически идентичной нуклеотидной последовательностью. В некоторых вариантах осуществления вариант представляет собой функциональный вариант.

Термин "функциональный вариант" относится к полипептиду, который имеет практически идентичную аминокислотную последовательность с эталонной аминокислотной последовательностью или кодируется практически идентичной нуклеотидной последовательностью и способен проявлять один или несколько видов активности эталонной аминокислотной последовательности.

Термин цитокин (например, IL-2, IL-7, IL-15, IL-21 или IL-6) включает полноразмерный цитокин, его фрагмент или вариант, например функциональный вариант, цитокина, встречающегося в природе (включая их фрагменты и функциональные варианты, обладающие по меньшей мере 10%, 30%, 50% или 80% активности, например иммуномодуляторной активности, цитокина, встречающегося в природе). В некоторых вариантах осуществления цитокин имеет аминокислотную последовательность, которая практически идентична (например, по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность) с цитокином, встречающимся в природе, или кодируется нуклеотидной последовательностью, которая является практически идентичной (например, по меньшей мере приблизительно 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность) со встречающейся в природе нуклеотидной последовательностью, кодирующей цитокин. В некоторых вариантах осуществления, как понятно из контекста, цитокин дополнительно содержит рецепторный домен, например домен, представляющий собой рецептор цитокина (например, IL-15/IL-15R).

Термин "химерный антигенный рецептор" или, в качестве альтернативы, "CAR" относится к рекомбинантной полипептидной конструкции, содержащей по меньшей мере внеклеточный антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и цитоплазматический сигнальный домен (также называемый в данном документе "внутриклеточным сигнальным доменом"), содержащий функциональный сигнальный домен, полученный из стимулирующей молекулы, определенной ниже. В некоторых вариантах осуществления домены в полипептидной конструкции CAR находятся в одной и той же полипептидной цепи, например образуют химерный слитый белок. В некоторых вариантах осуществления домены в полипептидной конструкции CAR не являются смежными друг с другом, например, находятся в разных полипептидных цепях, например, как представлено в RCAR, описанном в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления цитоплазматический сигнальный домен содержит первичный сигнальный домен (например, первичный сигнальный домен CD3-дзета). В некоторых вариантах осуществления цитоплазматический сигнальный домен дополнительно содержит один или несколько функциональных сигнальных доменов, полученных из по меньшей мере одной костимулирующей молекулы, определенной ниже. В некоторых вариантах осуществления костимулирующая молекула выбрана из 41BB (т. е., CD137), CD27, ICOS и/или CD28. В некоторых вариантах осуществления CAR содержит химерный слитый белок, содержащий внеклеточный антигенраспознающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, содержащий функциональный сигнальный домен, полученный из стимулирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления CAR содержит химерный слитый белок, содержащий внеклеточный антигенраспознающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, содержащий функциональный сигнальный домен, полученный из костимулирующей молекулы, и функциональный сигнальный домен, полученный из стимулирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления CAR содержит химерный слитый белок, содержащий внеклеточный антигенраспознающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, содержащий два функциональных сигнальных домена, полученных из одной или нескольких костимулирующих молекул, и функциональный сигнальный домен, полученный из стимулирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления CAR содержит химерный слитый белок, содержащий внеклеточный антигенраспознающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, содержащий по меньшей мере два функциональных сигнальных домена, полученных из одной или нескольких костимулирующих молекул, и функциональный сигнальный домен, полученный из стимулирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления CAR содержит необязательную лидерную последовательность на амино-конце (N-конце) слитого белка CAR. В некоторых вариантах осуществления CAR дополнительно содержит лидерную последовательность на N-конце внеклеточного антигенраспознающего домена, где лидерная последовательность необязательно отщепляется от антигенраспознающего домена (например, scFv) в ходе клеточного процессинга и локализации CAR в клеточной мембране.

CAR, содержащий антигенсвязывающий домен (например, scFv, однодоменное антитело или TCR (например, связывающий домен альфа-цепи TCR или связывающий домен бета-цепи TCR)), который нацеливается на конкретный опухолевый маркер X, где X может быть опухолевым маркером, описанным в данном документе, также называется XCAR. Например, CAR, который содержит антигенсвязывающий домен, нацеливающийся на BCMA, называется CAR для BCMA. CAR может экспрессироваться в любой клетке, например иммунной эффекторной клетке, описанной в данном документе (например, T-клетке или NK-клетке).

Термин "сигнальный домен" относится к функциональной части белка, которая действует путем передачи информации внутри клетки для регуляции клеточной активности посредством определенных сигнальных путей, образуя вторичные мессенджеры или функционируя в качестве эффекторов путем ответа на такие мессенджеры.

Используемый в данном документе термин "антитело" относится к последовательности белка или полипептида, полученной из молекулы иммуноглобулина, который специфично связывается с антигеном. Антитела могут являться поликлональными или моноклональными, многоцепочечными или одноцепочечными или интактными иммуноглобулинами и могут быть получены из природных источников или из рекомбинантных источников. Антитела могут являться тетрамерными молекулами иммуноглобулинов.

Термин "фрагмент антитела" относится к по меньшей мере одной части интактного антитела или его рекомбинантных вариантов и относится к антигенсвязывающему домену, например антигенраспознающей вариабельной области интактного антитела, достаточной для обеспечения распознавания и специфичного связывания фрагмента антитела с мишенью, такой как антиген. Примеры фрагментов антител включают без ограничения Fab-, Fab'-, F(ab')2- и Fv-фрагменты, scFv-фрагменты антител, линейные антитела, однодоменные антитела, такие как sdAb (либо VL, либо VH), VHH-домены верблюдовых и полиспецифические молекулы, образованные из фрагментов антител, такие как бивалентный фрагмент, содержащий два или более, например два, Fab-фрагмента, соединенных дисульфидным мостиком в шарнирной области, или две или более, например две, связанные выделенные CDR или другие эпитопсвязывающие фрагменты антитела. Фрагмент антитела также может быть включен в состав однодоменных антител, максител, минител, нанотел, интрател, диател, триател, тетрател, v-NAR и бис-scFv (см., например, Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005). Фрагменты антитела также могут быть привиты на остовы на основе полипептидов, таких как фибронектин III типа (Fn3) (см. патент США № 6703199, в котором описаны минитела на основе полипептида фибронектина).

Термин "scFv" относится к слитому белку, содержащему по меньшей мере один фрагмент антитела, содержащий вариабельную область легкой цепи, и по меньшей мере один фрагмент антитела, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, где вариабельные области легкой и тяжелой цепи присоединены друг к другу в смежном положении посредством короткого гибкого полипептидного линкера и способны экспрессироваться в виде одноцепочечного полипептида, и где scFv сохраняет специфичность интактного антитела, из которого он получен. Если не указано иное, то scFv, как используется в данном документе, может иметь вариабельные VL- и VH-области, расположенные в любом порядке, например, относительно N-конца и С-конца полипептида scFv может содержать VL-линкер-VH или может содержать VH-линкер-VL. В некоторых вариантах осуществления scFv может содержать структуру NH₂-V_L-линкер-V_H-COOH или NH₂-V_H-линкер-V_L-COOH.

Термины "область, определяющая комплементарность" или "CDR", используемые в данном документе, относятся к последовательностям из аминокислот в вариабельных областях антитела, которые придают антигенную специфичность и аффинность связывания. Например, как правило, в каждой вариабельной области тяжелой цепи находятся три CDR (HCDR1, HCDR2 и HCDR3), и в каждой вариабельной области легкой цепи находятся три CDR (LCDR1, LCDR2 и LCDR3). Точные границы аминокислотной последовательности указанной CDR могут быть определены с использованием любой из ряда широко известных схем, в том числе описанных Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5-е изд. Public Health Service, National Institutes of Health, Бетесда Мэриленд (схема нумерации "по Kabat"), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 (схема нумерации "по Chothia") или их комбинации. Согласно комбинированной схеме нумерации по Kabat и Chothia в некоторых вариантах осуществления CDR соответствуют аминокислотным остаткам, которые являются частью CDR по Kabat, CDR по Chothia или как тех, так и других.

Часть композиции на основе CAR по настоящему изобретению, предусматривающая соответствующее антитело или фрагмент антитела, может существовать в различных формах, например, в которых антигенсвязывающий домен экспрессируется в виде части полипептидной цепи, в том числе, например, в виде фрагмента однодоменного антитела (sdAb), одноцепочечного антитела (scFv) или, например, человеческого или гуманизированного антитела (Harlow et al., 1999, в: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, в: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426). В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен в композиции на основе CAR по настоящему изобретению содержит фрагмент антитела. В некоторых вариантах осуществления CAR содержит фрагмент антитела, который содержит scFv.

Используемый в данном документе термин "связывающий домен" или "молекула антитела" (также называемые в данном документе связывающим доменом к мишени) относится к белку, например к цепи иммуноглобулина или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере последовательность одного вариабельного домена иммуноглобулина. Термин "связывающий домен" или "молекула антитела" охватывает антитела и фрагменты антител. В некоторых вариантах осуществления молекула антитела представляет собой молекулу полиспецифического антитела, например она содержит совокупность последовательностей вариабельных доменов иммуноглобулина, причем первая последовательность вариабельного домена иммуноглобулина из совокупности характеризуется специфичностью связывания с первым эпитопом, а вторая последовательность вариабельного домена иммуноглобулина из совокупности характеризуется специфичностью связывания со вторым эпитопом. В некоторых вариантах осуществления молекула полиспецифического антитела представляет собой молекулу биспецифического антитела. Биспецифическое антитело характеризуется специфичностью в отношении не более чем двух антигенов. Молекула биспецифического антитела характеризуется наличием первой последовательности вариабельного домена иммуноглобулина, которая характеризуется специфичностью связывания с первым эпитопом, и второй последовательности вариабельного домена иммуноглобулина, которая характеризуется специфичностью связывания со вторым эпитопом.

Термины "биспецифическое антитело" и "биспецифические антитела" относятся к молекулам, в которых объединены антигенсвязывающие сайты двух антител в пределах одной молекулы. Таким образом, биспецифическое антитело способно связывать два разных антигена одновременно или последовательно. Способы получения биспецифических антител являются широко известными в данной области техники. Различные форматы объединения двух антител являются также известными в данной области техники. Формы биспецифических антител по настоящему изобретению включают без ограничения диатело, одноцепочечное диатело, продукт димеризации Fab (Fab-Fab), Fab-scFv и тандемное антитело, как известно специалистам в данной области техники.

Термин "тяжелая цепь антитела" относится к большей из полипептидных цепей двух типов, присутствующих в молекулах антител в их встречающихся в природе конформациях, которая обычно определяет класс, к которому принадлежит антитело.

Термин "легкая цепь антитела" относится к меньшей из полипептидных цепей двух типов, присутствующих в молекулах антител в их встречающихся в природе конформациях. Легкие каппа- (κ-) и лямбда- (λ-) цепи относятся к двум основным изотипам легких цепей антител.

Термин "рекомбинантное антитело" относится к антителу, создаваемому с применением технологии рекомбинантных ДНК, такому как, например, антитело, экспрессируемое в бактериофаговой или дрожжевой системе экспрессии. Термин также следует истолковывать как означающий антитело, которое было создано в результате синтеза молекулы ДНК, кодирующей антитело, при этом данная молекула ДНК экспрессирует белковое антитело или аминокислотную последовательность, определяющую антитело, где последовательность ДНК или аминокислотная последовательность были получены с применением технологии рекомбинантных ДНК или аминокислотных последовательностей, доступной и широко известной в данной области техники.

Термин "антиген" или "Ag" относится к молекуле, которая вызывает иммунный ответ. Такой иммунный ответ может предусматривать продуцирование антител либо активацию специфических иммунокомпетентных клеток или как то, так и другое. Специалисту в данной области будет понятно, что любая макромолекула, в том числе практически все белки или пептиды, может служить в качестве антигена. Кроме того, антигены могут быть получены из рекомбинантной или геномной ДНК. Специалисту в данной области будет понятно, что любая ДНК, которая содержит нуклеотидную последовательность или частичную нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, который вызывает иммунный ответ, тем самым кодирует "антиген", как этот термин используется в данном документе. Кроме того, специалисту в данной области будет понятно, что антиген не должен кодироваться исключительно полноразмерной нуклеотидной последовательностью гена. Очевидно, что настоящее изобретение включает без ограничения применение частичных нуклеотидных последовательностей более одного гена, и что эти нуклеотидные последовательности составлены в различных комбинациях для того, чтобы кодировать полипептиды, которые вызывают требуемый иммунный ответ. Более того, специалисту в данной области будет понятно, что антиген вообще не обязательно должен кодироваться "геном". Очевидно, что антиген может быть образован в результате синтеза, или может быть получен из биологического образца, или может представлять собой макромолекулу, отличную от полипептида. Такой биологический образец может включать без ограничения образец ткани, образец опухоли, клетку или жидкость с другими биологическими компонентами.

Термины "противоопухолевый эффект" и "противораковый эффект" применяют взаимозаменяемо и они относятся к биологическому эффекту, который может проявляться различным образом, в том числе без ограничения, например, в виде уменьшения объема опухоли или объема ракового образования, уменьшения числа опухолевых клеток или раковых клеток, уменьшения числа метастазов, повышения ожидаемой продолжительности жизни, уменьшения уровня пролиферации опухолевых клеток или пролиферации раковых клеток, уменьшения выживаемости опухолевых клеток или выживаемости раковых клеток, или ослаблению различных физиологических симптомов, ассоциированных с раковым состоянием. "Противоопухолевый эффект" или "противораковый эффект" также может проявляться в виде способности пептидов, полинуклеотидов, клеток и антител по настоящему изобретению в первую очередь предупреждать появление опухоли или рака.

Термин "аутологичный" относится к любому материалу, полученному от того же индивидуума, которому он позднее должен быть повторно введен.

Термин "аллогенный" относится к любому материалу, полученному от другого животного того же вида, что и индивидуум, которому данный материал вводят. Говорят, что два или более индивидуума являются аллогенными по отношению друг к другу, если их гены в одном или нескольких локусах не являются идентичными. В некоторых вариантах осуществления аллогенный материал от индивидуумов одного и того же вида может характеризоваться степенью генетической разнородности, достаточной для их антигенного взаимодействия.

Термин "ксеногенный" относится к трансплантату, полученному от животного другого вида.

Термин "аферез", используемый в данном документе, относится к признанному в данной области экстракорпоральному способу, при котором кровь донора или пациента отбирают у донора или пациента и пропускают через аппарат, который отделяет выбранные определенные составляющие компоненты, а остальную часть возвращает в кровоток донору или пациенту, например, посредством ретрансфузии. Таким образом, в контексте "образца, полученного путем афереза" подразумевают образец, полученный с использованием афереза.

Термин "рак" относится к заболеванию, которое характеризуется быстрым и неконтролируемым ростом аберрантных клеток. Раковые клетки могут распространяться локально или через кровоток и лимфатическую систему в другие части организма. Примеры различных видов рака описаны в данном документе и включают без ограничения рак молочной железы, рак предстательной железы, рак яичника, рак шейки матки, рак кожи, рак поджелудочной железы, колоректальный рак, рак почки, рак печени, рак головного мозга, лимфому, лейкоз, рак легкого и т. п. В некоторых вариантах осуществления виды рака, лечение которых осуществляют с помощью способов, описанных в данном документе, включают множественную миелому, лимфому Ходжкина или неходжкинскую лимфому.

Термины "опухоль" и "рак" используются в данном документе взаимозаменяемо, например, оба термина охватывают солидные опухоли и опухоли жидких тканей, например диффузные или циркулирующие. Используемый в данном документе термин "рак" или "опухоль" включает предзлокачественные, а также злокачественные виды рака и опухоли.

Используемый в данном документе термин "полученный из" указывает на взаимосвязь между первой и второй молекулами. Это обычно относится к структурному сходству между первой молекулой и второй молекулой и не имеет дополнительного значения или не включает ограничение способа или источника в отношении первой молекулы, которая получена из второй молекулы. Например, в случае с внутриклеточным сигнальным доменом, который получен из молекулы CD3-дзета, внутриклеточный сигнальный домен сохраняет структуру CD3-дзета в достаточной мере для того, чтобы характеризоваться необходимой функцией, а именно способностью образовывать сигнал в подходящих условиях. Это не имеет дополнительного значения или не включает ограничение в отношении конкретного способа получения внутриклеточного сигнального домена, например, это не означает, что для обеспечения наличия внутриклеточного сигнального домена нужно начинать с последовательности CD3-дзета и удалять нежелательную последовательность или вводить мутации для получения внутриклеточного сигнального домена.

Термин "консервативные модификации последовательности" относится к аминокислотным модификациям, которые не оказывают значительного влияния на характеристики связывания антитела или фрагмента антитела, содержащего аминокислотную последовательность, или не изменяют их в значительной степени. Такие консервативные модификации включают аминокислотные замены, добавления и делеции. Модификации могут быть введены в антитело или фрагмент антитела по настоящему изобретению с помощью стандартных методик, известных из уровня техники, таких как сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез. Консервативные замены представляют собой замены, при которых аминокислотный остаток заменяется аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, были определены в уровне техники. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, один или несколько аминокислотных остатков в CAR по настоящему изобретению можно заменить другими аминокислотными остатками из того же семейства боковых цепей, и измененный CAR можно протестировать с использованием функциональных анализов, описанных в данном документе.

Термин "стимуляция" в контексте стимуляции стимулирующей и/или костимулирующей молекулой относится к ответу, например первичному или вторичному ответу, индуцированному путем связывания стимулирующей молекулы (например, комплекса TCR/CD3) и/или костимулирующей молекулы (например, CD28 или 4-1BB) с ее когнатным лигандом, которое опосредует событие передачи сигнала, такое как без ограничения передача сигнала через комплекс TCR/CD3. Стимуляция может опосредовать изменение экспрессии определенных молекул и/или реорганизацию структур цитоскелета и т. п.

Термин "стимулирующая молекула" относится к молекуле, экспрессируемой Т-клеткой, которая обеспечивает цитоплазматическую(цитоплазматические) сигнальную(сигнальные) последовательность(последовательности), регулирующую(регулирующие) первичную активацию комплекса TCR стимулирующим образом в по меньшей мере некоторых аспектах сигнального пути T-клетки. В некоторых вариантах осуществления ITAM-содержащий домен в CAR воспроизводит передачу сигнала от первичного TCR независимо от эндогенных комплексов TCR. В некоторых вариантах осуществления первичный сигнал инициируется, например, путем связывания комплекса TCR/CD3 с молекулой МНС, нагруженной пептидом, и это приводит к опосредованию ответа Т-клеток, в том числе без ограничения пролиферации, активации, дифференцировки и т. п. Первичная цитоплазматическая сигнальная последовательность (также называемая "первичным сигнальным доменом"), которая действует стимулирующим образом, может содержать сигнальный мотив, известный как иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив или ITAM. Примеры ITAM-содержащей первичной цитоплазматической сигнальной последовательности, которая является особенно применимой в настоящем изобретении, включают без ограничения последовательности, полученные из TCR-дзета, FcR-гамма, FcR-бета, CD3-гамма, CD3-дельта, CD3-эпсилон, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 (также известного как "ICOS"), FcεRI и CD66d, DAP10 и DAP12. В конкретном CAR по настоящему изобретению внутриклеточный сигнальный домен в любом одном или нескольких CAR по настоящему изобретению содержит внутриклеточную сигнальную последовательность, например первичную сигнальную последовательность CD3-дзета. Термин "антигенпрезентирующая клетка" или "APC" относится к клетке иммунной системы, такой как антигенпрезентирующая клетка (например, B-клетка, дендритная клетка и т. п.), которая представляет чужеродный антиген в комплексе с молекулами главного комплекса гистосовместимости (MHC) на своей поверхности. Т-клетки могут распознавать эти комплексы с помощью своих T-клеточных рецепторов (TCR). АРС процессируют антигены и презентируют их Т-клеткам.

Используемый в данном документе термин "внутриклеточный сигнальный домен" относится к внутриклеточной части молекулы. В ряде вариантов осуществления внутриклеточный сигнальный домен передает сигнал эффекторной функции и направляет клетку на выполнение специализированной функции. Хотя может использоваться весь внутриклеточный сигнальный домен, во многих случаях отсутствует необходимость использовать всю цепь. В том случае, если используют усеченную часть внутриклеточного сигнального домена, такую усеченную часть можно использовать вместо интактной цепи, при условии, что она передает сигнал эффекторной функции. Таким образом, подразумевается, что термин "внутриклеточный сигнальный домен" включает любую усеченную часть внутриклеточного сигнального домена, достаточную для передачи сигнала эффекторной функции.

Внутриклеточный сигнальный домен генерирует сигнал, который способствует осуществлению иммунной эффекторной функции клеткой, содержащей CAR, например CART-клеткой. Примеры иммунной эффекторной функции, например, у CART-клетки, включают цитолитическую активность и хелперную активность, в том числе секрецию цитокинов.

В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен может содержать первичный внутриклеточный сигнальный домен. Иллюстративные первичные внутриклеточные сигнальные домены включают домены, полученные из молекул, отвечающих за первичную стимуляцию или антигензависимую стимуляцию. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен может содержать костимулирующий внутриклеточный домен. Иллюстративные костимулирующие внутриклеточные сигнальные домены включают домены, полученные из молекул, отвечающих за костимулирующие сигналы или антигеннезависимую стимуляцию. Например, в случае с CART первичный внутриклеточный сигнальный домен может содержать цитоплазматическую последовательность Т-клеточного рецептора, и костимулирующий внутриклеточный сигнальный домен может содержать цитоплазматическую последовательность корецептора или костимулирующей молекулы.

Первичный внутриклеточный сигнальный домен может содержать сигнальный мотив, который известен как иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив или ITAM. Примеры ITAM-содержащих первичных цитоплазматических сигнальных последовательностей включают без ограничения последовательности, полученные из CD3-дзета, FcR-гамма, FcR-бета, CD3-гамма, CD3-дельта, CD3-эпсилон, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 (также известного как "ICOS"), FcεRI, CD66d, DAP10 и DAP12.

Термин "дзета" или, в качестве альтернативы, "дзета-цепь", "CD3-дзета" или "TCR-дзета" относится к CD247. Под номером доступа Swiss-Prot P20963 представлены иллюстративные аминокислотные последовательности CD3-дзета человека. "Стимулирующий домен дзета", или в качестве альтернативы "стимулирующий домен CD3-дзета", или "стимулирующий домен TCR-дзета" относится к стимулирующему домену CD3-дзета или его варианту (например, молекуле, имеющей мутации, например точечные мутации, фрагменты, вставки или делеции). В некоторых вариантах осуществления цитоплазматический домен дзета содержит остатки 52-164 из последовательности под номером доступа в GenBank BAG36664.1 или ее варианта (например, молекулы имеющей мутации, например точечные мутации, фрагменты, вставки или делеции). В некоторых вариантах осуществления "стимулирующий домен дзета" или "стимулирующий домен CD3-дзета" представляет собой последовательность, представленную под SEQ ID NO: 9 или 10, или ее вариант (например, молекулу, имеющую мутации, например точечные мутации, фрагменты, вставки или делеции).

Термин "костимулирующая молекула" относится к когнатному партнеру по связыванию на Т-клетке, который специфично связывается с костимулирующим лигандом, за счет чего происходит опосредование костимулируемого ответа Т-клетки, такого как, без ограничения, пролиферация. Костимулирующие молекулы представляют собой молекулы клеточной поверхности, отличные от антигенных рецепторов или их лигандов, которые необходимы для эффективного иммунного ответа. Костимулирующие молекулы включают без ограничения молекулу MHC I класса, белковые рецепторы TNF, иммуноглобулиноподобные белки, рецепторы цитокинов, интегрины, сигнальные молекулы активации лимфоцитов (белки SLAM), активирующие рецепторы NK-клеток, BTLA, лиганд Toll-подобного рецептора, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8-альфа, CD8-бета, IL2R-бета, IL2R-гамма, IL7R-альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD28-OX40, CD28-4-1BB и лиганд, который специфично связывается с CD83.

Костимулирующий внутриклеточный сигнальный домен относится к внутриклеточной части костимулирующей молекулы.

Внутриклеточный сигнальный домен может содержать всю внутриклеточную часть или весь нативный внутриклеточный сигнальный домен молекулы, из которого он получен, или ее функциональный фрагмент.

Термин "4-1BB" относится к CD137 или представителю 9 суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли. Под номером доступа Swiss-Prot P20963 представлены иллюстративные аминокислотные последовательности 4-1BB человека. "Кoстимулирующий домен 4-1BB" относится к костимулирующему домену 4-1BB или его варианту (например, молекуле, имеющей мутации, например точечные мутации, фрагменты, вставки или делеции). В некоторых вариантах осуществления "костимулирующий домен 4-1BB" представляет собой последовательность, представленную под SEQ ID NO: 7, или ее вариант (например, молекулу, имеющую мутации, например точечные мутации, фрагменты, вставки или делеции).

Используемый в данном документе термин "иммунная эффекторная клетка" относится к клетке, которая вовлечена в иммунный ответ, например, способствуя осуществлению иммунного эффекторного ответа. Примеры иммунных эффекторных клеток включают Т-клетки, например альфа/бета-Т-клетки и гамма/дельта-Т-клетки, В-клетки, естественные клетки-киллеры (NK), естественные T-клетки-киллеры (NKT), тучные клетки и фагоциты миелоидного происхождения.

Используемый в данном документе термин "иммунная эффекторная функция или иммунный эффекторный ответ" относится к функции или ответу, например, иммунной эффекторной клетки, который усиливает иммунную атаку на клетку-мишень или способствуют ей. Например, иммунная эффекторная функция или ответ относятся к свойству T- или NK-клетки, которое способствует уничтожению или ингибированию роста или пролиферации клетки-мишени. В случае с Т-клеткой первичная стимуляция и костимуляция являются примерами иммунных эффекторных функции или ответа.

Термин "эффекторная функция" относится к специализированной функции клетки. Например, эффекторная функция Т-клетки может представлять собой цитолитическую активность или хелперную активность, в том числе секрецию цитокинов.

Термин "кодирование/кодирующий" относится к внутреннему свойству, присущему специфическим последовательностям нуклеотидов в полинуклеотиде, таким как ген, кДНК или мРНК, служить в качестве матриц для синтеза в ходе биологических процессов других полимеров и макромолекул, имеющих либо определенную последовательность нуклеотидов (т. е. рРНК, тРНК и мРНК), либо определенную последовательность аминокислот и биологические свойства, обусловленные ими. Таким образом, ген, кДНК или РНК кодирует белок, если в результате транскрипции и трансляции мРНК, соответствующей этому гену, в клетке или другой биологической системе продуцируется белок. Как кодирующая нить, нуклеотидная последовательность которой идентична последовательности мРНК и обычно представлена в перечнях последовательностей, так и некодирующая нить, используемая в качестве матрицы для транскрипции гена или кДНК, могут обозначаться как кодирующие белок или другой продукт данного гена или кДНК.

Если не указано иное, то "нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность" включает все нуклеотидные последовательности, которые являются вырожденными вариантами друг друга и которые кодируют одну и ту же аминокислотную последовательность. Фраза "нуклеотидная последовательность, которая кодирует белок или РНК" может также включать интроны в той мере, в которой нуклеотидная последовательность, кодирующая белок, может в каком-либо варианте содержать интрон(интроны).

Термины "эффективное количество" или "терапевтически эффективное количество" используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к количеству соединения, состава, материала или композиции, описанных в данном документе, эффективному для достижения конкретного биологического результата.

Термин "эндогенный" относится к любому материалу, полученному из организма, клетки, ткани или системы или продуцируемому внутри них.

Термин "экзогенный" относится к любому материалу, введенному в организм, клетку, ткань или систему или продуцируемому вне их.

Термин "экспрессия" относится к транскрипции и/или трансляции конкретной нуклеотидной последовательности. В некоторых вариантах осуществления экспрессия включает трансляцию mRNA, введенной в клетку.

Термин "вектор для переноса" относится к композиции, которая содержит выделенную нуклеиновую кислоту и которую можно применять для доставки выделенной нуклеиновой кислоты внутрь клетки. Из уровня техники известны многочисленные векторы, в том числе без ограничения линейные полинуклеотиды, полинуклеотиды, ассоциированные с ионными или амфифильными соединениями, плазмиды и вирусы. Таким образом, термин "вектор для переноса" включает автономно реплицирующуюся плазмиду или вирус. Данный термин также следует толковать таким образом, что он дополнительно включает неплазмидные и невирусные соединения, которые содействуют переносу нуклеиновой кислоты в клетки, такие как, например, полилизиновое соединение, липосома и т. п. Примеры вирусных векторов для переноса включают без ограничения аденовирусные векторы, векторы на основе аденоассоциированного вируса, ретровирусные векторы, лентивирусные векторы и т. п.

Термин "экспрессионный вектор" относится к вектору, который содержит рекомбинантный полинуклеотид, содержащий последовательности, контролирующие экспрессию, функционально связанные с нуклеотидной последовательностью, которая должна экспрессироваться. Экспрессионный вектор содержит достаточное количество цис-действующих элементов для экспрессии; а другие элементы для экспрессии могут предоставляться клеткой-хозяином или в системе для экспрессии in vitro. Экспрессионные векторы включают все векторы, известные из области техники, в том числе космиды, плазмиды (например, "голые" или содержащиеся в липосомах) и вирусы (например, лентивирусы, ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), в состав которых включен рекомбинантный полинуклеотид.

Термин "лентивирус" относится к роду из семейства Retroviridae. Лентивирусы являются уникальными среди ретровирусов в том, что способны инфицировать неделящиеся клетки; они могут доставлять значительное количество генетической информации в ДНК клетки-хозяина, поэтому они в качестве векторов являются одним из наиболее эффективных способов доставки генов. Все из HIV, SIV и FIV являются примерами лентивирусов.

Термин "лентивирусный вектор" относится к вектору, полученному из по меньшей мере части генома лентивируса, в том числе, в частности, к самоинактивирующемуся лентивирусному вектору, представленному в Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009). Другие примеры лентивирусных векторов, которые можно использовать в клинической практике, включают без ограничения, например, технологию доставки генов LENTIVECTOR® от Oxford BioMedica, векторную систему LENTIMAX™ от Lentigen и т. п. Неклинические типы лентивирусных векторов также являются доступными и известны специалисту в данной области.

Термин "гомологичный" или "идентичность" относится к идентичности последовательностей субъединиц у двух полимерных молекул, например двух молекул нуклеиновой кислоты, таких как две молекулы ДНК или две молекулы РНК, или двух молекул полипептидов. Если положение субъединицы в обеих из двух молекул занимает одна и та же мономерная субъединица, например, если положение в каждой из двух молекул ДНК занято аденином, то они являются гомологичными или идентичными по этому положению. Гомология между двумя последовательностями находится в прямой зависимости от количества совпадающих или гомологичных положений; например, если половина (например, пять положений в полимере длиной десять субъединиц) положений в двух последовательностях является гомологичной, то эти две последовательности являются гомологичными на 50%; если 90% положений (например, 9 из 10) являются совпадающими или гомологичными, то две последовательности являются гомологичными на 90%.

"Гуманизированные" формы антител, отличных от человеческих (например, мышиных), представляют собой химерные иммуноглобулины, цепи иммуноглобулинов или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab')2 или другие антигенсвязывающие подпоследовательности антител), которые содержат минимальную последовательность, полученную из иммуноглобулина, отличного от человеческого. В большинстве случаев гуманизированные антитела и фрагменты данных антител представляют собой иммуноглобулины человека (реципиентное антитело или фрагмент антитела), в которых остатки из области, определяющей комплементарность (CDR), реципиента заменены остатками из CDR вида, отличного от человека (донорного антитела), такого как мышь, крыса или кролик, обладающими требуемой специфичностью, аффинностью и способностью. В некоторых случаях остатки каркасной области (FR) Fv иммуноглобулина человека заменены соответствующими остатками, отличными от человеческих. Кроме того, гуманизированное антитело/фрагмент антитела может содержать остатки, не обнаруживаемые ни в реципиентном антителе, ни в импортированных последовательностях CDR или каркасных областей. С помощью этих модификаций можно дополнительно улучшить и оптимизировать функциональные характеристики антитела или фрагмента антитела. Как правило, гуманизированное антитело или фрагмент этого антитела будет содержать по существу все из по меньшей мере одного и, как правило, двух, вариабельных доменов, в которых все или по существу все CDR-области соответствуют областям иммуноглобулина, отличного от человеческого, и все FR-области или их значительная часть представляют собой области с последовательностью иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело или фрагмент антитела также может содержать по меньшей мере часть константной области (Fc) иммуноглобулина, как правило, иммуноглобулина человека. Дополнительные подробности см. в Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992.

"Полностью человеческий" относится к иммуноглобулину, такому как антитело или фрагмент антитела, где целая молекула имеет человеческое происхождение или состоит из аминокислотной последовательности, идентичной человеческой форме антитела или иммуноглобулина.

Термин "выделенный" означает измененный относительно природного состояния или извлеченный из него. Например, нуклеиновая кислота или пептид, в природных условиях присутствующие в живом животном, не являются "выделенными", однако те же нуклеиновая кислота или пептид, частично или полностью отделенные от материалов, сопутствующих им в их природном состоянии, являются "выделенными". Выделенные нуклеиновая кислота или белок могут находиться в по существу очищенной форме или могут находиться в ненативной среде, такой как, например, клетка-хозяин.

В контексте настоящего изобретения используются следующие сокращения для общераспространенных оснований нуклеиновых кислот. "А" относится к аденозину, "С" относится к цитозину, "G" относится к гуанозину, "Т" относится к тимидину, и "U" относится к уридину.

Термин "функционально связанный" или "транскрипционный контроль" относится к функциональной связи между регуляторной последовательностью и гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, приводящей к экспрессии последней. Например, первая последовательность нуклеиновой кислоты функционально связана со второй последовательностью нуклеиновой кислоты в тех случаях, когда первая последовательность нуклеиновой кислоты размещена в функциональной взаимосвязи со второй последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, если промотор влияет на транскрипцию или экспрессию кодирующей последовательности. Функционально связанные последовательности ДНК могут быть смежными друг с другом и, например, если необходимо соединить две области, кодирующие белок, находятся в одной и той же рамке считывания.

Термин "парентеральное" введение иммуногенной композиции включает, например, методики подкожной (s.c.), внутривенной (i.v.), внутримышечной (i.m.) или внутригрудинной инъекции, внутриопухолевого введения или инфузии.

Термин "нуклеиновая кислота", "молекула нуклеиновой кислоты", "полинуклеотид" или "молекула полинуклеотида" означает дезоксирибонуклеиновые кислоты (DNA) или рибонуклеиновые кислоты (РНК) и их полимеры в одно- или двухнитевой форме. Если специально не ограничено, то данный термин охватывает нуклеиновые кислоты, содержащие известные аналоги природных нуклеотидов, которые обладают свойствами связывания, сходными со свойствами эталонной нуклеиновой кислоты, и метаболизируются посредством механизма, сходного с механизмом для встречающихся в природе нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления "нуклеиновая кислота", "молекула нуклеиновой кислоты", "полинуклеотид" или "молекула полинуклеотида" предусматривает производное или аналог нуклеотида/нуклеозида. Если не указано иное, конкретная последовательность нуклеиновой кислоты также в неявной форме охватывает ее варианты с консервативными модификациями (например, с заменами вырожденными кодонами, например консервативными заменами), аллели, ортологи, SNP и комплементарные последовательности, а также последовательность, указанную в явной форме. В частности, замены вырожденными кодонами, например консервативные замены, можно осуществлять посредством образования последовательностей, в которых в третьем положении одного или нескольких выбранных (или всех) кодонов произведена замена любым из канонических оснований и/или остатками дезоксиинозина (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); и Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).

Термины "пептид", "полипептид" и "белок" используются взаимозаменяемо и относятся к соединению, состоящему из аминокислотных остатков, ковалентно связанных пептидными связями. Белок или пептид должен содержать по меньшей мере две аминокислоты, и не установлено ограничение на максимальное количество аминокислот, которые может содержать последовательность белка или пептида. Полипептиды включают любой пептид или белок, содержащий две или более аминокислоты, соединенные друг с другом пептидными связями. Используемый в данном документе термин относится как к коротким цепям, которые также, как правило, называются в уровне техники, например, пептидами, олигопептидами и олигомерами, так и к более длинным цепям, которые обычно называются в уровне техники белками, которых существует множество типов. "Полипептиды" включают, например, среди прочих, биологически активные фрагменты, по существу гомологичные полипептиды, олигопептиды, гомодимеры, гетеродимеры, варианты полипептидов, модифицированные полипептиды, производные, аналоги, слитые белки. Полипептид включает природный пептид, рекомбинантный пептид или их комбинацию.

Термин "промотор" относится к последовательности ДНК, распознаваемой синтетическим аппаратом клетки или введенным синтетическим аппаратом, которая необходима для инициации специфической транскрипции полинуклеотидной последовательности.

Термин "промоторная/регуляторная последовательность" относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая необходима для экспрессии продукта гена, функционально связанного с промоторной/регуляторной последовательностью. В некоторых случаях эта последовательность может являться коровой промоторной последовательностью, а в других случаях эта последовательность может также содержать энхансерную последовательность и другие регуляторные элементы, которые необходимы для экспрессии продукта гена. Например, промоторная/регуляторная последовательность может представлять собой последовательность, которая обеспечивает экспрессию продукта гена тканеспецифическим образом.

Термин "конститутивный промотор" относится к нуклеотидной последовательности, которая, находясь в функциональной связи с полинуклеотидом, который кодирует или определяет продукт гена, обуславливает продуцирование продукта гена в клетке при большинстве или всех физиологических условиях клетки.

Термин "индуцируемый промотор" относится к нуклеотидной последовательности, которая, находясь в функциональной связи с полинуклеотидом, который кодирует или определяет продукт гена, обуславливает продуцирование продукта гена в клетке по существу только в случае присутствия в клетке индуктора, который соответствует данному промотору.

Термин "тканеспецифический промотор" относится к нуклеотидной последовательности, которая, находясь в функциональной связи с полинуклеотидом, который кодирует или определяет ген, обуславливает продуцирование продукта гена в клетке по существу только в том случае, если клетка является клеткой из того типа ткани, который соответствует данному промотору.

Термины "антиген, ассоциированный с раком", "опухолевый антиген", "антиген, связанный с гиперпролиферативным нарушением" и "антиген, ассоциированный с гиперпролиферативным нарушением" взаимозаменяемо относятся к антигенам, которые являются общими для специфических гиперпролиферативных нарушений. В некоторых вариантах осуществления такие термины относятся к молекуле (как правило, белку, углеводу или липиду), которая экспрессируется на поверхности раковой клетки, либо полностью, либо в виде фрагмента (например, молекула MHC/пептид), и которая применима для предпочтительного нацеливания фармакологического средства на раковую клетку. В некоторых вариантах осуществления опухолевый антиген представляет собой маркер, экспрессируемый как нормальными клетками, так и раковыми клетками, например маркер линии дифференцировки, например CD19 на В-клетках. В некоторых вариантах осуществления опухолевый антиген представляет собой молекулу клеточной поверхности, которая в раковой клетке сверхэкспрессируется по сравнению с нормальной клеткой, например, характеризуется 1-кратной сверхэкспрессией, 2-кратной сверхэкспрессией, 3-кратной или большей сверхэкспрессией по сравнению с нормальной клеткой. В некоторых вариантах осуществления опухолевый антиген представляет собой молекулу клеточной поверхности, которая синтезируется в раковой клетке ненадлежащим образом, например, молекулу, которая содержит делеции, добавления или мутации по сравнению с молекулой, экспрессируемой на нормальной клетке. В некоторых вариантах осуществления опухолевый антиген будет экспрессироваться исключительно на клеточной поверхности раковой клетки, полностью или в виде фрагмента (например, молекула MHC/пептид) и не будет синтезироваться или экспрессироваться на поверхности нормальной клетки. В некоторых вариантах осуществления антигены, связанные с гиперпролиферативным нарушением, по настоящему изобретению получены из видов рака, включающих без ограничения первичную или метастатическую меланому, тимому, лимфому, саркому, рак легкого, рак печени, неходжкинскую лимфому, лимфому Ходжкина, виды лейкоза, рак матки, рак шейки матки, рак мочевого пузыря, рак почки и виды аденокарциномы, такие как рак молочной железы, рак предстательной железы (например, кастрационнорезистентный рак предстательной железы, или рак предстательной железы, резистентный к терапии, или метастатический рак предстательной железы), рак яичника, рак поджелудочной железы и т. п., или нарушение пролиферации плазматических клеток, например бессимптомную миелому ("тлеющую" множественную миелому или вялотекущую миелому), моноклональную гаммапатию неясного генеза (MGUS), макроглобулинемию Вальденстрема, виды плазмоцитомы (например, плазмоклеточную дискразию, солитарную миелому, солитарную плазмоцитому, экстрамедуллярную плазмоцитому и множественную плазмоцитому), системный амилоидоз в форме амилоидоза легких цепей и POEMS-синдром (также известный как синдром Кроу-Фукаса, болезнь Такатсуки и PEP-синдром). В некоторых вариантах осуществления CAR по настоящему изобретению включают CAR, содержащие антигенсвязывающий домен (например, антитело или фрагмент антитела), который связывается с пептидом, презентируемым молекулой MHC. Обычно пептиды, происходящие из эндогенных белков, заполняют карманы молекул главного комплекса гистосовместимости (MHC) I класса и распознаются T-клеточными рецепторами (TCR) на CD8+ T-лимфоцитах. Комплексы молекул MHC I класса конститутивно экспрессируются всеми ядросодержащими клетками. При раке комплексы вирусоспецифический и/или опухолеспецифический пептид/молекула MHC представляют собой уникальный класс мишеней клеточной поверхности для иммунотерапии. Были описаны TCR-подобные антитела, нацеливающиеся на пептиды, происходящие из вирусных или опухолевых антигенов, представленные в контексте лейкоцитарного антигена человека (HLA)-A1 или HLA-A2 (см., например, Sastry et al., J Virol. 2011 85(5):1935-1942; Sergeeva et al., Blood, 2011 117(16):4262-4272; Verma et al., J Immunol 2010 184(4):2156-2165; Willemsen et al., Gene Ther 2001 8(21) :1601-1608; Dao et al., Sci Transl Med 2013 5(176) :176ra33 ; Tassev et al., Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100). Например, TCR-подобное антитело можно идентифицировать при скрининге библиотеки, такой как фаг-дисплейная библиотека scFv человека.

Термины "антиген, обеспечивающий поддержание опухоли" или "антиген, обеспечивающий поддержание рака" взаимозаменяемо относятся к молекуле (как правило, белку, углеводу или липиду), которая экспрессируется на поверхности клетки, которая сама по себе не является раковой, но обеспечивает поддержание раковых клеток, например, путем способствования их росту или выживанию, например, устойчивость к иммунным клеткам. Иллюстративные клетки данного типа включают стромальные клетки и супрессорные клетки миелоидного происхождения (MDSC). Антиген, обеспечивающий поддержание опухоли, сам по себе не обязательно играет роль в поддержании опухолевых клеток, при условии, что антиген присутствует в клетке, которая обеспечивает поддержание раковых клеток.

Термин "гибкий полипептидный линкер" или "линкер", используемый применительно к scFv, относится к пептидному линкеру, который состоит из аминокислот, таких как глициновые и/или сериновые остатки, используемые в отдельности или в комбинации, для связывания вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи друг с другом. В некоторых вариантах осуществления гибкий полипептидный линкер представляет собой линкер Gly/Ser и содержит аминокислотную последовательность (Gly-Gly-Gly-Ser)n, где n представляет собой положительное целое число, равное 1 или больше (SEQ ID NO: 41). Например, n=1, n=2, n=3, n=4, n=5 и n=6, n=7, n=8, n=9, и n=10. В некоторых вариантах осуществления гибкие полипептидные линкеры включают без ограничения (Gly4Ser)4 (SEQ ID NO: 27) или (Gly4 Ser)3 (SEQ ID NO: 28). В некоторых вариантах осуществления линкеры содержат множественные повторы (Gly2Ser) (GlySer) или (Gly3Ser) (SEQ ID NO: 25). Также в объем настоящего изобретения включены линкеры, описанные в WO2012/138475, включенной в данный документ посредством ссылки.

Как используется в данном документе, 5'-кэп (также называемый РНК-кэпом, 7-метилгуанозиновым РНК-кэпом или РНК-кэпом m7G) представляет собой модифицированный гуаниновый нуклеотид, который добавляется к "переднему", или 5'-концу, эукариотической матричной РНК вскоре после начала транскрипции. 5'-кэп состоит из концевой группы, которая связана с первым транскрибированным нуклеотидом. Его присутствие является критически важным для распознавания рибосомой и защиты от РНКаз. Добавление кэпа сопряжено с транскрипцией и происходит совместно с транскрипцией, так что каждое из этих событий влияет на другое. Вскоре после начала транскрипции 5'-конец синтезируемой мРНК связывается с кэп-синтезирующим комплексом, ассоциированным с РНК-полимеразой. Этот ферментативный комплекс катализирует химические реакции, которые необходимы для кэпирования мРНК. Синтез протекает в виде многоступенчатой биохимической реакции. Кэпирующий фрагмент можно модифицировать для модулирования функциональных свойств мРНК, таких как ее стабильность или эффективность трансляции.

Как используется в данном документе, "РНК, транскрибированная in vitro" относится к РНК, предпочтительно мРНК, которая была синтезирована in vitro. В некоторых вариантах осуществления РНК представляет собой мРНК. Обычно РНК, транскрибированная in vitro, образуется из вектора транскрипции in vitro. Вектор транскрипции in vitro содержит матрицу, используемую для образования РНК, транскрибированной in vitro.

Как используется в данном документе, "поли(А)" представляет собой последовательный ряд аденозиновых остатков, присоединенных путем полиаденилирования к мРНК. В некоторых вариантах осуществления конструкции для транзиентной экспрессии длина поли(А) составляет от 50 до 5000. В некоторых вариантах осуществления длина поли(А) составляет более 64. В некоторых вариантах осуществления длина поли(А) составляет более 100. В некоторых вариантах осуществления длина поли(А) составляет более 300. В некоторых вариантах осуществления длина поли(А) составляет более 400. Последовательности поли(A) можно модифицировать с помощью химических средств или ферментов для модулирования функциональных свойств мРНК, таких как локализация, стабильность или эффективность трансляции.

Как используется в данном документе, "полиаденилирование" относится к ковалентной связи полиаденилилового фрагмента или его модифицированного варианта с молекулой матричной РНК. У эукариотических организмов большинство молекул матричной РНК (мРНК) являются полиаденилированными на 3'-конце. 3'-концевой поли(А)-хвост представляет собой длинную последовательность адениновых нуклеотидов (часто несколько сотен), добавленных к пре-мРНК под действием фермента полиаденилатполимеразы. У высших эукариот поли(А)-хвост добавляется к транскриптам, которые содержат определенную последовательность - сигнал полиаденилирования. Поли(А)-хвост и связанный с ним белок содействуют защите мРНК от разрушения экзонуклеазами. Полиаденилирование также важно для терминации транскрипции, экспорта мРНК из ядра и трансляции. Полиаденилирование происходит в ядре сразу после транскрипции ДНК в РНК, но дополнительно может также происходить позднее в цитоплазме. После завершения транскрипции цепь мРНК расщепляется под действием эндонуклеазного комплекса, ассоциированного с РНК-полимеразой. Сайт расщепления обычно характеризуется наличием последовательности оснований AAUAAA вблизи сайта расщепления. После того, как мРНК была расщеплена, к свободному 3'-концу в сайте расщепления добавляются аденозиновые остатки.

Как используется в данном документе, "транзиентный" относится к экспрессии неинтегрированного трансгена в течение периода нескольких часов, дней или недель, где период времени экспрессии является меньшим, чем период времени для экспрессии гена в случае, если он интегрирован в геном или содержится в стабильном плазмидном репликоне в клетке-хозяине.

Используемые в данном документе термины "лечить", "лечение" и "осуществление лечения" относятся к снижению скорости или ослаблению прогрессирования, снижению тяжести и/или продолжительности пролиферативного нарушения или ослаблению одного или нескольких симптомов (предпочтительно, одного или нескольких различимых симптомов) пролиферативного нарушения в результате введения одного или нескольких средств терапии (например, одного или нескольких терапевтических средств, таких как CAR по настоящему изобретению). В конкретных вариантах осуществления термины "лечить", "лечение" и "осуществление лечения" относятся к ослаблению по меньшей мере одного измеряемого физического параметра пролиферативного нарушения, такого как рост опухоли, не обязательно различимого для пациента. В других вариантах осуществления термины "лечить", "лечение" и "осуществление лечения" относятся к ингибированию прогрессирования пролиферативного нарушения либо на физическом уровне, например, посредством стабилизации различимого симптома, либо на физиологическом уровне, например, посредством стабилизации физического параметра, либо как на одном, так и на втором уровнях. В других вариантах осуществления термины "лечить", "лечение" и "осуществление лечения" относятся к снижению или стабилизации размера опухоли или количества раковых клеток.

Термин "путь передачи сигнала" относится к биохимической взаимосвязи между различными молекулами-переносчиками сигналов, которые играют роль в передаче сигнала от одной части клетки к другой части клетки. Фраза "рецептор клеточной поверхности" включает молекулы и комплексы молекул, способные принимать сигнал и передавать сигнал через мембрану клетки.

Термин "субъект" предполагает включение живых организмов, у которых можно вызвать иммунный ответ (например, млекопитающих, человека).

Термин "по существу очищенная клетка" относится к клетке, которая по сути свободна от других типов клеток. "По существу очищенная клетка" также относится к клетке, которая была отделена от других типов клеток, с которыми она обычно ассоциирована в своем встречающемся в природе состоянии. В некоторых случаях популяция по существу очищенных клеток относится к однородной популяции клеток. В других случаях данный термин просто относится к клетке, которая была отделена от клеток, с которыми она в природных условиях ассоциирована в своем природном состоянии. В некоторых вариантах осуществления клетки культивируют in vitro. В некоторых вариантах осуществления клетки не культивируют in vitro.

Используемый в данном документе термин "терапевтический" означает лечение. Терапевтический эффект получают путем ослабления, подавления, ремиссии или устранения болезненного состояния.

Используемый в данном документе термин "профилактика" означает предупреждение или профилактическое лечение заболевания или болезненного состояния.

Термины "трансфицированный", или "трансформированный", или "трансдуцированный" относятся к процессу, в ходе которого экзогенную нуклеиновую кислоту переносят или вводят в клетку-хозяина. "Трансфицированная", или "трансформированная", или "трансдуцированная" клетка представляет собой клетку, которая была подвергнута трансфекции, трансформации или трансдукции с помощью экзогенной нуклеиновой кислоты. Такая клетка включает первичную клетку субъекта и ее потомство.

Термин "специфично связывается" относится к антителу или лиганду, которые распознают своего когнатного белкового партнера по связыванию (например, стимулирующую и/или костимулирующую молекулу, присутствующую на Т-клетке), присутствующего в образце, и связываются с ним, но при этом это антитело или лиганд по существу не распознают или не связывают другие молекулы в образце.

Как используется в данном документе, "регулируемый химерный антигенный рецептор (RCAR)" относится к набору полипептидов, как правило, в простейших вариантах осуществления двух, которые, находясь в иммунной эффекторной клетке, наделяют клетку специфичностью в отношении клетки-мишени, как правило, раковой клетки, и образованием внутриклеточного сигнала. В некоторых вариантах осуществления RCAR содержит по меньшей мере внеклеточный антигенсвязывающий домен, трансмембранный и цитоплазматический сигнальный домен (также называемый в данном документе "внутриклеточным сигнальным доменом"), содержащий функциональный сигнальный домен, полученный из стимулирующей молекулы и/или костимулирующей молекулы, как определено в данном документе применительно к молекуле CAR. В некоторых вариантах осуществления полипептиды из совокупности в RCAR не являются смежными друг с другом, например находятся в разных полипептидных цепях. В некоторых вариантах осуществления RCAR содержит димеризационный переключатель, который при наличии димеризационной молекулы может связывать полипептиды друг с другом, например, может связывать антигенсвязывающий домен с внутриклеточным сигнальным доменом. В некоторых вариантах осуществления RCAR экспрессируется в клетке (например, иммунной эффекторной клетке), описанной в данном документе, например в клетке, экспрессирующей RCAR (также называемой в данном документе "RCAR-X-клеткой"). В некоторых вариантах осуществления RCARX-клетка представляет собой T-клетку и называется RCART-клеткой. В некоторых вариантах осуществления RCARX-клетка представляет собой NK-клетку и называется RCARN-клеткой. RCAR может наделять клетку, экспрессирующую RCAR, специфичностью в отношении клетки-мишени, как правило, раковой клетки, и регулируемым образованием внутриклеточного сигнала или пролиферацией, что может оптимизировать иммуноэффекторное свойство клетки, экспрессирующей RCAR. В ряде вариантов осуществления клетка с RCAR по меньшей мере частично зависит от антигенсвязывающего домена в обеспечении специфичности в отношении клетки-мишени, которая содержит антиген, связываемый антигенсвязывающим доменом.

Используемый в данном документе термин "мембранный якорь" или "домен прикрепления к мембране" относится к полипептиду или фрагменту, например к миристоильной группе, достаточному для заякоривания внеклеточного или внутриклеточного домена на плазматической мембране.

Используемый в данном документе термин "переключающий домен", например, в отношении RCAR, относится к объекту, обычно полипептидному объекту, который в присутствии димеризующей молекулы ассоциирует с другим переключающим доменом. Ассоциация приводит к функциональному связыванию первого объекта, связанного, например, слитого, с первым переключающим доменом, и второго объекта, связанного, например, слитого, со вторым переключающим доменом. Первый и второй переключающие домены в совокупности называются димеризационным переключателем. В ряде вариантов осуществления первый и второй переключающие домены являются одинаковыми, например, они являются полипептидами, имеющими одинаковую первичную аминокислотную последовательность, и в совокупности называются гомодимеризационным переключателем. В ряде вариантов осуществления первый и второй переключающие домены отличаются друг от друга, например, они являются полипептидами, имеющими разные первичные аминокислотные последовательности, и в совокупности называются гетеродимеризационным переключателем. В ряде вариантов осуществления переключатель является внутриклеточным. В ряде вариантов осуществления переключатель является внеклеточным. В некоторых вариантах осуществления переключающий домен представляет собой полипептидный объект, например объект на основе FKBP или FRB, а димеризующая молекула представляет собой малую молекулу, например рапалог. В ряде вариантов осуществления переключающий домен представляет собой полипептидный объект, например scFv, который связывает пептид myc, а димеризующая молекула представляет собой полипептид, его фрагмент или мультимер полипептида, например лиганд myc или мультимеры лиганда myc, которые связываются с одним или несколькими scFv для myc. В ряде вариантов осуществления переключающий домен представляет собой полипептидный объект, например, рецептор для myc, а димеризующая молекула представляет собой антитело или его фрагменты, например антитело к myc.

Используемый в данном документе термин "димеризующая молекула", например, в отношении RCAR, относится к молекуле, которая способствует образованию ассоциации первого переключающего домена со вторым переключающим доменом. В ряде вариантов осуществления димеризующая молекула не встречается у субъекта в природе или не встречается в концентрациях, которые могут привести к значительной степени димеризации. В ряде вариантов осуществления димеризующая молекула представляет собой малую молекулу, например рапамицин или рапалог, например RAD001.

Термин "низкая доза, усиливающая иммунный ответ" при использовании в отношении ингибитора mTOR, например аллостерического ингибитора mTOR, например RAD001 или рапамицина, или каталитического ингибитора mTOR, относится к дозе ингибитора mTOR, которая обеспечивает частичное, но не полное, ингибирование активности mTOR, например, согласно измерению по ингибированию активности киназы P70-S6. Способы оценки активности mTOR, например, по ингибированию киназы P70-S6, обсуждаются в данном документе. Доза является недостаточной, чтобы вызвать полное подавление иммунитета, но достаточной для усиления иммунного ответа. В некоторых вариантах осуществления низкая доза, усиливающая иммунный ответ, ингибитора mTOR приводит к уменьшению количества PD-1-положительных Т-клеток и/или увеличению количества PD-1-отрицательных Т-клеток или увеличению соотношения PD-1-отрицательные Т-клетки/PD-1-положительные Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления низкая доза, усиливающая иммунный ответ, ингибитора mTOR приводит к увеличению количества необученных Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления низкая доза, усиливающая иммунный ответ, ингибитора mTOR приводит к одному или нескольким из следующего:

повышению экспрессии одного или нескольких из следующих маркеров: CD62L^высок., CD127^высок., CD27⁺ и BCL2, например, на Т-клетках памяти, например на предшественниках Т-клеток памяти;

снижению экспрессии KLRG1, например, на Т-клетках памяти, например на предшественниках Т-клеток памяти; и

увеличению количества предшественников Т-клеток памяти, например клеток с любой из следующих характеристик или их комбинацией: повышенным уровнем CD62L^высок., повышенным уровнем CD127^высок., повышенным уровнем CD27⁺, сниженным уровнем KLRG1 и повышенным уровнем BCL2;

где любое из изменений, описанных выше, происходит, например, по меньшей мере транзиентно, например, по сравнению с субъектом, не получающим лечение.

Как используется в данном документе "рефрактерный" относится к заболеванию, например раку, которое не отвечает на лечение. В ряде вариантов осуществления рефрактерный рак может быть устойчивым к лечению до или в начале лечения. В других вариантах осуществления рефрактерный рак может стать устойчивым в ходе лечения. Рефрактерный рак также называют устойчивым раком.

Как используется в данном документе, "рецидивирующий" или "рецидив" относится к повторному появлению заболевания (например, рака) или признаков и симптомов заболевания, такого как рак, после периода улучшения или восприимчивости, например после предшествующего лечения с помощью терапии, например противораковой терапии. Начальный период восприимчивости может предусматривать падение уровня раковых клеток ниже определенного порога, например ниже 20%, 1%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1%. Повторное появление может предусматривать возрастание уровня раковых клеток выше определенного порога, например выше 20%, 1%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1%. Например, применительно к B-ALL повторное появление может предусматривать, например, повторное появление бластных клеток в крови, костном мозге (> 5%) или любом экстрамедуллярном участке после достижения полного ответа. Полный ответ в данном контексте может предусматривать < 5% бластных клеток в BM. В более широком смысле в некоторых вариантах осуществления ответ (например, полный ответ или частичный ответ) может предусматривать отсутствие выявляемого MRD (минимального остаточного заболевания). В некоторых вариантах осуществления начальный период восприимчивости продолжается в течение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5 или 6 дней; по меньшей мере 1, 2, 3 или 4 недель; по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10 или 12 месяцев или по меньшей мере 1, 2, 3, 4 или 5 лет.

Диапазоны: во всем настоящем раскрытии различные варианты осуществления настоящего изобретения могут быть представлены в формате диапазонов. Следует понимать, что описание в формате диапазонов служит лишь для удобства и краткости и не должно рассматриваться как жесткое ограничение объема настоящего изобретения. Соответственно, описание диапазона следует рассматривать как конкретно раскрывающее все возможные поддиапазоны, а также отдельные числовые значения в пределах этого диапазона. Например, описание такого диапазона, как от 1 до 6, следует рассматривать как конкретно раскрывающее такие поддиапазоны, как от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 2 до 4, от 2 до 6, от 3 до 6 и т. д., а также отдельные числа в пределах этого диапазона, например, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 и 6. В качестве другого примера, такой диапазон, как 95-99% идентичность, включает что-либо с 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью и включает такие поддиапазоны, как 96-99%, 96-98%, 96-97%, 97-99%, 97-98% и 98-99% идентичность. Это применимо независимо от ширины диапазона.

Используемый в данном документе термин "система редактирования генов" относится к системе, например одной или нескольким молекулам, которые управляют изменением, например делецией, и осуществляют его в одной или нескольких нуклеиновых кислотах в сайте геномной ДНК, на которую нацеливается указанная система, или рядом с ним. Системы редактирования генов известны из уровня техники и более подробно описаны ниже.

Как используется в данном документе, вводимый "в комбинации" означает, что два (или более) различных средства для лечения доставляют субъекту в период, когда субъект страдает нарушением, например два или более средства для лечения доставляют после того, как у субъекта было диагностировано нарушение, и до того, как нарушение было излечено или устранено или лечение было прекращено по другим причинам. В некоторых вариантах осуществления доставка одного средства для лечения по-прежнему происходит, когда начинается доставка второго, так что в отношении введения имеет место перекрывание. Это иногда упоминается в данном документе как "одновременная" или "параллельная" доставка. В других вариантах осуществления доставка одного средства для лечения заканчивается до начала доставки другого средства для лечения. В некоторых вариантах осуществления в любом из случаев лечение является более эффективным благодаря комбинированному введению. Например, второе средство для лечения является более эффективным, например эквивалентный эффект наблюдается при меньшем количестве второго средства для лечения, или второе средство для лечения снижает интенсивность симптомов в большей степени, чем наблюдалось бы при введении второго средства для лечения в отсутствие первого средства для лечения, или аналогичная ситуация наблюдается с первым средством для лечения. В некоторых вариантах осуществления доставка является такой, при которой снижение интенсивности симптома или другого параметра, связанного с нарушением, является большим, чем наблюдалось бы при доставке одного средства для лечения в отсутствие другого. Эффект двух средств для лечения может быть частично аддитивным, полностью аддитивным или превышающим аддитивный. Доставка может быть такой, что эффект от первого доставленного средства для лечения все еще поддается выявлению при доставке второго.

Термины "истощение" или "истощать", используемые взаимозаменяемо в данном документе, относятся к уменьшению или снижению уровня или количества клетки, белка или макромолекулы в образце после осуществления процесса, например стадии отбора, например отрицательного отбора. Истощение может быть полным или частичным истощением по клетке, белку или макромолекуле. В некоторых вариантах осуществления истощение представляет собой уменьшение или снижение уровня или количества клетки, белка или макромолекулы на по меньшей мере 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, или 99% по сравнению с уровнем или количеством клетки, белка или макромолекулы в образце перед осуществлением процесса.

Как используется в данном документе "необученная Т-клетка" относится к Т-клетке, которая не является опытной в отношении антигена. В некоторых вариантах осуществления Т-клетка, которая не является опытной в отношении антигена, встречала свой когнатный антиген в тимусе, но не на периферии. В некоторых вариантах осуществления необученные Т-клетки являются предшественниками клеток памяти. В некоторых вариантах осуществления необученные Т-клетки экспрессируют как CD45RA, так и CCR7, но не экспрессируют CD45RO. В некоторых вариантах осуществления необученные Т-клетки могут характеризоваться экспрессией CD62L, CD27, CCR7, CD45RA, CD28 и CD127 и отсутствием CD95 или изоформы CD45RO. В некоторых вариантах осуществления необученные Т-клетки экспрессируют CD62L, рецептор-α IL-7, рецептор IL-6 и CD132, но не экспрессируют CD25, CD44, CD69 или CD45RO. В некоторых вариантах осуществления необученные Т-клетки экспрессируют CD45RA, CCR7 и CD62L, и не экспрессируют CD95 или рецептор-β IL-2. В некоторых вариантах осуществления уровни экспрессии маркеров на поверхности оценивают с применением проточной цитометрии.

Термин "центральные T-клетки памяти" относится к субпопуляции T-клеток, которые у людей являются CD45RO-положительными и экспрессируют CCR7. В некоторых вариантах осуществления центральные T-клетки памяти экспрессируют CD95. В некоторых вариантах осуществления центральные T-клетки памяти экспрессируют IL-2R, IL-7R и/или IL-15R. В некоторых вариантах осуществления центральные T-клетки памяти экспрессируют CD45RO, CD95, рецептор-β IL-2, CCR7 и CD62L. В некоторых вариантах осуществления уровни экспрессии маркеров на поверхности оценивают с применением проточной цитометрии.

Термин "стволовые T-клетки памяти", "T-клетки памяти, представляющие собой стволовые клетки", "T-клетки памяти, подобные стволовым клеткам", "стволовые памяти T-клетки", "Т-клетки памяти стволовые", "клетки памяти, представляющие собой Т-клетки стволовые" или "TSCM-клетки" относится к субпопуляции T-клеток памяти со способностью подобной таковой у стволовых клеток, например, способностью к самообновлению и/или с мультипотентным потенциалом к преобразованию в субпопуляции T-клеток памяти и/или эффектoрных Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления стволовые T-клетки памяти экспрессируют CD45RA, CD95, рецептор-β IL-2, CCR7 и CD62L. В некоторых вариантах осуществления уровни экспрессии маркеров на поверхности оценивают с применением проточной цитометрии. В некоторых вариантах осуществления иллюстративные стволовые T-клетки памяти раскрыты в Gattinoni et al., Nat Med. 2017 January 06; 23(1): 18-27, включенной в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Для ясности, если не указано иное, классификация клетки или популяции клеток в качестве "неэкспрессирующих", или характеризующихся "отсутствием" определенного маркера, или являющихся "отрицательными в отношении" определенного маркера может не обязательно означать абсолютное отсутствие маркера. Специалист в данной области техники может с легкостью сравнить клетку с положительным и/или отрицательным контролем, и/или установить предварительно определяемое пороговое значение и классифицировать клетку или популяцию клеток в качестве неэкспрессирующих или являющихся отрицательными в отношении маркера, если клетка характеризуется уровнем экспрессии ниже предварительно определенного порогового значения или популяция клеток характеризуется общим уровнем экспрессии ниже предварительно определенного порогового значения с применением традиционных способов обнаружения, например, с применением проточной цитометрии, например, как описано в примерах в данном документе. Например, иллюстративные стратегии гейтирования показаны на фиг. 1G. Например, CCR7-положительные, CD45RO-отрицательные клетки показаны в верхнем левом квадранте на фиг. 1G.

Используемый в данном документе термин "показатель GeneSetScore (активируемые в TEM относительно подавляемых в TSCM)" клетки относится к баллу, который отражает степень, в которой клетка демонстрирует фенотип эффектoрной Т-клетки памяти (TEM) по сравнению с фенотипом T-клетки памяти, представляющей собой стволовую клетку (TSCM). Более высокий показатель GeneSetScore (активируемые в TEM относительно подавляемых в TSCM) указывает на увеличение степени выраженности фенотипа TEM, при этом более низкий показатель GeneSetScore (активируемые в TEM относительно подавляемых в TSCM) указывает на увеличение степени выраженности фенотипа TSCM. В некоторых вариантах осуществления показатель GeneSetScore (активируемые в TEM относительно подавляемых в TSCM) определяют путем измерения экспрессии одного или нескольких генов, которые активируются в TEM-клетках и/или подавляются в TSCM-клетках, например, одного или нескольких генов, выбранных из группы, состоящей из MXRA7, CLIC1, NAT13, TBC1D2B, GLCCI1, DUSP10, APOBEC3D, CACNB3, ANXA2P2, TPRG1, EOMES, MATK, ARHGAP10, ADAM8, MAN1A1, SLFN12L, SH2D2A, EIF2C4, CD58, MYO1F, RAB27B, ERN1, NPC1, NBEAL2, APOBEC3G, SYTL2, SLC4A4, PIK3AP1, PTGDR, MAF, PLEKHA5, ADRB2, PLXND1, GNAO1, THBS1, PPP2R2B, CYTH3, KLRF1, FLJ16686, AUTS2, PTPRM, GNLY и GFPT2. В некоторых вариантах осуществления показатель GeneSetScore (активируемые в TEM относительно подавляемых в TSCM) определяют для каждой клетки с применением секвенирования РНК, например секвенирования РНК одной клетки (scRNA-seq), что, например, проиллюстрировано в примере 10 в отношении фиг. 39A. В некоторых вариантах осуществления показатель GeneSetScore (активируемые в TEM относительно подавляемых в TSCM) рассчитывают с использованием среднего логарифмического нормализованного значения экспрессии гена для всех генов в наборе генов.

Используемый в данном документе термин "показатель GeneSetScore (активируемые в Treg относительно подавляемых в Teff)" клетки относится к баллу, который отражает степень, в которой клетка демонстрирует фенотип регуляторной Т-клетки (Treg) по сравнению с фенотипом эффекторной Т-клетки (Teff). Более высокий показатель GeneSetScore (активируемые в Treg относительно подавляемых в Teff) указывает на увеличение выраженности фенотипа Treg, при этом более низкий показатель GeneSetScore (активируемые в Treg относительно подавляемых в Teff) указывает на увеличение выраженности фенотипа Teff. В некоторых вариантах осуществления показатель GeneSetScore (активируемые в Treg относительно подавляемых в Teff) определяют путем измерения экспрессии одного или нескольких генов, которые активируются в Treg-клетках и/или подавляются в Teff-клетках, например одного или нескольких генов, выбранных из группы, состоящей из C12orf75, SELPLG, SWAP70, RGS1, PRR11, SPATS2L, SPATS2L, TSHR, C14orf145, CASP8, SYT11, ACTN4, ANXA5, GLRX, HLA-DMB, PMCH, RAB11FIP1, IL32, FAM160B1, SHMT2, FRMD4B, CCR3, TNFRSF13B, NTNG2, CLDND1, BARD1, FCER1G, TYMS, ATP1B1, GJB6, FGL2, TK1, SLC2A8, CDKN2A, SKAP2, GPR55, CDCA7, S100A4, GDPD5, PMAIP1, ACOT9, CEP55, SGMS1, ADPRH, AKAP2, HDAC9, IKZF4, CARD17, VAV3, OBFC2A, ITGB1, CIITA, SETD7, HLA-DMA, CCR10, KIAA0101, SLC14A1, PTTG3P, DUSP10, FAM164A, PYHIN1, MYO1F, SLC1A4, MYBL2, PTTG1, RRM2, TP53INP1, CCR5, ST8SIA6, TOX, BFSP2, ITPRIPL1, NCAPH, HLA-DPB2, SYT4, NINJ2, FAM46C, CCR4, GBP5, C15orf53, LMCD1, MKI67, NUSAP1, PDE4A, E2F2, CD58, ARHGEF12, LOC100188949, FAS, HLA-DPB1, SELP, WEE1, HLA-DPA1, FCRL1, ICA1, CNTNAP1, OAS1, METTL7A, CCR6, HLA-DRB4, ANXA2P3, STAM, HLA-DQB2, LGALS1, ANXA2, PI16, DUSP4, LAYN, ANXA2P2, PTPLA, ANXA2P1, ZNF365, LAIR2, LOC541471, RASGRP4, BCAS1, UTS2, MIAT, PRDM1, SEMA3G, FAM129A, HPGD, NCF4, LGALS3, CEACAM4, JAKMIP1, TIGIT, HLA-DRA, IKZF2, HLA-DRB1, FANK1, RTKN2, TRIB1, FCRL3 и FOXP3. В некоторых вариантах осуществления показатель GeneSetScore (активируемые в Treg относительно подавляемых в Teff) определяют с применением секвенирования РНК, например секвенирования РНК одной клетки (scRNA-seq), что, например, проиллюстрировано в примере 10 в отношении фиг. 39B. В некоторых вариантах осуществления показатель GeneSetScore (активируемые в Treg относительно подавляемых в Teff) рассчитывают с использованием среднего логарифмического нормализованного значения экспрессии гена для всех генов в наборе генов.

Используемый в данном документе термин "показатель GeneSetScore (подавление функции "стволовости")" клетки относится к баллу, который отражает степень, в которой клетка демонстрирует фенотип "стволовости". Более низкий показатель GeneSetScore (подавление функции "стволовости") указывает на увеличение выраженности фенотипа "стволовости". В некоторых вариантах осуществления показатель GeneSetScore (подавление функции "стволовости") определяют путем измерения экспрессии одного или нескольких генов, которые активируются в стволовых клетках, которые дифференцируются, относительно генов, которые подавляются в гематопоэтической стволовой клетке, например, одного или нескольких генов, выбранных из группы, состоящей из ACE, BATF, CDK6, CHD2, ERCC2, HOXB4, MEOX1, SFRP1, SP7, SRF, TAL1 и XRCC5. В некоторых вариантах осуществления показатель GeneSetScore (подавление функции "стволовости") определяют с применением секвенирования РНК, например секвенирования РНК одной клетки (scRNA-seq), как, например, проиллюстрировано в примере 10 в отношении фиг. 39C. В некоторых вариантах осуществления показатель GeneSetScore (подавление функции "стволовости") рассчитывают с использованием среднего логарифмического нормализованного значения экспрессии гена для всех генов в наборе генов.

Используемый в данном документе термин "показатель GeneSetScore (активируемые при гипоксии)" клетки относится к баллу, который отражает степень, в которой клетка демонстрирует фенотип, характерный для гипоксии. Более высокий показатель GeneSetScore (активируемые при гипоксии) указывает на увеличение выраженности фенотипа, характерного для гипоксии. В некоторых вариантах осуществления показатель GeneSetScore (активируемые при гипоксии) определяют путем измерения экспрессии одного или нескольких генов, которые активируются в клетках, испытывающих гипоксию, например одного или нескольких генов, выбранных из группы, состоящей из ABCB1, ACAT1, ADM, ADORA2B, AK2, AK3, ALDH1A1, ALDH1A3, ALDOA, ALDOC, ANGPT2, ANGPTL4, ANXA1, ANXA2, ANXA5, ARHGAP5, ARSE, ART1, BACE2, BATF3, BCL2L1, BCL2L2, BHLHE40, BHLHE41, BIK, BIRC2, BNIP3, BNIP3L, BPI, BTG1, C11orf2, C7orf68, CA12, CA9, CALD1, CCNG2, CCT6A, CD99, CDK1, CDKN1A, CDKN1B, CITED2, CLK1, CNOT7, COL4A5, COL5A1, COL5A2, COL5A3, CP, CTSD, CXCR4, D4S234E, DDIT3, DDIT4, 1-Dec, DKC1, DR1, EDN1, EDN2, EFNA1, EGF, EGR1, EIF4A3, ELF3, ELL2, ENG, ENO1, ENO3, ENPEP, EPO, ERRFI1, ETS1, F3, FABP5, FGF3, FKBP4, FLT1, FN1, FOS, FTL, GAPDH, GBE1, GLRX, GPI, GPRC5A, HAP1, HBP1, HDAC1, HDAC9, HERC3, HERPUD1, HGF, HIF1A, HK1, HK2, HLA-DQB1, HMOX1, HMOX2, HSPA5, HSPD1, HSPH1, HYOU1, ICAM1, ID2, IFI27, IGF2, IGFBP1, IGFBP2, IGFBP3, IGFBP5, IL6, IL8, INSIG1, IRF6, ITGA5, JUN, KDR, KRT14, KRT18, KRT19, LDHA, LDHB, LEP, LGALS1, LONP1, LOX, LRP1, MAP4, MET, MIF, MMP13, MMP2, MMP7, MPI, MT1L, MTL3P, MUC1, MXI1, NDRG1, NFIL3, NFKB1, NFKB2, NOS1, NOS2, NOS2P1, NOS2P2, NOS3, NR3C1, NR4A1, NT5E, ODC1, P4HA1, P4HA2, PAICS, PDGFB, PDK3, PFKFB1, PFKFB3, PFKFB4, PFKL, PGAM1, PGF, PGK1, PGK2, PGM1, PIM1, PIM2, PKM2, PLAU, PLAUR, PLIN2, PLOD2, PNN, PNP, POLM, PPARA, PPAT, PROK1, PSMA3, PSMD9, PTGS1, PTGS2, QSOX1, RBPJ, RELA, RIOK3, RNASEL, RPL36A, RRP9, SAT1, SERPINB2, SERPINE1, SGSM2, SIAH2, SIN3A, SIRPA, SLC16A1, SLC16A2, SLC20A1, SLC2A1, SLC2A3, SLC3A2, SLC6A10P, SLC6A16, SLC6A6, SLC6A8, SORL1, SPP1, SRSF6, SSSCA1, STC2, STRA13, SYT7, TBPL1, TCEAL1, TEK, TF, TFF3, TFRC, TGFA, TGFB1, TGFB3, TGFBI, TGM2, TH, THBS1, THBS2, TIMM17A, TNFAIP3, TP53, TPBG, TPD52, TPI1, TXN, TXNIP, UMPS, VEGFA, VEGFB, VEGFC, VIM, VPS11 и XRCC6. В некоторых вариантах осуществления показатель GeneSetScore (активируемые при гипоксии) определяют с применением секвенирования РНК, например секвенирования РНК одной клетки (scRNA-seq), как, например, проиллюстрировано в примере 10 в отношении фиг. 39D. В некоторых вариантах осуществления показатель GeneSetScore (активируемые при гипоксии) рассчитывают с использованием среднего логарифмического нормализованного значения экспрессии гена для всех генов в наборе генов.

Используемый в данном документе термин "показатель GeneSetScore (активация аутофагии)" клетки относится к баллу, который отражает степень, в которой клетка демонстрирует фенотип, характерный для аутофагии. Более высокий показатель GeneSetScore (активируемые при аутофагии) указывает на увеличение выраженности фенотипа, характерного для аутофагии. В некоторых вариантах осуществления показатель GeneSetScore (активируемые при аутофагии) определяют путем измерения экспрессии одного или нескольких генов, которые активируются в клетках подвергающихся аутофагии, например одного или нескольких генов, выбранных из группы, состоящей из ABL1, ACBD5, ACIN1, ACTRT1, ADAMTS7, AKR1E2, ALKBH5, ALPK1, AMBRA1, ANXA5, ANXA7, ARSB, ASB2, ATG10, ATG12, ATG13, ATG14, ATG16L1, ATG16L2, ATG2A, ATG2B, ATG3, ATG4A, ATG4B, ATG4C, ATG4D, ATG5, ATG7, ATG9A, ATG9B, ATP13A2, ATP1B1, ATPAF1-AS1, ATPIF1, BECN1, BECN1P1, BLOC1S1, BMP2KL, BNIP1, BNIP3, BOC, C11orf2, C11orf41, C12orf44, C12orf5, C14orf133, C1orf210, C5, C6orf106, C7orf59, C7orf68, C8orf59, C9orf72, CA7, CALCB, CALCOCO2, CAPS, CCDC36, CD163L1, CD93, CDC37, CDKN2A, CHAF1B, CHMP2A, CHMP2B, CHMP3, CHMP4A, CHMP4B, CHMP4C, CHMP6, CHST3, CISD2, CLDN7, CLEC16A, CLN3, CLVS1, COX8A, CPA3, CRNKL1, CSPG5, CTSA, CTSB, CTSD, CXCR7, DAP, DKKL1, DNAAF2, DPF3, DRAM1, DRAM2, DYNLL1, DYNLL2, DZANK1, EI24, EIF2S1, EPG5, EPM2A, FABP1, FAM125A, FAM131B, FAM134B, FAM13B, FAM176A, FAM176B, FAM48A, FANCC, FANCF, FANCL, FBXO7, FCGR3B, FGF14, FGF7, FGFBP1, FIS1, FNBP1L, FOXO1, FUNDC1, FUNDC2, FXR2, GABARAP, GABARAPL1, GABARAPL2, GABARAPL3, GABRA5, GDF5, GMIP, HAP1, HAPLN1, HBXIP, HCAR1, HDAC6, HGS, HIST1H3A, HIST1H3B, HIST1H3C, HIST1H3D, HIST1H3E, HIST1H3F, HIST1H3G, HIST1H3H, HIST1H3I, HIST1H3J, HK2, HMGB1, HPR, HSF2BP, HSP90AA1, HSPA8, IFI16, IPPK, IRGM, IST1, ITGB4, ITPKC, KCNK3, KCNQ1, KIAA0226, KIAA1324, KRCC1, KRT15, KRT73, LAMP1, LAMP2, LAMTOR1, LAMTOR2, LAMTOR3, LARP1B, LENG9, LGALS8, LIX1, LIX1L, LMCD1, LRRK2, LRSAM1, LSM4, MAP1A, MAP1LC3A, MAP1LC3B, MAP1LC3B2, MAP1LC3C, MAP1S, MAP2K1, MAP3K12, MARK2, MBD5, MDH1, MEX3C, MFN1, MFN2, MLST8, MRPS10, MRPS2, MSTN, MTERFD1, MTMR14, MTMR3, MTOR, MTSS1, MYH11, MYLK, MYOM1, NBR1, NDUFB9, NEFM, NHLRC1, NME2, NPC1, NR2C2, NRBF2, NTHL1, NUP93, OBSCN, OPTN, P2RX5, PACS2, PARK2, PARK7, PDK1, PDK4, PEX13, PEX3, PFKP, PGK2, PHF23, PHYHIP, PI4K2A, PIK3C3, PIK3CA, PIK3CB, PIK3R4, PINK1, PLEKHM1, PLOD2, PNPO, PPARGC1A, PPY, PRKAA1, PRKAA2, PRKAB1, PRKAB2, PRKAG1, PRKAG2, PRKAG3, PRKD2, PRKG1, PSEN1, PTPN22, RAB12, RAB1A, RAB1B, RAB23, RAB24, RAB33B, RAB39, RAB7A, RB1CC1, RBM18, REEP2, REP15, RFWD3, RGS19, RHEB, RIMS3, RNF185, RNF41, RPS27A, RPTOR, RRAGA, RRAGB, RRAGC, RRAGD, S100A8, S100A9, SCN1A, SERPINB10, SESN2, SFRP4, SH3GLB1, SIRT2, SLC1A3, SLC1A4, SLC22A3, SLC25A19, SLC35B3, SLC35C1, SLC37A4, SLC6A1, SLCO1A2, SMURF1, SNAP29, SNAPIN, SNF8, SNRPB, SNRPB2, SNRPD1, SNRPF, SNTG1, SNX14, SPATA18, SQSTM1, SRPX, STAM, STAM2, STAT2, STBD1, STK11, STK32A, STOM, STX12, STX17, SUPT3H, TBC1D17, TBC1D25, TBC1D5, TCIRG1, TEAD4, TECPR1, TECPR2, TFEB, TM9SF1, TMBIM6, TMEM203, TMEM208, TMEM39A, TMEM39B, TMEM59, TMEM74, TMEM93, TNIK, TOLLIP, TOMM20, TOMM22, TOMM40, TOMM5, TOMM6, TOMM7, TOMM70A, TP53INP1, TP53INP2, TRAPPC8, TREM1, TRIM17, TRIM5, TSG101, TXLNA, UBA52, UBB, UBC, UBQLN1, UBQLN2, UBQLN4, ULK1, ULK2, ULK3, USP10, USP13, USP30, UVRAG, VAMP7, VAMP8, VDAC1, VMP1, VPS11, VPS16, VPS18, VPS25, VPS28, VPS33A, VPS33B, VPS36, VPS37A, VPS37B, VPS37C, VPS37D, VPS39, VPS41, VPS4A, VPS4B, VTA1, VTI1A, VTI1B, WDFY3, WDR45, WDR45L, WIPI1, WIPI2, XBP1, YIPF1, ZCCHC17, ZFYVE1, ZKSCAN3, ZNF189, ZNF593 и ZNF681. В некоторых вариантах осуществления показатель GeneSetScore (активируемые при аутофагии) определяют с применением секвенирования РНК, например, секвенирования РНК одной клетки (scRNA-seq), как, например, проиллюстрировано в примере 10 в отношении фиг. 39E. В некоторых вариантах осуществления показатель GeneSetScore (активируемые при аутофагии) рассчитывают с использованием среднего логарифмического нормализованного значения экспрессии гена для всех генов в наборе генов.

Используемый в данном документе термин "показатель GeneSetScore (активируемые в покоящемся состоянии относительно подавляемых в активированном состоянии)" клетки относится к баллу, который отражает степень, в которой клетка демонстрирует фенотип активированной Т-клетки по сравнению с фенотипом покоящейся Т-клетки. Более высокий показатель GeneSetScore (активируемые в покоящемся состоянии относительно подавляемых в активированном состоянии) указывает на увеличение выраженности фенотипа покоящихся Т-клеток, при этом более низкий показатель GeneSetScore (активируемые в покоящемся состоянии относительно подавляемых в активированном состоянии) указывает на увеличение выраженности фенотипа активированных T-клеток. В некоторых вариантах осуществления показатель GeneSetScore (активируемые в покоящемся состоянии относительно подавляемых в активированном состоянии) определяют путем измерения экспрессии одного или нескольких генов, которые активируются в покоящихся T-клетках и/или подавляются в активированных T-клетках, например одного или нескольких генов, выбранных из группы, состоящей из ABCA7, ABCF3, ACAP2, AMT, ANKH, ATF7IP2, ATG14, ATP1A1, ATXN7, ATXN7L3B, BCL7A, BEX4, BSDC1, BTG1, BTG2, BTN3A1, C11orf21, C19orf22, C21orf2, CAMK2G, CARS2, CCNL2, CD248, CD5, CD55, CEP164, CHKB, CLK1, CLK4, CTSL1, DBP, DCUN1D2, DENND1C, DGKD, DLG1, DUSP1, EAPP, ECE1, ECHDC2, ERBB2IP, FAM117A, FAM134B, FAM134C, FAM169A, FAM190B, FAU, FLJ10038, FOXJ2, FOXJ3, FOXL1, FOXO1, FXYD5, FYB, HLA-E, HSPA1L, HYAL2, ICAM2, IFIT5, IFITM1, IKBKB, IQSEC1, IRS4, KIAA0664L3, KIAA0748, KLF3, KLF9, KRT18, LEF1, LINC00342, LIPA, LIPT1, LLGL2, LMBR1L, LPAR2, LTBP3, LYPD3, LZTFL1, MANBA, MAP2K6, MAP3K1, MARCH8, MAU2, MGEA5, MMP8, MPO, MSL1, MSL3, MYH3, MYLIP, NAGPA, NDST2, NISCH, NKTR, NLRP1, NOSIP, NPIP, NUMA1, PAIP2B, PAPD7, PBXIP1, PCIF1, PI4KA, PLCL2, PLEKHA1, PLEKHF2, PNISR, PPFIBP2, PRKCA, PRKCZ, PRKD3, PRMT2, PTP4A3, PXN, RASA2, RASA3, RASGRP2, RBM38, REPIN1, RNF38, RNF44, ROR1, RPL30, RPL32, RPLP1, RPS20, RPS24, RPS27, RPS6, RPS9, RXRA, RYK, SCAND2, SEMA4C, SETD1B, SETD6, SETX, SF3B1, SH2B1, SLC2A4RG, SLC35E2B, SLC46A3, SMAGP, SMARCE1, SMPD1, SNPH, SP140L, SPATA6, SPG7, SREK1IP1, SRSF5, STAT5B, SVIL, SYF2, SYNJ2BP, TAF1C, TBC1D4, TCF20, TECTA, TES, TMEM127, TMEM159, TMEM30B, TMEM66, TMEM8B, TP53TG1, TPCN1, TRIM22, TRIM44, TSC1, TSC22D1, TSC22D3, TSPYL2, TTC9, TTN, UBE2G2, USP33, USP34, VAMP1, VILL, VIPR1, VPS13C, ZBED5, ZBTB25, ZBTB40, ZC3H3, ZFP161, ZFP36L1, ZFP36L2, ZHX2, ZMYM5, ZNF136, ZNF148, ZNF318, ZNF350, ZNF512B, ZNF609, ZNF652, ZNF83, ZNF862 и ZNF91. В некоторых вариантах осуществления показатель GeneSetScore (активируемые в покоящемся состоянии относительно подавляемых в активированном состоянии) определяют с применением секвенирования РНК, например секвенирования РНК одной клетки (scRNA-seq), как, например, проиллюстрировано в примере 10 в отношении фиг. 38D. В некоторых вариантах осуществления показатель GeneSetScore (активируемые в покоящемся состоянии относительно подавляемых в активированном состоянии) рассчитывают с использованием среднего логарифмического нормализованного значения экспрессии гена для всех генов в наборе генов.

