По настоящей заявке испрашивается приоритет по заявке PCT № PCT/CN2014/090501, зарегистрированной 6 ноября 2014 года, и заявке PCT № PCT/CN2014/082586, зарегистрированной 21 июля 2014 года. Полное содержание этих заявок включено в настоящее описание в качестве ссылок.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Настоящая заявка содержит список последовательностей, поданный в электронном виде в формате ASCII и включенный, таким образом, в качестве ссылки в полном объеме. Указанная копия ASCII, созданная 15 июля 2015 года, названа N2067-7045WO3_SL.txt и имеет размер 771026 байтов.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение, в основном, относится к применению иммунных эффекторных клеток (например, T-клеток, NK-клеток), сконструированных для экспрессии химерного антигенного рецептора (CAR), для лечения заболевания, ассоциированного с экспрессией B-клеточного антигена созревания (BCMA).

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

B-клеточный антиген созревания (BCMA) является членом семейства рецепторов фактора некроза опухолей (TNFR), экспрессируемым клетками B-клеточной линии. Экспрессия BCMA является наиболее высокой на окончательно дифференцированных B-клетках. BCMA участвует в опосредовании выживания плазматических клеток для поддержания длительного гуморального иммунитета. В последнее время экспрессию BCMA связывают с рядом злокачественных новообразований, аутоиммунных нарушений и инфекционных заболеваний. Злокачественные новообразования с повышенной экспрессией BCMA включают некоторые гемобластозы, такие как множественная миелома, лимфома Ходжкина и неходжкинская лимфома, различные лейкозы и глиобластома.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В первом аспекте изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей химерный антигенный рецептор (CAR), где CAR содержит антитело или фрагмент антитела, включающий связывающий домен человека против BCMA или гуманизированный связывающий домен против BCMA, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен (например, внутриклеточный сигнальный домен, содержащий костимуляторный домен и/или первичный сигнальный домен). В одном из вариантов осуществления CAR содержит антитело или фрагмент антитела, включающий связывающий домен человека против BCMA, представленный в настоящем описании, или гуманизированный связывающий домен против BCMA, представленный в настоящем описании, трансмембранный домен, представленный в настоящем описании, и внутриклеточный сигнальный домен, представленный в настоящем описании (например, внутриклеточный сигнальный домен, содержащий костимуляторный домен и/или первичный сигнальный домен).

В одном из вариантов осуществления кодируемый BCMA-связывающий домен (например, человеческий или гуманизированный связывающий домен против BCMA) содержит одну или более (например, все три) из определяющей комплементарность области легкой цепи 1 (CDR1 LC), определяющей комплементарность области легкой цепи 2 (CDR2 LC) и определяющей комплементарность области легкой цепи 3 (CDR3 LC) человеческого или гуманизированного связывающего домена против BCMA, представленного в настоящем описании, и/или одну или более (например, все три) из определяющей комплементарность области тяжелой цепи 1 (CDR1 HC), определяющей комплементарность области тяжелой цепи 2 (CDR2 HC) и определяющей комплементарность области тяжелой цепи 3 (CDR3 HC) связывающего домена против BCMA, представленного в настоящем описании, например, человеческого или гуманизированного связывающего домена против BCMA, содержащего одну или более, например, все три, CDR LC и одну или более, например, все три, CDR HC. В одном из вариантов осуществления кодируемый связывающий домен человека против BCMA содержит вариабельную область легкой цепи, представленную в настоящем описании (например, в таблице 1), и/или вариабельную область тяжелой цепи, представленную в настоящем описании (например, в таблице 1). В одном из вариантов осуществления кодируемый гуманизированный связывающий домен против BCMA содержит вариабельную область легкой цепи, приведенную в SEQ ID NO: 271 или 273, и/или вариабельную область тяжелой цепи, приведенную в SEQ ID NO: 271 или 273. В одном из вариантов осуществления кодируемый связывающий домен человека против BCMA является scFv, содержащим легкую цепь и тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью из таблицы 1. В одном из вариантов осуществления кодируемый гуманизированный связывающий домен против BCMA является scFv, содержащим легкую цепь и тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 271 или 273. В варианте осуществления человеческий или гуманизированный связывающий домен против BCMA (например, scFv) содержит: вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, представленной в таблице 1 или SEQ ID NO: 271 или 273, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к аминокислотной последовательности из таблицы 1 или SEQ ID NO: 271 или 273, и/или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, представленной в таблице 1 или SEQ ID NO: 271 или 273, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к аминокислотной последовательности из таблицы 1. В одном из вариантов осуществления кодируемый связывающий домен человека против BCMA содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, и SEQ ID NO: 149, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к ним. В одном из вариантов осуществления кодируемый гуманизированный связывающий домен против BCMA содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 271 или SEQ ID NO: 273, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к ним. В одном из вариантов осуществления кодируемый человеческий или гуманизированный связывающий домен против BCMA включает линкер (Gly4-Ser)n, где n является 1, 2, 3, 4, 5 или 6, предпочтительно - 3 или 4 (SEQ ID NO: 26). Вариабельная область легкой цепи и вариабельная область тяжелой цепи scFv могут находиться, например, в любой из следующих ориентаций: вариабельная область легкой цепи-линкер-вариабельная область тяжелой цепи или вариабельная область тяжелой цепи-линкер-вариабельная область легкой цепи.

В других вариантах осуществления кодируемый BCMA-связывающий домен содержит CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC из любых аминокислотных последовательностей тяжелой цепи BCMA-связывающего домена, представленных в таблице 1 или 16. В вариантах осуществления BCMA-связывающий домен дополнительно содержит CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC. В вариантах осуществления BCMA-связывающий домен содержит CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC из любых аминокислотных последовательностей легкой цепи BCMA-связывающего домена, представленных в таблице 1 или 16.

В некоторых вариантах осуществления кодируемый BCMA-связывающий домен содержит одну, две или все из CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC из любых аминокислотных последовательностей легкой цепи BCMA-связывающего домена, представленных в таблице 1 или 16, и одну, две или все из CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC из любых аминокислотных последовательностей тяжелой цепи BCMA-связывающего домена, представленных в таблице 1 или 16.

В одном из вариантов осуществления кодируемый связывающий домен против BCMA содержит вариабельную область легкой цепи, представленную в настоящем описании (например, в таблице 16), и/или вариабельную область тяжелой цепи, представленную в настоящем описании (например, в таблице 16). В одном из вариантов осуществления кодируемый гуманизированный связывающий домен против BCMA содержит вариабельную область легкой цепи, приведенную в SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 262, и/или вариабельную область тяжелой цепи, приведенную в SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 256, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 258. В одном из вариантов осуществления кодируемый связывающий домен против BCMA является scFv, содержащим легкую цепь и тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью из таблицы 16. В варианте осуществления человеческий или гуманизированный связывающий домен против BCMA (например, scFv) содержит: вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 262, или последовательности с 95-99% идентичности по отношению к ним, и/или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 256, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 258, или последовательности с 95-99% идентичности по отношению к ним. В одном из вариантов осуществления кодируемый связывающий домен против BCMA включает (Gly4-Ser)n линкер, где n является 1, 2, 3, 4, 5 или 6, предпочтительно - 3 или 4 (SEQ ID NO: 26). Вариабельная область легкой цепи и вариабельная область тяжелой цепи scFv может находиться, например, в любой из следующих ориентаций: вариабельная область легкой цепи-линкер-вариабельная область тяжелой цепи или вариабельная область тяжелой цепи-линкер-вариабельная область легкой цепи.

В одном из вариантов осуществления кодируемый связывающий домен человека против BCMA содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 265 и SEQ ID NO: 266, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к ним.

В одном из вариантов осуществления кодируемый CAR включает трансмембранный домен, содержащий трансмембранный домен белка, например, представленный в настоящем описании, например, выбранный из группы, состоящей из альфа-, бета- или дзета-цепи T-клеточного рецептора, CD28, CD3 эпсилон, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 и CD154. В одном из вариантов осуществления кодируемый трансмембранный домен содержит последовательность SEQ ID NO: 6. В одном из вариантов осуществления кодируемый трансмембранный домен содержит аминокислотную последовательность, содержащую, по меньшей мере, одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6. В одном из вариантов осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая трансмембранный домен, содержит последовательность SEQ ID NO: 17 или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к ней.

В одном из вариантов осуществления кодируемый связывающий домен против BCMA соединяют с трансмембранным доменом посредством шарнирной области, например, шарнирной области, представленной в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления кодируемая шарнирная область содержит SEQ ID NO: 2 или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к ней. В одном из вариантов осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая шарнирную область, содержит последовательность SEQ ID NO: 13 или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к ней.

В одном из вариантов осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты дополнительно содержит последовательность, кодирующую костимуляторный домен, например, костимуляторный домен, представленный в настоящем описании. В вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит костимуляторный домен. В вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит первичный сигнальный домен. В вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит один или более (например, один или более, два или более, или три или более) из костимуляторного домена и первичного сигнального домена.

В одном из вариантов осуществления кодируемый костимуляторный домен является функциональным сигнальным доменом, полученным из белка, например, представленного в настоящем описании, например, выбранного из группы, состоящей из молекулы MHC класса I, белков рецепторов ФНО, иммуноглобулин-подобных белков, рецепторов цитокинов, интегринов, сигнальных молекул активации лимфоцитов (белков SLAM), активирующих рецепторов NK-клеток, BTLA, рецептора Толл-лиганда, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8 альфа, CD8 бета, IL2R бета, IL2R гамма, IL7R альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a и лиганда, специфически связывающегося с CD83. В вариантах осуществления кодируемый костимуляторный домен содержит 4-1BB, CD27, CD28 или ICOS.

В одном из вариантов осуществления кодируемый костимуляторный домен 4-1BB содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7. В одном из вариантов осуществления кодируемый костимуляторный домен содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7. В одном из вариантов осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая костимуляторный домен, содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 18 или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к ней. В другом варианте осуществления кодируемый костимуляторный домен CD28 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1104. В одном из вариантов осуществления кодируемый костимуляторный домен содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1104, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1104. В одном из вариантов осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая костимуляторный домен CD28, содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1105 или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к ней. В другом варианте осуществления кодируемый костимуляторный домен CD27 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8. В одном из вариантов осуществления кодируемый костимуляторный домен содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8. В одном из вариантов осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая костимуляторный домен CD27, содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 19 или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к ней. В другом варианте осуществления кодируемый костимуляторный домен ICOS содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1106. В одном из вариантов осуществления кодируемый костимуляторный домен содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1106, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1106. В одном из вариантов осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая костимуляторный домен ICOS, содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1107 или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к ней.

В вариантах осуществления кодируемый первичный сигнальный домен содержит функциональный сигнальный домен CD3 дзета. В вариантах осуществления функциональный сигнальный домен CD3 дзета содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 (мутантный CD3 дзета) или SEQ ID NO: 10 (CD3 дзета человека дикого типа) или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к ним.

В одном из вариантов осуществления кодируемый внутриклеточный сигнальный домен содержит функциональный сигнальный домен 4-1BB и/или функциональный сигнальный домен CD3 дзета. В одном из вариантов осуществления кодируемый внутриклеточный сигнальный домен 4-1BB содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 и/или аминокислотную последовательность CD3 дзета SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном из вариантов осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7 и/или аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7 и/или аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном из вариантов осуществления кодируемый внутриклеточный сигнальный домен содержит последовательность SEQ ID NO: 7 и последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, где последовательности, содержащие внутриклеточный сигнальный домен экспрессируются в одной и той же рамке считывания и в виде единой полипептидной цепи. В одном из вариантов осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внутриклеточный сигнальный домен 4-1BB, содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 18, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к ней, и/или нуклеотидную последовательность CD3 дзета SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к ним.

В одном из вариантов осуществления кодируемый внутриклеточный сигнальный домен содержит функциональный сигнальный домен CD27 и/или функциональный сигнальный домен CD3 дзета. В одном из вариантов осуществления кодируемый внутриклеточный сигнальный домен CD27 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 и/или аминокислотную последовательность CD3 дзета SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном из вариантов осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8 и/или аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8 и/или аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном из вариантов осуществления кодируемый внутриклеточный сигнальный домен содержит последовательность SEQ ID NO: 8 и последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, где последовательности, содержащие внутриклеточный сигнальный домен, экспрессируются в одной и той же рамке считывания и в виде единой полипептидной цепи. В одном из вариантов осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внутриклеточный сигнальный домен CD27, содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 19, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к ней, и/или нуклеотидную последовательность CD3 дзета SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к ним.

В одном из вариантов осуществления кодируемый внутриклеточный сигнальный домен содержит функциональный сигнальный домен CD28 и/или функциональный сигнальный домен CD3 дзета. В одном из вариантов осуществления кодируемый внутриклеточный сигнальный домен CD28 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1104 и/или аминокислотную последовательность CD3 дзета SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном из вариантов осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1104 и/или аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1104 и/или аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном из вариантов осуществления кодируемый внутриклеточный сигнальный домен содержит последовательность SEQ ID NO: 1104 и последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, где последовательности, содержащие внутриклеточный сигнальный домен, экспрессируются в одной и той же рамке считывания и в виде единой полипептидной цепи. В одном из вариантов осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внутриклеточный сигнальный домен CD28, содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1105, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к ним, и/или нуклеотидную последовательность CD3 дзета SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к ним.

В одном из вариантов осуществления кодируемый внутриклеточный сигнальный домен содержит функциональный сигнальный домен ICOS и/или функциональный сигнальный домен CD3 дзета. В одном из вариантов осуществления кодируемый внутриклеточный сигнальный домен ICOS содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1106 и/или аминокислотную последовательность CD3 дзета SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном из вариантов осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1106 и/или аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1106 и/или аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном из вариантов осуществления кодируемый внутриклеточный сигнальный домен содержит последовательность SEQ ID NO: 1106 и последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, где последовательности, содержащие внутриклеточный сигнальный домен, экспрессируются в одной и той же рамке считывания и в виде единой полипептидной цепи. В одном из вариантов осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внутриклеточный сигнальный домен ICOS, содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1107, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к ним, и/или нуклеотидную последовательность CD3 дзета SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к ним.

В другом аспекте изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей конструкцию CAR, содержащую лидерную последовательность, например, лидерную последовательность, представленную в настоящем описании, например, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, связывающий домен против BCMA, представленный в настоящем описании, например, связывающий домен человека против BCMA, содержащий CDR1 LC, CDR2 LC, CDR3 LC, CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC, представленный в настоящем описании (например, связывающий домен человека против BCMA, описываемый в таблице 1 или 16), или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к нему, шарнирную область, представленную в настоящем описании, например, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, трансмембранный домен, представленный в настоящем описании, например, имеющий последовательность SEQ ID NO: 6, и внутриклеточный сигнальный домен, например, внутриклеточный сигнальный домен, представленный в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления кодируемый внутриклеточный сигнальный домен содержит костимуляторный домен, например, костимуляторный домен, представленный в настоящем описании (например, костимуляторный домен 4-1BB, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, или костимуляторный домен CD27, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8), и/или первичный сигнальный домен, например, первичный сигнальный домен, представленный в настоящем описании, (например, стимуляторный домен CD3 дзета, имеющий последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10). В одном из вариантов осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая конструкцию CAR, включает лидерную последовательность, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 1, или последовательностью с 95-99% идентичности по отношению к ней.

В другом аспекте изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей конструкцию CAR, содержащую лидерную последовательность, например, лидерную последовательность, представленную в настоящем описании, например, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, связывающий домен против BCMA, представленный в настоящем описании (например, гуманизированный связывающий домен против BCMA, содержащий CDR1 LC, CDR2 LC, CDR3 LC, CDR1 HC, CDR2 HC и/или CDR3 HC, представленный в настоящем описании, например, гуманизированный связывающий домен против BCMA, представленный в настоящем описании (например, гуманизированный связывающий домен против BCMA, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 271 или SEQ ID NO: 273), или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к нему), шарнирную область, представленную в настоящем описании, например, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, трансмембранный домен, представленный в настоящем описании, например, имеющий последовательность SEQ ID NO: 6, и внутриклеточный сигнальный домен, например, внутриклеточный сигнальный домен, представленный в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления кодируемый внутриклеточный сигнальный домен содержит костимуляторный домен, например, костимуляторный домен, представленный в настоящем описании (например, костимуляторный домен 4-1BB, имеющий последовательность SEQ ID NO: 7), и/или первичный сигнальный домен, например, первичный сигнальный домен, представленный в настоящем описании (например, стимуляторный домен CD3 дзета, имеющий последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10). В одном из вариантов осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая конструкцию CAR, включает лидерную последовательность, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 1 или последовательностью с 95-99% идентичности по отношению к ней.

В одном из вариантов осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая конструкцию CAR, включает последовательность связывающего домена человека против BCMA, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 169 или SEQ ID NO: 170, или последовательностью с 95-99% идентичности по отношению к ним. В одном из вариантов осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая конструкцию CAR, включает последовательность гуманизированного связывающего домена против BCMA, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 272, SEQ ID NO: 274 или последовательностью с 95-99% идентичности по отношению к ним.

В одном из вариантов осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит (например, состоит из) нуклеиновую кислота, кодирующую аминокислотную последовательность CAR SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 232 или SEQ ID NO: 233, или аминокислотную последовательность, имеющую 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности или имеющую одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 232 или SEQ ID NO: 233.

В одном из вариантов осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит (например, состоит из) последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 236, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 252, SEQ ID NO: 253 или SEQ ID NO: 254, или последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности или имеющую одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности в последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 236, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 252, SEQ ID NO: 253 или SEQ ID NO: 254.

В одном из аспектов изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей связывающий домен против BCMA, где связывающий домен против BCMA содержит одну или более (например, все три) из определяющей комплементарность области легкой цепи 1 (CDR1 LC), определяющей комплементарность области легкой цепи 2 (CDR2 LC) и/или определяющей комплементарность области легкой цепи 3 (CDR3 LC) связывающего домена против BCMA, представленного в настоящем описании, и одну или более (например, все три) из определяющей комплементарность области тяжелой цепи 1 (CDR1 HC), определяющей комплементарность области тяжелой цепи 2 (CDR2 HC) и/или определяющей комплементарность области тяжелой цепи 3 (CDR3 HC) связывающего домена против BCMA, представленного в настоящем описании, например, связывающего домена человека против BCMA, содержащего одну или более, например, все три, CDR LC и одну или более, например, все три, CDR HC. В одном из вариантов осуществления кодируемый связывающий домен против BCMA содержит вариабельную область легкой цепи, представленную в настоящем описании (например, в SEQ ID NO: 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 259, 260, 261 или 262), и/или вариабельную область тяжелой цепи, представленную в настоящем описании (например, в SEQ ID NO: 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 255, 256, 257 или 258). В одном из вариантов осуществления кодируемый связывающий домен против BCMA является scFv, содержащим легкую цепь и тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 265 или SEQ ID NO: 266, или последовательности с 95-99% идентичности по отношению к ним. В варианте осуществления связывающий домен против BCMA (например, scFv) содержит: вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 259, 260, 261 или 262, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 259, 260, 261 или 262, и/или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 255, 256, 257 или 258, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 255, 256, 257 или 258. В одном из вариантов осуществления связывающий домен против BCMA содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, и SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 265 или SEQ ID NO: 266, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к ним. В одном из вариантов осуществления кодируемый связывающий домен против BCMA является scFv, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в настоящем описании, например, в таблице 1 или 16, соединяют с вариабельной областью тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в настоящем описании, например, в таблице 1 или 16, с помощью линкера, например, линкера, представленного в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления кодируемый связывающий домен против BCMA включает линкер (Gly₄-Ser)n, где n является 1, 2, 3, 4, 5 или 6, предпочтительно - 4 (SEQ ID NO: 26). Вариабельная область легкой цепи и вариабельная область тяжелой цепи scFv могут находиться, например, в любой из следующих ориентаций: вариабельная область легкой цепи-линкер-вариабельная область тяжелой цепи или вариабельная область тяжелой цепи-линкер-вариабельная область легкой цепи. В одном из вариантов осуществления выделенная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая связывающий домен человека против BCMA, содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 169 и SEQ ID NO: 170, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к ним.

В других вариантах осуществления кодируемый BCMA-связывающий домен содержит CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC любых аминокислотных последовательностей тяжелой цепи BCMA-связывающего домена, представленных в таблице 1 или 16. В вариантах осуществления BCMA-связывающий домен дополнительно содержит CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC. В вариантах осуществления BCMA-связывающий домен содержит CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC любых аминокислотных последовательностей легкой цепи BCMA-связывающего домена, представленных в таблице 1 или 16.

В некоторых вариантах осуществления кодируемый BCMA-связывающий домен содержит одну, две или все из CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC любых аминокислотных последовательностей легкой цепи BCMA-связывающего домена, представленных в таблице 1 или 16, и одну, две или все из CDR1 HC, CDR2 HC, и CDR3 HC любых аминокислотных последовательностей тяжелой цепи BCMA-связывающего домена, представленных в таблице 1 или 16.

В варианте осуществления связывающий домен против BCMA (например, scFv) содержит: вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, содержащую (или состоящую из) вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 271 или 273, и аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 271 или 273, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к ним, и/или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, содержащую (или состоящую из) вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 271 или 273, и аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 271 или 273, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к ней. В одном из вариантов осуществления кодируемый гуманизированный связывающий домен против BCMA является scFv, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в настоящем описании, например, приведенную в SEQ ID NO: 271 или 273, соединяют с вариабельной областью тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в настоящем описании, например, приведенную в SEQ ID NO: 271 или 273, с помощью линкера, например, линкера, представленного в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления кодируемый связывающий домен против BCMA включает линкер (Gly₄-Ser)n, где n является 1, 2, 3, 4, 5 или 6, предпочтительно - 4 (SEQ ID NO: 26).

В другом аспекте изобретение относится к выделенной полипептидной молекуле, например, выделенной молекуле химерного антигенного рецептора (CAR), кодируемой молекулой нуклеиновой кислоты. В одном из вариантов осуществления выделенная полипептидная молекула содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 232 и SEQ ID NO: 233, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к ним.

В другом аспекте изобретение относится к выделенной молекуле химерного антигенного рецептора (CAR) (например, полипептиду), содержащей связывающий домен против BCMA (например, человеческое или гуманизированное антитело или фрагмент антитела, специфически связывающееся с BCMA), трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен (например, внутриклеточный сигнальный домен, содержащий костимуляторный домен и/или первичный сигнальный домен). В одном из вариантов осуществления CAR содержит антитело или фрагмент антитела, включающее связывающий домен против BCMA, представленный в настоящем описании (например, антитело человека или фрагмент антитела, специфически связывающееся с BCMA, как представлено в настоящем описании), трансмембранный домен, представленный в настоящем описании, и внутриклеточный сигнальный домен, представленный в настоящем описании (например, внутриклеточный сигнальный домен, содержащий костимуляторный домен и/или первичный сигнальный домен, представленный в настоящем описании).

В одном из вариантов осуществления связывающий домен против BCMA содержит одну или более (например, все три) из определяющей комплементарность области легкой цепи 1 (CDR1 LC), определяющей комплементарность области легкой цепи 2 (CDR2 LC) и определяющей комплементарность области легкой цепи 3 (CDR3 LC) связывающего домена против BCMA, представленного в настоящем описании, и одну или более (например, все три) из определяющей комплементарность области тяжелой цепи 1 (CDR1 HC), определяющей комплементарность области тяжелой цепи 2 (CDR2 HC) и определяющей комплементарность области тяжелой цепи 3 (CDR3 HC) связывающего домена против BCMA, представленного в настоящем описании, например, человеческого или гуманизированного связывающего домена против BCMA, содержащего одну или более, например, все три, CDR LC и одну или более, например, все три, CDR HC. В одном из вариантов осуществления связывающий домен против BCMA содержит вариабельную область легкой цепи, представленную в настоящем описании (например, в таблице 1 или SEQ ID NO: 271 или 273), и/или вариабельную область тяжелой цепи, представленную в настоящем описании (например, в таблице 1 или SEQ ID NO: 271 или 273). В одном из вариантов осуществления связывающий домен против BCMA является scFv, содержащим легкую цепь и тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, представленной в таблице 1, SEQ ID NO: 271 или 273. В варианте осуществления связывающий домен против BCMA (например, scFv) содержит: вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, представленной в таблице 1 или SEQ ID NO: 271 или 273, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в таблице 1 или SEQ ID NO: 271 или 273, и/или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, представленной в таблице 1 или SEQ ID NO: 271 или 273, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в таблице 1 или SEQ ID NO: 271 или 273. В одном из вариантов осуществления связывающий домен против BCMA содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 265 или SEQ ID NO: 266, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) в любой из указанных выше последовательностей, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к любой из указанных выше последовательностей. В одном из вариантов осуществления связывающий домен против BCMA содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 271 или SEQ ID NO: 273, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к ней. В одном из вариантов осуществления связывающий домен против BCMA является scFv, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в настоящем описании, например, в таблице 1 или 16, SEQ ID NO: 271 или SEQ ID NO: 273, соединяют с вариабельной областью тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в настоящем описании, например, в таблице 1 или 16, SEQ ID NO: 271 или SEQ ID NO: 273, с помощью линкера, например, линкера, представленного в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления связывающий домен против BCMA включает линкер (Gly₄-Ser)n, где n является 1, 2, 3, 4, 5 или 6, предпочтительно - 4 (SEQ ID NO: 26). Вариабельная область легкой цепи и вариабельная область тяжелой цепи scFv могут находиться, например, в любой из следующих ориентаций: вариабельная область легкой цепи-линкер-вариабельная область тяжелой цепи или вариабельная область тяжелой цепи-линкер-вариабельная область легкой цепи.

В других вариантах осуществления BCMA-связывающий домен содержит CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC любых аминокислотных последовательностей тяжелой цепи BCMA-связывающего домена, представленных в таблице 1 или 16. В вариантах осуществления BCMA-связывающий домен дополнительно содержит CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC. В вариантах осуществления BCMA-связывающий домен содержит CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC любых аминокислотных последовательностей легкой цепи BCMA-связывающего домена, представленных в таблице 1 или 16.

В некоторых вариантах осуществления BCMA-связывающий домен содержит одну, две или все из CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC любых аминокислотных последовательностей легкой цепи BCMA-связывающего домена, представленных в таблице 1 или 16, и одну, две или все из CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC любых аминокислотных последовательностей тяжелой цепи BCMA-связывающего домена, представленных в таблице 1 или 16.

В одном из вариантов осуществления выделенная молекула CAR содержит трансмембранный домен белка, например, представленный в настоящем описании, например, выбранный из группы, состоящей из альфа-, бета- или дзета-цепи T-клеточного рецептора, CD28, CD3 эпсилон, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 и CD154. В одном из вариантов осуществления трансмембранный домен содержит последовательность SEQ ID NO: 6. В одном из вариантов осуществления трансмембранный домен содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 20, 10 или 5 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6.

В одном из вариантов осуществления связывающий домен против BCMA соединяют с трансмембранным доменом посредством шарнирной области, например, шарнирной области, представленной в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления кодируемая шарнирная область содержит SEQ ID NO: 2 или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к ней.

В одном из вариантов осуществления выделенная молекула CAR дополнительно содержит последовательность, кодирующую костимуляторный домен, например, костимуляторный домен, представленный в настоящем описании. В вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен выделенной молекулы CAR содержит костимуляторный домен. В вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен выделенной молекулы CAR содержит первичный сигнальный домен. В вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен выделенной молекулы CAR содержит костимуляторный домен и первичный сигнальный домен.

В одном из вариантов осуществления костимуляторный домен содержит функциональный сигнальный домен белка, выбранного из группы, состоящей из молекулы MHC класса I, белков рецепторов ФНО, иммуноглобулин-подобных белков, рецепторов цитокинов, интегринов, сигнальных молекул активации лимфоцитов (белков SLAM), активирующих рецепторов NK-клеток, BTLA, рецептора Толл-лиганда, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8 альфа, CD8 бета, IL2R бета, IL2R гамма, IL7R альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a и лиганда, специфически связывающегося с CD83.

В одном из вариантов осуществления костимуляторный домен содержит последовательность SEQ ID NO: 7. В одном из вариантов осуществления костимуляторный домен содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 20, 10 или 5 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7. В другом варианте осуществления костимуляторный домен CD28 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1104. В одном из вариантов осуществления костимуляторный домен содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1104, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1104. В другом варианте осуществления костимуляторный домен CD27 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8. В одном из вариантов осуществления костимуляторный домен содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8. В другом варианте осуществления костимуляторный домен ICOS содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1106. В одном из вариантов осуществления костимуляторный домен содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1106, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1106.

В вариантах осуществления первичный сигнальный домен содержит сигнальный домен или CD3 дзета. В вариантах осуществления функциональный сигнальный домен CD3 дзета содержит SEQ ID NO: 9 (мутантный CD3 дзета) или SEQ ID NO: 10 (CD3 дзета человека дикого типа), или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к ним.

В одном из вариантов осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит функциональный сигнальный домен 4-1BB и/или функциональный сигнальный домен CD3 дзета. В одном из вариантов осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит последовательность SEQ ID NO: 7 и/или последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном из вариантов осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 20, 10 или 5 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7 и/или последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7 и/или последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном из вариантов осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит последовательность SEQ ID NO: 7 и/или последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, где последовательности, содержащие внутриклеточный сигнальный домен, экспрессируются в одной и той же рамке считывания и в виде единой полипептидной цепи.

В одном из вариантов осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит функциональный сигнальный домен CD27 и/или функциональный сигнальный домен CD3 дзета. В одном из вариантов осуществления внутриклеточный сигнальный домен CD27 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 и/или аминокислотную последовательность CD3 дзета SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном из вариантов осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8 и/или аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8 и/или аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном из вариантов осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит последовательность SEQ ID NO: 8 и последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, где последовательности, содержащие внутриклеточный сигнальный домен, экспрессируются в одной и той же рамке считывания и в виде единой полипептидной цепи.

В одном из вариантов осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит функциональный сигнальный домен CD28 и/или функциональный сигнальный домен CD3 дзета. В одном из вариантов осуществления кодируемый внутриклеточный сигнальный домен CD28 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1104 и/или аминокислотную последовательность CD3 дзета SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном из вариантов осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1104 и/или аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 379 и/или аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном из вариантов осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит последовательность SEQ ID NO: 1104 и последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, где последовательности, содержащие внутриклеточный сигнальный домен, экспрессируются в одной и той же рамке считывания и в виде единой полипептидной цепи.

В одном из вариантов осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит функциональный сигнальный домен ICOS и/или функциональный сигнальный домен CD3 дзета. В одном из вариантов осуществления внутриклеточный сигнальный домен ICOS содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1106 и/или аминокислотную последовательность CD3 дзета SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном из вариантов осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации, но не более 20, 10 или 5 модификаций аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1106 и/или аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1106 и/или аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10. В одном из вариантов осуществления кодируемый внутриклеточный сигнальный домен содержит последовательность SEQ ID NO: 1106 и последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, где последовательности, содержащие внутриклеточный сигнальный домен, экспрессируются в одной и той же рамке считывания и в виде единой полипептидной цепи.

В одном из вариантов осуществления выделенная молекула CAR дополнительно содержит лидерную последовательность, например, лидерную последовательность, представленную в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления лидерная последовательность содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.

В другом аспекте изобретение относится к выделенной молекуле CAR, содержащей лидерную последовательность, например, лидерную последовательность, представленную в настоящем описании, например, лидерную последовательность SEQ ID NO: 1, или имеющую 95-99% идентичности по отношению к ней, связывающий домен против BCMA, представленный в настоящем описании, например, связывающий домен против BCMA, содержащий CDR1 LC, CDR2 LC, CDR3 LC, CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC, представленный в настоящем описании, например, связывающий домен против BCMA, описываемый в таблице 1 или 16, SEQ ID NO: 271 или SEQ ID NO: 273 или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к ним, шарнирную область, например, шарнирную область, представленную в настоящем описании, например, шарнирную область SEQ ID NO: 2, или имеющую 95-99% идентичности по отношению к ней, трансмембранный домен, например, трансмембранный домен, представленный в настоящем описании, например, трансмембранный домен, имеющий последовательность SEQ ID NO: 6 или последовательность, имеющую 95-99% идентичности по отношению к ней, внутриклеточный сигнальный домен, например, внутриклеточный сигнальный домен, представленный в настоящем описании (например, внутриклеточный сигнальный домен, содержащий костимуляторный домен и/или первичный сигнальный домен). В одном из вариантов осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит костимуляторный домен, например, костимуляторный домен, представленный в настоящем описании, например, костимуляторный домен 4-1BB, имеющий последовательность SEQ ID NO: 7 или имеющий 95-99% идентичности по отношению к ней, и/или первичный сигнальный домен, например, первичный сигнальный домен, представленный в настоящем описании, например, стимуляторный домен CD3 дзета, имеющий последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10 или имеющий 95-99% идентичности по отношению к ней. В одном из вариантов осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит костимуляторный домен, например, костимуляторный домен, представленный в настоящем описании, например, костимуляторный домен 4-1BB, имеющий последовательность SEQ ID NO: 7, и/или первичный сигнальный домен, например, первичный сигнальный домен, представленный в настоящем описании, например, стимуляторный домен CD3 дзета, имеющий последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10.

В одном из вариантов осуществления выделенная молекула CAR содержит (например, состоит из) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 232 или SEQ ID NO: 233, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять, 10, 15, 20 или 30 модификаций (например, замен, например, консервативных замен), но не более 60, 50 или 40 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 232 или SEQ ID NO: 233, или аминокислотную последовательность, имеющую 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 232 или SEQ ID NO: 233.

В других вариантах осуществления связывающий домен против BCMA содержит CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC любых аминокислотных последовательностей тяжелой цепи BCMA-связывающего домена, представленного в таблице 1 или 16. В вариантах осуществления BCMA-связывающий домен дополнительно содержит CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC. В вариантах осуществления BCMA-связывающий домен содержит CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC любых аминокислотных последовательностей легкой цепи BCMA-связывающего домена, представленного в таблице 1 или 16.

В некоторых вариантах осуществления связывающий домен против BCMA содержит одну, две или все из CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC любых аминокислотных последовательностей легкой цепи BCMA-связывающего домена, представленного в таблице 1 или 16, и одну, две или все из CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC любых аминокислотных последовательностей тяжелой цепи BCMA-связывающего домена, представленного в таблице 1 или 16.

В одном из аспектов изобретение относится к BCMA-связывающему домену, содержащему одну или более (например, все три) из определяющей комплементарность области легкой цепи 1 (CDR1 LC), определяющей комплементарность области легкой цепи 2 (CDR2 LC) и определяющей комплементарность области легкой цепи 3 (CDR3 LC) BCMA-связывающего домена, представленного в настоящем описании, и/или одну или более (например, все три) из определяющей комплементарность области тяжелой цепи 1 (CDR1 HC), определяющей комплементарность области тяжелой цепи 2 (CDR2 HC) и определяющей комплементарность области тяжелой цепи 3 (CDR3 HC) BCMA-связывающего домена, представленного в настоящем описании, например, BCMA-связывающего домена, содержащего одну или более, например, все три, CDR LC и одну или более, например, все три, CDR HC.

В других вариантах осуществления BCMA-связывающий домен содержит CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC любых аминокислотных последовательностей тяжелой цепи BCMA-связывающего домена, представленного в таблице 1 или 16. В вариантах осуществления BCMA-связывающий домен дополнительно содержит CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC. В вариантах осуществления BCMA-связывающий домен содержит CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC любых аминокислотных последовательностей легкой цепи BCMA-связывающего домена, представленного в таблице 1 или 16.

В некоторых вариантах осуществления BCMA-связывающий домен содержит одну, две или все из CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC любых аминокислотных последовательностей легкой цепи BCMA-связывающего домена, представленного в таблице 1 или 16, и одну, две или все из CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC любых аминокислотных последовательностей тяжелой цепи BCMA-связывающего домена, представленных в таблице 1 или 16.

В одном из вариантов осуществления BCMA-связывающий домен содержит одну или более (например, все три) из определяющей комплементарность области легкой цепи 1 (CDR1 LC), определяющей комплементарность области легкой цепи 2 (CDR2 LC) и определяющей комплементарность области легкой цепи 3 (CDR3 LC) BCMA-связывающего домена, представленного в настоящем описании, и одну или более (например, все три) из определяющей комплементарность области тяжелой цепи 1 (CDR1 HC), определяющей комплементарность области тяжелой цепи 2 (CDR2 HC) и определяющей комплементарность области тяжелой цепи 3 (CDR3 HC) BCMA-связывающего домена, представленного в настоящем описании, например, человеческого или гуманизированного связывающего домена против BCMA, содержащего одну или более, например, все три, CDR LC и одну или более, например, все три, CDR HC. В одном из вариантов осуществления BCMA-связывающий домен содержит вариабельную область легкой цепи, представленную в настоящем описании (например, в таблице 1 или SEQ ID NO: 271 или 273), и/или вариабельную область тяжелой цепи, представленную в настоящем описании (например, в таблице 1 или SEQ ID NO: 271 или 273). В одном из вариантов осуществления BCMA-связывающий домен является scFv, содержащим легкую цепь и тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, представленной в таблице 1, SEQ ID NO: 271 или 273. В варианте осуществления BCMA-связывающий домен (например, scFv) содержит: вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, представленной в таблице 1 или SEQ ID NO: 271 или 273, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в таблице 1 или SEQ ID NO: 271 или 273, и/или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, представленной в таблице 1 или SEQ ID NO: 271 или 273, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в таблице 1 или SEQ ID NO: 271 или 273. В одном из вариантов осуществления BCMA-связывающий домен содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 265 или SEQ ID NO: 266, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) в любой из указанных выше последовательностей, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к любой из указанных выше последовательностей. В одном из вариантов осуществления BCMA-связывающий домен содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 271 или SEQ ID NO: 273, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к ним. В одном из вариантов осуществления связывающий домен против BCMA является scFv, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в настоящем описании, например, в таблице 1 или 16, SEQ ID NO: 271 или SEQ ID NO: 273, соединяют с вариабельной областью тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в настоящем описании, например, в таблице 1 или 16, SEQ ID NO: 271 или SEQ ID NO: 273, с помощью линкера, например, линкера, представленного в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления BCMA-связывающий домен включает линкер (Gly₄-Ser)n, где n является 1, 2, 3, 4, 5 или 6, предпочтительно - 4 (SEQ ID NO: 26). Вариабельная область легкой цепи и вариабельная область тяжелой цепи scFv могут находиться, например, в любой из следующих ориентаций: вариабельная область легкой цепи-линкер-вариабельная область тяжелой цепи или вариабельная область тяжелой цепи-линкер-вариабельная область легкой цепи.

В другом аспекте изобретение относится к вектору, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты, представленную в настоящем описании, например, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR, представленный в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления вектор выбран из группы, состоящей из ДНК, РНК, плазмиды, лентивирусного вектора, аденовирусного вектора или ретровирусного вектора.

В одном из вариантов осуществления вектор является лентивирусным вектором. В одном из вариантов осуществления вектор дополнительно содержит промотор. В одном из вариантов осуществления промотор является промотором EF-1. В одном из вариантов осуществления промотор EF-1 содержит последовательность SEQ ID NO: 11. В другом варианте осуществления промотор является промотором PGK, например, укороченным промотором PGK, как представлено в настоящем описании.

В одном из вариантов осуществления вектор является транскрибируемым in vitro вектором, например, вектором, транскрибирующим РНК молекулы нуклеиновой кислоты, представленной в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления последовательность нуклеиновой кислоты в векторе дополнительно содержит поли(A)-хвост, например, поли(A)-хвост, представленный в настоящем описании, например, содержащий приблизительно 150 аденозиновых оснований (SEQ ID NO: 382). В одном из вариантов осуществления последовательность нуклеиновой кислоты в векторе дополнительно содержит 3'-UTR, например, 3'-UTR, представленную в настоящем описании, например, содержащую по меньшей мере один повтор 3'-UTR, полученный из бета-глобулина человека. В одном из вариантов осуществления последовательность нуклеиновой кислоты в векторе дополнительно содержит промотор, например, промотор T2A.

В другом аспекте изобретение относится к клетке, содержащей вектор, представленный в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления клетка является клеткой, представленной в настоящем описании, например, иммунной эффекторной клеткой, например, T-клеткой человека или NK-клеткой человека, например, T-клеткой человека, представленной в настоящем описании, или NK-клеткой человека, представленной в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления человек T-клетка является CD8+ T-клеткой.

В другом варианте осуществления CAR-экспрессирующая клетка, представленная в настоящем описании, может дополнительно экспрессировать другое средство, например, средство, повышающее активность CAR-экспрессирующей клетки. Например, в одном из вариантов осуществления средство может являться средством, ингибирующим ингибиторную молекулу. Примеры ингибиторных молекул включают PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, MHC класса I, MHC класса II, GAL9, аденозин и TGFR бета. В вариантах осуществления средство является средством, ингибирующим PD1. В вариантах осуществления средство является средством, ингибирующим PD-L1. В одном из вариантов осуществления средство, ингибирующее ингибиторную молекулу, может являться средством, представленным в настоящем описании, таким как, например, средство, содержащее первый полипептид, например, ингибиторную молекулу, связанную со вторым полипептидом, обеспечивающим положительный сигнал для клетки, например, внутриклеточный сигнальный домен, представленный в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления средство содержит первый полипептид, например, из ингибиторной молекулы, такой как PD1, PD-L1, PD-L2, LAG3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), CTLA4, VISTA, CD160, BTLA, LAIR1, TIM3, 2B4, TGFR бета, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, MHC класса I, MHC класса II, GAL9, аденозин и TIGIT, или фрагмент любого из них (например, по меньшей мере, часть внеклеточного домена любого из них), и второй полипептид, являющийся внутриклеточным сигнальным доменом, представленным в настоящем описании (например, содержащим костимуляторный домен (например, 41BB, CD27 или CD28, например, как представлено в настоящем описании), и/или первичным сигнальным доменом (например, сигнальным доменом CD3 дзета, представленным в настоящем описании). В одном из вариантов осуществления средство содержит первый полипептид PD1 или его фрагмент (например, по меньшей мере, часть внеклеточного домена PD1) и второй полипептид из внутриклеточного сигнального домена, представленного в настоящем описании (например, сигнального домена CD28, представленного в настоящем описании, и/или сигнального домена CD3 дзета, представленного в настоящем описании).

В другом аспекте изобретение относится к способу получения клетки, включающему трансдукцию клетки, представленной в настоящем описании, например, иммунной эффекторной клетки, представленной в настоящем описании, например, T-клетки или NK-клетки, представленной в настоящем описании, с использованием вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR, например, CAR, представленный в настоящем описании.

Настоящее изобретение также относится к способу получения популяции РНК-сконструированных клеток, например, клеток, представленных в настоящем описании, например, иммунных эффекторных клеток, например, T-клеток или NK-клеток, транзиторно экспрессирующих экзогенную РНК. Способ включает встраивание транскрибируемой in vitro РНК или синтетической РНК в клетку, где РНК содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу CAR, представленную в настоящем описании.

В другом аспекте изобретение относится к способу обеспечения противоопухолевого иммунитета у млекопитающего, включающему введение млекопитающему эффективного количества клеток, экспрессирующих молекулу CAR, например, клеток, экспрессирующих молекулу CAR, представленную в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления клетка является аутологичной иммунной эффекторной клеткой, например, T-клеткой или аутологичной NK-клеткой. В одном из вариантов осуществления клетка является иммунной эффекторной клеткой, например, аллогенной T-клеткой или аллогенной NK-клеткой. В одном из вариантов осуществления млекопитающее является человеком, например, пациентом с гемобластозом.

В другом аспекте изобретение относится к способу лечения млекопитающего, имеющего заболевание, ассоциированное с экспрессией BCMA (например, пролиферативное заболевание, предраковое состояние и несвязанное со злокачественным новообразованием показание, ассоциированное с экспрессией BCMA) включающему введение млекопитающему эффективного количества клеток, экспрессирующих молекулу CAR, например, молекулу CAR, представленную в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления млекопитающее является человеком, например, пациентом с гемобластозом.

В одном из вариантов осуществления заболевание является заболеванием, представленным в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления заболевание, ассоциированное с экспрессией BCMA, выбрано из гемобластоза, такого как острые лейкозы, включая, в качестве неограничивающих примеров, острый миелолейкоз (AML), миелодиспластический синдром, миелопролиферативные неоплазии, хронический миелолейкоз (CML), неоплазию из бластных плазмацитоидных дендритных клеток, и заболевания, ассоциированного с экспрессией BCMA, включая, в качестве неограничивающих примеров, атипичные и/или неклассические злокачественные новообразования, злокачественные новообразования, предраковые состояния или пролиферативные заболевания с экспрессией BCMA, и их комбинации. В одном из вариантов осуществления заболевание, ассоциированное с экспрессией BCMA, является гемобластозом, выбранным из группы, состоящей из одного или более острых лейкозов, включая, в качестве неограничивающих примеров, острый B-клеточный лимфоидный лейкоз ("BALL"), острый T-клеточный лимфоидный лейкоз ("TALL"), острый лимфоидный лейкоз (ALL), один или более хронических лейкозов, включая, в качестве неограничивающих примеров, хронический миелогенный лейкоз (CML), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), дополнительные гемобластозы или гематологические состояния, включая, в качестве неограничивающих примеров, B-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, неоплазию из бластных плазмацитоидных дендритных клеток, лимфому Беркитта, диффузную крупноклеточную B-клеточную лимфому, фолликулярную лимфому, волосатоклеточный лейкоз, мелкоклеточную или крупноклеточную фолликулярную лимфому, злокачественные лимфопролиферативные состояния, MALT-лимфому, лимфому из клеток мантийной зоны, лимфому из клеток маргинальной зоны, множественную миелому, миелодисплазию и миелодиспластический синдром, неходжкинскую лимфому, плазмобластную лимфому, неоплазию из плазмацитоидных дендритных клеток, макроглобулинемию Вальденстрема и "предлейкоз", представляющий собой широкий спектр гематологических состояний, объединенных неэффективной продукцией (или дисплазией) миелоидных клеток крови, и заболевание, ассоциированное с экспрессией BCMA, включает, в качестве неограничивающих примеров, атипичные и/или неклассические злокачественные новообразования, злокачественные новообразования, предраковые состояния или пролиферативные заболевания с экспрессией BCMA и их комбинации.

В вариантах осуществления заболевание, ассоциированное с экспрессией BCMA, включает пролиферативное нарушение плазматических клеток, например, бессимптомную миелому (вялотекущую множественную миелому или индолентную миелому), моноклональную гаммапатию неустановленной этиологии (MGUS), макроглобулинемию Вальденстрема, плазмоцитомы (например, плазмоклеточную дискразию, солитарную миелому, солитарную плазмоцитому, экстрамедуллярную плазмоцитому и множественную плазмоцитому), системный амилоидоз легких цепей и POEMS-синдром (также известный как синдром Кроу-Фуказа, болезнь Такацуки и PEP-синдром).

В вариантах осуществления заболевание, ассоциированное с экспрессией BCMA, включает злокачественное новообразование, например, злокачественное новообразование, представленное в настоящем описании, например, рак предстательной железы (например, кастрационно-резистентный или резистентный к терапии рак предстательной железы или метастазирующий рак предстательной железы), рак поджелудочной железы или рак легких.

В одном из вариантов осуществления терапевтических способов клетку, экспрессирующую молекулу CAR, представленную в настоящем описании (например, молекула CAR BCMA), вводят в комбинации с клеткой, содержащей молекулу CAR CD19. В одном из вариантов осуществления клетку, экспрессирующую молекулу CAR BCMA вводят до, после или одновременно с введением клетки, экспрессирующей CAR CD19. В одном из вариантов осуществления клетка, экспрессирующая молекулу CAR BCMA, и клетка, экспрессирующая молекулу CAR CD19, являются частью единой композиции, и в других вариантах осуществления клетка, экспрессирующая молекулу CAR BCMA, и клетка, экспрессирующая молекулу CAR CD19, являются частью отдельных композиций. В одном из вариантов осуществления клетка, экспрессирующая молекулу CAR, представленную в настоящем описании (например, молекулу CAR BCMA), также экспрессирует молекулу CAR CD19. В одном из вариантов осуществления заболевание, ассоциированное с BCMA, является множественной миеломой, например, CD19-отрицательной множественной миеломой. В одном из вариантов осуществления заболевание, ассоциированное с экспрессией BCMA, является множественной миеломой например, множественной миеломой, являющейся CD19-отрицательной, например, имеющей подавляющее большинство (например, 99,95%) неопластических плазматических клеток с CD19-отрицательным фенотипом, например, как определяют посредством проточной цитометрии и RT-ПЦР.

В одном из вариантов осуществления клетки, экспрессирующие молекулу CAR, например, молекулу CAR, представленную в настоящем описании, вводят в комбинации со средством, повышающим эффективность клетки, экспрессирующей молекулу CAR, например, средством, представленным в настоящем описании.

В одном из вариантов осуществления клетки, экспрессирующие молекулу CAR, например, молекулу CAR, представленную в настоящем описании, вводят в комбинации с низкой усиливающей иммунитет дозой ингибитора mTOR. Не желая быть связанными какой-либо теорией, полагают, что лечение низкой, усиливающей иммунитет дозой (например, дозой, недостаточной для полной супрессии иммунной системы, но достаточной для улучшения иммунной функции) сопровождается снижением PD-1-положительных иммунных эффекторных клеток, например, T-клеток или NK-клеток, или повышением PD-1-отрицательных клеток. PD-1-положительные иммунные эффекторные клетки, например, T-клетки или NK-клетки, но не PD-1-отрицательыне иммунные эффекторные клетки (например, T-клетки или NK-клетки), можно подвергать истощению посредством вовлечения клеток, экспрессирующих лиганд PD-1, например, PD-L1 или PD-L2.

В варианте осуществления этот подход можно использовать для оптимизации свойств клеток CAR, представленных в настоящем описании, у индивидуума. Не желая быть связанными какой-либо теорией, полагают, что в варианте осуществления улучшают свойства эндогенных, немодифицированных иммунных эффекторных клеток, например, T-клеток или NK-клеток. Не желая быть связанными какой-либо теорией, полагают, что в варианте осуществления улучшают свойства клетки, экспрессирующей CAR BCMA. В других вариантах осуществления клетки, например, иммунные эффекторные клетки (например, T-клетки или NK-клетки), имеющие или конструируемые для экспрессии CAR, можно обрабатывать ex vivo посредством приведения в контакт с количеством ингибитора mTOR, повышающим количество PD1-отрицательных иммунных эффекторных клеток, например, T-клеток или NK-клеток, или повышающим соотношение PD1-отрицательных иммунных эффекторных клеток, например, T-клеток или NK-клеток/PD1-положительных иммунных эффекторных клеток, например, T-клеток или NK-клеток.

В варианте осуществления введение низкой, усиливающей иммунитет дозы ингибитора mTOR, например, аллостерического ингибитора, например, RAD001, или каталитического ингибитора, начинают перед введением CAR-экспрессирующей клетки, представленной в настоящем описании, например, иммунных эффекторных клеток (например, T-клеток или NK-клеток). В варианте осуществления клетки CAR вводят после достаточного периода времени, или достаточного введения доз ингибитора mTOR, таким образом, что уровень PD1-отрицательных иммунных эффекторных клеток, например, T-клеток или NK-клеток, или соотношение PD1-отрицательных иммунных эффекторных клеток, например, T-клеток или NK-клеток/PD1-положительных иммунных эффекторных клеток, например, T-клеток или NK-клеток, по меньшей мере транзиторно, повышается.

В варианте осуществления клетку, например, иммунную эффекторную клетку (например, T-клетку или NK-клетку), подлежащую конструированию для экспрессии CAR, собирают после достаточного периода времени или после достаточного введения низкой, усиливающей иммунитет дозы ингибитора mTOR, таким образом, что уровень PD1-отрицательных иммунных эффекторных клеток, например, T-клеток или NK-клеток, или соотношение PD1-отрицательных иммунных эффекторных клеток, например, T-клеток или NK-клеток/PD1-положительных иммунных эффекторных клеток, например, T-клеток или NK-клеток, у индивидуума, или собранных из индивидуума, по меньшей мере, транзиторно, повышается.

В варианте осуществления изобретение относится к ингибитору mTOR для применения в лечении индивидуума, где указанный ингибитор mTOR повышает иммунный ответ указанного индивидуума, и где указанному индивидууму вводят или собираются вводить иммунную эффекторную клетку, экспрессирующую CAR BCMA, как представлено в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления клетки, экспрессирующие молекулу CAR, например, молекулу CAR, представленную в настоящем описании, вводят в комбинации со средством, улучшающим один или более побочных эффектов, ассоциированных с введением клетки, экспрессирующей молекулу CAR, например, средством, представленным в настоящем описании.

В одном из вариантов осуществления клетки, экспрессирующие молекулу CAR, например, молекулу CAR, представленную в настоящем описании, вводят в комбинации со средством, с помощью которого лечат заболевание, ассоциированное с BCMA, например, средством, представленным в настоящем описании.

В определенных вариантах осуществления заболевание, ассоциированное с BCMA, является пролиферативным заболеванием, таким как злокачественное новообразование или предраковое состояние, такое как миелодисплазия, миелодиспластический синдром или предлейкоз, или является несвязанным со злокачественным новообразованием показанием, ассоциированным с экспрессией BCMA.

В определенных вариантах осуществления заболевание, ассоциированное с BCMA, является гемобластозом, выбранным из группы, состоящей из одного или более острых лейкозов, включая, в качестве неограничивающих примеров, острый миелолейкоз (AML), миелодиспластический синдром, миелопролиферативные неоплазии, хронический миелолейкоз (CML), неоплазию из бластных плазмацитоидных дендритных клеток, множественную миелому, и заболеванием, ассоциированным с экспрессией BMCA, включая, в качестве неограничивающих примеров, атипичные и/или неклассические злокачественные новообразования, злокачественные новообразования, предраковые состояния или пролиферативные заболевания с экспрессией BCMA, и их комбинациями. В одном из вариантов осуществления заболевание, ассоциированное с BCMA, является множественной миеломой. В вариантах осуществления заболевание, ассоциированное с экспрессией BCMA, включает пролиферативное нарушение из плазматических клеток, например, бессимптомную миелому (вялотекущую множественную миелому или индолентную миелому), моноклональную гаммапатию неустановленной этиологии (MGUS), макроглобулинемию Вальденстрема, плазмоцитомы (например, плазмоклеточную дискразию, солитарную миелому, солитарную плазмоцитому, экстрамедуллярную плазмоцитому, и множественную плазмоцитому), системный амилоидоз легких цепей и POEMS-синдром (также известный как синдром Кроу-Фуказа, болезнь Такацуки и PEP-синдром). В вариантах осуществления заболевание, ассоциированное с экспрессией BCMA, включает злокачественное новообразование, например, злокачественное новообразование, представленное в настоящем описании, например, рак предстательной железы (например, кастрационно-резистентный или резистентный к терапии рак предстательной железы или метастазирующий рак предстательной железы), рак поджелудочной железы или рак легких.

В вариантах осуществления CAR BCMA-экспрессирующую клетку, например, CAR BCMA-экспрессирующую клетку, представленную в настоящем описании, используют для лечения индивидуума, имеющего множественную миелому. В вариантах осуществления CAR BCMA-экспрессирующую клетку, например, CAR BCMA-экспрессирующую клетку, представленную в настоящем описании, используют для лечения индивидуума, имеющего пролиферативное нарушение из плазматических клеток, например, бессимптомную миелому (вялотекущую множественную миелому или индолентную миелому), моноклональную гаммапатию неустановленной этиологии (MGUS), макроглобулинемию Вальденстрема, плазмоцитомы (например, плазмоклеточную дискразию, солитарную миелому, солитарную плазмоцитому, экстрамедуллярную плазмоцитому, и множественную плазмоцитому), системный амилоидоз легких цепей и POEMS-синдром (также известный как синдром Кроу-Фуказа, болезнь Такацуки и PEP-синдром). В вариантах осуществления CAR BCMA-экспрессирующую клетку, например, CAR BCMA-экспрессирующую клетку, представленную в настоящем описании, используют для лечения индивидуума, имеющего злокачественное новообразование, например, злокачественное новообразование, представленное в настоящем описании, например, рак предстательной железы (например, кастрационно-резистентный или резистентный к терапии рак предстательной железы или метастазирующий рак предстательной железы), рак поджелудочной железы или рак легких.

В вариантах осуществления CAR BCMA-экспрессирующую клетку, например, CAR BCMA-экспрессирующую клетку, представленную в настоящем описании, вводят индивидууму в соответствии со схемой введения, включающей общую дозу клеток, вводимых индивидууму, посредством фракционирования дозы, например, одного, двух, трех или больше отдельных введений частичной дозы. В вариантах осуществления первую процентную долю общей дозы вводят в первый день лечения, вторую процентную долю общей дозы вводят в последующий (например, второй, третий, четвертый, пятый, шестой, седьмой или более поздний) день лечения и, необязательно, третью процентную долю (например, оставшуюся процентную долю) общей дозы вводят в более поздний (например, третий, четвертый, пятый, шестой, седьмой, восьмой, девятый, десятый или более поздний) день лечения. Например, 10% общей дозы клеток вводят в первый день, 30% общей дозы клеток вводят во второй день и оставшиеся 60% общей дозы клеток вводят в третий день лечения. Например, общая доза клеток включает от 1 до 5×10⁷ или 1 до 5×10⁸ клеток BCMA-CART.

В вариантах осуществления перед введением CAR-экспрессирующих клеток индивидууму проводят терапию с истощением лимфоцитов (например, с использованием цитоксана, например, в дозе 1,5 г/м²). В вариантах осуществления перед введением CAR-экспрессирующих клеток индивидууму не проводят терапию с истощением лимфоцитов (например, с использованием цитоксана).

В вариантах осуществления не проводят химиотерапию с истощением лимфоцитов и вводят общую дозу клеток BCMA-CART от 1 до 5×10⁷ (например, посредством инфузии), при этом вводят 10% дозы клеток в день 1 лечения, 30% в день 2 лечения и 60% в день 3 лечения. В другом варианте осуществления не проводят химиотерапию с истощением лимфоцитов и вводят общую дозу клеток BCMA-CART от 1 до 5×10⁸ (например, посредством инфузии), при этом вводят 10% дозы клеток в день 1 лечения, 30% в день 2 лечения и 60% в день 3 лечения. В вариантах осуществления химиотерапию с истощением лимфоцитов (цитоксан в дозе 1,5 г/м²) проводят за три дня до введения клеток BCMA-CART, а затем вводят общую дозу клеток BCMA-CART от 1 до 5×10⁷ (например, посредством инфузии), при этом вводят 10% дозы клеток в день 1 лечения, 30% в день 2 лечения и 60% в день 3 лечения. В вариантах осуществления химиотерапию с истощением лимфоцитов (цитоксан в дозе 1,5 г/м²) проводят за три дня до введения клеток BCMA-CART, а затем вводят общую дозу клеток BCMA-CART от 1 до 5×10⁸ (например, посредством инфузии), при этом вводят 10% дозы клеток в день 1 лечения, 30% в день 2 лечения и 60% в день 3 лечения.

В другом аспекте изобретение относится к способу кондиционирования индивидуума перед трансплантацией клеток, включающему введение индивидууму эффективного количества клеток, содержащих молекулу CAR, представленную в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления трансплантация клеток является трансплантацией стволовых клеток. Трансплантация стволовых клеток является трансплантацией гематопоэтических стволовых клеток или трансплантацией костного мозга. В одном из вариантов осуществления трансплантация клеток является аллогенной или аутологичной.

В одном из вариантов осуществления кондиционирование индивидуума перед трансплантацией клеток включает снижение количества BCMA-экспрессирующих клеток у индивидуума. BCMA-экспрессирующие клетки у индивидуума являются BCMA-экспрессирующими нормальными клетками или BCMA-экспрессирующими злокачественными клетками, и в некоторых случаях при кондиционировании индивидуума перед трансплантацией клеток будут снижать BCMA-экспрессирующие нормальные и злокачественные клетки.

В другом аспекте изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR по изобретению, выделенной полипептидной молекуле CAR по изобретению, вектору, содержащему CAR по изобретению, и клетке, содержащей CAR по изобретению, для применения в качестве лекарственного средства, например, как представлено в настоящем описании.

В другом аспекте изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR по изобретению, выделенной полипептидной молекуле CAR по изобретению, вектору, содержащему CAR по изобретению, и клетке, содержащей CAR по изобретению, для применения в лечении заболевания с экспрессией BCMA, например, заболевания с экспрессией BCMA, как представлено в настоящем описании.

Дополнительные признаки и варианты осуществления указанных выше композиций и способов включают одно или более из следующего:

В определенных вариантах осуществления молекула CAR BCMA (например, нуклеиновая кислота CAR BCMA или полипептид CAR BCMA, как представлено в настоящем описании) или BCMA-связывающий домен, как представлено в настоящем описании, включает одну, две или три CDR из вариабельной области тяжелой цепи (например, CDR1 HC, CDR2 HC и/или CDR3 HC), представленной в таблице 20, и/или одну, две или три CDR из вариабельной области легкой цепи (например, CDR1 LC, CDR2 LC и/или CDR3 LC) BCMA-1, BCMA-2, BCMA-3, BCMA-4, BCMA-5, BCMA-6, BCMA-7, BCMA-8, BCMA-9, BCMA-10, BCMA-11, BCMA-12, BCMA-13, BCMA-14, BCMA-15, 149362, 149363, 149364, 149365, 149366, 149367, 149368, 149369, BCMA_EBB-C1978-A4, BCMA_EBB-C1978-G1, BCMA_EBB-C1979-C1, BCMA_EBB-C1978-C7, BCMA_EBB-C1978-D10, BCMA_EBB-C1979-C12, BCMA_EBB-C1980-G4, BCMA_EBB-C1980-D2, BCMA_EBB-C1978-A10, BCMA_EBB-C1978-D4, BCMA_EBB-C1980-A2, BCMA_EBB-C1981-C3, BCMA_EBB-C1978-G4, A7D12.2, C11D5.3, C12A3.2, C13F12.1, представленной в таблице 21, или последовательность, по существу, идентичную (например, на 95-99% идентичную или с до 5, 4, 3, 2 или 1 замены аминокислот, например, замены (например, консервативной замены)) любой из указанных выше последовательностей.