Используемый в данном документе термин "показатель GeneSetScore (постепенно активируемые при дифференцировке в клетки памяти)" клетки относится к баллу, который отражает стадию дифференцировки в клетки памяти. Более высокий показатель GeneSetScore (постепенно активируемые при дифференцировке в клетки памяти) указывает на увеличение выраженности фенотипа поздних Т-клеток памяти, при этом более низкий показатель GeneSetScore (постепенно активируемых при дифференцировки клеток памяти) указывает на увеличение выраженности фенотипа ранних Т-клеток памяти. В некоторых вариантах осуществления показатель GeneSetScore (активируемые при аутофагии) определяют путем измерения экспрессии одного или нескольких генов, которые активируются во время дифференцировки клеток памяти, например одного или нескольких генов, выбранных из группы, состоящей из MTCH2, RAB6C, KIAA0195, SETD2, C2orf24, NRD1, GNA13, COPA, SELT, TNIP1, CBFA2T2, LRP10, PRKCI, BRE, ANKS1A, PNPLA6, ARL6IP1, WDFY1, MAPK1, GPR153, SHKBP1, MAP1LC3B2, PIP4K2A, HCN3, GTPBP1, TLN1, C4orf34, KIF3B, TCIRG1, PPP3CA, ATG4D, TYMP, TRAF6, C17orf76, WIPF1, FAM108A1, MYL6, NRM, SPCS2, GGT3P, GALK1, CLIP4, ARL4C, YWHAQ, LPCAT4, ATG2A, IDS, TBC1D5, DMPK, ST6GALNAC6, REEP5, ABHD6, KIAA0247, EMB, TSEN54, SPIRE2, PIWIL4, ZSCAN22, ICAM1, CHD9, LPIN2, SETD8, ZC3H12A, ULBP3, IL15RA, HLA-DQB2, LCP1, CHP, RUNX3, TMEM43, REEP4, MEF2D, ABL1, TMEM39A, PCBP4, PLCD1, CHST12, RASGRP1, C1orf58, C11orf63, C6orf129, FHOD1, DKFZp434F142, PIK3CG, ITPR3, BTG3, C4orf50, CNNM3, IFI16, AK1, CDK2AP1, REL, BCL2L1, MVD, TTC39C, PLEKHA2, FKBP11, EML4, FANCA, CDCA4, FUCA2, MFSD10, TBCD, CAPN2, IQGAP1, CHST11, PIK3R1, MYO5A, KIR2DL3, DLG3, MXD4, RALGDS, S1PR5, WSB2, CCR3, TIPARP, SP140, CD151, SOX13, KRTAP5-2, NF1, PEA15, PARP8, RNF166, UEVLD, LIMK1, CACNB1, TMX4, SLC6A6, LBA1, SV2A, LLGL2, IRF1, PPP2R5C, CD99, RAPGEF1, PPP4R1, OSBPL7, FOXP4, SLA2, TBC1D2B, ST7, JAZF1, GGA2, PI4K2A, CD68, LPGAT1, STX11, ZAK, FAM160B1, RORA, C8orf80, APOBEC3F, TGFBI, DNAJC1, GPR114, LRP8, CD69, CMIP, NAT13, TGFB1, FLJ00049, ANTXR2, NR4A3, IL12RB1, NTNG2, RDX, MLLT4, GPRIN3, ADCY9, CD300A, SCD5, ABI3, PTPN22, LGALS1, SYTL3, BMPR1A, TBK1, PMAIP1, RASGEF1A, GCNT1, GABARAPL1, STOM, CALHM2, ABCA2, PPP1R16B, SYNE2, PAM, C12orf75, CLCF1, MXRA7, APOBEC3C, CLSTN3, ACOT9, HIP1, LAG3, TNFAIP3, DCBLD1, KLF6, CACNB3, RNF19A, RAB27A, FADS3, DLG5, APOBEC3D, TNFRSF1B, ACTN4, TBKBP1, ATXN1, ARAP2, ARHGEF12, FAM53B, MAN1A1, FAM38A, PLXNC1, GRLF1, SRGN, HLA-DRB5, B4GALT5, WIPI1, PTPRJ, SLFN11, DUSP2, ANXA5, AHNAK, NEO1, CLIC1, EIF2C4, MAP3K5, IL2RB, PLEKHG1, MYO6, GTDC1, EDARADD, GALM, TARP, ADAM8, MSC, HNRPLL, SYT11, ATP2B4, NHSL2, MATK, ARHGAP18, SLFN12L, SPATS2L, RAB27B, PIK3R3, TP53INP1, MBOAT1, GYG1, KATNAL1, FAM46C, ZC3HAV1L, ANXA2P2, CTNNA1, NPC1, C3AR1, CRIM1, SH2D2A, ERN1, YPEL1, TBX21, SLC1A4, FASLG, PHACTR2, GALNT3, ADRB2, PIK3AP1, TLR3, PLEKHA5, DUSP10, GNAO1, PTGDR, FRMD4B, ANXA2, EOMES, CADM1, MAF, TPRG1, NBEAL2, PPP2R2B, PELO, SLC4A4, KLRF1, FOSL2, RGS2, TGFBR3, PRF1, MYO1F, GAB3, C17orf66, MICAL2, CYTH3, TOX, HLA-DRA, SYNE1, WEE1, PYHIN1, F2R, PLD1, THBS1, CD58, FAS, NETO2, CXCR6, ST6GALNAC2, DUSP4, AUTS2, C1orf21, KLRG1, TNIP3, GZMA, PRR5L, PRDM1, ST8SIA6, PLXND1, PTPRM, GFPT2, MYBL1, SLAMF7, FLJ16686, GNLY, ZEB2, CST7, IL18RAP, CCL5, KLRD1 и KLRB1. В некоторых вариантах осуществления показатель GeneSetScore (постепенно активируемые при дифференцировке в клетки памяти) определяют с применением секвенирования РНК, например секвенирования РНК одной клетки (scRNA-seq), как, например, проиллюстрировано в примере 10 в отношении фиг. 40B. В некоторых вариантах осуществления показатель GeneSetScore (постепенно активируемые при дифференцировке в клетки памяти) рассчитывают с использованием среднего логарифмического нормализованного значения экспрессии гена для всех генов в наборе генов.

Используемый в данном документе термин "показатель GeneSetScore (активируемые в TEM относительно подавляемых в TN)" клетки относится к баллу, который отражает степень, в которой клетка демонстрирует фенотип эффекторной Т-клетки памяти (TEM) по сравнению с фенотипом необученной Т-клетки (TN). Более высокий показатель GeneSetScore (активируемые в TEM относительно подавляемых в TN) указывает на увеличение выраженности фенотипа TEM, при этом более низкий показатель GeneSetScore (активируемые в TEM относительно подавляемых в TN) указывает на увеличение выраженности фенотипа TN. В некоторых вариантах осуществления показатель GeneSetScore (активируемые в TEM относительно подавляемых в TN) определяют путем измерения экспрессии одного или нескольких генов, которые активируются в TEM-клетках и/или подавляются в TN-клетках, например одного или нескольких генов, выбранных из группы, состоящей из MYO5A, MXD4, STK3, S1PR5, GLCCI1, CCR3, SOX13, KRTAP5-2, PEA15, PARP8, RNF166, UEVLD, LIMK1, SLC6A6, SV2A, KPNA2, OSBPL7, ST7, GGA2, PI4K2A, CD68, ZAK, RORA, TGFBI, DNAJC1, JOSD1, ZFYVE28, LRP8, OSBPL3, CMIP, NAT13, TGFB1, ANTXR2, NR4A3, RDX, ADCY9, CHN1, CD300A, SCD5, PTPN22, LGALS1, RASGEF1A, GCNT1, GLUL, ABCA2, CLDND1, PAM, CLCF1, MXRA7, CLSTN3, ACOT9, METRNL, BMPR1A, LRIG1, APOBEC3G, CACNB3, RNF19A, RAB27A, FADS3, ACTN4, TBKBP1, FAM53B, MAN1A1, FAM38A, GRLF1, B4GALT5, WIPI1, DUSP2, ANXA5, AHNAK, CLIC1, MAP3K5, ST8SIA1, TARP, ADAM8, MATK, SLFN12L, PIK3R3, FAM46C, ANXA2P2, CTNNA1, NPC1, SH2D2A, ERN1, YPEL1, TBX21, STOM, PHACTR2, GBP5, ADRB2, PIK3AP1, DUSP10, PTGDR, EOMES, MAF, TPRG1, NBEAL2, NCAPH, SLC4A4, FOSL2, RGS2, TGFBR3, MYO1F, C17orf66, CYTH3, WEE1, PYHIN1, F2R, THBS1, CD58, AUTS2, FAM129A, TNIP3, GZMA, PRR5L, PRDM1, PLXND1, PTPRM, GFPT2, MYBL1, SLAMF7, ZEB2, CST7, CCL5, GZMK и KLRB1. В некоторых вариантах осуществления показатель GeneSetScore (активируемые в TEM относительно подавляемых в TN) определяют с применением секвенирования РНК, например секвенирования РНК одной клетки (scRNA-seq), как, например, проиллюстрировано в примере 10 в отношении фиг. 40C. В некоторых вариантах осуществления показатель GeneSetScore (активируемые в TEM относительно подавляемых в TN) рассчитывают с использованием среднего логарифмического нормализованного значения экспрессии гена для всех генов в наборе генов.

В контексте значений показателя GeneSetScore (например, медианного значения показателя GeneSetScore), если положительный показатель GeneSetScore уменьшить на 100%, получим значение 0. Если отрицательный показатель GeneSetScore повысить на 100%, получим значение 0. Например, на фиг. 39A медианное значение показателя GeneSetScore образца дня 1 составляет -0,084; медианное значение показателя GeneSetScore образца дня 9 составляет 0,035; и медианное значение показателя GeneSetScore изначального образца составляет -0,1. На фиг. 39A, повышение медианного значения показателя GeneSetScore изначального образца на 100% приводит к получению значения показателя GeneSetScore, составляющего 0; и повышение медианное значение показателя GeneSetScore изначального образца на 200% приводит к получению значения показателя GeneSetScore, составляющего 0,1. На фиг. 39A, понижение медианного значения показателя GeneSetScore образца дня 9 на 100% приводит к получению значения показателя GeneSetScore, составляющего 0; и понижение медианного значения показателя GeneSetScore образца дня 9 на 200% приводит к получению значения показателя GeneSetScore, составляющего -0,035.

Используемый в данном документе термин "гранула" относится к дискретной частице с твердой поверхностью, размер которой находится в пределах от примерно 0,1 мкм до нескольких миллиметров в диаметре. Гранулы могут быть сферическими (например, микросферы) или иметь неправильную форму. Гранулы могут содержать разнообразие материалов, включающих без ограничения парамагнитные материалы, керамику, пластик, стекло, полистирол, метилстирол, акриловые полимеры, титан, латекс, Sepharose™, целлюлозу, нейлон и т. п. В некоторых вариантах осуществления гранулы представляют собой относительно однородные, приблизительно 4,5 мкм в диаметре, сферичные гранулы, содержащие суперпарамагнетический полистирол, например, покрытые, например, ковалентно соединенные со смесью антител к CD3 (например, CD3-эпсилон) и CD28. В некоторых вариантах осуществления гранулы представляют собой Dynabeads^®. В некоторых вариантах осуществления как антитела к CD3, так и антитела к CD28, присоединены к одной и той же грануле, имитируя стимуляцию T-клетки антигенпрезентирующими клетками. Свойство Dynabeads^® и применение Dynabeads^® для выделение и размножения клеток широко известны в уровне техники, например, см., Neurauter et al., Cell isolation and expansion using Dynabeads, Adv Biochem Eng Biotechnol. 2007;106:41-73, включенную в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Используемый в данном документе термин "наноматрица" относится к наноструктуре, содержащей матрицу из подвижных полимерных цепей. Размер наноматрицы составляет от 1 до 500 нм, например от 10 до 200 нм. В некоторых вариантах осуществления матрица из подвижных полимерных цепей присоединена к одному или нескольким агонистам, которые передают активационные сигналы к T-клеткам, например агонистам, представляющим собой антитела к CD3 и/или антитела к CD28. В некоторых вариантах осуществления наноматрица предусматривает коллоидную полимерную наноматрицу, соединенную, например, ковалентно соединенную, с агонистом одной или нескольких стимулирующих молекул и/или агонистом одной или нескольких костимулирующих молекул. В некоторых вариантах осуществления агонист одной или нескольких стимулирующих молекул представляет собой агонист CD3 (например, агонистическое антитело к CD3). В некоторых вариантах осуществления агонист одной или нескольких костимулирующих молекул представляет собой агонист CD28 (например, агонистическое антитело к CD28). В некоторых вариантах осуществления наноматрица характеризуется отсутствием твердой поверхности, например, в качестве точки присоединения агонистов, таких как антитело к CD3 и/или антитело к CD28. В некоторых вариантах осуществления наноматрица представляет собой наноматрицу, раскрытую в WO2014/048920A1 или предусмотренную в наборе MACS^® GMP T Cell TransAct™ от Miltenyi Biotcc GmbH, включенных в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. MACS^® GMP T Cell TransAct™ состоит из коллоидной полимерной наноматрицы, ковалентно соединенной с гуманизированными рекомбинантными агонистическими антителами к человеческим CD3 и CD28.

Ниже более подробно описаны различные варианты осуществления композиций и способов, представленных в данном документе. Дополнительные определения изложены по всему тексту настоящего описания.

Описание

В данном документе предусмотрены способы изготовления иммунных эффекторных клеток (например, T-клеток или NK-клеток), сконструированных таким образом, чтобы они экспрессировали CAR, например CAR, описанный в данном документе, композиции, содержащие такие клетки, и способы применения таких клеток для лечения заболевания, такого как рак, у субъекта. В некоторых вариантах осуществления с помощью способов, раскрытых в данном документе, можно изготовлять иммунные эффектoрные клетки, сконструированные таким образом, чтобы они экспрессировали CAR, за менее чем 24 часа. Не ограничиваясь теорией, способы, предусмотренные в данном документе, обеспечивают сохранение недифференцированного фенотипа T-клеток, таких как необученные Т-клетки, во время процесса изготовления. Такие клетки, экспрессирующие CAR, с недифференцированным фенотипом могут сохраняться дольше и/или размножаться лучше in vivo после инфузии. В некоторых вариантах осуществления CART-клетки, полученные способами изготовления, предусмотренными в данном документе, содержат более высокую процентную долю T-клеток памяти, представляющих собой стволовые клетки, по сравнению с CART-клетками, полученными способом традиционного изготовления, например, согласно измерению с применением scRNA-seq (например, согласно измерению с применением способов, описанных в примере 10 в отношении фиг. 39A). В некоторых вариантах осуществления CART-клетки, полученные способами изготовления, предусмотренными в данном документе, содержат более высокую процентную долю эффекторных T-клеток, по сравнению с CART-клетками, полученными способом традиционного изготовления, например, согласно измерению с применением scRNA-seq (например, согласно измерению с применением способов, описанных в примере 10 в отношении фиг. 39B). В некоторых вариантах осуществления CART-клетки, полученные способами изготовления, предусмотренными в данном документе, обеспечивают лучшее сохранение функции "стволовости" T-клеток по сравнению с CART-клетками, полученными способом традиционного изготовления, например, согласно измерению с применением scRNA-seq (например, согласно измерению с применением способов, описанных в примере 10 в отношении фиг. 39C). В некоторых вариантах осуществления CART-клетки, полученные способами изготовления, предусмотренными в данном документе, демонстрируют более низкий уровень гипоксии по сравнению с CART-клетками, полученными способом традиционного изготовления, например, согласно измерению с применением scRNA-seq (например, согласно измерению с применением способов, описанных в примере 10 в отношении фиг. 39D). В некоторых вариантах осуществления CART-клетки, полученные способами изготовления, предусмотренными в данном документе, демонстрируют более низкий уровень аутофагии по сравнению с CART-клетками, полученными способом традиционного изготовления, например, согласно измерению с применением scRNA-seq (например, согласно измерению с применением способов, описанных в примере 10 в отношении фиг. 39E).

В некоторых вариантах осуществления способы, раскрытые в данном документе, не предусматривают применение гранулы, такой как Dynabeads^® (например, CD3/CD28 Dynabeads^®), и не предусматривают стадию удаления гранул. В некоторых вариантах осуществления CART-клетки, изготовленные способами, раскрытыми в данном документе, можно вводить субъекту с применением минимального размножения ex vivo, например менее 1 дня, менее 12 часов, менее 8 часов, менее 6 часов, менее 4 часов, менее 3 часов, менее 2 часов, менее 1 часа или без размножения ex vivo. Соответственно, способы, описанные в данном документе, предусматривают способ быстрого изготовления для получения улучшенных продуктов на основе клеток, экспрессирующих CAR, для применения в лечении заболевания у субъекта.

Способ с использованием цитокина

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает способы получения популяции клеток (например, T-клеток), которые экспрессируют химерный антигенный рецептор (CAR), включающие: (1) приведение в контакт популяции клеток с цитокином, выбранным из IL-2, IL-7, IL-15, IL-21, IL-6 или их комбинации, (2) приведение в контакт популяции клеток (например, T-клеток) с молекулой нуклеиновой кислоты (например, молекулой ДНК или РНК), кодирующей CAR, с получением таким образом популяции клеток (например, T-клеток), содержащих указанную молекулу нуклеиновой кислоты, и (3) сбор популяции клеток (например, T-клеток) для хранения (например, повторное составление популяции клеток в среде для криоконсервирования) или введения, где (a) стадию (2) проводят вместе со стадией (1) или не позже чем через 5 часов после начала стадии (1), например не позже чем через 1, 2, 3, 4 или 5 часов после начала стадии (1), и стадию (3) проводят не позже чем через 26 часов после начала стадии (1), например не позже чем через 22, 23 или 24 часа после начала стадии (1), например не позже чем через 24 часа после начала стадии (1), или (b) популяцию клеток из стадии (3) не размножают или размножают до увеличения количества клеток на не более чем 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или 40%, например не более чем 10%, например, согласно оценке по числу живых клеток, по сравнению с популяцией клеток в начале стадии (1). В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты на стадии (2) представляет собой молекулу ДНК. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты на стадии (2) представляет собой молекулу РНК. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты на стадии (2) находится в вирусном векторе, например вирусном векторе, выбранном из лентивирусного вектора, аденовирусного вектора или ретровирусного вектора. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты на стадии (2) находится в невирусном векторе. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты на стадии (2) находится в плазмиде. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты на стадии (2) не находится в каком-либо векторе. В некоторых вариантах осуществления стадия (2) включает осуществление трансдукции популяции клеток (например, T-клеток) c помощью вирусного вектора, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR.

В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток (например, T-клеток) собирают из образца, полученного путем афереза (например, образца полученного путем лейкафереза) у субъекта.

В некоторых вариантах осуществления образец, полученный путем афереза (например, образец полученный путем лейкафереза), собирают у субъекта и доставляют в виде замороженного образца (например, криоконсервированного образца) в учреждение, осуществляющее изготовление клеток. Замороженный образец, полученный путем афереза, затем размораживают и отбирают T-клетки (например, CD4+ T-клетки и/или CD8+ T-клетки) из образца, полученного путем афереза, например, с применением устройства для сортировки клеток (например, устройства CliniMACS^® Prodigy^®). Отобранные T-клетки (например, CD4+ T-клетки и/или CD8+ T-клетки) затем высевают для изготовления CART с применением способа с использованием цитокина, описанного в данном документе. В некоторых вариантах осуществления при завершении способа с использованием цитокина CART-клетки криоконсервируют и затем размораживают и вводят субъекту. В некоторых вариантах осуществления отобранные T-клетки (например, CD4+ T-клетки и/или CD8+ T-клетки) подвергаются одному или нескольким циклам замораживания-размораживания перед посевом для изготовления CART.

В некоторых вариантах осуществления образец, полученный путем афереза (например, образец полученный путем лейкафереза), собирают у субъекта и доставляют в виде свежего продукта (например, незамороженного продукта) в учреждение, осуществляющее изготовление клеток. Отбирают T-клетки (например, CD4+ T-клетки и/или CD8+ T-клетки) из образца, полученного путем афереза, например, с применением устройства для сортировки клеток (например, устройства CliniMACS^® Prodigy^®). Отобранные T-клетки (например, CD4+ T-клетки и/или CD8+ T-клетки) затем высевают для изготовления CART с применением способа с использованием цитокина, описанного в данном документе. В некоторых вариантах осуществления отобранные T-клетки (например, CD4+ T-клетки и/или CD8+ T-клетки) подвергаются одному или нескольким циклам замораживания-размораживания перед посевом для изготовления CART.

В некоторых вариантах осуществления у субъекта отбирают образец, получаемый путем афереза (например, образец, полученный путем лейкафереза). Отбирают T-клетки (например, CD4+ T-клетки и/или CD8+ T-клетки) из образца, полученного путем афереза, например, с применением устройства для сортировки клеток (например, устройства CliniMACS^® Prodigy^®). Отобранные T-клетки (например, CD4+ T-клетки и/или CD8+ T-клетки) затем доставляют в виде замороженного образца (например, криоконсервированного образца) в учреждение, осуществляющее изготовление клеток. Отобранные T-клетки (например, CD4+ T-клетки и/или CD8+ T-клетки) затем размораживают и высевают для изготовления CART с применением способа с использованием цитокина, описанного в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления после того, как клетки высевают (например, T-клетки), к клеткам добавляют один или несколько цитокинов (например, один или несколько цитокинов, выбранных из IL-2, IL-7, IL-15 (например, hetIL-15 (IL15/sIL-15Ra)), IL-21 или IL-6 (например, IL-6/sIL-6R)), а также векторы (например, лентивирусные векторы), кодирующие CAR. После инкубации в течение 20-24 часов клетки промывают и составляют для хранения или введения.

В отличие от традиционных подходов к изготовлению CART, способ с использованием цитокина, предусмотренный в данном документе, не предусматривает стимуляцию CD3 и/или CD28 или размножение Т-клеток ex vivo. T-клетки, которые были приведены в контакт с антителами к CD3 и антителами к CD28 и которые экстенсивно размножали ex vivo, склонны демонстрировать дифференцировку в сторону фенотипа центральных клеток памяти. Не ограничиваясь теорией, способ с использованием цитокина, предусмотренный в данном документе, обеспечивает сохранение или повышение выраженности недифференцированного фенотипа T-клеток во время изготовления CART, при этом обеспечивая получение продукта на основе CART, который может дольше персистировать после инфузии субъекту.

В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток приводят в контакт с одним или несколькими цитокинами (например, одним или несколькими цитокинами, выбранными из IL-2, IL-7, IL-15 (например, hetIL-15 (IL15/sIL-15Ra)), IL-21 или IL-6 (например, IL-6/sIL-6Ra).

В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток приводят в контакт с IL-2. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток приводят в контакт с IL-7. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток приводят в контакт с IL-15 (например, hetIL-15 (IL15/sIL-15Ra)). В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток приводят в контакт с IL-21. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток приводят в контакт с IL-6 (например, IL-6/sIL-6Ra). В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток приводят в контакт с IL-2 и IL-7. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток приводят в контакт с IL-2 и IL-15 (например, hetIL-15 (IL15/sIL-15Ra)). В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток приводят в контакт с IL-2 и IL-21. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток приводят в контакт с IL-2 и IL-6 (например, IL-6/sIL-6Ra). В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток приводят в контакт с IL-7 и IL-15 (например, hetIL-15 (IL15/sIL-15Ra)). В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток приводят в контакт с IL-7 и IL-21. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток приводят в контакт с IL-7 и IL-6 (например, IL-6/sIL-6Ra). В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток приводят в контакт с IL-15 (например, hetIL-15 (IL15/sIL-15Ra)) и IL-21. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток приводят в контакт с IL-15 (например, hetIL-15 (IL15/sIL-15Ra)) и IL-6 (например, IL-6/sIL-6Ra). В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток приводят в контакт с IL-21 и IL-6 (например, IL-6/sIL-6Ra). В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток приводят в контакт с IL-7, IL-15 (например, hetIL-15 (IL15/sIL-15Ra)) и IL-21. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток дополнительно приводят в контакт с ингибитором LSD1. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток дополнительно приводят в контакт с ингибитором MALT1.

В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток приводят в контакт с 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, или 300 ед./мл IL-2. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток приводят в контакт с 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 нг/мл IL-7. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток приводят в контакт с 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, или 20 нг/мл IL-15.

В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток приводят в контакт с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток подвергают трансдукции молекулой ДНК, кодирующей CAR.

В некоторых вариантах осуществления приведение в контакт популяции клеток с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, происходит одновременно с приведением в контакт популяции клеток с одним или несколькими цитокинами, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления приведение в контакт популяции клеток с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, происходит не позже чем через 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 или 10 часов после начала приведения в контакт популяции клеток с одним или несколькими цитокинами, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления приведение в контакт популяции клеток с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, происходит не позже чем через 5 часов после начала приведения в контакт популяции клеток с одним или несколькими цитокинами, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления приведение в контакт популяции клеток с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, происходит не позже чем через 4 часа после начала приведения в контакт популяции клеток с одним или несколькими цитокинами, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления приведение в контакт популяции клеток с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, происходит не позже чем через 3 часа после начала приведения в контакт популяции клеток с одним или несколькими цитокинами, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления приведение в контакт популяции клеток с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, происходит не позже чем через 2 часа после начала приведения в контакт популяции клеток с одним или несколькими цитокинами, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления приведение в контакт популяции клеток с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, происходит не позже чем через 1 час после начала приведения в контакт популяции клеток с одним или несколькими цитокинами, описанными выше.

В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток собирают для хранения или введения.

В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток собирают для хранения или введения не позже чем через 72, 60, 48, 36, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19 или 18 часов после начала приведения в контакт популяции клеток с одним или несколькими цитокинами, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток собирают для хранения или введение не позже чем через 26 часов после начала приведения в контакт популяции клеток с одним или несколькими цитокинами, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток собирают для хранения или введение не позже чем через 25 часов после начала приведения в контакт популяции клеток с одним или несколькими цитокинами, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток собирают для хранения или введение не позже чем через 24 часа после начала приведения в контакт популяции клеток с одним или несколькими цитокинами, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток собирают для хранения или введение не позже чем через 23 часа после начала приведения в контакт популяции клеток с одним или несколькими цитокинами, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток собирают для хранения или введение не позже чем через 22 часа после начала приведения в контакт популяции клеток с одним или несколькими цитокинами, описанными выше.

В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток не размножают ex vivo.

В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток размножают до увеличения количества клеток на не более чем 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, или 60%,, например, согласно оценке по числу живых клеток, по сравнению с популяцией клеток до ее приведения в контакт с одним или несколькими цитокинами, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток размножают до увеличения количества клеток на не более чем 5%, например, согласно оценке по числу живых клеток, по сравнению с популяцией клеток до ее приведения в контакт с одним или несколькими цитокинами, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток размножают до увеличения количества клеток на не более чем 10%, например, согласно оценке по числу живых клеток, по сравнению с популяцией клеток до ее приведения в контакт с одним или несколькими цитокинами, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток размножают до увеличения количества клеток на не более чем 15%, например, согласно оценке по числу живых клеток, по сравнению с популяцией клеток до ее приведения в контакт с одним или несколькими цитокинами, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток размножают до увеличения количества клеток на не более чем 20%, например, согласно оценке по числу живых клеток, по сравнению с популяцией клеток до ее приведения в контакт с одним или несколькими цитокинами, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток размножают до увеличения количества клеток на не более чем 25%, например, согласно оценке по числу живых клеток, по сравнению с популяцией клеток до ее приведения в контакт с одним или несколькими цитокинами, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток размножают до увеличения количества клеток на не более чем 30%, например, согласно оценке по числу живых клеток, по сравнению с популяцией клеток до ее приведения в контакт с одним или несколькими цитокинами, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток размножают до увеличения количества клеток на не более чем 35%, например, согласно оценке по числу живых клеток, по сравнению с популяцией клеток до ее приведения в контакт с одним или несколькими цитокинами, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток размножают до увеличения количества клеток на не более чем 40%, например, согласно оценке по числу живых клеток, по сравнению с популяцией клеток до ее приведения в контакт с одним или несколькими цитокинами, описанными выше.

В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток размножают до увеличения количества клеток, обеспечиваемого за не более чем 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 16, 20, 24, 36, или 48, например, согласно оценке по числу живых клеток, по сравнению с популяцией клеток до ее приведения в контакт с одним или несколькими цитокинами, описанными выше.

В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток не приводят в контакт in vitro со средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR (например, антителом к CD3), и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу, на поверхности клеток (например, антителом к CD28), или если приводят в контакт, время стадии приведения в контакт составляет менее 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 или 5 часов.

В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток приводят в контакт in vitro со средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR (например, антителом к CD3), и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу, на поверхности клеток (например, антитело к CD28) в течение 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 или 28 часов.

В некоторых вариантах осуществления популяция клеток, изготовленная с применением способа с использованием цитокина, предусмотренного в данном документе, демонстрирует более высокую процентную долю необученных клеток среди клеток, экспрессирующих CAR (например, выше на по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, или 60%), по сравнению с клетками, полученными способом, который дополнительно включает приведение в контакт популяции клеток с, например, средством, которое связывает комплекс CD3/TCR (например, антителом к CD3), и/или средством, которое связывает костимулирующую молекулу на поверхности клеток (например, антителом к CD28), в остальном аналогичным данному способу.

В некоторых вариантах осуществления способ с использованием цитокина, предусмотренный в данном документе, осуществляют в средах для клеток, содержащих не более 0, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, или 8% сыворотки. В некоторых вариантах осуществления способ с использованием цитокина, предусмотренный в данном документе, осуществляют в средах для клеток, содержащих ингибитор LSD1, ингибитор MALT1 или их комбинацию.

Способ с использованием активации

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает способы получения популяции клеток (например, T-клеток), которые экспрессируют химерный антигенный рецептор (CAR), включающие: (i) приведение в контакт популяции клеток (например, T-клеток, например T-клеток, выделенных из замороженного или свежего продукта, полученного в результате лейкафереза) со средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу на поверхности клеток; (ii) приведение в контакт популяции клеток (например, T-клеток) с молекулой нуклеиновой кислоты (например, молекулой ДНК или РНК), кодирующей CAR, с получением таким образом популяции клеток (например, T-клеток), содержащих указанную молекулу нуклеиновой кислоты, и (iii) сбор популяции клеток (например, T-клеток) для хранения (например, повторное составление популяции клеток в среде для криоконсервирования) или введения, где: (a) стадию (ii) проводят вместе со стадией (i) или не позже чем через 20 часов после начала стадии (i), например не позже чем через 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18 часов после начала стадии (i), например не позже чем через 18 часов после начала стадии (i), и стадию (iii) проводят не позже чем через 26 часов после начала стадии (i), например не позже чем через 22, 23 или 24 часа после начала стадии (i), например не позже чем через 24 часа после начала стадии (i); (b) стадию (ii) проводят вместе со стадией (i) или не позже чем через 20 часов после начала стадии (i), например не позже чем через 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18 часов после начала стадии (i), например не позже чем через 18 часов после начала стадии (i), и стадию (iii) проводят не позже чем через 30 часов после начала стадии (ii), например не позже чем через 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 часов после начала стадии (ii); или (c) популяцию клеток из стадии (iii) не размножают или размножают до увеличения количества клеток на не более чем 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или 40%, например не более чем 10%, например, согласно оценке по числу живых клеток, по сравнению с популяцией клеток в начале стадии (i). В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты на стадии (ii) представляет собой молекулу ДНК. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты на стадии (ii) представляет собой молекулу РНК. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты на стадии (ii) находится в вирусном векторе, например вирусном векторе, выбранном из лентивирусного вектора, аденовирусного вектора или ретровирусного вектора. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты на стадии (ii) находится в невирусном векторе. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты на стадии (ii) находится в плазмиде. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты на стадии (ii) не находится в каком-либо векторе. В некоторых вариантах осуществления стадия (ii) включает осуществление трансдукции популяции клеток (например, T-клеток) c помощью вирусного вектора, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR.

В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток (например, T-клеток) собирают из образца, полученного путем афереза (например, образца полученного путем лейкафереза) у субъекта.

В некоторых вариантах осуществления образец, полученный путем афереза (например, образец полученный путем лейкафереза), собирают у субъекта и доставляют в виде замороженного образца (например, криоконсервированного образца) в учреждение, осуществляющее изготовление клеток. Затем замороженный образец, полученный путем афереза, размораживают и отбирают T-клетки (например, CD4+ T-клетки и/или CD8+ T-клетки) из образца, полученного путем афереза, например, с применением устройства для сортировки клеток (например, устройства CliniMACS^® Prodigy^®). Отобранные T-клетки (например, CD4+ T-клетки и/или CD8+ T-клетки) затем высевают для изготовления CART с применением способа с использованием активации, описанного в данном документе. В некоторых вариантах осуществления отобранные T-клетки (например, CD4+ T-клетки и/или CD8+ T-клетки) подвергаются одному или нескольким циклам замораживания-размораживания перед посевом для изготовления CART.

В некоторых вариантах осуществления образец, полученный путем афереза (например, образец полученный путем лейкафереза), собирают у субъекта и доставляют в виде свежего продукта (например, незамороженного продукта) в учреждение, осуществляющее изготовление клеток. Отбирают T-клетки (например, CD4+ T-клетки и/или CD8+ T-клетки) из образца, полученного путем афереза, например, с применением устройства для сортировки клеток (например, устройства CliniMACS^® Prodigy^®). Отобранные T-клетки (например, CD4+ T-клетки и/или CD8+ T-клетки) затем высевают для изготовления CART с применением способа с использованием активации, описанного в данном документе. В некоторых вариантах осуществления отобранные T-клетки (например, CD4+ T-клетки и/или CD8+ T-клетки) подвергаются одному или нескольким циклам замораживания-размораживания перед посевом для изготовления CART.

В некоторых вариантах осуществления у субъекта отбирают образец, полученный путем афереза (например, образец, полученный путем лейкафереза). Отбирают T-клетки (например, CD4+ T-клетки и/или CD8+ T-клетки) из образца, полученного путем афереза, например, с применением устройства для сортировки клеток (например, устройства CliniMACS^® Prodigy^®). Отобранные T-клетки (например, CD4+ T-клетки и/или CD8+ T-клетки) затем доставляют в виде замороженного образца (например, криоконсервированного образца) в учреждение, осуществляющее изготовление клеток. Отобранные T-клетки (например, CD4+ T-клетки и/или CD8+ T-клетки) затем размораживают и высевают для изготовления CART с применением способа с использованием активации, описанного в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления клетки (например, T-клетки) приводят в контакт с антителами к CD3 и антителами к CD28 в течение, например, 12 часов с последующей трансдукцией с помощью вектора (например, лентивирусного вектора), кодирующего CAR. Через 24 часа после начала культивирования клетки промывают и составляют для хранения или введения.

Не ограничиваясь теорией, короткая стимуляция CD3 и CD28 может способствовать эффективной трансдукции самообновляющихся T-клеток. По сравнению с традиционными способами изготовления CART способ с использованием активации, предусмотренный в данном документе, не предусматривает продолжительного размножения ex vivo. Подобно способу с использованием цитокина, способ с использованием активации, предусмотренный в данном документе, также обеспечивает сохранение недифференцированных T-клеток во время изготовления CART.

В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток приводят в контакт со средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу, на поверхности клеток.

В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, представляет собой средство, которое стимулирует CD3. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует костимулирующую молекулу, представляет собой средство, которое стимулирует CD28, ICOS, CD27, HVEM, LIGHT, CD40, 4-1BB, OX40, DR3, GITR, CD30, TIM1, CD2, CD226 или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует костимулирующую молекулу, представляет собой средство, которое стимулирует CD28. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, выбрано из антитела (например, однодоменного антитела (например, антитела на основе вариабельного домена тяжелой цепи), пептитела, Fab-фрагмента или scFv), малой молекулы или лиганда (например, существующего в природе, рекомбинантного или химерного лиганда). В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, представляет собой антитело. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, представляет собой антитело к CD3. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует костимулирующую молекулу, выбрано из антитела (например, однодоменного антитела (например, антитела на основе вариабельного домена тяжелой цепи), пептитела, Fab-фрагмента или scFv), малой молекулы или лиганда (например, существующего в природе, рекомбинантного или химерного лиганда). В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует костимулирующую молекулу, представляет собой антитело. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует костимулирующую молекулу, представляет собой антитело к CD28. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, или средство, которое стимулирует костимулирующую молекулу, не содержит гранулу. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, содержит антитело к CD3, ковалентно присоединенное к коллоидной полимерной наноматрице. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует костимулирующую молекулу, содержит антитело к CD28, ковалентно присоединенное к коллоидной полимерной наноматрице. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и средство, которое стимулирует костимулирующую молекулу, содержат T Cell TransAct^TM.

В некоторых вариантах осуществления матрица содержит полимерный, например, биоразлагаемый или биосовместимый инертный материал, например, который является нетоксичным для клеток, или состоит из такого материала. В некоторых вариантах осуществления матрица состоит из гидрофильных полимерных цепей, которые обладают максимальной подвижностью в водном растворе благодаря гидратации цепей. В некоторых вариантах осуществления подвижная матрица может состоять из коллагена, очищенных белков, очищенных пептидов, полисахаридов, гликозаминогликанов или композиций на основе внеклеточного матрикса. Полисахарид может включать, например, эфиры целлюлозы, крахмал, гуммиарабик, агарoзу, декстран, хитозан, гиалуроновую кислоту, пектины, ксантан, гуаровую камедь или альгинат. Другие полимеры могут включать сложные полиэфиры, полиэфиры, полиакрилаты, полиакриламиды, полиамины, полиэтиленимины, полимеры поликватерниума, полифосфазены, поливинилспирты, поливинилацетаты, поливинилпирролидоны, блок-сополимеры или полиуретаны. В некоторых вариантах осуществления подвижная матрица представляет собой полимер декстрана.

В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток приводят в контакт с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток подвергают трансдукции молекулой ДНК, кодирующей CAR.

В некоторых вариантах осуществления приведение в контакт популяции клеток с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, происходит одновременно с приведением в контакт популяции клеток со средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу, на поверхности клеток, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления приведение в контакт популяции клеток с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, происходит не позже чем через 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, или 0,5 часа после начала приведения в контакт популяции клеток со средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу, на поверхности клеток, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления приведение в контакт популяции клеток с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, происходит не позже чем через 20 часов после начала приведения в контакт популяции клеток со средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу, на поверхности клеток, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления приведение в контакт популяции клеток с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, происходит не позже чем через 19 часов после начала приведения в контакт популяции клеток со средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу, на поверхности клеток, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления приведение в контакт популяции клеток с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, происходит не позже чем через 18 часов после начала приведения в контакт популяции клеток со средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу, на поверхности клеток, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления приведение в контакт популяции клеток с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, происходит не позже чем через 17 часов после начала приведения в контакт популяции клеток со средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу, на поверхности клеток, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления приведение в контакт популяции клеток с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, происходит не позже чем через 16 часов после начала приведения в контакт популяции клеток со средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу, на поверхности клеток, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления приведение в контакт популяции клеток с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, происходит не позже чем через 15 часов после начала приведения в контакт популяции клеток со средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу, на поверхности клеток, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления приведение в контакт популяции клеток с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, происходит не позже чем через 14 часов после начала приведения в контакт популяции клеток со средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу, на поверхности клеток, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления приведение в контакт популяции клеток с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, происходит не позже чем через 14 часов после начала приведения в контакт популяции клеток со средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу, на поверхности клеток, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления приведение в контакт популяции клеток с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, происходит не позже чем через 13 часов после начала приведения в контакт популяции клеток со средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу, на поверхности клеток, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления приведение в контакт популяции клеток с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, происходит не позже чем через 12 часов после начала приведения в контакт популяции клеток со средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу, на поверхности клеток, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления приведение в контакт популяции клеток с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, происходит не позже чем через 11 часов после начала приведения в контакт популяции клеток со средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу, на поверхности клеток, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления приведение в контакт популяции клеток с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, происходит не позже чем через 10 часов после начала приведения в контакт популяции клеток со средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу, на поверхности клеток, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления приведение в контакт популяции клеток с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, происходит не позже чем через 9 часов после начала приведения в контакт популяции клеток со средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу, на поверхности клеток, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления приведение в контакт популяции клеток с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, происходит не позже чем через 8 часов после начала приведения в контакт популяции клеток со средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу, на поверхности клеток, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления приведение в контакт популяции клеток с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, происходит не позже чем через 7 часов после начала приведения в контакт популяции клеток со средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу, на поверхности клеток, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления приведение в контакт популяции клеток с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, происходит не позже чем через 6 часов после начала приведения в контакт популяции клеток со средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу, на поверхности клеток, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления приведение в контакт популяции клеток с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, происходит не позже чем через 5 часов после начала приведения в контакт популяции клеток со средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу, на поверхности клеток, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления приведение в контакт популяции клеток с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, происходит не позже чем через 4 часа после начала приведения в контакт популяции клеток со средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу, на поверхности клеток, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления приведение в контакт популяции клеток с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, происходит не позже чем через 3 часа после начала приведения в контакт популяции клеток со средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу, на поверхности клеток, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления приведение в контакт популяции клеток с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, происходит не позже чем через 2 часа после начала приведения в контакт популяции клеток со средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу, на поверхности клеток, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления приведение в контакт популяции клеток с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, происходит не позже чем через 1 час после начала приведения в контакт популяции клеток со средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу, на поверхности клеток, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления приведение в контакт популяции клеток с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, происходит не позже чем через 30 минут после начала приведения в контакт популяции клеток со средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу, на поверхности клеток, описанными выше.

В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток собирают для хранения или введения.

В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток собирают для хранения или введения не позже чем через 72, 60, 48, 36, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, или 18 часов после начала приведения в контакт популяции клеток со средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу, на поверхности клеток, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток собирают для хранения или введения не позже чем через 26 часов после начала приведения в контакт популяции клеток со средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу, на поверхности клеток, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток собирают для хранения или введения не позже чем через 25 часов после начала приведения в контакт популяции клеток со средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу, на поверхности клеток, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток собирают для хранения или введения не позже чем через 24 часа после начала приведения в контакт популяции клеток со средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу, на поверхности клеток, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток собирают для хранения или введения не позже чем через 23 часа после начала приведения в контакт популяции клеток со средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу, на поверхности клеток, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток собирают для хранения или введения не позже чем через 22 часа после начала приведения в контакт популяции клеток со средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу, на поверхности клеток, описанными выше.

В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток не размножают ex vivo.

В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток размножали до увеличения количества клеток на не более чем 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, или 60%, например, согласно оценке по числу живых клеток, по сравнению с популяцией клеток до ее приведения в контакт со средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу, на поверхности клеток, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток размножали до увеличения количества клеток на не более чем 5%, например, согласно оценке по числу живых клеток, по сравнению с популяцией клеток до ее приведения в контакт со средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу, на поверхности клеток, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток размножали до увеличения количества клеток на не более чем 10%, например, согласно оценке по числу живых клеток, по сравнению с популяцией клеток до ее приведения в контакт со средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу, на поверхности клеток, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток размножали до увеличения количества клеток на не более чем 15%, например, согласно оценке по числу живых клеток, по сравнению с популяцией клеток до ее приведения в контакт со средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу, на поверхности клеток, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток размножали до увеличения количества клеток на не более чем 20%, например, согласно оценке по числу живых клеток, по сравнению с популяцией клеток до ее приведения в контакт со средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу, на поверхности клеток, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток размножали до увеличения количества клеток на не более чем 25%, например, согласно оценке по числу живых клеток, по сравнению с популяцией клеток до ее приведения в контакт со средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу, на поверхности клеток, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток размножали до увеличения количества клеток на не более чем 30%, например, согласно оценке по числу живых клеток, по сравнению с популяцией клеток до ее приведения в контакт со средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу, на поверхности клеток, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток размножали до увеличения количества клеток на не более чем 35%, например, согласно оценке по числу живых клеток, по сравнению с популяцией клеток до ее приведения в контакт со средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу, на поверхности клеток, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток размножали до увеличения количества клеток на не более чем 40%, например, согласно оценке по числу живых клеток, по сравнению с популяцией клеток до ее приведения в контакт со средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу, на поверхности клеток, описанными выше.

В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток размножают до увеличения количества клеток на не более чем 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 16, 20, 24, 36, или 48, например, согласно оценке по числу живых клеток, по сравнению с популяцией клеток до ее приведения в контакт с одним или несколькими цитокинами, описанными выше.

В некоторых вариантах осуществления способ с использованием активации осуществляют в средах для клеток, не содержащих сыворотки. В некоторых вариантах осуществления способ с использованием активации осуществляют в средах для клеток, содержащих один или несколько цитокинов, выбранных из IL-2, IL-15 (например, hetIL-15 (IL15/sIL-15Ra)) или IL-6 (например, IL-6/sIL-6Ra). В некоторых вариантах осуществления hetIL-15 содержит аминокислотную последовательность под NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQG (SEQ ID NO: 309). В некоторых вариантах осуществления hetIL-15 содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99% идентичностью с SEQ ID NO: 309. В некоторых вариантах осуществления способ с использованием активации осуществляют в средах для клеток, содержащих ингибитор LSD1. В некоторых вариантах осуществления способ с использованием активации осуществляют в средах для клеток, содержащих ингибитор MALT1. В некоторых вариантах осуществления среды для клеток, не содержащие сыворотки, содержат заменитель сыворотки. В некоторых вариантах осуществления заменитель сыворотки представляет собой заменитель сыворотки для иммунных клеток (ICSR) CTS™. В некоторых вариантах осуществления уровень ICSR может составлять, например, не более 5%, например приблизительно 1%, 2%, 3%, 4% или 5%. Не ограничиваясь теорией, применение сред для клеток, например сред для способа быстрого изготовления, показанных в таблице 21 или таблице 25, содержащих ICSR, например 2% ICSR, может обеспечить повышение жизнеспособности клеток во время процесса изготовления, описанного в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает способы получения популяции клеток (например, T-клеток), которые экспрессируют химерный антигенный рецептор (CAR), включающие: (a) получение образца, полученного путем афереза (например, свежего или криоконсервированного образца, полученного путем лейкафереза), отобранного у субъекта; (b) отбор T-клеток из образца, полученного путем афереза (например, с применением отрицательного отбора, положительного отбора или отбора без гранул); (c) посев выделенных T-клеток в концентрации, например, от 1×10⁶ до 1×0⁷ клеток/мл; (d) приведение в контакт T-клеток со средством, которое стимулирует T-клетки, например, средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу, на поверхности клеток (например, приведение в контакт T-клеток с антителами к CD3 и/или антителами к CD28, например, приведение в контакт T-клеток с TransAct); (e) приведение в контакт T-клеток с молекулой нуклеиновой кислоты (например, молекулой ДНК или РНК), кодирующей CAR (например, приведение в контакт T-клеток с вирусом, содержащим молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR), в течение, например, 6-48 часов, например 20-28 часов; и (f) промывание и сбор T-клеток для хранения (например, повторное составление T-клеток в средах для криоконсервирования) или введения. В некоторых вариантах осуществления стадию (f) проводят не позже чем через 30 часов после начала стадии (d) или (e), например не позже чем через 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 часов после начала стадии (d) или (e).

Популяция клеток, экспрессирующих CAR, изготовленная способами, раскрытыми в данном документе

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения описана иммунная эффектoрная клетка (например, T-клетка или NK-клетка), например, полученная с помощью любого из способов производства, описанных в данном документе, сконструированная таким образом, что она экспрессирует CAR, где сконструированная иммунная эффектoрная клетка демонстрирует противоопухолевое свойство. В некоторых вариантах осуществления CAR содержит антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен. Иллюстративный антиген представляет собой антиген, ассоциированный с раком, описанный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления клетку (например, Т-клетку или NK-клетку) трансформируют с помощью CAR, и CAR экспрессируется на поверхности клетки. В некоторых вариантах осуществления клетку (например, T-клетку или NK-клетку) трансдуцируют с помощью вирусного вектора, кодирующего CAR. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор представляет собой ретровирусный вектор. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор. В некоторых таких вариантах осуществления клетка может стабильно экспрессировать CAR. В некоторых вариантах осуществления клетку (например, Т-клетку или NK-клетку) трансфицируют нуклеиновой кислотой, например мРНК, кДНК или ДНК, кодирующей CAR. В некоторых таких вариантах осуществления клетка может транзиентно экспрессировать CAR.

В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусматривается популяция клеток (например, иммунных эффектoрных клеток, например T-клеток или NK-клеток), полученных любым из способов изготовления, описанных в данном документе (например, способом с использованием цитокина или способом с использованием активации, описанными в данном документе), в отношении которых было применено конструирование для обеспечения экспрессии CAR.

В некоторых вариантах осуществления процентная доля необученных клеток, например необученных Т-клеток, например CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T-клеток, в популяции клеток на завершающем этапе способа изготовления (например, на завершающем этапе способа с использованием цитокина или способа с использованием активации, описанных в данном документе) (1) является такой же, (2) отличается, например, на не более чем 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15%, или (3) является повышенной, например, на по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, или 25%,, по сравнению с процентной долей необученных клеток, например необученных Т-клеток, например CD45RA+ CD45RO- CCR7+ клеток, в популяции клеток на начальном этапе способа изготовления (например, на начальном этапе способа с использованием цитокина или способа с использованием активации, описанных в данном документе). В некоторых вариантах осуществления популяция клеток на завершающем этапе способа изготовления (например, на завершающем этапе способа с использованием цитокина или способа с использованием активации, описанных в данном документе) демонстрирует более высокую процентную долю необученных клеток, например необученных Т-клеток, например CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T-клеток (например, выше на по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, или 50%), по сравнению с клетками, полученными способом, который длится, например, более 26 часов (например, который длится более 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 дней), или который предусматривает размножение популяции клеток in vitro в течение, например, более чем 3 дней (например, размножение популяции клеток in vitro в течение 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 дней), в остальном аналогичным данному способу.

В некоторых вариантах осуществления процентная доля необученных клеток, например необученных Т-клеток, например CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T-клеток, в популяции клеток на завершающем этапе способа изготовления (например, на завершающем этапе способа с использованием цитокина или способа с использованием активации, описанных в данном документе) составляет не менее 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, или 60%.

В некоторых вариантах осуществления процентная доля центральных клеток памяти, например центральных T-клеток памяти, например центральных CD95+ Т-клеток памяти, в популяции клеток на завершающем этапе способа изготовления (например, на завершающем этапе способа с использованием цитокина или способа с использованием активации, описанных в данном документе) (1) является такой же, (2) отличается, например, на не более 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15%, или (3) является сниженной, например, на по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, или 25%,, по сравнению с процентной долей центральных клеток памяти, например центральных T-клеток памяти, например центральных CD95+ Т-клеток памяти, в популяции клеток на начальном этапе способа изготовления (например, на начальном этапе способа с использованием цитокина или способа с использованием активации, описанных в данном документе). В некоторых вариантах осуществления популяция клеток на завершающем этапе способа изготовления (например, на завершающем этапе способа с использованием цитокина или способа с использованием активации, описанных в данном документе) демонстрирует более низкую процентную долю центральных клеток памяти, например центральных T-клеток памяти, например центральных CD95+ Т-клеток памяти (например, ниже на по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, или 50%), по сравнению с клетками, полученными способом, который длится, например, более 26 часов (например, который длится более 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 дней), или который предусматривает размножение популяции клеток in vitro в течение, например, более чем 3 дней (например, размножение популяции клеток in vitro в течение 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 дней), в остальном аналогичным данному способу.

В некоторых вариантах осуществления процентная доля центральных клеток памяти, например центральных T-клеток памяти, например центральных CD95+ Т-клеток памяти, в популяции клеток на завершающем этапе способа изготовления (например, на завершающем этапе способа с использованием цитокина или способа с использованием активации, описанных в данном документе) составляет не более 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 или 80%.

В некоторых вариантах осуществления популяция клеток на завершающем этапе способа изготовления (например, на завершающем этапе способа с использованием цитокина или способа с использованием активации, описанных в данном документе) после введения in vivo персистирует дольше или размножается на более высоком уровне (например, выше на по меньшей мере 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 или 90%) (например, согласно оценке с применением способов, описанных в примере 1 в отношении фиг. 4C) по сравнению с клетками, полученными способом, который длится, например, более 26 часов (например, который длится более 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 дней), или который предусматривает размножение популяции клеток in vitro в течение, например, более чем 3 дней (например, размножение популяции клеток in vitro в течение 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, или 15 дней), в остальном аналогичным данному способу.

В некоторых вариантах осуществления популяция клеток была обогащена клетками, экспрессирующими IL6R (например, клетками, которые являются положительными в отношении IL6Rα и/или IL6Rβ), до начала способа изготовления (например, до начала способа с использованием цитокина или способа с использованием активации, описанных в данном документе). В некоторых вариантах осуществления популяция клеток содержит, например, не менее 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 или 80% клеток, экспрессирующих IL6R (например, клеток, которые являются положительными в отношении IL6Rα и/или IL6Rβ), на начальном этапе способа изготовления (например, на начальном этапе способа с использованием цитокина или способа с использованием активации, описанных в данном документе).

Фармацевтическая композиция

Кроме того, настоящее изобретение предусматривает композиции на основе клеток, экспрессирующих CAR, и их применение в лекарственных препаратах или способах лечения, среди других заболеваний, рака или определенного злокачественного новообразования, или аутоиммунных заболеваний, в развитие которых вовлечены клетки или ткани, которые экспрессируют опухолевый антиген, описанный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены фармацевтические композиции, содержащие клетку, экспрессирующую CAR, например, множество клеток, экспрессирующих CAR, полученных способом изготовления, описанным в данном документе (например, способом с использованием цитокина или способом с использованием активации, описанными в данном документе), в комбинации с одним или несколькими фармацевтически или физиологически приемлемыми носителями, разбавителями или наполнителями.

Химерный антигенный рецептор (CAR)

Настоящее изобретение предусматривает иммунные эффекторные клетки (например, T-клетки, NK-клетки), которые сконструированы таким образом, чтобы они содержали один или несколько CAR, которые осуществляют направление иммунных эффекторных клеток в отношении ракового образования. Это достигается с помощью антигенсвязывающего домена в CAR, который является специфичным в отношении антигена, ассоциированного с раком. Существует два класса антигенов, ассоциированных с раком (опухолевых антигенов), на которые могут нацеливаться CAR, описанные в данном документе: (1) антигены, ассоциированные с раком, которые экспрессируются на поверхности раковых клеток; и (2) антигены, ассоциированные с раком, которые сами по себе являются внутриклеточными, однако фрагменты (пептиды) такого антигена презентируются на поверхности раковых клеток с помощью MHC (главного комплекса гистосовместимости).

Соответственно, иммунная эффекторная клетка, например, полученная способом, описанным в данном документе, может быть сконструирована таким образом, чтобы она содержала CAR, нацеливающийся на один из следующих антигенов, ассоциированных с раком (опухолевых антигенов): CD19, CD123, CD22, CD30, CD171, CS-1, CLL-1, CD33, EGFRvIII, GD2, GD3, BCMA, Ag Tn, PSMA, ROR1, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, IL-13Ra2, мезотелин, IL-11Ra, PSCA, VEGFR2, антиген Y системы Льюис, CD24, PDGFR-бета, PRSS21, SSEA-4, CD20, рецептор фолиевой кислоты альфа, ERBB2 (Her2/neu), MUC1, EGFR, NCAM, простазу, PAP, ELF2M, эфрин B2, рецептор IGF-I, CAIX, LMP2, gp100, bcr-abl, тирозиназу, EphA2, фукозил-GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-ацетил-GD2, рецептор фолиевой кислоты бета, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, TSHR, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, полисиаловую кислоту, PLAC1, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, NY-ESO-1, LAGE-1a, легумаин, E6 и E7 HPV, MAGE-A1, MAGE A1, ETV6-AML, белок сперматозоидов 17, XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos-родственный антиген 1, p53, мутантный p53, простеин, сурвивин и теломеразу, PCTA-1/галектин 8, MelanA/MART1, мутантный Ras, hTERT, антигены саркомы с точечными разрывами при транслокации, ML-IAP, ERG (продукт слитого гена TMPRSS2-ETS), NA17, PAX3, андрогеновый рецептор, циклин B1, MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B1, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, теломеразную обратную транскриптазу человека, RU1, RU2, кишечную карбоксилэстеразу и мутантный вариант hsp70-2.

Последовательности из неограничивающих примеров различных компонентов, которые могут быть частью молекулы CAR, описанной в данном документе, перечислены в таблице 1, где "а. к." обозначает аминокислоты, а "н. к." обозначает нуклеиновые кислоты, которые кодируют соответствующий пептид.

Таблица 1. Последовательности различных компонентов CAR

SEQ ID NO Описание Последовательность SEQ ID NO: 11 Промотор гена EF-1α
(н. к.) CGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA SEQ ID NO: 1 Лидерная последовательность (а. к.) MALPVTALLLPLALLLHAARP SEQ ID NO: 12 Лидерная последовательность (н. к.) ATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCATGCCGCTAGACCC SEQ ID NO: 199 Лидерная последовательность (н. к.) Atggccctccctgtcaccgccctgctgcttccgctggctcttctgctccacgccgctcggccc SEQ ID NO: 2 Шарнирная область CD8 (а. к.) TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD SEQ ID NO: 13 Шарнирная область CD8 (н. к.) ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT SEQ ID NO: 3 Шарнирная область Ig4 (а. к.) ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM SEQ ID NO: 14 Шарнирная область Ig4 (н. к.) GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG SEQ ID NO: 4 Шарнирная область IgD (а. к.) RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDH SEQ ID NO: 15 Шарнирная область IgD (н. к.) AGGTGGCCCGAAAGTCCCAAGGCCCAGGCATCTAGTGTTCCTACTGCACAGCCCCAGGCAGAAGGCAGCCTAGCCAAAGCTACTACTGCACCTGCCACTACGCGCAATACTGGCCGTGGCGGGGAGGAGAAGAAAAAGGAGAAAGAGAAAGAAGAACAGGAAGAGAGGGAGACCAAGACCCCTGAATGTCCATCCCATACCCAGCCGCTGGGCGTCTATCTCTTGACTCCCGCAGTACAGGACTTGTGGCTTAGAGATAAGGCCACCTTTACATGTTTCGTCGTGGGCTCTGACCTGAAGGATGCCCATTTGACTTGGGAGGTTGCCGGAAAGGTACCCACAGGGGGGGTTGAGGAAGGGTTGCTGGAGCGCCATTCCAATGGCTCTCAGAGCCAGCACTCAAGACTCACCCTTCCGAGATCCCTGTGGAACGCCGGGACCTCTGTCACATGTACTCTAAATCATCCTAGCCTGCCCCCACAGCGTCTGATGGCCCTTAGAGAGCCAGCCGCCCAGGCACCAGTTAAGCTTAGCCTGAATCTGCTCGCCAGTAGTGATCCCCCAGAGGCCGCCAGCTGGCTCTTATGCGAAGTGTCCGGCTTTAGCCCGCCCAACATCTTGCTCATGTGGCTGGAGGACCAGCGAGAAGTGAACACCAGCGGCTTCGCTCCAGCCCGGCCCCCACCCCAGCCGGGTTCTACCACATTCTGGGCCTGGAGTGTCTTAAGGGTCCCAGCACCACCTAGCCCCCAGCCAGCCACATACACCTGTGTTGTGTCCCATGAAGATAGCAGGACCCTGCTAAATGCTTCTAGGAGTCTGGAGGTTTCCTACGTGACTGACCATT SEQ ID NO: 6 Трансмембранный домен CD8 (а. к.) IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC SEQ ID NO: 17 Трансмембранный домен CD8 (н. к.) ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC SEQ ID NO: 7 Внутриклеточный домен 4-1BB (а. к) KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL SEQ ID NO: 18 Внутриклеточный домен 4-1BB (н. к.) AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG SEQ ID NO: 8 CD27 (а. к.) QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP SEQ ID NO: 19 CD27 (н. к.) AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC SEQ ID NO: 9 CD3-дзета (а. к.)
(с мутацией Q/K) RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 20 CD3-дзета (н. к.)
(с мутацией Q/K) AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC SEQ ID NO: 10 CD3-дзета (а. к.)
(Эталонная последовательность NM_000734.3 в NCBI) RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 21 CD3-дзета (н. к.)
(Эталонная последовательность NM_000734.3 в NCBI) AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC SEQ ID NO: 36 Внутриклеточный домен CD28 (аминокислотная последовательность) RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS SEQ ID NO: 37 Внутриклеточный домен CD28 (нуклеотидная последовательность) AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC SEQ ID NO: 38 Внутриклеточный домен ICOS (аминокислотная последовательность) T K K K Y S S S V H D P N G E Y M F M R A V N T A K K S R L T D V T L SEQ ID NO: 39 Внутриклеточный домен ICOS (нуклеотидная последовательность) ACAAAAAAGAAGTATTCATCCAGTGTGCACGACCCTAACGGTGAATACATGTTCATGAGAGCAGTGAACACAGCCAAAAAATCCAGACTCACAGATGTGACCCTA SEQ ID NO: 5 Шарнирная область/линкер GS (а. к.) GGGGSGGGGS SEQ ID NO: 16 Шарнирная область/линкер GS (н. к.) GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC SEQ ID NO: 40 Шарнирная область/линкер GS (н. к.) GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGGGGTTCC SEQ ID NO: 25 Линкер GGGGS SEQ ID NO: 26 Линкер (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n, где n=1-6, например GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS SEQ ID NO: 27 Линкер GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO: 28 Линкер GGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO: 29 Линкер GGGS SEQ ID NO: 41 Линкер (Gly-Gly-Gly-Ser)n, где n представляет собой положительное целое число, равное 1 или больше SEQ ID NO: 42 Линкер (Gly-Gly-Gly-Ser)n, где n=1-10, например GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS SEQ ID NO: 43 Линкер GSTSGSGKPGSGEGSTKG SEQ ID NO: 30 Поли(A) (A)₅₀₀₀
Эта последовательность может охватывать 50-5000 адениновых оснований. SEQ ID NO: 31 Поли(T) (T)₁₀₀ SEQ ID NO: 32 Поли(T) (T)₅₀₀₀
Эта последовательность может охватывать 50-5000 тиминовых оснований. SEQ ID NO: 33 Поли(A) (A)₅₀₀₀
Эта последовательность может охватывать 100-5000 адениновых оснований. SEQ ID NO: 34 Поли(A) (A)₄₀₀
Эта последовательность может охватывать 100-400 адениновых оснований. SEQ ID NO: 35 Поли(A) (A)₂₀₀₀
Эта последовательность может охватывать 50-2000 адениновых оснований. SEQ ID NO: 22 CAR для PD1 (а. к.) pgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlvtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr SEQ ID NO: 23 CAR для PD-1 (н. к.)
(ECD PD1 подчеркнут) atggccctccctgtcactgccctgcttctccccctcgcactcctgctccacgccgctagaccacccggatggtttctggactctccggatcgcccgtggaatcccccaaccttctcaccggcactcttggttgtgactgagggcgataatgcgaccttcacgtgctcgttctccaacacctccgaatcattcgtgctgaactggtaccgcatgagcccgtcaaaccagaccgacaagctcgccgcgtttccggaagatcggtcgcaaccgggacaggattgtcggttccgcgtgactcaactgccgaatggcagagacttccacatgagcgtggtccgcgctaggcgaaacgactccgggacctacctgtgcggagccatctcgctggcgcctaaggcccaaatcaaagagagcttgagggccgaactgagagtgaccgagcgcagagctgaggtgccaactgcacatccatccccatcgcctcggcctgcggggcagtttcagaccctggtcacgaccactccggcgccgcgcccaccgactccggccccaactatcgcgagccagcccctgtcgctgaggccggaagcatgccgccctgccgccggaggtgctgtgcatacccggggattggacttcgcatgcgacatctacatttgggctcctctcgccggaacttgtggcgtgctccttctgtccctggtcatcaccctgtactgcaagcggggtcggaaaaagcttctgtacattttcaagcagcccttcatgaggcccgtgcaaaccacccaggaggaggacggttgctcctgccggttccccgaagaggaagaaggaggttgcgagctgcgcgtgaagttctcccggagcgccgacgcccccgcctataagcagggccagaaccagctgtacaacgaactgaacctgggacggcgggaagagtacgatgtgctggacaagcggcgcggccgggaccccgaaatgggcgggaagcctagaagaaagaaccctcaggaaggcctgtataacgagctgcagaaggacaagatggccgaggcctactccgaaattgggatgaagggagagcggcggaggggaaaggggcacgacggcctgtaccaaggactgtccaccgccaccaaggacacatacgatgccctgcacatgcaggcccttccccctcgc SEQ ID NO: 24 CAR для PD-1 с сигнальной последовательностью (а. к.)
(ECD PD1 подчеркнут) Malpvtalllplalllhaarppgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlvtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr

Биспецифические CAR

В некоторых вариантах осуществления молекула полиспецифического антитела представляет собой молекулу биспецифического антитела. Биспецифическое антитело характеризуется специфичностью в отношении не более чем двух антигенов. Молекула биспецифического антитела характеризуется наличием первой последовательности вариабельного домена иммуноглобулина, которая характеризуется специфичностью связывания с первым эпитопом, и второй последовательности вариабельного домена иммуноглобулина, которая характеризуется специфичностью связывания со вторым эпитопом. В некоторых вариантах осуществления первый и второй эпитопы находятся на одном и том же антигене, например одном и том же белке (или субъединице мультимерного белка). В некоторых вариантах осуществления первый и второй эпитопы перекрываются. В некоторых вариантах осуществления первый и второй эпитопы не перекрываются. В некоторых вариантах осуществления первый и второй эпитопы находятся на разный антигенах, например разных белках (или разных субъединицах мультимерного белка). В некоторых вариантах осуществления молекула биспецифического антитела содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи и последовательность вариабельного домена легкой цепи, которые характеризуются специфичностью связывания с первым эпитопом, и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи и последовательность вариабельного домена легкой цепи, которые характеризуются специфичностью связывания со вторым эпитопом. В одном варианте осуществления молекула биспецифического антитела содержит полуантитело, характеризующееся специфичностью связывания с первым эпитопом, и полуантитело, характеризующееся специфичностью связывания со вторым эпитопом. В некоторых вариантах осуществления молекула биспецифического антитела содержит полуантитело или его фрагмент, характеризующиеся специфичностью связывания с первым эпитопом, и полуантитело или его фрагмент, характеризующиеся специфичностью связывания со вторым эпитопом. В некоторых вариантах осуществления молекула биспецифического антитела содержит scFv или его фрагмент, характеризующиеся специфичностью связывания с первым эпитопом, и scFv или его фрагмент, характеризующиеся специфичностью связывания со вторым эпитопом.

В определенных вариантах осуществления молекула антитела представляет собой молекулу полиспецифического (например, биспецифического или триспецифического) антитела. Протоколы для получения молекул биспецифических или гетеродимерных антител и различных конфигураций для молекул биспецифических антител описаны, например, в абзацах 455-458 WO2015/142675, поданной 13 марта 2015 года, которая включена посредством ссылки во всей своей полноте.

В некоторых вариантах осуществления молекула биспецифического антитела характеризуется первой последовательностью вариабельного домена иммуноглобулина, например scFv, которая характеризуется специфичностью связывания с CD19, например содержит scFv, описанный в данном документе, или содержит CDR легкой цепи и/или CDR тяжелой цепи из scFv, описанного в данном документе, и второй последовательностью вариабельного домена иммуноглобулина, которая характеризуется специфичностью связывания со вторым эпитопом на другом антигене.

Химерный TCR

В некоторых вариантах осуществления антитела и фрагменты антител по настоящему изобретению (например, антитела к CD19 и их фрагменты) могут быть пересажены на один или несколько константных доменов цепи Т-клеточного рецептора ("TCR"), например, альфа-цепи TCR или бета-цепи TCR, с созданием химерного TCR. Не ограничиваясь какой-либо теорией полагают, что химерные TCR будут передавать сигналы через комплекс TCR при связывании антигена. Например, scFv, раскрытый в данном документе, можно пересадить на константный домен, например, на по меньшей мере часть внеклеточного константного домена, трансмембранного домена и цитоплазматического домена цепи TCR, например, альфа-цепи TCR и/или бета-цепи TCR. В качестве другого примера, фрагмент антитела, например, VL-домен, описанный в данном документе, можно пересадить на константный домен альфа-цепи TCR, и фрагмент антитела, например, VH-домен, описанный в данном документе, можно пересадить на константный домен бета-цепи TCR (или, в качестве альтернативы, VL-домен можно пересадить на константный домен бета-цепи TCR, а VH-домен можно пересадить на альфа-цепь TCR). В качестве другого примера, CDR антитела или фрагмента антитела можно пересадить на альфа- и/или бета-цепь TCR с созданием химерного TCR. Например, раскрытые в данном документе LCDR можно пересадить на вариабельный домен альфа-цепи TCR, а раскрытые в данном документе HCDR можно пересадить на вариабельный домен бета-цепи TCR или наоборот. Такие химерные TCR можно получить, например, с помощью способов, известных из уровня техники (например, Willemsen RA et al., Gene Therapy 2000; 7: 1369-1377; Zhang T et al, Cancer Gene Ther 2004; 11: 487-496; Aggen et al, Gene Ther. 2012 Apr;19(4):365-74).

Каркасные структуры, отличные от антител

В вариантах осуществления антигенсвязывающий домен содержит каркасную структуру, отличную от антитела, например фибронектин, анкирин, доменное антитело, липокалин, малое модульное иммунофармацевтическое средство, макситело, белок A или аффилин. Каркасная структура, отличная от антитела, обладает способностью связываться с антигеном-мишенью на клетке. В вариантах осуществления антигенсвязывающий домен представляет собой полипептид или его фрагмент из встречающегося в природе белка, экспрессируемые на клетке. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен содержит каркасную структуру, отличную от антитела. Можно использовать большое разнообразие каркасных структур, отличных от антител, при условии, что полученный в результате полипептид содержит по меньшей мере одну связывающую область, которая специфично связывается с антигеном-мишенью на клетке-мишени.

Каркасные структуры, отличные от антител, включают: фибронектин (Novartis, Массачусетс), анкирин (Molecular Partners AG, Цюрих, Швейцария), доменные антитела (Domantis, Ltd., Кембридж, Массачусетс и Ablynx NV, Звейнарде, Бельгия), липокалин (Pieris Proteolab AG, Фрайзинг, Германия), малые модульные иммунофармацевтические средства (Trubion Pharmaceuticals Inc., Сиэтл, Вашингтон), макситела (Avidia, Inc., Маунтин-Вью, Калифорния), белок A (Affibody AG, Швеция) и аффилин (гамма-кристаллин или убиквитин) (Scil Proteins GmbH, Галле, Германия).

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен содержит внеклеточный домен или его противолигандсвязывающий фрагмент из молекулы, которая связывает противолиганд на поверхности клетки-мишени.

Иммунные эффекторные клетки могут содержать рекомбинантную ДНК-конструкцию, содержащую последовательности, кодирующие CAR, где CAR содержит антигенсвязывающий домен (например, антитело или фрагмент антитела, TCR или фрагмент TCR), который специфично связывается с опухолевым антигеном, например опухолевым антигеном, описанным в данном документе, и внутриклеточный сигнальный домен. Внутриклеточный сигнальный домен может содержать костимулирующий сигнальный домен и/или первичный сигнальный домен, например дзета-цепь. Как описано в другом месте, способы, описанные в данном документе, могут включать трансдукцию клетки, например, из популяции, истощенной по регуляторным T-клеткам, нуклеиновой кислотой, кодирующей CAR, например CAR, описанный в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления CAR содержит scFv-домен, где перед scFv может располагаться необязательная лидерная последовательность, такая как представленная под SEQ ID NO: 1, и за ней может располагаться необязательная последовательность шарнирной области, такая как представленная под SEQ ID NO: 2, или SEQ ID NO: 36, или SEQ ID NO: 38, трансмембранная область, такая как представленная под SEQ ID NO: 6, внутриклеточный сигнальный домен, который содержит SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 16, и последовательность CD3-дзета, которая содержит SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, например, где домены являются смежными и находятся в одной и той же рамке считывания, образуя единый слитый белок.

В некоторых вариантах осуществления иллюстративные конструкции CAR содержат необязательную лидерную последовательность (например, лидерную последовательность, описанную в данном документе), внеклеточный антигенсвязывающий домен (например, антигенсвязывающий домен, описанный в данном документе), шарнирную область (например, шарнирную область, описанную в данном документе), трансмембранный домен (например, трансмембранный домен, описанный в данном документе) и внутриклеточный стимулирующий домен (например, внутриклеточный стимулирующий домен, описанный в данном документе). В некоторых вариантах осуществления иллюстративная конструкция CAR содержит необязательную лидерную последовательность (например, лидерную последовательность, описанную в данном документе), внеклеточный антигенсвязывающий домен (например, антигенсвязывающий домен, описанный в данном документе), шарнирную область (например, шарнирную область, описанную в данном документе), трансмембранный домен (например, трансмембранный домен, описанный в данном документе), внутриклеточный костимулирующий сигнальный домен (например, костимулирующий сигнальный домен, описанный в данном документе) и/или внутриклеточный первичный сигнальный домен (например, первичный сигнальный домен, описанный в данном документе).

Иллюстративная лидерная последовательность представлена под SEQ ID NO: 1. Иллюстративная последовательность шарнирной области/спейсера представлена под SEQ ID NO: 2, или SEQ ID NO:36, или SEQ ID NO:38. Иллюстративная последовательность трансмембранного домена представлена под SEQ ID NO: 6. Иллюстративная последовательность внутриклеточного сигнального домена белка 4-1BB представлена под SEQ ID NO: 7. Иллюстративная последовательность внутриклеточного сигнального домена CD27 представлена под SEQ ID NO:16. Иллюстративная последовательность домена CD3-дзета представлена под SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO:10.

В некоторых вариантах осуществления иммунная эффектoрная клетка содержит рекомбинантную конструкцию нуклеиновой кислоты, содержащую молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR, где молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую антигенсвязывающий домен, где последовательность является смежной с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей внутриклеточный сигнальный домен, и находится с ней в одной и той же рамке считывания. Иллюстративный внутриклеточный сигнальный домен, который может использоваться в CAR, включает без ограничения один или несколько внутриклеточных сигнальных доменов, например CD3-дзета, CD28, CD27, 4-1BB и т. п. В некоторых случаях CAR может содержать любую комбинацию из CD3-дзета, CD28, 4-1BB и т. п.

Последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие требуемые молекулы, можно получить с помощью рекомбинантных способов, известных из уровня техники, как, например, путем скрининга библиотек из клеток, экспрессирующих молекулу нуклеиновой кислоты, путем получения молекулы нуклеиновой кислоты из вектора, о котором известно, что он ее содержит, или путем непосредственного выделения из клеток и тканей, содержащих ее, с помощью стандартных методик. В качестве альтернативы, нуклеиновая кислота, представляющая интерес, может быть получена путем синтеза, а не клонирования.

Нуклеиновые кислоты, кодирующие CAR, можно вводить в иммунные эффекторные клетки с помощью, например, ретровирусных или лентивирусных векторных конструкций.

Нуклеиновые кислоты, кодирующие CAR, также можно вводить в иммунную эффекторную клетку с помощью, например, РНК-конструкции, которая может быть непосредственно введена в клетку путем трансфекции. Способ получения мРНК для применения в трансфекции включает обеспечение транскрипции in vitro (IVT) матрицы с использованием специально разработанных праймеров с последующим добавлением поли(А) с получением конструкции, содержащей последовательности 3'- и 5'-нетранслируемых областей ("UTR") (например, 3'- и/или 5'-UTR, описанных в данном документе), 5'-кэп (например, 5'-кэп, описанный в данном документе) и/или участок внутренней посадки рибосомы (IRES) (например, IRES, описанный в данном документе), нуклеиновую кислоту, которая должна экспрессироваться, и поли(A)-хвост, как правило, длиной 50-2000 оснований (например, описанный в примерах, например, под SEQ ID NO:35). С помощью РНК, полученной таким образом, можно эффективно трансфицировать различные типы клеток. В некоторых вариантах осуществления матрица содержит последовательности для CAR. В некоторых вариантах осуществления вектор на основе РНК, кодирующий CAR, вводят путем трансдукции в клетку, например T-клетку, с помощью электропорации.

Антигенсвязывающий домен

В некоторых вариантах осуществления множество иммунных эффекторных клеток, например, популяция, истощенная по регуляторным T-клеткам, содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR, которая содержит специфичный в отношении мишени связывающий элемент, иначе называемый антигенсвязывающим доменом. Выбор связывающего элемента зависит от типа и количества лигандов, которые определяют поверхность клетки-мишени. Например, антигенсвязывающий домен может быть выбран таким образом, чтобы он распознавал лиганд, который выступает в качестве маркера клеточной поверхности на клетках-мишенях, ассоциированных с конкретным болезненным состоянием. Таким образом, примеры маркеров клеточной поверхности, которые могут выступать в качестве лигандов для антигенсвязывающего домена в CAR, описанного в данном документе, включают маркеры, ассоциированные с вирусными, бактериальными и паразитарными инфекциями, аутоиммунным заболеванием и раковыми клетками.

В некоторых вариантах осуществления часть CAR, содержащая антигенсвязывающий домен, содержит антигенсвязывающий домен, который нацеливается на опухолевый антиген, например на опухолевый антиген, описанный в данном документе.

Антигенсвязывающий домен может представлять собой любой домен, который связывается с антигеном, в том числе без ограничения моноклональное антитело, поликлональное антитело, рекомбинантное антитело, антитело человека, гуманизированное антитело и их функциональный фрагмент, в том числе без ограничения однодоменное антитело, такое как вариабельный домен тяжелой цепи (VH), вариабельный домен легкой цепи (VL) и вариабельный домен (VHH) нанотела верблюдовых, а также альтернативную каркасную структуру, которая, как известно из уровня техники, функционирует в качестве антигенсвязывающего домена, такую как рекомбинантный фибронектиновый домен, T-клеточный рецептор (TCR) или его фрагмент, например одноцепочечный TCR, и т. п. В некоторых случаях целесообразно, чтобы антигенсвязывающий домен был получен из того же вида, в организме которого в конечном итоге будет применяться CAR. Например, для применения у людей может быть целесообразно, чтобы антигенсвязывающий домен CAR содержал человеческие или гуманизированные остатки в антигенсвязывающем домене антитела или фрагмента антитела.

CAR для CD19

В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе клетка, экспрессирующая CAR, представляет собой клетку, экспрессирующую CAR для CD19 (например, клетку, экспрессирующую CAR, который связывается с CD19 человека).

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен CAR для CD19 характеризуется такой же или сходной специфичностью связывания по сравнению с scFv-фрагментом FMC63, описанным в Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997). В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен CAR для CD19 включает scFv-фрагмент, описанный в Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997).

В некоторых вариантах осуществления CAR для CD19 содержит антигенсвязывающий домен (например, гуманизированный антигенсвязывающий домен) согласно таблице 3 из WO2014/153270, включенной в данный документ посредством ссылки. В WO2014/153270 также описаны способы выполнения анализа связывания и эффективности различных конструкций CAR.

В некоторых вариантах осуществления исходная последовательность мышиного scFv представляет собой конструкцию CAR19, представленную в публикации согласно PCT WO2012/079000 (включенной в данный документ посредством ссылки). В некоторых вариантах осуществления CD19-связывающий домен представляет собой scFv, описанный в WO2012/079000.

В некоторых вариантах осуществления молекула CAR содержит последовательность слитого полипептида, представленную под SEQ ID NO: 12 в публикации согласно PCT WO2012/079000, в которой представлен scFv-фрагмент мышиного происхождения, который специфично связывается с CD19 человека.

В некоторых вариантах осуществления CAR для CD19 содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 12 в публикации согласно PCT WO2012/079000.

В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность представляет собой:

Diqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr (SEQ ID NO: 292) или последовательность, по сути гомологичную ей.

В некоторых вариантах осуществления CAR для CD19 имеет обозначение согласно USAN TISAGENLECLEUCEL-T. В ряде вариантов осуществления CTL019 получают посредством генной модификации T-клеток, опосредованной стабильной вставкой путем трансдукции с помощью самоинактивирующегося лентивирусного (LV) вектора, дефектного по репликации, содержащего трансген CTL019 под контролем промотора гена EF-1-альфа. CTL019 может представлять собой смесь положительных и отрицательных по трансгену Т-клеток, которые доставляются субъекту исходя из процентной доли Т-клеток, положительных по трансгену.

В других вариантах осуществления CAR для CD19 содержит антигенсвязывающий домен (например, гуманизированный антигенсвязывающий домен) согласно таблице 3 из WO2014/153270, включенной в данный документ посредством ссылки.

Гуманизация мышиного антитела к CD19 необходима для клинического применения, когда специфические для мышей остатки могут индуцировать ответ с образованием антител человека к антигену мыши (HAMA) у пациентов, которые получают лечение с помощью CART19, т. е. лечения с помощью T-клеток, трансдуцированных конструкцией CAR19. Получение, определение характеристик и эффективность гуманизированных последовательностей CAR для CD19 описаны в международной заявке WO2014/153270, включенной в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте, включая примеры 1-5 (стр. 115-159).

В некоторых вариантах осуществления молекула CAR представляет собой гуманизированный CAR для CD19, содержащий аминокислотную последовательность под eivmtqspatlslspgeratlscrasqdiskylnwyqqkpgqaprlliyhtsrlhsgiparfsgsgsgtdytltisslqpedfavyfcqqgntlpytfgqgtkleikggggsggggsggggsqvqlqesgpglvkpsetlsltctvsgvslpdygvswirqppgkglewigviwgsettyyqsslksrvtiskdnsknqvslklssvtaadtavyycakhyyyggsyamdywgqgtlvtvss (SEQ ID NO: 293)

В некоторых вариантах осуществления молекула CAR представляет собой гуманизированный CAR для CD19, содержащий аминокислотную последовательность под

eivmtqspatlslspgeratlscrasqdiskylnwyqqkpgqaprlliyhtsrlhsgiparfsgsgsgtdytltisslqpedfavyfcqqgntlpytfgqgtkleikggggsggggsggggsqvqlqesgpglvkpsetlsltctvsgvslpdygvswirqppgkglewigviwgsettyyqsslksrvtiskdnsknqvslklssvtaadtavyycakhyyyggsyamdywgqgtlvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr (sEQ ID NO: 294)

В соответствии с настоящим изобретением можно применять любой CAR для CD19, например антигенсвязывающий домен для CD19 из любого известного CAR для CD19. Например, CAR для CD19, LG-740, описан в патенте США № 8399645; патенте США № 7446190; Xu et al., Leuk Lymphoma. 2013 54(2):255-260(2012); Cruz et al., Blood 122(17):2965-2973 (2013); Brentjens et al., Blood, 118(18):4817-4828 (2011); Kochenderfer et al., Blood 116(20):4099-102 (2010); Kochenderfer et al., Blood 122 (25):4129-39 (2013) и 16th Annu Meet Am Soc Gen Cell Ther (ASGCT) (May 15-18, Солт-Лейк-Сити) 2013, Abst 10.

Иллюстративные CAR для CD19 включают CAR для CD19, описанный в данном документе, или CAR для CD19, описанный в Xu et al. Blood 123.24(2014):3750-9; Kochenderfer et al. Blood 122.25(2013):4129-39, Cruz et al. Blood 122.17(2013):2965-73, NCT00586391, NCT01087294, NCT02456350, NCT00840853, NCT02659943, NCT02650999, NCT02640209, NCT01747486, NCT02546739, NCT02656147, NCT02772198, NCT00709033, NCT02081937, NCT00924326, NCT02735083, NCT02794246, NCT02746952, NCT01593696, NCT02134262, NCT01853631, NCT02443831, NCT02277522, NCT02348216, NCT02614066, NCT02030834, NCT02624258, NCT02625480, NCT02030847, NCT02644655, NCT02349698, NCT02813837, NCT02050347, NCT01683279, NCT02529813, NCT02537977, NCT02799550, NCT02672501, NCT02819583, NCT02028455, NCT01840566, NCT01318317, NCT01864889, NCT02706405, NCT01475058, NCT01430390, NCT02146924, NCT02051257, NCT02431988, NCT01815749, NCT02153580, NCT01865617, NCT02208362, NCT02685670, NCT02535364, NCT02631044, NCT02728882, NCT02735291, NCT01860937, NCT02822326, NCT02737085, NCT02465983, NCT02132624, NCT02782351, NCT01493453, NCT02652910, NCT02247609, NCT01029366, NCT01626495, NCT02721407, NCT01044069, NCT00422383, NCT01680991, NCT02794961 или NCT02456207, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

В некоторых вариантах осуществления CAR к CD19 содержат последовательность, например CDR, VH, VL, scFv или полную последовательность CAR, раскрытую в таблице 2, или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью с ней.

Таблица 2. Аминокислотные последовательности иллюстративных молекул антител к CD19

SEQ ID NO Область Последовательность CTL019 295 HCDR1 (Kabat) DYGVS 296 HCDR2 (Kabat) VIWGSETTYYNSALKS 297 HCDR3 (Kabat) HYYYGGSYAMDY 298 LCDR1 (Kabat) RASQDISKYLN 299 LCDR2 (Kabat) HTSRLHS 300 LCDR3 (Kabat) QQGNTLPYT 301 Полная аминокислотная последовательность CTL019 MALPVTALLLPLALLLHAARPdiqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr 302 Полная нуклеотидная последовательность CTL019 atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggagatcacaggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcggatctgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggccaaggaacctcagtcaccgtctcctcaaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc 303 scFv-домен CTL019 Diqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvss Гуманизированный CAR2 295 HCDR1 (Kabat) DYGVS 304 HCDR2 (Kabat) VIWGSETTYYQSSLKS 297 HCDR3 (Kabat) HYYYGGSYAMDY 298 LCDR1 (Kabat) RASQDISKYLN 299 LCDR2 (Kabat) HTSRLHS 300 LCDR3 (Kabat) QQGNTLPYT 293 scFv-домен CAR2 - a. к. (линкер подчеркнут) EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS 305 scFv-домен CAR2 - н. к. atggccctccctgtcaccgccctgctgcttccgctggctcttctgctccacgccgctcggcccgaaattgtgatgacccagtcacccgccactcttagcctttcacccggtgagcgcgcaaccctgtcttgcagagcctcccaagacatctcaaaataccttaattggtatcaacagaagcccggacaggctcctcgccttctgatctaccacaccagccggctccattctggaatccctgccaggttcagcggtagcggatctgggaccgactacaccctcactatcagctcactgcagccagaggacttcgctgtctatttctgtcagcaagggaacaccctgccctacacctttggacagggcaccaagctcgagattaaaggtggaggtggcagcggaggaggtgggtccggcggtggaggaagccaggtccaactccaagaaagcggaccgggtcttgtgaagccatcagaaactctttcactgacttgtactgtgagcggagtgtctctccccgattacggggtgtcttggatcagacagccaccggggaagggtctggaatggattggagtgatttggggctctgagactacttactaccaatcatccctcaagtcacgcgtcaccatctcaaaggacaactctaagaatcaggtgtcactgaaactgtcatctgtgaccgcagccgacaccgccgtgtactattgcgctaagcattactattatggcgggagctacgcaatggattactggggacagggtactctggtcaccgtgtccagccaccaccatcatcaccatcaccat 306 CAR2 - полный - а. к. MALPVTALLLPLALLLHAARPEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR 307 CAR2 - полный - н. к. atggccctccctgtcaccgccctgctgcttccgctggctcttctgctccacgccgctcggcccgaaattgtgatgacccagtcacccgccactcttagcctttcacccggtgagcgcgcaaccctgtcttgcagagcctcccaagacatctcaaaataccttaattggtatcaacagaagcccggacaggctcctcgccttctgatctaccacaccagccggctccattctggaatccctgccaggttcagcggtagcggatctgggaccgactacaccctcactatcagctcactgcagccagaggacttcgctgtctatttctgtcagcaagggaacaccctgccctacacctttggacagggcaccaagctcgagattaaaggtggaggtggcagcggaggaggtgggtccggcggtggaggaagccaggtccaactccaagaaagcggaccgggtcttgtgaagccatcagaaactctttcactgacttgtactgtgagcggagtgtctctccccgattacggggtgtcttggatcagacagccaccggggaagggtctggaatggattggagtgatttggggctctgagactacttactaccaatcatccctcaagtcacgcgtcaccatctcaaaggacaactctaagaatcaggtgtcactgaaactgtcatctgtgaccgcagccgacaccgccgtgtactattgcgctaagcattactattatggcgggagctacgcaatggattactggggacagggtactctggtcaccgtgtccagcaccactaccccagcaccgaggccacccaccccggctcctaccatcgcctcccagcctctgtccctgcgtccggaggcatgtagacccgcagctggtggggccgtgcatacccggggtcttgacttcgcctgcgatatctacatttgggcccctctggctggtacttgcggggtcctgctgctttcactcgtgatcactctttactgtaagcgcggtcggaagaagctgctgtacatctttaagcaacccttcatgaggcctgtgcagactactcaagaggaggacggctgttcatgccggttcccagaggaggaggaaggcggctgcgaactgcgcgtgaaattcagccgcagcgcagatgctccagcctacaagcaggggcagaaccagctctacaacgaactcaatcttggtcggagagaggagtacgacgtgctggacaagcggagaggacgggacccagaaatgggcgggaagccgcgcagaaagaatccccaagagggcctgtacaacgagctccaaaaggataagatggcagaagcctatagcgagattggtatgaaaggggaacgcagaagaggcaaaggccacgacggactgtaccagggactcagcaccgccaccaaggacacctatgacgctcttcacatgcaggccctgccgcctcgg

CAR для BCMA

В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе клетка, экспрессирующая CAR, представляет собой клетку, экспрессирующую CAR для BCMA (например, клетку, экспрессирующую CAR, который связывается с BCMA человека). Иллюстративные CAR для BCMA могут включать последовательности, раскрытые в таблице 1 или 16 WO2016/014565, включенной в данный документ посредством ссылки. Конструкция CAR для BCMA может содержать необязательную лидерную последовательность; необязательный шарнирный домен, например шарнирный домен CD8; трансмембранный домен, например трансмембранный домен CD8; внутриклеточный домен, например внутриклеточный домен 4-1BB; и функциональный сигнальный домен, например домен CD3-дзета. В определенных вариантах осуществления домены являются смежными и находятся в одной и той же рамке считывания, образуя единый слитый белок. В других вариантах осуществления домены находятся в отдельных полипептидах, как, например, в молекуле RCAR, описанной в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления молекула CAR для BCMA содержит одну или несколько CDR, VH, VL, scFv или полноразмерных последовательностей BCMA-1, BCMA-2, BCMA-3, BCMA-4, BCMA-5, BCMA-6, BCMA-7, BCMA-8, BCMA-9, BCMA-10, BCMA-11, BCMA-12, BCMA-13, BCMA-14, BCMA-15, 149362, 149363, 149364, 149365, 149366, 149367, 149368, 149369, BCMA_EBB-C1978-A4, BCMA_EBB-C1978-G1, BCMA_EBB-C1979-C1, BCMA_EBB-C1978-C7, BCMA_EBB-C1978-D10, BCMA_EBB-C1979-C12, BCMA_EBB-C1980-G4, BCMA_EBB-C1980-D2, BCMA_EBB-C1978-A10, BCMA_EBB-C1978-D4, BCMA_EBB-C1980-A2, BCMA_EBB-C1981-C3, BCMA_EBB-C1978-G4, A7D12.2, C11D5.3, C12A3.2 или C13F12.1, раскрытых в WO2016/014565, или последовательность, по сути (например, на 95-99%) идентичную им.