В определенных вариантах осуществления молекула CAR BCMA (например, нуклеиновая кислота CAR BCMA или полипептид CAR BCMA, как представлено в настоящем описании) или антигенсвязывающий домен против BCMA, как представлено в настоящем описании, включает одну, две или три CDR из вариабельной области тяжелой цепи (например, CDR1 HC, CDR2 HC и/или CDR3 HC), представленной в таблице 22, и/или одну, две или три CDR из вариабельной области легкой цепи (например, CDR1 LC, CDR2 LC и/или CDR3 LC) BCMA-1, BCMA-2, BCMA-3, BCMA-4, BCMA-5, BCMA-6, BCMA-7, BCMA-8, BCMA-9, BCMA-10, BCMA-11, BCMA-12, BCMA-13, BCMA-14, BCMA-15, 149362, 149363, 149364, 149365, 149366, 149367, 149368, 149369, BCMA_EBB-C1978-A4, BCMA_EBB-C1978-G1, BCMA_EBB-C1979-C1, BCMA_EBB-C1978-C7, BCMA_EBB-C1978-D10, BCMA_EBB-C1979-C12, BCMA_EBB-C1980-G4, BCMA_EBB-C1980-D2, BCMA_EBB-C1978-A10, BCMA_EBB-C1978-D4, BCMA_EBB-C1980-A2, BCMA_EBB-C1981-C3, BCMA_EBB-C1978-G4, A7D12.2, C11D5.3, C12A3.2, C13F12.1, представленной в таблице 23, или последовательность, по существу, идентичную (например, на 95-99% идентичную или с до 5, 4, 3, 2 или 1 замены аминокислоты, например, замены (например, консервативной замены)) любой из указанных выше последовательностей. В определенных вариантах осуществления молекула CAR BCMA или антигенсвязывающий домен против BCMA включает одну, две или три CDR из вариабельной области тяжелой цепи (например, HCDR1, HCDR2 и/или HCDR3), представленной в таблице 24, и/или одну, две или три CDR из вариабельной области легкой цепи (например, CDR1 LC, CDR2 LC и/или CDR3 LC) BCMA-1, BCMA-2, BCMA-3, BCMA-4, BCMA-5, BCMA-6, BCMA-7, BCMA-8, BCMA-9, BCMA-10, BCMA-11, BCMA-12, BCMA-13, BCMA-14, BCMA-15, 149362, 149363, 149364, 149365, 149366, 149367, 149368, 149369, BCMA_EBB-C1978-A4, BCMA_EBB-C1978-G1, BCMA_EBB-C1979-C1, BCMA_EBB-C1978-C7, BCMA_EBB-C1978-D10, BCMA_EBB-C1979-C12, BCMA_EBB-C1980-G4, BCMA_EBB-C1980-D2, BCMA_EBB-C1978-A10, BCMA_EBB-C1978-D4, BCMA_EBB-C1980-A2, BCMA_EBB-C1981-C3, BCMA_EBB-C1978-G4, A7D12.2, C11D5.3, C12A3.2, C13F12.1, представленной в таблице 25, или последовательность, по существу, идентичную (например, на 95-99% идентичную или с до 5, 4, 3, 2 или 1 замены аминокислоты, например, замены (например, консервативной замены)) любой из указанных выше последовательностей.

В определенных вариантах осуществления молекула CAR BCMA или антигенсвязывающий домен против BCMA включает

(i) CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC любых аминокислотных последовательностей легкой цепи BCMA-связывающего домена, представленных в таблице 1 или 16, в SEQ ID NO: 271 или 273 или в CDR LC в таблице 21, 23 или 25; и/или,

(ii) CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC любых аминокислотных последовательностей тяжелой цепи BCMA-связывающего домена, представленных в таблице 1 или 16, в SEQ ID NO: 271 или 273 или в CDR HC в таблице 20, 22 или 24.

В определенных вариантах осуществления молекула BCMA (например, нуклеиновая кислота CAR BCMA или полипептид CAR BCMA, как представлено в настоящем описании) или антигенсвязывающий домен против BCMA, как представлено в настоящем описании, включает:

(1) три CDR легкой цепи (LC), выбранные из одного из следующего:

(i) CDR1 LC SEQ ID NO: 504, CDR2 LC SEQ ID NO: 544 и CDR3 LC SEQ ID NO: 584 BCMA-4 CAR (139103);

(ii) CDR1 LC SEQ ID NO: 514, CDR2 LC SEQ ID NO: 554 и CDR3 LC SEQ ID NO: 594 BCMA-10 CAR (139109);

(iii) CDR1 LC SEQ ID NO: 516, CDR2 LC SEQ ID NO: 556 и CDR3 LC SEQ ID NO: 596 BCMA-13 CAR (139112); или

(iv) CDR1 LC SEQ ID NO: 518, CDR2 LC SEQ ID NO: 558 и CDR3 LC SEQ ID NO: 598 BCMA-15 CAR (139114); и/или

(2) три CDR тяжелой цепи (HC), выбранные из одного из следующего:

(i) CDR1 HC SEQ ID NO: 384, CDR2 HC SEQ ID NO: 424 и CDR3 HC SEQ ID NO: 464 BCMA-4 CAR (139103);

(ii) CDR1 HC SEQ ID NO: 394, CDR2 HC SEQ ID NO: 434 и CDR3 HC SEQ ID NO: 474 BCMA-10 CAR (139109);

(iii) CDR1 HC SEQ ID NO: 396, CDR2 HC SEQ ID NO: 436 и CDR3 HC SEQ ID NO: 476 BCMA-13 CAR (139112); или

(iv) CDR1 HC SEQ ID NO: 398, CDR2 HC SEQ ID NO: 438 и CDR3 HC SEQ ID NO: 478 BCMA-15 (139114).

В определенных вариантах осуществления молекула CAR BCMA (например, нуклеиновая кислота CAR BCMA или полипептид CAR BCMA как представлено в настоящем описании) или антигенсвязывающий домен против BCMA, как представлено в настоящем описании, включает:

(1) три CDR легкой цепи (LC), выбранные из одного из следующего:

(i) CDR1 LC SEQ ID NO: 744, CDR2 LC SEQ ID NO: 784 и CDR3 LC SEQ ID NO: 824 BCMA-4 CAR (139103);

(ii) CDR1 LC SEQ ID NO: 754, CDR2 LC SEQ ID NO: 794 и CDR3 LC SEQ ID NO: 834 BCMA-10 CAR (139109);

(iii) CDR1 LC SEQ ID NO: 756, CDR2 LC SEQ ID NO: 796 и CDR3 LC SEQ ID NO: 836 BCMA-13 CAR (139112); или

(iv) CDR1 LC SEQ ID NO: 758, CDR2 LC SEQ ID NO: 798 и CDR3 LC SEQ ID NO: 838 BCMA-15 CAR (139114); и/или

(2) три CDR тяжелой цепи (HC), выбранные из одного из следующего:

(i) CDR1 HC SEQ ID NO: 624, CDR2 HC SEQ ID NO: 664 и CDR3 HC SEQ ID NO: 704 BCMA-4 CAR (139103);

(ii) CDR1 HC SEQ ID NO: 634, CDR2 HC SEQ ID NO: 674 и CDR3 HC SEQ ID NO: 714 BCMA-10 CAR (139109);

(iii) CDR1 HC SEQ ID NO: 636, CDR2 HC SEQ ID NO: 676 и CDR3 HC SEQ ID NO: 716 BCMA-13 CAR (139112); или

(iv) CDR1 HC SEQ ID NO: 638, CDR2 HC SEQ ID NO: 678 и CDR3 HC SEQ ID NO: 718 BCMA-15 CAR (139114).

В определенных вариантах осуществления молекула CAR BCMA (например, нуклеиновая кислота CAR BCMA или полипептид CAR BCMA, как представлено в настоящем описании) или антигенсвязывающий домен против BCMA, как представлено в настоящем описании, включает:

(1) три CDR легкой цепи (LC), выбранные из одного из следующего:

(i) CDR1 LC SEQ ID NO: 984 CDR2 LC SEQ ID NO: 1024 и CDR3 LC SEQ ID NO: 1064 BCMA-4 CAR (139103);

(ii) CDR1 LC SEQ ID NO: 994, CDR2 LC SEQ ID NO: 1034 и CDR3 LC SEQ ID NO: 1074 BCMA-10 CAR (139109);

(iii) CDR1 LC SEQ ID NO: 996, CDR2 LC SEQ ID NO: 1036 и CDR3 LC SEQ ID NO: 1076 BCMA-13 CAR (139112); или

(iv) CDR1 LC SEQ ID NO: 998, CDR2 LC SEQ ID NO: 1038 и CDR3 LC SEQ ID NO: 1078 BCMA-15 CAR (139114); и/или

(2) три CDR тяжелой цепи (HC), выбранные из одного из следующего:

(i) CDR1 HC SEQ ID NO: 864, CDR2 HC SEQ ID NO: 904 и CDR3 HC SEQ ID NO: 944 BCMA-4 CAR (139103);

(ii) CDR1 HC SEQ ID NO: 874, CDR2 HC SEQ ID NO: 914 и CDR3 HC SEQ ID NO: 954 BCMA-10 CAR (139109);

(iii) CDR1 HC SEQ ID NO: 876, CDR2 HC SEQ ID NO: 916 и CDR3 HC SEQ ID NO: 956 BCMA-13 CAR (139112);

(iv) CDR1 HC SEQ ID NO: 878, CDR2 HC SEQ ID NO: 918 и CDR3 HC SEQ ID NO: 958 BCMA-15 CAR (139114).

В определенных вариантах осуществления молекула CAR BCMA (например, нуклеиновая кислота CAR BCMA или полипептид CAR BCMA, как представлено в настоящем описании) или антигенсвязывающий домен против BCMA, как представлено в настоящем описании, включает аминокислотную последовательность гуманизированного scFv SEQ ID NO: 271 или 273 или нуклеотидную последовательность, кодирующую scFv (SEQ ID NO: 272 или 274), или его антигенсвязывающий домен (например, VH, VL или одну или более их CDR).

Если не указано иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, обладают тем же значением, которое общепринято понятно специалисту в области, к которой принадлежит изобретение. Хотя в практическом осуществлении или тестировании настоящего изобретения можно использовать способы и материалы, схожие или эквивалентные представленным в настоящем описании, подходящие способы и материалы описаны ниже. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки, упомянутые в настоящем описании, включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме. Кроме того, материалы, способы и примеры являются исключительно иллюстративными и не предназначены для ограничения. Заголовки, подзаголовки или пронумерованные или обозначенные буквами элементы, например, (a), (b), (i) и т.д., представлены исключительно для простоты чтения. Использование заголовков или пронумерованных или обозначенных буквами элементов в настоящем описании не требует того, чтобы этапы или элементы осуществляли в алфавитном порядке, или того, чтобы этапы или элементы обязательно отделяли друг от друга. Другие признаки, объекты и преимущества изобретения будут очевидны из описания, чертежей и формулы изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1, содержащая фигуры 1A и 1B, является двумя графическими представлениями экспрессии BCMA в образцах миеломы, которую определяют посредством количественной ПЦР. Экспрессию BCMA определяли в различных линиях клеток миеломы (фиг. 1A). Сравнивали экспрессию BCMA в нормальных плазматических клетках и образцах от пациентов с миеломой (фиг. 1B).

Фигура 2, содержащая фигуры 2A, 2B, 2C, 2D и 2E, является серией графических представлений экспрессии BCMA в линиях клеток множественной миеломы и первичных образцах посредством проточной цитометрии. BCMA определяли на поверхности клеток линий U266 (фиг. 2A), H929 (фиг. 2B) и 8226 (фиг. 2C). BCMA также однородно экспрессировался на большинстве клональных плазматических клеток у 9 из 10 анализируемых пациентов с множественной миеломой (фиг. 2D и 2E).

Фигура 3, содержащая фигуры 3A и 3B, является серией графических представлений, где показано отсутствие экспрессии BCMA в нормальных клетках периферической крови и после экспансии CD3/CD28 (фиг. 3A) и на нормальных клетках костного мозга (фиг. 3B).

Фигура 4, содержащая фигуры 4A, 4B, 4C, 4D, 4E,и 4F, является серией изображений и графиком, где показана экспрессия BCMA в нормальных тканях. Ткани, положительно окрашенные на экспрессию BCMA при иммуногистохимическом анализе, являлись лимфоузлом (фиг. 4A) и миндалиной (фиг. 4B). Типичные ткани, не окрашивающиеся на экспрессию BCMA (BCMA-отрицательные), включали легкое (фиг. 4C), поджелудочную железу (фиг. 4D) и щитовидную железу (фиг. 4E). Также осуществляли анализ гибридизации РНК in situ в различных тканях (фиг. 4F).

Фигура 5 является схематическим представлением четырех конструкций CAR, содержащих гуманизированные scFv мыши против BCMA, обозначенные как pBCMA1, pBCMA2, pBCMA3 и pBCMA4.

Фигура 6 является серией графиков проточной цитометрии, на которых показана эффективность трансдукции и экспрессия конструкций BMCA-CAR на T-клетках. SS1-BBz представляет собой CAR против мезотелина, служащий в качестве отрицательного контроля.

Фигура 7, содержащая фигуру 7A и фигуру 7B, является двумя графиками, на которых показана антиген-специфическая продукция цитокинов BCMA-CART, измеряемая посредством анализов ELISA. Оценивали продукцию ИЛ-2 (фиг. 7A) и интерферона-гамма (ИФНγ) (фиг. 7B).

Фигура 8, содержащая фигуру 8A, фигуру 8B, фигуру 8C и фигуру 8D, является серией графиков, на которых показана цитотоксическая активность BCMA-CART в отношении указанных линий клеток миеломы: K562, экспрессирующей BCMA (фиг. 8A), 8226 (фиг. 8B), NCI H929 (фиг. 8C) и OPM2 (фиг. 8D).

Фигура 9, содержащая фигуру 9A и фигуру 9B, является графиком и серией изображений, на которых показана противоопухолевая активность BCMA-CART в доклинической модели множественной миеломы на животных. На фигуре 9A показано количественное определение средней биолюминесценции, представляющей опухолевую массу у целого животного животное (представленное в фотонах/секунду). На фигуре 9B представлены изображения биолюминесценции, определяемой у исследуемых мышей на 5, 15 и 20 день после обработки.

Фигура 10, содержащая фигуры 10A и 10B, является серией схематических представлений рабочих конструкций CAR BCMA, содержащих гуманизированные scFv мыши против BCMA.

Фигура 11 является серией графиков, на которых показана мишене-специфическая активация рабочих конструкций BCMA CAR, трансдуцируемых в репортерную линию клеток, посредством анализа репортерного гена люциферазы.

Фигура 12 является графиком проточной цитометрии, на котором показано распределение популяций CD4+ и CD8+ T-клеток после экспансии CD3/CD28 перед трансдукцией с использованием рабочих конструкций BCMA CAR.

Фигура 13 является серией графиков, на которых показаны эффективность трансдукции CART посредством детекции антигена BCMA-Fc через 10 дней после трансдукции посредством проточной цитометрии и соответствующие гистограммы.

Фигура 14 является серией гистограмм, на которых показана пролиферация рабочих клеток BCMA CART посредством окрашивания CFSE после стимуляции с использованием указанных клеток-мишеней (например, K562, K562, экспрессирующей BCMA, KMS11-luc, MM1-S-luc, NCI-H929, KMs26, RPMI 8226 и бус с CD3/CD28).

Фигура 15, содержащая фигуры 15A и 15B, представляет собой два графика, на которых показана пролиферация рабочих клеток BCMA CART посредством количества клеток (измеряемого посредством проточной цитометрии) в случае CART-экспрессирующих клеток (фиг. 15A) и общего количества клеток (фиг. 15B) после стимуляции с использованием указанных клеток-мишеней.

Фигура 16 является графиком, на котором показано цитолиз рабочих BCMA CART в ответ на BCMA-экспрессирующие клетки-мишени, клетки KMS11-люцифераза (слева) и клетки MM1-S-люцифераза (справа), в анализе люциферазы.

Фигура 17 является серией графиков, на которых показано цитолиз рабочих BCMA CART в ответ на BCMA-экспрессирующие клетки-мишени в анализе цитолиза клеток CFSE.

Фигура 18 является серией графиков, на которых показана мишене-специфическая активация CAR BCMA, содержащих scFv человека против BCMA, трансдуцированных в репортерную линию клеток в анализе репортерного гена люциферазы.

Фигура 19 является графиком проточной цитометрии, на котором показано распределение популяций CD4+ и CD8+ T-клеток после экспансии CD3/CD28 и перед трансдукцией CAR.

Фигура 20 является серией графиков проточной цитометрии и соответствующих гистограмм, на которых показана эффективность трансдукции посредством оценки экспрессии CAR на трансдуцированных T-клетках.

Фигура 21 является серией гистограмм, на которых показана пролиферация клеток BCMA CART в ответ на стимуляцию с использованием указанных клеток-мишеней (K562, K562, экспрессирующих BCMA, RPMI 8226, KM11-luc и NCI-H929), измеряемая посредством окрашивания CFSE.

Фигура 22, содержащая фигуру 22A, фигуру 22B и фигуру 22C, является серией графиков, на которых показана пролиферация клеток BCMA CART в ответ на стимуляцию с использованием указанных клеток-мишеней (K562, K562, экспрессирующих BCMA, RPMI 8226, KMS11-luc и NCI-H929), измеряемая посредством проточной цитометрии. Пролиферацию CART-клеток анализировали независимо для каждой популяции T-клеток, экспрессирующих CD3 (фиг. 22A), CD4 (фиг. 22B) и CD8 (фиг. 22C).

Фигура 23, содержащая фигуры 23A, 23B и 23C, является серией графиков, на которых показан цитолиз BCMA CART в ответ на BCMA-экспрессирующие клетки-мишени KMS11-люцифераза в анализе люциферазы. Мощность цитолиза (процент убитых клеток-мишеней) каждой конструкции CAR BCMA сравнивают с BCMA-3NP и BCMA-4NP на каждом графике на фигуре 23A. На фигуре 23B выбранные конструкции BCMA CAR сравнивали друг с другом. На фигуре 23C соотношение эффектор:мишень нормализовали по CAR-экспрессирующим клеткам. Ось X представляет собой процент убитых клеток-мишеней, ось Y представляет собой соотношение эффектор:мишень (E:T).

Фигура 24 является графиком, на котором показано, что лечение с использованием BCMA CART приводит к контролю прогрессирования заболевания в ксенотрансплантате множественной миеломы человека KMS-11-luc у мышей NSG. Средняя биолюминесценция (+/- SEM) опухолевых клеток представляет опухолевую массу у целого животного, как представлено на графике в фотонах/секунду (ф/с) ROI (интересующей области, например, целой мыши). Значимость вычисляли с помощью ANOVA относительно наполнителя, * означает P<0,01.

Фигура 25, содержащая фигуры 25A и 25B, является двумя графиками, на которых показана противоопухолевая активность T-клеток с CAR BCMA в модели множественной миеломы человека KMS-11 в двух независимых экспериментах. Средняя биолюминесценция (+/- SEM) опухолевых клеток представляет опухолевую массу у целого животного, представленное на графиках в фотонах/секунду (ф/с) (или суммарный поток или BLI) целой мыши. Значимость вычисляли с помощью ANOVA относительно наполнителя в день 28, на фигуре 25A * означает P<0,01. На фигуре 25B BCMA-4NP* означает результаты первого эксперимента для BCMA-4NP (результаты представлены на фигуре 25A).

Фигура 26, содержащая фигуры 26A, 26B, 26C и 26D, является графиками, на которых показана пролиферация клеток BCMA-CART при количественном анализе клеток BCMA-CART в периферической крови мышей, несущих опухоль KMS-11-luc. T-клетки периферической крови анализировали в дни 1, 3, 7, 10, 14 и еженедельно впоследствии после лечения CAR T-клетками. Что касается первого эксперимента с опухолями (результаты представлены на фигуре 25A), оценка популяции CD4+ CART представлена на фигуре 26A и оценка популяции CD8+ CART представлена на фигуре 26B. Что касается второго эксперимента с опухолями (результаты представлены на фигуре 25B), оценка популяции CD4+ CART представлена на фигуре 26C и оценка популяции CD8+ CART представлена на фигуре 26D.

Фигура 27, содержащая фигуры 27A, 27B, 27C и 27D, является графиками, на которых показана экспансия CAR BCMA-экспрессирующих T-клеток в костном мозге и селезенке в конце первого эксперимента с опухолями (результаты представлены на фигуре 25A). Вычисляли среднее количество CD4+ CAR BCMA-экспрессирующих T-клеток в костном мозге (фиг. 27A) и селезенке (фиг. 27B). Вычисляли среднее количество CD4=8+ CAR BCMA-экспрессирующих T-клеток в костном мозге (фиг. 27C) и селезенке (фиг. 27D). Образец J6MO представляет собой CAR T-клетки, экспрессирующие конструкцию CAR BCMA-4NP.

Фигура 28, содержащая фигуры 28A и 28B, является графиками, на которых представлен титр лентивируса для выбранных конструкций BCMA CAR в двух независимых экспериментах с лентивирусом. При первом тестировании тестировали два разных препарата ДНК конструкций BCMA CAR (A и B) (фиг. 28A). При втором тестировании тестировали три различных препарата ДНК конструкций BCMA CAR (A, B и C) (фиг. 28B).

Фигура 29 является графиком, на котором показан конкурентный анализ BCMA-4NP и выбранных конструкций BCMA CAR, BCMA-4 (B4), BCMA-10 (B10), BCMA-13 (B13) и BCMA-15 (B15).

Фигура 30, содержащая фигуры 30A, 30B, 30C, 30D и 30E, является графиками, на которых показаны результаты анализов аффинности выбранных конструкций BCMA: BMCA-10 (фиг. 30A), BCMA-13 (фиг. 30B), BCMA-15 (фиг. 30C), BCMA-4 (фиг. 30D) и BCMA-4NP (фиг. 30E).

Фигура 31 является графиком, на котором показано селективное связывание выбранных CAR BCMA-экспрессирующих T-клеток в случае рекомбинантного BCMA. Рекомбинантные формы BCMA и близкородственных членов семейств BAFFR и TACI, содержащих белки, слитые с Fc-доменами, инкубировали с T-клетками, экспрессирующими BCMA-4, BCMA-10, BCMA-13 и BCMA-15. Определяли процентную долю клеток, связавшихся с рекомбинантными белками (% положительных клеток).

Фигура 32, содержащая фигуры 32A, 32B, 32C, 32D, 32E и 32F, является серией изображений, на которых показано иммуногистохимическое окрашивание BCMA в ткани головного мозга. Окрашивание на BCMA в лазящих волокнах мозжечка яванского макака (фиг. 32A). Окрашивание на BCMA в тельцах нервных клеток в нижнем оливном ядре яванского макака (фиг. 32B). Окрашивание на BCMA (фиг. 32C) и Ig-окрашивание (контроль) (фиг. 32E) в продолговатом мозге яванского макака. Окрашивание BCMA (фиг. 32D) и Ig-окрашивание (контроль) (фиг. 32F) в продолговатом мозге человека.

Фигура 33, содержащая фигуры 33A, 33B, 33C, 33D и 33E, является серией изображений и графиком, на котором изображен РНК-анализ экспрессии BCMA в ткани головного мозга. Гибридизация РНК BCMA, DAPB и PPIB in situ в мозжечке не являющегося человеком примата (фиг. 33A). Гибридизация РНК BCMA, DAPB и PPIB in situ в продолговатом мозге не являющегося человеком примата (фиг. 33B). Анализ количественной ПЦР BCMA в мозжечке, продолговатом мозге, желудке и почке человека (фиг. 33C). Анализ количественной ПЦР BCMA в белом веществе, сером веществе, продолговатом мозге, желудке и почке яванского макака (фиг. 33D). Анализ RNAseq нормальной ткани человека (фиг. 33E), рамкой показана экспрессия BCMA в мозжечке.

Фигура 34 является схематической диаграммой, на которой показана хронология исследования для оценки безопасности и осуществимости терапии клетками BCMA CART при рецидивирующей и/или рефрактерной миеломе.

Фигуры 35A и 35B являются графиками, на которых показана концентрация цитокинов, секретируемых BCMA-10 CART при сокультивировании с клетками-мишенями. Фигура 35A является графиком, на котором показана концентрация интерлейкина-2 (ИЛ-2) и интерферона-гамма (ИФНγ), секретируемых BCMA-10 CART. Фигура 35B является графиком, на котором показана концентрация фактора некроза опухоли (ФНО), секретируемого BCMA-10 CART.

Фигуры 36A и 36B являются графиками, на которых показана кривая роста и эффективность лентивирусной трансдукции huBCMA-BBz T-клеток. Фигура 36A является графиком, на котором показано количество T-клеток, трансдуцированных с использованием вектора huBCMA-BBz, через несколько дней после экспансии. Фигура 36B является панелью графиков проточной цитометрии, на которых показана экспрессия в день 6 при экспансии ex vivo BCMA на клетках CART-BCMA (T-клетках, трансдуцированных с использованием вектора huBCMA-BBz) по сравнению с нетрансдуцированными клетками NTD.

Фигура 37 является панелью гистограмм проточной цитометрии, на которых показана поверхностная экспрессия BCMA на различных линиях клеток, включая клетки K562-BCMA и линии клеток множественной миеломы NCI H929, U266, RPMI 8226, OPM2 и MM1S. На всех графиках оранжевый сплошной пик представляет изотипический контроль, и синий сплошной пик представляет окрашивание с использованием антитела против BCMA.

Фигуры 38A и 38B являются графиками, на которых показана концентрация цитокинов, продуцируемых клетками CART-BCMA в ответ на линии клеток миеломы. На фигуре 38A показана концентрация продуцируемого ИЛ-2, и на фигуре 38B показана концентрация продуцируемого ИФНγ. Значения представляют собой концентрацию цитокина в пг/мл.

Фигуры 39A, 39B и 39C являются графиками, на которых показано антиген-специфический цитолиз BCMA⁺ линий клеток множественной миеломы клетками CART-BCMA. На фигуре 39A показано антиген-специфический цитолиз клеток K562-BCMA, на фигуре 39B показано антиген-специфический цитолиз клеток RPMI 8226 и на фигуре 39C показано антиген-специфический цитолиз клеток MM1S.

Фигуры 40A, 40B и 4°C являются графиками, на которых показано, что клетки CART-BCMA демонстрируют эффективную противомиеломную активность in vivo. Фигура 40A является графиком, на котором показана общая интенсивность излучения у мышей, которым вводили нетрансдуцированные клетки, и фигура 40B является графиком, на котором показана общая интенсивность излучения у мышей с CART-BCMA. Фигура 4°C является графиком, на котором показан процент выживаемости мышей NTD или CART-BCMA после инъекции T-клеток. Представлено дорзальное испускание фотонов из опухолей RPMI 8226 CBG+, при этом отдельные животные изображены серым, и средняя общая интенсивность излучения представлена красным. n=10 для каждой группы. Время представлено в неделях после инъекции T-клеток.

На фигуре 41A-41D показаны различные конфигурации в отдельном векторе, например, где U6-регулируемая shRNA находится выше или ниже EF1 альфа-регулируемых CAR-кодирующих элементов. В примерах конструкций, изображенных на фиг. 41A и 41B, транскрипция происходит с помощью промоторов U6 и EF1 альфа в одном направлении. В примерах конструкций, изображенных на фиг. 41C и 41D, транскрипция происходит с помощью промоторов U6 и EF1 альфа в разных направлениях. На фигуре 41E, shRNA (и соответствующий промотор U6) находится на первом векторе, и CAR (и соответствующий промотор EF1 альфа) находится на втором векторе.

На фигуре 42 изображены структуры двух примеров конфигураций RCAR. Антигенсвязывающие члены содержат антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и домен-переключатель. Внутриклеточные связывающие члены содержат домен-переключатель, костимуляторный сигнальный домен и первичный сигнальный домен. Две конфигурации свидетельствуют о том, что первый и второй домены-переключатели, представленные в настоящем описании, могут находиться в разных ориентациях в отношении антигенсвязывающего члена и внутриклеточного связывающего члена. Другие конфигурации RCAR дополнительно представлены в настоящем описании.

На фигуре 43 показано, что пролиферацию CAR-экспрессирующих, трансдуцированных T-клеток повышают низкими дозами RAD001 в системе культивирования клеток. CART сокультивировали с клетками Nalm-6 в присутствие различных концентраций RAD001. Количество CAR-положительных CD3-положительных T-клеток (черный) и общее количество T-клеток (серый) оценивали через 4 дня сокультивирования.

На фигуре 44 изображены измерения роста опухоли клеток NALM6-luc с ежедневным введением дозы RAD001 0,3, 1, 3 и 10 мг/кг (мг/кг) или дозы наполнителя. Кругами обозначен наполнитель, квадратами обозначена доза 10 мг/кг RAD001, треугольниками обозначена доза 3 мг/кг RAD001, перевернутыми треугольниками обозначена доза 1 мг/кг RAD001 и ромбами обозначена доза 0,3 мг/кг RAD001.

На фигурах 45A и 45B показаны фармакокинетические кривые, на которых показано количество RAD001 в крови мышей NSG с опухолями NALM6. На фиг. 45A показана PK в день 0 после первой дозы RAD001. На фиг. 45B показана PK в день 14 после последней дозы RAD001. Ромбами обозначена доза 10 мг/кг RAD001, квадратами обозначена доза 1 мг/кг RAD001, треугольниками обозначена доза 3 мг/кг RAD001 и X обозначена доза 10 мг/кг RAD001.

На фигурах 46A и 46B показана пролиферация in vivo клеток с гуманизированным CD19 CART с введением дозы RAD001 и без него. Низкие ежедневные дозы RAD001 (0,003 мг/кг) приводят к повышению пролиферации CAR T-клеток выше нормального уровня пролиферации huCAR19. На фигурах 46A показаны CD4⁺ CAR T-клетки, на фиг. 46B показаны CD8⁺ CAR T-клетки. Кругами обозначен PBS, квадратами обозначен huCTL019, треугольниками обозначен huCTL019 с 3 мг/кг RAD001, перевернутыми треугольниками обозначен huCTL019 с 0,3 мг/кг RAD001, ромбами обозначен huCTL019 с 0,03 мг/кг RAD001 и кругами обозначен huCTL019 с 0,003 мг/кг RAD001.