Дополнительные иллюстративные последовательности, нацеливающиеся на BCMA, которые можно использовать в конструкциях CAR, связывающихся с BCMA, раскрыты в WO 2017/021450, WO 2017/011804, WO 2017/025038, WO 2016/090327, WO 2016/130598, WO 2016/210293, WO 2016/090320, WO 2016/014789, WO 2016/094304, WO 2016/154055, WO 2015/166073, WO 2015/188119, WO 2015/158671, US 9243058, US 8920776, US 9273141, US 7083785, US 9034324, US 2007/0049735, US 2015/0284467, US 2015/0051266, US 2015/0344844, US 2016/0131655, US 2016/0297884, US 2016/0297885, US 2017/0051308, US 2017/0051252, US 2017/0051252, WO 2016/020332, WO 2016/087531, WO 2016/079177, WO 2015/172800, WO 2017/008169, US 9340621, US 2013/0273055, US 2016/0176973, US 2015/0368351, US 2017/0051068, US 2016/0368988 и US 2015/0232557, включенных в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В некоторых вариантах осуществления дополнительные иллюстративные конструкции CAR для BCMA получают с использованием последовательностей VH и VL из публикации согласно PCT WO2012/0163805 (содержание которой включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте).

В некоторых вариантах осуществления CAR для BCMA содержат последовательность, например CDR, VH, VL, scFv или полную последовательность CAR, раскрытую в таблицах 3-15, или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью с ней. В одном аспекте антигенсвязывающий домен содержит антитело человека или фрагмент антитела человека. В некоторых вариантах осуществления человеческий домен, связывающий BCMA, содержит одну или несколько (например, все три) CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC человеческого домена, связывающего BCMA, описанного в данном документе (например, в таблицах 3-10 и 12-15) и/или одну или несколько (например, все три) CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC человеческого домена, связывающего BCMA, описанного в данном документе (например, в таблицах 3-10 и 12-15). В некоторых вариантах осуществления человеческий домен, связывающий BCMA, содержит VL человека, описанную в данном документе (например, в таблицах 3, 7 и 12), и/или VH человека, описанную в данном документе (например, в таблицах 3, 7 и 12). В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, представляет собой scFv, содержащий VL и VH с аминокислотной последовательностью из таблиц 3, 7 и 12. В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA (например, scFv) содержит: VL, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например консервативных замен) аминокислотной последовательности, представленной в таблицах 3, 7 и 12, или последовательность с 95-99% идентичностью с аминокислотной последовательностью из таблиц 3, 7 и 12; и/или VH, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например консервативных замен) аминокислотной последовательности, представленной в таблицах 3, 7 и 12, или последовательность с 95-99% идентичностью с аминокислотной последовательностью из таблиц 3, 7 и 12.

Таблица 3. Аминокислотные последовательности и последовательности нуклеиновых кислот иллюстративных молекул, полученных из PALLAS, связывающихся с BCMA

SEQ ID NO Название/
описание Последовательность R1B6 SEQ ID NO: 44 HCDR1 (Kabat) SYAMS SEQ ID NO: 45 HCDR2 (Kabat) AISGSGGSTYYADSVKG SEQ ID NO: 46 HCDR3 (Kabat) REWVPYDVSWYFDY SEQ ID NO: 47 HCDR1 (Chothia) GFTFSSY SEQ ID NO: 48 HCDR2 (Chothia) SGSGGS SEQ ID NO: 46 HCDR3 (Chothia) REWVPYDVSWYFDY SEQ ID NO: 49 HCDR1 (IMGT) GFTFSSYA SEQ ID NO: 50 HCDR2 (IMGT) ISGSGGST SEQ ID NO: 51 HCDR3 (IMGT) ARREWVPYDVSWYFDY SEQ ID NO: 52 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARREWVPYDVSWYFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 53 ДНК VH GAAGTGCAGTTGCTGGAGTCAGGCGGAGGACTGGTGCAGCCCGGAGGATCGCTTCGCTTGAGCTGCGCAGCCTCAGGCTTTACCTTCTCCTCCTACGCCATGTCCTGGGTCAGACAGGCTCCCGGGAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCCATTAGCGGTTCCGGCGGAAGCACTTACTATGCCGACTCTGTGAAGGGCCGCTTCACTATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTATCTCCAAATGAATTCCCTGAGGGCCGAAGATACCGCGGTGTACTACTGCGCTAGACGGGAGTGGGTGCCCTACGATGTCAGCTGGTACTTCGACTACTGGGGACAGGGCACTCTCGTGACTGTGTCCTCC SEQ ID NO: 54 LCDR1 (Kabat) RASQSISSYLN SEQ ID NO: 55 LCDR2 (Kabat) AASSLQS SEQ ID NO: 56 LCDR3 (Kabat) QQSYSTPLT SEQ ID NO: 57 LCDR1 (Chothia) SQSISSY SEQ ID NO: 58 LCDR2 (Chothia) AAS SEQ ID NO: 59 LCDR3 (Chothia) SYSTPL SEQ ID NO: 60 LCDR1 (IMGT) QSISSY SEQ ID NO: 58 LCDR2 (IMGT) AAS SEQ ID NO: 56 LCDR3 (IMGT) QQSYSTPLT SEQ ID NO: 61 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 62 ДНК VL GACATTCAAATGACTCAGTCCCCGTCCTCCCTCTCCGCCTCCGTGGGAGATCGCGTCACGATCACGTGCAGGGCCAGCCAGAGCATCTCCAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAGGCACCGAAGCTCCTGATCTACGCCGCTAGCTCGCTGCAGTCCGGCGTCCCTTCACGGTTCTCGGGATCGGGCTCAGGCACCGACTTCACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAGGACTTCGCGACATACTACTGTCAGCAGTCATACTCCACCCCTCTGACCTTCGGCCAAGGGACCAAAGTGGAGATCAAG SEQ ID NO: 63 Линкер GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO: 64 scFv (VH-линкер-VL) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARREWVPYDVSWYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 65 ДНК scFv GAAGTGCAGTTGCTGGAGTCAGGCGGAGGACTGGTGCAGCCCGGAGGATCGCTTCGCTTGAGCTGCGCAGCCTCAGGCTTTACCTTCTCCTCCTACGCCATGTCCTGGGTCAGACAGGCTCCCGGGAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCCATTAGCGGTTCCGGCGGAAGCACTTACTATGCCGACTCTGTGAAGGGCCGCTTCACTATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTATCTCCAAATGAATTCCCTGAGGGCCGAAGATACCGCGGTGTACTACTGCGCTAGACGGGAGTGGGTGCCCTACGATGTCAGCTGGTACTTCGACTACTGGGGACAGGGCACTCTCGTGACTGTGTCCTCCGGTGGTGGTGGATCGGGGGGTGGTGGTTCGGGCGGAGGAGGATCTGGAGGAGGAGGGTCGGACATTCAAATGACTCAGTCCCCGTCCTCCCTCTCCGCCTCCGTGGGAGATCGCGTCACGATCACGTGCAGGGCCAGCCAGAGCATCTCCAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAGGCACCGAAGCTCCTGATCTACGCCGCTAGCTCGCTGCAGTCCGGCGTCCCTTCACGGTTCTCGGGATCGGGCTCAGGCACCGACTTCACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAGGACTTCGCGACATACTACTGTCAGCAGTCATACTCCACCCCTCTGACCTTCGGCCAAGGGACCAAAGTGGAGATCAAG SEQ ID NO: 66 Полная аминокислотная последовательность CAR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARREWVPYDVSWYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 67 Полная последовательность ДНК CAR GAAGTGCAGTTGCTGGAGTCAGGCGGAGGACTGGTGCAGCCCGGAGGATCGCTTCGCTTGAGCTGCGCAGCCTCAGGCTTTACCTTCTCCTCCTACGCCATGTCCTGGGTCAGACAGGCTCCCGGGAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCCATTAGCGGTTCCGGCGGAAGCACTTACTATGCCGACTCTGTGAAGGGCCGCTTCACTATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTATCTCCAAATGAATTCCCTGAGGGCCGAAGATACCGCGGTGTACTACTGCGCTAGACGGGAGTGGGTGCCCTACGATGTCAGCTGGTACTTCGACTACTGGGGACAGGGCACTCTCGTGACTGTGTCCTCCGGTGGTGGTGGATCGGGGGGTGGTGGTTCGGGCGGAGGAGGATCTGGAGGAGGAGGGTCGGACATTCAAATGACTCAGTCCCCGTCCTCCCTCTCCGCCTCCGTGGGAGATCGCGTCACGATCACGTGCAGGGCCAGCCAGAGCATCTCCAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAGGCACCGAAGCTCCTGATCTACGCCGCTAGCTCGCTGCAGTCCGGCGTCCCTTCACGGTTCTCGGGATCGGGCTCAGGCACCGACTTCACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAGGACTTCGCGACATACTACTGTCAGCAGTCATACTCCACCCCTCTGACCTTCGGCCAAGGGACCAAAGTGGAGATCAAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACCAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG R1F2 SEQ ID NO: 44 HCDR1 (Kabat) SYAMS SEQ ID NO: 45 HCDR2 (Kabat) AISGSGGSTYYADSVKG SEQ ID NO: 68 HCDR3 (Kabat) REWWYDDWYLDY SEQ ID NO: 47 HCDR1 (Chothia) GFTFSSY SEQ ID NO: 48 HCDR2 (Chothia) SGSGGS SEQ ID NO: 68 HCDR3 (Chothia) REWWYDDWYLDY SEQ ID NO: 49 HCDR1 (IMGT) GFTFSSYA SEQ ID NO: 50 HCDR2 (IMGT) ISGSGGST SEQ ID NO: 69 HCDR3 (IMGT) ARREWWYDDWYLDY SEQ ID NO: 70 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARREWWYDDWYLDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 71 ДНК VH GAAGTGCAGTTGCTGGAGTCAGGCGGAGGACTGGTGCAGCCCGGAGGATCGCTTCGCTTGAGCTGCGCAGCCTCAGGCTTTACCTTCTCCTCCTACGCCATGTCCTGGGTCAGACAGGCTCCCGGGAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCCATTAGCGGTTCCGGCGGAAGCACTTACTATGCCGACTCTGTGAAGGGCCGCTTCACTATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTATCTCCAAATGAATTCCCTGAGGGCCGAAGATACCGCGGTGTACTACTGCGCTAGACGGGAGTGGTGGTACGACGATTGGTACCTGGACTACTGGGGACAGGGCACTCTCGTGACTGTGTCCTCC SEQ ID NO: 54 LCDR1 (Kabat) RASQSISSYLN SEQ ID NO: 55 LCDR2 (Kabat) AASSLQS SEQ ID NO: 56 LCDR3 (Kabat) QQSYSTPLT SEQ ID NO: 57 LCDR1 (Chothia) SQSISSY SEQ ID NO: 58 LCDR2 (Chothia) AAS SEQ ID NO: 59 LCDR3 (Chothia) SYSTPL SEQ ID NO: 60 LCDR1 (IMGT) QSISSY SEQ ID NO: 58 LCDR2 (IMGT) AAS SEQ ID NO: 56 LCDR3 (IMGT) QQSYSTPLT SEQ ID NO: 61 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 62 ДНК VL GACATTCAAATGACTCAGTCCCCGTCCTCCCTCTCCGCCTCCGTGGGAGATCGCGTCACGATCACGTGCAGGGCCAGCCAGAGCATCTCCAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAGGCACCGAAGCTCCTGATCTACGCCGCTAGCTCGCTGCAGTCCGGCGTCCCTTCACGGTTCTCGGGATCGGGCTCAGGCACCGACTTCACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAGGACTTCGCGACATACTACTGTCAGCAGTCATACTCCACCCCTCTGACCTTCGGCCAAGGGACCAAAGTGGAGATCAAG SEQ ID NO: 63 Линкер GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO: 72 scFv (VH-линкер-VL) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARREWWYDDWYLDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 73 ДНК scFv GAAGTGCAGTTGCTGGAGTCAGGCGGAGGACTGGTGCAGCCCGGAGGATCGCTTCGCTTGAGCTGCGCAGCCTCAGGCTTTACCTTCTCCTCCTACGCCATGTCCTGGGTCAGACAGGCTCCCGGGAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCCATTAGCGGTTCCGGCGGAAGCACTTACTATGCCGACTCTGTGAAGGGCCGCTTCACTATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTATCTCCAAATGAATTCCCTGAGGGCCGAAGATACCGCGGTGTACTACTGCGCTAGACGGGAGTGGTGGTACGACGATTGGTACCTGGACTACTGGGGACAGGGCACTCTCGTGACTGTGTCCTCCGGTGGTGGTGGATCGGGGGGTGGTGGTTCGGGCGGAGGAGGATCTGGAGGAGGAGGGTCGGACATTCAAATGACTCAGTCCCCGTCCTCCCTCTCCGCCTCCGTGGGAGATCGCGTCACGATCACGTGCAGGGCCAGCCAGAGCATCTCCAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAGGCACCGAAGCTCCTGATCTACGCCGCTAGCTCGCTGCAGTCCGGCGTCCCTTCACGGTTCTCGGGATCGGGCTCAGGCACCGACTTCACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAGGACTTCGCGACATACTACTGTCAGCAGTCATACTCCACCCCTCTGACCTTCGGCCAAGGGACCAAAGTGGAGATCAAG SEQ ID NO: 74 Полная аминокислотная последовательность CAR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARREWWYDDWYLDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 75 Полная последовательность ДНК CAR GAAGTGCAGTTGCTGGAGTCAGGCGGAGGACTGGTGCAGCCCGGAGGATCGCTTCGCTTGAGCTGCGCAGCCTCAGGCTTTACCTTCTCCTCCTACGCCATGTCCTGGGTCAGACAGGCTCCCGGGAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCCATTAGCGGTTCCGGCGGAAGCACTTACTATGCCGACTCTGTGAAGGGCCGCTTCACTATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTATCTCCAAATGAATTCCCTGAGGGCCGAAGATACCGCGGTGTACTACTGCGCTAGACGGGAGTGGTGGTACGACGATTGGTACCTGGACTACTGGGGACAGGGCACTCTCGTGACTGTGTCCTCCGGTGGTGGTGGATCGGGGGGTGGTGGTTCGGGCGGAGGAGGATCTGGAGGAGGAGGGTCGGACATTCAAATGACTCAGTCCCCGTCCTCCCTCTCCGCCTCCGTGGGAGATCGCGTCACGATCACGTGCAGGGCCAGCCAGAGCATCTCCAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAGGCACCGAAGCTCCTGATCTACGCCGCTAGCTCGCTGCAGTCCGGCGTCCCTTCACGGTTCTCGGGATCGGGCTCAGGCACCGACTTCACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAGGACTTCGCGACATACTACTGTCAGCAGTCATACTCCACCCCTCTGACCTTCGGCCAAGGGACCAAAGTGGAGATCAAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACCAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG R1G5 SEQ ID NO: 44 HCDR1 (Kabat) SYAMS SEQ ID NO: 45 HCDR2 (Kabat) AISGSGGSTYYADSVKG SEQ ID NO: 76 HCDR3 (Kabat) REWWGESWLFDY SEQ ID NO: 47 HCDR1 (Chothia) GFTFSSY SEQ ID NO: 48 HCDR2 (Chothia) SGSGGS SEQ ID NO: 76 HCDR3 (Chothia) REWWGESWLFDY SEQ ID NO: 49 HCDR1 (IMGT) GFTFSSYA SEQ ID NO: 50 HCDR2 (IMGT) ISGSGGST SEQ ID NO: 77 HCDR3 (IMGT) ARREWWGESWLFDY SEQ ID NO: 78 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARREWWGESWLFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 79 ДНК VH GAAGTGCAGTTGCTGGAGTCAGGCGGAGGACTGGTGCAGCCCGGAGGATCGCTTCGCTTGAGCTGCGCAGCCTCAGGCTTTACCTTCTCCTCCTACGCCATGTCCTGGGTCAGACAGGCTCCCGGGAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCCATTAGCGGTTCCGGCGGAAGCACTTACTATGCCGACTCTGTGAAGGGCCGCTTCACTATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTATCTCCAAATGAATTCCCTGAGGGCCGAAGATACCGCGGTGTACTACTGCGCTAGACGGGAGTGGTGGGGAGAAAGCTGGCTGTTCGACTACTGGGGACAGGGCACTCTCGTGACTGTGTCCTCC SEQ ID NO: 54 LCDR1 (Kabat) RASQSISSYLN SEQ ID NO: 55 LCDR2 (Kabat) AASSLQS SEQ ID NO: 56 LCDR3 (Kabat) QQSYSTPLT SEQ ID NO: 57 LCDR1 (Chothia) SQSISSY SEQ ID NO: 58 LCDR2 (Chothia) AAS SEQ ID NO: 59 LCDR3 (Chothia) SYSTPL SEQ ID NO: 60 LCDR1 (IMGT) QSISSY SEQ ID NO: 58 LCDR2 (IMGT) AAS SEQ ID NO: 56 LCDR3 (IMGT) QQSYSTPLT SEQ ID NO: 61 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 62 ДНК VL GACATTCAAATGACTCAGTCCCCGTCCTCCCTCTCCGCCTCCGTGGGAGATCGCGTCACGATCACGTGCAGGGCCAGCCAGAGCATCTCCAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAGGCACCGAAGCTCCTGATCTACGCCGCTAGCTCGCTGCAGTCCGGCGTCCCTTCACGGTTCTCGGGATCGGGCTCAGGCACCGACTTCACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAGGACTTCGCGACATACTACTGTCAGCAGTCATACTCCACCCCTCTGACCTTCGGCCAAGGGACCAAAGTGGAGATCAAG SEQ ID NO: 63 Линкер GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO: 80 scFv (VH-линкер-VL) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARREWWGESWLFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 81 ДНК scFv GAAGTGCAGTTGCTGGAGTCAGGCGGAGGACTGGTGCAGCCCGGAGGATCGCTTCGCTTGAGCTGCGCAGCCTCAGGCTTTACCTTCTCCTCCTACGCCATGTCCTGGGTCAGACAGGCTCCCGGGAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCCATTAGCGGTTCCGGCGGAAGCACTTACTATGCCGACTCTGTGAAGGGCCGCTTCACTATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTATCTCCAAATGAATTCCCTGAGGGCCGAAGATACCGCGGTGTACTACTGCGCTAGACGGGAGTGGTGGGGAGAAAGCTGGCTGTTCGACTACTGGGGACAGGGCACTCTCGTGACTGTGTCCTCCGGTGGTGGTGGATCGGGGGGTGGTGGTTCGGGCGGAGGAGGATCTGGAGGAGGAGGGTCGGACATTCAAATGACTCAGTCCCCGTCCTCCCTCTCCGCCTCCGTGGGAGATCGCGTCACGATCACGTGCAGGGCCAGCCAGAGCATCTCCAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAGGCACCGAAGCTCCTGATCTACGCCGCTAGCTCGCTGCAGTCCGGCGTCCCTTCACGGTTCTCGGGATCGGGCTCAGGCACCGACTTCACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAGGACTTCGCGACATACTACTGTCAGCAGTCATACTCCACCCCTCTGACCTTCGGCCAAGGGACCAAAGTGGAGATCAAG SEQ ID NO: 82 Полная аминокислотная последовательность CAR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARREWWGESWLFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 83 Полная последовательность ДНК CAR GAAGTGCAGTTGCTGGAGTCAGGCGGAGGACTGGTGCAGCCCGGAGGATCGCTTCGCTTGAGCTGCGCAGCCTCAGGCTTTACCTTCTCCTCCTACGCCATGTCCTGGGTCAGACAGGCTCCCGGGAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCCATTAGCGGTTCCGGCGGAAGCACTTACTATGCCGACTCTGTGAAGGGCCGCTTCACTATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTATCTCCAAATGAATTCCCTGAGGGCCGAAGATACCGCGGTGTACTACTGCGCTAGACGGGAGTGGTGGGGAGAAAGCTGGCTGTTCGACTACTGGGGACAGGGCACTCTCGTGACTGTGTCCTCCGGTGGTGGTGGATCGGGGGGTGGTGGTTCGGGCGGAGGAGGATCTGGAGGAGGAGGGTCGGACATTCAAATGACTCAGTCCCCGTCCTCCCTCTCCGCCTCCGTGGGAGATCGCGTCACGATCACGTGCAGGGCCAGCCAGAGCATCTCCAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAGGCACCGAAGCTCCTGATCTACGCCGCTAGCTCGCTGCAGTCCGGCGTCCCTTCACGGTTCTCGGGATCGGGCTCAGGCACCGACTTCACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAGGACTTCGCGACATACTACTGTCAGCAGTCATACTCCACCCCTCTGACCTTCGGCCAAGGGACCAAAGTGGAGATCAAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACCAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG

Таблица 4. CDR по Kabat иллюстративных молекул, полученных из PALLAS, связывающихся с BCMA

Kabat HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3 R1B6 SYAMS (SEQ ID NO: 44) AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 45) REWVPYDVSWYFDY (SEQ ID NO: 46) RASQSISSYLN (SEQ ID NO: 54) AASSLQS (SEQ ID NO: 55) QQSYSTPLT (SEQ ID NO: 56) R1F2 SYAMS (SEQ ID NO: 44) AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 45) REWWYDDWYLDY (SEQ ID NO: 68) RASQSISSYLN (SEQ ID NO: 54) AASSLQS (SEQ ID NO: 55) QQSYSTPLT (SEQ ID NO: 56) R1G5 SYAMS (SEQ ID NO: 44) AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 45) REWWGESWLFDY (SEQ ID NO: 76) RASQSISSYLN (SEQ ID NO: 54) AASSLQS (SEQ ID NO: 55) QQSYSTPLT (SEQ ID NO: 56) Консенсусная последовательность SYAMS (SEQ ID NO: 44) AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 45) REWX₁X₂X₃X₄X₅X₆WX₇X₈DY, где X₁ отсутствует или V; X₂ отсутствует или P; X₃ представляет собой W или Y; X₄ представляет собой G, Y или D; X₅ представляет собой E, D или V; X₆ представляет собой S или D; X₇ представляет собой L или Y; и X₈ представляет собой F или L (SEQ ID NO: 84) RASQSISSYLN (SEQ ID NO: 54) AASSLQS (SEQ ID NO: 55) QQSYSTPLT (SEQ ID NO: 56)

Таблица 5. CDR по Chothia иллюстративных молекул, полученных из PALLAS, связывающихся с BCMA

Chothia HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3 R1B6 GFTFSSY (SEQ ID NO: 47) SGSGGS (SEQ ID NO: 48) REWVPYDVSWYFDY (SEQ ID NO: 46) SQSISSY (SEQ ID NO: 57) AAS (SEQ ID NO: 58) SYSTPL (SEQ ID NO: 59) R1F2 GFTFSSY (SEQ ID NO: 47) SGSGGS (SEQ ID NO: 48) REWWYDDWYLDY (SEQ ID NO: 68) SQSISSY (SEQ ID NO: 57) AAS (SEQ ID NO: 58) SYSTPL (SEQ ID NO: 59) R1G5 GFTFSSY (SEQ ID NO: 47) SGSGGS (SEQ ID NO: 48) REWWGESWLFDY (SEQ ID NO: 76) SQSISSY (SEQ ID NO: 57) AAS (SEQ ID NO: 58) SYSTPL (SEQ ID NO: 59) Консенсусная последовательность GFTFSSY (SEQ ID NO: 47) SGSGGS (SEQ ID NO: 48) REWX₁X₂X₃X₄X₅X₆WX₇X₈DY, где X₁ отсутствует или V; X₂ отсутствует или P; X₃ представляет собой W или Y; X₄ представляет собой G, Y или D; X₅ представляет собой E, D или V; X₆ представляет собой S или D; X₇ представляет собой L или Y; и X₈ представляет собой F или L (SEQ ID NO: 84) SQSISSY (SEQ ID NO: 57) AAS (SEQ ID NO: 58) SYSTPL (SEQ ID NO: 59)

Таблица 6. CDR по IMGT иллюстративных молекул, полученных из PALLAS, связывающихся с BCMA

IMGT HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3 R1B6 GFTFSSYA (SEQ ID NO: 49) ISGSGGST (SEQ ID NO: 50) ARREWVPYDVSWYFDY (SEQ ID NO: 51) QSISSY (SEQ ID NO: 60) AAS (SEQ ID NO: 58) QQSYSTPLT (SEQ ID NO: 56) R1F2 GFTFSSYA (SEQ ID NO: 49) ISGSGGST (SEQ ID NO: 50) ARREWWYDDWYLDY (SEQ ID NO: 69) QSISSY (SEQ ID NO: 60) AAS (SEQ ID NO: 58) QQSYSTPLT (SEQ ID NO: 56) R1G5 GFTFSSYA (SEQ ID NO: 49) ISGSGGST (SEQ ID NO: 50) ARREWWGESWLFDY (SEQ ID NO: 77) QSISSY (SEQ ID NO: 60) AAS (SEQ ID NO: 58) QQSYSTPLT (SEQ ID NO: 56) Консенсусная последовательность GFTFSSYA (SEQ ID NO: 49) ISGSGGST (SEQ ID NO: 50) ARREWX₁X₂X₃X₄X₅X₆WX₇X₈DY, где X₁ отсутствует или V; X₂ отсутствует или P; X₃ представляет собой W или Y; X₄ представляет собой G, Y или D; X₅ представляет собой E, D или V; X₆ представляет собой S или D; X₇ представляет собой L или Y; и X₈ представляет собой F или L (SEQ ID NO: 85) QSISSY (SEQ ID NO: 60) AAS (SEQ ID NO: 58) QQSYSTPLT (SEQ ID NO: 56)

Таблица 7. Аминокислотные последовательности и последовательности нуклеиновых кислот иллюстративных молекул, полученных из В-клеток, связывающихся с BCMA

SEQ ID NO Название/
описание Последовательность PI61 SEQ ID NO: 86 HCDR1 (Kabat) SYGMH SEQ ID NO: 87 HCDR2 (Kabat) VISYDGSNKYYADSVKG SEQ ID NO: 88 HCDR3 (Kabat) SGYALHDDYYGLDV SEQ ID NO: 47 HCDR1 (Chothia) GFTFSSY SEQ ID NO: 89 HCDR2 (Chothia) SYDGSN SEQ ID NO: 88 HCDR3 (Chothia) SGYALHDDYYGLDV SEQ ID NO: 90 HCDR1 (IMGT) GFTFSSYG SEQ ID NO: 91 HCDR2 (IMGT) ISYDGSNK SEQ ID NO: 92 HCDR3 (IMGT) GGSGYALHDDYYGLDV SEQ ID NO: 93 VH QVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 94 ДНК VH CAAGTGCAGCTGCAGGAATCCGGTGGCGGAGTCGTGCAGCCTGGAAGGAGCCTGAGACTCTCATGCGCCGCGTCAGGGTTCACCTTTTCCTCCTACGGGATGCATTGGGTCAGACAGGCCCCCGGAAAGGGACTCGAATGGGTGGCTGTGATCAGCTACGACGGCTCCAACAAGTACTACGCCGACTCCGTGAAAGGCCGGTTCACTATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAATTCACTGCGCGCGGAGGATACCGCTGTGTACTACTGCGGTGGCTCCGGTTACGCCCTGCACGATGACTATTACGGCCTTGACGTCTGGGGCCAGGGAACCCTCGTGACTGTGTCCAGC SEQ ID NO: 95 LCDR1 (Kabat) TGTSSDVGGYNYVS SEQ ID NO: 96 LCDR2 (Kabat) DVSNRPS SEQ ID NO: 97 LCDR3 (Kabat) SSYTSSSTLYV SEQ ID NO: 98 LCDR1 (Chothia) TSSDVGGYNY SEQ ID NO: 99 LCDR2 (Chothia) DVS SEQ ID NO: 100 LCDR3 (Chothia) YTSSSTLY SEQ ID NO: 101 LCDR1 (IMGT) SSDVGGYNY SEQ ID NO: 99 LCDR2 (IMGT) DVS SEQ ID NO: 97 LCDR3 (IMGT) SSYTSSSTLYV SEQ ID NO: 102 VL QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGSGTKVTVL SEQ ID NO: 103 ДНК VL CAGAGCGCACTGACTCAGCCGGCATCCGTGTCCGGTAGCCCCGGACAGTCGATTACCATCTCCTGTACCGGCACCTCCTCCGACGTGGGAGGGTACAACTACGTGTCGTGGTACCAGCAGCACCCAGGAAAGGCCCCTAAGTTGATGATCTACGATGTGTCAAACCGCCCGTCTGGAGTCTCCAACCGGTTCTCCGGCTCCAAGTCCGGCAACACCGCCAGCCTGACCATTAGCGGGCTGCAAGCCGAGGATGAGGCCGACTACTACTGCTCGAGCTACACATCCTCGAGCACCCTCTACGTGTTCGGCTCGGGGACTAAGGTCACCGTGCTG SEQ ID NO: 104 Линкер GGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO: 105 scFv (VH-линкер-VL) QVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGSGTKVTVL SEQ ID NO: 106 ДНК scFv CAAGTGCAGCTGCAGGAATCCGGTGGCGGAGTCGTGCAGCCTGGAAGGAGCCTGAGACTCTCATGCGCCGCGTCAGGGTTCACCTTTTCCTCCTACGGGATGCATTGGGTCAGACAGGCCCCCGGAAAGGGACTCGAATGGGTGGCTGTGATCAGCTACGACGGCTCCAACAAGTACTACGCCGACTCCGTGAAAGGCCGGTTCACTATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAATTCACTGCGCGCGGAGGATACCGCTGTGTACTACTGCGGTGGCTCCGGTTACGCCCTGCACGATGACTATTACGGCCTTGACGTCTGGGGCCAGGGAACCCTCGTGACTGTGTCCAGCGGTGGAGGAGGTTCGGGCGGAGGAGGATCAGGAGGGGGTGGATCGCAGAGCGCACTGACTCAGCCGGCATCCGTGTCCGGTAGCCCCGGACAGTCGATTACCATCTCCTGTACCGGCACCTCCTCCGACGTGGGAGGGTACAACTACGTGTCGTGGTACCAGCAGCACCCAGGAAAGGCCCCTAAGTTGATGATCTACGATGTGTCAAACCGCCCGTCTGGAGTCTCCAACCGGTTCTCCGGCTCCAAGTCCGGCAACACCGCCAGCCTGACCATTAGCGGGCTGCAAGCCGAGGATGAGGCCGACTACTACTGCTCGAGCTACACATCCTCGAGCACCCTCTACGTGTTCGGCTCGGGGACTAAGGTCACCGTGCTG SEQ ID NO: 107 Полная аминокислотная последовательность CAR QVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGSGTKVTVLTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 108 Полная последовательность ДНК CAR CAAGTGCAGCTGCAGGAATCCGGTGGCGGAGTCGTGCAGCCTGGAAGGAGCCTGAGACTCTCATGCGCCGCGTCAGGGTTCACCTTTTCCTCCTACGGGATGCATTGGGTCAGACAGGCCCCCGGAAAGGGACTCGAATGGGTGGCTGTGATCAGCTACGACGGCTCCAACAAGTACTACGCCGACTCCGTGAAAGGCCGGTTCACTATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAATTCACTGCGCGCGGAGGATACCGCTGTGTACTACTGCGGTGGCTCCGGTTACGCCCTGCACGATGACTATTACGGCCTTGACGTCTGGGGCCAGGGAACCCTCGTGACTGTGTCCAGCGGTGGAGGAGGTTCGGGCGGAGGAGGATCAGGAGGGGGTGGATCGCAGAGCGCACTGACTCAGCCGGCATCCGTGTCCGGTAGCCCCGGACAGTCGATTACCATCTCCTGTACCGGCACCTCCTCCGACGTGGGAGGGTACAACTACGTGTCGTGGTACCAGCAGCACCCAGGAAAGGCCCCTAAGTTGATGATCTACGATGTGTCAAACCGCCCGTCTGGAGTCTCCAACCGGTTCTCCGGCTCCAAGTCCGGCAACACCGCCAGCCTGACCATTAGCGGGCTGCAAGCCGAGGATGAGGCCGACTACTACTGCTCGAGCTACACATCCTCGAGCACCCTCTACGTGTTCGGCTCGGGGACTAAGGTCACCGTGCTGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACCAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACcaaggacacctatgacgctcttcacatgcaggccctgccgcctcgg B61-02 SEQ ID NO: 86 HCDR1 (Kabat) SYGMH SEQ ID NO: 109 HCDR2 (Kabat) VISYKGSNKYYADSVKG SEQ ID NO: 88 HCDR3 (Kabat) SGYALHDDYYGLDV SEQ ID NO: 47 HCDR1 (Chothia) GFTFSSY SEQ ID NO: 110 HCDR2 (Chothia) SYKGSN SEQ ID NO: 88 HCDR3 (Chothia) SGYALHDDYYGLDV SEQ ID NO: 90 HCDR1 (IMGT) GFTFSSYG SEQ ID NO: 111 HCDR2 (IMGT) ISYKGSNK SEQ ID NO: 92 HCDR3 (IMGT) GGSGYALHDDYYGLDV SEQ ID NO: 112 VH QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYKGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 113 ДНК VH CAAGTGCAGCTTGTCGAATCGGGAGGCGGAGTGGTGCAGCCTGGACGATCGCTCCGGCTCTCATGTGCCGCGAGCGGATTCACCTTCTCGAGCTACGGCATGCACTGGGTCAGACAAGCCCCAGGAAAGGGCCTGGAATGGGTGGCTGTCATCTCGTACAAGGGCTCAAACAAGTACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGATAACTCCAAGAATACCCTCTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGATACTGCAGTGTACTACTGCGGGGGTTCAGGCTACGCGCTGCACGACGACTACTACGGATTGGACGTCTGGGGCCAAGGAACTCTTGTGACCGTGTCCTCT SEQ ID NO: 95 LCDR1 (Kabat) TGTSSDVGGYNYVS SEQ ID NO: 114 LCDR2 (Kabat) EVSNRLR SEQ ID NO: 115 LCDR3 (Kabat) SSYTSSSALYV SEQ ID NO: 98 LCDR1 (Chothia) TSSDVGGYNY SEQ ID NO: 116 LCDR2 (Chothia) EVS SEQ ID NO: 117 LCDR3 (Chothia) YTSSSALY SEQ ID NO: 101 LCDR1 (IMGT) SSDVGGYNY SEQ ID NO: 116 LCDR2 (IMGT) EVS SEQ ID NO: 115 LCDR3 (IMGT) SSYTSSSALYV SEQ ID NO: 118 VL QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYEVSNRLRGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSALYVFGSGTKVTVL SEQ ID NO: 119 ДНК VL CAGAGCGCGCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGAGCGGTTCGCCGGGACAGTCCATTACCATTTCGTGCACCGGGACCTCCTCCGACGTGGGAGGCTACAACTACGTGTCCTGGTACCAGCAGCATCCCGGAAAGGCCCCGAAGCTGATGATCTACGAAGTGTCGAACAGACTGCGGGGAGTCTCCAACCGCTTTTCCGGGTCCAAGTCCGGCAACACCGCCAGCCTGACCATCAGCGGGCTCCAGGCAGAAGATGAGGCTGACTATTACTGCTCCTCCTACACGTCAAGCTCCGCCCTCTACGTGTTCGGGTCCGGGACCAAAGTCACTGTGCTG SEQ ID NO: 63 Линкер GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO: 120 scFv (VH-линкер-VL) QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYKGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYEVSNRLRGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSALYVFGSGTKVTVL SEQ ID NO: 121 ДНК scFv CAAGTGCAGCTTGTCGAATCGGGAGGCGGAGTGGTGCAGCCTGGACGATCGCTCCGGCTCTCATGTGCCGCGAGCGGATTCACCTTCTCGAGCTACGGCATGCACTGGGTCAGACAAGCCCCAGGAAAGGGCCTGGAATGGGTGGCTGTCATCTCGTACAAGGGCTCAAACAAGTACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGATAACTCCAAGAATACCCTCTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGATACTGCAGTGTACTACTGCGGGGGTTCAGGCTACGCGCTGCACGACGACTACTACGGATTGGACGTCTGGGGCCAAGGAACTCTTGTGACCGTGTCCTCTGGTGGAGGCGGATCAGGGGGTGGCGGATCTGGGGGTGGTGGTTCCGGGGGAGGAGGATCGCAGAGCGCGCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGAGCGGTTCGCCGGGACAGTCCATTACCATTTCGTGCACCGGGACCTCCTCCGACGTGGGAGGCTACAACTACGTGTCCTGGTACCAGCAGCATCCCGGAAAGGCCCCGAAGCTGATGATCTACGAAGTGTCGAACAGACTGCGGGGAGTCTCCAACCGCTTTTCCGGGTCCAAGTCCGGCAACACCGCCAGCCTGACCATCAGCGGGCTCCAGGCAGAAGATGAGGCTGACTATTACTGCTCCTCCTACACGTCAAGCTCCGCCCTCTACGTGTTCGGGTCCGGGACCAAAGTCACTGTGCTG SEQ ID NO: 122 Полная аминокислотная последовательность CAR QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYKGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYEVSNRLRGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSALYVFGSGTKVTVLTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 123 Полная последовательность ДНК CAR CAAGTGCAGCTTGTCGAATCGGGAGGCGGAGTGGTGCAGCCTGGACGATCGCTCCGGCTCTCATGTGCCGCGAGCGGATTCACCTTCTCGAGCTACGGCATGCACTGGGTCAGACAAGCCCCAGGAAAGGGCCTGGAATGGGTGGCTGTCATCTCGTACAAGGGCTCAAACAAGTACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGATAACTCCAAGAATACCCTCTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGATACTGCAGTGTACTACTGCGGGGGTTCAGGCTACGCGCTGCACGACGACTACTACGGATTGGACGTCTGGGGCCAAGGAACTCTTGTGACCGTGTCCTCTGGTGGAGGCGGATCAGGGGGTGGCGGATCTGGGGGTGGTGGTTCCGGGGGAGGAGGATCGCAGAGCGCGCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGAGCGGTTCGCCGGGACAGTCCATTACCATTTCGTGCACCGGGACCTCCTCCGACGTGGGAGGCTACAACTACGTGTCCTGGTACCAGCAGCATCCCGGAAAGGCCCCGAAGCTGATGATCTACGAAGTGTCGAACAGACTGCGGGGAGTCTCCAACCGCTTTTCCGGGTCCAAGTCCGGCAACACCGCCAGCCTGACCATCAGCGGGCTCCAGGCAGAAGATGAGGCTGACTATTACTGCTCCTCCTACACGTCAAGCTCCGCCCTCTACGTGTTCGGGTCCGGGACCAAAGTCACTGTGCTGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACCAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG B61-10 SEQ ID NO: 86 HCDR1 (Kabat) SYGMH SEQ ID NO: 109 HCDR2 (Kabat) VISYKGSNKYYADSVKG SEQ ID NO: 88 HCDR3 (Kabat) SGYALHDDYYGLDV SEQ ID NO: 47 HCDR1 (Chothia) GFTFSSY SEQ ID NO: 110 HCDR2 (Chothia) SYKGSN SEQ ID NO: 88 HCDR3 (Chothia) SGYALHDDYYGLDV SEQ ID NO: 90 HCDR1 (IMGT) GFTFSSYG SEQ ID NO: 111 HCDR2 (IMGT) ISYKGSNK SEQ ID NO: 92 HCDR3 (IMGT) GGSGYALHDDYYGLDV SEQ ID NO: 112 VH QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYKGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 113 ДНК VH CAAGTGCAGCTTGTCGAATCGGGAGGCGGAGTGGTGCAGCCTGGACGATCGCTCCGGCTCTCATGTGCCGCGAGCGGATTCACCTTCTCGAGCTACGGCATGCACTGGGTCAGACAAGCCCCAGGAAAGGGCCTGGAATGGGTGGCTGTCATCTCGTACAAGGGCTCAAACAAGTACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGATAACTCCAAGAATACCCTCTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGATACTGCAGTGTACTACTGCGGGGGTTCAGGCTACGCGCTGCACGACGACTACTACGGATTGGACGTCTGGGGCCAAGGAACTCTTGTGACCGTGTCCTCT SEQ ID NO: 95 LCDR1 (Kabat) TGTSSDVGGYNYVS SEQ ID NO: 114 LCDR2 (Kabat) EVSNRLR SEQ ID NO: 97 LCDR3 (Kabat) SSYTSSSTLYV SEQ ID NO: 98 LCDR1 (Chothia) TSSDVGGYNY SEQ ID NO: 116 LCDR2 (Chothia) EVS SEQ ID NO: 100 LCDR3 (Chothia) YTSSSTLY SEQ ID NO: 101 LCDR1 (IMGT) SSDVGGYNY SEQ ID NO: 116 LCDR2 (IMGT) EVS SEQ ID NO: 97 LCDR3 (IMGT) SSYTSSSTLYV SEQ ID NO: 124 VL QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYEVSNRLRGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGSGTKVTVL SEQ ID NO: 125 ДНК VL CAGAGCGCGCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGAGCGGTTCGCCGGGACAGTCCATTACCATTTCGTGCACCGGGACCTCCTCCGACGTGGGAGGCTACAACTACGTGTCCTGGTACCAGCAGCATCCCGGAAAGGCCCCGAAGCTGATGATCTACGAAGTGTCGAACAGACTGCGGGGAGTCTCCAACCGCTTTTCCGGGTCCAAGTCCGGCAACACCGCCAGCCTGACCATCAGCGGGCTCCAGGCAGAAGATGAGGCTGACTATTACTGCTCCTCCTACACGTCAAGCTCCACCCTCTACGTGTTCGGGTCCGGGACCAAAGTCACTGTGCTG SEQ ID NO: 63 Линкер GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO: 126 scFv (VH-линкер-VL) QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYKGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYEVSNRLRGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGSGTKVTVL SEQ ID NO: 127 ДНК scFv CAAGTGCAGCTTGTCGAATCGGGAGGCGGAGTGGTGCAGCCTGGACGATCGCTCCGGCTCTCATGTGCCGCGAGCGGATTCACCTTCTCGAGCTACGGCATGCACTGGGTCAGACAAGCCCCAGGAAAGGGCCTGGAATGGGTGGCTGTCATCTCGTACAAGGGCTCAAACAAGTACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGATAACTCCAAGAATACCCTCTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGATACTGCAGTGTACTACTGCGGGGGTTCAGGCTACGCGCTGCACGACGACTACTACGGATTGGACGTCTGGGGCCAAGGAACTCTTGTGACCGTGTCCTCTGGTGGAGGCGGATCAGGGGGTGGCGGATCTGGGGGTGGTGGTTCCGGGGGAGGAGGATCGCAGAGCGCGCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGAGCGGTTCGCCGGGACAGTCCATTACCATTTCGTGCACCGGGACCTCCTCCGACGTGGGAGGCTACAACTACGTGTCCTGGTACCAGCAGCATCCCGGAAAGGCCCCGAAGCTGATGATCTACGAAGTGTCGAACAGACTGCGGGGAGTCTCCAACCGCTTTTCCGGGTCCAAGTCCGGCAACACCGCCAGCCTGACCATCAGCGGGCTCCAGGCAGAAGATGAGGCTGACTATTACTGCTCCTCCTACACGTCAAGCTCCACCCTCTACGTGTTCGGGTCCGGGACCAAAGTCACTGTGCTG SEQ ID NO: 128 Полная аминокислотная последовательность CAR QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYKGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYEVSNRLRGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGSGTKVTVLTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 129 Полная последовательность ДНК CAR CAAGTGCAGCTTGTCGAATCGGGAGGCGGAGTGGTGCAGCCTGGACGATCGCTCCGGCTCTCATGTGCCGCGAGCGGATTCACCTTCTCGAGCTACGGCATGCACTGGGTCAGACAAGCCCCAGGAAAGGGCCTGGAATGGGTGGCTGTCATCTCGTACAAGGGCTCAAACAAGTACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGATAACTCCAAGAATACCCTCTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGATACTGCAGTGTACTACTGCGGGGGTTCAGGCTACGCGCTGCACGACGACTACTACGGATTGGACGTCTGGGGCCAAGGAACTCTTGTGACCGTGTCCTCTGGTGGAGGCGGATCAGGGGGTGGCGGATCTGGGGGTGGTGGTTCCGGGGGAGGAGGATCGCAGAGCGCGCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGAGCGGTTCGCCGGGACAGTCCATTACCATTTCGTGCACCGGGACCTCCTCCGACGTGGGAGGCTACAACTACGTGTCCTGGTACCAGCAGCATCCCGGAAAGGCCCCGAAGCTGATGATCTACGAAGTGTCGAACAGACTGCGGGGAGTCTCCAACCGCTTTTCCGGGTCCAAGTCCGGCAACACCGCCAGCCTGACCATCAGCGGGCTCCAGGCAGAAGATGAGGCTGACTATTACTGCTCCTCCTACACGTCAAGCTCCACCCTCTACGTGTTCGGGTCCGGGACCAAAGTCACTGTGCTGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACCAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG

Таблица 8. CDR по Kabat иллюстративных молекул, полученных из B-клеток, связывающихся с BCMA

Kabat HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3 PI61 SYGMH (SEQ ID NO: 86) VISYDGSNKYYADSVKG (SEQ ID NO: 87) SGYALHDDYYGLDV (SEQ ID NO: 88) TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO: 95) DVSNRPS (SEQ ID NO: 96) SSYTSSSTLYV (SEQ ID NO: 97) B61-02 SYGMH (SEQ ID NO: 86) VISYKGSNKYYADSVKG (SEQ ID NO: 109) SGYALHDDYYGLDV (SEQ ID NO: 88) TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO: 95) EVSNRLR (SEQ ID NO: 114) SSYTSSSALYV (SEQ ID NO: 115) B61-10 SYGMH (SEQ ID NO: 86) VISYKGSNKYYADSVKG (SEQ ID NO: 109) SGYALHDDYYGLDV (SEQ ID NO: 88) TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO: 95) EVSNRLR (SEQ ID NO: 114) SSYTSSSTLYV (SEQ ID NO: 97) Консенсусная последовательность SYGMH (SEQ ID NO: 86) VISYXGSNKYYADSVKG, где X представляет собой D или K (SEQ ID NO: 130) SGYALHDDYYGLDV (SEQ ID NO: 88) TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO: 95) X₁VSNRX₂X₃, где X₁ представляет собой D или E; X₂ представляет собой P или L; и X₃ представляет собой S или R (SEQ ID NO: 131) SSYTSSSXLYV, где X представляет собой T или A (SEQ ID NO: 132)

Таблица 9. CDR по Chothia иллюстративных молекул, полученных из B-клеток, связывающихся с BCMA

Chothia HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3 PI61 GFTFSSY (SEQ ID NO: 47) SYDGSN (SEQ ID NO: 89) SGYALHDDYYGLDV (SEQ ID NO: 88) TSSDVGGYNY (SEQ ID NO: 98) DVS (SEQ ID NO: 99) YTSSSTLY (SEQ ID NO: 100) B61-02 GFTFSSY (SEQ ID NO: 47) SYKGSN (SEQ ID NO: 110) SGYALHDDYYGLDV (SEQ ID NO: 88) TSSDVGGYNY (SEQ ID NO: 98) EVS (SEQ ID NO: 116) YTSSSALY (SEQ ID NO: 117) B61-10 GFTFSSY (SEQ ID NO: 47) SYKGSN (SEQ ID NO: 110) SGYALHDDYYGLDV (SEQ ID NO: 88) TSSDVGGYNY (SEQ ID NO: 98) EVS (SEQ ID NO: 116) YTSSSTLY (SEQ ID NO: 100) Консенсусная последовательность GFTFSSY (SEQ ID NO: 47) SYXGSN, где X представляет собой D или K (SEQ ID NO: 133) SGYALHDDYYGLDV (SEQ ID NO: 88) TSSDVGGYNY (SEQ ID NO: 98) XVS, где X представляет собой D или E (SEQ ID NO: 134) YTSSSXLY, где X представляет собой T или A (SEQ ID NO: 135)

Таблица 10. CDR по IMGT иллюстративных молекул, полученных из B-клеток, связывающихся с BCMA

IMGT HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3 PI61 GFTFSSYG (SEQ ID NO: 90) ISYDGSNK (SEQ ID NO: 91) GGSGYALHDDYYGLDV (SEQ ID NO: 92) SSDVGGYNY (SEQ ID NO: 101) DVS (SEQ ID NO: 99) SSYTSSSTLYV (SEQ ID NO: 97) B61-02 GFTFSSYG (SEQ ID NO: 90) ISYKGSNK (SEQ ID NO: 111) GGSGYALHDDYYGLDV (SEQ ID NO: 92) SSDVGGYNY (SEQ ID NO: 101) EVS (SEQ ID NO: 116) SSYTSSSALYV (SEQ ID NO: 115) B61-10 GFTFSSYG (SEQ ID NO: 90) ISYKGSNK (SEQ ID NO: 111) GGSGYALHDDYYGLDV (SEQ ID NO: 92) SSDVGGYNY (SEQ ID NO: 101) EVS (SEQ ID NO: 116) SSYTSSSTLYV (SEQ ID NO: 97) Консенсусная последовательность GFTFSSYG (SEQ ID NO: 90) ISYXGSNK, где X представляет собой D или K (SEQ ID NO: 136) GGSGYALHDDYYGLDV (SEQ ID NO: 92) SSDVGGYNY (SEQ ID NO: 101) XVS, где X представляет собой D или E (SEQ ID NO: 134) SSYTSSSXLYV, где X представляет собой T или A (SEQ ID NO: 132)

Таблица 11. Аминокислотные последовательности и последовательности нуклеиновых кислот иллюстративных молекул, связывающихся с BCMA, на основе PI61

Идентификация Последовательность белка Последовательность ДНК (5'-3') Сигнальный пептид MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO: 1) Atggccctccctgtcaccgctctgttgctgccgcttgctctgctgctccacgcagcgcgaccg (SEQ ID NO: 252) ScFv PI61 QVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGSGTKVTVL (SEQ ID NO: 105) CaggtacaattgcaggagtctggaggcggtgtgGtgcaacccggtcgcagcttgcgcctgagttgtGctgcgtctggatttacattttcatcttacggaAtgcattgggtacgccaggcaccggggaaaggcCttgaatgggtggctgtaatttcatacgatggtTccaacaaatactatgctgactcagtcaagggtCgatttacaattagtcgggacaactccaagaacAccctttatcttcaaatgaattcccttagagcaGaggatacggcggtctattactgtggtggcagtGgttatgcacttcatgatgattactatggcttgGatgtctgggggcaagggacgcttgtaactgtaTcctctggtggtggtggtagtggtgggggaggcTccggcggtggcggctctcaatctgctctgactCaaccagcaagcgtatcagggtcaccgggacagAgtattaccataagttgcacggggacctctagcGatgtaggggggtataattatgtatcttggtatCaacaacaccccgggaaagcccctaaattgatgAtctacgacgtgagcaatcgacctagtggcgtaTcaaatcgcttctctggtagcaagagtgggaatAcggcgtcccttactattagcggattgcaagcaGaagatgaggccgattactactgcagctcctatActagctcttctacattgtacgtctttgggagcggaacaaaagtaacagtactc (SEQ ID NO: 253) Трансмембранный домен и шарнирная область TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC (SEQ ID NO: 202) AcaacaacacctgccccgagaccgcctacaccaGccccgactattgccagccagcctctgagcctcAggcctgaggcctgtaggcccgcagcgggcggcGcagttcatacacggggcttggatttcgcttgtGatatttatatttgggctcctttggcggggacaTgtggcgtgctgcttctgtcacttgttattacactgtactgt (SEQ ID NO: 254) 4-1BB KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (SEQ ID NO: 7) AaacgcgggcgaaaaaaattgctgtatatttttAagcagccatttatgaggcccgttcagacgacgCaggaggaggacggttgctcttgcaggttcccagaagaggaagaagggggctgtgaattg (SEQ ID NO: 255) CD3-дзета RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 10) CgggttaaattttcaagatccgcagacgctccaGcataccaacagggacaaaaccaactctataacGagctgaatcttggaagaagggaggaatatgatGtgctggataaacggcgcggtagagatccggagAtgggcggaaaaccaaggcgaaaaaaccctcagGagggactctacaacgaactgcagaaagacaaaAtggcggaggcttattccgaaataggcatgaagGgcgagcggaggcgagggaaagggcacgacggaCtgtatcaaggcctctcaaccgcgactaaggatAcgtacgacgccctgcacatgcaggccctgcctccgaga (SEQ ID NO: 256) Полная конструкция CAR PI61 MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGSGTKVTVLTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 257) ATGGCCCTCCCTGTCACCGCTCTGTTGCTGCCGCTTGCTCTGCTGCTCCACGCAGCGCGACCGCAGGTACAATTGCAGGAGTCTGGAGGCGGTGTGGTGCAACCCGGTCGCAGCTTGCGCCTGAGTTGTGCTGCGTCTGGATTTACATTTTCATCTTACGGAATGCATTGGGTACGCCAGGCACCGGGGAAAGGCCTTGAATGGGTGGCTGTAATTTCATACGATGGTTCCAACAAATACTATGCTGACTCAGTCAAGGGTCGATTTACAATTAGTCGGGACAACTCCAAGAACACCCTTTATCTTCAAATGAATTCCCTTAGAGCAGAGGATACGGCGGTCTATTACTGTGGTGGCAGTGGTTATGCACTTCATGATGATTACTATGGCTTGGATGTCTGGGGGCAAGGGACGCTTGTAACTGTATCCTCTGGTGGTGGTGGTAGTGGTGGGGGAGGCTCCGGCGGTGGCGGCTCTCAATCTGCTCTGACTCAACCAGCAAGCGTATCAGGGTCACCGGGACAGAGTATTACCATAAGTTGCACGGGGACCTCTAGCGATGTAGGGGGGTATAATTATGTATCTTGGTATCAACAACACCCCGGGAAAGCCCCTAAATTGATGATCTACGACGTGAGCAATCGACCTAGTGGCGTATCAAATCGCTTCTCTGGTAGCAAGAGTGGGAATACGGCGTCCCTTACTATTAGCGGATTGCAAGCAGAAGATGAGGCCGATTACTACTGCAGCTCCTATACTAGCTCTTCTACATTGTACGTCTTTGGGAGCGGAACAAAAGTAACAGTACTCACAACAACACCTGCCCCGAGACCGCCTACACCAGCCCCGACTATTGCCAGCCAGCCTCTGAGCCTCAGGCCTGAGGCCTGTAGGCCCGCAGCGGGCGGCGCAGTTCATACACGGGGCTTGGATTTCGCTTGTGATATTTATATTTGGGCTCCTTTGGCGGGGACATGTGGCGTGCTGCTTCTGTCACTTGTTATTACACTGTACTGTAAACGCGGGCGAAAAAAATTGCTGTATATTTTTAAGCAGCCATTTATGAGGCCCGTTCAGACGACGCAGGAGGAGGACGGTTGCTCTTGCAGGTTCCCAGAAGAGGAAGAAGGGGGCTGTGAATTGCGGGTTAAATTTTCAAGATCCGCAGACGCTCCAGCATACCAACAGGGACAAAACCAACTCTATAACGAGCTGAATCTTGGAAGAAGGGAGGAATATGATGTGCTGGATAAACGGCGCGGTAGAGATCCGGAGATGGGCGGAAAACCAAGGCGAAAAAACCCTCAGGAGGGACTCTACAACGAACTGCAGAAAGACAAAATGGCGGAGGCTTATTCCGAAATAGGCATGAAGGGCGAGCGGAGGCGAGGGAAAGGGCACGACGGACTGTATCAAGGCCTCTCAACCGCGACTAAGGATACGTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCGAGA (SEQ ID NO: 258) Зрелый белок CAR PI61 QVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGSGTKVTVLTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 107)

Таблица 12. Аминокислотные последовательности и последовательности нуклеиновых кислот иллюстративных молекул, полученных из гибридомы, связывающихся с BCMA

SEQ ID NO Название/
описание Последовательность Hy03 SEQ ID NO: 137 HCDR1 (Kabat) GFWMS SEQ ID NO: 138 HCDR2 (Kabat) NIKQDGSEKYYVDSVRG SEQ ID NO: 139 HCDR3 (Kabat) ALDYYGMDV SEQ ID NO: 140 HCDR1 (Chothia) GFTFSGF SEQ ID NO: 141 HCDR2 (Chothia) KQDGSE SEQ ID NO: 139 HCDR3 (Chothia) ALDYYGMDV SEQ ID NO: 142 HCDR1 (IMGT) GFTFSGFW SEQ ID NO: 143 HCDR2 (IMGT) IKQDGSEK SEQ ID NO: 144 HCDR3 (IMGT) ARALDYYGMDV SEQ ID NO: 145 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGFWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARALDYYGMDVWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 146 ДНК VH GAAGTGCAACTGGTGGAGAGCGGTGGAGGGCTTGTCCAGCCCGGAGGATCGCTGCGGCTGTCCTGTGCTGCGTCCGGGTTCACCTTCTCCGGCTTCTGGATGTCCTGGGTCAGACAGGCACCGGGAAAGGGCCTCGAATGGGTGGCCAACATCAAGCAGGATGGCTCCGAGAAGTACTACGTCGACTCCGTGAGAGGCCGCTTCACCATCTCCCGGGACAACGCCAAGAACTCGCTGTACCTCCAAATGAATAGCCTCAGGGCGGAAGATACTGCTGTGTATTACTGCGCACGCGCCCTTGACTACTACGGCATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACTGTGACCGTGTCTAGC SEQ ID NO: 147 LCDR1 (Kabat) RSSQSLLDSDDGNTYLD SEQ ID NO: 148 LCDR2 (Kabat) TLSYRAS SEQ ID NO: 149 LCDR3 (Kabat) TQRLEFPSIT SEQ ID NO: 150 LCDR1 (Chothia) SQSLLDSDDGNTY SEQ ID NO: 151 LCDR2 (Chothia) TLS SEQ ID NO: 152 LCDR3 (Chothia) RLEFPSI SEQ ID NO: 153 LCDR1 (IMGT) QSLLDSDDGNTY SEQ ID NO: 151 LCDR2 (IMGT) TLS SEQ ID NO: 149 LCDR3 (IMGT) TQRLEFPSIT SEQ ID NO: 154 VL DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSDDGNTYLDWYLQKPGQSPRLLIYTLSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGLYYCTQRLEFPSITFGQGTRLEIK SEQ ID NO: 155 ДНК VL GATATCGTGATGACCCAGACTCCCCTGTCCCTGCCTGTGACTCCCGGAGAACCAGCCTCCATTTCCTGCCGGTCCTCCCAGTCCCTGCTGGACAGCGACGACGGCAACACTTACCTGGACTGGTACTTGCAGAAGCCGGGCCAATCGCCTCGCCTGCTGATCTATACCCTGTCATACCGGGCCTCAGGAGTGCCTGACCGCTTCTCGGGATCAGGGAGCGGGACCGATTTCACCCTGAAAATTTCCCGAGTGGAAGCCGAGGACGTCGGACTGTACTACTGCACCCAGCGCCTCGAATTCCCGTCGATTACGTTTGGACAGGGTACCCGGCTTGAGATCAAG SEQ ID NO: 63 Линкер GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO: 156 scFv (VH-линкер-VL) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGFWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARALDYYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSDDGNTYLDWYLQKPGQSPRLLIYTLSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGLYYCTQRLEFPSITFGQGTRLEIK SEQ ID NO: 157 ДНК scFv GAAGTGCAACTGGTGGAGAGCGGTGGAGGGCTTGTCCAGCCCGGAGGATCGCTGCGGCTGTCCTGTGCTGCGTCCGGGTTCACCTTCTCCGGCTTCTGGATGTCCTGGGTCAGACAGGCACCGGGAAAGGGCCTCGAATGGGTGGCCAACATCAAGCAGGATGGCTCCGAGAAGTACTACGTCGACTCCGTGAGAGGCCGCTTCACCATCTCCCGGGACAACGCCAAGAACTCGCTGTACCTCCAAATGAATAGCCTCAGGGCGGAAGATACTGCTGTGTATTACTGCGCACGCGCCCTTGACTACTACGGCATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACTGTGACCGTGTCTAGCGGAGGCGGAGGTTCAGGGGGCGGTGGATCAGGCGGAGGAGGATCGGGGGGTGGTGGATCGGATATCGTGATGACCCAGACTCCCCTGTCCCTGCCTGTGACTCCCGGAGAACCAGCCTCCATTTCCTGCCGGTCCTCCCAGTCCCTGCTGGACAGCGACGACGGCAACACTTACCTGGACTGGTACTTGCAGAAGCCGGGCCAATCGCCTCGCCTGCTGATCTATACCCTGTCATACCGGGCCTCAGGAGTGCCTGACCGCTTCTCGGGATCAGGGAGCGGGACCGATTTCACCCTGAAAATTTCCCGAGTGGAAGCCGAGGACGTCGGACTGTACTACTGCACCCAGCGCCTCGAATTCCCGTCGATTACGTTTGGACAGGGTACCCGGCTTGAGATCAAG SEQ ID NO: 158 Полная аминокислотная последовательность CAR EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGFWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARALDYYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSDDGNTYLDWYLQKPGQSPRLLIYTLSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGLYYCTQRLEFPSITFGQGTRLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 159 Полная последовательность ДНК CAR GAAGTGCAACTGGTGGAGAGCGGTGGAGGGCTTGTCCAGCCCGGAGGATCGCTGCGGCTGTCCTGTGCTGCGTCCGGGTTCACCTTCTCCGGCTTCTGGATGTCCTGGGTCAGACAGGCACCGGGAAAGGGCCTCGAATGGGTGGCCAACATCAAGCAGGATGGCTCCGAGAAGTACTACGTCGACTCCGTGAGAGGCCGCTTCACCATCTCCCGGGACAACGCCAAGAACTCGCTGTACCTCCAAATGAATAGCCTCAGGGCGGAAGATACTGCTGTGTATTACTGCGCACGCGCCCTTGACTACTACGGCATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACTGTGACCGTGTCTAGCGGAGGCGGAGGTTCAGGGGGCGGTGGATCAGGCGGAGGAGGATCGGGGGGTGGTGGATCGGATATCGTGATGACCCAGACTCCCCTGTCCCTGCCTGTGACTCCCGGAGAACCAGCCTCCATTTCCTGCCGGTCCTCCCAGTCCCTGCTGGACAGCGACGACGGCAACACTTACCTGGACTGGTACTTGCAGAAGCCGGGCCAATCGCCTCGCCTGCTGATCTATACCCTGTCATACCGGGCCTCAGGAGTGCCTGACCGCTTCTCGGGATCAGGGAGCGGGACCGATTTCACCCTGAAAATTTCCCGAGTGGAAGCCGAGGACGTCGGACTGTACTACTGCACCCAGCGCCTCGAATTCCCGTCGATTACGTTTGGACAGGGTACCCGGCTTGAGATCAAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACCAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG Hy52 SEQ ID NO: 160 HCDR1 (Kabat) SFRMN SEQ ID NO: 161 HCDR2 (Kabat) SISSSSSYIYYADSVKG SEQ ID NO: 162 HCDR3 (Kabat) WLSYYGMDV SEQ ID NO: 163 HCDR1 (Chothia) GFTFSSF SEQ ID NO: 164 HCDR2 (Chothia) SSSSSY SEQ ID NO: 162 HCDR3 (Chothia) WLSYYGMDV SEQ ID NO: 165 HCDR1 (IMGT) GFTFSSFR SEQ ID NO: 166 HCDR2 (IMGT) ISSSSSYI SEQ ID NO: 167 HCDR3 (IMGT) ARWLSYYGMDV SEQ ID NO: 168 VH EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSFRMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWLSYYGMDVWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 169 ДНК VH GAAGTGCAACTGGTGGAGAGCGGTGGAGGGCTTGTCAAGCCCGGAGGATCGCTGCGGCTGTCCTGTGCTGCGTCCGGGTTCACCTTCTCCTCGTTCCGCATGAACTGGGTCAGACAGGCACCGGGAAAGGGCCTCGAATGGGTGTCCTCAATCTCATCGTCCTCGTCCTACATCTACTACGCCGACTCCGTGAAAGGCCGCTTCACCATCTCCCGGGACAACGCCAAGAACTCGCTGTACCTCCAAATGAATAGCCTCAGGGCGGAAGATACTGCTGTGTATTACTGCGCACGCTGGCTTTCCTACTACGGCATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACTGTGACCGTGTCTAGC SEQ ID NO: 147 LCDR1 (Kabat) RSSQSLLDSDDGNTYLD SEQ ID NO: 170 LCDR2 (Kabat) TLSFRAS SEQ ID NO: 171 LCDR3 (Kabat) MQRIGFPIT SEQ ID NO: 150 LCDR1 (Chothia) SQSLLDSDDGNTY SEQ ID NO: 151 LCDR2 (Chothia) TLS SEQ ID NO: 172 LCDR3 (Chothia) RIGFPI SEQ ID NO: 153 LCDR1 (IMGT) QSLLDSDDGNTY SEQ ID NO: 151 LCDR2 (IMGT) TLS SEQ ID NO: 171 LCDR3 (IMGT) MQRIGFPIT SEQ ID NO: 173 VL DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSDDGNTYLDWYLQKPGQSPQLLIYTLSFRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKIRRVEAEDVGVYYCMQRIGFPITFGQGTRLEIK SEQ ID NO: 174 ДНК VL GATATCGTGATGACCCAGACTCCCCTGTCCCTGCCTGTGACTCCCGGAGAACCAGCCTCCATTTCCTGCCGGTCCTCCCAGTCCCTGCTGGACAGCGACGACGGCAACACTTACCTGGACTGGTACTTGCAGAAGCCGGGCCAATCGCCTCAGCTGCTGATCTATACCCTGTCATTCCGGGCCTCAGGAGTGCCTGACCGCTTCTCGGGATCAGGGAGCGGGACCGATTTCACCCTGAAAATTAGGCGAGTGGAAGCCGAGGACGTCGGAGTGTACTACTGCATGCAGCGCATCGGCTTCCCGATTACGTTTGGACAGGGTACCCGGCTTGAGATCAAG SEQ ID NO: 63 Линкер GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO: 175 scFv (VH-линкер-VL) EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSFRMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWLSYYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSDDGNTYLDWYLQKPGQSPQLLIYTLSFRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKIRRVEAEDVGVYYCMQRIGFPITFGQGTRLEIK SEQ ID NO: 176 ДНК scFv GAAGTGCAACTGGTGGAGAGCGGTGGAGGGCTTGTCAAGCCCGGAGGATCGCTGCGGCTGTCCTGTGCTGCGTCCGGGTTCACCTTCTCCTCGTTCCGCATGAACTGGGTCAGACAGGCACCGGGAAAGGGCCTCGAATGGGTGTCCTCAATCTCATCGTCCTCGTCCTACATCTACTACGCCGACTCCGTGAAAGGCCGCTTCACCATCTCCCGGGACAACGCCAAGAACTCGCTGTACCTCCAAATGAATAGCCTCAGGGCGGAAGATACTGCTGTGTATTACTGCGCACGCTGGCTTTCCTACTACGGCATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACTGTGACCGTGTCTAGCGGAGGCGGAGGTTCAGGGGGCGGTGGATCAGGCGGAGGAGGATCGGGGGGTGGTGGATCGGATATCGTGATGACCCAGACTCCCCTGTCCCTGCCTGTGACTCCCGGAGAACCAGCCTCCATTTCCTGCCGGTCCTCCCAGTCCCTGCTGGACAGCGACGACGGCAACACTTACCTGGACTGGTACTTGCAGAAGCCGGGCCAATCGCCTCAGCTGCTGATCTATACCCTGTCATTCCGGGCCTCAGGAGTGCCTGACCGCTTCTCGGGATCAGGGAGCGGGACCGATTTCACCCTGAAAATTAGGCGAGTGGAAGCCGAGGACGTCGGAGTGTACTACTGCATGCAGCGCATCGGCTTCCCGATTACGTTTGGACAGGGTACCCGGCTTGAGATCAAG SEQ ID NO: 177 Полная аминокислотная последовательность CAR EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSFRMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWLSYYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSDDGNTYLDWYLQKPGQSPQLLIYTLSFRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKIRRVEAEDVGVYYCMQRIGFPITFGQGTRLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 178 Полная последовательность ДНК CAR GAAGTGCAACTGGTGGAGAGCGGTGGAGGGCTTGTCAAGCCCGGAGGATCGCTGCGGCTGTCCTGTGCTGCGTCCGGGTTCACCTTCTCCTCGTTCCGCATGAACTGGGTCAGACAGGCACCGGGAAAGGGCCTCGAATGGGTGTCCTCAATCTCATCGTCCTCGTCCTACATCTACTACGCCGACTCCGTGAAAGGCCGCTTCACCATCTCCCGGGACAACGCCAAGAACTCGCTGTACCTCCAAATGAATAGCCTCAGGGCGGAAGATACTGCTGTGTATTACTGCGCACGCTGGCTTTCCTACTACGGCATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACTGTGACCGTGTCTAGCGGAGGCGGAGGTTCAGGGGGCGGTGGATCAGGCGGAGGAGGATCGGGGGGTGGTGGATCGGATATCGTGATGACCCAGACTCCCCTGTCCCTGCCTGTGACTCCCGGAGAACCAGCCTCCATTTCCTGCCGGTCCTCCCAGTCCCTGCTGGACAGCGACGACGGCAACACTTACCTGGACTGGTACTTGCAGAAGCCGGGCCAATCGCCTCAGCTGCTGATCTATACCCTGTCATTCCGGGCCTCAGGAGTGCCTGACCGCTTCTCGGGATCAGGGAGCGGGACCGATTTCACCCTGAAAATTAGGCGAGTGGAAGCCGAGGACGTCGGAGTGTACTACTGCATGCAGCGCATCGGCTTCCCGATTACGTTTGGACAGGGTACCCGGCTTGAGATCAAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACCAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG

Таблица 13. CDR по Kabat иллюстративных молекул, полученных из гибридомы, связывающихся с BCMA

Kabat HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3 Hy03 GFWMS (SEQ ID NO: 137) NIKQDGSEKYYVDSVRG (SEQ ID NO: 138) ALDYYGMDV (SEQ ID NO: 139) RSSQSLLDSDDGNTYLD (SEQ ID NO: 147) TLSYRAS (SEQ ID NO: 148) TQRLEFPSIT (SEQ ID NO: 149) Hy52 SFRMN (SEQ ID NO: 160) SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID NO: 161) WLSYYGMDV (SEQ ID NO: 162) RSSQSLLDSDDGNTYLD (SEQ ID NO: 147) TLSFRAS (SEQ ID NO: 170) MQRIGFPIT (SEQ ID NO: 171) Консенсусная последовательность X₁FX₂MX₃, где X₁ представляет собой G или S; X₂ представляет собой W или R; и X₃ представляет собой S или N (SEQ ID NO: 179) X₁IX₂X₃X₄X₅SX₆X₇YYX₈DSVX₉G, где X₁ представляет собой N или S; X₂ представляет собой K или S; X₃ представляет собой Q или S; X₄ представляет собой D или S; X₅ представляет собой G или S; X₆ представляет собой E или Y; X₇ представляет собой K или I; X₈ представляет собой V или A; и X₉ представляет собой R или K (SEQ ID NO: 180) X₁LX₂YYGMDV, где X₁ представляет собой A или W; и X₂ представляет собой D или S (SEQ ID NO: 181) RSSQSLLDSDDGNTYLD (SEQ ID NO: 147) TLSXRAS, где X представляет собой Y или F (SEQ ID NO: 182) X₁QRX₂X₃FPX₄IT, где X₁ представляет собой T или M; X₂ представляет собой L или I; X₃ представляет собой E или G; и X₄ представляет собой S или отсутствует (SEQ ID NO: 183)

Таблица 14. CDR по Chothia иллюстративных молекул, полученных из гибридомы, связывающихся с BCMA

Chothia HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3 Hy03 GFTFSGF (SEQ ID NO: 140) KQDGSE (SEQ ID NO: 141) ALDYYGMDV (SEQ ID NO: 139) SQSLLDSDDGNTY (SEQ ID NO: 150) TLS (SEQ ID NO: 151) RLEFPSI (SEQ ID NO: 152) Hy52 GFTFSSF (SEQ ID NO: 163) SSSSSY (SEQ ID NO: 164) WLSYYGMDV (SEQ ID NO: 162) SQSLLDSDDGNTY (SEQ ID NO: 150) TLS (SEQ ID NO: 151) RIGFPI (SEQ ID NO: 172) Консенсусная последовательность GFTFSXF, где X представляет собой G или S (SEQ ID NO: 184) X₁X₂X₃X₄SX₅, где X₁ представляет собой K или S; X₂ представляет собой Q или S; X₃ представляет собой D или S; X₄ представляет собой G или S; и X₅ представляет собой E или Y (SEQ ID NO: 185) X₁LX₂YYGMDV, где X₁ представляет собой A или W; и X₂ представляет собой D или S (SEQ ID NO: 181) SQSLLDSDDGNTY (SEQ ID NO: 150) TLS (SEQ ID NO: 151) RX₁X₂FPX₃I, где X₁ представляет собой L или I; X₂ представляет собой E или G; и X₃ представляет собой S или отсутствует (SEQ ID NO: 186)

Таблица 15. CDR по IMGT иллюстративных молекул, полученных из гибридомы, связывающихся с BCMA

IMGT HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3 Hy03 GFTFSGFW (SEQ ID NO: 142) IKQDGSEK (SEQ ID NO: 143) ARALDYYGMDV (SEQ ID NO: 144) QSLLDSDDGNTY (SEQ ID NO: 153) TLS (SEQ ID NO: 151) TQRLEFPSIT (SEQ ID NO: 149) Hy52 GFTFSSFR (SEQ ID NO: 165) ISSSSSYI (SEQ ID NO: 166) ARWLSYYGMDV (SEQ ID NO: 167) QSLLDSDDGNTY (SEQ ID NO: 153) TLS (SEQ ID NO: 151) MQRIGFPIT (SEQ ID NO: 171) Консенсусная последовательность GFTFSX₁FX₂, где X₁ представляет собой G или S; и X₂ представляет собой W или R (SEQ ID NO: 187) IX₁X₂X₃X₄SX₅X₆, где X₁ представляет собой K или S; X₂ представляет собой Q или S; X₃ представляет собой D или S; X₄ представляет собой G или S; X₅ представляет собой E или Y; и X₆ представляет собой K или I (SEQ ID NO: 188) ARX₁LX₂YYGMDV, где X₁ представляет собой A или W; и X₂ представляет собой D или S (SEQ ID NO: 189) QSLLDSDDGNTY (SEQ ID NO: 153) TLS (SEQ ID NO: 151) X₁QRX₂X₃FPX₄IT, где X₁ представляет собой T или M; X₂ представляет собой L или I; X₃ представляет собой E или G; и X₄ представляет собой S или отсутствует (SEQ ID NO: 183)

В некоторых вариантах осуществления человеческий домен, связывающий BCMA, содержит CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC.

В определенных вариантах осуществления молекула CAR, описанная в данном документе, или домен, связывающий BCMA, описанный в данном документе, содержат

(1) одну, две или три CDR легкой цепи (LC), выбранные из

(i) CDR1 LC под SEQ ID NO: 54, CDR2 LC под SEQ ID NO: 55 и CDR3 LC под SEQ ID NO: 56; и/или

(2) одну, две или три CDR тяжелой цепи (HC) из любой из следующих:

(i) CDR1 HC под SEQ ID NO: 44, CDR2 HC под SEQ ID NO: 45 и CDR3 HC под SEQ ID NO: 84; (ii) CDR1 HC под SEQ ID NO: 44, CDR2 HC под SEQ ID NO: 45 и CDR3 HC под SEQ ID NO: 46; (iii) CDR1 HC под SEQ ID NO: 44, CDR2 HC под SEQ ID NO: 45 и CDR3 HC под SEQ ID NO: 68; или (iv) CDR1 HC под SEQ ID NO: 44, CDR2 HC под SEQ ID NO: 45 и CDR3 HC под SEQ ID NO: 76.

В определенных вариантах осуществления молекула CAR, описанная в данном документе, или домен, связывающий BCMA, описанный в данном документе, содержат

(1) одну, две или три CDR легкой цепи (LC) из любой из следующих:

(i) CDR1 LC под SEQ ID NO: 95, CDR2 LC под SEQ ID NO: 131 и CDR3 LC под SEQ ID NO: 132; (ii) CDR1 LC под SEQ ID NO: 95, CDR2 LC под SEQ ID NO: 96 и CDR3 LC под SEQ ID NO: 97; (iii) CDR1 LC под SEQ ID NO: 95, CDR2 LC под SEQ ID NO: 114 и CDR3 LC под SEQ ID NO: 115; или (iv) CDR1 LC под SEQ ID NO: 95, CDR2 LC под SEQ ID NO: 114 и CDR3 LC под SEQ ID NO: 97; и/или

(2) одну, две или три CDR тяжелой цепи (HC) из любой из следующих:

(i) CDR1 HC под SEQ ID NO: 86, CDR2 HC под SEQ ID NO: 130 и CDR3 HC под SEQ ID NO: 88; (ii) CDR1 HC под SEQ ID NO: 86, CDR2 HC под SEQ ID NO: 87 и CDR3 HC под SEQ ID NO: 88; или (iii) CDR1 HC под SEQ ID NO: 86, CDR2 HC под SEQ ID NO: 109 и CDR3 HC под SEQ ID NO: 88.

В определенных вариантах осуществления молекула CAR, описанная в данном документе, или домен, связывающий BCMA, описанный в данном документе, содержат

(1) одну, две или три CDR легкой цепи (LC) из любой из следующих:

(i) CDR1 LC под SEQ ID NO: 147, CDR2 LC под SEQ ID NO: 182 и CDR3 LC под SEQ ID NO: 183; (ii) CDR1 LC под SEQ ID NO: 147, CDR2 LC под SEQ ID NO: 148 и CDR3 LC под SEQ ID NO: 149; или (iii) CDR1 LC под SEQ ID NO: 147, CDR2 LC под SEQ ID NO: 170 и CDR3 LC под SEQ ID NO: 171; и/или

(2) одну, две или три CDR тяжелой цепи (HC) из любой из следующих:

(i) CDR1 HC под SEQ ID NO: 179, CDR2 HC под SEQ ID NO: 180 и CDR3 HC под SEQ ID NO: 181; (ii) CDR1 HC под SEQ ID NO: 137, CDR2 HC под SEQ ID NO: 138 и CDR3 HC под SEQ ID NO: 139; или (iii) CDR1 HC под SEQ ID NO: 160, CDR2 HC под SEQ ID NO: 161 и CDR3 HC под SEQ ID NO: 162.

В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 44, 45, 84, 54, 55 и 56 соответственно. В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 44, 45, 46, 54, 55 и 56 соответственно. В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 44, 45, 68, 54, 55 и 56 соответственно. В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 44, 45, 76, 54, 55 и 56 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 47, 48, 84, 57, 58 и 59 соответственно. В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 47, 48, 46, 57, 58 и 59 соответственно. В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 47, 48, 68, 57, 58 и 59 соответственно. В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 47, 48, 76, 57, 58 и 59 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 49, 50, 85, 60, 58 и 56 соответственно. В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 49, 50, 51, 60, 58 и 56 соответственно. В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 49, 50, 69, 60, 58 и 56 соответственно. В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 49, 50, 77, 60, 58 и 56 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления человеческий домен, связывающий BCMA, содержит scFv, содержащий VH (например, VH, описанную в данном документе) и VL (например, VL, описанную в данном документе). В некоторых вариантах осуществления VH присоединена к VL посредством линкера, например линкера, описанного в данном документе, например линкера, описанного в таблице 1. В некоторых вариантах осуществления человеческий домен, связывающий BCMA, содержит линкер (Gly₄-Ser)n, где n равняется 1, 2, 3, 4, 5 или 6, предпочтительно 3 или 4 (SEQ ID NO: 26). Вариабельная область легкой цепи и вариабельная область тяжелой цепи scFv могут находиться, например, в любой из следующих ориентаций: вариабельная область легкой цепи-линкер-вариабельная область тяжелой цепи или вариабельная область тяжелой цепи-линкер-вариабельная область легкой цепи.

В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, представляет собой фрагмент, например, одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv). В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, представляет собой Fv, Fab (Fab')2 или бифункциональное (например, биспецифическое) гибридное антитело (например, Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)). В некоторых вариантах осуществления антитела и их фрагменты по настоящему изобретению связываются c белком BCMA с аффинностью антител дикого типа или усиленной аффинностью.

В некоторых случаях scFv можно получить в соответствии со способом, известным из уровня техники (см., например, Bird et al., (1988) Science 242:423-426 и Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Молекулы scFv можно получить путем связывания VH- и VL-областей друг с другом с помощью гибких полипептидных линкеров. Молекулы scFv содержат линкер (например, линкер Ser-Gly) с оптимизированными длиной и/или аминокислотным составом. Длина линкера может сильно влиять на укладку и взаимодействие вариабельных областей scFv. В действительности, если используют короткий полипептидный линкер (например, длиной 5-10 аминокислот), то внутрицепочечное сворачивание предотвращается. Межцепочечное сворачивание также необходимо для объединения двух вариабельных областей вместе с образованием функционального эпитопсвязывающего участка. Примеры ориентации и размера линкеров см., например, в Hollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448, публикациях заявок на патент США №№ 2005/0100543, 2005/0175606, 2007/0014794 и публикациях согласно PCT №№ WO2006/020258 и WO2007/024715, включенных в данный документ посредством ссылки.

ScFv может содержать линкер из по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, или более аминокислотных остатков между его VL- и VH-областями. Линкерная последовательность может содержать любую встречающуюся в природе аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления линкерная последовательность содержит аминокислоты глицин и серин. В некоторых вариантах осуществления линкерная последовательность содержит группы глициновых и сериновых повторов, таких как (Gly₄Ser)n, где n представляет собой положительное целое число, равное 1 или больше (SEQ ID NO: 25). В некоторых вариантах осуществления линкер может представлять собой (Gly₄Ser)₄ (SEQ ID NO: 27) или (Gly₄Ser)₃(SEQ ID NO: 28). При изменении длины линкера может сохраняться или усиливаться активность, что приводит к улучшению эффективности в исследованиях активности.

CAR для CD20

В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе клетка, экспрессирующая CAR, представляет собой клетку, экспрессирующую CAR для CD20 (например, клетку, экспрессирующую CAR, который связывается с CD20 человека). В некоторых вариантах осуществления клетка, экспрессирующая CAR для CD20, содержит антигенсвязывающий домен согласно WO2016164731 и WO2018067992, включенным в данный документ посредством ссылки. Иллюстративные CD20-связывающие последовательности или последовательности CAR для CD20 раскрыты, например, в таблицах 1-5 из WO2018067992. В некоторых вариантах осуществления CAR для CD20 содержит CDR, вариабельную область, scFv или полноразмерную последовательность CAR для CD20, раскрытую в WO2018067992 или WO2016164731.

CAR для CD22

В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе клетка, экспрессирующая CAR, представляет собой клетку, экспрессирующую CAR для CD22 (например, клетку, экспрессирующую CAR, который связывается с CD22 человека). В некоторых вариантах осуществления клетка, экспрессирующая CAR для CD22, содержит антигенсвязывающий домен согласно WO2016164731 и WO2018067992, включенными в данный документ посредством ссылки. Иллюстративные CD22-связывающие последовательности или последовательности CAR для CD22 раскрыты в, например, таблицах 6A, 6B, 7A, 7B, 7C, 8A, 8B, 9A, 9B, 10A и 10B согласно WO2016164731 и таблицах 6-10 согласно WO2018067992. В некоторых вариантах осуществления последовательность CAR для CD22 содержит CDR, вариабельную область, scFv или полноразмерную последовательность CAR для CD22, раскрытую в WO2018067992 или WO2016164731.

В ряде вариантов осуществления молекула CAR содержит антигенсвязывающий домен, который связывается с CD22 (CAR для CD22). В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен нацеливается на CD22 человека. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен содержит последовательность одноцепочечного Fv, описанного в данном документе.

Последовательности CAR для CD22 человека представлены ниже. В некоторых вариантах осуществления CAR для CD22 человека представляет собой CAR22-65.

Последовательность scFv CAR для CD22 человека

EVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSMLSNSDTWNWIRQSPSRGLEWLGRTYHRSTWYDDYASSVRGRVSINVDTSKNQYSLQLNAVTPEDTGVYYCARVRLQDGNSWSDAFDVWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASASGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGTGTQLTVL (SEQ ID NO: 285)

Вариабельная область тяжелой цепи CAR для CD22 человека

EVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSMLSNSDTWNWIRQSPSRGLEWLGRTYHRSTWYDDYASSVRGRVSINVDTSKNQYSLQLNAVTPEDTGVYYCARVRLQDGNSWSDAFDVWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO 286)

Вариабельная область легкой цепи CAR для CD22 человека

QSALTQPASASGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGTGTQLTVL (SEQ ID NO 287)

Таблица 16. CDR вариабельного домена тяжелой цепи CAR для CD22 (CAR22-65)

Кандидат HCDR1 SEQ ID NO: HCDR2 SEQ ID NO: HCDR3 SEQ ID NO: CAR22-65 по комбинированному определению GDSMLSNSDTWN 288 RTYHRSTWYDDYASSVRG 290 VRLQDGNSWSDAFDV 291 CAR22-65 по Kabat SNSDTWN 289 RTYHRSTWYDDYASSVRG 290 VRLQDGNSWSDAFDV 291

Таблица 17. CDR вариабельного домена легкой цепи CAR для CD22 (CAR22-65). Последовательности CDR LC в данной таблице имеют одинаковую последовательность согласно определению по Kabat или комбинированному определению.