На фиг. 47 изображена экспрессия CD19 в опухолевых клетках пациента. Опухолевые клетки CD138⁺ CD45^dim окрашивали на CD19 (ось x) и CD38 (ось y). Приблизительно 1-2% опухолевых клеток экспрессировали антиген CD19.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Определения

Если не указано иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют то же значение, которое общепринято понятно специалисту в области, к которой принадлежит изобретение.

Термин в единственном числе относится к одному или более (т.е. по меньшей мере одному) грамматическому объекту в описании. В качестве примера, термин "элемент" относится к одному элементу или более элементам.

Термин "приблизительно" в отношении измеримого значения, такого как количество, длительность времени и т.п., предназначен для включения вариантов ±20%, или в некоторых случаях ±10%, или в некоторых случаях ±5%, или в некоторых случаях ±1%, или в некоторых случаях ±0,1% указанного значения, т.к. такие варианты подходят для осуществления описываемых способов.

Термин "химерный антигенный рецептор" или, альтернативно, "CAR" относится к рекомбинантной полипептидной конструкции, содержащей, по меньшей мере, внеклеточный антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и цитоплазматический сигнальный домен (также обозначаемый в настоящем описании как "внутриклеточный сигнальный домен"), содержащий функциональный сигнальный домен, полученный из стимуляторной молекулы, описываемой ниже. В некоторых вариантах осуществления домены в полипептидной конструкции CAR находятся в одной полипептидной цепи, например, содержат химерный слитый белок. В некоторых вариантах осуществления домены в полипептидной конструкции CAR не являются смежными друг с другом, например, находятся в разных полипептидных цепях, например, как в RCAR, как представлено в настоящем описании.

В одном из аспектов стимуляторная молекула CAR является дзета-цепью, ассоциированной с T-клеточным рецепторным комплексом. В одном из аспектов цитоплазматический сигнальный домен содержит первичный сигнальный домен (например, первичный сигнальный домен CD3 дзета). В одном из аспектов цитоплазматический сигнальный домен дополнительно содержит один или более функциональных сигнальных доменов, полученных по меньшей мере из одной костимуляторной молекулы, описываемой ниже. В одном из аспектов костимуляторная молекула выбрана из 4-1BB (т.е. CD137), CD27, ICOS и/или CD28. В одном из аспектов CAR содержит химерный слитый белок, содержащий внеклеточный антиген-распознающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, содержащий функциональный сигнальный домен, полученный из стимуляторной молекулы. В одном из аспектов CAR содержит химерный слитый белок, содержащий внеклеточный антиген-распознающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, содержащий функциональный сигнальный домен, полученный из костимуляторной молекулы, и функциональный сигнальный домен, полученный из стимуляторной молекулы. В одном из аспектов CAR содержит химерный слитый белок, содержащий внеклеточный антиген-распознающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, содержащий два функциональных сигнальных домена, полученных из одной или более костимуляторных молекул, и функциональный сигнальный домен, полученный из стимуляторной молекулы. В одном из аспектов CAR содержит химерный слитый белок, содержащий внеклеточный антиген-распознающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, содержащий по меньшей мере два функциональных сигнальных домена, полученных из одной или более костимуляторных молекул, и функциональный сигнальный домен, полученный из стимуляторной молекулы. В одном из аспектов CAR содержит необязательную лидерную последовательность на амино-конце (N-конце) слитого белка CAR. В одном из аспектов CAR дополнительно содержит лидерную последовательность на N-конце внеклеточного антиген-распознающего домена, где лидерная последовательность, необязательно, отщепляется от антиген-распознающего домена (например, scFv) при клеточном процессинге и транспорте CAR к клеточной мембране.

CAR, содержащий антигенсвязывающий домен (например, scFv, однодоменное антитело или TCR (например, связывающий домен TCR альфа или связывающий домен TCR бета)), воздействующий на конкретный опухолевый маркер X, где X может являться опухолевым маркером, представленным в настоящем описании, также обозначают как XCAR. Например, CAR, содержащий антигенсвязывающий домен, воздействующий на BCMA, обозначают как CAR BCMA. CAR можно экспрессировать в любой клетке, например, иммунной эффекторной клетке, как представлено в настоящем описании (например, T-клетке или NK-клетке).

Термин "сигнальный домен" относится к функциональной части белка, действующей, передавая информацию внутри клетки для регуляции клеточной активности посредством определенных путей передачи сигнала посредством образования вторичных мессенджеров или функционирования в качестве эффекторов, отвечающих на такие мессенджеры.

Как применяют в настоящем описании, термин "BCMA" относится к B-клеточному антигену созревания. BCMA (также известный как TNFRSF17, BCM или CD269) является членом семейства рецепторов фактора некроза опухоли (TNFR) и, главным образом, экспрессируется на окончательно дифференцированных B-клетках, например, B-клетках памяти и плазматических клетках. Его лиганд назван B-клеточным активатором семейства ФНО (BAFF) и индуцирующим пролиферацию лигандом (APRIL). BCMA участвует в опосредовании выживаемости плазматических клеток для поддержания длительного гуморального иммунитета. Ген BCMA расположен на хромосоме 16, приводя к образованию первичного транскрипта мРНК длиной 994 нуклеотидов (регистрационный номер NCBI NM_001192.2), кодирующего белок из 184 аминокислот (NP_001183.2). Описан второй антисмысловой транскрипт, полученный из локуса BCMA, который может играть роль в регуляции экспрессии BCMA. (Laabi Y. et al., Nucleic Acids Res., 1994, 22:1147-1154). Описаны дополнительные варианты транскрипции с неизвестным значением (Smirnova AS et al. Mol Immunol., 2008, 45(4):1179-1183. Идентифицирована вторая изоформа, также известная как TV4 (идентификатор Uniprot Q02223-2). Как применяют в настоящем описании, термин "BCMA" включает белки, содержащие мутации, например, точечные мутации, фрагменты, инсерции, делеции и варианты сплайсинга полноразмерного BCMA дикого типа.

Как применяют в настоящем описании, термин "антитело" относится к последовательности белка или полипептида, полученной из молекулы иммуноглобулина, специфически связывающейся с антигеном. Антитела могут являться поликлональными или моноклональными, много- или одноцепочечными или интактными иммуноглобулинами, и их можно получать из природных источников или рекомбинантных источников. Антитела могут являться тетрамерами молекул иммуноглобулинов.

Термин "фрагмент антитела" относится по меньшей мере к одной части интактного антитела или его рекомбинантным вариантам и относится к антигенсвязывающему домену, например, антигенраспознающей вариабельной области интактного антитела, достаточной для придания способности к распознаванию и специфическому связыванию фрагмента антитела с мишенью, такой как антиген. Неограничивающие примеры фрагментов антител включают Fab, Fab'-, F(ab')_2- и Fv-фрагменты, scFv-фрагменты антител, линейные антитела, однодоменные антитела, такие как sdAb (VL или VH), домены VHH верблюжьих и полиспецифические молекулы, образованные из фрагментов антител, таких как бивалентный фрагмент, содержащий два или более, например, два, Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области, или две или более, например, две, связанные выделенных CDR или другие эпитоп-связывающие фрагменты антител. Фрагмент антитела также можно встраивать в однодоменные антитела, макситела, минитела, нанотела, интратела, диатела, триатела, тетратела, v-NAR и бис-scFv (см., например, Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005). Фрагменты антител также можно пересаживать на каркасы на основе полипептидов, таких как фибронектин типа III (Fn3) (см. патент США №: 6703199, в котором описывают минитела на основе полипептида фибронектина).

Термин "scFv" относится к слитому белку, содержащему по меньшей мере один фрагмент антитела, содержащий вариабельную область легкой цепи, и по меньшей мере один фрагмент антитела, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, где вариабельные области легкой и тяжелой цепи смежно связывают с помощью короткого гибкого полипептидного линкера, и они способны экспрессироваться в виде одноцепочечного полипептида, и где scFv сохраняет специфичность интактного антитела, из которого его получают. Как применяют в настоящем описании, если не указано иначе, scFv может содержать вариабельные области VL и VH в любом порядке, например, относительно N-конца и C-конца полипептида scFv может содержать VL-линкер-VH или может содержать VH-линкер-VL.

Как применяют в настоящем описании, термины "определяющая комплементарность область" или "CDR" относятся к аминокислотным последовательностям в вариабельных областях антитела, придающим специфичность в отношении антигена и аффинность связывания. Например, в основном, существует три CDR в каждой вариабельной области тяжелой цепи (например, HCDR1, HCDR2 и HCDR3) и три CDR в каждой вариабельной области легкой цепи (LCDR1, LCDR2, и LCDR3). Точные границы аминокислотной последовательности указанной CDR можно определять с использованием любой из ряда хорошо известных схем, включая описываемые Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (схема нумерации по "Kabat"), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273.927-948 (схема нумерации по "Chothia") или их комбинации. В случае схемы нумерации по Kabat в некоторых вариантах осуществления аминокислотные остатки CDR в вариабельном домене тяжелой цепи (VH) нумеруют как 31-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2) и 95-102 (HCDR3), а аминокислотные остатки CDR в вариабельном домене легкой цепи (VL) нумеруют 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) и 89-97 (LCDR3). В случае схемы нумерации по Chothia в некоторых вариантах осуществления аминокислоты CDR в VH нумеруют как 26-32 (HCDR1), 52-56 (HCDR2) и 95-102 (HCDR3), а аминокислотные остатки CDR в VL нумеруют как 26-32 (LCDR1), 50-52 (LCDR2) и 91-96 (LCDR3). В комбинированной схеме нумерации по Kabat и Chothia в некоторых вариантах осуществления CDR соответствуют аминокислотным остаткам, являющимся частью CDR по Kabat, CDR по Chothia, или и той, и другой. Например, в некоторых вариантах осуществления CDR соответствуют аминокислотным остаткам 26-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2) и 95-102 (HCDR3) в VH, например, VH млекопитающего, например, VH человека, и аминокислотным остаткам 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) и 89-97 (LCDR3) в VL, например, VL млекопитающего, например, VL человека.

Часть композиции CAR по изобретению, содержащей антитело или фрагмент антитела, может существовать во множестве форм, например, где антигенсвязывающий домен экспрессируется в виде части полипептидной цепи, включая, например, фрагмент однодоменного антитела (sdAb), одноцепочечное антитело (scFv) или, например, гуманизированное антитело (Harlow et al., 1999, в: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, в: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426). В одном из аспектов антигенсвязывающий домен композиции CAR по изобретению содержит фрагмент антитела. В дополнительном аспекте CAR содержит фрагмент антитела, содержащий scFv.

Как применяют в настоящем описании, термин "связывающий домен" или "молекула антитела" (также обозначаемый в настоящем описании как "связывающий домен против мишени (например, BCMA)") относится к белку, например, цепи иммуноглобулина или его фрагмента, содержащему по меньшей мере одну последовательность вариабельного домена иммуноглобулина. Термин "связывающий домен" или "молекула антитела" включает антитела и фрагменты антител. В варианте осуществления молекула антитела является полиспецифической молекулой антитела, например, она содержит множество последовательностей вариабельных доменов иммуноглобулина, где первая последовательность вариабельного домена иммуноглобулина из множества имеет специфичность связывания для первого эпитопа, и вторая последовательность вариабельного домена иммуноглобулина из множества имеет специфичность связывания для второго эпитопа. В варианте осуществления молекула полиспецифического антитела является молекулой биспецифического антитела. Биспецифическое антитело имеет специфичность не более чем для двух антигенов. Молекула биспецифического антитела отличается первой последовательностью вариабельного домена иммуноглобулина, имеющей специфичность связывания для первого эпитопа, и второй последовательностью вариабельного домена иммуноглобулина, имеющей специфичность связывания для второго эпитопа. Термин "тяжелая цепь антитела" относится к более крупной из двух типов полипептидных цепей, присутствующих в молекулах антител в их природных конформациях, и, как правило, определяющей класс, к которому принадлежит антитело.

Термин "легкая цепь антитела" относится к меньшей из двух типов полипептидных цепей, присутствующих в молекулах антител в их природных конформациях. Каппа- (κ) и лямбда- (λ) легкие цепи относятся к двум основным изотипам легких цепей антител.

Термин "рекомбинантное антитело" относится к антителу, получаемому с использованием технологии рекомбинантных ДНК, такому как, например, антитело, экспрессируемое бактериофагом или дрожжевой системой экспрессии. Термин также следует истолковывать в значении антитела, получаемого посредством синтеза молекулы ДНК, кодирующей антитело, и где с молекулы ДНК экспрессируется белок антитела, или аминокислотной последовательности, определяющей антитело, где ДНК или аминокислотную последовательность получают с использованием технологии рекомбинантной ДНК, или аминокислотной последовательности, доступной и хорошо известной в этой области.

Термин "антиген" или "Ag" относится к молекуле, вызывающей иммунный ответ. Этот иммунный ответ может включать продукцию антител, или активацию специфичных иммунокомпетентных клеток, или и то, и другое. Специалистам в этой области будет понятно, что любая макромолекула, включая практически все белки или пептиды, может служить в качестве антигена. Кроме того, антигены можно получать из рекомбинантной или геномной ДНК. Специалистам в этой области будет понятно, что любая ДНК, содержащая нуклеотидные последовательности, или частичная нуклеотидная последовательность, кодирующая белок, вызывающий иммунный ответ, таким образом, кодирует "антиген" в том смысле, в котором этот термин используют в настоящем описании. Кроме того, специалисту в этой области будет понятно, что антиген может кодироваться не только полноразмерной нуклеотидной последовательностью гена. Очевидно, что настоящее изобретение, в качестве неограничивающих примеров, относится к применению частичных нуклеотидных последовательностей нескольких генов, и что эти нуклеотидные последовательности расположены в различных комбинациях так, что они кодируют полипептиды, вызывающие желаемый иммунный ответ. Кроме того, специалистам в этой области будет понятно, что антиген вообще может не кодироваться "геном". Очевидно, что антиген можно получать синтезированным, или его можно получать из биологического образца, или он может являться макромолекулой помимо полипептида. Такой биологический образец может включать, в качестве неограничивающих примеров, образец ткани, образец опухоли, клетку или жидкость с другими биологическими компонентами.

Термин "противоопухолевый эффект" относится к биологическому эффекту, который может проявляться различными способами, включая, в качестве неограничивающих примеров, например, снижение объема опухоли, снижение количества опухолевых клеток, снижение количества метастазов, повышение предполагаемой продолжительности жизни, снижение пролиферации опухолевых клеток, снижение выживаемости опухолевых клеток или улучшение различных физиологических симптомов, ассоциированных со злокачественным состоянием. "Противоопухолевый эффект" также может проявляться как способность пептидов, полинуклеотидов, клеток и антител по изобретению предотвращать появление опухолей в первом участке.

Термин "противораковый эффект" относится к биологическому эффекту, который может проявляться различными способами, включая, в качестве неограничивающих примеров, например, снижение объема опухоли, снижение количества злокачественных клеток, снижение количества метастазов, повышение предполагаемой продолжительности жизни, снижение пролиферации злокачественных клеток, снижение выживаемости злокачественных клеток или улучшение различных физиологических симптомов, ассоциированных со злокачественным состоянием. "Противораковый эффект" также может проявляться как способность пептидов, полинуклеотидов, клеток и антител по изобретению предотвращать появление опухоли в первом участке. Термин "противоопухолевый эффект" относится к биологическому эффекту, который может проявляться различными способами, включая, в качестве неограничивающих примеров, например, снижение объема опухоли, снижение количества опухолевых клеток, снижение пролиферации опухолевых клеток или снижение выживаемости опухолевых клеток. Термин "аутологичный" относится к любому материалу, полученному из одного индивидуума, которому его позднее вводят.

Термин "аллогенный" относится к любому материалу, полученному из другого животного того же вида, что и индивидуум, которому материал вводят. Указывают, что два или более индивидуума являются аллогенными по отношению друг к другу, если гены в одном или более локусах не являются идентичными. В некоторых аспектах аллогенный материал из индивидуумов одного вида может в достаточной степени являться генетически непохожим, чтобы взаимодействовать антигенно.

Термин "ксеногенный" относится к трансплантату, полученному из животного другого вида.

Как применяют в настоящем описании, термин "аферез" относится к известному в этой области экстракорпоральному способу, посредством которого кровь донора или пациента удаляют из донора или пациента и пропускают через аппарат, с помощью которого отделяют выбранные конкретные составляющие и возвращают оставшуюся часть в кровоток донора или пациента, например, посредством обратного переливания крови. Таким образом, термин "аферезный образец" относится к образцу, полученному с использованием афереза.

Термин "комбинация" относится к фиксированной комбинации в одной стандартной лекарственной форме или комбинированному введению, где соединение по настоящему изобретению и партнера по комбинации (например, другое лекарственное средство, как описано ниже, также обозначаемое как "терапевтическое средство" или "ко-средство") можно вводить независимо одновременно или раздельно через временные интервалы, особенно когда эти временные интервалы делают возможной демонстрацию партнерами по комбинации кооперативного, например, синергического, действия. Отдельные компоненты можно упаковывать в набор или раздельно. Один или оба компонента (например, порошки или жидкости) можно восстанавливать или разводить до желаемой дозы перед введением. Как применяют в настоящем описании, термины "совместное введение" или "комбинированное введение" или т.п. предназначены для включения введения выбранного партнера по комбинации отдельному нуждающемуся в этом индивидууму (например, пациенту) и предназначены для включения схем лечения, в которых средства не обязательно вводить одним путем введения или одновременно. Как применяют в настоящем описании, термин "фармацевтическая комбинация" означает продукт, являющийся результатом смешивания или комбинирования нескольких активных ингредиентов, и включает фиксированные и нефиксированные комбинации активных ингредиентов. Термин "фиксированная комбинация" означает, что активные ингредиенты, например, соединение по настоящему изобретению и партнера по комбинации, вводят пациенту одновременно в форме единого объекта или дозы. Термин "нефиксированная комбинация" означает, что активные ингредиенты, например, соединение по настоящему изобретению и партнера по комбинации, вводят пациенту в виде отдельных объектов одновременно, параллельно или последовательно без конкретных временных пределов, где такое введение обеспечивает терапевтически эффективные уровни двух соединений в организме пациента. Последнее также применимо к терапии смесью соединений, например, введению трех или более активных ингредиентов.

Термин "злокачественное новообразование" относится к заболеванию, отличающемуся быстрым и неконтролируемым ростом аномальных клеток. Злокачественные клетки могут распространяться локально или через кровоток и лимфатическую систему в другие части тела. Неограничивающие примеры различных злокачественных новообразований представлены в настоящем описании и включают рак молочной железы, рак предстательной железы, рак яичников, рак шейки матки, рак кожи, рак поджелудочной железы, колоректальный рак, злокачественную опухоль почки, рак печени, рак головного мозга, лимфому, лейкоз, рак легких и т.п. Предпочтительные злокачественные новообразования, подвергаемые лечению способами, представленными в настоящем описании, включают множественную миелому, лимфому Ходжкина или неходжкинскую лимфому.

Термины "опухоль" и "злокачественное новообразование" в настоящем описании используют взаимозаменяемо, например, оба термина включают солидные и несолидные, например, диффузные или циркулирующие, опухоли. Как применяют в настоящем описании, термин "злокачественное новообразование" или "опухоль" включает предраковые, а также злокачественные новообразования и опухоли.

Как применяют в настоящем описании, термин "полученный из" означает взаимосвязь между первой и второй молекулой. Как правило, он относится к структурному сходству между первой молекулой и второй молекулой и не означает или не включает ограничение способа или источника в отношении первой молекулы, полученной из второй молекулы. Например, в случае внутриклеточного сигнального домена, полученного из молекулы CD3 дзета, внутриклеточный сигнальный домен сохраняет достаточную структуру CD3 дзета таким образом, что он обладает необходимой функцией, а именно, способностью генерировать сигнал в соответствующих условиях. Он не означает или не включает ограничение в отношении конкретного способа получения внутриклеточного сигнального домена, например, он не означает, что для получения внутриклеточного сигнального домена необходимо начинать с последовательности CD3 дзета и подвергать делеции нежелательную последовательность или включать мутации для получения внутриклеточного сигнального домена.

Фраза "заболевание, ассоциированное с экспрессией BCMA" включает, в качестве неограничивающих примеров, заболевание, ассоциированное с клетками, экспрессирующими BCMA (например, BCMA дикого типа или мутантный BCMA), или состояние, ассоциированное с клетками, экспрессирующими BCMA (например, BCMA дикого типа или мутантный BCMA), включая, например, пролиферативные заболевания, такие как злокачественное новообразование или предраковое состояние, такое как миелодисплазия, миелодиспластический синдром или предлейкоз, или несвязанное со злокачественным новообразованием показание, ассоциированное с клетками, экспрессирующими BCMA (например, BCMA дикого типа или мутантный BCMA). Чтобы избежать сомнений, заболевание, ассоциированное с экспрессией BCMA, может включать состояние, ассоциированное с клеткой, в настоящее время не экспрессирующей BCMA, например, т.к. экспрессия BCMA подвергнута отрицательной регуляции, например, в результате лечения молекулой против BCMA, например, ингибитором BCMA, представленным в настоящем описании, но в какое-то время экспрессирующей BCMA. В одном из аспектов злокачественное новообразование, ассоциированное с экспрессией BCMA (например, BCMA дикого типа или мутантного BCMA), является гемобластозом. В одном из аспектов гемобластоз является лейкозом или лимфомой. В одном из аспектов злокачественное новообразование, ассоциированное с экспрессией BCMA (например, BCMA дикого типа или мутантного BCMA), является злокачественным новообразованием из дифференцированных плазматических B-клеток. В одном из аспектов злокачественное новообразование, ассоциированное с экспрессией BCMA (например, BCMA дикого типа или мутантного BCMA), включает злокачественные новообразования, включая, в качестве неограничивающих примеров, например, один или более острых лейкозов, включая, в качестве неограничивающих примеров, например, острый B-клеточный лимфоидный лейкоз ("BALL"), острый T-клеточный лимфоидный лейкоз ("TALL"), острый лимфоидный лейкоз (ALL), один или более хронических лейкозов, включая, в качестве неограничивающих примеров, например, хронический миелогенный лейкоз (CML), хронический лимфоидный лейкоз (CLL). Дополнительные злокачественные образования или гематологические состояния, ассоциированные с экспрессией BMCA (например, BCMA дикого типа или мутантного BCMA), включают, в качестве неограничивающих примеров, например, B-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, неоплазию из бластных плазмацитоидных дендритных клеток, лимфому Беркитта, диффузную крупноклеточную B-клеточную лимфому, фолликулярную лимфому, волосатоклеточный лейкоз, мелкоклеточную или крупноклеточную фолликулярную лимфому, злокачественные лимфопролиферативные состояния, MALT-лимфому, лимфому из клеток мантийной зоны, лимфому из клеток маргинальной зоны, множественную миелому, миелодисплазию и миелодиспластический синдром, неходжкинскую лимфому, плазмобластную лимфому, неоплазию из плазмацитоидных дендритных клеток, макроглобулинемию Вальденстрема и "предлейкоз", представляющий собой широкий спектр гематологических состояний, объединенных неэффективной продукцией (или дисплазией) миелоидных клеток крови, и т.п. В некоторых вариантах осуществления злокачественное новообразование является множественной миеломой, лимфомой Ходжкина, неходжкинской лимфомой или глиобластомой. В вариантах осуществления заболевание, ассоциированное с экспрессией BCMA, включает пролиферативное нарушение из плазматических клеток, например, бессимптомную миелому (вялотекущую множественную миелому или индолентную миелому), моноклональную гаммапатию неустановленной этиологии (MGUS), макроглобулинемию Вальденстрема, плазмоцитомы (например, плазмоклеточную дискразию, солитарную миелому, солитарную плазмоцитому, экстрамедуллярную плазмоцитому и множественную плазмоцитому), системный амилоидоз легких цепей и POEMS-синдром (также известный как синдром Кроу-Фуказа, болезнь Такацуки и PEP-синдром). Дополнительные заболевания, ассоциированные с экспрессией BCMA (например, BCMA дикого типа или мутантного BCMA) включают, в качестве неограничивающих примеров, например, атипичные и/или неклассические злокачественные новообразования, злокачественные новообразования, предраковые состояния или пролиферативные заболевания, ассоциированные с экспрессией BCMA (например, BCMA дикого типа или мутантного BCMA), например, злокачественное новообразование, представленное в настоящем описании, например, рак предстательной железы (например, кастрационно-резистентный или резистентный к терапии рак предстательной железы или метастазирующий рак предстательной железы), рак поджелудочной железы или рак легких.

Несвязанные со злокачественным новообразованием показания, ассоциированные с BCMA (например, BCMA дикого типа или мутантным BCMA), включают вирусные инфекции, например, ВИЧ, грибковые инфекции, например, C. neoformans, аутоиммунное заболевание, например ревматоидный артрит, системную красную волчанку (SLE), обыкновенную пузырчатку и синдром Шегрена, воспалительное заболевание кишечника, язвенный колит, связанные с трансплантацией аллоспецифические нарушения иммунитета, связанные со слизистым иммунитетом, и нежелательные иммунные ответы на биологические средства (например, фактор VIII), когда важен гуморальный иммунитет. В вариантах осуществления несвязанное со злокачественным новообразованием показание, ассоциированное с экспрессией BCMA, включает, в качестве неограничивающих примеров, например, аутоиммунное заболевание, (например, системную красную волчанку), воспалительные нарушения (аллергию и астму) и трансплантацию. В некоторых вариантах осуществления опухолевая антиген-экспрессирующая клетка экспрессирует, или в какое-либо время экспрессировала, мРНК, кодирующую опухолевый антиген. В варианте осуществления опухолевая антиген-экспрессирующая клетка продуцирует опухолевый антигенный белок (например, дикого типа или мутантный), и опухолевый антигенный белок может присутствовать на нормальных уровнях или сниженных уровнях. В варианте осуществления опухолевая антиген-экспрессирующая клетка продуцировала детектируемые уровни опухолевого антигенного белка в одно время, а затем продуцировала, по существу, недетектируемый опухолевый антигенный белок.

Термин "консервативные модификации последовательности" относится к модификациям аминокислот, которые значимо не влияют или не изменяют характеристики связывания антитела или фрагмента антитела, содержащего аминокислотную последовательность. Такие консервативные модификации включают замены аминокислот, инсерции и делеции. Модификации можно включать в антитело или фрагмент антитела по изобретению стандартными способами, известными в этой области, такими как сайт-специфический мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез. Консервативные замены являются заменами, при которых аминокислотный остаток заменяют аминокислотным остатком, имеющим схожую боковую цепь. В этой области определены семейства аминокислотных остатков, имеющих схожие боковые цепи. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, один или более аминокислотных остатков в CAR по изобретению можно заменять другими аминокислотными остатками из одного семейства боковых цепей и измененный CAR можно тестировать с использованием функциональных анализов, представленных в настоящем описании.

Термин "стимуляция" относится к первичному ответу, индуцируемому связыванием стимуляторной молекулы (например, комплекса TCR/CD3) с ее когнатным лигандом, таким образом, опосредующим передачу сигнала, в качестве неограничивающих примеров, такую как передача сигнала через комплекс TCR/CD3. Стимуляция может опосредовать измененную экспрессию конкретных молекул, такую как отрицательная регуляция TGF-β, и/или реорганизацию структур цитоскелета и т.п.

Термин "стимуляторная молекула" относится к молекуле, экспрессируемой T-клеткой, из которой получают первичные цитоплазматические сигнальные последовательности, регулирующие первичную активацию комплекса TCR стимулирующим образом в случае, по меньшей мере, некоторых аспектов T-клеточного пути передачи сигнала. В некоторых вариантах осуществления ITAM-содержащий домен в CAR повторяет передачу сигнала первичного TCR независимо от эндогенных комплексов TCR. В одном из аспектов первичный сигнал инициируется, например, связыванием комплекса TCR/CD3 с молекулой MHC, нагруженной пептидом, что приводит к опосредованию T-клеточного ответа, включая, в качестве неограничивающих примеров, пролиферацию, активацию, дифференцировку и т.п. Первичная цитоплазматическая сигнальная последовательность (также обозначаемая как "первичный сигнальный домен"), действующая стимуляторным образом, может содержать сигнальный мотив, известный в качестве иммунорецепторного тирозинового активирующего мотива или ITAM. Неограничивающие примеры ITAM, содержащего первичную цитоплазматическую сигнальную последовательность, особенно применимую в настоящем изобретении, включают полученные из TCR дзета, FcR гамма, FcR бета, CD3 гамма, CD3 дельта, CD3 эпсилон, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 (также известный как "ICOS"), FcεRI и CD66d, DAP10 и DAP12. В конкретном CAR по изобретению внутриклеточный сигнальный домен в любом одном или более CAR по изобретению содержит внутриклеточную сигнальную последовательность, например, первичную сигнальную последовательность CD3 дзета. В конкретном CAR по изобретению первичная сигнальная последовательность CD3 дзета является последовательностью, приведенной как SEQ ID NO: 9, или эквивалентными остатками не являющихся человеком видов, например, мыши, грызуна, обезьяны, примата и т.п. В конкретном CAR по изобретению первичная сигнальная последовательность CD3 дзета является последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 10, или эквивалентными остатками не являющихся человеком видов, например, мыши, грызуна, обезьяны, примата и т.п. Термин "антигенпредставляющая клетка" или "APC" относится к клетке иммунной системы, такой как вспомогательная клетка (например, B-клетка, дендритная клетка и т.п.), презентирующей чужеродный антиген в комплексе с главным комплексом гистосовместимости (MHC) на своей поверхности. T-клетки могут распознавать эти комплексы с помощью своих T-клеточных рецепторов (TCR). APC процессируют антигены и презентируют их T-клеткам.

Как применяют в настоящем описании, термин "внутриклеточный сигнальный домен" относится к внутриклеточной части молекулы. В вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен передает сигнал эффекторной функции и заставляет клетку осуществлять специализированную функцию. Хотя можно использовать целый внутриклеточный сигнальный домен, во многих случаях не является необходимым использовать целую цепь. В той степени, в которой используют укороченную часть внутриклеточного сигнального домена, такую укороченную часть можно использовать вместо интактной цепи при условии, что она передает сигнал эффекторной функции. Таким образом, термин "внутриклеточный сигнальный домен" предназначен для включения любой укороченной части внутриклеточного сигнального домена, достаточной для передачи сигнала эффекторной функции.

Внутриклеточный сигнальный домен генерирует сигнал, стимулирующий иммунную эффекторную функцию клетки, содержащей CAR, например, CART-клетки. Примеры иммунной эффекторной функции, например, в CART-клетке, включают цитолитическую активность и хелперную активность, включая секрецию цитокинов.

В варианте осуществления внутриклеточный сигнальный домен может содержать первичный внутриклеточный сигнальный домен. Примеры первичных внутриклеточных сигнальных доменов включают полученные из молекул, отвечающих за первичную стимуляцию или антигензависимую стимуляцию. В варианте осуществления внутриклеточный сигнальный домен может содержать костимуляторный внутриклеточный домен. Примеры костимуляторных внутриклеточных сигнальных доменов включают полученные из молекул, отвечающих за костимуляторные сигналы или антиген-независимую стимуляцию. Например, в случае CART первичный внутриклеточный сигнальный домен может содержать цитоплазматическую последовательность T-клеточного рецептора, и костимуляторный внутриклеточный сигнальный домен может содержать цитоплазматическую последовательность из корецептора или костимуляторной молекулы.

Первичный внутриклеточный сигнальный домен может содержать сигнальный мотив, известный в качестве иммунорецепторного тирозинового активирующего мотива или ITAM. Неограничивающие примеры содержащих ITAM первичных цитоплазматических сигнальных последовательностей включают полученные из CD3 дзета, FcR гамма, FcR бета, CD3 гамма, CD3 дельта, CD3 эпсилон, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 (также известный как "ICOS"), FcεRI, CD66d, DAP10 и DAP12.

Термин "дзета" или, альтернативно, "дзета-цепь", "CD3 дзета" или "TCR-дзета" определяют как белок, представленный в GenBank под регистрационным номером BAG36664.1, или эквивалентные остатки не являющихся человеком видов, например, мыши, грызуна, обезьяны, примата и т.п., и термин "стимуляторный домен дзета" или, альтернативно, "стимуляторный домен CD3 дзета" или "стимуляторный домен TCR-дзета" определяют как аминокислотные остатки из цитоплазматического домена дзета-цепи, достаточные для функциональной передачи исходного сигнала, необходимого для активации T-клеток. В одном из аспектов цитоплазматический домен дзета содержит остатки 52-164 из записи GenBank под регистрационным номером BAG36664.1 или эквивалентные остатки не являющихся человеком видов, например, мыши, грызуна, обезьяны, примата и т.п., являющиеся их функциональными ортологами. В одном из аспектов "стимуляторный домен" или "стимуляторный домен CD3 дзета" является последовательностью, приведенной как SEQ ID NO: 9. В одном из аспектов "стимуляторный домен дзета" или "стимуляторный домен CD3 дзета" является последовательностью, приведенной как SEQ ID NO: 10.

Термин "костимуляторная молекула" относится к когнатному партнеру по связыванию на T-клетке, специфически связывающемуся с костимуляторным лигандом, таким образом, опосредуя костимуляторный ответ T-клетки, в качестве неограничивающих примеров, такой как пролиферация. Костимуляторные молекулы являются молекулами поверхности клетки, иными, чем антигенные рецепторы или их лиганды, необходимыми для эффективного иммунного ответа. Костимуляторные молекулы включают, в качестве неограничивающих примеров, молекулу MHC класса I, белки рецепторов ФНО, иммуноглобулин-подобные белки, рецепторы цитокинов, интегрины, сигнальные молекулы активации лимфоцитов (белки SLAM), активирующие рецепторы NK-клеток, BTLA, рецептор Толл-лигандов, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8 альфа, CD8 бета, IL2R бета, IL2R гамма, IL7R альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a и лиганд, специфически связывающийся с CD83.

Костимуляторный внутриклеточный сигнальный домен относится к внутриклеточной части костимуляторной молекулы.

Внутриклеточный сигнальный домен может содержать целую внутриклеточную часть или целый нативный внутриклеточный сигнальный домен молекулы, из которой его получают, или его функциональный фрагмент.

Термин "4-1BB" относится к члену суперсемейства TNFR с аминокислотной последовательностью, представленной в GenBank под регистрационным номером AAA62478.2, или эквивалентными остатками не являющихся человеком видов, например, мыши, грызуна, обезьяны, примата и т.п., и "костимуляторный домен 4-1BB" определяют как аминокислотные остатки 214-255 из записи GenBank под регистрационным номером AAA62478.2 или эквивалентные остатки не являющихся человеком видов, например, мыши, грызуна, обезьяны, примата и т.п. В одном из аспектов "костимуляторный домен 4-1BB" является последовательностью, приведенной как SEQ ID NO: 7, или эквивалентными остатками не являющихся человеком видов, например, мыши, грызуна, обезьяны, примата и т.п.

Как применяют в настоящем описании, термин "иммунная эффекторная клетка" относится к клетке, участвующей в иммунном ответе, например, в стимуляции эффекторного иммунного ответа. Примеры иммунных эффекторных клеток включают T-клетки, например, альфа/бета T-клетки и гамма/дельта T-клетки, B-клетки, естественные киллеры (NK-клетки), естественные киллерные T-клетки (NKT), тучные клетки и фагоциты миелоидного происхождения.

Как применяют в настоящем описании, термин "иммунная эффекторная функция или эффекторный иммунный ответ" относится к функции или ответу, например, иммунной эффекторной клетки, усиливающему или стимулирующему иммунную атаку клетки-мишени. Например, иммунная эффекторная функция или ответ относится к свойству T- или NK-клетки, стимулирующей цитолиз или ингибирование роста или пролиферации клетки-мишени. В случае T-клетки первичная стимуляция и костимуляция являются примерами иммунной эффекторной функции или ответа.

Термин "эффекторная функция" относится к специализированной функции клетки. Эффекторная функция T-клетки, например, может являться цитолитической активностью или хелперной активностью, включая секрецию цитокинов.

Термин "кодирующий" относится к внутреннему свойству конкретных последовательностей нуклеотидов в полинуклеотиде, таком как ген, кДНК или мРНК, служить в качестве матриц для синтеза других полимеров и макромолекул в биологических процессах, имеющих определенную последовательность нуклеотидов (например, рРНК, тРНК и мРНК) или определенную последовательность аминокислот и биологические свойства, являющиеся их результатом. Таким образом, ген, кДНК или РНК кодирует белок, если транскрипция и трансляция мРНК, соответствующей этому гену, приводит к образованию белка в клетке или другой биологической системе. И кодирующую цепь, нуклеотидная последовательность которой идентична последовательности мРНК, и которую, как правило, предоставляют в списках последовательностей, и некодирующую цепь, используемую в качестве матрицы для транскрипции гена или кДНК, можно обозначать как кодирующую белок или другой продукт этого гена или кДНК.

Если не указано иначе, "нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность" включает все нуклеотидные последовательности, являющиеся вырожденными версиями друг друга и кодирующими одну и ту же аминокислотную последовательность. Фраза "нуклеотидная последовательность, кодирующая белок или РНК" также может включать интроны до той степени, что нуклеотидная последовательность, кодирующая белок, в некоторой версии может содержать интроны.

Термины "эффективное количество" или "терапевтически эффективное количество" в настоящем описании используют взаимозаменяемо, и они относятся к количеству соединения, состава, материала или композиции, как представлено в настоящем описании, эффективному для достижения конкретного биологического результата.

Термин "эндогенный" относится к любому материалу из организма, клетки, ткани или системы или продуцирующемуся внутри организма, клетки, ткани или системы.

Термин "экзогенный" относится к любому материалу, вводимому или продуцирующемуся вне организма, клетки, ткани или системы.

Термин "экспрессия" относится к транскрипции и/или трансляции конкретной нуклеотидной последовательности, запускаемой промотором.

Термин "вектор для переноса" относится к композиции по настоящему изобретению, содержащей выделенную нуклеиновую кислоту, которую можно использовать для доставки выделенной нуклеиновой кислоты внутрь клетки. В этой области известны многочисленные векторы, включая, в качестве неограничивающих примеров, линейные полинуклеотиды, полинуклеотиды, связанные с ионными или амфифильными соединениями, плазмиды и вирусы. Таким образом, термин "вектор для переноса" включает автономно реплицирующуюся плазмиду или вирус. Термин также следует истолковывать как дополнительно включающий неплазмидные и невирусные соединения, облегчающие перенос нуклеиновой кислоты в клетки, такие как, например, полилизиновое соединение, липосома и т.п. Неограничивающие примеры вирусных векторов для переноса включают аденовирусные векторы, аденоассоциированные вирусные векторы, ретровирусные векторы, лентивирусные векторы и т.п.

Термин "экспрессирующий вектор" относится к вектору, содержащему рекомбинантный полинуклеотид, содержащий последовательности контроля экспрессии, функционально связанные с нуклеотидной последовательностью, подлежащей экспрессии. Экспрессирующий вектор содержит достаточные цис-элементы для экспрессии, другие элементы для экспрессии могут находиться в клетке-хозяине или системе экспрессии in vitro. Экспрессирующие векторы включают все известные в этой области векторы, включая космиды, плазмиды (например, безоболочечные или содержащиеся в липосомах) и вирусы (например, лентивирусы, ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), включающие рекомбинантный полинуклеотид.

Термин "лентивирус" относится к роду из семейства Retroviridae. Лентивирусы являются уникальными среди ретровирусов своей способностью инфицировать неделящиеся клетки, с помощью них можно доставлять значительное количество генетической информации в ДНК клетки-хозяина, таким образом, что они представляют собой один из наиболее эффективных способов доставки генов посредством вектора. ВИЧ, SIV и FIV являются примерами лентивирусов.

Термин "лентивирусный вектор" относится к вектору, полученному, по меньшей мере, из части генома лентивируса, включая, в частности, само-инактивирующийся лентивирусный вектор, как представлено в Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009). Другие неограничивающие примеры лентивирусных векторов, которые можно использовать в клинических условиях, включают, например, технологию доставки генов LENTIVECTOR® от Oxford BioMedica, векторную систему LENTIMAX™ от Lentigen и т.п. Неклинические типы лентивирусных векторов также доступны и известны специалисту в этой области.

Термин "гомологичный" или "идентичность" относится к идентичности последовательности субъединиц между двумя полимерными молекулами, например, между двумя молекулами нуклеиновой кислоты, такими как две молекулы ДНК или две молекулы РНК, или между двумя полипептидными молекулами. Если положение субъединицы в обеих молекулах занято одной и той же мономерной субъединицей, например, если положение в каждой из двух молекул ДНК занято аденином, то они являются гомологичными или идентичными в этом положении. Гомология между двумя последовательностями является прямой функцией количества совпадений или гомологичных положений, например, если половина (например, пять положений в полимере длиной десять субъединиц) положений в двух последовательностях является гомологичной, две последовательности являются на 50% гомологичными, если 90% положений (например, 9 из 10) совпадают или являются гомологичными, две последовательности являются на 90% гомологичными.

"Гуманизированные" формы не принадлежащих человеку антител (например, мыши) являются химерными иммуноглобулинами, цепями иммуноглобулинов или их фрагментами (такими как Fv, Fab, Fab', F(ab')2 или другие антигенсвязывающие подпоследовательности антител), содержащие минимальную последовательность, полученную из не принадлежащего человеку иммуноглобулина. Преимущественно, гуманизированные антитела и фрагменты антител являются иммуноглобулинами человека (реципиентным антителом или фрагментом антитела), в которых остатки из определяющей комплементарность области (CDR) реципиента заменяют остатками из CDR не являющихся человеком видов (донорного антитела), таких как мышь, крыса или кролик, имеющими желаемую специфичность, аффинность и активность. В некоторых случаях остатки каркасной области (FR) Fv иммуноглобулина человека заменяют соответствующими не принадлежащими человеку остатками. Кроме того, гуманизированное антитело/фрагмент антитела может содержать остатки, не обнаруживаемые ни в реципиентном антителе, ни в заимствованных последовательностях CDR или каркаса. Можно дополнительно уточнять эти модификации и оптимизировать свойства антитела или фрагмента антитела. В основном, гуманизированное антитело или фрагмент антитела будет содержать, по существу, все из по меньшей мере одного и, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или, по существу, все области CDR соответствуют областям CDR из не принадлежащего человеку иммуноглобулина, и все или значительная часть областей FR являются областями FR из последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело или фрагмент антитела также может содержать, по меньшей мере, часть константной области иммуноглобулина (Fc), как правило, иммуноглобулина человека. Более подробно, см. Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992.

Термин "полностью человеческий" относится к иммуноглобулину, такому как антитело или фрагмент антитела, где целая молекула имеет человеческое происхождение или состоит из аминокислотной последовательности, идентичной человеческой форме антитела или иммуноглобулина.

Термин "выделенный" означает измененный или удаленный из природного состояния. Например, нуклеиновая кислота или пептид, в природе находящиеся в живом животное, не являются "выделенными", но та же нуклеиновая кислота или пептид, частично или полностью отделенная от сосуществующих материалов в его природном состоянии, является "выделенной". Выделенная нуклеиновая кислота или белок могут существовать в значительной степени в очищенной форме или в неприродном окружении, таком как, например, клетка-хозяин.

В контексте настоящего описания, используют следующие сокращения для общераспространенных оснований нуклеиновой кислоты. "A" относится к аденозину, "C" относится к цитозину, "G" относится к гуанозину, "T" относится к тимидину и "U" относится к уридину.

Термин "функционально связанный" или "транскрипционный контроль" относится к функциональной связи между регуляторной последовательностью и гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, приводящей к экспрессии последней. Например, первая последовательность нуклеиновой кислоты функционально связана со второй последовательностью нуклеиновой кислоты, если первая последовательность нуклеиновой кислоты находится в функциональной взаимосвязи со второй последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, если промотор влияет на транскрипцию или экспрессию кодирующей последовательности. Функционально связанные последовательности ДНК могут являться смежными друг с другом, и, например, если необходимо соединять две кодирующие белок области, они находятся в одной рамке считывания.

Термин "парентеральное" введение иммуногенной композиции включает, например, подкожную (s.c.), внутривенную (i.v.), внутримышечную (i.m.) или интрастернальную инъекцию, внутриопухолевые или инфузионные способы.

Термин "нуклеиновая кислота" или "полинуклеотид" относится к дезоксирибонуклеиновым кислотам (ДНК) или рибонуклеиновым кислотам (РНК) и их полимерам в одно- или двухцепочечной форме. Если нет конкретных ограничений, термин включает нуклеиновые кислоты, содержащие известные аналоги природных нуклеотидов, имеющие схожие связывающие свойства с референсной нуклеиновой кислотой и метаболизируемые схожим образом с природными нуклеотидами. Если не указано иначе, конкретная последовательность нуклеиновой кислоты также косвенно включает ее консервативно модифицированные варианты (например, замены вырожденных кодонов, например, консервативные замены), аллели, ортологи, SNP и комплементарные последовательности, а также конкретно указанную последовательность. В частности, замены вырожденных кодонов, например, консервативные замены можно осуществлять, получая последовательности, в которых третье положение одного или более выбранных (или всех) кодонов замещают смешанными основаниями и/или дезоксиинозиновыми остатками (Batzer et al., Nucleic Acid Res 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985) и Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).

Термины "пептид", "полипептид" и "белок" используют взаимозаменяемо, и они относятся к соединению, состоящему из аминокислотных остатков, ковалентно связанных пептидными связями. Белок или пептид должен содержать по меньшей мере две аминокислоты, и нет ограничений в отношении максимального количества аминокислот, которое может содержать последовательность белка или пептида. Полипептиды включают любой пептид или белок, содержащий две или более аминокислоты, соединенные друг с другом пептидными связями. Как применяют в настоящем описании, термин относится к коротким цепям, общепринято обозначаемым в этой области как пептиды, олигопептиды и олигомеры, например, и к более длинным цепям, как правило, обозначаемым в этой области как белки, существует множество типов которых. "Полипептиды" включают, помимо прочего, например, биологически активные фрагменты, по существу, гомологичные полипептиды, олигопептиды, гомодимеры, гетеродимеры, варианты полипептидов, модифицированные полипептиды, производные, аналоги, слитые белки. Полипептид включает природный пептид, рекомбинантный пептид или их комбинацию.

Термин "промотор" относится к последовательности ДНК, распознаваемой синтетическим аппаратом клетки или встраиваемым синтетическим аппаратом, необходимой для инициации специфической транскрипции полинуклеотидной последовательности.

Термин "промотор/регуляторная последовательность" относится к последовательности нуклеиновой кислоты, необходимой для экспрессии продукта гена, функционально связанного с промотором/регуляторной последовательностью. В некоторых случаях, эта последовательность может являться коровой последовательностью промотора, а в других случаях эта последовательность также может включать энхансерную последовательность и другие регуляторные элементы, необходимые для экспрессии продукта гена. Промотор/регуляторная последовательность, например, может являться последовательностью, экспрессирующей продукт гена тканеспецифическим образом.

Термин "конститутивный" промотор относится к нуклеотидной последовательности, которая в случае функциональной связи с полинуклеотидом, кодирующим или определяющим продукт гена, вызывает продукцию продукта гена в клетке в большинстве или всех физиологических условиях клетки.

Термин "индуцибельный" промотор относится к нуклеотидной последовательности, которая в случае функциональной связи с полинуклеотидом, кодирующим или определяющим продукт гена, вызывает продукцию продукта гена в клетке, по существу, только при наличии в клетке индуктора, соответствующего промотору.

Термин "тканеспецифический" промотор относится к нуклеотидной последовательности, которая в случае функциональной связи с полинуклеотидом, кодирующим или определяющим продукт гена, вызывает продукцию продукта гена в клетке, по существу, только если клетка является клеткой типа ткани, соответствующего промотору.

Термины "ассоциированный со злокачественным новообразованием антиген" или "опухолевый антиген", используемые взаимозаменяемо, относятся к молекуле (как правило, белку, углеводу или липиду), экспрессирующемуся на поверхности злокачественной клетки, целиком или в виде фрагмента (например, MHC/пептид), и применимому для избирательного таргетинга фармакологического средства к злокачественной клетке. В некоторых вариантах осуществления опухолевый антиген является маркером, экспрессирующимся нормальными клетками и злокачественными клетками, например, линейным маркером, например, CD19 на B-клетках. В некоторых вариантах осуществления опухолевый антиген является молекулой поверхности клетки, гиперэкспрессированной в злокачественной клетке по сравнению с нормальной клеткой, например, с 1-кратной гиперэкспрессией, 2-кратной гиперэкспрессией, 3-кратной гиперэкспрессией или более по сравнению с нормальной клеткой. В некоторых вариантах осуществления опухолевый антиген является молекулой поверхности клетки, неправильно синтезирующейся в злокачественной клетке, например, молекулой, содержащей делеции, инсерции или мутации по сравнению с молекулой, экспрессируемой на нормальной клетке. В некоторых вариантах осуществления опухолевый антиген будет экспрессироваться исключительно на поверхности злокачественной клетки, целиком или в виде фрагмента (например, MHC/пептид), и не будет синтезироваться или экспрессироваться на поверхности нормальной клетки. В некоторых вариантах осуществления CAR по настоящему изобретению относятся к CAR, содержащим антигенсвязывающий домен (например, антитело или фрагмент антитела), связывающийся с MHC-презентированным пептидом. Как правило, пептиды, полученные из эндогенных белков, наполняют карманы молекул главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I и распознаются T-клеточными рецепторами (TCR) на CD8+T-лимфоцитах. Комплексы MHC класса I конститутивно экспрессируются всеми ядросодержащими клетками. При злокачественном новообразовании вирус-специфичные и/или опухолеспецифичные комплексы пептид/MHC представляют уникальный класс мишеней для иммунотерапии, расположенных на поверхности клетки. Описаны TCR-подобные антитела, направленные против пептидов, полученных из вирусных или опухолевых антигенов в контексте лейкоцитарного антигена человека (HLA)-A1 или HLA-A2 (см., например, Sastry et al., J Virol. 2011 85(5):1935-1942; Sergeeva et al., Blood, 2011 117(16):4262-4272; Verma et al., J Immunol 2010 184(4):2156-2165; Willemsen et al., Gene Ther 2001 8(21):1601-1608; Dao et al., Sci Transl Med 2013 5(176):176ra33; Tassev et al., Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100). Например, TCR-подобное антитело можно идентифицировать при скрининге библиотеки, такой как библиотека фагового дисплея scFv человека.

Термины "опухоль-поддерживающий антиген" или "поддерживающий злокачественное новообразование антиген" используют взаимозаменяемо, и они относятся к молекуле (как правило, белку, углеводу или липиду), экспрессирующемуся на поверхности клетки, самому по себе не являющемуся злокачественным, но поддерживающим злокачественные клетки, например, стимулируя их рост или выживаемость, например, резистентность к иммунным клеткам. Примеры клеток этого типа включают стромальные клетки и супрессорные клетки миелоидного происхождения (MDSC). Самому опухоле-поддерживающему антигену нет необходимости играть роль в поддержании опухолевых клеток при условии, что антиген присутствует на клетке, поддерживающей злокачественные клетки.

Термин "гибкий полипептидный линкер" или "линкер", как применяют в отношении scFv, относится к пептидному линкеру, состоящему из аминокислот, таких как остатки глицина и/или серина, используемые в отдельности или в комбинации для связывания вариабельных областей тяжелой и легкой цепи. В одном из вариантов осуществления гибкий полипептидный линкер является линкером Gly/Ser и содержит аминокислотную последовательность (Gly-Gly-Gly-Ser)n (SEQ ID NO: 38), где n является положительным целым числом, равным 1 или более. Например, n=1, n=2, n=3. n=4, n=5 и n=6, n=7, n=8, n=9 и n=10. В одном из вариантов осуществления гибкие полипептидные линкеры включают, в качестве неограничивающих примеров, (Gly4 Ser)4 (SEQ ID NO: 27) или (Gly4 Ser)3 (SEQ ID NO: 28). В другом варианте осуществления линкеры включают множественные повторы (Gly2Ser), (GlySer) или (Gly3Ser) (SEQ ID NO: 29). Кроме того, в объем изобретения включены линкеры, описываемые в WO2012/138475, включенном в настоящее описание в качестве ссылки).

Как применяют в настоящем описании, 5'-кэп (также обозначаемый как РНК-кэп, 7-метилгуанозиновый РНК-кэп или РНК m⁷G-кэп) является модифицированным гуаниновым нуклеотидом, добавляемым "вперед" или на 5'-конец эукариотической матричной РНК вскоре после начала транскрипции. 5'-кэп состоит из концевой группы, связанной с первым транскрибируемым нуклеотидом. Его наличие является критическим для распознавания рибосомой и защиты от РНКаз. Добавление кэпа сопряжено с транскрипцией и происходит котранскрипционно, таким образом, что одно влияет на другое. Вскоре после начала транскрипции 5'-конец синтезируемой мРНК связывается кэп-синтезирующим комплексом, ассоциированным с РНК-полимеразой. Этот ферментативный комплекс катализирует химические реакции, необходимые для кэпирования мРНК. Синтез происходит как многоэтапная биохимическая реакция. Кэпирующий остаток можно модифицировать для модуляции функциональности мРНК, такой как ее стабильность или эффективность трансляции.

Как применяют в настоящем описании, "транскрибируемая in vitro РНК" относится к РНК, предпочтительно мРНК, синтезируемой in vitro. Как правило, транскрибируемая in vitro РНК образуется из транскрибирующегося in vitro вектора. Транскрибирующийся in vitro вектор содержит матрицу, используемую для получения транскрибируемой in vitro РНК.

Как применяют в настоящем описании, "поли(A)" является серией аденозинов, прикрепляемых к мРНК посредством полиаденилирования. В предпочтительном варианте осуществления конструкции для транзиторной экспрессии поли(A) составляет от 50 до 5000 (SEQ ID NO: 30), предпочтительно - более 64, более предпочтительно - более 100, наиболее предпочтительно - более 300 или 400. Поли(A)-последовательности можно модифицировать химически или ферментативно для модуляции функциональности мРНК, такой как локализация, стабильность или эффективность трансляции.

Как применяют в настоящем описании, "полиаденилирование" относится к ковалентному соединению полиаденилилового остатка или его модифицированного варианта с молекулой матричной РНК. В эукариотических организмах большинство молекул матричной РНК (мРНК) являются полиаденилированными на 3'-конце. 3'-поли(A)-хвост является длинной последовательностью адениновых нуклеотидов (зачастую несколько сотен), добавляемых к пре-мРНК под действием фермента полиаденилатполимеразы. У высших эукариот поли(A)-хвост добавляется к транскриптам, содержащим конкретную последовательность, сигнал полиаденилирования. Поли(A)-хвост и белок, связанный с ним, способствуют защите мРНК от деградации экзонуклеазами. Полиаденилирование также важно для терминации транскрипции, экспорту мРНК из ядра и трансляции. Полиаденилирование происходит в ядре непосредственно после транскрипции ДНК в РНК, но дополнительно может происходить позднее в цитоплазме. После терминации транскрипции цепь мРНК расщепляется под действием эндонуклеазного комплекса, ассоциированного с РНК-полимеразой. Участок расщепления, как правило, отличается наличием последовательности оснований AAUAAA вблизи участка расщепления. После расщепления мРНК остатки аденозина добавляются к свободному 3'-концу в участке расщепления.

Как применяют в настоящем описании, термин "транзиторный" относится к экспрессии невстроенного трансгена в течение часов, дней или недель, где период времени экспрессии является меньшим, чем период времени экспрессии гена, встроенного в геном или содержащегося в стабильном репликоне плазмиды в клетке-хозяине.

Как применяют в настоящем описании, термины "лечить" и "лечение" относятся к снижению или улучшению прогрессирования, тяжести и/или длительности пролиферативного нарушения или улучшению одного или более симптомов (предпочтительно, одного или более заметных симптомов) пролиферативного нарушения, являющемуся результатом введения одного или более терапевтических средств (например, одного или более терапевтических средств, таких как CAR по изобретению). В конкретных вариантах осуществления термины "лечить" и "лечение" относятся к улучшению по меньшей мере одного измеримого физического параметра пролиферативного нарушения, такого как рост опухоли, не обязательно заметного для пациента. В других вариантах осуществления термины "лечить" и "лечение" относятся к ингибированию прогрессирования пролиферативного нарушения физически, например, посредством стабилизации заметного симптома, физиологически, например, посредством стабилизации физического параметра, или и тому, и другому. В других вариантах осуществления термины "лечить" и "лечение" относятся к снижению или стабилизации размера опухоли или количества злокачественных клеток.

Термин "путь передачи сигнала" относится к биохимической взаимосвязи между множеством молекул передачи сигнала, играющих роль в передаче сигнала от одной части клетки другой части клетки. Фраза "рецептор поверхности клетки" включает молекулы и комплексы молекул, способные получать сигнал и передавать сигнал через мембрану клетки.

Термин "индивидуум" предназначен для включения живых организмов, в которых можно вызывать иммунный ответ (например, млекопитающих, человека).

Термин "в значительной степени очищенная" клетка относится к клетке, по существу, не содержащей другие типы клеток. Термин "в значительной степени очищенная клетка" также относится к клетке, отделенной от других типов клеток, в которыми она, как правило, ассоциирована в его природном состоянии. В некоторых случаях популяция, в значительной степени, очищенных клеток относится к гомогенной популяции клеток. В других случаях этот термин просто относится к клетке, отделенной от клеток, с которыми она, как правило, ассоциирована в их природном состоянии. В некоторых аспектах клетки культивируют in vitro. В других аспектах клетки не культивируют in vitro.

Как применяют в настоящем описании, термин "терапевтический" означает лечение. Терапевтического эффекта достигают посредством снижения, супрессии, ремиссии или эрадикации заболевания.

Как применяют в настоящем описании, термин "профилактика" означает предотвращение или протективное лечение в случае заболевания.

В контексте настоящего описания, "опухолевый антиген" или "антиген гиперпролиферативного нарушения" или "антиген, ассоциированный с гиперпролиферативным нарушением" относится к антигенам, общим для конкретных гиперпролиферативных нарушений. В определенных аспектах антигены гиперпролиферативного нарушения по настоящему изобретению получают из злокачественных новообразований, включая, в качестве неограничивающих примеров, первичную или метастазирующую меланому, тимому, лимфому, саркому, рак легких, рак печени, неходжкинскую лимфому, лимфому Ходжкина, лейкозы, рак матки, рак шейки матки, рак мочевого пузыря, рак почки и аденокарциномы, такие как рак молочной железы, рак предстательной железы (например, кастрационно-резистентный или резистентный к терапии рак предстательной железы или метастазирующий рак предстательной железы), рак яичников, рак поджелудочной железы и т.п., или пролиферативное нарушение из плазматических клеток, например, бессимптомную миелому (вялотекущую множественную миелому или индолентную миелому), моноклональную гаммапатию неустановленной этиологии (MGUS), макроглобулинемию Вальденстрема, плазмоцитомы (например, плазмоклеточную дискразию, солитарную миелому, солитарную плазмоцитому, экстрамедуллярную плазмоцитому и множественную плазмоцитому), системный амилоидоз легких цепей и POEMS-синдром (также известный как синдром Кроу-Фуказа, болезнь Такацуки и PEP-синдром).

Термин "трансфицированный", или "трансформированный", или "трансдуцированный" относится к способу, посредством которого экзогенную нуклеиновую кислоту переносят или встраивают в клетку-хозяина. "Трансфицированная", или "трансформированная", или "трансдуцированная" клетка является клеткой, трансфицированной, трансформированной или трансдуцированной с использованием экзогенной нуклеиновой кислоты. Клетка включает первичную клетку и ее потомство.

Термин "специфически связывается" относится к антителу или лиганду, распознающему и связывающемуся с когнатным белком-партнером по связыванию (например, стимуляторной и/или костимуляторной молекулой, присутствующей на T-клетке), присутствующим в образце, но где антитело или лиганд, по существу, не распознают или не связываются с другими молекулами в образце.

Как применяют в настоящем описании, термин "регулируемый химерный антигенный рецептор (RCAR)" относится к набору полипептидов, как правило, двум в самых простых вариантах осуществления, которые при их наличии в иммунной эффекторной клетке обеспечивают специфичность клетки для клетки-мишени, как правило, злокачественной клетки, и генерирование внутриклеточного сигнала. В некоторых вариантах осуществления RCAR содержит, по меньшей мере, внеклеточный антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и цитоплазматический сигнальный домен (также обозначаемый в настоящем описании как "внутриклеточный сигнальный домен"), содержащий функциональный сигнальный домен, полученный из стимуляторной молекулы и/или костимуляторной молекулы, как определено в настоящем описании в отношении молекулы CAR. В некоторых вариантах осуществления полипептиды в наборе в RCAR не являются смежными друг с другом, например, они находятся в разных полипептидных цепях. В некоторых вариантах осуществления RCAR включает переключатель димеризации, который при наличии молекулы димеризации, может соединять полипептиды друг с другом, например, может соединять антигенсвязывающий домен с внутриклеточным сигнальным доменом. В некоторых вариантах осуществления RCAR экспрессируется в клетке (например, иммунной эффекторной клетке), как представлено в настоящем описании, например, RCAR-экспрессирующей клетке (также обозначаемой в настоящем описании как "клетка RCARX"). В варианте осуществления клетка RCARX является T-клеткой, и ее обозначают как клетку RCART. В варианте осуществления клетка RCARX является NK-клеткой, и ее обозначают как клетку RCARN. RCAR может обеспечивать RCAR-экспрессирующую клетку специфичностью для клетки-мишени, как правило, злокачественной клетки, и генерированием регулируемого внутриклеточного сигнала или пролиферацией, которые могут оптимизировать иммунные эффекторные свойства RCAR-экспрессирующей клетки. В вариантах осуществления клетка RCAR, по меньшей мере, частично, обусловлена антигенсвязывающим доменом в том, что касается специфичности для клетки-мишени, содержащей антиген, связанный антигенсвязывающим доменом.