Кандидат LCDR1 SEQ ID NO: LCDR2 SEQ ID NO: LCDR3 SEQ ID NO: CAR22-65 по комбинированному определению TGTSSDVGGYNYVS 95 DVSNRPS 96 SSYTSSSTLYV 97

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен содержит CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC с любыми аминокислотными последовательностями тяжелой цепи связывающего домена, перечисленными в таблице 16. В ряде вариантов осуществления антигенсвязывающий домен дополнительно содержит CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC. В ряде вариантов осуществления антигенсвязывающий домен содержит аминокислотные последовательности CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC, перечисленные в таблице 17.

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен содержит одну, две или все из CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC с любыми аминокислотными последовательностями легкой цепи связывающего домена, перечисленными в таблице 17, и одну, две или все из CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC с любыми аминокислотными последовательностями тяжелой цепи связывающего домена, перечисленными в таблице 16.

В некоторых вариантах осуществления CDR определены в соответствии со схемой нумерации по Kabat, схемой нумерации по Chothia или их комбинацией.

Порядок, в котором VL- и VH-домены представлены в scFv, может варьировать (т. е. в ориентации VL-VH или VH-VL), и при этом любое число из одной, двух, трех или четырех копий субъединиц "G4S" (SEQ ID NO: 25), где каждая субъединица содержит последовательность GGGGS (SEQ ID NO: 25) (например (G4S)₃ (SEQ ID NO: 28) или (G4S)₄ (SEQ ID NO: 27)), может соединять вариабельные домены для создания целого scFv-домена. В качестве альтернативы, конструкция CAR может содержать, например, линкер, содержащий последовательность GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 43). В качестве альтернативы, конструкция CAR может содержать, например, линкер содержащий последовательность LAEAAAK (SEQ ID NO: 308). В одном варианте осуществления конструкция CAR не содержит линкер между VL- и VH-доменами.

Все эти клоны содержали изменение остатка Q/K в сигнальном домене костимулирующего домена, полученного из дзета-цепи CD3.

CAR для EGFR

В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе клетка, экспрессирующая CAR, представляет собой клетку, экспрессирующую CAR для EGFR (например, клетку, экспрессирующую CAR, который связывается с EGFR человека). В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе клетка, экспрессирующая CAR, представляет собой клетку, экспрессирующую CAR для EGFRvIII (например, клетку, экспрессирующую CAR, который связывается с EGFRvIII человека). Иллюстративные CAR для EGFRvIII могут включать последовательности, раскрытые в WO2014/130657, например, таблице 2 из WO2014/130657, включенной в данный документ посредством ссылки.

Иллюстративные EGFRvIII-связывающие последовательности или последовательности CAR для EGFR могут содержать CDR, вариабельную область, scFv или полноразмерную последовательность CAR из CAR для EGFR, раскрытого в WO2014/130657.

CAR для мезотелина

В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе клетка, экспрессирующая CAR, представляет собой клетку, связывающую мезотелин, экспрессирующую CAR (например, клетку, экспрессирующую CAR, которая связывается с мезотелином человека). Иллюстративные CAR для мезотелина могут включать последовательности, раскрытые в WO2015090230 и WO2017112741, например, таблицах 2, 3, 4 и 5 из WO2017112741, включенных в данный документ посредством ссылки.

Другие иллюстративные CAR

В других вариантах осуществления клетки, экспрессирующие CAR, могут специфично связываться с CD123, например, могут содержать молекулу CAR (например, любую из CAR1-CAR8) или антигенсвязывающий домен согласно таблицам 1-2 из WO 2014/130635, включенной в данный документ посредством ссылки. Аминокислотные последовательности молекул и антигенсвязывающих доменов CAR для CD123 (например, содержащих одну, две, три CDR VH и одну, две, три CDR VL согласно Kabat или Chothia) и нуклеотидные последовательности, кодирующие их, указаны в WO 2014/130635. В других вариантах осуществления клетки, экспрессирующие CAR, могут специфично связываться с CD123, например, могут содержать молекулу CAR (например, любую из молекул от CAR123-1 до CAR123-4 и от hzCAR123-1 до hzCAR123-32) или ее антигенсвязывающий домен согласно таблицам 2, 6 и 9 из WO2016/028896, включенной в данный документ посредством ссылки. Аминокислотные последовательности молекул и антигенсвязывающих доменов CAR для CD123 (например, содержащих одну, две, три CDR VH и одну, две, три CDR VL согласно Kabat или Chothia) и нуклеотидные последовательности, кодирующие их, указаны в WO2016/028896.

В некоторых вариантах осуществления молекула CAR предусматривает CAR для CLL1, описанный в данном документе, например, CAR для CLL1, описанный в US2016/0051651A1, включенной в данный документ посредством ссылки. В ряде вариантов осуществления CAR для CLL1 содержит аминокислотную последовательность или имеет нуклеотидную последовательность, показанные в US2016/0051651A1, включенной в данный документ посредством ссылки. В других вариантах осуществления клетки, экспрессирующие CAR, могут специфично связываться с CLL-1, например, могут содержать молекулу CAR или антигенсвязывающий домен согласно таблице 2 из WO2016/014535, включенной в данный документ посредством ссылки. Аминокислотные последовательности молекул и антигенсвязывающих доменов CAR для CLL-1 (например, содержащих одну, две, три CDR VH и одну, две, три CDR VL согласно Kabat или Chothia) и нуклеотидные последовательности, кодирующие их, указаны в WO2016/014535.

В некоторых вариантах осуществления молекула CAR предусматривает CAR для CD33, описанный в данном документе, например, CAR для CD33, описанный в US2016/0096892A1, включенной в данный документ посредством ссылки. В ряде вариантов осуществления CAR для CD33 содержит аминокислотную последовательность или имеет нуклеотидную последовательность, показанные в US2016/0096892A1, включенной в данный документ посредством ссылки. В других вариантах осуществления клетки, экспрессирующие CAR, могут специфично связываться с CD33, например, могут содержать молекулу CAR (например, любую из молекул от CAR33-1 до CAR-33-9) или антигенсвязывающий домен согласно таблице 2 или 9 из WO2016/014576, включенной в данный документ посредством ссылки. Аминокислотные последовательности молекул и антигенсвязывающих доменов CAR для CD33 (например, содержащих одну, две, три CDR VH и одну, две, три CDR VL согласно Kabat или Chothia) и нуклеотидные последовательности, кодирующие их, указаны в WO2016/014576.

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен содержит одну, две, три (например, все три) CDR тяжелой цепи, CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC, из антитела, описанного в данном документе (например, антитела, описанного в WO2015/142675, US-2015-0283178-A1, US-2016-0046724-A1, US2014/0322212A1, US2016/0068601A1, US2016/0051651A1, US2016/0096892A1, US2014/0322275A1 или WO2015/090230, включенных в данный документ посредством ссылки), и/или одну, две, три (например, все три) CDR легкой цепи, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC, из антитела, описанного в данном документе (например, антитела, описанного в WO2015/142675, US-2015-0283178-A1, US-2016-0046724-A1, US2014/0322212A1, US2016/0068601A1, US2016/0051651A1, US2016/0096892A1, US2014/0322275A1 или WO2015/090230, включенных в данный документ посредством ссылки). В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен содержит вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи антитела, указанного выше.

В вариантах осуществления антигенсвязывающий домен представляет собой антигенсвязывающий домен, описанный в WO2015/142675, US-2015-0283178-A1, US-2016-0046724-A1, US2014/0322212A1, US2016/0068601A1, US2016/0051651A1, US2016/0096892A1, US2014/0322275A1 или WO2015/090230, включенных в данный документ посредством ссылки.

В ряде вариантов осуществления антигенсвязывающий домен нацеливается на BCMA и описан в US-2016-0046724-A1. В ряде вариантов осуществления антигенсвязывающий домен нацеливается на CD19 и описан в US-2015-0283178-A1. В ряде вариантов осуществления антигенсвязывающий домен нацеливается на CD123 и описан в US2014/0322212A1, US2016/0068601A1. В ряде вариантов осуществления антигенсвязывающий домен нацеливается на CLL1 и описан в US2016/0051651A1. В ряде вариантов осуществления антигенсвязывающий домен нацеливается на CD33 и описан в US2016/0096892A1.

Иллюстративные антигены-мишени, на которые можно нацеливаться с помощью клеток, экспрессирующих CAR, включают без ограничения, среди прочих, CD19, CD123, EGFRvIII, CD33, мезотелин, BCMA и GFR-ALPHA 4, описанные, например, в WO2014/153270, WO 2014/130635, WO2016/028896, WO 2014/130657, WO2016/014576, WO 2015/090230, WO2016/014565, WO2016/014535 и WO2016/025880, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

В других вариантах осуществления клетки, экспрессирующие CAR, могут специфично связываться с GFR ALPHA-4, например, могут содержать молекулу CAR или антигенсвязывающий домен согласно таблице 2 из WO2016/025880, включенной в данный документ посредством ссылки. Аминокислотные последовательности молекул и антигенсвязывающих доменов CAR для GFR ALPHA-4 (например, содержащих одну, две, три CDR VH и одну, две, три CDR VL согласно Kabat или Chothia) и нуклеотидные последовательности, кодирующие их, указаны в WO2016/025880.

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен любой из молекул CAR, описанных в данном документе (например, для любого из CD19, CD123, EGFRvIII, CD33, мезотелина, BCMA и GFR-ALPHA 4), содержит одну, две, три (например, все три) CDR тяжелой цепи, CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC, из антитела, приведенного выше, и/или одну, две, три (например, все три) CDR легкой цепи, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC, из антигенсвязывающего домена, приведенного выше. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен содержит вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи антитела, указанного или описанного выше.

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен содержит одну, две, три (например, все три) CDR тяжелой цепи, CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC, из антитела, приведенного выше, и/или одну, две, три (например, все три) CDR легкой цепи, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC, из антитела, приведенного выше. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен содержит вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи антитела, указанного или описанного выше.

В некоторых вариантах осуществления опухолевый антиген представляет собой опухолевый антиген, описанный в международной заявке WO2015/142675, поданной 13 марта 2015 года, включенной в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В некоторых вариантах осуществления опухолевый антиген, выбран из одного или нескольких из CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS-1 (также называемого CD2 субпопуляции 1, CRACC, SLAMF7, CD319 и 19A24); молекулы 1, подобной лектинам С-типа (CLL-1 или CLECL1); CD33; варианта III рецептора эпидермального фактора роста (EGFRvIII); ганглиозида G2 (GD2); ганглиозида GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer); антигена созревания В-клеток (BCMA), являющегося представителем семейства рецепторов TNF; Tn-антигена ((Ag Tn) или (GalNAcα-Ser/Thr)); простатического специфического мембранного антигена (PSMA); орфанного рецептора 1, подобного рецепторной тирозинкиназе (ROR1); Fms-подобной тирозинкиназы 3 (FLT3); опухолеассоциированного гликопротеина 72 (TAG72); CD38; CD44v6; раково-эмбрионального антигена (СЕА); молекулы адгезии эпителиальных клеток (ЕРСАМ); В7Н3 (CD276); KIT (CD117); альфа-2-субъединицы рецептора интерлейкина-13 (IL-13Ra2 или CD213A2); мезотелина; альфа-субъединицы рецептора интерлейкина 11 (IL-11Ra); антигена стволовых клеток предстательной железы (PSCA); сериновой протеазы 21 (тестизина или PRSS21); рецептора 2 фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR2); антигена системы Льюис (Y); CD24; рецептора фактора роста тромбоцитов бета-типа (PDGFR-бета); стадиеспецифического эмбрионального антигена 4 (SSEA-4); CD20; рецептора фолиевой кислоты альфа; рецепторной тирозинпротеинкиназы ERBB2 (Her2/neu); муцина 1, ассоциированного с клеточной поверхностью (MUC1); рецептора эпидермального фактора роста (EGFR); молекулы адгезии нервных клеток (NCAM); простазы; простатической кислой фосфатазы (РАР); мутантного фактора элонгации 2 (ELF2M); эфрина В2; белка активации фибробластов альфа (FAP); рецептора инсулиноподобного фактора роста 1 (рецептора IGF-I), карбоангидразы IX (CAIX); субъединицы бета-типа 9 протеасомы (просомы, мультикаталитической протеазы) (LMP2); гликопротеина 100 (gp100); онкогенного слитого белка, состоящего из кластерного региона точечных разрывов (BCR) и гомолога 1 онкогена вируса лейкоза мышей Абельсона (Abl) (bcr-abl); тирозиназы; рецептора 2 эфрина А-типа (EphA2); фукозил-GM1; молекулы адгезии, представляющей собой сиалилированный антиген системы Льюис (sLe); ганглиозида GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer); трансглутаминазы 5 (TGS5); высокомолекулярного антигена, ассоциированного с меланомой (HMWMAA); ганглиозида о-ацетил-GD2 (OAcGD2); рецептора фолиевой кислоты бета; опухолевого эндотелиального маркера 1 (TEM1/CD248); белка, родственного опухолевому эндотелиальному маркеру 7 (TEM7R); клаудина 6 (CLDN6); рецептора тиреотропного гормона (TSHR); представителя D группы 5 класса С рецепторов, сопряженных с G-белками (GPRC5D); белка, кодируемого открытой рамкой считывания 61 X-хромосомы (CXORF61); CD97; CD179a; киназы анапластической лимфомы (ALK); полисиаловой кислоты; плацентоспецифического белка 1 (PLAC1); гексасахаридной части гликоцерамида globoH (GloboH); дифференцировочного антигена молочной железы (NY-BR-1); уроплакина 2 (UPK2); клеточного рецептора 1 вируса гепатита A (HAVCR1); бета-3-адренорецептора (ADRB3); паннексина 3 (PANX3); рецептора 20, сопряженного с G-белком (GPR20); антигена локуса K9 комплекса лимфоцитарных антигенов 6 (LY6K); обонятельного рецептора 51Е2 (OR51E2); белка, кодируемого альтернативной рамкой считывания гена TCаR-гамма (TARP); белка опухоли Вильмса (WT1); раково-тестикулярного антигена 1 (NY-ESO-1); раково-тестикулярного антигена 2 (LAGE-1a); антигена 1, ассоциированного с меланомой (MAGE-A1); белка, кодируемого транслокационным вариантом 6 гена ETS, локализованным в р-плече 12 хромосомы (ETV6-AML); белка спермы 17 (SPA17); представителя 1А семейства X-антигенов (XAGE1); ангиопоэтин-связывающего рецептора клеточной поверхности 2 (TIE-2); раково-тестикулярного антигена меланомы 1 (MAD-CT-1); раково-тестикулярного антигена меланомы 2 (MAD-CT-2); Fos-родственного антигена 1; опухолевого белка р53 (р53); мутантного р53; простеина; сурвивина; теломеразы; опухолевого антигена 1 карциномы предстательной железы (РСТА-1 или галектина 8), антигена меланомы 1, распознаваемого Т-клетками (MelanA или MART1); мутантного антигена саркомы крыс (Ras); теломеразной обратной транскриптазы человека (hTERT); антигена саркомы с точечными разрывами при транслокации; меланомного ингибитора апоптоза (ML-IAP); ERG (продукта слитого гена трансмембранной сериновой протеазы 2 (TMPRSS2) и ETS); N-ацетилглюкозаминилтрансферазы V (NA17); белка с парным box-доменом Рах-3 (РАХЗ); андрогенового рецептора; циклина В1; нейробластомного гомолога онкогена вируса миелоцитоматоза птиц v-myc (MYCN); представителя С семейства гомологов Ras (RhoC); белка 2, родственного тирозиназе (TRP-2); цитохрома Р450 1В1 (CYP1B1); белка, подобного CCCTC-связывающему фактору (белку с "цинковыми пальцами") (BORIS или "брата регулятора импринтированных сайтов"), антигена плоскоклеточной карциномы 3, распознаваемого Т-клетками (SART3); белка с парным box-доменом Рах-5 (РАХ5); проакрозин-связывающего белка sp32 (OY-TES1); лимфоцитоспецифической протеинтирозинкиназы (LCK); якорного белка 4 киназы A (AKAP-4); антигена 2 синовиальной саркомы с точечным разрывом в X-хромосоме (SSX2); рецептора конечных продуктов гликирования (RAGE-1); почечного убиквитарного белка 1 (RU1); почечного убиквитарного белка 2 (RU2); легумаина; Е6 вируса папилломы человека (Е6 HPV); Е7 вируса папилломы человека (Е7 HPV); кишечной карбоксилэстеразы; мутантного белка теплового шока 70-2 (мутантный вариант hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; иммуноглобулиноподобного рецептора 1, ассоциированного с лейкоцитами (LAIR1); рецептора Fc-фрагмента IgA (FCAR или CD89); представителя 2 подсемейства А лейкоцитарных иммуноглобулиноподобных рецепторов (LILRA2); представителя f семейства белков, подобных молекулам CD300 (CD300LF); представителя А семейства 12 лектиновых доменов С-типа (CLEC12A); антигена 2 стромальных клеток костного мозга (BST2); белка 2, подобного муциноподобному рецептору гормона, содержащего EGF-подобный модуль (EMR2); лимфоцитарного антигена 75 (LY75); глипикана-3 (GPC3); антигена 5, подобного Fc-рецептору (FCRL5); и полипептида 1, подобного иммуноглобулину лямбда (IGLL1).

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен содержит одну, две, три (например, все три) CDR тяжелой цепи, CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC, из антитела, приведенного выше, и/или одну, две, три (например, все три) CDR легкой цепи, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC, из антитела, приведенного выше. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен содержит вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи антитела, указанного или описанного выше.

В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий опухолевый антиген, представляет собой фрагмент, например, одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv). В некоторых вариантах осуществления связывающий домен для антигена, ассоциированного с раком, описанного в данном документе, представляет собой Fv, Fab (Fab')2 или бифункциональное (например, биспецифическое) гибридное антитело (например, Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)). В некоторых вариантах осуществления антитела и их фрагменты по настоящему изобретению связываются с белком, представляющим собой антиген, ассоциированный с раком, описанный в данном документе, с аффинностью антител дикого типа или усиленной аффинностью.

В некоторых случаях scFv можно получить согласно способу, известному из уровня техники (см., например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426 и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Молекулы scFv можно получить путем связывания VH- и VL-областей друг с другом с помощью гибких полипептидных линкеров. Молекулы scFv содержат линкер (например, линкер Ser-Gly) с оптимизированными длиной и/или аминокислотным составом. Длина линкера может сильно влиять на укладку и взаимодействие вариабельных областей scFv. В действительности, если используют короткий полипептидный линкер (например, длиной 5-10 аминокислот), то внутрицепочечное сворачивание предотвращается. Межцепочечное сворачивание также необходимо для объединения двух вариабельных областей вместе с образованием функционального эпитопсвязывающего участка. Примеры ориентации и размера линкеров см., например, в Hollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448, публикациях заявок на патент США №№ 2005/0100543, 2005/0175606, 2007/0014794 и публикациях согласно PCT №№ WO2006/020258 и WO2007/024715, которые включены в данный документ посредством ссылки.

ScFv может содержать линкер из по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, или более аминокислотных остатков между его VL- и VH-областями. Линкерная последовательность может содержать любую встречающуюся в природе аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления линкерная последовательность содержит аминокислоты глицин и серин. В некоторых вариантах осуществления линкерная последовательность содержит группы глициновых и сериновых повторов, таких как (Gly₄Ser)n, где n представляет собой положительное целое число, равное 1 или больше (SEQ ID NO: 25). В некоторых вариантах осуществления линкер может представлять собой (Gly₄Ser)₄ (SEQ ID NO: 27) или (Gly₄Ser)₃(SEQ ID NO: 28). При изменении длины линкера может сохраняться или усиливаться активность, что приводит к улучшению эффективности в исследованиях активности.

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен представляет собой T-клеточный рецептор ("TCR") или его фрагмент, например одноцепочечный TCR (scTCR). Способы получения таких TCR известны из уровня техники. См., например, Willemsen RA et al, Gene Therapy 7: 1369-1377 (2000); Zhang T et al, Cancer Gene Ther 11: 487-496 (2004); Aggen et al, Gene Ther. 19(4):365-74 (2012) (литературные источники включены в данный документ во всей своей полноте). Например, может быть сконструирован scTCR, который содержит гены Vα и Vβ из клона Т-клеток, связанные с помощью линкера (например, гибкого пептида). Данный подход является весьма применимым для мишени, ассоциированной с раком, которая сама по себе является внутриклеточной, однако фрагмент такого антигена (пептида) презентируется на поверхности раковых клеток с помощью MHC.

Трансмембранный домен

Что касается трансмембранного домена, в различных вариантах осуществления CAR можно разработать таким образом, чтобы он содержал трансмембранный домен, присоединенный к внеклеточному домену CAR. Трансмембранный домен может содержать одну или несколько дополнительных аминокислот, прилегающих к трансмембранной области, например, одну или несколько аминокислот, относящихся к внеклеточной области белка, из которого получен трансмембранный домен (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и до 15 аминокислот внеклеточной области), и/или одну или несколько дополнительных аминокислот, относящихся к внутриклеточной области белка, из которого получен трансмембранный домен (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и до 15 аминокислот внутриклеточной области). В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен представляет собой домен, ассоциированный с одним из остальных используемых доменов CAR. В некоторых случаях трансмембранный домен можно выбрать или модифицировать с помощью аминокислотной замены, чтобы избежать связывания таких доменов с трансмембранными доменами тех же или других поверхностных мембранных белков, например, чтобы свести к минимуму взаимодействия с другими элементами рецепторного комплекса. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен способен к гомодимеризации с другим CAR на поверхности клетки, экспрессирующей CAR, например, CART-клетки. В некоторых вариантах осуществления аминокислотную последовательность трансмембранного домена можно модифицировать или подвергнуть замене таким образом, чтобы свести к минимуму взаимодействия со связывающими доменами нативного партнера по связыванию, присутствующего в той же клетке, экспрессирующей CAR, например, CART.

Трансмембранный домен может быть получен из природного либо из рекомбинантного источника. Если источник является природным, то домен может быть получен из любого мембраносвязанного или трансмембранного белка. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен способен передавать сигнал внутриклеточному(внутриклеточным) домену(доменам) всякий раз, когда CAR связался с мишенью. Трансмембранный домен, особенно применимый в настоящем изобретении, может включать по меньшей мере трансмембранную(трансмембранные) область(области), например, альфа-, бета- или дзета-цепи Т-клеточного рецептора, CD28, CD3-эпсилон, CD45, CD4, CD5, CD8 (например, CD8-альфа, CD8-бета), CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен может содержать по меньшей мере трансмембранную(трансмембранные) область(области) костимулирующей молекулы, например молекулы MHC I класса, белковых рецепторов TNF, иммуноглобулиноподобных белков, рецепторов цитокинов, интегринов, сигнальных молекул активации лимфоцитов (белки SLAM), активирующих рецепторов NK-клеток, BTLA, лиганда Toll-подобного рецептора, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8-альфа, CD8-бета, IL2R-бета, IL2R-гамма, IL7R-альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a и лиганда, который специфично связывается с CD83.

В некоторых случаях трансмембранный домен может быть присоединен к внеклеточной области CAR, например, антигенсвязывающему домену CAR, с помощью шарнирной области, например шарнирной области из белка человека. Например, в некоторых вариантах осуществления шарнирная область может представлять собой шарнирную область Ig (иммуноглобулина) человека, например шарнирную область IgG4 или шарнирную область CD8a. В некоторых вариантах осуществления шарнирная область или спейсер содержат аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2 (например, состоят из нее). В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен содержит трансмембранный домен под SEQ ID NO: 6.

В некоторых вариантах осуществления шарнирная область или спейсер содержат шарнирную область IgG4. Например, в некоторых вариантах осуществления шарнирная область или спейсер содержат шарнирную область под SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления шарнирная область или спейсер включают шарнирную область, кодируемую нуклеотидной последовательностью под SEQ ID NO: 14.

В некоторых вариантах осуществления шарнирная область или спейсер содержат шарнирную область IgD. Например, в некоторых вариантах осуществления шарнирная область или спейсер содержат шарнирную область с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления шарнирная область или спейсер включают шарнирную область, кодируемую нуклеотидной последовательностью под SEQ ID NO:15.

В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен может быть рекомбинантным, и в этом случае он будет содержать главным образом гидрофобные остатки, такие как лейцин и валин. В некоторых вариантах осуществления на каждом конце рекомбинантного трансмембранного домена может находиться триплет из фенилаланина, триптофана и валина.

Короткий олиго- или полипептидный линкер длиной от 2 до 10 аминокислот необязательно может образовывать связь между трансмембранным доменом и цитоплазматической областью CAR. Глицин-сериновый дублет представляет собой особенно подходящий линкер. Например, в некоторых вариантах осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления линкер кодируется нуклеотидной последовательностью под SEQ ID NO: 16.

В некоторых вариантах осуществления шарнирная область или спейсер содержат шарнирную область KIR2DS2.

Цитоплазматический домен

Цитоплазматические домен или область CAR по настоящему изобретению содержат внутриклеточный сигнальный домен. Внутриклеточный сигнальный домен обычно отвечает за активацию по меньшей мере одной из нормальных эффекторных функций иммунной клетки, в которую был введен CAR.

Примеры внутриклеточных сигнальных доменов для применения в CAR по настоящему изобретению включают цитоплазматические последовательности Т-клеточного рецептора (TCR) и корецепторов, которые действуют совместно с инициированием передачи сигнала после вступления в контакт с антигенным рецептором, а также любое производное или вариант этих последовательностей и любую рекомбинантную последовательность, которая обладает такими же функциональными способностями.

Известно, что сигналы, образуемые при участии только TCR, являются недостаточными для полной активации Т-клетки, и что также необходим вторичный и/или костимулирующий сигнал. Таким образом, можно сказать, что активация Т-клеток опосредуется двумя различными классами цитоплазматических сигнальных последовательностей: теми, которые инициируют антигензависимую первичную активацию посредством TCR (первичные внутриклеточные сигнальные домены), и теми, которые действуют антигеннезависимым образом, передавая вторичный или костимулирующий сигнал (вторичный цитоплазматический домен, например костимулирующий домен).

Первичный сигнальный домен регулирует первичную активацию комплекса TCR стимулирующим образом либо ингибирующим образом. Первичные внутриклеточные сигнальные домены, которые действуют стимулирующим образом, могут содержать сигнальные мотивы, известные как иммунорецепторные тирозиновые активирующие мотивы или ITAM.

Примеры первичных внутриклеточных сигнальных доменов, содержащих ITAM, которые являются особенно применимыми в настоящем изобретении, включают домены из TCR-дзета, FcR-гамма, FcR-бета, CD3-гамма, CD3-дельта, CD3-эпсилон, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 (также известного как "ICOS"), FcεRI, DAP10, DAP12 и CD66d. В некоторых вариантах осуществления CAR по настоящему изобретению содержит внутриклеточный сигнальный домен, например первичный сигнальный домен CD3-дзета.

В некоторых вариантах осуществления первичный сигнальный домен содержит модифицированный домен ITAM, например мутантный домен ITAM, который обладает измененной (например, повышенной или пониженной) активностью по сравнению с нативным доменом ITAM. В некоторых вариантах осуществления первичный сигнальный домен содержит модифицированный ITAM-содержащий первичный внутриклеточный сигнальный домен, например оптимизированный и/или усеченный ITAM-содержащий первичный внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления первичный сигнальный домен содержит один, два, три, четыре или больше мотивов ITAM.

Дополнительные примеры молекул, содержащих первичный внутриклеточный сигнальный домен, являющихся особенно применимыми в настоящем изобретении, включают молекулы DAP10, DAP12 и CD32.

Внутриклеточный сигнальный домен CAR может содержать первичный сигнальный домен, например сигнальный домен CD3-дзета, в отдельности или в комбинации с любым(любыми) другим(другими) требуемым(требуемыми) внутриклеточным(внутриклеточными) сигнальным(сигнальными) доменом(доменами), применимым(применимыми) в качестве составной части CAR по настоящему изобретению. Например, внутриклеточный сигнальный домен CAR может содержать первичный сигнальный домен, например часть дзета-цепи CD3, и костимулирующий сигнальный домен. Костимулирующий сигнальный домен относится к части CAR, содержащей внутриклеточный домен костимулирующей молекулы. Костимулирующая молекула представляет собой молекулу поверхности клетки, отличную от антигенного рецептора или его лигандов, которая необходима для эффективного ответа лимфоцитов на антиген. Примеры такой молекулы включают молекулу MHC I класса, белковые рецепторы TNF, иммуноглобулиноподобные белки, рецепторы цитокинов, интегрины, сигнальные молекулы активации лимфоцитов (белки SLAM), активирующие рецепторы NK-клеток, BTLA, лиганд Toll-подобного рецептора, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8-альфа, CD8-бета, IL2R-бета, IL2R-гамма, IL7R-альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NКG2D, NКG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a и лиганд, который специфично связывается с CD83, и т. п. Например, было продемонстрировано, что костимуляция с помощью CD27 усиливает размножение, эффекторную функцию и выживание CAR-T-клеток человека in vitro и усиливает персистенцию и противоопухолевую активность T-клеток человека in vivo (Song et al. Blood. 2012; 119(3):696-706). Внутриклеточные сигнальные последовательности в цитоплазматической части CAR по настоящему изобретению могут быть связаны друг с другом в случайном или установленном порядке. Короткий олиго- или полипептидный линкер, например, длиной от 2 до 10 аминокислот (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот) необязательно может образовывать связь между внутриклеточными сигнальными последовательностями. В некоторых вариантах осуществления в качестве подходящего линкера может применяться глицин-сериновый дублет. В некоторых вариантах осуществления в качестве подходящего линкера может применяться одна аминокислота, например аланин, глицин.

В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен разработан таким образом, что он содержит два или более, например 2, 3, 4, 5 или более, костимулирующих сигнальных доменов. В некоторых вариантах осуществления два или более, например 2, 3, 4, 5 или более, костимулирующих сигнальных доменов разделены линкерной молекулой, например линкерной молекулой, описанной в данном документе. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит два костимулирующих сигнальных домена. В некоторых вариантах осуществления линкерная молекула представляет собой глициновый остаток. В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой аланиновый остаток.

В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен сконструирован таким образом, что он содержит сигнальный домен CD3-дзета и сигнальный домен CD28. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен сконструирован таким образом, что он содержит сигнальный домен CD3-дзета и сигнальный домен 4-1BB. В некоторых вариантах осуществления сигнальный домен 4-1BB представляет собой сигнальный домен под SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления сигнальный домен CD3-дзета представляет собой сигнальный домен под SEQ ID NO: 9 (мутантный CD3-дзета) или SEQ ID NO: 10 (CD3-дзета человека дикого типа).

В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен сконструирован таким образом, что он содержит сигнальный домен CD3-дзета и сигнальный домен CD27. В некоторых вариантах осуществления сигнальный домен CD27 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах осуществления сигнальный домен CD27 кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 19.

В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный домен сконструирован таким образом, что он содержит сигнальный домен CD3-дзета и сигнальный домен CD28. В некоторых вариантах осуществления сигнальный домен CD28 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 36. В некоторых вариантах осуществления сигнальный домен CD28 кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 37.

В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный домен сконструирован таким образом, что он содержит сигнальный домен CD3-дзета и сигнальный домен ICOS. В некоторых вариантах осуществления сигнальный домен ICOS содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 38. В некоторых вариантах осуществления сигнальный домен ICOS кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 39.

Совместная экспрессия CAR с другими молекулами или средствами

Совместная экспрессия второго CAR

В некоторых вариантах осуществления клетка, экспрессирующая CAR, описанная в данном документе, может дополнительно содержать второй CAR, например второй CAR, который содержит другой антигенсвязывающий домен, например, для той же мишени (например, CD19) или другой мишени (например, для мишени, отличной от CD19, например мишени, описанной в данном документе). В некоторых вариантах осуществления клетка, экспрессирующая CAR, содержит первый CAR, который нацеливается на первый антиген и включает внутриклеточный сигнальный домен, имеющий костимулирующий сигнальный домен, но не первичный сигнальный домен, и второй CAR, который нацеливается на второй, другой антиген и включает внутриклеточный сигнальный домен, имеющий первичный сигнальный домен, но не костимулирующий сигнальный домен. Размещение костимулирующего сигнального домена, например 4-1BB, CD28, CD27, OX-40 или ICOS, в первом CAR и первичного сигнального домена, например CD3-дзета, во втором CAR может ограничивать активность CAR клетками, в которых экспрессируются обе мишени. В некоторых вариантах осуществления клетка, экспрессирующая CAR, содержит первый CAR, который содержит антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и костимулирующий домен, и второй CAR, который нацеливается на другой антиген и содержит антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и первичный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления клетка, экспрессирующая CAR, содержит первый CAR, который содержит антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и первичный сигнальный домен, и второй CAR, который нацеливается на другой антиген и содержит антигенсвязывающий домен для антигена, трансмембранный домен и костимулирующий сигнальный домен.

В некоторых вариантах осуществления клетка, экспрессирующая CAR, содержит XCAR, описанный в данном документе, и ингибирующий CAR. В некоторых вариантах осуществления ингибирующий CAR содержит антигенсвязывающий домен, который связывается с антигеном, обнаруживаемым на нормальных клетках, но не на раковых клетках, например на нормальных клетках, которые также экспрессируют X. В некоторых вариантах осуществления ингибирующий CAR содержит антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный домен ингибирующей молекулы. Например, внутриклеточный домен ингибирующего CAR может представлять собой внутриклеточный домен PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, молекулы MHC I класса, молекулы MHC II класса, GAL9, аденозина и TGF (например, TGF-бета).

В некоторых вариантах осуществления в случае, если клетка, экспрессирующая CAR, содержит два или более различных CAR, то антигенсвязывающие домены различных CAR могут быть такими, что антигенсвязывающие домены не взаимодействуют друг с другом. Например, клетка, экспрессирующая первый и второй CAR, может иметь антигенсвязывающий домен первого CAR, например, в качестве фрагмента, например scFv, который не ассоциирует с антигенсвязывающим доменом второго CAR, например антигенсвязывающий домен второго CAR представляет собой VHH.

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен содержит однодоменные антигенсвязывающие (SDAB) молекулы, в том числе молекулы, определяющие комплементарность области, которых являются частью однодоменного полипептида. Примеры включают без ограничения вариабельные домены тяжелых цепей, связывающие молекулы, в природных условиях лишенные легких цепей, отдельные домены, полученные из традиционных 4-цепочечных антител, сконструированные домены и однодоменные каркасные структуры, отличные от полученных из антител. Молекулы SDAB могут являться любыми молекулами, известными из уровня техники, или любыми однодоменными молекулами, которые будут известны в будущем. Молекулы SDAB могут быть получены из любых видов, в том числе без ограничения из мыши, человека, верблюда, ламы, миноги, рыбы, акулы, козы, кролика и быка. Этот термин также охватывает встречающиеся в природе молекулы однодоменных антител из видов, отличных от Camelidae и акул.

В некоторых вариантах осуществления молекула SDAB может быть получена из вариабельной области иммуноглобулина, обнаруживаемого у рыб, как например та, которая получена из изотипа иммуноглобулина, известного как новый антигенный рецептор (NAR), обнаруживаемого в сыворотке крови акулы. Способы получения однодоменных молекул, получаемых из вариабельной области NAR ("IgNAR") описаны в WO 03/014161 и Streltsov (2005) Protein Sci. 14:2901-2909.

В некоторых вариантах осуществления молекула SDAB представляет собой встречающуюся в природе однодоменную антигенсвязывающую молекулу, известную как тяжелая цепь, лишенная легких цепей. Такие однодоменные молекулы раскрыты, например, в WO 9404678 и Hamers-Casterman, C. et al. (1993) Nature 363:446-448. В целях ясности этот вариабельный домен, полученный из молекулы тяжелой цепи, в природных условиях лишенной легкой цепи, именуется в данном документе как VHH или нанотело, чтобы отличать его от традиционного VH четырехцепочечных иммуноглобулинов. Такую молекулу VHH можно получить от видов Camelidae, например, от верблюда, ламы, дромадера, альпаки и гуанако. Другие виды, помимо Camelidae, могут вырабатывать молекулы тяжелых цепей, в природных условиях лишенные легкой цепи; такие VHH входят в объем настоящего изобретения.

Молекулы SDAB могут быть рекомбинантными, с пересаженными CDR, гуманизированными, камелизированными, деиммунизированными и/или полученными in vitro (например, отобранными с помощью фагового дисплея).

Также было обнаружено, что в клетках, имеющих множество встроенных в мембрану химерных рецепторов, содержащих антигенсвязывающий домен, взаимодействия между антигенсвязывающими доменами рецепторов могут быть нежелательными, например, поскольку они ингибируют способность одного или нескольких антигенсвязывающих доменов связываться с их когнатными антигенами. Соответственно, в данном документе раскрыты клетки, имеющие первый и второй не встречающиеся в природе химерные рецепторы, встроенные в мембрану, содержащие антигенсвязывающие домены, для которых сведены к минимуму такие взаимодействия. Также в данном документе раскрыты нуклеиновые кислоты, кодирующие первый и второй не встречающиеся в природе химерные рецепторы, встроенные в мембрану, содержащие антигенсвязывающие домены, для которых сведены к минимуму такие взаимодействия, а также способы получения и применения таких клеток и нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен одного из первого и второго не встречающегося в природе химерного рецептора, встроенного в мембрану, содержит scFv, а другой содержит отдельный VH-домен, например отдельный VH-домен верблюдовых, акулы или миноги, или отдельный VH-домен, полученный из последовательности человека или мыши.

В некоторых вариантах осуществления композиция, описанная в данном документе, содержит первый и второй CAR, где антигенсвязывающий домен одного из первого и второго CAR не содержит вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен одного из первого и второго CAR представляет собой scFv, а другой не представляет собой scFv. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен одного из первого и второго CAR содержит отдельный VH-домен, например отдельный VH-домен верблюдовых, акулы или миноги, или отдельный VH-домен, полученный из последовательности человека или мыши. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен одного из первого и второго CAR содержит нанотело. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен одного из первого и второго CAR содержит VHH-домен верблюдовых.

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен одного из первого и второго CAR содержит scFv, а другой содержит отдельный VH-домен, например отдельный VH-домен верблюдовых, акулы или миноги, или отдельный VH-домен, полученный из последовательности человека или мыши. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен одного из первого и второго CAR содержит scFv, а другой содержит нанотело. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен одного из первого и второго CAR содержит scFv, а другой содержит VHH-домен верблюдовых.

В некоторых вариантах осуществления связывание антигенсвязывающего домена первого CAR при наличии его на поверхности клетки со своим когнатным антигеном существенно не снижается из-за наличия второго CAR. В некоторых вариантах осуществления связывание антигенсвязывающего домена первого CAR со своим когнатным антигеном в присутствии второго CAR составляет по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, например 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, от связывания антигенсвязывающего домена первого CAR со своим когнатным антигеном в отсутствие второго CAR.

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающие домены первого и второго CAR при наличии их на поверхности клетки ассоциируют друг с другом в меньшей степени, чем в случае, если бы оба они являлись антигенсвязывающими scFv-доменами. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающие домены первого и второго CAR ассоциируют друг с другом в степени, на по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% меньшей, например 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% меньшей, чем в случае, если бы оба они являлись антигенсвязывающими scFv-доменами.

Совместная экспрессия средства, усиливающего активность CAR

В некоторых вариантах осуществления клетка, экспрессирующая CAR, описываемая в данном документе, может дополнительно экспрессировать другое средство, например средство, усиливающее активность или приспособленность клетки, экспрессирующей CAR.

Например, в некоторых вариантах осуществления данное средство может представлять собой средство, ингибирующее молекулу, которая модулирует или регулирует, например ингибирует, функцию Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления молекула, которая модулирует или регулирует функцию Т-клеток, представляет собой ингибирующую молекулу. Ингибирующие молекулы, например PD1, в некоторых вариантах осуществления могут снижать способность клеток, экспрессирующих CAR, осуществлять иммунный эффекторный ответ. Примеры ингибирующих молекул включают PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, MHC I класса, MHC II класса, GAL9, аденозин или TGF-бета.

В ряде вариантов осуществления средство, например ингибирующую нуклеиновую кислоту, например dsRNA, например siRNA или shRNA; или, например, ингибирующие белок или систему, например короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами (CRISPR), эффекторную нуклеазу, подобную активаторам транскрипции (TALEN), или эндонуклеазу с "цинковыми пальцами" (ZFN), например, описываемые в данном документе, можно применять для ингибирования экспрессии молекулы, которая модулирует или регулирует, например ингибирует, Т-клеточную функцию в клетке, экспрессирующей CAR. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой shRNA, например shRNA, описываемую в данном документе. В некоторых вариантах осуществления средство, которое модулирует или регулирует, например ингибирует, функцию Т-клеток, ингибируется в клетке, экспрессирующей CAR. Например, молекула dsRNA, ингибирующая экспрессию молекулы, которая модулирует или регулирует, например ингибирует, функцию Т-клеток, связана с нуклеиновой кислотой, которая кодирует компонент, например все компоненты, CAR.

В некоторых вариантах осуществления средство, которое ингибирует ингибирующую молекулу, содержит первый полипептид, например ингибирующую молекулу, ассоциированный со вторым полипептидом, который обеспечивает положительный сигнал для клетки, например внутриклеточный сигнальный домен, описанный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления средство содержит первый полипептид, например ингибирующую молекулу, такую как PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, молекула MHC I класса, молекула MHC II класса, GAL9, аденозин или TGF-бета или фрагмент любого из них (например, по меньшей мере часть внеклеточного домена любого из них), и второй полипептид, который представляет собой внутриклеточный сигнальный домен, описанный в данном документе (например, содержащий костимулирующий домен (например, 41BB, CD27 или CD28, например, описанные в данном документе) и/или первичный сигнальный домен (например, сигнальный домен CD3-дзета, описанный в данном документе)). В некоторых вариантах осуществления средство содержит первый полипептид PD1 или его фрагмент (например, по меньшей мере часть внеклеточного домена PD1) и второй полипептид внутриклеточного сигнального домена, описанный в данном документе (например, сигнальный домен CD28, описанный в данном документе, и/или сигнальный домен CD3-дзета, описанный в данном документе). PD1 является ингибирующим представителем семейства рецепторов CD28, которое также включает CD28, CTLA-4, ICOS и BTLA. PD-1 экспрессируется на активированных B-клетках, T-клетках и миелоидных клетках (Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75). Было показано, что два лиганда PD1, PD-L1 и PD-L2 подавляют активацию Т-клеток при связывании с PD1 (Freeman et a. 2000 J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43). PD-L1 является широко распространенным при различных формах рака у человека (Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7; Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094). Иммуносупрессию можно устранить путем ингибирования локального взаимодействия PD1 с PD-L1.

В некоторых вариантах осуществления средство, содержащее внеклеточный домен (ECD) ингибирующей молекулы, например белка запрограммированной смерти клетки 1 (PD1), может быть слито с трансмембранным доменом и внутриклеточными сигнальными доменами, такими как 41BB и CD3-дзета (также называемое в данном документе CAR на основе PD1). В некоторых вариантах осуществления CAR на основе PD1 при использовании в комбинации с XCAR, описанным в данном документе, улучшает персистенцию Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления CAR представляет собой CAR на основе PD1, содержащий внеклеточный домен PD1, указанный подчеркиванием в SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления CAR на основе PD1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 24.

В некоторых вариантах осуществления CAR на основе PD1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 22.

В некоторых вариантах осуществления средство содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR на основе PD1, например CAR на основе PD1, описанный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты для CAR на основе PD1 представлена под SEQ ID NO: 23, при этом ECD PD1 подчеркнут.

В другом примере в некоторых вариантах осуществления средство, которое усиливает активность клетки, экспрессирующей CAR, может представлять собой костимулирующую молекулу или лиганд костимулирующей молекулы. Примеры костимулирующих молекул включают молекулу MHC I класса, BTLA и лиганд Toll-подобного рецептора, а также OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278) и 4-1BB (CD137). Дополнительные примеры таких костимулирующих молекул включают CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, CD4, CD8-альфа, CD8-бета, IL2R-бета, IL2R-гамма, IL7R-альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a и лиганд, который специфично связывается с CD83, например, описанные в данном документе. Примеры лигандов костимулирующих молекул включают CD80, CD86, CD40L, ICOSL, CD70, OX40L, 4-1BBL, GITRL и LIGHT. В ряде вариантов осуществления лиганд костимулирующей молекулы является лигандом костимулирующей молекулы, отличной от костимулирующей молекулы, домен которой используется в CAR. В ряде вариантов осуществления лиганд костимулирующей молекулы является лигандом той же костимулирующей молекулы, что и костимулирующая молекула, домен которой используется в CAR. В некоторых вариантах осуществления лиганд костимулирующей молекулы представляет собой 4-1BBL. В одном варианте осуществления лиганд костимулирующей молекулы представляет собой CD80 или CD86. В некоторых вариантах осуществления лиганд костимулирующей молекулы представляет собой CD70. В ряде вариантов осуществления иммунная эффекторная клетка, экспрессирующая CAR, описанная в данном документе, может быть дополнительно сконструирована таким образом, чтобы она экспрессировала одну или несколько дополнительных костимулирующих молекул или лигандов костимулирующих молекул.

Совместная экспрессия CAR с рецептором хемокина

В ряде вариантов осуществления клетка, экспрессирующая CAR, описанная в данном документе, например клетка, экспрессирующая CAR для CD19, дополнительно содержит молекулу рецептора хемокина. Трансгенная экспрессия рецепторов хемокинов CCR2b или CXCR2 в Т-клетках усиливает их миграцию к солидным опухолям, секретирующим CCL2 или CXCL1, в том числе к меланоме и нейробластоме (Craddock et al., J Immunother. 2010 Oct; 33(8):780-8 и Kershaw et al., Hum Gene Ther. 2002 Nov 1; 13(16):1971-80). Таким образом, не ограничиваясь теорией, полагают, что рецепторы хемокинов, экспрессируемые в клетках, экспрессирующих CAR, которые распознают хемокины, секретируемые опухолями, например солидными опухолями, могут улучшать "хоуминг" клетки, экспрессирующей CAR, в опухоль, облегчать инфильтрацию клетки, экспрессирующей CAR, в опухоль и усиливают противоопухолевую эффективность клетки, экспрессирующей CAR. Молекула рецептора хемокина может содержать встречающийся в природе или рекомбинантный рецептор хемокина или его хемокинсвязывающий фрагмент. Молекула рецептора хемокина, подходящая для экспрессии в клетке, экспрессирующей CAR (например, CAR-Tx), описанной в данном документе, включает рецептор хемокина CXC (например, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6 или CXCR7), рецептор хемокина CC (например, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10 или CCR11), рецептор хемокина CX3C (например, CX3CR1), рецептор хемокина XC (например, XCR1) или их хемокинсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления молекулу рецептора хемокина, которая должна экспрессироваться вместе с CAR, описанным в данном документе, выбирают с учетом хемокина(хемокинов), секретируемых опухолью. В некоторых вариантах осуществления клетка, экспрессирующая CAR, описанная в данном документе, дополнительно содержит, например экспрессирует, рецептор CCR2b или рецептор CXCR2. В некоторых вариантах осуществления CAR, описанный в данном документе, и молекула рецептора хемокина находятся в одном и том же векторе или находятся в двух разных векторах. В ряде вариантов осуществления, в которых CAR, описанный в данном документе, и молекула рецептора хемокина находятся в одном и том же векторе, CAR и молекула рецептора хемокина находятся под контролем двух разных промоторов или находятся под контролем одного и того же промотора.

Конструкции нуклеиновых кислот, кодирующие CAR

Настоящее изобретение также предусматривает иммунную эффекторную клетку, например, полученную посредством способа, описанного в данном документе, которая содержит молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие одну или несколько конструкций CAR, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты представлена в виде транскрипта, представляющего собой матричную РНК. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты представлена в виде конструкции ДНК.

Молекулы нуклеиновой кислоты, описанные в данном документе, могут представлять собой молекулу ДНК, молекулу РНК или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты представляет собой мРНК, кодирующую полипептид CAR, описанный в данном документе. В других вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты представляет собой вектор, который содержит любую из вышеуказанных молекул нуклеиновой кислоты.

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен CAR по настоящему изобретению (например, scFv) кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, последовательность которой была кодон-оптимизирована для экспрессии в клетке млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления целая конструкция CAR по настоящему изобретению кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, целая последовательность которой была кодон-оптимизирована для экспрессии в клетке млекопитающего. Оптимизация кодонов относится к обнаружению того, что частота встречаемости синонимичных кодонов (т. е. кодонов, кодирующих одну и ту же аминокислоту) в кодирующей ДНК смещена у разных видов. Такая вырожденность кодонов обеспечивает возможность кодирования идентичного полипептида различными нуклеотидными последовательностями. Из уровня техники известны различные способы оптимизации кодонов, и они включают, например, способы, раскрытые по меньшей мере в патентах США №№ 5786464 и 6114148.

Соответственно, в некоторых вариантах осуществления иммунная эффекторная клетка, например, полученная посредством способа, описанного в данном документе, содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую химерный антигенный рецептор (CAR), где CAR содержит антигенсвязывающий домен, который связывается с опухолевым антигеном, описанным в данном документе, трансмембранный домен (например, трансмембранный домен, описанный в данном документе) и внутриклеточный сигнальный домен (например, внутриклеточный сигнальный домен, описанный в данном документе), содержащий стимулирующий домен, например костимулирующий сигнальный домен (например, костимулирующий сигнальный домен, описанный в данном документе), и/или первичный сигнальный домен (например, первичный сигнальный домен, описанный в данном документе, например дзета-цепь, описанную в данном документе).

Настоящее изобретение также предусматривает векторы, в которые вставлена молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая CAR, например молекула нуклеиновой кислоты, описанная в данном документе. Векторы, полученные из ретровирусов, таких как лентивирус, являются подходящими инструментами для достижения долгосрочного переноса генов, поскольку они обеспечивают долгосрочную стабильную интеграцию трансгена и его размножение в дочерних клетках. Лентивирусные векторы обладают дополнительным преимуществом по сравнению с векторами, полученными из онкоретровирусов, таких как вирусы лейкоза мышей, заключающимся в том, что ими можно трансдуцировать непролиферирующие клетки, такие как гепатоциты. Они также обладают дополнительным преимуществом низкой иммуногенности. Ретровирусный вектор также может представлять собой, например, гамма-ретровирусный вектор. Гамма-ретровирусный вектор может содержать, например, промотор, сигнал упаковки (ψ), сайт связывания праймера (PBS), один или несколько (например, два) длинных концевых повторов (LTR) и трансген, представляющий интерес, например ген, кодирующий CAR. В гамма-ретровирусном векторе могут отсутствовать структурные гены вирусов, такие как gag, pol и env. Иллюстративные гамма-ретровирусные векторы включают вирус лейкоза мышей (MLV), вирус некроза селезенки (SFFV) и вирус миелопролиферативной саркомы (MPSV), а также векторы, полученные из них. Другие гамма-ретровирусные векторы описаны, например, в Tobias Maetzig et al., "Gammaretroviral Vectors: Biology, Technology and Application" Viruses. 2011 Jun; 3(6): 677-713.

В некоторых вариантах осуществления вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую требуемый CAR, представляет собой аденовирусный вектор (A5/35). В некоторых вариантах осуществления экспрессии нуклеиновых кислот, кодирующих CAR, можно достичь с помощью транспозонов, таких как "спящая красавица", CRISPR, CAS9 и нуклеазы с "цинковыми пальцами". См. ниже June et al. 2009, Nature Reviews Immunology 9.10: 704-716, включенную в данный документ посредством ссылки.

Вкратце, экспрессия природных или синтетических нуклеиновых кислот, кодирующих CAR, как правило, достигается путем образования функциональной связи нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид CAR или его части, с промотором и включения конструкции в состав экспрессионного вектора. Векторы могут подходить для репликации и интеграции у эукариот. Типичные клонирующие векторы содержат терминаторы транскрипции и трансляции, последовательности инициации и промоторы, применимые для регуляции экспрессии необходимой последовательности нуклеиновой кислоты.

Нуклеиновую кислоту можно клонировать в векторы множества типов. Например, нуклеиновую кислоту можно клонировать в вектор, включающий без ограничения плазмиду, фагмиду, производное фага, вирус животных и космиду. Векторы, представляющие особый интерес, включают экспрессионные векторы, репликационные векторы, векторы для образования зондов и векторы для секвенирования.

Кроме того, экспрессионный вектор может предоставляться клетке в форме вирусного вектора. Технология вирусных векторов хорошо известна из уровня техники и описана, например, в Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, тома 1-4, Cold Spring Harbor Press, Нью-Йорк, и в других руководствах по вирусологии и молекулярной биологии. Вирусы, применимые в качестве векторов, включают без ограничения ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, герпесвирусы и лентивирусы. Как правило, подходящий вектор содержит точку начала репликации, функционирующую в по меньшей мере одном организме, промоторную последовательность, подходящие сайты для эндонуклеаз рестрикции и один или несколько селектируемых маркеров (например, WO 01/96584; WO 01/29058 и патент США № 6326193).

Для переноса генов в клетки млекопитающих был разработан целый ряд систем на основе вирусов. Например, ретровирусы обеспечивают удобную платформу для систем доставки генов. Выбранный ген можно вставить в вектор и упаковать в ретровирусные частицы с помощью методик, известных из уровня техники. Затем рекомбинантный вирус можно выделить и доставить в клетки субъекта in vivo либо ex vivo. Из уровня техники известен целый ряд ретровирусных систем. В некоторых вариантах осуществления применяются аденовирусные векторы. Из уровня техники известен целый ряд аденовирусных векторов. В некоторых вариантах осуществления применяют лентивирусные векторы.

Дополнительные промоторные элементы, например энхансеры, регулируют частоту начала транскрипции. Как правило, они расположены в области на 30-110 п. о. выше сайта начала, хотя было показано, что ряд промоторов также содержит функциональные элементы ниже сайта начала. Расстояние между промоторными элементами часто является гибким, так что промоторная функция сохраняется при инверсии элементов или их перемещении друг относительно друга. В промоторе гена тимидинкиназы (tk) расстояние между промоторными элементами можно увеличить до 50 п. о., прежде чем активность начнет снижаться. В зависимости от промотора оказывается, что отдельные элементы могут функционировать для активации транскрипции совместно либо независимо. Иллюстративные промоторы включают промоторы генов IE CMV, EF-1α, убиквитина С или фосфоглицерокиназы (PGK).

Примером промотора, который способен обеспечивать экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, в Т-клетке млекопитающего, является промотор EF1a. Нативный промотор EF1a управляет экспрессией альфа-субъединицы комплекса фактора элонгации-1, который отвечает за ферментативную доставку аминоацил-тРНК к рибосоме. Промотор EF1a широко использовался в экспрессионных плазмидах для млекопитающих и было показано, что он эффективно управляет экспрессией CAR с молекул нуклеиновой кислоты, клонированных в лентивирусный вектор. См., например, Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009). В некоторых вариантах осуществления промотор EF1a содержит последовательность, представленную в примерах.

Другим примером промотора является последовательность немедленно-раннего промотора цитомегаловируса (CMV). Эта промоторная последовательность является последовательностью сильного конститутивного промотора, способного управлять экспрессией любой полинуклеотидной последовательности, функционально связанной с ней, на высоких уровнях. Однако можно также использовать последовательности других конститутивных промоторов, в том числе без ограничения раннего промотора вируса обезьян 40 (SV40), промотора вируса опухоли молочной железы мышей (MMTV), промотора длинного концевого повтора (LTR) вируса иммунодефицита человека (HIV), промотора MoMuLV, промотора вируса лейкоза птиц, немедленно-раннего промотора вируса Эпштейна-Барр, промотора вируса саркомы Рауса, а также промоторы генов человека, такие как, без ограничения, промотор гена актина, промотор гена миозина, промотор гена фактора элонгации-1α, промотор гена гемоглобина и промотор гена креатинкиназы. Кроме того, настоящее изобретение не должно ограничиваться использованием конститутивных промоторов. Индуцируемые промоторы также рассматриваются как часть настоящего изобретения. Использование индуцируемого промотора обеспечивает наличие молекулярного переключателя, способного включать экспрессию полинуклеотидной последовательности, с которой он функционально связан, если такая экспрессия требуется, или отключать экспрессию, если экспрессия не требуется. Примеры индуцируемых промоторов включают без ограничения металлотионеин-индуцируемый промотор, глюкокортикоид-индуцируемый промотор, прогестерон-индуцируемый промотор и тетрациклин-индуцируемый промотор.

Другим примером промотора является промотор гена фосфоглицераткиназы (PGK). В ряде вариантов осуществления может быть необходим усеченный промотор гена PGK (например, промотор гена PGK с одной или несколькими, например 1, 2, 5, 10, 100, 200, 300 или 400, делециями нуклеотидов по сравнению с последовательностью промотора гена PGK дикого типа).

Нуклеотидные последовательности иллюстративных промоторов гена PGK представлены ниже.

Промотор гена PGK WT:

ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCGCGGCGACGCAAAGGGCCTTGGTGCGGGTCTCGTCGGCGCAGGGACGCGTTTGGGTCCCGACGGAACCTTTTCCGCGTTGGGGTTGGGGCACCATAAGCT (SEQ ID NO: 190)

Иллюстративные усеченные промоторы гена PGK:

PGK100:

ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTG (SEQ ID NO: 198)

PGK200:

ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACG (SEQ ID NO: 191)

PGK300:

ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCG (SEQ ID NO: 192)

PGK400:

ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCG (SEQ ID NO: 193)

Вектор также может содержать, например, сигнальную последовательность, содействующую секреции, сигнал полиаденилирования и терминатор транскрипции (например, из гена бычьего гормона роста (BGH)), элемент, обеспечивающий возможность эписомальной репликации и репликации у прокариот (например, точку начала репликации SV40 и ColE1 или другие, известные из уровня техники), и/или элементы для обеспечения возможности осуществления отбора (например, ген устойчивости к ампициллину и/или маркер устойчивости к зеоцину).

Для оценки экспрессии полипептида CAR или его частей экспрессионный вектор, который должен быть введен в клетку, также может содержать селектируемый маркерный ген или репортерный ген либо их оба для облегчения идентификации и отбора экспрессирующих клеток из популяции клеток, в отношении которых стремились провести трансфекцию или инфицирование посредством вирусных векторов. В некоторых вариантах осуществления селектируемый маркер может переноситься на отдельном фрагменте ДНК и использоваться в процедуре котрансфекции. Как селектируемые маркеры, так и репортерные гены могут быть фланкированы соответствующими регуляторными последовательностями для обеспечения экспрессии в клетках-хозяевах. Применимые селектируемые маркеры включают, например, гены устойчивости к антибиотикам, такие как neo и т. п.

Репортерные гены используют для идентификации потенциально трансфицированных клеток и для оценивания функциональных свойств регуляторных последовательностей. Как правило, репортерный ген представляет собой ген, который отсутствует или не экспрессируется в организме- или ткани-реципиенте и который кодирует полипептид, экспрессия которого проявляется в некотором легко выявляемом свойстве, например ферментативной активности. Экспрессию репортерного гена анализируют в подходящее время после введения ДНК в клетки-реципиенты. Подходящие репортерные гены могут включать гены, кодирующие люциферазу, бета-галактозидазу, хлорамфениколацетилтрансферазу, секретируемую щелочную фосфатазу, или ген зеленого флуоресцентного белка (например, Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82). Подходящие системы экспрессии хорошо известны и могут быть получены с помощью известных методик или приобретены коммерческим путем. Как правило, конструкцию с минимальной 5'-фланкирующей областью, демонстрирующую наивысший уровень экспрессии репортерного гена, идентифицируют как промотор. Такие промоторные области могут быть связаны с репортерным геном и использоваться для оценивания средств в отношении способности к модулированию транскрипции, управляемой промотором.

В ряде вариантов осуществления вектор может содержать две или более последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие CAR, например CAR, описанный в данном документе, например CAR для CD19, и второй CAR, например ингибирующий CAR или CAR, который специфично связывается с антигеном, отличным от CD19. В таких вариантах осуществления две или более последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие CAR, кодируются одной молекулой нуклеиновой кислоты в одной и той же рамке считывания и в виде одной полипептидной цепи. В некоторых вариантах осуществления два или более CAR могут, например, быть разделены одним или несколькими сайтами расщепления пептидов (например, сайтом саморасщепления или субстратом для внутриклеточной протеазы). Примеры сайтов расщепления пептидов включают сайты T2A, P2A, E2A или F2A.

Способы введения генов в клетку и обеспечения их экспрессии в ней известны из уровня техники. Что касается экспрессионного вектора, то вектор можно легко ввести в клетку-хозяина, например клетку млекопитающего, бактерии, дрожжей или насекомого, любым способом, например способом, известным из уровня техники. Например, экспрессионный вектор можно перенести в клетку-хозяина физическим, химическим или биологическим способом.

Физические способы введения полинуклеотида в клетку-хозяина включают осаждение фосфатом кальция, липофекцию, бомбардировку частицами, микроинъекцию, электропорацию и т. п. Способы получения клеток, содержащих векторы и/или экзогенные нуклеиновые кислоты, хорошо известны из уровня техники. См., например, Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, тома 1-4, Cold Spring Harbor Press, Нью-Йорк. Подходящим способом введения полинуклеотида в клетку-хозяина является трансфекция с использованием фосфата кальция.

Биологические способы введения полинуклеотида, представляющего интерес, в клетку-хозяина включают использование векторов на основе ДНК и РНК. Вирусные векторы, и особенно ретровирусные векторы, стали наиболее широко применяемым способом вставки генов в клетки млекопитающего, например человека. Другие вирусные векторы могут быть получены из лентивируса, поксвирусов, вируса простого герпеса I типа, аденовирусов и аденоассоциированных вирусов и т. п. См., например, патенты США №№ 5350674 и 5585362.

Химические средства для введения полинуклеотида в клетку-хозяина включают коллоидные дисперсные системы, такие как макромолекулярные комплексы, нанокапсулы, микросферы, гранулы и липидные системы, в том числе эмульсии типа "масло в воде", мицеллы, смешанные мицеллы и липосомы. Иллюстративной коллоидной системой для применения в качестве средства для доставки in vitro и in vivo является липосома (например, искусственная мембранная везикула). Из уровня техники доступны другие способы целенаправленной доставки нуклеиновых кислот, такие как доставка полинуклеотидов с помощью нацеливающихся наночастиц или другой подходящей системы доставки субмикронного размера.

В случае использования системы доставки, отличной от вирусной, иллюстративным средством для доставки является липосома. Для введения нуклеиновых кислот в клетку-хозяина (in vitro, ex vivo или in vivo) предполагается применение липидных составов. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота может быть ассоциирована с липидом. Нуклеиновая кислота, ассоциированная с липидом, может быть инкапсулированной в водной внутренней части липосомы, помещенной в липидный бислой липосомы, присоединенной к липосоме посредством связывающей молекулы, которая ассоциирована как с липосомой, так и с олигонуклеотидом, захваченной в липосому, образовывать комплекс с липосомой, быть диспергированной в растворе, содержащем липид, смешанной с липидом, объединенной с липидом, содержаться в виде суспензии в липиде, содержаться в мицелле или образовывать комплекс с ней или иным образом быть ассоциированной с липидом. Композиции для ассоциации на основе липидов, липидов/ДНК или липидов/экспрессионного вектора не ограничиваются какой-либо конкретной структурой в растворе. Например, они могут присутствовать в бислойной структуре, в виде мицелл или в "сжатой" структуре. Они также могут быть просто помещены в раствор, при этом по возможности образуют агрегаты, которые не являются однородными по размеру или форме. Липиды представляют собой жирные вещества, которые могут являться встречающимися в природе или синтетическими липидами. Например, липиды включают жировые капли, которые встречаются в природе в цитоплазме, а также класс соединений, который содержит длинноцепочечные алифатические углеводороды и их производные, такие как жирные кислоты, спирты, амины, аминоспирты и альдегиды.

Подходящие для применения липиды можно получить из коммерческих источников. Например, димиристилфосфатидилхолин ("DMPC") можно получить от Sigma, Сент-Луис, Миссури; дицетилфосфат ("DCP") можно получить от K & K Laboratories (Плейнвью, Нью-Йорк); холестерин ("Choi") можно получить от Calbiochem-Behring; димиристилфосфатидилглицерин ("DMPG") и другие липиды можно получить от Avanti Polar Lipids, Inc. (Бирмингем, Алабама). Исходные растворы липидов в хлороформе или хлороформе/метаноле можно хранить при температуре приблизительно -20ºC. Хлороформ используется в качестве единственного растворителя, поскольку он испаряется легче, чем метанол. "Липосома" является общим термином, охватывающим различные одно- и мультиламеллярные липидные носители, образованные путем формирования замкнутых липидных бислоев или агрегатов. Липосомы можно охарактеризовать как имеющие везикулярные структуры с фосфолипидной бислойной мембраной и внутренней водной средой. Мультиламеллярные липосомы имеют несколько липидных слоев, разделенных водной средой. Они образуются самопроизвольно при суспендировании фосфолипидов в избытке водного раствора. Липидные компоненты подвергаются самореорганизации перед образованием замкнутых структур и захватывают воду и растворенные вещества между липидными бислоями (Ghosh et al., 1991, Glycobiology 5: 505-10). Однако также охватываются композиции, которые в растворе имеют структуры, отличные от нормальной везикулярной структуры. Например, липиды могут принимать вид мицеллярной структуры или просто существовать в виде неоднородных агрегатов липидных молекул. Также предполагаются комплексы липофектамин-нуклеиновая кислота.

Чтобы подтвердить присутствие последовательности рекомбинантной нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине, можно проводить различные анализы, независимо от способа, применяемого для введения экзогенных нуклеиновых кислот в клетку-хозяина, или иного воздействия ингибитора по настоящему изобретению на клетку. Такие анализы включают, например, "молекулярно-биологические" анализы, хорошо известные специалистам в данной области техники, такие как саузерн- и нозерн-блоттинг, ОТ-ПЦР и ПЦР; "биохимические" анализы, такие как выявление присутствия или отсутствия конкретного пептида, например, с помощью иммунологических способов (ELISA и вестерн-блоттинга) или с помощью описанных в данном документе анализов для идентификации средств, находящихся в пределах объема настоящего изобретения.

CAR, содержащие рецепторы естественных клеток-киллеров (NKR)

В некоторых вариантах осуществления молекула CAR, описанная в данном документе, содержит один или несколько компонентов рецептора естественных клеток-киллеров (NKR), образуя таким образом NKR-CAR. Компонент NKR может представлять собой трансмембранный домен, шарнирный домен или цитоплазматический домен любого из следующих рецепторов естественных клеток-киллеров: иммуноглобулиноподобного рецептора клеток-киллеров (KIR), например KIR2DL1, KIR2DL2/L3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, DIR2DS5, KIR3DL1/S1, KIR3DL2, KIR3DL3, KIR2DP1 и KIR3DP1, рецептора естественной цитотоксичности (NCR), например NKp30, NKp44, NKp46; семейства рецепторов иммунных клеток, являющихся сигнальными молекулами активации лимфоцитов (SLAM), например CD48, CD229, 2B4, CD84, NTB-A, CRACC, BLAME и CD2F-10; Fc-рецептора (FcR), например CD16 и CD64; и рецепторов Ly49, например LY49A, LY49C. Молекулы NKR-CAR, описанные в данном документе, могут взаимодействовать с адапторной молекулой или внутриклеточным сигнальным доменом, например DAP12. Иллюстративные конфигурации и последовательности молекул CAR, содержащих компоненты NKR, описаны в международной публикации № WO2014/145252, содержание которой включено в данный документ посредством ссылки.

Разделенный CAR

В некоторых вариантах осуществления в клетке, экспрессирующей CAR, используется разделенный CAR. Подход с использованием разделенных CAR более подробно описан в публикациях WO2014/055442 и WO2014/055657. Вкратце, система разделенного CAR содержит клетку, экспрессирующую первый CAR, содержащий первый антигенсвязывающий домен и костимулирующий домен (например, 41BB), и эта клетка также экспрессирует второй CAR, содержащий второй антигенсвязывающий домен и внутриклеточный сигнальный домен (например, CD3-дзета). Когда клетка встречается с первым антигеном, то активируется костимулирующий домен, и клетка пролиферирует. Когда клетка встречается со вторым антигеном, то активируется внутриклеточный сигнальный домен, и запускается активность уничтожения клеток. Таким образом, клетка, экспрессирующая CAR, полностью активируется только в присутствии обоих антигенов.

Стратегии регуляции химерных антигенных рецепторов

В некоторых вариантах осуществления регулируемый CAR (RCAR), в котором можно контролировать активность CAR, является желательным для оптимизации безопасности и эффективности средства терапии на основе CAR. Существует множество путей, которыми можно регулировать формы активности CAR. Например, индуцируемый апоптоз с использованием, например, каспазы, слитой с димеризационным доменом (см., например, Di Stasa et al., N Engl. J. Med. 2011 Nov. 3; 365(18):1673-1683), можно применять в качестве защитного переключателя в средстве терапии на основе CAR по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления клетки (например, Т-клетки или NK-клетки), экспрессирующие CAR по настоящему изобретению, дополнительно содержат индуцируемый переключатель апоптоза, где каспаза человека (например, каспаза 9) или ее модифицированный вариант слиты с модифицированным вариантом белка FKB человека, что обеспечивает условную димеризацию. В присутствии малой молекулы, такой как рапалог (например, AP1903, AP20187), индуцируемая каспаза (например, каспаза 9) активируется и приводит к быстрому апоптозу и гибели клеток (например, Т-клеток или NK-клеток), экспрессирующих CAR по настоящему изобретению. Примеры индуцируемого переключателя апоптоза на основе каспазы (или одного или нескольких аспектов такого переключателя) описаны, например, в US2004040047; US20110286980; US20140255360; WO1997031899; WO2014151960; WO2014164348; WO2014197638; WO2014197638; все из которых включены в данный документ посредством ссылки.

В другом примере клетки, экспрессирующие CAR, могут также экспрессировать индуцируемую молекулу каспазы-9 (iCaspase-9), которая при введении димеризующего лекарственного средства (например, римидуцида (также называемого AP1903 (Bellicum Pharmaceuticals) или AP20187 (Ariad))) приводит к активации каспазы-9 и апоптозу клеток. Молекула iCaspase-9 содержит химический индуктор димеризационного (CID) связывающего домена, который опосредует димеризацию в присутствии CID. Это приводит к индуцируемому и селективному истощению по клеткам, экспрессирующим CAR. В некоторых случаях молекула iCaspase-9 кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, отдельной от вектора(векторов), кодирующего(кодирующих) CAR. В некоторых случаях молекула iCaspase-9 кодируется той же молекулой нуклеиновой кислоты, что и вектор, кодирующий CAR. iCaspase-9 может обеспечивать защитное переключение для избежания возможной токсичности клеток, экспрессирующих CAR. См., например, Song et al. Cancer Gene Ther. 2008; 15(10):667-75; Clinical Trial Id. № NCT02107963; и Di Stasi et al. N. Engl. J. Med. 2011; 365:1673-83.

Альтернативные стратегии регуляции средства терапии на основе CAR по настоящему изобретению включают использование малых молекул или антител, которые дезактивируют или выключают активность CAR, например, путем удаления клеток, экспрессирующих CAR, например, путем индукции антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (ADCC). Например, клетки, экспрессирующие CAR, описанные в данном документе, могут также экспрессировать антиген, распознаваемый молекулами, способными индуцировать гибель клеток, например ADCC или комплемент-индуцированную гибель клеток. Например, клетки, экспрессирующие CAR, описанные в данном документе, также могут экспрессировать рецептор, на который могут нацеливаться антитело или фрагмент антитела. Примеры таких рецепторов включают EpCAM, VEGFR, интегрины (например, интегрины ανβ3, α4, αΙ¾β3, α4β7, α5β1, ανβ3, αν), представители суперсемейства рецепторов TNF (например, TRAIL-R1, TRAIL-R2), рецептор PDGF, рецептор интерферона, рецептор фолиевой кислоты, GPNMB, ICAM-1, HLA-DR, CEA, CA-125, MUC1, TAG-72, рецептор IL-6, 5T4, GD2, GD3, CD2, CD3, CD4, CD5, CD1 1, CD1 1 a/LFA-1, CD15, CD18/ITGB2, CD19, CD20, CD22, CD23/IgE-рецептор, CD25, CD28, CD30, CD33, CD38, CD40, CD41, CD44, CD51, CD52, CD62L, CD74, CD80, CD125, CD147/базигин, CD152/CTLA-4, CD154/CD40L, CD195/CCR5, CD319/SLAMF7 и EGFR и их усеченные версии (например, версии, сохраняющие один или несколько внеклеточных эпитопов, но не содержащие одной или нескольких областей в пределах цитоплазматического домена).

Например, клетка, экспрессирующая CAR, описанная в данном документе, также может экспрессировать усеченный рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), который не обладает сигнальной способностью, но сохраняет эпитоп, который распознается молекулами, способными индуцировать ADCC, например, цетуксимабом (ERBITUX®), так что введение цетуксимаба индуцирует ADCC и последующее истощение по клеткам, экспрессирующим CAR (см., например, WO2011/056894 и Jonnalagadda et al., Gene Ther. 2013; 20(8)853-860). Другая стратегия предусматривает экспрессию очень компактного маркерного/"суицидального" гена, который объединяет целевые эпитопы из обоих антигенов CD32 и CD20 в клетках, экспрессирующих CAR, описанных в данном документе, которые связывают ритуксимаб, что приводит к селективному истощению по клеткам, экспрессирующим CAR, например, посредством ADCC (см., например, Philip et al., Blood. 2014; 124(8)1277-1287). Другие способы истощения по клеткам, экспрессирующим CAR, описанным в данном документе, включают введение CAMPATH, моноклонального антитела к CD52, которое избирательно связывается со зрелыми лимфоцитами, например, клетками, экспрессирующими CAR, и направляет их на разрушение, например, посредством индукции ADCC. В других вариантах осуществления на клетку, экспрессирующую CAR, можно осуществлять избирательное нацеливание с помощью лиганда CAR, например, антиидиотипического антитела. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело может вызывать активность эффекторных клеток, например формы активности ADCC или ADC, за счет чего обеспечивается снижение количества клеток, экспрессирующих CAR. В других вариантах осуществления лиганд CAR, например, антиидиотипическое антитело, может быть связан со средством, которое вызывает уничтожение клеток, например токсином, тем самым уменьшая число клеток, экспрессирующих CAR. В качестве альтернативы, сами молекулы CAR могут быть сконфигурированы с возможностью регуляции активности, например, путем включения или выключения, как описано ниже.

В других вариантах осуществления клетка, экспрессирующая CAR, описанная в данном документе, также может экспрессировать целевой белок, распознаваемый средством, обеспечивающим истощение по Т-клеткам. В некоторых вариантах осуществления целевой белок представляет собой CD20, а средство, обеспечивающее истощение по Т-клеткам, представляет собой антитело к CD20, например ритуксимаб. В некоторых вариантах осуществления средство, обеспечивающее истощение по Т-клеткам, вводят тогда, когда необходимо уменьшить количество или уничтожить клетку, экспрессирующую CAR, например, чтобы уменьшить вызванную CAR токсичность. В других вариантах осуществления средство, обеспечивающее истощение по Т-клеткам, представляет собой антитело к CD52, например алемтузумаб, как описано в примерах в данном документе.

В других вариантах осуществления RCAR содержит набор полипептидов, как правило, в простейших вариантах осуществления два, в которых компоненты стандартного CAR, описанного в данном документе, например, антигенсвязывающий домен и внутриклеточный сигнальный домен, разделены на отдельные полипептиды или элементы. В некоторых вариантах осуществления набор полипептидов включает димеризационный переключатель, который при наличии димеризующей молекулы может связывать полипептиды друг с другом, например может связывать антигенсвязывающий домен с внутриклеточным сигнальным доменом. В некоторых вариантах осуществления в CAR по настоящему изобретению используется такой димеризационный переключатель, как описанные, например, в WO2014127261, включенной в данный документ посредством ссылки. Дополнительное описание и иллюстративные конфигурации таких регулируемых CAR представлены в данном документе и, например, в абзацах 527-551 международной публикации № WO 2015/090229, поданной 13 марта 2015 года, которая включена посредством ссылки во всей своей полноте. В некоторых вариантах осуществления RCAR предусматривает наличие переключающего домена, например переключающего домена FKBP, указанного под SEQ ID NO: 275, или содержит фрагмент FKBP, обладающий способностью связываться с FRB, например, указанный под SEQ ID NO: 276. В некоторых вариантах осуществления RCAR предусматривает наличие переключающего домена, содержащего последовательность FRB, например, представленную под SEQ ID NO: 277, или мутантную последовательность FRB, например, представленную под любым из SEQ ID NO: 278-283.

DVPDYASLGGPSSPKKKRKVSRGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLETSY (SEQ ID NO: 275)

VQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLETS (SEQ ID NO: 276)

ILWHEMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLTQAWDLYYHVFRRISK (SEQ ID NO: 277)

Таблица 18. Иллюстративный мутантный FRB, характеризующийся повышенной аффинностью в отношении димеризующей молекулы.

Мутантный FRB Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: Мутантная форма E2032I ILWHEMWHEGLIEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLTQAWDLYYHVFRRISKTS 278 Мутантная форма E2032L ILWHEMWHEGLLEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLTQAWDLYYHVFRRISKTS 279 Мутантная форма T2098L ILWHEMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLLQAWDLYYHVFRRISKTS 280 Мутантная форма E2032, T2098 ILWHEMWHEGLXEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLXQAWDLYYHVFRRISKTS 281 Мутантная форма E2032I, T2098L ILWHEMWHEGLIEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLLQAWDLYYHVFRRISKTS 282 Мутантная форма
E2032L, T2098L ILWHEMWHEGLLEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLLQAWDLYYHVFRRISKTS 283

Трансфекция РНК

В данном документе раскрыты способы получения РНК, транскрибированной in vitro, кодирующей CAR. РНК, кодирующая CAR, и способы ее применения описаны, например, в абзацах 553-570 международной заявки WO2015/142675, поданной 13 марта 2015 года, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Иммунная эффектoрная клетка может содержать CAR, кодируемый матричной РНК (мРНК). В некоторых вариантах осуществления мРНК, кодирующую CAR, описанную в данном документе, вводят в иммунную эффекторную клетку, например, полученную посредством способа, описанного в данном документе, для получения клетки, экспрессирующей CAR.

В некоторых вариантах осуществления РНК, транскрибированную in vitro, кодирующую CAR, можно вводить в клетку в форме транзиентной трансфекции. РНК получают путем транскрипции in vitro с применением матрицы, полученной посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР). ДНК, представляющая интерес, из любого источника может быть непосредственно преобразована с помощью ПЦР в матрицу для синтеза мРНК in vitro с использованием соответствующих праймеров и РНК-полимеразы. Источником ДНК может быть, например, геномная ДНК, плазмидная ДНК, фаговая ДНК, кДНК, синтетическая последовательность ДНК или любой другой подходящий источник ДНК. Требуемая матрица для транскрипции in vitro представляет собой CAR, описанный в данном документе. Например, матрица для РНК, кодирующей CAR, содержит внеклеточную область, содержащую одноцепочечный вариабельный домен антитела к опухолеассоциированному антигену, описанному в данном документе; шарнирную область (например, шарнирную область, описанную в данном документе), трансмембранный домен (например, трансмембранный домен, описанный в данном документе, такой как трансмембранный домен CD8a) и цитоплазматическую область, которая содержит внутриклеточный сигнальный домен, например внутриклеточный сигнальный домен, описанный в данном документе, например, содержащий сигнальный домен CD3-дзета и сигнальный домен 4-1BB.

В некоторых вариантах осуществления ДНК, подлежащая применению в ПЦР, содержит открытую рамку считывания. ДНК может быть получена из встречающейся в природе последовательности ДНК из генома организма. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота может содержать некоторые или все из 5'- и/или 3'-нетранслируемых областей (UTR). Нуклеиновая кислота может содержать экзоны и интроны. В некоторых вариантах осуществления ДНК, подлежащая применению в ПЦР, представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты человека. В некоторых вариантах осуществления ДНК, подлежащая применению в ПЦР, представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты человека, содержащую 5'- и 3'-UTR. В качестве альтернативы, ДНК может представлять собой искусственную последовательность ДНК, которая обычно не экспрессируется у встречающегося в природе организма. Иллюстративная искусственная последовательность ДНК представляет собой последовательность, которая содержит части генов, лигированные друг с другом с образованием открытой рамки считывания, которая кодирует слитый белок. Части ДНК, лигированные друг с другом, могут быть получены из одного организма или из более чем одного организма.

ПЦР применяют для получения матрицы, предназначенной для транскрипции in vitro мРНК, которая применяется для трансфекции. Способы осуществления ПЦР хорошо известны из уровня техники. Праймеры для применения в ПЦР разрабатывают таким образом, чтобы они имели области, по существу комплементарные областям ДНК, подлежащей применению в качестве матрицы для ПЦР. Используемый в данном документе термин "по существу комплементарные" относится к последовательностям нуклеотидов, где большинство или все основания в последовательности праймера являются комплементарными, или одно или несколько оснований являются некомплементарными или несовпадающими. По существу комплементарные последовательности способны отжигаться или гибридизироваться с предполагаемой ДНК-мишенью в условиях отжига, используемых для ПЦР. Праймеры можно разрабатывать таким образом, чтобы они были по существу комплементарными любой части ДНК-матрицы. Например, праймеры можно разрабатывать таким образом, чтобы обеспечить амплификацию части нуклеиновой кислоты, которая обычно транскрибируется в клетках (открытой рамки считывания), включающей 5'- и 3'-UTR. Праймеры также можно разрабатывать таким образом, чтобы обеспечить амплификацию части нуклеиновой кислоты, которая кодирует конкретный домен, представляющий интерес. В некоторых вариантах осуществления праймеры сконструированы таким образом, чтобы обеспечить амплификацию кодирующей области cDNA человека, в том числе 5'- и 3'-UTR целиком или их частей. Праймеры, применимые для ПЦР, могут быть получены посредством способов синтеза, которые хорошо известны из уровня техники. "Прямые праймеры" представляют собой праймеры, которые содержат область из нуклеотидов, по существу комплементарных нуклеотидам в ДНК-матрице, которые расположены выше последовательности ДНК, подлежащей амплификации. "Вышерасположенное" используется в данном документе для обозначения местоположения в 5'-направлении от последовательности ДНК, подлежащей амплификации, относительно кодирующей цепи. "Обратные праймеры" представляют собой праймеры, которые содержат области из нуклеотидов, по существу комплементарных нуклеотидам в двухнитевой ДНК-матрице, которые расположены ниже последовательности ДНК, подлежащей амплификации. "Нижерасположенное" используется в данном документе для обозначения местоположения в 3'-направлении от последовательности ДНК, подлежащей амплификации, относительно кодирующей нити.

В способах, раскрытых в данном документе, может применяться любая ДНК-полимераза, применимая для ПЦР. Реагенты и полимераза являются коммерчески доступными из ряда источников.

Также можно использовать химические структуры, которые могут способствовать стабильности и/или эффективности трансляции. РНК в ряде вариантов осуществления содержит 5'- и 3'-UTR. В некоторых вариантах осуществления длина 5'-UTR составляет от одного до 3000 нуклеотидов. Длину последовательностей 5'- и 3'-UTR, которые подлежат добавлению к кодирующей области, можно изменять с помощью различных способов, включая без ограничения разработку праймеров для ПЦР, которые отжигаются с различными областями UTR. Используя данный подход, специалист средней квалификации в данной области техники может модифицировать длину 5'- и 3'-UTR, необходимую для достижения оптимальной эффективности трансляции после трансфекции транскрибированной РНК.

5'- и 3'-UTR могут представлять собой встречающиеся в природе эндогенные 5'- и 3'-UTR для нуклеиновой кислоты, представляющей интерес. В качестве альтернативы, последовательности UTR, которые не являются эндогенными для нуклеиновой кислоты, представляющей интерес, могут быть добавлены путем включения последовательностей UTR в прямой и обратный праймеры или с помощью любых других модификаций матрицы. Использование последовательностей UTR, которые не являются эндогенными для нуклеиновой кислоты, представляющей интерес, может быть применимым для модификации стабильности и/или эффективности трансляции РНК. Например, известно, что AU-богатые элементы в последовательностях 3'-UTR могут уменьшать стабильность мРНК. Следовательно, 3'-UTR могут быть выбраны или разработаны таким образом, чтобы они увеличивали стабильность транскрибированной РНК, исходя из свойств UTR, которые хорошо известны из уровня техники.

В некоторых вариантах осуществления 5'-UTR может содержать последовательность Козак из эндогенной нуклеиновой кислоты В качестве альтернативы, если 5'-UTR, которая не является эндогенной для нуклеиновой кислоты, представляющей интерес, добавляют с помощью ПЦР, как описано выше, консенсусная последовательность Козак может быть видоизменена путем добавления последовательности 5'-UTR. Последовательности Козак могут увеличивать эффективность трансляции некоторых РНК-транскриптов, но, по-видимому, они не являются необходимыми для обеспечения эффективной трансляции всех РНК. Требование наличия последовательностей Козак для многих мРНК известно из уровня техники. В других вариантах осуществления 5'-UTR может представлять собой 5'-UTR из РНК-содержащего вируса, РНК-геном которого является стабильным в клетках. В других вариантах осуществления можно использовать различные аналоги нуклеотидов в 3'- или 5'-UTR, чтобы воспрепятствовать разрушению мРНК под действием экзонуклеаз.

Для обеспечения синтеза РНК с ДНК-матрицы без необходимости клонирования гена промотор транскрипции должен быть присоединен к ДНК-матрице выше последовательности, подлежащей транскрипции. Если последовательность, которая функционирует в качестве промотора для РНК-полимеразы, добавляют к 5'-концу прямого праймера, то промотор для РНК-полимеразы включается в состав продукта ПЦР выше открытой рамки считывания, которая подлежит транскрипции. В некоторых вариантах осуществления промотор представляет собой промотор полимеразы Т7, как описано в другом разделе в данном документе. Другие применимые промоторы включают без ограничения промоторы для РНК-полимераз Т3 и SP6. Консенсусные нуклеотидные последовательности для промоторов T7, T3 и SP6 известны из уровня техники.

В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит как кэп на 5'-конце, так и 3'-поли(А)-хвост, которые определяют связывание с рибосомой, инициацию трансляции и стабильность мРНК в клетке. На кольцевой ДНК-матрице, например, плазмидной ДНК, РНК-полимераза продуцирует длинный конкатемерный продукт, который не подходит для экспрессии в эукариотических клетках. Транскрипция плазмидной ДНК, линеаризованной на конце 3'-UTR, приводит к образованию мРНК нормального размера, которая не является эффективной для трансфекции эукариот даже в случае ее полиаденилирования после транскрипции.

На линейной ДНК-матрице РНК-полимераза фага Т7 может удлинять 3'-конец транскрипта за пределы последнего основания матрицы (Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985); Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003).

Традиционный способ интеграции отрезков поли(А)/(Т) в ДНК-матрицу представляет собой молекулярное клонирование. Однако последовательность поли(А)/(Т), интегрированная в плазмидную ДНК, может обуславливать нестабильность плазмиды, вследствие чего плазмидные ДНК-матрицы, полученные из бактериальных клеток, зачастую сильно засорены делециями и другими аберрациями. Это приводит к тому, что процедуры клонирования являются не только трудоемкими и времязатратными, но зачастую и ненадежными. Поэтому существует большая потребность в способе, который позволяет конструировать ДНК-матрицы с отрезками поли(А)/(Т) на 3'-конце без клонирования.

Сегмент поли(A)/(T) в транскрипционной ДНК-матрице может быть получен во время ПЦР с использованием обратного праймера, содержащего поли(T)-хвост, такой как хвост 100T (размер может составлять 50-5000 Т (SEQ ID NO: 32)) или после ПЦР с помощью любого другого способа, в том числе без ограничения лигирования или рекомбинации ДНК in vitro. Поли(А)-хвосты также обеспечивают стабильность РНК и уменьшают их разрушение. Как правило, длина поли(А)-хвоста положительно коррелирует со стабильностью транскрибированной РНК. В некоторых вариантах осуществления длина поли(А)-хвоста составляет от 100 до 5000 остатков аденозина (например, SEQ ID NO: 33).