Как применяют в настоящем описании, термины "мембранный якорь" или "мембраносвязывающий домен" относятся к полипептиду или остатку, например, миристоильной группе, достаточной для заякоривания внеклеточного или внутриклеточного домена в плазматической мембране.

Как применяют в настоящем описании, термин "домен-переключатель", например, в отношении RCAR, относится к веществу, как правило, основанному на полипептиде веществу, которое в присутствие молекулы димеризации связывается с другим доменом-переключателем. Связывание приводит к функциональному соединению первого вещества, связанного, например, слитого, с первым доменом-переключателем, и второго вещества, связанного, например, слитого, со вторым доменом-переключателем. Первый и второй домен-переключатель в совокупности обозначают как переключатель димеризации. В вариантах осуществления первый и второй домены-переключатели являются одинаковыми, например, они являются полипептидами, имеющими одинаковую первичную аминокислотную последовательность, и их в совокупности обозначают как переключатель гомодимеризации. В вариантах осуществления первый и второй домены-переключатели отличаются друг от друга, например, они являются полипептидами, имеющими разные первичные аминокислотные последовательности, и их в совокупности обозначают как переключатель гетеродимеризации. В вариантах осуществления переключатель является внутриклеточным. В вариантах осуществления переключатель является внеклеточным. В вариантах осуществления домен-переключатель является веществом на основе полипептида, например, на основе FKBP или FRB, и молекула димеризации является низкомолекулярным соединением, например, рапалогом. В вариантах осуществления домен-переключатель является веществом на основе полипептида, например, scFv, связывающимся с пептидом myc, и молекула димеризации является полипептидом, его фрагментом или мультимером полипептида, например, лигандом myc или мультимерами лиганда myc, связывающимися с одним или более scFv против myc. В вариантах осуществления домен-переключатель является веществом на основе полипептида, например, рецептором myc, и молекула димеризации является антителом или его фрагментами, например, антителом против myc.

Как применяют в настоящем описании, термин "Молекула димеризации", например, в отношении RCAR, относится к молекуле, стимулирующей связывание первого домена-переключателя со вторым доменом-переключателем. В вариантах осуществления молекула димеризации в природе не встречается у индивидуума или не встречается в концентрациях, которые будут приводить к значительной димеризации. В вариантах осуществления молекула димеризации является низкомолекулярным соединением, например, рапамицином или рапалогом, например, RAD001.

Термин "биоэквивалент" относится к количеству средства, иного, чем референсное соединение (например, RAD001), необходимое для достижения эффекта, эквивалентного эффекту, достигаемому посредством референсной дозы или референсного количества референсного соединения (например, RAD001). В варианте осуществления эффект является уровнем ингибирования mTOR, например, измеряемым по ингибированию киназы P70 S6, например, оцениваемому в анализе in vivo или in vitro, например, измеряемому посредством анализа, представленного в настоящем описании, например, анализа Boulay, или измерения уровней фосфорилированного S6 посредством вестерн-блоттинга. В варианте осуществления эффект является изменением соотношения PD-1-положительных/PD-1-отрицательных T-клеток, измеряемого посредством сортинга клеток. В варианте осуществления биоэквивалентное количество или доза ингибитора mTOR является количеством или дозой, при которой достигают того же уровня ингибирования киназы P70 S6, что и при референсной дозе или референсном количестве референсного соединения. В варианте осуществления биоэквивалентное количество или доза ингибитора mTOR является количеством или дозой, при которой достигают того же уровня изменения соотношения PD-1-положительных/PD-1-отрицательных T-клеток, что и при референсной дозе или референсном количестве референсного соединения.

Термин "низкая, усиливающая иммунитет доза" при использовании в комбинации с ингибитором mTOR, например, аллостерическим ингибитором mTOR, например, RAD001 или рапамицином, или каталитическим ингибитором mTOR, относится к дозе ингибитора mTOR, которая частично, а не полностью, ингибирует активность mTOR, например, измеряемую по ингибированию киназной активности P70 S6. Способы оценки активности mTOR, например, посредством ингибирования киназы P70 S6, представлены в настоящем описании. Доза является недостаточной, чтобы приводить к полной иммуносупрессии, но достаточной для усиления иммунного ответа. В варианте осуществления низкая, усиливающая иммунитет доза ингибитора mTOR приводит к снижению количеств PD-1-положительных иммунных эффекторных клеток, например, T-клеток или NK-клеток, и/или повышению количества PD-1-отрицательных иммунных эффекторных клеток, например, T-клеток или NK-клеток, или повышению соотношения PD-1-отрицательных иммунных эффекторных клеток (например, T-клеток или NK-клеток)/PD-1-положительных иммунных эффекторных клеток (например, T-клеток или NK-клеток).

В варианте осуществления низкая, усиливающая иммунитет доза ингибитора mTOR приводит к повышению количества наивных T-клеток. В варианте осуществления низкая, усиливающая иммунитет доза ингибитора mTOR приводит к одному или более из следующего:

повышению экспрессии одного или более из следующих маркеров: CD62L^high, CD127^high, CD27⁺ и BCL2, например, на T-клетках памяти, например, предшественниках T-клеток памяти;

снижению экспрессии KLRG1, например, на T-клетках памяти, например, предшественниках T-клеток памяти; и

повышению количества предшественников T-клеток памяти, например, клеток с любой из следующих характеристик или их комбинацией: повышенным CD62L^high, повышенным CD127^high, повышенным CD27⁺, сниженным KLRG1 и повышенным BCL2;

где любое из описываемых выше изменений происходит, например, по меньшей мере, транзиторно, например, по сравнению с неподвергнутым лечению индивидуумом.

Как применяют в настоящем описании, термин "рефрактерный" относится к заболеванию, например, злокачественному новообразованию, не отвечающему на лечение. В вариантах осуществления рефрактерное злокачественное новообразование может являться резистентным к лечению до лечения или в его начале. В других вариантах осуществления рефрактерное злокачественное новообразование может становиться резистентным в течение лечения. Рефрактерное злокачественное новообразование также называют резистентным злокачественным новообразованием.

Как применяют в настоящем описании, термины "рецидивирующий" или "рецидив" относится к повторному появлению заболевания (например, злокачественного новообразования) или признаков и симптомов заболевания, такого как злокачественное новообразование, после периода улучшения или отвечаемости, например, после предшествующего лечения, например, терапии злокачественного новообразования. Например, период отвечаемости может включать уровень злокачественных клеток ниже конкретного порогового значения, например, ниже 20%, 1%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1%. Повторное появление может включать уровень злокачественных клеток, повышающийся выше конкретного порогового значения, например, выше 20%, 1%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1%.

Диапазоны: на всем протяжении настоящего описания различные аспекты изобретения могут быть представлены в формате диапазона. Следует понимать, что описание в формате диапазона представлено исключительно для удобства и краткости, и его не следует истолковывать в качестве жесткого ограничения объема изобретения. Таким образом, описание диапазона следует считать конкретно описывающим все возможные поддиапазоны, а также отдельные числовые значения в этом диапазоне. Например, описание диапазона, такого как от 1 до 6, следует считать конкретно описывающим поддиапазоны, такие как от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 2 до 4, от 2 до 6, от 3 до 6 и т.д., а также отдельные числа в этом диапазоне, например, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 и 6. В качестве другого примера, диапазон, такой как 95-99% идентичности, включает что-либо с 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности, и включает поддиапазоны, такие как 96-99%, 96-98%, 96-97%, 97-99%, 97-98% и 98-99% идентичности. Это применимо независимо от широты диапазона.

Описание

Настоящее изобретение относится к композициям по настоящему изобретению и способам применения для лечения заболевания, такого как злокачественное новообразование, с использованием клеток, экспрессирующих химерные антигенные рецепторы (CAR) BCMA, например, CART-BCMA.

В одном из аспектов изобретение относится к ряду химерных антигенных рецепторов (CAR), содержащих антитело или фрагмент антитела, сконструированное для повышенного связывания с белком BCMA. В одном из аспектов изобретение относится к клетке (например, иммунной эффекторной клетке, например, T-клетке или NK-клетке), сконструированной для экспрессии CAR, где CAR T-клетка ("CART") или CAR NK-клетка проявляет противоопухолевые свойства. В одном из аспектов клетку трансформируют с использованием CAR, и CAR экспрессируется на поверхности клетки. В некоторых вариантах осуществления клетку (например, иммунную эффекторную клетку, например, T-клетку или NK-клетку) трансдуцируют с использованием вирусного вектора, кодирующего CAR. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор является ретровирусным вектором. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор является лентивирусными векторами. В некоторых таких вариантах осуществления клетка может стабильно экспрессировать CAR. В другом варианте осуществления клетку (например, иммунную эффекторную клетку, например, T-клетку или NK-клетку) трансфицируют с использованием нуклеиновой кислотой, например, мРНК, кДНК, ДНК, кодирующей CAR. В некоторых таких вариантах осуществления клетка может транзиторно экспрессировать CAR.

В одном из аспектов антигенсвязывающая часть CAR против BCMA является scFv-фрагментом антитела. В одном из аспектов такие фрагменты антител являются функциональными таким образом, что они сохраняют эквивалентную аффинность связывания, например, они связывают со сравнимой эффективностью тот же антиген, что и антитело IgG, из которого его получают. В других вариантах осуществления фрагмент антитела имеет более низкую аффинность связывания, например, он связывает тот же антиген с более низкой аффинностью связывания, чем антитело, из которого его получают, но он является функциональным таким образом, что он обеспечивает биологический ответ, представленный в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления молекула CAR содержит фрагмент антитела, имеющий аффинность связывания KD от 10^-4 M до 10^-8 M, например, от 10^-5 M до 10^-7 M, например, 10^-6 M или 10^-7 M, для антигена-мишени. В одном из вариантов осуществления фрагмент антитела имеет аффинность связывания, являющуюся по меньшей мере в пять раз, в 10 раз, в 20 раз, в 30 раз, в 50 раз, в 100 раз или в 1000 раз меньшую, чем у референсного антитела, например, антитела, представленного в настоящем описании.

В одном из аспектов такие фрагменты антител являются функциональными таким образом, что они обеспечивают биологический ответ, который может включать, в качестве неограничивающих примеров, активацию иммунного ответа, ингибирование источника передачи сигнала от антигена-мишени, ингибирование киназной активности и т.п., как будет понятно специалистам в этой области. В одном из аспектов антигенсвязывающий домен CAR против BCMA является scFv-фрагментом антитела, являющимся гуманизированным по сравнению с последовательностью scFv мыши, из которого его получают. В одном из вариантов осуществления антигенсвязывающий домен против BCMA является антигенсвязывающим доменом человека против BCMA. В одном из вариантов осуществления антигенсвязывающий домен против BCMA является гуманизированным антигенсвязывающим доменом против BCMA.

В некоторых аспектах антитела по изобретению встраивают с химерный антигенный рецептор (CAR). В одном из аспектов CAR содержит BCMA-связывающий домен, содержащий последовательность SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 265 или SEQ ID NO: 266. В одном из аспектов scFV-домены являются человеческими. В другом аспекте scFV-домены являются гуманизированными вариантами scFV-домена антител или фрагментов антител, описываемых в публикации PCT № WO2012/163805, патенте США № 7083785, патенте EP № 1975231 B1 или публикации PCT № WO13/154760 (содержание каждого из которых, таким образом, включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме), в которых описывают антитела или scFv-фрагменты мышиного происхождения, специфически связывающиеся с BCMA человека. Гуманизация этих антител и/или scFv мыши может являться желательной для клинических условий, где специфичные для мыши остатки могут индуцировать ответ человека против антигена мыши (HAMA) у пациентов, которым проводили лечение CART-BCMA, например, лечение с использованием иммунных эффекторных клеток, например, T-клеток или NK-клеток, трансдуцированных с использованием конструкции CAR против BCMA.

В одном из аспектов связывающий домен против BCMA, например, человеческий или гуманизированный scFv, часть CAR по изобретению кодируется трансгеном, последовательность которого кодон-оптимизирована для экспрессии в клетке млекопитающего. В одном из аспектов целая конструкция CAR по изобретению кодируется трансгеном, целая последовательность которого кодон-оптимизирована для экспрессии в клетке млекопитающего. Оптимизация кодонов относится к открытию того, что частота возникновения синонимичных кодонов (т.е. кодонов, кодирующих одну аминокислоту) в кодирующей ДНК различается у различных видов. Такая вырожденность кодонов позволяет идентичному полипептиду кодироваться множеством нуклеотидных последовательностей. В этой области известен ряд способов оптимизации кодонов, и они включают, например, способы, описываемые, по меньшей мере, в патентах США №№ 5786464 и 6114148.

В одном из аспектов связывающий домен человека против BCMA содержит scFv-часть, приведенную в SEQ ID NO: 39. В одном из аспектов CAR человека против BCMA содержит scFv-часть, приведенную в SEQ ID NO: 40. В одном из аспектов связывающий домен человека против BCMA содержит scFv-часть, приведенную в SEQ ID NO: 41. В одном из аспектов связывающий домен человека против BCMA содержит scFv-часть, приведенную в SEQ ID NO: 42. В одном из аспектов связывающий домен человека против BCMA содержит scFv-часть, приведенную в SEQ ID NO: 43. В одном из аспектов связывающий домен человека против BCMA содержит scFv-часть, приведенную в SEQ ID NO: 44. В одном из аспектов связывающий домен человека против BCMA содержит scFv-часть, приведенную в SEQ ID NO: 45. В одном из аспектов связывающий домен человека против BCMA содержит scFv-часть, приведенную в SEQ ID NO: 46. В одном из аспектов связывающий домен человека против BCMA содержит scFv-часть, приведенную в SEQ ID NO: 47. В одном из аспектов связывающий домен человека против BCMA содержит scFv-часть, приведенную в SEQ ID NO: 48. В одном из аспектов связывающий домен человека против BCMA содержит scFv-часть, приведенную в SEQ ID NO: 49. В одном из аспектов связывающий домен человека против BCMA содержит scFv-часть, приведенную в SEQ ID NO: 50. В одном из аспектов связывающий домен человека против BCMA содержит scFv-часть, приведенную в SEQ ID NO: 51. В одном из аспектов связывающий домен человека против BCMA содержит scFv-часть, приведенную в SEQ ID NO: 52. В одном из аспектов связывающий домен человека против BCMA содержит scFv-часть, приведенную в SEQ ID NO: 53. В одном из аспектов связывающий домен человека против BCMA содержит scFv-часть, приведенную в SEQ ID NO: 129. В одном из аспектов связывающий домен человека против BCMA содержит scFv-часть, приведенную в SEQ ID NO: 130. В одном из аспектов CAR человека против BCMA содержит scFv-часть, приведенную в SEQ ID NO: 131. В одном из аспектов связывающий домен человека против BCMA содержит scFv-часть, приведенную в SEQ ID NO: 132. В одном из аспектов связывающий домен человека против BCMA содержит scFv-часть, приведенную в SEQ ID NO: 133. В одном из аспектов связывающий домен человека против BCMA содержит scFv-часть, приведенную в SEQ ID NO: 134. В одном из аспектов связывающий домен человека против BCMA содержит scFv-часть, приведенную в SEQ ID NO: 135. В одном из аспектов связывающий домен человека против BCMA содержит scFv-часть, приведенную в SEQ ID NO: 136. В одном из аспектов связывающий домен человека против BCMA содержит scFv-часть, приведенную в SEQ ID NO: 137. В одном из аспектов связывающий домен человека против BCMA содержит scFv-часть, приведенную в SEQ ID NO: 138. В одном из аспектов связывающий домен человека против BCMA содержит scFv-часть, приведенную в SEQ ID NO: 139. В одном из аспектов связывающий домен человека против BCMA содержит scFv-часть, приведенную в SEQ ID NO: 140. В одном из аспектов связывающий домен человека против BCMA содержит scFv-часть, приведенную в SEQ ID NO: 141. В одном из аспектов CAR человека против BCMA содержит scFv-часть, приведенную в SEQ ID NO: 142. В одном из аспектов CAR человека против BCMA содержит scFv-часть, приведенную в SEQ ID NO: 143. В одном из аспектов CAR человека против BCMA содержит scFv-часть, приведенную в SEQ ID NO: 144. В одном из аспектов CAR человека против BCMA содержит scFv-часть, приведенную в SEQ ID NO: 145. В одном из аспектов CAR человека против BCMA содержит scFv-часть, приведенную в SEQ ID NO: 146. В одном из аспектов CAR человека против BCMA содержит scFv-часть, приведенную в SEQ ID NO: 147. В одном из аспектов CAR человека против BCMA содержит scFv-часть, приведенную в SEQ ID NO: 148. В одном из аспектов CAR человека против BCMA содержит scFv-часть, приведенную в SEQ ID NO: 149. В одном из аспектов гуманизированный связывающий домен против BCMA содержит scFv-часть, приведенную в SEQ ID NO: 255. В одном из аспектов гуманизированный CAR против BCMA содержит scFv-часть, приведенную в SEQ ID NO: 257.

В одном из аспектов CAR человека против BCMA содержит scFv-часть, приведенную в SEQ ID NO: 263. В одном из аспектов CAR человека против BCMA содержит scFv-часть, приведенную в SEQ ID NO: 264. В одном из аспектов CAR человека против BCMA содержит scFv-часть, приведенную в SEQ ID NO: 265. В одном из аспектов CAR человека против BCMA содержит scFv-часть, приведенную в SEQ ID NO: 266.

В одном из аспектов в CAR по изобретению комбинируют антигенсвязывающий домен конкретного антитела с внутриклеточной сигнальной молекулой. Например, в некоторых аспектах внутриклеточная сигнальная молекула включает, в качестве неограничивающих примеров, сигнальные модули дзета-цепи CD3, 4-1BB и CD28 и их комбинации. В одном из аспектов антигенсвязывающий домен связывается с BCMA. В одном из аспектов CAR BCMA содержит CAR, выбранный из последовательности, представленной в одной или более из SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 232 и SEQ ID NO: 233. В одном из аспектов CAR BCMA содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 99. В одном из аспектов CAR BCMA содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 100. В одном из аспектов CAR BCMA содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 101. В одном из аспектов CAR BCMA содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 102. В одном из аспектов CAR BCMA содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 103. В одном из аспектов CAR BCMA содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 104. В одном из аспектов CAR BCMA содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 105. В одном из аспектов CAR BCMA содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 106. В одном из аспектов CAR BCMA содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 107. В одном из аспектов CAR BCMA содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 108. В одном из аспектов CAR BCMA содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 109. В одном из аспектов CAR BCMA содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 110. В одном из аспектов CAR BCMA содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 111. В одном из аспектов CAR BCMA содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 112. В одном из аспектов CAR BCMA содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 213. В одном из аспектов CAR BCMA содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 214. В одном из аспектов CAR BCMA содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 215. В одном из аспектов CAR BCMA содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 216. В одном из аспектов CAR BCMA содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 217. В одном из аспектов CAR BCMA содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 218. В одном из аспектов CAR BCMA содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 219. В одном из аспектов CAR BCMA содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 220. В одном из аспектов CAR BCMA содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 221. В одном из аспектов CAR BCMA содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 222. В одном из аспектов CAR BCMA содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 223. В одном из аспектов CAR BCMA содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 224. В одном из аспектов CAR BCMA содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 225. В одном из аспектов CAR BCMA содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 226. В одном из аспектов CAR BCMA содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 227. В одном из аспектов CAR BCMA содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 228. В одном из аспектов CAR BCMA содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 229. В одном из аспектов CAR BCMA содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 230. В одном из аспектов CAR BCMA содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 231. В одном из аспектов CAR BCMA содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 232. В одном из аспектов CAR BCMA содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 233.

Кроме того, настоящее изобретение относится к композициям CAR BCMA и их применению в лекарственных веществах или способах лечения, среди прочих заболеваний, злокачественного новообразования или аутоиммунных заболеваний, включающих клетки или ткани, экспрессирующие BCMA.

В одном из аспектов CAR по изобретению можно использовать для эрадикации BCMA-экспрессирующих нормальных клеток, таким образом, он подходит для применения в качестве клеточного кондиционирования перед трансплантацией клеток. В одном из аспектов BCMA-экспрессирующая нормальная клетка является BCMA-экспрессирующей нормальной стволовой клеткой, и трансплантация клеток является трансплантацией стволовых клеток.

В одном из аспектов изобретение относится к клетке (например, T-клетке или NK-клетке), сконструированной для экспрессии химерного антигенного рецептора (CAR), где CAR T-клетка ("CART") или CAR NK-клетка проявляет противоопухолевые свойства. Предпочтительным антигеном является BCMA. В одном из аспектов антигенсвязывающий домен CAR содержит фрагмент антитела человека против BCMA или частично гуманизированный фрагмент антитела против BCMA. В одном из аспектов антигенсвязывающий домен CAR содержит фрагмент антитела человека против BCMA или частично гуманизированный фрагмент антитела против BCMA, содержащий scFv. Таким образом, изобретение относится к BCMA-CAR, содержащему гуманизированный связывающий домен против BCMA и сконструированному в клетке, например, T-клетке или NK-клетке, и способам их применения для адоптивной терапии.

В одном из аспектов BCMA-CAR содержит по меньшей мере один внутриклеточный домен, выбранный из группы сигнального домена CD137 (4-1BB), сигнального домена CD28, сигнального домена CD3 дзета и любой их комбинации. В одном из аспектов BCMA-CAR содержит по меньшей мере один внутриклеточный сигнальный домен из одной или более костимуляторных молекул, иных, чем CD137 (4-1BB) или CD28.

Химерный антигенный рецептор (CAR)

Настоящее изобретение относится к CAR (например, полипептиду CAR), содержащему связывающий домен против BCMA (например, человеческий или гуманизированный BCMA-связывающий домен, как представлено в настоящем описании), трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, и где указанный связывающий домен против BCMA содержит определяющую комплементарность область тяжелой цепи 1 (CDR1 HC), определяющую комплементарность область тяжелой цепи 2 (CDR2 HC) и определяющую комплементарность область тяжелой цепи 3 (CDR3 HC) из любых аминокислотных последовательностей связывающего домена тяжелой цепи против BMCA, представленных в таблице 1 или 16. Связывающий домен против BCMA CAR может дополнительно содержать определяющую комплементарность область легкой цепи 1 (CDR1 LC), определяющую комплементарность область легкой цепи 2 (CDR2 LC) и определяющую комплементарность область легкой цепи 3 (CDR3 LC) из любых аминокислотных последовательностей связывающего домена тяжелой цепи против BMCA, представленных в таблице 1 или 16.

Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим CAR, как представлено в настоящем описании, например, кодирующим CAR, содержащий связывающий домен против BCMA (например, человеческий или гуманизированный BCMA-связывающий домен, как представлено в настоящем описании), трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, и где указанный связывающий домен против BCMA содержит определяющую комплементарность область тяжелой цепи 1 (CDR1 HC), определяющую комплементарность область тяжелой цепи 2 (CDR2 HC) и определяющую комплементарность область тяжелой цепи 3 (CDR3 HC) из любых аминокислотных последовательностей связывающего домена тяжелой цепи против BMCA, представленных в таблице 1 или 16. В одном из вариантов осуществления кодируемый связывающий домен против BCMA CAR может дополнительно содержать определяющую комплементарность область легкой цепи 1 (CDR1 LC), определяющую комплементарность область легкой цепи 2 (CDR2 LC) и определяющую комплементарность область легкой цепи 3 (CDR3 LC) из любых аминокислотных последовательностей связывающего домена тяжелой цепи против BMCA, представленных в таблице 1 или 16.

В конкретных аспектах конструкция CAR по изобретению содержит scFV-домен, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 265, и SEQ ID NO: 266, где scFv может предшествовать необязательная лидерная последовательность, такая, как приведено в SEQ ID NO: 1, и после нее может следовать необязательная шарнирная последовательность, такая, как приведено в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5, трансмембранная область, такая, как приведено в SEQ ID NO: 6, внутриклеточный сигнальный домен, включающий SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 8, и последовательность CD3 дзета, включающую SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, где домены являются смежными и находятся в одной рамке считывания для образования единого слитого белка. В настоящее изобретение также включена нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид каждого из scFv-фрагментов, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 265 и SEQ ID NO: 266.

В настоящее изобретение также включена нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид каждого из scFv-фрагментов, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 265 и SEQ ID NO: 266, и каждый из доменов SEQ ID NO: 1, 2 и 6-9, и кодируемый слитый белок CAR BCMA по изобретению.

В одном из аспектов примеры конструкций BCMA CAR содержат необязательную лидерную последовательность, внеклеточный антигенсвязывающий домен, шарнирный, трансмембранный домен и внутриклеточный стимуляторный домен. В одном из аспектов пример конструкции CAR BCMA содержит необязательную лидерную последовательность, внеклеточный антигенсвязывающий домен, шарнирный, трансмембранный домен, внутриклеточный костимуляторный домен и внутриклеточный стимуляторный домен. Конкретные конструкции BCMA CAR, содержащие scFV-домены человека по изобретению, приведены как SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148 и SEQ ID NO: 149. Полноразмерные последовательности CAR также представлены в настоящем описании как SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148 и SEQ ID NO: 149, как представлено в таблице 1.

Пример лидерной последовательности приведен как SEQ ID NO: 1. Пример шарнирной/спейсерной последовательности приведен как SEQ ID NO: 2, или SEQ ID NO: 3, или SEQ ID NO: 4, или SEQ ID NO: 5. Пример последовательности трансмембранного домена приведен как SEQ ID NO: 6. Пример последовательности внутриклеточного сигнального домена белка 4-1BB приведен как SEQ ID NO: 7. Пример последовательности внутриклеточного сигнального домена CD27 приведен как SEQ ID NO: 8. Пример последовательности домена CD3 дзета приведен как SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к рекомбинантной конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR, где молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую связывающий домен против BCMA, например, представленный в настоящем описании, являющийся смежным и находящийся в той же рамке считывания, что и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внутриклеточный сигнальный домен. В одном из аспектов связывающий домен против BCMA выбран из одной или более из SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 169 и SEQ ID NO: 170. В одном из аспектов связывающий домен против BCMA содержит SEQ ID NO: 54.В одном из аспектов связывающий домен против BCMA содержит SEQ ID NO: 55. В одном из аспектов связывающий домен против BCMA содержит SEQ ID NO: 56. В одном из аспектов связывающий домен против BCMA содержит SEQ ID NO: 57. В одном из аспектов связывающий домен против BCMA содержит SEQ ID NO: 58. В одном из аспектов связывающий домен против BCMA содержит SEQ ID NO: 59. В одном из аспектов связывающий домен против BCMA содержит SEQ ID NO: 60. В одном из аспектов связывающий домен против BCMA содержит SEQ ID NO: 61. В одном из аспектов связывающий домен против BCMA содержит SEQ ID NO: 62. В одном из аспектов связывающий домен против BCMA содержит SEQ ID NO: 63. В одном из аспектов связывающий домен против BCMA содержит SEQ ID NO: 64. В одном из аспектов связывающий домен против BCMA содержит SEQ ID NO: 65. В одном из аспектов связывающий домен против BCMA содержит SEQ ID NO: 66. В одном из аспектов связывающий домен против BCMA содержит SEQ ID NO: 67. В одном из аспектов связывающий домен против BCMA содержит SEQ ID NO: 68. В одном из аспектов связывающий домен против BCMA содержит SEQ ID NO: 150. В одном из аспектов связывающий домен против BCMA содержит SEQ ID NO: 151. В одном из аспектов связывающий домен против BCMA содержит SEQ ID NO: 152. В одном из аспектов связывающий домен против BCMA содержит SEQ ID NO: 153. В одном из аспектов связывающий домен против BCMA содержит SEQ ID NO: 154. В одном из аспектов связывающий домен против BCMA содержит SEQ ID NO: 155. В одном из аспектов связывающий домен против BCMA содержит SEQ ID NO: 156. В одном из аспектов связывающий домен против BCMA содержит SEQ ID NO: 157. В одном из аспектов связывающий домен против BCMA содержит SEQ ID NO: 158. В одном из аспектов связывающий домен против BCMA содержит SEQ ID NO: 159. В одном из аспектов связывающий домен против BCMA содержит SEQ ID NO: 160. В одном из аспектов связывающий домен против BCMA содержит SEQ ID NO: 161. В одном из аспектов связывающий домен против BCMA содержит SEQ ID NO: 162. В одном из аспектов связывающий домен против BCMA содержит SEQ ID NO: 163. В одном из аспектов связывающий домен против BCMA содержит SEQ ID NO: 164. В одном из аспектов связывающий домен против BCMA содержит SEQ ID NO: 165. В одном из аспектов связывающий домен против BCMA содержит SEQ ID NO: 166. В одном из аспектов связывающий домен против BCMA содержит SEQ ID NO: 167. В одном из аспектов связывающий домен против BCMA содержит SEQ ID NO: 168. В одном из аспектов связывающий домен против BCMA содержит SEQ ID NO: 169. В одном из аспектов связывающий домен против BCMA содержит SEQ ID NO: 170.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к рекомбинантной конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR, где молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую связывающий домен против BCMA, выбранный из одного или более из SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 169 и SEQ ID NO: 170, например, где последовательность является смежной и находится в той же рамке считывания, что и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внутриклеточный сигнальный домен. Неограничивающий пример внутриклеточного сигнального домена, который можно использовать в CAR, включает один или более внутриклеточных сигнальных доменов, например, из CD3 дзета, CD28, 4-1BB и т.п. В некоторых случаях CAR может содержать любую комбинацию CD3 дзета, CD28, 4-1BB и т.п. В одном из аспектов последовательность нуклеиновой кислоты конструкции CAR по изобретению выбрана из одной или более из SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 236, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 252, SEQ ID NO: 253 или SEQ ID NO: 254. В одном из аспектов последовательность нуклеиновой кислоты конструкции CAR является SEQ ID NO: 114. В одном из аспектов последовательность нуклеиновой кислоты конструкции CAR является SEQ ID NO: 115. В одном из аспектов последовательность нуклеиновой кислоты конструкции CAR является SEQ ID NO: 116. В одном из аспектов последовательность нуклеиновой кислоты конструкции CAR является SEQ ID NO: 117. В одном из аспектов последовательность нуклеиновой кислоты конструкции CAR является SEQ ID NO: 118. В одном из аспектов последовательность нуклеиновой кислоты конструкции CAR является SEQ ID NO: 119. В одном из аспектов последовательность нуклеиновой кислоты конструкции CAR является SEQ ID NO: 120. В одном из аспектов последовательность нуклеиновой кислоты конструкции CAR является SEQ ID NO: 121. В одном из аспектов последовательность нуклеиновой кислоты конструкции CAR является SEQ ID NO: 122. В одном из аспектов последовательность нуклеиновой кислоты конструкции CAR является SEQ ID NO: 123. В одном из аспектов последовательность нуклеиновой кислоты конструкции CAR является SEQ ID NO: 124. В одном из аспектов последовательность нуклеиновой кислоты конструкции CAR является SEQ ID NO: 125. В одном из аспектов последовательность нуклеиновой кислоты конструкции CAR является SEQ ID NO: 126. В одном из аспектов последовательность нуклеиновой кислоты конструкции CAR является SEQ ID NO: 127. В одном из аспектов последовательность нуклеиновой кислоты конструкции CAR является SEQ ID NO: 128. В одном из аспектов последовательность нуклеиновой кислоты конструкции CAR является SEQ ID NO: 234. В одном из аспектов последовательность нуклеиновой кислоты конструкции CAR является SEQ ID NO: 235. В одном из аспектов последовательность нуклеиновой кислоты конструкции CAR является SEQ ID NO: 236. В одном из аспектов последовательность нуклеиновой кислоты конструкции CAR является SEQ ID NO: 237. В одном из аспектов последовательность нуклеиновой кислоты конструкции CAR является SEQ ID NO: 238. В одном из аспектов последовательность нуклеиновой кислоты конструкции CAR является SEQ ID NO: 239. В одном из аспектов последовательность нуклеиновой кислоты конструкции CAR является SEQ ID NO: 240. В одном из аспектов последовательность нуклеиновой кислоты конструкции CAR является SEQ ID NO: 241. В одном из аспектов последовательность нуклеиновой кислоты конструкции CAR является SEQ ID NO: 242. В одном из аспектов последовательность нуклеиновой кислоты конструкции CAR является SEQ ID NO: 243. В одном из аспектов последовательность нуклеиновой кислоты конструкции CAR является SEQ ID NO: 244. В одном из аспектов последовательность нуклеиновой кислоты конструкции CAR является SEQ ID NO: 245. В одном из аспектов последовательность нуклеиновой кислоты конструкции CAR является SEQ ID NO: 246. В одном из аспектов последовательность нуклеиновой кислоты конструкции CAR является SEQ ID NO: 247. В одном из аспектов последовательность нуклеиновой кислоты конструкции CAR является SEQ ID NO: 248. В одном из аспектов последовательность нуклеиновой кислоты конструкции CAR является SEQ ID NO: 249. В одном из аспектов последовательность нуклеиновой кислоты конструкции CAR является SEQ ID NO: 250. В одном из аспектов последовательность нуклеиновой кислоты конструкции CAR является SEQ ID NO: 251. В одном из аспектов последовательность нуклеиновой кислоты конструкции CAR является SEQ ID NO: 252. В одном из аспектов последовательность нуклеиновой кислоты конструкции CAR является SEQ ID NO: 253. В одном из аспектов последовательность нуклеиновой кислоты конструкции CAR является SEQ ID NO: 254.

Последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие желаемые молекулы, можно получать известными в этой области рекомбинантными способами, такими как, например, скрининг библиотек из клеток, экспрессирующих ген, получая ген из вектора, о котором известно, что он его включает, или выделяя его непосредственно из клеток и тканей, содержащих его, стандартными способами. Альтернативно, интересующую нуклеиновую кислоту можно получать синтетически, а не клонировать.

Настоящее изобретение относится к конструкциям ретровирусных и лентивирусных векторов, экспрессирующих CAR, которые можно напрямую трансдуцировать в клетку.

Настоящее изобретение также относится к конструкции РНК, которую можно напрямую трансфицировать в клетку. Способ получения мРНК для использования в трансфекции включает транскрипцию in vitro (IVT) матрицы с использованием специально сконструированных праймеров с последующим добавлением поли-A для получения конструкции, содержащей 3'- и 5'-нетранслируемую последовательность ("UTR"), 5'-кэп и/или внутренний участок связывания рибосомы (IRES), нуклеиновую кислоту, подлежащую экспрессии, и поли(A)-хвост, как правило, длиной 50-2000 оснований (SEQ ID NO: 35). Получаемую таким образом РНК можно эффективно трансфицировать в различные типы клеток. В одном из вариантов осуществления матрица включает последовательности CAR. В варианте осуществления вектор РНК CAR трансдуцируют в клетку, например, T-клетку или NK-клетку, посредством электропорации.

Антигенсвязывающий домен

CAR по настоящему изобретению содержат мишене-специфический связывающий домен. Выбор остатка зависит от типа и количества лигандов, определяющих поверхность клетки-мишени. Например, можно выбирать антигенсвязывающий домен, распознающий антиген, действующий в качестве поверхностного клеточного маркера на клетках-мишенях, ассоциированных с конкретным заболеванием.

В одном из аспектов CAR-опосредованный T-клеточный ответ можно направлять против интересующего антигена посредством конструирования антигенсвязывающего домена, специфически связывающегося с желаемым антигеном, в CAR.

В одном из аспектов CAR по настоящему изобретению содержит связывающий домен, специфически связывающийся с BCMA. В одном из аспектов CAR по настоящему изобретению содержит антигенсвязывающий домен, специфически связывающийся с BCMA человека.

Антигенсвязывающий домен может являться любым белком, связывающимся с антигеном, включая, в качестве неограничивающих примеров, моноклональное антитело, поликлональное антитело, рекомбинантное антитело, антитело человека, гуманизированное антитело и его функциональный фрагмент, включая, в качестве неограничивающих примеров, однодоменное антитело, такое как вариабельный домен тяжелой цепи (VH), вариабельный домен легкой цепи (VL) и вариабельный домен (VHH) нанотела верблюжьего происхождения, и альтернативный каркас, о котором в этой области известно, что он функционирует как антигенсвязывающий домен, такой как рекомбинантный фибронектиновый домен, и т.п. В некоторых случаях полезно получать антигенсвязывающий домен из того же вида, в котором CAR будут, в конечном итоге, использовать. Например, для применения у людей может быть полезным, чтобы антигенсвязывающий домен CAR содержал человеческие или гуманизированные остатки для антигенсвязывающего домена антитела или фрагмента антитела.

Таким образом, в одном из аспектов антигенсвязывающий домен содержит человеческое или гуманизированное антитело или фрагмент антитела. В одном из вариантов осуществления связывающий домен человека против BCMA содержит одну или более (например, все три) из определяющей комплементарность области легкой цепи 1 (CDR1 LC), определяющей комплементарность области легкой цепи 2 (CDR2 LC) и определяющей комплементарность области легкой цепи 3 (CDR3 LC) связывающего домена человека против BCMA, представленного в настоящем описании, и/или одну или более (например, все три) из определяющей комплементарность области тяжелой цепи 1 (CDR1 HC), определяющей комплементарность области тяжелой цепи 2 (CDR2 HC) и определяющей комплементарность области тяжелой цепи 3 (CDR3 HC) связывающего домена человека против BCMA, представленного в настоящем описании, например, связывающего домена человека против BCMA, содержащего одну или более, например, все три, CDR LC и одну или более, например, все три, CDR HC. В одном из вариантов осуществления связывающий домен человека против BCMA содержит одну или более (например, все три) из определяющей комплементарность области тяжелой цепи 1 (CDR1 HC), определяющей комплементарность области тяжелой цепи 2 (CDR2 HC) и определяющей комплементарность области тяжелой цепи 3 (CDR3 HC) связывающего домена человека против BCMA, представленного в настоящем описании, например, связывающий домен человека против BCMA содержит две вариабельные области тяжелой цепи, каждая из которых содержит CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC, представленные в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления связывающий домен человека против BCMA содержит вариабельную область легкой цепи человека, представленную в настоящем описании (например, в таблице 1), и/или вариабельную область тяжелой цепи человека, представленную в настоящем описании (например, в таблице 1). В одном из вариантов осуществления связывающий домен человека против BCMA содержит вариабельную область тяжелой цепи человека, представленную в настоящем описании (например, в таблице 1), например, по меньшей мере две вариабельные области тяжелой цепи человека, представленные в настоящем описании (например, в таблице 1). В одном из вариантов осуществления связывающий домен против BCMA является scFv, содержащим легкую цепь и тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью из таблицы 1. В варианте осуществления связывающий домен против BCMA (например, scFv) содержит: вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, представленной в таблице 1, или последовательности с 95-99% идентичности по отношению к аминокислотной последовательности из таблицы 11, и/или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, представленной в таблице 1, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к аминокислотной последовательности из таблицы 1.

В одном из вариантов осуществления связывающий домен человека против BCMA содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148 и SEQ ID NO: 149, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к ней. В одном из вариантов осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая связывающий домен человека против BCMA, содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 169 и SEQ ID NO: 170, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к ней. В одном из вариантов осуществления связывающий домен человека против BCMA является scFv, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в настоящем описании, например, в таблице 1, соединяют с вариабельной областью тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в настоящем описании, например, в таблице 1, с помощью линкера, например, линкера, представленного в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления связывающий домен человека против BCMA включает линкер (Gly₄-Ser)n, где n является 1, 2, 3, 4, 5 или 6, предпочтительно - 3 или 4 (SEQ ID NO: 26). Вариабельная область легкой цепи и вариабельная область тяжелой цепи scFv могут находиться, например, в любой из следующих ориентаций: вариабельная область легкой цепи-линкер-вариабельная область тяжелой цепи или вариабельная область тяжелой цепи-линкер-вариабельная область легкой цепи. В одном из аспектов часть антигенсвязывающего домена содержит одну или более последовательностей, выбранных из SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, и SEQ ID NO: 149. В одном из аспектов CAR выбран из одной или более последовательностей, выбранных из SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 232 и SEQ ID NO: 233.

В одном из вариантов осуществления связывающий домен против BCMA содержит вариабельную область легкой цепи, представленную в настоящем описании (например, в таблице 16), и/или вариабельную область тяжелой цепи, представленную в настоящем описании (например, в таблице 16). В одном из вариантов осуществления кодируемый гуманизированный связывающий домен против BCMA содержит вариабельную область легкой цепи, приведенную в SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 262, и/или вариабельную область тяжелой цепи, приведенную в SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 256, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 258. В одном из вариантов осуществления кодируемый связывающий домен против BCMA является scFv, содержащим легкую цепь и тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью из таблицы 16. В варианте осуществления человеческий или гуманизированный связывающий домен против BCMA (например, scFv) содержит: вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 262, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к ним, и/или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 256, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 258, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к ним. В одном из вариантов осуществления кодируемый связывающий домен против BCMA включает линкер (Gly4-Ser)n, где n является 1, 2, 3, 4, 5 или 6, предпочтительно - 3 или 4 (SEQ ID NO: 26). Вариабельная область легкой цепи и вариабельная область тяжелой цепи scFv могут находиться, например, в любой из следующих ориентаций: вариабельная область легкой цепи-линкер-вариабельная область тяжелой цепи или вариабельная область тяжелой цепи-линкер-вариабельная область легкой цепи.

В одном из вариантов осуществления связывающий домен человека против BCMA содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 265, и SEQ ID NO: 266, или последовательность с 95-99% идентичности по отношению к ним.

В некоторых аспектах не принадлежащее человеку антитело является гуманизированным, где конкретные последовательности или области антитела модифицируют для повышения сходства с антителом, в природе продуцирующимся у человека, или его фрагментом. В одном из аспектов антигенсвязывающий домен является гуманизированным.

Гуманизированное антитело можно получать с использованием ряда способов, известных в этой области, включая, в качестве неограничивающих примеров, пересадку CDR (см., например, европейский патент № EP 239400, международную публикацию № WO91/09967 и патенты США №№ 5225539, 5530101 и 5585089, каждый из которых включен в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме), рекомбинацию поверхностных остатков или изменение поверхностных остатков (см., например, европейские патенты №№ EP 592106 и EP 519596; Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering, 7(6):805-814 и Roguska et al., 1994, PNAS, 91:969-973, каждый из которых включен в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме), перестановку цепей (см., например, патент США № 5565332, включенный в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме) и способы, описываемые, например, в публикации патентной заявки США № US2005/0042664, публикации патентной заявки США № US2005/0048617, патенте США № 6407213, патенте США № 5766886, международной публикации № WO9317105, Tan et al., J. Immunol., 169:1119-25 (2002), Caldas et al., Protein Eng., 13(5):353-60 (2000), Morea et al., Methods, 20(3):267-79 (2000), Baca et al., J. Biol. Chem., 272(16):10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng., 9(10):895-904 (1996), Couto et al., Cancer Res., 55 (23 Supp):5973s-5977s (1995), Couto et al., Cancer Res., 55(8):1717-22 (1995), Sandhu J S, Gene, 150(2):409-10 (1994), и Pedersen et al., J. Mol. Biol., 235(3):959-73 (1994), каждый из которых включен в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Зачастую каркасные остатки в каркасных областях будут заменять соответствующим остатком из CDR-донорного антитела для изменения, например, улучшения, связывания антигена. Эти замены каркаса, например консервативные замены, идентифицируют способами, хорошо известными в этой области, например, посредством моделирования взаимодействий CDR и каркасных остатков для идентификации каркасных остатков, важных для связывания антигена, и сравнения последовательности для идентификации необычных каркасных остатков в конкретных положениях (см., например, Queen et al., патент США № 5585089 и Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323, включенные в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме).

Гуманизированное антитело или фрагмент антитела содержит один или более аминокислотных остатков, оставшихся в нем, из источника, не принадлежащего человеку. Эти не принадлежащие человеку аминокислотные остатки часто обозначают как "импортированные" остатки, как правило, взятые из "импортированного" вариабельного домена. Как представлено в настоящем описании, гуманизированные антитела или фрагменты антител содержат одну или более CDR из не принадлежащих человеку молекул иммуноглобулина и каркасные области, где аминокислотные остатки, содержащие каркас, получают полностью или в основном из зародышевой линии человека. В этой области хорошо известно множество способов гуманизации антител или фрагментов антител, и ее можно осуществлять, по существу, способом Winter и соавторов (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), посредством замены CDR грызуна или последовательностей CDR соответствующими последовательностями антитела человека, т.е. пересадки CDR (EP 239400, публикация PCT № WO91/09967 и патенты США №№ 4816567, 6331415, 5225539, 5530101, 5585089, 6548640, содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме). В таких гуманизированных антителах и фрагментах антител, по существу, менее чем интактный вариабельный домен человека заменяют соответствующей последовательностью не являющихся человеком видов. Гуманизированные антитела часто являются антителами человека, в которых некоторые остатки CDR и, возможно, некоторые каркасные (FR) остатки заменяют остатками из аналогичных участков в антителах грызуна. Гуманизацию антител и фрагментов антител также можно осуществлять посредством ремоделирования поверхностных остатков, или изменения поверхностных остатков (EP 592106, EP 519596; Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994) и Roguska et al., PNAS, 91:969-973 (1994)), или перестановки цепей (патент США № 5565332, содержание которого включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме).

Выбор вариабельных доменов человека и легких, и тяжелых цепей для использования в получении гуманизированных антител основан на снижении антигенности. В соответствии с так называемым способом "лучшего совпадения" последовательность вариабельного домена антитела грызуна подвергают скринингу относительно целой библиотеки известных последовательностей вариабельного домена человека. Затем последовательность человека, наиболее близкую к последовательности грызуна, принимают в качестве каркаса человека (FR) для гуманизированного антитела (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987), содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме). В другом способе используют конкретный каркас, полученный из консенсусной последовательности всех антител человека из конкретной подгруппы легких или тяжелых цепей. Тот же каркас можно использовать для нескольких других гуманизированных антител (см., например, Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997); Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993), содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме). В некоторых вариантах осуществления каркасную область, например, все четыре каркасные области, вариабельной области тяжелой цепи получают из последовательности зародышевой линии VH4_4-59. В одном из вариантов осуществления каркасная область может содержать одну, две, три, четыре или пять модификаций, например, замен, например, консервативных замен, например, аминокислоты в соответствующей последовательности мыши. В одном из вариантов осуществления каркасную область, например, все четыре каркасные области вариабельной области легкой цепи получают из последовательности зародышевой линии VK3_1.25. В одном из вариантов осуществления каркасная область может содержать одну, две, три, четыре или пять модификаций, например, замен, например, консервативных замен, например, аминокислот в соответствующей последовательности мыши.

В некоторых аспектах часть композиции CAR по изобретению, содержащей фрагмент антитела, является гуманизированной с сохранением высокой аффинности к антигену-мишени и других предпочтительных биологических свойств. По одному из аспектов изобретения гуманизированные антитела и фрагменты антител получают способом анализа родительских последовательностей и различных концептуальных гуманизированных продуктов с использованием трехмерных моделей родительских и гуманизированных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулинов широкодоступны и хорошо известны специалистам в этой области. Доступны компьютерные программы, иллюстрирующие и демонстрирующие возможные трехмерные конформационные структуры выбранных иммуноглобулиновых последовательностей-кандидатов. Изучение этих отображенных данных делает возможным анализ вероятной роли остатков в функционировании иммуноглобулиновой последовательности-кандидата, например, анализ остатков, влияющих на способность иммуноглобулина-кандидата связываться с антигеном-мишенью. Таким образом, остатки FR можно выбирать и комбинировать с последовательностями реципиента и импортированными последовательностями таким образом, что достигают желаемой характеристики антитела или фрагмента антитела, такой как повышенная аффинность к антигену-мишени. В основном, остатки CDR напрямую и наиболее существенно влияют на связывание антигена.

Гуманизированное антитело или фрагмент антитела может сохранять антигенную специфичность, схожую с исходным антителом, например, в настоящем изобретении способность связываться с BCMA человека. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело или фрагмент антитела может иметь улучшенную аффинность и/или специфичность связывания с BCMA человека.

В одном из вариантов осуществления гуманизированный связывающий домен CAR против BCMA содержит одну или более (например, все три) из определяющей комплементарность области легкой цепи 1 (CDR1 LC), определяющей комплементарность области легкой цепи 2 (CDR2 LC) и определяющей комплементарность области легкой цепи 3 (CDR3 LC) гуманизированного связывающего домена против BCMA, представленного в настоящем описании, и/или одну или более (например, все три) из определяющей комплементарность области тяжелой цепи 1 (CDR1 HC), определяющей комплементарность области тяжелой цепи 2 (CDR2 HC) и определяющей комплементарность области тяжелой цепи 3 (CDR3 HC) гуманизированного связывающего домена против BCMA, представленного в настоящем описании, например, гуманизированного связывающего домена против BCMA, содержащего одну или более, например, все три, CDR LC и одну или более, например, все три, CDR HC. В одном из вариантов осуществления гуманизированный связывающий домен против BCMA содержит одну или более (например, все три) из определяющей комплементарность области тяжелой цепи 1 (CDR1 HC), определяющей комплементарность области тяжелой цепи 2 (CDR2 HC) и определяющей комплементарность области тяжелой цепи 3 (CDR3 HC) гуманизированного связывающего домена против BCMA, представленного в настоящем описании, например, гуманизированный связывающий домен против BCMA содержит две вариабельные области тяжелой цепи, каждая из которых содержит CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC, представленные в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления гуманизированный связывающий домен против BCMA содержит гуманизированную вариабельную область легкой цепи, представленную в настоящем описании (например, SEQ ID NO: 255 или 257), и/или вариабельную область тяжелой цепи человека, представленную в настоящем описании (например, SEQ ID NO: 255 или 257).

В одном из аспектов связывающий домен против BCMA отличается конкретными функциональными признаками или свойствами антитела или фрагмента антитела. Например, в одном из аспектов часть композиции CAR по изобретению, содержащей антигенсвязывающий домен, специфически связывается с BCMA человека.

В одном из аспектов антигенсвязывающий домен имеет ту же или схожую специфичность связывания с BCMA человека, что и с BCMA мыши. В одном из аспектов изобретение относится к антигенсвязывающему домену, содержащему антитело или фрагмент антитела, где связывающий домен антитела специфически связывается с белком BCMA или его фрагментом, где антитело или фрагмент антитела содержит вариабельную область легкой цепи и/или вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148 или SEQ ID NO: 149. В одном из аспектов антигенсвязывающий домен содержит аминокислотную последовательность scFv, выбранную из SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148 или SEQ ID NO: 149. В определенных аспектах scFv является смежным и находится в той же рамке считывания, что и лидерная последовательность. В одном из аспектов лидерная последовательность является полипептидной последовательностью, приведенной как SEQ ID NO: 1.

В одном из аспектов связывающий домен против BCMA является фрагментом, например, одноцепочечным вариабельным фрагментом (scFv). В одном из аспектов связывающий домен против BCMA является Fv, Fab, (Fab')2 или бифункциональным (например, биспецифическим) гибридным антителом (например, Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)). В одном из аспектов антитела и их фрагменты по изобретению связываются с белком BCMA с аффинностью антитела дикого типа или повышенной аффинностью.

В некоторых случаях scFv можно получать известным в этой области способом (см., например, Bird et al., (1988) Science 242:423-426 и Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Молекулы scFv можно получать, связывая области VH и VL с использованием гибких полипептидных линкеров. Молекулы scFv содержат линкер (например, линкер Ser-Gly) с оптимизированной длиной и/или аминокислотной композицией. Длина линкера может значительно влиять на то, как сворачиваются и взаимодействуют вариабельные области scFv. Фактически, при использовании короткого полипептидного линкера (например, 5-10 аминокислот) предотвращают внутрицепочечный фолдинг. Межцепочечный фолдинг также необходим для удержания двух вариабельных областей вместе для образования функционального эпитоп-связывающего участка. Примеры ориентации и размера линкера см., например, в Hollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448, публикациях патентных заявок США №№ 2005/0100543, 2005/0175606, 2007/0014794 и публикациях PCT №№ WO2006/020258 и WO2007/024715, включенных в настоящее описание в качестве ссылок.

ScFv может содержать линкер из по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более аминокислотных остатков между его областями VL и VH. Последовательность линкера может содержать любую природную аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления последовательность линкера содержит аминокислоты глицин и серин. В другом варианте осуществления последовательность линкера содержит наборы глициновых и сериновых повторов, такие как (Gly₄Ser)n, где n является положительным целым числом, равным 1 или более 1 (SEQ ID NO: 25). В одном из вариантов осуществления линкер может являться (Gly₄Ser)₄ (SEQ ID NO: 27) или (Gly₄Ser)₃(SEQ ID NO: 28). Изменение длины линкера может приводить к сохранению или повышению активности, приводя к превосходящей эффективности в исследованиях активности.

Примеры конструкций BCMA CAR человека и антигенсвязывающих доменов

Примеры конструкций BCMA CAR, представленные в настоящем описании, содержат scFv (например, scFv описываемый в таблицах 1 или 16, которому, необязательно, предшествует необязательная лидерная последовательность (например, SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 12 в качестве примера лидерных аминокислотных и нуклеотидных последовательностей, соответственно). Последовательности scFv-фрагментов (SEQ ID NO: 39-53, 129-149 или 263-266, не включая необязательную лидерную последовательность) представлены в настоящем описании в таблицах 1 или 16. Конструкция CAR BCMA может дополнительно включать необязательный шарнирный домен, например, шарнирный домен CD8 (например, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 или кодируемый последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 13), трансмембранный домен, например, трансмембранный домен CD8 (например, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 или кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 17), внутриклеточный домен, например, внутриклеточный домен 4-1BB (например, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 или кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 18), и функциональный сигнальный домен, например, домен CD3 дзета (например, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или 10 или кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 20 или 21). В определенных вариантах осуществления домены являются смежными и находятся в одной рамке считывания для образования единого слитого белка. В других вариантах осуществления домены находятся в отдельных полипептидах, например, как в молекуле RCAR, как представлено в настоящем описании.

В определенных вариантах осуществления полноразмерная молекула CAR BCMA включает аминокислотную последовательность или кодируется нуклеотидной последовательностью BCMA-1, BCMA-2, BCMA-3, BCMA-4, BCMA-5, BCMA-6, BCMA-7, BCMA-8, BCMA-9, BCMA-10, BCMA-11, BCMA-12, BCMA-13, BCMA-14, BCMA-15, 149362, 149363, 149364, 149365, 149366, 149367, 149368, 149369, BCMA_EBB-C1978-A4, BCMA_EBB-C1978-G1, BCMA_EBB-C1979-C1, BCMA_EBB-C1978-C7, BCMA_EBB-C1978-D10, BCMA_EBB-C1979-C12, BCMA_EBB-C1980-G4, BCMA_EBB-C1980-D2, BCMA_EBB-C1978-A10, BCMA_EBB-C1978-D4, BCMA_EBB-C1980-A2, BCMA_EBB-C1981-C3, BCMA_EBB-C1978-G4, A7D12.2, C11D5.3, C12A3.2 или C13F12.1, представленными в таблице 1 или 16, или последовательностью, по существу, (например, на 95-99%) идентичной ей.

В определенных вариантах осуществления молекула CAR BCMA или антигенсвязывающий домен против BCMA включает аминокислотную последовательность scFv BCMA-1, BCMA-2, BCMA-3, BCMA-4, BCMA-5, BCMA-6, BCMA-7, BCMA-8, BCMA-9, BCMA-10, BCMA-11, BCMA-12, BCMA-13, BCMA-14, BCMA-15, 149362, 149363, 149364, 149365, 149366, 149367, 149368, 149369, BCMA_EBB-C1978-A4, BCMA_EBB-C1978-G1, BCMA_EBB-C1979-C1, BCMA_EBB-C1978-C7, BCMA_EBB-C1978-D10, BCMA_EBB-C1979-C12, BCMA_EBB-C1980-G4, BCMA_EBB-C1980-D2, BCMA_EBB-C1978-A10, BCMA_EBB-C1978-D4, BCMA_EBB-C1980-A2, BCMA_EBB-C1981-C3, BCMA_EBB-C1978-G4, A7D12.2, C11D5.3, C12A3.2 или C13F12.1, представленную в таблице 1 или 16 (с лидерной последовательностью или без нее), или последовательность, по существу, идентичную (например, на 95-99% идентичную или с до 20, 15, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 заменой аминокислоты, например, заменами (например, консервативными заменами)) любой из указанных выше последовательностей.

В определенных вариантах осуществления молекула CAR BCMA или антигенсвязывающий домен против BCMA включает вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи BCMA-1, BCMA-2, BCMA-3, BCMA-4, BCMA-5, BCMA-6, BCMA-7, BCMA-8, BCMA-9, BCMA-10, BCMA-11, BCMA-12, BCMA-13, BCMA-14, BCMA-15, 149362, 149363, 149364, 149365, 149366, 149367, 149368, 149369, BCMA_EBB-C1978-A4, BCMA_EBB-C1978-G1, BCMA_EBB-C1979-C1, BCMA_EBB-C1978-C7, BCMA_EBB-C1978-D10, BCMA_EBB-C1979-C12, BCMA_EBB-C1980-G4, BCMA_EBB-C1980-D2, BCMA_EBB-C1978-A10, BCMA_EBB-C1978-D4, BCMA_EBB-C1980-A2, BCMA_EBB-C1981-C3, BCMA_EBB-C1978-G4, A7D12.2, C11D5.3, C12A3.2 или C13F12.1, представленную в таблице 1 или 16, или последовательность, по существу, идентичную (например, на 95-99% идентичную или с до 20, 15, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 заменой аминокислоты, например, заменами (например, консервативными заменами)) любой из указанных выше последовательностей.

В определенных вариантах осуществления молекула CAR BCMA или антигенсвязывающий домен против BCMA включает одну, две или три CDR из вариабельной области тяжелой цепи (например, HCDR1, HCDR2 и/или HCDR3), представленной в таблице 20, и/или одну, две или три CDR из вариабельной области легкой цепи (например, LCDR1, LCDR2 и/или LCDR3) BCMA-1, BCMA-2, BCMA-3, BCMA-4, BCMA-5, BCMA-6, BCMA-7, BCMA-8, BCMA-9, BCMA-10, BCMA-11, BCMA-12, BCMA-13, BCMA-14, BCMA-15, 149362, 149363, 149364, 149365, 149366, 149367, 149368, 149369, BCMA_EBB-C1978-A4, BCMA_EBB-C1978-G1, BCMA_EBB-C1979-C1, BCMA_EBB-C1978-C7, BCMA_EBB-C1978-D10, BCMA_EBB-C1979-C12, BCMA_EBB-C1980-G4, BCMA_EBB-C1980-D2, BCMA_EBB-C1978-A10, BCMA_EBB-C1978-D4, BCMA_EBB-C1980-A2, BCMA_EBB-C1981-C3, BCMA_EBB-C1978-G4, A7D12.2, C11D5.3, C12A3.2 или C13F12.1, представленной в таблице 21, или последовательность, по существу, идентичную (например, на 95-99% идентичную или с до 20, 15, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 заменой аминокислоты, например, заменами (например, консервативными заменами)) любой из указанных выше последовательностей.

В определенных вариантах осуществления молекула CAR BCMA или антигенсвязывающий домен против BCMA включает одну, две или три CDR из вариабельной области тяжелой цепи (например, HCDR1, HCDR2 и/или HCDR3), представленной в таблице 22, и/или одну, две или три CDR из вариабельной области легкой цепи (например, LCDR1, LCDR2 и/или LCDR3) BCMA-1, BCMA-2, BCMA-3, BCMA-4, BCMA-5, BCMA-6, BCMA-7, BCMA-8, BCMA-9, BCMA-10, BCMA-11, BCMA-12, BCMA-13, BCMA-14, BCMA-15, 149362, 149363, 149364, 149365, 149366, 149367, 149368, 149369, BCMA_EBB-C1978-A4, BCMA_EBB-C1978-G1, BCMA_EBB-C1979-C1, BCMA_EBB-C1978-C7, BCMA_EBB-C1978-D10, BCMA_EBB-C1979-C12, BCMA_EBB-C1980-G4, BCMA_EBB-C1980-D2, BCMA_EBB-C1978-A10, BCMA_EBB-C1978-D4, BCMA_EBB-C1980-A2, BCMA_EBB-C1981-C3, BCMA_EBB-C1978-G4, A7D12.2, C11D5.3, C12A3.2 или C13F12.1, представленной в таблице 23, или последовательность, по существу, идентичную (например, на 95-99% идентичную или с до 20, 15, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 заменой аминокислоты, например, заменами (например, консервативными заменами)) любой из указанных выше последовательностей.

В определенных вариантах осуществления молекула CAR BCMA или антигенсвязывающий домен против BCMA включает одну, две или три CDR из вариабельной области тяжелой цепи (например, HCDR1, HCDR2 и/или HCDR3), представленной в таблице 24, и/или одну, две или три CDR из вариабельной области легкой цепи (например, LCDR1, LCDR2 и/или LCDR3) BCMA-1, BCMA-2, BCMA-3, BCMA-4, BCMA-5, BCMA-6, BCMA-7, BCMA-8, BCMA-9, BCMA-10, BCMA-11, BCMA-12, BCMA-13, BCMA-14, BCMA-15, 149362, 149363, 149364, 149365, 149366, 149367, 149368, 149369, BCMA_EBB-C1978-A4, BCMA_EBB-C1978-G1, BCMA_EBB-C1979-C1, BCMA_EBB-C1978-C7, BCMA_EBB-C1978-D10, BCMA_EBB-C1979-C12, BCMA_EBB-C1980-G4, BCMA_EBB-C1980-D2, BCMA_EBB-C1978-A10, BCMA_EBB-C1978-D4, BCMA_EBB-C1980-A2, BCMA_EBB-C1981-C3, BCMA_EBB-C1978-G4, A7D12.2, C11D5.3, C12A3.2 или C13F12.1, представленной в таблице 25, или последовательность, по существу, идентичную (например, на 95-99% идентичную или с до 20, 15, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 заменой аминокислоты, например, заменами (например, консервативными заменами)) любой из указанных выше последовательностей.