Поли(А)-хвосты РНК могут быть дополнительно удлинены после транскрипции in vitro путем использования поли(А)-полимеразы, такой как поли(А)-полимераза Е. coli (E-PAP). В некоторых вариантах осуществления увеличение длины поли(А)-хвоста от 100 нуклеотидов до 300-400 нуклеотидов (SEQ ID NO: 34) дает в результате приблизительно двукратное увеличение эффективности трансляции РНК. Кроме того, присоединение различных химических групп к 3'-концу может увеличивать стабильность мРНК. Такое присоединение может включать присоединение модифицированных/искусственных нуклеотидов, аптамеров и других соединений. Например, в состав поли(А)-хвоста с помощью поли(А)-полимеразы могут быть включены аналоги ATP. Аналоги ATP могут дополнительно увеличивать стабильность РНК.

5'-кэп-структуры также обеспечивают стабильность молекул РНК. В некоторых вариантах осуществления РНК, полученные с помощью способов, раскрытых в данном документе, содержат 5'-кэп. Наличие 5'-кэпа обеспечивают с помощью методик, известных из уровня техники и описанных в данном документе (Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001); Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001); Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)).

РНК, полученные с помощью способов, раскрытых в данном документе, также могут содержать последовательность участка внутренней посадки рибосомы (IRES). Последовательность IRES может быть любой вирусной, хромосомной или искусственно разработанной последовательностью, которая инициирует кэп-независимое связывание рибосомы с мРНК и содействует инициации трансляции. Могут быть включены любые растворенные вещества, подходящие для электропорации клеток, которые могут включать факторы, содействующие проникновению в клетку и жизнеспособности клеток, такие как сахара, пептиды, липиды, белки, антиоксиданты и поверхностно-активные вещества.

РНК можно вводить в клетки-мишени с помощью любого из целого ряда различных способов, например, коммерчески доступных способов, которые включают без ограничения электропорацию (Amaxa Nucleofector-II (Amaxa Biosystems, Кельн, Германия)), ECM 830 (BTX) (Harvard Instruments, Бостон, Массачусетс) или Gene Pulser II (BioRad, Денвер, Колорадо), Multiporator (Eppendorf, Гамбург, Германия)), трансфекцию, опосредованную катионными липосомами, с применением липофекции, инкапсуляцию в полимеры, трансфекцию, опосредованную пептидами, или биобаллистические системы доставки частиц, такие как "генные пушки" (см., например, Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001).

Невирусные способы доставки

В некоторых вариантах осуществления можно применять невирусные способы для доставки нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, описанный в данном документе, в клетку, или ткань, или организм субъекта.

В некоторых вариантах осуществления невирусный способ включает применение транспозона (также называемого мобильным генетическим элементом). В некоторых вариантах осуществления транспозон представляет собой фрагмент ДНК, который может самостоятельно вставляться в определенное местоположение в геноме, например, фрагмент ДНК, который способен к саморепликации и вставке своей копии в геном, или фрагмент ДНК, который с помощью сплайсинга может быть вырезан из более длинной нуклеиновой кислоты и вставлен в другое место в геноме. Например, транспозон содержит последовательность ДНК, состоящую из инвертированных повторов, фланкирующих гены для транспозиции.

Иллюстративные способы доставки нуклеиновой кислоты с применением транспозона включают транспозонную систему "спящая красавица" (SBTS) и транспозонную систему piggyBac^ТМ (PB). См., например, Aronovich et al. Hum. Mol. Genet. 20.R1(2011):R14-20; Singh et al. Cancer Res. 15(2008):2961-2971; Huang et al. Mol. Ther. 16(2008):580-589; Grabundzija et al. Mol. Ther. 18(2010):1200-1209; Kebriaei et al. Blood. 122.21(2013):166; Williams. Molecular Therapy 16.9(2008):1515-16; Bell et al. Nat. Protoc. 2.12(2007):3153-65; и Ding et al. Cell. 122.3(2005):473-83, все из которых включены в данный документ посредством ссылки.

SBTS содержит два компонента: 1) транспозон, содержащий трансген, и 2) источник фермента транспозазы. Транспозаза может транспонировать транспозон из плазмиды-носителя (или другой донорной ДНК) в целевую ДНК, такую как хромосома/геном клетки-хозяина. Например, транспозаза связывается с плазмидой-носителем/донорной ДНК, вырезает транспозон (в том числе трансген(трансгены)) из плазмиды и вставляет его в геном клетки-хозяина. См., например, Aronovich et al. выше.

Иллюстративные транспозоны включают транспозон на основе pT2. См., например, Grabundzija et al. Nucleic Acids Res. 41.3(2013):1829-47 и Singh et al. Cancer Res. 68.8(2008): 2961-2971, все из которых включены в данный документ посредством ссылки. Иллюстративные транспозазы включают транспозазу типа Tc1/mariner, например транспозазу SB10 или транспозазу SB11 (гиперактивную транспозазу, которая может экспрессироваться, например, под контролем промотора цитомегаловируса). См., например, Aronovich et al.; Kebriaei et al. и Grabundzija et al., все из которых включены в данный документ посредством ссылки.

Применение SBTS обеспечивает эффективную интеграцию и экспрессию трансгена, например нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, описанный в данном документе. В данном документе представлены способы получения клетки, например T-клетки или NK-клетки, которая стабильно экспрессирует CAR, описанный в данном документе, например, с применением системы транспозонов, такой как SBTS.

В соответствии со способами, описанными в данном документе, в некоторых вариантах осуществления одна или несколько нуклеиновых кислот, например плазмид, содержащих компоненты SBTS, доставляются в клетку (например, T- или NK-клетку). Например, нуклеиновую(нуклеиновые) кислоту(кислоты) доставляют с помощью стандартных способов доставки нуклеиновых кислот (например, плазмидной ДНК), например, с помощью описанных в данном документе способов, например электропорации, трансфекции или липофекции. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит транспозон, содержащий трансген, например нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR, описанный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит транспозон, содержащий трансген (например, нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR, описанный в данном документе), а также последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент транспозазу. В других вариантах осуществления представлена система с двумя нуклеиновыми кислотами, например система с двумя плазмидами, например, где первая плазмида содержит транспозон, содержащий трансген, а вторая плазмида содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент транспозазу. Например, первая и вторая нуклеиновые кислоты совместно доставляются в клетку-хозяина.

В некоторых вариантах осуществления клетки, например, T- или NK-клетки, которые экспрессируют CAR, описанный в данном документе, получают с помощью комбинации вставки гена с помощью SBTS и генетического редактирования с помощью нуклеазы (например, нуклеаз с "цинковыми пальцами" (ZFN), эффекторных нуклеаз, подобных активаторам транскрипции (TALEN), системы CRISPR/Cas или сконструированных мегануклеаз, представляющих собой реконструированные хоуминг-эндонуклеазы).

В некоторых вариантах осуществления применение невирусного способа доставки делает возможным перепрограммирование клеток, например Т- или NK-клеток, и прямую инфузию клеток в организм субъекта. Преимущества невирусных векторов включают без ограничения простоту и относительно низкую стоимость получения достаточных количеств, необходимых для популяции пациентов, стабильность при хранении и отсутствие иммуногенности.

Способы изготовления/получения

В некоторых вариантах осуществления способы, раскрытые в данном документе, дополнительно включают введение средства, обеспечивающего истощение по Т-клеткам, после лечения клеткой (например, иммунной эффектoрной клеткой, описанной в данном документе), за счет чего обеспечивается снижение количества (например, истощение) клеток, экспрессирующих CAR (например, клеток, экспрессирующих CAR для CD19). Такие средства, обеспечивающие истощение по Т-клеткам, можно применять для обеспечения эффективного истощения по клеткам, экспрессирующим CAR (например, клеткам, экспрессирующим CAR для CD19), для уменьшения токсичности. В некоторых вариантах осуществления клетки, экспрессирующие CAR, были произведены в соответствии со способом, описанным в данном документе, например, проанализированы (например, до или после трансфекции или трансдукции) в соответствии со способом, описанным в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления средство, обеспечивающее истощение по Т-клеткам, вводят через одну, две, три, четыре или пять недель после введения клетки, например популяции иммунных эффекторных клеток, описанной в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления средство, обеспечивающее истощение по Т-клеткам, представляет собой средство, которое обеспечивает истощение по Т-клеткам, экспрессирующим CAR, например, посредством индукции антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности(ADCC) и/или комплемент-индуцированной гибели клеток. Например, клетки, экспрессирующие CAR, описанные в данном документе, могут также экспрессировать антиген (например, антиген-мишень), который распознается молекулами, способными индуцировать гибель клеток, например ADCC или комплемент-индуцированную гибель клеток. Например, клетки, экспрессирующие CAR, описанные в данном документе, также могут экспрессировать белок-мишень (например, рецептор), на который могут нацеливаться антитело или фрагмент антитела. Примеры таких белков-мишеней включают без ограничения EpCAM, VEGFR, интегрины (например, интегрины ανβ3, α4, αΙ3/4β3, α4β7, α5β1, ανβ3, αν), представители суперсемейства рецепторов TNF (например, TRAIL-R1, TRAIL-R2), рецептор PDGF, рецептор интерферона, рецептор фолиевой кислоты, GPNMB, ICAM-1, HLA-DR, CEA, CA-125, MUC1, TAG-72, рецептор IL-6, 5T4, GD2, GD3, CD2, CD3, CD4, CD5, CD11, CD11a/LFA-1, CD15, CD18/ITGB2, CD19, CD20, CD22, CD23/IgE-рецептор, CD25, CD28, CD30, CD33, CD38, CD40, CD41, CD44, CD51, CD52, CD62L, CD74, CD80, CD125, CD147/базигин, CD152/CTLA-4, CD154/CD40L, CD195/CCR5, CD319/SLAMF7 и EGFR и их усеченные версии (например, версии, сохраняющие один или несколько внеклеточных эпитопов, но не содержащие одной или нескольких областей в пределах цитоплазматического домена).

В некоторых вариантах осуществления клетка, экспрессирующая CAR, совместно экспрессирует CAR и белок-мишень, например, естественным образом экспрессирует белок-мишень или сконструирована таким образом, что она экспрессирует белок-мишень. Например, клетка, например популяция иммунных эффекторных клеток, может содержать нуклеиновую кислоту (например, вектор), содержащую нуклеиновую кислоту CAR (например, нуклеиновую кислоту CAR, описанную в данном документе) и нуклеиновую кислоту, кодирующую белок-мишень.

В некоторых вариантах осуществления средство, обеспечивающее истощение по Т-клеткам, представляет собой ингибитор CD52, например молекулу антитела к CD52, например алемтузумаб.

В других вариантах осуществления клетка, например популяция иммунных эффекторных клеток, экспрессирует молекулу CAR, описанную в данном документе (например, CAR для CD19), и белок-мишень, распознаваемый средством, обеспечивающим истощение по Т-клеткам. В некоторых вариантах осуществления белок-мишень представляет собой CD20. В ряде вариантов осуществления, в которых белок-мишень представляет собой CD20, средство, обеспечивающее истощение по Т-клеткам, представляет собой антитело к CD20, например ритуксимаб.

В дополнительных вариантах осуществления любого из вышеупомянутых способов способы дополнительно включают трансплантацию клетки, например гемопоэтической стволовой клетки, или костного мозга в организм млекопитающего.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения описан способ подготовки млекопитающего перед трансплантацией клеток. Способ включает введение млекопитающему эффективного количества клетки, содержащей нуклеиновую кислоту или полипептид CAR, например нуклеиновую кислоту или полипептид CAR для CD19. В некоторых вариантах осуществления трансплантация клеток представляет собой трансплантацию стволовых клеток, например трансплантацию гемопоэтических стволовых клеток, или трансплантацию костного мозга. В других вариантах осуществления подготовка субъекта перед трансплантацией клеток включает снижение у субъекта количества клеток, экспрессирующих мишень, например нормальных клеток, экспрессирующих CD19, или раковых клеток, экспрессирующих CD19.

Элютриация

В некоторых вариантах осуществления способы, описанные в данном документе, включают способ элютриации, с помощью которого удаляют нежелательные клетки, например моноциты и бластные клетки, что в результате приводит к улучшенному обогащению популяции требуемых иммунных эффектoрных клеток, подходящих для экспрессии CAR. В одном варианте осуществления способ элютриации, описанный в данном документе, оптимизирован для обогащения по требуемым иммунным эффектoрным клеткам, подходящим для экспрессии CAR, из ранее замороженного образца, например размороженного образца. В некоторых вариантах осуществления способ элютриации, описанный в данном документе, обеспечивает получение клеток с улучшенной чистотой по сравнению с получением клеток, собранных согласно протоколам элютриации известным из уровня техники. В некоторых вариантах осуществления способ элютриации, описанный в данном документе, включает использование оптимизированной вязкости исходного образца, например образца клеток, например размороженного клеточного образца, путем разбавления определенными изотоническими растворами (например, PBS), а также использование оптимизированной комбинации скоростей потока и объема собираемого материала для каждой фракции, собираемой с помощью устройства для элютриации. Иллюстративные способы элютриации, которые можно применять в настоящем изобретении, описаны на страницах 48-51 из WO 2017/117112, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Центрифугирование в градиенте плотности

Изготовление терапевтического продукта на основе адоптивной клетки требует обработки требуемых клеток, например иммунных эффекторных клеток, для отделения от сложной смеси клеток крови и элементов крови, присутствующих в исходных материалах периферической крови, полученных путем афереза. Образцы лимфоцитов периферической крови были успешно выделены с помощью центрифугирования в градиенте плотности в растворе Ficoll. Однако Ficoll не является предпочтительным реагентом для выделения клеток для терапевтического применения, поскольку Ficoll не пригоден для клинического применения. Кроме того, Ficoll содержит гликоль, который обладает токсичным потенциалом в отношении клеток. Кроме того, при центрифугировании в градиенте плотности Ficoll размороженных после криоконсервации продуктов, полученных путем афереза, получают неоптимальный продукт T-клеток, например, как описано в примерах в данном документе. Например, в препаратах клеток, выделенных посредством центрифугирования в градиенте плотности в растворе Ficoll, наблюдали утрату Т-клеток в конечном продукте с относительным увеличением количества клеток, отличных от T-клеток, особенно нежелательных B-клеток, бластных клеток и моноцитов.

Не ограничиваясь теорией, полагают, что иммунные эффектoрные клетки, например T-клетки, обезвоживаются во время криоконсервации, становясь более плотными, чем свежие клетки. Не желая ограничиваться какой-либо теорией, также полагают, что иммунные эффектoрные клетки, например T-клетки, остаются более плотными дольше, чем другие клетки крови, и, таким образом, легче утрачиваются при разделении в градиенте плотности Ficoll по сравнению с другими клетками. Соответственно, не ограничиваясь теорией, полагают, что среда с плотностью, превышающей плотность Ficoll, будет обеспечивать улучшение в отношении выделения требуемых иммунных эффектoрных клеток по сравнению с Ficoll или другими средами с такой же плотностью, как у Ficoll, например 1,077 г/мл.

В некоторых вариантах осуществления способ центрифугирования в градиенте плотности, описанный в данном документе, включает применение среды с градиентом плотности, содержащей йодиксанол. В некоторых вариантах осуществления среда с градиентом плотности содержит приблизительно 60% йодиксанола в воде.

В некоторых вариантах осуществления способ центрифугирования в градиенте плотности, описанный в данном документе, включает применение среды с градиентом плотности, характеризующейся плотностью, превышающей плотность Ficoll. В некоторых вариантах осуществления способ центрифугирования в градиенте плотности, описанный в данном документе, включает применение среды с градиентом плотности, характеризующейся плотностью более 1,077 г/мл, например более 1,077 г/мл, более 1,1 г/мл, более 1,15 г/мл, более 1,2 г/мл, более 1,25 г/мл, более 1,3 г/мл, более 1,31 г/мл. В некоторых вариантах осуществления среда с градиентом плотности характеризуется плотностью, составляющей приблизительно 1,32 г/мл.

Дополнительные варианты осуществления центрифугирования в градиенте плотности описаны на станицах 51-53 из WO 2017/117112, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Обогащение посредством отбора

В данном документе предусмотрены способы отбора конкретных клеток для обеспечения улучшения в отношении обогащения по требуемым иммунным эффектoрным клеткам, подходящим для экспрессии CAR. В некоторых вариантах осуществления отбор включает положительный отбор, например отбор в отношении требуемых иммунных эффектoрных клеток. В некоторых вариантах осуществления отбор включает отрицательный отбор, например отбор в отношении нежелательных клеток, например удаление нежелательных клеток. В вариантах осуществления способы положительного или отрицательного отбора, описанные в данном документе, проводят в условиях потока, например, с помощью проточного устройства, например проточного устройства, описанного в данном документе. Иллюстративные положительные и отрицательные способы отбора описаны на страницах 53-57 из WO 2017/117112, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Способы отбора можно осуществлять в условиях потока, например с помощью проточного устройства, также называемого система для обработки клеток, для дополнительного обогащения препарата клеток в отношении требуемых иммунных эффектoрных клеток, например T-клеток, подходящих для экспрессии CAR. Иллюстративные проточные устройства описаны на страницах 57-70 из WO 2017/117112, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Иллюстративные способы разделения клеток и удаления гранул описаны на страницах 70-78 из WO 2017/117112, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Процедуры отбора не ограничиваются теми, которые описаны на страницах 57-70 из WO 2017/117112. Можно применять отрицательный отбор Т-клеток путем удаления нежелательных клеток с помощью гранул с антителами к CD19, CD14 и CD26 от Miltenyi в комбинации с колоночной технологией (CliniMACS^® Plus или CliniMACS^® Prodigy^®) или положительный отбор Т-клеток с помощью комбинации метода с использованием гранул с антителами к CD4 и CD8 от Miltenyi и колоночной технологии (CliniMACS^® Plus или CliniMACS^® Prodigy^®). В качестве альтернативы, можно применять технологию без использования колонки с гранулами с антителами к CD3 с возможностью последующего удаления (GE Healthcare).

Кроме того, можно также применять технологии без использования гранул, такие как устройства ThermoGenesis X-series.

Виды клинического применения

Все способы в данном документе можно осуществлять согласно клиническим стандартам производства и контроля качества лекарственных средств (cGMP).

Способы можно применять для очистки клеток, обогащения, сбора, промывания, концентрирования или для замены сред для клеток, в частности во время сбора необработанных, исходных материалов (в частности клеток) на начальном этапе способа изготовления, а также во время процесса изготовления для отбора или размножения клеток для средства терапии на основе клеток.

Клетки могут включать любое множество клеток. Клетки могут относиться к одному и тому же типу клеток или представлять собой смесь типов клеток. Кроме того, клетки могут быть от одного донора, такого как аутогенный донор или один аллогенный донор для средства терапии на основе клеток. Клетки можно получать от пациентов с помощью, например, лейкафереза или афереза. Клетки могут включать T-клетки, например могут включать популяцию которая содержит более 50% T-клеток, более 60% T-клеток, более 70% T-клеток, более 80% T-клеток или 90% T-клеток.

Способы отбора можно в частности применять для отбора клеток до культивирования и размножения. Например, можно применять парамагнитные частицы, покрытые антителом к CD3 и/или к CD28, для отбора T-клеток для размножения или для введения нуклеиновой кислоты, кодирующей химерный антигенный рецептор (CAR) или другой белок. Такой способ используют для получения T-клеток для CTL019 для лечения острого лимфобластного лейкоза (ALL).

Способы и модули удаления гранул, раскрытые в данном документе, можно в частности применять в изготовлении клеток для средства терапии на основе клеток, например во время проведения очистки клетки до или после культивирования и размножения. Например, парамагнитные частицы, покрытые антителом к CD3 и/или к CD28, можно применять для селективного размножения T-клеток, например тех T-клеток, которые являются или будут модифицированы посредством введения нуклеиновой кислоты, кодирующей химерный антигенный рецептор (CAR) или другой белок с обеспечением экспрессии CAR T-клетками. Во время изготовления таких T-клеток способы или модули удаления гранул можно применять для отделения T-клеток от парамагнитных частиц. Такой способ или модуль удаления гранул используют для получения, например, T-клеток для CTL019 для лечения острого лимфобластного лейкоза (ALL).

В одном таком способе, проиллюстрированном в данном документе в качестве примера, клетки, например T-клетки, отбирают у донора (например, пациента, которого будут лечить с помощью продукта на основе аутогенных Т-клеток с химерным антигенным рецептором) посредством афереза (например, лейкафереза). Отобранные клетки затем можно необязательно очищать, например с помощью стадии элютриации или с помощью положительного или отрицательного отбора клеток-мишеней (например, T-клеток). Парамагнитные частицы, например парамагнитные частицы, покрытые антителом к CD3/антителом к CD28, можно затем добавлять к популяции клеток для осуществления размножения T-клеток. Способ также может включать стадию трансдукции, где в клетку вводят нуклеиновую кислоту, кодирующую один или несколько требуемых белков, например CAR, например CAR, который нацеливается на CD19. Нуклеиновая кислота может быть введена в лентивирусный вектор. Клетки, например трансдуцированные лентивирусным вектором клетки, затем можно размножать в течение дней, например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более дней, например в присутствии подходящей среды. После размножения можно применять способы/модули удаления гранул, раскрытые в данном документе, для отделения требуемых T-клеток от парамагнитных частиц. Способ может включать один или несколько стадий удаления гранул согласно способам по настоящему изобретению. Клетки, из которых были удалены гранулы, затем можно составлять для введения пациенту. Примеры CART-клеток и их изготовление дополнительно описаны, например, в WO2012/079000, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Методики и способы по настоящему изобретению можно применять для любых способов разделения клеток/очистки клеток/удаления гранул из клеток, описанных в WO2012/079000 или связанных с ней заявках. Дополнительные способы изготовления CAR-T описаны в, например, WO2016109410 и WO2017117112, которые включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Методики и способы, описанные в данном документе, подобным образом могут обеспечивать благоприятный эффект для других терапевтических продуктов на основе клеток, обеспечивая уменьшение потерь требуемых клеток, уменьшение степени повреждения клеток и более надежное удаление магнитных и любых непарамагнитных частиц от клеток с меньшим воздействием химических средств или без их воздействия по сравнению с традиционными методиками и способами.

Хотя только иллюстративные варианты осуществления настоящего изобретения конкретно описаны выше, будет понятно, что возможны модификации и вариации таких примеров без отступления от сущности и подразумеваемого объема настоящего изобретения. Например, магнитные модули и системы, содержащие их, можно организовывать и применять в разнообразии конфигураций в дополнение к тем, что описаны. Кроме этого, также можно использовать немагнитные модули. Кроме того, методики и способы могут включать дополнительные компоненты и стадии, которые не описаны конкретно в данном документе. Например, способы могут включать праймирование, где жидкость сначала вносят в компонент для удаления пузырей и уменьшения противодействия движению суспензии клеток или буфера. Кроме того, варианты осуществления могут включать только часть систем, описанных в данном документе, для применения со способами, описанными в данном документе. Например, варианты осуществления могут относится к одноразовым модулям, рукавам и т. д., применимым внутри неодноразового оборудования с образованием целостной системы, способной отделять клетки или удалять гранулы из клеток с получением продукта на основе клеток.

Дополнительные способы изготовления и методы, которые можно объединять с настоящим изобретением, были описаны в уровне техники. Например, на страницах 86-91 из WO 2017/117112 описаны улучшенные стадии промывки и улучшенный способ изготовления.

Источники иммунных эффекторных клеток

В этом разделе предусмотрены дополнительные способы или стадии для получения исходного образца, содержащего требуемые иммунные эффекторные клетки, выделения и обработки требуемых иммунных эффекторных клеток, например T-клеток, и удаления нежелательных материалов, например нежелательных клеток. Дополнительные способы или стадии, описанные в этом разделе, можно использовать в комбинации с любым из следующего: элютриация, центрифугирование в градиенте плотности, отбор в условиях потока, улучшенная стадия промывки, описанных в предыдущих разделах.

Источник клеток, например T-клеток или естественных клеток-киллеров (NK), можно получить от субъекта. Примеры субъектов включают людей, обезьян, шимпанзе, собак, кошек, мышей, крыс и их трансгенные формы. Т-клетки можно получить из ряда источников, в том числе из мононуклеарных клеток периферической крови, костного мозга, ткани лимфатических узлов, пуповинной крови, ткани тимуса, ткани из очага инфекции, асцита, плеврального выпота, ткани селезенки и опухолей.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения иммунные эффекторные клетки, например Т-клетки, можно получать из единицы крови, собранной у субъекта, с помощью любого количества методик, известных специалисту в данной области техники, и любого из способов, раскрытых в данном документе, при любой комбинации их стадий. В некоторых вариантах осуществления клетки из циркулирующей крови организма индивидуума получают путем афереза. Продукт афереза обычно содержит лимфоциты, в том числе Т-клетки, моноциты, гранулоциты, В-клетки, другие ядросодержащие лейкоциты, эритроциты и тромбоциты. В некоторых вариантах осуществления клетки, собранные путем афереза, можно промыть, чтобы удалить фракцию плазмы крови, и необязательно поместить клетки в соответствующий буфер или среду для последующих стадий обработки. В некоторых вариантах осуществления клетки промывают фосфатно-солевым буферным раствором (PBS). В некоторых вариантах осуществления в растворе для промывания отсутствует кальций и может отсутствовать магний или могут отсутствовать многие, если практически все, двухвалентные катионы. В некоторых вариантах осуществления клетки промывают с применением улучшенной стадии промывания, описанной в данном документе.

Начальные стадии активации в отсутствие кальция могут приводить к усиленной активации. Как будет очевидно для специалистов средней квалификации в данной области техники, стадию промывания можно осуществлять с помощью способов, известных специалистам в данной области техники, как, например, с применением полуавтоматической "проточной" центрифуги (например, устройства для обработки клеток Cobe 2991, CytoMate^TM от Baxter или Cell Saver 5 от Haemonetics), Cell Saver Elite от Haemonetics (Sepax или Sefia от GE Healthcare) или устройства, в котором используется технология фильтрации с помощью крутящейся мембраны (LOVO от Fresenius Kabi), в соответствии с инструкциями производителя. После промывания клетки можно ресуспендировать в различных биосовместимых буферах, таких как, например, PBS, не содержащий Ca и не содержащий Mg, PlasmaLyte A, PBS-EDTA, дополненный сывороточным альбумином человека (HSA), или другой солевой раствор с буфером или без него. В качестве альтернативы, нежелательные компоненты из образца, полученного путем афереза, можно удалить, и клетки можно ресуспендировать непосредственно в культуральной среде.

В некоторых вариантах осуществления требуемые иммунные клетки, например Т-клетки, выделяют из лимфоцитов периферической крови путем лизиса эритроцитов и истощения по моноцитам, например, посредством центрифугирования в градиенте PERCOLL^TM или посредством противоточного элютриационного центрифугирования.

Способы, описанные в данном документе, могут включать, например, отбор конкретной субпопуляции иммунных эффекторных клеток, например Т-клеток, которая представляет собой популяцию клеток, истощенную по регуляторным Т-клеткам, например с истощением по CD25+ клеткам или истощением по CD25^высок. клеткам, с помощью, например, методики отрицательного отбора, например, описанной в данном документе. В некоторых вариантах осуществления популяция клеток, истощенная по регуляторным T-клеткам, содержит менее 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% CD25+ клеток или CD25^высок. клеток.

В некоторых вариантах осуществления регуляторные T-клетки, например CD25+ T-клетки или CD25^высок. Т-клетки, удаляют из популяции с помощью антитела к CD25 или его фрагмента или CD25-связывающего лиганда, например IL-2. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD25 или его фрагмент или CD25-связывающий лиганд конъюгированы с субстратом, например гранулой, или в ином случае покрывают субстрат, например гранулу. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD25 или его фрагмент, конъюгированы с субстратом, описанным в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления регуляторные T-клетки, например CD25+ T-клетки или CD25^высок. Т-клетки, удаляют из популяции с помощью реагента для истощения по CD25 от Miltenyi^TM. В некоторых вариантах осуществления соотношение клеток и реагента для истощения по CD25 составляет 1e7 клеток на 20 мкл или 1e7 клеток на 15 мкл, или 1e7 клеток на 10 мкл, или 1e7 клеток на 5 мкл, или 1e7 клеток на 2,5 мкл, или 1e7 клеток на 1,25 мкл. В некоторых вариантах осуществления, например, для регуляторных Т-клеток используют более 500 миллионов клеток/мл. В некоторых вариантах осуществления используют концентрацию клеток, составляющую 600, 700, 800 или 900 миллионов клеток/мл.

В некоторых вариантах осуществления популяция иммунных эффекторных клеток, подлежащая истощению, содержит приблизительно 6×10⁹ CD25+ T-клеток. В некоторых вариантах осуществления популяция иммунных эффекторных клеток, подлежащая истощению, содержит от приблизительно 1×10⁹ до 1×10¹⁰ CD25+ Т-клеток, включая любое целочисленное значение в данном промежутке. В некоторых вариантах осуществления полученная популяция, истощенная по регуляторным T-клеткам, содержит 2×10⁹ регуляторных T-клеток, например CD25+ клеток или CD25^высок. клеток, или меньше (например, 1×10⁹, 5×10⁸, 1×10⁸, 5×10⁷, 1×10⁷ или меньше регуляторных T-клеток).

В некоторых вариантах осуществления регуляторные T-клетки, например CD25+ клетки или CD25^высок. клетки, удаляют из популяции с помощью системы CliniMACS с набором трубок для истощения, таким как, например трубки 162-01. В некоторых вариантах осуществления система CliniMACS работает с установленными параметрами истощения, например, такими как DEPLETION2.1.

Не ограничиваясь конкретной теорией, полагают, что уменьшение уровня отрицательных регуляторов иммунных клеток (например, уменьшения количества нежелательных иммунных клеток, например Treg-клеток) у субъекта до афереза или в ходе производства продукта на основе клетки, экспрессирующей CAR, обеспечивает значительное снижение риска рецидива у субъекта. Например, способы истощения по Treg-клеткам известны из уровня техники. Способы уменьшения количества Treg-клеток включают без ограничения применение циклофосфамида, антитела к GITR (антитела к GITR, описанного в данном документе), реагента для истощения по CD25 и их комбинаций.

В некоторых вариантах осуществления способы изготовления включают снижение количества (например, истощение) Treg-клеток до изготовления клетки, экспрессирующей CAR. Например, способы изготовления предусматривают приведение образца, например образца, полученного путем афереза, в контакт с антителом к GITR и/или антителом к CD25 (или его фрагментом или CD25-связывающим лигандом), например, для истощения по Treg-клеткам до изготовления продукта на основе клетки (например, T-клетки, NK-клетки), экспрессирующей CAR.

Не ограничиваясь конкретной теорией, полагают, что посредством уменьшения уровня отрицательных регуляторов иммунных клеток (например, уменьшения количества нежелательных иммунных клеток, например Treg-клеток) у субъекта до афереза или в ходе производства продукта на основе клетки, экспрессирующей CAR, можно снизить риск рецидива у субъекта. В некоторых вариантах осуществления субъект получает предварительное лечение с помощью одного или нескольких средств терапии, которые обеспечивают снижение количества Treg-клеток, перед сбором клеток для изготовления продукта на основе клетки, экспрессирующей CAR, за счет чего обеспечивается снижение риска рецидива у субъекта при лечении с помощью клеток, экспрессирующих CAR. В некоторых вариантах осуществления способы уменьшения количества Treg-клеток включают без ограничения введение субъекту одного или нескольких из циклофосфамида, антитела к GITR, реагента для истощения по CD25 или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления способы уменьшения количества Treg-клеток включают без ограничения введение субъекту одного или нескольких из циклофосфамида, антитела к GITR, реагента для истощения по CD25 или их комбинации. Введение одного или нескольких из циклофосфамида, антитела к GITR, реагента для истощения по CD25 или их комбинации может происходить до, во время или после инфузии продукта на основе клетки, экспрессирующей CAR. Введение одного или нескольких из циклофосфамида, антитела к GITR, реагента для истощения по CD25 или их комбинации может происходить до, во время или после инфузии продукта на основе клетки, экспрессирующей CAR.

В некоторых вариантах осуществления способы изготовления включают снижение количества (например, истощение) Treg-клеток до изготовления клетки, экспрессирующей CAR. Например, способы изготовления предусматривают приведение образца, например образца, полученного путем афереза, в контакт с антителом к GITR и/или антителом к CD25 (или его фрагментом или CD25-связывающим лигандом), например, для истощения по Treg-клеткам до изготовления продукта на основе клетки (например, T-клетки, NK-клетки), экспрессирующей CAR.

В некоторых вариантах осуществления субъект получает предварительное лечение с помощью циклофосфамида перед сбором клеток для производства продукта на основе клетки, экспрессирующей CAR, за счет чего обеспечивается снижение риска рецидива у субъекта при лечении с помощью клеток, экспрессирующих CAR (например, лечении с помощью CTL019). В некоторых вариантах осуществления субъект получает предварительное лечение с помощью антитела к GITR перед сбором клеток для производства продукта на основе клетки (например, T-клетки или NK-клетки), экспрессирующей CAR, за счет чего обеспечивается снижение риска рецидива у субъекта при лечении с помощью клеток, экспрессирующих CAR.

В некоторых вариантах осуществления процесс производства клетки, экспрессирующей CAR (например, T-клетки, NK-клетки), модифицируют для обеспечения истощения по Treg-клеткам до производства продукта на основе клетки, экспрессирующей CAR (например, T-клетки, NK-клетки) (например, продукта CTL019). В некоторых вариантах осуществления истощение по CD25 применяют для истощения по Treg-клеткам до производства продукта на основе клетки (например, T-клетки, NK-клетки), экспрессирующей CAR (например, продукта CTL019).

В некоторых вариантах осуществления популяция клеток, которая должна быть удалена, не представляет собой ни регуляторные Т-клетки, ни опухолевые клетки, а представляет собой клетки, которые в иных отношениях отрицательно влияют на размножение и/или функцию CART-клеток, например, клетки, экспрессирующие CD14, CD11b, CD33, CD15 или другие маркеры, экспрессируемые потенциально иммуносупрессорными клетками. В некоторых вариантах осуществления предполагается, что такие клетки удаляют одновременно с регуляторными Т-клетками и/или опухолевыми клетками, или после указанного истощения, или в другом порядке.

Способы, описанные в данном документе, могут включать более одной стадии отбора, например более одной стадии истощения. Обогащение популяции Т-клеток путем отрицательного отбора можно осуществлять, например, с помощью комбинации антител, направленных на маркеры поверхности, уникальные для клеток, подвергаемых отрицательному отбору. Один из способов представляет собой сортировку и/или отбор клеток с помощью отрицательной магнитной иммуноадгезии или проточной цитометрии, в которых используется коктейль моноклональных антител, направленных на маркеры клеточной поверхности, присутствующие на клетках, подвергаемых отрицательному отбору. Например, для обогащения CD4+ клетками путем отрицательного отбора коктейль моноклональных антител может содержать антитела к CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR и CD8.

Способы, описанные в данном документе, могут дополнительно включать удаление из популяции клеток, экспрессирующих опухолевый антиген, например, опухолевый антиген, который не включает CD25, например CD19, CD30, CD38, CD123, CD20, CD14 или CD11b, с получением таким образом популяции, истощенной по регуляторным Т-клеткам, например истощенной по CD25+ клеткам или истощенной по CD25^высок. клеткам и истощенной по клеткам с опухолевым антигеном, которые подходят для экспрессии CAR, например CAR, описанного в данном документе. В некоторых вариантах осуществления клетки, экспрессирующие опухолевый антиген, удаляют одновременно с регуляторными Т-клетками, например CD25+ клетками или CD25^высок. клетками. Например, антитело к CD25 или его фрагмент и антитело к опухолевому антигену или его фрагмент могут быть присоединены к одному и тому же субстрату, например грануле, который можно использовать для удаления клеток, или антитело к CD25 или его фрагмент или антитело к опухолевому антигену или его фрагмент могут быть присоединены к отдельным гранулам, смесь которых можно использовать для удаления клеток. В других вариантах осуществления удаление регуляторных Т-клеток, например, CD25+ клеток или CD25^высок. клеток, и удаление клеток, экспрессирующих опухолевый антиген, является последовательным и может происходить, например, в любом порядке.

Также предусмотрены способы, которые включают удаление из популяции клеток, экспрессирующих ингибитор контрольной точки иммунного ответа, например ингибитор контрольной точки иммунного ответа, описанный в данном документе, например одного или нескольких из PD1+ клеток, LAG3+ клеток и TIM3+ клеток, с получением таким образом популяции, истощенной по регуляторным Т-клеткам, например истощенной по CD25+ клеткам и истощенной по клеткам с ингибитором контрольной точки иммунного ответа, например истощенной по PD1+, LAG3+ и/или TIM3+ клеткам. Иллюстративные ингибиторы контрольных точек иммунного ответа включают PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, молекулу MHC I класса, молекулу MHC II класса, GAL9, аденозин и TGF (например, TGF-бета), например, как описано в данном документе. В некоторых вариантах осуществления клетки, экспрессирующие ингибитор контрольных точек иммунного ответа, удаляют одновременно с регуляторными Т-клетками, например CD25+ клетками или CD25^высок. клетками. Например, антитело к CD25 или его фрагмент и антитело к ингибитору контрольной точки иммунного ответа или его фрагмент могут быть присоединены к одной и той же грануле, которую можно использовать для удаления клеток, или антитело к CD25 или его фрагмент и антитело к ингибитору контрольной точки иммунного ответа или его фрагмент могут быть присоединены к отдельным гранулам, смесь которых можно использовать для удаления клеток. В других вариантах осуществления удаление регуляторных Т-клеток, например CD25+ клеток или CD25^высок. клеток, и удаление клеток, экспрессирующих ингибитор контрольных точек иммунного ответа, является последовательным и может происходить, например, в любом порядке.

Способы, описанные в данном документе, могут включать стадию положительного отбора. Например, Т-клетки можно выделять путем инкубирования с гранулами, конъюгированными с антителами к CD3/антителами к CD28 (например, 3×28), такими как Dynabeads^® M-450 CD3/CD28 T, в течение периода времени, достаточного для положительного отбора требуемых Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления период времени составляет приблизительно 30 минут. В некоторых вариантах осуществления период времени находится в диапазоне от 30 минут до 36 часов или большее и включает все целочисленные значения в данном промежутке. В некоторых вариантах осуществления период времени составляет по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5 или 6 часов. В некоторых вариантах осуществления период времени составляет от 10 до 24 часов, например 24 часа. Более длительное время инкубирования можно использовать для выделения Т-клеток в любой ситуации, при которой Т-клеток немного по сравнению с другими типами клеток, как, например, при выделении лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль (TIL), из опухолевой ткани или у индивидуумов с ослабленным иммунитетом. Кроме того, при использовании более длительного времени инкубирования может увеличиваться эффективность захвата CD8+ Т-клеток. Таким образом, просто сокращая или удлиняя время, в течение которого Т-клетки имеют возможность связываться с гранулами с антителами к CD3/CD28, и/или увеличивая или уменьшая соотношение гранул и Т-клеток (как дополнительно описано в данном документе), можно предпочтительно осуществлять положительный или отрицательный отбор субпопуляций Т-клеток в начале культивирования или в другие моменты времени в ходе процесса. Кроме того, путем увеличения или уменьшения соотношения антител к CD3 и/или антител к CD28 на гранулах или другой поверхности можно предпочтительно осуществлять положительный или отрицательный отбор субпопуляций Т-клеток в начале культивирования или в другие необходимые моменты времени.

В некоторых вариантах осуществления можно выбрать популяцию Т-клеток, которые экспрессируют один или несколько из IFN-γ, TNFα, IL-17A, IL-2, IL-3, IL-4, GM-CSF, IL-10, IL-13, гранзима В и перфорина или других соответствующих молекул, например других цитокинов. Способы скрининга в отношении клеточной экспрессии можно определить, например, с помощью способов, описанных в публикации согласно PCT № WO 2013/126712.

Для выделения необходимой популяции клеток путем положительного или отрицательного отбора, можно варьировать концентрацию клеток и поверхность (например, частицы, такие как гранулы). В определенных аспектах может быть необходимым значительно уменьшить объем, в котором гранулы и клетки смешиваются друг с другом (например, увеличить концентрацию клеток), чтобы обеспечить максимальный контакт клеток и гранул. Например, в некоторых вариантах осуществления используют концентрацию, составляющую 10 миллиардов клеток/мл, 9 миллиардов/мл, 8 миллиардов/мл, 7 миллиардов/мл, 6 миллиардов/мл или 5 миллиардов/мл. В некоторых вариантах осуществления используют концентрацию, составляющую 1 миллиард клеток/мл. В некоторых вариантах осуществления используют концентрацию клеток, составляющую от 75, 80, 85, 90, 95 или 100 миллионов клеток/мл. В некоторых вариантах осуществления можно использовать концентрации, составляющие 125 или 150 миллионов клеток/мл.

Использование высоких концентраций может приводить к увеличению выхода клеток, активации клеток и размножения клеток. Кроме того, использование высоких концентраций клеток позволяет более эффективно захватывать клетки, которые могут характеризоваться слабой экспрессией антигенов-мишеней, представляющих интерес, такие как CD28-отрицательные Т-клетки, или клетки из образцов, в которых присутствует много опухолевых клеток (например, лейкозной крови, опухолевой ткани и т. д.). Такие популяции клеток могут иметь терапевтическую ценность, и может потребоваться их получение. Например, использование высокой концентрации клеток позволяет проводить более эффективный отбор CD8+ Т-клеток, которые обычно характеризуются более слабой экспрессией CD28.

В некоторых вариантах осуществления может потребоваться использование более низких концентраций клеток. Благодаря значительному разбавлению смеси Т-клеток и поверхности (например, частиц, таких как гранулы), взаимодействие между частицами и клетками сводится к минимуму. При этом отбираются клетки, которые экспрессируют необходимые антигены, подлежащие связыванию с частицами, в высоких количествах. Например, CD4+ T-клетки экспрессируют CD28 на более высоких уровнях и захватываются в слабых концентрациях более эффективно, чем CD8+ T-клетки. В некоторых вариантах осуществления используемая концентрация клеток составляет 5×10⁶/мл. В некоторых вариантах осуществления используемая концентрация может составлять от приблизительно 1 х 10⁵/мл до 1 х 10⁶/мл, включая любое целочисленное значение в данном промежутке.

В некоторых вариантах осуществления клетки можно инкубировать на ротаторе в течение различных промежутков времени с различными скоростями при 2-10^oC либо при комнатной температуре.

В некоторых вариантах осуществления множество иммунных эффекторных клеток в популяции не экспрессируют диацилглицеринкиназу (DGK), например характеризуются дефицитом DGK. В некоторых вариантах осуществления множество иммунных эффекторных клеток в популяции не экспрессируют Ikaros, например характеризуются дефицитом Ikaros. В некоторых вариантах осуществления множество иммунных эффекторных клеток в популяции не экспрессируют DGK и Ikaros, например характеризуются дефицитом как DGK, так и Ikaros.

Т-клетки для стимуляции также можно замораживать после стадии промывания. Не желая ограничиваться какой-либо теорией, полагают, что стадия замораживания и последующего размораживания обеспечивает получение более однородного продукта за счет удаления гранулоцитов и в некоторой степени моноцитов из популяции клеток. После стадии промывания, на которой удаляют плазму крови и тромбоциты, клетки можно суспендировать в замораживающем растворе. Хотя многие замораживающие растворы и параметры для замораживания известны из уровня техники и будут применимыми в данном случае, один способ предусматривает использование PBS, содержащего 20% DMSO и 8% человеческий сывороточный альбумин, или культуральных сред, содержащих 10% декстран 40 в 5% декстрозе, 20% человеческий сывороточный альбумин и 7,5% DMSO или 31,25% PlasmaLyte-А, 31,25% раствор с 5% декстрозой в 0,45% NaCl, 10% декстран 40 в 5% декстрозе, 20% человеческий сывороточный альбумин и 7,5% DMSO, или других подходящих сред для замораживания клеток, содержащих, например, Hespan и PlasmaLyte A, и затем клетки замораживают до -80°C со скоростью 1° в минуту и хранят в паровой фазе в резервуаре для хранения жидкого азота. Можно применять другие способы контролируемого замораживания, а также неконтролируемого замораживания немедленно при -20°C или в жидком азоте.

В некоторых вариантах осуществления криоконсервированные клетки размораживают и промывают, как описано в данном документе, и оставляют на один час при комнатной температуре до активации с применением способов по настоящему изобретению.

В контексте настоящего изобретения также предусмотрен сбор образцов крови или продукта афереза у субъекта в период времени до того, как могут понадобиться размноженные клетки, описанные в данном документе. Ввиду этого источник клеток, подлежащих размножению, можно собирать в любой необходимый момент времени, и необходимые клетки, такие как Т-клетки, можно выделять и замораживать для последующего применения в терапии с использованием иммунных эффекторных клеток для любых заболеваний или состояний, при которых будет благоприятной терапия с использованием иммунных эффекторных клеток, таких как описанные в данном документе. В некоторых вариантах осуществления образец крови или образец, полученный путем афереза, берут у в целом здорового субъекта. В некоторых вариантах осуществления образец крови или образец, полученный путем афереза, берут у в целом здорового субъекта, для которого существует риск развития заболевания, но у которого заболевание еще не развилось, и клетки, представляющие интерес, выделяют и замораживают для последующего применения. В некоторых вариантах осуществления Т-клетки можно размножать, замораживать и использовать позднее. В некоторых вариантах осуществления образцы собирают у пациента вскоре после диагностирования конкретного заболевания, описанного в данном документе, однако до проведения каких-либо видов лечения. В некоторых вариантах осуществления клетки выделяют из образца крови или образца, полученного путем афереза, у субъекта до осуществления какого-либо количества соответствующих способов лечения, в том числе без ограничения лечения такими средствами, как натализумаб, эфализумаб, противовирусные средства, химиотерапия, лучевая терапия, иммуносупрессивные средства, такие как циклоспорин, азатиоприн, метотрексат, микофенолят и FK506, антитела или другие иммунодеструктивные средства, такие как CAMPATH, антитела к CD3, цитоксан, флударабин, циклоспорин, FK506, рапамицин, микофеноловая кислота, стероиды, FR901228 и облучение.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения Т-клетки получают от пациента непосредственно после лечения, при котором у субъекта остаются функциональные Т-клетки. В данном отношении наблюдалось, что после определенных видов лечения рака, в частности видов лечения лекарственными средствами, которые повреждают иммунную систему, вскоре после лечения в течение периода, когда пациенты обычно восстанавливаются после лечения, качество полученных Т-клеток может быть оптимальным или улучшенным в отношении их способности размножаться ex vivo. Аналогично, после манипуляций ex vivo с применением способов, описанных в данном документе, эти клетки могут находиться в состоянии, предпочтительном для улучшенного приживления и размножения in vivo. Таким образом, в контексте настоящего изобретения рассматривается сбор клеток крови, в том числе Т-клеток, дендритных клеток или других клеток гемопоэтической линии дифференцировки, во время этой фазы восстановления. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления можно использовать мобилизацию (например, мобилизацию с помощью GM-CSF) и режимы кондиционирования для создания у субъекта состояния, благоприятного для репопуляции, рециркуляции, регенерации и/или размножения определенных типов клеток, особенно в течение определенного временного окна после терапии. Иллюстративные типы клеток включают Т-клетки, В-клетки, дендритные клетки и другие клетки иммунной системы.

В некоторых вариантах осуществления иммунные эффекторные клетки, экспрессирующие молекулу CAR, например молекулу CAR, описанную в данном документе, получают от субъекта, который получил низкую повышающую иммунитет дозу ингибитора mTOR. В некоторых вариантах осуществления популяцию иммунных эффекторных клеток, например Т-клеток, подлежащих конструированию для экспрессии CAR, собирают спустя достаточное количество времени или после достаточного введения низкой дозы ингибитора mTOR, усиливающей иммунный ответ, так, чтобы уровень PD1-отрицательных иммунных эффекторных клеток, например Т-клеток, или соотношение PD1-отрицательных иммунных эффекторных клеток, например Т-клеток, и PD1-положительных иммунных эффекторных клеток, например Т-клеток, у субъекта или в материале, собранном у субъекта, по меньшей мере транзиентно были повышены.

В других вариантах осуществления популяция иммунных эффекторных клеток, например Т-клеток, которые были сконструированы или будут сконструированы для экспрессии CAR, может быть обработана ex vivo путем приведения ее в контакт с таким количеством ингибитора mTOR, которое обеспечивает увеличение количества PD1-отрицательных иммунных эффекторных клеток, например Т-клеток, или обеспечивает увеличение соотношения PD1-отрицательных иммунных эффекторных клеток, например Т-клеток, и PD1-положительных иммунных эффекторных клеток, например Т-клеток.

Признано, что в способах применения можно использовать условия для культуральных сред, содержащих человеческую сыворотку крови AB с концентрацией 5% или меньше, например 2%, и использовать известные условия и составы культуральных сред, например, описанные в Smith et al., "Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS^TM Immune Cell Serum Replacement" Clinical & Translational Immunology (2015) 4, e31; doi:10.1038/cti.2014.31.

В некоторых вариантах осуществления в способах применения можно использовать условия для сред, содержащих по меньшей мере about 0,1%, 0,5%, 1,0%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% или 10% сыворотки. В некоторых вариантах осуществления среда содержит приблизительно 0,5%-5%, приблизительно 0,5%-4,5%, приблизительно 0,5%-4%, приблизительно 0,5%-3,5%, приблизительно 0,5%-3%, приблизительно 0,5%-2,5%, приблизительно 0,5%-2%, приблизительно 0,5%-1,5%, приблизительно 0,5%-1,0%, приблизительно 1,0%-5%, приблизительно 1,5%-5%, приблизительно 2%-5%, приблизительно 2,5%-5%, приблизительно 3%-5%, приблизительно 3,5%-5%, приблизительно 4%-5% или приблизительно 4,5%-5% сыворотки. В некоторых вариантах осуществления среда содержит приблизительно 0,5% сыворотки. В некоторых вариантах осуществления среда содержит приблизительно 0,5% сыворотки. В некоторых вариантах осуществления среда содержит приблизительно 1% сыворотки. В некоторых вариантах осуществления среда содержит приблизительно 1,5% сыворотки. В некоторых вариантах осуществления среда содержит приблизительно 2% сыворотки. В некоторых вариантах осуществления среда содержит приблизительно 2,5% сыворотки. В некоторых вариантах осуществления среда содержит приблизительно 3% сыворотки. В некоторых вариантах осуществления среда содержит приблизительно 3,5% сыворотки. В некоторых вариантах осуществления среда содержит приблизительно 4% сыворотки. В некоторых вариантах осуществления среда содержит приблизительно 4,5% сыворотки. В некоторых вариантах осуществления среда содержит приблизительно 5% сыворотки. В некоторых вариантах осуществления сыворотка предусматривает человеческую сыворотку, например человеческую сыворотку AB. В некоторых вариантах осуществления сыворотка представляет собой человеческую сыворотку, которой позволили естественно свернуться после сбора, например, сыворотка без тромбоцитов (OTC). В некоторых вариантах осуществления сыворотка представляет собой полученную из плазмы человеческую сыворотку. Полученную из плазмы сыворотку можно получить путем удаления фибриногена из объединенной человеческой плазмы, собранной в присутствии антикоагулянта, например цитрата натрия.

В некоторых вариантах осуществления в способах применения можно использовать условия для культуральных сред, включающих бессывороточную среду. В некоторых вариантах осуществления бессывороточная среда представляет собой OpTmizer^TM CTS^TM (LifeTech), ImmunoCult^TM XF (Stemcell Technologies), CellGro^TM (CellGenix), TexMacs^TM (Miltenyi), Stemline^TM (Sigma), Xvivo15^TM (Lonza), PrimeXV^® (Irvine Scientific) или StemXVivo^® (RandD systems). Бессывороточную среду, можно дополнять таким имитатором сыворотки, как ICSR (заменитель сыворотки для иммунных клеток) от LifeTech. Уровень имитатора сыворотки (например, ICSR) может составлять, например, до 5%, например приблизительно 1%, 2%, 3%, 4% или 5%. В некоторых вариантах осуществления бессывороточную среду можно дополнять сывороткой, например человеческой сывороткой, например, человеческой сывороткой AB. В некоторых вариантах осуществления сыворотка представляет собой человеческую сыворотку, которой позволили естественно свернуться после сбора, например, сыворотка без тромбоцитов (OTC). В некоторых вариантах осуществления сыворотка представляет собой полученную из плазмы человеческую сыворотку. Полученную из плазмы сыворотку можно получить путем удаления фибриногена из объединенной человеческой плазмы, собранной в присутствии антикоагулянта, например цитрата натрия.

В некоторых вариантах осуществления Т-клетки в популяции характеризуются дефицитом диацилглицеринкиназы (DGK). Клетки с дефицитом DGK включают клетки, которые не экспрессируют DGK в виде РНК или белка или характеризуются пониженной или ингибированной активностью DGK. Клетки с дефицитом DGK можно получить с помощью генетических подходов, например путем введения средств для РНК-интерференции, например siRNA, shRNA, miRNA, для снижения или предотвращения экспрессии DGK. В качестве альтернативы, клетки с дефицитом DGK можно получить путем обработки ингибиторами DGK, описанными в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления Т-клетки в популяции характеризуются дефицитом Ikaros. Клетки с дефицитом Ikaros включают клетки, которые не экспрессируют Ikaros в виде РНК или белка или характеризуются пониженной или ингибированной активностью Ikaros; клетки с дефицитом Ikaros можно получить с помощью генетических подходов, например путем введения средств для РНК-интерференции, например siRNA, shRNA, miRNA, для снижения или предотвращения экспрессии Ikaros. В качестве альтернативы, клетки с дефицитом Ikaros можно получить путем обработки ингибиторами Ikaros, например леналидомидом.

В ряде вариантов осуществления популяция Т-клеток характеризуется дефицитом DGK и дефицитом Ikaros, например в ней не происходит экспрессия DGK и Ikaros или она характеризуются сниженной или ингибированной активностью DGK и Ikaros. Такие клетки с дефицитом DGK и Ikaros можно получить любым из способов, описанных в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления NK-клетки получают от субъекта. В некоторых вариантах осуществления NK-клетки представляют собой линию NK-клеток, например линию клеток NK-92 (Conkwest).

Аллогенные клетки, экспрессирующие CAR

В ряде вариантов осуществления, описанных в данном документе, иммунная эффекторная клетка может представлять собой аллогенную иммунную эффекторную клетку, например Т-клетку или NK-клетку. Например, клетка может представлять собой аллогенную Т-клетку, например аллогенную Т-клетку, в которой отсутствует экспрессия функционального Т-клеточного рецептора (TCR) и/или лейкоцитарного антигена человека (HLA), например HLA I класса и/или HLA II класса.

T-клетку, в которой отсутствует функциональный TCR, можно, например, сконструировать таким образом, чтобы она вообще не экспрессировала функциональный TCR на своей поверхности, сконструировать таким образом, чтобы она не экспрессировала одну или несколько субъединиц, которые образуют функциональный TCR (например, сконструировать таким образом, чтобы она не экспрессировала (или демонстрировала сниженную экспрессию) TCR-альфа, TCR-бета, TCR-гамма, TCR-дельта, TCR-эпсилон и/или TCR-дзета), или сконструировать таким образом, чтобы она вырабатывала очень небольшое количество функционального TCR на своей поверхности. В качестве альтернативы, Т-клетка может экспрессировать существенно нарушенный TCR, например, посредством экспрессии мутантных или усеченных форм одной или нескольких субъединиц TCR. Термин "существенно нарушенный TCR" означает, что этот TCR не будет вызывать нежелательную иммунную реакцию у хозяина.

Т-клетку, описанную в данном документе, можно, например, сконструировать таким образом, чтобы она не экспрессировала функциональный HLA на своей поверхности. Например, Т-клетку, описанную в данном документе, можно сконструировать таким образом, чтобы экспрессия HLA, например HLA I класса и/или HLA II класса, на поверхности клетки была подавлена. В некоторых вариантах осуществления подавление экспрессии HLA можно осуществлять с помощью уменьшения или устранения экспрессии бета-2-микроглобулина (B2M).

В некоторых вариантах осуществления в Т-клетке может отсутствовать функциональный TCR и функциональный HLA, например HLA класса I и/или HLA класса II.

Модифицированные Т-клетки, в которых отсутствует экспрессия функционального TCR и/или HLA, можно получить любым подходящим способом, в том числе путем нокаута или нокдауна одной или нескольких субъединиц TCR или HLA. Например, можно предусмотреть нокдаун TCR и/или HLA в Т-клетке с помощью siRNA, shRNA, коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных группами (CRISPR), эффекторной нуклеазы, подобной активаторам транскрипции (TALEN), или эндонуклеазы с "цинковыми пальцами" (ZFN).

В некоторых вариантах осуществления аллогенная клетка может представлять собой клетку, в которой не экспрессируется или экспрессируется на низких уровнях ингибирующая молекула, например, за счет любого способа, описанного в данном документе. Например, клетка может представлять собой клетку, в которой не экспрессируется или экспрессируется на низких уровнях ингибирующая молекула, например молекула, которая может снижать способность клетки, экспрессирующей CAR, осуществлять иммунный эффекторный ответ. Примеры ингибирующих молекул включают: PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, молекулу MHC I класса, молекулу MHC II класса, GAL9, аденозин и TGF (например, TGF-бета). Ингибирование ингибирующей молекулы, например, путем ингибирования на уровне ДНК, РНК или белка, может оптимизировать функциональные характеристики клетки, экспрессирующей CAR. В ряде вариантов осуществления можно применять ингибирующую нуклеиновую кислоту, например ингибирующую нуклеиновую кислоту, например dsRNA, например siRNA или shRNA, короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами (CRISPR), эффекторную нуклеазу, подобную активаторам транскрипции (TALEN), или эндонуклеазу с "цинковыми пальцами" (ZFN), например, описанные в данном документе.

siРНК и shРНК для ингибирования TCR или HLA

В некоторых вариантах осуществления экспрессию TCR и/или экспрессию HLA можно ингибировать с помощью siRNA или shRNA, нацеливающихся на нуклеиновую кислоту, кодирующую TCR и/или HLA, и/или ингибирующую молекулу, описанную в данном документе (например, PD1, PD-L1, PD- L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, молекулу MHC I класса, молекулу MHC II класса, GAL9, аденозин и TGF-бета), в клетке, например Т-клетке.

Системы экспрессии для siRNA и shRNA и иллюстративные shRNA описаны, например, в абзацах 649 и 650 международной заявки WO2015/142675, поданной 13 марта 2015 года, которая включена посредством ссылки во всей своей полноте.

CRISPR для ингибирования TCR или HLA

Используемые в данном документе "CRISPR", или "CRISPR для TCR и/или HLA", или "CRISPR для ингибирования TCR и/или HLA" относится к набору коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных группами, или к системе, содержащей такой набор повторов. Используемый в данном документе "Cas" относится к CRISPR-ассоциированному белку. Система "CRISPR/Cas" относится к системе, полученной из CRISPR и Cas, которую можно применять для сайленсинга или осуществления мутации гена TCR и/или HLA и/или ингибирующей молекулы, описанной в данном документе (например, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, молекулы MHC I класса, молекулы MHC II класса, GAL9, аденозина и TGF-бета), в клетке, например Т-клетке.

Система CRISPR/Cas и пути ее применения описаны, например, в абзацах 651-658 международной заявки WO2015/142675, поданной 13 марта 2015 года, которая включена посредством ссылки во всей своей полноте.

TALEN для ингибирования TCR и/или HLA

"TALEN", или "TALEN для HLA и/или TCR", или "TALEN для ингибирования HLA и/или TCR" относится к эффекторной нуклеазе, подобной активаторам транскрипции, искусственной нуклеазе, которую можно применять для редактирования гена HLA и/или TCR и/или ингибирующей молекулы, описанной в данном документе (например, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, молекулы MHC I класса, молекулы MHC II класса, GAL9, аденозина и TGF-бета), в клетке, например T-клетке.

TALEN и пути их применения описаны, например, в абзацах 659-665 международной заявки WO2015/142675, поданной 13 марта 2015 года, которая включена посредством ссылки во всей своей полноте.

Нуклеаза с "цинковыми пальцами" для ингибирования HLA и/или TCR

"ZFN", или "нуклеаза с "цинковыми пальцами", или "ZFN для HLA и/или TCR", или "ZFN для ингибирования HLA и/или TCR" относится к нуклеазе с "цинковыми пальцами", искусственной нуклеазе, которую можно применять для редактирования гена HLA и/или TCR и/или ингибирующей молекулы, описанной в данном документе (например, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, молекулы MHC I класса, молекулы MHC II класса, GAL9, аденозина и TGF-бета), в клетке, например T-клетке.

ZFN и пути их применения описаны, например, в абзацах 666-671 международной заявки WO2015/142675, поданной 13 марта 2015 года, которая включена посредством ссылки во всей своей полноте.

Экспрессия теломеразы

Теломеры играют важнейшую роль в персистенции соматических клеток, и их длину поддерживает теломераза (TERT). Длина теломер в клетках CLL может быть очень короткой (Roth et al., "Significantly shorter telomeres in T-cells of patients with ZAP-70+/CD38 chronic lymphocytic leukaemia" British Journal of Haematology, 143, 383-386., August 28 2008) и может быть еще короче в изготовленных CAR-экспрессирующих клетках, например клетках CART19, что ограничивает их потенциал для размножения после адоптивной пересадки пациенту. Экспрессия теломеразы может "спасти" клетки, экспрессирующие CAR, от репликативного истощения.

Не желая ограничиваться какой-либо конкретной теорией, полагают, что в некоторых вариантах осуществления для терапевтической Т-клетки характерна кратковременная персистенция в пациенте вследствие укороченных теломер в Т-клетке; соответственно, трансфекция гена теломеразы может приводить к удлинению теломер в Т-клетке и улучшить персистенцию Т-клетки в пациенте. См. Carl June, "Adoptive T cell therapy for cancer in the clinic", Journal of Clinical Investigation, 117:1466-1476 (2007). Таким образом, в некоторых вариантах осуществления иммунная эффекторная клетка, например Т-клетка, характеризуется эктопической экспрессией субъединицы теломеразы, например каталитической субъединицы теломеразы, например TERT, например hTERT. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения представлен способ получения клетки, экспрессирующей CAR, включающий приведение клетки в контакт с нуклеиновой кислотой, кодирующей субъединицу теломеразы, например каталитическую субъединицу теломеразы, например TERT, например hTERT. Клетку можно приводить в контакт с нуклеиновой кислотой перед приведением в контакт с конструкцией, кодирующей CAR, одновременно с этим или после этого.

Экспрессия теломеразы может быть стабильной (например, нуклеиновая кислота может интегрироваться в геном клетки) или транзиентной (например, нуклеиновая кислота не интегрируется, и уровень экспрессии снижается спустя некоторый период времени, например через несколько дней). Стабильная экспрессия может быть достигнута путем трансфекции или трансдукции клетки с помощью ДНК, кодирующей субъединицу теломеразы и селектируемый маркер, и отбора в отношении стабильных интегрантов. В качестве альтернативы или в комбинации, стабильная экспрессия может быть достигнута посредством сайт-специфической рекомбинации, например, с помощью системы Cre/Lox или FLP/FRT.

Транзиентная экспрессия может предусматривать трансфекцию или трансдукцию нуклеиновой кислотой, например ДНК или РНК, такой как мРНК. В некоторых вариантах осуществления транзиентная трансфекция мРНК позволяет избежать генетической неустойчивости, иногда связанной со стабильной трансфекцией TERT. Транзиентная экспрессия экзогенной теломеразной активности описана, например, в международной заявке WO2014/130909, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В ряде вариантов осуществления трансфекцию субъединицы теломеразы с использованием мРНК проводят в соответствии с платформой Therapeutics™ на основе матричных РНК, коммерциализированной Moderna Therapeutics. Например, способ может представлять собой способ, описанный в патенте США № 8710200, 8822663, 8680069, 8754062, 8664194 или 8680069.

В некоторых вариантах осуществления hTERT характеризуется аминокислотной последовательностью с ID белка в GenBank AAC51724.1 (Meyerson et al., "hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization" Cell, том 90, выпуск 4, 22 августа 1997 г., страницы 785-795): MPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPLATFVRRLGPQGWRLVQRGDPAAFRALVAQCLVCVPWDARPPPAAPSFRQVSCLKELVARVLQRLCERGAKNVLAFGFALLDGARGGPPEAFTTSVRSYLPNTVTDALRGSGAWGLLLRRVGDDVLVHLLARCALFVLVAPSCAYQVCGPPLYQLGAATQARPPPHASGPRRRLGCERAWNHSVREAGVPLGLPAPGARRRGGSASRSLPLPKRPRRGAAPEPERTPVGQGSWAHPGRTRGPSDRGFCVVSPARPAEEATSLEGALSGTRHSHPSVGRQHHAGPPSTSRPPRPWDTPCPPVYAETKHFLYSSGDKEQLRPSFLLSSLRPSLTGARRLVETIFLGSRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNHAQCPYGVLLKTHCPLRAAVTPAAGVCAREKPQGSVAAPEEEDTDPRRLVQLLRQHSSPWQVYGFVRACLRRLVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQELTWKMSVRGCAWLRRSPGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMSVYVVELLRSFFYVTETTFQKNRLFFYRKSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRELSEAEVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDYVVGARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVDVTGAYDTIPQDRLTEVIASIIKPQNTYCVRRYAVVQKAAHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFVAHLQETSPLRDAVVIEQSSSLNEASSGLFDVFLRFMCHHAVRIRGKSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGIRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKTFLRTLVRGVPEYGCVVNLRKTVVNFPVEDEALGGTAFVQMPAHGLFPWCGLLLDTRTLEVQSDYSSYARTSIRASLTFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLKCHSLFLDLQVNSLQTVCTNIYKILLLQAYRFHACVLQLPFHQQVWKNPTFFLRVISDTASLCYSILKAKNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQTQLSRKLPGTTLTALEAAANPALPSDFKTILD (SEQ ID NO: 284)

В некоторых вариантах осуществления hTERT имеет последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью с последовательностью под SEQ ID NO: 284. В некоторых вариантах осуществления hТРЕТ имеет последовательность под SEQ ID NO: 284. В некоторых вариантах осуществления hTERT содержит делецию (например, размером не более 5, 10, 15, 20 или 30 аминокислот) на N-конце, С-конце или на них обоих. В некоторых вариантах осуществления hTERT содержит трансгенную аминокислотную последовательность (например, размером не более 5, 10, 15, 20 или 30 аминокислот) на N-конце, C-конце или на них обоих.

В некоторых вариантах осуществления hTERT кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под № доступа в GenBank AF018167 (Meyerson et al., "hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization" Cell, том 90, выпуск 4, 22 августа 1997 г., страницы 785-795):

Активация и размножение иммунных эффекторных клеток (например, T-клеток)

Иммунные эффекторные клетки, такие как Т-клетки, полученные или обогащенные способами, описанными в данном документе, можно активировать и размножать, как правило, с использованием способов, описанных, например, в патентах США №№ 6352694; 6534055; 6905680; 6692964; 5858358; 6887466; 6905681; 7144575; 7067318; 7172869; 7232566; 7175843; 5883223; 6905874; 6797514; 6867041 и публикации заявки на патент США № 20060121005.

Как правило, популяцию иммунных эффекторных клеток можно размножать путем приведения их в контакт с поверхностью, к которой присоединено средство, стимулирующее передачу сигнала, ассоциированного с комплексом CD3/TCR, и лиганд, стимулирующий костимулирующую молекулу на поверхности Т-клеток. В частности, популяции Т-клеток можно стимулировать, как описано в данном документе, например путем приведения в контакт с антителом к CD3 или его антигенсвязывающим фрагментом или антителом к CD2, иммобилизованным на поверхности, или путем приведения в контакт с активатором протеинкиназы С (например, бриостатином) в сочетании с ионофором кальция. Для костимуляции вспомогательной молекулы на поверхности Т-клеток используют лиганд, который связывает вспомогательную молекулу. Например, популяцию Т-клеток можно приводить в контакт с антителом к CD3 и антителом к CD28 в условиях, подходящих для стимуляции пролиферации Т-клеток. Для стимуляции пролиферации CD4+ T-клеток либо CD8+ T-клеток можно применять антитело к CD3 и антитело к CD28. Примеры антитела к CD28 включают 9.3, B-T3, XR-CD28 (Diaclone, Безансон, Франция), и их можно применять, равно как и другие способы, общеизвестные из уровня техники (Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):1319-1328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999).

В некоторых вариантах осуществления первичный стимулирующий сигнал и костимулирующий сигнал для Т-клетки можно обеспечивать с помощью различных протоколов. Например, средства, обеспечивающие каждый сигнал, могут находиться в растворе или быть связаны с поверхностью. В случае, если они связаны с поверхностью, средства могут быть связаны с одной и той же поверхностью (т. е. в "цис"-расположении) или с отдельными поверхностями (т. е. в "транс"-расположении). В качестве альтернативы, одно средство может быть связано с поверхностью, а другое средство может находиться в растворе. В некоторых вариантах осуществления средство, обеспечивающее костимулирующий сигнал, связано с клеточной поверхностью, а средство, обеспечивающее первичный сигнал активации, находится в растворе или связано с поверхностью. В некоторых вариантах осуществления оба средства могут находиться в растворе. В некоторых вариантах осуществления средства могут находиться в растворимой форме, а затем их сшивают с поверхностью, такой как клетка, экспрессирующая Fc-рецепторы, или антитело или другое связывающее средство, которое будет связываться с данными средствами. В этом отношении см., например, публикации заявок на патент США №№ 20040101519 и 20060034810 в том, что касается искусственных антигенпрезентирующих клеток (aAPC), которые предполагаются для применения в активации и размножении Т-клеток в настоящем изобретении.

В некоторых вариантах осуществления два средства иммобилизованы на гранулах: либо на одной и той же грануле, т. е. в "цис"-положении, либо на отдельных гранулах, т. е. в "транс"-положении. В качестве примера, средство, обеспечивающее первичный сигнал активации, представляет собой антитело к CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент, а средство, обеспечивающее костимулирующий сигнал, представляет собой антитело к CD28 или его антигенсвязывающий фрагмент; и оба средства совместно иммобилизованы на одной и той же грануле в эквивалентных молекулярных количествах. В некоторых вариантах осуществления для размножения CD4+ T-клеток и роста T-клеток каждое антитело, связанное с гранулами, применяют в соотношении 1:1. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения используют такое соотношение антител к CD3:CD28, связанных с гранулами, при котором наблюдается повышение интенсивности размножения Т-клеток по сравнению с размножением, наблюдаемым при использовании соотношения 1:1. В некоторых вариантах осуществления наблюдается повышение в от приблизительно 1 до приблизительно 3 раз по сравнению с размножением, наблюдаемым при использовании соотношения 1:1. В некоторых вариантах осуществления соотношение антител к CD3:CD28, связанных с гранулами, находится в диапазоне от 100:1 до 1:100 и включает все целочисленные значения в этом промежутке. В некоторых вариантах осуществления с частицами связано больше антител к CD28, чем антител к CD3, т. е. соотношение антител к CD3:CD28 составляет меньше единицы. В некоторых вариантах осуществления соотношение антитела к CD28 и антитела к CD3, связанных с гранулами, составляет более чем 2:1. В некоторых вариантах осуществления антитела к CD3 и CD28, связанные с гранулами, используют в соотношении 1:100. В некоторых вариантах осуществления антитела к CD3 и CD28, связанные с гранулами, используют в соотношении 1:75. В некоторых вариантах осуществления антитела к CD3 и CD28, связанные с гранулами, используют в соотношении 1:50. В некоторых вариантах осуществления антитела к CD3 и CD28, связанные с гранулами, используют в соотношении 1:30. В некоторых вариантах осуществления антитела к CD3 и CD28, связанные с гранулами, используют в соотношении 1:10. В некоторых вариантах осуществления антитела к CD3 и CD28, связанные с гранулами, используют в соотношении 1:3. В некоторых вариантах осуществления антитела к CD3 и CD28, связанные с гранулами, используют в соотношении 3:1.

Для стимуляции Т-клеток или других клеток-мишеней можно использовать соотношения частиц и клеток от 1:500 до 500:1 с включением любых целочисленных значений в этом промежутке. Как будет очевидно для специалистов средней квалификации в данной области техники, соотношение частиц и клеток может зависеть от размера частиц относительно клетки-мишени. Например, гранулы небольшого размера могут связывать лишь немного клеток, тогда как более крупные гранулы могут связывать много клеток. В некоторых вариантах осуществления соотношение клеток и частиц находится в диапазоне от 1:100 до 100:1 и включает любые целочисленные значения в этом промежутке, и в некоторых вариантах осуществления соотношение составляет от 1:9 до 9:1 и включает любые целочисленные значения в этом промежутке, и его также можно использовать для стимуляции Т-клеток. Соотношение частиц, связанных с антителами к CD3 и антителами к CD28, и Т-клеток, которое приводит к стимуляции Т-клеток, может варьировать, как отмечено выше, однако определенные подходящие значения включают 1:100, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1 и 15:1, при этом одно подходящее соотношение составляет по меньшей мере 1:1 для частиц на Т-клетку. В некоторых вариантах осуществления используют соотношение частиц и клеток, составляющее 1:1 или меньше. В некоторых вариантах осуществления подходящее соотношение частицы:клетки составляет 1:5. В некоторых вариантах осуществления соотношение частиц и клеток можно варьировать в зависимости от дня стимуляции. Например, в некоторых вариантах осуществления соотношение частиц и клеток составляет от 1:1 до 10:1 в первый день, и после этого к клеткам ежедневно или раз в два дня добавляют дополнительные частицы в течение периода до 10 дней при конечных соотношениях от 1:1 до 1:10 (в пересчете на количество клеток в день добавления). В некоторых вариантах осуществления соотношение частиц и клеток составляет 1:1 в первый день стимуляции и доводится до 1:5 в третий и пятый дни стимуляции. В некоторых вариантах осуществления частицы добавляют на каждый день или раз в два дня до конечного соотношения 1:1 в первый день и 1:5 в третий и пятый дни стимуляции. В некоторых вариантах осуществления соотношение частиц и клеток составляет 2:1 в первый день стимуляции и доводится до 1:10 в третий и пятый дни стимуляции. В некоторых вариантах осуществления частицы добавляют на каждый день или раз в два дня до конечного соотношения 1:1 в первый день и 1:10 в третий и пятый дни стимуляции. Специалисту в данной области будет понятно, что для использования в настоящем изобретении может подходить множество других соотношений. В частности, соотношения будут варьироваться в зависимости от размера частиц, а также от размера и типа клеток. В некоторых вариантах осуществления наиболее типичные соотношения для использования составляют примерно 1:1, 2:1 и 3:1 в первый день.

В некоторых вариантах осуществления клетки, такие как Т-клетки, объединяют с гранулами, покрытыми средством, впоследствии гранулы и клетки разделяют, а затем клетки культивируют. В некоторых вариантах осуществления гранулы, покрытые средством, и клетки не разделяют перед культивированием, а культивируют вместе. В некоторых вариантах осуществления гранулы и клетки вначале концентрируют путем приложения силы, такой как сила магнитного поля, что приводит к увеличению лигирования маркеров клеточной поверхности, за счет чего обеспечивается индукция стимуляции клеток.

В качестве примера, белки клеточной поверхности можно лигировать, обеспечивая возможность контакта парамагнитных гранул, к которым присоединены антитела к CD3 и антитела к CD28 (гранул 3 × 28), и Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления клетки (например, от 10⁴ до 10⁹ T-клеток) и гранулы (например, парамагнитные гранулы DYNABEADS^® M-450 CD3/CD28 T в соотношении 1:1) объединяют в буфере, например PBS (без двухвалентных катионов, таких как кальций и магний). Специалистам средней квалификации в данной области техники также будет очевидно, какую концентрацию клеток можно использовать. Например, клетка-мишень может очень редко встречаться в образце и составлять только 0,01% образца, или весь образец (т. е. 100%) может состоять из клетки-мишени, представляющей интерес. Соответственно, любое количество клеток находится в рамках настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления может потребоваться значительно уменьшить объем, в котором частицы и клетки смешивают друг с другом (т. е. увеличить концентрацию клеток), чтобы гарантировать максимальный контакт клеток и частиц. Например, в некоторых вариантах осуществления используют концентрацию, составляющую приблизительно 10 миллиардов клеток/мл, 9 миллиардов/мл, 8 миллиардов/мл, 7 миллиардов/мл, 6 миллиардов/мл, 5 миллиардов/мл или 2 миллиарда клеток/мл. В некоторых вариантах осуществления используют более 100 миллионов клеток/мл. В некоторых вариантах осуществления используют концентрацию клеток, составляющую 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 миллионов клеток/мл. В некоторых вариантах осуществления используют концентрацию клеток, составляющую от 75, 80, 85, 90, 95 или 100 миллионов клеток/мл. В некоторых вариантах осуществления можно использовать концентрации, составляющие 125 или 150 миллионов клеток/мл. Использование высоких концентраций может приводить к увеличению выхода клеток, активации клеток и размножения клеток. Кроме того, использование высоких концентраций клеток позволяет более эффективно захватывать клетки, которые могут характеризоваться слабой экспрессией антигенов-мишеней, представляющих интерес, такие как CD28-отрицательные Т-клетки. Такие популяции клеток могут иметь терапевтическую ценность, и в некоторых вариантах осуществления может требоваться их получение. Например, использование высокой концентрации клеток позволяет проводить более эффективный отбор CD8+ Т-клеток, которые обычно характеризуются более слабой экспрессией CD28.

В некоторых вариантах осуществления клетки, трансдуцированные нуклеиновой кислотой, кодирующей CAR, например CAR, описанный в данном документе, например CAR для CD19, описанный в данном документе, размножают, например, посредством способа, описанного в данном документе. В некоторых вариантах осуществления клетки размножают в культуре в течение периода времени, который составляет от нескольких часов (например, приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 18, 21 часа) до приблизительно 14 дней (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 дней). В некоторых вариантах осуществления клетки размножают в течение периода от 4 до 9 дней. В некоторых вариантах осуществления клетки размножают в течение периода времени, который составляет 8 дней или меньше, например 7, 6 или 5 дней. В некоторых вариантах осуществления клетки размножают в культуре в течение 5 дней, и полученные клетки являются более активными, чем те же самые клетки, размножаемые в культуре в течение 9 дней при тех же условиях культивирования. Эффективность можно определить, например, по различным Т-клеточным функциям, например пролиферации, уничтожению клеток-мишеней, продуцированию цитокинов, активации, миграции, экспрессии CAR на поверхности, с помощью количественного ПЦР в отношении CAR или их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления клетки, например CAR-клетка для CD19, описанная в данном документе, размножаемые в течение 5 дней, демонстрируют по меньшей мере одно-, двух-, трех- или четырехкратное увеличение интенсивности удвоения клеток при стимуляции антигеном по сравнению с теми же клетками, размножаемыми в культуре в течение 9 дней при тех же условиях культивирования. В некоторых вариантах осуществления клетки, например клетки, экспрессирующие CAR для CD19, описанные в данном документе, размножают в культуре в течение 5 дней, и полученные клетки демонстрируют более высокие уровни продуцирования провоспалительных цитокинов, например уровни IFN-γ и/или GM-CSF, по сравнению с теми же клетками, размножаемыми в культуре в течение 9 дней при тех же условиях культивирования. В некоторых вариантах осуществления клетки, например, CAR-клетка для CD19, описанная в данном документе, размножаемые в течение 5 дней демонстрируют по меньшей мере одно-, двух-, трех-, четырех-, пяти-, десятикратное или большее повышение уровней продуцирования провоспалительных цитокинов в пг/мл, например уровней IFN-γ и/или GM-CSF, по сравнению с теми же клетками, размножаемыми в культуре в течение 9 дней при тех же условиях культивирования.

Также могут потребоваться несколько циклов стимуляции, вследствие чего время культивирования Т-клеток может составлять 60 дней или больше. Условия, подходящие для культивирования Т-клеток, включают подходящие среды (например, минимальную питательную среду, α-MEM, среду RPMI 1640, AIM-V, DMEM, F-12 или X-vivo 15 (Lonza), X-Vivo 20, OpTmizer и IMDM), которые могут содержать факторы, необходимые для пролиферации и жизнеспособности, в том числе сыворотку (например, фетальную бычью или человеческую сыворотку), интерлейкин-2 (IL-2), инсулин, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ и TNF-α или любые другие добавки для роста клеток, известные специалисту в данной области техники. Другие добавки для роста клеток включают без ограничения поверхностно-активное вещество, плазманат и восстановители, такие как N-ацетилцистеин и 2-меркаптоэтанол. Среды могут включать без ограничения RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 15 и X-Vivo 20, OpTmizer и IMDM с добавлением аминокислот, пирувата натрия и витаминов, либо без сыворотки, либо с добавлением соответствующего количества сыворотки (или плазмы) крови, или определенного набора гормонов и/или количества цитокина(цитокинов), достаточных для роста и размножения Т-клеток. Антибиотики, например пенициллин и стрептомицин, включают только в экспериментальные культуры, но не в культуры клеток, которые предназначены для инфузии субъекту. Клетки-мишени содержатся в условиях, необходимых для поддержания роста, например при соответствующей температуре (например, 37°C) и параметрах атмосферного воздуха (например, воздух с 5% CO₂).

В некоторых вариантах осуществления клетки размножают в подходящей среде (например, среде, описанной в данном документе), содержащей один или несколько интерлейкинов, которые приводят к по меньшей мере 200-кратному (например, к 200-кратному, 250-кратному, 300-кратному, 350-кратному) увеличению количества клеток в течение 14-дневного периода размножения, например, согласно измерению посредством способа, описанного в данном документе, такого как проточная цитометрия. В некоторых вариантах осуществления клетки размножают в присутствии IL-15 и/или IL-7 (например, IL-15 и IL-7).

В ряде вариантов осуществления способы, описанные в данном документе, например способы изготовления клеток, экспрессирующих CAR, включают удаление регуляторных T-клеток, например CD25+ T-клеток или CD25^высок. Т-клеток, из популяции клеток, например, с помощью антитела к CD25 или его фрагмента или CD25-связывающего лиганда IL-2. Способы удаления регуляторных Т-клеток, например CD25+ Т-клеток или CD25^высок. Т-клеток, из популяции клеток описаны в данном документе. В ряде вариантов осуществления способы, например способы изготовления, дополнительно включают приведение популяции клеток (например, популяции клеток, которая была истощена по регуляторным T-клеткам, таким как CD25+ T-клетки или CD25^высок. Т-клетки; или популяции клеток, которая ранее была приведена в контакт с антителом к CD25, его фрагментом или CD25-связывающим лигандом) в контакт с IL-15 и/или IL-7. Например, популяцию клеток (например, популяцию, которая ранее была приведена в контакт с антителом к CD25, его фрагментом или CD25-связывающим лигандом) размножают в присутствии IL-15 и/или IL-7.

В некоторых вариантах осуществления клетку, экспрессирующую CAR, описанную в данном документе, приводят в контакт с композицией, содержащей полипептид интерлейкин-15 (IL-15), полипептид альфа-субъединицу рецептора интерлейкина-15 (IL-15Ra) или комбинацию, как полипептида IL-15, так и полипептида IL-15Ra, например hetIL-15, в ходе изготовления клетки, экспрессирующей CAR, например ex vivo. В ряде вариантов осуществления клетку, экспрессирующую CAR, описанную в данном документе, приводят в контакт с композицией, содержащей полипептид IL-15, в ходе изготовления клетки, экспрессирующей CAR, например ex vivo. В ряде вариантов осуществления клетку, описанную в данном документе, экспрессирующую CAR, приводят в контакт с композицией, содержащей комбинацию как полипептида IL-15, так и полипептида IL-15Ra, в ходе изготовления клетки, экспрессирующей CAR, например ex vivo. В ряде вариантов осуществления клетку, экспрессирующую CAR, описанную в данном документе, приводят в контакт с композицией, содержащей hetIL-15, в ходе изготовления клетки, экспрессирующей CAR, например ex vivo.

В некоторых вариантах осуществления клетку, экспрессирующую CAR, описанную в данном документе, приводят в контакт с композицией, содержащей hetIL-15, в ходе размножения ex vivo. В некоторых вариантах осуществления описанную в данном документе клетку, экспрессирующую CAR, приводят в контакт с композицией, содержащей полипептид IL-15, в ходе размножения ex vivo. В некоторых вариантах осуществления клетку, экспрессирующую CAR, описанную в данном документе, приводят в контакт с композицией, содержащей как полипептид IL-15, так и полипептид IL-15Ra, в ходе размножения ex vivo. В некоторых вариантах осуществления приведение в контакт приводит к выживанию и пролиферации субпопуляции лимфоцитов, например CD8+ T-клеток.

Т-клетки, которые подвергались стимуляции в течение разных периодов времени, могут демонстрировать разные характеристики. Например, в типичных препаратах крови или продуктах афереза мононуклеарных клеток периферической крови популяция Т-клеток-хелперов (TH, CD4+) превосходит по числу популяцию цитотоксических Т-клеток или Т-клеток-супрессоров (TC, CD8+). Размножение Т-клеток ex vivo путем стимуляции рецепторов CD3 и CD28 приводит к получению популяции Т-клеток, которая до приблизительно дней 8-9 состоит главным образом из ТН-клеток, тогда как после приблизительно дней 8-9 популяция Т-клеток содержит все более многочисленную популяцию TC-клеток. Соответственно, в зависимости от цели лечения может быть преимущественной инфузия субъекту популяции Т-клеток, содержащей главным образом ТН-клетки. Аналогично, если была выделена антигенспецифическая субпопуляция TC-клеток, то может быть целесообразным размножение этой субпопуляции в большей степени.

Кроме того, в ходе процесса размножения клеток в дополнение к маркерам CD4 и CD8 в значительной степени, но по большей части воспроизводимо, варьируются уровни других фенотипических маркеров. Таким образом, подобная воспроизводимость дает возможность адаптировать продукт на основе активированных Т-клеток для конкретных целей.

После конструирования CAR, описанного в данном документе, можно применять различные анализы для оценки активности молекулы, такой как без ограничения, способность Т-клеток размножаться после стимуляции антигеном, устойчивое размножение Т-клеток при отсутствии повторной стимуляции и формы противораковой активности, в соответствующих моделях in vitro и моделях на животных. Анализы для оценки эффектов CAR по настоящему изобретению описаны более подробно ниже.

Вестерн-блот-анализ экспрессии CAR в первичных T-клетках можно применять для выявления присутствия мономеров и димеров, например, как описано в абзаце 695 международной заявки WO2015/142675, поданной 13 марта 2015 года, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Размножение CAR⁺ Т-клеток in vitro после стимуляции антигеном можно измерить с помощью проточной цитометрии. Например, смесь CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеток стимулируют с помощью aAPC с αCD3/αCD28, а затем трансдуцируют лентивирусными векторами, экспрессирующими GFP под контролем промоторов, подлежащих анализу. Иллюстративные промоторы включают промоторы генов IE CMV, EF-1α, убиквитина С или фосфоглицераткиназы (PGK). Флуоресценцию GFP оценивают с помощью проточной цитометрии в день 6 культивирования в субпопуляциях CD4⁺ и/или CD8⁺ T-клеток. См., например, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). В качестве альтернативы, смесь CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеток стимулируют с помощью магнитных гранул, покрытых αCD3/αCD28, в день 0 и трансдуцируют с помощью CAR в день 1 с применением бицистронного лентивирусного вектора, экспрессирующего CAR вместе с eGFP с использованием последовательности 2A для "проскока" рибосомы. Культуры повторно стимулируют клетками K562, положительными⁺ в отношении антигена, ассоциированного с раком, описанного в данном документе (K562, экспрессирующими антиген, ассоциированный с раком, описанный в данном документе), клетками K562 дикого типа (K562 дикого типа) либо клетками K562, экспрессирующими hCD32 и 4-1BBL в присутствии антитела к CD3 и антитела к CD28 (K562-BBL-3/28). Экзогенный IL-2 добавляют в культуры раз в два дня из расчета 100 МЕ/мл. GFP⁺ Т-клетки подсчитывают с помощью проточной цитометрии с применением подсчета по гранулам. См., например, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009).

Также можно измерять уровень устойчивости размножения CAR⁺ T-клеток при отсутствии повторной стимуляции. См., например, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Вкратце, измеряют средний объем Т-клеток (фл) в день 8 культивирования с использованием устройства для подсчета частиц Multisizer III или более поздней версии от Coulter, Cellometer Vision от Nexcelom или Scepter от Millipore или других устройств для подсчета клеток после стимуляции с помощью магнитных гранул, покрытых αCD3/αCD28, в день 0 и трансдукции с помощью указанного CAR в день 1.

Модели на животных также можно использовать для измерения активности клеток, экспрессирующих CAR, например, как описано в абзаце 698 международной заявки WO2015/142675, поданной 13 марта 2015 года, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Дозозависимый ответ на лечение с помощью CAR можно оценивать, например, как описано в абзаце 699 международной заявки WO2015/142675, поданной 13 марта 2015 года, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Оценка пролиферации клеток и выработки цитокинов была описана ранее, как описано в абзаце 700 международной заявки WO2015/142675, поданной 13 марта 2015 года, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Цитотоксичность можно оценить с помощью стандартного анализа высвобождения 51Cr, например, как описано в абзаце 701 международной заявки WO2015/142675, поданной 13 марта 2015 года, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Также можно использовать альтернативные способы без применения радиоактивных изотопов.

Цитотоксичность можно также оценить посредством измерения изменений электрического импеданса адгезивных клеток, например, с помощью анализатора клеток в реальном времени (RTCA) xCELLigence. В некоторых вариантах осуществления измеряется в нескольких моментах времени.

Для оценки специфической миграции и пролиферации CAR в моделях на животных, несущих опухоль, можно применять технологии визуализации, например, как описано в абзаце 702 международной заявки WO2015/142675, поданной 13 марта 2015 года, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Также можно применять другие анализы, включая анализы, описанные в данном документе в разделе "Примеры", а также анализы, которые известны из уровня техники, для оценки CAR, описанных в данном документе.

В качестве альтернативы или в комбинации со способами, раскрытыми в данном документе, раскрыты способы и композиции для одного или нескольких из выявления и/или количественного определения клеток, экспрессирующих CAR (например, in vitro или in vivo (например, клинического мониторинга)); размножения и/или активации иммунных клеток и/или CAR-специфического отбора, которые предусматривают применение лиганда CAR. В некоторых вариантах осуществления лиганд CAR представляет собой антитело, которое связывается с молекулой CAR, например связывается с внеклеточным антигенсвязывающим доменом CAR (например, антитело, которое связывается с антигенсвязывающим доменом, например антиидиотипическое антитело; или антитело, которое связывается с константной областью внеклеточного связывающего домена). В других вариантах осуществления лиганд CAR представляет собой молекулу антигена CAR (например, молекулу антигена CAR, описанную в данном документе).

В некоторых вариантах осуществления раскрыт способ выявления и/или количественного определения клеток, экспрессирующих CAR. Например, лиганд CAR можно применять для выявления и/или количественного определения клеток, экспрессирующих CAR, in vitro или in vivo (например, для клинического мониторинга клеток, экспрессирующих CAR, у пациента или введения доз пациенту). Способ включает:

получение лиганда CAR (необязательно меченого лиганда CAR, например лиганда CAR, который содержит маркер, гранулу, радиоактивную или флуоресцентную метку);

получение клетки, экспрессирующей CAR (например, получение образца, содержащего клетки, экспрессирующие CAR, такого как производственный образец или клинический образец);

приведение клетки, экспрессирующей CAR, в контакт с лигандом CAR в условиях, при которых происходит связывание, за счет чего обеспечивается выявление уровня (например, количества) присутствующих клеток, экспрессирующих CAR. Связывание клетки, экспрессирующей CAR, с лигандом CAR можно выявлять с помощью стандартных методик, таких как FACS, ELISA и т. п.

В некоторых вариантах осуществления раскрыт способ размножения и/или активации клеток (например, иммунных эффектoрных клеток). Способ включает:

получение клетки, экспрессирующей CAR (например, первой клетки, экспрессирующей CAR, или клетки, транзиентно экспрессирующей CAR);

приведение указанной клетки, экспрессирующей CAR, в контакт с лигандом CAR (например, лигандом CAR, описанным в данном документе) в условиях, при которых происходит размножение и/или пролиферация иммунных клеток, с получением таким образом популяции активированных и/или размноженных клеток.

В определенных вариантах осуществления лиганд CAR присутствует на субстрате (например, является иммобилизованным на субстрате, например не встречающемся в природе субстрате, или присоединенным к нему). В некоторых вариантах осуществления субстрат представляет собой неклеточный субстрат. Неклеточный субстрат может представлять собой твердую подложку, выбранную из, например планшета (например, титрационного микропланшета), мембраны (например, нитроцеллюлозной мембраны), матрицы, чипа или гранулы. В вариантах осуществления лиганд CAR присутствует в субстрате (например, на поверхности субстрата). Лиганд CAR может быть иммобилизован на субстрате, присоединен к нему или ковалентно или нековалентно ассоциирован (например, сшит) с ним. В некоторых вариантах осуществления лиганд CAR присоединен (например, ковалентно присоединен) к грануле. В вышеуказанных вариантах осуществления популяцию иммунных клеток можно размножать in vitro или ex vivo. Способ может дополнительно включать культивирование популяции иммунных клеток в присутствии лиганда молекулы CAR, например, с помощью любого из способов, описанных в данном документе.

В других вариантах осуществления способ размножения и/или активации клеток дополнительно включает добавление второй стимулирующей молекулы, например CD28. Например, лиганд CAR и вторая стимулирующая молекула могут быть иммобилизованы на субстрате, например на одной или нескольких гранулах, за счет чего обеспечивается увеличение интенсивности размножения и/или активации клеток.

В некоторых вариантах осуществления предусмотрен способ отбора клетки, экспрессирующей CAR, или обогащения по такой клетке. Способ включает приведение клетки, экспрессирующей CAR, в контакт с лигандом CAR, описанным в данном документе; и отбор клетки на основании связывания с лигандом CAR.

В еще нескольких других вариантах осуществления представлен способ истощения популяции, снижения количества и/или уничтожения клеток, экспрессирующих CAR. Способ включает приведение клетки, экспрессирующей CAR, в контакт с лигандом CAR, описанным в данном документе; и нацеливание на клетку на основании связывания с лигандом CAR, за счет чего обеспечивается снижение количества и/или уничтожение клеток, экспрессирующих CAR. В некоторых вариантах осуществления лиганд CAR связан с токсичным средством (например, токсином или лекарственным средством, разрушающим клетки). В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело может обуславливать активность эффекторных клеток, например формы активности ADCC или ADC.

Иллюстративные антитела к CAR, которые можно использовать в способах, раскрытых в данном документе, описаны, например, в WO 2014/190273 и в Jena et al.,"Chimeric Antigen Receptor (CAR)-Specific Monoclonal Antibody to Detect CD19-Specific T cells in Clinical Trials", PLOS March 2013 8:3 e57838, содержание которых включено посредством ссылки.

В некоторых вариантах осуществления композиции и способы в данном документе оптимизированы для конкретной субпопуляции Т-клеток, например, как описано в заявке на патент США с регистрационным № PCT/US2015/043219, поданной 31 июля 2015 года, содержание которой включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В некоторых вариантах осуществления оптимизированные субпопуляции T-клеток проявляют повышенную персистенцию по сравнению с контрольной T-клеткой, например T-клеткой другого типа (например, CD8+ или CD4+), экспрессирующей такую же конструкцию.

В некоторых вариантах осуществления CD4+ T-клетка содержит CAR, описанный в данном документе, при этом CAR содержит внутриклеточный сигнальный домен, подходящий для CD4+ T-клетки (например, оптимизированный для, например, приведения к ее повышенной персистенции), например домен ICOS. В некоторых вариантах осуществления CD8+ T-клетка содержит CAR, описанный в данном документе, при этом CAR содержит внутриклеточный сигнальный домен, подходящий для CD8+ T-клетки (например, оптимизированный для, например, приведения к ее повышенной персистенции), например домен 4-1BB, домен CD28 или другой костимулирующий домен, отличный от домена ICOS. В некоторых вариантах осуществления CAR, описанный в данном документе, содержит антигенсвязывающий домен, описанный в данном документе, например, представляет собой CAR, содержащий антигенсвязывающий домен.

В некоторых вариантах осуществления в данном документе описан способ лечения субъекта, например субъекта, у которого имеется рак. Способ включает введение указанному субъекту эффективного количества:

1) CD4+ T-клетки, содержащей CAR (CARCD4+), который содержит:

антигенсвязывающий домен, например антигенсвязывающий домен, описанный в данном документе;

трансмембранный домен; и

внутриклеточный сигнальный домен, например первый костимулирующий домен, например домен ICOS; и

2) CD8⁺ T-клетки, содержащей CAR (CARCD8+), который содержит:

антигенсвязывающий домен, например антигенсвязывающий домен, описанный в данном документе;

трансмембранный домен; и

внутриклеточный сигнальный домен, например второй костимулирующий домен, например домен 4-1BB, домен CD28 или другой костимулирующий домен, отличный от домена ICOS;

где CARCD4+ и CARCD8+ отличаются друг от друга.

Способ необязательно дополнительно включает введение:

3) второй CD8+ T-клетки, содержащей CAR (второй CARCD8+), который содержит:

антигенсвязывающий домен, например антигенсвязывающий домен, описанный в данном документе;

трансмембранный домен; и

внутриклеточный сигнальный домен, где второй CARCD8+ содержит внутриклеточный сигнальный домен, например костимулирующий сигнальный домен, отсутствующий в CARCD8+ и необязательно не содержит сигнального домена ICOS.

Способы доставки с помощью биополимеров

В некоторых вариантах осуществления одну или несколько клеток, экспрессирующих CAR, раскрытых в данном документе, можно вводить или доставлять субъекту посредством биополимерного каркаса, например биополимерного имплантата. Биополимерные каркасы могут поддерживать или усиливать доставку, размножение и/или распространение клеток, экспрессирующих CAR, описанных в данном документе. Биополимерный каркас содержит биосовместимый (например, который по существу не индуцирует воспалительный или иммунный ответ) и/или биоразлагаемый полимер, который может быть встречающимся в природе или синтетическим. Иллюстративные биополимеры описаны, например, в абзацах 1004-1006 международной заявки WO2015/142675, поданной 13 марта 2015 года, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Фармацевтические композиции и средства для лечения

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает способ лечения пациента, включающий введение клеток, экспрессирующих CAR, полученных, как описано в данном документе, необязательно в комбинации с одним или несколькими другими видами терапии. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает способ лечения пациента, включающий введение реакционной смеси, содержащей клетки, экспрессирующие CAR, описанные в данном документе, необязательно в комбинации с одним или несколькими другими видами терапии. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает способ доставки или приема реакционной смеси, содержащей клетки, экспрессирующие CAR, описанные в данном документе. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает способ лечения пациента, включающий прием клетки, экспрессирующей CAR, которая была получена, как описано в данном документе и дополнительно включающий введение клетки, экспрессирующей CAR, пациенту, необязательно в комбинации с одним или несколькими другими видами терапии. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает способ лечения пациента, включающий получение клетки, экспрессирующей CAR, описанной в данном документе и дополнительно включающий введение клетки, экспрессирующей CAR, пациенту, необязательно в комбинации с одним или несколькими другими видами терапии. Другим видом терапии может быть, например, противораковая терапия, такая как химиотерапия.

В некоторых вариантах осуществления клетки, экспрессирующие CAR, описанные в данном документе, вводят субъекту в комбинации с молекулой, которая обеспечивает уменьшение популяции Treg-клеток. Способы, которые обеспечивают уменьшение количества (например, приводят к истощению) Treg-клеток, известны из уровня техники и включают, например, истощение по CD25, введение циклофосфамида, модулирование функции GITR. Не ограничиваясь теорией, полагают, что снижение количества Treg-клеток у субъекта до афереза или до введения клетки, экспрессирующей CAR, описанной в данном документе, снижает количество нежелательных иммунных клеток (например, Treg) в микроокружении опухоли и снижает риск рецидива у субъекта.

В некоторых вариантах осуществления средство терапии, описанное в данном документе, например, клетку, экспрессирующую CAR, вводят субъекту в комбинации с молекулой, которая нацеливается на GITR и/или модулирует функции GITR, такой как антагонист GITR и/или антитело к GITR, которые обеспечивают истощение по регуляторным Т-клеткам (Treg). В ряде вариантов осуществления клетки, экспрессирующие CAR, описанные в данном документе, вводят субъекту в комбинации с циклофосфамидом. В некоторых вариантах осуществления молекулы, связывающие GITR, и/или молекулы, модулирующие функции GITR (например, агонист GITR и/или антитела к GITR, обеспечивающие истощение по Treg), вводят до введения клетки, экспрессирующей CAR. Например, в некоторых вариантах осуществления агонист GITR можно вводить до афереза клеток. В ряде вариантов осуществления циклофосфамид вводят субъекту до введения (например, до инфузии или повторной инфузии) клетки, экспрессирующей CAR, или до афереза клеток. В ряде вариантов осуществления циклофосфамид и антитело к GITR вводят субъекту до введения (например, инфузии или повторной инфузии) клетки, экспрессирующей CAR, или до афереза клеток. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется рак (например, солидный рак или гематологический рак, такой как ALL или CLL). В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется CLL. В ряде вариантов осуществления у субъекта имеется ALL. В ряде вариантов осуществления у субъекта имеется солидный рак, например солидный рак, описанный в данном документе. Иллюстративные агонисты GITR включают, например, слитые белки на основе GITR и антитела к GITR (например, бивалентные антитела к GITR), такие как, например, слитый белок на основе GITR, описанный в патенте США № 6111090, европейском патенте № 090505B1, патенте США № 8586023, публикациях согласно PCT №№ WO 2010/003118 и 2011/090754, или антитело к GITR, описанное, например, в патенте США № 7025962, европейском патенте № 1947183B1, патенте США № 7812135, патенте США № 8388967, патенте США № 8591886, европейском патенте № EP 1866339, публикации согласно PCT № WO 2011/028683, публикации согласно PCT № WO 2013/039954, публикации согласно PCT № WO2005/007190, публикации согласно PCT № WO 2007/133822, публикации согласно PCT № WO2005/055808, публикации согласно PCT № WO 99/40196, публикации согласно PCT № WO 2001/03720, публикации согласно PCT № WO99/20758, публикации согласно PCT № WO2006/083289, публикации согласно PCT № WO 2005/115451, патенте США № 7618632 и публикации согласно PCT № WO 2011/051726.

В некоторых вариантах осуществления клетку, экспрессирующую CAR, описанную в данном документе, вводят субъекту в комбинации с агонистом GITR, например агонистом GITR, описанным в данном документе. В некоторых вариантах осуществления агонист GITR вводят до введения клетки, экспрессирующей CAR. Например, в некоторых вариантах осуществления агонист GITR можно вводить до афереза клеток. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется CLL.

Способы, описанные в данном документе, могут дополнительно включать составление клетки, экспрессирующей CAR, в виде фармацевтической композиции. Фармацевтические композиции могут содержать клетку, экспрессирующую CAR, например множество клеток, экспрессирующих CAR, описанных в данном документе, в комбинации с одним или несколькими фармацевтически или физиологически приемлемыми носителями, разбавителями или наполнителями. Такие композиции могут содержать буферы, такие как нейтральный буферный солевой раствор, фосфатно-солевой буферный раствор и т. п.; углеводы, такие как глюкоза, манноза, сахароза или декстраны, маннит; белки; полипептиды или аминокислоты, такие как глицин; антиоксиданты; хелатообразующие средства, такие как EDTA или глутатион; адъюванты (например, гидроксид алюминия) и консерванты. Композиции можно составлять, например, для внутривенного введения.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция по существу не содержит загрязнителя, например, выбранного из группы, состоящей из эндотоксина, микоплазмы, репликационно-компетентного лентивируса (RCL), p24, нуклеиновой кислоты VSV-G, gag HIV, остаточных количеств гранул, покрытых антителами к CD3/антителами к CD28, антител мыши, объединенной человеческой сыворотки, бычьего сывороточного альбумина, бычьей сыворотки, компонентов культуральных сред, клеточных или плазмидных компонентов для упаковки векторов, бактерии и гриба, например, в ней отсутствуют его поддающиеся выявлению уровни. В некоторых вариантах осуществления бактерия представляет собой по меньшей мере бактерию, выбранную из группы, состоящей из Alcaligenes faecalis, Candida albicans, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae и Streptococcus pyogenes группы A.

В случае, если указано "иммунологически эффективное количество", "эффективное противораковое количество", "количество, эффективное для ингибирования рака" или "терапевтическое количество", точное количество композиций, подлежащих введению, может быть определено врачом с учетом индивидуальных различий в возрасте, массе тела, размере опухоли, степени инфицирования или метастазирования и состояния пациента (субъекта). В целом, можно отметить, что фармацевтическую композицию, содержащую иммунные эффекторные клетки (например, T-клетки, NK-клетки), описанные в данном документе, можно вводить в дозе от 10⁴ до 10⁹ клеток/кг массы тела, в некоторых случаях от 10⁵ до 10⁶ клеток/кг массы тела, включая все целочисленные значения в пределах данных диапазонов. Композиции на основе Т-клеток можно также вводить несколько раз в этих дозах. Клетки можно вводить с помощью методик инфузии, которые являются общеизвестными в иммунотерапии (см., например, Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988).

В некоторых вариантах осуществления доза CAR-клеток (например, CAR-клеток для CD19) составляет приблизительно 1×10⁶, 1,1×10⁶, 2×10⁶, 3,6×10⁶, 5×10⁶, 1×10⁷, 1,8×10⁷, 2×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁸, 2×10⁸ или 5×10⁸ клеток/кг. В некоторых вариантах осуществления доза CAR-клеток (например, CAR-клеток для CD19) составляет по меньшей мере приблизительно 1×10⁶, 1,1×10⁶, 2×10⁶, 3,6×10⁶, 5×10⁶, 1×10⁷, 1,8×10⁷, 2×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁸, 2×10⁸ или 5×10⁸ клеток/кг. В некоторых вариантах осуществления доза CAR-клеток (например, CAR-клеток для CD19) составляет не более приблизительно 1×10⁶, 1,1×10⁶, 2×10⁶, 3,6×10⁶, 5×10⁶, 1×10⁷, 1,8×10⁷, 2×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁸, 2×10⁸ или 5×10⁸ клеток/кг. В некоторых вариантах осуществления доза CAR-клеток (например, CAR-клеток для CD19) составляет приблизительно 1,1×10⁶-1,8×10⁷ клеток/кг. В некоторых вариантах осуществления доза CAR-клеток (например, CAR-клеток для CD19) составляет приблизительно 1×10⁷, 2×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁸, 2×10⁸, 5×10⁸, 1×10⁹, 2×10⁹ или 5×10⁹ клеток. В некоторых вариантах осуществления доза CAR-клеток (например, CAR-клеток для CD19) составляет по меньшей мере приблизительно 1×10⁷, 2×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁸, 2×10⁸, 5×10⁸, 1×10⁹, 2×10⁹ или 5×10⁹ клеток. В некоторых вариантах осуществления доза CAR-клеток (например, CAR-клеток для CD19) составляет не более приблизительно 1×10⁷, 2×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁸, 2×10⁸, 5×10⁸, 1×10⁹, 2×10⁹ или 5×10⁹ клеток.

В некоторых вариантах осуществления субъекту может потребоваться введение активированных иммунных эффекторных клеток (например, T-клеток, NK-клеток), и тогда последовательно повторно берут кровь (или осуществляют аферез), активируют иммунные эффекторные клетки (например, T-клетки, NK-клетки) из нее и проводят повторную инфузию этих активированных и размноженных иммунных эффекторных клеток (например, T-клеток, NK-клеток) пациенту. Этот процесс можно осуществлять несколько раз каждые несколько недель. В некоторых вариантах осуществления иммунные эффекторные клетки (например, T-клетки, NK-клетки) можно активировать из образцов крови объемом от 10 куб. см до 400 куб. см. В некоторых вариантах осуществления иммунные эффекторные клетки (например, T-клетки, NK-клетки) активируют из образцов крови объемом 20 куб. см, 30 куб. см, 40 куб. см, 50 куб. см, 60 куб. см, 70 куб. см, 80 куб. см, 90 куб. см или 100 куб. см.

Введение рассматриваемых композиций можно осуществлять любым удобным способом. Композиции, описанные в данном документе, можно вводить пациенту трансартериально, подкожно, внутрикожно, интратуморально, интранодально, интрамедуллярно, внутримышечно, с помощью внутривенной (i.v.) инъекции или внутрибрюшинно, например, с помощью внутрикожной или подкожной инъекции. Композиции на основе иммунных эффекторных клеток (например, T-клеток, NK-клеток) можно вводить непосредственно в опухоль, лимфатический узел или очаг инфекции.

Схема введения доз

В некоторых вариантах осуществления доза жизнеспособных клеток, экспрессирующих CAR (например, жизнеспособных клеток, экспрессирующих CAR для CD19, BCMA, CD20 или CD22), составляет от приблизительно 0,5×10⁶ жизнеспособных клеток, экспрессирующих CAR, до приблизительно 1,25×10⁹ жизнеспособных клеток, экспрессирующих CAR (например, от 0,5×10⁶ жизнеспособных клеток, экспрессирующих CAR, до 1,25×10⁹ жизнеспособных клеток, экспрессирующих CAR). В некоторых вариантах осуществления доза жизнеспособных клеток, экспрессирующих CAR (например, жизнеспособных клеток, экспрессирующих CAR для CD19, BCMA, CD20 или CD22), составляет приблизительно 1×10⁶, приблизительно 2,5×10⁶, приблизительно 5×10⁶, приблизительно 1,25×10⁷, приблизительно 2,5×10⁷, приблизительно 5×10⁷, приблизительно 5,75×10⁷ или приблизительно 8×10⁷ жизнеспособных клеток, экспрессирующих CAR.

Отбор пациентов

В некоторых вариантах осуществления любого из способов лечения субъекта или композиции для применения, раскрытых в данном документе, у субъекта имеется рак, например гематологический рак. В некоторых вариантах осуществления рак выбран из лимфоцитарного лейкоза (CLL), лимфомы из клеток мантийной зоны (MCL), множественной миеломы, острого лимфоидного лейкоза (ALL), лимфомы Ходжкина, B-клеточного острого лимфоидного лейкоза (BALL), T-клеточного острого лимфоидного лейкоза (TALL), мелкоклеточного лимфоцитарного лейкоза (SLL), B-клеточного пролимфоцитарного лейкоза, новообразования из бластных плазмоцитоидных дендритных клеток, лимфомы Беркитта, диффузной В-крупноклеточной лимфомы (DLBCL), DLBCL, ассоциированной с хроническим воспалением, хронического миелоидного лейкоза, миелопролиферативных новообразований, фолликулярной лимфомы, фолликулярной лимфомы у детей, волосатоклеточного лейкоза, мелкоклеточной или крупноклеточной фолликулярной лимфомы, злокачественных лимфопролиферативных состояний, MALT-лимфомы (экстранодальной лимфомы маргинальной зоны из лимфоидной ткани слизистых оболочек), лимфомы маргинальной зоны, миелодисплазии, миелодиспластического синдрома, неходжкинской лимфомы, плазмобластной лимфомы, новообразования из плазмоцитоидных дендритных клеток, макроглобулинемии Вальденстрема, лимфомы маргинальной зоны селезенки, лимфомы/лейкоза селезенки, диффузной лимфомы из малых B-клеток красной пульпы селезенки, варианта волосатоклеточного лейкоза, лимфоплазмоцитарной лимфомы, болезни тяжелых цепей, плазмоклеточной миеломы, солитарной плазмоцитомы кости, внекостной плазмоцитомы, нодальной лимфомы маргинальной зоны, нодальной лимфомы маргинальной зоны у детей, первичной кожной лимфомы из клеток центра фолликула, лимфоматоидного гранулематоза, первичной медиастинальной (тимусной) крупноклеточной B-клеточной лимфомы, внутрисосудистой крупноклеточной B-клеточной лимфомы, ALK+ крупноклеточной B-клеточной лимфомы, крупноклеточной B-клеточной лимфомы, возникающей при HHV8-ассоциированной многоочаговой болезни Кастельмана, первичной выпотной лимфомы, B-клеточной лимфомы, острого миелоидного лейкоза (AML) или неклассифицируемой лимфомы. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рецидивирующий и/или рефрактерный рак.

В некоторых вариантах осуществления любого из способов лечения субъекта или композиции для применения, раскрытых в данном документе, у субъекта имеется CLL или SLL В некоторых вариантах осуществления субъекту, у которого имеется CLL или SLL, ранее вводили средство терапии на основе ингибитора BTK, например ибрутиниб, в течение по меньшей мере 1-12 месяцев, например 6 месяцев. В некоторых вариантах осуществления средство терапии на основе ингибитора BTK, например средство терапии ибрутиниб, представляет собой средство терапии второй линии. В некоторых вариантах осуществления у субъекта наблюдался частичный ответ или устойчивое заболевание в ответ на средство терапии на основе ингибитора BTK. В некоторых вариантах осуществления у субъекта не наблюдался ответ на средство терапии на основе ингибитора BTK. В некоторых вариантах осуществления у субъекта развилась устойчивость, например, развились мутации устойчивости к ибрутинибу. В некоторых вариантах осуществления мутации устойчивости к ибрутинибу включают мутацию в гене, кодирующем BTK, и/или гене, кодирующем PLCg2. В некоторых вариантах осуществления субъект представляет собой взрослую особь, например возрастом по меньшей мере 18 лет.

В некоторых вариантах осуществления любого из способов лечения субъекта или композиции для применения, раскрытых в данном документе, у субъекта имеется DLBCL, например рецидивирующий и/или рефрактерный DLBCL. В некоторых вариантах осуществления субъекту, у которого имеется DLBCL, например рецидивирующий и/или рефрактерный DLBCL, ранее вводили по меньшей мере 2 линии средств химиотерапии, например средство терапии на основе антитела к CD20 и/или средство химиотерапии на основе антрациклина. В некоторых вариантах осуществления субъект ранее получал средство терапии на основе стволовых клеток, например средство терапии на основе аутогенных стволовых клеток, и у него не наблюдался ответ на указанное средство терапии на основе стволовых клеток. В некоторых вариантах осуществления субъект не соответствует критериям для применения средства терапии на основе стволовых клеток, например средства терапии на основе аутогенных стволовых клеток. В некоторых вариантах осуществления субъект представляет собой взрослую особь, например возрастом по меньшей мере 18 лет.

Биомаркеры для оценки эффективности CAR

В некоторых вариантах осуществления в данном документе раскрыт способ оценки или мониторинга эффективности средства терапии на основе клетки, экспрессирующей CAR (например, средства терапии на основе CAR для CD19 или BCMA), у субъекта (например, субъект, у которого имеется рак, например гематологический рак). Способ включает сбор данных о величине эффективности средства терапии на основе CAR, где указанная величина является показателем эффективности или пригодности средства терапии на основе клетки, экспрессирующей CAR.

В ряде вариантов осуществления значение эффективности средства терапии на основе CAR у субъекта, у которого имеется CLL или SLL, включает показатель одного, двух, трех или всех следующих параметров:

(i) мутация в гене, кодирующем BTK, в образце (например, образце, полученном путем афереза, или изготовленном образце продукта на основе клетки, экспрессирующей CAR);

(ii) мутация в гене, кодирующем PLCg2, в образце (например, образце, полученном путем афереза, или изготовленном образце продукта на основе клетки, экспрессирующей CAR);

(iii) минимальное остаточное заболевание, например оцененное с помощью уровня и/или активности CD8, CD4, CD3, CD5, CD19, CD20, CD22, CD43, CD79b, CD27, CD45RO, CD45RA, CCR7, CD95, Lag3, PD-1, Tim-3 и/или CD81; или оцененное с помощью глубокого секвенирования иммуноглобулинов; в образце (например, образце, полученном путем афереза, или образце опухоли у субъекта); или

(iv) уровень или активность одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти или всех цитокинов, выбранных из IFN-g, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-15, TNF-a, IP-10, MCP1, MIP1a, в образце, например образце, полученном путем афереза, у субъекта.

В ряде вариантов осуществления значение эффективности средства терапии на основе CAR у субъекта, у которого имеется DLBCL, например рецидивирующий и/или рефрактерный DLBCL, содержит показатель одного или обоих следующих параметров:

(i) минимальное остаточное заболевание, например оцененное с помощью уровня и/или активности CD8, CD4, CAR19, CD3, CD27, CD45RO, CD45RA, CCR7, CD95, Lag3, PD-1 и/или Tim-3; или оцененное с помощью глубокого секвенирования иммуноглобулинов; в образце (например, образце, полученном путем афереза, или образце опухоли у субъекта); или

(ii) уровень или активность одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти или всех цитокинов, выбранных из IFN-g, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-15, TNF-a, IP-10, MCP1, MIP1a, в образце, например образце, полученном путем афереза, у субъекта.

В других вариантах осуществления значение эффективности средства терапии на основе CAR, дополнительно включает показатели одного, двух, трех, четырех, пяти, шести или более (всех) из следующих параметров:

(i) уровень или активность одного, двух, трех или более (например, всех) покоящихся T_EFF-клеток, покоящихся T_REG-клеток, молодых T-клеток (например, необученных Т-клеток (например, необученных CD4- или CD8-T-клеток, необученных гамма/дельта-T-клеток) или стволовых T-клеток памяти (например, стволовых CD4- или CD8-T-клеток памяти, или стволовых гамма/дельта-T-клеток памяти), или ранних T-клеток памяти, или их комбинацию, в образце (например, образце, полученном путем афереза, или изготовленном образце продукта на основе клетки, экспрессирующей CAR);

(ii) уровень или активность одного, двух, трех или более (например, всех) из активированных T_EFF-клеток, активированных T_REG-клеток, старых T-клеток (например, старых CD4- или CD8-клеток), или поздних T-клеток памяти, или их комбинацию, в образце (например, образце, полученном путем афереза, или изготовленном образце продукта на основе клетки, экспрессирующей CAR);

(iii) уровень или активность маркера истощения иммунных клеток, например одного, двух или более ингибиторов контрольных точек иммунного ответа (например, PD-1, PD-L1, TIM-3, TIGIT и/или LAG-3) в образце (например, образце, полученном путем афереза, или изготовленном образце продукта на основе клетки, экспрессирующей CAR). В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка имеет фенотип истощения, например совместно экспрессирует по меньшей мере два маркера истощения, например совместно экспрессирует PD-1 и TIM-3. В других вариантах осуществления иммунная клетка имеет фенотип истощения, например совместно экспрессирует по меньшей мере два маркера истощения, например совместно экспрессирует PD-1 и LAG-3;

(iv) уровень или активность CD27 и/или CD45RO- (например, CD27+ CD45RO-) иммунных эффектoрных клеток, например, в CD4+ или CD8+ популяции Т-клеток, в образце (например, образце, полученном путем афереза, или изготовленном образце продукта на основе клетки, экспрессирующей CAR);

(v) уровень или активность одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати или всех биомаркеров, выбранных из CCL20, IL-17a, IL-6, PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L, KLRG1;

(vi) уровень или активность цитокинов (например, качество репертуара цитокинов) в образце продукта на основе клетки, экспрессирующей CAR, например образце продукта клеток, экспрессирующих CLL-1; или

(vii) эффективность трансдукции клетки, экспрессирующей CAR, в образце полученного продукта на основе клетки, экспрессирующей CAR.

В некоторых вариантах осуществления любого из способов, раскрытых в данном документе, средство терапии на основе клетки, экспрессирующей CAR, содержит множество (например, популяцию) иммунных эффекторных клеток, экспрессирующих CAR, например множество (например, популяцию) T-клеток или NK-клеток или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления средство терапии на основе клетки, экспрессирующей CAR, представляет собой средство терапии на основе клетки, экспрессирующей CAR для CD19.

В некоторых вариантах осуществления любого из способов, раскрытых в данном документе, показатель одного или нескольких параметров, раскрытых в данном документе, получают из образца, полученного путем афереза, взятого у субъекта. Образец афереза можно оценить перед инфузией или повторной инфузией.

В некоторых вариантах осуществления любого из способов, раскрытых в данном документе, показатель одного или нескольких параметров, раскрытых в данном документе, получают из образца опухоли взятого у субъекта.

В некоторых вариантах осуществления любого из способов, раскрытых в данном документе, показатель одного или нескольких параметров, раскрытых в данном документе, получают из изготовленного образца продукта на основе клетки, экспрессирующей CAR, например образца продукта клеток, экспрессирующих CAR для CD19. Полученный продукт на основе клетки, экспрессирующей CAR, можно оценить перед инфузией или повторной инфузией.

В некоторых вариантах осуществления любого из способов, раскрытых в данном документе, оценивание субъекта проводят до получения, во время или после получения средства терапии на основе клетки, экспрессирующей CAR.

В некоторых вариантах осуществления любого из способов раскрытый в данном документе, показатель одного или нескольких параметров, раскрытых в данном документе, оценивает профиль экспрессии одного или нескольких генов, проточной цитометрии или экспрессии белка.

В некоторых вариантах осуществления любого из способов, раскрытых в данном документе, способ дополнительно включает идентификацию субъекта как отвечающего на лечение, не отвечающего на лечение, пациента с рецидивом или пациента без рецидива, на основе показателя одного или нескольких из параметров, раскрытых в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления любого из способов раскрытых в данном документе, пациент, отвечающий на лечение, например пациент, отвечающий на лечение в полной мере, имеет или идентифицирован как имеющий более высокую, например статистически значимо более высокую процентную долю CD8+ T-клеток по сравнению с контрольным значением, например процентной долей CD8+ T-клеток у пациента, не отвечающего на лечение.

В некоторых вариантах осуществления любого из способов, раскрытых в данном документе, пациент, отвечающий на лечение, например пациент, отвечающий на лечение в полной мере, имеет или идентифицирован как имеющий более высокую процентную долю CD27+CD45RO- иммунных эффекторных клеток, например, в популяции CD8 +, по сравнению с контрольным значением, например, количеством CD27+CD45RO иммунных эффекторных клеток у пациента, не отвечающего на лечение.

В некоторых вариантах осуществления любого из способов, раскрытых в данном документе, пациент, отвечающий на лечение, например пациент, отвечающий на лечение в полной мере, или пациент, отвечающий на лечение частично, имеет или идентифицирован как имеющий более высокую, например статистически значимо более высокую, процентную долю CD4+ T-клеток по сравнению с контрольным значением, например процентной долей CD4+ T-клеток у пациента, не отвечающего на лечение.

В некоторых вариантах осуществления любого из способов, раскрытых в данном документе, пациент, отвечающий на лечение, например пациент, отвечающий на лечение в полной мере, имеет или идентифицирован как имеющий более высокую процентную долю одного, двух, трех или более (например всех) из покоящихся T_EFF-клеток, покоящихся T_REG-клеток, молодых T-клеток или ранних T-клеток памяти, или их комбинации, по сравнению с контрольным значением, например количеством покоящихся T_EFF-клеток, покоящихся T_REG-клеток, молодых T-клеток или ранних T-клеток памяти у пациента, не отвечающего на лечение.

В некоторых вариантах осуществления любого из способов, раскрытых в данном документе, пациент, не отвечающий на лечение, имеет или идентифицирован как имеющий более высокую процентную долю одного, двух, трех или более (например всех) из активированных T_EFF-клеток, активированных T_REG-клеток, более старых T-клеток (например, более старых CD4-клеток или CD8-клеток) или поздних T-клеток памяти, или их комбинации, по сравнению с контрольным значением, например количеством активированных T_EFF-клеток, активированных T_REG-клеток, более старых T-клеток (например, более старых CD4-клеток или CD8-клеток) или поздних T-клеток памяти у пациента, отвечающего на лечение.

В некоторых вариантах осуществления любого из способов, раскрытых в данном документе, пациент, не отвечающий на лечение, имеет или идентифицирован как имеющий более высокую процентную долю маркера иммунных клеток, по которому проводится истощение, например одного, двух или более из ингибиторов контрольных точек иммунного ответа (например PD-1, PD-L1, TIM-3,TIGIT и/или LAG-3). В некоторых вариантах осуществления пациент, не отвечающий на лечение, имеет или идентифицирован как имеющий более высокую процентную долю иммунных эффекторных клеток, экспрессирующих PD-1, PD-L1 или LAG-3 (например, CD4+ T-клеток и/или CD8+ T-клеток) (например, CD4+ клеток и/или CD8+ T-клеток, экспрессирующих CAR) по сравнению с процентной долей иммунных эффекторных клеток, экспрессирующих PD-1 или LAG-3, у пациента, отвечающего на лечение.

В некоторых вариантах осуществления пациент, не отвечающий на лечение, имеет или идентифицирован как имеющий более высокую процентную долю иммунных клеток, имеющих фенотип, по которому проводится истощение, например иммунных клеток, которые совместно экспрессируют по меньшей мере два маркера, по которым проводится истощение, например совместно экспрессируют PD-1, PD-L1 и/или TIM-3. В других вариантах осуществления пациент, не отвечающий на лечение, имеет или идентифицирован как имеющий более высокую процентную долю иммунных клеток, имеющих фенотип, по которому проводится истощение, например иммунных клеток, которые совместно экспрессируют по меньшей мере два маркера, по которым проводится истощение, например совместно экспрессируют PD-1 и LAG-3.

В некоторых вариантах осуществления любого из способов, раскрытых в данном документе, у пациента, не отвечающего на лечение, имеется, или он идентифицирован как имеющий более высокую процентную долю PD-1/PD-L1+/LAG-3+ клеток в популяции клеток, экспрессирующих CAR (например, популяции CLL-1CAR+ клеток), по сравнению с пациентом, отвечающим на лечение (например пациентом, отвечающим на лечение в полной мере) с помощью средства терапии на основе клетки, экспрессирующей CAR.

В некоторых вариантах осуществления любого из способов, раскрытых в данном документе, у пациента, отвечающего на лечение (например, пациента, отвечающего на лечение в полной мере или частично), имеется один, два, три или больше (или все) из следующих профилей:

(i) имеется большее количество CD27+ иммунных эффекторных клеток по сравнению с контрольным значением, например количеством CD27+ иммунных эффектoрных клеток у пациента, не отвечающего на лечение;

(ii) имеется большее количество CD8+ T-клеток по сравнению с контрольным значением, например количеством CD8+ T-клеток у пациента, не отвечающего на лечение;

(iii) имеется меньшее количество иммунных клеток, экспрессирующих один или несколько ингибиторов контрольных точек иммунного ответа, например ингибиторов контрольных точек иммунного ответа, выбранных из PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3 или KLRG-1 или их комбинации, по сравнению с контрольным значением, например количеством иммунных клеток, экспрессирующих один или несколько ингибиторов контрольных точек иммунного ответа, у пациента, не отвечающего на лечение; или

(iv) имеется большее количество одной, двух, трех, четырех или более (всех) из покоящихся T_EFF-клеток, покоящихся T_REG-клеток, необученных CD4+ клеток, нестимулированных клеток памяти или ранних T-клеток памяти или их комбинации по сравнению с контрольным значением, например количеством покоящихся T_EFF-клеток, покоящихся T_REG-клеток, необученных CD4+ клеток, нестимулированных клеток памяти или ранних T-клеток памяти у пациента, не отвечающего на лечение.

В ряде вариантов осуществления субъект, который представляет собой пациента, отвечающего на лечение, пациента, не отвечающего на лечение, пациента с рецидивом или пациента без рецидива, идентифицированного с помощью способов, изложенных в данном документе, может быть подвергнут дополнительной оценке в соответствии с клиническими критериями. Например, пациент, отвечающий на лечение в полной мере, является субъектом или идентифицирован как субъект, у которого имеется заболевание, например рак, у которого проявляется полный ответ на лечение, например полная ремиссия. Полный ответ на лечение можно идентифицировать, например, с применением NCCN Guidelines^® или руководства, утвержденного на международном семинаре по хроническому лимфоцитарному лейкозу (iwCLL) 2018 года, как раскрыто в Hallek M et al., Blood (2018) 131:2745-2760 "iwCLL guidelines for diagnosis, indications for treatment, response assessment, and supportive management of CLL", полное содержание которого включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Пациент, отвечающий на лечение частично, является субъектом или идентифицирован как субъект, у которого имеется заболевание, например рак, у которого проявляется частичный ответ на лечение, например частичная ремиссия. Частичный ответ можно идентифицировать, например, с использованием NCCN Guidelines^® или критериев по iwCLL 2018 года, как описано в данном документе. Пациент, не отвечающий на лечение, является субъектом или идентифицирован как субъект, у которого имеется заболевание, например рак, у которого не проявляется ответ на лечение, например у пациента наблюдается стабилизация заболевания или прогрессирование заболевания. Пациента, не отвечающего на лечение, можно идентифицировать, например, с использованием NCCN Guidelines^® или критериев по iwCLL 2018 года, как описано в данном документе.

В качестве альтернативы или в комбинации со способами, раскрытыми в данном документе, с учетом указанной величины осуществляется одно, два, три, четыре или больше из следующего:

введения, например, пациенту, отвечающему на лечение, или пациенту без рецидива, средства терапии на основе клетки, экспрессирующей CAR;

введения измененных доз средства терапии на основе клетки, экспрессирующей CAR;

изменения схемы или периода введения средства терапии на основе клетки, экспрессирующей CAR;

введения, например, пациенту, не отвечающему на лечение, или частично отвечающему на лечение пациенту, дополнительного средства в комбинации со средством терапии на основе клетки, экспрессирующей CAR, например ингибитора контрольной точки иммунного ответа, например ингибитора контрольной точки иммунного ответа, описанного в данном документе;

введения пациенту, не отвечающему на лечение, или пациенту с частичным ответом на лечение средства терапии, которое обеспечивает увеличение количества более молодых T-клеток у субъекта, перед проведением лечения с помощью средства терапии на основе клетки, экспрессирующей CAR;

модификации способа изготовления средства терапии на основе клетки, экспрессирующей CAR, например обогащения более молодыми T-клетками перед введением нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, или повышения эффективности трансдукции, например, у субъекта, идентифицированного как пациент, не отвечающий на лечение, или пациент, частично отвечающий на лечение;

введения альтернативного средства терапии, например, пациенту, не отвечающему на лечение, или пациенту, отвечающему на лечение частично, или пациенту с рецидивом; или,

в случае, если субъект является или идентифицирован как пациент, не отвечающий на лечение, или пациент с рецидивом, уменьшения популяции T_REG-клеток и/или уровня экспрессии генной сигнатуры T_REG, например посредством одного или нескольких из следующего: истощение по CD25, введение циклофосфамида, антитела к GITR или их комбинации.

ПРИМЕРЫ

Настоящее изобретение дополнительно подробно описано посредством ссылки на следующие экспериментальные примеры. Эти примеры приведены лишь в целях иллюстрации и не предполагаются как ограничивающие, если не указано иное. Таким образом, настоящее изобретение никоим образом не следует истолковывать как ограниченное следующими примерами, а, наоборот, следует истолковывать как охватывающее все без исключения видоизменения, которые становятся очевидными как следствие идеи, приведенной в данном документе.

Пример 1. Получение CART с помощью стимуляции цитокинами

Краткое описание

Данный пример описывает способ изготовления CART, называемый "способом с использованием цитокинов". В некоторых вариантах осуществления клетки (например, T-клетки) высевают в среды (например, среды, содержащие сыворотку, например среды содержащие 2% сыворотки). К клеткам добавляют один или несколько цитокинов (например, один или несколько цитокинов, выбранных из IL-2, IL-7, IL-15 (например, hetIL-15 (IL15/sIL-15Ra)), IL-21 или IL-6 (например, IL-6/sIL-6Ra), а также векторы (например, лентивирусные векторы), кодирующие CAR. После инкубации в течение 20-24 часов клетки промывают, составляют и криоконсервируют. Иллюстративный способ с использованием цитокинов показан на фиг. 1A.

По сравнению с традиционным способом изготовления CART, пересмотренный в данном документе способ исключает стимуляцию CD3/CD28, а также размножение Т-клетки ex vivo. Не ограничиваясь теорией, гранулы, содержащие антитела к CD3/CD28, запускают дифференциацию в центральные клетки памяти; и в отличие от цитокинов, таких как IL-15, IL-21 и IL-7, могут помогать сохранять недифференцированный фенотип трансдуцированных CD3+ T-клеток. Как следствие, способ с использованием цитокинов, который не предполагает активацию CD3/CD28 может обеспечивать получение CART-клеток с большей процентной долей необученных/стволовых T-клеток по сравнению с CART-клетками, полученными с применением традиционного подхода.

Способы

После осуществления афереза в течение 24 часов после сбора T-клетки очищали и чистоту полученных T-клеток оценивали с помощью проточной цитометрии. T-клетки замораживали и помещали в жидкий азот до тех пор, пока они не потребовались для использования.

В качестве альтернативы, получают криоконсервированный образец после афереза и обогащают CD4+ T-клетками и/или CD8+ T-клетками с применением устройства Prodigy^®.

IL-7 и IL-15 получали при концентрации, большей от конечной требуемой в 1000 раз. IL-2 получали посредством 10-кратного разбавления в средах.

Таблица 19. Условия применения цитокинов

Условия 1. IL2 2. IL-7 3. IL-15 4. IL2+IL7 5. IL-7+IL-15 6. IL2+IL-15 7. Гранулы +IL2 8. Гранулы +IL15

В условиях для роста, стимулированных гранулами, расчеты проводили для клеток в планшете с конечной концентрацией соотношения гранул и клеток, составляющего 3:1. Магнитные гранулы Dynabeads^® промывали дважды с применением Dynamag^® и ресуспендировали в требуемом объеме среды для эксперимента. Промытые гранулы добавляли в пробирки, которые содержали конкретные цитокины и клетки.

Во время посева клетки подвергали трансдукции с помощью лентивирусного вектора при множественности заражения (MOI), составляющей 1. Конкретный объем вектора, подлежащего трансдукции, рассчитывали на основе множественности заражения (MOI) и концентрации (титр) применяемой партии вектора. Титр и MOI измеряли на основе первичных линий T-клеток.

В условиях, где цитокины сами по себя использовались для стимуляции, клетки ресуспендировали после промывки при концентрации 1E7/мл и добавляли в коническую пробирку, которая уже содержала цитокины в зависимости от условия (таблица 19). После добавления клеток и цитокинов добавляли лентивирусный вектор с последующим добавлением сред.

Во всех из условий клетки смешивали и 1 мл высевали в 14 лунок 24 луночного планшета. Клетки помещали в инкубатор при 37^oC и 5% CO₂.

На следующий день клетки собирали, регистрировали концентрацию и жизнеспособность клеток. Их функцию измеряли с применением анализа внедрения цитотоксичности и пролиферации (EDU). Такие клетки назывались "CART дня 1".

Клетки иммунофенотипировали в отношении статуса дифференциации T-клеток и трансдукцию CAR оценивали с применением проточной цитометрии. Клетки промывали, добавляли краситель для определения жизнеспособности с последующим добавлением смеси антител (таблица 20) и планшеты инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре. После инкубации клетки промывали дважды и фиксировали до анализа на BD Fortessa.

Таблица 20. Антигены панели антител, применяемых для определения статуса дифференциации T-клеток

Антиген Жизнеспособность CD3 CD4 CD8 HLADR CD28 CD45RO CD95 CCR7 Антиидиотип

Для определения того, сохраняли ли CART дня 1 способность размножаться после сбора, 5e6 клеток/условие размножали с применением гранул с антителами к CD3/CD28 в колбе T25 при соотношении 3:1 (гранулы и клетки). Магнитные гранулы Dynabeads^® промывали, как описано ранее. Среды не содержали цитокинов. Клетки помещали в инкубатор при 37^oC и 5% CO₂.

В случае, если T-клетки размножали с помощью гранул с антителами к CD3/CD28 каждые 2 дня, то клетки подсчитывали и разделяли до не более 10 дней в культуре. На 10 день клетки собирали, подсчитывали, иммунофенотипировали с применением панели дифференциации (таблица 20) и замораживали в Cryostor 10™. Клетки размораживали для функциональных анализов, которые включают анализ цитотоксичности, анализ пролиферации и анализ секреции цитокинов.

Клетки, размноженные в присутствии гранул с антителами к CD3/CD28 in vitro в течение 10 дней, называли "CART дня 10".

Результаты

При очистке T-клетки инкубировали с цитокинами в отсутствии любых других стимулов для активации, наблюдалось повышение в трансдукции с 1 дня до 4 дня (фиг. 1B). Независимо от момента времени и условия применения цитокинов, преобладающая популяция в CAR-положительной популяции представляла собой популяцию необученных клеток (фиг. 1D, 1E и 1F). Исключение средства для активации привело к усилению трансдукции примитивной популяции. Следует отметить, что воздействие IL-2 или IL-15 поддерживало самообновление T-клеток in vitro (фиг. 1G). Подобное явление наблюдали при других тестируемых обработках цитокинами (IL-7; IL2+IL7; IL-7+IL-15 и IL2+IL-15) (данные не показаны). Способ с использованием цитокинов (с применением IL2 или IL-15 в данном конкретном примере) обеспечивал сохранение или небольшое повышение процентной доли CD45RO-CCR7+ клеток (фиг. 1G). Подобные данные показаны на фиг. 1H и 1I для IL-2, IL-15 и комбинации IL-7 и IL-15. Культивирование T-клеток с указанными цитокинами в течение 24 часов обеспечило сохранение необученного фенотипа CD3+ T-клеток и снижение процентной доли T-клеток центральной памяти (фиг. 1H и 1I).

Для уверенности в том, что трансдукция, наблюдаемая в течение 24 часов, была устойчивой, CART, полученные в течение 24 часов, промывали для удаления любого остаточного вируса и размножали в течение 10 дней с применением гранул с антителами к CD3/D28 для размножения. Размноженные клетки демонстрировали уровень трансдукции, почти эквивалентный уровню трансдукции у CART дня 1, указывая на то, что трансдукция являлась устойчивой (фиг. 2A).

Функциональность CART дня 1 и CART дня 10 тестировали с применением анализа цитотоксичности, высвобождения цитокинов и пролиферации. Клетки-мишени представляли собой клетки Nalm6, клеточную линию B-клеток ALL, которая экспрессирует CD19. Анализ цитотоксичности продемонстрировал, что в отношении уничтожения клеток CART дня 1 после размножения были эквивалентными CART дня 10 (фиг. 2B), несмотря на то, что среди CART дня 1 было намного меньше трансдуцированных клеток. Те же CART дня 1, которые размножали, сравнивали в отношении секреции IFN-гамма и обнаружили, что они характеризуются пониженной секрецией IFN-гамма по сравнению с CART дня 10 (фиг. 2C), что скорее всего обусловлено различием в числе подвергнутых трансдукции клеток. В отдельном исследовании, где CART дня 1 характеризовались повышенным уровнем трансдукции, они секретировали повышенный уровень IFN-гамма (данные не показаны). Кроме того, CART дня 1, полученные с применением всех условий обработки, за исключением условия, предусматривающего обработку только с помощью IL7, продемонстрировали уровень пролиферации, подобный таковому у CART дня 10, или более высокий (фиг. 2D). Показанные данные на фиг. 2D не были нормализованы в отношении уровней трансдукции.

Хотя устойчивая трансдукция наблюдалась в CART дня 10, эффективность была неизменно ниже. Титрование с повышением множественности заражения (MOI) лентивирусным вектором тестировали при четырех условиях применения цитокинов и во всех протестированных условиях наблюдалась линейная зависимость с уровнем трансдукции (фиг. 3A).

Кроме того, разные композиции сред (преимущественно со снижением концентрации сыворотки от 5% до 2% до отсутствия сыворотки) сравнивали для определения их влияния на эффективность трансдукции. Снижение концентрации сыворотки до 2% сыворотки крови человека привело к высокой эффективности трансдукции (фиг. 3B). Считается, что добавление только Glutamax также имеет значительное влияние на эффективность трансдукции.

Далее, CART дня 1 и CART дня 10 исследовали в отношении их противоопухолевой активности in vivo с применением модели на мышах с ALL. Вкратце, CART дня 1 и CART дня 10 были изготовлены как описано выше с жизнеспособностью, превышающей 80% (фиг. 4A и 4B). CART вводили мышам, несущих опухоль, и отслеживали в отношении размножения in vivo. Как показано на фиг. 4C, CART дня 1 продемонстрировали более высокий уровень размножения in vivo, чем их аналоги дня 10. В частности, CART, полученные в присутствии IL-2, продемонстрировали наивысший уровень размножения in vivo (фиг. 4C). Все протестированные CART обеспечивали подавление роста опухоли in vivo, хотя CART дня 1 демонстрировали замедленную кинетику по сравнению с CART дня 10 (фиг. 4D). В данном конкретном доноре условие с применением IL2 демонстрировало наилучшую способность к устранению опухоли in vivo (фиг. 4D).

Кроме того, его тестировали в отношении масштабирования данного способа изготовления. Очищенные T-клетки из замороженных образцов, полученных путем афереза, подвергали трансдукции с помощью CAR19 в либо 24-луночном планшете, либо в мягком контейнере PL30, после обогащения, в присутствии либо IL2, либо hetIL-15 (IL15/sIL-15Ra). hetIL-15 был описан в WO 2014/066527, включенной в данном документе посредством ссылки во всей своей полноте, и содержит IL-15 человека в комплексе с растворимой формой IL-15Ra человека. Клетки собирали через 24 часа и тестировали в отношении экспрессии CAR. Как показано на фиг. 5B влияния на трансдукцию не наблюдалось, когда способ был масштабирован от 24-луночного планшета до мягкого контейнера PL30 в присутствии либо IL2, либо hetIL-15.

Пример 2. Получение CART с помощью стимуляции TCR

Краткое описание

В данном примере описан способ изготовления CART, называемый "способ с использованием активации" В некоторых вариантах осуществления клетки (например, T-клетки) высевают в среды (например, бессывороточные среды, например среды от OpTmizer^TM), содержащие IL-2 (например, среды от OpTmizer^TM, содержащие добавку от OpTmizer^TM, GlutaMAX и 100 МЕ/мл IL-2), помещают в устройство для культивирования клеток и приводят в контакт с антителами к CD3/CD28 (например, TransAct). Через 12 часов вектор (например, лентивирусный вектор), кодирующий CAR, добавляют к клеткам и клетки возвращают в инкубатор. Через 24 часа после начала культивирования клеток, клетки собирают, из них отбирают образцы и составляют. Не ограничиваясь теорией, быстрая активация CD3 и CD28, например с применением антител к CD3/CD28 (например, TransAct), способствует эффективной трансдукции самообновляющихся T-клеток.

В данном и других примерах применяли способ получения CART, называемый способом "традиционного изготовления (TM)", в качестве контроля. В некоторых вариантах осуществления T-клетки выбирали из свежих или криоконсервированных образцов, полученных с помощью лейкафереза (например, с применением положительного или отрицательного отбора), активировали (например, с применением Dynabeads^®, покрытых антителами к CD3/CD28), приводили в контакт с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу CAR (например, трансдуцированной с помощью лентивирусного вектора, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулу CAR), и размножали in vitro в течение, например, 7, 8, 9, 10 или 11 дней. В данном примере предусматривается иллюстративный способ TM в качестве способов, применяемых для получения CAR из контрольных групп d9.

Способы

В некоторых вариантах осуществления способ с использованием активации, предусмотренный в данном документе, начинается с замороженного или свежего продукта, полученного с помощью лейкафереза. После получения образца для подсчета и QC продукт присоединяют к устройству для сортировки клеток (например, установленный набор устройства CliniMACS^® Prodigy^®) и программу начинают. Клетки промывают и инкубируют с микрогранулами, которые связываются с требуемыми поверхностными маркером или маркерами (такими как CD3, CD4, CD8, CD27, CD28, CD45RO, CCR7, CD62L, CD14, CD34, CD95, CD19, CD20, CD22 и/или CD56). Меченные гранулами клетки отобраны путем пропускания клеток через магнитную колонку. При необходимости клетки можно дополнительно разделять путем инкубирования отрицательной фракции с гранулами, которые связываются со вторым набором поверхностных маркеров (такими как CD3, CD4, CD8, CD27, CD28, CD45RO, CCR7, CD62L, CD14, CD34, CD95, CD19, CD20, CD22 и/или CD56) и снова пропуская клетки через колонку с магнитным разделением. Выделенные клетки снова промывали и буфер для разделения заменяли на среды для клеток. Очищенные клетки затем либо переносят в культуру, либо криоконсервирвируют для дальнейшего применения. Криоконсервированные клетки можно размораживать, промывать в предварительно нагретых средах для клеток и ресуспендировать в средах для клеток. Свежие клетки можно добавлять в культуру непосредственно. Клетки высевают в мембранные биореакторы при 0,4-1,2e6 клеток/см² мембраны, добавляют активирующий реагент, такой как гранулы/полимеры, содержащие антитела к CD3/CD28, наночастицы или коллоидные наносистемы (и/или любые из следующих совместных активаторов отдельно или в комбинации: реагент, который стимулирует ICOS, CD27, HVEM, LIGHT, CD40, 4-1BB, OX40, DR3, GITR, CD30, TIM1, CD2 или CD226) и среды для клеток добавляют в конечном объеме 0,25-2 мл/см² мембраны. Вектор (например, лентивирусный вектор), кодирующий CAR, добавляют непосредственно или не более чем через 18 часов после начала культивирования. Клетки инкубируют с вектором и активирующим реагентом, описанным выше, в течение в общем 24 часов после начала культивирования. После того, как культивирование продолжалось в течение 24 часов клетки ресуспендировали механически посредством взбалтывания, или пипетирования, или перемешивая другим образом и остовы активирующих реагентов растворяли с помощью подходящих буферов. Клетки промывали для удаления нежелательных реагентов и повторно составляли в среде для криоконсервирования. Клетки криоконсервируют до тех пор, пока они не понадобятся для введения.

Для исследований, относящихся к фиг. 6A-6C, применяли следующий протокол.

Клетки очищали из свежей ¼ лейкоцитарной массы с применением автоматизированной системы разделения на основе Ficoll (Sepax 2, BioSafe) для получения мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC). Такие PBMC дополнительно очищали с применением иммуномагнитного отрицательного отбора (набор для отрицательного отбора для всех T-клеток, Miltenyi) для получения CD3 T-клеток высокой чистоты (98-100%). Такие клетки помещали в культуру с полными средами от OpTmizer^TM (Thermo) (составлены согласно инструкции для применения и дополнены IL-2 при 100 МЕ/мл (Proleukin, Prometheus)) и реагентом для активации, содержащим антитела к CD3/CD28, в рекомендуемой дозе (TransAct, Milenyi) в мембранном биореакторе. Клетки затем инкубировали при 37°C, 5% CO₂ в течение 12 часов для активации. Клетки удаляли из инкубатора и в культуры добавляли свежеразмороженный лентивирусный вектор с множественностью заражения (MOI), составляющей 2,5 т. е./клетка. Клетки возвращали в инкубатор для трансдукции в течение еще 12 часов. Клетки собирали, промывали дважды средой и составляли непосредственно в стерильном PBS (Invitrogen) и вводили NSG-мышам через хвостовую вену. Клетки из контрольных групп d9 выращивали в колбах (T25-T225, Corning) с применением сред RPMI (Thermo), дополненных 10% фетальной бычьей сывороткой крови (Seradigm) (полные среды, также называемые "R10") и средства для размножения, содержащего антитела к CD3/28, Dynabeads^® (Thermo), в количестве 3 гранулы на T-клетку. Клетки затем инкубировали при 37°C, 5% CO₂ в течение 24 часов для активации. Клетки удаляли из инкубатора и в культуры добавляли свежеразмороженный лентивирусный вектор с MOI, составляющей 2,5 т. е./клетка. Клетки возвращали в инкубатор для инкубации в течение дополнительных 7 дней, разделяя каждые 2 дня для поддержания концентрации 5e5 клеток/мл. Размноженные клетки переносили в центрифужные пробирки, объемом 50 мл (Corning), и подвергали двум циклам удаления гранул с применением фиксированного магнита (Dynamag-50, Thermo). Клетки, не содержащие гранул, затем промывали дважды с помощью среды и составляли с криосредами CryoStor10 (STEMCELL Technologies), криоконсервировали с применением устройства CoolCell (BioCision) и хранили в паровой фазе жидкого азота в течение минимум 48 часов. Клетки размораживали в предварительно нагретых средах R10, промывали дважды с помощью сред, затем составляли в стерильном PBS (Invitrogen) и вводил NSG-мышам через хвостовую вену.

NSG-мышам возрастом 6-8 недель (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJl, Jackson Labs) вводили клетки опухоли NALM6, меченные люциферазой (ATCC CRL-3273, ATCC), при 1e6 клеток/мышь за 4 дня до введения CART без предварительной подготовки. Вводили CART-клетки, составленные в PBS, при 2e6, 5e5 или 2e5 CAR+-клеток на NSG-мышь, или подходящую дозу не подвергнутых трансдукции размноженных T-клеток, или контрольную среду-носитель, представляющую собой PBS. Мышей отслеживали с помощью еженедельного взятия крови, визуализации люциферазы каждые две недели (Xenogen IVIS, PerkinElmer) и измерений веса каждые две недели. Всех животных отслеживали в отношении признаков токсичности (потери веса, умирающей) и умерщвляли, если симптомы проявлялись. Всех выживших мышей умерщвляли при окончании исследования (неделя 5) и получали образцы переферической крови, костного мозга и селезенки. Исследование проводили в соответствии с IACUC и всеми другими применимыми руководствами.

Результаты

CART-клетки получали с применением способа с использованием активации, описанного выше и характеризовали в отношении их противоопухолевой активности in vivo в модели мыши ALL. Как показано на фиг. 6A-6C CART-клетки, полученные с применением способа с использованием активации, продемонстрировали сильную противоопухолевую активность in vivo.

Пример 3. Эффект экспрессии IL6R на T-клетки и эффект применения цитокинов на размножение Т-клеток

Материалы и способы

Культура T-клеток

Ранее замороженные T-клетки размораживали и приводили в контакт с подвергнутыми динамическому анализу гранулами αCD3/αCD28 (соотношение клеток и гранул составляет 1 к 3) в присутствии указанных цитокинов в день 0. С 3 дня добавляли в два раза больше сред для роста T-клеток (RPMI1640, 10% FBS, 2 мМ L-глутамин, 100 мкМ заменимые аминокислоты, 1 мМ пируват натрия, 10 мМ Hepes, 55 мкM β-меркаптоэтанола, 10% FBS и 100 ед./мл смеси пенициллин-стрептомицин) в планшет с указанными цитокинами (без цитокинов, rhIL2 (50 МЕ/мл, Novartis), IL6 (10 нг/мл, системы R&D), IL7 (10 нг/мл, Peprotech), IL15 (10 нг/мл, Peprotech) и IL21 (10 нг/мл, Peprotech)) в день 3, 5, 6, 9, 12, 15 и 18. Клетки, подвергнутые обработке без цитокинов IL6 или IL21, культивировали до 18 дня и клетки, обработанные с помощью IL2, IL7 или IL15, культивировали до 25 дня.

Окраска поверхности клетки

Клетки собирали в указанные моменты времени и затем окрашивали с помощью красителя для определения жизнеспособности (eFluro780, eBioscience), антител к CD3 (BioLegend, клон №: OKT3), CD4 (BioLegend, клон №: OKT4), CD8 (BD Bioscience, клон №: RPA-T8), CD45RO (BioLegend, клон №: UCHL1), CCR7 (BioLegend, клон №: G043H7), CD27 (BD Horizon, клон №: L128), CD127 (BioLegend, клон №: A019D5), CD57 (BioLegend, клон №: HCD57), CD126 (BioLegend, клон №: UV4) и CD130 (R&D Systems, клон №: 28126). Клетки получали с помощью FACS Fortessa и затем применяли программу FlowJo для анализа данных.

Внутриклеточная окраска цитокинов

Для изучения процентной доли продуцируемого клетками цитокина в день 25 T-клетки собирали и затем быстро активировали с помощью PMA (50 нг/мл, Sigma-Aldrich) и иономицина (1 мкМ, Sigma-Aldrich) в течение 4 часов в присутствии Brefeldin A (BioLegend) при 37°C в инкубаторе. T-клетки затем окрашивали с помощью красителя для определения жизнеспособности (eFluro780, eBioscience), антител к CD3 (BioLegend, клон №: OKT3), CD4 (BioLegend, клон №: OKT4), CD8 (BD Bioscience, клон №: RPA-T8) с последующей фиксацией и пермеабилизацией. Затем T-клетки дополнительно окрашивали с помощью антител к IFN-γ (BioLegend, клон №: 4S.B3), IL-2 (BioLegend, MQ1-17H12) и TNF-a (BioLegend, Mab11). Клетки получали с помощью FACS Fortessa и затем применяли программу FlowJo для анализа данных.

Результаты

Клетки, экспрессирующие IL6Rα и/или IL6Rβ, обогащали в менее дифференцированных субпопуляциях T-клеток как в CD4, и в CD8 T-клеток. Как показано на фиг. 7A и 7B необученные CD4 и CD8 T-клетки демонстрировали более высокие уровни экспрессии IL6Rα и IL6Rβ, чем соответствующие T-клетки памяти. T-клетки, которые экспрессировали как IL6Rα, так и IL6Rβ представляли собой преимущественно CD45RA+CD45RO-CD27+CD28+-клетки (фиг. 8A и 8B). После стимуляции TCR, экспрессия IL6Rα, но не IL6Rβ подавлялась (фиг. 11).

Далее разные цитокины сравнивали в отношении их влияния на размножение Т-клеток. Среди тестируемых цитокинов IL15, IL2 и IL7 усиливали размножение Т-клетки, при этом IL15 демонстрирует наивысшее усиление (фиг. 12). Обработка с помощью цитокинов не повлияла на размер (фиг. 13A) или жизнеспособность клетки (фиг. 13B). Обработка с помощью IL15 также усиливала размножение клеток, экспрессирующих IL6Rβ (фиг. 14). Клетки, экспрессирующие IL6Rβ, в CD27+ (фиг. 16) или CD57- (фиг. 17) субпопуляциях преимущественно находились в виде как CD4, так и CD8 T-клеток, в день 15 после осуществления контакта TCR с его лигандом и продуцировали цитокины IL2, IFNγ и TNFα в день 25 после активации TCR (фиг. 18).

Пример 4. Получение CART с помощью стимуляции TCR для доклинических исследований

В день 0 операции инженерных прогонов для доклинических исследований начались с получения сред, используемых в день 0. Буфер для способа быстрого изготовления и среды для способа быстрого изготовления (таблица 21). Буфер для способа быстрого изготовления (RB) содержит буфер CliniMACS^® (Miltenyi) с 0,5% HSA. Среды для способа быстрого изготовления (таблица 21) были составлены в день 0 изготовления и основные среды содержат готовые для использования среды, называемые OpTmizer^TM, которые содержат Glutamax, IL-2, добавку CTS^TM и ICSR. Устройство Prodigy^® заполняли для применения в день 0.

Таблица 21. Тип сред и цель применения во время получения CART

Тип сред/буфера Комозиция Цель применения Буфер для способа быстрого изготовления (RB) Буфер CliniMACS^® (+0,5% сывороточного альбумина человека (HSA)) День 0 обработка в устройстве для промывки клеток/сепараторе Среды для способа быстрого изготовления (RM) Среды от OpTmizer^TM, CTS^TM, IL-2, Glutamax и ICSR День 0 для обработки в устройстве для промывки клеток/сепараторе и высевание клеток Буфер для сбора клеток (HB) (также называемый буферный раствор для сбора клеток) PBS без EDTA и 2% HSA Буфер для сбора и промывки клеток (день 1) Криосреды Cryostor10 (CS10) Составление собранных клеток

Устройство Prodigy^® было загружено в день 0, полученный от здорового донора материал, полученный с помощью лейкафареза, был разморожен и объединен с материалом, полученным с помощью афереза, в мягком контейнере для переноса, объемом 600 мл, который может быть далее присоединен к Prodigy^®. Образец IPC экстрагировали из мягкого контейнера для переноса, объемом 600 мл, и измеряли с помощью NC200 с получением как числа, так и процентной доли жизнеспособных клеток для исходного материала, полученного с помощью афереза. После завершения загрузки Prodigy^®, материал, полученный с помощью афереза, переносили в мягкий контейнер для применения. После того, как образцы, полученные с помощью афереза, поместили в устройство Prodigy^®, после начала программы TCT, программа работала от 3 ч. 45 мин. до 4 ч. 15 мин. в зависимости от того, насколько много разделений с положительным отбором она осуществляла. Программа TCT в день 0 обеспечивала вымывание DMSO в Centricult с буфером для способа быстрого изготовления, осуществление промывки тромбоцитов, снижение объема, инкубацию образцов, полученных с помощью афереза, с микрогранулами CD4 и CD8 в Centricult, и затем отбор T-клеток с микрогранулами посредством положительного отбора с применением магнита, установленного в Prodigy^®. Отобранные T-клетки с реагентами CD4 и CD8 элюировали в мягкий контейнер для повторного применения со средами для способа быстрого изготовления. Образец внутрипроизводственного контроля (IPC) брали из мягкого контейнера для повторного применения для определения общего числа жизнеспособных клеток, доступных для высевания в сосуд для культивирования (G-Rex500MCS).

Устройство G-Rex для культивирования сначала загружали средами для способа быстрого изготовления и затем добавляли объем целевых клеток из мягкого контейнера для повторного применения в сосуд для культивирования. Реагент для активации (TransACT) затем добавляли в сосуд для культивирования. Лентивирусный вектор затем добавляли в сосуд для культивирования после введения TransACT и осуществляли добавление вектора с применением MOI, составляющим 1,0. Сосуд G-Rex500MCS для культивирования затем продували с помощью сред для способа быстрого изготовления до того, пока объем конечных сред не составил 250 мл плюс объем вектора, подлежащего добавлению. Сосуд G-Rex для культивирования затем помещали в инкубатор для обеспечения инкубирования культуры в течение требуемых 24 ч с диапазоном в 20-28 часов.

После требуемой инкубации в течение 24 ч, культуру CART вынимали из инкубатора и образец экстрагировали с получением числа и показателя жизнеспособности жизнеспособных клеток из культуры клеток перед промывкой для сбора. Образец, отобранный при предварительном сборе, представлял собой IPC и применялся в качестве изначального образца в устройстве для промывки LOVO для определения скорости потока клеток во вращающейся фильтрационной мембране. В LOVO концентрация жизнеспособных WBC используется в качестве IPC. Применяемая программа для способа изготовления CART была описана как 4 промывки с помощью одного раствора и в ней использовался буфер для сбора клеток (PBS+2,0% HSA). Во время промывки в LOVO мягкий контейнер, содержащий IPC, применяли как для уменьшения объема, так и промывки клеток с помощью буфера для сбора клеток перед тем, как его наконец элюировали в выходной мягкий контейнер. Затем из выходного мягкого контейнера после промывки в LOVO отбирали образцы с получением числа и показателя жизнеспособности жизнеспособных клеток с целью осуществления ручного центрифугирования с бутылкой SaniSure и для осуществления конечной стадии конечного составления с помощью криосред.

Пример 5. Получение CART для BCMA с применением способа быстрого изготовления с активированием (ARM)

Краткое описание

Данный пример описывает способ изготовления CART, называемый "быстрое изготовление с активированием (ARM)". В некоторых вариантах осуществления клетки (например T-клетки) культивируют в устройстве для культивирования клеток, содержащем среды (например бессывороточные среды, например среды OpTmizer^TM), рекомбинантный IL-2 человека (например, среды OpTmizer^TM, содержащие добавку OpTmizer^TM, GlutaMAX и 100 МЕ/мл IL-2), антитела к CD3/CD28 (например, TransAct) и вектор (например, лентивирусный вектор), кодирующий клетки CAR для BCMA. Через 24 часа, клетки, называемые "продукт на основе CART дня 1", собирают, из них отбирают образцы и осуществляют составление. Не ограничиваясь теорией, быстрая активация CD3 и CD28, например с применением антител к CD3/CD28 (например, TransAct), способствует эффективной трансдукции самообновляющихся T-клеток. В некоторых случаях некоторые клетки собирают через 48 ч, 72 ч и 96 ч или 7 дней после культивирования для измерения кинетики экспрессии клеток CAR для BCMA in vitro. Ответы, обеспечиваемые CART дня 1, включают без ограничения цитолитическую активность и размножение in vivo.

Получение CART для BCMA в день 1 с применением способа ARM

В некоторых вариантах осуществления способ с использованием активации, предусмотренный в данном документе, начинается с замороженного или свежего продукта, полученного с помощью лейкафереза. После получения образца для подсчета и QC продукт присоединяют к устройству для сортировки клеток (например, установленный набор устройства CliniMACS^® Prodigy^®) и программу начинают. Клетки промывали и инкубировали с микрогранулами, которые связываются с требуемыми поверхностынми маркерами, такими как CD4 и CD8. Меченные гранулами клетки отобраны путем пропускания клеток через магнитную колонку. Выделенные клетки снова промывали и буфер для разделения заменяли на среды для клеток. Очищенные Т-клетки затем либо переносят в культуру, либо криоконсервируют для дальнейшего применения. Чистота выделенных T-клеток проходит стадию QC посредством оценки с помощью проточной цитометрии. Криоконсервированные клетки можно размораживать, промывать в предварительно нагретых средах для клеток и ресуспендировать в средах для клеток. Свежие клетки можно добавлять в культуру непосредственно. Клетки высевают в мембранные биореакторы при 0,4-1,2e⁶ клеток/см² мембраны, добавляют активирующий реагент, такой как гранулы/полимеры, содержащие антитела к CD3/CD28, наночастицы или коллоидные наносистемы, и среды для клеток добавляют в конечном объеме 0,25-2 мл/см² мембраны. Во время посева, клетки подвергают трансдукции с помощью лентивирусного вектора, кодирующего CAR BCMA, при разных значениях множественности заражения (MOI). Титр и MOI измеряются на основе клеточных линий, таких как SupT1. Через 24 часа клетки промывают для удаления ненужных реагентов перед окраской для измерения уровня экспрессии CAR с помощью проточной цитометрии и повторно составляют в среде для криоконсервирования в виде "продукта на основе CART дня 1" для исследования in vivo.

В данном примере описано получение и характеристика T-клеток, экспрессирующих CAR R1B6, R1F2, R1G5, PI61, B61-02, B61-10 или Hy03 для BCMA, изготовленных с применением способа ARM. Последовательности R1B6, R1F2 и R1G5 раскрыты в таблицах 3-6. Последовательности PI61, B61-02 и B61-10 раскрыты в таблицах 7-11. Последовательности Hy03 раскрыты в таблицах 12-15.

Через двадцать четыре часа после того, как T-клетки подвергали трансдукции с применением лентивирусных векторов, кодирующих CAR для BCMA, при значении MOI, составляющем 2,5, экспрессию CAR измеряли с помощью проточной цитометрии с применением rBCMA_Fc. Как показано на фиг. 19A, ее наблюдали во всей популяции живых CD3+ T-клеток, сдвинутых вправо в разной степени. Клетки, подверженные трансдукции для обеспечения экспрессии R1G5, R1B6 или PI61, продемонстрировали наивысшую экспрессию CAR (фиг. 19A). Данная модель экспрессии, измеренной с помощью проточной цитометрии, отличалась от типичных гистограмм проточной цитометрии клеток, трансдуцированных для экспрессии CAR, где CAR-положительная популяция четко отделяется от отрицательной популяции. На фиг. 19A показано то, что может быть "псевдотрансдукция или транзиентная экспрессия", детектируемые с помощью rBCMA_Fc, что не всегда указывает на действительную экспрессию генов. Ранее было указано, что лентивирусную псевдотрансдукцию наблюдали, в начале после добавления вектора и на протяжении более 24 часов в CD34+-клетках и не более 72 часов в 293 клетках (Haas DL, et al. Mol Ther. 2000. 291: 71-80). Дефектный по интегразе лентивирусный вектор обусловлен транзиентной экспрессией eGFP в течение не более 10 дней в CD34+-клетках и в течение не более 14 дней в 293 клетках. Несмотря на то, что лентивирусная псевдотрансдукция не была тщательно изучена в T-клетках, данная возможность транзиентной экспрессии в такой короткий период времени нельзя было исключать. Следовательно, исследование кинетики in vitro проводили для измерения экспрессии CAR в клетках, изготовленных с применением ARM, указанных ниже.

Исследование in vitro кинетики экспрессии CAR клетками, изготовленными с применением способа ARM

В исследовании, описанном в данном документе, изучено как клетки, изготовленные с применением способа ARM, экспрессируют молекулы CAR в течение времени. Вкратце, T-клетки, полученные от здорового донора, изготовлены для экспрессии CAR для BCMA с применением способа ARM при значении MOI, составляющем 1, и поддерживались в культуре в течение разных периодов времени и их собирали через 24 ч., 48 ч., 72 ч., 96 ч. и 7 дней для оценки кинетики экспрессии CAR с помощью проточной цитометрии с применением rBCMA_Fc, меченного AF647. Понимание кинетики экспрессии CAR помогает найти суррогатный момент времени для настоящей и устойчивой экспрессии для in vivo исследования с сортировкой или стратегией клинического введения доз.

В день 1, модель экспрессии CAR клеток, трансдуцированных при значении MOI, составляющем 1 (фиг. 20A), подобна клеткам, подвергнутым трансдукции при значении MOI, составляющем 2,5 (фиг. 19A). При обоих условиях значения MOI продемонстрирована псевдо- или транзиентная модель экспрессии в день 1 (фиг. 19A и 20A). Однако, в день 2 положительная по rBCMA_Fc популяция начала отделяться от отрицательной по UTD контрольной группы (фиг. 20A). В день 3 и день 4 положительная по rBCMA_Fc популяция, которая представляет собой клетки, экспрессирующие CAR для BCMA, и отсутствует в группе UTD, четко проявилась во всех группах, где клетки подвергали трансдукции для экспрессии CAR для BCMA. Со дня 3 до дня 4 CAR+% был относительно устойчивым для каждой конструкции CAR (фиг. 20B) с наивысшим MFI, наблюдаемым в день 3 (фиг. 20C) (клетки были наибольшими в данный момент времени). В соответствии с показанными данными на фиг. 19A клетки, трансдуцированные для экспрессии PI61, R1G5 и R1B6, представляли собой клетки, больше всех экспресирующие CAR (фиг. 20A). Следует отметить, что клетки, трансдуцированные с помощью векторов, кодирующих R1F2 или Hy03, не продемонстрировали транзиентной экспрессии CAR в день 1, но четко експрессировали молекулы CAR для BCMA позднее в день 3 и день 4 (фиг. 20A). В заключение, векторы, кодирующие разные виды CAR, могут характеризоваться разной кинетикой экспрессии CAR в течение времени, и день 3 был выбран в качестве суррогатного момента времени для экспрессии CAR.

Оценка функциональности in vivo CART для BCMA, обработанных с помощью ARM, в день 1

CART дня 1 исследовали в отношении их противоопухолевой активности in vivo с применением модели на мышах с ксенотрансплантатом множественной рассеянной миеломы KMS-11-Luc. Репортер, представляющий собой люциферазу, обеспечивает контроль нагрузки болезни посредством количественной биолюминесцентной визуализации (BLI). Вкратце, CART дня 1, изготовленные как описано выше, вводили мышам, несущим опухоль. В первом исследовании in vivo (фиг. 21A и 21B) каждая мышь получала конечный продукт на основе CART, в дозе, составляющей 1,5E6 клеток. Экспрессию CAR анализировали в день 1 и день 7 (фиг. 21A). В исследовании эффективности in vivo клетки, экспрессирующие PI61, R1G5 или R1B6 демонстрировали высокие значения противоопухолевой активности (фиг. 21B). Клетки, экспрессирующие R1F2, продемонстрировали замедленную эффективность (фиг. 21B). В группе UTD также демонстрировалась частичная противоопухолевая активность через 14 дней после инъекции CART, которая могла быть обусловлена аллореактивностью (фиг. 21B). Во втором исследовании in vivo тестировалась доза титрования CAR+T-клеток. Дозы CAR+T-клеток были основаны на CAR+ % в день 3 (фиг. 22A). Кинетику поглощения опухоли отслеживали дважды в неделю путем измерения с помощью BLI. На фиг. 22A продемонстрирована экспрессия CAR, обнаруженная в день 1 и день 3. Результаты in vivo указывают на то, что все три клона PI61, R1B6 и R1G5 при обеих дозах, составляющих 1,5e5 CAR+ T-клеток и 5e4 CAR+ T-клеток, были способны отторгать и очищать опухоль, как показано на фиг. 22B. На фиг. 22C продемонстрированы изменения веса тела в течение курса данного исследования, отображая отсутствие признаков GVHD.

Пример 6. Данные кинетики CART, изготовленных с применением способа быстрого изготовления с активированием, собранные в промежутке 12-24 часа

Введение

Для определения того, может ли продукт на основе CART, полученный с помощью способа быстрого изготовления с активированием, быть получен за менее чем 24 часа, оценивали кинетику для сбора CART, изготовленных с применением способа быстрого изготовления с активированием, полученных после 12-24 часов в культуре. Данную оценку проводили в малом масштабе с применением T-клеток, обогащенных от криоконсервированных образцов после афереза, полученных от здоровых доноров, и одновременным добавлением активирующего реагента TransAct и вектора CTL019 технической степени чистоты при высевании. Первичные показатели представляли собой жизнеспособность, выход жизнеспособных клеток после размножения, состав субпопуляции лейкоцитов и Т-клеток и эффективность трансдукции (определена с помощью поверхностного иммунофенотипирования) на свежесобранных продуктах на основе CART.

Способы

Продуцирование лентивируса и определение титра. Лентивирусный вектор, кодирующий CTL019, получали с помощью 4,7×107 т. ед./мл титра на основе HEK293T, полученного с помощью qPCR, и приблизительно 1,88×107 т. ед./мл титра на основе Т-клеток.

Выделение Т-клеток. Криоконсервированные образцы, представляющие собой лейкопак (LKPK), полученные из образцов после афереза здорового донора, получали от Hemacare и хранили в жидком азоте до тех пор, пока они не понадобятся. В день 0 образцы, полученные с помощью афереза, размораживали до тех пор, пока не оставались маленькие кристаллы и затем разбавляли с помощью буфера для обработки Prodigy^®. Автоматизированный положительный по CD4/CD8 отбор затем осуществлялся с помощью программного обеспечения CliniMACS^® Prodigy^®, версии 1.0, с набором трубок TS 520 и трансдукцией Т-клеток (TCT). Конечный продукт, полученный с помощью Prodigy^®, элюировали в полную среду для Т-клеток OpTmizer^TM и концентрацию и жизнеспособность клеток определяли путем окрашивания AO/PI и подсчитывали с помощью Cellometer Vision (Nexcelom).

Начало культивирования и трансдукция. Клетки, полученные из продукта, полученного из Prodigy^®, сразу же высевали в целом в семь сосудов: пять сосудов для подвергнутых трансдукции культур и два сосуда для не подвергнутых трансдукции (UTD) культур. В начальный момент времени каждый сосуд засевали при плотности, составляющей 0,6×10⁶ жизнеспособных клеток на см² мембраны, плюс TransAct со степенью чистоты, соответствующей GMP, и доводили до конечной концентрации, составляющей 1,2×10⁶ жизнеспособных клеток/мл, с помощью полных сред для Т-клеток OpTmizer^TM, содержащих IL-2. Вектор размораживали при комнатной температуре и добавляли в каждую подвергнутую трансдукции культуру при значении MOI, составляющем 0,45, на основе приблизительного титра Т-клеток. Вирус не добавляли в UTD контроли. После высевания культуры инкубировали при 37°C и 5% CO₂ до готовности к сбору.

Сбор. В каждый момент времени в диапазоне 12-24 часа после начала культивирования одну подвергнутую трансдукции культуру выбирали для сбора. Клетки собирали посредством взбалтывания сосуда для аккуратного отделения клеток от мембраны, затем весь объем культуры ресуспендировали и переносили с помощью серологической пипетки в коническую трубку. Небольшую аликвоту брали для подсчета перед промывкой, определения жизнеспособности и окрашивания с помощью проточной цитометрии. Остальную часть каждой культуры промывали дважды 50 мл (дважды 100 мл для UTD сосудов), ресуспендировали и отбирали аликвоту после отмывки для изучения числа и жизнеспособности.

Проточная цитометрия для определения состава лейкоцитов и экспрессии CD19-CAR во время изготовления CART. Внутрипроизводственные образцы до и после культивирования окрашивали для определения состава лейкоцитов, фенотипа Т-клеток и экспрессии CAR, где применимо. Экспрессию CTL019-CAR в подвергнутых трансдукции T-клетках оценивали с применением изготовленного на заказ флуорофор-меченного антиидиотипического антитела (eBioscience). В каждый момент времени во время отбора аликвоты культуры непосредственно окрашивали с помощью красителя для определения жизнеспособности (Biolegend), промывали, затем окрашивали с помощью двух панелей для проточной цитометрии, при этом обе содержали краситель CD3 и антиидиотипическое антитело, и фиксировали в параформальдегиде для дальнейшего исследования. Образцы измеряли на проточном цитометре (BD LSRFortessa; применялись одноцветные контроли для выравнивания) и данные анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo. Для анализа все образцы, окрашенные для определения состава лейкоцитов, предварительно гейтировали в отношении синглетных жизнеспособных CD45+ объектов, и все образцы, окрашенные в отношении субпопуляций T-клеток, предварительно гейтировали в отношении синглетных жизнеспособных CD3+ объектов. Гейты для CD45RO и CCR7 получали с применением контролей флуоресценции с комбинацией детектируемых меток без одной (FMO).

Результаты

Состав лейкоцитов продукта, полученного из LKPK, Prodigy^® перед культивированием и продуктов, содержащих CART, после культивирования характеризовали с применением проточной цитометрии в день 0 и в каждый момент времени при сборе. Идентифицированные типы клеток представляли собой T-клетки (CD3+), моноциты (CD14+), B-клетки (CD19+), естественные клетки-киллеры (NK) (CD3-56+) и другие клетки (таблица 22). Обогащение с помощью Prodigy^® в день 0 обеспечило получение исходного материала, который был высоко жизнеспособен (92,9%) и обогащен T-клетками (от 48% до 92%), при этом со сниженной контаминацией B-клетками (6%-0,10%), и моноцитами, и NK-клетками до менее чем 4% каждого типа. После 12-24 часов культивирования чистота жизнеспособных клеток повышалась на дополнительные 3-4,4%, в соответствии с немедленным снижением содержания количества моноцитов и B-клеток через 12 часов и постепенным снижением NK-клеток в диапазоне 12 и 24 часов. Из лейкоцитов, которые экспрессируют внеклеточный CAR, определенный с помощью проточной цитометрии, менее 3% представляли собой контаминантные клетки (т. е. не T-клетки), при этом наибольшый скачок чистоты CAR (96,6%-99,2%) возникал в диапазоне 15 и 18 часов после высевания.

Таблица 22. Общий состав лейкоцитов в продуктах на основе CART

% популяции Момент времени Продукт или субпопуляция CD3+ CD14+ CD19+ CD3-CD56+ Другие День 0 LKPK 48% 29% 6,0% 11,6% 5,0% Продукт, полученный из Prodigy^® 92% 3% 0,10% 3,7% 0,4% CART
предварительная заморозка 12 ч. 95,3% 0,2% 0,02% 3,3% 1,1% 15 ч. 95,6% 0,2% 0,01% 3,3% 0,9% 18 ч. 96,4% 0,1% 0,0% 2,7% 0,9% 21 ч. 96,3% 0,2% 0,0% 2,3% 1,2% 24 ч. 96,2% 0,2% 0,0% 2,2% 1,5% 24 ч. UTD (n=2) 96,4% 0,1% 0,06% 2,4% 1,1% 12 ч. (только CAR+) 97,1% 0,6% 0,0% 2,4% 0,0% 15 ч. (только CAR+) 96,6% 0,9% 0,0% 2,5% 0,0% 18 ч. (только CAR+) 99,2% 0,1% 0,0% 0,7% 0,0% 21 ч. (только CAR+) 99,1% 0,3% 0,0% 0,7% 0,0% 24 ч. (только CAR+) 98,9% 0,3% 0,0% 0,8% 0,0%

Повышение чистоты клеток, экспрессирующих CAR, через 18 часов в культуре (таблица 22) совпало с повышением процентной доли T-клеток с экспрессией на поверхности CAR (фиг. 23A и 23C). Как наблюдалось ранее с продуктами на основе CART-клеток, изготовленными с применением способа быстрого изготовления с активированием, оцененными с помощью проточной цитометрии через 24 часа культивирования (см. пример 5), экспрессия CAR на поверхности не привела к появлению отличительных положительных и отрицательных популяций. Следовательно, гейтирование в отношении положительности по CAR было установлено с применением UTD образцов в качестве нижнего предела. Доля CD3+-клеток, экспрессирующих внеклеточный CAR, оставалась ниже 1% до 15 часов после высевания; и затем экспрессия CAR повышалась на 3-4% каждые три часа до максимального значения, которое составляло 11,8%, без насыщения (фиг. 23A). Интенсивность экспрессии CAR, определенная посредством MFI, также немного повышалась >18 часов культивирования, но оставалась слабой в течение 24 часов (фиг. 23B).

Субпопуляции T-клеток (соотношение CD4:CD8 и состав субпопуляции клеток памяти) также оценивались в каждый момент времени (фиг. 24A и 24B) с применением комбинации CD4, CD8, CD45RO и CCR7; где недифференцированные подобные необученным T-клетки были определены как CCR7+CD45RO-, центральные клетки памяти как CCR7+CD45RO+, эффектoрные клетки памяти как CCR7-CD45RO+ и высокодифференцированные эффектoрные T-клетки как CCR7-CD45RO-. Во все моменты времени, в которые проводилась оценка, включая UTD, культуры, содержали большую долю необученных клеток (40-47%) и меньшую долю Т-клеток центральной памяти (33-39%), по сравнению с исходным материалом (23% и 52%, соответственно). Интересно, хотя частота необученных T-клеток или T-клеток центральной памяти в основной массе композиции не изменялась в диапазоне 12-24 часа, в дальнейшие сборы коррелировали с повышенной частотой клеток, экспрессирующих внеклеточный CAR, которые представляли собой необученные клетки, и пониженной частотой клеток, экспрессирующих внеклеточный CAR, которые представляли собой центральные клетки памяти (16% необученные/63% центральные клетки памяти среди клеток, экспрессирующих CAR, через 18 часов против 24% необученные/54% центральных клеток памяти среди клеток, экспрессирующих CAR, через 24 часа). Подобным образом, тогда как соотношение CD4:CD8 в основной массе в значительной степени не изменилось, фракция CD4 CAR+-клеток снизилась на 10% (с 66% до 56%) в диапазоне 18-24 часа. Преобразование таких значений частот в общее число клеток (фиг. 25) выявляет, что субпопуляции T-клеток, которые возникали для экспрессирования CAR ранее всего, представляли собой преимущественно необученные CD4 клетки в диапазоне 15-18 часов в культуре; затем быстро повышалась доля CAR необученных CD8-клеток и CAR CD8-клеток центральной памяти.

Выход жизнеспособных клеток (или кратность увеличения количества), как и жизнеспособность до и после отмывки, определяли в каждый момент времени при сборе (фиг. 26 и 27). Восстановление жизнеспособных клеток снижалось на 13% к 18 часам после высевания (наименьшее значение, составлявшее 46%, совпало с повышением скорости экспрессии внеклеточного CAR), затем немного повышалось на 52% для культур, собранных в более поздние моменты времени (фиг. 26). Жизнеспособность клеток в продукте повышается после промывки до 71-77% с уменьшением жизнеспособности для клеток после сбора в диапазоне 15-24 часа (фиг. 27).

Вывод

В моменты времени, тестируемые в диапазоне 12-24 часа, CART, изготовленные с применением способа быстрого изготовления с активированием, высеянные одновременно с TransAct и вектором CTL019 технической степени чистоты, демонстрируют наивысшую экспрессию CAR на поверхности через 24 часа. Очень немногие клетки являются CAR+ (что измерено во время сбора) через 15 часов после высевания, после чего %CAR повышается быстрее. Интенсивность экспрессии CAR является слабой, но повышается медленно через 18 часов после высевания.

Продукты, содержащие CART, изготовленные с применением способа быстрого изготовления с активированием, становятся чище (больший % T-клеток) чем исходный материал во всех точках в диапазоне 12-24 часа после высевания из-за уменьшения содержания моноцитов в первые 12 часов, с последующим небольшим уменьшением содержания NK-клеток и любые остаточные B-клетки не удаляются после обогащения с помощью Prodigy^®.

Хотя общее восстановление клеток ниже при сборе через 18 часов после высевания (небольшое улучшение через 24 часа), общий состав Т-клеток не изменяется в диапазоне 12 и 24 часа после высевания. T-клетки, которые первые экспрессируют внеклеточный CAR, представляют собой центральные клетки памяти CD4 в диапазоне 15 и 18 часов после высевания, затем необученные клетки и центральные клетки памяти CD8 демонстрируют экспрессию CAR.

Пример 7. Описание способа быстрого изготовления с активированием (ARM)

В некоторых вариантах осуществления CART-клетки изготовлены с применением непрерывного способа быстрого изготовления с активированием (ARM) в течение примерно 2 дней, что будет потенциально обеспечивать большее число менее дифференцированных Т-клеток (необученных T-клеток и T_SCM-клеток (стволовые T-клетки центральной памяти)), подлежащих возвращению пациенту для размножения клеток in vivo. Короткие периоды времени для изготовления обеспечивают раннюю дифференциацию профиля T-клеток для пролиферации в теле для их требуемого конечного дифференцированного состояния чем в сосуде для культивирования ex vivo.

В некоторых вариантах осуществления CART-клетки изготовлены с применением источника криоконсервированного материала, полученного с помощью лейкафареза, например материала на основе немобилизированой аутогенной периферической крови, полученной на основе лейкафареза (LKPK). Источник криоконсервированного материала подвергается стадиям обработки для обогащения Т-клетками в первый день получения (день 0) с помощью иммуномагнитной системы, содержащей антитела к CD4/CD8. Положительная фракция затем высевается в сосуд G-rex для культивирования, активируется с помощью системы, содержащей антитела к CD3/CD28 (TransACT), и в тот же день подвергается трансдукции с помощью лентивирусного вектора (LV), кодирующего CAR. На следующий день, через 20-28 часов трансдукции, T-клетки собирают, промывают четыре раза, составляют в среде для заморозки и затем замораживают с помощью программируемого криозамораживателя (CRF). С начала способа в день 0 до начала сбора в следующий день клетки культивируют в течение 20-28 часов с целевым временем культивирования, составляющем 24 часа после высевания в день 0.

Среды для дня 0 получали в соответствии с таблицей 21. Размораживали криоконсервированный материал, полученный с помощью лейкафареза,. Размороженные клетки разбавляли с помощью буфера для способа быстрого изготовления (таблица 21) и промывали на устройстве CliniMACS^® Prodigy^®. Т-клетки выбрали с помощью микрогранул CliniMACS^®, содержащих CD4 и CD8. Как только программа для выбора Т-клеток завершалась (примерно от 3 ч. 40 мин. до 4 ч. 40 мин.), мягкий контейнер для повторного применения, содержащий клетки, суспендированные в средах для способа быстрого изготовления (таблица 21), переносят в мягкий контейнер для переноса. Отбирают образец для оценки жизнеспособности и числа клеток. Число клеток и данные в отношении жизнеспособности из положительной фракции мягкого контейнера применяют для определения концентрации клеток при высевании в сосуд для культивирования для активации и трансдукции вектора.

После положительного отбора T-клеток с помощью микрогранул CliniMACS^® (CD4 и CD8), клетки высевают в сосуд для культивирования, G-Rex. Как только клетки высевают, затем добавляется реагент для активации (TransACT) в сосуд для культивирования. Клетки затем подвергают трансдукции с помощью лентивирусного вектора, кодирующего CAR при целевом значении MOI, составляющем 1,0 (0,8-1,2). После добавления вектора сосуд для культивирования транспортируют в инкубатор, где его инкубируют в течение целевого времени, составляющего 24 часа (рабочий диапазон 20-28 часов), при допустимой температуре 37°C (рабочий диапазон 36-38°C), с допустимыми 5% CO₂ (рабочий диапазон 4,5-5,5%). После инкубации клетки промывают с помощью раствора для промывки при сборе (таблица 21) четыре раза для удаления любого неинтегрировашегося вектора и остаточных вирусных частиц, также любых других примесей, связанных со способом. Затем клетки элюируют и отбирают образцы для тестирования и подсчета числа и жизнеспособности клеток и результаты применяют для определения объема, требуемого для ресуспендирования клеток, для конечного составления с помощью CryoStor^® CS10. Клетки затем цетрифугируют для удаления раствора для отмывки при сборе и подвергают криоконсервированию.

В некоторых вариантах осуществления CAR, экспрессируемый в CART-клетках, связывается с CD19. В некоторых вариантах осуществления IL-2, применяемый в средах для способа быстрого изготовления (RM) (таблица 21), может быть заменен на IL-15, hetIL-15 (IL-15/sIL-15Ra), IL-6 или IL-6/sIL-6Ra.

В некоторых вариантах осуществления CAR, экспрессируемый в CAR-T-клетках, связывается с BCMA. В некоторых вариантах осуществления IL-2, применяемый в средах для способа быстрого изготовления (RM) (таблица 21), может быть заменен на IL-15, hetIL-15 (IL-15/sIL-15Ra), IL-6 или IL-6/sIL-6Ra.

Пример 8. Характеристика CART-клеток для CD19, изготовленных с применением способа быстрого изготовления с активированием (ARM)

В данном документе раскрыт продукт на основе Т-клеток, содержащих CAR для CD19, изготовленных с применением способа быстрого изготовления с активированием (ARM). Способ ARM снижает время цикла по сравнению с способами традиционного изготовления (TM), запланировано обеспечивая своевременную инфузию продукта на основе Т-клеток, содержащих CAR для CD19, пациентам. Более того, способ ARM также предположительно сохраняет стволовые T-клетки памяти (T_stem), клеточную субпопуляцию, ассоциированную с улучшенной противоопухолевой эффективностью. Основное отличие в изготовлении заключается в том, что способ TM включает фазу размножения, в которой Т-клетки, содержащие CAR для CD19, культивируют in vitro в течение 9 дней с интерлейкином (IL-) 2 перед составлением, способ ARM обеспечивает составление уже после 24 часов культивирования. Это достигается с помощью применения полностью биологически совместимой наноматрицы, связанной с моноклональными антителами (mAb), с агонистической активностью в отношении CD3 и CD28, которая отличается от парамагнитных гранул, содержащих CD3/CD28, применяемых в способе TM, тем, что может быть отмыта с остаточным лентивирусным вектором сразу после трансдукции. Результаты из мышиной модели с ксенотрансплантатом, а также конечного продукта, полученного с помощью обогащения T_stem-клетками, субпопуляции, ассоциированной с повышенной персистенстностью и долговременными противоопухолевыми эффектами, позволяют предположить общий улучшенный терапевтический потенциал Т-клеток, содержащих CAR для CD19, изготовленных с применением способа ARM, по сравнению с Т-клетками, содержащими CAR для CD19, изготовленными с применением способа TM. Другое важное отличие, выявленное с помощью мышиной модели с ксенотрансплантатом, представляет собой потенциально замедленную кинетику клеточного размножения Т-клеток, содержащих CAR для CD19, изготовленных с применением способа ARM, в течение примерно одной недели по сравнению с аналогами, изготовленными с применением способа TM. По оценкам продолжительность данного замедления составляет примерно 1 неделю, что обеспечивает соответствующее продление окна для тщательного контроля потенциальных токсических эффектов начиная с 3 недель по сравнению с Т-клетками, содержащими CAR для CD19, изготовленными с применением способа TM, начиная с 4 недель. Напротив, данные доклинической безопасности из модели высвобождения цитокинов in vitro указывают на то, что Т-клетки, содержащие CAR для CD19, изготовленные с применением способа ARM, и те, которые изготовлены с применением способа TM, могут характеризоваться подобным потенциалом для индуцирования продукции IL-6 in vivo и следовательно нести подобный риск возникновения синдрома выброса цитокинов (CRS). На основании данного доказательства Т-клетки, содержащие CAR для CD19, изготовленные с применением способа ARM, будут изучены в фазе I открытого клинического исследования на пациентах с тяжелой лимфомой из малых лимфоцитов (SLL)/хроническим лимфоцитарным лейкозом (CLL) в комбинации с ингибитором тирозинкиназы Брутона (BTKi), ибрутинибом (Imbruvica), уже одобренным лекарственным средством при данном показании и в качестве средства монотерапии при DLBCL.

Получение и анализ in vitro

Для тестирования способа ARM в отношении изготовления Т-клеток, содержащих CAR для CD19, в клиническом масштабе замороженный продукт, полученный от здорового донора путем лейкафереза, (Leukopak, LKPK) применяли в качестве исходного материала, описанного на фиг. 28A в качестве иллюстративного примера. LKPK содержал 37% T-клеток, 4% NK-клеток, 37% моноцитов и 15% B-клеток (фиг. 28A). После размораживания T-клетки были положительно отобраны с применением микрогранул, содержащих антитела к CD4 и CD8. Состав продукта после положительного отбора в отношении Т-клеток представлял собой 95,4% T-клеток, 1,9% NK-клеток, 1,7% моноцитов и 0,1% B-клеток (фиг. 28A).

Положительно отобранные T-клетки активировали с применением полимерной наноматрицы, связанной с агонистическими моноклональными антителами к CD3 и CD28, и подвергали трансдукции с помощью лентивирусного вектора, кодирующего CAR для CD19. Через 24 часа культивирования клетки собирали и подвергали криозамораживанию (в данном примере такие клетки назывались "ARM-CD19 CAR"). Параллельно с этим CART-клетки получали с применением способа традиционного изготовления (TM) (в данном примере такие клетки назывались "TM-CD19 CAR") с применением T-клеток, полученных от того же донора, и лентивирусного вектора. В способе TM использовались парамагнитные гранулы, связанные с антителами к CD3 и CD28, и 9-дневный период культивирования в колбах для тканевых культур, с последующими такими же сбором и процедурой заморозки. CART-клетки, полученные с помощью каждого способа, анализировали с помощью проточной цитометрии для оценки экспрессии CAR после размораживания, а также фенотипа Т-клеток (фиг. 28B-28D). Анализ фенотипа T-клеток выявил, что при способе ARM сохранялись подобные необученным T-клетки (45,1% CD45RO-/CCR7+) в обоих компартментах CD8 и CD4, при этом в способе TM преимущественно сохранялись T-клетки центральной памяти (T_CM) (68,6% CD45RO+/CCR7+ по сравнению с 43,6% для ARM-CD19 CAR) (фиг. 28C и 28D). Важно отметить, что способ ARM лучше поддерживал исходную популяцию подобных необученным CD45RO-/CCR7+ T-клеток по сравнению со способом TM, также проводимым в CAR+ популяции (28,6% в исходном материале, 37,5% для ARM-CD19 CAR и 4,5% для TM-CD19 CAR) (фиг. 28C и 28D). Данная популяция T-клеток главным образом перекрывается с CD45RO-/CD27+ стволовыми T-клетками, описанными Fraietta, et al (2018) Nat Med, 24(5); 563-571, и ассоциированными с устойчивой ремиссией CLL в фазе I клинического испытания.

В дополнение к их фенотипу, конечный продукт на основе клеток ARM-CD19 CAR был также оценен в отношении его функции in vitro. ARM-CD19 CAR и TM-CD19 CAR размораживали и совместно культивировали с клеточными линиями NALM6 (ALL) или TMD-8 (DLBCL), экспрессирующими CD19. Сравнение уровней цитокина в надосадочных жидкостях через 48 часов после совместного культивирования выявило повышение в 11-17 раз IFN-γ и повышение в 3,5-10 раз уровней IL-2, секретируемого ARM-CD19 CAR, по сравнению с TM-CD19 CAR в зависимости от стимулирующих раковых клеток (NALM6 или TMD-8, фиг. 29A и 29C). Эксперименты с не подвергнутыми трансдукции (UTD) клетками, которые подверглись обработке с помощью способа ARM или TM (фиг. 29C), или с отрицательными по CD19 клетками-мишенями NALM6 (NALM6-19KO) (фиг. 29D), подтвердили специфическое по CD19 распознавание ARM-CD19 CAR и TM-CD19 CAR. Вышеприведенная фоновая секреция IFN-γ ARM-UTD и ARM-CD19 CAR в отсутствии CD19-специфической стимуляции (фиг. 29A и 29B, соответственно) вероятно возникает из-за активированной природы таких продуктов. Данная фоновая секреция снижалась через 48 часов совместного культивирования (фиг. 29B и 29D). Промежуточная промывка клеток после первых 24 часов совместного культивирования с клетками-мишенями с последующим совместным культивированием в течение дополнительных 24 часов (24 ч.+24 ч.) дополнительно усиливала отличие между фоновой и CD19-специфической секрецией цитокина. Данное 24 ч.+24 ч. условие подчеркивает то, что фоновая секреция IFN-γ ARM-CD19 CAR ослабляется через первые 24 часа.

Таким образом, способ ARM, применяемый для получения ARM-CD19 CAR приводит к получению T-клеток с подобным или большим уровнем экспрессии CAR по сравнению с TM-CD19 CAR. Важно отметить, что способ ARM обеспечивает сохранение фенотипа T-клетки, подобного исходному материалу. ARM-CD19 CAR демонстрирует CD19-специфическую активациею in vitro, и секретирует более высокие уровни IL-2 по сравнению с TM-CD19 CAR, что коррелирует с фенотипом T_stem-клеток.

Эффективность in vivo

Исследования эффективности in vivo применяли для направления развития способа ARM, что в конечном итоге привело к способу, который будет использоваться для клинического изготовления Т-клеток, содержащих CAR для CD19. Для описанного в данном документе эксперимента был получен ARM-CD19 CAR в клиническом масштабе. Параллельно с этим был получен TM-CD19 CAR с применением того же лентивирусного вектора и T-клеток, полученных от одного и того же донора. Эффективность CAR-T-клеток, полученных с применением разных способов, оценивали на NSG-мышах с иммунодефицитом (NOD-scid IL2Rg-ноль), которым инокулировали клеточную линию NALM6 pre-B ALL. Данную опухолевую клеточную линию приживляли в костный мозг, но в случае высокой опухолевой нагрузкой она может также обнаруживаться в кровотоке. Через семь дней после инокуляции клеточной линии лейкоза, мыши в когортах получали однократную инфузию CAR+ T-клеток (фиг. 30A). Запланированные дозы, составляющие 0,2×10⁶, 0,5×10⁶ и 2×10⁶ жизнеспособных CAR+ T-клеток, определяли на основе анализа TM-CD19 CAR и ARM-CD19 CAR способом проточной цитометрии после разморозки в день 0.

Из-за беспокойства о псевдотрансдукции для ARM-CD19 CAR в день 0 после разморозки содержимое индикаторного флакона размораживали и культивировали в течение не более 5 дней, и экспрессию CAR (процентная доля и средняя интенсивность флуоресценции) анализировали посредством проточной цитометрии в разные моменты времени (фиг. 30B). Процентная доля положительных клеток в более поздние моменты времени была ниже по сравнению с днем 0 после разморозки образца. В то же время средняя интенсивность флуоресценции CAR на клетку была выше, отражая стабильно трансдуцированные CAR-T-клетки. Применяли измерение в день 3 для определения действительной дозы ARM-CD19 CAR, которая составляла 0,1×10⁶, 0,25×10⁶ и 1×10⁶ жизнеспособных CAR+ T-клеток. Доза TM-CD19 CAR оставалась неизменной (0,2×10⁶, 0,5×10⁶ и 2×10⁶ жизнеспособных CAR+ T-клеток), поскольку анализ способом поточной цитометрии размороженных образцов проводили на находящихся в состоянии покоя, полностью интегрированных CART-клетках.

Как ARM-CD19 CAR, так и TM-CD19 CAR индуцировали регрессию опухоли дозозависимым образом (фиг. 30C). У мышей, обработанных с помощью 0,5×10⁶ или 2×10⁶ клеток TM-CD19 CAR или 0,25×10⁶ или 1×10⁶ клеток ARM-CD19 CAR, наблюдалась устойчивая регрессия опухоли. Интересно, что при соответствующих более низких тестируемых дозах (0,2×10⁶ клеток TM-CD19 CAR или 0,1×10⁶ клеток ARM-CD19 CAR), ответ на TM-CD19 CAR не был устойчивым и у всех мышей в конечном итоге наблюдался рецидив после исходного частичного контроля лейкоза. Напротив, у мышей, обработанных наименьшей дозой (0,1×10⁶) ARM-CD19 CAR, наблюдалось устойчивое снижение опухолевой нагрузки, которое продолжалось до конца исследования. Кинетика регрессии опухоли свидетельствует о замедленной на приблизительно 1 неделю активации ARM-CD19 CAR, позволяя предположить, что T_stem-клеткам необходимо претерпеть пролиферацию и дифференциацию в эффектoрные клетки с целью проявления их противоопухолевой активности.

У мышей, обработанных с помощью CAR-T-клеток и UTD клеток, полученных двумя способами изготовления, отбирали кровь дважды в неделю для измерения уровней цитокинов (фиг. 31A-31D). Уровни IFN-γ в кровотоке мышей, получивших инфузию CAR-T-клеток, либо ARM-CD19 CAR, либо TM-CD19 CAR, продемонстрировали двухфазную модель (фиг. 31A). Ранний пик IFN-γ наблюдали в дни 4-7 после инфузии CAR-Т-клеток, и он вероятно связан с CD19-специфической активацией после распознавания опухоли, поскольку он не наблюдался у мышей, получавших инфузию TM-UTD или ARM-UTD (фиг. 31B). Раннюю активацию, опосредованную CD19, подтверждали с помощью сопутствующего повышения уровней IL-2 in vivo (фиг. 31C), которая, однако, ослабла в дальнейшие моменты времени.

Клеточная кинетика in vivo

Как часть фармакологического исследования для оценки эффективности ARM-CD19 CAR у NSG-мышей оценивали размножение CAR+ T-клеток in vivo (фиг. 32). Концентрацию CD3+/CAR+ T-клеток в крови анализировали посредством проточной цитометрии не более чем через 4 недели после инфузии. Размножение CAR-Т-клеток может быть выведено. Однако, долговременная персинтенция не может быть оценена из-за ограниченного времени исследования, обусловленного развитием X-GVHD. Размножение клеток наблюдали как для ARM-CD19 CAR, так и для TM-CD19 CAR во всех дозах, за исключением TM-CD19 CAR при наименьшей дозе, составляющей 0,2×10⁶ клеток. Воздействие (Cmax и AUC в пределах 21 дня после инъекции клеток) повышалось с повышением дозы как TM-CD19 CAR, так и ARM-CD19 CAR. Для сравнения размножения ARM-CD19 CAR с TM-CD19 CAR при одинаковом уровне дозы, воздействие TM-CD19 CAR интерполировали для сравнимых доз ARM-CD19 CAR (0,25×10⁶ и 1×10⁶ клеток). Значение Cmax было в 24-46 раз выше и значение AUC0-21d было в 18-33 раза выше по сравнению с TM-CD19 CAR при дозах, составляющих 0,25×10⁶ и 1×10⁶ клеток. Время для достижения пикового размножения ARM-CD19 CAR (Tmax) было замедленно в течение по меньшей мере 1 недели по сравнению с TM-CD19 CAR.

Таким образом, фармакологические исследования для оценки ARM-CD19 CAR in vitro продемонстрировало, что ARM-CD19 CAR характеризуется фенотипом с ранним дифференцированием и характеризуется потенциалом для секреции большего количества IFN-γ и IL-2. ARM-CD19 CAR демонстрирует замедленное но более высокое клеточное размножение in vivo, индуцированное большей секрецией IL-2, и контролируемым ростом опухоли при более низких дозах по сравнению с TM-CD19 CAR. Рассматриваются другие свойства ARM-CD19 CAR, такие как повышенные уровни IFN-γ в плазме крови в более поздние моменты времени и обнаруженное раннее возникновение X-GVHD как для ARM-CD19 CAR, так и для ARM-UTD, подчеркивая ограничения применяемой мышиной модели с ксенотрансплантатом. В совокупности такие результаты поддерживают гипотезу о том, что ARM-CD19 CAR содержит T-клетки с более выраженными стволовыми свойствами, позволяя ARM-CD19 CAR эффективно приживляться, размножаться и отторгать опухоли.

Анализ высвобождения IL-6 in vitro

Модель трехстороннего совместного культивирования для исследования потенциала индукции IL-6 CART-клетками in vitro была впервые опубликована Norelli, et al (2018) Nat Med., Jun;24(6); 739-748 и использована в данном документе с некоторыми адаптациями. Данная модель состоит из CAR-T-клеток, лейкозных клеток-мишеней и моноцитарных клеток-"свидетелей" THP-1 в качестве источника миелоидных клеток для максимизированного продуцирования IL-6. В данной клеточной модели in vitro секреция IL-6 либо ARM-CD19 CAR, либо отдельно TM-CD19 CAR была повышена с помощью совместного культивирования с CD19-экспрессирующими клетками-мишенями и клетками THP-1 (фиг. 33A и 33B). Важно отметить, что зависимая от времени CD19-специфическая секреция IL-6, индуцированная ARM-CD19 CAR, совпадала с секрецией, индуцированной TM-CD19 CAR. В той же модели in vitro CD19-специфическая секреция IFN-γ в условии ARM-CD19 CAR была в 10 раз выше, чем в условии TM-CD19 CAR (данные не показаны).

Краткое описание

Эти результаты указывают на то, что ARM-CD19 CAR может характеризоваться более сильным противоопухолевым потенциалом и подобным профилем безопасности по сравнению с TM-CD19 CAR. Более сильный противоопухолевый потенциал обусловлен лучшим контролем опухоли при наименьшей тестируемой дозе и более высоким клеточным размножением in vivo. Такой расчет может однако недооценивать общий терапевтический потенциал ARM-CD19 CAR, поскольку его анализировали в модели ALL (NALM6), которая является более агрессивной, чем два представленных заболевания (CLL и DLBCL), при которых ARM-CD19 CAR будет изначально изучен. При CLL, в частности, где размножение CAR-Т-клетки in vivo стойко коррелирует с регрессией опухоли (Mueller, et al (2017) Blood. 130(21); 2317-2325; Fraietta, et al (2018) Nat Med, 24(5); 563-571), в значительной степени более высокий потенциал пролиферации ARM-CD19 CAR (не более чем в 20 раз) может привести к значимой превосходящей эффективности по сравнению с TM-CD19 CAR.

В мышах раннее системное высвобождение IFN-γ и IL-2 ARM-CD19 CAR, ассоциированное с опосредованной CAR регрессией опухоли, было в 3 раза и в 10 раз выше, чем при индуцировании CAR-T-клетками, изготовленными с помощью традиционного способа, соответственно. Уровни IL-6 не изучались in vivo, поскольку недостаток функциональных миелоидных клеток в данном штамме приводит к неспособности продуцировать воспалительные цитокины (Norelli, et al. (2018) Nat Med., Jun;24(6); 739-748; Giavridis, et al (2018) Nat Med., Jun;24(6);731-738). Чтобы избежать этого и оценить потенциал в отношении высвобождения IL-6, индуцированного ARM-CD19 CAR, in vivo использовали систему трехстороннего совместного культивирования in vitro, в которой моноцитарные клетки-"свидетели" добавляли в качестве источника воспалительных цитокинов (Norelli, et al. (2018) Nat Med., Jun;24(6); 739-748). В данной системе продукция IL-6 была подобной между ARM-CD19 CAR и CAR-T-клетками, изготовленными с помощью традиционного способа, позволяя предположить подобный риск возникновения CRS. Напротив, из-за замедленной кинетики клеточного размножения ARM-CD19 CAR будет необходим более продолжительный период контроля CRS с 3 недель, характерных для TM-CD19 CAR, до 4 недель. Эксперименты in vitro с ARM-CD19 CAR также выявили потенциальную временную, не опосредованную CAR, секрецию IFN-γ и IL-2 ARM-CD19 CAR во время первых 3 дней культивирования после размораживания. Полная оценка риска на основе данных, полученных от пациентов, получавших рекомбинантный IL-2 человека (Proleukin) и рекомбинантный IFN-γ человека (ACTIMMUNE), и рассмотрение прогнозируемого уровня воздействия после инфузии ARM-CD19 CAR указывает на то, что риск для системных симптомов (лихорадка, озноб, эритема), описанных у этих пациентов, будет очень мал. Для дополнительного смягчения данного риска, пациенты, получавшие ARM-CD19 CAR, будут госпитализированы в течение по меньшей мере 72 часов после инфузии клеточного продукта.

Наконец, в токсикологическом исследовании, соответствующем GLP, у NSG-мышей, которым приживляли ARM-CD19 CAR, не демонстрировалось неожиданное поведение по сравнению с мышами, которым приживляли CAR-T-клетки, изготовленные с помощью традиционного способа, и не подвергнутые трансдукции клетки, изготовленные с помощью способа ARM, при оценке крови или органов лимфатической системы способом иммунофенотипирования, а также гистологической оценке соответствующего набора органов.

Пример 9. CART-клетки для BCMA, изготовленные с применением способа ARM

Способы

Выделение Т-клеток

Свежий лейкопак, полученный из образцов, полученных с помощью афереза, от здорового донора, получали от Hemacare и хранили в паровой фазе жидкого азота (LN2) до тех пор, пока они не понадобятся. В день 0, две четверти содержимого лейкопака удаляли из LN2, нагревали в Plasmatherm (Barkey, Леопольдсхеэ, Германия) до тех пор, пока не остались маленькие кристаллы льда, и разбавляли с помощью буфера для обработки Prodigy^®. Автоматизированный положительный по CD4/CD8 отбор затем осуществлялся с помощью программного обеспечения CliniMACS^® Prodigy^®, версии 1.0, с набором трубок TS 520 и трансдукцией Т-клеток (TCT). Число и жизнеспособность клеток для каждого параметра Prodigy^® (продукт, отходы и нецелевые клетки) определяли с помощью окрашивания AO/PI и подсчитывали с помощью Cellometer Vision (Nexcelom, Лоренс, штат массачусетс, США) для оценки общего восстановления клеток и восстановления Т-клеток. Обогащенный CD4/CD8 продукт элюировали в полную среду для Т-клеток OpTmizer^TM и разделяли для дополнительного культивирования с применением либо 24-часового, либо традиционного 9-дневного способа (TM). Оставшиеся T-клетки замораживали в резервуаре с LN. Чистоту Т-клеток оценивали с помощью анализов способом проточной цитометрии.

Продуцирование CAR-T-клеток с применением способа ARM

T-клетки, очищенные с помощью Prodigy^® высевали в разного масштаба сосуды, такие как планшет, колба, сосуд G-REX или Centricult полного клинического масштаба. После высевания добавляли полимерную наноматрицу TransAct (Miltenyi Biotec), связанную с агонистическими антителами к CD3 и CD28, в дополнение к лентивирусному вектору клинической степени чистоты. Клетки инкубировали в полной среде для Т-клеток OpTmizer^TM, содержащей 100 МЕ/мл рекомбинантного IL-2 человека (Prometheus, Сан-Диего, штат Калифорния, США), 2% ICRS (Life Technologies), в течение 24 ч. перед сбором и криозаморозкой.

Аликвоты криоконсервированных CAR-T-клеток размораживали в предварительно нагретых полных средах OpTmizer^TM, промывали дважды с помощью 20x объема в предварительно нагретых средах перед культивированием и анализом способом проточной цитометрии для оценки экспрессии CAR для BCMA и стволовых характеристик в разные моменты времени после разморозки. Аликвоты продуктов на основе клеток совместно культивировали с целевыми клеточными линиями для оценки высвобождения цитокинов в ответ на специфическую стимуляцию антигеном.

Продуцирование CAR-T-клеток с применением способа TM

T-клетки, обработанные с помощью Prodigy^®, ресуспендировали в теплой полной среде для Т-клеток RPMI и высевали в 24-луночные планшеты. T-клетки инкубировали в течение ночи при 37°C с гранулами с антителами к CD3/CD28 Human T-Expander при отношении гранул к клеткам, составляющем 3:1.

В день 1 добавляли лентивирусы при значении MOI, составляющем 2, на основе титра SUP-T1. Вирус не добавляли в не подвергнутый трансдукции контроль (UTD). T-клетки инкубировали в течение ночи при 37°C с последующим добавлением 1 мл полной среды для Т-клеток на лунку, после чего их инкубировали в течение ночи при 37°C. В течение оставшихся семи дней размножения культуры T-клеток переносили в колбы для тканевых культур и разбавляли с помощью полных сред для Т-клеток каждые два дня.

В дни 8-9 удаляли гранулы из T-клеток, собирали и криоконсервировали в среде для заморозки CryoStor CS10, замораживали при -80°C в контейнерах для заморозки клеток CoolCell (Biocision) и переносили в LN2 на следующий день. Небольшие аликвоты T-клеток красили в отношении экспрессии CAR. Одноцветные контроли были включены для выравнивания. Образцы измеряли на проточном цитометре (BD LSRFortessa) и данные анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo.

Целевая клеточная линия и культура

Клетки Nalm6 трансфицировали репортерной конструкцией на основе закодированной в лентивирусе люциферазы светлячков для создания клеточной линии Nalm6-luc. Клетки выращивали в инкубаторах при 37°C с 5% CO₂. Применяли аликвоту клеток для обнаружения экспрессии опухолевого антигена BCMA до применения.

Анализ секреции цитокина in vitro

Секрецию цитокина CAR-T-клетками для BCMA (называемые эффектoрными клетками) в ответ на экспрессирующие BCMA клетки-мишени оценивали с помощью инкубирования CAR-T-клеток с клетками-мишенями при 2,5-кратном соотношении E:T в течение 20 ч. в 96-луночных планшетах с плоским дном. Эффектoрные клетки представляли собой PI61, R1G5 и BCMA10 CART-клетки, полученные с применением либо способа ARM, либо способа TM. CART-клетки, изготовленные с применением способа ARM, высевали для 24-часовой промывки для клеток и оставляли, чтобы минимизировать неспецифическую активность. Клетки-мишени включают BCMA-положительные KMS11-luc или BCMA-отрицательные NALM6-luc. Эти клетки-мишени добавляли в свежевысеянные T-клетки или T-клетки после 24-часовой промывки (только клетки, полученные с помощью способа ARM). Для данного анализа % трансдукции CAR-T-клеток нормализовали с помощью добавления UTD в CAR-T-клетки для BCMA. Это обеспечило возможность сравнивать то же число CAR-T и то же общее число Т-клеток в каждом образце. Надосадочную жидкость через 20 часов совместного культивирования эффекторных клеток и клеток-мишеней собирали из каждой лунки и замораживали при -20°C для применения в MSD-анализе цитокина. Применяли набор MSD V-PLEX собственной разработки (№ K151A0H-4A), содержащий IFN-γ и IL-2 человека, для количественной оценки секретируемых цитокинов в каждом из образцов надосадочной жидкости.

Результаты

Способ ARM сохраняет стволовые характеристики Т-клеток

CAR-T-клетки, полученные с применением способа ARM, анализировали с помощью проточной цитометрии для оценки их экспрессии CAR при разморозке и через 48 ч. после разморозки, а также фенотипа T-клеток (фиг. 34A, 34B и 34C). Для CAR-T-клеток, изготовленных с применением способа TM, экспрессию CAR оценивали в день 9 перед сбором (фиг. 35A). CAR для BCMA почти не поддавался выявлению при разморозке, что показано на фиг. 34A. Однако, через 48 ч. после разморозки уровень CAR для BCMA был четко выражен как 32,9% для PI61, 35,9% для R1G5 и 17,4% для BCMA10. 9-дневные клетки, полученные с применением способа TM, демонстрируют уровень экспрессии CAR для BCMA, составляющий 36% для PI61, 40% для R1G5 и 7% для BCMA10 (фиг. 35A). Анализ фенотипа CAR+T-клеток выявил, что способ ARM обеспечивал сохранение подобных необученным T-клеток (~60% CD45RO-/CCR7+ для PI61 и R1G5, 32% CD45RO-/CCR7+ для BCMA10) (фиг. 34C). Способ TM в основном привел к получению T-клеток центральной памяти (TCM) (72 ~81% CD45RO+/CCR7+ для всех трех типов CAR-T для BCMA), в то время как популяция подобных необученным T-клеток практически исчезла в CAR+T-клетках, изготовленных с применением способа TM (фиг. 35B). В целом, популяция необученных T-клеток сильно перекрывается с CD45RO-/CD27+ стволовыми T-клетками, описанными в предыдущих источниках (Cohen AD, et al (2019). J Clin Invest. 130. pii: 126397. doi: 10.1172/JCI126397; Fraietta, JA, et al (2018). Nat Med, 24(5); 563-571) и ассоциирована с показателями и размножением CAR-T.

В дополнение к их фенотипу, конечные продукты на основе CAR-T-клеток PI61, R1G5 и BCMA10 были также оценены в отношении их функции in vitro. Продукты на основе клеток PI61, R1G5 и BCMA10 размораживали и совместно культивировали с клеточной линией KMS-11, экспрессирующей BCMA, при соотношении, составляющем 1:1. Клетки, полученные с помощью способа ARM, после разморозки оставляли в покое в течение 24 ч. перед началом совместного культивирования. Сравнение уровней цитокина в супернатантах через 24 часа после совместного культивирования выявило повышение уровней IL-2 в ~5-25 раз и повышение уровней IFN-γ в ~3-7 раз, секретируемых продуктами, полученными с помощью способа ARM, по сравнению с продуктами, полученными с помощью способа TM, как показано на фиг. 36A-36D. Эксперименты с не подвергнутыми трансдукции (UTD) клетками, которые подверглись обработке с помощью способа ARM или TM, подтвердили специфическое по BCMA распознавание PI61, R1G5 и BCMA10.

Таким образом, PI61, R1G5 и BCMA10 CAR-T-клетки, полученные с применением способа ARM, демонстрируют BCMA-специфическую активацию in vitro и характеризуются повышенной секрецией IL-2 и IFN-γ по сравнению с продуктами, обработанными с помощью способа TM, что коррелирует с фенотипом столовых T-клеток CART-клеток, полученных с применением способа ARM.

Пример 10. Анализ генных сигнатур CART-клеток, изготовленных с применением способа ARM

Способы

Секвенирование РНК отдельной клетки

Библиотеки для секвенирования РНК отдельной клетки получали с применением устройства 10X Genomics Chromium Controller и дополнительной библиотеки конструкционных наборов.

Криоконсервированные клетки размораживали, подсчитывали и сортировали с использованием проточной цитометрии (если необходимо для предмета исследования) до загрузки в устройство 10X Genomics. Отдельные клетки помещали в капли и осуществляли штрихкодирование РНК в отдельных каплях с помощью гранулы GemCode. Штрихкодированные РНК высвобождали из капель и конвертировали в совместимую с полным транскриптомом библиотеку для секвенирования Illumina.

Полученные библиотеки секвенировали на устройстве Illumina HiSeq и анализировали с применением программного конвейера для анализа 10X Genomics и программного обеспечения Loupe Cell Browser.

Иммунологическое профилирование отдельных клеток

Применяли библиотеки 10X Genomics полного транскриптома для отдельной клетки в качестве исходного материала для образования иммунологического профилирования и анализа спектра фрагментов. Последовательности рецептора Т-клетки подвергали ПЦР-амплификации из библиотек Chromium Single Cell 5' и анализировали на устройстве для секвенирования Illumina.

Последовательный анализ

Данные секвенирования РНК отдельной клетки были обработаны с помощью программного конвейера для анализа Cell Ranger, начиная с файлов FASTQ. Подробное описание программного конвейера для анализа Cell Ranger может быть найдено на: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger. Общий программный конвейер включает выравнивание, фильтрование, подсчет штрихкодов и подсчет UMI. Клеточные штрихкоды применяли для образования матриц на основе генов и штрихкодов, определения кластеров и осуществления анализа экспрессии гена. Данные о значении экспрессии гена нормализовали с применением пакета Seurat Bioconductor. Клетки, которые имели менее 200 экспрессируемых генов, отбрасывали из анализа. Гены, которые экспрессировались только в 2 клетках или менее, отбрасывали из анализа. Оставшиеся данные нормализовали с помощью способа логарифмической нормализации Seurat с применением коэффициента моделирования, составляющего 10000. Данные масштабировали посредством регрессии числа обнаруженных молекул на клетку. Балл набора генов (показатель GeneSetScore) рассчитывают используя среднее логарифмическое нормализованное значение экспрессии гена всех генов в наборе генов. Каждое значение экспрессии гена нормализируют с использованием Z-показателя так, что значение средней экспрессии гена среди образцов равняется 0 и стандартное отклонение равняется 1. Балл набора генов затем рассчитывают как среднее значение нормализированных значений экспрессии генов в наборе генов. Иллюстративный расчет балла набора генов описан ниже.

Для данного примера расчета балла набора генов значения нормализованной экспрессии гена двух (2) образцов для шести (6) генов предоставлены в таблице 23. Для целей данного иллюстративного расчета набор генов состоит из генов 1-4. Следовательно, оба образца 1 и 2 характеризуются баллом набора генов, равным 0.

Таблица 23. Иллюстративный набор данных для расчета балла набора генов

Образец 1 Образец 2 Ген 1 -3 0 Ген 2 3 0 Ген 3 1 0 Ген 4 -1 0 Ген 5 10 4 Ген 6 -5 3

Набор генов "активируемых в TEM и при этом подавляемых в TSCM" включает следующие гены: MXRA7, CLIC1, NAT13, TBC1D2B, GLCCI1, DUSP10, APOBEC3D, CACNB3, ANXA2P2, TPRG1, EOMES, MATK, ARHGAP10, ADAM8, MAN1A1, SLFN12L, SH2D2A, EIF2C4, CD58, MYO1F, RAB27B, ERN1, NPC1, NBEAL2, APOBEC3G, SYTL2, SLC4A4, PIK3AP1, PTGDR, MAF, PLEKHA5, ADRB2, PLXND1, GNAO1, THBS1, PPP2R2B, CYTH3, KLRF1, FLJ16686, AUTS2, PTPRM, GNLY и GFPT2.

Набор генов "активируемых в Treg и при этом подавляемых в Teff" включает следующие гены: C12orf75, SELPLG, SWAP70, RGS1, PRR11, SPATS2L, SPATS2L, TSHR, C14orf145, CASP8, SYT11, ACTN4, ANXA5, GLRX, HLA-DMB, PMCH, RAB11FIP1, IL32, FAM160B1, SHMT2, FRMD4B, CCR3, TNFRSF13B, NTNG2, CLDND1, BARD1, FCER1G, TYMS, ATP1B1, GJB6, FGL2, TK1, SLC2A8, CDKN2A, SKAP2, GPR55, CDCA7, S100A4, GDPD5, PMAIP1, ACOT9, CEP55, SGMS1, ADPRH, AKAP2, HDAC9, IKZF4, CARD17, VAV3, OBFC2A, ITGB1, CIITA, SETD7, HLA-DMA, CCR10, KIAA0101, SLC14A1, PTTG3P, DUSP10, FAM164A, PYHIN1, MYO1F, SLC1A4, MYBL2, PTTG1, RRM2, TP53INP1, CCR5, ST8SIA6, TOX, BFSP2, ITPRIPL1, NCAPH, HLA-DPB2, SYT4, NINJ2, FAM46C, CCR4, GBP5, C15orf53, LMCD1, MKI67, NUSAP1, PDE4A, E2F2, CD58, ARHGEF12, LOC100188949, FAS, HLA-DPB1, SELP, WEE1, HLA-DPA1, FCRL1, ICA1, CNTNAP1, OAS1, METTL7A, CCR6, HLA-DRB4, ANXA2P3, STAM, HLA-DQB2, LGALS1, ANXA2, PI16, DUSP4, LAYN, ANXA2P2, PTPLA, ANXA2P1, ZNF365, LAIR2, LOC541471, RASGRP4, BCAS1, UTS2, MIAT, PRDM1, SEMA3G, FAM129A, HPGD, NCF4, LGALS3, CEACAM4, JAKMIP1, TIGIT, HLA-DRA, IKZF2, HLA-DRB1, FANK1, RTKN2, TRIB1, FCRL3 и FOXP3.

Набор генов "подавляемых в стволовых клетках" включает следующие гены: ACE, BATF, CDK6, CHD2, ERCC2, HOXB4, MEOX1, SFRP1, SP7, SRF, TAL1 и XRCC5.

Набор генов "активируемых при гипоксии" включает следующие гены: ABCB1, ACAT1, ADM, ADORA2B, AK2, AK3, ALDH1A1, ALDH1A3, ALDOA, ALDOC, ANGPT2, ANGPTL4, ANXA1, ANXA2, ANXA5, ARHGAP5, ARSE, ART1, BACE2, BATF3, BCL2L1, BCL2L2, BHLHE40, BHLHE41, BIK, BIRC2, BNIP3, BNIP3L, BPI, BTG1, C11orf2, C7orf68, CA12, CA9, CALD1, CCNG2, CCT6A, CD99, CDK1, CDKN1A, CDKN1B, CITED2, CLK1, CNOT7, COL4A5, COL5A1, COL5A2, COL5A3, CP, CTSD, CXCR4, D4S234E, DDIT3, DDIT4, 1-Dec, DKC1, DR1, EDN1, EDN2, EFNA1, EGF, EGR1, EIF4A3, ELF3, ELL2, ENG, ENO1, ENO3, ENPEP, EPO, ERRFI1, ETS1, F3, FABP5, FGF3, FKBP4, FLT1, FN1, FOS, FTL, GAPDH, GBE1, GLRX, GPI, GPRC5A, HAP1, HBP1, HDAC1, HDAC9, HERC3, HERPUD1, HGF, HIF1A, HK1, HK2, HLA-DQB1, HMOX1, HMOX2, HSPA5, HSPD1, HSPH1, HYOU1, ICAM1, ID2, IFI27, IGF2, IGFBP1, IGFBP2, IGFBP3, IGFBP5, IL6, IL8, INSIG1, IRF6, ITGA5, JUN, KDR, KRT14, KRT18, KRT19, LDHA, LDHB, LEP, LGALS1, LONP1, LOX, LRP1, MAP4, MET, MIF, MMP13, MMP2, MMP7, MPI, MT1L, MTL3P, MUC1, MXI1, NDRG1, NFIL3, NFKB1, NFKB2, NOS1, NOS2, NOS2P1, NOS2P2, NOS3, NR3C1, NR4A1, NT5E, ODC1, P4HA1, P4HA2, PAICS, PDGFB, PDK3, PFKFB1, PFKFB3, PFKFB4, PFKL, PGAM1, PGF, PGK1, PGK2, PGM1, PIM1, PIM2, PKM2, PLAU, PLAUR, PLIN2, PLOD2, PNN, PNP, POLM, PPARA, PPAT, PROK1, PSMA3, PSMD9, PTGS1, PTGS2, QSOX1, RBPJ, RELA, RIOK3, RNASEL, RPL36A, RRP9, SAT1, SERPINB2, SERPINE1, SGSM2, SIAH2, SIN3A, SIRPA, SLC16A1, SLC16A2, SLC20A1, SLC2A1, SLC2A3, SLC3A2, SLC6A10P, SLC6A16, SLC6A6, SLC6A8, SORL1, SPP1, SRSF6, SSSCA1, STC2, STRA13, SYT7, TBPL1, TCEAL1, TEK, TF, TFF3, TFRC, TGFA, TGFB1, TGFB3, TGFBI, TGM2, TH, THBS1, THBS2, TIMM17A, TNFAIP3, TP53, TPBG, TPD52, TPI1, TXN, TXNIP, UMPS, VEGFA, VEGFB, VEGFC, VIM, VPS11 и XRCC6.

Набор генов "активируемых при аутофагии" включает следующие гены: ABL1, ACBD5, ACIN1, ACTRT1, ADAMTS7, AKR1E2, ALKBH5, ALPK1, AMBRA1, ANXA5, ANXA7, ARSB, ASB2, ATG10, ATG12, ATG13, ATG14, ATG16L1, ATG16L2, ATG2A, ATG2B, ATG3, ATG4A, ATG4B, ATG4C, ATG4D, ATG5, ATG7, ATG9A, ATG9B, ATP13A2, ATP1B1, ATPAF1-AS1, ATPIF1, BECN1, BECN1P1, BLOC1S1, BMP2KL, BNIP1, BNIP3, BOC, C11orf2, C11orf41, C12orf44, C12orf5, C14orf133, C1orf210, C5, C6orf106, C7orf59, C7orf68, C8orf59, C9orf72, CA7, CALCB, CALCOCO2, CAPS, CCDC36, CD163L1, CD93, CDC37, CDKN2A, CHAF1B, CHMP2A, CHMP2B, CHMP3, CHMP4A, CHMP4B, CHMP4C, CHMP6, CHST3, CISD2, CLDN7, CLEC16A, CLN3, CLVS1, COX8A, CPA3, CRNKL1, CSPG5, CTSA, CTSB, CTSD, CXCR7, DAP, DKKL1, DNAAF2, DPF3, DRAM1, DRAM2, DYNLL1, DYNLL2, DZANK1, EI24, EIF2S1, EPG5, EPM2A, FABP1, FAM125A, FAM131B, FAM134B, FAM13B, FAM176A, FAM176B, FAM48A, FANCC, FANCF, FANCL, FBXO7, FCGR3B, FGF14, FGF7, FGFBP1, FIS1, FNBP1L, FOXO1, FUNDC1, FUNDC2, FXR2, GABARAP, GABARAPL1, GABARAPL2, GABARAPL3, GABRA5, GDF5, GMIP, HAP1, HAPLN1, HBXIP, HCAR1, HDAC6, HGS, HIST1H3A, HIST1H3B, HIST1H3C, HIST1H3D, HIST1H3E, HIST1H3F, HIST1H3G, HIST1H3H, HIST1H3I, HIST1H3J, HK2, HMGB1, HPR, HSF2BP, HSP90AA1, HSPA8, IFI16, IPPK, IRGM, IST1, ITGB4, ITPKC, KCNK3, KCNQ1, KIAA0226, KIAA1324, KRCC1, KRT15, KRT73, LAMP1, LAMP2, LAMTOR1, LAMTOR2, LAMTOR3, LARP1B, LENG9, LGALS8, LIX1, LIX1L, LMCD1, LRRK2, LRSAM1, LSM4, MAP1A, MAP1LC3A, MAP1LC3B, MAP1LC3B2, MAP1LC3C, MAP1S, MAP2K1, MAP3K12, MARK2, MBD5, MDH1, MEX3C, MFN1, MFN2, MLST8, MRPS10, MRPS2, MSTN, MTERFD1, MTMR14, MTMR3, MTOR, MTSS1, MYH11, MYLK, MYOM1, NBR1, NDUFB9, NEFM, NHLRC1, NME2, NPC1, NR2C2, NRBF2, NTHL1, NUP93, OBSCN, OPTN, P2RX5, PACS2, PARK2, PARK7, PDK1, PDK4, PEX13, PEX3, PFKP, PGK2, PHF23, PHYHIP, PI4K2A, PIK3C3, PIK3CA, PIK3CB, PIK3R4, PINK1, PLEKHM1, PLOD2, PNPO, PPARGC1A, PPY, PRKAA1, PRKAA2, PRKAB1, PRKAB2, PRKAG1, PRKAG2, PRKAG3, PRKD2, PRKG1, PSEN1, PTPN22, RAB12, RAB1A, RAB1B, RAB23, RAB24, RAB33B, RAB39, RAB7A, RB1CC1, RBM18, REEP2, REP15, RFWD3, RGS19, RHEB, RIMS3, RNF185, RNF41, RPS27A, RPTOR, RRAGA, RRAGB, RRAGC, RRAGD, S100A8, S100A9, SCN1A, SERPINB10, SESN2, SFRP4, SH3GLB1, SIRT2, SLC1A3, SLC1A4, SLC22A3, SLC25A19, SLC35B3, SLC35C1, SLC37A4, SLC6A1, SLCO1A2, SMURF1, SNAP29, SNAPIN, SNF8, SNRPB, SNRPB2, SNRPD1, SNRPF, SNTG1, SNX14, SPATA18, SQSTM1, SRPX, STAM, STAM2, STAT2, STBD1, STK11, STK32A, STOM, STX12, STX17, SUPT3H, TBC1D17, TBC1D25, TBC1D5, TCIRG1, TEAD4, TECPR1, TECPR2, TFEB, TM9SF1, TMBIM6, TMEM203, TMEM208, TMEM39A, TMEM39B, TMEM59, TMEM74, TMEM93, TNIK, TOLLIP, TOMM20, TOMM22, TOMM40, TOMM5, TOMM6, TOMM7, TOMM70A, TP53INP1, TP53INP2, TRAPPC8, TREM1, TRIM17, TRIM5, TSG101, TXLNA, UBA52, UBB, UBC, UBQLN1, UBQLN2, UBQLN4, ULK1, ULK2, ULK3, USP10, USP13, USP30, UVRAG, VAMP7, VAMP8, VDAC1, VMP1, VPS11, VPS16, VPS18, VPS25, VPS28, VPS33A, VPS33B, VPS36, VPS37A, VPS37B, VPS37C, VPS37D, VPS39, VPS41, VPS4A, VPS4B, VTA1, VTI1A, VTI1B, WDFY3, WDR45, WDR45L, WIPI1, WIPI2, XBP1, YIPF1, ZCCHC17, ZFYVE1, ZKSCAN3, ZNF189, ZNF593 и ZNF681.

Набор генов "активируемых в клетках в состоянии покоя и при этом подавляемых в активированных клетках" включает следующие гены: ABCA7, ABCF3, ACAP2, AMT, ANKH, ATF7IP2, ATG14, ATP1A1, ATXN7, ATXN7L3B, BCL7A, BEX4, BSDC1, BTG1, BTG2, BTN3A1, C11orf21, C19orf22, C21orf2, CAMK2G, CARS2, CCNL2, CD248, CD5, CD55, CEP164, CHKB, CLK1, CLK4, CTSL1, DBP, DCUN1D2, DENND1C, DGKD, DLG1, DUSP1, EAPP, ECE1, ECHDC2, ERBB2IP, FAM117A, FAM134B, FAM134C, FAM169A, FAM190B, FAU, FLJ10038, FOXJ2, FOXJ3, FOXL1, FOXO1, FXYD5, FYB, HLA-E, HSPA1L, HYAL2, ICAM2, IFIT5, IFITM1, IKBKB, IQSEC1, IRS4, KIAA0664L3, KIAA0748, KLF3, KLF9, KRT18, LEF1, LINC00342, LIPA, LIPT1, LLGL2, LMBR1L, LPAR2, LTBP3, LYPD3, LZTFL1, MANBA, MAP2K6, MAP3K1, MARCH8, MAU2, MGEA5, MMP8, MPO, MSL1, MSL3, MYH3, MYLIP, NAGPA, NDST2, NISCH, NKTR, NLRP1, NOSIP, NPIP, NUMA1, PAIP2B, PAPD7, PBXIP1, PCIF1, PI4KA, PLCL2, PLEKHA1, PLEKHF2, PNISR, PPFIBP2, PRKCA, PRKCZ, PRKD3, PRMT2, PTP4A3, PXN, RASA2, RASA3, RASGRP2, RBM38, REPIN1, RNF38, RNF44, ROR1, RPL30, RPL32, RPLP1, RPS20, RPS24, RPS27, RPS6, RPS9, RXRA, RYK, SCAND2, SEMA4C, SETD1B, SETD6, SETX, SF3B1, SH2B1, SLC2A4RG, SLC35E2B, SLC46A3, SMAGP, SMARCE1, SMPD1, SNPH, SP140L, SPATA6, SPG7, SREK1IP1, SRSF5, STAT5B, SVIL, SYF2, SYNJ2BP, TAF1C, TBC1D4, TCF20, TECTA, TES, TMEM127, TMEM159, TMEM30B, TMEM66, TMEM8B, TP53TG1, TPCN1, TRIM22, TRIM44, TSC1, TSC22D1, TSC22D3, TSPYL2, TTC9, TTN, UBE2G2, USP33, USP34, VAMP1, VILL, VIPR1, VPS13C, ZBED5, ZBTB25, ZBTB40, ZC3H3, ZFP161, ZFP36L1, ZFP36L2, ZHX2, ZMYM5, ZNF136, ZNF148, ZNF318, ZNF350, ZNF512B, ZNF609, ZNF652, ZNF83, ZNF862 и ZNF91.

Набор генов "постепенно активируемых во время дифференциации клеток памяти" включает следующие гены: MTCH2, RAB6C, KIAA0195, SETD2, C2orf24, NRD1, GNA13, COPA, SELT, TNIP1, CBFA2T2, LRP10, PRKCI, BRE, ANKS1A, PNPLA6, ARL6IP1, WDFY1, MAPK1, GPR153, SHKBP1, MAP1LC3B2, PIP4K2A, HCN3, GTPBP1, TLN1, C4orf34, KIF3B, TCIRG1, PPP3CA, ATG4D, TYMP, TRAF6, C17orf76, WIPF1, FAM108A1, MYL6, NRM, SPCS2, GGT3P, GALK1, CLIP4, ARL4C, YWHAQ, LPCAT4, ATG2A, IDS, TBC1D5, DMPK, ST6GALNAC6, REEP5, ABHD6, KIAA0247, EMB, TSEN54, SPIRE2, PIWIL4, ZSCAN22, ICAM1, CHD9, LPIN2, SETD8, ZC3H12A, ULBP3, IL15RA, HLA-DQB2, LCP1, CHP, RUNX3, TMEM43, REEP4, MEF2D, ABL1, TMEM39A, PCBP4, PLCD1, CHST12, RASGRP1, C1orf58, C11orf63, C6orf129, FHOD1, DKFZp434F142, PIK3CG, ITPR3, BTG3, C4orf50, CNNM3, IFI16, AK1, CDK2AP1, REL, BCL2L1, MVD, TTC39C, PLEKHA2, FKBP11, EML4, FANCA, CDCA4, FUCA2, MFSD10, TBCD, CAPN2, IQGAP1, CHST11, PIK3R1, MYO5A, KIR2DL3, DLG3, MXD4, RALGDS, S1PR5, WSB2, CCR3, TIPARP, SP140, CD151, SOX13, KRTAP5-2, NF1, PEA15, PARP8, RNF166, UEVLD, LIMK1, CACNB1, TMX4, SLC6A6, LBA1, SV2A, LLGL2, IRF1, PPP2R5C, CD99, RAPGEF1, PPP4R1, OSBPL7, FOXP4, SLA2, TBC1D2B, ST7, JAZF1, GGA2, PI4K2A, CD68, LPGAT1, STX11, ZAK, FAM160B1, RORA, C8orf80, APOBEC3F, TGFBI, DNAJC1, GPR114, LRP8, CD69, CMIP, NAT13, TGFB1, FLJ00049, ANTXR2, NR4A3, IL12RB1, NTNG2, RDX, MLLT4, GPRIN3, ADCY9, CD300A, SCD5, ABI3, PTPN22, LGALS1, SYTL3, BMPR1A, TBK1, PMAIP1, RASGEF1A, GCNT1, GABARAPL1, STOM, CALHM2, ABCA2, PPP1R16B, SYNE2, PAM, C12orf75, CLCF1, MXRA7, APOBEC3C, CLSTN3, ACOT9, HIP1, LAG3, TNFAIP3, DCBLD1, KLF6, CACNB3, RNF19A, RAB27A, FADS3, DLG5, APOBEC3D, TNFRSF1B, ACTN4, TBKBP1, ATXN1, ARAP2, ARHGEF12, FAM53B, MAN1A1, FAM38A, PLXNC1, GRLF1, SRGN, HLA-DRB5, B4GALT5, WIPI1, PTPRJ, SLFN11, DUSP2, ANXA5, AHNAK, NEO1, CLIC1, EIF2C4, MAP3K5, IL2RB, PLEKHG1, MYO6, GTDC1, EDARADD, GALM, TARP, ADAM8, MSC, HNRPLL, SYT11, ATP2B4, NHSL2, MATK, ARHGAP18, SLFN12L, SPATS2L, RAB27B, PIK3R3, TP53INP1, MBOAT1, GYG1, KATNAL1, FAM46C, ZC3HAV1L, ANXA2P2, CTNNA1, NPC1, C3AR1, CRIM1, SH2D2A, ERN1, YPEL1, TBX21, SLC1A4, FASLG, PHACTR2, GALNT3, ADRB2, PIK3AP1, TLR3, PLEKHA5, DUSP10, GNAO1, PTGDR, FRMD4B, ANXA2, EOMES, CADM1, MAF, TPRG1, NBEAL2, PPP2R2B, PELO, SLC4A4, KLRF1, FOSL2, RGS2, TGFBR3, PRF1, MYO1F, GAB3, C17orf66, MICAL2, CYTH3, TOX, HLA-DRA, SYNE1, WEE1, PYHIN1, F2R, PLD1, THBS1, CD58, FAS, NETO2, CXCR6, ST6GALNAC2, DUSP4, AUTS2, C1orf21, KLRG1, TNIP3, GZMA, PRR5L, PRDM1, ST8SIA6, PLXND1, PTPRM, GFPT2, MYBL1, SLAMF7, FLJ16686, GNLY, ZEB2, CST7, IL18RAP, CCL5, KLRD1 и KLRB1.

Набор генов "активируемых в TEM и при этом подавляемых в TN" включает следующие гены: MYO5A, MXD4, STK3, S1PR5, GLCCI1, CCR3, SOX13, KRTAP5-2, PEA15, PARP8, RNF166, UEVLD, LIMK1, SLC6A6, SV2A, KPNA2, OSBPL7, ST7, GGA2, PI4K2A, CD68, ZAK, RORA, TGFBI, DNAJC1, JOSD1, ZFYVE28, LRP8, OSBPL3, CMIP, NAT13, TGFB1, ANTXR2, NR4A3, RDX, ADCY9, CHN1, CD300A, SCD5, PTPN22, LGALS1, RASGEF1A, GCNT1, GLUL, ABCA2, CLDND1, PAM, CLCF1, MXRA7, CLSTN3, ACOT9, METRNL, BMPR1A, LRIG1, APOBEC3G, CACNB3, RNF19A, RAB27A, FADS3, ACTN4, TBKBP1, FAM53B, MAN1A1, FAM38A, GRLF1, B4GALT5, WIPI1, DUSP2, ANXA5, AHNAK, CLIC1, MAP3K5, ST8SIA1, TARP, ADAM8, MATK, SLFN12L, PIK3R3, FAM46C, ANXA2P2, CTNNA1, NPC1, SH2D2A, ERN1, YPEL1, TBX21, STOM, PHACTR2, GBP5, ADRB2, PIK3AP1, DUSP10, PTGDR, EOMES, MAF, TPRG1, NBEAL2, NCAPH, SLC4A4, FOSL2, RGS2, TGFBR3, MYO1F, C17orf66, CYTH3, WEE1, PYHIN1, F2R, THBS1, CD58, AUTS2, FAM129A, TNIP3, GZMA, PRR5L, PRDM1, PLXND1, PTPRM, GFPT2, MYBL1, SLAMF7, ZEB2, CST7, CCL5, GZMK и KLRB1.

Другие наборы генов, описывающие подобные способы и/или характеристики могут также применяться для характеристики фенотипов клеток, описанных выше.

Применяли Cell Ranger VDJ для получения последовательностей VDJ отдельных клеток и аннотаций для каждой 5'-библиотеки для отдельной клетки. Программное обеспечение Loupe Cell Browser и пакеты Bioconductor применялись для анализа и визуализации данных.

Результаты

Целью данного примера является сравнение состояния Т-клеток между очищенными T-клетками, которые выступали в качестве изначальных клеток, CART-клетками, изготовленными с применением способа ARM (обозначенные как клетки "дня 1"), и CART-клетками, изготовленными с применением способа TM (меченные как клетки "дня 9"), с применением секвенирования РНК на одну клетку (секвенирование scRNA). Кроме того, проводили секвенирование TCR в одной клетке (секвенирование scTCR) для исследования клональности и отслеживания дифференциации клеток в изначальных материалах и материалах после изготовления.

Как показано на фиг. 37A-37C изначальные клетки характеризовались наименьшей экспрессией генов и UMI, позволяя предположить, что такие клетки не были транскрипционно активными и находились в состоянии покоя. Клетки дня 1 и дня 9 экспрессировали больше генов, при этом клетки дня 9 были наиболее транскрипционно активными. Подобные результаты показаны на фиг. 38A-38D. Изначальные клетки не экспрессировали гены пролиферации (фиг. 38A и 38D).

Дополнительный анализ данных набора генов показан на фиг. 39A-39E. Разные популяции клеток сравнивали с применением медианных баллов набора генов. Клетки дня 1 и изначальные клетки находились в более молодом состоянии более подобном на стволовые клетки памяти (фиг. 39A-39C). На фиг. 39A значения медианного показателя GeneSetScore (активируемых в TEM при этом подавляемых в TSCM) для клеток дня 1, клеток дня 9 и изначальных клеток составляли -0,084, 0,035 и -0,1 соответственно. На фиг. 39B значения медианного показателя GeneSetScore (активируемых в Treg при этом подавляемых в Teff) для клеток дня 1, клеток дня 9 и изначальных клеток составляли -0,082, 0,087 и -0,071 соответственно. На фиг. 39C значения медианного показателя GeneSetScore (подавляемых в стволовых клетках) для клеток дня 1, клеток дня 9 и изначальных клеток составляли -0,062, 0,14 и -0,081 соответственно.

Кроме того, клетки дня 1 находились в более совершенном метаболическом состоянии по сравнению с клетками дня 9 (фиг. 39D и 39E). На фиг. 39D значения медианного показателя GeneSetScore (активируемых при гипоксии) для клеток дня 1, клеток дня 9 и изначальных клеток составляли 0,019, 0,11 и -0,096 соответственно. На фиг. 39E значения медианного показателя GeneSetScore (активируемых при аутофагии) для клеток дня 1, клеток дня 9 и изначальных клеток составляли 0,066, 0,11 и -0,09 соответственно.

На основе экспрессии генов изначальные клетки включали четыре кластера. Кластер 0 характеризуется высокой экспрессией LMNA, S100A4 и т. д. Кластер 1 характеризуется высокой экспрессией RP913, PRKCQ-AS1 и т. д. Кластер 2 характеризуется высокой экспрессией PR11-291B21.2, CD8B и т. д. Кластер 3 характеризуется высокой экспрессией NKG7, GZMH, CCL5, CST7, GNLY, FGFBP2, GZMA, CCL4, CTSW, CD8A и т. д. На графике стохастического вложения соседей с t-распределением (TSNE) для изначальных клеток кластер 3 отличался от других клеток и кластер 1 и кластер 2 было тяжело отличить.

В соответствии с анализом набора генов, показанным на фиг. 40A-40C, кластер 0 и кластер 3 обогащали фенотипом регуляторных T-клеток по сравнению с кластером 1 и кластером 2, которые обогащали фенотипом эффектoрных T-клеток. В кластере 3 преобладали поздние T-клети памяти/эффектoрные T-клети памяти (TEM), в кластере 1 и кластере 2 ранние Т-клетки памяти и необученные Т-клетки и кластер 0 находится посередине. Большинство изначальных клеток находились в состоянии необученных Т-клеток памяти. Не ограничиваясь теорией, такие клетки могут проявить себя лучше всего во время процедуры изготовления.

Меньшая транскрипционная гетерогенность наблюдалась в популяциях клеток дня 1, клеток дня 9 (данные не показаны).

Как и изначальная популяция, клетки дня 1 продемонстрировали большой кластер ранних клеток памяти и меньший кластер поздних клеток памяти на графике TSNE. Подобно тому, что наблюдалось с кластером 3 изначальных клеток. Напротив, клетки дня 9 не показали различных кластеров ранних клеток памяти на графике TSNE. Это подразумевает, что на 9 день клетки стали более однородными.

Секвенировали TCR и измеряли разнообразие клонотипа. В целом, три профиля клонотипов были очень плоскими - большинство клонов характеризовались только одним пиком (фиг. 41A-41C и таблица 24). Энтропия Шэннона в таблице 24 измеряет плоскостность распределения. Преобладающие клоны в изначальных клетках представляли собой поздние клетки памяти. График клеток дня 1 выглядел подобно графику изначальных клеток, но начинал выравниваться. На день 9 график преобладающих клонов существенно выравнивался и распределение было намного более плоским. Параметр разнообразия был наибольшим в день 9, поскольку наблюдалось еще более ровное и плоское распределение на графике клеток дня 9, чем в изначальных клетках или клетках дня 1.

Таблица 24. Измерения разнообразия TCR

Изначальные клетки Продукт дня 1 Продукт дня 9 Среднее количество клонов на клонотип 1,10 1,05 1,07 Рассчитанное число клеток 7344 7687 7233 Общее число клонотипов 5325 7403 6736 Разнообразие 342,27 802,94 3382,62 Нормализированная энтропия Шеннона 9,98E-01 9,95E-01 9,96E-01

Краткое описание

Наблюдались значительные отличия в состоянии Т-клетки между продуктами дня 1 и дня 9. Клетки дня 1 были намного более подобными изначальным клеткам и характеризовались обогащением стволовыми сигнатурами, указывая на получение более эффективного продукта.

Пример 11. Фаза I открытого исследования CAR-T-клеток, нацеленных в отношении антигена созревания В-клеток (BCMA), у взрослых пациентов с рецидивирующей и/или рефрактерной множественной миеломой (MM)

В данном исследовании оценивается безопасность и переносимость терапии на основе CAR-T-клеток для BCMA, у взрослых субъектов с MM, у которых проявился рецидив и/или рефрактерность по меньшей мере дважды до начала осуществления схем лечения, включая IMiD (например, леналидомид или помалидомид), ингибитор протеасомы (например, бортезомиб, карфилзомиб) и одобренное антитело к CD38 (например, даратумумаб), если доступны, и задокументировано доказательство прогрессирования заболевания (критерии IMWG).

CAR для BCMA содержит scFv из PI61 для BCMA, шарнирную и трансмембранную области CD8, костимулирующий домен 4-1BB и сигнальный домен CD3-дзета. В данном исследовании продукты на основе CAR-Т-клеток для BCMA изготовлены с применением способа быстрого изготовления с активированием (ARM). Такие клетки называются "ARM-BCMA CAR". Конкретно, T-клетки субъекта, полученные с помощью лейкафареза, обогащены с применением коммерчески доступных магнитных гранул, захватывающих корецепторы CD4 и CD8 на поверхности Т-клеток. Обогащенные T-клетки затем стимулируют коллоидной полимерной наноматрицей, ковалентно присоединенной к гуманизированным рекомбинантным агонистическим антителам к CD3 и CD28 человека. Через двадцать четыре часа после высевания, активации и трансдукции, CAR-T-клетки собирают и промывают для удаления остаточного неинтегрировавшегося вектора и несвязанной активирующей матрицы. После промывки средство терапии на основе CART-клеток для BCMA концентрируют и криоконсервируют. Результаты из процедуры испытания высвобождения необходимы до высвобождения продукта для введения.

По сравнению со способом TM для CAR-T-клеток, который основывается на периоде размножения T-клеток ex vivo, длящемся 7-8 дней после трансдукции лентивирусным вектором, способ ARM не включает размножения T-клеток ex vivo. Напротив, T-клетки, полученные с помощью способа ARM, собирают через 24 часа после переноса генов, обеспечивая их размножение в организмах пациентов in vivo. Предполагается, что большее размножение Т-клеток in vivo, достигаемое с помощью способа ARM, приводит к получению менее дифференцированного фенотипа Т-клеток, при этом сохраняя большую фракцию T-клеток памяти в конечном продукте на основе клеток. Присутствие менее дифференцированных CAR-T-клеток памяти было ассоциировано с улучшенной противоопухолевой эффективностью в клинических исследованиях (Fraietta JA, et al., (2018) Nat Med, 24(5); 563-71 ). Не ограничиваясь теорией, CART-клетки для BCMA содержат большую фракцию стволовых Т-клеток памяти, что приводит к повышенному размножению CAR-Т-клеток у пациентов, таким образом преодолевая истощение эффектoрных Т-клеток и приводя к более долговременной эффективности у пациентов с MM по сравнению с CART для BCMA, полученные в результате осуществления способа традиционного изготовления.

Способ ARM обеспечивает получение CAR-T-клеток, состоящих из значительно большей части подобных необученным T-клеток памяти (CCR7+/CD45RO-) как в общем продукте, так и в CAR-положительной фракции, по сравнению с CART-клетками, изготовленными с применением способа традиционного изготовления (TM). Было показано, что ARM-BCMA CAR обеспечивал устранение опухоли в доклинических моделях MM дозозависимым образом. ARM-BCMA CAR по меньшей мере в пять раз более сильный по сравнению с BCMA CAR-T-клетками, полученными с помощью способа TM, и приводит к более длительному размножению CAR-T in vivo, с более высокими уровнями системных цитокинов. Вместе, такие результаты поддерживают гипотезу о том, что продукты на основе CAR-Т-клеток для BCMA, изготовленных с помощью способа ARM, содержат T-клетки с явным фенотипом стволовой клетки памяти, что приводит к получению продукта на основе CAR-Т-клеток для BCMA с увеличенными показателями приживления, размножения и свойств, направленных против MM.

В данной фазе I исследования, каждый субъект сначала оценивается в отношении клинического соответствия во время скрининга. Субъекты, подходящие для включения в данное исследование, должны соответствовать всем из следующих критериев: (1) ≥18-ти лет на момент подписания ICF; (2) показатель общего состояния при скрининге по шкале ECOG, составляющий 0 или 1; (3) субъекты с MM, у которых проявился рецидив и/или рефрактерность по меньшей мере 2 раза до начала осуществления схем лечения, включая IMiD (например, леналидомид или помалидомид), ингибитор протеасомы (например, бортезомиб, карфилзомиб) и одобренное антитело к CD38 (например, даратумумаб) (если доступны), и задокументировано доказательство прогрессирования заболевания (критерии IMWG); (4) субъекты должны характеризоваться поддающимся измерению заболеванием, определенным с помощью по меньшей мере 1 из следующих 3 измерений: M-белок в сыворотке крови ≥ 1,0 г/дл, M-белок в моче ≥ 200 мг/24 часа или свободные легкие (sFLC) цепи в сыворотке крови > 100 мг/л вовлеченного FLC; (5) все пациенты должны подходить для последовательных отборов биоптатов и/или сборов аспиратов костного мозга в соответствии с руководствами учреждения и быть готовыми повторить процедуру, описанную для данного исследования; (6) субъекты должны соответствовать следующим гематологическим показателям при скрининге: абсолютное число нейтрофилов (ANC) ≥ 1000/мм³ (≥ 1×10⁹/л) без введения фактора роста в течение 7 дней перед тестированием, абсолютное число CD3+ T-клеток > 150/мм³ (> 0,15×10⁹/л) без переливания крови в течение 7 дней перед испытанием, тромбоциты ≥ 50000/мм³ (≥ 50×10⁹/л) и гемоглобин ≥ 8,0 г/дл (≥ 4,9 ммоль/л); (7) исследователь должен признать пациента подходящим для прохождения режима для LD, предусматривающим введение флударабина/циклофосфамида; и (8) должен иметь материал, полученный с помощью афереза, содержащий немобилизированные клетки, пригодные для изготовления. Если субъект соответствует, то у него имеется продукт, полученный путем лейкафереза, собранный и поданный для изготовления CAR-T. Субъекты считаются включенными при принятии их продукта, полученного путем лейкафереза, для начала изготовления.

Субъекты подвергаются химиотерапии для лимфодеплеции (LD) только после того, как было подтверждено получение конечного продукта. После химиотерапии для LD вводят однократную дозу продукта на основе CAR-Т-клеток, связывающихся с BCMA, с помощью внутривенной (i.v.) иньекции субъекту в течение 90 минут поле размораживания (фиг. 42). Начальная доза ARM-BCMA CAR составляла 1×10⁷ жизнеспособных CAR-положительных T-клеток. Доза 5×10⁷ жизнеспособных CAR-положительных T-клеток также тестируется. Каждого субъекта госпитализируют в течение первых 72 часов после введения CAR-Т-клетки, связывающейся с BCMA.

Для фармакокинетического анализа собираются последовательные образцы крови в разные моменты времени для измерения клеточной кинетики ARM-BCMA CAR в периферической крови посредством проточной цитометрии и qPCR, в костном мозгу посредством проточной цитометрии и qPCR, для измерения клеточной и гуморальной иммуногенности и для измерения потенциальных фармакодинамических маркеров, включая sBCMA, BAFF и APRIL, в периферической крови посредством ELISA. В частности, субъектов анализируют в отношении количества трансгена CAR в периферической крови, костном мозге или других соответствующих тканях; экспрессии на поверхности CAR-положительных T-клеток в периферической крови или костном мозге; уровней антител к mCAR в сыворотке крови; процентной доли IFN-γ-положительных CD4/CD8 T-клеток в PBMC; маркеров активации иммунной клетки; растворимых иммунных факторов и цитокинов (например, sBCMA, IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-15, TNF-α), клональности CAR-T; и уровней растворимых BCMA, APRIL и BAFF в сыворотке крови.

Пример 12. Изготовление CART-клеток для BCMA с применением способа быстрого изготовления с активированием (ARM)

Способ ARM для получения CART-клеток для BCMA начинается с получения сред, как указанно в таблице 25.

Применяют криоконсервированный продукт, полученный путем лейкафереза, в качестве исходного материала и обрабатывают для обогащения Т-клетками. Если доступна, то документация по аферезу используется для определения процентной доли Т-клеток. В отсутствии в документации по аферезу данных о процентной доли Т-клеток тестирование индикаторного флакона проводят на поступающих криоконсервированных продуктах на основе образцов, полученных с помощью лейкафареза, с получением целевой процентной доли Т-клеток для афереза. Результаты для процентной доли Т-клеток определяют то, как много мягких контейнеров размораживается в день 0 осуществления способа ARM.

Таблица 25. Тип сред и буфера и цель применения во время изготовления CART для BCMA

Тип сред Источник Цель применения Буфер CliniMACS^®/сывороточный альбумин человека (HSA) (0,5% в рабочей концентрации) Получен оператором в день 0 День 0 обработка в устройстве для промывки клеток/сепараторе Среды для способа быстрого изготовления Получен оператором в день 0 День 0 для высевания клетки PBS/HSA (1% или 2% в рабочей концентрации) Получен оператором в день 0 Сбор и культура промывка сред (день 1) Cryostor10 (CS10) Коммерчески доступный Составление собранных клеток

Криоконсервированные образцы, полученные с помощью лейкафареза, размораживали, промывали и затем подвергали отбору и обогащению Т-клетками с применением технологии на основе микрогранул CliniMACS^®. Жизнеспособные ядросодержащие клетки (VNC) активируют с помощью TransACT (Miltenyi) и подвергают трансдукции с помощью лентивирусного вектора, кодирующего CAR. Жизнеспособные клетки, отобранные с помощью микрогранул Miltenyi, высевают на Centricult в Prodigy^®, который представляет собой не увлажненную камеру для инкубации. В то время как в культуре клетки суспендировали в среде для способа быстрого изготовления, которая представляет собой среду на основе OpTmizer^TM CTS^TM, которая содержит добавку CTS^TM (ThermoFisher), Glutamax, IL-2 и 2% заместитель сыворотки иммунных клеток вместе с ее компонентами для ускорения активации и трансдукции Т-клеток. Лентивирусную трансдукцию проводят один раз в день высевания после добавления TransACT в разбавленные клетки в питательную среду. Лентивирусный вектор будут размораживать непосредственно перед применением в день высевания в течение не более 30 минут при комнатной температуре.

С начала способа в день 0 до начала промывки культуры и сбора, CAR-T-клетки для BCMA культивируют в течение 20-28 часов после высевания. После культивирования, суспензия клеток подвергается двум промывкам культуры и одной промывке при сборе в пределах камеры Centricult (Miltenyi Biotech).

После промывки при сборе на CliniMACS^® Prodigy^® в день 1, отбирают образцы из суспензии клеток для определения количества жизнеспособных клеток и жизнеспособности. Клеточную суспензию затем переносят в центрифугу для осаждения вручную. Надосадочную жидкость удаляют и сгусток клеток ресуспендируют в CS10 (BioLife Solution), что приводит к составлению продукта с помощью конечной концентрации DMSO, составляющей ~10,0%. Количество жизнеспособных клеток составлено под конец сбора для введения дозы. Дозы затем распределяются в отдельные мягкие контейнеры для криозаморозки и аналитический отбор образцов осуществляется в флаконы для криозаморозки.

Криоконсервированные продукты хранятся в контролируемых резервуарах для хранения с LN2 в безопасной зоне с ограниченным доступом до окончательного выпуска и отгрузки.

Пример 13. Характеристика CART-клеток для BCMA, изготовленных с применением способа быстрого изготовления с активированием (ARM)

Краткое описание

Данный пример описывает характеристику CART-клеток для BCMA, изготовленных с применением способа ARM. Способ ARM обеспечивает получение CAR-T-клеток, состоящих из значительно большей части подобных необученным T-клеток памяти (CCR7+/CD45RO-) по сравнению с продуктом, изготовленным с применением способа традиционного изготовления (TM). В доклинической модели множественной миеломы (MM), CART-клетки для BCMA, изготовленные с применением способа ARM, индуцировали регрессию опухоли дозозависимым образом и были не более чем в 5 раз более эффективными в уничтожении опухолей по сравнению с CART-клетками для BCMA, изготовленными с применением способа TM. Кроме того, клетки, изготовленные с помощью ARM, продемонстрировали более длительное размножение CART in vivo (Cmax и AUC0-21 дней не более чем в 3 раза выше) и индуцировали более высокие системные уровни секреции цитокинов (IFN-γ в 3,5 раз) по сравнению с клетками, изготовленными с помощью способа TM. Вместе такие результаты поддерживают гипотезу о том, что CART-клетки для BCMA, изготовленные с помощью способа ARM, содержат T-клетки с явным фенотипом стволовой клетки памяти и увеличенным потенциалом размножения in vivo.

С применением способа ARM CAR могут стабильно экспрессироваться через 96 ч после добавление вируса (также через 72 ч после разморозки продукта). Следовательно, момент времени через 96 ч после добавления вируса или через 72 ч после разморозки считается суррогатным для экспрессии CAR для in vitro и in vivo активности. CART-клетки для BCMA, изготовленные с применением способа ARM, сохраняют менее дифференцированную популяцию клеток, и демонстрируют большую целевую специфическую продукцию цитокинов in vitro по сравнению с CART-клетками для BCMA, изготовленными с помощью способа TM.

CART-клетки для BCMA, изготовленные с применением способа ARM, демонстрируют большую специфичность в отношении BCMA с применением коммерческого комплекта мембранного белка плазмы крови человека. Анализ выявил связывание с BCMA (TNFRSF17), но не выявил других сильных, средних или слабых видов связывания. Скрининг не выявил с какой-либо высокой достоверностью наличия перекрестно-реагирующих белков вариабельного фрагмента одноцепочечного антитела (scFv) (PI61) к BCMA человека, экспрессируемых в продукте на основе CART для BCMA. Исследования целевого распределения проводили для определения потенциальной нецелевой или неопухолевой токсичности. Анализы способом иммуногистохимического исследования (IHC), гибридизации in situ (ISH) и полимеразной цепной реакции (PCR) использовались для изучения распределения BCMA в нормальных тканях человека. Такие анализы демонстрируют, что экспрессия BCMA ограничена местами, содержащими нормальные клетки плазмы крови (PC), такими как лимфоидные вторичные органы, костный мозг и лимфоидная ткань, ассоциированная со слизистой. Поскольку беспокойство в других видах терапии на основе клеток вызывала нейротоксичность в отношении центральной нервной системы (ЦНС), исследовали экспрессию в головном мозге. Не наблюдали окрашивания в ЦНС посредством иммуногистохимического исследования с применением коммерчески доступного антитела, которое является специфичным в отношении BCMA, ни посредством анализов связывания с применением инструмента на основе химерного гуманизированного антитела кролика, содержащего scFv, нацеленный на BCMA. Такие полученные данные подтверждались отсутствием mRNA BCMA в таких тканях, что измерено посредством гибридизации in situ и анализом сплайс-варианта на основе ПЦР. CART для BCMA, нацеленные на нормальные PC и экспрессирующие BCMA плазмацитоидные дендритные клетки, вероятней всего приведут к их истощению; однако, нацеливание в отношении других типов клеток не предполагается.

Результаты

В исследованиях, описанных ниже, сравнивались CART-клетки для BCMA, изготовленные с применением способа ARM (называемые "ARM-BCMA CAR"), с CART-клетками для BCMA, изготовленными с применением способа TM (называемые "TM-BCMA CAR" или "TM-BCMA CAR*"). CAR, экспрессируемый в ARM-BCMA CAR, и CAR, экспрессируемый в TM-BCMA CAR*, характеризовались одинаковой последовательностью, содержащей scFv из PI61, шарнирную и трансмембранную области CD8, костимулирующий домен 4-1BB и сигнальный домен CD3-дзета. CAR, экспрессируемый в TM-BCMA CAR, содержит scFv BCMA10, шарнирную CD8 и трансмембранный участок, костимулирующий домен 4-1BB и сигнальный домен CD3-дзета.

Кинетика экспрессии ARM-BCMA CAR in vitro

В отличие от TM, который измеряет лентивирусную интеграцию трансгена CAR через 8-9 дней, в способе ARM лентивирусный трансген может не полностью интегрироваться и на самом деле экспрессируется через 24 ч. после добавления лентивируса, может возникать лентивирусная псевдотрансдукция (Haas DL, et al., (2000) Mol Ther; 2(1):71-80; Galla M, et al., (2004) Mol Cell; 16(2):309-15). Следовательно, модель экспрессии BCMA CAR оценивали в течение времени с помощью более длительного культивирования ARM-BCMA CAR in vitro в присутствии или отсутствии 3'-азидо-3'-дезокситимидина (AZT) для оценки потенциала псевдотрансудкции относительно устойчивой интеграции и экспрессии трансгена CAR. Анализы на основе проточной цитометрии (FACS) проводили для определения экспрессии CAR на поверхности через 24 ч., 48 ч., 72 ч., 96 ч. и 168 ч. после активации Т-клетки и трансдукции лентивирусным вектором. В некоторых случаях ARM-BCMA CAR и аликвоту данного продукта замораживали непосредственно при сборе для дополнительного определения характеристик в других анализах.

Как показано на фиг. 43, анализы FACS указывают на то, что BCMA-CAR практически не проявил экспрессии через 24 ч. после добавления лентивирусного вектора. Однако, CAR+ популяция изначально появилась через 48 ч. CAR+ популяция немного увеличивалась в каждый момент времени в диапазоне от 48 ч. до 168 ч. после добавления вируса. CAR, вероятно, стабильно экспрессировался начиная с 96 ч. Это отличается от не подвергнутых трансдукции (UTD) образцов и образцов, обработанных AZT, в которых демонстрировалось отсутствие CAR+ популяции в любой момент времени, начиная с 48 ч. (фиг. 43). AZT был способен эффективно ингибировать экспрессию CAR как при дозе 30 мкM, так и при дозе 100 мкM, позволяя предположить, что экспрессия BCMA-CAR обусловлена интеграцией вирусного гена в геном клетки-хозяина и маловероятно является следствием лентивирусной псевдотрансдукции.

ARM-BCMA CAR сохраняет стволовые характеристики Т-клетки

ARM-BCMA CAR и TM-BCMA CAR анализировали с помощью FACS для оценки экспрессии CAR при разморозке, также фенотипа T-клетки через 48 ч. после разморозки (фиг. 44A и 44B). BCMA-CAR почти не поддавался выявлению при разморозке у двух доноров (фиг. 44A), что соответствует наблюдению в исследовании кинетики экспрессии CAR, показанному на фиг. 43. Однако, через 48 ч. после разморозки экспрессия BCMA-CAR составляла 32,9% для ARM-BCMA CAR. Напротив, TM-BCMA CAR проявил экспрессию BCMA-CAR, составляющую 7% (фиг. 44B). Анализ фенотипа CAR+ T-клетки выявил, что способ ARM обеспечил сохранение подобных необученным T-клеток (60% CD45RO-/CCR7+), что доказывает большее в 26 раз содержание популяции эффектoрных Т-клеток памяти (CD45RO+/CCR7-). Способ TM преимущественно приводит к получению T-клеток центральной памяти (81% CD45RO+/CCR7+) в пределах CAR+ T-клеток. Популяция подобных необученному типу T-клеток практически отсутствовала при применении способа TM. Данная популяция необученных T-клеток сильно перекрывалась с CD45RO-/CD27+ стволовыми T-клетками (что описано в Cohen AD, et al., (2019) J Clin Invest; 129(6):2210-21; и Fraietta, et al (2018) Nat Med, 24(5); 563-571) и ассоциирована с повышенным размножением CAR-T и клиническими ответами.

В дополнение к их фенотипу, конечный продукт на основе клеток ARM-BCMA CAR был также оценен в отношении его активации in vitro. ARM-BCMA CAR и TM-BCMA CAR размораживали и совместно культивировали с клеточной линией KMS-11, экспрессирующей BCMA. Клетки ARM-BCMA CAR после разморозки оставляли в покое в течение 24 ч. перед началом совместного культивирования. Сравнение уровней цитокинов в супернатантах через 24 часа после совместного культивирования выявило повышение уровней IL-2 в 5 раз и повышение уровней IFN-γ в 2 раза, секретируемых ARM-BCMA CAR, по сравнению с TM-BCMA CAR, как показано на фиг. 45A и 45B. Эксперименты с UTD клетками, которые подверглись обработке с помощью способа ARM или TM, подтвердили BCMA-специфическое распознавание ARM-BCMA CAR и TM-BCMA CAR. Однако, в вышеуказанном уровне техники секреция IFN-γ ARM-UTD в отсутствии BCMA-специфической стимуляции (фиг. 45B) вероятней всего обусловлена активированной природой продуктов ARM.

Таким образом, способ ARM, применяемый для получения CAR-T-клеток для BCMA, обеспечил получение T-клеток с уровнем экспрессии CAR, выше, чем при способе TM. ARM-BCMA CAR демонстрирует BCMA-специфическую активацию in vitro и секретирует более высокие уровни IL-2 по сравнению с TM-BCMA CAR, что коррелирует с их фенотипом стволовых T-клеток.

Эффективность ARM-BCMA CAR и TM-BCMA CAR в модели с ксенотрансплантатом

Исследования фармакологии in vivo применяли для направления развития ARM-BCMA CAR. Для эксперимента, описанного на фиг. 46, ARM-BCMA CAR был получен с помощью материала GMP. Параллельно с этим был получен TM-BCMA CAR с применением тех же T-клеток, но с помощью TM. Для расчета дозы с применением ARM-BCMA CAR применяли измерение % CAR+ через 72 ч после разморозки продукта для расчета дозы; в то время как для TM-BCMA CAR применяли % CAR+ продуктов, полученных с помощью способа TM, в день 9 для расчета дозы. Эффективность CAR-T-клеток, полученных с применением разных способов, оценивали на NSG-мышах с иммунодефицитом (NOD-scid IL2Rg-ноль), которым инокулировали клеточную линию MM KMS-11-Luc. Данную опухолевую клеточную линию приживляют в костный мозг. Через восемь дней после инокуляции клеточной линией MM, мыши в когортах получали однократную инфузию CAR+ T-клеток. Дозы нормализовали по общему содержанию CAR-T-клеток для соответствующих групп дозирования. UTD T-клетки получали подобным образом и вводили как независимую группу для контроля аллогенного ответа на опухоль. Доза UTD клеток соответствовала наивысшей достижимой общей дозе Т-клетки соответствующего способа как для TM, так и ARM.

Таблица 26. Краткое описание плана исследования для разных групп доз, и моментов времени для измерения фармакокинетики цитокина в крови (PK) и в плазме крови.

Способ получения клетки Группа CAR+ продукт/мышь Клеточная кинетика крови и цитокина в плазме крови после инъекции CAR-T PBS Цитокины: День 2, 7, 14 и 21
PK: День 7, 14 и 21 ARM UTD ARM-BCMA CAR 1,5e⁵ ARM-BCMA CAR 5e⁴ ARM-BCMA CAR 1e⁴ TM UTD TM-BCMA CAR 5e⁵ TM-BCMA CAR 1,5e⁵ TM-BCMA CAR 5e⁴

На фиг. 47 представлена кривая регрессии опухоли для всех групп. Оба продукта на основе CAR-T для BCMA (ARM-BCMA CAR и TM-BCMA CAR) были способны устранять опухоль при всех тестируемых уровнях дозы, даже в группе наименьшей дозой. Регрессия опухоли была индуцирована дозозависимым образом. Развитие эффекта в уничтожении опухоли было замедленно на приблизительно неделю в группе с низкой дозой по сравнению с группой с высокой дозой. ARM-BCMA CAR индуцировали подобную регрессию опухоли при дозах в 3-5 раз ниже, чем TM-BCMA CAR, указывая на то, что ARM-BCMA CAR в 3-5 раз более сильный по сравнению с TM-BCMA CAR в отношении уничтожения опухоли.

Более того, в данном исследовании была также оценена эффективность TM-BCMA CAR*. TM-BCMA CAR* и ARM-BCMA CAR экспрессирвали одинаковый CAR, связывающий с BCMA, но были изготовлены с применением разных способов: способа TM и способа ARM соответственно. Результаты демонстрируют, что ARM-BCMA CAR индуцируют подобную регрессию опухоли при дозах, которые в 1-5 раз ниже, чем TM-BCMA CAR*.

У всех мышей отбирали кровь в день 2, 7, 14 и 21 после терапии на основе CAR-T-клеток для измерения IFN-γ в плазме крови (фиг. 48A-48C). Не наблюдали раннего пика и во всех группах демонстрировали очень низкие уровни циркулирующих IFN-γ (<10 пг/мл) в день 2. Пики для всех групп наблюдали в течение 14 дней после дозы CAR-T. Однако, уровни IFN-γ были в 3,5 раз выше для ARM-BCMA CAR по сравнению с TM-BCMA CAR. В группах ARM-UTD демонстрировалась низкая продукция или отсутствие IFN-γ в день 2 и день 7 до окончания исследования. IFN-γ снизился в вышеуказанных группах дозы в день 21 по сравнению с группами ARM-BCMA CAR 1e4 и TM-BCMA CAR 5e4, поскольку CAR+T-клетки все еще размножались с замедленным ингибированием опухоли в таких двух группах.

Клеточная кинетика ARM-BCMA CAR in vivo

Как часть данного фармакологического исследования для оценки эффективности в мышах NSG, размножение CAR-T-клеток в периферической крови анализировали с помощью FACS не более чем через 3 недели после инфузии. Размножение как CD3+ Т-клеток, так и CAR+ Т-клеток наблюдали во всех группах, обработанных CAR-T-клеток. Не наблюдалось чистого дозозависимого размножения для ARM-BCMA CAR или TM-BCMA CAR по отношению к Cmax или AUC0-21d. Пик клеточного размножения для ARM-BCMA CAR или MTV273 не достигался в течение 21 дней. Однако, для TM-BCMA CAR в группе с дозой 5e5 и для ARM-BCMA CAR в группе с дозой 0,5e5 достигался видимый пик размножения в день 14 (фиг. 49). Сравнение размножения ARM-BCMA CAR с таковым TM-BCMA CAR через 21 день выявило, что как Cmax, так и AUC0-21d для ARM-BCMA CAR были в 2-3 раза выше.

Пример 14. Изготовление CART-клетки для BCMA с применением способа быстрого изготовления с активированием (ARM) с применением IL-15 или hetIL-15 (IL-15/sIL-15Ra)

Способ ARM для получения CART-клеток для BCMA начинается с получения сред, как указанно в таблице 25.

Применяют криоконсервированный продукт, полученный путем лейкафереза, в качестве исходного материала и обрабатывают для обогащения Т-клетками. Если доступна, то документация по аферезу используется для определения процентной доли Т-клеток. В отсутствии в документации по аферезу данных о процентной доли Т-клеток тестирование индикаторного флакона проводят на поступающих криоконсервированных продуктах на основе образцов, полученных с помощью лейкафареза, с получением целевой процентной доли Т-клеток для афереза. Результаты для процентной доли Т-клеток определяют то, как много мягких контейнеров размораживается в день 0 осуществления способа ARM.

Криоконсервированные образцы, полученные с помощью лейкафареза, размораживали, промывали и затем подвергали отбору и обогащению Т-клетками с применением технологии на основе микрогранул CliniMACS^®. Жизнеспособные ядросодержащие клетки (VNC) активируют с помощью TransACT (Miltenyi) и подвергают трансдукции с помощью лентивирусного вектора, кодирующего CAR. Жизнеспособные клетки, отобранные с помощью микрогранул Miltenyi, высевают на Centricult в Prodigy^®, который представляет собой не увлажненную камеру для инкубации. В то время как в культуре клетки суспендировали в среде для способа быстрого изготовления, которая представляет собой среду на основе OpTmizer^TM CTS^TM, которая содержит добавку CTS^TM (ThermoFisher), Glutamax, IL-15 или hetIL-15 (IL-15/sIL-15Ra), и 2% заместитель сыворотки иммунных клеток вместе с ее компонентами для ускорения активации и трансдукции Т-клеток. Лентивирусную трансдукцию проводят один раз в день высевания после добавления TransACT в разбавленные клетки в питательную среду. Лентивирусный вектор будут размораживать непосредственно перед применением в день высевания в течение не более 30 минут при комнатной температуре.

С начала способа в день 0 до начала промывки культуры и сбора, CAR-T-клетки для BCMA культивируют в течение 20-28 часов после высевания. После культивирования, суспензия клеток подвергается двум промывкам культуры и одной промывке при сборе в пределах камеры Centricult (Miltenyi Biotech).

После промывки при сборе на CliniMACS^® Prodigy^® в день 1, отбирают образцы из суспензии клеток для определения количества жизнеспособных клеток и жизнеспособности. Клеточную суспензию затем переносят в центрифугу для осаждения вручную. Надосадочную жидкость удаляют и сгусток клеток ресуспендируют в CS10 (BioLife Solution), что приводит к составлению продукта с помощью конечной концентрации DMSO, составляющей ~10,0%. Количество жизнеспособных клеток составлено под конец сбора для введения дозы. Дозы затем распределяются в отдельные мягкие контейнеры для криозаморозки и аналитический отбор образцов осуществляется в флаконы для криозаморозки.

Криоконсервированные продукты хранятся в контролируемых резервуарах для хранения с LN2 в безопасной зоне с ограниченным доступом до окончательного выпуска и отгрузки.

В некоторых вариантах осуществления IL-15 или hetIL-15, применяемые в среде на основе OpTmizer^TM CTS^TM, могут быть заменены с помощью IL-6 или IL-6/sIL-6Ra.

Пример 15. Изготовление CD19 CART-клеток с применением способа быстрого изготовления с активированием (ARM)

Способ ARM для получения CART-клеток для CD19 начинается с получения сред, как указанно в таблице 25.

Применяют криоконсервированный продукт, полученный путем лейкафереза, в качестве исходного материала и обрабатывают для обогащения Т-клетками. Если доступна, то документация по аферезу используется для определения процентной доли Т-клеток. В отсутствии в документации по аферезу данных о процентной доли Т-клеток тестирование индикаторного флакона проводят на поступающих криоконсервированных продуктах на основе образцов, полученных с помощью лейкафареза, с получением целевой процентной доли Т-клеток для афереза. Результаты для процентной доли Т-клеток определяют то, как много мягких контейнеров размораживается в день 0 осуществления способа ARM.

Криоконсервированные образцы, полученные с помощью лейкафареза, размораживали, промывали и затем подвергали отбору и обогащению Т-клетками с применением технологии на основе микрогранул CliniMACS^®. Жизнеспособные ядросодержащие клетки (VNC) активируют с помощью TransACT (Miltenyi) и подвергают трансдукции с помощью лентивирусного вектора, кодирующего CAR. Жизнеспособные клетки, отобранные с помощью микрогранул Miltenyi, высевают на Centricult в Prodigy^®, который представляет собой не увлажненную камеру для инкубации. В то время как в культуре клетки суспендировали в среде для способа быстрого изготовления, которая представляет собой среду на основе OpTmizer^TM CTS^TM, которая содержит добавку CTS^TM (ThermoFisher), Glutamax, IL-2 и 2% заместитель сыворотки иммунных клеток вместе с ее компонентами для ускорения активации и трансдукции Т-клеток. Лентивирусную трансдукцию проводят один раз в день высевания после добавления TransACT в разбавленные клетки в питательную среду. Лентивирусный вектор будут размораживать непосредственно перед применением в день высевания в течение не более 30 минут при комнатной температуре.

С начала способа в день 0 до начала промывки культуры и сбора, CAR-T-клетки для CD19 культивируют в течение 20-28 часов после высевания. После культивирования, суспензия клеток подвергается двум промывкам культуры и одной промывке при сборе в пределах камеры Centricult (Miltenyi Biotech).

После промывки при сборе на CliniMACS^® Prodigy^® в день 1, отбирают образцы из суспензии клеток для определения количества жизнеспособных клеток и жизнеспособности. Клеточную суспензию затем переносят в центрифугу для осаждения вручную. Надосадочную жидкость удаляют и сгусток клеток ресуспендируют в CS10 (BioLife Solution), что приводит к составлению продукта с помощью конечной концентрации DMSO, составляющей ~10,0%. Количество жизнеспособных клеток составлено под конец сбора для введения дозы. Дозы затем распределяются в отдельные мягкие контейнеры для криозаморозки и аналитический отбор образцов осуществляется в флаконы для криозаморозки.

Криоконсервированные продукты хранятся в контролируемых резервуарах для хранения с LN2 в безопасной зоне с ограниченным доступом до окончательного выпуска и отгрузки.

В некоторых вариантах осуществления IL-2, применяемый в среде на основе OpTmizer^TM CTS^TM, может быть заменен с помощью IL-15, hetIL-15 (IL-15/sIL-15Ra), IL-6 или IL-6/sIL-6Ra.

ЭКВИВАЛЕНТЫ

Раскрытия всех без исключения патентов, заявок на патент и публикаций, цитируемых в данном документе, настоящим включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Несмотря на то, что настоящее изобретение было раскрыто со ссылкой на некоторый варианты осуществления, очевидно, что дополнительные варианты осуществления и варианты данного изобретения могут быть разработаны другими специалистами в данной области без отступления от фактической сущности и объема настоящего изобретения. Предполагается, что прилагаемую формулу изобретения следует истолковывать как включающую все такие варианты осуществления и эквивалентные видоизменения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> NOVARTIS AG

<120> СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ КЛЕТОК, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ХИМЕРНЫЙ АНТИГЕННЫЙ

РЕЦЕПТОР

<130> N2067-7153WO

<140>

<141>

<150> 62/858,482

<151> 2019-06-07

<150> 62/773,679

<151> 2018-11-30

<150> 62/726,155

<151> 2018-08-31

<160> 309

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 1

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1. 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 2

<211> 45

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 2

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1. 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 3

<211> 230

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 3

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1. 5 10 15

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys Met

225 230

<210> 4

<211> 282

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 4

Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala

1. 5 10 15

Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala

20 25 30

Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys

35 40 45

Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro

50 55 60

Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala Val Gln

65 70 75 80

Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val Val Gly

85 90 95

Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys Val

100 105 110

Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser Asn Gly

115 120 125

Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu Trp Asn

130 135 140

Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu Pro Pro

145 150 155 160

Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Val Lys

165 170 175

Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala Ala Ser

180 185 190

Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile Leu Leu

195 200 205

Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe Ala Pro

210 215 220

Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ser Thr Thr Phe Trp Ala Trp Ser

225 230 235 240

Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr Thr

245 250 255

Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala Ser Arg

260 265 270

Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His

275 280

<210> 5

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 5

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1. 5 10

<210> 6

<211> 24

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 6

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1. 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

20

<210> 7

<211> 42

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 7

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1. 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 8

<211> 48

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 8

Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro

1. 5 10 15

Ala Glu Pro Cys Arg Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr

20 25 30

Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro

35 40 45

<210> 9

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 9

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly

1. 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 10

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 10

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1. 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 11

<211> 1184

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 11

cgtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 60

tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag gtggcgcggg gtaaactggg 120

aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 180

gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa 240

gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt 300

gaattacttc cacctggctg cagtacgtga ttcttgatcc cgagcttcgg gttggaagtg 360

ggtgggagag ttcgaggcct tgcgcttaag gagccccttc gcctcgtgct tgagttgagg 420

cctggcctgg gcgctggggc cgccgcgtgc gaatctggtg gcaccttcgc gcctgtctcg 480

ctgctttcga taagtctcta gccatttaaa atttttgatg acctgctgcg acgctttttt 540

tctggcaaga tagtcttgta aatgcgggcc aagatctgca cactggtatt tcggtttttg 600

gggccgcggg cggcgacggg gcccgtgcgt cccagcgcac atgttcggcg aggcggggcc 660

tgcgagcgcg gccaccgaga atcggacggg ggtagtctca agctggccgg cctgctctgg 720

tgcctggcct cgcgccgccg tgtatcgccc cgccctgggc ggcaaggctg gcccggtcgg 780

caccagttgc gtgagcggaa agatggccgc ttcccggccc tgctgcaggg agctcaaaat 840

ggaggacgcg gcgctcggga gagcgggcgg gtgagtcacc cacacaaagg aaaagggcct 900

ttccgtcctc agccgtcgct tcatgtgact ccacggagta ccgggcgccg tccaggcacc 960

tcgattagtt ctcgagcttt tggagtacgt cgtctttagg ttggggggag gggttttatg 1020

cgatggagtt tccccacact gagtgggtgg agactgaagt taggccagct tggcacttga 1080

tgtaattctc cttggaattt gccctttttg agtttggatc ttggttcatt ctcaagcctc 1140

agacagtggt tcaaagtttt tttcttccat ttcaggtgtc gtga 1184

<210> 12

<211> 63

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

cинтетический олигонуклеотид"

<400> 12

atggccctgc ctgtgacagc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca tgccgctaga 60

ccc 63

<210> 13

<211> 135

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 13

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgat 135

<210> 14

<211> 690

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 14

gagagcaagt acggccctcc ctgcccccct tgccctgccc ccgagttcct gggcggaccc 60

agcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag gacaccctga tgatcagccg gacccccgag 120

gtgacctgtg tggtggtgga cgtgtcccag gaggaccccg aggtccagtt caactggtac 180

gtggacggcg tggaggtgca caacgccaag accaagcccc gggaggagca gttcaatagc 240

acctaccggg tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggaa 300

tacaagtgta aggtgtccaa caagggcctg cccagcagca tcgagaaaac catcagcaag 360

gccaagggcc agcctcggga gccccaggtg tacaccctgc cccctagcca agaggagatg 420

accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg gtgaagggct tctaccccag cgacatcgcc 480

gtggagtggg agagcaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccctgtgctg 540

gacagcgacg gcagcttctt cctgtacagc cggctgaccg tggacaagag ccggtggcag 600

gagggcaacg tctttagctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 660

aagagcctga gcctgtccct gggcaagatg 690

<210> 15

<211> 847

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 15

aggtggcccg aaagtcccaa ggcccaggca tctagtgttc ctactgcaca gccccaggca 60

gaaggcagcc tagccaaagc tactactgca cctgccacta cgcgcaatac tggccgtggc 120

ggggaggaga agaaaaagga gaaagagaaa gaagaacagg aagagaggga gaccaagacc 180

cctgaatgtc catcccatac ccagccgctg ggcgtctatc tcttgactcc cgcagtacag 240

gacttgtggc ttagagataa ggccaccttt acatgtttcg tcgtgggctc tgacctgaag 300

gatgcccatt tgacttggga ggttgccgga aaggtaccca cagggggggt tgaggaaggg 360

ttgctggagc gccattccaa tggctctcag agccagcact caagactcac ccttccgaga 420

tccctgtgga acgccgggac ctctgtcaca tgtactctaa atcatcctag cctgccccca 480

cagcgtctga tggcccttag agagccagcc gcccaggcac cagttaagct tagcctgaat 540

ctgctcgcca gtagtgatcc cccagaggcc gccagctggc tcttatgcga agtgtccggc 600

tttagcccgc ccaacatctt gctcatgtgg ctggaggacc agcgagaagt gaacaccagc 660

ggcttcgctc cagcccggcc cccaccccag ccgggttcta ccacattctg ggcctggagt 720

gtcttaaggg tcccagcacc acctagcccc cagccagcca catacacctg tgttgtgtcc 780

catgaagata gcaggaccct gctaaatgct tctaggagtc tggaggtttc ctacgtgact 840

gaccatt 847

<210> 16

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

cинтетический олигонуклеотид"

<400> 16

ggtggcggag gttctggagg tggaggttcc 30

<210> 17

<211> 72

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

cинтетический олигонуклеотид"

<400> 17

atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60

accctttact gc 72

<210> 18

<211> 126

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 18

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 19

<211> 123

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 19

aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60

gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120

tcc 123

<210> 20

<211> 336

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 20

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

<210> 21

<211> 336

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 21

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

<210> 22

<211> 373

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 22

Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr

1. 5 10 15

Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe

20 25 30

Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr

35 40 45

Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu

50 55 60

Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu

65 70 75 80

Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn

85 90 95

Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala

100 105 110

Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg

115 120 125

Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly

130 135 140

Gln Phe Gln Thr Leu Val Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr

145 150 155 160

Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala

165 170 175

Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe

180 185 190

Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val

195 200 205

Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys

210 215 220

Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr

225 230 235 240

Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu

245 250 255

Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro

260 265 270

Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly

275 280 285

Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro

290 295 300

Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr

305 310 315 320

Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly

325 330 335

Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln

340 345 350

Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln

355 360 365

Ala Leu Pro Pro Arg

370

<210> 23

<211> 1182

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 23

atggccctcc ctgtcactgc cctgcttctc cccctcgcac tcctgctcca cgccgctaga 60

ccacccggat ggtttctgga ctctccggat cgcccgtgga atcccccaac cttctcaccg 120

gcactcttgg ttgtgactga gggcgataat gcgaccttca cgtgctcgtt ctccaacacc 180

tccgaatcat tcgtgctgaa ctggtaccgc atgagcccgt caaaccagac cgacaagctc 240

gccgcgtttc cggaagatcg gtcgcaaccg ggacaggatt gtcggttccg cgtgactcaa 300

ctgccgaatg gcagagactt ccacatgagc gtggtccgcg ctaggcgaaa cgactccggg 360

acctacctgt gcggagccat ctcgctggcg cctaaggccc aaatcaaaga gagcttgagg 420

gccgaactga gagtgaccga gcgcagagct gaggtgccaa ctgcacatcc atccccatcg 480

cctcggcctg cggggcagtt tcagaccctg gtcacgacca ctccggcgcc gcgcccaccg 540

actccggccc caactatcgc gagccagccc ctgtcgctga ggccggaagc atgccgccct 600

gccgccggag gtgctgtgca tacccgggga ttggacttcg catgcgacat ctacatttgg 660

gctcctctcg ccggaacttg tggcgtgctc cttctgtccc tggtcatcac cctgtactgc 720

aagcggggtc ggaaaaagct tctgtacatt ttcaagcagc ccttcatgag gcccgtgcaa 780

accacccagg aggaggacgg ttgctcctgc cggttccccg aagaggaaga aggaggttgc 840

gagctgcgcg tgaagttctc ccggagcgcc gacgcccccg cctataagca gggccagaac 900

cagctgtaca acgaactgaa cctgggacgg cgggaagagt acgatgtgct ggacaagcgg 960

cgcggccggg accccgaaat gggcgggaag cctagaagaa agaaccctca ggaaggcctg 1020

tataacgagc tgcagaagga caagatggcc gaggcctact ccgaaattgg gatgaaggga 1080

gagcggcgga ggggaaaggg gcacgacggc ctgtaccaag gactgtccac cgccaccaag 1140

gacacatacg atgccctgca catgcaggcc cttccccctc gc 1182

<210> 24

<211> 394

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 24

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1. 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro

20 25 30

Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly

35 40 45

Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe

50 55 60

Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu

65 70 75 80

Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe

85 90 95

Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val

100 105 110

Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser

115 120 125

Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg

130 135 140

Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser

145 150 155 160

Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Thr Thr Thr Pro Ala

165 170 175

Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser

180 185 190

Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr

195 200 205

Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala

210 215 220

Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

225 230 235 240

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

245 250 255

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

260 265 270

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg

275 280 285

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

290 295 300

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

305 310 315 320

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

325 330 335

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

340 345 350

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

355 360 365

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

370 375 380

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

385 390

<210> 25

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 25

Gly Gly Gly Gly Ser

1. 5

<210> 26

<211> 30

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<220>

<221> Сайт

<222> (1)..(30)

<223> /примечание="Эта последовательность может охватывать 1-6

повторяющихся звеньев "Gly Gly Gly Gly Ser"

<400> 26

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1. 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

20 25 30

<210> 27

<211> 20

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 27

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1. 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 28

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 28

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1. 5 10 15

<210> 29

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 29

Gly Gly Gly Ser

1

<210> 30

<211> 5000

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<220>

<221> другой_признак

<222> (1)..(5000)

<223> /примечание="Эта последовательность может охватывать 50-5000

нуклеотидов"

<400> 30

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 420

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 480

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 540

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 600

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 660

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 720

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 780

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 840

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1080

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1140

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1200

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1320

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1440

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1500

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1560

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1680

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1740

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1860

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1920

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1980

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2040

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2100

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2160

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2220

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2280

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2340

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2400

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2460

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2520

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2580

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2640

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2700

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2760

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2820

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2880

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2940

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3000

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3060

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3120

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3180

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3240

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3300

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3360

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3420

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3480

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3540

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3600

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3660

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3720

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3780

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3840

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3900

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3960

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4020

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4080

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4140

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4200

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4260

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4320

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4380

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4440

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4500

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4560

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4620

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4680

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4740

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4800

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4860

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4920

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4980

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 5000

<210> 31

<211> 100

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 31

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 100

<210> 32

<211> 5000

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<220>

<221> другой_признак

<222> (1)..(5000)

<223> /примечание="Эта последовательность может охватывать 50-5000

нуклеотидов"

<400> 32

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 120

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 180

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 240

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 300

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 360

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 420

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 480

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 540

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 600

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 660

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 720

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 780

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 840

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 900

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 960

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1020

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1080

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1140

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1200

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1260

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1320

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1380

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1440

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1500

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1560

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1620

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1680

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1740

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1800

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1860

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1920

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1980

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2040

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2100

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2160

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2220

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2280

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2340

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2400

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2460

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2520

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2580

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2640

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2700

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2760

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2820

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2880

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2940

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3000

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3060

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3120

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3180

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3240

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3300

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3360

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3420

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3480

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3540

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3600

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3660

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3720

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3780

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3840

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3900

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3960

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4020

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4080

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4140

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4200

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4260

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4320

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4380

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4440

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4500

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4560

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4620

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4680

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4740

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4800

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4860

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4920

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4980

tttttttttt tttttttttt 5000

<210> 33

<211> 5000

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<220>

<221> другой_признак

<222> (1)..(5000)

<223> /примечание="Эта последовательность может охватывать 100-5000

нуклеотидов"

<400> 33

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 420

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 480

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 540

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 600

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 660

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 720

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 780

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 840

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1080

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1140

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1200

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1320

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1440

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1500

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1560

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1680

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1740

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1860

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1920

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1980

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2040

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2100

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2160

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2220

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2280

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2340

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2400

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2460

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2520

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2580

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2640

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2700

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2760

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2820

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2880

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2940

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3000

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3060

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3120

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3180

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3240

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3300

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3360

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3420

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3480

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3540

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3600

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3660

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3720

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3780

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3840

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3900

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3960

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4020

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4080

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4140

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4200

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4260

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4320

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4380

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4440

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4500

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4560

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4620

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4680

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4740

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4800

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4860

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4920

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4980

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 5000

<210> 34

<211> 400

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<220>

<221> другой_признак

<222> (1)..(400)

<223> /примечание="Эта последовательность может охватывать 100-400

нуклеотидов"

<400> 34

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 400

<210> 35

<211> 2000

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<220>

<221> другой_признак

<222> (1)..(2000)

<223> /примечание="Эта последовательность может охватывать 50-2000

нуклеотидов"

<400> 35

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 420

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 480

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 540

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 600

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 660

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 720

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 780

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 840

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1080

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1140

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1200

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1320

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1440

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1500

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1560

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1680

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1740

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1860

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1920

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1980

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2000

<210> 36

<211> 41

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 36

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1. 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 37

<211> 123

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 37

aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60

gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120

tcc 123

<210> 38

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 38

Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro Asn Gly Glu Tyr

1. 5 10 15

Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser Arg Leu Thr Asp

20 25 30

Val Thr Leu

35

<210> 39

<211> 105

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 39

acaaaaaaga agtattcatc cagtgtgcac gaccctaacg gtgaatacat gttcatgaga 60

gcagtgaaca cagccaaaaa atccagactc acagatgtga cccta 105

<210> 40

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

cинтетический олигонуклеотид"

<400> 40

ggtggcggag gttctggagg tgggggttcc 30

<210> 41

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<220>

<221> источник

<223> /примечание="См. поданное описание для подробного описания замен

и предпочтительных вариантов осуществления"

<400> 41

Gly Gly Gly Ser

1

<210> 42

<211> 40

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<220>

<221> Сайт

<222> (1)..(40)

<223> /примечание="Эта последовательность может охватывать 1-10

повторяющихся звеньев "Gly Gly Gly Ser»

<400> 42

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

1. 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

20 25 30

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

35 40

<210> 43

<211> 18

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 43

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr

1. 5 10 15

Lys Gly

<210> 44

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 44

Ser Tyr Ala Met Ser

1. 5

<210> 45

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 45

Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1. 5 10 15

Gly

<210> 46

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 46

Arg Glu Trp Val Pro Tyr Asp Val Ser Trp Tyr Phe Asp Tyr

1. 5 10

<210> 47

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 47

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

1. 5

<210> 48

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 48

Ser Gly Ser Gly Gly Ser

1. 5

<210> 49

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 49

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala

1. 5

<210> 50

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 50

Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr

1. 5

<210> 51

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 51

Ala Arg Arg Glu Trp Val Pro Tyr Asp Val Ser Trp Tyr Phe Asp Tyr

1. 5 10 15

<210> 52

<211> 123

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 52

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1. 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Glu Trp Val Pro Tyr Asp Val Ser Trp Tyr Phe Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 53

<211> 369

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 53

gaagtgcagt tgctggagtc aggcggagga ctggtgcagc ccggaggatc gcttcgcttg 60

agctgcgcag cctcaggctt taccttctcc tcctacgcca tgtcctgggt cagacaggct 120

cccgggaagg gactggaatg ggtgtccgcc attagcggtt ccggcggaag cacttactat 180

gccgactctg tgaagggccg cttcactatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtat 240

ctccaaatga attccctgag ggccgaagat accgcggtgt actactgcgc tagacgggag 300

tgggtgccct acgatgtcag ctggtacttc gactactggg gacagggcac tctcgtgact 360

gtgtcctcc 369

<210> 54

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 54

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn

1. 5 10

<210> 55

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 55

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1. 5

<210> 56

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 56

Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr

1. 5

<210> 57

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 57

Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

1. 5

<210> 58

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 58

Ala Ala Ser

1

<210> 59

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 59

Ser Tyr Ser Thr Pro Leu

1. 5

<210> 60

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 60

Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

1. 5

<210> 61

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 61

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1. 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 62

<211> 321

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 62

gacattcaaa tgactcagtc cccgtcctcc ctctccgcct ccgtgggaga tcgcgtcacg 60

atcacgtgca gggccagcca gagcatctcc agctacctga actggtacca gcagaagcca 120

gggaaggcac cgaagctcct gatctacgcc gctagctcgc tgcagtccgg cgtcccttca 180

cggttctcgg gatcgggctc aggcaccgac ttcaccctga ccattagcag cctgcagccg 240

gaggacttcg cgacatacta ctgtcagcag tcatactcca cccctctgac cttcggccaa 300

gggaccaaag tggagatcaa g 321

<210> 63

<211> 20

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 63

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1. 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 64

<211> 250

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 64

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1. 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Glu Trp Val Pro Tyr Asp Val Ser Trp Tyr Phe Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp

130 135 140

Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp

145 150 155 160

Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu

165 170 175

Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

180 185 190

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

195 200 205

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

210 215 220

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr

225 230 235 240

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

245 250

<210> 65

<211> 750

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 65

gaagtgcagt tgctggagtc aggcggagga ctggtgcagc ccggaggatc gcttcgcttg 60

agctgcgcag cctcaggctt taccttctcc tcctacgcca tgtcctgggt cagacaggct 120

cccgggaagg gactggaatg ggtgtccgcc attagcggtt ccggcggaag cacttactat 180

gccgactctg tgaagggccg cttcactatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtat 240

ctccaaatga attccctgag ggccgaagat accgcggtgt actactgcgc tagacgggag 300

tgggtgccct acgatgtcag ctggtacttc gactactggg gacagggcac tctcgtgact 360

gtgtcctccg gtggtggtgg atcggggggt ggtggttcgg gcggaggagg atctggagga 420

ggagggtcgg acattcaaat gactcagtcc ccgtcctccc tctccgcctc cgtgggagat 480

cgcgtcacga tcacgtgcag ggccagccag agcatctcca gctacctgaa ctggtaccag 540

cagaagccag ggaaggcacc gaagctcctg atctacgccg ctagctcgct gcagtccggc 600

gtcccttcac ggttctcggg atcgggctca ggcaccgact tcaccctgac cattagcagc 660

ctgcagccgg aggacttcgc gacatactac tgtcagcagt catactccac ccctctgacc 720

ttcggccaag ggaccaaagt ggagatcaag 750

<210> 66

<211> 473

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 66

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1. 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Glu Trp Val Pro Tyr Asp Val Ser Trp Tyr Phe Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp

130 135 140

Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp

145 150 155 160

Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu

165 170 175

Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

180 185 190

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

195 200 205

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

210 215 220

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr

225 230 235 240

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro

245 250 255

Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu

260 265 270

Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg

275 280 285

Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly

290 295 300

Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys

305 310 315 320

Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg

325 330 335

Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro

340 345 350

Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser

355 360 365

Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu

370 375 380

Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg

385 390 395 400

Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln

405 410 415

Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr

420 425 430

Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp

435 440 445

Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala

450 455 460

Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

465 470

<210> 67

<211> 1419

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 67

gaagtgcagt tgctggagtc aggcggagga ctggtgcagc ccggaggatc gcttcgcttg 60

agctgcgcag cctcaggctt taccttctcc tcctacgcca tgtcctgggt cagacaggct 120

cccgggaagg gactggaatg ggtgtccgcc attagcggtt ccggcggaag cacttactat 180

gccgactctg tgaagggccg cttcactatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtat 240

ctccaaatga attccctgag ggccgaagat accgcggtgt actactgcgc tagacgggag 300

tgggtgccct acgatgtcag ctggtacttc gactactggg gacagggcac tctcgtgact 360

gtgtcctccg gtggtggtgg atcggggggt ggtggttcgg gcggaggagg atctggagga 420

ggagggtcgg acattcaaat gactcagtcc ccgtcctccc tctccgcctc cgtgggagat 480

cgcgtcacga tcacgtgcag ggccagccag agcatctcca gctacctgaa ctggtaccag 540

cagaagccag ggaaggcacc gaagctcctg atctacgccg ctagctcgct gcagtccggc 600

gtcccttcac ggttctcggg atcgggctca ggcaccgact tcaccctgac cattagcagc 660

ctgcagccgg aggacttcgc gacatactac tgtcagcagt catactccac ccctctgacc 720

ttcggccaag ggaccaaagt ggagatcaag accactaccc cagcaccgag gccacccacc 780

ccggctccta ccatcgcctc ccagcctctg tccctgcgtc cggaggcatg tagacccgca 840

gctggtgggg ccgtgcatac ccggggtctt gacttcgcct gcgatatcta catttgggcc 900

cctctggctg gtacttgcgg ggtcctgctg ctttcactcg tgatcactct ttactgtaag 960

cgcggtcgga agaagctgct gtacatcttt aagcaaccct tcatgaggcc tgtgcagact 1020

actcaagagg aggacggctg ttcatgccgg ttcccagagg aggaggaagg cggctgcgaa 1080

ctgcgcgtga aattcagccg cagcgcagat gctccagcct accagcaggg gcagaaccag 1140

ctctacaacg aactcaatct tggtcggaga gaggagtacg acgtgctgga caagcggaga 1200

ggacgggacc cagaaatggg cgggaagccg cgcagaaaga atccccaaga gggcctgtac 1260

aacgagctcc aaaaggataa gatggcagaa gcctatagcg agattggtat gaaaggggaa 1320

cgcagaagag gcaaaggcca cgacggactg taccagggac tcagcaccgc caccaaggac 1380

acctatgacg ctcttcacat gcaggccctg ccgcctcgg 1419

<210> 68

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 68

Arg Glu Trp Trp Tyr Asp Asp Trp Tyr Leu Asp Tyr

1. 5 10

<210> 69

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 69

Ala Arg Arg Glu Trp Trp Tyr Asp Asp Trp Tyr Leu Asp Tyr

1. 5 10

<210> 70

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 70

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1. 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Glu Trp Trp Tyr Asp Asp Trp Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 71

<211> 363

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 71

gaagtgcagt tgctggagtc aggcggagga ctggtgcagc ccggaggatc gcttcgcttg 60

agctgcgcag cctcaggctt taccttctcc tcctacgcca tgtcctgggt cagacaggct 120

cccgggaagg gactggaatg ggtgtccgcc attagcggtt ccggcggaag cacttactat 180

gccgactctg tgaagggccg cttcactatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtat 240

ctccaaatga attccctgag ggccgaagat accgcggtgt actactgcgc tagacgggag 300

tggtggtacg acgattggta cctggactac tggggacagg gcactctcgt gactgtgtcc 360

tcc 363

<210> 72

<211> 248

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 72

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1. 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Glu Trp Trp Tyr Asp Asp Trp Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln

130 135 140

Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val

145 150 155 160

Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp

165 170 175

Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala

180 185 190

Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

195 200 205

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe

210 215 220

Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly

225 230 235 240

Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

245

<210> 73

<211> 744

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 73

gaagtgcagt tgctggagtc aggcggagga ctggtgcagc ccggaggatc gcttcgcttg 60

agctgcgcag cctcaggctt taccttctcc tcctacgcca tgtcctgggt cagacaggct 120

cccgggaagg gactggaatg ggtgtccgcc attagcggtt ccggcggaag cacttactat 180

gccgactctg tgaagggccg cttcactatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtat 240

ctccaaatga attccctgag ggccgaagat accgcggtgt actactgcgc tagacgggag 300

tggtggtacg acgattggta cctggactac tggggacagg gcactctcgt gactgtgtcc 360

tccggtggtg gtggatcggg gggtggtggt tcgggcggag gaggatctgg aggaggaggg 420

tcggacattc aaatgactca gtccccgtcc tccctctccg cctccgtggg agatcgcgtc 480

acgatcacgt gcagggccag ccagagcatc tccagctacc tgaactggta ccagcagaag 540

ccagggaagg caccgaagct cctgatctac gccgctagct cgctgcagtc cggcgtccct 600

tcacggttct cgggatcggg ctcaggcacc gacttcaccc tgaccattag cagcctgcag 660

ccggaggact tcgcgacata ctactgtcag cagtcatact ccacccctct gaccttcggc 720

caagggacca aagtggagat caag 744

<210> 74

<211> 471

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 74

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1. 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Glu Trp Trp Tyr Asp Asp Trp Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln

130 135 140

Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val

145 150 155 160

Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp

165 170 175

Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala

180 185 190

Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

195 200 205

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe

210 215 220

Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly

225 230 235 240

Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro

245 250 255

Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro

260 265 270

Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu

275 280 285

Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys

290 295 300

Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly

305 310 315 320

Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val

325 330 335

Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu

340 345 350

Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp

355 360 365

Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn

370 375 380

Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg

385 390 395 400

Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly

405 410 415

Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu

420 425 430

Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu

435 440 445

Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His

450 455 460

Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

465 470

<210> 75

<211> 1413

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 75

gaagtgcagt tgctggagtc aggcggagga ctggtgcagc ccggaggatc gcttcgcttg 60

agctgcgcag cctcaggctt taccttctcc tcctacgcca tgtcctgggt cagacaggct 120

cccgggaagg gactggaatg ggtgtccgcc attagcggtt ccggcggaag cacttactat 180

gccgactctg tgaagggccg cttcactatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtat 240

ctccaaatga attccctgag ggccgaagat accgcggtgt actactgcgc tagacgggag 300

tggtggtacg acgattggta cctggactac tggggacagg gcactctcgt gactgtgtcc 360

tccggtggtg gtggatcggg gggtggtggt tcgggcggag gaggatctgg aggaggaggg 420

tcggacattc aaatgactca gtccccgtcc tccctctccg cctccgtggg agatcgcgtc 480

acgatcacgt gcagggccag ccagagcatc tccagctacc tgaactggta ccagcagaag 540

ccagggaagg caccgaagct cctgatctac gccgctagct cgctgcagtc cggcgtccct 600

tcacggttct cgggatcggg ctcaggcacc gacttcaccc tgaccattag cagcctgcag 660

ccggaggact tcgcgacata ctactgtcag cagtcatact ccacccctct gaccttcggc 720

caagggacca aagtggagat caagaccact accccagcac cgaggccacc caccccggct 780

cctaccatcg cctcccagcc tctgtccctg cgtccggagg catgtagacc cgcagctggt 840

ggggccgtgc atacccgggg tcttgacttc gcctgcgata tctacatttg ggcccctctg 900

gctggtactt gcggggtcct gctgctttca ctcgtgatca ctctttactg taagcgcggt 960

cggaagaagc tgctgtacat ctttaagcaa cccttcatga ggcctgtgca gactactcaa 1020

gaggaggacg gctgttcatg ccggttccca gaggaggagg aaggcggctg cgaactgcgc 1080

gtgaaattca gccgcagcgc agatgctcca gcctaccagc aggggcagaa ccagctctac 1140

aacgaactca atcttggtcg gagagaggag tacgacgtgc tggacaagcg gagaggacgg 1200

gacccagaaa tgggcgggaa gccgcgcaga aagaatcccc aagagggcct gtacaacgag 1260

ctccaaaagg ataagatggc agaagcctat agcgagattg gtatgaaagg ggaacgcaga 1320

agaggcaaag gccacgacgg actgtaccag ggactcagca ccgccaccaa ggacacctat 1380

gacgctcttc acatgcaggc cctgccgcct cgg 1413

<210> 76

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 76

Arg Glu Trp Trp Gly Glu Ser Trp Leu Phe Asp Tyr

1. 5 10

<210> 77

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 77

Ala Arg Arg Glu Trp Trp Gly Glu Ser Trp Leu Phe Asp Tyr

1. 5 10

<210> 78

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 78

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1. 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Glu Trp Trp Gly Glu Ser Trp Leu Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 79

<211> 363

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 79

gaagtgcagt tgctggagtc aggcggagga ctggtgcagc ccggaggatc gcttcgcttg 60

agctgcgcag cctcaggctt taccttctcc tcctacgcca tgtcctgggt cagacaggct 120

cccgggaagg gactggaatg ggtgtccgcc attagcggtt ccggcggaag cacttactat 180

gccgactctg tgaagggccg cttcactatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtat 240

ctccaaatga attccctgag ggccgaagat accgcggtgt actactgcgc tagacgggag 300

tggtggggag aaagctggct gttcgactac tggggacagg gcactctcgt gactgtgtcc 360

tcc 363

<210> 80

<211> 248

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 80

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1. 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Glu Trp Trp Gly Glu Ser Trp Leu Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln

130 135 140

Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val

145 150 155 160

Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp

165 170 175

Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala

180 185 190

Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

195 200 205

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe

210 215 220

Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly

225 230 235 240

Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

245

<210> 81

<211> 744

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 81

gaagtgcagt tgctggagtc aggcggagga ctggtgcagc ccggaggatc gcttcgcttg 60

agctgcgcag cctcaggctt taccttctcc tcctacgcca tgtcctgggt cagacaggct 120

cccgggaagg gactggaatg ggtgtccgcc attagcggtt ccggcggaag cacttactat 180

gccgactctg tgaagggccg cttcactatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtat 240

ctccaaatga attccctgag ggccgaagat accgcggtgt actactgcgc tagacgggag 300

tggtggggag aaagctggct gttcgactac tggggacagg gcactctcgt gactgtgtcc 360

tccggtggtg gtggatcggg gggtggtggt tcgggcggag gaggatctgg aggaggaggg 420

tcggacattc aaatgactca gtccccgtcc tccctctccg cctccgtggg agatcgcgtc 480

acgatcacgt gcagggccag ccagagcatc tccagctacc tgaactggta ccagcagaag 540

ccagggaagg caccgaagct cctgatctac gccgctagct cgctgcagtc cggcgtccct 600

tcacggttct cgggatcggg ctcaggcacc gacttcaccc tgaccattag cagcctgcag 660

ccggaggact tcgcgacata ctactgtcag cagtcatact ccacccctct gaccttcggc 720

caagggacca aagtggagat caag 744

<210> 82

<211> 471

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 82

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1. 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Glu Trp Trp Gly Glu Ser Trp Leu Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln

130 135 140

Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val

145 150 155 160

Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp

165 170 175

Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala

180 185 190

Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

195 200 205

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe

210 215 220

Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly

225 230 235 240

Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro

245 250 255

Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro

260 265 270

Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu

275 280 285

Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys

290 295 300

Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly

305 310 315 320

Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val

325 330 335

Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu

340 345 350

Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp

355 360 365

Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn

370 375 380

Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg

385 390 395 400

Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly

405 410 415

Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu

420 425 430

Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu

435 440 445

Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His

450 455 460

Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

465 470

<210> 83

<211> 1413

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 83

gaagtgcagt tgctggagtc aggcggagga ctggtgcagc ccggaggatc gcttcgcttg 60

agctgcgcag cctcaggctt taccttctcc tcctacgcca tgtcctgggt cagacaggct 120

cccgggaagg gactggaatg ggtgtccgcc attagcggtt ccggcggaag cacttactat 180

gccgactctg tgaagggccg cttcactatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtat 240

ctccaaatga attccctgag ggccgaagat accgcggtgt actactgcgc tagacgggag 300

tggtggggag aaagctggct gttcgactac tggggacagg gcactctcgt gactgtgtcc 360

tccggtggtg gtggatcggg gggtggtggt tcgggcggag gaggatctgg aggaggaggg 420

tcggacattc aaatgactca gtccccgtcc tccctctccg cctccgtggg agatcgcgtc 480

acgatcacgt gcagggccag ccagagcatc tccagctacc tgaactggta ccagcagaag 540

ccagggaagg caccgaagct cctgatctac gccgctagct cgctgcagtc cggcgtccct 600

tcacggttct cgggatcggg ctcaggcacc gacttcaccc tgaccattag cagcctgcag 660

ccggaggact tcgcgacata ctactgtcag cagtcatact ccacccctct gaccttcggc 720

caagggacca aagtggagat caagaccact accccagcac cgaggccacc caccccggct 780

cctaccatcg cctcccagcc tctgtccctg cgtccggagg catgtagacc cgcagctggt 840

ggggccgtgc atacccgggg tcttgacttc gcctgcgata tctacatttg ggcccctctg 900

gctggtactt gcggggtcct gctgctttca ctcgtgatca ctctttactg taagcgcggt 960

cggaagaagc tgctgtacat ctttaagcaa cccttcatga ggcctgtgca gactactcaa 1020

gaggaggacg gctgttcatg ccggttccca gaggaggagg aaggcggctg cgaactgcgc 1080

gtgaaattca gccgcagcgc agatgctcca gcctaccagc aggggcagaa ccagctctac 1140

aacgaactca atcttggtcg gagagaggag tacgacgtgc tggacaagcg gagaggacgg 1200

gacccagaaa tgggcgggaa gccgcgcaga aagaatcccc aagagggcct gtacaacgag 1260

ctccaaaagg ataagatggc agaagcctat agcgagattg gtatgaaagg ggaacgcaga 1320

agaggcaaag gccacgacgg actgtaccag ggactcagca ccgccaccaa ggacacctat 1380

gacgctcttc acatgcaggc cctgccgcct cgg 1413

<210> 84

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (4)..(4)

<223> /замена=" "

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (5)..(5)

<223> /замена=" "

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (6)..(6)

<223> /замена="Tyr"

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (7)..(7)

<223> /замена="Tyr" или "Asp"

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (8)..(8)

<223> /замена="Asp" или "Val"

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (9)..(9)

<223> /замена="Asp"

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (11)..(11)

<223> /замена="Tyr"

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (12)..(12)

<223> /замена="Leu"

<220>

<221> Сайт

<222> (1)..(14)

<223> /примечание="Остатки вариантов, приведенные в последовательности,

не имеют предпочтения по отношению к тем, которые указаны в

аннотациях для положений вариантов"

<400> 84

Arg Glu Trp Val Pro Trp Gly Glu Ser Trp Leu Phe Asp Tyr

1. 5 10

<210> 85

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (6)..(6)

<223> /замена=" "

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (7)..(7)

<223> /замена=" "

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (8)..(8)

<223> /замена="Tyr"

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (9)..(9)

<223> /замена="Tyr" или "Asp"

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (10)..(10)

<223> /замена="Asp" или "Val"

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (11)..(11)

<223> /замена="Asp"

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (13)..(13)

<223> /замена="Tyr"

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (14)..(14)

<223> /замена="Leu"

<220>

<221> Сайт

<222> (1)..(16)

<223> /примечание="Остатки вариантов, приведенные в последовательности, не

имеют предпочтения по отношению к тем, которые указаны в аннотациях

для положений вариантов"

<400> 85

Ala Arg Arg Glu Trp Val Pro Trp Gly Glu Ser Trp Leu Phe Asp Tyr

1. 5 10 15

<210> 86

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 86

Ser Tyr Gly Met His

1. 5

<210> 87

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 87

Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1. 5 10 15

Gly

<210> 88

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 88

Ser Gly Tyr Ala Leu His Asp Asp Tyr Tyr Gly Leu Asp Val

1. 5 10

<210> 89

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 89

Ser Tyr Asp Gly Ser Asn

1. 5

<210> 90

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 90

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly

1. 5

<210> 91

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 91

Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys

1. 5

<210> 92

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 92

Gly Gly Ser Gly Tyr Ala Leu His Asp Asp Tyr Tyr Gly Leu Asp Val

1. 5 10 15

<210> 93

<211> 123

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 93

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1. 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Gly Gly Ser Gly Tyr Ala Leu His Asp Asp Tyr Tyr Gly Leu Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 94

<211> 369

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 94

caagtgcagc tgcaggaatc cggtggcgga gtcgtgcagc ctggaaggag cctgagactc 60

tcatgcgccg cgtcagggtt caccttttcc tcctacggga tgcattgggt cagacaggcc 120

cccggaaagg gactcgaatg ggtggctgtg atcagctacg acggctccaa caagtactac 180

gccgactccg tgaaaggccg gttcactatc tcccgggaca actccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga attcactgcg cgcggaggat accgctgtgt actactgcgg tggctccggt 300

tacgccctgc acgatgacta ttacggcctt gacgtctggg gccagggaac cctcgtgact 360

gtgtccagc 369

<210> 95

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 95

Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser

1. 5 10

<210> 96

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 96

Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser

1. 5

<210> 97

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 97

Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Leu Tyr Val

1. 5 10

<210> 98

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 98

Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr

1. 5 10

<210> 99

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 99

Asp Val Ser

1

<210> 100

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 100

Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Leu Tyr

1. 5

<210> 101

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 101

Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr

1. 5

<210> 102

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 102

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1. 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser

85 90 95

Ser Thr Leu Tyr Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

100 105 110

<210> 103

<211> 333

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 103

cagagcgcac tgactcagcc ggcatccgtg tccggtagcc ccggacagtc gattaccatc 60

tcctgtaccg gcacctcctc cgacgtggga gggtacaact acgtgtcgtg gtaccagcag 120

cacccaggaa aggcccctaa gttgatgatc tacgatgtgt caaaccgccc gtctggagtc 180

tccaaccggt tctccggctc caagtccggc aacaccgcca gcctgaccat tagcgggctg 240

caagccgagg atgaggccga ctactactgc tcgagctaca catcctcgag caccctctac 300

gtgttcggct cggggactaa ggtcaccgtg ctg 333

<210> 104

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 104

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1. 5 10 15

<210> 105

<211> 249

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 105

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1. 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Gly Gly Ser Gly Tyr Ala Leu His Asp Asp Tyr Tyr Gly Leu Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Ala Leu Thr Gln

130 135 140

Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys

145 150 155 160

Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr

165 170 175

Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp Val Ser

180 185 190

Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly

195 200 205

Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala

210 215 220

Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Leu Tyr Val Phe

225 230 235 240

Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

245

<210> 106

<211> 747

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 106

caagtgcagc tgcaggaatc cggtggcgga gtcgtgcagc ctggaaggag cctgagactc 60

tcatgcgccg cgtcagggtt caccttttcc tcctacggga tgcattgggt cagacaggcc 120

cccggaaagg gactcgaatg ggtggctgtg atcagctacg acggctccaa caagtactac 180

gccgactccg tgaaaggccg gttcactatc tcccgggaca actccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga attcactgcg cgcggaggat accgctgtgt actactgcgg tggctccggt 300

tacgccctgc acgatgacta ttacggcctt gacgtctggg gccagggaac cctcgtgact 360

gtgtccagcg gtggaggagg ttcgggcgga ggaggatcag gagggggtgg atcgcagagc 420

gcactgactc agccggcatc cgtgtccggt agccccggac agtcgattac catctcctgt 480

accggcacct cctccgacgt gggagggtac aactacgtgt cgtggtacca gcagcaccca 540

ggaaaggccc ctaagttgat gatctacgat gtgtcaaacc gcccgtctgg agtctccaac 600

cggttctccg gctccaagtc cggcaacacc gccagcctga ccattagcgg gctgcaagcc 660

gaggatgagg ccgactacta ctgctcgagc tacacatcct cgagcaccct ctacgtgttc 720

ggctcgggga ctaaggtcac cgtgctg 747

<210> 107

<211> 472

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 107

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1. 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Gly Gly Ser Gly Tyr Ala Leu His Asp Asp Tyr Tyr Gly Leu Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Ala Leu Thr Gln

130 135 140

Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys

145 150 155 160

Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr

165 170 175

Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp Val Ser

180 185 190

Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly

195 200 205

Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala

210 215 220

Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Leu Tyr Val Phe

225 230 235 240

Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg

245 250 255

Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg

260 265 270

Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly

275 280 285

Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr

290 295 300

Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg

305 310 315 320

Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro

325 330 335

Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu

340 345 350

Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala

355 360 365

Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu

370 375 380

Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly

385 390 395 400

Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu

405 410 415

Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser

420 425 430

Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly

435 440 445

Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu

450 455 460

His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

465 470

<210> 108

<211> 1416

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 108

caagtgcagc tgcaggaatc cggtggcgga gtcgtgcagc ctggaaggag cctgagactc 60

tcatgcgccg cgtcagggtt caccttttcc tcctacggga tgcattgggt cagacaggcc 120

cccggaaagg gactcgaatg ggtggctgtg atcagctacg acggctccaa caagtactac 180

gccgactccg tgaaaggccg gttcactatc tcccgggaca actccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga attcactgcg cgcggaggat accgctgtgt actactgcgg tggctccggt 300

tacgccctgc acgatgacta ttacggcctt gacgtctggg gccagggaac cctcgtgact 360

gtgtccagcg gtggaggagg ttcgggcgga ggaggatcag gagggggtgg atcgcagagc 420

gcactgactc agccggcatc cgtgtccggt agccccggac agtcgattac catctcctgt 480

accggcacct cctccgacgt gggagggtac aactacgtgt cgtggtacca gcagcaccca 540

ggaaaggccc ctaagttgat gatctacgat gtgtcaaacc gcccgtctgg agtctccaac 600

cggttctccg gctccaagtc cggcaacacc gccagcctga ccattagcgg gctgcaagcc 660

gaggatgagg ccgactacta ctgctcgagc tacacatcct cgagcaccct ctacgtgttc 720

ggctcgggga ctaaggtcac cgtgctgacc actaccccag caccgaggcc acccaccccg 780

gctcctacca tcgcctccca gcctctgtcc ctgcgtccgg aggcatgtag acccgcagct 840

ggtggggccg tgcatacccg gggtcttgac ttcgcctgcg atatctacat ttgggcccct 900

ctggctggta cttgcggggt cctgctgctt tcactcgtga tcactcttta ctgtaagcgc 960

ggtcggaaga agctgctgta catctttaag caacccttca tgaggcctgt gcagactact 1020

caagaggagg acggctgttc atgccggttc ccagaggagg aggaaggcgg ctgcgaactg 1080

cgcgtgaaat tcagccgcag cgcagatgct ccagcctacc agcaggggca gaaccagctc 1140

tacaacgaac tcaatcttgg tcggagagag gagtacgacg tgctggacaa gcggagagga 1200

cgggacccag aaatgggcgg gaagccgcgc agaaagaatc cccaagaggg cctgtacaac 1260

gagctccaaa aggataagat ggcagaagcc tatagcgaga ttggtatgaa aggggaacgc 1320

agaagaggca aaggccacga cggactgtac cagggactca gcaccgccac caaggacacc 1380

tatgacgctc ttcacatgca ggccctgccg cctcgg 1416

<210> 109

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 109

Val Ile Ser Tyr Lys Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1. 5 10 15

Gly

<210> 110

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 110

Ser Tyr Lys Gly Ser Asn

1. 5

<210> 111

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 111

Ile Ser Tyr Lys Gly Ser Asn Lys

1. 5

<210> 112

<211> 123

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 112

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1. 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Lys Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Gly Gly Ser Gly Tyr Ala Leu His Asp Asp Tyr Tyr Gly Leu Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 113

<211> 369

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 113

caagtgcagc ttgtcgaatc gggaggcgga gtggtgcagc ctggacgatc gctccggctc 60

tcatgtgccg cgagcggatt caccttctcg agctacggca tgcactgggt cagacaagcc 120

ccaggaaagg gcctggaatg ggtggctgtc atctcgtaca agggctcaaa caagtactac 180

gccgactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgata actccaagaa taccctctat 240

ctgcaaatga acagcctgag ggccgaggat actgcagtgt actactgcgg gggttcaggc 300

tacgcgctgc acgacgacta ctacggattg gacgtctggg gccaaggaac tcttgtgacc 360

gtgtcctct 369

<210> 114

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 114

Glu Val Ser Asn Arg Leu Arg

1. 5

<210> 115

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 115

Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Ala Leu Tyr Val

1. 5 10

<210> 116

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 116

Glu Val Ser

1

<210> 117

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 117

Tyr Thr Ser Ser Ser Ala Leu Tyr

1. 5

<210> 118

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 118

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1. 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Leu Arg Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser

85 90 95

Ser Ala Leu Tyr Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

100 105 110

<210> 119

<211> 333

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 119

cagagcgcgc tgactcagcc tgcctccgtg agcggttcgc cgggacagtc cattaccatt 60

tcgtgcaccg ggacctcctc cgacgtggga ggctacaact acgtgtcctg gtaccagcag 120

catcccggaa aggccccgaa gctgatgatc tacgaagtgt cgaacagact gcggggagtc 180

tccaaccgct tttccgggtc caagtccggc aacaccgcca gcctgaccat cagcgggctc 240

caggcagaag atgaggctga ctattactgc tcctcctaca cgtcaagctc cgccctctac 300

gtgttcgggt ccgggaccaa agtcactgtg ctg 333

<210> 120

<211> 254

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 120

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1. 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Lys Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Gly Gly Ser Gly Tyr Ala Leu His Asp Asp Tyr Tyr Gly Leu Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln

130 135 140

Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser

145 150 155 160

Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn

165 170 175

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met

180 185 190

Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Leu Arg Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser

195 200 205

Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln

210 215 220

Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Ala Leu Tyr Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

245 250

<210> 121

<211> 762

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 121

caagtgcagc ttgtcgaatc gggaggcgga gtggtgcagc ctggacgatc gctccggctc 60

tcatgtgccg cgagcggatt caccttctcg agctacggca tgcactgggt cagacaagcc 120

ccaggaaagg gcctggaatg ggtggctgtc atctcgtaca agggctcaaa caagtactac 180

gccgactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgata actccaagaa taccctctat 240

ctgcaaatga acagcctgag ggccgaggat actgcagtgt actactgcgg gggttcaggc 300

tacgcgctgc acgacgacta ctacggattg gacgtctggg gccaaggaac tcttgtgacc 360

gtgtcctctg gtggaggcgg atcagggggt ggcggatctg ggggtggtgg ttccggggga 420

ggaggatcgc agagcgcgct gactcagcct gcctccgtga gcggttcgcc gggacagtcc 480

attaccattt cgtgcaccgg gacctcctcc gacgtgggag gctacaacta cgtgtcctgg 540

taccagcagc atcccggaaa ggccccgaag ctgatgatct acgaagtgtc gaacagactg 600

cggggagtct ccaaccgctt ttccgggtcc aagtccggca acaccgccag cctgaccatc 660

agcgggctcc aggcagaaga tgaggctgac tattactgct cctcctacac gtcaagctcc 720

gccctctacg tgttcgggtc cgggaccaaa gtcactgtgc tg 762

<210> 122

<211> 477

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 122

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1. 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Lys Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Gly Gly Ser Gly Tyr Ala Leu His Asp Asp Tyr Tyr Gly Leu Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln

130 135 140

Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser

145 150 155 160

Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn

165 170 175

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met

180 185 190

Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Leu Arg Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser

195 200 205

Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln

210 215 220

Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Ala Leu Tyr Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Thr Thr

245 250 255

Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln

260 265 270

Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala

275 280 285

Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala

290 295 300

Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr

305 310 315 320

Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln

325 330 335

Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser

340 345 350

Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys

355 360 365

Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln

370 375 380

Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu

385 390 395 400

Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg

405 410 415

Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met

420 425 430

Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly

435 440 445

Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp

450 455 460

Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

465 470 475

<210> 123

<211> 1431

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 123

caagtgcagc ttgtcgaatc gggaggcgga gtggtgcagc ctggacgatc gctccggctc 60

tcatgtgccg cgagcggatt caccttctcg agctacggca tgcactgggt cagacaagcc 120

ccaggaaagg gcctggaatg ggtggctgtc atctcgtaca agggctcaaa caagtactac 180

gccgactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgata actccaagaa taccctctat 240

ctgcaaatga acagcctgag ggccgaggat actgcagtgt actactgcgg gggttcaggc 300

tacgcgctgc acgacgacta ctacggattg gacgtctggg gccaaggaac tcttgtgacc 360

gtgtcctctg gtggaggcgg atcagggggt ggcggatctg ggggtggtgg ttccggggga 420

ggaggatcgc agagcgcgct gactcagcct gcctccgtga gcggttcgcc gggacagtcc 480

attaccattt cgtgcaccgg gacctcctcc gacgtgggag gctacaacta cgtgtcctgg 540

taccagcagc atcccggaaa ggccccgaag ctgatgatct acgaagtgtc gaacagactg 600

cggggagtct ccaaccgctt ttccgggtcc aagtccggca acaccgccag cctgaccatc 660

agcgggctcc aggcagaaga tgaggctgac tattactgct cctcctacac gtcaagctcc 720

gccctctacg tgttcgggtc cgggaccaaa gtcactgtgc tgaccactac cccagcaccg 780

aggccaccca ccccggctcc taccatcgcc tcccagcctc tgtccctgcg tccggaggca 840

tgtagacccg cagctggtgg ggccgtgcat acccggggtc ttgacttcgc ctgcgatatc 900

tacatttggg cccctctggc tggtacttgc ggggtcctgc tgctttcact cgtgatcact 960

ctttactgta agcgcggtcg gaagaagctg ctgtacatct ttaagcaacc cttcatgagg 1020

cctgtgcaga ctactcaaga ggaggacggc tgttcatgcc ggttcccaga ggaggaggaa 1080

ggcggctgcg aactgcgcgt gaaattcagc cgcagcgcag atgctccagc ctaccagcag 1140

gggcagaacc agctctacaa cgaactcaat cttggtcgga gagaggagta cgacgtgctg 1200

gacaagcgga gaggacggga cccagaaatg ggcgggaagc cgcgcagaaa gaatccccaa 1260

gagggcctgt acaacgagct ccaaaaggat aagatggcag aagcctatag cgagattggt 1320

atgaaagggg aacgcagaag aggcaaaggc cacgacggac tgtaccaggg actcagcacc 1380

gccaccaagg acacctatga cgctcttcac atgcaggccc tgccgcctcg g 1431

<210> 124

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 124

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1. 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Leu Arg Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser

85 90 95

Ser Thr Leu Tyr Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

100 105 110

<210> 125

<211> 333

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 125

cagagcgcgc tgactcagcc tgcctccgtg agcggttcgc cgggacagtc cattaccatt 60

tcgtgcaccg ggacctcctc cgacgtggga ggctacaact acgtgtcctg gtaccagcag 120

catcccggaa aggccccgaa gctgatgatc tacgaagtgt cgaacagact gcggggagtc 180

tccaaccgct tttccgggtc caagtccggc aacaccgcca gcctgaccat cagcgggctc 240

caggcagaag atgaggctga ctattactgc tcctcctaca cgtcaagctc caccctctac 300

gtgttcgggt ccgggaccaa agtcactgtg ctg 333

<210> 126

<211> 254

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 126

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1. 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Lys Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Gly Gly Ser Gly Tyr Ala Leu His Asp Asp Tyr Tyr Gly Leu Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln

130 135 140

Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser

145 150 155 160

Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn

165 170 175

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met

180 185 190

Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Leu Arg Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser

195 200 205

Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln

210 215 220

Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Leu Tyr Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

245 250

<210> 127

<211> 762

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 127

caagtgcagc ttgtcgaatc gggaggcgga gtggtgcagc ctggacgatc gctccggctc 60

tcatgtgccg cgagcggatt caccttctcg agctacggca tgcactgggt cagacaagcc 120

ccaggaaagg gcctggaatg ggtggctgtc atctcgtaca agggctcaaa caagtactac 180

gccgactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgata actccaagaa taccctctat 240

ctgcaaatga acagcctgag ggccgaggat actgcagtgt actactgcgg gggttcaggc 300

tacgcgctgc acgacgacta ctacggattg gacgtctggg gccaaggaac tcttgtgacc 360

gtgtcctctg gtggaggcgg atcagggggt ggcggatctg ggggtggtgg ttccggggga 420

ggaggatcgc agagcgcgct gactcagcct gcctccgtga gcggttcgcc gggacagtcc 480

attaccattt cgtgcaccgg gacctcctcc gacgtgggag gctacaacta cgtgtcctgg 540

taccagcagc atcccggaaa ggccccgaag ctgatgatct acgaagtgtc gaacagactg 600

cggggagtct ccaaccgctt ttccgggtcc aagtccggca acaccgccag cctgaccatc 660

agcgggctcc aggcagaaga tgaggctgac tattactgct cctcctacac gtcaagctcc 720

accctctacg tgttcgggtc cgggaccaaa gtcactgtgc tg 762

<210> 128

<211> 477

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 128

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1. 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Lys Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Gly Gly Ser Gly Tyr Ala Leu His Asp Asp Tyr Tyr Gly Leu Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln

130 135 140

Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser

145 150 155 160

Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn

165 170 175

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met

180 185 190

Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Leu Arg Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser

195 200 205

Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln

210 215 220

Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Leu Tyr Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Thr Thr

245 250 255

Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln

260 265 270

Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala

275 280 285

Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala

290 295 300

Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr

305 310 315 320

Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln

325 330 335

Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser

340 345 350

Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys

355 360 365

Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln

370 375 380

Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu

385 390 395 400

Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg

405 410 415

Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met

420 425 430

Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly

435 440 445

Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp

450 455 460

Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

465 470 475

<210> 129

<211> 1431

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 129

caagtgcagc ttgtcgaatc gggaggcgga gtggtgcagc ctggacgatc gctccggctc 60

tcatgtgccg cgagcggatt caccttctcg agctacggca tgcactgggt cagacaagcc 120

ccaggaaagg gcctggaatg ggtggctgtc atctcgtaca agggctcaaa caagtactac 180

gccgactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgata actccaagaa taccctctat 240

ctgcaaatga acagcctgag ggccgaggat actgcagtgt actactgcgg gggttcaggc 300

tacgcgctgc acgacgacta ctacggattg gacgtctggg gccaaggaac tcttgtgacc 360

gtgtcctctg gtggaggcgg atcagggggt ggcggatctg ggggtggtgg ttccggggga 420

ggaggatcgc agagcgcgct gactcagcct gcctccgtga gcggttcgcc gggacagtcc 480

attaccattt cgtgcaccgg gacctcctcc gacgtgggag gctacaacta cgtgtcctgg 540

taccagcagc atcccggaaa ggccccgaag ctgatgatct acgaagtgtc gaacagactg 600

cggggagtct ccaaccgctt ttccgggtcc aagtccggca acaccgccag cctgaccatc 660

agcgggctcc aggcagaaga tgaggctgac tattactgct cctcctacac gtcaagctcc 720

accctctacg tgttcgggtc cgggaccaaa gtcactgtgc tgaccactac cccagcaccg 780

aggccaccca ccccggctcc taccatcgcc tcccagcctc tgtccctgcg tccggaggca 840

tgtagacccg cagctggtgg ggccgtgcat acccggggtc ttgacttcgc ctgcgatatc 900

tacatttggg cccctctggc tggtacttgc ggggtcctgc tgctttcact cgtgatcact 960

ctttactgta agcgcggtcg gaagaagctg ctgtacatct ttaagcaacc cttcatgagg 1020

cctgtgcaga ctactcaaga ggaggacggc tgttcatgcc ggttcccaga ggaggaggaa 1080

ggcggctgcg aactgcgcgt gaaattcagc cgcagcgcag atgctccagc ctaccagcag 1140

gggcagaacc agctctacaa cgaactcaat cttggtcgga gagaggagta cgacgtgctg 1200

gacaagcgga gaggacggga cccagaaatg ggcgggaagc cgcgcagaaa gaatccccaa 1260

gagggcctgt acaacgagct ccaaaaggat aagatggcag aagcctatag cgagattggt 1320

atgaaagggg aacgcagaag aggcaaaggc cacgacggac tgtaccaggg actcagcacc 1380

gccaccaagg acacctatga cgctcttcac atgcaggccc tgccgcctcg g 1431

<210> 130

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (5)..(5)

<223> /замена="Lys"

<220>

<221> Сайт

<222> (1)..(17)

<223> /примечание="Остатки вариантов, приведенные в последовательности, не

имеют предпочтения по отношению к тем, которые указаны в аннотациях

для положений вариантов"

<400> 130

Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1. 5 10 15

Gly

<210> 131

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(1)

<223> /замена="Glu"

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (6)..(6)

<223> /замена="Leu"

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (7)..(7)

<223> /замена="Arg"

<220>

<221> Сайт

<222> (1)..(7)

<223> /примечание="Остатки вариантов, приведенные в последовательности, не

имеют предпочтения по отношению к тем, которые указаны в аннотациях

для положений вариантов"

<400> 131

Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser

1. 5

<210> 132

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (8)..(8)

<223> /замена="Ala"

<220>

<221> Сайт

<222> (1)..(11)

<223> /примечание="Остатки вариантов, приведенные в последовательности, не

имеют предпочтения по отношению к тем, которые указаны в аннотациях

для положений вариантов"

<400> 132

Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Leu Tyr Val

1. 5 10

<210> 133

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (3)..(3)

<223> /замена="Lys"

<220>

<221> Сайт

<222> (1)..(6)

<223> /примечание="Остатки вариантов, приведенные в последовательности, не

имеют предпочтения по отношению к тем, которые указаны в аннотациях

для положений вариантов"

<400> 133

Ser Tyr Asp Gly Ser Asn

1. 5

<210> 134

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(1)

<223> /замена="Glu"

<220>

<221> Сайт

<222> (1)..(3)

<223> /примечание="Остатки вариантов, приведенные в последовательности, не

имеют предпочтения по отношению к тем, которые указаны в аннотациях

для положений вариантов"

<400> 134

Asp Val Ser

1

<210> 135

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (6)..(6)

<223> /замена="Ala"

<220>

<221> Сайт

<222> (1)..(8)

<223> /примечание="Остатки вариантов, приведенные в последовательности, не

имеют предпочтения по отношению к тем, которые указаны в аннотациях

для положений вариантов"

<400> 135

Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Leu Tyr

1. 5

<210> 136

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (4)..(4)

<223> /замена="Lys"

<220>

<221> Сайт

<222> (1)..(8)

<223> /примечание="Остатки вариантов, приведенные в последовательности, не

имеют предпочтения по отношению к тем, которые указаны в аннотациях

для положений вариантов"

<400> 136

Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys

1. 5

<210> 137

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 137

Gly Phe Trp Met Ser

1. 5

<210> 138

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 138

Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Arg

1. 5 10 15

Gly

<210> 139

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 139

Ala Leu Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val

1. 5

<210> 140

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 140

Gly Phe Thr Phe Ser Gly Phe

1. 5

<210> 141

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 141

Lys Gln Asp Gly Ser Glu

1. 5

<210> 142

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 142

Gly Phe Thr Phe Ser Gly Phe Trp

1. 5

<210> 143

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 143

Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys

1. 5

<210> 144

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 144

Ala Arg Ala Leu Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val

1. 5 10

<210> 145

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 145

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1. 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Phe

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Leu Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 146

<211> 354

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 146

gaagtgcaac tggtggagag cggtggaggg cttgtccagc ccggaggatc gctgcggctg 60

tcctgtgctg cgtccgggtt caccttctcc ggcttctgga tgtcctgggt cagacaggca 120

ccgggaaagg gcctcgaatg ggtggccaac atcaagcagg atggctccga gaagtactac 180

gtcgactccg tgagaggccg cttcaccatc tcccgggaca acgccaagaa ctcgctgtac 240

ctccaaatga atagcctcag ggcggaagat actgctgtgt attactgcgc acgcgccctt 300

gactactacg gcatggacgt ctggggccaa gggaccactg tgaccgtgtc tagc 354

<210> 147

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 147

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu

1. 5 10 15

Asp

<210> 148

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 148

Thr Leu Ser Tyr Arg Ala Ser

1. 5

<210> 149

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 149

Thr Gln Arg Leu Glu Phe Pro Ser Ile Thr

1. 5 10

<210> 150

<211> 13

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 150

Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Asp Gly Asn Thr Tyr

1. 5 10

<210> 151

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 151

Thr Leu Ser

1

<210> 152

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 152

Arg Leu Glu Phe Pro Ser Ile

1. 5

<210> 153

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 153

Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Asp Gly Asn Thr Tyr

1. 5 10

<210> 154

<211> 114

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 154

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1. 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

65 70 75 80

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Leu Tyr Tyr Cys Thr Gln

85 90 95

Arg Leu Glu Phe Pro Ser Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu

100 105 110

Ile Lys

<210> 155

<211> 342

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 155

gatatcgtga tgacccagac tcccctgtcc ctgcctgtga ctcccggaga accagcctcc 60

atttcctgcc ggtcctccca gtccctgctg gacagcgacg acggcaacac ttacctggac 120

tggtacttgc agaagccggg ccaatcgcct cgcctgctga tctataccct gtcataccgg 180

gcctcaggag tgcctgaccg cttctcggga tcagggagcg ggaccgattt caccctgaaa 240

atttcccgag tggaagccga ggacgtcgga ctgtactact gcacccagcg cctcgaattc 300

ccgtcgatta cgtttggaca gggtacccgg cttgagatca ag 342

<210> 156

<211> 252

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 156

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1. 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Phe

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Leu Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln

130 135 140

Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser

145 150 155 160

Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Asp Gly Asn Thr Tyr

165 170 175

Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile

180 185 190

Tyr Thr Leu Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

195 200 205

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala

210 215 220

Glu Asp Val Gly Leu Tyr Tyr Cys Thr Gln Arg Leu Glu Phe Pro Ser

225 230 235 240

Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

245 250

<210> 157

<211> 756

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 157

gaagtgcaac tggtggagag cggtggaggg cttgtccagc ccggaggatc gctgcggctg 60

tcctgtgctg cgtccgggtt caccttctcc ggcttctgga tgtcctgggt cagacaggca 120

ccgggaaagg gcctcgaatg ggtggccaac atcaagcagg atggctccga gaagtactac 180

gtcgactccg tgagaggccg cttcaccatc tcccgggaca acgccaagaa ctcgctgtac 240

ctccaaatga atagcctcag ggcggaagat actgctgtgt attactgcgc acgcgccctt 300

gactactacg gcatggacgt ctggggccaa gggaccactg tgaccgtgtc tagcggaggc 360

ggaggttcag ggggcggtgg atcaggcgga ggaggatcgg ggggtggtgg atcggatatc 420

gtgatgaccc agactcccct gtccctgcct gtgactcccg gagaaccagc ctccatttcc 480

tgccggtcct cccagtccct gctggacagc gacgacggca acacttacct ggactggtac 540

ttgcagaagc cgggccaatc gcctcgcctg ctgatctata ccctgtcata ccgggcctca 600

ggagtgcctg accgcttctc gggatcaggg agcgggaccg atttcaccct gaaaatttcc 660

cgagtggaag ccgaggacgt cggactgtac tactgcaccc agcgcctcga attcccgtcg 720

attacgtttg gacagggtac ccggcttgag atcaag 756

<210> 158

<211> 475

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 158

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1. 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Phe

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Leu Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln

130 135 140

Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser

145 150 155 160

Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Asp Gly Asn Thr Tyr

165 170 175

Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile

180 185 190

Tyr Thr Leu Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

195 200 205

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala

210 215 220

Glu Asp Val Gly Leu Tyr Tyr Cys Thr Gln Arg Leu Glu Phe Pro Ser

225 230 235 240

Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro

245 250 255

Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu

260 265 270

Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His

275 280 285

Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu

290 295 300

Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr

305 310 315 320

Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe

325 330 335

Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg

340 345 350

Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser

355 360 365

Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr

370 375 380

Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys

385 390 395 400

Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn

405 410 415

Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu

420 425 430

Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly

435 440 445

His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr

450 455 460

Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

465 470 475

<210> 159

<211> 1425

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 159

gaagtgcaac tggtggagag cggtggaggg cttgtccagc ccggaggatc gctgcggctg 60

tcctgtgctg cgtccgggtt caccttctcc ggcttctgga tgtcctgggt cagacaggca 120

ccgggaaagg gcctcgaatg ggtggccaac atcaagcagg atggctccga gaagtactac 180

gtcgactccg tgagaggccg cttcaccatc tcccgggaca acgccaagaa ctcgctgtac 240

ctccaaatga atagcctcag ggcggaagat actgctgtgt attactgcgc acgcgccctt 300

gactactacg gcatggacgt ctggggccaa gggaccactg tgaccgtgtc tagcggaggc 360

ggaggttcag ggggcggtgg atcaggcgga ggaggatcgg ggggtggtgg atcggatatc 420

gtgatgaccc agactcccct gtccctgcct gtgactcccg gagaaccagc ctccatttcc 480

tgccggtcct cccagtccct gctggacagc gacgacggca acacttacct ggactggtac 540

ttgcagaagc cgggccaatc gcctcgcctg ctgatctata ccctgtcata ccgggcctca 600

ggagtgcctg accgcttctc gggatcaggg agcgggaccg atttcaccct gaaaatttcc 660

cgagtggaag ccgaggacgt cggactgtac tactgcaccc agcgcctcga attcccgtcg 720

attacgtttg gacagggtac ccggcttgag atcaagacca ctaccccagc accgaggcca 780

cccaccccgg ctcctaccat cgcctcccag cctctgtccc tgcgtccgga ggcatgtaga 840

cccgcagctg gtggggccgt gcatacccgg ggtcttgact tcgcctgcga tatctacatt 900

tgggcccctc tggctggtac ttgcggggtc ctgctgcttt cactcgtgat cactctttac 960

tgtaagcgcg gtcggaagaa gctgctgtac atctttaagc aacccttcat gaggcctgtg 1020

cagactactc aagaggagga cggctgttca tgccggttcc cagaggagga ggaaggcggc 1080

tgcgaactgc gcgtgaaatt cagccgcagc gcagatgctc cagcctacca gcaggggcag 1140

aaccagctct acaacgaact caatcttggt cggagagagg agtacgacgt gctggacaag 1200

cggagaggac gggacccaga aatgggcggg aagccgcgca gaaagaatcc ccaagagggc 1260

ctgtacaacg agctccaaaa ggataagatg gcagaagcct atagcgagat tggtatgaaa 1320

ggggaacgca gaagaggcaa aggccacgac ggactgtacc agggactcag caccgccacc 1380

aaggacacct atgacgctct tcacatgcag gccctgccgc ctcgg 1425

<210> 160

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 160

Ser Phe Arg Met Asn

1. 5

<210> 161

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 161

Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1. 5 10 15

Gly

<210> 162

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 162

Trp Leu Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Val

1. 5

<210> 163

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 163

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

1. 5

<210> 164

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 164

Ser Ser Ser Ser Ser Tyr

1. 5

<210> 165

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 165

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Arg

1. 5

<210> 166

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 166

Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile

1. 5

<210> 167

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 167

Ala Arg Trp Leu Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Val

1. 5 10

<210> 168

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 168

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1. 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Arg Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Leu Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 169

<211> 354

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 169

gaagtgcaac tggtggagag cggtggaggg cttgtcaagc ccggaggatc gctgcggctg 60

tcctgtgctg cgtccgggtt caccttctcc tcgttccgca tgaactgggt cagacaggca 120

ccgggaaagg gcctcgaatg ggtgtcctca atctcatcgt cctcgtccta catctactac 180

gccgactccg tgaaaggccg cttcaccatc tcccgggaca acgccaagaa ctcgctgtac 240

ctccaaatga atagcctcag ggcggaagat actgctgtgt attactgcgc acgctggctt 300

tcctactacg gcatggacgt ctggggccaa gggaccactg tgaccgtgtc tagc 354

<210> 170

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 170

Thr Leu Ser Phe Arg Ala Ser

1. 5

<210> 171

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 171

Met Gln Arg Ile Gly Phe Pro Ile Thr

1. 5

<210> 172

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 172

Arg Ile Gly Phe Pro Ile

1. 5

<210> 173

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 173

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1. 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser Phe Arg Ala Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

65 70 75 80

Ile Arg Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln

85 90 95

Arg Ile Gly Phe Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 174

<211> 339

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 174

gatatcgtga tgacccagac tcccctgtcc ctgcctgtga ctcccggaga accagcctcc 60

atttcctgcc ggtcctccca gtccctgctg gacagcgacg acggcaacac ttacctggac 120

tggtacttgc agaagccggg ccaatcgcct cagctgctga tctataccct gtcattccgg 180

gcctcaggag tgcctgaccg cttctcggga tcagggagcg ggaccgattt caccctgaaa 240

attaggcgag tggaagccga ggacgtcgga gtgtactact gcatgcagcg catcggcttc 300

ccgattacgt ttggacaggg tacccggctt gagatcaag 339

<210> 175

<211> 251

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 175

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1. 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Arg Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Leu Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln

130 135 140

Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser

145 150 155 160

Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Asp Gly Asn Thr Tyr

165 170 175

Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile

180 185 190

Tyr Thr Leu Ser Phe Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

195 200 205

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Arg Arg Val Glu Ala

210 215 220

Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Arg Ile Gly Phe Pro Ile

225 230 235 240

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

245 250

<210> 176

<211> 753

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 176

gaagtgcaac tggtggagag cggtggaggg cttgtcaagc ccggaggatc gctgcggctg 60

tcctgtgctg cgtccgggtt caccttctcc tcgttccgca tgaactgggt cagacaggca 120

ccgggaaagg gcctcgaatg ggtgtcctca atctcatcgt cctcgtccta catctactac 180

gccgactccg tgaaaggccg cttcaccatc tcccgggaca acgccaagaa ctcgctgtac 240

ctccaaatga atagcctcag ggcggaagat actgctgtgt attactgcgc acgctggctt 300

tcctactacg gcatggacgt ctggggccaa gggaccactg tgaccgtgtc tagcggaggc 360

ggaggttcag ggggcggtgg atcaggcgga ggaggatcgg ggggtggtgg atcggatatc 420

gtgatgaccc agactcccct gtccctgcct gtgactcccg gagaaccagc ctccatttcc 480

tgccggtcct cccagtccct gctggacagc gacgacggca acacttacct ggactggtac 540

ttgcagaagc cgggccaatc gcctcagctg ctgatctata ccctgtcatt ccgggcctca 600

ggagtgcctg accgcttctc gggatcaggg agcgggaccg atttcaccct gaaaattagg 660

cgagtggaag ccgaggacgt cggagtgtac tactgcatgc agcgcatcgg cttcccgatt 720

acgtttggac agggtacccg gcttgagatc aag 753

<210> 177

<211> 474

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 177

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1. 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Arg Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Leu Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln

130 135 140

Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser

145 150 155 160

Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Asp Gly Asn Thr Tyr

165 170 175

Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile

180 185 190

Tyr Thr Leu Ser Phe Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

195 200 205

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Arg Arg Val Glu Ala

210 215 220

Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Arg Ile Gly Phe Pro Ile

225 230 235 240

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala

245 250 255

Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser

260 265 270

Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr

275 280 285

Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala

290 295 300

Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

305 310 315 320

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

325 330 335

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

340 345 350

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg

355 360 365

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

370 375 380

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

385 390 395 400

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

405 410 415

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

420 425 430

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

435 440 445

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

450 455 460

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

465 470

<210> 178

<211> 1422

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 178

gaagtgcaac tggtggagag cggtggaggg cttgtcaagc ccggaggatc gctgcggctg 60

tcctgtgctg cgtccgggtt caccttctcc tcgttccgca tgaactgggt cagacaggca 120

ccgggaaagg gcctcgaatg ggtgtcctca atctcatcgt cctcgtccta catctactac 180

gccgactccg tgaaaggccg cttcaccatc tcccgggaca acgccaagaa ctcgctgtac 240

ctccaaatga atagcctcag ggcggaagat actgctgtgt attactgcgc acgctggctt 300

tcctactacg gcatggacgt ctggggccaa gggaccactg tgaccgtgtc tagcggaggc 360

ggaggttcag ggggcggtgg atcaggcgga ggaggatcgg ggggtggtgg atcggatatc 420

gtgatgaccc agactcccct gtccctgcct gtgactcccg gagaaccagc ctccatttcc 480

tgccggtcct cccagtccct gctggacagc gacgacggca acacttacct ggactggtac 540

ttgcagaagc cgggccaatc gcctcagctg ctgatctata ccctgtcatt ccgggcctca 600

ggagtgcctg accgcttctc gggatcaggg agcgggaccg atttcaccct gaaaattagg 660

cgagtggaag ccgaggacgt cggagtgtac tactgcatgc agcgcatcgg cttcccgatt 720

acgtttggac agggtacccg gcttgagatc aagaccacta ccccagcacc gaggccaccc 780

accccggctc ctaccatcgc ctcccagcct ctgtccctgc gtccggaggc atgtagaccc 840

gcagctggtg gggccgtgca tacccggggt cttgacttcg cctgcgatat ctacatttgg 900

gcccctctgg ctggtacttg cggggtcctg ctgctttcac tcgtgatcac tctttactgt 960

aagcgcggtc ggaagaagct gctgtacatc tttaagcaac ccttcatgag gcctgtgcag 1020

actactcaag aggaggacgg ctgttcatgc cggttcccag aggaggagga aggcggctgc 1080

gaactgcgcg tgaaattcag ccgcagcgca gatgctccag cctaccagca ggggcagaac 1140

cagctctaca acgaactcaa tcttggtcgg agagaggagt acgacgtgct ggacaagcgg 1200

agaggacggg acccagaaat gggcgggaag ccgcgcagaa agaatcccca agagggcctg 1260

tacaacgagc tccaaaagga taagatggca gaagcctata gcgagattgg tatgaaaggg 1320

gaacgcagaa gaggcaaagg ccacgacgga ctgtaccagg gactcagcac cgccaccaag 1380

gacacctatg acgctcttca catgcaggcc ctgccgcctc gg 1422

<210> 179

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(1)

<223> /замена="Ser"

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (3)..(3)

<223> /замена="Arg"

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (5)..(5)

<223> /замена="Asn"

<220>

<221> Сайт

<222> (1)..(5)

<223> /примечание="Остатки вариантов, приведенные в последовательности, не

имеют предпочтения по отношению к тем, которые указаны в аннотациях

для положений вариантов"

<400> 179

Gly Phe Trp Met Ser

1. 5

<210> 180

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (1)..(1)

<223> /замена="Ser"

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (3)..(3)

<223> /замена="Ser"