Последовательности CDR человека scFV-доменов представлены в таблицах 20, 22 и 24 в случае вариабельных доменов тяжелой цепи и в таблицах 21, 23 и 25 в случае вариабельных доменов легких цепей. "ID" означает соответствующую SEQ ID NO для каждой CDR.

Таблица 20: CDR вариабельного домена тяжелой цепи в соответствии со схемой нумерации по Kabat (Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD)

Кандидат HCDR1 ID HCDR2 ID HCDR3 ID 139109 NHGMS 394 GIVYSGSTYYAASVKG 434 HGGESDV 474 139103 NYAMS 384 GISRSGENTYYADSVKG 424 SPAHYYGGMDV 464 139105 DYAMH 385 GISWNSGSIGYADSVKG 425 HSFLAY 465 139111 NHGMS 386 GIVYSGSTYYAASVKG 426 HGGESDV 466 139100 NFGIN 387 WINPKNNNTNYAQKFQG 427 GPYYYQSYMDV 467 139101 SDAMT 388 VISGSGGTTYYADSVKG 428 LDSSGYYYARGPRY 468 139102 NYGIT 389 WISAYNGNTNYAQKFQG 429 GPYYYYMDV 469 139104 NHGMS 390 GIVYSGSTYYAASVKG 430 HGGESDV 470 139106 NHGMS 391 GIVYSGSTYYAASVKG 431 HGGESDV 471 139107 NHGMS 392 GIVYSGSTYYAASVKG 432 HGGESDV 472 139108 DYYMS 393 YISSSGSTIYYADSVKG 433 ESGDGMDV 473 139110 DYYMS 395 YISSSGNTIYYADSVKG 435 STMVREDY 475 139112 NHGMS 396 GIVYSGSTYYAASVKG 436 HGGESDV 476 139113 NHGMS 397 GIVYSGSTYYAASVKG 437 HGGESDV 477 139114 NHGMS 398 GIVYSGSTYYAASVKG 438 HGGESDV 478 149362 SSYYYWG 399 SIYYSGSAYYNPSLKS 439 HWQEWPDAFDI 479 149363 TSGMCVS 400 RIDWDEDKFYSTSLKT 440 SGAGGTSATAFDI 480 149364 SYSMN 401 SISSSSSYIYYADSVKG 441 TIAAVYAFDI 481 149365 DYYMS 402 YISSSGSTIYYADSVKG 442 DLRGAFDI 482 149366 SHYIH 403 MINPSGGVTAYSQTLQG 443 EGSGSGWYFDF 483 149367 SGGYYWS 404 YIYYSGSTYYNPSLKS 444 AGIAARLRGAFDI 484 149368 SYAIS 405 GIIPIFGTANYAQKFQG 445 RGGYQLLRWDVGLLRSAFDI 485 149369 SNSAAWN 406 RTYYRSKWYSFYAISLKS 446 SSPEGLFLYWFDP 486 BCMA_EBB-C1978-A4 SYAMS 407 AISGSGGSTYYADSVKG 447 VEGSGSLDY 487 BCMA_EBB-C1978-G1 RYPMS 408 GISDSGVSTYYADSAKG 448 RAGSEASDI 488 BCMA_EBB-C1979-C1 SYAMS 409 AISGSGGSTYYADSVKG 449 ATYKRELRYYYGMDV 489 BCMA_EBB-C1978-C7 SYAMS 410 AISGSGGSTYYADSVKG 450 ATYKRELRYYYGMDV 490 BCMA_EBB-C1978-D10 DYAMH 411 GISWNSGSIGYADSVKG 451 VGKAVPDV 491 BCMA_EBB-C1979-C12 DYAMH 412 SINWKGNSLAYGDSVKG 452 HQGVAYYNYAMDV 492 BCMA_EBB-C1980-G4 SYAMS 413 AISGSGGSTYYADSVKG 453 VVRDGMDV 493 BCMA_EBB-C1980-D2 SYAMS 414 AISGSGGSTYYADSVKG 454 IPQTGTFDY 494 BCMA_EBB-C1978-A10 SYAMS 415 AISGSGGSTYYADSVKG 455 ANYKRELRYYYGMDV 495 BCMA_EBB-C1978-D4 SYAMS 416 AISGSGGSTYYADSVKG 456 ALVGATGAFDI 496 BCMA_EBB-C1980-A2 SYAMS 417 AISGSGGSTYYADSVKG 457 WFGEGFDP 497 BCMA_EBB-C1981-C3 SYAMS 418 AISGSGGSTYYADSVKG 458 VGYDSSGYYRDYYGMDV 498 BCMA_EBB-C1978-G4 SYAMS 419 AISGSGGSTYYADSVKG 459 MGWSSGYLGAFDI 499 A7D12.2 NFGMN 420 WINTYTGESYFADDFKG 460 GEIYYGYDGGFAY 500 C11D5.3 DYSIN 421 WINTETREPAYAYDFRG 461 DYSYAMDY 501 C12A3.2 HYSMN 422 RINTESGVPIYADDFKG 462 DYLYSLDF 502 C13F12.1 HYSMN 423 RINTETGEPLYADDFKG 463 DYLYSCDY 503

Таблица 21: CDR вариабельного домена легкой цепи в соответствии со схемой нумерации по Kabat (Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD)

Кандидат LCDR1 ID LCDR2 ID LCDR3 ID 139109 RASQSISSYLN 514 AASSLQS 554 QQSYSTPYT 594 139103 RASQSISSSFLA 504 GASRRAT 544 QQYHSSPSWT 584 139105 RSSQSLLHSNGYNYLD 505 LGSNRAS 545 MQALQTPYT 585 139111 KSSQSLLRNDGKTPLY 506 EVSNRFS 546 MQNIQFPS 586 139100 RSSQSLLHSNGYNYLN 507 LGSKRAS 547 MQALQTPYT 587 139101 RASQSISSYLN 508 GASTLAS 548 QQSYKRAS 588 139102 RSSQSLLYSNGYNYVD 509 LGSNRAS 549 MQGRQFPYS 589 139104 RASQSVSSNLA 510 GASTRAS 550 QQYGSSLT 590 139106 RASQSVSSKLA 511 GASIRAT 551 QQYGSSSWT 591 139107 RASQSVGSTNLA 512 DASNRAT 552 QQYGSSPPWT 592 139108 RASQSISSYLN 513 AASSLQS 553 QQSYTLA 593 139110 KSSESLVHNSGKTYLN 515 EVSNRDS 555 MQGTHWPGT 595 139112 QASEDINKFLN 516 DASTLQT 556 QQYESLPLT 596 139113 RASQSVGSNLA 517 GASTRAT 557 QQYNDWLPVT 597 139114 RASQSIGSSSLA 518 GASSRAS 558 QQYAGSPPFT 598 149362 KASQDIDDAMN 519 SATSPVP 559 LQHDNFPLT 599 149363 RASQDIYNNLA 520 AANKSQS 560 QHYYRFPYS 600 149364 RSSQSLLHSNGYNYLD 521 LGSNRAS 561 MQALQTPYT 601 149365 GGNNIGTKSVH 522 DDSVRPS 562 QVWDSDSEHVV 602 149366 SGDGLSKKYVS 523 RDKERPS 563 QAWDDTTVV 603 149367 RASQGIRNWLA 524 AASNLQS 564 QKYNSAPFT 604 149368 GGNNIGSKSVH 525 GKNNRPS 565 SSRDSSGDHLRV 605 149369 QGDSLGNYYAT 526 GTNNRPS 566 NSRDSSGHHLL 606 BCMA_EBB-C1978-A4 RASQSVSSAYLA 527 GASTRAT 567 QHYGSSFNGSSLFT 607 BCMA_EBB-C1978-G1 RASQSVSNSLA 528 DASSRAT 568 QQFGTSSGLT 608 BCMA_EBB-C1979-C1 RASQSVSSSFLA 529 GASSRAT 569 QQYHSSPSWT 609 BCMA_EBB-C1978-C7 RASQSVSTTFLA 530 GSSNRAT 570 QQYHSSPSWT 610 BCMA_EBB-C1978-D10 RASQSISSYLN 531 AASSLQS 571 QQSYSTPYS 611 BCMA_EBB-C1979-C12 RATQSIGSSFLA 532 GASQRAT 572 QHYESSPSWT 612 BCMA_EBB-C1980-G4 RASQSVSSSYLA 533 GASSRAT 573 QQYGSPPRFT 613 BCMA_EBB-C1980-D2 RASQSVSSSYLA 534 GASSRAT 574 QHYGSSPSWT 614 BCMA_EBB-C1978-A10 RASQRVASNYLA 535 GASSRAT 575 QHYDSSPSWT 615 BCMA_EBB-C1978-D4 RASQSLSSNFLA 536 GASNWAT 576 QYYGTSPMYT 616 BCMA_EBB-C1980-A2 RSSQSLLHSNGYNYLD 537 LGSNRAS 577 MQALQTPLT 617 BCMA_EBB-C1981-C3 RASQSVSSSYLA 538 GTSSRAT 578 QHYGNSPPKFT 618 BCMA_EBB-C1978-G4 RASQSVASSFLA 539 GASGRAT 579 QHYGGSPRLT 619 A7D12.2 RASQDVNTAVS 540 SASYRYT 580 QQHYSTPWT 620 C11D5.3 RASESVSVIGAHLIH 541 LASNLET 581 LQSRIFPRT 621 C12A3.2 RASESVTILGSHLIY 542 LASNVQT 582 LQSRTIPRT 622 C13F12.1 RASESVTILGSHLIY 543 LASNVQT 583 LQSRTIPRT 623

Таблица 22: CDR вариабельного домена тяжелой цепи в соответствии со схемой нумерации по Chothia (Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273, 927-948)

Кандидат HCDR1 ID HCDR2 ID HCDR3 ID 139109 GFALSNH 634 VYSGS 674 HGGESDV 714 139103 GFTFSNY 624 SRSGEN 664 SPAHYYGGMDV 704 139105 GFTFDDY 625 SWNSGS 665 HSFLAY 705 139111 GFALSNH 626 VYSGS 666 HGGESDV 706 139100 GYIFDNF 627 NPKNNN 667 GPYYYQSYMDV 707 139101 GFTFSSD 628 SGSGGT 668 LDSSGYYYARGPRY 708 139102 GYTFSNY 629 SAYNGN 669 GPYYYYMDV 709 139104 GFALSNH 630 VYSGS 670 HGGESDV 710 139106 GFALSNH 631 VYSGS 671 HGGESDV 711 139107 GFALSNH 632 VYSGS 672 HGGESDV 712 139108 GFTFSDY 633 SSSGST 673 ESGDGMDV 713 139110 GFTFSDY 635 SSSGNT 675 STMVREDY 715 139112 GFALSNH 636 VYSGS 676 HGGESDV 716 139113 GFALSNH 637 VYSGS 677 HGGESDV 717 139114 GFALSNH 638 VYSGS 678 HGGESDV 718 149362 GGSISSSYY 639 YYSGS 679 HWQEWPDAFDI 719 149363 GFSLRTSGM 640 DWDED 680 SGAGGTSATAFDI 720 149364 GFTFSSY 641 SSSSSY 681 TIAAVYAFDI 721 149365 GFTFSDY 642 SSSGST 682 DLRGAFDI 722 149366 GYTVTSH 643 NPSGGV 683 EGSGSGWYFDF 723 149367 GGSISSGGY 644 YYSGS 684 AGIAARLRGAFDI 724 149368 GGTFSSY 645 IPIFGT 685 RGGYQLLRWDVGLLRSAFDI 725 149369 GDSVSSNSA 646 YYRSKWY 686 SSPEGLFLYWFDP 726 BCMA_EBB-C1978-A4 GFTFSSY 647 SGSGGS 687 VEGSGSLDY 727 BCMA_EBB-C1978-G1 GITFSRY 648 SDSGVS 688 RAGSEASDI 728 BCMA_EBB-C1979-C1 GFTFSSY 649 SGSGGS 689 ATYKRELRYYYGMDV 729 BCMA_EBB-C1978-C7 GFTFSSY 650 SGSGGS 690 ATYKRELRYYYGMDV 730 BCMA_EBB-C1978-D10 GFTFDDY 651 SWNSGS 691 VGKAVPDV 731 BCMA_EBB-C1979-C12 GFTFDDY 652 NWKGNS 692 HQGVAYYNYAMDV 732 BCMA_EBB-C1980-G4 GFTFSSY 653 SGSGGS 693 VVRDGMDV 733 BCMA_EBB-C1980-D2 GFTFSSY 654 SGSGGS 694 IPQTGTFDY 734 BCMA_EBB-C1978-A10 GFTFSSY 655 SGSGGS 695 ANYKRELRYYYGMDV 735 BCMA_EBB-C1978-D4 GFSFSSY 656 SGSGGS 696 ALVGATGAFDI 736 BCMA_EBB-C1980-A2 GFTFSSY 657 SGSGGS 697 WFGEGFDP 737 BCMA_EBB-C1981-C3 GFTFSSY 658 SGSGGS 698 VGYDSSGYYRDYYGMDV 738 BCMA_EBB-C1978-G4 GFTFSSY 659 SGSGGS 699 MGWSSGYLGAFDI 739 A7D12.2 GYTFTNF 660 NTYTGE 700 GEIYYGYDGGFAY 740 C11D5.3 GYTFTDY 661 NTETRE 701 DYSYAMDY 741 C12A3.2 GYTFRHY 662 NTESGV 702 DYLYSLDF 742 C13F12.1 GYTFTHY 663 NTETGE 703 DYLYSCDY 743

Таблица 23: CDR вариабельного домена легкой цепи в соответствии со схемой нумерации по Chothia (Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273, 927-948)

Кандидат LCDR1 ID LCDR2 ID LCDR3 ID 139109 SQSISSY 754 AAS 794 SYSTPY 834 139103 SQSISSSF 744 GAS 784 YHSSPSW 824 139105 SQSLLHSNGYNY 745 LGS 785 ALQTPY 825 139111 SQSLLRNDGKTP 746 EVS 786 NIQFP 826 139100 SQSLLHSNGYNY 747 LGS 787 ALQTPY 827 139101 SQSISSY 748 GAS 788 SYKRA 828 139102 SQSLLYSNGYNY 749 LGS 789 GRQFPY 829 139104 SQSVSSN 750 GAS 790 YGSSL 830 139106 SQSVSSK 751 GAS 791 YGSSSW 831 139107 SQSVGSTN 752 DAS 792 YGSSPPW 832 139108 SQSISSY 753 AAS 793 SYTL 833 139110 SESLVHNSGKTY 755 EVS 795 GTHWPG 835 139112 SEDINKF 756 DAS 796 YESLPL 836 139113 SQSVGSN 757 GAS 797 YNDWLPV 837 139114 SQSIGSSS 758 GAS 798 YAGSPPF 838 149362 SQDIDDA 759 SAT 799 HDNFPL 839 149363 SQDIYNN 760 AAN 800 YYRFPY 840 149364 SQSLLHSNGYNY 761 LGS 801 ALQTPY 841 149365 NNIGTKS 762 DDS 802 WDSDSEHV 842 149366 DGLSKKY 763 RDK 803 WDDTTV 843 149367 SQGIRNW 764 AAS 804 YNSAPF 844 149368 NNIGSKS 765 GKN 805 RDSSGDHLR 845 149369 DSLGNYY 766 GTN 806 RDSSGHHL 846 BCMA_EBB-C1978-A4 SQSVSSAY 767 GAS 807 YGSSFNGSSLF 847 BCMA_EBB-C1978-G1 SQSVSNS 768 DAS 808 FGTSSGL 848 BCMA_EBB-C1979-C1 SQSVSSSF 769 GAS 809 YHSSPSW 849 BCMA_EBB-C1978-C7 SQSVSTTF 770 GSS 810 YHSSPSW 850 BCMA_EBB-C1978-D10 SQSISSY 771 AAS 811 SYSTPY 851 BCMA_EBB-C1979-C12 TQSIGSSF 772 GAS 812 YESSPSW 852 BCMA_EBB-C1980-G4 SQSVSSSY 773 GAS 813 YGSPPRF 853 BCMA_EBB-C1980-D2 SQSVSSSY 774 GAS 814 YGSSPSW 854 BCMA_EBB-C1978-A10 SQRVASNY 775 GAS 815 YDSSPSW 855 BCMA_EBB-C1978-D4 SQSLSSNF 776 GAS 816 YGTSPMY 856 BCMA_EBB-C1980-A2 SQSLLHSNGYNY 777 LGS 817 ALQTPL 857 BCMA_EBB-C1981-C3 SQSVSSSY 778 GTS 818 YGNSPPKF 858 BCMA_EBB-C1978-G4 SQSVASSF 779 GAS 819 YGGSPRL 859 A7D12.2 SQDVNTA 780 SAS 820 HYSTPW 860 C11D5.3 SESVSVIGAHL 781 LAS 821 SRIFPR 861 C12A3.2 SESVTILGSHL 782 LAS 822 SRTIPR 862 C13F12.1 SESVTILGSHL 783 LAS 823 SRTIPR 863

Таблица 24. CDR вариабельного домена тяжелой цепи в соответствии с комбинацией схемы нумерации по Kabat (Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD) и схемы нумерации по Chothia (Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273, 927-948).

Кандидат HCDR1 ID HCDR2 ID HCDR3 ID 139109 GFALSNHGMS 874 GIVYSGSTYYAASVKG 914 HGGESDV 954 139103 GFTFSNYAMS 864 GISRSGENTYYADSVKG 904 SPAHYYGGMDV 944 139105 GFTFDDYAMH 865 GISWNSGSIGYADSVKG 905 HSFLAY 945 139111 GFALSNHGMS 866 GIVYSGSTYYAASVKG 906 HGGESDV 946 139100 GYIFDNFGIN 867 WINPKNNNTNYAQKFQG 907 GPYYYQSYMDV 947 139101 GFTFSSDAMT 868 VISGSGGTTYYADSVKG 908 LDSSGYYYARGPRY 948 139102 GYTFSNYGIT 869 WISAYNGNTNYAQKFQG 909 GPYYYYMDV 949 139104 GFALSNHGMS 870 GIVYSGSTYYAASVKG 910 HGGESDV 950 139106 GFALSNHGMS 871 GIVYSGSTYYAASVKG 911 HGGESDV 951 139107 GFALSNHGMS 872 GIVYSGSTYYAASVKG 912 HGGESDV 952 139108 GFTFSDYYMS 873 YISSSGSTIYYADSVKG 913 ESGDGMDV 953 139110 GFTFSDYYMS 875 YISSSGNTIYYADSVKG 915 STMVREDY 955 139112 GFALSNHGMS 876 GIVYSGSTYYAASVKG 916 HGGESDV 956 139113 GFALSNHGMS 877 GIVYSGSTYYAASVKG 917 HGGESDV 957 139114 GFALSNHGMS 878 GIVYSGSTYYAASVKG 918 HGGESDV 958 149362 GGSISSSYYYWG 879 SIYYSGSAYYNPSLKS 919 HWQEWPDAFDI 959 149363 GFSLRTSGMCVS 880 RIDWDEDKFYSTSLKT 920 SGAGGTSATAFDI 960 149364 GFTFSSYSMN 881 SISSSSSYIYYADSVKG 921 TIAAVYAFDI 961 149365 GFTFSDYYMS 882 YISSSGSTIYYADSVKG 922 DLRGAFDI 962 149366 GYTVTSHYIH 883 MINPSGGVTAYSQTLQG 923 EGSGSGWYFDF 963 149367 GGSISSGGYYWS 884 YIYYSGSTYYNPSLKS 924 AGIAARLRGAFDI 964 149368 GGTFSSYAIS 885 GIIPIFGTANYAQKFQG 925 RGGYQLLRWDVGLLRSAFDI 965 149369 GDSVSSNSAAWN 886 RTYYRSKWYSFYAISLKS 926 SSPEGLFLYWFDP 966 BCMA_EBB-C1978-A4 GFTFSSYAMS 887 AISGSGGSTYYADSVKG 927 VEGSGSLDY 967 BCMA_EBB-C1978-G1 GITFSRYPMS 888 GISDSGVSTYYADSAKG 928 RAGSEASDI 968 BCMA_EBB-C1979-C1 GFTFSSYAMS 889 AISGSGGSTYYADSVKG 929 ATYKRELRYYYGMDV 969 BCMA_EBB-C1978-C7 GFTFSSYAMS 890 AISGSGGSTYYADSVKG 930 ATYKRELRYYYGMDV 970 BCMA_EBB-C1978-D10 GFTFDDYAMH 891 GISWNSGSIGYADSVKG 931 VGKAVPDV 971 BCMA_EBB-C1979-C12 GFTFDDYAMH 892 SINWKGNSLAYGDSVKG 932 HQGVAYYNYAMDV 972 BCMA_EBB-C1980-G4 GFTFSSYAMS 893 AISGSGGSTYYADSVKG 933 VVRDGMDV 973 BCMA_EBB-C1980-D2 GFTFSSYAMS 894 AISGSGGSTYYADSVKG 934 IPQTGTFDY 974 BCMA_EBB-C1978-A10 GFTFSSYAMS 895 AISGSGGSTYYADSVKG 935 ANYKRELRYYYGMDV 975 BCMA_EBB-C1978-D4 GFSFSSYAMS 896 AISGSGGSTYYADSVKG 936 ALVGATGAFDI 976 BCMA_EBB-C1980-A2 GFTFSSYAMS 897 AISGSGGSTYYADSVKG 937 WFGEGFDP 977 BCMA_EBB-C1981-C3 GFTFSSYAMS 898 AISGSGGSTYYADSVKG 938 VGYDSSGYYRDYYGMDV 978 BCMA_EBB-C1978-G4 GFTFSSYAMS 899 AISGSGGSTYYADSVKG 939 MGWSSGYLGAFDI 979 A7D12.2 GYTFTNFGMN 900 WINTYTGESYFADDFKG 940 GEIYYGYDGGFAY 980 C11D5.3 GYTFTDYSIN 901 WINTETREPAYAYDFRG 941 DYSYAMDY 981 C12A3.2 GYTFRHYSMN 902 RINTESGVPIYADDFKG 942 DYLYSLDF 982 C13F12.1 GYTFTHYSMN 903 RINTETGEPLYADDFKG 943 DYLYSCDY 983

Таблица 25. CDR вариабельного домена легкой цепи в соответствии с комбинацией схемы нумерации по Kabat (Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD) и схемы нумерации по Chothia (Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273, 927-948).

Кандидат LCDR1 ID LCDR2 ID LCDR3 ID 139109 RASQSISSYLN 994 AASSLQS 1034 QQSYSTPYT 1074 139103 RASQSISSSFLA 984 GASRRAT 1024 QQYHSSPSWT 1064 139105 RSSQSLLHSNGYNYLD 985 LGSNRAS 1025 MQALQTPYT 1065 139111 KSSQSLLRNDGKTPLY 986 EVSNRFS 1026 MQNIQFPS 1066 139100 RSSQSLLHSNGYNYLN 987 LGSKRAS 1027 MQALQTPYT 1067 139101 RASQSISSYLN 988 GASTLAS 1028 QQSYKRAS 1068 139102 RSSQSLLYSNGYNYVD 989 LGSNRAS 1029 MQGRQFPYS 1069 139104 RASQSVSSNLA 990 GASTRAS 1030 QQYGSSLT 1070 139106 RASQSVSSKLA 991 GASIRAT 1031 QQYGSSSWT 1071 139107 RASQSVGSTNLA 992 DASNRAT 1032 QQYGSSPPWT 1072 139108 RASQSISSYLN 993 AASSLQS 1033 QQSYTLA 1073 139110 KSSESLVHNSGKTYLN 995 EVSNRDS 1035 MQGTHWPGT 1075 139112 QASEDINKFLN 996 DASTLQT 1036 QQYESLPLT 1076 139113 RASQSVGSNLA 997 GASTRAT 1037 QQYNDWLPVT 1077 139114 RASQSIGSSSLA 998 GASSRAS 1038 QQYAGSPPFT 1078 149362 KASQDIDDAMN 999 SATSPVP 1039 LQHDNFPLT 1079 149363 RASQDIYNNLA 1000 AANKSQS 1040 QHYYRFPYS 1080 149364 RSSQSLLHSNGYNYLD 1001 LGSNRAS 1041 MQALQTPYT 1081 149365 GGNNIGTKSVH 1002 DDSVRPS 1042 QVWDSDSEHVV 1082 149366 SGDGLSKKYVS 1003 RDKERPS 1043 QAWDDTTVV 1083 149367 RASQGIRNWLA 1004 AASNLQS 1044 QKYNSAPFT 1084 149368 GGNNIGSKSVH 1005 GKNNRPS 1045 SSRDSSGDHLRV 1085 149369 QGDSLGNYYAT 1006 GTNNRPS 1046 NSRDSSGHHLL 1086 BCMA_EBB-C1978-A4 RASQSVSSAYLA 1007 GASTRAT 1047 QHYGSSFNGSSLFT 1087 BCMA_EBB-C1978-G1 RASQSVSNSLA 1008 DASSRAT 1048 QQFGTSSGLT 1088 BCMA_EBB-C1979-C1 RASQSVSSSFLA 1009 GASSRAT 1049 QQYHSSPSWT 1089 BCMA_EBB-C1978-C7 RASQSVSTTFLA 1010 GSSNRAT 1050 QQYHSSPSWT 1090 BCMA_EBB-C1978-D10 RASQSISSYLN 1011 AASSLQS 1051 QQSYSTPYS 1091 BCMA_EBB-C1979-C12 RATQSIGSSFLA 1012 GASQRAT 1052 QHYESSPSWT 1092 BCMA_EBB-C1980-G4 RASQSVSSSYLA 1013 GASSRAT 1053 QQYGSPPRFT 1093 BCMA_EBB-C1980-D2 RASQSVSSSYLA 1014 GASSRAT 1054 QHYGSSPSWT 1094 BCMA_EBB-C1978-A10 RASQRVASNYLA 1015 GASSRAT 1055 QHYDSSPSWT 1095 BCMA_EBB-C1978-D4 RASQSLSSNFLA 1016 GASNWAT 1056 QYYGTSPMYT 1096 BCMA_EBB-C1980-A2 RSSQSLLHSNGYNYLD 1017 LGSNRAS 1057 MQALQTPLT 1097 BCMA_EBB-C1981-C3 RASQSVSSSYLA 1018 GTSSRAT 1058 QHYGNSPPKFT 1098 BCMA_EBB-C1978-G4 RASQSVASSFLA 1019 GASGRAT 1059 QHYGGSPRLT 1099 A7D12.2 RASQDVNTAVS 1020 SASYRYT 1060 QQHYSTPWT 1100 C11D5.3 RASESVSVIGAHLIH 1021 LASNLET 1061 LQSRIFPRT 1101 C12A3.2 RASESVTILGSHLIY 1022 LASNVQT 1062 LQSRTIPRT 1102 C13F12.1 RASESVTILGSHLIY 1023 LASNVQT 1063 LQSRTIPRT 1103

В определенных вариантах осуществления молекула CAR, представленная в настоящем описании (например, нуклеиновая кислота CAR или полипептид CAR), или BCMA-связывающий домен включает:

(1) одну, две или три CDR легкой цепи (LC), выбранные из одного из следующего:

(i) CDR1 LC SEQ ID NO: 504, CDR2 LC SEQ ID NO: 544 и CDR3 LC SEQ ID NO: 584 BCMA-4 CAR (139103);

(ii) CDR1 LC SEQ ID NO: 514, CDR2 LC SEQ ID NO: 554 и CDR3 LC SEQ ID NO: 594 BCMA-10 CAR (139109);

(iii) CDR1 LC SEQ ID NO: 516, CDR2 LC SEQ ID NO: 556 и CDR3 LC SEQ ID NO: 596 BCMA-13 CAR (139112); или

(iv) CDR1 LC SEQ ID NO: 518, CDR2 LC SEQ ID NO: 558 и CDR3 LC SEQ ID NO: 598 BCMA-15 CAR (139114), и/или

(2) одну, две или три CDR тяжелой цепи (HC) из одного из следующего:

(i) CDR1 HC SEQ ID NO: 384, CDR2 HC SEQ ID NO: 424 и CDR3 HC SEQ ID NO: 464 BCMA-4 CAR (139103);

(ii) CDR1 HC SEQ ID NO: 394, CDR2 HC SEQ ID NO: 434 и CDR3 HC SEQ ID NO: 474 BCMA-10 CAR (139109);

(iii) CDR1 HC SEQ ID NO: 396, CDR2 HC SEQ ID NO: 436 и CDR3 HC SEQ ID NO: 476 BCMA-13 CAR (139112); или

(iv) CDR1 HC SEQ ID NO: 398, CDR2 HC SEQ ID NO: 438 и CDR3 HC SEQ ID NO: 478 BCMA-15 (139114).

В определенных вариантах осуществления молекула CAR, представленная в настоящем описании (например, нуклеиновая кислота CAR или полипептид CAR) включает:

(1) одну, две или три CDR легкой цепи (LC), выбранные из одного из следующего:

(i) CDR1 LC SEQ ID NO: 744, CDR2 LC SEQ ID NO: 784 и CDR3 LC SEQ ID NO: 824 BCMA-4 CAR (139103);

(ii) CDR1 LC SEQ ID NO: 754, CDR2 LC SEQ ID NO: 794 и CDR3 LC SEQ ID NO: 834 BCMA-10 CAR (139109);

(iii) CDR1 LC SEQ ID NO: 756, CDR2 LC SEQ ID NO: 796 и CDR3 LC SEQ ID NO: 836 BCMA-13 CAR (139112); или

(iv) CDR1 LC SEQ ID NO: 758, CDR2 LC SEQ ID NO: 798 и CDR3 LC SEQ ID NO: 838 BCMA-15 CAR (139114); и/или

(2) одну, две или три CDR тяжелой цепи (HC), выбранные из одного из следующего:

(i) CDR1 HC SEQ ID NO: 624, CDR2 HC SEQ ID NO: 664 и CDR3 HC SEQ ID NO: 704 BCMA-4 CAR (139103);

(ii) CDR1 HC SEQ ID NO: 634, CDR2 HC SEQ ID NO: 674 и CDR3 HC SEQ ID NO: 714 BCMA-10 CAR (139109);

(iii) CDR1 HC SEQ ID NO: 636, CDR2 HC SEQ ID NO: 676 и CDR3 HC SEQ ID NO: 716 BCMA-13 CAR (139112); или

(iv) CDR1 HC SEQ ID NO: 638, CDR2 HC SEQ ID NO: 678 и CDR3 HC SEQ ID NO: 718 BCMA-15 CAR (139114).

В определенных вариантах осуществления молекула CAR, представленная в настоящем описании (например, нуклеиновая кислота CAR или полипептид CAR), включает: