ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании заявки на патент США с регистрационным номером 62/940509, поданной 26 ноября 2019 года, содержание которой включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был подан в электронном виде в формате ASCII и настоящим включен посредством ссылки во всей своей полноте. Указанная копия в формате ASCII, созданная 24 ноября 2020 года, имеет название N2067-7166WO_SL.txt, и ее размер составляет 598194 байта.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится в общем к иммунным эффекторным клеткам (например, T-клеткам или NK-клеткам), сконструированным таким образом, что они экспрессируют химерный антигенный рецептор (CAR), а также к композициям на их основе и путям их применения.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Терапия на основе адоптивного переноса клеток (ACT) с использованием Т-клеток, в особенности T-клеток, трансдуцированных с помощью химерных антигенных рецепторов (CAR), показала перспективность в нескольких исследованиях в отношении гематологического рака. Существует потребность в способах и процессах для улучшения получения терапевтического продукта на основе клеток, экспрессирующих CAR, повышения качества продукта и доведения до максимума терапевтической эффективности продукта.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном аспекте в настоящем изобретении описана клетка, например, иммунная клетка, например, T-клетка или NK-клетка, содержащая первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен. В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен представляет собой домен, связывающий BCMA. В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, содержит последовательность, связывающую BCMA, раскрытую в данном документе, например, последовательность CDR, VH, VL или scFv, раскрытую в таблицах 3-15, 19, 20, 22, 26 и 31. В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий домен представляет собой домен, связывающий CD19. В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий CD19, содержит последовательность, связывающую CD19, раскрытую в данном документе, например, последовательность CDR, VH, VL или scFv, раскрытую в таблицах 2, 19, 22 и 31.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрена клетка, содержащая (a) первый антигенсвязывающий домен, который представляет собой домен, связывающий BCMA, где домен, связывающий BCMA, содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (CDR1 HC), определяющую комплементарность область 2 тяжелой цепи (CDR2 HC) и определяющую комплементарность область 3 тяжелой цепи (CDR3 HC), и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (CDR1 LC), определяющую комплементарность область 2 легкой цепи (CDR2 LC) и определяющую комплементарность область 3 легкой цепи (CDR3 LC), где CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под (i) SEQ ID NO: 86, 130, 88, 95, 131 и 132 соответственно; (ii) SEQ ID NO: 44, 45, 84, 54, 55 и 56 соответственно или (iii) SEQ ID NO: 179, 180, 181, 147, 182 и 183 соответственно; и (b) второй антигенсвязывающий домен. В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен расположены в двух химерных антигенных рецепторах (CAR). В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен расположены в одном CAR.

В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 86, 130, 88, 95, 131 и 132 соответственно. В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 86, 87, 88, 95, 96 и 97 соответственно. В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 86, 109, 88, 95, 114 и 115 соответственно. В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 86, 109, 88, 95, 114 и 97 соответственно. В некоторых вариантах осуществления VH содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 93 или 112 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления VH кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 260, 94 или 113 или последовательностью нуклеиновой кислоты, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления VL содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 102, 118 или 124 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления VL кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 261, 103, 119 или 125 или последовательностью нуклеиновой кислоты, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления VH и VL содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 93 и 102 соответственно. В некоторых вариантах осуществления VH и VL содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 112 и 118 соответственно. В некоторых вариантах осуществления VH и VL содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 112 и 124 соответственно. В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен содержит одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 105, 120 или 126 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 253, 106, 121 или 127 или последовательностью нуклеиновой кислоты, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен расположен в первом CAR. В некоторых вариантах осуществления первый CAR содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 107, 226, 122 или 128 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления первый CAR кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 259, 258, 108, 123 или 129 или последовательностью нуклеиновой кислоты, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней.

В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 44, 45, 84, 54, 55 и 56 соответственно. В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 44, 45, 76, 54, 55 и 56 соответственно. В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 44, 45, 46, 54, 55 и 56 соответственно. В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 44, 45, 68, 54, 55 и 56 соответственно. В некоторых вариантах осуществления VH содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 78, 52 или 70 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления VH кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 79, 53 или 71 или последовательностью нуклеиновой кислоты, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления VL содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 61 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления VL кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 62 или последовательностью нуклеиновой кислоты, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления VH и VL содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 78 и 61 соответственно. В некоторых вариантах осуществления VH и VL содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 52 и 61 соответственно. В некоторых вариантах осуществления VH и VL содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 70 и 61 соответственно. В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен содержит одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 80, 64 или 72 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 81, 65 или 73 или последовательностью нуклеиновой кислоты, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен расположен в первом CAR. В некоторых вариантах осуществления первый CAR содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 224, 82, 66 или 74 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления первый CAR кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 83, 67 или 75 или последовательностью нуклеиновой кислоты, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней.

В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 179, 180, 181, 147, 182 и 183 соответственно. В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 137, 138, 139, 147, 148 и 149 соответственно. В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 160, 161, 162, 147, 170 и 171 соответственно. В некоторых вариантах осуществления VH содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 145 или 168 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления VH кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 146 или 169 или последовательностью нуклеиновой кислоты, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления VL содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 154 или 173 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления VL кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 155 или 174 или последовательностью нуклеиновой кислоты, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления VH и VL содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 145 и 154 соответственно. В некоторых вариантах осуществления VH и VL содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 168 и 173 соответственно. В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен содержит одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 156 или 175 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 157 или 176 или последовательностью нуклеиновой кислоты, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен расположен в первом CAR. В некоторых вариантах осуществления первый CAR содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 158 или 177 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления первый CAR кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 159 или 178 или последовательностью нуклеиновой кислоты, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней.

В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрена клетка, содержащая (a) первый антигенсвязывающий домен, который представляет собой домен, связывающий BCMA, где домен, связывающий BCMA, содержит (i) VH, содержащую CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC последовательности, связывающей BCMA, представленные в таблице 20 или 26, и VL, содержащую CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC последовательности, связывающей BCMA, представленные в таблице 20 или 26, где VH и VL соединены линкером, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 243; (ii) VH и VL, содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 239 и 242 соответственно, где VH и VL соединены линкером, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 243; или (iii) scFv, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 200; и (b) второй антигенсвязывающий домен. В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен расположены в двух химерных антигенных рецепторах (CAR). В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен расположены в одном CAR. В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий домен связывается с антигеном, выбранным из CD19, CD5, CD10, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD27, CD30, CD34, CD37, CD38, CD40, CD53, CD69, CD72, CD73, CD74, CD75, CD77, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CD84, CD85, CD86, CD123, CD135, CD138, CD179, CD269, Flt3, ROR1, FcRn5, FcRn2, CS-1, CXCR4, 5, 7, IL-7/3R, IL7/4/3R или IL4R, где В-клеточный антиген необязательно выбран из CD19, CD20, CD22, FcRn5, FcRn2, CS-1, CD138, CD123, CD33, CD34, CLL-1, рецептора фолиевой кислоты бета или FLT3. В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий домен связывается с CD19. В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий домен связывается с антигеном, выбранным из EGFRvIII, мезотелина, GD2, Tn-антигена, sTn-антигена, Tn-O-гликопептидов, sTn-O-гликопептидов, PSMA, CD97, TAG72, CD44v6, CEA, EPCAM, KIT, IL-13Ra2, легумана, GD3, CD171, IL-11Ra, PSCA, MAD-CT-1, MAD-CT-2, VEGFR2, антигена Y системы Льюис, CD24, PDGFR-бета, SSEA-4, рецептора фолиевой кислоты альфа, ERBB (например, ERBB2), Her2/neu, MUC1, EGFR, NCAM, эфрина B2, CAIX, LMP2, sLe, HMWMAA, o-ацетил-GD2, рецептора фолиевой кислоты бета, TEM1/CD248, TEM7R, FAP, легумаина, E6 или E7 HPV, ML-IAP, CLDN6, TSHR, GPRC5D, ALK, полисиаловой кислоты, Fos-родственного антигена, эластазы нейтрофилов, TRP-2, CYP1B1, белка спермы 17, бета-субъединицы хорионического гонадотропина человека, AFP, тиреоглобулина, PLAC1, globoH, RAGE1, MN-CA IX, обратной транскриптазы теломеразы человека, кишечной карбоксилэстеразы, мутантного варианта hsp 70-2, NA-17, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, NY-ESO-1, GPR20, Ly6k, OR51E2, TARP, GFRα4 или пептида любого из этих антигенов, презентированного на MHC.

В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий домен связывается с CD19. В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий домен содержит CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и/или CDR3 LC последовательности, связывающей CD19, представленные в таблице 19 или таблице 22, например, CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC, содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 295 и 245-249 соответственно. В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий домен содержит VH и/или VL последовательности, связывающей CD19, представленные в таблице 19 или таблице 22, например, VH и VL, содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 250 и 251 соответственно или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ними. В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий домен содержит scFv последовательности, связывающей CD19, представленный в таблице 19 или таблице 22, например, scFv, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 211 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий домен расположен во втором CAR, где CAR включает в себя CAR с последовательностью, связывающей CD19, представленный в таблице 19 или таблице 22, например, CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 225 или 229 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней.

В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен содержит CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR LC, содержащие аминокислотные последовательности под (a) SEQ ID NO: 86, 87, 88, 95, 96 и 97 соответственно; (b) SEQ ID NO: 44, 45, 76, 54, 55 и 56 соответственно или (c) SEQ ID NO: 44, 45, 46, 54, 55 и 56 соответственно. В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий домен содержит CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC, содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 295 и 245-249 соответственно. В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен содержит VH и VL, содержащие аминокислотные последовательности под (a) SEQ ID NO: 93 и 102 соответственно; (b) SEQ ID NO: 78 и 61 соответственно или (c) SEQ ID NO: 52 и 61 соответственно. В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий домен содержит VH и VL, содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 250 и 251 соответственно. В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен содержит scFv, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 105, 80 или 64. В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий домен содержит scFv, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 211. В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 253, 106, 81 или 65. В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий домен кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 212.

В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен расположен в первом CAR, а второй антигенсвязывающий домен расположен во втором CAR. В некоторых вариантах осуществления первый CAR дополнительно содержит первый трансмембранный домен и первый внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления второй CAR дополнительно содержит второй трансмембранный домен и второй внутриклеточный сигнальный домен.

В некоторых вариантах осуществления первый CAR кодируется первой последовательностью нуклеиновой кислоты, а второй CAR кодируется второй последовательностью нуклеиновой кислоты, где первая и вторая последовательности нуклеиновой кислоты расположены в отдельных молекулах нуклеиновой кислоты.

В некоторых вариантах осуществления первый CAR кодируется первой последовательностью нуклеиновой кислоты, а второй CAR кодируется второй последовательностью нуклеиновой кислоты, где первая и вторая последовательности нуклеиновой кислоты расположены в одной молекуле нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления отдельная молекула нуклеиновой кислоты имеет следующую конфигурацию в ориентации 5'-3': последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая первый антигенсвязывающий домен - последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая первый трансмембранный домен - последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая первый внутриклеточный сигнальный домен - последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая линкер - последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая второй антигенсвязывающий домен - последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая второй трансмембранный домен - последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая второй внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления отдельная молекула нуклеиновой кислоты имеет следующую конфигурацию в ориентации 5'-3': последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая второй антигенсвязывающий домен - последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая второй трансмембранный домен - последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая второй внутриклеточный сигнальный домен - последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая линкер - последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая первый антигенсвязывающий домен - последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая первый трансмембранный домен - последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая первый внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит сайт саморасщепления. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит сайт P2A, сайт Т2A, сайт Е2A или сайт F2A. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит сайт P2A. В некоторых вариантах осуществления линкер кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 209 или последовательностью нуклеиновой кислоты, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 208 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления отдельная молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 215, 217, 219, 221 или 223 или последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления отдельная молекула нуклеиновой кислоты кодирует аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 214, 216, 218, 220 или 222 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней.

В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен расположены в одном CAR, где CAR дополнительно содержит трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен содержит первую VH (VH1) и первую VL (VL1), а второй антигенсвязывающий домен содержит вторую VH (VH2) и вторую VL (VL2). В некоторых вариантах осуществления VH1, VL1, VH2 и VL2 расположены в следующей конфигурации от N-конца до C-конца: VH2 - необязательно линкер 1 ("L1") - VL1 - необязательно линкер 2 ("L2") - VH1 - необязательно линкер 3 ("L3") - VL2. В некоторых вариантах осуществления VH1, VL1, VH2 и VL2 расположены в следующей конфигурации от N-конца до C-конца: VH1 - необязательно L1 - VH2 - необязательно L2 - VL2 - необязательно L3 - VL1. В некоторых вариантах осуществления VH1, VL1, VH2 и VL2 расположены в следующей конфигурации от N-конца до C-конца: VL2 - необязательно L1 - VL1 - необязательно L2 - VH1 - необязательно L3 - VH2. В некоторых вариантах осуществления VH1, VL1, VH2 и VL2 расположены в следующей конфигурации от N-конца до C-конца: VL2 - необязательно L1 - VH1 - необязательно L2 - VL1 - необязательно L3 - VH2. В некоторых вариантах осуществления VH1, VL1, VH2 и VL2 расположены в следующей конфигурации от N-конца до C-конца: VH2 - необязательно L1 - VH1 - необязательно L2 - VL1 - необязательно L3 - VL2. В некоторых вариантах осуществления VH1, VL1, VH2 и VL2 расположены в следующей конфигурации от N-конца до C-конца: VL1 - необязательно L1 - VH2 - необязательно L2 - VL2 - необязательно L3 - VH1. В некоторых вариантах осуществления VH1, VL1, VH2 и VL2 расположены в следующей конфигурации от N-конца до C-конца: VL1 - необязательно L1 - VL2 - необязательно L2 - VH2 - необязательно L3 - VH1. В некоторых вариантах осуществления VH1, VL1, VH2 и VL2 расположены в следующей конфигурации от N-конца до C-конца: VH1 - необязательно L1 - VL2 - необязательно L2 - VH2 - необязательно L3 - VL1. В некоторых вариантах осуществления VH1 и VL1 содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 93 и 102 соответственно (или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ними). В некоторых вариантах осуществления VH1 и VL1 содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 333 и 334 соответственно (или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ними). В некоторых вариантах осуществления VH1 и VL1 содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 78 и 61 соответственно (или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ними). В некоторых вариантах осуществления VH1 и VL1 содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 335 и 336 соответственно (или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ними). В некоторых вариантах осуществления VH2 и VL2 содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 250 и 251 соответственно (или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ними). В некоторых вариантах осуществления VH2 и VL2 содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 331 и 332 соответственно (или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ними). В некоторых вариантах осуществления L1 или L3 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 5 (или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней). В некоторых вариантах осуществления L2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 63 (или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней). В некоторых вариантах осуществления CAR содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 321-330, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью с ней. В некоторых вариантах осуществления CAR содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 339-348, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью с ней.

В некоторых вариантах осуществления CAR кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей следующую конфигурацию в ориентации 5'-3': последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая первый антигенсвязывающий домен - необязательно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая линкер - последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая второй антигенсвязывающий домен - последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая трансмембранный домен - последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления CAR кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей следующую конфигурацию в ориентации 5'-3': последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая второй антигенсвязывающий домен - необязательно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая линкер - последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая первый антигенсвязывающий домен - последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая трансмембранный домен - последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внутриклеточный сигнальный домен.

В некоторых вариантах осуществления CAR имеет следующую конфигурацию в ориентации от N- до C-конца: первый антигенсвязывающий домен - необязательно линкер - второй антигенсвязывающий домен - трансмембранный домен - внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления CAR имеет следующую конфигурацию в ориентации от N- до C-конца: второй антигенсвязывающий домен - необязательно линкер - первый антигенсвязывающий домен - трансмембранный домен - внутриклеточный сигнальный домен.

В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен или второй антигенсвязывающий домен содержит VH и VL. В некоторых вариантах осуществления VH и VL соединены линкером. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 5, 63, 104 или 243 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней.

В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен, первый трансмембранный домен или второй трансмембранный домен включает в себя трансмембранный домен белка, выбранного из альфа-, бета- или дзета-цепи T-клеточного рецептора, CD28, CD3-эпсилон, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 или CD154. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен, первый трансмембранный домен или второй трансмембранный домен содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен, первый трансмембранный домен или второй трансмембранный домен кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 17 или последовательностью нуклеиновой кислоты, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней.

В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен или второй антигенсвязывающий домен соединены с трансмембранным доменом, первым трансмембранным доменом или вторым трансмембранным доменом с помощью шарнирной области (например, первой или второй шарнирной области). В некоторых вариантах осуществления шарнирная область содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2, 3 или 4 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления шарнирная область кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 13, 14 или 15 или последовательностью нуклеиновой кислоты, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления шарнирная область и трансмембранный домен содержат аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 202 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления шарнирная область и трансмембранный домен кодируются последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 203 или 213 или последовательностью нуклеиновой кислоты, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней.

В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен, первый внутриклеточный сигнальный домен или второй внутриклеточный сигнальный домен содержит первичный сигнальный домен (например, первый или второй первичный сигнальный домен). В некоторых вариантах осуществления первичный сигнальный домен предусматривает функциональный сигнальный домен, полученный из CD3-дзета, TCR-дзета, FcR-гамма, FcR-бета, CD3-гамма, CD3-дельта, CD3-эпсилон, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 (ICOS), FcεRI, DAP10, DAP12 или CD66d. В некоторых вариантах осуществления первичный сигнальный домен содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9 или 10 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления первичный сигнальный домен кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 20, 21 или 205 или последовательностью нуклеиновой кислоты, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен, первый внутриклеточный сигнальный домен или второй внутриклеточный сигнальный домен содержит костимулирующий сигнальный домен (например, первый или второй костимулирующий сигнальный домен). В некоторых вариантах осуществления костимулирующий сигнальный домен предусматривает функциональный сигнальный домен, полученный из молекулы MHC I класса, белкового рецептора TNF, иммуноглобулиноподобного белка, рецептора цитокина, интегрина, сигнальной молекулы активации лимфоцитов (белка SLAM), активирующего рецептора NK-клеток, BTLA, лиганда Toll-подобного рецептора, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, 4-1BB (CD137), B7-H3, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8-альфа, CD8-бета, IL2R-бета, IL2R-гамма, IL7R-альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD28-OX40, CD28-4-1BB или лиганда, который специфично связывается с CD83. В некоторых вариантах осуществления костимулирующий сигнальный домен содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления костимулирующий сигнальный домен кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 18 или 204 или последовательностью нуклеиновой кислоты, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен, первый внутриклеточный сигнальный домен или второй внутриклеточный сигнальный домен содержит функциональный сигнальный домен, полученный из 4-1BB, и функциональный сигнальный домен, полученный из CD3-дзета. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен, первый внутриклеточный сигнальный домен или второй внутриклеточный сигнальный домен содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7 (или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней) и аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9 или 10 (или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней). В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен, первый внутриклеточный сигнальный домен или второй внутриклеточный сигнальный домен содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7 и аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9 или 10.

В некоторых вариантах осуществления CAR, первый CAR или второй CAR дополнительно содержат лидерную последовательность (например, первую или вторую лидерную последовательность). В некоторых вариантах осуществления лидерная последовательность предусматривает аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления лидерная последовательность кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 199 или 210 или последовательностью нуклеиновой кислоты, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней.

В некоторых вариантах осуществления первая лидерная последовательность и вторая лидерная последовательность кодируются разными последовательностями нуклеиновой кислоты (например, отличающимися на по меньшей мере 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, или 100%). В некоторых вариантах осуществления первая шарнирная область и вторая шарнирная область кодируются разными последовательностями нуклеиновой кислоты (например, отличающимися на по меньшей мере 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, или 100%). В некоторых вариантах осуществления первый трансмембранный домен и второй трансмембранный домен кодируются разными последовательностями нуклеиновой кислоты (например, отличающимися на по меньшей мере 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, или 100%). В некоторых вариантах осуществления первый внутриклеточный сигнальный домен и второй внутриклеточный сигнальный домен кодируются разными последовательностями нуклеиновой кислоты (например, отличающимися на по меньшей мере 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, или 100%). В некоторых вариантах осуществления первый первичный сигнальный домен и второй первичный сигнальный домен кодируются разными последовательностями нуклеиновой кислоты (например, отличающимися на по меньшей мере 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, или 100%). В некоторых вариантах осуществления первый костимулирующий сигнальный домен и второй костимулирующий сигнальный домен кодируются разными последовательностями нуклеиновой кислоты (например, отличающимися на по меньшей мере 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, или 100%). В некоторых вариантах осуществления первая лидерная последовательность и вторая лидерная последовательность предусматривают одинаковые аминокислотные последовательности (например, первая лидерная последовательность и вторая лидерная последовательность предусматривают аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней). В некоторых вариантах осуществления первая лидерная последовательность и вторая лидерная последовательность предусматривают разные аминокислотные последовательности. В некоторых вариантах осуществления первая шарнирная область и вторая шарнирная область содержат одинаковые аминокислотные последовательности (например, первая шарнирная область и вторая шарнирная область содержат аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней). В некоторых вариантах осуществления первая шарнирная область и вторая шарнирная область содержат разные аминокислотные последовательности. В некоторых вариантах осуществления первый трансмембранный домен и второй трансмембранный домен содержат одинаковые аминокислотные последовательности (например, первый трансмембранный домен и второй трансмембранный домен содержат аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней). В некоторых вариантах осуществления первый трансмембранный домен и второй трансмембранный домен содержат разные аминокислотные последовательности. В некоторых вариантах осуществления первый внутриклеточный сигнальный домен и второй внутриклеточный сигнальный домен содержат одинаковые аминокислотные последовательности. В некоторых вариантах осуществления первый внутриклеточный сигнальный домен и второй внутриклеточный сигнальный домен содержат разные аминокислотные последовательности. В некоторых вариантах осуществления первый первичный сигнальный домен и второй первичный сигнальный домен содержат одинаковые аминокислотные последовательности (например, первый первичный сигнальный домен и второй первичный сигнальный домен содержат аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 10 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней). В некоторых вариантах осуществления первый первичный сигнальный домен и второй первичный сигнальный домен содержат разные аминокислотные последовательности. В некоторых вариантах осуществления первый костимулирующий сигнальный домен и второй костимулирующий сигнальный домен содержат одинаковые аминокислотные последовательности (например, первый костимулирующий сигнальный домен и второй костимулирующий сигнальный домен содержат аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней). В некоторых вариантах осуществления первый костимулирующий сигнальный домен и второй костимулирующий сигнальный домен содержат разные аминокислотные последовательности (например, первый и второй костимулирующие сигнальные домены содержат последовательность костимулирующего домена 4-1BB и последовательность костимулирующего домена CD28 соответственно или содержат последовательность костимулирующего домена CD28 и последовательность костимулирующего домена 4-1BB соответственно). В некоторых вариантах осуществления первая лидерная последовательность и вторая лидерная последовательность кодируются последовательностями нуклеиновой кислоты, содержащими SEQ ID NO: 199 и 210 соответственно (или последовательностью нуклеиновой кислоты, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ними). В некоторых вариантах осуществления первая лидерная последовательность и вторая лидерная последовательность кодируются последовательностями нуклеиновой кислоты, содержащими SEQ ID NO: 210 и 199 соответственно (или последовательностью нуклеиновой кислоты, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ними). В некоторых вариантах осуществления первая шарнирная область и вторая шарнирная область кодируются последовательностями нуклеиновой кислоты, содержащими SEQ ID NO: 337 и 13 соответственно (или последовательностью нуклеиновой кислоты, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ними). В некоторых вариантах осуществления первая шарнирная область и вторая шарнирная область кодируются последовательностями нуклеиновой кислоты, содержащими SEQ ID NO: 13 и 337 соответственно (или последовательностью нуклеиновой кислоты, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ними). В некоторых вариантах осуществления первый трансмембранный домен и второй трансмембранный домен кодируются последовательностями нуклеиновой кислоты, содержащими SEQ ID NO: 338 и 17 соответственно (или последовательностью нуклеиновой кислоты, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ними). В некоторых вариантах осуществления первый трансмембранный домен и второй трансмембранный домен кодируются последовательностями нуклеиновой кислоты, содержащими SEQ ID NO: 17 и 338 соответственно (или последовательностью нуклеиновой кислоты, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ними). В некоторых вариантах осуществления первый костимулирующий сигнальный домен и второй костимулирующий сигнальный домен кодируются последовательностями нуклеиновой кислоты, содержащими SEQ ID NO: 204 и 18 соответственно (или последовательностью нуклеиновой кислоты, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ними). В некоторых вариантах осуществления первый костимулирующий сигнальный домен и второй костимулирующий сигнальный домен кодируются последовательностями нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 18 и 204 соответственно (или последовательностью нуклеиновой кислоты, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ними). В некоторых вариантах осуществления первый первичный сигнальный домен и второй первичный сигнальный домен кодируются последовательностями нуклеиновой кислоты, содержащими SEQ ID NO: 205 и 21 соответственно (или последовательностью нуклеиновой кислоты, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ними). В некоторых вариантах осуществления первый первичный сигнальный домен и второй первичный сигнальный домен кодируются последовательностями нуклеиновой кислоты, содержащими SEQ ID NO: 21 и 205 соответственно (или последовательностью нуклеиновой кислоты, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ними).

В некоторых вариантах осуществления CAR, первый CAR или второй CAR кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита лесных сурков (WPRE).

В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрена молекула нуклеиновой кислоты, содержащая (a) первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую первый антигенсвязывающий домен, который представляет собой домен, связывающий BCMA, где домен, связывающий BCMA, содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (CDR1 HC), определяющую комплементарность область 2 тяжелой цепи (CDR2 HC) и определяющую комплементарность область 3 тяжелой цепи (CDR3 HC), и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (CDR1 LC), определяющую комплементарность область 2 легкой цепи (CDR2 LC) и определяющую комплементарность область 3 легкой цепи (CDR3 LC), где CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под (i) SEQ ID NO: 86, 130, 88, 95, 131 и 132 соответственно; (ii) SEQ ID NO: 44, 45, 84, 54, 55 и 56 соответственно или (iii) SEQ ID NO: 179, 180, 181, 147, 182 и 183 соответственно; и (b) вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую второй антигенсвязывающий домен.

В некоторых вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты предусматривает первую молекулу нуклеиновой кислоты и вторую молекулу нуклеиновой кислоты, которые являются отдельными молекулами нуклеиновой кислоты, и где первая последовательность нуклеиновой кислоты расположена в первой молекуле нуклеиновой кислоты, а вторая последовательность нуклеиновой кислоты расположена во второй молекуле нуклеиновой кислоты.

В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрена молекула нуклеиновой кислоты, содержащая (a) первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую первый антигенсвязывающий домен, который представляет собой домен, связывающий BCMA, где домен, связывающий BCMA, содержит (i) VH, содержащую CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC последовательности, связывающей BCMA, представленные в таблице 20 или 26, и VL, содержащую CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC последовательности, связывающей BCMA, представленные в таблице 20 или 26, где VH и VL соединены линкером, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 243; (ii) VH и VL, содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 239 и 242 соответственно, где VH и VL соединены линкером, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 243; или (iii) scFv, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 200; и (b) вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую второй антигенсвязывающий домен.

В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрена молекула нуклеиновой кислоты, содержащая первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую первый CAR, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую второй CAR, где первый CAR содержит первый антигенсвязывающий домен, который представляет собой домен, связывающий BCMA, первый трансмембранный домен и первый внутриклеточный сигнальный домен, и где второй CAR содержит второй антигенсвязывающий домен, который представляет собой домен, связывающий CD19, второй трансмембранный домен и второй внутриклеточный сигнальный домен, где (i) первый антигенсвязывающий домен содержит CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR LC, содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 86, 87, 88, 95, 96 и 97 соответственно, и второй антигенсвязывающий домен содержит CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR LC, содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 295 и 245-249 соответственно; (ii) первый антигенсвязывающий домен содержит VH и VL, содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 93 и 102 соответственно, и второй антигенсвязывающий домен содержит VH и VL, содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 250 и 251 соответственно; (iii) первый антигенсвязывающий домен содержит scFv, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 105, и второй антигенсвязывающий домен содержит scFv, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 211; (iv) первый CAR содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 107 или 226, и второй CAR содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 225 или 229; или (v) выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 271.

В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрена молекула нуклеиновой кислоты, содержащая первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую первый CAR, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую второй CAR, где первый CAR содержит первый антигенсвязывающий домен, который представляет собой домен, связывающий BCMA, первый трансмембранный домен и первый внутриклеточный сигнальный домен, и где второй CAR содержит второй антигенсвязывающий домен, который представляет собой домен, связывающий CD19, второй трансмембранный домен и второй внутриклеточный сигнальный домен, где (i) первый антигенсвязывающий домен содержит CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR LC, содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 44, 45, 76, 54, 55 и 56 соответственно, второй антигенсвязывающий домен содержит CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC, содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 295 и 245-249 соответственно; (ii) первый антигенсвязывающий домен содержит VH и VL, содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 78 и 61 соответственно, и второй антигенсвязывающий домен содержит VH и VL, содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 250 и 251 соответственно; (iii) первый антигенсвязывающий домен содержит scFv, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 80, и второй антигенсвязывающий домен содержит scFv, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 211; (iv) первый CAR содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 82 или 224, и второй CAR содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 225 или 229; или (v) выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 215.

В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрена молекула полипептида, кодируемая молекулой нуклеиновой кислоты, раскрытой в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрен CAR, где CAR содержит (a) первый антигенсвязывающий домен, который представляет собой домен, связывающий BCMA, где домен, связывающий BCMA, содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (CDR1 HC), определяющую комплементарность область 2 тяжелой цепи (CDR2 HC) и определяющую комплементарность область 3 тяжелой цепи (CDR3 HC), и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (CDR1 LC), определяющую комплементарность область 2 легкой цепи (CDR2 LC) и определяющую комплементарность область 3 легкой цепи (CDR3 LC), где CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под (i) SEQ ID NO: 86, 130, 88, 95, 131 и 132 соответственно; (ii) SEQ ID NO: 44, 45, 84, 54, 55 и 56 соответственно или (iii) SEQ ID NO: 179, 180, 181, 147, 182 и 183 соответственно; и (b) второй антигенсвязывающий домен.

В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрен CAR, где CAR содержит (a) первый антигенсвязывающий домен, который представляет собой домен, связывающий BCMA, где домен, связывающий BCMA, содержит (i) VH, содержащую CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC последовательности, связывающей BCMA, представленные в таблице 20 или 26, и VL, содержащую CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC последовательности, связывающей BCMA, представленные в таблице 20 или 26, где VH и VL соединены линкером, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 243; (ii) VH и VL, содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 239 и 242 соответственно, где VH и VL соединены линкером, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 243; или (iii) scFv, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 200; и (b) второй антигенсвязывающий домен.

В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрен вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, раскрытую в данном документе, или молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR, раскрытый в данном документе. В некоторых вариантах осуществления вектор выбран из ДНК-вектора, РНК-вектора, плазмиды, лентивирусного вектора, аденовирусного вектора или ретровирусного вектора. В некоторых вариантах осуществления вектор содержит промотор EF-1, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 11.

В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрена клетка, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты, раскрытую в данном документе, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR, раскрытый в данном документе, полипептид, раскрытый в данном документе, CAR, раскрытый в данном документе, или вектор, раскрытый в данном документе. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой T-клетку или NK-клетку.

В некоторых вариантах осуществления в данном документе раскрыт способ получения клетки, включающий трансдукцию клетки вектором, раскрытым в данном документе, где клетка необязательно представляет собой T-клетку или NK-клетку. В некоторых вариантах осуществления в данном документе раскрыт способ получения РНК-сконструированной клетки, включающий введение РНК, транскрибированной in vitro, или синтетической РНК в клетку, где РНК содержит молекулу нуклеиновой кислоты, раскрытую в данном документе, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR, раскрытый в данном документе. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой T-клетку или NK-клетку.

В некоторых вариантах осуществления в данном документе раскрыт способ получения популяции клеток (например, T-клеток), которые экспрессируют химерный антигенный рецептор (CAR), при этом способ включает (i) приведение популяции клеток (например, T-клеток, например, T-клеток, выделенных из замороженного или свежего продукта лейкафереза) в контакт (например, связывание) со средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу на поверхности клеток; (ii) приведение популяции клеток (например, T-клеток) в контакт с молекулой нуклеиновой кислоты, раскрытой в данном документе, или молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, раскрытый в данном документе, за счет чего обеспечивается получение популяции клеток (например, T-клеток), содержащих молекулу нуклеиновой кислоты, и (iii) сбор популяции клеток (например, T-клеток) для хранения (например, повторного составления популяции клеток в среде для криоконсервации) или введения, где:

(a) стадию (ii) проводят вместе со стадией (i) или не позже чем через 20 часов после начала стадии (i), например, не позже чем через 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18 часов после начала стадии (i), например, не позже чем через 18 часов после начала стадии (i), и

стадию (iii) проводят не позже чем через 30 (например, 26) часов после начала стадии (i), например, не позже чем через 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 часов после начала стадии (i), например, не позже чем через 24 часа после начала стадии (i),

(b) стадию (ii) проводят вместе со стадией (i) или не позже чем через 20 часов после начала стадии (i), например, не позже чем через 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18 часов после начала стадии (i), например, не позже чем через 18 часов после начала стадии (i), и

стадию (iii) проводят не позже чем через 30 часов после начала стадии (ii), например, не позже чем через 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 часов после начала стадии (ii), или

(c) популяция клеток из стадии (iii) не является размножившейся или является размножившейся с увеличением численности на не более чем 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или 40%, например, на не более чем 10%, например, согласно оценке по количеству живых клеток, по сравнению с популяцией клеток в начале стадии (i),

где молекула нуклеиновой кислоты на стадии (ii) необязательно находится в вирусном векторе, где молекула нуклеиновой кислоты на стадии (ii) необязательно представляет собой молекулу РНК в вирусном векторе, где стадия (ii) необязательно включает трансдукцию популяции клеток (например, T-клеток) с помощью вирусного вектора, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR.

В некоторых вариантах осуществления в данном документе раскрыт способ получения популяции клеток (например, T-клеток), которые экспрессируют химерный антигенный рецептор (CAR), при этом способ включает (1) приведение популяции клеток (например, T-клеток, например, T-клеток, выделенных из замороженного продукта лейкафереза) в контакт с цитокином, выбранным из IL-2, IL-7, IL-15 (например, hetIL-15 (IL15/sIL-15Ra)), IL-21, IL-6 (например, IL-6/sIL-6Ra) или их комбинации, (2) приведение популяции клеток (например, T-клеток) в контакт с молекулой нуклеиновой кислоты, раскрытой в данном документе, или молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, раскрытый в данном документе, за счет чего обеспечивается получение популяции клеток (например, T-клеток), содержащих молекулу нуклеиновой кислоты, и (3) сбор популяции клеток (например, T-клеток) для хранения (например, повторного составления популяции клеток в среде для криоконсервации) или введения, где:

(a) стадию (2) проводят вместе со стадией (1) или не позже чем через 5 часов после начала стадии (1), например, не позже чем через 1, 2, 3, 4 или 5 часов после начала стадии (1), и

стадию (3) проводят не позже чем через 26 часов после начала стадии (1), например, не позже чем через 22, 23 или 24 часа после начала стадии (1), например, не позже чем через 24 часа после начала стадии (1), или

(b) популяция клеток из стадии (3) не является размножившейся или является размножившейся с увеличением численности на не более чем 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или 40%, например, на не более чем 10%, например, согласно оценке по количеству живых клеток, по сравнению с популяцией клеток в начале стадии (1),

где молекула нуклеиновой кислоты на стадии (2) необязательно находится в вирусном векторе, где молекула нуклеиновой кислоты на стадии (ii) необязательно представляет собой молекулу РНК в вирусном векторе, где стадия (ii) необязательно включает трансдукцию популяции клеток (например, T-клеток) с помощью вирусного вектора, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR.

В некоторых вариантах осуществления в данном документе раскрыта популяция клеток, сконструированных таким образом, что они экспрессируют CAR ("популяция клеток, экспрессирующих CAR"), при этом указанная популяция предусматривает: (a) приблизительно такую же процентную долю необученных клеток, например, необученных Т-клеток, например, CD45RO- CCR7+ T-клеток, по сравнению с процентной долей необученных клеток, например, необученных Т-клеток, например, CD45RO- CCR7+ клеток, в той же популяции клеток до их конструирования таким образом, чтобы они экспрессировали CAR; (b) изменение количества необученных клеток, например, необученных Т-клеток, например, CD45RO- CCR7+ T-клеток, находящееся в пределах от приблизительно 5% до приблизительно 10%, например, по сравнению с процентной долей необученных клеток, например, необученных Т-клеток, например, CD45RO- CCR7+ T-клеток, в той же популяции клеток до их конструирования таким образом, чтобы они экспрессировали CAR; (c) увеличенную процентную долю необученных клеток, например, необученных Т-клеток, например, CD45RO- CCR7+ T-клеток, например, увеличенную в по меньшей мере 1,2, 1,4, 1,6, 1,8, 2,0, 2,2, 2,4, 2,6, 2,8 или 3 раза, по сравнению с процентной долей необученных клеток, например, необученных Т-клеток, например, CD45RO- CCR7+ T-клеток, в той же популяции клеток до их конструирования таким образом, чтобы они экспрессировали CAR; (d) приблизительно такую же процентную долю центральных клеток памяти, например, центральных T-клеток памяти, например, CCR7+ CD45RO+ T-клеток, по сравнению с процентной долей центральных клеток памяти, например, центральных T-клеток памяти, например, CCR7+ CD45RO+ T-клеток, в той же популяции клеток до их конструирования таким образом, чтобы они экспрессировали CAR; (e) изменение количества центральных клеток памяти, например, центральных T-клеток памяти, например, CCR7+ CD45RO+ T-клеток, находящееся в пределах от приблизительно 5% до приблизительно 10%, по сравнению с процентной долей центральных клеток памяти, например, центральных T-клеток памяти, например, CCR7+ CD45RO+ T-клеток, в той же популяции клеток до их конструирования таким образом, чтобы они экспрессировали CAR; (f) уменьшенную процентную долю центральных клеток памяти, например, центральных T-клеток памяти, например, CCR7+ CD45RO+ T-клеток, например, уменьшенную на по меньшей мере 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50%, по сравнению с процентной долей центральных клеток памяти, например, центральных T-клеток памяти, например, CCR7+ CD45RO+ T-клеток, в той же популяции клеток до их конструирования таким образом, чтобы они экспрессировали CAR; (g) приблизительно такую же процентную долю стволовых T-клеток памяти, например, CD45RA+ CD95+ рецептор IL-2 β+ CCR7+ CD62L+ T-клеток, по сравнению с процентной долей стволовых T-клеток памяти, например, CD45RA+ CD95+ рецептор IL-2 β+ CCR7+ CD62L+ T-клеток, в той же популяции клеток до их конструирования таким образом, чтобы они экспрессировали CAR; (h) изменение количества стволовых T-клеток памяти, например, CD45RA+ CD95+ рецептор IL-2 β+ CCR7+ CD62L+ T-клеток, находящееся в пределах от приблизительно 5% до приблизительно 10%, по сравнению с процентной долей стволовых T-клеток памяти, например, CD45RA+ CD95+ рецептор IL-2 β+ CCR7+ CD62L+ T-клеток, в той же популяции клеток до их конструирования таким образом, чтобы они экспрессировали CAR; или (i) увеличенную процентную долю стволовых T-клеток памяти, например, CD45RA+ CD95+ рецептор IL-2 β+ CCR7+ CD62L+ T-клеток, по сравнению с процентной долей стволовых T-клеток памяти, например, CD45RA+ CD95+ рецептор IL-2 β+ CCR7+ CD62L+ T-клеток, в той же популяции клеток до их конструирования таким образом, чтобы они экспрессировали CAR. В некоторых вариантах осуществления популяция содержит клетку, раскрытую в данном документе. В некоторых вариантах осуществления популяция содержит клетку, содержащую двойной CAR или CAR в формате диатела, раскрытые в данном документе. В некоторых вариантах осуществления популяция содержит клетку, содержащую (a) первый антигенсвязывающий домен, который представляет собой домен, связывающий BCMA, где домен, связывающий BCMA, содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (CDR1 HC), определяющую комплементарность область 2 тяжелой цепи (CDR2 HC) и определяющую комплементарность область 3 тяжелой цепи (CDR3 HC), и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (CDR1 LC), определяющую комплементарность область 2 легкой цепи (CDR2 LC) и определяющую комплементарность область 3 легкой цепи (CDR3 LC), где CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под (i) SEQ ID NO: 86, 130, 88, 95, 131 и 132 соответственно; (ii) SEQ ID NO: 44, 45, 84, 54, 55 и 56 соответственно или (iii) SEQ ID NO: 179, 180, 181, 147, 182 и 183 соответственно; и (b) второй антигенсвязывающий домен.

В некоторых вариантах осуществления в данном документе раскрыта фармацевтическая композиция, содержащая клетку, раскрытую в данном документе, или популяцию клеток, раскрытую в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель.

В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток получают посредством способа, раскрытого в данном документе. В некоторых вариантах осуществления популяция содержит:

(a) первую популяцию клеток, содержащих CAR для BCMA, но не CAR для CD19;

(b) вторую популяцию клеток, содержащих CAR для CD19, но не CAR для BCMA; и

(c) третью популяцию клеток, содержащих как CAR для BCMA, так и CAR для CD19.

В некоторых вариантах осуществления:

(i) общее количество жизнеспособных клеток в объединенных второй и третьей популяциях меньше или равняется приблизительно 110% (например, меньше или равняется приблизительно 105%, 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1% или меньше) от общего количества жизнеспособных клеток в объединенных первой и третьей популяциях;

(ii) общее количество жизнеспособных клеток в объединенных первой и третьей популяциях больше или равняется приблизительно 90% (например, больше или равняется приблизительно 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 750%, 1000%, 2000% , 5000, 10000% или больше) от общего количества жизнеспособных клеток в объединенных второй и третьей популяциях; и/или

(iii) общее количество жизнеспособных клеток в объединенных первой и третьей популяциях больше или равняется приблизительно 5% (например, больше или равняется приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%) от общего количества жизнеспособных клеток в популяции.

В некоторых вариантах осуществления популяция дополнительно содержит четвертую популяцию клеток, которые не содержат CAR.

В некоторых вариантах осуществления:

(i) общее количество жизнеспособных клеток во второй популяции меньше или равняется приблизительно 110% (например, меньше или равняется приблизительно 105%, 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1% или меньше) от общего количества жизнеспособных клеток в объединенных первой и третьей популяциях;

(ii) общее количество жизнеспособных клеток во второй популяции меньше или равняется от приблизительно 45% до приблизительно 50% (например, приблизительно 47%); от приблизительно 50 до приблизительно 55% (например, приблизительно 53%); от приблизительно 60% до приблизительно 65% (например, приблизительно 63%) или от приблизительно 80 до приблизительно 85% (например, приблизительно 82%) от общего количества жизнеспособных клеток в объединенных первой и третьей популяциях.

В некоторых вариантах осуществления в данном документе раскрыт способ обеспечения противоопухолевого иммунитета у субъекта, включающий введение субъекту эффективного количества клетки, раскрытой в данном документе, популяции клеток, раскрытых в данном документе, или фармацевтической композиции, раскрытой в данном документе. В некоторых вариантах осуществления в данном документе раскрыт способ лечения субъекта, у которого имеется заболевание, ассоциированное с экспрессией BCMA, включающий введение субъекту эффективного количества клетки, раскрытой в данном документе, популяции клеток, раскрытой в данном документе, или фармацевтической композиции, раскрытой в данном документе. В некоторых вариантах осуществления заболевание, ассоциированное с экспрессией BCMA, представляет собой (i) рак, или злокачественное новообразование, или предраковое состояние, выбранное из одного или нескольких из миелодисплазии, миелодиспластического синдрома или предлейкоза, или (ii) не связанное с раком показание, ассоциированное с экспрессией BCMA. В некоторых вариантах осуществления заболевание представляет собой гематологический рак или солидный рак. В некоторых вариантах осуществления заболевание выбрано из острого лейкоза, B-клеточного острого лимфоидного лейкоза ("BALL"), T-клеточного острого лимфоидного лейкоза ("TALL"), острого лимфоидного лейкоза (ALL), хронического миелогенного лейкоза (CML), хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL), B-клеточного пролимфоцитарного лейкоза, новообразования из бластных плазмоцитоидных дендритных клеток, лимфомы Беркитта, диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомы, фолликулярной лимфомы, волосатоклеточного лейкоза, мелкоклеточной или крупноклеточной фолликулярной лимфомы, злокачественных лимфопролиферативных состояний, MALT-лимфомы, мантийноклеточной лимфомы, лимфомы из клеток маргинальной зоны, множественной миеломы, миелодисплазии и миелодиспластического синдрома, неходжкинской лимфомы, плазмобластной лимфомы, новообразования из плазмоцитоидных дендритных клеток, макроглобулинемии Вальденстрема, рака предстательной железы (например, кастрационнорезистентного или резистентного к терапии рака предстательной железы или метастатического рака предстательной железы), рака поджелудочной железы, рака легкого, нарушения пролиферации плазматических клеток (например, бессимптомной миеломы ("тлеющей" множественной миеломы или вялотекущей миеломы), моноклональной гаммапатии неустановленной этиологии (MGUS), макроглобулинемии Вальденстрема, плазмоцитомы (например, плазмоклеточной дискразии, солитарной миеломы, солитарной плазмоцитомы, экстрамедуллярной плазмоцитомы и множественной плазмоцитомы), системного амилоидоза в форме амилоидоза легких цепей или POEMS-синдрома (также известного как синдром Кроу-Фукаса, болезнь Такатсуки и PEP-синдром)) или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления заболевание представляет собой множественную миелому.

В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток или фармацевтическую композицию вводят субъекту в дозе от приблизительно 1×10⁶ до приблизительно 1×10⁸(например, от приблизительно 2×10⁶ до приблизительно 5×10⁷, от приблизительно 5×10⁶ до приблизительно 2×10⁷, от приблизительно 1×10⁶ до приблизительно 1×10⁷, от приблизительно 1×10⁷ до приблизительно 1×10⁸, от приблизительно 1×10⁶ до приблизительно 3×10⁶, от приблизительно 2×10⁶ до приблизительно 4×10⁶, от приблизительно 3×10⁶ до приблизительно 5×10⁶, от приблизительно 4×10⁶ до приблизительно 6×10⁶, от приблизительно 5×10⁶ до приблизительно 7×10⁶, от приблизительно 6×10⁶ до приблизительно 8×10⁶, от приблизительно 7×10⁶ до приблизительно 9×10⁶, от приблизительно 8×10⁶ до приблизительно 1×10⁷, от приблизительно 9×10⁶ до приблизительно 2×10⁷, от приблизительно 1×10⁷ до приблизительно 3×10⁷, от приблизительно 2×10⁷ до приблизительно 4×10⁷, от приблизительно 3×10⁷ до приблизительно 5×10⁷, от приблизительно 4×10⁷ до приблизительно 6×10⁷, от приблизительно 5×10⁷ до приблизительно 7×10⁷, от приблизительно 6×10⁷ до приблизительно 8×10⁷, от приблизительно 7×10⁷ до приблизительно 9×10⁷, от приблизительно 8×10⁷ до приблизительно 1×10⁸, приблизительно 1×10⁶, приблизительно 2×10⁶, приблизительно 3×10⁶, приблизительно 4×10⁶, приблизительно 5×10⁶, приблизительно 6×10⁶, приблизительно 7×10⁶, приблизительно 8×10⁶, приблизительно 9×10⁶, приблизительно 1×10⁷, приблизительно 2×10⁷, приблизительно 3×10⁷, приблизительно 4×10⁷, приблизительно 5×10⁷, приблизительно 6×10⁷, приблизительно 7×10⁷, приблизительно 8×10⁷, приблизительно 9×10⁷ или приблизительно 1×10⁸) CAR-положительных жизнеспособных клеток (например, BCMA-CAR+ Т-клеток). В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток или фармацевтическую композицию вводят субъекту в дозе от приблизительно 5×10⁶ до приблизительно 2×10⁷ CAR-положительных жизнеспособных клеток (например, BCMA-CAR+ Т-клеток).

В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток или фармацевтическую композицию вводят субъекту в одной или нескольких (например, 2, 3, 4 или больше) дозах. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток или фармацевтическую композицию вводят субъекту в двух дозах. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько доз включают первую дозу и вторую дозу, где количество CAR-положительных жизнеспособных клеток (например, BCMA-CAR+ Т-клеток) в первой дозе больше количества, равняется количеству или меньше количества CAR-положительных жизнеспособных клеток (например, BCMA-CAR+ Т-клеток) во второй дозе.

В некоторых вариантах осуществления одна или несколько доз включают первую дозу и вторую дозу, где:

(a) первая доза содержит от приблизительно 1×10⁶ до приблизительно 1×10⁷ (например, от приблизительно 2×10⁶ до приблизительно 8×10⁶, от приблизительно 4×10⁶ до приблизительно 6×10⁶, от приблизительно 1×10⁶ до приблизительно 5×10⁶, от приблизительно 5×10⁶ до приблизительно 1×10⁷, от приблизительно 1×10⁶ до приблизительно 3×10⁶, от приблизительно 2×10⁶ до приблизительно 4×10⁶, от приблизительно 3×10⁶ до приблизительно 5×10⁶, от приблизительно 4×10⁶ до приблизительно 6×10⁶, от приблизительно 5×10⁶ до приблизительно 7×10⁶, от приблизительно 6×10⁶ до приблизительно 8×10⁶, от приблизительно 7×10⁶ до приблизительно 9×10⁶, от приблизительно 8×10⁶ до приблизительно 1×10⁷, приблизительно 1×10⁶, приблизительно 2×10⁶, приблизительно 3×10⁶, приблизительно 4×10⁶, приблизительно 5×10⁶, приблизительно 6×10⁶, приблизительно 7×10⁶, приблизительно 8×10⁶, приблизительно 9×10⁶ или приблизительно 1×10⁷) жизнеспособных CAR-положительных клеток (например, BCMA-CAR+ Т-клеток);

(b) вторая доза содержит от приблизительно 1×10⁷ до приблизительно 1×10⁸ (например, от приблизительно 2×10⁷ до приблизительно 8×10⁷, от приблизительно 4×10⁷ до приблизительно 6×10⁷, от приблизительно 1×10⁷ до приблизительно 5×10⁷, от приблизительно 5×10⁷ до приблизительно 1×10⁸, от приблизительно 1×10⁷ до приблизительно 3×10⁷, от приблизительно 2×10⁷ до приблизительно 4×10⁷, от приблизительно 3×10⁷ до приблизительно 5×10⁷, от приблизительно 4×10⁷ до приблизительно 6×10⁷, от приблизительно 5×10⁷ до приблизительно 7×10⁷, от приблизительно 6×10⁷ до приблизительно 8×10⁷, от приблизительно 7×10⁷ до приблизительно 9×10⁷, от приблизительно 8×10⁷ до приблизительно 1×10⁸, приблизительно 1×10⁷, приблизительно 2×10⁷, приблизительно 3×10⁷, приблизительно 4×10⁷, приблизительно 5×10⁷, приблизительно 6×10⁷, приблизительно 7×10⁷, приблизительно 8×10⁷, приблизительно 9×10⁷ или приблизительно 1×10⁸) CAR-положительных жизнеспособных клеток (например, BCMA-CAR+ Т-клеток);

(c) количество CAR-положительных жизнеспособных клеток (например, BCMA-CAR+ Т-клеток) в первой дозе составляет не более чем 1/X, где X равняется 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100, от количества CAR-положительных жизнеспособных клеток (например, BCMA-CAR+ Т-клеток) во второй дозе; и/или

(d) количество CAR-положительных жизнеспособных клеток (например, BCMA-CAR+ Т-клеток) в первой дозе составляет от приблизительно 1% до 100% (например, от приблизительно 10% до приблизительно 90%, от приблизительно 20% до приблизительно 80%, от приблизительно 30% до приблизительно 70%, от приблизительно 40% до приблизительно 60%, от приблизительно 10% до приблизительно 50%, от приблизительно 50% до приблизительно 90%, от приблизительно 10% до приблизительно 30%, от приблизительно 20% до приблизительно 40%, от приблизительно 30% до приблизительно 50%, от приблизительно 50% до приблизительно 70%, от приблизительно 60% до приблизительно 80% или от приблизительно 70% до приблизительно 90%) от количества CAR-положительных жизнеспособных клеток (например, BCMA-CAR+ Т-клеток) во второй дозе.

В некоторых вариантах осуществления первая доза содержит приблизительно 5×10⁶ жизнеспособных CAR-положительных клеток (например, BCMA-CAR+ Т-клеток). В некоторых вариантах осуществления вторая доза содержит приблизительно 1×10⁷ или приблизительно 2×10⁷ жизнеспособных CAR-положительных клеток (например, BCMA-CAR+ Т-клеток).

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение субъекту второго терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления второе терапевтическое средство выбрано из (i) ингибитора PD-1, где ингибитор PD-1 необязательно выбран из группы, состоящей из PDR001, ниволумаба, пембролизумаба, пидилизумаба, MEDI0680, REGN2810, TSR-042, PF-06801591 и AMP-224; (ii) ингибитора PD-L1, где ингибитор PD-L1 необязательно выбран из группы, состоящей из FAZ053, атезолизумаба, авелумаба, дурвалумаба и BMS-936559; (iii) ингибитора LAG-3, где ингибитор LAG-3 необязательно выбран из группы, состоящей из LAG525, BMS-986016, TSR-033, MK-4280 и REGN3767; (iv) ингибитора TIM-3, где ингибитор TIM-3 необязательно выбран из группы, состоящей из MBG453, TSR-022 и LY3321367; (v) ингибитора CTLA-4, где ингибитор CTLA-4 необязательно представляет собой ипилимумаб или тремелимумаб; (vi) полипептида интерлейкина-15 (IL-15), полипептида альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-15 (IL-15Ra) или комбинации как полипептида IL-15, так и полипептида IL-15Ra, например, hetIL-15; (vii) полипептида интерлейкина-12 (IL-12); или (viii) ингибитора mTOR, где ингибитор mTOR необязательно представляет собой RAD001 или рапамицин.

В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрена клетка, содержащая (a) первый CAR, содержащий первый антигенсвязывающий домен, который связывается с первым антигеном, первый трансмембранный домен и первый внутриклеточный сигнальный домен (например, первый первичный сигнальный домен и/или первый костимулирующий сигнальный домен), где первый CAR необязательно дополнительно содержит первую лидерную последовательность и/или первую шарнирную область; и (b) второй CAR, содержащий второй антигенсвязывающий домен, который связывается со вторым антигеном, второй трансмембранный домен и второй внутриклеточный сигнальный домен (например, второй первичный сигнальный домен и/или второй костимулирующий сигнальный домен), где второй CAR необязательно дополнительно содержит вторую лидерную последовательность и/или вторую шарнирную область, где (i) первая лидерная последовательность и вторая лидерная последовательность кодируются разными последовательностями нуклеиновой кислоты (например, отличающимися на по меньшей мере 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, или 100%), где первая и вторая лидерные последовательности необязательно содержат одинаковые аминокислотные последовательности; (ii) первая шарнирная область и вторая шарнирная область кодируются разными последовательностями нуклеиновой кислоты (например, отличающимися на по меньшей мере 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, или 100%), где первая и вторая шарнирные области необязательно содержат одинаковые аминокислотные последовательности; (iii) первый трансмембранный домен и второй трансмембранный домен кодируются разными последовательностями нуклеиновой кислоты (например, отличающимися на по меньшей мере 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, или 100%), где первый и второй трансмембранные домены необязательно содержат одинаковые аминокислотные последовательности; и/или (iv) первый внутриклеточный сигнальный домен и второй внутриклеточный сигнальный домен кодируются разными последовательностями нуклеиновой кислоты (например, отличающимися на по меньшей мере 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, или 100%), где необязательно первый первичный сигнальный домен и второй первичный сигнальный домен кодируются разными последовательностями нуклеиновой кислоты (например, отличающимися на по меньшей мере 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, или 100%) и/или первый костимулирующий сигнальный домен и второй костимулирующий сигнальный домен кодируются разными последовательностями нуклеиновой кислоты (например, отличающимися на по меньшей мере 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, или 100%).

В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрена молекула нуклеиновой кислоты, содержащая (a) первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую первый CAR, где первый CAR содержит первый антигенсвязывающий домен, который связывается с первым антигеном, первый трансмембранный домен и первый внутриклеточный сигнальный домен (например, первый первичный сигнальный домен и/или первый костимулирующий сигнальный домен), где первый CAR необязательно дополнительно содержит первую лидерную последовательность и/или первую шарнирную область; и (b) вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую второй CAR, где второй CAR содержит второй антигенсвязывающий домен, который связывается со вторым антигеном, второй трансмембранный домен и второй внутриклеточный сигнальный домен (например, второй первичный сигнальный домен и/или второй костимулирующий сигнальный домен), где второй CAR необязательно дополнительно содержит вторую лидерную последовательность и/или вторую шарнирную область, где (i) первая лидерная последовательность и вторая лидерная последовательность кодируются разными последовательностями нуклеиновой кислоты (например, отличающимися на по меньшей мере 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, или 100%), где первая и вторая лидерные последовательности необязательно содержат одинаковые аминокислотные последовательности; (ii) первая шарнирная область и вторая шарнирная область кодируются разными последовательностями нуклеиновой кислоты (например, отличающимися на по меньшей мере 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, или 100%), где первая и вторая шарнирные области необязательно содержат одинаковые аминокислотные последовательности; (iii) первый трансмембранный домен и второй трансмембранный домен кодируются разными последовательностями нуклеиновой кислоты (например, отличающимися на по меньшей мере 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, или 100%), где первый и второй трансмембранные домены необязательно содержат одинаковые аминокислотные последовательности; и/или (iv) первый внутриклеточный сигнальный домен и второй внутриклеточный сигнальный домен кодируются разными последовательностями нуклеиновой кислоты (например, отличающимися на по меньшей мере 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, или 100%), где первый внутриклеточный сигнальный домен и второй внутриклеточный сигнальный домен необязательно содержат одинаковые аминокислотные последовательности.

В некоторых вариантах осуществления первая и вторая лидерные последовательности содержат одинаковые аминокислотные последовательности. Не ограничиваясь какой-либо теорией, полагают, что такая молекула нуклеиновой кислоты демонстрирует меньшую рекомбинацию, чем в остальном сходная молекула нуклеиновой кислоты, в которой первая лидерная последовательность и вторая лидерная последовательность кодируются одинаковыми последовательностями нуклеиновой кислоты.

В некоторых вариантах осуществления первая и вторая шарнирные области содержат одинаковые аминокислотные последовательности. Не ограничиваясь какой-либо теорией, полагают, что такая молекула нуклеиновой кислоты демонстрирует меньшую рекомбинацию, чем в остальном сходная молекула нуклеиновой кислоты, в которой первая шарнирная область и вторая шарнирная область кодируются одинаковыми последовательностями нуклеиновой кислоты.

В некоторых вариантах осуществления первый и второй трансмембранные домены содержат одинаковые аминокислотные последовательности. Не ограничиваясь какой-либо теорией, полагают, что такая молекула нуклеиновой кислоты демонстрирует меньшую рекомбинацию, чем в остальном сходная молекула нуклеиновой кислоты, в которой первый трансмембранный домен и второй трансмембранный домен кодируются одинаковыми последовательностями нуклеиновой кислоты.

В некоторых вариантах осуществления первый внутриклеточный сигнальный домен и второй внутриклеточный сигнальный домен содержат одинаковые аминокислотные последовательности. Не ограничиваясь какой-либо теорией, полагают, что такая молекула нуклеиновой кислоты демонстрирует меньшую рекомбинацию, чем в остальном сходная молекула нуклеиновой кислоты, в которой первый внутриклеточный сигнальный домен и второй внутриклеточный сигнальный домен кодируются одинаковыми последовательностями нуклеиновой кислоты.

В некоторых вариантах осуществления первый первичный сигнальный домен и второй первичный сигнальный домен содержат одинаковые аминокислотные последовательности. Не ограничиваясь какой-либо теорией, полагают, что такая молекула нуклеиновой кислоты демонстрирует меньшую рекомбинацию, чем в остальном сходная молекула нуклеиновой кислоты, в которой первый первичный сигнальный домен и второй первичный сигнальный домен кодируются одинаковыми последовательностями нуклеиновой кислоты.

В некоторых вариантах осуществления первый первичный сигнальный домен и второй первичный сигнальный домен содержат разные аминокислотные последовательности.

В некоторых вариантах осуществления первый костимулирующий сигнальный домен и второй костимулирующий сигнальный домен содержат одинаковые аминокислотные последовательности. Не ограничиваясь какой-либо теорией, полагают, что такая молекула нуклеиновой кислоты демонстрирует меньшую рекомбинацию, чем в остальном сходная молекула нуклеиновой кислоты, в которой первый костимулирующий сигнальный домен и второй костимулирующий сигнальный домен кодируются одинаковыми последовательностями нуклеиновой кислоты.

В некоторых вариантах осуществления первый костимулирующий сигнальный домен и второй костимулирующий сигнальный домен содержат разные аминокислотные последовательности (например, первый и второй костимулирующие сигнальные домены содержат последовательность костимулирующего домена 4-1BB и последовательность костимулирующего домена CD28 соответственно или содержат последовательность костимулирующего домена CD28 и последовательность костимулирующего домена 4-1BB соответственно).

В некоторых вариантах осуществления первая лидерная последовательность и вторая лидерная последовательность содержат аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления первая лидерная последовательность и вторая лидерная последовательность кодируются последовательностями нуклеиновой кислоты, содержащими SEQ ID NO: 199 и 210 соответственно (или последовательностью нуклеиновой кислоты, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ними) или SEQ ID NO: 210 и 199 соответственно (или последовательностью нуклеиновой кислоты, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ними).

В некоторых вариантах осуществления первая шарнирная область и вторая шарнирная область содержат аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления первая шарнирная область и вторая шарнирная область кодируются последовательностями нуклеиновой кислоты, содержащими SEQ ID NO: 337 и 13 соответственно (или последовательностью нуклеиновой кислоты, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ними) или SEQ ID NO: 13 и 337 соответственно (или последовательностью нуклеиновой кислоты, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ними).

В некоторых вариантах осуществления первый трансмембранный домен и второй трансмембранный домен содержат аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления первый трансмембранный домен и второй трансмембранный домен кодируются последовательностями нуклеиновой кислоты, содержащими SEQ ID NO: 338 и 17 соответственно (или последовательностью нуклеиновой кислоты, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ними) или SEQ ID NO: 17 и 338 соответственно (или последовательностью нуклеиновой кислоты, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ними).

В некоторых вариантах осуществления первый костимулирующий сигнальный домен и второй костимулирующий сигнальный домен содержат аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления первый костимулирующий сигнальный домен и второй костимулирующий сигнальный домен кодируются последовательностями нуклеиновой кислоты, содержащими SEQ ID NO: 204 и 18 соответственно (или последовательностью нуклеиновой кислоты, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ними) или SEQ ID NO: 18 и 204 соответственно (или последовательностью нуклеиновой кислоты, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ними).

В некоторых вариантах осуществления первый первичный сигнальный домен и второй первичный сигнальный домен содержат аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 10 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления первый первичный сигнальный домен и второй первичный сигнальный домен кодируются последовательностями нуклеиновой кислоты, содержащими SEQ ID NO: 205 и 21 соответственно (или последовательностью нуклеиновой кислоты, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ними) или SEQ ID NO: 21 и 205 соответственно (или последовательностью нуклеиновой кислоты, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ними).

В некоторых вариантах осуществления первый и второй антигены являются разными. В некоторых вариантах осуществления первый или второй антиген выбран из BCMA, CD19, CD5, CD10, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD27, CD30, CD34, CD37, CD38, CD40, CD53, CD69, CD72, CD73, CD74, CD75, CD77, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CD84, CD85, CD86, CD123, CD135, CD138, CD179, CD269, Flt3, ROR1, FcRn5, FcRn2, CS-1, CXCR4, 5, 7, IL-7/3R, IL7/4/3R или IL4R, где В-клеточный антиген необязательно выбран из CD19, CD20, CD22, FcRn5, FcRn2, CS-1, CD138, CD123, CD33, CD34, CLL-1, рецептора фолиевой кислоты бета, FLT3, EGFRvIII, мезотелина, GD2, Tn-антигена, sTn-антигена, Tn-O-гликопептидов, sTn-O-гликопептидов, PSMA, CD97, TAG72, CD44v6, CEA, EPCAM, KIT, IL-13Ra2, легумана, GD3, CD171, IL-11Ra, PSCA, MAD-CT-1, MAD-CT-2, VEGFR2, антигена Y системы Льюис, CD24, PDGFR-бета, SSEA-4, рецептора фолиевой кислоты альфа, ERBB (например, ERBB2), Her2/neu, MUC1, EGFR, NCAM, эфрина B2, CAIX, LMP2, sLe, HMWMAA, o-ацетил-GD2, рецептора фолиевой кислоты бета, TEM1/CD248, TEM7R, FAP, легумаина, E6 или E7 HPV, ML-IAP, CLDN6, TSHR, GPRC5D, ALK, полисиаловой кислоты, Fos-родственного антигена, эластазы нейтрофилов, TRP-2, CYP1B1, белка спермы 17, бета-субъединицы хорионического гонадотропина человека, AFP, тиреоглобулина, PLAC1, globoH, RAGE1, MN-CA IX, обратной транскриптазы теломеразы человека, кишечной карбоксилэстеразы, мутантного варианта hsp 70-2, NA-17, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, NY-ESO-1, GPR20, Ly6k, OR51E2, TARP, GFRα4 или пептида любого из этих антигенов, презентированного на MHC. В некоторых вариантах осуществления первый или второй антигенсвязывающий домен содержит CDR, VH, VL или scFv, раскрытые в данном документе, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ними.

В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрен CAR, содержащий первую VH (VH1), первую VL (VL1), вторую VH (VH2), вторую VL (VL2), трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, где VH1 и VL1 связываются с первым антигеном, а VH2 и VL2 связываются со вторым антигеном. В некоторых вариантах осуществления VH1, VL1, VH2 и VL2 расположены в следующей конфигурации от N-конца до C-конца: VH1 - необязательно линкер 1 ("L1") - VH2 - необязательно линкер 2 ("L2") - VL2 - необязательно линкер 3 ("L3") - VL1. В некоторых вариантах осуществления VH1, VL1, VH2 и VL2 расположены в следующей конфигурации от N-конца до C-конца: VH1 - необязательно L1 - VL2 - необязательно L2 - VH2 - необязательно L3 - VL1. В некоторых вариантах осуществления VH1, VL1, VH2 и VL2 расположены в следующей конфигурации от N-конца до C-конца: VL1 - необязательно L1 - VH2 - необязательно L2 - VL2 - необязательно L3 - VH1. В некоторых вариантах осуществления VH1, VL1, VH2 и VL2 расположены в следующей конфигурации от N-конца до C-конца: VL1 - необязательно L1 - VL2 - необязательно L2 - VH2 - необязательно L3 - VH1. В некоторых вариантах осуществления VH1, VL1, VH2 и VL2 расположены в следующей конфигурации от N-конца до C-конца: VH2 - необязательно L1 - VH1 - необязательно L2 - VL1 - необязательно L3 - VL2. В некоторых вариантах осуществления VH1, VL1, VH2 и VL2 расположены в следующей конфигурации от N-конца до C-конца: VH2 - необязательно L1 - VL1 - необязательно L2 - VH1 - необязательно L3 - VL2. В некоторых вариантах осуществления VH1, VL1, VH2 и VL2 расположены в следующей конфигурации от N-конца до C-конца: VL2 - необязательно L1 - VH1 - необязательно L2 - VL1 - необязательно L3 - VH2. В некоторых вариантах осуществления VH1, VL1, VH2 и VL2 расположены в следующей конфигурации от N-конца до C-конца: VL2 - необязательно L1 - VL1 - необязательно L2 - VH1 - необязательно L3 - VH2. В некоторых вариантах осуществления VH1, VL1, VH2 и VL2 расположены в следующей конфигурации от N-конца до C-конца: VH1 - линкер 1 ("L1") - VH2 - линкер 2 ("L2") - VL2 - линкер 3 ("L3") - VL1. В некоторых вариантах осуществления VH1, VL1, VH2 и VL2 расположены в следующей конфигурации от N-конца до C-конца: VH1 - L1 - VL2 - L2 - VH2 - L3 - VL1. В некоторых вариантах осуществления VH1, VL1, VH2 и VL2 расположены в следующей конфигурации от N-конца до C-конца: VL1 - L1 - VH2 - L2 - VL2 - L3 - VH1. В некоторых вариантах осуществления VH1, VL1, VH2 и VL2 расположены в следующей конфигурации от N-конца до C-конца: VL1 - L1 - VL2 - L2 - VH2 - L3 - VH1. В некоторых вариантах осуществления VH1, VL1, VH2 и VL2 расположены в следующей конфигурации от N-конца до C-конца: VH2 - L1 - VH1 - L2 - VL1 - L3 - VL2. В некоторых вариантах осуществления VH1, VL1, VH2 и VL2 расположены в следующей конфигурации от N-конца до C-конца: VH2 - L1 - VL1 - L2 - VH1 - L3 - VL2. В некоторых вариантах осуществления VH1, VL1, VH2 и VL2 расположены в следующей конфигурации от N-конца до C-конца: VL2 - L1 - VH1 - L2 - VL1 - L3 - VH2. В некоторых вариантах осуществления VH1, VL1, VH2 и VL2 расположены в следующей конфигурации от N-конца до C-конца: VL2 - L1 - VL1 - L2 - VH1 - L3 - VH2. В некоторых вариантах осуществления L1 или L3 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 5 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления L2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 63 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления CAR имеет следующую конфигурацию от N-конца до C-конца: (i) VH1 - необязательно линкер 1 ("L1") - VH2 - необязательно линкер 2 ("L2") - VL2 - необязательно линкер 3 ("L3") - VL1 - необязательно шарнирная область - трансмембранный домен - внутриклеточный сигнальный домен; (ii) VH1 - необязательно L1 - VL2 - необязательно L2 - VH2 - необязательно L3 - VL1 - необязательно шарнирная область - трансмембранный домен - внутриклеточный сигнальный домен; (iii) VL1 - необязательно L1 - VH2 - необязательно L2 - VL2 - необязательно L3 - VH1 - необязательно шарнирная область - трансмембранный домен - внутриклеточный сигнальный домен; (iv) VL1 - необязательно L1 - VL2 - необязательно L2 - VH2 - необязательно L3 - VH1 - необязательно шарнирная область - трансмембранный домен - внутриклеточный сигнальный домен; (v) VH2 - необязательно L1 - VH1 - необязательно L2 - VL1 - необязательно L3 - VL2 - необязательно шарнирная область - трансмембранный домен - внутриклеточный сигнальный домен; (vi) VH2 - необязательно L1 - VL1 - необязательно L2 - VH1 - необязательно L3 - VL2 - необязательно шарнирная область - трансмембранный домен - внутриклеточный сигнальный домен; (vii) VL2 - необязательно L1 - VH1 - необязательно L2 - VL1 - необязательно L3 - VH2 - необязательно шарнирная область - трансмембранный домен - внутриклеточный сигнальный домен; или (viii) VL2 - необязательно L1 - VL1 - необязательно L2 - VH1 - необязательно L3 - VH2 - необязательно шарнирная область - трансмембранный домен - внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления первый и второй антигены являются разными. В некоторых вариантах осуществления первый или второй антиген выбран из BCMA, CD19, CD5, CD10, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD27, CD30, CD34, CD37, CD38, CD40, CD53, CD69, CD72, CD73, CD74, CD75, CD77, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CD84, CD85, CD86, CD123, CD135, CD138, CD179, CD269, Flt3, ROR1, FcRn5, FcRn2, CS-1, CXCR4, 5, 7, IL-7/3R, IL7/4/3R или IL4R, где В-клеточный антиген необязательно выбран из CD19, CD20, CD22, FcRn5, FcRn2, CS-1, CD138, CD123, CD33, CD34, CLL-1, рецептора фолиевой кислоты бета, FLT3, EGFRvIII, мезотелина, GD2, Tn-антигена, sTn-антигена, Tn-O-гликопептидов, sTn-O-гликопептидов, PSMA, CD97, TAG72, CD44v6, CEA, EPCAM, KIT, IL-13Ra2, легумана, GD3, CD171, IL-11Ra, PSCA, MAD-CT-1, MAD-CT-2, VEGFR2, антигена Y системы Льюис, CD24, PDGFR-бета, SSEA-4, рецептора фолиевой кислоты альфа, ERBB (например, ERBB2), Her2/neu, MUC1, EGFR, NCAM, эфрина B2, CAIX, LMP2, sLe, HMWMAA, o-ацетил-GD2, рецептора фолиевой кислоты бета, TEM1/CD248, TEM7R, FAP, легумаина, E6 или E7 HPV, ML-IAP, CLDN6, TSHR, GPRC5D, ALK, полисиаловой кислоты, Fos-родственного антигена, эластазы нейтрофилов, TRP-2, CYP1B1, белка спермы 17, бета-субъединицы хорионического гонадотропина человека, AFP, тиреоглобулина, PLAC1, globoH, RAGE1, MN-CA IX, обратной транскриптазы теломеразы человека, кишечной карбоксилэстеразы, мутантного варианта hsp 70-2, NA-17, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, NY-ESO-1, GPR20, Ly6k, OR51E2, TARP, GFRα4 или пептида любого из этих антигенов, презентированного на MHC. В некоторых вариантах осуществления VH1, VL1, VH2 или VL2 содержат последовательность CDR, VH или VL, раскрытую в данном документе, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления шарнирная область, трансмембранный домен или внутриклеточный сигнальный домен (например, первичный сигнальный домен и/или костимулирующий сигнальный домен) содержат последовательность шарнирной области, последовательность трансмембранного домена или последовательность внутриклеточного сигнального домена (например, последовательность первичного сигнального домена и/или последовательность костимулирующего сигнального домена), раскрытую в данном документе, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней.

В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрена молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая CAR в формате диатела, раскрытый в данном документе. В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрен вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR в формате диатела, раскрытый в данном документе. В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрена клетка, содержащая CAR, раскрытый в данном документе, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR в формате диатела, раскрытый в данном документе, или вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR в формате диатела, раскрытый в данном документе. В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрена фармацевтическая композиция, которая содержит клетку, содержащую CAR в формате диатела, раскрытый в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых вариантах осуществления в данном документе раскрыт способ получения клетки, содержащей CAR в формате диатела, раскрытый в данном документе. В некоторых вариантах осуществления в данном документе раскрыт способ лечения субъекта, например, субъекта с раком, с применением клетки, содержащей CAR в формате диатела, раскрытый в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам получения иммунных эффекторных клеток (например, T-клеток или NK-клеток), сконструированных таким образом, что они экспрессируют CAR, и композиций, полученных с применением таких способов. Способы, раскрытые в данном документе (например, способ ARM или способ с использованием цитокинов, раскрытый в данном документе), можно применять для получения клеток, экспрессирующих двойные CAR или CAR в формате диатела, раскрытые в данном документе. Также раскрыты способы применения таких композиций для лечения заболевания, например, рака, у субъекта.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении описан способ получения популяции клеток (например, T-клеток), которые экспрессируют химерный антигенный рецептор (CAR), при этом способ включает: (i) приведение популяции клеток (например, T-клеток, например, T-клеток, выделенных из замороженного или свежего продукта лейкафереза) в контакт (например, связывание) со средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу на поверхности клеток; (ii) приведение популяции клеток (например, T-клеток) в контакт с молекулой нуклеиновой кислоты (например, молекулой ДНК или РНК), кодирующей CAR, за счет чего обеспечивается получение популяции клеток (например, T-клеток), содержащих молекулу нуклеиновой кислоты, и (iii) сбор популяции клеток (например, T-клеток) для хранения (например, повторного составления популяции клеток в среде для криоконсервации) или введения, где: (a) стадию (ii) проводят вместе со стадией (i) или не позже чем через 20 часов после начала стадии (i), например, не позже чем через 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18 часов после начала стадии (i), например, не позже чем через 18 часов после начала стадии (i), и стадию (iii) проводят не позже чем через 26 часов после начала стадии (i), например, не позже чем через 22, 23, 24 или 25 часов после начала стадии (i), например, не позже чем через 24 часа после начала стадии (i); (b) стадию (ii) проводят вместе со стадией (i) или не позже чем через 20 часов после начала стадии (i), например, не позже чем через 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18 часов после начала стадии (i), например, не позже чем через 18 часов после начала стадии (i), и стадию (iii) проводят не позже чем через 30 часов после начала стадии (ii), например, не позже чем через 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 часов после начала стадии (ii); или (c) популяция клеток из стадии (iii) не является размножившейся или является размножившейся с увеличением численности на не более чем 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, или 40%, например, на не более чем 10%, например, согласно оценке по количеству живых клеток, по сравнению с популяцией клеток в начале стадии (i). В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты на стадии (ii) представляет собой молекулу ДНК. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты на стадии (ii) представляет собой молекулу РНК. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты на стадии (ii) находится в вирусном векторе, например, в вирусном векторе, выбранном из лентивирусного вектора, аденовирусного вектора или ретровирусного вектора. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты на стадии (ii) находится в невирусном векторе. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты на стадии (ii) находится в плазмиде. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты на стадии (ii) не находится в каком-либо векторе. В некоторых вариантах осуществления стадия (ii) включает трансдукцию популяции клеток (например, T-клеток) c помощью вирусного вектора, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR. В некоторых вариантах осуществления стадию (ii) проводят вместе со стадией (i). В некоторых вариантах осуществления стадию (ii) проводят не позже чем через 20 часов после начала стадии (i). В некоторых вариантах осуществления стадию (ii) проводят не позже чем через 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18 часов после начала стадии (i). В некоторых вариантах осуществления стадию (ii) проводят не позже чем через 18 часов после начала стадии (i). В некоторых вариантах осуществления стадию (iii) проводят не позже чем через 26 часов после начала стадии (i). В некоторых вариантах осуществления стадию (iii) проводят не позже чем через 22, 23, 24 или 25 часов после начала стадии (i). В некоторых вариантах осуществления стадию (iii) проводят не позже чем через 24 часа после начала стадии (i). В некоторых вариантах осуществления стадию (iii) проводят не позже чем через 30 часов после начала стадии (ii). В некоторых вариантах осуществления стадию (iii) проводят не позже чем через 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 часов после начала стадии (ii). В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая CAR, представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, раскрытую в данном документе. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую первый CAR, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую второй CAR. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая последовательности нуклеиновой кислоты расположены в одной молекуле нуклеиновой кислоты, например, где первая последовательность нуклеиновой кислоты и вторая последовательность нуклеиновой кислоты разделены третьей последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей сайт саморасщепления (например, сайт P2A, сайт Т2A, сайт Е2A или сайт F2A). В некоторых вариантах осуществления первая и вторая последовательности нуклеиновой кислоты расположены в отдельных молекулах нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR, где CAR содержит первую VH (VH1), первую VL (VL1), вторую VH (VH2), вторую VL (VL2), трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, где VH1 и VL1 связываются с первым антигеном, а VH2 и VL2 связываются со вторым антигеном, где VH1, VL1, VH2 и VL2 расположены в следующей конфигурации от N-конца до C-конца: VH1 - необязательно линкер 1 ("L1") - VH2 - необязательно линкер 2 ("L2") - VL2 - необязательно линкер 3 ("L3") - VL1, VH1 - необязательно L1 - VL2 - необязательно L2 - VH2 - необязательно L3 - VL1, VL1 - необязательно L1 - VH2 - необязательно L2 - VL2 - необязательно L3 - VH1, VL1 - необязательно L1 - VL2 - необязательно L2 - VH2 - необязательно L3 - VH1, VH2 - необязательно L1 - VH1 - необязательно L2 - VL1 - необязательно L3 - VL2, VH2 - необязательно L1 - VL1 - необязательно L2 - VH1 - необязательно L3 - VL2, VL2 - необязательно L1 - VH1 - необязательно L2 - VL1 - необязательно L3 - VH2 или VL2 - необязательно L1 - VL1 - необязательно L2 - VH1 - необязательно L3 - VH2.

В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (iii) не является размножившейся. В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (iii) является размножившейся с увеличением численности на не более чем 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, или 40%, например, согласно оценке по количеству живых клеток, по сравнению с популяцией клеток в начале стадии (i). В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (iii) является размножившейся с увеличением численности на не более чем 10%, например, согласно оценке по количеству живых клеток, по сравнению с популяцией клеток в начале стадии (i).

В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую первый CAR, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую второй CAR, где первая и вторая последовательности нуклеиновой кислоты расположены в отдельных молекулах нуклеиновой кислоты.

В некоторых вариантах осуществления первая и вторая молекулы нуклеиновой кислоты находятся в отдельных вирусных векторах, и при этом стадия (ii) включает трансдукцию популяции клеток (например, Т-клеток) с помощью первого вирусного вектора, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую первый CAR, и второго вирусного вектора, содержащего вторую молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую второй CAR.

В некоторых вариантах осуществления первый CAR содержит домен, связывающий BCMA (например, CAR для BCMA), а второй CAR содержит домен, связывающий CD19 (например, CAR для CD19).

В некоторых вариантах осуществления на стадии (ii) популяцию клеток приводят в контакт с первым вирусным вектором при множественности заражения (MOI), которая больше, равняется или меньше MOI, при которой популяцию клеток приводят в контакт со вторым вирусным вектором. В некоторых вариантах осуществления на стадии (ii) популяцию клеток приводят в контакт с первым вирусным вектором при множественности заражения (MOI), которая больше MOI, при которой популяцию клеток приводят в контакт со вторым вирусным вектором.

В некоторых вариантах осуществления на стадии (ii) популяцию клеток приводят в контакт с первым вирусным вектором при первой MOI и со вторым вирусным вектором при второй MOI, так что полученная в результате популяция клеток содержит первую популяцию клеток, которые содержат CAR для BCMA, но не CAR для CD19, вторую популяцию клеток, которые содержат CAR для CD19, но не CAR для BCMA, и третью популяцию клеток, которые содержат как CAR для BCMA, так и CAR для CD19, где:

(a) общее количество жизнеспособных клеток в объединенных второй и третьей популяциях меньше или равняется приблизительно 110% (например, меньше или равняется приблизительно 105%, 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1% или меньше) от общего количества жизнеспособных клеток в объединенных первой и третьей популяциях, например, при определении посредством способа, описанного в примере 10;

(b) общее количество жизнеспособных клеток в объединенных первой и третьей популяциях больше или равняется приблизительно 90% (например, больше или равняется приблизительно 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 750%, 1000%, 2000% , 5000, 10000% или больше) от общего количества жизнеспособных клеток в объединенных второй и третьей популяциях, например, при определении посредством способа, описанного в примере 10;

(c) общее количество жизнеспособных клеток в объединенных первой и третьей популяциях больше или равняется приблизительно 5% (например, больше или равняется приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%) от общего количества жизнеспособных клеток в полученной в результате популяции, например, при определении посредством способа, описанного в примере 10;

(d) общее количество жизнеспособных клеток во второй популяции меньше или равняется приблизительно 110% (например, меньше или равняется приблизительно 105%, 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1% или меньше) от общего количества жизнеспособных клеток в объединенных первой и третьей популяциях, например, при определении посредством способа, описанного в примере 10; или

(e) общее количество жизнеспособных клеток в объединенных первой и третьей популяциях больше или равняется приблизительно 90% (например, больше или равняется приблизительно 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 750%, 1000%, 2000% , 5000, 10000% или больше) от общего количества жизнеспособных клеток во второй популяции, например, при определении посредством способа, описанного в примере 10. В некоторых вариантах осуществления на стадии (ii) популяцию клеток приводят в контакт со вторым вирусным вектором при MOI, например, MOI, которая достаточно ниже, чем MOI, при которой популяцию клеток приводят в контакт с первым вирусным вектором, так что в полученной в результате популяции клеток:

(a) общее количество жизнеспособных клеток в объединенных второй и третьей популяциях меньше или равняется приблизительно 110% (например, меньше или равняется приблизительно 105%, 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1% или меньше) от общего количества жизнеспособных клеток в объединенных первой и третьей популяциях, например, при определении посредством способа, описанного в примере 10;

(b) общее количество жизнеспособных клеток в объединенных первой и третьей популяциях больше или равняется приблизительно 90% (например, больше или равняется приблизительно 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 750%, 1000%, 2000%, 5000, 10000% или больше) от общего количества жизнеспособных клеток в объединенных второй и третьей популяциях, например, при определении посредством способа, описанного в примере 10;

(c) общее количество жизнеспособных клеток в объединенных первой и третьей популяциях больше или равняется приблизительно 5% (например, больше или равняется приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%) от общего количества жизнеспособных клеток в полученной в результате популяции, например, при определении посредством способа, описанного в примере 10;

(d) общее количество жизнеспособных клеток во второй популяции меньше или равняется приблизительно 110% (например, меньше или равняется приблизительно 105%, 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1% или меньше) от общего количества жизнеспособных клеток в объединенных первой и третьей популяциях, например, при определении посредством способа, описанного в примере 10; или

(e) общее количество жизнеспособных клеток в объединенных первой и третьей популяциях больше или равняется приблизительно 90% (например, больше или равняется приблизительно 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 750%, 1000%, 2000%, 5000, 10000% или больше) от общего количества жизнеспособных клеток во второй популяции, например, при определении посредством способа, описанного в примере 10.

В некоторых вариантах осуществления на стадии (ii) популяцию клеток приводят в контакт с первым вирусным вектором при первой MOI и популяцию клеток приводят в контакт со вторым вирусным вектором при второй MOI, так что полученная в результате популяция клеток содержит:

(a) общее количество жизнеспособных клеток в объединенных второй и третьей популяциях меньше или равняется приблизительно 110% (например, меньше или равняется приблизительно 105%, 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1% или меньше) от общего количества жизнеспособных клеток в объединенных первой и третьей популяциях, например, при определении посредством способа, описанного в примере 10;

(b) общее количество жизнеспособных клеток в объединенных первой и третьей популяциях больше или равняется приблизительно 90% (например, больше или равняется приблизительно 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 750%, 1000%, 2000% , 5000, 10000% или больше) от общего количества жизнеспособных клеток в объединенных второй и третьей популяциях, например, при определении посредством способа, описанного в примере 10;

(c) общее количество жизнеспособных клеток в объединенных первой и третьей популяциях больше или равняется приблизительно 5% (например, больше или равняется приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%) от общего количества жизнеспособных клеток в полученной в результате популяции, например, при определении посредством способа, описанного в примере 10;

(d) общее количество жизнеспособных клеток во второй популяции меньше или равняется приблизительно 110% (например, меньше или равняется приблизительно 105%, 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1% или меньше) от общего количества жизнеспособных клеток в объединенных первой и третьей популяциях, например, при определении посредством способа, описанного в примере 10; или

(e) общее количество жизнеспособных клеток в объединенных первой и третьей популяциях больше или равняется приблизительно 90% (например, больше или равняется приблизительно 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 750%, 1000%, 2000%, 5000, 10000% или больше) от общего количества жизнеспособных клеток во второй популяции, например, при определении посредством способа, описанного в примере 10.

В некоторых вариантах осуществления на стадии (ii) популяцию клеток приводят в контакт с:

(a) первым вирусным вектором при MOI, составляющей от приблизительно 1 до приблизительно 10 (например, от приблизительно 2 до приблизительно 9, от приблизительно 3 до приблизительно 8, от приблизительно 4 до приблизительно 7, от приблизительно 5 до приблизительно 6, от приблизительно 1 до приблизительно 8, от приблизительно 1 до приблизительно 6, от приблизительно 1 до приблизительно 4, от приблизительно 8 до приблизительно 10, от приблизительно 6 до приблизительно 10, от приблизительно 4 до приблизительно 10, от приблизительно 1 до приблизительно 3, от приблизительно 2 до приблизительно 4, от приблизительно 3 до приблизительно 5, от приблизительно 4 до приблизительно 6, от приблизительно 5 до приблизительно 7, от приблизительно 6 до приблизительно 8, от приблизительно 7 до приблизительно до приблизительно 9, от приблизительно 8 до приблизительно 10, от приблизительно 2,5 до приблизительно 5, приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9 или приблизительно 10);

(b) вторым вирусным вектором при MOI, составляющей от приблизительно 0,1 до приблизительно 5 (например, от приблизительно 0,2 до приблизительно 4, от приблизительно 0,3 до приблизительно 3, от приблизительно 0,4 до приблизительно 2, от приблизительно 0,5 до приблизительно 1, от приблизительно 0,6 до приблизительно 0,9, от приблизительно 0,7 до приблизительно 0,8, от приблизительно 0,1 до приблизительно 4, от приблизительно 0,1 до приблизительно 3, от приблизительно 0,1 до приблизительно 2, от приблизительно 0,1 до приблизительно 1, от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,5, от приблизительно 4 до приблизительно 5, от приблизительно 3 до приблизительно 5, от приблизительно 2 до приблизительно 5, от приблизительно 1 до приблизительно 5, от приблизительно 0,5 до приблизительно 5, от приблизительно 0,2 до приблизительно 5, от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,5, от приблизительно 0,2 до приблизительно 1, от приблизительно 0,5 до приблизительно 2, от приблизительно 1 до приблизительно 3, от приблизительно 2 до приблизительно 4, от приблизительно 3 до приблизительно 5, от приблизительно 0,5 до приблизительно 1, приблизительно 0,1, приблизительно 0,2, приблизительно 0,3, приблизительно 0,4, приблизительно 0,5, приблизительно 0,6, приблизительно 0,7, приблизительно 0,8, приблизительно 0,9, приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4 или приблизительно 5);

(c) первым вирусным вектором при MOI, составляющей по меньшей мере приблизительно 10% (например, по меньшей мере приблизительно 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%) от MOI, при которой популяцию клеток приводят в контакт со вторым вирусным вектором, или в по меньшей мере приблизительно 1 раз (например, в по меньшей мере приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, или 100 раз, например, от приблизительно 2 до приблизительно 50 раз, от приблизительно 3 до 20 раз, от приблизительно 5 до приблизительно 15 раз или от приблизительно 8 до приблизительно 10 раз) выше нее; и/или

(d) вторым вирусным вектором при MOI, которая составляет не более чем 1/X, где X равняется 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70. 80, 90, или 100, от MOI, при которой популяцию клеток приводят в контакт с первым вирусным вектором.

В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток приводят в контакт с первым вирусным вектором при MOI, составляющей от приблизительно 2,5 до приблизительно 5. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток приводят в контакт со вторым вирусным вектором при MOI, составляющей от приблизительно 0,5 до приблизительно 1,0. В некоторых вариантах осуществления MOI для первого вирусного вектора в от приблизительно 8 до приблизительно 10 раз выше, чем MOI, при которой популяцию клеток приводят в контакт со вторым вирусным вектором. В некоторых вариантах осуществления MOI для второго вирусного вектора составляет не более чем 1/X, где X равняется 6, 8, 10 или 12, от MOI, при которой популяцию клеток приводят в контакт с первым вирусным вектором.

В некоторых вариантах осуществления на стадии (ii) популяцию клеток приводят в контакт с:

(a) первым вирусным вектором при MOI, составляющей от приблизительно 4 до приблизительно 5 (например, приблизительно 4,75); и/или

(b) вторым вирусным вектором при MOI, составляющей от приблизительно 0,2 до приблизительно 1 (например, приблизительно 0,5).

В некоторых вариантах осуществления на стадии (ii) популяция клеток содержит от приблизительно 1×10⁸ до приблизительно 5×10⁹ (например, от приблизительно 2×10⁸ до приблизительно 2×10⁹ или от приблизительно 4×10⁸ до приблизительно 1×10⁹) всех жизнеспособных клеток. В некоторых вариантах осуществления клетки суспендированы в культуре при концентрации, составляющей от приблизительно 1×10⁶ до приблизительно 1 ×10⁷ (например, от приблизительно 2×10⁶ до приблизительно 5 ×10⁶ или от приблизительно 3×10⁶ до приблизительно 4 ×10⁶) жизнеспособных клеток/мл.

В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, представляет собой средство, которое стимулирует CD3. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует костимулирующую молекулу, представляет собой средство, которое стимулирует CD28, ICOS, CD27, HVEM, LIGHT, CD40, 4-1BB, OX40, DR3, GITR, CD30, TIM1, CD2, CD226 или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует костимулирующую молекулу, представляет собой средство, которое стимулирует CD28. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, выбрано из антитела (например, однодоменного антитела (например, антитела из одного вариабельного домена тяжелой цепи), пептитела, Fab-фрагмента или scFv), малой молекулы или лиганда (например, существующего в природе, рекомбинантного или химерного лиганда). В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует костимулирующую молекулу, выбрано из антитела (например, однодоменного антитела (например, антитела из одного вариабельного домена тяжелой цепи), пептитела, Fab-фрагмента или scFv), малой молекулы или лиганда (например, существующего в природе, рекомбинантного или химерного лиганда). В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, не содержит гранулу. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует костимулирующую молекулу, не содержит гранулу. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, содержит антитело к CD3. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует костимулирующую молекулу, содержит антитело к CD28. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, содержит антитело к CD3, ковалентно присоединенное к коллоидной полимерной наноматрице. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует костимулирующую молекулу, содержит антитело к CD28, ковалентно присоединенное к коллоидной полимерной наноматрице. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и средство, которое стимулирует костимулирующую молекулу, содержат TransAct™ для T-клеток.

В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, не содержит гидрогель. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует костимулирующую молекулу, не содержит гидрогель. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, не содержит альгинат. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует костимулирующую молекулу, не содержит альгинат.

В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, содержит гидрогель. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует костимулирующую молекулу, содержит гидрогель. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, содержит альгинат. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует костимулирующую молекулу, содержит альгинат. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, или средство, которое стимулирует костимулирующую молекулу, содержат MagCloudz™ от Quad Technologies.

В некоторых вариантах осуществления стадия (i) обеспечивает увеличение процентной доли клеток, экспрессирующих CAR, в популяции клеток из стадии (iii), например, популяция клеток из стадии (iii) демонстрирует более высокую процентную долю клеток, экспрессирующих CAR (например, на по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50 или 60% выше), по сравнению с клетками, полученными посредством в остальном аналогичного способа без стадии (i).

В некоторых вариантах осуществления процентная доля необученных клеток, например, необученных Т-клеток, например, CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T-клеток, в популяции клеток из стадии (iii) является такой же, как процентная доля необученных клеток, например, необученных Т-клеток, например, CD45RA+ CD45RO- CCR7+ клеток, в популяции клеток в начале стадии (i). В некоторых вариантах осуществления процентная доля необученных клеток, например, необученных Т-клеток, например, CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T-клеток, в популяции клеток из стадии (iii) отличается на не более чем 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12% от процентной доли необученных клеток, например, необученных Т-клеток, например, CD45RA+ CD45RO- CCR7+ клеток, в популяции клеток в начале стадии (i). В некоторых вариантах осуществления процентная доля необученных клеток, например, необученных Т-клеток, например, CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T-клеток, в популяции клеток из стадии (iii) отличается на не более чем 5 или 10% от процентной доли необученных клеток, например, необученных Т-клеток, например, CD45RA+ CD45RO- CCR7+ клеток, в популяции клеток в начале стадии (i).

В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (iii) демонстрирует более высокую процентную долю необученных клеток, например, необученных Т-клеток, например, CD45RA+ CD45RO- CCR7+ Т-клеток (например, на по меньшей мере 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35 или 40% выше), по сравнению с клетками, полученными посредством в остальном аналогичного способа, в котором стадию (iii) проводят через более чем 26 часов после начала стадии (i), например, через более чем 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 дней после начала стадии (i). В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (iii) демонстрирует более высокую процентную долю необученных клеток, например, необученных Т-клеток, например, CD45RA+ CD45RO- CCR7+ Т-клеток (например, на по меньшей мере 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35 или 40% выше), по сравнению с клетками, полученными посредством в остальном аналогичного способа, который дополнительно включает после стадии (ii) и перед стадией (iii) размножение популяции клеток (например, T-клеток) in vitro в течение более чем 3 дней, например, в течение 5, 6, 7, 8 или 9 дней.

В некоторых вариантах осуществления процентная доля центральных клеток памяти, например, центральных Т-клеток памяти, например, CD95+ центральных Т-клеток памяти, в популяции клеток из стадии (iii) является такой же, как процентная доля центральных клеток памяти, например, центральных T-клеток памяти, например, CD95+ центральных Т-клеток памяти, в популяции клеток в начале стадии (i). В некоторых вариантах осуществления процентная доля центральных клеток памяти, например, центральных T-клеток памяти, например, CD95+ центральных Т-клеток памяти, в популяции клеток из стадии (iii) отличается на не более чем 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12% от процентной доли центральных клеток памяти, например, центральных T-клеток памяти, например, CD95+ центральных Т-клеток памяти, в популяции клеток в начале стадии (i). В некоторых вариантах осуществления процентная доля центральных клеток памяти, например, центральных T-клеток памяти, например, CD95+ центральных Т-клеток памяти, в популяции клеток из стадии (iii) отличается на не более чем 5 или 10% от процентной доли центральных клеток памяти, например, центральных T-клеток памяти, например, CD95+ центральных Т-клеток памяти, в популяции клеток в начале стадии (i).

В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (iii) демонстрирует более низкую процентную долю центральных клеток памяти, например, центральных T-клеток памяти, например, CD95+ центральных Т-клеток памяти (например, на по меньшей мере 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35 или 40% ниже), по сравнению с клетками, полученными посредством в остальном аналогичного способа, в котором стадию (iii) проводят через более чем 26 часов после начала стадии (i), например, через более чем 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 дней после начала стадии (i). В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (iii) демонстрирует более низкую процентную долю центральных клеток памяти, например, центральных T-клеток памяти, например, CD95+ центральных Т-клеток памяти (например, на по меньшей мере 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35 или 40% ниже), по сравнению с клетками, полученными посредством в остальном аналогичного способа, который дополнительно включает после стадии (ii) и перед стадией (iii) размножение популяции клеток (например, T-клеток) in vitro в течение более чем 3 дней, например, в течение 5, 6, 7, 8 или 9 дней.

В некоторых вариантах осуществления процентная доля стволовых T-клеток памяти, например, CD45RA+ CD95+ рецептор IL-2 β+ CCR7+ CD62L+ T-клеток, в популяции клеток из стадии (iii) является увеличенной по сравнению с процентной долей стволовых T-клеток памяти, например, CD45RA+ CD95+ рецептор IL-2 β+ CCR7+ CD62L+ T-клеток, в популяции клеток в начале стадии (i). В некоторых вариантах осуществления процентная доля стволовых T-клеток памяти, экспрессирующих CAR, например, CD45RA+ CD95+ рецептор IL-2 β+ CCR7+ CD62L+ T-клеток, экспрессирующих CAR, в популяции клеток из стадии (iii) является увеличенной по сравнению с процентной долей стволовых T-клеток памяти, экспрессирующих CAR, например, CD45RA+ CD95+ рецептор IL-2 β+ CCR7+ CD62L+ T-клеток, экспрессирующих CAR, в популяции клеток в начале стадии (i). В некоторых вариантах осуществления процентная доля стволовых T-клеток памяти, например, CD45RA+ CD95+ рецептор IL-2 β+ CCR7+ CD62L+ T-клеток, в популяции клеток из стадии (iii) является более высокой, чем процентная доля стволовых T-клеток памяти, например, CD45RA+ CD95+ рецептор IL-2 β+ CCR7+ CD62L+ T-клеток, среди клеток, полученных посредством в остальном аналогичного способа, в котором стадию (iii) проводят через более чем 26 часов после начала стадии (i), например, через более чем 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 дней после начала стадии (i). В некоторых вариантах осуществления процентная доля стволовых T-клеток памяти, экспрессирующих CAR, например, CD45RA+ CD95+ рецептор IL-2 β+ CCR7+ CD62L+ T-клеток, экспрессирующих CAR, в популяции клеток из стадии (iii) является более высокой, чем процентная доля стволовых T-клеток памяти, экспрессирующих CAR, например, CD45RA+ CD95+ рецептор IL-2 β+ CCR7+ CD62L+ T-клеток, экспрессирующих CAR, среди клеток, полученных посредством в остальном аналогичного способа, в котором стадию (iii) проводят через более чем 26 часов после начала стадии (i), например, через более чем 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 дней после начала стадии (i). В некоторых вариантах осуществления процентная доля стволовых T-клеток памяти, например, CD45RA+ CD95+ рецептор IL-2 β+ CCR7+ CD62L+ T-клеток, в популяции клеток из стадии (iii) является более высокой, чем процентная доля стволовых T-клеток памяти, например, CD45RA+ CD95+ рецептор IL-2 β+ CCR7+ CD62L+ T-клеток, среди клеток, полученных посредством в остальном аналогичного способа, который дополнительно включает после стадии (ii) и перед стадией (iii) размножение популяции клеток (например, T-клеток) in vitro в течение более чем 3 дней, например, в течение 5, 6, 7, 8 или 9 дней. В некоторых вариантах осуществления процентная доля стволовых T-клеток памяти, экспрессирующих CAR, например, CD45RA+ CD95+ рецептор IL-2 β+ CCR7+ CD62L+ T-клеток, экспрессирующих CAR, в популяции клеток из стадии (iii) является более высокой, чем процентная доля стволовых T-клеток памяти, экспрессирующих CAR, например, CD45RA+ CD95+ рецептор IL-2 β+ CCR7+ CD62L+ T-клеток, экспрессирующих CAR, среди клеток, полученных посредством в остальном аналогичного способа, который дополнительно включает после стадии (ii) и перед стадией (iii) размножение популяции клеток (например, T-клеток) in vitro в течение более чем 3 дней, например, в течение 5, 6, 7, 8 или 9 дней.

В некоторых вариантах осуществления медианный балл набора генов (активируемые в TEM относительно подавляемых в TSCM) для популяции клеток из стадии (iii) является приблизительно таким же, как медианный балл набора генов (активируемые в TEM относительно подавляемых в TSCM) для популяции клеток в начале стадии (i), или отличается от него на не более чем (например, увеличен на не более чем) приблизительно 25, 50, 75, 100 или 125%. В некоторых вариантах осуществления медианный балл набора генов (активируемые в TEM относительно подавляемых в TSCM) для популяции клеток из стадии (iii) является более низким (например, на по меньшей мере приблизительно 100, 150, 200, 250 или 300% ниже), чем медианный балл набора генов (активируемые в TEM относительно подавляемых в TSCM) для клеток, полученных посредством в остальном аналогичного способа, в котором стадию (iii) проводят через более чем 26 часов после начала стадии (i), например, через более чем 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 дней после начала стадии (i). В некоторых вариантах осуществления медианный балл набора генов (активируемые в TEM относительно подавляемых в TSCM) для популяции клеток из стадии (iii) является более низким (например, на по меньшей мере приблизительно 100, 150, 200, 250 или 300% ниже), чем медианный балл набора генов (активируемые в TEM относительно подавляемых в TSCM) для клеток, полученных посредством в остальном аналогичного способа, который дополнительно включает после стадии (ii) и перед стадией (iii) размножение популяции клеток (например, T-клеток) in vitro в течение более чем 3 дней, например, в течение 5, 6, 7, 8 или 9 дней. В некоторых вариантах осуществления медианный балл набора генов (активируемые в Treg относительно подавляемых в Teff) для популяции клеток из стадии (iii) является приблизительно таким же, как медианный балл набора генов (активируемые в Treg относительно подавляемых в Teff) для популяции клеток в начале стадии (i), или отличается от него на не более чем (например, увеличен на не более чем) приблизительно 25, 50, 100, 150 или 200%. В некоторых вариантах осуществления медианный балл набора генов (активируемые в Treg относительно подавляемых в Teff) для популяции клеток из стадии (iii) является более низким (например, на по меньшей мере приблизительно 50, 100, 125, 150 или 175% ниже), чем медианный балл набора генов (активируемые в Treg относительно подавляемых в Teff) для клеток, полученных посредством в остальном аналогичного способа, в котором стадию (iii) проводят через более чем 26 часов после начала стадии (i), например, через более чем 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 дней после начала стадии (i). В некоторых вариантах осуществления медианный балл набора генов (активируемые в Treg относительно подавляемых в Teff) для популяции клеток из стадии (iii) является более низким (например, на по меньшей мере приблизительно 50, 100, 125, 150 или 175% ниже), чем медианный балл набора генов (активируемые в Treg относительно подавляемых в Teff) для клеток, полученных посредством в остальном аналогичного способа, который дополнительно включает после стадии (ii) и перед стадией (iii) размножение популяции клеток (например, T-клеток) in vitro в течение более чем 3 дней, например, в течение 5, 6, 7, 8 или 9 дней. В некоторых вариантах осуществления медианный балл набора генов (подавляемые в состоянии стволовости) для популяции клеток из стадии (iii) является приблизительно таким же, как медианный балл набора генов (подавляемые в состоянии стволовости) для популяции клеток в начале стадии (i), или отличается от него на не более чем (например, увеличен на не более чем) приблизительно 25, 50, 100, 150, 200 или 250%. В некоторых вариантах осуществления медианный балл набора генов (подавляемые в состоянии стволовости) для популяции клеток из стадии (iii) является более низким (например, на по меньшей мере приблизительно 50, 100 или 125% ниже), чем медианный балл набора генов (подавляемые в состоянии стволовости) для клеток, полученных посредством в остальном аналогичного способа, в котором стадию (iii) проводят через более чем 26 часов после начала стадии (i), например, через более чем 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 дней после начала стадии (i). В некоторых вариантах осуществления медианный балл набора генов (подавляемые в состоянии стволовости) для популяции клеток из стадии (iii) является более низким (например, на по меньшей мере приблизительно 50, 100 или 125% ниже), чем медианный балл набора генов (подавляемые в состоянии стволовости) для клеток, полученных посредством в остальном аналогичного способа, который дополнительно включает после стадии (ii) и перед стадией (iii) размножение популяции клеток (например, T-клеток) in vitro в течение более чем 3 дней, например, в течение 5, 6, 7, 8 или 9 дней. В некоторых вариантах осуществления медианный балл набора генов (активируемые при гипоксии) для популяции клеток из стадии (iii) является приблизительно таким же, как медианный балл набора генов (активируемые при гипоксии) для популяции клеток в начале стадии (i), или отличается от него на не более чем (например, увеличен на не более чем) приблизительно 125, 150, 175 или 200%. В некоторых вариантах осуществления медианный балл набора генов (активируемые при гипоксии) для популяции клеток из стадии (iii) является более низким (например, на по меньшей мере приблизительно 40, 50, 60, 70 или 80% ниже), чем медианный балл набора генов (активируемые при гипоксии) для клеток, полученных посредством в остальном аналогичного способа, в котором стадию (iii) проводят через более чем 26 часов после начала стадии (i), например, через более чем 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 дней после начала стадии (i). В некоторых вариантах осуществления медианный балл набора генов (активируемые при гипоксии) для популяции клеток из стадии (iii) является более низким (например, на по меньшей мере приблизительно 40, 50, 60, 70 или 80% ниже), чем медианный балл набора генов (активируемые при гипоксии) для клеток, полученных посредством в остальном аналогичного способа, который дополнительно включает после стадии (ii) и перед стадией (iii) размножение популяции клеток (например, T-клеток) in vitro в течение более чем 3 дней, например, в течение 5, 6, 7, 8 или 9 дней. В некоторых вариантах осуществления медианный балл набора генов (активируемые при аутофагии) для популяции клеток из стадии (iii) является приблизительно таким же, как медианный балл набора генов (активируемые при аутофагии) для популяции клеток в начале стадии (i), или отличается от него на не более чем (например, увеличен на не более чем) приблизительно 180, 190, 200 или 210%. В некоторых вариантах осуществления медианный балл набора генов (активируемые при аутофагии) для популяции клеток из стадии (iii) является более низким (например, на по меньшей мере приблизительно 20, 30 или 40% ниже), чем медианный балл набора генов (активируемые при аутофагии) для клеток, полученных посредством в остальном аналогичного способа, в котором стадию (iii) проводят через более чем 26 часов после начала стадии (i), например, через более чем 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 дней после начала стадии (i). В некоторых вариантах осуществления медианный балл набора генов (активируемые при аутофагии) для популяции клеток из стадии (iii) является более низким (например, на по меньшей мере 20, 30 или 40% ниже), чем медианный балл набора генов (активируемые при аутофагии) для клеток, полученных посредством в остальном аналогичного способа, который дополнительно включает после стадии (ii) и перед стадией (iii) размножение популяции клеток (например, T-клеток) in vitro в течение более чем 3 дней, например, в течение 5, 6, 7, 8 или 9 дней.

В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (iii) после инкубирования с клеткой, экспрессирующей антиген, распознаваемый CAR, секретирует IL-2 на более высоком уровне (например, в по меньшей мере 2, 4, 6, 8, 10, 12 или 14 раз более высоком), чем клетки, полученные посредством в остальном аналогичного способа, в котором стадию (iii) проводят через более чем 26 часов после начала стадии (i), например, через более чем 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 дней после начала стадии (i), или клетки, полученные посредством в остальном аналогичного способа, который дополнительно включает после стадии (ii) и перед стадией (iii) размножение популяции клеток (например, T-клеток) in vitro в течение более чем 3 дней, например, в течение 5, 6, 7, 8 или 9 дней.

В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (iii) после введения in vivo персистирует дольше или размножается на более высоком уровне (например, на по меньшей мере 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, или 90% более высоком) по сравнению с клетками, полученными посредством в остальном аналогичного способа, в котором стадию (iii) проводят через более чем 26 часов после начала стадии (i), например, через более чем 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 дней после начала стадии (i). В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (iii) после введения in vivo персистирует дольше или размножается на более высоком уровне (например, на по меньшей мере 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, или 90% более высоком) по сравнению с клетками, полученными посредством в остальном аналогичного способа, который дополнительно включает после стадии (ii) и перед стадией (iii) размножение популяции клеток (например, T-клеток) in vitro в течение более чем 3 дней, например, в течение 5, 6, 7, 8 или 9 дней.

В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (iii) после введения in vivo демонстрирует более сильную противоопухолевую активность (например, более сильную противоопухолевую активность при низкой дозе, например, дозе, составляющей не более 0,15×10⁶, 0,2×10⁶, 0,25×10⁶ или 0,3×10⁶ жизнеспособных клеток, экспрессирующих CAR), чем клетки, полученные посредством в остальном аналогичного способа, в котором стадию (iii) проводят через более чем 26 часов после начала стадии (i), например, через более чем 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 дней после начала стадии (i), или клетки, полученные посредством в остальном аналогичного способа, который дополнительно включает после стадии (ii) и перед стадией (iii) размножение популяции клеток (например, T-клеток) in vitro в течение более чем 3 дней, например, в течение 5, 6, 7, 8 или 9 дней.

В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (iii) не является размножившейся, например, согласно оценке по количеству живых клеток, по сравнению с популяцией клеток в начале стадии (i). В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (iii) является уменьшенной по сравнению с количеством живых клеток в популяции клеток в начале стадии (i), например, согласно оценке по количеству живых клеток. В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (iii) является размножившейся с увеличением численности на не более чем 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, или 40%, например, на не более чем 10%, например, согласно оценке по количеству живых клеток, по сравнению с популяцией клеток в начале стадии (i). В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (iii) не является размножившейся или является размножившейся за менее чем 0,5, 1, 1,5 или 2 часа, например, менее чем 1 или 1,5 часа, по сравнению с популяцией клеток в начале стадии (i).

В некоторых вариантах осуществления стадии (i) и (ii) проводят в средах для клеток (например, бессывороточных средах), содержащих IL-2, IL-15 (например, hetIL-15 (IL15/sIL-15Ra)), IL-6 (например, IL-6/sIL-6Ra), ингибитор LSD1 или ингибитор MALT1. В некоторых вариантах осуществления стадии (i) и (ii) проводят в средах для клеток (например, бессывороточных средах), содержащих IL-7, IL-21 или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления стадии (i) и (ii) проводят в средах для клеток (например, бессывороточных средах), содержащих IL-2, IL-15 (например, hetIL-15 (IL15/sIL-15Ra)), IL-21, IL-7, IL-6 (например, IL-6/sIL-6Ra), ингибитор LSD1, ингибитор MALT1 или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления стадию (i) проводят в средах для клеток (например, бессывороточных средах), содержащих IL-2, IL-15 (например, hetIL-15 (IL15/sIL-15Ra)), IL-6 (например, IL-6/sIL-6Ra), ингибитор LSD1 или ингибитор MALT1. В некоторых вариантах осуществления стадию (ii) проводят в средах для клеток (например, бессывороточных средах), содержащих IL-2, IL-15 (например, hetIL-15 (IL15/sIL-15Ra)), IL-6 (например, IL-6/sIL-6Ra), ингибитор LSD1 или ингибитор MALT1. В некоторых вариантах осуществления стадию (i) проводят в средах для клеток (например, бессывороточных средах), содержащих IL-7, IL-21 или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления стадию (ii) проводят в средах для клеток (например, бессывороточных средах), содержащих IL-7, IL-21 или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления стадию (i) проводят в средах для клеток (например, бессывороточных средах), содержащих IL-2, IL-15 (например, hetIL-15 (IL15/sIL-15Ra)), IL-21, IL-7, IL-6 (например, IL-6/sIL-6Ra), ингибитор LSD1, ингибитор MALT1 или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления стадию (ii) проводят в средах для клеток (например, бессывороточных средах), содержащих IL-2, IL-15 (например, hetIL-15 (IL15/sIL-15Ra)), IL-21, IL-7, IL-6 (например, IL-6/sIL-6Ra), ингибитор LSD1, ингибитор MALT1 или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления среда для клеток представляет собой бессывороточную среду, содержащую заменитель сыворотки. В некоторых вариантах осуществления заменитель сыворотки представляет собой заменитель сыворотки для иммунных клеток (ICSR) CTS™.

В некоторых вариантах осуществления вышеуказанные способы дополнительно включают перед стадией (i) (iv) получение свежего продукта лейкафереза (или альтернативного источника гемопоэтической ткани, такого как свежий продукт, представляющий собой цельную кровь, свежий продукт, представляющий собой костный мозг, или свежий продукт, полученный в результате биопсии или удаления опухоли или органа (например, свежий продукт, полученный в результате тимэктомии)), от организации, например, лаборатории, больницы или учреждения здравоохранения.

В некоторых вариантах осуществления вышеуказанные способы дополнительно включают перед стадией (i) (v) выделение популяции клеток (например, T-клеток, например, CD8+ и/или CD4+ T-клеток), приводимых в контакт на стадии (i), из свежего продукта лейкафереза (или альтернативного источника гемопоэтической ткани, такого как свежий продукт, представляющий собой цельную кровь, свежий продукт, представляющий собой костный мозг, или свежий продукт, полученный в результате биопсии или удаления опухоли или органа (например, свежий продукт, полученный в результате тимэктомии)). В некоторых вариантах осуществления стадию (iii) проводят не позже чем через 35 часов после начала стадии (v), например, не позже чем через 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 или 35 часов после начала стадии (v), например, не позже чем через 30 часов после начала стадии (v). В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (iii) не является размножившейся или является размножившейся с увеличением численности на не более чем 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или 40%, например, на не более чем 10%, например, согласно оценке по количеству живых клеток, по сравнению с популяцией клеток в конце стадии (v).

В некоторых вариантах осуществления вышеуказанные способы дополнительно включают перед стадией (i) получение криоконсервированных T-клеток, выделенных из продукта лейкафереза (или альтернативного источника гемопоэтической ткани, как, например, криоконсервированных T-клеток, выделенных из цельной крови, костного мозга или продукта, полученного в результате биопсии или удаления опухоли или органа (например, тимэктомии)), от организации, например, лаборатории, больницы или учреждения здравоохранения.

В некоторых вариантах осуществления вышеуказанные способы дополнительно включают перед стадией (i) (iv) получение криоконсервированного продукта лейкафереза (или альтернативного источника гемопоэтической ткани, такого как криоконсервированный продукт, представляющий собой цельную кровь, криоконсервированный продукт, представляющий собой костный мозг, или криоконсервированный продукт, полученный в результате биопсии или удаления опухоли или органа (например, криоконсервированный продукт, полученный в результате тимэктомии)), от организации, например, лаборатории, больницы или учреждения здравоохранения.

В некоторых вариантах осуществления вышеуказанные способы дополнительно включают перед стадией (i) (v) выделение популяции клеток (например, T-клеток, например, CD8+ и/или CD4+ T-клеток), приводимых в контакт на стадии (i), из криоконсервированного продукта лейкафереза (или альтернативного источника гемопоэтической ткани, такого как криоконсервированный продукт, представляющий собой цельную кровь, криоконсервированный продукт, представляющий собой костный мозг, или криоконсервированный продукт, полученный в результате биопсии или удаления опухоли или органа (например, криоконсервированный продукт, полученный в результате тимэктомии)). В некоторых вариантах осуществления стадию (iii) проводят не позже чем через 35 часов после начала стадии (v), например, не позже чем через 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 или 35 часов после начала стадии (v), например, не позже чем через 30 часов после начала стадии (v). В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (iii) не является размножившейся или является размножившейся с увеличением численности на не более чем 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или 40%, например, на не более чем 10%, например, согласно оценке по количеству живых клеток, по сравнению с популяцией клеток в конце стадии (v).

В некоторых вариантах осуществления клетки из стадии (iii) культивируют в течение от приблизительно двух до приблизительно четырех дней, например, приблизительно трех дней (например, приблизительно 72 часов после сбора), перед измерением уровня экспрессии CAR в их части (например, перед измерением процентной доли жизнеспособных клеток, экспрессирующих CAR, в их части, например, перед измерением процентной доли жизнеспособных клеток, экспрессирующих CAR для BCMA, в их части). В некоторых вариантах осуществления измерение экспрессии CAR осуществляют через приблизительно 4 дня (например, 96 часов) после стадии (ii). В некоторых вариантах осуществления уровень экспрессии CAR измеряют посредством проточной цитометрии.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении описан способ получения популяции клеток (например, T-клеток), которые экспрессируют химерный антигенный рецептор (CAR), при этом способ включает (1) приведение популяции клеток (например, T-клеток, например, T-клеток, выделенных из замороженного продукта лейкафереза) в контакт с цитокином, выбранным из IL-2, IL-7, IL-15, IL-21, IL-6 или их комбинации, (2) приведение популяции клеток (например, T-клеток) в контакт с молекулой нуклеиновой кислоты (например, молекулой ДНК или РНК), кодирующей CAR, за счет чего обеспечивается получение популяции клеток (например, T-клеток), содержащих молекулу нуклеиновой кислоты, и (3) сбор популяции клеток (например, T-клеток) для хранения (например, повторного составления популяции клеток в среде для криоконсервации) или введения, где (a) стадию (2) проводят вместе со стадией (1) или не позже чем через 5 часов после начала стадии (1), например, не позже чем через 1, 2, 3, 4 или 5 часов после начала стадии (1), и стадию (3) проводят не позже чем через 26 часов после начала стадии (1), например, не позже чем через 22, 23, 24 или 25 часов после начала стадии (1), например, не позже чем через 24 часа после начала стадии (1), или (b) популяция клеток из стадии (3) не является размножившейся или является размножившейся с увеличением численности на не более чем 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или 40%, например, на не более чем 10%, например, согласно оценке по количеству живых клеток, по сравнению с популяцией клеток в начале стадии (1). В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты на стадии (2) представляет собой молекулу ДНК. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты на стадии (2) представляет собой молекулу РНК. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты на стадии (2) находится в вирусном векторе, например, в вирусном векторе, выбранном из лентивирусного вектора, аденовирусного вектора или ретровирусного вектора. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты на стадии (2) находится в невирусном векторе. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты на стадии (2) находится в плазмиде. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты на стадии (2) не находится в каком-либо векторе. В некоторых вариантах осуществления стадия (2) включает трансдукцию популяции клеток (например, T-клеток) c помощью вирусного вектора, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая CAR, представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, раскрытую в данном документе. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую первый CAR, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую второй CAR. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая последовательности нуклеиновой кислоты расположены в одной молекуле нуклеиновой кислоты, например, где первая последовательность нуклеиновой кислоты и вторая последовательность нуклеиновой кислоты разделены третьей последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей сайт саморасщепления (например, сайт P2A, сайт Т2A, сайт Е2A или сайт F2A). В некоторых вариантах осуществления первая и вторая последовательности нуклеиновой кислоты расположены в отдельных молекулах нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR, где CAR содержит первую VH (VH1), первую VL (VL1), вторую VH (VH2), вторую VL (VL2), трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, где VH1 и VL1 связываются с первым антигеном, а VH2 и VL2 связываются со вторым антигеном, где VH1, VL1, VH2 и VL2 расположены в следующей конфигурации от N-конца до C-конца: VH1 - необязательно линкер 1 ("L1") - VH2 - необязательно линкер 2 ("L2") - VL2 - необязательно линкер 3 ("L3") - VL1, VH1 - необязательно L1 - VL2 - необязательно L2 - VH2 - необязательно L3 - VL1, VL1 - необязательно L1 - VH2 - необязательно L2 - VL2 - необязательно L3 - VH1, VL1 - необязательно L1 - VL2 - необязательно L2 - VH2 - необязательно L3 - VH1, VH2 - необязательно L1 - VH1 - необязательно L2 - VL1 - необязательно L3 - VL2, VH2 - необязательно L1 - VL1 - необязательно L2 - VH1 - необязательно L3 - VL2, VL2 - необязательно L1 - VH1 - необязательно L2 - VL1 - необязательно L3 - VH2 или VL2 - необязательно L1 - VL1 - необязательно L2 - VH1 - необязательно L3 - VH2.

В некоторых вариантах осуществления стадию (2) проводят вместе со стадией (1). В некоторых вариантах осуществления стадию (2) проводят не позже чем через 5 часов после начала стадии (1). В некоторых вариантах осуществления стадию (2) проводят не позже чем через 1, 2, 3, 4 или 5 часов после начала стадии (1). В некоторых вариантах осуществления стадию (3) проводят не позже чем через 26 часов после начала стадии (1). В некоторых вариантах осуществления стадию (3) проводят не позже чем через 22, 23, 24 или 25 часов после начала стадии (1). В некоторых вариантах осуществления стадию (3) проводят не позже чем через 24 часа после начала стадии (1).

В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (3) не является размножившейся, например, согласно оценке по количеству живых клеток, по сравнению с популяцией клеток в начале стадии (1). В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (3) является размножившейся с увеличением численности на не более чем 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, или 40%, например, согласно оценке по количеству живых клеток, по сравнению с популяцией клеток в начале стадии (1). В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (3) является размножившейся с увеличением численности на не более чем 10%, например, согласно оценке по количеству живых клеток, по сравнению с популяцией клеток в начале стадии (1).

В некоторых вариантах осуществления стадия (1) включает приведение популяции клеток (например, T-клеток) в контакт с IL-2. В некоторых вариантах осуществления стадия (1) включает приведение популяции клеток (например, T-клеток) в контакт с IL-7. В некоторых вариантах осуществления стадия (1) включает приведение популяции клеток (например, T-клеток) в контакт с IL-15 (например, hetIL-15 (IL15/sIL-15Ra)). В некоторых вариантах осуществления стадия (1) включает приведение популяции клеток (например, T-клеток) в контакт с IL-21. В некоторых вариантах осуществления стадия (1) включает приведение популяции клеток (например, T-клеток) в контакт с IL-6 (например, IL-6/sIL-6Ra). В некоторых вариантах осуществления стадия (1) включает приведение популяции клеток (например, T-клеток) в контакт с IL-2 и IL-7. В некоторых вариантах осуществления стадия (1) включает приведение популяции клеток (например, T-клеток) в контакт с IL-2 и IL-15 (например, hetIL-15 (IL15/sIL-15Ra)). В некоторых вариантах осуществления стадия (1) включает приведение популяции клеток (например, T-клеток) в контакт с IL-2 и IL-21. В некоторых вариантах осуществления стадия (1) включает приведение популяции клеток (например, T-клеток) в контакт с IL-2 и IL-6 (например, IL-6/sIL-6Ra). В некоторых вариантах осуществления стадия (1) включает приведение популяции клеток (например, T-клеток) в контакт с IL-7 и IL-15 (например, hetIL-15 (IL15/sIL-15Ra)). В некоторых вариантах осуществления стадия (1) включает приведение популяции клеток (например, T-клеток) в контакт с IL-7 и IL-21. В некоторых вариантах осуществления стадия (1) включает приведение популяции клеток (например, T-клеток) в контакт с IL-7 и IL-6 (например, IL-6/sIL-6Ra). В некоторых вариантах осуществления стадия (1) включает приведение популяции клеток (например, T-клеток) в контакт с IL-15 (например, hetIL-15 (IL15/sIL-15Ra)) и IL-21. В некоторых вариантах осуществления стадия (1) включает приведение популяции клеток (например, T-клеток) в контакт с IL-15 (например, hetIL-15 (IL15/sIL-15Ra)) и IL-6 (например, IL-6/sIL-6Ra). В некоторых вариантах осуществления стадия (1) включает приведение популяции клеток (например, T-клеток) в контакт с IL-21 и IL-6 (например, IL-6/sIL-6Ra). В некоторых вариантах осуществления стадия (1) включает приведение популяции клеток (например, T-клеток) в контакт с IL-7, IL-15 (например, hetIL-15 (IL15/sIL-15Ra)) и IL-21.

В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (3) демонстрирует более высокую процентную долю необученных клеток среди клеток, экспрессирующих CAR (например, на по меньшей мере 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35 или 40% выше), по сравнению с клетками, полученными посредством в остальном аналогичного способа, который дополнительно включает приведение популяции клеток в контакт, например, с антителом к CD3.

В некоторых вариантах осуществления процентная доля необученных клеток, например, необученных Т-клеток, например, CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T-клеток, в популяции клеток из стадии (3) является такой же, как процентная доля необученных клеток, например, необученных Т-клеток, например, CD45RA+ CD45RO- CCR7+ клеток, в популяции клеток в начале стадии (1). В некоторых вариантах осуществления процентная доля необученных клеток, например, необученных Т-клеток, например, CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T-клеток, в популяции клеток из стадии (3) отличается на не более чем 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12% от процентной доли необученных клеток, например, необученных Т-клеток, например, CD45RA+ CD45RO- CCR7+ клеток, в популяции клеток в начале стадии (1). В некоторых вариантах осуществления процентная доля необученных клеток, например, необученных Т-клеток, например, CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T-клеток, в популяции клеток из стадии (3) отличается на не более чем 5 или 10% от процентной доли необученных клеток, например, необученных Т-клеток, например, CD45RA+ CD45RO- CCR7+ клеток, в популяции клеток в начале стадии (1). В некоторых вариантах осуществления процентная доля необученных клеток, например, необученных Т-клеток, например, CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T-клеток, в популяции клеток из стадии (3) является увеличенной по сравнению с процентной долей необученных клеток, например, необученных Т-клеток, например, CD45RA+ CD45RO- CCR7+ клеток, в популяции клеток в начале стадии (1). В некоторых вариантах осуществления процентная доля необученных клеток, например, необученных Т-клеток, например, CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T-клеток, в популяции клеток из стадии (3) увеличена на по меньшей мере 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20% по сравнению с процентной долей необученных клеток, например, необученных Т-клеток, например, CD45RA+ CD45RO- CCR7+ клеток, в популяции клеток в начале стадии (1). В некоторых вариантах осуществления процентная доля необученных клеток, например, необученных Т-клеток, например, CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T-клеток, в популяции клеток из стадии (3) увеличена на по меньшей мере 10 или 20% по сравнению с процентной долей необученных клеток, например, необученных Т-клеток, например, CD45RA+ CD45RO- CCR7+ клеток, в популяции клеток в начале стадии (1).

В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (3) демонстрирует более высокую процентную долю необученных клеток, например, необученных Т-клеток, например, CD45RA+ CD45RO- CCR7+ Т-клеток (например, на по меньшей мере 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35 или 40% выше), по сравнению с клетками, полученными посредством в остальном аналогичного способа, в котором стадию (3) проводят через более чем 26 часов после начала стадии (1), например, через более чем 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 дней после начала стадии (1). В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (3) демонстрирует более высокую процентную долю необученных клеток, например, необученных Т-клеток, например, CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T-клеток (например, на по меньшей мере 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35 или 40% выше), по сравнению с клетками, полученными посредством в остальном аналогичного способа, который дополнительно включает после стадии (2) и перед стадией (3) размножение популяции клеток (например, T-клеток) in vitro в течение более чем 3 дней, например, в течение 5, 6, 7, 8 или 9 дней.

В некоторых вариантах осуществления процентная доля центральных клеток памяти, например, центральных Т-клеток памяти, например, CD95+ центральных Т-клеток памяти, в популяции клеток из стадии (3) является такой же, как процентная доля центральных клеток памяти, например, центральных T-клеток памяти, например, CD95+ центральных Т-клеток памяти, в популяции клеток в начале стадии (i). В некоторых вариантах осуществления процентная доля центральных клеток памяти, например, центральных T-клеток памяти, например, CD95+ центральных Т-клеток памяти, в популяции клеток из стадии (3) отличается на не более чем 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12% от процентной доли центральных клеток памяти, например, центральных T-клеток памяти, например, CD95+ центральных Т-клеток памяти, в популяции клеток в начале стадии (i). В некоторых вариантах осуществления процентная доля центральных клеток памяти, например, центральных T-клеток памяти, например, CD95+ центральных Т-клеток памяти, в популяции клеток из стадии (3) отличается на не более чем 5 или 10% от процентной доли центральных клеток памяти, например, центральных T-клеток памяти, например, CD95+ центральных Т-клеток памяти, в популяции клеток в начале стадии (i). В некоторых вариантах осуществления процентная доля центральных клеток памяти, например, центральных T-клеток памяти, например, CD95+ центральных Т-клеток памяти, в популяции клеток из стадии (3) является уменьшенной по сравнению с процентной долей центральных клеток памяти, например, центральных T-клеток памяти, например, CD95+ центральных Т-клеток памяти, в популяции клеток в начале стадии (1). В некоторых вариантах осуществления процентная доля центральных клеток памяти, например, центральных T-клеток памяти, например, CD95+ центральных Т-клеток памяти, в популяции клеток из стадии (3) уменьшена на по меньшей мере 10 или 20% по сравнению с процентной долей центральных клеток памяти, например, центральных T-клеток памяти, например, CD95+ центральных Т-клеток памяти, в популяции клеток в начале стадии (1). В некоторых вариантах осуществления процентная доля центральных клеток памяти, например, центральных T-клеток памяти, например, CD95+ центральных Т-клеток памяти, в популяции клеток из стадии (3) уменьшена на по меньшей мере 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20% по сравнению с процентной долей центральных клеток памяти, например, центральных T-клеток памяти, например, CD95+ центральных Т-клеток памяти, в популяции клеток в начале стадии (1).

В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (3) демонстрирует более низкую процентную долю центральных клеток памяти, например, центральных T-клеток памяти, например, CD95+ центральных Т-клеток памяти (например, на по меньшей мере 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35 или 40% ниже), по сравнению с клетками, полученными посредством в остальном аналогичного способа, в котором стадию (3) проводят через более чем 26 часов после начала стадии (1), например, через более чем 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 дней после начала стадии (1). В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (3) демонстрирует более низкую процентную долю центральных клеток памяти, например, центральных T-клеток памяти, например, CD95+ центральных Т-клеток памяти (например, на по меньшей мере 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35 или 40% ниже), по сравнению с клетками, полученными посредством в остальном аналогичного способа, который дополнительно включает после стадии (2) и перед стадией (3) размножение популяции клеток (например, T-клеток) in vitro в течение более чем 3 дней, например, в течение 5, 6, 7, 8 или 9 дней.

В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (3) после введения in vivo персистирует дольше или размножается на более высоком уровне (например, на по меньшей мере 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, или 90% более высоком) по сравнению с клетками, полученными посредством в остальном аналогичного способа, в котором стадию (3) проводят через более чем 26 часов после начала стадии (1), например, через более чем 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 дней после начала стадии (1). В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (3) после введения in vivo персистирует дольше или размножается на более высоком уровне (например, на по меньшей мере 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, или 90% более высоком) по сравнению с клетками, полученными посредством в остальном аналогичного способа, который дополнительно включает после стадии (2) и перед стадией (3) размножение популяции клеток (например, T-клеток) in vitro в течение более чем 3 дней, например, в течение 5, 6, 7, 8 или 9 дней.

В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (3) не является размножившейся, например, согласно оценке по количеству живых клеток, по сравнению с популяцией клеток в начале стадии (1). В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (3) является размножившейся с увеличением численности на не более чем 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, или 40%, например, согласно оценке по количеству живых клеток, по сравнению с популяцией клеток в начале стадии (1). В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (3) является размножившейся с увеличением численности на не более чем 10%, например, согласно оценке по количеству живых клеток, по сравнению с популяцией клеток в начале стадии (1). В некоторых вариантах осуществления количество живых клеток в популяции клеток из стадии (3) является уменьшенным по сравнению с количеством живых клеток в популяции клеток в начале стадии (1), например, согласно оценке по количеству живых клеток.

В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (3) не является размножившейся по сравнению с популяцией клеток в начале стадии (1), например, согласно оценке по количеству живых клеток. В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (3) является размножившейся за менее чем 0,5, 1, 1,5 или 2 часа, например, менее чем 1 или 1,5 часа, по сравнению с популяцией клеток в начале стадии (1).

В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток не приводят в контакт in vitro со средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу на поверхности клеток, или, в случае приведения в контакт, продолжительность стадии приведения в контакт составляет менее 2 часов, например, не более 1 или 1,5 часа. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, представляет собой средство, которое стимулирует CD3 (например, антитело к CD3). В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует костимулирующую молекулу, представляет собой средство, которое стимулирует CD28, ICOS, CD27, HVEM, LIGHT, CD40, 4-1BB, OX40, DR3, GITR, CD30, TIM1, CD2, CD226 или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует костимулирующую молекулу, представляет собой средство, которое стимулирует CD28. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, или средство, которое стимулирует костимулирующую молекулу, выбрано из антитела (например, однодоменного антитела (например, антитела из одного вариабельного домена тяжелой цепи), пептитела, Fab-фрагмента или scFv), малой молекулы или лиганда (например, существующего в природе, рекомбинантного или химерного лиганда).

В некоторых вариантах осуществления стадии (1) и/или (2) проводят в средах для клеток, содержащих не более 5, 4, 3, 2, 1 или 0% сыворотки. В некоторых вариантах осуществления стадии (1) и/или (2) проводят в средах для клеток, содержащих не более 2% сыворотки. В некоторых вариантах осуществления стадии (1) и/или (2) проводят в средах для клеток, содержащих приблизительно 2% сыворотки. В некоторых вариантах осуществления стадии (1) и/или (2) проводят в средах для клеток, содержащих ингибитор LSD1 или ингибитор MALT1. В некоторых вариантах осуществления стадию (1) проводят в средах для клеток, содержащих не более 5, 4, 3, 2, 1 или 0% сыворотки. В некоторых вариантах осуществления стадию (1) проводят в средах для клеток, содержащих не более 2% сыворотки. В некоторых вариантах осуществления стадию (1) проводят в средах для клеток, содержащих приблизительно 2% сыворотки. В некоторых вариантах осуществления стадию (2) проводят в средах для клеток, содержащих не более 5, 4, 3, 2, 1 или 0% сыворотки. В некоторых вариантах осуществления стадию (2) проводят в средах для клеток, содержащих не более 2% сыворотки. В некоторых вариантах осуществления стадию (2) проводят в средах для клеток, содержащих приблизительно 2% сыворотки. В некоторых вариантах осуществления стадию (1) проводят в средах для клеток, содержащих ингибитор LSD1 или ингибитор MALT1. В некоторых вариантах осуществления стадию (2) проводят в средах для клеток, содержащих ингибитор LSD1 или ингибитор MALT1.

В некоторых вариантах осуществления вышеуказанные способы дополнительно включают перед стадией (i) (iv) получение свежего продукта лейкафереза (или альтернативного источника гемопоэтической ткани, такого как свежий продукт, представляющий собой цельную кровь, свежий продукт, представляющий собой костный мозг, или свежий продукт, полученный в результате биопсии или удаления опухоли или органа (например, свежий продукт, полученный в результате тимэктомии)), от организации, например, лаборатории, больницы или учреждения здравоохранения.

В некоторых вариантах осуществления вышеуказанные способы дополнительно включают перед стадией (i) (v) выделение популяции клеток (например, T-клеток, например, CD8+ и/или CD4+ T-клеток), приводимых в контакт на стадии (i), из свежего продукта лейкафереза (или альтернативного источника гемопоэтической ткани, такого как свежий продукт, представляющий собой цельную кровь, свежий продукт, представляющий собой костный мозг, или свежий продукт, полученный в результате биопсии или удаления опухоли или органа (например, свежий продукт, полученный в результате тимэктомии)). В некоторых вариантах осуществления стадию (iii) проводят не позже чем через 35 часов после начала стадии (v), например, не позже чем через 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 или 35 часов после начала стадии (v), например, не позже чем через 30 часов после начала стадии (v). В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (iii) не является размножившейся или является размножившейся с увеличением численности на не более чем 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или 40%, например, на не более чем 10%, например, согласно оценке по количеству живых клеток, по сравнению с популяцией клеток в конце стадии (v).

В некоторых вариантах осуществления вышеуказанные способы дополнительно включают перед стадией (i) получение криоконсервированных T-клеток, выделенных из продукта лейкафереза (или альтернативного источника гемопоэтической ткани, как, например, криоконсервированных T-клеток, выделенных из цельной крови, костного мозга или продукта, полученного в результате биопсии или удаления опухоли или органа (например, тимэктомии)), от организации, например, лаборатории, больницы или учреждения здравоохранения.

В некоторых вариантах осуществления вышеуказанные способы дополнительно включают перед стадией (i) (iv) получение криоконсервированного продукта лейкафереза (или альтернативного источника гемопоэтической ткани, такого как криоконсервированный продукт, представляющий собой цельную кровь, криоконсервированный продукт, представляющий собой костный мозг, или криоконсервированный продукт, полученный в результате биопсии или удаления опухоли или органа (например, криоконсервированный продукт, полученный в результате тимэктомии)), от организации, например, лаборатории, больницы или учреждения здравоохранения.

В некоторых вариантах осуществления вышеуказанные способы дополнительно включают перед стадией (i) (v) выделение популяции клеток (например, T-клеток, например, CD8+ и/или CD4+ T-клеток), приводимых в контакт на стадии (i), из криоконсервированного продукта лейкафереза (или альтернативного источника гемопоэтической ткани, такого как криоконсервированный продукт, представляющий собой цельную кровь, криоконсервированный продукт, представляющий собой костный мозг, или криоконсервированный продукт, полученный в результате биопсии или удаления опухоли или органа (например, криоконсервированный продукт, полученный в результате тимэктомии)). В некоторых вариантах осуществления стадию (iii) проводят не позже чем через 35 часов после начала стадии (v), например, не позже чем через 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 или 35 часов после начала стадии (v), например, не позже чем через 30 часов после начала стадии (v). В некоторых вариантах осуществления популяция клеток из стадии (iii) не является размножившейся или является размножившейся с увеличением численности на не более чем 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или 40%, например, на не более чем 10%, например, согласно оценке по количеству живых клеток, по сравнению с популяцией клеток в конце стадии (v).

В некоторых вариантах осуществления популяция клеток в начале стадии (i) или стадии (1) была обогащена клетками, экспрессирующими IL6R (например, клетками, которые являются положительными по IL6Rα и/или IL6Rβ). В некоторых вариантах осуществления популяция клеток в начале стадии (i) или стадии (1) содержит не менее 40, 45, 50, 55, 60, 65 или 70% клеток, экспрессирующих IL6R (например, клеток, которые являются положительными по IL6Rα и/или IL6Rβ).

В некоторых вариантах осуществления стадии (i) и (ii) или стадии (1) и (2) проводят в средах для клеток, содержащих IL-15 (например, hetIL-15 (IL15/sIL-15Ra)). В некоторых вариантах осуществления IL-15 увеличивает способность популяции клеток к размножению, например, спустя 10, 15, 20 или 25 дней. В некоторых вариантах осуществления IL-15 увеличивает процентную долю клеток, экспрессирующих IL6Rβ, в популяции клеток.

В некоторых вариантах осуществления вышеуказанных способов способы осуществляют в закрытой системе. В некоторых вариантах осуществления все из отделения, активации, трансдукции, инкубирования и промывания Т-клеток проводят в закрытой системе. В некоторых вариантах осуществления вышеуказанных способов способы осуществляют в отдельных устройствах. В некоторых вариантах осуществления отделение, активацию, трансдукцию, инкубирование и промывание Т-клеток проводят в отдельных устройствах.

В некоторых вариантах осуществления вышеуказанных способов способы дополнительно включают добавление вспомогательного вещества или реагента, усиливающего трансдукцию, в среду для культивирования клеток для повышения эффективности трансдукции. В некоторых вариантах осуществления вспомогательное вещество или реагент, усиливающий трансдукцию, содержит катионный полимер. В некоторых вариантах осуществления вспомогательное вещество или реагент, усиливающий трансдукцию, выбраны из LentiBOOST™ (Sirion Biotech), вектофусина-1, F108, бромида гексадиметрина (полибрена), PEA, Pluronic F68, Pluronic F127, Synperonic или LentiTrans™. В некоторых вариантах осуществления вспомогательное вещество представляет собой LentiBOOST™ (Sirion Biotech).

В некоторых вариантах осуществления вышеуказанных способов трансдукция популяции клеток (например, T-клеток) c помощью вирусного вектора включает воздействие на популяцию клеток и вирусный вектор центробежной силы в условиях, при которых повышается эффективность трансдукции. В одном варианте осуществления клетки трансдуцируют путем спинокуляции.

В некоторых вариантах осуществления вышеуказанных способов клетки (например, T-клетки) активируют и трансдуцируют в колбе для культивирования клеток, содержащей газопроницаемую мембрану в основании, которая предоставляет возможность работы с большими объемами сред без существенного нарушения газообмена. В некоторых вариантах осуществления рост клеток достигается путем предоставления доступа, например, по существу непрерывного доступа, к питательным веществам посредством конвекции.

В некоторых вариантах осуществления вышеуказанных способов CAR содержит антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен.

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен связывается с антигеном, выбранным из CD19, CD20, CD22, BCMA, мезотелина, EGFRvIII, GD2, Tn-антигена, sTn-антигена, Tn-O-гликопептидов, sTn-O-гликопептидов, PSMA, CD97, TAG72, CD44v6, CEA, EPCAM, KIT, IL-13Ra2, легумана, GD3, CD171, IL-11Ra, PSCA, MAD-CT-1, MAD-CT-2, VEGFR2, антигена Y системы Льюис, CD24, PDGFR-бета, SSEA-4, рецептора фолиевой кислоты альфа, ERBB (например, ERBB2), Her2/neu, MUC1, EGFR, NCAM, эфрина B2, CAIX, LMP2, sLe, HMWMAA, o-ацетил-GD2, рецептора фолиевой кислоты бета, TEM1/CD248, TEM7R, FAP, легумаина, E6 или E7 HPV, ML-IAP, CLDN6, TSHR, GPRC5D, ALK, полисиаловой кислоты, Fos-родственного антигена, эластазы нейтрофилов, TRP-2, CYP1B1, белка спермы 17, бета-субъединицы хорионического гонадотропина человека, AFP, тиреоглобулина, PLAC1, globoH, RAGE1, MN-CA IX, обратной транскриптазы теломеразы человека, кишечной карбоксилэстеразы, мутантного варианта hsp 70-2, NA-17, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, NY-ESO-1, GPR20, Ly6k, OR51E2, TARP, GFRα4 или пептида любого из этих антигенов, презентированного на MHC. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен содержит последовательность CDR, VH, VL, scFv или CAR, раскрытую в данном документе. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен содержит VH и VL, где VH и VL соединены линкером, где линкер необязательно содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 63 или 104.

В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен включает в себя трансмембранный домен белка, выбранного из альфа-, бета- или дзета-цепи T-клеточного рецептора, CD28, CD3-эпсилон, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 и CD154. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен включает в себя трансмембранный домен CD8. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую трансмембранный домен, где последовательность нуклеиновой кислоты включает в себя последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 17 или последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней.

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен соединен с трансмембранным доменом с помощью шарнирной области. В некоторых вариантах осуществления шарнирная область содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2, 3 или 4 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую шарнирную область, где последовательность нуклеиновой кислоты включает в себя последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 13, 14 или 15 или последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней.

В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит первичный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления первичный сигнальный домен предусматривает функциональный сигнальный домен, полученный из CD3-дзета, TCR-дзета, FcR-гамма, FcR-бета, CD3-гамма, CD3-дельта, CD3-эпсилон, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 (ICOS), FcεRI, DAP10, DAP12 или CD66d. В некоторых вариантах осуществления первичный сигнальный домен предусматривает функциональный сигнальный домен, полученный из CD3-дзета. В некоторых вариантах осуществления первичный сигнальный домен содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9 или 10 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую первичный сигнальный домен, где последовательность нуклеиновой кислоты включает в себя последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 20 или 21 или последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней.

В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит костимулирующий сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления костимулирующий сигнальный домен предусматривает функциональный сигнальный домен, полученный из молекулы MHC I класса, белкового рецептора TNF, иммуноглобулиноподобного белка, рецептора цитокина, интегрина, сигнальной молекулы активации лимфоцитов (белка SLAM), активирующего рецептора NK-клеток, BTLA, лиганда Toll-подобного рецептора, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, 4-1BB (CD137), B7-H3, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8-альфа, CD8-бета, IL2R-бета, IL2R-гамма, IL7R-альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD28-OX40, CD28-4-1BB или лиганда, который специфично связывается с CD83. В некоторых вариантах осуществления костимулирующий сигнальный домен предусматривает функциональный сигнальный домен, полученный из 4-1BB. В некоторых вариантах осуществления костимулирующий сигнальный домен содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую костимулирующий сигнальный домен, где последовательность нуклеиновой кислоты включает в себя последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 18 или последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней.

В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен предусматривает функциональный сигнальный домен, полученный из 4-1BB, и функциональный сигнальный домен, полученный из CD3-дзета. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7 (или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней) и аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9 или 10 (или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней). В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7 и аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9 или 10.

В некоторых вариантах осуществления CAR дополнительно содержит лидерную последовательность, предусматривающую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении описана популяция клеток, экспрессирующих CAR (например, аутологичных или аллогенных T-клеток или NK-клеток, экспрессирующих CAR), полученных посредством любого из вышеуказанных способов или любого другого способа, раскрытого в данном документе. В некоторых вариантах осуществления в данном документе раскрыта фармацевтическая композиция, содержащая популяцию клеток, экспрессирующих CAR, раскрытую в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель.

В некоторых вариантах осуществления популяция содержит:

(a) первую популяцию клеток, содержащих CAR для BCMA, но не CAR для CD19;

(b) вторую популяцию клеток, содержащих CAR для CD19, но не CAR для BCMA; и

(c) третью популяцию клеток, содержащих как CAR для BCMA, так и CAR для CD19.

В некоторых вариантах осуществления:

(i) общее количество жизнеспособных клеток в объединенных второй и третьей популяциях меньше или равняется приблизительно 110% (например, меньше или равняется приблизительно 105%, 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1% или меньше) от общего количества жизнеспособных клеток в объединенных первой и третьей популяциях;

(ii) общее количество жизнеспособных клеток в объединенных первой и третьей популяциях больше или равняется приблизительно 90% (например, больше или равняется приблизительно 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 750%, 1000%, 2000% , 5000, 10000% или больше) от общего количества жизнеспособных клеток в объединенных второй и третьей популяциях; и/или

(iii) общее количество жизнеспособных клеток в объединенных первой и третьей популяциях больше или равняется приблизительно 5% (например, больше или равняется приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%) от общего количества жизнеспособных клеток в популяции.

В некоторых вариантах осуществления популяция дополнительно содержит четвертую популяцию клеток, которые не содержат CAR.

В некоторых вариантах осуществления:

(i) общее количество жизнеспособных клеток во второй популяции меньше или равняется приблизительно 110% (например, меньше или равняется приблизительно 105%, 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1% или меньше) от общего количества жизнеспособных клеток в объединенных первой и третьей популяциях;

(ii) общее количество жизнеспособных клеток во второй популяции меньше или равняется от приблизительно 45% до приблизительно 50% (например, приблизительно 47%); от приблизительно 50 до приблизительно 55% (например, приблизительно 53%); от приблизительно 60% до приблизительно 65% (например, приблизительно 63%) или от приблизительно 80 до приблизительно 85% (например, приблизительно 82%) от общего количества жизнеспособных клеток в объединенных первой и третьей популяциях.

В некоторых вариантах осуществления в конечном продукте на основе клеток с CAR, изготовленном с использованием способов, описанных в данном документе, общее количество гранул (например, гранул с антителами к CD4, гранул с антителами к CD8 и/или гранул TransAct) составляет не более 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 или 0,5% от общего количества гранул, добавляемых в ходе способа изготовления.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении описана популяция клеток, экспрессирующих CAR (например, аутологичных или аллогенных T-клеток или NK-клеток, экспрессирующих CAR), предусматривающая одну или несколько из следующих характеристик: (a) приблизительно такую же процентную долю необученных клеток, например, необученных Т-клеток, например, CD45RO- CCR7+ T-клеток, по сравнению с процентной долей необученных клеток, например, необученных Т-клеток, например, CD45RO- CCR7+ клеток, в той же популяции клеток до их конструирования таким образом, чтобы они экспрессировали CAR; (b) изменение количества необученных клеток, например, необученных Т-клеток, например, CD45RO- CCR7+ T-клеток, находящееся в пределах от приблизительно 5% до приблизительно 10%, например, по сравнению с процентной долей необученных клеток, например, необученных Т-клеток, например, CD45RO- CCR7+ T-клеток, в той же популяции клеток до их конструирования таким образом, чтобы они экспрессировали CAR; (c) увеличенную процентную долю необученных клеток, например, необученных Т-клеток, например, CD45RO- CCR7+ T-клеток, например, увеличенную в по меньшей мере 1,2, 1,4, 1,6, 1,8, 2,0, 2,2, 2,4, 2,6, 2,8 или 3 раза, по сравнению с процентной долей необученных клеток, например, необученных Т-клеток, например, CD45RO- CCR7+ T-клеток, в той же популяции клеток до их конструирования таким образом, чтобы они экспрессировали CAR; (d) приблизительно такую же процентную долю центральных клеток памяти, например, центральных T-клеток памяти, например, CCR7+ CD45RO+ T-клеток, по сравнению с процентной долей центральных клеток памяти, например, центральных T-клеток памяти, например, CCR7+ CD45RO+ T-клеток, в той же популяции клеток до их конструирования таким образом, чтобы они экспрессировали CAR; (e) изменение количества центральных клеток памяти, например, центральных T-клеток памяти, например, CCR7+ CD45RO+ T-клеток, находящееся в пределах от приблизительно 5% до приблизительно 10%, по сравнению с процентной долей центральных клеток памяти, например, центральных T-клеток памяти, например, CCR7+ CD45RO+ T-клеток, в той же популяции клеток до их конструирования таким образом, чтобы они экспрессировали CAR; (f) уменьшенную процентную долю центральных клеток памяти, например, центральных T-клеток памяти, например, CCR7+ CD45RO+ T-клеток, например, уменьшенную на по меньшей мере 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50%, по сравнению с процентной долей центральных клеток памяти, например, центральных T-клеток памяти, например, CCR7+ CD45RO+ T-клеток, в той же популяции клеток до их конструирования таким образом, чтобы они экспрессировали CAR; (g) приблизительно такую же процентную долю стволовых T-клеток памяти, например, CD45RA+ CD95+ рецептор IL-2 β+ CCR7+ CD62L+ T-клеток, по сравнению с процентной долей стволовых T-клеток памяти, например, CD45RA+ CD95+ рецептор IL-2 β+ CCR7+ CD62L+ T-клеток, в той же популяции клеток до их конструирования таким образом, чтобы они экспрессировали CAR; (h) изменение количества стволовых T-клеток памяти, например, CD45RA+ CD95+ рецептор IL-2 β+ CCR7+ CD62L+ T-клеток, находящееся в пределах от приблизительно 5% до приблизительно 10%, по сравнению с процентной долей стволовых T-клеток памяти, например, CD45RA+ CD95+ рецептор IL-2 β+ CCR7+ CD62L+ T-клеток, в той же популяции клеток до их конструирования таким образом, чтобы они экспрессировали CAR; или (i) увеличенную процентную долю стволовых T-клеток памяти, например, CD45RA+ CD95+ рецептор IL-2 β+ CCR7+ CD62L+ T-клеток, по сравнению с процентной долей стволовых T-клеток памяти, например, CD45RA+ CD95+ рецептор IL-2 β+ CCR7+ CD62L+ T-клеток, в той же популяции клеток до их конструирования таким образом, чтобы они экспрессировали CAR.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении описана популяция клеток, экспрессирующих CAR (например, аутологичных или аллогенных T-клеток или NK-клеток, экспрессирующих CAR), где (a) медианный балл набора генов (активируемые в TEM относительно подавляемых в TSCM) для популяции клеток является приблизительно таким же, как медианный балл набора генов (активируемые в TEM относительно подавляемых в TSCM) для той же популяции клеток до их конструирования таким образом, чтобы они экспрессировали CAR, или отличается от него на не более чем (например, увеличен на не более чем) приблизительно 25, 50, 75, 100 или 125%; (b) медианный балл набора генов (активируемые в Treg относительно подавляемых в Teff) для популяции клеток является приблизительно таким же, как медианный балл набора генов (активируемые в Treg относительно подавляемых в Teff) для популяции клеток до их конструирования таким образом, чтобы они экспрессировали CAR, или отличается от него на не более чем (например, увеличен на не более чем) приблизительно 25, 50, 100, 150 или 200%; (c) медианный балл набора генов (подавляемые в состоянии стволовости) для популяции клеток является приблизительно таким же, как медианный балл набора генов (подавляемые в состоянии стволовости) для популяции клеток до их конструирования таким образом, чтобы они экспрессировали CAR, или отличается от него на не более чем (например, увеличен на не более чем) приблизительно 25, 50, 100, 150, 200 или 250%; (d) медианный балл набора генов (активируемые при гипоксии) для популяции клеток является приблизительно таким же, как медианный балл набора генов (активируемые при гипоксии) для популяции клеток до их конструирования таким образом, чтобы они экспрессировали CAR, или отличается от него на не более чем (например, увеличен на не более чем) приблизительно 125, 150, 175 или 200%; или (e) медианный балл набора генов (активируемые при аутофагии) для популяции клеток является приблизительно таким же, как медианный балл набора генов (активируемые при аутофагии) для популяции клеток до их конструирования таким образом, чтобы они экспрессировали CAR, или отличается от него на не более чем (например, увеличен на не более чем) приблизительно 180, 190, 200 или 210%.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении описан способ усиления иммунного ответа у субъекта, включающий введение субъекту популяции клеток, экспрессирующих CAR, раскрытой в данном документе, или фармацевтической композиции, раскрытой в данном документе, за счет чего обеспечивается усиление иммунного ответа у субъекта.

В некоторых вариантах осуществления в данном документе раскрыт способ лечения рака у субъекта, включающий введение субъекту популяции клеток, экспрессирующих CAR, раскрытой в данном документе, или фармацевтической композиции, раскрытой в данном документе, за счет чего обеспечивается лечение рака у субъекта. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой солидный рак, например, выбранный из одного или нескольких из мезотелиомы, злокачественной мезотелиомы плевры, немелкоклеточного рака легкого, мелкоклеточного рака легкого, плоскоклеточного рака легкого, крупноклеточного рака легкого, рака поджелудочной железы, протоковой аденокарциномы поджелудочной железы, аденокарциномы пищевода, рака молочной железы, глиобластомы, рака яичника, колоректального рака, рака предстательной железы, рака шейки матки, рака кожи, меланомы, рака почки, рака печени, рака головного мозга, тимомы, саркомы, карциномы, рака матки, рака почки, рака желудочно-кишечного тракта, уротелиального рака, рака глотки, рака головы и шеи, рака прямой кишки, рака пищевода или рака мочевого пузыря или их метастазов. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой гемобластоз, например, выбранный из хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL), мантийноклеточной лимфомы (MCL), множественной миеломы, острого лимфоидного лейкоза (ALL), лимфомы Ходжкина, B-клеточного острого лимфоидного лейкоза (BALL), T-клеточного острого лимфоидного лейкоза (TALL), мелкоклеточного лимфоцитарного лейкоза (SLL), B-клеточного пролимфоцитарного лейкоза, новообразования из бластных плазмоцитоидных дендритных клеток, лимфомы Беркитта, диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы (DLBCL), DLBCL, ассоциированной с хроническим воспалением, хронического миелоидного лейкоза, миелопролиферативных новообразований, фолликулярной лимфомы, педиатрической фолликулярной лимфомы, волосатоклеточного лейкоза, мелкоклеточной или крупноклеточной фолликулярной лимфомы, злокачественных лимфопролиферативных состояний, MALT-лимфомы (экстранодальной лимфомы из клеток маргинальной зоны из лимфоидной ткани слизистых оболочек), лимфомы из клеток маргинальной зоны, миелодисплазии, миелодиспластического синдрома, неходжкинской лимфомы, плазмобластной лимфомы, новообразования из плазмоцитоидных дендритных клеток, макроглобулинемии Вальденстрема, лимфомы из клеток маргинальной зоны селезенки, лимфомы/лейкоза селезенки, диффузной мелкоклеточной B-клеточной лимфомы красной пульпы селезенки, варианта волосатоклеточного лейкоза, лимфоплазмоцитарной лимфомы, болезни тяжелых цепей, плазмоклеточной миеломы, солитарной плазмоцитомы кости, внекостной плазмоцитомы, нодулярной лимфомы из клеток маргинальной зоны, педиатрической нодулярной лимфомы из клеток маргинальной зоны, первичной кожной лимфомы из клеток центра фолликула, лимфоматоидного гранулематоза, первичной медиастинальной (тимической) крупноклеточной B-клеточной лимфомы, внутрисосудистой крупноклеточной B-клеточной лимфомы, ALK+ крупноклеточной B-клеточной лимфомы, крупноклеточной B-клеточной лимфомы, возникающей при HHV8-ассоциированной многоочаговой болезни Кастлемана, первичной выпотной лимфомы, B-клеточной лимфомы, острого миелоидного лейкоза (AML) или неклассифицируемой лимфомы.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение субъекту второго терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления второе терапевтическое средство представляет собой противораковое терапевтическое средство, например, средство химиотерапии, лучевой терапии или иммунорегуляторной терапии. В некоторых вариантах осуществления второе терапевтическое средство представляет собой IL-15 (например, hetIL-15 (IL15/sIL-15Ra)).

В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрена выделенная клетка или популяция клеток, полученная посредством способа, описанного в данном документе, предусматривающая одну или несколько клеток, содержащих:

(a) первую молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую первый CAR, который содержит домен, связывающий BCMA, первый трансмембранный домен и первый внутриклеточный сигнальный домен, где домен, связывающий BCMA, содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (CDR1 HC), определяющую комплементарность область 2 тяжелой цепи (CDR2 HC) и определяющую комплементарность область 3 тяжелой цепи (CDR3 HC), и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (CDR1 LC), определяющую комплементарность область 2 легкой цепи (CDR2 LC) и определяющую комплементарность область 3 легкой цепи (CDR3 LC), где CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 86, 87, 88, 95, 96 и 97 соответственно; и

(b) вторую молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую второй CAR, который содержит домен, связывающий CD19, второй трансмембранный домен и второй внутриклеточный сигнальный домен, где домен, связывающий CD19, содержит VH, содержащую CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC, и VL, содержащую CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC, где CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 295, 304 и 297-300 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрена выделенная клетка, содержащая:

(a) первую молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую первый CAR, который содержит домен, связывающий BCMA, первый трансмембранный домен и первый внутриклеточный сигнальный домен, где домен, связывающий BCMA, содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (CDR1 HC), определяющую комплементарность область 2 тяжелой цепи (CDR2 HC) и определяющую комплементарность область 3 тяжелой цепи (CDR3 HC), и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (CDR1 LC), определяющую комплементарность область 2 легкой цепи (CDR2 LC) и определяющую комплементарность область 3 легкой цепи (CDR3 LC), где CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 86, 87, 88, 95, 96 и 97 соответственно; и

(b) вторую молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую второй CAR, который содержит домен, связывающий CD19, второй трансмембранный домен и второй внутриклеточный сигнальный домен, где домен, связывающий CD19, содержит VH, содержащую CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC, и VL, содержащую CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC, где CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 295, 304 и 297-300 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления VH и VL домена, связывающего BCMA, содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 93 и 102 соответственно. В некоторых вариантах осуществления VH и VL домена, связывающего CD19, содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 250 и 251 соответственно. В некоторых вариантах осуществления VH и VL домена, связывающего BCMA, содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 93 и 102 соответственно, а VH и VL домена, связывающего CD19, содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 250 и 251 соответственно. В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 105. В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий CD19, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 293. В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 105, а домен, связывающий CD19, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 293. В некоторых вариантах осуществления первый CAR содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 107. В некоторых вариантах осуществления второй CAR содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 225. В некоторых вариантах осуществления первый CAR содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 107; и второй CAR содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 225. В некоторых вариантах осуществления первый CAR кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 259, 258 или 416. В некоторых вариантах осуществления второй CAR кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 417, 355, 356 или 354. В некоторых вариантах осуществления первый CAR кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 259, 258 или 416, и второй CAR кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 417, 355, 356 или 354.

В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрена фармацевтическая композиция, содержащая клетку или популяцию клеток, описанные в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрен способ обеспечения противоопухолевого иммунитета у субъекта или лечения субъекта, у которого имеется заболевание, ассоциированное с экспрессией BCMA, включающий введение субъекту эффективного количества клетки или популяции клеток или фармацевтической композиции, описанных в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления заболевание, ассоциированное с экспрессией BCMA, представляет собой гематологический рак или солидный рак, например, гематологический рак или солидный рак, описанный в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления заболевание выбрано из острого лейкоза, B-клеточного острого лимфоидного лейкоза ("BALL"), T-клеточного острого лимфоидного лейкоза ("TALL"), острого лимфоидного лейкоза (ALL), хронического миелогенного лейкоза (CML), хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL), B-клеточного пролимфоцитарного лейкоза, новообразования из бластных плазмоцитоидных дендритных клеток, лимфомы Беркитта, диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомы, фолликулярной лимфомы, волосатоклеточного лейкоза, мелкоклеточной или крупноклеточной фолликулярной лимфомы, злокачественных лимфопролиферативных состояний, MALT-лимфомы, мантийноклеточной лимфомы, лимфомы из клеток маргинальной зоны, множественной миеломы, миелодисплазии и миелодиспластического синдрома, неходжкинской лимфомы, плазмобластной лимфомы, новообразования из плазмоцитоидных дендритных клеток, макроглобулинемии Вальденстрема, рака предстательной железы (например, кастрационнорезистентного или резистентного к терапии рака предстательной железы или метастатического рака предстательной железы), рака поджелудочной железы, рака легкого, нарушения пролиферации плазматических клеток (например, бессимптомной миеломы ("тлеющей" множественной миеломы или вялотекущей миеломы), моноклональной гаммапатии неустановленной этиологии (MGUS), макроглобулинемии Вальденстрема, плазмоцитомы (например, плазмоклеточной дискразии, солитарной миеломы, солитарной плазмоцитомы, экстрамедуллярной плазмоцитомы и множественной плазмоцитомы), системного амилоидоза в форме амилоидоза легких цепей или POEMS-синдрома (также известного как синдром Кроу-Фукаса, болезнь Такатсуки и PEP-синдром)) или их комбинации.

В некоторых вариантах осуществления заболевание представляет собой множественную миелому.

Хотя при осуществлении на практике или тестировании настоящего изобретения можно применять способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в данном документе, ниже описываются подходящие способы и материалы. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие литературные источники (например, идентификационные номера последовательностей в базах данных), упоминаемые в данном документе, включены посредством ссылки во всей своей полноте. Например, все последовательности из GenBank, Unigene и Entrez, упоминаемые в данном документе, например, в любой таблице в данном документе, включены посредством ссылки. Если для одного гена или белка представлены ссылки на несколько номеров доступа последовательностей, охватываются все варианты последовательности.

Кроме того, материалы, способы и примеры являются исключительно иллюстративными и не предполагаются как ограничивающие. Заголовки, подзаголовки или пронумерованные или обозначенные буквами элементы, например, (a) (b) (i) и т. д., представлены исключительно для удобства прочтения. Использование заголовков или пронумерованных или обозначенных буквами элементов в данном документе не требует того, чтобы стадии или элементы проводились в алфавитном порядке, или того, чтобы стадии или элементы обязательно были отделены друг от друга. Другие признаки, цели и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из описания и графических материалов, а также из формулы изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1A-1H. Анализ в репортерных клетках Jurkat с NFAT-люциферазой (JNL) с помощью автоматической системы применяли для тестирования функции CAR для BCMA. Клоны CAR оценивали в анализе в репортерных клетках JNL в отношении антигензависимой активности. Клетки JNL, содержащие указанные клоны CAR, или нетрансдуцированные клетки JNL (UTD) совместно культивировали со средой в отдельности (фиг. 1G и 1H) или с линиями клеток-мишеней (KMS11 в качестве BCMA-положительной линии клеток (фиг. 1A и 1C) и NALM6 в качестве BCMA-отрицательной линии клеток (фиг. 1E и 1F)) при различных соотношениях, и активность люциферазы измеряли в виде интенсивности люминесценции. Клоны считались активными, если интенсивность люминесценции в 2 раза превышала уровень в клетках UTD в присутствии клеток, экспрессирующих антиген. Регистрируемый показатель люминесценции является прямой мерой стимуляции CAR. Фиг. 1B и 1D представляют собой графики, на которых показан уровень экспрессии CAR для ВСМА на клетках JNL, выявленный с помощью проточной цитометрии с использованием рекомбинантного (r)BCMA_Fc-AF647 человека. Платформа 1x или 2x указывала на 40000 клеток H293 или 80000 клеток H293, высеянных для продуцирования вируса.

Фиг. 2. Уровень экспрессии CAR для BCMA на первичных Т-клетках человека. Клетки окрашивали реагентом rBCMA_Fc-AF647 человека и анализировали с помощью проточной цитометрии. Процентная доля CAR+ клеток и MFI показаны на графике для дня 5 и дня 9 культивирования клеток. Данные обобщены в таблице 27, которая включает титр вируса, достигнутый для соответствующих CAR.

Фиг. 3A-3C. Способность Т-клеток, экспрессирующих указанные CAR, опосредовать лизис клеток и продуцирование цитокинов оценивали в отношении линии клеток-мишеней KMS11, экспрессирующих люциферазу светлячков (KMS11-luc). Фиг. 3A. CAR-T-клетки совместно культивировали с клетками-мишенями KMS11-luc при указанных соотношениях E:T. % уничтожения клеток определяли по разнице в сигнале люциферазы между клетками-мишенями без эффекторных Т-клеток (контроль) и с эффекторными Т-клетками (эксперимент), выраженной в виде процента от контроля. UTD представляет нетрансдуцированные Т-клетки. Фиг. 3B. Фоновый уровень уничтожения наблюдался для BCMA-отрицательной линии NALM6. Фиг. 3C. Уровень IFNγ измеряли с помощью MSD в надосадочных жидкостях, собранных через 24 часа из этих систем совместного культивирования при соотношении Е:Т 2,5. Все данные выражены в виде среднего значения +/- стандартное отклонение.

Фиг. 4A-4C. Экспрессия CAR в Т-клетках, трансдуцированных при MOI=5 (титр вируса определен по первому CAR, экспрессируемому в клетках SupT1). На фиг. 4A представлена таблица, в которой обобщены % CAR19, % CAR для BCMA, % дважды положительных, % только CAR19 и % только CAR для BCMA для различных конструкций. На фиг. 4B представлен ряд графиков проточной цитометрии, на которых показано окрашивание клеток для выявления поверхностной экспрессии CAR для BCMA (ось x) и поверхностной экспрессии CAR для CD19 (ось y). На фиг. 4C представлена пара столбчатых диаграмм, на которых показана MFI для CAR для BCMA (верхняя панель) и MFI для CAR для CD19 (нижняя панель).

Фиг. 5A-5C. Анализ уничтожения in vitro с использованием CAR-T-клеток в день 8. На фиг. 5A-5C представлен ряд графиков, на которых показан % уничтожения BCMA-положительных клеток KMS11, CD19-положительных клеток Nalm6 или BCMA/CD19-отрицательных клеток соответственно при указанных соотношениях E:T.

Фиг. 6A-6D. Анализ продуцирования цитокинов in vitro с использованием CAR-T-клеток в день 8. На фиг. 6A-6D представлен ряд столбчатых диаграмм, на которых показано продуцирование IFN-гамма CAR-T-клетками при совместном культивировании с BCMA-положительными клетками KMS11 или CD19-положительными клетками Nalm6.

Фиг. 7A-7C. Индивидуальная экспрессия CAR в клетках, изготовленных с использованием способа ARM. На фиг. 7A-7B представлены гистограммы, на которых показан паттерн экспрессии как CAR для BCMA, так и CAR для CD19 через 24 часа или 72 часа после трансдукции первичных Т-клеток человека, изготовленных с использованием способа ARM. В исследованиях использовали MOI, составляющую 1, исходя из титра в SupT1, определенного по экспрессии вышерасположенного CAR. На каждой из фиг. 7A и 7B левая часть представляет собой панель гистограмм, на которых показано окрашивание с использованием rBCMA-Fc, а правая часть представляет собой панель гистограмм, на которых показано окрашивание с использованием антиидиотипического антитела, связывающегося с CAR для CD19. Конструкции № 244 ("c244") и № 245 ("c245") представляют собой моно-CAR для CD19 и моно-CAR для BCMA соответственно. На фиг. 7C представлена панель графиков проточной цитометрии, на которых показан паттерн экспрессии CAR для BCMA и CD19 через 72 часа после трансдукции первичных Т-клеток человека с использованием MOI, составляющей 1, исходя из титра для вышерасположенного CAR.

Фиг. 8A-8C. Противоопухолевая активность in vivo конструкции № 236 ("c236") и конструкции № 238 ("c238") с использованием трех мышиных моделей: модели диссеминированной множественной миеломы из KMS-11 (BCMA+ CD19-), экспрессирующей репортерный ген люциферазы (KMS11-Luc) (фиг. 8A), ксенотрансплантатной мышиной модели из Nalm6-Luc (CD19+BCMA-) (фиг. 8B) и смешанной модели из 95% клеток KMS-luc и 5% клеток NALM6-Luc (фиг. 8C). Опухолевая нагрузка выражена в виде люминесценции всего тела (фотонов/с) и изображена в виде среднего значения опухолевой нагрузки+SEM. В день 7 или 8 после инокуляции опухоли мышей обрабатывали с помощью c236 и c238 в обозначенных дозах BCMA-CAR+ или CD19-CAR+ Т-клеток (приблизительное количество жизнеспособных CAR+ Т-клеток), как показано в таблице 30. Среда-носитель (PBS) и нетрансдуцированные Т-клетки (UTD) служили в качестве отрицательных контролей. Также в качестве контролей использовали моно-CAR для BCMA PI61 и моно-CAR для CD19 CTL119.

Фиг. 9A-9C. Потеря массы тела, индуцированная реакцией "трансплантат против хозяина". У всех мышей индивидуально отслеживали потерю массы тела, что является регистрируемым показателем X-GvHD, путем измерения массы тела с течением времени. Массу тела (BWT) наносили на график в виде % изменения относительно исходного уровня.

Фиг. 10A-10C. Размножение CD3+ Т-клеток периферической крови in vivo анализировали с помощью проточной цитометрии в течение вплоть до 4 недель после инфузии.

Фиг. 11A-11C. Размножение CAR+ Т-клеток in vivo (процентную долю BCMA-CAR+) анализировали с помощью проточной цитометрии в течение вплоть до 4 недель после инфузии.

Фиг. 12A-12C. Размножение CAR+ Т-клеток in vivo (показатели количества дважды CAR+) анализировали с помощью проточной цитометрии в течение вплоть до 4 недель после инфузии.

Фиг. 13A-13C. Кинетические показатели IFNγ в плазме крови in vivo. Уровни IFNγ в плазме крови во всех трех мышиных моделях при обработке с помощью c236 и c238, а также моно-CAR в качестве контролей в соответствующих дозах CAR-T наносили на графики. У мышей отбирали кровь, и уровень цитокинов в плазме крови измеряли посредством MSD-анализа.

Фиг. 14A и 14B. Эффективность in vivo и размножение клеток у клеток, полученных с использованием 236 и c238, в ксенотрансплантатной мышиной модели множественной миеломы. Фиг. 14A. Мышам NSG инъецировали линию клеток множественной миеломы KMS11, которые экспрессировали репортерный ген люциферазы. Опухолевая нагрузка выражена в виде люминесценции всего тела (фотонов/с) и изображена в виде среднего значения опухолевой нагрузки+SEM. В день 8 после инокуляции опухоли мышей обрабатывали с помощью c236 и c238 в дозе 9e4 дважды BCMA/CD19-CAR+ T-клеток (приблизительное количество жизнеспособных CAR+ Т-клеток). Среда-носитель (PBS) и нетрансдуцированные Т-клетки (UTD) служили в качестве отрицательных контролей. Фиг. 14B. Размножение CAR+ Т-клеток периферической крови анализировали с помощью проточной цитометрии в течение вплоть до 4 недель после инфузии. Размножение дважды BCMA/CD19-CAR+ T-клеток наблюдалось в группах Rx CAR-T c236 и c238.

Фиг. 15A и 15B. Экспрессия CAR в клетках, изготовленных с использованием способа ARM. Графики проточной цитометрии, на которых показана экспрессия CAR для BCMA и CD19 в дважды положительных клетках через 96 часов (фиг. 15A) и 7 дней (фиг. 15B) после добавления вируса к первичным Т-клеткам человека, изготовленным с использованием способа ARM. В исследованиях использовали MOI, составляющую 2, исходя из титра в SupT1, определенного по экспрессии CAR в дважды положительных клетках (положительных по клонам PI61 или R1G5 и CTL119), выявленной с помощью антиидиотипического антитела, связывающегося с CAR для CD19, и рекомбинантного BCMA_Fc (AF647), связывающегося с PI61 или R1G5. Моно-BCMA-CAR-T PI61 и R1G5, а также моно-CD19-CAR-T CTL119 служили в качестве контролей.

Фиг. 16. Экспрессия CAR в день 7 в способе ТМ с использованием MOI, составляющей 5. Графики проточной цитометрии, на которых показана экспрессия CAR для BCMA и CD19 в дважды положительных клетках через 7 дней после добавления вируса к первичным Т-клеткам человека, изготовленным с использованием способа TM. В исследованиях использовали MOI, составляющую 5, исходя из титра в SupT1, определенного по экспрессии CAR в дважды положительных клетках (положительных по клонам PI61 или R1G5 и CTL119), выявленной с помощью антиидиотипического антитела, связывающегося с CAR для CD19, и рекомбинантного BCMA_Fc (AF647), связывающегося с PI61 или R1G5.

Фиг. 17A и 17B. Специфичное уничтожение in vitro опухолевых клеток, экспрессирующих BCMA или CD19, Т-клетками, сконструированными с использованием конструкций CAR для BCMA и CAR для CD19 в формате диатела. Способность Т-клеток, экспрессирующих клоны PI61/CTL119, опосредовать лизис клеток оценивали в отношении линии клеток-мишеней KMS11-Luc или NALM6-Luc. CAR-Т-клетки совместно культивировали с BCMA+ клетками-мишенями KMS-11-luc или BCMA- клетками-мишенями NALM6-Luc при указанных соотношениях E:T в течение 20 часов, и в качестве косвенного показателя лизиса клеток-мишеней измеряли % уничтожения клеток, определяемый по разнице в сигнале люциферазы между клетками-мишенями без эффекторных Т-клеток (контроль) и с эффекторными Т-клетками (эксперимент), выраженной в виде процента от контроля. UTD представляет нетрансдуцированные Т-клетки. Моноварианты PI61 или CTL119 служили в качестве контролей.

Фиг. 18A и 18B. Продуцирование цитокинов Т-клетками, сконструированными с использованием конструкций CAR для BCMA и CAR для CD19 в формате диатела, в ответ на опухолевые клетки, экспрессирующие BCMA или CD19. Уровни IFNγ (фиг. 18A) и IL-2 (фиг. 18B) измеряли с помощью MSD в надосадочных жидкостях совместной культуры из анализа уничтожения при соотношении 1,25:1.

Фиг. 19. Процентные доли дважды CAR-положительной популяции, положительной по CAR для BCMA популяции и положительной по CAR для CD19 популяции в день 4.

Фиг. 20. Графики проточной цитометрии, на которых показано окрашивание клеток с помощью rBCMA-Fc и антиидиотипического антитела, которое связывается с CAR для CD19.

Фиг. 21. Процентные доли общих CAR-положительных популяций в день 4 и день 7 в указанных условиях.

Фиг. 22. Показатели количества клеток (левая панель) и процентная доля живых клеток (правая панель) в дни 0, 1, 3 и 7 в указанных условиях.

Фиг. 23A, 23B и 23C. Данные секвенирования РНК одиночных клеток для исходных клеток (фиг. 23A), клеток дня 1 (фиг. 23B) и клеток дня 9 (фиг. 23C). Графики "n генов" демонстрируют количество экспрессируемых генов на клетку. Графики "n UMI" демонстрируют количество уникальных молекулярных идентификаторов (UMI) на клетку.

Фиг. 24A, 24B, 24C и 24D. Графики, построенные методом нелинейного снижения размерности и визуализации многомерных переменных (TSNE), на которых сравниваются исходные клетки (фиг. 24A), клетки дня 1 (фиг. 24B) и клетки дня 9 (фиг. 24C) в отношении сигнатуры пролиферации, которую определяли на основании экспрессии генов CCNB1, CCND1, CCNE1, PLK1 и MKI67. Каждая точка представляет собой клетку в рассматриваемом образце. Клетки, показанные светло-серым цветом, не экспрессируют гены, отвечающие за пролиферацию, тогда как клетки, заштрихованные темным цветом, экспрессируют один или несколько генов, отвечающих за пролиферацию. Фиг. 24D представляет собой скрипичный график, на котором показано распределение баллов набора генов для набора генов, состоящего из генов, которые характеризуют покоящееся состояние T-клеток, относительно таковых, которые характеризуют активированное состояние T-клеток, для клеток дня 1, клеток дня 9 и исходных клеток. На фиг. 24D более высокий балл набора генов (активируемые в покоящемся состоянии относительно подавляемых в активированном состоянии) указывает на увеличение выраженности фенотипа покоящихся Т-клеток, тогда как более низкий балл набора генов (активируемые в покоящемся состоянии относительно подавляемых в активированном состоянии) указывает на увеличение выраженности фенотипа активированных T-клеток. Исходные клетки в целом были в большинстве своем в покоящемся состоянии по сравнению с клетками дня 9 и дня 1. Клетки дня 1 демонстрируют наиболее высокий балл набора генов, отвечающих за активацию.

Фиг. 25A, 25B, 25C, 25D и 25E. Анализ наборов генов для исходных клеток, клеток дня 1 и клеток дня 9. На фиг. 25A более высокий балл набора генов для набора генов "активируемые в TEM относительно подавляемых в TSCM" указывает на увеличение выраженности фенотипа эффекторных Т-клеток памяти (TEM) в рассматриваемом образце, тогда как более низкий балл набора генов указывает на увеличение выраженности фенотипа стволовых T-клеток памяти (TSCM). На фиг. 25B более высокий балл набора генов для набора генов "активируемые в Treg относительно подавляемых в Teff" указывает на увеличение выраженности фенотипа регуляторных Т-клеток (Treg), тогда как более низкий балл набора генов указывает на увеличение выраженности фенотипа эффектoрных Т-клеток (Teff). На фиг. 25C более низкий балл набора генов для набора генов "подавляемые в состоянии стволовости" указывает на увеличение выраженности фенотипа стволовости. На фиг. 25D более высокий балл набора генов для набора генов "активируемые при гипоксии" указывает на увеличение выраженности фенотипа, характерного для гипоксии. На фиг. 25E более высокий балл набора генов для набора генов "активируемые при аутофагии" указывает на увеличение выраженности фенотипа, характерного для аутофагии. Клетки дня 1 выглядели похожими на исходные клетки в отношении сигнатуры памяти, подобия стволовым клеткам и дифференцировки. Клетки дня 9 в то же время демонстрируют более высокую степень выраженности метаболического стресса.

Фиг. 26A, 26B и 26C. Анализ генов в кластерах исходных клеток. Фиг. 26A-26C представляют собой скрипичные графики, на которых показаны баллы наборов генов из анализа наборов генов в четырех кластерах исходных клеток. Каждая точка, лежащая на скрипичных графиках на фиг. 26A-26C, представляет балл набора генов в клетке. На фиг. 26A более высокий балл набора генов для набора генов "активируемые в Treg относительно подавляемых в Teff" указывает на увеличение выраженности фенотипа Treg-клеток, тогда как более низкий балл набора генов для набора генов "активируемые в Treg относительно подавляемых в Teff" указывает на увеличение выраженности фенотипа Teff-клеток. На фиг. 26B более высокий балл набора генов для набора генов "постепенно активируемые при дифференцировке в клетки памяти" указывает на увеличение выраженности фенотипа поздних Т-клеток памяти, тогда как более низкий балл набора генов для набора генов "постепенно активируемые при дифференцировке в клетки памяти" указывает на увеличение выраженности фенотипа ранних Т-клеток памяти. На фиг. 26C более высокий балл набора генов для набора генов "активируемые в TEM относительно подавляемых в TN" указывает на увеличение выраженности фенотипа эффекторных Т-клеток памяти, тогда как более низкий балл набора генов для набора генов "активируемые в TEM относительно подавляемых в TN" указывает на увеличение выраженности фенотипа необученных Т-клеток памяти. Показано, что клетки в кластере 3 находились в состоянии поздних, более дифференцированных Т-клеток памяти по сравнению с клетками в кластере 1 и кластере 2, которые находились в состоянии ранних, менее дифференцированных Т-клеток памяти. Кластер 0, по-видимому, соответствует промежуточному состоянию Т-клеток. Взятые вместе, эти данные демонстрируют, что среди исходных клеток имеется значительный уровень гетерогенности.

Фиг. 27A, 27B и 27C. Секвенирование TCR и измерение разнообразия клонотипов. Клетки дня 9 характеризовались более плосковершинным распределением частот клонотипов (более высоким разнообразием).

Фиг. 28A и 28B. Анализы методом проточной цитометрии для определения экспрессии CAR в дни 4 и 7 после трансдукции. Анализы методом проточной цитометрии для CAR-T-клеток, полученных путем котрансдукции клеток с помощью векторов, кодирующих CAR для BCMA и CD19, при разных комбинациях MOI с использованием способа ARM в 24-луночном планшете. Фиг. 28A. Графики проточной цитометрии, на которых показана экспрессия моно-CAR для BCMA, моно-CAR для CD19 и CAR в дважды+ клетках в дни 4 и 7 после трансдукции в условиях четырех разных MOI в дополнение к контролям (UTD и одиночный вектор). Фиг. 28B. Количественное оценивание субпопуляций в CAR+ популяциях, включающих общую популяцию BCMA-CAR+ Т-клеток, общую популяцию CD19-CAR+ Т-клеток, а также общую популяцию CAR+ Т-клеток (сумму двух групп моно-CAR+ Т-клеток и дважды CAR+ Т-клеток) при каждом условии, как описано на фиг. 28A. Приведенные данные являются иллюстративными для Т-клеток от трех доноров с согласующимися результатами. Процентные доли CAR+ клеток гейтированы по популяции живых CD3+ T-клеток.

Фиг. 29. Анализы методом проточной цитометрии для определения экспрессии CAR в день 4 после трансдукции. Анализы методом проточной цитометрии конечных продуктов в виде коктейля CAR-T с двойным нацеливанием, моно-BCMA-CAR-T и моно-CD19-CAR-T в отношении экспрессии CAR в день 4 после трансдукции. Небольшие аликвоты каждого продукта, собранные через 24 часа, повторно культивировали в течение трех дней перед окрашиванием в ходе проточной цитометрии.

Фиг. 30A, 30B, 30C, 30D и 30E. Эффективность in vivo CAR-T с двойной специфичностью по сравнению с моно-BCMA-CAR-T и CD19-CAR-T в ксенотрансплантатных моделях. Мышам NSG инъецировали линии клеток, экспрессирующие репортерный ген люциферазы (KMS-11, или Nalm-6, или смесь обоих с 5% Nalm-6-luc). Опухолевая нагрузка выражена в виде люминесценции всего тела (фотонов/с) и изображена в виде среднего значения опухолевой нагрузки+SEM. В день 7 или 8 после инокуляции опухоли мышей обрабатывали с помощью коктейля CAR-T с двойным нацеливанием, BCMA-CAR-T или CD19-CAR-T в соответствующих дозах (приблизительное количество жизнеспособных CAR+ Т-клеток). Среда-носитель (PBS) и нетрансдуцированные Т-клетки (UTD) служили в качестве отрицательных контролей. N=5 мышей для всех групп. BCMA-CAR-T и CD19-CAR-T служили в качестве соответствующих контролей при использовании наивысшего уровня дозы. Все эксперименты завершали в день 23 после введения CAR-T.

Фиг. 31. На фиг. 31 представлена столбчатая диаграмма, на которой показан % моно-CD19-CAR+ клеток, % моно-BCMA-CAR+ клеток и % дважды BCMA/CD19-CAR+ клеток в день 4 после трансдукции (день 3 после сбора).

Фиг. 32. Определение характеристик субпопуляций T-клеток. На фиг. 32 представлен график, на котором показан % CD4+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток, необученных Т-клеток (Tn), центральных Т-клеток памяти (Tcm), эффекторных Т-клеток памяти (Tem) и эффекторных Т-клеток памяти, реэкспрессирующих CD45RA (TEMRA), в исходном материале, материале после обогащения и в материале после сбора в день 1.

Фиг. 33A и 33B. Кинетические показатели IFNγ в плазме крови мышей, обработанных клеточным продуктом на основе CAR-T с двойной специфичностью к BCMA/CD19, BCMA-CAR-T и CD19-CAR-T. Животных обрабатывали с помощью PBS, UTD, клеточного продукта на основе CAR-T с двойной специфичностью к BCMA/CD19, BCMA-CAR-T или CD19-CAR-T в соответствующих дозах CAR-T. У мышей отбирали кровь, и уровень цитокинов в плазме крови измеряли посредством MSD-анализа.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Определения

Если не указано иное, то все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понятно специалисту средней квалификации в области техники, к которой относится настоящее изобретение.

Форма единственного числа относится к одному или нескольким (т. e. по меньшей мере одному) грамматическим объектам настоящей заявки. В качестве примера, "элемент" означает один элемент или несколько элементов.

Подразумевается, что термин "приблизительно" в отношении измеряемой величины, такой как количество, временной промежуток и т. п., охватывает отклонения на ± 20%, или в некоторых случаях на ± 10%, или в некоторых случаях на ± 5%, или в некоторых случаях на ± 1%, или в некоторых случаях на ± 0,1% от указанного значения, поскольку такие отклонения являются допустимыми для осуществления раскрытых способов.

Композиции и способы по настоящему изобретению охватывают полипептиды и нуклеиновые кислоты, имеющие указанные последовательности или последовательности, по существу идентичные им или сходные с ними, например, последовательности, идентичные указанной последовательности на по меньшей мере 85%, 90% или 95% или больше. Применительно к аминокислотной последовательности термин "по существу идентичная" используется в данном документе для обозначения первой аминокислотной последовательности, которая содержит достаточное или минимальное количество аминокислотных остатков, которые i) идентичны аминокислотным остаткам во второй аминокислотной последовательности после их выравнивания или ii) являются их консервативными заменами, так что первая и вторая аминокислотные последовательности могут иметь общий структурный домен и/или характеризоваться общей функциональной активностью, например, аминокислотные последовательности, которые содержат общий структурный домен, характеризуются по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью с эталонной последовательностью, например, последовательностью, представленной в данном документе.

Применительно к нуклеотидной последовательности термин "по существу идентичная" используется в данном документе для обозначения первой последовательности нуклеиновой кислоты, которая содержит достаточное или минимальное количество нуклеотидов, которые идентичны нуклеотидам во второй последовательности нуклеиновой кислоты после их выравнивания, так что первая и вторая нуклеотидные последовательности кодируют полипептиды, характеризующиеся общей функциональной активностью, или кодируют общий структурный домен полипептидов или отвечают за общую функциональную активность полипептидов, например, нуклеотидные последовательности характеризуются по меньшей мере приблизительно 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью с эталонной последовательностью, например, последовательностью, представленной в данном документе.

Термин "вариант" относится к полипептиду, который имеет аминокислотную последовательность, по существу идентичную эталонной аминокислотной последовательности, или кодируется по существу идентичной нуклеотидной последовательностью. В некоторых вариантах осуществления вариант представляет собой функциональный вариант.

Термин "функциональный вариант" относится к полипептиду, который имеет аминокислотную последовательность, по существу идентичную эталонной аминокислотной последовательности, или кодируется по существу идентичной нуклеотидной последовательностью и способен характеризоваться одним или несколькими видами активности эталонной аминокислотной последовательности.

Термин "цитокин" (например, IL-2, IL-7, IL-15, IL-21 или IL-6) включает полноразмерный встречающийся в природе цитокин, его фрагмент или вариант, например, функциональный вариант (в том числе его фрагменты и функциональные варианты, характеризующиеся по меньшей мере 10%, 30%, 50% или 80% активности, например, иммуномодулирующей активности, встречающегося в природе цитокина). В некоторых вариантах осуществления цитокин имеет аминокислотную последовательность, которая по существу идентична (например, идентична на по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) встречающемуся в природе цитокину или кодируется нуклеотидной последовательностью, которая по существу идентична (например, идентична на по меньшей мере приблизительно 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) встречающейся в природе нуклеотидной последовательности, кодирующей цитокин. В некоторых вариантах осуществления, как понятно из контекста, цитокин дополнительно содержит рецепторный домен, например, домен, представляющий собой рецептор цитокина (например, IL-15/IL-15R).

Используемый в данном документе термин "ВСМА" относится к антигену созревания В-клеток. BCMA (также известный как TNFRSF17, BCM или CD269) является представителем семейства рецепторов фактора некроза опухоли (TNFR) и преимущественно экспрессируется на терминально дифференцированных B-клетках, например, B-клетках памяти и плазматических клетках. Его лиганд называют B-клеточным активатором семейства TNF (BAFF) и лигандом, индуцирующим пролиферацию (APRIL). BCMA вовлечен в опосредование выживания плазматических клеток для поддержания долгосрочного гуморального иммунитета. Ген BCMA кодируется в хромосоме 16, продуцируя первичный мРНК-транскрипт длиной 994 нуклеотида (№ доступа в NCBI NM_001192.2), который кодирует белок из 184 аминокислот (NP_001183.2). Был описан второй антисмысловой транскрипт, происходящий из локуса BCMA, который может играть роль в регуляции экспрессии BCMA. (Laabi Y. et al., Nucleic Acids Res., 1994, 22:1147-1154). Были описаны дополнительные варианты транскрипта с неизвестным значением (Smirnova AS et al. Mol Immunol., 2008, 45(4):1179-1183). Была идентифицирована вторая изоформа, также известная как TV4 (идентификатор UniProt Q02223-2). Как используется в данном документе, "BCMA" включает белки, содержащие мутации, например, точечные мутации, фрагменты, вставки, делеции и сплайс-варианты полноразмерного BCMA дикого типа.

Фраза "заболевание, ассоциированное с экспрессией BCMA" включает без ограничения заболевание, ассоциированное с клеткой, которая экспрессирует BCMA (например, BCMA дикого типа или мутантный BCMA), или состояние, ассоциированное с клеткой, которая экспрессирует BCMA (например, BCMA дикого типа или мутантный BCMA), в том числе, например, пролиферативные заболевания, такие как рак или злокачественное новообразование, или предраковое состояние, такое как миелодисплазия, миелодиспластический синдром или предлейкоз; или показание, не связанное с раком, ассоциированное с клеткой, которая экспрессирует BCMA (например, BCMA дикого типа или мутантный BCMA). Во избежание неоднозначности, заболевание, ассоциированное с экспрессией ВСМА, может включать состояние, ассоциированное с клеткой, которая в настоящее время не экспрессирует ВСМА, например, из-за того, что экспрессия ВСМА была подавлена, например, вследствие лечения молекулой, нацеливающейся на ВСМА, например, ингибитором ВСМА, описанным в данном документе, но которая в свое время экспрессировала ВСМА. В одном аспекте рак, ассоциированный с экспрессией ВСМА (например, ВСМА дикого типа или мутантного ВСМА), представляет собой гематологический рак. В одном аспекте гематологический рак представляет собой лейкоз или лимфому. В одном аспекте рак, ассоциированный с экспрессией ВСМА (например, ВСМА дикого типа или мутантного ВСМА), представляет собой злокачественное новообразование из дифференцированных плазматических В-клеток. В одном аспекте рак, ассоциированный с экспрессией BCMA (например, BCMA дикого типа или мутантного BCMA), включает формы рака и злокачественные новообразования, в том числе без ограничения, например, одну или несколько форм острого лейкоза, в том числе без ограничения, например, B-клеточный острый лимфоидный лейкоз ("BALL"), Т-клеточный острый лимфоидный лейкоз ("TALL"), острый лимфоидный лейкоз (ALL); одну или несколько форм хронического лейкоза, в том числе без ограничения, например, хронический миелогенный лейкоз (CML), хронический лимфоидный лейкоз (CLL). Дополнительные формы рака или гематологические состояния, ассоциированные с экспрессией BMCA (например, BCMA дикого типа или мутантного BCMA), включают без ограничения, например, В-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, новообразование из бластных плазмоцитоидных дендритных клеток, лимфому Беркитта, диффузную крупноклеточную B-клеточную лимфому, фолликулярную лимфому, волосатоклеточный лейкоз, мелкоклеточную или крупноклеточную фолликулярную лимфому, злокачественные лимфопролиферативные состояния, MALT-лимфому, мантийноклеточную лимфому, лимфому из клеток маргинальной зоны, множественную миелому, миелодисплазию и миелодиспластический синдром, неходжкинскую лимфому, плазмобластную лимфому, новообразование из плазмоцитоидных дендритных клеток, макроглобулинемию Вальденстрема и "предлейкоз", который представляет собой разнообразную группу гематологических состояний, объединенных неэффективным образованием (или дисплазией) миелоидных клеток крови, и т. п. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой множественную миелому, лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому или глиобластому. В ряде вариантов осуществления заболевание, ассоциированное с экспрессией ВСМА, включает нарушение пролиферации плазматических клеток, например, бессимптомную миелому ("тлеющую" множественную миелому или вялотекущую миелому), моноклональную гаммапатию неустановленной этиологии (MGUS), макроглобулинемию Вальденстрема, формы плазмоцитомы (например, дискразию плазматических клеток, солитарную миелому, солитарную плазмоцитому, экстрамедуллярную плазмоцитому и множественную плазмоцитому), системный амилоидоз в форме амилоидоза легких цепей и POEMS-синдром (также известный как синдром Кроу-Фукаса, болезнь Такатсуки и PEP-синдром). Дополнительные заболевания, ассоциированные с экспрессией BCMA (например, BCMA дикого типа или мутантного BCMA), включают без ограничения, например, атипичные и/или неклассические формы рака, злокачественные новообразования, предраковые состояния или пролиферативные заболевания, ассоциированные с экспрессией BCMA (например, BCMA дикого типа или мутантного BCMA), например, рак, описанный в данном документе, например, рак предстательной железы (например, кастрационнорезистентный или резистентный к терапии рак предстательной железы или метастатический рак предстательной железы), рак поджелудочной железы или рак легкого.

Состояния, не связанные с раком, которые ассоциированы с ВСМА (например, ВСМА дикого типа или мутантным ВСМА), включают вирусные инфекции; например, вызванные HIV, грибковые инфекции, например, вызванные C. neoformans; аутоиммунное заболевание; например, ревматоидный артрит, системную красную волчанку (SLE или волчанку), пузырчатку обыкновенную и синдром Шегрена; воспалительное заболевание кишечника, неспецифический язвенный колит; аллоспецифический иммунный ответ, связанный с трансплантацией, нарушения, связанные с иммунитетом слизистых оболочек; и нежелательные иммунные ответы на биопрепараты (например, фактор VIII), при которых важен гуморальный иммунитет. В ряде вариантов осуществления показание, не связанное с раком, ассоциированное с экспрессией BCMA, включает без ограничения, например, аутоиммунное заболевание (например, волчанку), воспалительные нарушения (аллергию и астму) и трансплантацию. В некоторых вариантах осуществления клетка, экспрессирующая опухолевый антиген, экспрессирует или в какое-либо время экспрессировала мРНК, кодирующую опухолевый антиген. В одном варианте осуществления клетка, экспрессирующая опухолевый антиген, продуцирует опухолевый антигенный белок (например, дикого типа или мутантный), и при этом опухолевый антигенный белок может присутствовать на нормальных уровнях или сниженных уровнях. В одном варианте осуществления клетка, экспрессирующая опухолевый антиген, в один момент времени продуцировала опухолевый антигенный белок на выявляемых уровнях, а затем по существу не продуцировала опухолевый антигенный белок на выявляемых уровнях.

Термин "химерный антигенный рецептор" или в качестве альтернативы "CAR" или "молекула CAR" относится к рекомбинантной полипептидной конструкции, содержащей по меньшей мере внеклеточный антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и цитоплазматический сигнальный домен (также называемый в данном документе "внутриклеточным сигнальным доменом"), содержащий функциональный сигнальный домен, полученный из стимулирующей молекулы, определенной ниже. В некоторых вариантах осуществления домены в полипептидной конструкции CAR находятся в одной и той же полипептидной цепи, например, образуют химерный слитый белок. В некоторых вариантах осуществления домены в полипептидной конструкции CAR не являются смежными друг с другом, например, находятся в разных полипептидных цепях, например, как представлено в RCAR, описанном в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления цитоплазматический сигнальный домен содержит первичный сигнальный домен (например, первичный сигнальный домен CD3-дзета). В некоторых вариантах осуществления цитоплазматический сигнальный домен дополнительно содержит один или несколько функциональных сигнальных доменов, полученных из по меньшей мере одной костимулирующей молекулы, определенной ниже. В некоторых вариантах осуществления костимулирующая молекула выбрана из 4-1BB (т. е. CD137), CD27, ICOS и/или CD28. В некоторых вариантах осуществления CAR содержит химерный слитый белок, содержащий внеклеточный антигенраспознающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, содержащий функциональный сигнальный домен, полученный из стимулирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления CAR содержит химерный слитый белок, содержащий внеклеточный антигенраспознающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, содержащий функциональный сигнальный домен, полученный из костимулирующей молекулы, и функциональный сигнальный домен, полученный из стимулирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления CAR содержит химерный слитый белок, содержащий внеклеточный антигенраспознающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, содержащий два функциональных сигнальных домена, полученных из одной или нескольких костимулирующих молекул, и функциональный сигнальный домен, полученный из стимулирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления CAR содержит химерный слитый белок, содержащий внеклеточный антигенраспознающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен, содержащий по меньшей мере два функциональных сигнальных домена, полученных из одной или нескольких костимулирующих молекул, и функциональный сигнальный домен, полученный из стимулирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления CAR содержит необязательную лидерную последовательность на амино-конце (N-конце) слитого белка CAR. В некоторых вариантах осуществления CAR дополнительно содержит лидерную последовательность на N-конце внеклеточного антигенраспознающего домена, где лидерная последовательность необязательно отщепляется от антигенраспознающего домена (например, scFv) в ходе клеточного процессинга и локализации CAR в клеточной мембране.

CAR, содержащий антигенсвязывающий домен (например, scFv, однодоменное антитело или TCR (например, связывающий домен альфа-цепи TCR или связывающий домен бета-цепи TCR)), который нацеливается на конкретный опухолевый маркер X, где X может быть опухолевым маркером, описанным в данном документе, также называется XCAR. Например, CAR, который содержит антигенсвязывающий домен, нацеливающийся на BCMA, называется CAR для BCMA. CAR может экспрессироваться в любой клетке, например, иммунной эффекторной клетке, описанной в данном документе (например, T-клетке или NK-клетке).

Термин "сигнальный домен" относится к функциональной части белка, которая действует путем передачи информации внутри клетки для регуляции клеточной активности посредством определенных сигнальных путей, образуя вторичные мессенджеры или функционируя в качестве эффекторов путем ответа на такие мессенджеры.

Используемый в данном документе термин "антитело" относится к последовательности белка или полипептида, полученной из молекулы иммуноглобулина, который специфично связывается с антигеном. Антитела могут являться поликлональными или моноклональными, многоцепочечными или одноцепочечными или интактными иммуноглобулинами и могут быть получены из природных источников или из рекомбинантных источников. Антитела могут являться тетрамерными молекулами иммуноглобулинов.

Термин "фрагмент антитела" относится к по меньшей мере одной части интактного антитела или его рекомбинантных вариантов и относится к антигенсвязывающему домену, например, антигенраспознающей вариабельной области интактного антитела, достаточной для обеспечения распознавания и специфичного связывания фрагмента антитела с мишенью, такой как антиген. Примеры фрагментов антител включают без ограничения Fab-, Fab'-, F(ab')2- и Fv-фрагменты, scFv-фрагменты антител, линейные антитела, однодоменные антитела, такие как sdAb (VL либо VH), VHH-домены верблюдовых и полиспецифические молекулы, образованные из фрагментов антител, такие как бивалентный фрагмент, содержащий два или более, например, два, Fab-фрагмента, соединенных дисульфидным мостиком в шарнирной области, или две или более, например, две, связанные выделенные CDR или другие эпитопсвязывающие фрагменты антитела. Фрагмент антитела также может быть включен в состав однодоменных антител, максиантител, миниантител, нанотел, интрател, диател, триател, тетрател, v-NAR и бис-scFv (см., например, Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005). Фрагменты антитела также могут быть пересажены на каркасные структуры на основе полипептидов, таких как фибронектин III типа (Fn3) (см. патент США № 6703199, в котором описаны миниантитела на основе полипептида фибронектина).

Термин "scFv" относится к слитому белку, содержащему по меньшей мере один фрагмент антитела, содержащий вариабельную область легкой цепи, и по меньшей мере один фрагмент антитела, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, где вариабельные области легкой и тяжелой цепи присоединены друг к другу в смежном положении посредством короткого гибкого полипептидного линкера и способны экспрессироваться в виде одноцепочечного полипептида, и где scFv сохраняет специфичность интактного антитела, из которого он получен. Если не указано иное, то scFv, как используется в данном документе, может иметь вариабельные VL- и VH-области, расположенные в любом порядке, например, относительно N-конца и С-конца полипептида scFv может содержать VL-линкер-VH или может содержать VH-линкер-VL. В некоторых вариантах осуществления scFv может содержать структуру NH₂-V_L-линкер-V_H-COOH или NH₂-V_H-линкер-V_L-COOH.

Термины "область, определяющая комплементарность" или "CDR", используемые в данном документе, относятся к последовательностям из аминокислот в вариабельных областях антитела, которые придают антигенную специфичность и аффинность связывания. Например, как правило, в каждой вариабельной области тяжелой цепи находятся три CDR (HCDR1, HCDR2 и HCDR3), и в каждой вариабельной области легкой цепи находятся три CDR (LCDR1, LCDR2 и LCDR3). Точные границы аминокислотной последовательности указанной CDR могут быть определены с использованием любой из ряда хорошо известных схем, в том числе описанных в Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (схема нумерации "по Kabat"), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 (схема нумерации "по Chothia") или их комбинации. Согласно комбинированной схеме нумерации по Kabat и Chothia в некоторых вариантах осуществления CDR соответствуют аминокислотным остаткам, которые являются частью CDR по Kabat, CDR по Chothia или как тех, так и других.

Часть композиции на основе CAR по настоящему изобретению, предусматривающая соответствующее антитело или фрагмент антитела, может существовать в различных формах, например, в которых антигенсвязывающий домен экспрессируется в виде части полипептидной цепи, в том числе, например, в виде фрагмента однодоменного антитела (sdAb), одноцепочечного антитела (scFv) или, например, человеческого или гуманизированного антитела (Harlow et al., 1999, в: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, в: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426). В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен в композиции на основе CAR по настоящему изобретению содержит фрагмент антитела. В некоторых вариантах осуществления CAR содержит фрагмент антитела, который содержит scFv.

Используемый в данном документе термин "связывающий домен" или "молекула антитела" (также называемые в данном документе связывающим доменом для мишени) относится к белку, например, к цепи иммуноглобулина или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере одну последовательность вариабельного домена иммуноглобулина. Термин "связывающий домен" или "молекула антитела" охватывает антитела и фрагменты антител. В некоторых вариантах осуществления молекула антитела представляет собой молекулу полиспецифического антитела, например, она содержит множество последовательностей вариабельных доменов иммуноглобулина, причем первая последовательность вариабельного домена иммуноглобулина из множества характеризуется специфичностью связывания с первым эпитопом, а вторая последовательность вариабельного домена иммуноглобулина из множества характеризуется специфичностью связывания со вторым эпитопом. В некоторых вариантах осуществления молекула полиспецифического антитела представляет собой молекулу биспецифического антитела. Биспецифическое антитело характеризуется специфичностью в отношении не более чем двух антигенов. Молекула биспецифического антитела характеризуется наличием первой последовательности вариабельного домена иммуноглобулина, которая характеризуется специфичностью связывания с первым эпитопом, и второй последовательности вариабельного домена иммуноглобулина, которая характеризуется специфичностью связывания со вторым эпитопом.

Термины "биспецифическое антитело" и "биспецифические антитела" относятся к молекулам, в которых объединены антигенсвязывающие участки двух антител в пределах одной молекулы. Таким образом, биспецифическое антитело способно связывать два разных антигена одновременно или последовательно. Способы получения биспецифических антител хорошо известны из уровня техники. Различные форматы объединения двух антител также известны из уровня техники. Формы биспецифических антител по настоящему изобретению включают без ограничения диатело, одноцепочечное диатело, продукт димеризации Fab (Fab-Fab), Fab-scFv и тандемное антитело, как известно специалистам в данной области.

Термин "тяжелая цепь антитела" относится к большей из полипептидных цепей двух типов, присутствующих в молекулах антител в их встречающихся в природе конформациях, которая обычно определяет класс, к которому принадлежит антитело.

Термин "легкая цепь антитела" относится к меньшей из полипептидных цепей двух типов, присутствующих в молекулах антител в их встречающихся в природе конформациях. Легкие каппа- (κ-) и лямбда- (λ-) цепи относятся к двум основным изотипам легких цепей антител.

Термин "рекомбинантное антитело" относится к антителу, образованному с помощью технологии рекомбинантных ДНК, такому как, например, антитело, экспрессируемое в бактериофаговой или дрожжевой системе экспрессии. Термин также следует истолковывать как означающий антитело, которое было образовано в результате синтеза молекулы ДНК, кодирующей антитело, при этом данная молекула ДНК экспрессирует белковое антитело или аминокислотную последовательность, определяющую антитело, где последовательность ДНК или аминокислотная последовательность были получены с помощью технологии рекомбинантных ДНК или аминокислотных последовательностей, доступной и хорошо известной из уровня техники.

Термин "антиген" или "Ag" относится к молекуле, которая вызывает иммунный ответ. Такой иммунный ответ может предусматривать продуцирование антител либо активацию специфических иммунокомпетентных клеток или как то, так и другое. Специалисту в данной области будет понятно, что любая макромолекула, в том числе практически все белки или пептиды, может служить в качестве антигена. Кроме того, антигены могут быть получены из рекомбинантной или геномной ДНК. Специалисту в данной области будет понятно, что любая ДНК, которая содержит нуклеотидную последовательность или частичную нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, который вызывает иммунный ответ, тем самым кодирует "антиген", как этот термин используется в данном документе. Кроме того, специалисту в данной области будет понятно, что антиген не должен кодироваться исключительно полноразмерной нуклеотидной последовательностью гена. Очевидно, что настоящее изобретение включает без ограничения применение частичных нуклеотидных последовательностей более одного гена, и что эти нуклеотидные последовательности составлены в различных комбинациях для того, чтобы кодировать полипептиды, которые вызывают требуемый иммунный ответ. Более того, специалисту в данной области будет понятно, что антиген вообще не обязательно должен кодироваться "геном". Очевидно, что антиген может быть образован в результате синтеза, или может быть получен из биологического образца, или может представлять собой макромолекулу, отличную от полипептида. Такой биологический образец может включать без ограничения образец ткани, образец опухоли, клетку или жидкость с другими биологическими компонентами.

Термины "противоопухолевый эффект" и "противораковый эффект" используются взаимозаменяемо и относятся к биологическому эффекту, который может проявляться различным образом, в том числе без ограничения, например, в виде уменьшения объема опухоли или объема ракового образования, уменьшения количества опухолевых клеток или раковых клеток, уменьшения количества метастазов, увеличения ожидаемой продолжительности жизни, уменьшения уровня пролиферации опухолевых клеток или пролиферации раковых клеток, уменьшения выживаемости опухолевых клеток или выживаемости раковых клеток или ослабления различных физиологических симптомов, ассоциированных с раковым состоянием. "Противоопухолевый эффект" или "противораковый эффект" также может проявляться в виде способности пептидов, полинуклеотидов, клеток и антител по настоящему изобретению в первую очередь предупреждать появление опухоли или рака.

Термин "аутологичный" относится к любому материалу, полученному от того же индивидуума, которому он позднее должен быть повторно введен.

Термин "аллогенный" относится к любому материалу, полученному от другого животного того же вида, что и индивидуум, которому данный материал вводят. Говорят, что два или более индивидуума являются аллогенными по отношению друг к другу, если их гены в одном или нескольких локусах не являются идентичными. В некоторых вариантах осуществления аллогенный материал от индивидуумов одного и того же вида может характеризоваться степенью генетической разнородности, достаточной для их антигенного взаимодействия.

Термин "ксеногенный" относится к трансплантату, полученному от животного другого вида.

Термин "аферез", используемый в данном документе, относится к признанному в данной области экстракорпоральному способу, при котором кровь донора или пациента отбирают у донора или пациента и пропускают через аппарат, который отделяет выбранные определенные составляющие компоненты, а остальную часть возвращает в кровоток донору или пациенту, например, посредством ретрансфузии. Таким образом, применительно к "образцу, полученному путем афереза" подразумевают образец, полученный с использованием афереза.

Термин "рак" относится к заболеванию, которое характеризуется быстрым и неконтролируемым ростом аберрантных клеток. Раковые клетки могут распространяться локально или через кровоток и лимфатическую систему в другие части организма. Примеры различных форм рака описаны в данном документе и включают без ограничения рак молочной железы, рак предстательной железы, рак яичника, рак шейки матки, рак кожи, рак поджелудочной железы, колоректальный рак, рак почки, рак печени, рак головного мозга, лимфому, лейкоз, рак легкого и т. п. В некоторых вариантах осуществления формы рака, лечение которых осуществляют посредством способов, описанных в данном документе, включают множественную миелому, лимфому Ходжкина или неходжкинскую лимфому.

Термины "опухоль" и "рак" используются в данном документе взаимозаменяемо, например, оба термина охватывают солидные опухоли и опухоли жидких тканей, например, диффузные или циркулирующие. Используемый в данном документе термин "рак" или "опухоль" включает предзлокачественные, а также злокачественные формы рака и опухоли.

Используемый в данном документе термин "полученный из" указывает на взаимосвязь между первой и второй молекулами. Это обычно относится к структурному сходству между первой молекулой и второй молекулой и не имеет дополнительного значения или не включает ограничение способа или источника в отношении первой молекулы, которая получена из второй молекулы. Например, в случае с внутриклеточным сигнальным доменом, который получен из молекулы CD3-дзета, внутриклеточный сигнальный домен сохраняет структуру CD3-дзета в достаточной мере для того, чтобы обладать необходимой функцией, а именно способностью образовывать сигнал в подходящих условиях. Это не имеет дополнительного значения или не включает ограничение в отношении конкретного способа получения внутриклеточного сигнального домена, например, это не означает, что для обеспечения наличия внутриклеточного сигнального домена нужно начинать с последовательности CD3-дзета и удалять нежелательную последовательность или вводить мутации для получения внутриклеточного сигнального домена.

Термин "консервативные модификации последовательности" относится к аминокислотным модификациям, которые не оказывают значительного влияния на характеристики связывания антитела или фрагмента антитела, содержащего аминокислотную последовательность, или не изменяют их в значительной степени. Такие консервативные модификации включают аминокислотные замены, добавления и делеции. Модификации могут быть введены в антитело или фрагмент антитела по настоящему изобретению с помощью стандартных методик, известных из уровня техники, таких как сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез. Консервативные замены представляют собой замены, при которых аминокислотный остаток заменяется аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, были определены в уровне техники. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, один или несколько аминокислотных остатков в CAR по настоящему изобретению могут быть заменены другими аминокислотными остатками из того же семейства боковых цепей, и измененный CAR можно протестировать с использованием функциональных анализов, описанных в данном документе.

Термин "стимуляция" применительно к стимуляции стимулирующей и/или костимулирующей молекулой относится к ответу, например, первичному или вторичному ответу, индуцированному путем связывания стимулирующей молекулы (например, комплекса TCR/CD3) и/или костимулирующей молекулы (например, CD28 или 4-1BB) с ее когнатным лигандом, которое опосредует событие передачи сигнала, такое как без ограничения передача сигнала через комплекс TCR/CD3. Стимуляция может опосредовать изменение экспрессии определенных молекул и/или реорганизацию структур цитоскелета и т. п.

Термин "стимулирующая молекула" относится к молекуле, экспрессируемой Т-клеткой, которая обеспечивает первичную(первичные) цитоплазматическую(цитоплазматические) сигнальную(сигнальные) последовательность(последовательности), регулирующую(регулирующие) первичную активацию комплекса TCR стимулирующим образом в по меньшей мере некоторых аспектах сигнального пути T-клетки. В некоторых вариантах осуществления ITAM-содержащий домен в CAR воспроизводит передачу сигнала от первичного TCR независимо от эндогенных комплексов TCR. В некоторых вариантах осуществления первичный сигнал инициируется, например, путем связывания комплекса TCR/CD3 с молекулой МНС, нагруженной пептидом, и это приводит к опосредованию ответа Т-клеток, в том числе без ограничения пролиферации, активации, дифференцировки и т. п. Первичная цитоплазматическая сигнальная последовательность (также называемая "первичным сигнальным доменом"), которая действует стимулирующим образом, может содержать сигнальный мотив, известный как иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив или ITAM. Примеры ITAM-содержащей первичной цитоплазматической сигнальной последовательности, которая является особенно применимой в настоящем изобретении, включают без ограничения последовательности, полученные из TCR-дзета, FcR-гамма, FcR-бета, CD3-гамма, CD3-дельта, CD3-эпсилон, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 (также известного как "ICOS"), FcεRI и CD66d, DAP10 и DAP12. В конкретном CAR по настоящему изобретению внутриклеточный сигнальный домен в любом одном или нескольких CAR по настоящему изобретению содержит внутриклеточную сигнальную последовательность, например, первичную сигнальную последовательность CD3-дзета. Термин "антигенпрезентирующая клетка" или "APC" относится к клетке иммунной системы, такой как вспомогательная клетка (например, B-клетка, дендритная клетка и т. п.), которая представляет чужеродный антиген в комплексе с молекулами главного комплекса гистосовместимости (MHC) на своей поверхности. Т-клетки могут распознавать эти комплексы с помощью своих T-клеточных рецепторов (TCR). АРС процессируют антигены и презентируют их Т-клеткам.

Используемый в данном документе термин "внутриклеточный сигнальный домен" относится к внутриклеточной части молекулы. В ряде вариантов осуществления внутриклеточный сигнальный домен передает сигнал эффекторной функции и направляет клетку на выполнение специализированной функции. Хотя может использоваться весь внутриклеточный сигнальный домен, во многих случаях отсутствует необходимость использовать всю цепь. В том случае, если используют усеченную часть внутриклеточного сигнального домена, такую усеченную часть можно использовать вместо интактной цепи, при условии, что она передает сигнал эффекторной функции. Таким образом, подразумевается, что термин "внутриклеточный сигнальный домен" включает любую усеченную часть внутриклеточного сигнального домена, достаточную для передачи сигнала эффекторной функции.

Внутриклеточный сигнальный домен образует сигнал, который способствует осуществлению иммунной эффекторной функции клеткой, содержащей CAR, например, CAR-T-клеткой. Примеры иммунной эффекторной функции, например, у CAR-T-клетки, включают цитолитическую активность и хелперную активность, в том числе секрецию цитокинов.

В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен может содержать первичный внутриклеточный сигнальный домен. Иллюстративные первичные внутриклеточные сигнальные домены включают домены, полученные из молекул, отвечающих за первичную стимуляцию или антигензависимую стимуляцию. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен может содержать костимулирующий внутриклеточный домен. Иллюстративные костимулирующие внутриклеточные сигнальные домены включают домены, полученные из молекул, отвечающих за костимулирующие сигналы или антигеннезависимую стимуляцию. Например, в случае с CAR-T первичный внутриклеточный сигнальный домен может содержать цитоплазматическую последовательность Т-клеточного рецептора, и костимулирующий внутриклеточный сигнальный домен может содержать цитоплазматическую последовательность корецептора или костимулирующей молекулы.

Первичный внутриклеточный сигнальный домен может содержать сигнальный мотив, который известен как иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив или ITAM. Примеры ITAM-содержащих первичных цитоплазматических сигнальных последовательностей включают без ограничения последовательности, полученные из CD3-дзета, FcR-гамма, FcR-бета, CD3-гамма, CD3-дельта, CD3-эпсилон, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 (также известного как "ICOS"), FcεRI, CD66d, DAP10 и DAP12.

Термин "дзета" или, в качестве альтернативы, "дзета-цепь", "CD3-дзета" или "TCR-дзета" относится к CD247. Под номером доступа Swiss-Prot P20963 представлены иллюстративные аминокислотные последовательности CD3-дзета человека. "Стимулирующий домен дзета" или, в качестве альтернативы, "стимулирующий домен CD3-дзета" или "стимулирующий домен TCR-дзета" относится к стимулирующему домену CD3-дзета или его варианту (например, молекуле, имеющей мутации, например, точечные мутации, фрагменты, вставки или делеции). В некоторых вариантах осуществления цитоплазматический домен дзета содержит остатки 52-164 из последовательности под номером доступа в GenBank BAG36664.1 или ее варианта (например, молекулы, имеющей мутации, например, точечные мутации, фрагменты, вставки или делеции). В некоторых вариантах осуществления "стимулирующий домен дзета" или "стимулирующий домен CD3-дзета" представляет собой последовательность, представленную под SEQ ID NO: 9 или 10, или ее вариант (например, молекулу, имеющую мутации, например, точечные мутации, фрагменты, вставки или делеции).

Термин "костимулирующая молекула" относится к когнатному партнеру по связыванию на Т-клетке, который специфично связывается с костимулирующим лигандом, за счет чего происходит опосредование костимулируемого ответа Т-клетки, такого как, без ограничения, пролиферация. Костимулирующие молекулы представляют собой молекулы клеточной поверхности, отличные от антигенных рецепторов или их лигандов, которые необходимы для эффективного иммунного ответа. Костимулирующие молекулы включают без ограничения молекулу MHC I класса, белковые рецепторы TNF, иммуноглобулиноподобные белки, рецепторы цитокинов, интегрины, сигнальные молекулы активации лимфоцитов (белки SLAM), активирующие рецепторы NK-клеток, BTLA, лиганд Toll-подобного рецептора, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8-альфа, CD8-бета, IL2R-бета, IL2R-гамма, IL7R-альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD28-OX40, CD28-4-1BB и лиганд, который специфично связывается с CD83.

Костимулирующий внутриклеточный сигнальный домен относится к внутриклеточной части костимулирующей молекулы.

Внутриклеточный сигнальный домен может содержать всю внутриклеточную часть или весь нативный внутриклеточный сигнальный домен молекулы, из которой он получен, или их функциональный фрагмент.

Термин "4-1BB" относится к CD137 или представителю 9 суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли. Под номером доступа Swiss-Prot P20963 представлены иллюстративные аминокислотные последовательности 4-1BB человека. "Кoстимулирующий домен 4-1BB" относится к костимулирующему домену 4-1BB или его варианту (например, молекуле, имеющей мутации, например, точечные мутации, фрагменты, вставки или делеции). В некоторых вариантах осуществления "костимулирующий домен 4-1BB" представляет собой последовательность, представленную под SEQ ID NO: 7, или ее вариант (например, молекулу, имеющую мутации, например, точечные мутации, фрагменты, вставки или делеции).

Используемый в данном документе термин "иммунная эффекторная клетка" относится к клетке, которая вовлечена в иммунный ответ, например, способствуя осуществлению иммунного эффекторного ответа. Примеры иммунных эффекторных клеток включают Т-клетки, например, альфа/бета-Т-клетки и гамма/дельта-Т-клетки, В-клетки, естественные клетки-киллеры (NK), естественные T-клетки-киллеры (NKT), тучные клетки и фагоциты миелоидного происхождения.

Используемый в данном документе термин "иммунная эффекторная функция или иммунный эффекторный ответ" относится к функции или ответу, например, иммунной эффекторной клетки, которые усиливают иммунную атаку на клетку-мишень или способствуют ей. Например, иммунная эффекторная функция или ответ относятся к свойству T- или NK-клетки, которое способствует уничтожению или ингибированию роста или пролиферации клетки-мишени. В случае с Т-клеткой первичная стимуляция и костимуляция являются примерами иммунных эффекторных функции или ответа.

Термин "эффекторная функция" относится к специализированной функции клетки. Например, эффекторная функция Т-клетки может представлять собой цитолитическую активность или хелперную активность, в том числе секрецию цитокинов.

Термин "кодирование" относится к внутренне присущему свойству специфических последовательностей нуклеотидов в полинуклеотиде, таком как ген, кДНК или мРНК, служить в качестве матриц для синтеза в ходе биологических процессов других полимеров и макромолекул, имеющих определенную последовательность нуклеотидов (т. е. рРНК, тРНК и мРНК) либо определенную последовательность аминокислот и биологические свойства, обусловленные ими. Таким образом, ген, кДНК или РНК кодирует белок, если в результате транскрипции и трансляции мРНК, соответствующей этому гену, в клетке или другой биологической системе продуцируется белок. Как кодирующая нить, нуклеотидная последовательность которой идентична последовательности мРНК и обычно представлена в перечнях последовательностей, так и некодирующая нить, используемая в качестве матрицы для транскрипции гена или кДНК, могут обозначаться как кодирующие белок или другой продукт данного гена или кДНК.

Если не указано иное, то "нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность" включает все нуклеотидные последовательности, которые являются вырожденными вариантами друг друга и которые кодируют одну и ту же аминокислотную последовательность. Фраза "нуклеотидная последовательность, которая кодирует белок или РНК" может также включать интроны в той степени, в которой нуклеотидная последовательность, кодирующая белок, может в каком-либо варианте содержать интрон(интроны).

Термины "эффективное количество" или "терапевтически эффективное количество" используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к количеству соединения, состава, материала или композиции, описанных в данном документе, эффективному для достижения конкретного биологического результата.

Термин "эндогенный" относится к любому материалу, полученному из организма, клетки, ткани или системы или продуцируемому внутри них.

Термин "экзогенный" относится к любому материалу, введенному в организм, клетку, ткань или систему или продуцируемому вне их.

Термин "экспрессия" относится к транскрипции и/или трансляции конкретной нуклеотидной последовательности. В некоторых вариантах осуществления экспрессия включает трансляцию мРНК, введенной в клетку.

Термин "вектор для переноса" относится к композиции, которая содержит выделенную нуклеиновую кислоту и которую можно применять для доставки выделенной нуклеиновой кислоты внутрь клетки. Из уровня техники известны многочисленные векторы, в том числе без ограничения линейные полинуклеотиды, полинуклеотиды, ассоциированные с ионными или амфифильными соединениями, плазмиды и вирусы. Таким образом, термин "вектор для переноса" включает автономно реплицирующуюся плазмиду или вирус. Данный термин также следует толковать таким образом, что он дополнительно включает неплазмидные и невирусные соединения, которые содействуют переносу нуклеиновой кислоты в клетки, такие как, например, полилизиновое соединение, липосома и т. п. Примеры вирусных векторов для переноса включают без ограничения аденовирусные векторы, векторы на основе аденоассоциированного вируса, ретровирусные векторы, лентивирусные векторы и т. п.

Термин "экспрессионный вектор" относится к вектору, который содержит рекомбинантный полинуклеотид, содержащий последовательности, контролирующие экспрессию, функционально связанные с нуклеотидной последовательностью, которая должна экспрессироваться. Экспрессионный вектор содержит достаточное количество цис-действующих элементов для экспрессии; а другие элементы для экспрессии могут предоставляться клеткой-хозяином или в системе экспрессии in vitro. Экспрессионные векторы включают все векторы, известные из уровня техники, в том числе космиды, плазмиды (например, "голые" или содержащиеся в липосомах) и вирусы (например, лентивирусы, ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), в состав которых включен рекомбинантный полинуклеотид.

Термин "лентивирус" относится к роду из семейства Retroviridae. Лентивирусы являются уникальными среди ретровирусов в том, что способны инфицировать неделящиеся клетки; они могут доставлять значительное количество генетической информации в ДНК клетки-хозяина, поэтому они в качестве векторов являются одним из наиболее эффективных способов доставки генов. Все из HIV, SIV и FIV являются примерами лентивирусов.

Термин "лентивирусный вектор" относится к вектору, полученному из по меньшей мере части генома лентивируса, в том числе, в частности, к самоинактивирующемуся лентивирусному вектору, представленному в Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009). Другие примеры лентивирусных векторов, которые можно использовать в клинической практике, включают без ограничения, например, технологию доставки генов LENTIVECTOR® от Oxford BioMedica, векторную систему LENTIMAX™ от Lentigen и т. п. Неклинические типы лентивирусных векторов также являются доступными и должны быть известны специалисту в данной области.

Термин "гомологичный" или "идентичность" относится к идентичности последовательностей субъединиц у двух полимерных молекул, например, двух молекул нуклеиновой кислоты, таких как две молекулы ДНК или две молекулы РНК, или двух молекул полипептидов. Если положение субъединицы в обеих из двух молекул занимает одна и та же мономерная субъединица, например, если положение в каждой из двух молекул ДНК занято аденином, то они являются гомологичными или идентичными по этому положению. Гомология между двумя последовательностями находится в прямой зависимости от количества совпадающих или гомологичных положений; например, если половина (например, пять положений в полимере длиной десять субъединиц) положений в двух последовательностях является гомологичной, то эти две последовательности являются гомологичными на 50%; если 90% положений (например, 9 из 10) являются совпадающими или гомологичными, то две последовательности являются гомологичными на 90%.

"Гуманизированные" формы антител, отличных от человеческих (например, мышиных), представляют собой химерные иммуноглобулины, цепи иммуноглобулинов или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab')2 или другие антигенсвязывающие подпоследовательности антител), которые содержат минимальную последовательность, полученную из иммуноглобулина, отличного от человеческого. В большинстве случаев гуманизированные антитела и фрагменты данных антител представляют собой иммуноглобулины человека (реципиентное антитело или фрагмент антитела), в которых остатки из определяющей комплементарность области (CDR) реципиента заменены остатками из CDR вида, отличного от человека (донорного антитела), такого как мышь, крыса или кролик, обладающими требуемой специфичностью, аффинностью и емкостью. В некоторых случаях остатки каркасной области (FR) Fv иммуноглобулина человека заменены соответствующими остатками, отличными от человеческих. Кроме того, гуманизированное антитело/фрагмент антитела может содержать остатки, не обнаруживаемые ни в реципиентном антителе, ни в импортированных последовательностях CDR или каркасных областей. С помощью этих модификаций можно дополнительно улучшить и оптимизировать функциональные характеристики антитела или фрагмента антитела. Как правило, гуманизированное антитело или фрагмент этого антитела будет содержать по существу все из по меньшей мере одного и, как правило, двух, вариабельных доменов, в которых все или по существу все CDR-области соответствуют областям иммуноглобулина, отличного от человеческого, и все FR-области или их значительная часть представляют собой области с последовательностью иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело или фрагмент антитела также может содержать по меньшей мере часть константной области (Fc) иммуноглобулина, как правило, иммуноглобулина человека. Дополнительные подробности см. в Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992.

"Полностью человеческий" относится к иммуноглобулину, такому как антитело или фрагмент антитела, где целая молекула имеет человеческое происхождение или состоит из аминокислотной последовательности, идентичной человеческой форме антитела или иммуноглобулина.

Термин "выделенный" означает измененный относительно природного состояния или извлеченный из него. Например, нуклеиновая кислота или пептид, в природных условиях присутствующие в живом животном, не являются "выделенными", однако те же нуклеиновая кислота или пептид, частично или полностью отделенные от материалов, сопутствующих им в их природном состоянии, являются "выделенными". Выделенные нуклеиновая кислота или белок могут находиться в по существу очищенной форме или могут находиться в ненативной среде, такой как, например, клетка-хозяин.

В контексте настоящего изобретения используются следующие сокращения для общераспространенных оснований нуклеиновых кислот. "А" относится к аденозину, "С" относится к цитозину, "G" относится к гуанозину, "Т" относится к тимидину, и "U" относится к уридину.

Термин "функционально связанный" или "транскрипционный контроль" относится к функциональной связи между регуляторной последовательностью и гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, приводящей к экспрессии последней. Например, первая последовательность нуклеиновой кислоты функционально связана со второй последовательностью нуклеиновой кислоты в тех случаях, когда первая последовательность нуклеиновой кислоты размещена в функциональной взаимосвязи со второй последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, если промотор влияет на транскрипцию или экспрессию кодирующей последовательности. Функционально связанные последовательности ДНК могут быть смежными друг с другом и, например, если необходимо соединить две области, кодирующие белок, находятся в одной и той же рамке считывания.

Термин "парентеральное" введение иммуногенной композиции включает, например, методики подкожной (s.c.), внутривенной (i.v.), внутримышечной (i.m.) или внутригрудинной инъекции, внутриопухолевого введения или инфузии.

Термин "нуклеиновая кислота", "молекула нуклеиновой кислоты", "полинуклеотид" или "молекула полинуклеотида" относится к дезоксирибонуклеиновым кислотам (ДНК) или рибонуклеиновым кислотам (РНК) и их полимерам в одно- или двухнитевой форме. Если специально не ограничено, то данный термин охватывает нуклеиновые кислоты, содержащие известные аналоги природных нуклеотидов, которые обладают свойствами связывания, сходными со свойствами эталонной нуклеиновой кислоты, и метаболизируются посредством механизма, сходного с механизмом для встречающихся в природе нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления "нуклеиновая кислота", "молекула нуклеиновой кислоты", "полинуклеотид" или "молекула полинуклеотида" предусматривает производное или аналог нуклеотида/нуклеозида. Если не указано иное, конкретная последовательность нуклеиновой кислоты также в неявной форме охватывает ее варианты с консервативными модификациями (например, с заменами вырожденными кодонами, например, консервативными заменами), аллели, ортологи, SNP и комплементарные последовательности, а также последовательность, указанную в явной форме. В частности, замены вырожденными кодонами, например, консервативные замены, можно осуществлять посредством образования последовательностей, в которых в третьем положении одного или нескольких выбранных (или всех) кодонов произведена замена любым из канонических оснований и/или остатками дезоксиинозина (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); и Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).

Термины "пептид", "полипептид" и "белок" используются взаимозаменяемо и относятся к соединению, состоящему из аминокислотных остатков, ковалентно связанных пептидными связями. Белок или пептид должен содержать по меньшей мере две аминокислоты, и не установлено ограничение на максимальное количество аминокислот, которые может содержать последовательность белка или пептида. Полипептиды включают любой пептид или белок, содержащий две или более аминокислоты, соединенные друг с другом пептидными связями. Используемый в данном документе термин относится как к коротким цепям, которые также обычно называются в уровне техники, например, пептидами, олигопептидами и олигомерами, так и к более длинным цепям, которые обычно называются в уровне техники белками, которых существует множество типов. "Полипептиды" включают, например, среди прочих, биологически активные фрагменты, по существу гомологичные полипептиды, олигопептиды, гомодимеры, гетеродимеры, варианты полипептидов, модифицированные полипептиды, производные, аналоги, слитые белки. Полипептид включает природный пептид, рекомбинантный пептид или их комбинацию.

Термин "промотор" относится к последовательности ДНК, распознаваемой синтетическим аппаратом клетки или введенным синтетическим аппаратом, которая необходима для инициации специфической транскрипции полинуклеотидной последовательности.

Термин "промоторная/регуляторная последовательность" относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая необходима для экспрессии продукта гена, функционально связанного с промоторной/регуляторной последовательностью. В некоторых случаях эта последовательность может являться коровой промоторной последовательностью, а в других случаях эта последовательность может также содержать энхансерную последовательность и другие регуляторные элементы, которые необходимы для экспрессии продукта гена. Например, промоторная/регуляторная последовательность может представлять собой последовательность, которая обеспечивает экспрессию продукта гена тканеспецифическим образом.

Термин "конститутивный промотор" относится к нуклеотидной последовательности, которая, находясь в функциональной связи с полинуклеотидом, который кодирует или определяет продукт гена, обуславливает продуцирование продукта гена в клетке при большинстве или всех физиологических условиях клетки.

Термин "индуцируемый промотор" относится к нуклеотидной последовательности, которая, находясь в функциональной связи с полинуклеотидом, который кодирует или определяет продукт гена, обуславливает продуцирование продукта гена в клетке по существу только в случае присутствия в клетке индуктора, который соответствует данному промотору.

Термин "тканеспецифический промотор" относится к нуклеотидной последовательности, которая, находясь в функциональной связи с полинуклеотидом, который кодирует или определяет ген, обуславливает продуцирование продукта гена в клетке по существу только в том случае, если клетка является клеткой из того типа ткани, который соответствует данному промотору.

Термины "антиген, ассоциированный с раком", "опухолевый антиген", "антиген, связанный с гиперпролиферативным нарушением" и "антиген, ассоциированный с гиперпролиферативным нарушением" взаимозаменяемо относятся к антигенам, которые являются общими для специфических гиперпролиферативных нарушений. В некоторых вариантах осуществления такие термины относятся к молекуле (как правило, белку, углеводу или липиду), которая экспрессируется на поверхности раковой клетки полностью либо в виде фрагмента (например, молекула MHC/пептид) и которая применима для предпочтительного нацеливания фармакологического средства на раковую клетку. В некоторых вариантах осуществления опухолевый антиген представляет собой маркер, экспрессируемый как нормальными клетками, так и раковыми клетками, например, маркер линии дифференцировки, например, CD19 на В-клетках. В некоторых вариантах осуществления опухолевый антиген представляет собой молекулу клеточной поверхности, которая в раковой клетке сверхэкспрессируется по сравнению с нормальной клеткой, например, характеризуется 1-кратной сверхэкспрессией, 2-кратной сверхэкспрессией, 3-кратной или большей сверхэкспрессией по сравнению с нормальной клеткой. В некоторых вариантах осуществления опухолевый антиген представляет собой молекулу клеточной поверхности, которая синтезируется в раковой клетке ненадлежащим образом, например, молекулу, которая содержит делеции, добавления или мутации по сравнению с молекулой, экспрессируемой на нормальной клетке. В некоторых вариантах осуществления опухолевый антиген будет экспрессироваться исключительно на клеточной поверхности раковой клетки, полностью или в виде фрагмента (например, молекула MHC/пептид), и не будет синтезироваться или экспрессироваться на поверхности нормальной клетки. В некоторых вариантах осуществления антигены, связанные с гиперпролиферативным нарушением, по настоящему изобретению получены из раковых образований, включающих без ограничения первичную или метастатическую меланому, тимому, лимфому, саркому, рак легкого, рак печени, неходжкинскую лимфому, лимфому Ходжкина, формы лейкоза, рак матки, рак шейки матки, рак мочевого пузыря, рак почки и формы аденокарциномы, такие как рак молочной железы, рак предстательной железы (например, кастрационнорезистентный или резистентный к терапии рак предстательной железы или метастатический рак предстательной железы), рак яичника, рак поджелудочной железы и т. п., или нарушение пролиферации плазматических клеток, например, бессимптомную миелому ("тлеющую" множественную миелому или вялотекущую миелому), моноклональную гаммапатию неустановленной этиологии (MGUS), макроглобулинемию Вальденстрема, формы плазмоцитомы (например, плазмоклеточную дискразию, солитарную миелому, солитарную плазмоцитому, экстрамедуллярную плазмоцитому и множественную плазмоцитому), системный амилоидоз в форме амилоидоза легких цепей и POEMS-синдром (также известный как синдром Кроу-Фукаса, болезнь Такатсуки и PEP-синдром). В некоторых вариантах осуществления CAR по настоящему изобретению включают CAR, содержащие антигенсвязывающий домен (например, антитело или фрагмент антитела), который связывается с пептидом, презентируемым молекулой MHC. Обычно пептиды, происходящие из эндогенных белков, заполняют карманы молекул главного комплекса гистосовместимости (MHC) I класса и распознаются T-клеточными рецепторами (TCR) на CD8+ T-лимфоцитах. Комплексы молекул MHC I класса конститутивно экспрессируются всеми ядросодержащими клетками. При раке комплексы вирусоспецифический и/или опухолеспецифический пептид/молекула MHC представляют собой уникальный класс мишеней клеточной поверхности для иммунотерапии. Были описаны TCR-подобные антитела, нацеливающиеся на пептиды, происходящие из вирусных или опухолевых антигенов, в окружении человеческого лейкоцитарного антигена (HLA)-A1 или HLA-A2 (см., например, Sastry et al., J Virol. 2011 85(5):1935-1942; Sergeeva et al., Blood, 2011 117(16):4262-4272; Verma et al., J Immunol 2010 184(4):2156-2165; Willemsen et al., Gene Ther 2001 8(21) :1601-1608; Dao et al., Sci Transl Med 2013 5(176) :176ra33 ; Tassev et al., Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100). Например, TCR-подобное антитело можно идентифицировать при скрининге библиотеки, такой как фаг-дисплейная библиотека scFv человека.

Термины "антиген, обеспечивающий поддержание опухоли" или "антиген, обеспечивающий поддержание рака" взаимозаменяемо относятся к молекуле (как правило, белку, углеводу или липиду), которая экспрессируется на поверхности клетки, которая сама по себе не является раковой, но обеспечивает поддержание раковых клеток, например, путем способствования их росту или выживанию, например, устойчивости к иммунным клеткам. Иллюстративные клетки данного типа включают стромальные клетки и супрессорные клетки миелоидного происхождения (MDSC). Антиген, обеспечивающий поддержание опухоли, сам по себе не обязательно играет роль в поддержании опухолевых клеток, при условии, что антиген присутствует в клетке, которая обеспечивает поддержание раковых клеток.

Термин "гибкий полипептидный линкер" или "линкер", используемый применительно к scFv, относится к пептидному линкеру, который состоит из аминокислот, таких как глициновые и/или сериновые остатки, используемые в отдельности или в комбинации, для связывания вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи друг с другом. В некоторых вариантах осуществления гибкий полипептидный линкер представляет собой линкер Gly/Ser и содержит аминокислотную последовательность (Gly-Gly-Gly-Ser)n, где n представляет собой положительное целое число, которое равняется или больше 1 (SEQ ID NO: 41). Например, n=1, n=2, n=3, n=4, n=5 и n=6, n=7, n=8, n=9 и n=10. В некоторых вариантах осуществления гибкие полипептидные линкеры включают без ограничения (Gly4Ser)4 (SEQ ID NO: 27) или (Gly4 Ser)3 (SEQ ID NO: 28). В некоторых вариантах осуществления линкеры содержат множественные повторы (Gly2Ser) (GlySer) или (Gly3Ser) (SEQ ID NO: 29). Также в объем настоящего изобретения включены линкеры, описанные в WO2012/138475, включенной в данный документ посредством ссылки.

Как используется в данном документе, 5'-кэп (также называемый РНК-кэпом, 7-метилгуанозиновым РНК-кэпом или РНК-кэпом m7G) представляет собой модифицированный гуаниновый нуклеотид, который добавляется к "переднему", или 5'-концу, эукариотической матричной РНК вскоре после начала транскрипции. 5'-кэп состоит из концевой группы, которая связана с первым транскрибированным нуклеотидом. Его присутствие является критически важным для распознавания рибосомой и защиты от РНКаз. Добавление кэпа сопряжено с транскрипцией и происходит совместно с транскрипцией, так что каждое из этих событий влияет на другое. Вскоре после начала транскрипции 5'-конец синтезируемой мРНК связывается с кэп-синтезирующим комплексом, ассоциированным с РНК-полимеразой. Этот ферментативный комплекс катализирует химические реакции, которые необходимы для кэпирования мРНК. Синтез протекает в виде многоступенчатой биохимической реакции. Кэпирующий фрагмент можно модифицировать для модулирования функциональных свойств мРНК, таких как ее стабильность или эффективность трансляции.

Как используется в данном документе, "РНК, транскрибированная in vitro" относится к РНК, предпочтительно мРНК, которая была синтезирована in vitro. В некоторых вариантах осуществления РНК представляет собой мРНК. Обычно РНК, транскрибированная in vitro, образуется из вектора транскрипции in vitro. Вектор транскрипции in vitro содержит матрицу, используемую для образования РНК, транскрибированной in vitro.

Как используется в данном документе, "поли(А)" представляет собой последовательный ряд аденозиновых остатков, присоединенных путем полиаденилирования к мРНК. В некоторых вариантах осуществления конструкции для транзиентной экспрессии длина поли(А) составляет от 50 до 5000 (SEQ ID NO: 30). В некоторых вариантах осуществления длина поли(А) составляет более 64. В некоторых вариантах осуществления длина поли(А) составляет более 100. В некоторых вариантах осуществления длина поли(А) составляет более 300. В некоторых вариантах осуществления длина поли(А) составляет более 400. Последовательности поли(A) можно модифицировать с помощью химических средств или ферментов для модулирования функциональных свойств мРНК, таких как локализация, стабильность или эффективность трансляции.

Как используется в данном документе, "полиаденилирование" относится к ковалентной связи полиаденилилового фрагмента или его модифицированного варианта с молекулой матричной РНК. У эукариотических организмов большинство молекул матричной РНК (мРНК) являются полиаденилированными на 3'-конце. 3'-концевой поли(А)-хвост представляет собой длинную последовательность адениновых нуклеотидов (часто несколько сотен), добавленных к пре-мРНК под действием фермента полиаденилатполимеразы. У высших эукариот поли(А)-хвост добавляется к транскриптам, которые содержат определенную последовательность - сигнал полиаденилирования. Поли(А)-хвост и связанный с ним белок содействуют защите мРНК от разрушения экзонуклеазами. Полиаденилирование также важно для терминации транскрипции, экспорта мРНК из ядра и трансляции. Полиаденилирование происходит в ядре сразу после транскрипции ДНК в РНК, но дополнительно может также происходить позднее в цитоплазме. После терминации транскрипции цепь мРНК расщепляется под действием эндонуклеазного комплекса, ассоциированного с РНК-полимеразой. Сайт расщепления обычно характеризуется наличием последовательности оснований AAUAAA вблизи сайта расщепления. После того, как мРНК была расщеплена, к свободному 3'-концу в сайте расщепления добавляются аденозиновые остатки.

Как используется в данном документе, "транзиентный" относится к экспрессии неинтегрированного трансгена в течение периода нескольких часов, дней или недель, где период времени экспрессии является меньшим, чем период времени для экспрессии гена в случае, если он интегрирован в геном или содержится в стабильном плазмидном репликоне в клетке-хозяине.

Используемые в данном документе термины "лечить", "лечение" и "осуществление лечения" относятся к снижению или ослаблению прогрессирования, тяжести и/или продолжительности пролиферативного нарушения или ослаблению одного или нескольких симптомов (предпочтительно одного или нескольких различимых симптомов) пролиферативного нарушения в результате введения одного или нескольких средств терапии (например, одного или нескольких терапевтических средств, таких как CAR по настоящему изобретению). В конкретных вариантах осуществления термины "лечить", "лечение" и "осуществление лечения" относятся к ослаблению по меньшей мере одного измеряемого физического параметра пролиферативного нарушения, такого как рост опухоли, не обязательно различимого для пациента. В других вариантах осуществления термины "лечить", "лечение" и "осуществление лечения" относятся к ингибированию прогрессирования пролиферативного нарушения либо на физическом уровне, например, посредством стабилизации различимого симптома, либо на физиологическом уровне, например, посредством стабилизации физического параметра, либо как на одном, так и на другом уровнях. В других вариантах осуществления термины "лечить", "лечение" и "осуществление лечения" относятся к снижению или стабилизации размера опухоли или количества раковых клеток.

Термин "путь передачи сигнала" относится к биохимической взаимосвязи между различными молекулами-переносчиками сигналов, которые играют роль в передаче сигнала от одной части клетки к другой части клетки. Фраза "рецептор клеточной поверхности" включает молекулы и комплексы молекул, способные принимать сигнал и передавать сигнал через мембрану клетки.

Термин "субъект" предполагает включение живых организмов, у которых можно вызвать иммунный ответ (например, млекопитающих, человека).

Термин "по существу очищенная клетка" относится к клетке, которая по сути свободна от других типов клеток. "По существу очищенная клетка" также относится к клетке, которая была отделена от других типов клеток, с которыми она обычно ассоциирована в своем встречающемся в природе состоянии. В некоторых случаях популяция по существу очищенных клеток относится к однородной популяции клеток. В других случаях данный термин просто относится к клетке, которая была отделена от клеток, с которыми она в природных условиях ассоциирована в своем природном состоянии. В некоторых вариантах осуществления клетки культивируют in vitro. В некоторых вариантах осуществления клетки не культивируют in vitro.

Используемый в данном документе термин "терапевтический" означает лечение. Терапевтический эффект получают путем ослабления, подавления, ремиссии или устранения болезненного состояния.

Используемый в данном документе термин "профилактика" означает предупреждение или профилактическое лечение заболевания или болезненного состояния.

Термины "трансфицированный", или "трансформированный", или "трансдуцированный" относятся к процессу, в ходе которого экзогенную нуклеиновую кислоту переносят или вводят в клетку-хозяина. "Трансфицированная", или "трансформированная", или "трансдуцированная" клетка представляет собой клетку, которая была подвергнута трансфекции, трансформации или трансдукции с помощью экзогенной нуклеиновой кислоты. Такая клетка включает первичную клетку субъекта и ее потомство.

Термин "специфично связывается" относится к антителу или лиганду, которые распознают своего когнатного белкового партнера по связыванию (например, стимулирующую и/или костимулирующую молекулу, присутствующую на Т-клетке), присутствующего в образце, и связываются с ним, но при этом это антитело или лиганд по существу не распознают или не связывают другие молекулы в образце.

Как используется в данном документе, "регулируемый химерный антигенный рецептор (RCAR)" относится к набору полипептидов, как правило, в простейших вариантах осуществления двух, которые, находясь в иммунной эффекторной клетке, наделяют клетку специфичностью в отношении клетки-мишени, как правило, раковой клетки, и образованием внутриклеточного сигнала. В некоторых вариантах осуществления RCAR содержит по меньшей мере внеклеточный антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и цитоплазматический сигнальный домен (также называемый в данном документе "внутриклеточным сигнальным доменом"), содержащий функциональный сигнальный домен, полученный из стимулирующей молекулы и/или костимулирующей молекулы, как определено в данном документе применительно к молекуле CAR. В некоторых вариантах осуществления полипептиды из набора в RCAR не являются смежными друг с другом, например, находятся в разных полипептидных цепях. В некоторых вариантах осуществления RCAR содержит димеризационный переключатель, который при наличии димеризационной молекулы может связывать полипептиды друг с другом, например, может связывать антигенсвязывающий домен с внутриклеточным сигнальным доменом. В некоторых вариантах осуществления RCAR экспрессируется в клетке (например, иммунной эффекторной клетке), описанной в данном документе, например, в клетке, экспрессирующей RCAR (также называемой в данном документе "RCARX-клеткой"). В некоторых вариантах осуществления RCARX-клетка представляет собой T-клетку и называется RCAR-T-клеткой. В некоторых вариантах осуществления RCARX-клетка представляет собой NK-клетку и называется RCAR-N-клеткой. RCAR может наделять клетку, экспрессирующую RCAR, специфичностью в отношении клетки-мишени, как правило, раковой клетки, и регулируемым образованием внутриклеточного сигнала или пролиферацией, что может оптимизировать иммуноэффекторное свойство клетки, экспрессирующей RCAR. В ряде вариантов осуществления клетка с RCAR по меньшей мере частично зависит от антигенсвязывающего домена в обеспечении специфичности в отношении клетки-мишени, которая содержит антиген, связываемый антигенсвязывающим доменом.

Используемый в данном документе термин "мембранный якорь" или "домен прикрепления к мембране" относится к полипептиду или фрагменту, например, к миристоильной группе, достаточному для заякоривания внеклеточного или внутриклеточного домена на плазматической мембране.

Используемый в данном документе термин "переключающий домен", например, в отношении RCAR, относится к объекту, обычно полипептидному объекту, который в присутствии димеризующей молекулы ассоциирует с другим переключающим доменом. Ассоциация приводит к функциональному связыванию первого объекта, связанного, например, слитого, с первым переключающим доменом, и второго объекта, связанного, например, слитого, со вторым переключающим доменом. Первый и второй переключающие домены в совокупности называются димеризационным переключателем. В ряде вариантов осуществления первый и второй переключающие домены являются одинаковыми, например, они являются полипептидами, имеющими одинаковую первичную аминокислотную последовательность, и в совокупности называются гомодимеризационным переключателем. В ряде вариантов осуществления первый и второй переключающие домены отличаются друг от друга, например, они являются полипептидами, имеющими разные первичные аминокислотные последовательности, и в совокупности называются гетеродимеризационным переключателем. В ряде вариантов осуществления переключатель является внутриклеточным. В ряде вариантов осуществления переключатель является внеклеточным. В ряде вариантов осуществления переключающий домен представляет собой полипептидный объект, например, объект на основе FKBP или FRB, а димеризующая молекула представляет собой малую молекулу, например, рапалог. В ряде вариантов осуществления переключающий домен представляет собой полипептидный объект, например, scFv, который связывает пептид myc, а димеризующая молекула представляет собой полипептид, его фрагмент или мультимер полипептида, например, лиганд myc или мультимеры лиганда myc, которые связываются с одним или несколькими scFv для myc. В ряде вариантов осуществления переключающий домен представляет собой полипептидный объект, например, рецептор для myc, а димеризующая молекула представляет собой антитело или его фрагменты, например, антитело к myc.

Используемый в данном документе термин "димеризующая молекула", например, в отношении RCAR, относится к молекуле, которая способствует ассоциации первого переключающего домена со вторым переключающим доменом. В ряде вариантов осуществления димеризующая молекула не встречается у субъекта в природе или не встречается в концентрациях, которые могут привести к значительной степени димеризации. В ряде вариантов осуществления димеризующая молекула представляет собой малую молекулу, например, рапамицин или рапалог, например, RAD001.

Термин "низкая доза, усиливающая иммунный ответ" при использовании в отношении ингибитора mTOR, например, аллостерического ингибитора mTOR, например, RAD001 или рапамицина, или каталитического ингибитора mTOR относится к дозе ингибитора mTOR, которая обеспечивает частичное, но не полное, ингибирование активности mTOR, например, согласно измерению по ингибированию активности киназы P70-S6. Способы оценивания активности mTOR, например, по ингибированию киназы P70-S6, обсуждаются в данном документе. Доза является недостаточной, чтобы вызвать полное подавление иммунитета, но достаточной для усиления иммунного ответа. В некоторых вариантах осуществления низкая доза, усиливающая иммунный ответ, ингибитора mTOR приводит к уменьшению количества PD-1-положительных Т-клеток и/или увеличению количества PD-1-отрицательных Т-клеток или увеличению соотношения PD-1-отрицательные Т-клетки/PD-1-положительные Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления низкая доза, усиливающая иммунный ответ, ингибитора mTOR приводит к увеличению количества необученных Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления низкая доза, усиливающая иммунный ответ, ингибитора mTOR приводит к одному или нескольким из следующего:

повышению экспрессии одного или нескольких из следующих маркеров: CD62L^{высокий}, CD127^{высокий}, CD27⁺ и BCL2, например, на Т-клетках памяти, например, на предшественниках Т-клеток памяти;

снижению экспрессии KLRG1, например, на Т-клетках памяти, например, на предшественниках Т-клеток памяти; и

увеличению количества предшественников Т-клеток памяти, например, клеток с любой из следующих характеристик или их комбинацией: повышенным уровнем CD62L^{высокий}, повышенным уровнем CD127^{высокий}, повышенным уровнем CD27⁺, сниженным уровнем KLRG1 и повышенным уровнем BCL2;

где любое из изменений, описанных выше, происходит, например, по меньшей мере транзиентно, например, по сравнению с субъектом, не получающим лечение.

Как используется в данном документе, "рефрактерный" относится к заболеванию, например, раку, которое не отвечает на лечение. В ряде вариантов осуществления рефрактерный рак может быть устойчивым к лечению до или в начале лечения. В других вариантах осуществления рефрактерный рак может стать устойчивым в ходе лечения. Рефрактерный рак также называют устойчивым раком.

Как используется в данном документе, "рецидивирующий" или "рецидив" относится к возвращению или повторному появлению заболевания (например, рака) или признаков и симптомов заболевания, такого как рак, после периода улучшения или восприимчивости, например, после предшествующего лечения с помощью терапии, например, противораковой терапии. Начальный период восприимчивости может предусматривать падение уровня раковых клеток ниже определенного порога, например, ниже 20%, 1%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1%. Повторное появление может предусматривать возрастание уровня раковых клеток выше определенного порога, например, выше 20%, 1%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1%. Например, применительно к B-ALL повторное появление может предусматривать, например, повторное появление бластных клеток в крови, костном мозге (> 5%) или любом экстрамедуллярном участке после достижения полного ответа. Полный ответ в данном контексте может предусматривать < 5% бластных клеток в BM. В более широком смысле в некоторых вариантах осуществления ответ (например, полный ответ или частичный ответ) может предусматривать отсутствие выявляемого MRD (минимального остаточного заболевания). В некоторых вариантах осуществления начальный период восприимчивости продолжается в течение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5 или 6 дней; по меньшей мере 1, 2, 3 или 4 недель; по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10 или 12 месяцев или по меньшей мере 1, 2, 3, 4 или 5 лет.

Диапазоны: во всем настоящем раскрытии различные варианты осуществления настоящего изобретения могут быть представлены в формате диапазонов. Следует понимать, что описание в формате диапазонов служит лишь для удобства и краткости и не должно рассматриваться как жесткое ограничение объема настоящего изобретения. Соответственно, описание диапазона следует рассматривать как конкретно раскрывающее все возможные поддиапазоны, а также отдельные числовые значения в пределах этого диапазона. Например, описание такого диапазона, как от 1 до 6, следует рассматривать как конкретно раскрывающее такие поддиапазоны, как от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 2 до 4, от 2 до 6, от 3 до 6 и т. д., а также отдельные числа в пределах этого диапазона, например, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 и 6. В качестве другого примера, такой диапазон, как 95-99% идентичность, включает что-либо с 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью и включает такие поддиапазоны, как 96-99%, 96-98%, 96-97%, 97-99%, 97-98% и 98-99% идентичность. Это применимо независимо от ширины диапазона.

Используемый в данном документе термин "система редактирования генов" относится к системе, например, одной или нескольким молекулам, которые управляют изменением, например, делецией, и осуществляют его в одной или нескольких нуклеиновых кислотах в сайте геномной ДНК, на которую нацеливается указанная система, или рядом с ним. Системы редактирования генов известны из уровня техники и более подробно описаны ниже.

Как используется в данном документе, вводимый "в комбинации" означает, что два (или более) различных средства для лечения доставляют субъекту в период, когда субъект страдает нарушением, например, два или более средства для лечения доставляют после того, как у субъекта было диагностировано нарушение, и до того, как нарушение было излечено или устранено или лечение было прекращено по другим причинам. В некоторых вариантах осуществления доставка одного средства для лечения по-прежнему происходит, когда начинается доставка второго, так что в отношении введения имеет место перекрывание. Это иногда упоминается в данном документе как "одновременная" или "параллельная" доставка. В других вариантах осуществления доставка одного средства для лечения заканчивается до начала доставки другого средства для лечения. В некоторых вариантах осуществления в любом из случаев лечение является более эффективным благодаря комбинированному введению. Например, второе средство для лечения является более эффективным, например, эквивалентный эффект наблюдается при меньшем количестве второго средства для лечения, или второе средство для лечения снижает интенсивность симптомов в большей степени, чем наблюдалось бы при введении второго средства для лечения в отсутствие первого средства для лечения, или аналогичная ситуация наблюдается с первым средством для лечения. В некоторых вариантах осуществления доставка является такой, при которой снижение интенсивности симптома или другого параметра, связанного с нарушением, является большим, чем наблюдалось бы при доставке одного средства для лечения в отсутствие другого. Эффект двух средств для лечения может быть частично аддитивным, полностью аддитивным или превышающим аддитивный. Доставка может быть такой, что эффект от первого доставленного средства для лечения все еще поддается выявлению при доставке второго.

Термины "истощение" или "истощать", используемые взаимозаменяемо в данном документе, относятся к уменьшению или снижению уровня или количества клетки, белка или макромолекулы в образце после осуществления процесса, например, стадии отбора, например, отрицательного отбора. Истощение может быть полным или частичным истощением по клетке, белку или макромолекуле. В некоторых вариантах осуществления истощение представляет собой по меньшей мере 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, или 99% уменьшение или снижение уровня или количества клетки, белка или макромолекулы по сравнению с уровнем или количеством клетки, белка или макромолекулы в образце перед осуществлением процесса.

Как используется в данном документе, "необученная Т-клетка" относится к Т-клетке, которая является неопытной в отношении антигена. В некоторых вариантах осуществления Т-клетка, которая является неопытной в отношении антигена, встречалась со своим когнатным антигеном в тимусе, но не на периферии. В некоторых вариантах осуществления необученные Т-клетки являются предшественниками клеток памяти. В некоторых вариантах осуществления необученные Т-клетки экспрессируют как CD45RA, так и CCR7, но не экспрессируют CD45RO. В некоторых вариантах осуществления необученные Т-клетки могут характеризоваться экспрессией CD62L, CD27, CCR7, CD45RA, CD28 и CD127 и отсутствием CD95 или изоформы CD45RO. В некоторых вариантах осуществления необученные Т-клетки экспрессируют CD62L, рецептор IL-7 α, рецептор IL-6 и CD132, но не экспрессируют CD25, CD44, CD69 или CD45RO. В некоторых вариантах осуществления необученные Т-клетки экспрессируют CD45RA, CCR7 и CD62L и не экспрессируют CD95 или рецептор IL-2 β. В некоторых вариантах осуществления уровни экспрессии маркеров на поверхности оценивают с помощью проточной цитометрии.

Термин "центральные T-клетки памяти" относится к субпопуляции T-клеток, которые у людей являются CD45RO-положительными и экспрессируют CCR7. В некоторых вариантах осуществления центральные T-клетки памяти экспрессируют CD95. В некоторых вариантах осуществления центральные T-клетки памяти экспрессируют IL-2R, IL-7R и/или IL-15R. В некоторых вариантах осуществления центральные T-клетки памяти экспрессируют CD45RO, CD95, рецептор IL-2 β, CCR7 и CD62L. В некоторых вариантах осуществления уровни экспрессии маркеров на поверхности оценивают с помощью проточной цитометрии.

Термин "стволовые T-клетки памяти", "T-клетки памяти, представляющие собой стволовые клетки", "T-клетки памяти, подобные стволовым клеткам", "стволовые T-клетки, являющиеся клетками памяти", "стволовые клетки, являющиеся Т-клетками памяти", "клетки памяти, представляющие собой стволовые Т-клетки" или "TSCM-клетки" относится к субпопуляции T-клеток памяти со способностью, подобной таковой у стволовых клеток, например, способностью к самообновлению и/или с мультипотентным потенциалом преобразования в субпопуляции T-клеток памяти и/или эффектoрных Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления стволовые T-клетки памяти экспрессируют CD45RA, CD95, рецептор IL-2 β, CCR7 и CD62L. В некоторых вариантах осуществления уровни экспрессии маркеров на поверхности оценивают с помощью проточной цитометрии. В некоторых вариантах осуществления иллюстративные стволовые T-клетки памяти раскрыты в Gattinoni et al., Nat Med. 2017 January 06; 23(1): 18-27, включенной в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Для ясности, если не указано иное, классификация клетки или популяции клеток в качестве "не экспрессирующих", или характеризующихся "отсутствием" определенного маркера, или являющихся "отрицательными в отношении" определенного маркера не обязательно может означать абсолютное отсутствие маркера. Специалист в данной области может без труда сравнить клетку с положительным и/или отрицательным контролем и/или установить предварительно определенное пороговое значение и классифицировать клетку или популяцию клеток в качестве не экспрессирующих или являющихся отрицательными в отношении маркера, если клетка характеризуется уровнем экспрессии ниже предварительно определенного порогового значения или популяция клеток характеризуется общим уровнем экспрессии ниже предварительно определенного порогового значения, с помощью традиционных способов выявления, например, с помощью проточной цитометрии, например, как описано в примерах в данном документе.

Используемый в данном документе термин "балл набора генов (активируемые в TEM относительно подавляемых в TSCM)" для клетки относится к баллу, который отражает степень, в которой клетка демонстрирует фенотип эффектoрной Т-клетки памяти (TEM) по сравнению с фенотипом T-клетки памяти, представляющей собой стволовую клетку (TSCM). Более высокий балл набора генов (активируемые в TEM относительно подавляемых в TSCM) указывает на увеличение выраженности фенотипа TEM, тогда как более низкий балл набора генов (активируемые в TEM относительно подавляемых в TSCM) указывает на увеличение выраженности фенотипа TSCM. В некоторых вариантах осуществления балл набора генов (активируемые в TEM относительно подавляемых в TSCM) определяют путем измерения экспрессии одного или нескольких генов, которые активируются в TEM-клетках и/или подавляются в TSCM-клетках, например, одного или нескольких генов, выбранных из группы, состоящей из MXRA7, CLIC1, NAT13, TBC1D2B, GLCCI1, DUSP10, APOBEC3D, CACNB3, ANXA2P2, TPRG1, EOMES, MATK, ARHGAP10, ADAM8, MAN1A1, SLFN12L, SH2D2A, EIF2C4, CD58, MYO1F, RAB27B, ERN1, NPC1, NBEAL2, APOBEC3G, SYTL2, SLC4A4, PIK3AP1, PTGDR, MAF, PLEKHA5, ADRB2, PLXND1, GNAO1, THBS1, PPP2R2B, CYTH3, KLRF1, FLJ16686, AUTS2, PTPRM, GNLY и GFPT2. В некоторых вариантах осуществления балл набора генов (активируемые в TEM относительно подавляемых в TSCM) определяют для каждой клетки с помощью секвенирования РНК, например, секвенирования РНК одиночных клеток (scRNA-seq), что, например, проиллюстрировано в примере 7 в отношении фиг. 25A. В некоторых вариантах осуществления балл набора генов (активируемые в TEM относительно подавляемых в TSCM) рассчитывают с использованием среднего логарифмически нормализованного значения экспрессии гена для всех генов в наборе генов.

Используемый в данном документе термин "балл набора генов (активируемые в Treg относительно подавляемых в Teff)" для клетки относится к баллу, который отражает степень, в которой клетка демонстрирует фенотип регуляторной Т-клетки (Treg) по сравнению с фенотипом эффекторной Т-клетки (Teff). Более высокий балл набора генов (активируемые в Treg относительно подавляемых в Teff) указывает на увеличение выраженности фенотипа Treg, тогда как более низкий балл набора генов (активируемые в Treg относительно подавляемых в Teff) указывает на увеличение выраженности фенотипа Teff. В некоторых вариантах осуществления балл набора генов (активируемые в Treg относительно подавляемых в Teff) определяют путем измерения экспрессии одного или нескольких генов, которые активируются в Treg-клетках и/или подавляются в Teff-клетках, например, одного или нескольких генов, выбранных из группы, состоящей из C12orf75, SELPLG, SWAP70, RGS1, PRR11, SPATS2L, SPATS2L, TSHR, C14orf145, CASP8, SYT11, ACTN4, ANXA5, GLRX, HLA-DMB, PMCH, RAB11FIP1, IL32, FAM160B1, SHMT2, FRMD4B, CCR3, TNFRSF13B, NTNG2, CLDND1, BARD1, FCER1G, TYMS, ATP1B1, GJB6, FGL2, TK1, SLC2A8, CDKN2A, SKAP2, GPR55, CDCA7, S100A4, GDPD5, PMAIP1, ACOT9, CEP55, SGMS1, ADPRH, AKAP2, HDAC9, IKZF4, CARD17, VAV3, OBFC2A, ITGB1, CIITA, SETD7, HLA-DMA, CCR10, KIAA0101, SLC14A1, PTTG3P, DUSP10, FAM164A, PYHIN1, MYO1F, SLC1A4, MYBL2, PTTG1, RRM2, TP53INP1, CCR5, ST8SIA6, TOX, BFSP2, ITPRIPL1, NCAPH, HLA-DPB2, SYT4, NINJ2, FAM46C, CCR4, GBP5, C15orf53, LMCD1, MKI67, NUSAP1, PDE4A, E2F2, CD58, ARHGEF12, LOC100188949, FAS, HLA-DPB1, SELP, WEE1, HLA-DPA1, FCRL1, ICA1, CNTNAP1, OAS1, METTL7A, CCR6, HLA-DRB4, ANXA2P3, STAM, HLA-DQB2, LGALS1, ANXA2, PI16, DUSP4, LAYN, ANXA2P2, PTPLA, ANXA2P1, ZNF365, LAIR2, LOC541471, RASGRP4, BCAS1, UTS2, MIAT, PRDM1, SEMA3G, FAM129A, HPGD, NCF4, LGALS3, CEACAM4, JAKMIP1, TIGIT, HLA-DRA, IKZF2, HLA-DRB1, FANK1, RTKN2, TRIB1, FCRL3 и FOXP3. В некоторых вариантах осуществления балл набора генов (активируемые в Treg относительно подавляемых в Teff) определяют с помощью секвенирования РНК, например, секвенирования РНК одиночных клеток (scRNA-seq), что, например, проиллюстрировано в примере 7 в отношении фиг. 25B. В некоторых вариантах осуществления балл набора генов (активируемые в Treg относительно подавляемых в Teff) рассчитывают с использованием среднего логарифмически нормализованного значения экспрессии гена для всех генов в наборе генов.

Используемый в данном документе термин "балл набора генов (подавляемые в состоянии стволовости)" для клетки относится к баллу, который отражает степень, в которой клетка демонстрирует фенотип стволовости. Более низкий балл набора генов (подавляемые в состоянии стволовости) указывает на увеличение выраженности фенотипа стволовости. В некоторых вариантах осуществления балл набора генов (подавляемые в состоянии стволовости) определяют путем измерения экспрессии одного или нескольких генов, которые активируются в дифференцирующейся стволовой клетке, относительно генов, которые подавляются в гемопоэтической стволовой клетке, например, одного или нескольких генов, выбранных из группы, состоящей из ACE, BATF, CDK6, CHD2, ERCC2, HOXB4, MEOX1, SFRP1, SP7, SRF, TAL1 и XRCC5. В некоторых вариантах осуществления балл набора генов (подавляемые в состоянии стволовости) определяют с помощью секвенирования РНК, например, секвенирования РНК одиночных клеток (scRNA-seq), как, например, проиллюстрировано в примере 7 в отношении фиг. 25C. В некоторых вариантах осуществления балл набора генов (подавляемые в состоянии стволовости) рассчитывают с использованием среднего логарифмически нормализованного значения экспрессии гена для всех генов в наборе генов.

Используемый в данном документе термин "балл набора генов (активируемые при гипоксии)" для клетки относится к баллу, который отражает степень, в которой клетка демонстрирует фенотип, характерный для гипоксии. Более высокий балл набора генов (активируемые при гипоксии) указывает на увеличение выраженности фенотипа, характерного для гипоксии. В некоторых вариантах осуществления балл набора генов (активируемые при гипоксии) определяют путем измерения экспрессии одного или нескольких генов, которые активируются в клетках, подвергающихся гипоксии, например, одного или нескольких генов, выбранных из группы, состоящей из ABCB1, ACAT1, ADM, ADORA2B, AK2, AK3, ALDH1A1, ALDH1A3, ALDOA, ALDOC, ANGPT2, ANGPTL4, ANXA1, ANXA2, ANXA5, ARHGAP5, ARSE, ART1, BACE2, BATF3, BCL2L1, BCL2L2, BHLHE40, BHLHE41, BIK, BIRC2, BNIP3, BNIP3L, BPI, BTG1, C11orf2, C7orf68, CA12, CA9, CALD1, CCNG2, CCT6A, CD99, CDK1, CDKN1A, CDKN1B, CITED2, CLK1, CNOT7, COL4A5, COL5A1, COL5A2, COL5A3, CP, CTSD, CXCR4, D4S234E, DDIT3, DDIT4, 1-Dec, DKC1, DR1, EDN1, EDN2, EFNA1, EGF, EGR1, EIF4A3, ELF3, ELL2, ENG, ENO1, ENO3, ENPEP, EPO, ERRFI1, ETS1, F3, FABP5, FGF3, FKBP4, FLT1, FN1, FOS, FTL, GAPDH, GBE1, GLRX, GPI, GPRC5A, HAP1, HBP1, HDAC1, HDAC9, HERC3, HERPUD1, HGF, HIF1A, HK1, HK2, HLA-DQB1, HMOX1, HMOX2, HSPA5, HSPD1, HSPH1, HYOU1, ICAM1, ID2, IFI27, IGF2, IGFBP1, IGFBP2, IGFBP3, IGFBP5, IL6, IL8, INSIG1, IRF6, ITGA5, JUN, KDR, KRT14, KRT18, KRT19, LDHA, LDHB, LEP, LGALS1, LONP1, LOX, LRP1, MAP4, MET, MIF, MMP13, MMP2, MMP7, MPI, MT1L, MTL3P, MUC1, MXI1, NDRG1, NFIL3, NFKB1, NFKB2, NOS1, NOS2, NOS2P1, NOS2P2, NOS3, NR3C1, NR4A1, NT5E, ODC1, P4HA1, P4HA2, PAICS, PDGFB, PDK3, PFKFB1, PFKFB3, PFKFB4, PFKL, PGAM1, PGF, PGK1, PGK2, PGM1, PIM1, PIM2, PKM2, PLAU, PLAUR, PLIN2, PLOD2, PNN, PNP, POLM, PPARA, PPAT, PROK1, PSMA3, PSMD9, PTGS1, PTGS2, QSOX1, RBPJ, RELA, RIOK3, RNASEL, RPL36A, RRP9, SAT1, SERPINB2, SERPINE1, SGSM2, SIAH2, SIN3A, SIRPA, SLC16A1, SLC16A2, SLC20A1, SLC2A1, SLC2A3, SLC3A2, SLC6A10P, SLC6A16, SLC6A6, SLC6A8, SORL1, SPP1, SRSF6, SSSCA1, STC2, STRA13, SYT7, TBPL1, TCEAL1, TEK, TF, TFF3, TFRC, TGFA, TGFB1, TGFB3, TGFBI, TGM2, TH, THBS1, THBS2, TIMM17A, TNFAIP3, TP53, TPBG, TPD52, TPI1, TXN, TXNIP, UMPS, VEGFA, VEGFB, VEGFC, VIM, VPS11 и XRCC6. В некоторых вариантах осуществления балл набора генов (активируемые при гипоксии) определяют с помощью секвенирования РНК, например, секвенирования РНК одиночных клеток (scRNA-seq), как, например, проиллюстрировано в примере 7 в отношении фиг. 25D. В некоторых вариантах осуществления балл набора генов (активируемые при гипоксии) рассчитывают с использованием среднего логарифмически нормализованного значения экспрессии гена для всех генов в наборе генов.

Используемый в данном документе термин "балл набора генов (активируемые при аутофагии)" для клетки относится к баллу, который отражает степень, в которой клетка демонстрирует фенотип, характерный для аутофагии. Более высокий балл набора генов (активируемые при аутофагии) указывает на увеличение выраженности фенотипа, характерного для аутофагии. В некоторых вариантах осуществления балл набора генов (активируемые при аутофагии) определяют путем измерения экспрессии одного или нескольких генов, которые активируются в клетках, подвергающихся аутофагии, например, одного или нескольких генов, выбранных из группы, состоящей из ABL1, ACBD5, ACIN1, ACTRT1, ADAMTS7, AKR1E2, ALKBH5, ALPK1, AMBRA1, ANXA5, ANXA7, ARSB, ASB2, ATG10, ATG12, ATG13, ATG14, ATG16L1, ATG16L2, ATG2A, ATG2B, ATG3, ATG4A, ATG4B, ATG4C, ATG4D, ATG5, ATG7, ATG9A, ATG9B, ATP13A2, ATP1B1, ATPAF1-AS1, ATPIF1, BECN1, BECN1P1, BLOC1S1, BMP2KL, BNIP1, BNIP3, BOC, C11orf2, C11orf41, C12orf44, C12orf5, C14orf133, C1orf210, C5, C6orf106, C7orf59, C7orf68, C8orf59, C9orf72, CA7, CALCB, CALCOCO2, CAPS, CCDC36, CD163L1, CD93, CDC37, CDKN2A, CHAF1B, CHMP2A, CHMP2B, CHMP3, CHMP4A, CHMP4B, CHMP4C, CHMP6, CHST3, CISD2, CLDN7, CLEC16A, CLN3, CLVS1, COX8A, CPA3, CRNKL1, CSPG5, CTSA, CTSB, CTSD, CXCR7, DAP, DKKL1, DNAAF2, DPF3, DRAM1, DRAM2, DYNLL1, DYNLL2, DZANK1, EI24, EIF2S1, EPG5, EPM2A, FABP1, FAM125A, FAM131B, FAM134B, FAM13B, FAM176A, FAM176B, FAM48A, FANCC, FANCF, FANCL, FBXO7, FCGR3B, FGF14, FGF7, FGFBP1, FIS1, FNBP1L, FOXO1, FUNDC1, FUNDC2, FXR2, GABARAP, GABARAPL1, GABARAPL2, GABARAPL3, GABRA5, GDF5, GMIP, HAP1, HAPLN1, HBXIP, HCAR1, HDAC6, HGS, HIST1H3A, HIST1H3B, HIST1H3C, HIST1H3D, HIST1H3E, HIST1H3F, HIST1H3G, HIST1H3H, HIST1H3I, HIST1H3J, HK2, HMGB1, HPR, HSF2BP, HSP90AA1, HSPA8, IFI16, IPPK, IRGM, IST1, ITGB4, ITPKC, KCNK3, KCNQ1, KIAA0226, KIAA1324, KRCC1, KRT15, KRT73, LAMP1, LAMP2, LAMTOR1, LAMTOR2, LAMTOR3, LARP1B, LENG9, LGALS8, LIX1, LIX1L, LMCD1, LRRK2, LRSAM1, LSM4, MAP1A, MAP1LC3A, MAP1LC3B, MAP1LC3B2, MAP1LC3C, MAP1S, MAP2K1, MAP3K12, MARK2, MBD5, MDH1, MEX3C, MFN1, MFN2, MLST8, MRPS10, MRPS2, MSTN, MTERFD1, MTMR14, MTMR3, MTOR, MTSS1, MYH11, MYLK, MYOM1, NBR1, NDUFB9, NEFM, NHLRC1, NME2, NPC1, NR2C2, NRBF2, NTHL1, NUP93, OBSCN, OPTN, P2RX5, PACS2, PARK2, PARK7, PDK1, PDK4, PEX13, PEX3, PFKP, PGK2, PHF23, PHYHIP, PI4K2A, PIK3C3, PIK3CA, PIK3CB, PIK3R4, PINK1, PLEKHM1, PLOD2, PNPO, PPARGC1A, PPY, PRKAA1, PRKAA2, PRKAB1, PRKAB2, PRKAG1, PRKAG2, PRKAG3, PRKD2, PRKG1, PSEN1, PTPN22, RAB12, RAB1A, RAB1B, RAB23, RAB24, RAB33B, RAB39, RAB7A, RB1CC1, RBM18, REEP2, REP15, RFWD3, RGS19, RHEB, RIMS3, RNF185, RNF41, RPS27A, RPTOR, RRAGA, RRAGB, RRAGC, RRAGD, S100A8, S100A9, SCN1A, SERPINB10, SESN2, SFRP4, SH3GLB1, SIRT2, SLC1A3, SLC1A4, SLC22A3, SLC25A19, SLC35B3, SLC35C1, SLC37A4, SLC6A1, SLCO1A2, SMURF1, SNAP29, SNAPIN, SNF8, SNRPB, SNRPB2, SNRPD1, SNRPF, SNTG1, SNX14, SPATA18, SQSTM1, SRPX, STAM, STAM2, STAT2, STBD1, STK11, STK32A, STOM, STX12, STX17, SUPT3H, TBC1D17, TBC1D25, TBC1D5, TCIRG1, TEAD4, TECPR1, TECPR2, TFEB, TM9SF1, TMBIM6, TMEM203, TMEM208, TMEM39A, TMEM39B, TMEM59, TMEM74, TMEM93, TNIK, TOLLIP, TOMM20, TOMM22, TOMM40, TOMM5, TOMM6, TOMM7, TOMM70A, TP53INP1, TP53INP2, TRAPPC8, TREM1, TRIM17, TRIM5, TSG101, TXLNA, UBA52, UBB, UBC, UBQLN1, UBQLN2, UBQLN4, ULK1, ULK2, ULK3, USP10, USP13, USP30, UVRAG, VAMP7, VAMP8, VDAC1, VMP1, VPS11, VPS16, VPS18, VPS25, VPS28, VPS33A, VPS33B, VPS36, VPS37A, VPS37B, VPS37C, VPS37D, VPS39, VPS41, VPS4A, VPS4B, VTA1, VTI1A, VTI1B, WDFY3, WDR45, WDR45L, WIPI1, WIPI2, XBP1, YIPF1, ZCCHC17, ZFYVE1, ZKSCAN3, ZNF189, ZNF593 и ZNF681. В некоторых вариантах осуществления балл набора генов (активируемые при аутофагии) определяют с помощью секвенирования РНК, например, секвенирования РНК одиночных клеток (scRNA-seq), как, например, проиллюстрировано в примере 7 в отношении фиг. 25E. В некоторых вариантах осуществления балл набора генов (активируемые при аутофагии) рассчитывают с использованием среднего логарифмически нормализованного значения экспрессии гена для всех генов в наборе генов.

Используемый в данном документе термин "балл набора генов (активируемые в покоящемся состоянии относительно подавляемых в активированном состоянии)" для клетки относится к баллу, который отражает степень, в которой клетка демонстрирует фенотип покоящейся Т-клетки по сравнению с фенотипом активированной Т-клетки. Более высокий балл набора генов (активируемые в покоящемся состоянии относительно подавляемых в активированном состоянии) указывает на увеличение выраженности фенотипа покоящихся Т-клеток, тогда как более низкий балл набора генов (активируемые в покоящемся состоянии относительно подавляемых в активированном состоянии) указывает на увеличение выраженности фенотипа активированных T-клеток. В некоторых вариантах осуществления балл набора генов (активируемые в покоящемся состоянии относительно подавляемых в активированном состоянии) определяют путем измерения экспрессии одного или нескольких генов, которые активируются в покоящихся T-клетках и/или подавляются в активированных T-клетках, например, одного или нескольких генов, выбранных из группы, состоящей из ABCA7, ABCF3, ACAP2, AMT, ANKH, ATF7IP2, ATG14, ATP1A1, ATXN7, ATXN7L3B, BCL7A, BEX4, BSDC1, BTG1, BTG2, BTN3A1, C11orf21, C19orf22, C21orf2, CAMK2G, CARS2, CCNL2, CD248, CD5, CD55, CEP164, CHKB, CLK1, CLK4, CTSL1, DBP, DCUN1D2, DENND1C, DGKD, DLG1, DUSP1, EAPP, ECE1, ECHDC2, ERBB2IP, FAM117A, FAM134B, FAM134C, FAM169A, FAM190B, FAU, FLJ10038, FOXJ2, FOXJ3, FOXL1, FOXO1, FXYD5, FYB, HLA-E, HSPA1L, HYAL2, ICAM2, IFIT5, IFITM1, IKBKB, IQSEC1, IRS4, KIAA0664L3, KIAA0748, KLF3, KLF9, KRT18, LEF1, LINC00342, LIPA, LIPT1, LLGL2, LMBR1L, LPAR2, LTBP3, LYPD3, LZTFL1, MANBA, MAP2K6, MAP3K1, MARCH8, MAU2, MGEA5, MMP8, MPO, MSL1, MSL3, MYH3, MYLIP, NAGPA, NDST2, NISCH, NKTR, NLRP1, NOSIP, NPIP, NUMA1, PAIP2B, PAPD7, PBXIP1, PCIF1, PI4KA, PLCL2, PLEKHA1, PLEKHF2, PNISR, PPFIBP2, PRKCA, PRKCZ, PRKD3, PRMT2, PTP4A3, PXN, RASA2, RASA3, RASGRP2, RBM38, REPIN1, RNF38, RNF44, ROR1, RPL30, RPL32, RPLP1, RPS20, RPS24, RPS27, RPS6, RPS9, RXRA, RYK, SCAND2, SEMA4C, SETD1B, SETD6, SETX, SF3B1, SH2B1, SLC2A4RG, SLC35E2B, SLC46A3, SMAGP, SMARCE1, SMPD1, SNPH, SP140L, SPATA6, SPG7, SREK1IP1, SRSF5, STAT5B, SVIL, SYF2, SYNJ2BP, TAF1C, TBC1D4, TCF20, TECTA, TES, TMEM127, TMEM159, TMEM30B, TMEM66, TMEM8B, TP53TG1, TPCN1, TRIM22, TRIM44, TSC1, TSC22D1, TSC22D3, TSPYL2, TTC9, TTN, UBE2G2, USP33, USP34, VAMP1, VILL, VIPR1, VPS13C, ZBED5, ZBTB25, ZBTB40, ZC3H3, ZFP161, ZFP36L1, ZFP36L2, ZHX2, ZMYM5, ZNF136, ZNF148, ZNF318, ZNF350, ZNF512B, ZNF609, ZNF652, ZNF83, ZNF862 и ZNF91. В некоторых вариантах осуществления балл набора генов (активируемые в покоящемся состоянии относительно подавляемых в активированном состоянии) определяют с помощью секвенирования РНК, например, секвенирования РНК одиночных клеток (scRNA-seq), как, например, проиллюстрировано в примере 7 в отношении фиг. 24D. В некоторых вариантах осуществления балл набора генов (активируемые в покоящемся состоянии относительно подавляемых в активированном состоянии) рассчитывают с использованием среднего логарифмически нормализованного значения экспрессии гена для всех генов в наборе генов.

Используемый в данном документе термин "балл набора генов (постепенно активируемые при дифференцировке в клетки памяти)" для клетки относится к баллу, который отражает стадию дифференцировки в клетки памяти. Более высокий балл набора генов (постепенно активируемые при дифференцировке в клетки памяти) указывает на увеличение выраженности фенотипа поздних Т-клеток памяти, тогда как более низкий балл набора генов (постепенно активируемые при дифференцировке в клетки памяти) указывает на увеличение выраженности фенотипа ранних Т-клеток памяти. В некоторых вариантах осуществления балл набора генов (активируемые при аутофагии) определяют путем измерения экспрессии одного или нескольких генов, которые активируются в ходе дифференцировки в клетки памяти, например, одного или нескольких генов, выбранных из группы, состоящей из MTCH2, RAB6C, KIAA0195, SETD2, C2orf24, NRD1, GNA13, COPA, SELT, TNIP1, CBFA2T2, LRP10, PRKCI, BRE, ANKS1A, PNPLA6, ARL6IP1, WDFY1, MAPK1, GPR153, SHKBP1, MAP1LC3B2, PIP4K2A, HCN3, GTPBP1, TLN1, C4orf34, KIF3B, TCIRG1, PPP3CA, ATG4D, TYMP, TRAF6, C17orf76, WIPF1, FAM108A1, MYL6, NRM, SPCS2, GGT3P, GALK1, CLIP4, ARL4C, YWHAQ, LPCAT4, ATG2A, IDS, TBC1D5, DMPK, ST6GALNAC6, REEP5, ABHD6, KIAA0247, EMB, TSEN54, SPIRE2, PIWIL4, ZSCAN22, ICAM1, CHD9, LPIN2, SETD8, ZC3H12A, ULBP3, IL15RA, HLA-DQB2, LCP1, CHP, RUNX3, TMEM43, REEP4, MEF2D, ABL1, TMEM39A, PCBP4, PLCD1, CHST12, RASGRP1, C1orf58, C11orf63, C6orf129, FHOD1, DKFZp434F142, PIK3CG, ITPR3, BTG3, C4orf50, CNNM3, IFI16, AK1, CDK2AP1, REL, BCL2L1, MVD, TTC39C, PLEKHA2, FKBP11, EML4, FANCA, CDCA4, FUCA2, MFSD10, TBCD, CAPN2, IQGAP1, CHST11, PIK3R1, MYO5A, KIR2DL3, DLG3, MXD4, RALGDS, S1PR5, WSB2, CCR3, TIPARP, SP140, CD151, SOX13, KRTAP5-2, NF1, PEA15, PARP8, RNF166, UEVLD, LIMK1, CACNB1, TMX4, SLC6A6, LBA1, SV2A, LLGL2, IRF1, PPP2R5C, CD99, RAPGEF1, PPP4R1, OSBPL7, FOXP4, SLA2, TBC1D2B, ST7, JAZF1, GGA2, PI4K2A, CD68, LPGAT1, STX11, ZAK, FAM160B1, RORA, C8orf80, APOBEC3F, TGFBI, DNAJC1, GPR114, LRP8, CD69, CMIP, NAT13, TGFB1, FLJ00049, ANTXR2, NR4A3, IL12RB1, NTNG2, RDX, MLLT4, GPRIN3, ADCY9, CD300A, SCD5, ABI3, PTPN22, LGALS1, SYTL3, BMPR1A, TBK1, PMAIP1, RASGEF1A, GCNT1, GABARAPL1, STOM, CALHM2, ABCA2, PPP1R16B, SYNE2, PAM, C12orf75, CLCF1, MXRA7, APOBEC3C, CLSTN3, ACOT9, HIP1, LAG3, TNFAIP3, DCBLD1, KLF6, CACNB3, RNF19A, RAB27A, FADS3, DLG5, APOBEC3D, TNFRSF1B, ACTN4, TBKBP1, ATXN1, ARAP2, ARHGEF12, FAM53B, MAN1A1, FAM38A, PLXNC1, GRLF1, SRGN, HLA-DRB5, B4GALT5, WIPI1, PTPRJ, SLFN11, DUSP2, ANXA5, AHNAK, NEO1, CLIC1, EIF2C4, MAP3K5, IL2RB, PLEKHG1, MYO6, GTDC1, EDARADD, GALM, TARP, ADAM8, MSC, HNRPLL, SYT11, ATP2B4, NHSL2, MATK, ARHGAP18, SLFN12L, SPATS2L, RAB27B, PIK3R3, TP53INP1, MBOAT1, GYG1, KATNAL1, FAM46C, ZC3HAV1L, ANXA2P2, CTNNA1, NPC1, C3AR1, CRIM1, SH2D2A, ERN1, YPEL1, TBX21, SLC1A4, FASLG, PHACTR2, GALNT3, ADRB2, PIK3AP1, TLR3, PLEKHA5, DUSP10, GNAO1, PTGDR, FRMD4B, ANXA2, EOMES, CADM1, MAF, TPRG1, NBEAL2, PPP2R2B, PELO, SLC4A4, KLRF1, FOSL2, RGS2, TGFBR3, PRF1, MYO1F, GAB3, C17orf66, MICAL2, CYTH3, TOX, HLA-DRA, SYNE1, WEE1, PYHIN1, F2R, PLD1, THBS1, CD58, FAS, NETO2, CXCR6, ST6GALNAC2, DUSP4, AUTS2, C1orf21, KLRG1, TNIP3, GZMA, PRR5L, PRDM1, ST8SIA6, PLXND1, PTPRM, GFPT2, MYBL1, SLAMF7, FLJ16686, GNLY, ZEB2, CST7, IL18RAP, CCL5, KLRD1 и KLRB1. В некоторых вариантах осуществления балл набора генов (постепенно активируемые при дифференцировке в клетки памяти) определяют с помощью секвенирования РНК, например, секвенирования РНК одиночных клеток (scRNA-seq), как, например, проиллюстрировано в примере 7 в отношении фиг. 26B. В некоторых вариантах осуществления балл набора генов (постепенно активируемые при дифференцировке в клетки памяти) рассчитывают с использованием среднего логарифмически нормализованного значения экспрессии гена для всех генов в наборе генов.

Используемый в данном документе термин "балл набора генов (активируемые в TEM относительно подавляемых в TN)" для клетки относится к баллу, который отражает степень, в которой клетка демонстрирует фенотип эффекторной Т-клетки памяти (TEM) по сравнению с фенотипом необученной Т-клетки (TN). Более высокий балл набора генов (активируемые в TEM относительно подавляемых в TN) указывает на увеличение выраженности фенотипа TEM, тогда как более низкий балл набора генов (активируемые в TEM относительно подавляемых в TN) указывает на увеличение выраженности фенотипа TN. В некоторых вариантах осуществления балл набора генов (активируемые в TEM относительно подавляемых в TN) определяют путем измерения экспрессии одного или нескольких генов, которые активируются в TEM-клетках и/или подавляются в TN-клетках, например, одного или нескольких генов, выбранных из группы, состоящей из MYO5A, MXD4, STK3, S1PR5, GLCCI1, CCR3, SOX13, KRTAP5-2, PEA15, PARP8, RNF166, UEVLD, LIMK1, SLC6A6, SV2A, KPNA2, OSBPL7, ST7, GGA2, PI4K2A, CD68, ZAK, RORA, TGFBI, DNAJC1, JOSD1, ZFYVE28, LRP8, OSBPL3, CMIP, NAT13, TGFB1, ANTXR2, NR4A3, RDX, ADCY9, CHN1, CD300A, SCD5, PTPN22, LGALS1, RASGEF1A, GCNT1, GLUL, ABCA2, CLDND1, PAM, CLCF1, MXRA7, CLSTN3, ACOT9, METRNL, BMPR1A, LRIG1, APOBEC3G, CACNB3, RNF19A, RAB27A, FADS3, ACTN4, TBKBP1, FAM53B, MAN1A1, FAM38A, GRLF1, B4GALT5, WIPI1, DUSP2, ANXA5, AHNAK, CLIC1, MAP3K5, ST8SIA1, TARP, ADAM8, MATK, SLFN12L, PIK3R3, FAM46C, ANXA2P2, CTNNA1, NPC1, SH2D2A, ERN1, YPEL1, TBX21, STOM, PHACTR2, GBP5, ADRB2, PIK3AP1, DUSP10, PTGDR, EOMES, MAF, TPRG1, NBEAL2, NCAPH, SLC4A4, FOSL2, RGS2, TGFBR3, MYO1F, C17orf66, CYTH3, WEE1, PYHIN1, F2R, THBS1, CD58, AUTS2, FAM129A, TNIP3, GZMA, PRR5L, PRDM1, PLXND1, PTPRM, GFPT2, MYBL1, SLAMF7, ZEB2, CST7, CCL5, GZMK и KLRB1. В некоторых вариантах осуществления балл набора генов (активируемые в TEM относительно подавляемых в TN) определяют с помощью секвенирования РНК, например, секвенирования РНК одиночных клеток (scRNA-seq), как, например, проиллюстрировано в примере 7 в отношении фиг. 26C. В некоторых вариантах осуществления балл набора генов (активируемые в TEM относительно подавляемых в TN) рассчитывают с использованием среднего логарифмически нормализованного значения экспрессии гена для всех генов в наборе генов.

Применительно к значениям балла набора генов (например, медианным значениям балла набора генов), если положительный балл набора генов уменьшить на 100%, получим значение 0. Если отрицательный балл набора генов увеличить на 100%, получим значение 0. Например, на фиг. 25A медианный балл набора генов для образца в день 1 составляет -0,084; медианный балл набора генов для образца в день 9 составляет 0,035; и медианный балл набора генов для исходного образца составляет -0,1. На фиг. 25A увеличение медианного балла набора генов для исходного образца на 100% приводит к получению значения балла набора генов, составляющего 0; и увеличение медианного балла набора генов для исходного образца на 200% приводит к получению значения балла набора генов, составляющего 0,1. На фиг. 25A уменьшение медианного балла набора генов для образца в день 9 на 100% приводит к получению значения балла набора генов, составляющего 0; и уменьшение медианного балла набора генов для образца в день 9 на 200% приводит к получению значения балла набора генов, составляющего -0,035.

Используемый в данном документе термин "гранула" относится к дискретной частице с твердой поверхностью, размер которой находится в пределах от примерно 0,1 мкм до нескольких миллиметров в диаметре. Гранулы могут быть сферическими (например, микросферы) или иметь неправильную форму. Гранулы могут содержать разнообразные материалы, включающие без ограничения парамагнитные материалы, керамику, пластик, стекло, полистирол, метилстирол, акриловые полимеры, титан, латекс, Sepharose™, целлюлозу, нейлон и т. п. В некоторых вариантах осуществления гранулы представляют собой относительно однородные сферические суперпарамагнитные полистирольные гранулы диаметром приблизительно 4,5 мкм, например, покрытые смесью антител к CD3 (например, CD3-эпсилон) и CD28, например, ковалентно связанные с ней. В некоторых вариантах осуществления гранулы представляют собой Dynabeads®. В некоторых вариантах осуществления как антитела к CD3, так и антитела к CD28, связаны с одной и той же гранулой, имитируя стимуляцию T-клетки антигенпрезентирующими клетками. Свойство Dynabeads® и применение Dynabeads® для выделения и размножения клеток хорошо известны из уровня техники, например, см., Neurauter et al., Cell isolation and expansion using Dynabeads, Adv Biochem Eng Biotechnol. 2007;106:41-73, включенную в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Используемый в данном документе термин "наноматрица" относится к наноструктуре, содержащей матрицу из подвижных полимерных цепей. Размер наноматрицы составляет от 1 до 500 нм, например, от 10 до 200 нм. В некоторых вариантах осуществления матрица из подвижных полимерных цепей присоединена к одному или нескольким агонистам, которые передают сигналы активации к T-клеткам, например, агонистам, представляющим собой антитела к CD3 и/или антитела к CD28. В некоторых вариантах осуществления наноматрица предусматривает коллоидную полимерную наноматрицу, присоединенную, например, ковалентно присоединенную, к агонисту одной или нескольких стимулирующих молекул и/или агонисту одной или нескольких костимулирующих молекул. В некоторых вариантах осуществления агонист одной или нескольких стимулирующих молекул представляет собой агонист CD3 (например, агонистическое антитело к CD3). В некоторых вариантах осуществления агонист одной или нескольких костимулирующих молекул представляет собой агонист CD28 (например, агонистическое антитело к CD28). В некоторых вариантах осуществления наноматрица характеризуется отсутствием твердой поверхности, например, в качестве точки присоединения агонистов, таких как антитела к CD3 и/или антитела к CD28. В некоторых вариантах осуществления наноматрица представляет собой наноматрицу, раскрытую в WO2014/048920A1 или предоставляемую в наборе MACS® GMP TransAct™ для T-клеток от Miltenyi Biotec GmbH, включенных в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. MACS® GMP TransAct™ для T-клеток состоит из коллоидной полимерной наноматрицы, ковалентно присоединенной к гуманизированным рекомбинантным агонистическим антителам к CD3 и CD28 человека.

Ниже более подробно описаны различные варианты осуществления композиций и способов, представленных в данном документе. Дополнительные определения изложены по всему тексту настоящего описания.

Описание

В данном документе предусмотрены композиции и способы применения для лечения заболевания, такого как рак, с помощью клеток, экспрессирующих один или несколько химерных антигенных рецепторов (CAR). В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрена клетка (например, иммунная эффекторная клетка, например, T-клетка или NK-клетка), сконструированная таким образом, что она экспрессирует один или несколько CAR, где CAR-T-клетка ("CAR-T") или CAR-NK-клетка демонстрирует противоопухолевое свойство.

В некоторых вариантах осуществления клетка экспрессирует по меньшей мере два CAR. В некоторых вариантах осуществления клетка экспрессирует первый CAR, который связывается с первым антигеном, и второй CAR, который связывается со вторым антигеном. В некоторых вариантах осуществления первый антиген и второй антиген являются разными. В некоторых вариантах осуществления первый антиген представляет собой BCMA. В некоторых вариантах осуществления первый CAR представляет собой CAR для BCMA, содержащий последовательность CDR, VH, VL, scFv или CAR, раскрытую в данном документе, например, последовательность, раскрытую в таблицах 3-15, 19, 20, 22 и 26, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, например, CAR для BCMA, раскрытый в данном документе. В некоторых вариантах осуществления второй антиген представляет собой CD19. В некоторых вариантах осуществления второй антиген представляет собой CAR для CD19, содержащий последовательность CDR, VH, VL, scFv или CAR, раскрытую в данном документе, например, последовательность, раскрытую в таблицах 2, 19 и 22, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней, например, CAR для CD19, раскрытый в данном документе. В некоторых вариантах осуществления первый CAR и второй CAR экспрессируются последовательностями нуклеиновой кислоты, расположенными в одной молекуле нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая первый CAR, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая второй CAR, разделены последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей сайт саморасщепления, например, сайт P2A, сайт Т2A, сайт Е2A или сайт F2A. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку, экспрессирующую двойные CAR, раскрытые в данном документе. В некоторых вариантах осуществления первый CAR и второй CAR экспрессируются последовательностями нуклеиновой кислоты, расположенными в отдельных молекулах нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления клетка сконструирована с использованием системы котрансдукции, раскрытой в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления клетка экспрессирует CAR, который связывается с первым антигеном и вторым антигеном. В некоторых вариантах осуществления CAR представляет собой CAR в формате диатела, раскрытый в данном документе. В некоторых вариантах осуществления CAR содержит связывающий домен, который содержит первую VH (VH1), первую VL (VL1), вторую VH (VH2) и вторую VL (VL2). В некоторых вариантах осуществления VH1 и VL1 связываются с первым антигеном, а VH2 и VL2 связываются со вторым антигеном. В некоторых вариантах осуществления VH1, VL1, VH2 и VL2 расположены в следующей конфигурации от N-конца до C-конца: VH1 - необязательно линкер 1 ("L1") - VH2 - необязательно линкер 2 ("L2") - VL2 - необязательно линкер 3 ("L3") - VL1, VH1 - необязательно L1 - VL2 - необязательно L2 - VH2 - необязательно L3 - VL1, VL1 - необязательно L1 - VH2 - необязательно L2 - VL2 - необязательно L3 - VH1, VL1 - необязательно L1 - VL2 - необязательно L2 - VH2 - необязательно L3 - VH1, VH2 - необязательно L1 - VH1 - необязательно L2 - VL1 - необязательно L3 - VL2, VH2 - необязательно L1 - VL1 - необязательно L2 - VH1 - необязательно L3 - VL2, VL2 - необязательно L1 - VH1 - необязательно L2 - VL1 - необязательно L3 - VH2 или VL2 - необязательно L1 - VL1 - необязательно L2 - VH1 - необязательно L3 - VH2.

В некоторых вариантах осуществления в CAR по настоящему изобретению антигенсвязывающий домен объединен с внутриклеточной сигнальной молекулой. Например, в некоторых вариантах осуществления внутриклеточная сигнальная молекула содержит без ограничения дзета-цепь CD3, сигнальные модули 4-1BB и CD28 и их комбинации.

Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрены композиции на основе CAR и их применение в лекарственных препаратах или способах лечения, среди прочих заболеваний, рака, или любого злокачественного новообразования, или аутоиммунных заболеваний.

Химерный антигенный рецептор (CAR)

В настоящем изобретении предусмотрены иммунные эффекторные клетки (например, T-клетки, NK-клетки), сконструированные таким образом, что они содержат один или несколько CAR, которые направляют иммунные эффекторные клетки на раковое образование. Это достигается с помощью антигенсвязывающего домена в CAR, который является специфичным в отношении антигена, ассоциированного с раком. Существует два класса антигенов, ассоциированных с раком (опухолевых антигенов), на которые могут нацеливаться CAR, описанные в данном документе: (1) антигены, ассоциированные с раком, которые экспрессируются на поверхности раковых клеток; и (2) антигены, ассоциированные с раком, которые сами по себе являются внутриклеточными, однако фрагменты (пептиды) такого антигена презентируются на поверхности раковых клеток с помощью MHC (главного комплекса гистосовместимости).

Соответственно, иммунная эффекторная клетка, например, полученная посредством способа, описанного в данном документе, может быть сконструирована таким образом, чтобы она содержала CAR, нацеливающийся на один из следующих антигенов, ассоциированных с раком (опухолевых антигенов): CD19, CD123, CD22, CD30, CD171, CS-1, CLL-1, CD33, EGFRvIII, GD2, GD3, BCMA, Ag Tn, PSMA, ROR1, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, IL-13Ra2, мезотелин, IL-11Ra, PSCA, VEGFR2, антиген Y системы Льюис, CD24, PDGFR-бета, PRSS21, SSEA-4, CD20, рецептор фолиевой кислоты альфа, ERBB2 (Her2/neu), MUC1, EGFR, NCAM, простазу, PAP, ELF2M, эфрин B2, рецептор IGF-I, CAIX, LMP2, gp100, bcr-abl, тирозиназу, EphA2, фукозил-GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-ацетил-GD2, рецептор фолиевой кислоты бета, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, TSHR, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, полисиаловую кислоту, PLAC1, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, NY-ESO-1, LAGE-1a, легумаин, E6 и E7 HPV, MAGE-A1, MAGE A1, ETV6-AML, белок спермы 17, XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos-родственный антиген 1, p53, мутантный p53, простеин, сурвивин и теломеразу, PCTA-1/галектин 8, MelanA/MART1, мутантный Ras, hTERT, антигены саркомы с точечными разрывами при транслокации, ML-IAP, ERG (продукт слитого гена TMPRSS2-ETS), NA17, PAX3, андрогеновый рецептор, циклин B1, MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B1, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, обратную транскриптазу теломеразы человека, RU1, RU2, кишечную карбоксилэстеразу и мутантный вариант hsp70-2.

Последовательности из неограничивающих примеров различных компонентов, которые могут быть частью молекулы CAR, описанной в данном документе, перечислены в таблице 1, где "а. к." обозначает аминокислоты, а "н. к." обозначает нуклеиновые кислоты, которые кодируют соответствующий пептид.

Таблица 1. Последовательности различных компонентов CAR SEQ ID NO Описание Последовательность SEQ ID NO: 11 Промотор гена EF-1α
(н. к.) CGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA SEQ ID NO: 1 Лидерная последовательность (а. к.) MALPVTALLLPLALLLHAARP SEQ ID NO: 12 Лидерная последовательность (н. к.) ATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCATGCCGCTAGACCC SEQ ID NO: 199 Лидерная последовательность (н. к.) Atggccctccctgtcaccgccctgctgcttccgctggctcttctgctccacgccgctcggccc SEQ ID NO: 351 Лидерная последовательность (а. к.) MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP SEQ ID NO: 352 Лидерная последовательность (н. к.) atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatccca SEQ ID NO: 353 Лидерная последовательность (н. к.) ATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAGCTGCCCCACCCCGCCTTTCTGCTGATCCCC SEQ ID NO: 2 Шарнирная область CD8 (а. к.) TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD SEQ ID NO: 13 Шарнирная область CD8 (н. к.) ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT SEQ ID NO: 3 Шарнирная область Ig4 (а. к.) ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM SEQ ID NO: 14 Шарнирная область Ig4 (н. к.) GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG SEQ ID NO: 4 Шарнирная область IgD (а. к.) RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDH SEQ ID NO: 15 Шарнирная область IgD (н. к.) AGGTGGCCCGAAAGTCCCAAGGCCCAGGCATCTAGTGTTCCTACTGCACAGCCCCAGGCAGAAGGCAGCCTAGCCAAAGCTACTACTGCACCTGCCACTACGCGCAATACTGGCCGTGGCGGGGAGGAGAAGAAAAAGGAGAAAGAGAAAGAAGAACAGGAAGAGAGGGAGACCAAGACCCCTGAATGTCCATCCCATACCCAGCCGCTGGGCGTCTATCTCTTGACTCCCGCAGTACAGGACTTGTGGCTTAGAGATAAGGCCACCTTTACATGTTTCGTCGTGGGCTCTGACCTGAAGGATGCCCATTTGACTTGGGAGGTTGCCGGAAAGGTACCCACAGGGGGGGTTGAGGAAGGGTTGCTGGAGCGCCATTCCAATGGCTCTCAGAGCCAGCACTCAAGACTCACCCTTCCGAGATCCCTGTGGAACGCCGGGACCTCTGTCACATGTACTCTAAATCATCCTAGCCTGCCCCCACAGCGTCTGATGGCCCTTAGAGAGCCAGCCGCCCAGGCACCAGTTAAGCTTAGCCTGAATCTGCTCGCCAGTAGTGATCCCCCAGAGGCCGCCAGCTGGCTCTTATGCGAAGTGTCCGGCTTTAGCCCGCCCAACATCTTGCTCATGTGGCTGGAGGACCAGCGAGAAGTGAACACCAGCGGCTTCGCTCCAGCCCGGCCCCCACCCCAGCCGGGTTCTACCACATTCTGGGCCTGGAGTGTCTTAAGGGTCCCAGCACCACCTAGCCCCCAGCCAGCCACATACACCTGTGTTGTGTCCCATGAAGATAGCAGGACCCTGCTAAATGCTTCTAGGAGTCTGGAGGTTTCCTACGTGACTGACCATT SEQ ID NO: 6 Трансмембранный домен CD8 (а. к.) IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC SEQ ID NO: 17 Трансмембранный домен CD8 (н. к.) ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC SEQ ID NO: 7 Внутриклеточный домен 4-1BB (а. к) KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL SEQ ID NO: 18 Внутриклеточный домен 4-1BB (н. к.) AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG SEQ ID NO: 8 CD27 (а. к.) QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP SEQ ID NO: 19 CD27 (н. к.) AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC SEQ ID NO: 9 CD3-дзета (а. к.)
(с мутацией Q/K) RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 20 CD3-дзета (н. к.)
(с мутацией Q/K) AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC SEQ ID NO: 10 CD3-дзета (а. к.)
(эталонная последовательность NM_000734.3 в NCBI) RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 21 CD3-дзета (н. к.)
(эталонная последовательность NM_000734.3 в NCBI) AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC SEQ ID NO: 36 Внутриклеточный домен CD28 (аминокислотная последовательность) RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS SEQ ID NO: 37 Внутриклеточный домен CD28 (нуклеотидная последовательность) AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC SEQ ID NO: 38 Внутриклеточный домен ICOS (аминокислотная последовательность) T K K K Y S S S V H D P N G E Y M F M R A V N T A K K S R L T D V T L SEQ ID NO: 39 Внутриклеточный домен ICOS (нуклеотидная последовательность) ACAAAAAAGAAGTATTCATCCAGTGTGCACGACCCTAACGGTGAATACATGTTCATGAGAGCAGTGAACACAGCCAAAAAATCCAGACTCACAGATGTGACCCTA SEQ ID NO: 5 Шарнирная область/линкер GS (а. к.) GGGGSGGGGS SEQ ID NO: 16 Шарнирная область/линкер GS (н. к.) GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC SEQ ID NO: 40 Шарнирная область/линкер GS (н. к.) GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGGGGTTCC SEQ ID NO: 25 Линкер GGGGS SEQ ID NO: 26 Линкер (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n, где n=1-6, например, GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS SEQ ID NO: 27 Линкер GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO: 28 Линкер GGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO: 29 Линкер GGGS SEQ ID NO: 41 Линкер (Gly-Gly-Gly-Ser)n где n представляет собой положительные целое число, которое равняется до или больше 1 SEQ ID NO: 42 Линкер (Gly-Gly-Gly-Ser)n, где n=1-10, например, GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS SEQ ID NO: 43 Линкер GSTSGSGKPGSGEGSTKG SEQ ID NO: 30 Поли(A) (A)₅₀₀₀
Эта последовательность может охватывать 50-5000 адениновых оснований. SEQ ID NO: 31 Поли(T) (T)₁₀₀ SEQ ID NO: 32 Поли(T) (T)₅₀₀₀
Эта последовательность может охватывать 50-5000 тиминовых оснований. SEQ ID NO: 33 Поли(A) (A)₅₀₀₀
Эта последовательность может охватывать 100-5000 адениновых оснований. SEQ ID NO: 34 Поли(A) (A)₄₀₀
Эта последовательность может охватывать 100-400 адениновых оснований. SEQ ID NO: 35 Поли(A) (A)₂₀₀₀
Эта последовательность может охватывать 50-2000 адениновых оснований. SEQ ID NO: 22 CAR на основе PD1 (а. к.) pgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlvtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr SEQ ID NO: 23 CAR на основе PD-1 (н. к.)
(ECD PD1 подчеркнут) atggccctccctgtcactgccctgcttctccccctcgcactcctgctccacgccgctagaccacccggatggtttctggactctccggatcgcccgtggaatcccccaaccttctcaccggcactcttggttgtgactgagggcgataatgcgaccttcacgtgctcgttctccaacacctccgaatcattcgtgctgaactggtaccgcatgagcccgtcaaaccagaccgacaagctcgccgcgtttccggaagatcggtcgcaaccgggacaggattgtcggttccgcgtgactcaactgccgaatggcagagacttccacatgagcgtggtccgcgctaggcgaaacgactccgggacctacctgtgcggagccatctcgctggcgcctaaggcccaaatcaaagagagcttgagggccgaactgagagtgaccgagcgcagagctgaggtgccaactgcacatccatccccatcgcctcggcctgcggggcagtttcagaccctggtcacgaccactccggcgccgcgcccaccgactccggccccaactatcgcgagccagcccctgtcgctgaggccggaagcatgccgccctgccgccggaggtgctgtgcatacccggggattggacttcgcatgcgacatctacatttgggctcctctcgccggaacttgtggcgtgctccttctgtccctggtcatcaccctgtactgcaagcggggtcggaaaaagcttctgtacattttcaagcagcccttcatgaggcccgtgcaaaccacccaggaggaggacggttgctcctgccggttccccgaagaggaagaaggaggttgcgagctgcgcgtgaagttctcccggagcgccgacgcccccgcctataagcagggccagaaccagctgtacaacgaactgaacctgggacggcgggaagagtacgatgtgctggacaagcggcgcggccgggaccccgaaatgggcgggaagcctagaagaaagaaccctcaggaaggcctgtataacgagctgcagaaggacaagatggccgaggcctactccgaaattgggatgaagggagagcggcggaggggaaaggggcacgacggcctgtaccaaggactgtccaccgccaccaaggacacatacgatgccctgcacatgcaggcccttccccctcgc SEQ ID NO: 24 CAR на основе PD-1 с сигнальной последовательностью (а. к.)
(ECD PD1 подчеркнут) Malpvtalllplalllhaarppgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlvtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен содержит внеклеточный домен или его противолигандсвязывающий фрагмент из молекулы, которая связывает противолиганд на поверхности клетки-мишени.

Иммунные эффекторные клетки могут содержать рекомбинантную ДНК-конструкцию, содержащую последовательности, кодирующие CAR, где CAR содержит антигенсвязывающий домен (например, антитело или фрагмент антитела, TCR или фрагмент TCR), который специфично связывается с опухолевым антигеном, например, опухолевым антигеном, описанным в данном документе, и внутриклеточный сигнальный домен. Внутриклеточный сигнальный домен может содержать костимулирующий сигнальный домен и/или первичный сигнальный домен, например, дзета-цепь. Как описано в другом месте, способы, описанные в данном документе, могут включать трансдукцию клетки, например, из популяции, истощенной по регуляторным T-клеткам, с помощью нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, например, CAR, описанный в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления CAR содержит scFv-домен, где перед scFv может располагаться необязательная лидерная последовательность, такая как представленная под SEQ ID NO: 1, и за ней может располагаться необязательная последовательность шарнирной области, такая как представленная под SEQ ID NO: 2, или SEQ ID NO: 36, или SEQ ID NO: 38, трансмембранная область, такая как представленная под SEQ ID NO: 6, внутриклеточный сигнальный домен, который содержит SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 16, и последовательность CD3-дзета, которая содержит SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10, например, где домены являются смежными и находятся в одной и той же рамке считывания, образуя единый слитый белок.

В некоторых вариантах осуществления иллюстративные конструкции CAR содержат необязательную лидерную последовательность (например, лидерную последовательность, описанную в данном документе), внеклеточный антигенсвязывающий домен (например, антигенсвязывающий домен, описанный в данном документе), шарнирную область (например, шарнирную область, описанную в данном документе), трансмембранный домен (например, трансмембранный домен, описанный в данном документе) и внутриклеточный стимулирующий домен (например, внутриклеточный стимулирующий домен, описанный в данном документе). В некоторых вариантах осуществления иллюстративная конструкция CAR содержит необязательную лидерную последовательность (например, лидерную последовательность, описанную в данном документе), внеклеточный антигенсвязывающий домен (например, антигенсвязывающий домен, описанный в данном документе), шарнирную область (например, шарнирную область, описанную в данном документе), трансмембранный домен (например, трансмембранный домен, описанный в данном документе), внутриклеточный костимулирующий сигнальный домен (например, костимулирующий сигнальный домен, описанный в данном документе) и/или внутриклеточный первичный сигнальный домен (например, первичный сигнальный домен, описанный в данном документе).

Иллюстративная лидерная последовательность представлена под SEQ ID NO: 1. Следующие иллюстративные лидерные последовательности включают представленные под SEQ ID NO: 351 или кодируются представленными под SEQ ID NO: 352 или 353. Иллюстративная последовательность шарнирной области/спейсера представлена под SEQ ID NO: 2, или SEQ ID NO: 36, или SEQ ID NO: 38. Иллюстративная последовательность трансмембранного домена представлена под SEQ ID NO: 6. Иллюстративная последовательность внутриклеточного сигнального домена белка 4-1BB представлена под SEQ ID NO: 7. Иллюстративная последовательность внутриклеточного сигнального домена CD27 представлена под SEQ ID NO:16. Иллюстративная последовательность домена CD3-дзета представлена под SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO:10.

В некоторых вариантах осуществления иммунная эффектoрная клетка содержит рекомбинантную конструкцию нуклеиновой кислоты, содержащую молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR, где молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую антигенсвязывающий домен, где последовательность является смежной с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей внутриклеточный сигнальный домен, и находится с ней в одной и той же рамке считывания. Иллюстративный внутриклеточный сигнальный домен, который может использоваться в CAR, включает без ограничения один или несколько внутриклеточных сигнальных доменов, например, CD3-дзета, CD28, CD27, 4-1BB и т. п. В некоторых случаях CAR может содержать любую комбинацию из CD3-дзета, CD28, 4-1BB и т. п.

Последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие требуемые молекулы, можно получить с помощью рекомбинантных способов, известных из уровня техники, как, например, путем скрининга библиотек из клеток, экспрессирующих молекулу нуклеиновой кислоты, путем получения молекулы нуклеиновой кислоты из вектора, о котором известно, что он ее содержит, или путем непосредственного выделения из клеток и тканей, содержащих ее, с помощью стандартных методик. В качестве альтернативы нуклеиновая кислота, представляющая интерес, может быть получена путем синтеза, а не клонирования.

Нуклеиновые кислоты, кодирующие CAR, можно вводить в иммунные эффекторные клетки с помощью, например, ретровирусных или лентивирусных векторных конструкций.

Нуклеиновые кислоты, кодирующие CAR, также можно вводить в иммунную эффекторную клетку с помощью, например, РНК-конструкции, которая может быть непосредственно введена в клетку путем трансфекции. Способ получения мРНК для применения в трансфекции включает обеспечение транскрипции in vitro (IVT) матрицы с использованием специально разработанных праймеров с последующим добавлением поли(А) с получением конструкции, содержащей последовательности 3'- и 5'-нетранслируемых областей ("UTR") (например, 3'- и/или 5'-UTR, описанных в данном документе), 5'-кэп (например, 5'-кэп, описанный в данном документе) и/или участок внутренней посадки рибосомы (IRES) (например, IRES, описанный в данном документе), нуклеиновую кислоту, которая должна экспрессироваться, и поли(A)-хвост, как правило, длиной 50-2000 оснований (например, описанный в примерах, например, под SEQ ID NO: 35). С помощью РНК, полученной таким образом, можно эффективно трансфицировать различные типы клеток. В некоторых вариантах осуществления матрица содержит последовательности для CAR. В некоторых вариантах осуществления вектор на основе РНК, кодирующей CAR, вводят путем трансдукции в клетку, например, T-клетку, с помощью электропорации.

Антигенсвязывающий домен

В некоторых вариантах осуществления множество иммунных эффекторных клеток, например, популяция, истощенная по регуляторным T-клеткам, содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR, которая содержит специфичный в отношении мишени связывающий элемент, иначе называемый антигенсвязывающим доменом. Выбор связывающего элемента зависит от типа и количества лигандов, которые определяют поверхность клетки-мишени. Например, антигенсвязывающий домен может быть выбран таким образом, чтобы он распознавал лиганд, который выступает в качестве маркера клеточной поверхности на клетках-мишенях, ассоциированных с конкретным болезненным состоянием. Таким образом, примеры маркеров клеточной поверхности, которые могут выступать в качестве лигандов для антигенсвязывающего домена в CAR, описанного в данном документе, включают маркеры, ассоциированные с вирусными, бактериальными и паразитарными инфекциями, аутоиммунным заболеванием и раковыми клетками.

В некоторых вариантах осуществления часть CAR, содержащая антигенсвязывающий домен, содержит антигенсвязывающий домен, который нацеливается на опухолевый антиген, например, на опухолевый антиген, описанный в данном документе.

Антигенсвязывающий домен может представлять собой любой домен, который связывается с антигеном, в том числе без ограничения моноклональное антитело, поликлональное антитело, рекомбинантное антитело, антитело человека, гуманизированное антитело и их функциональный фрагмент, в том числе без ограничения однодоменное антитело, такое как вариабельный домен тяжелой цепи (VH), вариабельный домен легкой цепи (VL) и вариабельный домен (VHH) нанотела верблюдовых, а также альтернативную каркасную структуру, которая, как известно из уровня техники, функционирует в качестве антигенсвязывающего домена, такую как рекомбинантный фибронектиновый домен, T-клеточный рецептор (TCR) или его фрагмент, например, одноцепочечный TCR, и т. п. В некоторых случаях целесообразно, чтобы антигенсвязывающий домен был получен из того же вида, в организме которого в конечном итоге будет применяться CAR. Например, для применения у людей может быть целесообразно, чтобы антигенсвязывающий домен CAR содержал человеческие или гуманизированные остатки в антигенсвязывающем домене антитела или фрагмента антитела.

CAR для CD19

В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе клетка, экспрессирующая CAR, представляет собой клетку, экспрессирующую CAR для CD19 (например, клетку, экспрессирующую CAR, который связывается с CD19 человека).

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен CAR для CD19 характеризуется такой же или сходной специфичностью связывания по сравнению с scFv-фрагментом FMC63, описанным в Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997). В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен CAR для CD19 включает в себя scFv-фрагмент, описанный в Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997).

В некоторых вариантах осуществления CAR для CD19 содержит антигенсвязывающий домен (например, гуманизированный антигенсвязывающий домен) согласно таблице 3 из WO2014/153270, включенной в данный документ посредством ссылки. В WO2014/153270 также описаны способы анализа связывания и эффективности различных конструкций CAR.

В некоторых вариантах осуществления исходная последовательность scFv мыши представляет собой конструкцию CAR19, представленную в публикации согласно PCT WO2012/079000 (включенной в данный документ посредством ссылки). В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий CD19, представляет собой scFv, описанный в WO2012/079000.

В некоторых вариантах осуществления молекула CAR содержит последовательность слитого полипептида, представленную под SEQ ID NO: 12 в публикации согласно PCT WO2012/079000, в которой представлен scFv-фрагмент мышиного происхождения, который специфично связывается с CD19 человека.

В некоторых вариантах осуществления CAR для CD19 содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 12 в публикации согласно PCT WO2012/079000.

В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность представляет собой

Diqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr (SEQ ID NO: 292), или последовательность, по существу гомологичную ей.

В некоторых вариантах осуществления CAR для CD19 имеет обозначение согласно USAN тисагенлеклейсел-T. В ряде вариантов осуществления CTL019 получают посредством генной модификации T-клеток, опосредованной стабильной вставкой путем трансдукции с помощью самоинактивирующегося лентивирусного (LV) вектора, дефектного по репликации, содержащего трансген CTL019 под контролем промотора гена EF-1-альфа. CTL019 может представлять собой смесь положительных и отрицательных по трансгену Т-клеток, которые доставляются субъекту, исходя из процентной доли Т-клеток, положительных по трансгену.

В других вариантах осуществления CAR для CD19 содержит антигенсвязывающий домен (например, гуманизированный антигенсвязывающий домен) согласно таблице 3 из WO2014/153270, включенной в данный документ посредством ссылки.

Гуманизация антитела к CD19 мыши необходима для клинических условий, когда специфические для мышей остатки могут индуцировать ответ с образованием антител человека к антигенам мыши (HAMA) у пациентов, которые получают лечение с помощью CART19, т. е. лечение с помощью T-клеток, трансдуцированных конструкцией CAR19. Получение, определение характеристик и эффективность гуманизированных последовательностей CAR для CD19 описаны в международной заявке WO2014/153270, включенной в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте, включая примеры 1-5 (стр. 115-159).

В некоторых вариантах осуществления молекула CAR представляет собой гуманизированный CAR для CD19, содержащий следующую аминокислотную последовательность: eivmtqspatlslspgeratlscrasqdiskylnwyqqkpgqaprlliyhtsrlhsgiparfsgsgsgtdytltisslqpedfavyfcqqgntlpytfgqgtkleikggggsggggsggggsqvqlqesgpglvkpsetlsltctvsgvslpdygvswirqppgkglewigviwgsettyyqsslksrvtiskdnsknqvslklssvtaadtavyycakhyyyggsyamdywgqgtlvtvss (SEQ ID NO: 293)

В некоторых вариантах осуществления молекула CAR представляет собой гуманизированный CAR для CD19, содержащий следующую аминокислотную последовательность:

eivmtqspatlslspgeratlscrasqdiskylnwyqqkpgqaprlliyhtsrlhsgiparfsgsgsgtdytltisslqpedfavyfcqqgntlpytfgqgtkleikggggsggggsggggsqvqlqesgpglvkpsetlsltctvsgvslpdygvswirqppgkglewigviwgsettyyqsslksrvtiskdnsknqvslklssvtaadtavyycakhyyyggsyamdywgqgtlvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr (sEQ ID NO: 294)

В некоторых вариантах осуществления молекула CAR представляет собой гуманизированный CAR для CD19, содержащий следующую аминокислотную последовательность:

MALPVTALLLPLALLLHAARPEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 349)

В некоторых вариантах осуществления молекула CAR представляет собой гуманизированный CAR для CD19, содержащий следующую аминокислотную последовательность:

EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 350)

В соответствии с настоящим изобретением можно применять любой известный CAR для CD19, например, антигенсвязывающий домен для CD19 из любого известного CAR для CD19. Например, CAR для CD19 LG-740 описан в патенте США № 8399645; патенте США № 7446190; Xu et al., Leuk Lymphoma. 2013 54(2):255-260(2012); Cruz et al., Blood 122(17):2965-2973 (2013); Brentjens et al., Blood, 118(18):4817-4828 (2011); Kochenderfer et al., Blood 116(20):4099-102 (2010); Kochenderfer et al., Blood 122 (25):4129-39 (2013) и 16th Annu Meet Am Soc Gen Cell Ther (ASGCT) (May 15-18, Salt Lake City) 2013, Abst 10.

Иллюстративные CAR для CD19 включают CAR для CD19, описанный в данном документе, или CAR для CD19, описанный в Xu et al. Blood 123.24(2014):3750-9; Kochenderfer et al. Blood 122.25(2013):4129-39, Cruz et al. Blood 122.17(2013):2965-73, NCT00586391, NCT01087294, NCT02456350, NCT00840853, NCT02659943, NCT02650999, NCT02640209, NCT01747486, NCT02546739, NCT02656147, NCT02772198, NCT00709033, NCT02081937, NCT00924326, NCT02735083, NCT02794246, NCT02746952, NCT01593696, NCT02134262, NCT01853631, NCT02443831, NCT02277522, NCT02348216, NCT02614066, NCT02030834, NCT02624258, NCT02625480, NCT02030847, NCT02644655, NCT02349698, NCT02813837, NCT02050347, NCT01683279, NCT02529813, NCT02537977, NCT02799550, NCT02672501, NCT02819583, NCT02028455, NCT01840566, NCT01318317, NCT01864889, NCT02706405, NCT01475058, NCT01430390, NCT02146924, NCT02051257, NCT02431988, NCT01815749, NCT02153580, NCT01865617, NCT02208362, NCT02685670, NCT02535364, NCT02631044, NCT02728882, NCT02735291, NCT01860937, NCT02822326, NCT02737085, NCT02465983, NCT02132624, NCT02782351, NCT01493453, NCT02652910, NCT02247609, NCT01029366, NCT01626495, NCT02721407, NCT01044069, NCT00422383, NCT01680991, NCT02794961 или NCT02456207, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

В некоторых вариантах осуществления CAR для CD19 содержат последовательность, например, CDR, VH, VL, scFv или полную последовательность CAR, раскрытую в таблице 2, или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью с ней.

Таблица 2. Аминокислотные последовательности иллюстративных молекул, связывающихся с CD19 SEQ ID NO Область Последовательность CTL019 295 HCDR1 (Kabat) DYGVS 296 HCDR2 (Kabat) VIWGSETTYYNSALKS 297 HCDR3 (Kabat) HYYYGGSYAMDY 298 LCDR1 (Kabat) RASQDISKYLN 299 LCDR2 (Kabat) HTSRLHS 300 LCDR3 (Kabat) QQGNTLPYT 301 Полная аминокислотная последовательность CTL019 MALPVTALLLPLALLLHAARPdiqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr 302 Полная нуклеотидная последовательность CTL019 atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggagatcacaggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcggatctgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggccaaggaacctcagtcaccgtctcctcaaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc 303 scFv-домен CTL019 Diqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvss Гуманизированный CAR2 295 HCDR1 (Kabat) DYGVS 304 HCDR2 (Kabat) VIWGSETTYYQSSLKS 297 HCDR3 (Kabat) HYYYGGSYAMDY 298 LCDR1 (Kabat) RASQDISKYLN 299 LCDR2 (Kabat) HTSRLHS 300 LCDR3 (Kabat) QQGNTLPYT 293 scFv-домен CAR2 - a. к. (линкер подчеркнут) EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS 305 scFv-домен CAR2 - н. к. GAAATTGTGATGACCCAGTCACCCGCCACTCTTAGCCTTTCACCCGGTGAGCGCGCAACCCTGTCTTGCAGAGCCTCCCAAGACATCTCAAAATACCTTAATTGGTATCAACAGAAGCCCGGACAGGCTCCTCGCCTTCTGATCTACCACACCAGCCGGCTCCATTCTGGAATCCCTGCCAGGTTCAGCGGTAGCGGATCTGGGACCGACTACACCCTCACTATCAGCTCACTGCAGCCAGAGGACTTCGCTGTCTATTTCTGTCAGCAAGGGAACACCCTGCCCTACACCTTTGGACAGGGCACCAAGCTCGAGATTAAAGGTGGAGGTGGCAGCGGAGGAGGTGGGTCCGGCGGTGGAGGAAGCCAGGTCCAACTCCAAGAAAGCGGACCGGGTCTTGTGAAGCCATCAGAAACTCTTTCACTGACTTGTACTGTGAGCGGAGTGTCTCTCCCCGATTACGGGGTGTCTTGGATCAGACAGCCACCGGGGAAGGGTCTGGAATGGATTGGAGTGATTTGGGGCTCTGAGACTACTTACTACCAATCATCCCTCAAGTCACGCGTCACCATCTCAAAGGACAACTCTAAGAATCAGGTGTCACTGAAACTGTCATCTGTGACCGCAGCCGACACCGCCGTGTACTATTGCGCTAAGCATTACTATTATGGCGGGAGCTACGCAATGGATTACTGGGGACAGGGTACTCTGGTCACCGTGTCCAGC 306 CAR2 - полный - а. к. MALPVTALLLPLALLLHAARPEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR 307 CAR2 - полный - н. к. atggccctccctgtcaccgccctgctgcttccgctggctcttctgctccacgccgctcggcccgaaattgtgatgacccagtcacccgccactcttagcctttcacccggtgagcgcgcaaccctgtcttgcagagcctcccaagacatctcaaaataccttaattggtatcaacagaagcccggacaggctcctcgccttctgatctaccacaccagccggctccattctggaatccctgccaggttcagcggtagcggatctgggaccgactacaccctcactatcagctcactgcagccagaggacttcgctgtctatttctgtcagcaagggaacaccctgccctacacctttggacagggcaccaagctcgagattaaaggtggaggtggcagcggaggaggtgggtccggcggtggaggaagccaggtccaactccaagaaagcggaccgggtcttgtgaagccatcagaaactctttcactgacttgtactgtgagcggagtgtctctccccgattacggggtgtcttggatcagacagccaccggggaagggtctggaatggattggagtgatttggggctctgagactacttactaccaatcatccctcaagtcacgcgtcaccatctcaaaggacaactctaagaatcaggtgtcactgaaactgtcatctgtgaccgcagccgacaccgccgtgtactattgcgctaagcattactattatggcgggagctacgcaatggattactggggacagggtactctggtcaccgtgtccagcaccactaccccagcaccgaggccacccaccccggctcctaccatcgcctcccagcctctgtccctgcgtccggaggcatgtagacccgcagctggtggggccgtgcatacccggggtcttgacttcgcctgcgatatctacatttgggcccctctggctggtacttgcggggtcctgctgctttcactcgtgatcactctttactgtaagcgcggtcggaagaagctgctgtacatctttaagcaacccttcatgaggcctgtgcagactactcaagaggaggacggctgttcatgccggttcccagaggaggaggaaggcggctgcgaactgcgcgtgaaattcagccgcagcgcagatgctccagcctacaagcaggggcagaaccagctctacaacgaactcaatcttggtcggagagaggagtacgacgtgctggacaagcggagaggacgggacccagaaatgggcgggaagccgcgcagaaagaatccccaagagggcctgtacaacgagctccaaaaggataagatggcagaagcctatagcgagattggtatgaaaggggaacgcagaagaggcaaaggccacgacggactgtaccagggactcagcaccgccaccaaggacacctatgacgctcttcacatgcaggccctgccgcctcgg 349 CAR 2A -
полная аминокислотная последовательность; сигнальный пептид подчеркнут MALPVTALLLPLALLLHAARPEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR 225 CAR 2A -
аминокислотная последовательность; сигнальный пептид отсутствует EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR 354 CAR 2A - полная последовательность нуклеиновой кислоты; сигнальный пептид и стоп-кодон подчеркнуты atggccctccctgtcaccgccctgctgcttccgctggctcttctgctccacgccgctcggcccgaaattgtgatgacccagtcacccgccactcttagcctttcacccggtgagcgcgcaaccctgtcttgcagagcctcccaagacatctcaaaataccttaattggtatcaacagaagcccggacaggctcctcgccttctgatctaccacaccagccggctccattctggaatccctgccaggttcagcggtagcggatctgggaccgactacaccctcactatcagctcactgcagccagaggacttcgctgtctatttctgtcagcaagggaacaccctgccctacacctttggacagggcaccaagctcgagattaaaggtggaggtggcagcggaggaggtgggtccggcggtggaggaagccaggtccaactccaagaaagcggaccgggtcttgtgaagccatcagaaactctttcactgacttgtactgtgagcggagtgtctctccccgattacggggtgtcttggatcagacagccaccggggaagggtctggaatggattggagtgatttggggctctgagactacttactaccaatcatccctcaagtcacgcgtcaccatctcaaaggacaactctaagaatcaggtgtcactgaaactgtcatctgtgaccgcagccgacaccgccgtgtactattgcgctaagcattactattatggcgggagctacgcaatggattactggggacagggtactctggtcaccgtgtccagcaccactaccccagcaccgaggccacccaccccggctcctaccatcgcctcccagcctctgtccctgcgtccggaggcatgtagacccgcagctggtggggccgtgcatacccggggtcttgacttcgcctgcgatatctacatttgggcccctctggctggtacttgcggggtcctgctgctttcactcgtgatcactctttactgtaagcgcggtcggaagaagctgctgtacatctttaagcaacccttcatgaggcctgtgcagactactcaagaggaggacggctgttcatgccggttcccagaggaggaggaaggcggctgcgaactgcgcgtgaaattcagccgcagcgcagatgctccagcctaccagcaggggcagaaccagctctacaacgaactcaatcttggtcggagagaggagtacgacgtgctggacaagcggagaggacgggacccagaaatgggcgggaagccgcgcagaaagaatccccaagagggcctgtacaacgagctccaaaaggataagatggcagaagcctatagcgagattggtatgaaaggggaacgcagaagaggcaaaggccacgacggactgtaccagggactcagcaccgccaccaaggacacctatgacgctcttcacatgcaggccctgccgcctcggtaa 355 CAR 2А - последовательность нуклеиновой кислоты; сигнальный пептид подчеркнут; стоп-кодон отсутствует atggccctccctgtcaccgccctgctgcttccgctggctcttctgctccacgccgctcggcccgaaattgtgatgacccagtcacccgccactcttagcctttcacccggtgagcgcgcaaccctgtcttgcagagcctcccaagacatctcaaaataccttaattggtatcaacagaagcccggacaggctcctcgccttctgatctaccacaccagccggctccattctggaatccctgccaggttcagcggtagcggatctgggaccgactacaccctcactatcagctcactgcagccagaggacttcgctgtctatttctgtcagcaagggaacaccctgccctacacctttggacagggcaccaagctcgagattaaaggtggaggtggcagcggaggaggtgggtccggcggtggaggaagccaggtccaactccaagaaagcggaccgggtcttgtgaagccatcagaaactctttcactgacttgtactgtgagcggagtgtctctccccgattacggggtgtcttggatcagacagccaccggggaagggtctggaatggattggagtgatttggggctctgagactacttactaccaatcatccctcaagtcacgcgtcaccatctcaaaggacaactctaagaatcaggtgtcactgaaactgtcatctgtgaccgcagccgacaccgccgtgtactattgcgctaagcattactattatggcgggagctacgcaatggattactggggacagggtactctggtcaccgtgtccagcaccactaccccagcaccgaggccacccaccccggctcctaccatcgcctcccagcctctgtccctgcgtccggaggcatgtagacccgcagctggtggggccgtgcatacccggggtcttgacttcgcctgcgatatctacatttgggcccctctggctggtacttgcggggtcctgctgctttcactcgtgatcactctttactgtaagcgcggtcggaagaagctgctgtacatctttaagcaacccttcatgaggcctgtgcagactactcaagaggaggacggctgttcatgccggttcccagaggaggaggaaggcggctgcgaactgcgcgtgaaattcagccgcagcgcagatgctccagcctaccagcaggggcagaaccagctctacaacgaactcaatcttggtcggagagaggagtacgacgtgctggacaagcggagaggacgggacccagaaatgggcgggaagccgcgcagaaagaatccccaagagggcctgtacaacgagctccaaaaggataagatggcagaagcctatagcgagattggtatgaaaggggaacgcagaagaggcaaaggccacgacggactgtaccagggactcagcaccgccaccaaggacacctatgacgctcttcacatgcaggccctgccgcctcgg 356 CAR 2А - последовательность нуклеиновой кислоты; сигнальный пептид отсутствует; стоп-кодон подчеркнут gaaattgtgatgacccagtcacccgccactcttagcctttcacccggtgagcgcgcaaccctgtcttgcagagcctcccaagacatctcaaaataccttaattggtatcaacagaagcccggacaggctcctcgccttctgatctaccacaccagccggctccattctggaatccctgccaggttcagcggtagcggatctgggaccgactacaccctcactatcagctcactgcagccagaggacttcgctgtctatttctgtcagcaagggaacaccctgccctacacctttggacagggcaccaagctcgagattaaaggtggaggtggcagcggaggaggtgggtccggcggtggaggaagccaggtccaactccaagaaagcggaccgggtcttgtgaagccatcagaaactctttcactgacttgtactgtgagcggagtgtctctccccgattacggggtgtcttggatcagacagccaccggggaagggtctggaatggattggagtgatttggggctctgagactacttactaccaatcatccctcaagtcacgcgtcaccatctcaaaggacaactctaagaatcaggtgtcactgaaactgtcatctgtgaccgcagccgacaccgccgtgtactattgcgctaagcattactattatggcgggagctacgcaatggattactggggacagggtactctggtcaccgtgtccagcaccactaccccagcaccgaggccacccaccccggctcctaccatcgcctcccagcctctgtccctgcgtccggaggcatgtagacccgcagctggtggggccgtgcatacccggggtcttgacttcgcctgcgatatctacatttgggcccctctggctggtacttgcggggtcctgctgctttcactcgtgatcactctttactgtaagcgcggtcggaagaagctgctgtacatctttaagcaacccttcatgaggcctgtgcagactactcaagaggaggacggctgttcatgccggttcccagaggaggaggaaggcggctgcgaactgcgcgtgaaattcagccgcagcgcagatgctccagcctaccagcaggggcagaaccagctctacaacgaactcaatcttggtcggagagaggagtacgacgtgctggacaagcggagaggacgggacccagaaatgggcgggaagccgcgcagaaagaatccccaagagggcctgtacaacgagctccaaaaggataagatggcagaagcctatagcgagattggtatgaaaggggaacgcagaagaggcaaaggccacgacggactgtaccagggactcagcaccgccaccaaggacacctatgacgctcttcacatgcaggccctgccgcctcggtaa SEQ ID NO: 417 CAR 2А - последовательность нуклеиновой кислоты; сигнальный пептид отсутствует; стоп-кодон отсутствует gaaattgtgatgacccagtcacccgccactcttagcctttcacccggtgagcgcgcaaccctgtcttgcagagcctcccaagacatctcaaaataccttaattggtatcaacagaagcccggacaggctcctcgccttctgatctaccacaccagccggctccattctggaatccctgccaggttcagcggtagcggatctgggaccgactacaccctcactatcagctcactgcagccagaggacttcgctgtctatttctgtcagcaagggaacaccctgccctacacctttggacagggcaccaagctcgagattaaaggtggaggtggcagcggaggaggtgggtccggcggtggaggaagccaggtccaactccaagaaagcggaccgggtcttgtgaagccatcagaaactctttcactgacttgtactgtgagcggagtgtctctccccgattacggggtgtcttggatcagacagccaccggggaagggtctggaatggattggagtgatttggggctctgagactacttactaccaatcatccctcaagtcacgcgtcaccatctcaaaggacaactctaagaatcaggtgtcactgaaactgtcatctgtgaccgcagccgacaccgccgtgtactattgcgctaagcattactattatggcgggagctacgcaatggattactggggacagggtactctggtcaccgtgtccagcaccactaccccagcaccgaggccacccaccccggctcctaccatcgcctcccagcctctgtccctgcgtccggaggcatgtagacccgcagctggtggggccgtgcatacccggggtcttgacttcgcctgcgatatctacatttgggcccctctggctggtacttgcggggtcctgctgctttcactcgtgatcactctttactgtaagcgcggtcggaagaagctgctgtacatctttaagcaacccttcatgaggcctgtgcagactactcaagaggaggacggctgttcatgccggttcccagaggaggaggaaggcggctgcgaactgcgcgtgaaattcagccgcagcgcagatgctccagcctaccagcaggggcagaaccagctctacaacgaactcaatcttggtcggagagaggagtacgacgtgctggacaagcggagaggacgggacccagaaatgggcgggaagccgcgcagaaagaatccccaagagggcctgtacaacgagctccaaaaggataagatggcagaagcctatagcgagattggtatgaaaggggaacgcagaagaggcaaaggccacgacggactgtaccagggactcagcaccgccaccaaggacacctatgacgctcttcacatgcaggccctgccgcctcgg 357 VH CAGGTCCAGCTGCAGGAATCAGGACCAGGGCTGGTGAAACCTAGCGAAACTCTGAGTCTGACTTGTACCGTCTCCGGGGTGTCTCTGCCAGACTACGGCGTGAGCTGGATCAGACAGCCCCCTGGCAAGTGCCTGGAGTGGATCGGCGTGATCTGGGGCTCCGAGACCACATACTATCAGAGCTCCCTGAAGTCTCGGGTGACCATCTCCAAGGACAACTCTAAGAATCAGGTGAGCCTGAAGCTGTCTAGCGTGACCGCCGCCGATACAGCCGTGTACTATTGTGCCAAGCACTACTATTACGGCGGCTCCTATGCCATGGATTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCCTCT 358 VH CAGGTCCAGCTGCAGGAATCCGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTAGCGAGACCCTGTCCCTGACCTGCACAGTGAGCGGCGTGTCCCTGCCCGATTACGGCGTGAGCTGGATCAGACAGCCCCCTGGCAAGTGTCTGGAGTGGATCGGCGTGATCTGGGGCTCTGAGACCACATACTATCAGTCCTCTCTGAAGAGCAGGGTGACCATCTCTAAGGACAACAGCAAGAATCAGGTGTCCCTGAAGCTGAGCTCCGTGACCGCAGCAGATACAGCCGTGTACTATTGCGCCAAGCACTACTATTACGGCGGCTCCTATGCTATGGATTATTGGGGGCAGGGCACTCTGGTCACTGTCTCATCA 359 VH CAGGTGCAGCTGCAGGAATCTGGACCCGGACTGGTGAAACCTAGTGAAACTCTGTCTCTGACTTGTACCGTCTCAGGGGTCTCACTGCCAGACTACGGCGTGTCCTGGATCAGACAGCCCCCTGGCAAGTGCCTGGAGTGGATCGGCGTGATCTGGGGCTCTGAGACCACATACTATCAGAGCTCCCTGAAGAGCCGGGTGACCATCTCCAAGGACAACTCTAAGAATCAGGTGTCCCTGAAGCTGTCTAGCGTGACCGCCGCCGATACAGCCGTGTACTATTGTGCCAAGCACTACTATTACGGCGGCAGCTATGCCATGGATTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCCTCT 360 VH CAGGTCCAGCTGCAGGAAAGCGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTAGCGAGACCCTGTCCCTGACCTGCACAGTGAGCGGCGTGTCCCTGCCTGATTACGGCGTGTCCTGGATCAGACAGCCCCCTGGCAAGTGTCTGGAGTGGATCGGCGTGATCTGGGGCTCCGAGACCACATACTATCAGTCCTCTCTGAAGTCTAGGGTGACAATCTCTAAGGACAACAGCAAGAATCAGGTGAGCCTGAAGCTGAGCTCCGTGACCGCAGCAGATACAGCCGTGTACTATTGTGCCAAGCACTACTATTACGGCGGCTCTTATGCTATGGATTATTGGGGGCAGGGCACTCTGGTCACTGTCTCAAGC 361 VH CAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCCGAGACACTGTCTCTGACCTGTACAGTGAGCGGCGTGTCCCTGCCCGACTACGGCGTGTCCTGGATCAGACAGCCACCTGGCAAGGGACTGGAGTGGATCGGCGTGATCTGGGGCAGCGAGACCACATACTATCAGAGCTCCCTGAAGTCCAGGGTGACCATCAGCAAGGACAACTCCAAGAATCAGGTGAGCCTGAAGCTGTCTAGCGTGACCGCCGCCGATACAGCCGTGTACTATTGCGCCAAGCACTACTATTACGGCGGCTCCTATGCCATGGATTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACAGTGTCCTCT 362 VH CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCTGAGACCCTGAGCCTGACCTGCACAGTGTCCGGCGTGTCTCTGCCCGATTACGGCGTGTCCTGGATCAGACAGCCACCTGGCAAGGGACTGGAGTGGATCGGCGTGATCTGGGGCTCTGAGACCACATACTATCAGTCTAGCCTGAAGAGCCGGGTGACAATCTCCAAGGACAACTCTAAGAATCAGGTGTCCCTGAAGCTGTCCTCTGTGACCGCCGCCGATACAGCCGTGTACTATTGTGCCAAGCACTACTATTACGGCGGCAGCTATGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGAGCTCC 363 VH CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCTGAGACCCTGAGCCTGACCTGCACAGTGAGCGGCGTGTCCCTGCCCGATTACGGCGTGTCCTGGATCAGACAGCCACCTGGCAAGGGACTGGAGTGGATCGGCGTGATCTGGGGCAGCGAGACCACATACTATCAGTCCTCTCTGAAGTCCAGGGTGACAATCTCCAAGGACAACTCTAAGAATCAGGTGAGCCTGAAGCTGAGCTCCGTGACCGCAGCAGATACAGCCGTGTACTATTGCGCCAAGCACTACTATTACGGCGGCTCCTATGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACAGTGTCTAGC 364 VH CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCCGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCCGAGACACTGTCTCTGACCTGTACAGTGTCCGGCGTGTCTCTGCCCGACTACGGCGTGAGCTGGATCAGACAGCCACCTGGCAAGGGACTGGAGTGGATCGGCGTGATCTGGGGCTCTGAGACCACATACTATCAGTCCTCTCTGAAGAGCCGGGTGACCATCAGCAAGGACAACTCCAAGAATCAGGTGTCCCTGAAGCTGAGCTCCGTGACCGCAGCAGATACAGCCGTGTACTATTGCGCCAAGCACTACTATTACGGCGGCAGCTATGCCATGGATTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCTAGC 365 VL GAGATCGTGATGACCCAGAGCCCAGCCACACTGAGCCTGTCCCCAGGAGAGAGGGCCACACTGTCTTGTAGAGCCAGCCAGGATATCTCCAAGTATCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCTGGACAGGCACCAAGGCTGCTGATCTACCACACCTCTAGACTGCACAGCGGCATCCCTGCCAGGTTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACAGACTATACCCTGACAATCTCTAGCCTGCAGCCAGAGGATTTCGCCGTGTACTTTTGTCAGCAGGGCAATACTCTGCCATACACCTTTGGATGCGGAACTAAACTGGAAATCAAG 366 VL GAAATTGTGATGACCCAGTCCCCCGCTACTCTGTCTCTGTCCCCCGGAGAACGGGCTACTCTGTCTTGTCGCGCTTCCCAGGATATTAGCAAGTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCAGGACAGGCACCAAGGCTGCTGATCTACCACACCTCTCGCCTGCACAGCGGCATCCCTGCACGGTTCTCTGGCAGCGGCTCCGGCACAGACTACACCCTGACAATCAGCTCCCTGCAGCCTGAGGATTTCGCCGTGTACTTTTGCCAGCAGGGCAATACCCTGCCATATACATTTGGCTGTGGCACCAAGCTGGAGATCAAG 367 VL GAGATCGTGATGACCCAGTCCCCAGCCACACTGAGCCTGTCCCCAGGAGAGAGGGCCACCCTGTCTTGTAGAGCCAGCCAGGATATCTCCAAGTATCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCTGGACAGGCACCAAGGCTGCTGATCTACCACACCTCTAGACTGCACAGCGGCATCCCTGCCAGGTTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACAGACTATACCCTGACAATCTCTAGCCTGCAGCCAGAGGATTTCGCCGTGTACTTTTGTCAGCAGGGAAATACTCTGCCATACACCTTTGGATGCGGAACTAAACTGGAAATCAAG 368 VL GAGATTGTGATGACCCAGTCCCCCGCCACCCTGAGTCTGAGCCCCGGAGAACGAGCTACCCTGAGTTGCCGAGCTTCCCAGGACATTTCCAAGTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCAGGACAGGCACCAAGGCTGCTGATCTACCACACCTCTCGCCTGCACAGCGGCATCCCAGCACGGTTCTCTGGCAGCGGCTCCGGCACAGACTACACCCTGACAATCAGCTCCCTGCAGCCTGAGGATTTCGCCGTGTACTTTTGCCAGCAGGGCAATACCCTGCCATATACATTTGGCTGTGGCACCAAGCTGGAGATCAAG 369 VL GAGATCGTGATGACCCAGTCTCCAGCCACACTGTCTCTGAGCCCAGGAGAGAGGGCCACCCTGTCTTGCCGCGCCAGCCAGGATATCTCCAAGTATCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGCACCAAGGCTGCTGATCTACCACACCTCTCGCCTGCACAGCGGCATCCCAGCACGGTTCTCCGGCTCTGGCAGCGGCACAGACTACACCCTGACAATCTCCTCTCTGCAGCCCGAGGATTTCGCCGTGTATTTTTGCCAGCAGGGCAATACCCTGCCTTACACATTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAG 370 VL GAGATCGTGATGACCCAGAGCCCAGCCACACTGAGCCTGTCCCCAGGAGAGAGGGCCACCCTGAGCTGCAGAGCCTCCCAGGATATCTCTAAGTATCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCTGGACAGGCACCAAGGCTGCTGATCTACCACACCAGCAGACTGCACTCCGGCATCCCTGCAAGGTTCTCTGGCAGCGGCTCCGGCACAGACTACACCCTGACAATCTCTAGCCTGCAGCCTGAGGATTTCGCCGTGTATTTTTGTCAGCAGGGCAATACCCTGCCATACACATTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAG 371 VL GAGATCGTGATGACCCAGAGCCCAGCCACACTGTCTCTGAGCCCAGGAGAGAGGGCCACCCTGAGCTGTCGCGCCTCCCAGGATATCTCTAAGTATCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGCACCAAGGCTGCTGATCTACCACACCAGCCGCCTGCACTCCGGCATCCCAGCACGGTTCTCCGGCTCTGGCAGCGGCACAGACTACACCCTGACAATCTCCTCTCTGCAGCCCGAGGATTTCGCCGTGTATTTTTGCCAGCAGGGCAATACCCTGCCTTACACATTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAG 372 VL GAGATCGTGATGACCCAGTCTCCAGCCACACTGAGCCTGTCCCCAGGAGAGAGGGCCACCCTGTCTTGCAGAGCCAGCCAGGATATCTCCAAGTATCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCTGGACAGGCACCAAGGCTGCTGATCTACCACACCTCTAGACTGCACAGCGGCATCCCAGCAAGGTTCTCTGGCAGCGGCTCCGGCACAGACTACACCCTGACAATCTCTAGCCTGCAGCCTGAGGATTTCGCCGTGTATTTTTGCCAGCAGGGCAATACCCTGCCATACACATTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAG SEQ ID NO: 250 VH для CD19 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 251 VL для CD19 EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIK SEQ ID NO: 331 VH QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKCLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 332 VL EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGCGTKLEIK 373 scFv CAR 1 EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYSSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS 374 scFv CAR 3 qvqlqesgpglvkpsetlsltctvsgvslpdygvswirqppgkglewigviwgsettyyssslksrvtiskdnsknqvslklssvtaadtavyycakhyyyggsyamdywgqgtlvtvssggggsggggsggggseivmtqspatlslspgeratlscrasqdiskylnwyqqkpgqaprlliyhtsrlhsgiparfsgsgsgtdytltisslqpedfavyfcqqgntlpytfgqgtkleik 375 scFv CAR 4 qvqlqesgpglvkpsetlsltctvsgvslpdygvswirqppgkglewigviwgsettyyqsslksrvtiskdnsknqvslklssvtaadtavyycakhyyyggsyamdywgqgtlvtvssggggsggggsggggseivmtqspatlslspgeratlscrasqdiskylnwyqqkpgqaprlliyhtsrlhsgiparfsgsgsgtdytltisslqpedfavyfcqqgntlpytfgqgtkleik 376 scFv CAR 5 eivmtqspatlslspgeratlscrasqdiskylnwyqqkpgqaprlliyhtsrlhsgiparfsgsgsgtdytltisslqpedfavyfcqqgntlpytfgqgtkleikggggsggggsggggsggggsqvqlqesgpglvkpsetlsltctvsgvslpdygvswirqppgkglewigviwgsettyyssslksrvtiskdnsknqvslklssvtaadtavyycakhyyyggsyamdywgqgtlvtvss 377 scFv CAR 6 eivmtqspatlslspgeratlscrasqdiskylnwyqqkpgqaprlliyhtsrlhsgiparfsgsgsgtdytltisslqpedfavyfcqqgntlpytfgqgtkleikggggsggggsggggsggggsqvqlqesgpglvkpsetlsltctvsgvslpdygvswirqppgkglewigviwgsettyyqsslksrvtiskdnsknqvslklssvtaadtavyycakhyyyggsyamdywgqgtlvtvss 378 scFv CAR 7 qvqlqesgpglvkpsetlsltctvsgvslpdygvswirqppgkglewigviwgsettyyssslksrvtiskdnsknqvslklssvtaadtavyycakhyyyggsyamdywgqgtlvtvssggggsggggsggggsggggseivmtqspatlslspgeratlscrasqdiskylnwyqqkpgqaprlliyhtsrlhsgiparfsgsgsgtdytltisslqpedfavyfcqqgntlpytfgqgtkleik 379 scFv CAR 8 qvqlqesgpglvkpsetlsltctvsgvslpdygvswirqppgkglewigviwgsettyyqsslksrvtiskdnsknqvslklssvtaadtavyycakhyyyggsyamdywgqgtlvtvssggggsggggsggggsggggseivmtqspatlslspgeratlscrasqdiskylnwyqqkpgqaprlliyhtsrlhsgiparfsgsgsgtdytltisslqpedfavyfcqqgntlpytfgqgtkleik 380 scFv CAR 9 eivmtqspatlslspgeratlscrasqdiskylnwyqqkpgqaprlliyhtsrlhsgiparfsgsgsgtdytltisslqpedfavyfcqqgntlpytfgqgtkleikggggsggggsggggsggggsqvqlqesgpglvkpsetlsltctvsgvslpdygvswirqppgkglewigviwgsettyynsslksrvtiskdnsknqvslklssvtaadtavyycakhyyyggsyamdywgqgtlvtvss 381 scFv CAR 10 qvqlqesgpglvkpsetlsltctvsgvslpdygvswirqppgkglewigviwgsettyynsslksrvtiskdnsknqvslklssvtaadtavyycakhyyyggsyamdywgqgtlvtvssggggsggggsggggsggggseivmtqspatlslspgeratlscrasqdiskylnwyqqkpgqaprlliyhtsrlhsgiparfsgsgsgtdytltisslqpedfavyfcqqgntlpytfgqgtkleik 382 scFv CAR 11 eivmtqspatlslspgeratlscrasqdiskylnwyqqkpgqaprlliyhtsrlhsgiparfsgsgsgtdytltisslqpedfavyfcqqgntlpytfgqgtkleikggggsggggsggggsqvqlqesgpglvkpsetlsltctvsgvslpdygvswirqppgkglewigviwgsettyynsslksrvtiskdnsknqvslklssvtaadtavyycakhyyyggsyamdywgqgtlvtvss 383 scFv CAR 12 qvqlqesgpglvkpsetlsltctvsgvslpdygvswirqppgkglewigviwgsettyynsslksrvtiskdnsknqvslklssvtaadtavyycakhyyyggsyamdywgqgtlvtvssggggsggggsggggseivmtqspatlslspgeratlscrasqdiskylnwyqqkpgqaprlliyhtsrlhsgiparfsgsgsgtdytltisslqpedfavyfcqqgntlpytfgqgtkleik 384 CAR A - полная нуклеотидная последовательность; с лидерной последовательностью atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggactaagttggaaataacaggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggcgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttgggggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc 385 CAR A - полная аминокислотная трансгенная последовательность; с лидерной последовательностью MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR 386 CAR A - нуклеотидная последовательность scFv для CD19 с лидерной последовательностью atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggactaagttggaaataacaggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggcgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca 387 CAR A - аминокислотная последовательность scFv для CD19; с лидерной последовательностью MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVS 388 CAR A - полная нуклеотидная последовательность; лидерная последовательность отсутствует gacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggactaagttggaaataacaggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggcgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttgggggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc 389 CAR A - полная аминокислотная трансгенная последовательность; лидерная последовательность отсутствует DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR 390 CAR A - нуклеотидная последовательность scFv для CD19; лидерная последовательность отсутствует gacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggactaagttggaaataacaggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggcgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca 391 CAR A - аминокислотная последовательность scFv для CD19; лидерная последовательность отсутствует DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS 392 CAR B - полная нуклеотидная последовательность; с лидерной последовательностью ATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAGCTGCCCCACCCCGCCTTTCTGCTGATCCCCGACATCCAGATGACCCAGACCACCTCCAGCCTGAGCGCCAGCCTGGGCGACCGGGTGACCATCAGCTGCCGGGCCAGCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGACGGCACCGTCAAGCTGCTGATCTACCACACCAGCCGGCTGCACAGCGGCGTGCCCAGCCGGTTTAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTACAGCCTGACCATCTCCAACCTGGAACAGGAAGATATCGCCACCTACTTTTGCCAGCAGGGCAACACACTGCCCTACACCTTTGGCGGCGGAACAAAGCTGGAAATCACCGGCAGCACCTCCGGCAGCGGCAAGCCTGGCAGCGGCGAGGGCAGCACCAAGGGCGAGGTGAAGCTGCAGGAAAGCGGCCCTGGCCTGGTGGCCCCCAGCCAGAGCCTGAGCGTGACCTGCACCGTGAGCGGCGTGAGCCTGCCCGACTACGGCGTGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCCAGGAAGGGCCTGGAATGGCTGGGCGTGATCTGGGGCAGCGAGACCACCTACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCATCAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGCAGCTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGAGCAGCGAATCTAAGTACGGACCGCCCTGCCCCCCTTGCCCTATGTTCTGGGTGCTGGTGGTGGTCGGAGGCGTGCTGGCCTGCTACAGCCTGCTGGTCACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGCGGGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAGGGCCAGAATCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGAAGGGAAGAGTACGACGTCCTGGATAAGCGGAGAGGCCGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCTCGGCGGAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGGCGGGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTATCAGGGCCTGTCCACCGCCACCAAGGATACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCAAGG 393 CAR B - полная трансгенная аминокислотная последовательность; с лидерной последовательностью MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSESKYGPPCPPCPMFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR 394 CAR B - нуклеотидная последовательность scFv для CD19 с лидерной последовательностью ATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAGCTGCCCCACCCCGCCTTTCTGCTGATCCCCGACATCCAGATGACCCAGACCACCTCCAGCCTGAGCGCCAGCCTGGGCGACCGGGTGACCATCAGCTGCCGGGCCAGCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGACGGCACCGTCAAGCTGCTGATCTACCACACCAGCCGGCTGCACAGCGGCGTGCCCAGCCGGTTTAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTACAGCCTGACCATCTCCAACCTGGAACAGGAAGATATCGCCACCTACTTTTGCCAGCAGGGCAACACACTGCCCTACACCTTTGGCGGCGGAACAAAGCTGGAAATCACCGGCAGCACCTCCGGCAGCGGCAAGCCTGGCAGCGGCGAGGGCAGCACCAAGGGCGAGGTGAAGCTGCAGGAAAGCGGCCCTGGCCTGGTGGCCCCCAGCCAGAGCCTGAGCGTGACCTGCACCGTGAGCGGCGTGAGCCTGCCCGACTACGGCGTGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCCAGGAAGGGCCTGGAATGGCTGGGCGTGATCTGGGGCAGCGAGACCACCTACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCATCAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGCAGCTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGAGCAGC 395 CAR В - аминокислотная последовательность scFv для CD19; с лидерной последовательностью MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS 396 CAR B - полная нуклеотидная последовательность; лидерная последовательность отсутствует GACATCCAGATGACCCAGACCACCTCCAGCCTGAGCGCCAGCCTGGGCGACCGGGTGACCATCAGCTGCCGGGCCAGCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGACGGCACCGTCAAGCTGCTGATCTACCACACCAGCCGGCTGCACAGCGGCGTGCCCAGCCGGTTTAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTACAGCCTGACCATCTCCAACCTGGAACAGGAAGATATCGCCACCTACTTTTGCCAGCAGGGCAACACACTGCCCTACACCTTTGGCGGCGGAACAAAGCTGGAAATCACCGGCAGCACCTCCGGCAGCGGCAAGCCTGGCAGCGGCGAGGGCAGCACCAAGGGCGAGGTGAAGCTGCAGGAAAGCGGCCCTGGCCTGGTGGCCCCCAGCCAGAGCCTGAGCGTGACCTGCACCGTGAGCGGCGTGAGCCTGCCCGACTACGGCGTGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCCAGGAAGGGCCTGGAATGGCTGGGCGTGATCTGGGGCAGCGAGACCACCTACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCATCAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGCAGCTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGAGCAGCGAATCTAAGTACGGACCGCCCTGCCCCCCTTGCCCTATGTTCTGGGTGCTGGTGGTGGTCGGAGGCGTGCTGGCCTGCTACAGCCTGCTGGTCACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGCGGGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAGGGCCAGAATCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGAAGGGAAGAGTACGACGTCCTGGATAAGCGGAGAGGCCGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCTCGGCGGAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGGCGGGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTATCAGGGCCTGTCCACCGCCACCAAGGATACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCAAGG 397 CAR B - полная аминокислотная трансгенная последовательность; лидерная последовательность отсутствует DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSESKYGPPCPPCPMFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR 398 CAR B - последовательность scFv для CD19; лидерная последовательность отсутствует GACATCCAGATGACCCAGACCACCTCCAGCCTGAGCGCCAGCCTGGGCGACCGGGTGACCATCAGCTGCCGGGCCAGCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGACGGCACCGTCAAGCTGCTGATCTACCACACCAGCCGGCTGCACAGCGGCGTGCCCAGCCGGTTTAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTACAGCCTGACCATCTCCAACCTGGAACAGGAAGATATCGCCACCTACTTTTGCCAGCAGGGCAACACACTGCCCTACACCTTTGGCGGCGGAACAAAGCTGGAAATCACCGGCAGCACCTCCGGCAGCGGCAAGCCTGGCAGCGGCGAGGGCAGCACCAAGGGCGAGGTGAAGCTGCAGGAAAGCGGCCCTGGCCTGGTGGCCCCCAGCCAGAGCCTGAGCGTGACCTGCACCGTGAGCGGCGTGAGCCTGCCCGACTACGGCGTGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCCAGGAAGGGCCTGGAATGGCTGGGCGTGATCTGGGGCAGCGAGACCACCTACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCATCAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGCAGCTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGAGCAGC 399 CAR B - последовательность scFv для CD19; лидерная последовательность отсутствует DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS

CAR для BCMA

В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе клетка, экспрессирующая CAR, представляет собой клетку, экспрессирующую CAR для BCMA (например, клетку, экспрессирующую CAR, который связывается с BCMA человека). Иллюстративные CAR для BCMA могут включать последовательности, раскрытые в таблице 1 или 16 из WO2016/014565, включенной в данный документ посредством ссылки. Конструкция CAR для BCMA может содержать необязательную лидерную последовательность; необязательный шарнирный домен, например, шарнирный домен CD8; трансмембранный домен, например, трансмембранный домен CD8; внутриклеточный домен, например, внутриклеточный домен 4-1BB; и функциональный сигнальный домен, например, домен CD3-дзета. В определенных вариантах осуществления домены являются смежными и находятся в одной и той же рамке считывания, образуя единый слитый белок. В других вариантах осуществления домены находятся в отдельных полипептидах, как, например, в молекуле RCAR, описанной в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления молекула CAR для BCMA содержит одну или несколько CDR, VH, VL, scFv или полноразмерных последовательностей BCMA-1, BCMA-2, BCMA-3, BCMA-4, BCMA-5, BCMA-6, BCMA-7, BCMA-8, BCMA-9, BCMA-10, BCMA-11, BCMA-12, BCMA-13, BCMA-14, BCMA-15, 149362, 149363, 149364, 149365, 149366, 149367, 149368, 149369, BCMA_EBB-C1978-A4, BCMA_EBB-C1978-G1, BCMA_EBB-C1979-C1, BCMA_EBB-C1978-C7, BCMA_EBB-C1978-D10, BCMA_EBB-C1979-C12, BCMA_EBB-C1980-G4, BCMA_EBB-C1980-D2, BCMA_EBB-C1978-A10, BCMA_EBB-C1978-D4, BCMA_EBB-C1980-A2, BCMA_EBB-C1981-C3, BCMA_EBB-C1978-G4, A7D12.2, C11D5.3, C12A3.2 или C13F12.1, раскрытых в WO2016/014565, или последовательность, по существу (например, на 95-99%) идентичную им.

Дополнительные иллюстративные последовательности, нацеливающиеся на BCMA, которые можно использовать в конструкциях CAR для BCMA, раскрыты в WO 2017/021450, WO 2017/011804, WO 2017/025038, WO 2016/090327, WO 2016/130598, WO 2016/210293, WO 2016/090320, WO 2016/014789, WO 2016/094304, WO 2016/154055, WO 2015/166073, WO 2015/188119, WO 2015/158671, US 9243058, US 8920776, US 9273141, US 7083785, US 9034324, US 2007/0049735, US 2015/0284467, US 2015/0051266, US 2015/0344844, US 2016/0131655, US 2016/0297884, US 2016/0297885, US 2017/0051308, US 2017/0051252, US 2017/0051252, WO 2016/020332, WO 2016/087531, WO 2016/079177, WO 2015/172800, WO 2017/008169, US 9340621, US 2013/0273055, US 2016/0176973, US 2015/0368351, US 2017/0051068, US 2016/0368988 и US 2015/0232557, включенных в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В некоторых вариантах осуществления дополнительные иллюстративные конструкции CAR для BCMA получают с использованием последовательностей VH и VL из публикации согласно PCT WO2012/0163805 (содержание которой включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте).

В некоторых вариантах осуществления CAR для BCMA содержат последовательность, например, CDR, VH, VL, scFv или полную последовательность CAR, раскрытую в таблицах 3-15, или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью с ней. В одном аспекте антигенсвязывающий домен содержит антитело человека или фрагмент антитела человека. В некоторых вариантах осуществления человеческий домен, связывающий BCMA, содержит одну или несколько (например, все три) из CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC человеческого домена, связывающего BCMA, описанного в данном документе (например, в таблицах 3-15), и/или одну или несколько (например, все три) из CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC человеческого домена, связывающего BCMA, описанного в данном документе (например, в таблицах 3-15). В некоторых вариантах осуществления человеческий домен, связывающий BCMA, содержит VL человека, описанную в данном документе (например, в таблицах 3, 7, 11, 11a и 12), и/или VH человека, описанную в данном документе (например, в таблицах 3, 7, 11, 11a и 12). В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, представляет собой scFv, содержащий VL и VH с аминокислотной последовательностью из таблиц 3, 7, 11, 11a и 12. В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA (например, scFv), содержит: VL, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности, представленной в таблицах 3, 7, 11, 11a и 12, или последовательность с 95-99% идентичностью с аминокислотной последовательностью из таблиц 3, 7, 11, 11a и 12; и/или VH, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну, две или три модификации (например, замены, например, консервативные замены), но не более 30, 20 или 10 модификаций (например, замен, например, консервативных замен) аминокислотной последовательности, представленной в таблицах 3, 7, 11, 11a и 12, или последовательность с 95-99% идентичностью с аминокислотной последовательностью из таблиц 3, 7, 11, 11a и 12.

Таблица 3. Аминокислотные последовательности и последовательности нуклеиновой кислоты иллюстративных молекул, связывающихся с BCMA, полученных из PALLAS SEQ ID NO Название/
описание Последовательность R1B6 SEQ ID NO: 44 HCDR1 (Kabat) SYAMS SEQ ID NO: 45 HCDR2 (Kabat) AISGSGGSTYYADSVKG SEQ ID NO: 46 HCDR3 (Kabat) REWVPYDVSWYFDY SEQ ID NO: 47 HCDR1 (Chothia) GFTFSSY SEQ ID NO: 48 HCDR2 (Chothia) SGSGGS SEQ ID NO: 46 HCDR3 (Chothia) REWVPYDVSWYFDY SEQ ID NO: 49 HCDR1 (IMGT) GFTFSSYA SEQ ID NO: 50 HCDR2 (IMGT) ISGSGGST SEQ ID NO: 51 HCDR3 (IMGT) ARREWVPYDVSWYFDY SEQ ID NO: 52 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARREWVPYDVSWYFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 53 ДНК VH GAAGTGCAGTTGCTGGAGTCAGGCGGAGGACTGGTGCAGCCCGGAGGATCGCTTCGCTTGAGCTGCGCAGCCTCAGGCTTTACCTTCTCCTCCTACGCCATGTCCTGGGTCAGACAGGCTCCCGGGAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCCATTAGCGGTTCCGGCGGAAGCACTTACTATGCCGACTCTGTGAAGGGCCGCTTCACTATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTATCTCCAAATGAATTCCCTGAGGGCCGAAGATACCGCGGTGTACTACTGCGCTAGACGGGAGTGGGTGCCCTACGATGTCAGCTGGTACTTCGACTACTGGGGACAGGGCACTCTCGTGACTGTGTCCTCC SEQ ID NO: 54 LCDR1 (Kabat) RASQSISSYLN SEQ ID NO: 55 LCDR2 (Kabat) AASSLQS SEQ ID NO: 56 LCDR3 (Kabat) QQSYSTPLT SEQ ID NO: 57 LCDR1 (Chothia) SQSISSY SEQ ID NO: 58 LCDR2 (Chothia) AAS SEQ ID NO: 59 LCDR3 (Chothia) SYSTPL SEQ ID NO: 60 LCDR1 (IMGT) QSISSY SEQ ID NO: 58 LCDR2 (IMGT) AAS SEQ ID NO: 56 LCDR3 (IMGT) QQSYSTPLT SEQ ID NO: 61 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 62 ДНК VL GACATTCAAATGACTCAGTCCCCGTCCTCCCTCTCCGCCTCCGTGGGAGATCGCGTCACGATCACGTGCAGGGCCAGCCAGAGCATCTCCAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAGGCACCGAAGCTCCTGATCTACGCCGCTAGCTCGCTGCAGTCCGGCGTCCCTTCACGGTTCTCGGGATCGGGCTCAGGCACCGACTTCACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAGGACTTCGCGACATACTACTGTCAGCAGTCATACTCCACCCCTCTGACCTTCGGCCAAGGGACCAAAGTGGAGATCAAG SEQ ID NO: 63 Линкер GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO: 64 scFv (VH-линкер-VL) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARREWVPYDVSWYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 65 ДНК scFv GAAGTGCAGTTGCTGGAGTCAGGCGGAGGACTGGTGCAGCCCGGAGGATCGCTTCGCTTGAGCTGCGCAGCCTCAGGCTTTACCTTCTCCTCCTACGCCATGTCCTGGGTCAGACAGGCTCCCGGGAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCCATTAGCGGTTCCGGCGGAAGCACTTACTATGCCGACTCTGTGAAGGGCCGCTTCACTATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTATCTCCAAATGAATTCCCTGAGGGCCGAAGATACCGCGGTGTACTACTGCGCTAGACGGGAGTGGGTGCCCTACGATGTCAGCTGGTACTTCGACTACTGGGGACAGGGCACTCTCGTGACTGTGTCCTCCGGTGGTGGTGGATCGGGGGGTGGTGGTTCGGGCGGAGGAGGATCTGGAGGAGGAGGGTCGGACATTCAAATGACTCAGTCCCCGTCCTCCCTCTCCGCCTCCGTGGGAGATCGCGTCACGATCACGTGCAGGGCCAGCCAGAGCATCTCCAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAGGCACCGAAGCTCCTGATCTACGCCGCTAGCTCGCTGCAGTCCGGCGTCCCTTCACGGTTCTCGGGATCGGGCTCAGGCACCGACTTCACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAGGACTTCGCGACATACTACTGTCAGCAGTCATACTCCACCCCTCTGACCTTCGGCCAAGGGACCAAAGTGGAGATCAAG SEQ ID NO: 66 Полная аминокислотная последовательность CAR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARREWVPYDVSWYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 67 Полная последовательность ДНК CAR GAAGTGCAGTTGCTGGAGTCAGGCGGAGGACTGGTGCAGCCCGGAGGATCGCTTCGCTTGAGCTGCGCAGCCTCAGGCTTTACCTTCTCCTCCTACGCCATGTCCTGGGTCAGACAGGCTCCCGGGAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCCATTAGCGGTTCCGGCGGAAGCACTTACTATGCCGACTCTGTGAAGGGCCGCTTCACTATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTATCTCCAAATGAATTCCCTGAGGGCCGAAGATACCGCGGTGTACTACTGCGCTAGACGGGAGTGGGTGCCCTACGATGTCAGCTGGTACTTCGACTACTGGGGACAGGGCACTCTCGTGACTGTGTCCTCCGGTGGTGGTGGATCGGGGGGTGGTGGTTCGGGCGGAGGAGGATCTGGAGGAGGAGGGTCGGACATTCAAATGACTCAGTCCCCGTCCTCCCTCTCCGCCTCCGTGGGAGATCGCGTCACGATCACGTGCAGGGCCAGCCAGAGCATCTCCAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAGGCACCGAAGCTCCTGATCTACGCCGCTAGCTCGCTGCAGTCCGGCGTCCCTTCACGGTTCTCGGGATCGGGCTCAGGCACCGACTTCACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAGGACTTCGCGACATACTACTGTCAGCAGTCATACTCCACCCCTCTGACCTTCGGCCAAGGGACCAAAGTGGAGATCAAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACCAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG R1F2 SEQ ID NO: 44 HCDR1 (Kabat) SYAMS SEQ ID NO: 45 HCDR2 (Kabat) AISGSGGSTYYADSVKG SEQ ID NO: 68 HCDR3 (Kabat) REWWYDDWYLDY SEQ ID NO: 47 HCDR1 (Chothia) GFTFSSY SEQ ID NO: 48 HCDR2 (Chothia) SGSGGS SEQ ID NO: 68 HCDR3 (Chothia) REWWYDDWYLDY SEQ ID NO: 49 HCDR1 (IMGT) GFTFSSYA SEQ ID NO: 50 HCDR2 (IMGT) ISGSGGST SEQ ID NO: 69 HCDR3 (IMGT) ARREWWYDDWYLDY SEQ ID NO: 70 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARREWWYDDWYLDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 71 ДНК VH GAAGTGCAGTTGCTGGAGTCAGGCGGAGGACTGGTGCAGCCCGGAGGATCGCTTCGCTTGAGCTGCGCAGCCTCAGGCTTTACCTTCTCCTCCTACGCCATGTCCTGGGTCAGACAGGCTCCCGGGAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCCATTAGCGGTTCCGGCGGAAGCACTTACTATGCCGACTCTGTGAAGGGCCGCTTCACTATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTATCTCCAAATGAATTCCCTGAGGGCCGAAGATACCGCGGTGTACTACTGCGCTAGACGGGAGTGGTGGTACGACGATTGGTACCTGGACTACTGGGGACAGGGCACTCTCGTGACTGTGTCCTCC SEQ ID NO: 54 LCDR1 (Kabat) RASQSISSYLN SEQ ID NO: 55 LCDR2 (Kabat) AASSLQS SEQ ID NO: 56 LCDR3 (Kabat) QQSYSTPLT SEQ ID NO: 57 LCDR1 (Chothia) SQSISSY SEQ ID NO: 58 LCDR2 (Chothia) AAS SEQ ID NO: 59 LCDR3 (Chothia) SYSTPL SEQ ID NO: 60 LCDR1 (IMGT) QSISSY SEQ ID NO: 58 LCDR2 (IMGT) AAS SEQ ID NO: 56 LCDR3 (IMGT) QQSYSTPLT SEQ ID NO: 61 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 62 ДНК VL GACATTCAAATGACTCAGTCCCCGTCCTCCCTCTCCGCCTCCGTGGGAGATCGCGTCACGATCACGTGCAGGGCCAGCCAGAGCATCTCCAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAGGCACCGAAGCTCCTGATCTACGCCGCTAGCTCGCTGCAGTCCGGCGTCCCTTCACGGTTCTCGGGATCGGGCTCAGGCACCGACTTCACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAGGACTTCGCGACATACTACTGTCAGCAGTCATACTCCACCCCTCTGACCTTCGGCCAAGGGACCAAAGTGGAGATCAAG SEQ ID NO: 63 Линкер GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO: 72 scFv (VH-линкер-VL) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARREWWYDDWYLDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 73 ДНК scFv GAAGTGCAGTTGCTGGAGTCAGGCGGAGGACTGGTGCAGCCCGGAGGATCGCTTCGCTTGAGCTGCGCAGCCTCAGGCTTTACCTTCTCCTCCTACGCCATGTCCTGGGTCAGACAGGCTCCCGGGAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCCATTAGCGGTTCCGGCGGAAGCACTTACTATGCCGACTCTGTGAAGGGCCGCTTCACTATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTATCTCCAAATGAATTCCCTGAGGGCCGAAGATACCGCGGTGTACTACTGCGCTAGACGGGAGTGGTGGTACGACGATTGGTACCTGGACTACTGGGGACAGGGCACTCTCGTGACTGTGTCCTCCGGTGGTGGTGGATCGGGGGGTGGTGGTTCGGGCGGAGGAGGATCTGGAGGAGGAGGGTCGGACATTCAAATGACTCAGTCCCCGTCCTCCCTCTCCGCCTCCGTGGGAGATCGCGTCACGATCACGTGCAGGGCCAGCCAGAGCATCTCCAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAGGCACCGAAGCTCCTGATCTACGCCGCTAGCTCGCTGCAGTCCGGCGTCCCTTCACGGTTCTCGGGATCGGGCTCAGGCACCGACTTCACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAGGACTTCGCGACATACTACTGTCAGCAGTCATACTCCACCCCTCTGACCTTCGGCCAAGGGACCAAAGTGGAGATCAAG SEQ ID NO: 74 Полная аминокислотная последовательность CAR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARREWWYDDWYLDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 75 Полная последовательность ДНК CAR GAAGTGCAGTTGCTGGAGTCAGGCGGAGGACTGGTGCAGCCCGGAGGATCGCTTCGCTTGAGCTGCGCAGCCTCAGGCTTTACCTTCTCCTCCTACGCCATGTCCTGGGTCAGACAGGCTCCCGGGAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCCATTAGCGGTTCCGGCGGAAGCACTTACTATGCCGACTCTGTGAAGGGCCGCTTCACTATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTATCTCCAAATGAATTCCCTGAGGGCCGAAGATACCGCGGTGTACTACTGCGCTAGACGGGAGTGGTGGTACGACGATTGGTACCTGGACTACTGGGGACAGGGCACTCTCGTGACTGTGTCCTCCGGTGGTGGTGGATCGGGGGGTGGTGGTTCGGGCGGAGGAGGATCTGGAGGAGGAGGGTCGGACATTCAAATGACTCAGTCCCCGTCCTCCCTCTCCGCCTCCGTGGGAGATCGCGTCACGATCACGTGCAGGGCCAGCCAGAGCATCTCCAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAGGCACCGAAGCTCCTGATCTACGCCGCTAGCTCGCTGCAGTCCGGCGTCCCTTCACGGTTCTCGGGATCGGGCTCAGGCACCGACTTCACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAGGACTTCGCGACATACTACTGTCAGCAGTCATACTCCACCCCTCTGACCTTCGGCCAAGGGACCAAAGTGGAGATCAAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACCAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG R1G5 SEQ ID NO: 44 HCDR1 (Kabat) SYAMS SEQ ID NO: 45 HCDR2 (Kabat) AISGSGGSTYYADSVKG SEQ ID NO: 76 HCDR3 (Kabat) REWWGESWLFDY SEQ ID NO: 47 HCDR1 (Chothia) GFTFSSY SEQ ID NO: 48 HCDR2 (Chothia) SGSGGS SEQ ID NO: 76 HCDR3 (Chothia) REWWGESWLFDY SEQ ID NO: 49 HCDR1 (IMGT) GFTFSSYA SEQ ID NO: 50 HCDR2 (IMGT) ISGSGGST SEQ ID NO: 77 HCDR3 (IMGT) ARREWWGESWLFDY SEQ ID NO: 78 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARREWWGESWLFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 79 ДНК VH GAAGTGCAGTTGCTGGAGTCAGGCGGAGGACTGGTGCAGCCCGGAGGATCGCTTCGCTTGAGCTGCGCAGCCTCAGGCTTTACCTTCTCCTCCTACGCCATGTCCTGGGTCAGACAGGCTCCCGGGAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCCATTAGCGGTTCCGGCGGAAGCACTTACTATGCCGACTCTGTGAAGGGCCGCTTCACTATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTATCTCCAAATGAATTCCCTGAGGGCCGAAGATACCGCGGTGTACTACTGCGCTAGACGGGAGTGGTGGGGAGAAAGCTGGCTGTTCGACTACTGGGGACAGGGCACTCTCGTGACTGTGTCCTCC SEQ ID NO: 54 LCDR1 (Kabat) RASQSISSYLN SEQ ID NO: 55 LCDR2 (Kabat) AASSLQS SEQ ID NO: 56 LCDR3 (Kabat) QQSYSTPLT SEQ ID NO: 57 LCDR1 (Chothia) SQSISSY SEQ ID NO: 58 LCDR2 (Chothia) AAS SEQ ID NO: 59 LCDR3 (Chothia) SYSTPL SEQ ID NO: 60 LCDR1 (IMGT) QSISSY SEQ ID NO: 58 LCDR2 (IMGT) AAS SEQ ID NO: 56 LCDR3 (IMGT) QQSYSTPLT SEQ ID NO: 61 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 62 ДНК VL GACATTCAAATGACTCAGTCCCCGTCCTCCCTCTCCGCCTCCGTGGGAGATCGCGTCACGATCACGTGCAGGGCCAGCCAGAGCATCTCCAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAGGCACCGAAGCTCCTGATCTACGCCGCTAGCTCGCTGCAGTCCGGCGTCCCTTCACGGTTCTCGGGATCGGGCTCAGGCACCGACTTCACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAGGACTTCGCGACATACTACTGTCAGCAGTCATACTCCACCCCTCTGACCTTCGGCCAAGGGACCAAAGTGGAGATCAAG SEQ ID NO: 63 Линкер GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO: 80 scFv (VH-линкер-VL) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARREWWGESWLFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 81 ДНК scFv GAAGTGCAGTTGCTGGAGTCAGGCGGAGGACTGGTGCAGCCCGGAGGATCGCTTCGCTTGAGCTGCGCAGCCTCAGGCTTTACCTTCTCCTCCTACGCCATGTCCTGGGTCAGACAGGCTCCCGGGAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCCATTAGCGGTTCCGGCGGAAGCACTTACTATGCCGACTCTGTGAAGGGCCGCTTCACTATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTATCTCCAAATGAATTCCCTGAGGGCCGAAGATACCGCGGTGTACTACTGCGCTAGACGGGAGTGGTGGGGAGAAAGCTGGCTGTTCGACTACTGGGGACAGGGCACTCTCGTGACTGTGTCCTCCGGTGGTGGTGGATCGGGGGGTGGTGGTTCGGGCGGAGGAGGATCTGGAGGAGGAGGGTCGGACATTCAAATGACTCAGTCCCCGTCCTCCCTCTCCGCCTCCGTGGGAGATCGCGTCACGATCACGTGCAGGGCCAGCCAGAGCATCTCCAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAGGCACCGAAGCTCCTGATCTACGCCGCTAGCTCGCTGCAGTCCGGCGTCCCTTCACGGTTCTCGGGATCGGGCTCAGGCACCGACTTCACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAGGACTTCGCGACATACTACTGTCAGCAGTCATACTCCACCCCTCTGACCTTCGGCCAAGGGACCAAAGTGGAGATCAAG SEQ ID NO: 82 Полная аминокислотная последовательность CAR EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARREWWGESWLFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 83 Полная последовательность ДНК CAR GAAGTGCAGTTGCTGGAGTCAGGCGGAGGACTGGTGCAGCCCGGAGGATCGCTTCGCTTGAGCTGCGCAGCCTCAGGCTTTACCTTCTCCTCCTACGCCATGTCCTGGGTCAGACAGGCTCCCGGGAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCCATTAGCGGTTCCGGCGGAAGCACTTACTATGCCGACTCTGTGAAGGGCCGCTTCACTATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTATCTCCAAATGAATTCCCTGAGGGCCGAAGATACCGCGGTGTACTACTGCGCTAGACGGGAGTGGTGGGGAGAAAGCTGGCTGTTCGACTACTGGGGACAGGGCACTCTCGTGACTGTGTCCTCCGGTGGTGGTGGATCGGGGGGTGGTGGTTCGGGCGGAGGAGGATCTGGAGGAGGAGGGTCGGACATTCAAATGACTCAGTCCCCGTCCTCCCTCTCCGCCTCCGTGGGAGATCGCGTCACGATCACGTGCAGGGCCAGCCAGAGCATCTCCAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAGGCACCGAAGCTCCTGATCTACGCCGCTAGCTCGCTGCAGTCCGGCGTCCCTTCACGGTTCTCGGGATCGGGCTCAGGCACCGACTTCACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAGGACTTCGCGACATACTACTGTCAGCAGTCATACTCCACCCCTCTGACCTTCGGCCAAGGGACCAAAGTGGAGATCAAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACCAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG

Таблица 4. CDR по Kabat иллюстративных молекул, связывающихся с BCMA, полученных из PALLAS Kabat HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3 R1B6 SYAMS (SEQ ID NO: 44) AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 45) REWVPYDVSWYFDY (SEQ ID NO: 46) RASQSISSYLN (SEQ ID NO: 54) AASSLQS (SEQ ID NO: 55) QQSYSTPLT (SEQ ID NO: 56) R1F2 SYAMS (SEQ ID NO: 44) AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 45) REWWYDDWYLDY (SEQ ID NO: 68) RASQSISSYLN (SEQ ID NO: 54) AASSLQS (SEQ ID NO: 55) QQSYSTPLT (SEQ ID NO: 56) R1G5 SYAMS (SEQ ID NO: 44) AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 45) REWWGESWLFDY (SEQ ID NO: 76) RASQSISSYLN (SEQ ID NO: 54) AASSLQS (SEQ ID NO: 55) QQSYSTPLT (SEQ ID NO: 56) Консенсусная последовательность SYAMS (SEQ ID NO: 44) AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 45) REWX₁X₂X₃X₄X₅X₆WX₇X₈DY, где X₁ отсутствует или представляет собой V; X₂ отсутствует или представляет собой P; X₃ представляет собой W или Y; X₄ представляет собой G, Y или D; X₅ представляет собой E, D или V; X₆ представляет собой S или D; X₇ представляет собой L или Y; и X₈ представляет собой F или L (SEQ ID NO: 84) RASQSISSYLN (SEQ ID NO: 54) AASSLQS (SEQ ID NO: 55) QQSYSTPLT (SEQ ID NO: 56)

Таблица 5. CDR по Chothia иллюстративных молекул, связывающихся с BCMA, полученных из PALLAS Chothia HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3 R1B6 GFTFSSY (SEQ ID NO: 47) SGSGGS (SEQ ID NO: 48) REWVPYDVSWYFDY (SEQ ID NO: 46) SQSISSY (SEQ ID NO: 57) AAS (SEQ ID NO: 58) SYSTPL (SEQ ID NO: 59) R1F2 GFTFSSY (SEQ ID NO: 47) SGSGGS (SEQ ID NO: 48) REWWYDDWYLDY (SEQ ID NO: 68) SQSISSY (SEQ ID NO: 57) AAS (SEQ ID NO: 58) SYSTPL (SEQ ID NO: 59) R1G5 GFTFSSY (SEQ ID NO: 47) SGSGGS (SEQ ID NO: 48) REWWGESWLFDY (SEQ ID NO: 76) SQSISSY (SEQ ID NO: 57) AAS (SEQ ID NO: 58) SYSTPL (SEQ ID NO: 59) Консенсусная последовательность GFTFSSY (SEQ ID NO: 47) SGSGGS (SEQ ID NO: 48) REWX₁X₂X₃X₄X₅X₆WX₇X₈DY, где X₁ отсутствует или представляет собой V; X₂ отсутствует или представляет собой P; X₃ представляет собой W или Y; X₄ представляет собой G, Y или D; X₅ представляет собой E, D или V; X₆ представляет собой S или D; X₇ представляет собой L или Y; и X₈ представляет собой F или L (SEQ ID NO: 84) SQSISSY (SEQ ID NO: 57) AAS (SEQ ID NO: 58) SYSTPL (SEQ ID NO: 59)

Таблица 6. CDR по IMGT иллюстративных молекул, связывающихся с BCMA, полученных из PALLAS IMGT HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3 R1B6 GFTFSSYA (SEQ ID NO: 49) ISGSGGST (SEQ ID NO: 50) ARREWVPYDVSWYFDY (SEQ ID NO: 51) QSISSY (SEQ ID NO: 60) AAS (SEQ ID NO: 58) QQSYSTPLT (SEQ ID NO: 56) R1F2 GFTFSSYA (SEQ ID NO: 49) ISGSGGST (SEQ ID NO: 50) ARREWWYDDWYLDY (SEQ ID NO: 69) QSISSY (SEQ ID NO: 60) AAS (SEQ ID NO: 58) QQSYSTPLT (SEQ ID NO: 56) R1G5 GFTFSSYA (SEQ ID NO: 49) ISGSGGST (SEQ ID NO: 50) ARREWWGESWLFDY (SEQ ID NO: 77) QSISSY (SEQ ID NO: 60) AAS (SEQ ID NO: 58) QQSYSTPLT (SEQ ID NO: 56) Консенсусная последовательность GFTFSSYA (SEQ ID NO: 49) ISGSGGST (SEQ ID NO: 50) ARREWX₁X₂X₃X₄X₅X₆WX₇X₈DY, где X₁ отсутствует или представляет собой V; X₂ отсутствует или представляет собой P; X₃ представляет собой W или Y; X₄ представляет собой G, Y или D; X₅ представляет собой E, D или V; X₆ представляет собой S или D; X₇ представляет собой L или Y; и X₈ представляет собой F или L (SEQ ID NO: 85) QSISSY (SEQ ID NO: 60) AAS (SEQ ID NO: 58) QQSYSTPLT (SEQ ID NO: 56)

Таблица 7. Аминокислотные последовательности и последовательности нуклеиновой кислоты иллюстративных молекул, полученных из В-клеток, связывающихся с BCMA SEQ ID NO Название/
описание Последовательность PI61 SEQ ID NO: 86 HCDR1 (Kabat) SYGMH SEQ ID NO: 87 HCDR2 (Kabat) VISYDGSNKYYADSVKG SEQ ID NO: 88 HCDR3 (Kabat) SGYALHDDYYGLDV SEQ ID NO: 47 HCDR1 (Chothia) GFTFSSY SEQ ID NO: 89 HCDR2 (Chothia) SYDGSN SEQ ID NO: 88 HCDR3 (Chothia) SGYALHDDYYGLDV SEQ ID NO: 90 HCDR1 (IMGT) GFTFSSYG SEQ ID NO: 91 HCDR2 (IMGT) ISYDGSNK SEQ ID NO: 92 HCDR3 (IMGT) GGSGYALHDDYYGLDV SEQ ID NO: 93 VH QVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 94 ДНК VH CAAGTGCAGCTGCAGGAATCCGGTGGCGGAGTCGTGCAGCCTGGAAGGAGCCTGAGACTCTCATGCGCCGCGTCAGGGTTCACCTTTTCCTCCTACGGGATGCATTGGGTCAGACAGGCCCCCGGAAAGGGACTCGAATGGGTGGCTGTGATCAGCTACGACGGCTCCAACAAGTACTACGCCGACTCCGTGAAAGGCCGGTTCACTATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAATTCACTGCGCGCGGAGGATACCGCTGTGTACTACTGCGGTGGCTCCGGTTACGCCCTGCACGATGACTATTACGGCCTTGACGTCTGGGGCCAGGGAACCCTCGTGACTGTGTCCAGC SEQ ID NO: 95 LCDR1 (Kabat) TGTSSDVGGYNYVS SEQ ID NO: 96 LCDR2 (Kabat) DVSNRPS SEQ ID NO: 97 LCDR3 (Kabat) SSYTSSSTLYV SEQ ID NO: 98 LCDR1 (Chothia) TSSDVGGYNY SEQ ID NO: 99 LCDR2 (Chothia) DVS SEQ ID NO: 100 LCDR3 (Chothia) YTSSSTLY SEQ ID NO: 101 LCDR1 (IMGT) SSDVGGYNY SEQ ID NO: 99 LCDR2 (IMGT) DVS SEQ ID NO: 97 LCDR3 (IMGT) SSYTSSSTLYV SEQ ID NO: 102 VL QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGSGTKVTVL SEQ ID NO: 103 ДНК VL CAGAGCGCACTGACTCAGCCGGCATCCGTGTCCGGTAGCCCCGGACAGTCGATTACCATCTCCTGTACCGGCACCTCCTCCGACGTGGGAGGGTACAACTACGTGTCGTGGTACCAGCAGCACCCAGGAAAGGCCCCTAAGTTGATGATCTACGATGTGTCAAACCGCCCGTCTGGAGTCTCCAACCGGTTCTCCGGCTCCAAGTCCGGCAACACCGCCAGCCTGACCATTAGCGGGCTGCAAGCCGAGGATGAGGCCGACTACTACTGCTCGAGCTACACATCCTCGAGCACCCTCTACGTGTTCGGCTCGGGGACTAAGGTCACCGTGCTG SEQ ID NO: 104 Линкер GGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO: 105 scFv (VH-линкер-VL) QVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGSGTKVTVL SEQ ID NO: 106 ДНК scFv CAAGTGCAGCTGCAGGAATCCGGTGGCGGAGTCGTGCAGCCTGGAAGGAGCCTGAGACTCTCATGCGCCGCGTCAGGGTTCACCTTTTCCTCCTACGGGATGCATTGGGTCAGACAGGCCCCCGGAAAGGGACTCGAATGGGTGGCTGTGATCAGCTACGACGGCTCCAACAAGTACTACGCCGACTCCGTGAAAGGCCGGTTCACTATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAATTCACTGCGCGCGGAGGATACCGCTGTGTACTACTGCGGTGGCTCCGGTTACGCCCTGCACGATGACTATTACGGCCTTGACGTCTGGGGCCAGGGAACCCTCGTGACTGTGTCCAGCGGTGGAGGAGGTTCGGGCGGAGGAGGATCAGGAGGGGGTGGATCGCAGAGCGCACTGACTCAGCCGGCATCCGTGTCCGGTAGCCCCGGACAGTCGATTACCATCTCCTGTACCGGCACCTCCTCCGACGTGGGAGGGTACAACTACGTGTCGTGGTACCAGCAGCACCCAGGAAAGGCCCCTAAGTTGATGATCTACGATGTGTCAAACCGCCCGTCTGGAGTCTCCAACCGGTTCTCCGGCTCCAAGTCCGGCAACACCGCCAGCCTGACCATTAGCGGGCTGCAAGCCGAGGATGAGGCCGACTACTACTGCTCGAGCTACACATCCTCGAGCACCCTCTACGTGTTCGGCTCGGGGACTAAGGTCACCGTGCTG SEQ ID NO: 107 Полная аминокислотная последовательность CAR QVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGSGTKVTVLTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 108 Полная последовательность ДНК CAR CAAGTGCAGCTGCAGGAATCCGGTGGCGGAGTCGTGCAGCCTGGAAGGAGCCTGAGACTCTCATGCGCCGCGTCAGGGTTCACCTTTTCCTCCTACGGGATGCATTGGGTCAGACAGGCCCCCGGAAAGGGACTCGAATGGGTGGCTGTGATCAGCTACGACGGCTCCAACAAGTACTACGCCGACTCCGTGAAAGGCCGGTTCACTATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAATTCACTGCGCGCGGAGGATACCGCTGTGTACTACTGCGGTGGCTCCGGTTACGCCCTGCACGATGACTATTACGGCCTTGACGTCTGGGGCCAGGGAACCCTCGTGACTGTGTCCAGCGGTGGAGGAGGTTCGGGCGGAGGAGGATCAGGAGGGGGTGGATCGCAGAGCGCACTGACTCAGCCGGCATCCGTGTCCGGTAGCCCCGGACAGTCGATTACCATCTCCTGTACCGGCACCTCCTCCGACGTGGGAGGGTACAACTACGTGTCGTGGTACCAGCAGCACCCAGGAAAGGCCCCTAAGTTGATGATCTACGATGTGTCAAACCGCCCGTCTGGAGTCTCCAACCGGTTCTCCGGCTCCAAGTCCGGCAACACCGCCAGCCTGACCATTAGCGGGCTGCAAGCCGAGGATGAGGCCGACTACTACTGCTCGAGCTACACATCCTCGAGCACCCTCTACGTGTTCGGCTCGGGGACTAAGGTCACCGTGCTGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACCAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACcaaggacacctatgacgctcttcacatgcaggccctgccgcctcgg B61-02 SEQ ID NO: 86 HCDR1 (Kabat) SYGMH SEQ ID NO: 109 HCDR2 (Kabat) VISYKGSNKYYADSVKG SEQ ID NO: 88 HCDR3 (Kabat) SGYALHDDYYGLDV SEQ ID NO: 47 HCDR1 (Chothia) GFTFSSY SEQ ID NO: 110 HCDR2 (Chothia) SYKGSN SEQ ID NO: 88 HCDR3 (Chothia) SGYALHDDYYGLDV SEQ ID NO: 90 HCDR1 (IMGT) GFTFSSYG SEQ ID NO: 111 HCDR2 (IMGT) ISYKGSNK SEQ ID NO: 92 HCDR3 (IMGT) GGSGYALHDDYYGLDV SEQ ID NO: 112 VH QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYKGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 113 ДНК VH CAAGTGCAGCTTGTCGAATCGGGAGGCGGAGTGGTGCAGCCTGGACGATCGCTCCGGCTCTCATGTGCCGCGAGCGGATTCACCTTCTCGAGCTACGGCATGCACTGGGTCAGACAAGCCCCAGGAAAGGGCCTGGAATGGGTGGCTGTCATCTCGTACAAGGGCTCAAACAAGTACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGATAACTCCAAGAATACCCTCTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGATACTGCAGTGTACTACTGCGGGGGTTCAGGCTACGCGCTGCACGACGACTACTACGGATTGGACGTCTGGGGCCAAGGAACTCTTGTGACCGTGTCCTCT SEQ ID NO: 95 LCDR1 (Kabat) TGTSSDVGGYNYVS SEQ ID NO: 114 LCDR2 (Kabat) EVSNRLR SEQ ID NO: 115 LCDR3 (Kabat) SSYTSSSALYV SEQ ID NO: 98 LCDR1 (Chothia) TSSDVGGYNY SEQ ID NO: 116 LCDR2 (Chothia) EVS SEQ ID NO: 117 LCDR3 (Chothia) YTSSSALY SEQ ID NO: 101 LCDR1 (IMGT) SSDVGGYNY SEQ ID NO: 116 LCDR2 (IMGT) EVS SEQ ID NO: 115 LCDR3 (IMGT) SSYTSSSALYV SEQ ID NO: 118 VL QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYEVSNRLRGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSALYVFGSGTKVTVL SEQ ID NO: 119 ДНК VL CAGAGCGCGCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGAGCGGTTCGCCGGGACAGTCCATTACCATTTCGTGCACCGGGACCTCCTCCGACGTGGGAGGCTACAACTACGTGTCCTGGTACCAGCAGCATCCCGGAAAGGCCCCGAAGCTGATGATCTACGAAGTGTCGAACAGACTGCGGGGAGTCTCCAACCGCTTTTCCGGGTCCAAGTCCGGCAACACCGCCAGCCTGACCATCAGCGGGCTCCAGGCAGAAGATGAGGCTGACTATTACTGCTCCTCCTACACGTCAAGCTCCGCCCTCTACGTGTTCGGGTCCGGGACCAAAGTCACTGTGCTG SEQ ID NO: 63 Линкер GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO: 120 scFv (VH-линкер-VL) QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYKGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYEVSNRLRGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSALYVFGSGTKVTVL SEQ ID NO: 121 ДНК scFv CAAGTGCAGCTTGTCGAATCGGGAGGCGGAGTGGTGCAGCCTGGACGATCGCTCCGGCTCTCATGTGCCGCGAGCGGATTCACCTTCTCGAGCTACGGCATGCACTGGGTCAGACAAGCCCCAGGAAAGGGCCTGGAATGGGTGGCTGTCATCTCGTACAAGGGCTCAAACAAGTACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGATAACTCCAAGAATACCCTCTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGATACTGCAGTGTACTACTGCGGGGGTTCAGGCTACGCGCTGCACGACGACTACTACGGATTGGACGTCTGGGGCCAAGGAACTCTTGTGACCGTGTCCTCTGGTGGAGGCGGATCAGGGGGTGGCGGATCTGGGGGTGGTGGTTCCGGGGGAGGAGGATCGCAGAGCGCGCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGAGCGGTTCGCCGGGACAGTCCATTACCATTTCGTGCACCGGGACCTCCTCCGACGTGGGAGGCTACAACTACGTGTCCTGGTACCAGCAGCATCCCGGAAAGGCCCCGAAGCTGATGATCTACGAAGTGTCGAACAGACTGCGGGGAGTCTCCAACCGCTTTTCCGGGTCCAAGTCCGGCAACACCGCCAGCCTGACCATCAGCGGGCTCCAGGCAGAAGATGAGGCTGACTATTACTGCTCCTCCTACACGTCAAGCTCCGCCCTCTACGTGTTCGGGTCCGGGACCAAAGTCACTGTGCTG SEQ ID NO: 122 Полная аминокислотная последовательность CAR QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYKGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYEVSNRLRGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSALYVFGSGTKVTVLTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 123 Полная последовательность ДНК CAR CAAGTGCAGCTTGTCGAATCGGGAGGCGGAGTGGTGCAGCCTGGACGATCGCTCCGGCTCTCATGTGCCGCGAGCGGATTCACCTTCTCGAGCTACGGCATGCACTGGGTCAGACAAGCCCCAGGAAAGGGCCTGGAATGGGTGGCTGTCATCTCGTACAAGGGCTCAAACAAGTACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGATAACTCCAAGAATACCCTCTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGATACTGCAGTGTACTACTGCGGGGGTTCAGGCTACGCGCTGCACGACGACTACTACGGATTGGACGTCTGGGGCCAAGGAACTCTTGTGACCGTGTCCTCTGGTGGAGGCGGATCAGGGGGTGGCGGATCTGGGGGTGGTGGTTCCGGGGGAGGAGGATCGCAGAGCGCGCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGAGCGGTTCGCCGGGACAGTCCATTACCATTTCGTGCACCGGGACCTCCTCCGACGTGGGAGGCTACAACTACGTGTCCTGGTACCAGCAGCATCCCGGAAAGGCCCCGAAGCTGATGATCTACGAAGTGTCGAACAGACTGCGGGGAGTCTCCAACCGCTTTTCCGGGTCCAAGTCCGGCAACACCGCCAGCCTGACCATCAGCGGGCTCCAGGCAGAAGATGAGGCTGACTATTACTGCTCCTCCTACACGTCAAGCTCCGCCCTCTACGTGTTCGGGTCCGGGACCAAAGTCACTGTGCTGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACCAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG B61-10 SEQ ID NO: 86 HCDR1 (Kabat) SYGMH SEQ ID NO: 109 HCDR2 (Kabat) VISYKGSNKYYADSVKG SEQ ID NO: 88 HCDR3 (Kabat) SGYALHDDYYGLDV SEQ ID NO: 47 HCDR1 (Chothia) GFTFSSY SEQ ID NO: 110 HCDR2 (Chothia) SYKGSN SEQ ID NO: 88 HCDR3 (Chothia) SGYALHDDYYGLDV SEQ ID NO: 90 HCDR1 (IMGT) GFTFSSYG SEQ ID NO: 111 HCDR2 (IMGT) ISYKGSNK SEQ ID NO: 92 HCDR3 (IMGT) GGSGYALHDDYYGLDV SEQ ID NO: 112 VH QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYKGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 113 ДНК VH CAAGTGCAGCTTGTCGAATCGGGAGGCGGAGTGGTGCAGCCTGGACGATCGCTCCGGCTCTCATGTGCCGCGAGCGGATTCACCTTCTCGAGCTACGGCATGCACTGGGTCAGACAAGCCCCAGGAAAGGGCCTGGAATGGGTGGCTGTCATCTCGTACAAGGGCTCAAACAAGTACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGATAACTCCAAGAATACCCTCTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGATACTGCAGTGTACTACTGCGGGGGTTCAGGCTACGCGCTGCACGACGACTACTACGGATTGGACGTCTGGGGCCAAGGAACTCTTGTGACCGTGTCCTCT SEQ ID NO: 95 LCDR1 (Kabat) TGTSSDVGGYNYVS SEQ ID NO: 114 LCDR2 (Kabat) EVSNRLR SEQ ID NO: 97 LCDR3 (Kabat) SSYTSSSTLYV SEQ ID NO: 98 LCDR1 (Chothia) TSSDVGGYNY SEQ ID NO: 116 LCDR2 (Chothia) EVS SEQ ID NO: 100 LCDR3 (Chothia) YTSSSTLY SEQ ID NO: 101 LCDR1 (IMGT) SSDVGGYNY SEQ ID NO: 116 LCDR2 (IMGT) EVS SEQ ID NO: 97 LCDR3 (IMGT) SSYTSSSTLYV SEQ ID NO: 124 VL QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYEVSNRLRGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGSGTKVTVL SEQ ID NO: 125 ДНК VL CAGAGCGCGCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGAGCGGTTCGCCGGGACAGTCCATTACCATTTCGTGCACCGGGACCTCCTCCGACGTGGGAGGCTACAACTACGTGTCCTGGTACCAGCAGCATCCCGGAAAGGCCCCGAAGCTGATGATCTACGAAGTGTCGAACAGACTGCGGGGAGTCTCCAACCGCTTTTCCGGGTCCAAGTCCGGCAACACCGCCAGCCTGACCATCAGCGGGCTCCAGGCAGAAGATGAGGCTGACTATTACTGCTCCTCCTACACGTCAAGCTCCACCCTCTACGTGTTCGGGTCCGGGACCAAAGTCACTGTGCTG SEQ ID NO: 63 Линкер GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO: 126 scFv (VH-линкер-VL) QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYKGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYEVSNRLRGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGSGTKVTVL SEQ ID NO: 127 ДНК scFv CAAGTGCAGCTTGTCGAATCGGGAGGCGGAGTGGTGCAGCCTGGACGATCGCTCCGGCTCTCATGTGCCGCGAGCGGATTCACCTTCTCGAGCTACGGCATGCACTGGGTCAGACAAGCCCCAGGAAAGGGCCTGGAATGGGTGGCTGTCATCTCGTACAAGGGCTCAAACAAGTACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGATAACTCCAAGAATACCCTCTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGATACTGCAGTGTACTACTGCGGGGGTTCAGGCTACGCGCTGCACGACGACTACTACGGATTGGACGTCTGGGGCCAAGGAACTCTTGTGACCGTGTCCTCTGGTGGAGGCGGATCAGGGGGTGGCGGATCTGGGGGTGGTGGTTCCGGGGGAGGAGGATCGCAGAGCGCGCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGAGCGGTTCGCCGGGACAGTCCATTACCATTTCGTGCACCGGGACCTCCTCCGACGTGGGAGGCTACAACTACGTGTCCTGGTACCAGCAGCATCCCGGAAAGGCCCCGAAGCTGATGATCTACGAAGTGTCGAACAGACTGCGGGGAGTCTCCAACCGCTTTTCCGGGTCCAAGTCCGGCAACACCGCCAGCCTGACCATCAGCGGGCTCCAGGCAGAAGATGAGGCTGACTATTACTGCTCCTCCTACACGTCAAGCTCCACCCTCTACGTGTTCGGGTCCGGGACCAAAGTCACTGTGCTG SEQ ID NO: 128 Полная аминокислотная последовательность CAR QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYKGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYEVSNRLRGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGSGTKVTVLTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 129 Полная последовательность ДНК CAR CAAGTGCAGCTTGTCGAATCGGGAGGCGGAGTGGTGCAGCCTGGACGATCGCTCCGGCTCTCATGTGCCGCGAGCGGATTCACCTTCTCGAGCTACGGCATGCACTGGGTCAGACAAGCCCCAGGAAAGGGCCTGGAATGGGTGGCTGTCATCTCGTACAAGGGCTCAAACAAGTACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGATAACTCCAAGAATACCCTCTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGATACTGCAGTGTACTACTGCGGGGGTTCAGGCTACGCGCTGCACGACGACTACTACGGATTGGACGTCTGGGGCCAAGGAACTCTTGTGACCGTGTCCTCTGGTGGAGGCGGATCAGGGGGTGGCGGATCTGGGGGTGGTGGTTCCGGGGGAGGAGGATCGCAGAGCGCGCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGAGCGGTTCGCCGGGACAGTCCATTACCATTTCGTGCACCGGGACCTCCTCCGACGTGGGAGGCTACAACTACGTGTCCTGGTACCAGCAGCATCCCGGAAAGGCCCCGAAGCTGATGATCTACGAAGTGTCGAACAGACTGCGGGGAGTCTCCAACCGCTTTTCCGGGTCCAAGTCCGGCAACACCGCCAGCCTGACCATCAGCGGGCTCCAGGCAGAAGATGAGGCTGACTATTACTGCTCCTCCTACACGTCAAGCTCCACCCTCTACGTGTTCGGGTCCGGGACCAAAGTCACTGTGCTGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACCAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG

Таблица 8. CDR по Kabat иллюстративных молекул, связывающихся с BCMA, полученных из B-клеток Kabat HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3 PI61 SYGMH (SEQ ID NO: 86) VISYDGSNKYYADSVKG (SEQ ID NO: 87) SGYALHDDYYGLDV (SEQ ID NO: 88) TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO: 95) DVSNRPS (SEQ ID NO: 96) SSYTSSSTLYV (SEQ ID NO: 97) B61-02 SYGMH (SEQ ID NO: 86) VISYKGSNKYYADSVKG (SEQ ID NO: 109) SGYALHDDYYGLDV (SEQ ID NO: 88) TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO: 95) EVSNRLR (SEQ ID NO: 114) SSYTSSSALYV (SEQ ID NO: 115) B61-10 SYGMH (SEQ ID NO: 86) VISYKGSNKYYADSVKG (SEQ ID NO: 109) SGYALHDDYYGLDV (SEQ ID NO: 88) TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO: 95) EVSNRLR (SEQ ID NO: 114) SSYTSSSTLYV (SEQ ID NO: 97) Консенсусная последовательность SYGMH (SEQ ID NO: 86) VISYXGSNKYYADSVKG, где X представляет собой D или K (SEQ ID NO: 130) SGYALHDDYYGLDV (SEQ ID NO: 88) TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO: 95) X₁VSNRX₂X₃, где X₁ представляет собой D или E; X₂ представляет собой P или L; и X₃ представляет собой S или R (SEQ ID NO: 131) SSYTSSSXLYV, где X представляет собой T или A (SEQ ID NO: 132)

Таблица 9. CDR по Chothia иллюстративных молекул, связывающихся с BCMA, полученных из B-клеток Chothia HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3 PI61 GFTFSSY (SEQ ID NO: 47) SYDGSN (SEQ ID NO: 89) SGYALHDDYYGLDV (SEQ ID NO: 88) TSSDVGGYNY (SEQ ID NO: 98) DVS (SEQ ID NO: 99) YTSSSTLY (SEQ ID NO: 100) B61-02 GFTFSSY (SEQ ID NO: 47) SYKGSN (SEQ ID NO: 110) SGYALHDDYYGLDV (SEQ ID NO: 88) TSSDVGGYNY (SEQ ID NO: 98) EVS (SEQ ID NO: 116) YTSSSALY (SEQ ID NO: 117) B61-10 GFTFSSY (SEQ ID NO: 47) SYKGSN (SEQ ID NO: 110) SGYALHDDYYGLDV (SEQ ID NO: 88) TSSDVGGYNY (SEQ ID NO: 98) EVS (SEQ ID NO: 116) YTSSSTLY (SEQ ID NO: 100) Консенсусная последовательность GFTFSSY (SEQ ID NO: 47) SYXGSN, где X представляет собой D или K (SEQ ID NO: 133) SGYALHDDYYGLDV (SEQ ID NO: 88) TSSDVGGYNY (SEQ ID NO: 98) XVS, где X представляет собой D или E (SEQ ID NO: 134) YTSSSXLY, где X представляет собой T или A (SEQ ID NO: 135)

Таблица 10. CDR по IMGT иллюстративных молекул, связывающихся с BCMA, полученных из B-клеток IMGT HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3 PI61 GFTFSSYG (SEQ ID NO: 90) ISYDGSNK (SEQ ID NO: 91) GGSGYALHDDYYGLDV (SEQ ID NO: 92) SSDVGGYNY (SEQ ID NO: 101) DVS (SEQ ID NO: 99) SSYTSSSTLYV (SEQ ID NO: 97) B61-02 GFTFSSYG (SEQ ID NO: 90) ISYKGSNK (SEQ ID NO: 111) GGSGYALHDDYYGLDV (SEQ ID NO: 92) SSDVGGYNY (SEQ ID NO: 101) EVS (SEQ ID NO: 116) SSYTSSSALYV (SEQ ID NO: 115) B61-10 GFTFSSYG (SEQ ID NO: 90) ISYKGSNK (SEQ ID NO: 111) GGSGYALHDDYYGLDV (SEQ ID NO: 92) SSDVGGYNY (SEQ ID NO: 101) EVS (SEQ ID NO: 116) SSYTSSSTLYV (SEQ ID NO: 97) Консенсусная последовательность GFTFSSYG (SEQ ID NO: 90) ISYXGSNK, где X представляет собой D или K (SEQ ID NO: 136) GGSGYALHDDYYGLDV (SEQ ID NO: 92) SSDVGGYNY (SEQ ID NO: 101) XVS, где X представляет собой D или E (SEQ ID NO: 134) SSYTSSSXLYV, где X представляет собой T или A (SEQ ID NO: 132)

Таблица 11. Аминокислотные последовательности и последовательности нуклеиновой кислоты иллюстративных молекул, связывающихся с BCMA, на основе PI61 Идентификация Последовательность белка Последовательность ДНК (5'-3') Сигнальный пептид MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO: 1) Atggccctccctgtcaccgctctgttgctgccgcttgctctgctgctccacgcagcgcgaccg (SEQ ID NO: 252) VH PI61 QVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 93) CAGGTACAATTGCAGGAGTCTGGAGGCGGTGTGGTGCAACCCGGTCGCAGCTTGCGCCTGAGTTGTGCTGCGTCTGGATTTACATTTTCATCTTACGGAATGCATTGGGTACGCCAGGCACCGGGGAAAGGCCTTGAATGGGTGGCTGTAATTTCATACGATGGTTCCAACAAATACTATGCTGACTCAGTCAAGGGTCGATTTACAATTAGTCGGGACAACTCCAAGAACACCCTTTATCTTCAAATGAATTCCCTTAGAGCAGAGGATACGGCGGTCTATTACTGTGGTGGCAGTGGTTATGCACTTCATGATGATTACTATGGCTTGGATGTCTGGGGGCAAGGGACGCTTGTAACTGTATCCTCT (SEQ ID NO: 260) VL PI61 QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGSGTKVTVL (SEQ ID NO: 102) caatctgctctgactcaaccagcaagcgtatcagggtcaccgggacagagtattaccataagttgcacggggacctctagcgatgtaggggggtataattatgtatcttggtatcaacaacaccccgggaaagcccctaaattgatgatctacgacgtgagcaatcgacctagtggcgtatcaaatcgcttctctggtagcaagagtgggaatacggcgtcccttactattagcggattgcaagcagaagatgaggccgattactactgcagctcctatactagctcttctacattgtacgtctttgggagcggaacaaaagtaacagtactc (SEQ ID NO: 261) Линкер GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 104) ScFv PI61 QVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGSGTKVTVL (SEQ ID NO: 105) CaggtacaattgcaggagtctggaggcggtgtgGtgcaacccggtcgcagcttgcgcctgagttgtGctgcgtctggatttacattttcatcttacggaAtgcattgggtacgccaggcaccggggaaaggcCttgaatgggtggctgtaatttcatacgatggtTccaacaaatactatgctgactcagtcaagggtCgatttacaattagtcgggacaactccaagaacAccctttatcttcaaatgaattcccttagagcaGaggatacggcggtctattactgtggtggcagtGgttatgcacttcatgatgattactatggcttgGatgtctgggggcaagggacgcttgtaactgtaTcctctggtggtggtggtagtggtgggggaggcTccggcggtggcggctctcaatctgctctgactCaaccagcaagcgtatcagggtcaccgggacagAgtattaccataagttgcacggggacctctagcGatgtaggggggtataattatgtatcttggtatCaacaacaccccgggaaagcccctaaattgatgAtctacgacgtgagcaatcgacctagtggcgtaTcaaatcgcttctctggtagcaagagtgggaatAcggcgtcccttactattagcggattgcaagcaGaagatgaggccgattactactgcagctcctatActagctcttctacattgtacgtctttgggagcggaacaaaagtaacagtactc (SEQ ID NO: 253) Трансмембранный домен и шарнирная область TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC (SEQ ID NO: 202) AcaacaacacctgccccgagaccgcctacaccaGccccgactattgccagccagcctctgagcctcAggcctgaggcctgtaggcccgcagcgggcggcGcagttcatacacggggcttggatttcgcttgtGatatttatatttgggctcctttggcggggacaTgtggcgtgctgcttctgtcacttgttattacactgtactgt (SEQ ID NO: 254) 4-1BB KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (SEQ ID NO: 7) AaacgcgggcgaaaaaaattgctgtatatttttAagcagccatttatgaggcccgttcagacgacgCaggaggaggacggttgctcttgcaggttcccagaagaggaagaagggggctgtgaattg (SEQ ID NO: 255) CD3-дзета RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 10) CgggttaaattttcaagatccgcagacgctccaGcataccaacagggacaaaaccaactctataacGagctgaatcttggaagaagggaggaatatgatGtgctggataaacggcgcggtagagatccggagAtgggcggaaaaccaaggcgaaaaaaccctcagGagggactctacaacgaactgcagaaagacaaaAtggcggaggcttattccgaaataggcatgaagGgcgagcggaggcgagggaaagggcacgacggaCtgtatcaaggcctctcaaccgcgactaaggatAcgtacgacgccctgcacatgcaggccctgcctccgaga (SEQ ID NO: 256) Полная конструкция CAR PI61 MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGSGTKVTVLTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 257) ATGGCCCTCCCTGTCACCGCTCTGTTGCTGCCGCTTGCTCTGCTGCTCCACGCAGCGCGACCGCAGGTACAATTGCAGGAGTCTGGAGGCGGTGTGGTGCAACCCGGTCGCAGCTTGCGCCTGAGTTGTGCTGCGTCTGGATTTACATTTTCATCTTACGGAATGCATTGGGTACGCCAGGCACCGGGGAAAGGCCTTGAATGGGTGGCTGTAATTTCATACGATGGTTCCAACAAATACTATGCTGACTCAGTCAAGGGTCGATTTACAATTAGTCGGGACAACTCCAAGAACACCCTTTATCTTCAAATGAATTCCCTTAGAGCAGAGGATACGGCGGTCTATTACTGTGGTGGCAGTGGTTATGCACTTCATGATGATTACTATGGCTTGGATGTCTGGGGGCAAGGGACGCTTGTAACTGTATCCTCTGGTGGTGGTGGTAGTGGTGGGGGAGGCTCCGGCGGTGGCGGCTCTCAATCTGCTCTGACTCAACCAGCAAGCGTATCAGGGTCACCGGGACAGAGTATTACCATAAGTTGCACGGGGACCTCTAGCGATGTAGGGGGGTATAATTATGTATCTTGGTATCAACAACACCCCGGGAAAGCCCCTAAATTGATGATCTACGACGTGAGCAATCGACCTAGTGGCGTATCAAATCGCTTCTCTGGTAGCAAGAGTGGGAATACGGCGTCCCTTACTATTAGCGGATTGCAAGCAGAAGATGAGGCCGATTACTACTGCAGCTCCTATACTAGCTCTTCTACATTGTACGTCTTTGGGAGCGGAACAAAAGTAACAGTACTCACAACAACACCTGCCCCGAGACCGCCTACACCAGCCCCGACTATTGCCAGCCAGCCTCTGAGCCTCAGGCCTGAGGCCTGTAGGCCCGCAGCGGGCGGCGCAGTTCATACACGGGGCTTGGATTTCGCTTGTGATATTTATATTTGGGCTCCTTTGGCGGGGACATGTGGCGTGCTGCTTCTGTCACTTGTTATTACACTGTACTGTAAACGCGGGCGAAAAAAATTGCTGTATATTTTTAAGCAGCCATTTATGAGGCCCGTTCAGACGACGCAGGAGGAGGACGGTTGCTCTTGCAGGTTCCCAGAAGAGGAAGAAGGGGGCTGTGAATTGCGGGTTAAATTTTCAAGATCCGCAGACGCTCCAGCATACCAACAGGGACAAAACCAACTCTATAACGAGCTGAATCTTGGAAGAAGGGAGGAATATGATGTGCTGGATAAACGGCGCGGTAGAGATCCGGAGATGGGCGGAAAACCAAGGCGAAAAAACCCTCAGGAGGGACTCTACAACGAACTGCAGAAAGACAAAATGGCGGAGGCTTATTCCGAAATAGGCATGAAGGGCGAGCGGAGGCGAGGGAAAGGGCACGACGGACTGTATCAAGGCCTCTCAACCGCGACTAAGGATACGTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCGAGA (SEQ ID NO: 258) Полная конструкция CAR PI61 (нуклеиновая кислота с сигнальным пептидом и стоп-кодонами) ATGGCCCTCCCTGTCACCGCTCTGTTGCTGCCGCTTGCTCTGCTGCTCCACGCAGCGCGACCGCAGGTACAATTGCAGGAGTCTGGAGGCGGTGTGGTGCAACCCGGTCGCAGCTTGCGCCTGAGTTGTGCTGCGTCTGGATTTACATTTTCATCTTACGGAATGCATTGGGTACGCCAGGCACCGGGGAAAGGCCTTGAATGGGTGGCTGTAATTTCATACGATGGTTCCAACAAATACTATGCTGACTCAGTCAAGGGTCGATTTACAATTAGTCGGGACAACTCCAAGAACACCCTTTATCTTCAAATGAATTCCCTTAGAGCAGAGGATACGGCGGTCTATTACTGTGGTGGCAGTGGTTATGCACTTCATGATGATTACTATGGCTTGGATGTCTGGGGGCAAGGGACGCTTGTAACTGTATCCTCTGGTGGTGGTGGTAGTGGTGGGGGAGGCTCCGGCGGTGGCGGCTCTCAATCTGCTCTGACTCAACCAGCAAGCGTATCAGGGTCACCGGGACAGAGTATTACCATAAGTTGCACGGGGACCTCTAGCGATGTAGGGGGGTATAATTATGTATCTTGGTATCAACAACACCCCGGGAAAGCCCCTAAATTGATGATCTACGACGTGAGCAATCGACCTAGTGGCGTATCAAATCGCTTCTCTGGTAGCAAGAGTGGGAATACGGCGTCCCTTACTATTAGCGGATTGCAAGCAGAAGATGAGGCCGATTACTACTGCAGCTCCTATACTAGCTCTTCTACATTGTACGTCTTTGGGAGCGGAACAAAAGTAACAGTACTCACAACAACACCTGCCCCGAGACCGCCTACACCAGCCCCGACTATTGCCAGCCAGCCTCTGAGCCTCAGGCCTGAGGCCTGTAGGCCCGCAGCGGGCGGCGCAGTTCATACACGGGGCTTGGATTTCGCTTGTGATATTTATATTTGGGCTCCTTTGGCGGGGACATGTGGCGTGCTGCTTCTGTCACTTGTTATTACACTGTACTGTAAACGCGGGCGAAAAAAATTGCTGTATATTTTTAAGCAGCCATTTATGAGGCCCGTTCAGACGACGCAGGAGGAGGACGGTTGCTCTTGCAGGTTCCCAGAAGAGGAAGAAGGGGGCTGTGAATTGCGGGTTAAATTTTCAAGATCCGCAGACGCTCCAGCATACCAACAGGGACAAAACCAACTCTATAACGAGCTGAATCTTGGAAGAAGGGAGGAATATGATGTGCTGGATAAACGGCGCGGTAGAGATCCGGAGATGGGCGGAAAACCAAGGCGAAAAAACCCTCAGGAGGGACTCTACAACGAACTGCAGAAAGACAAAATGGCGGAGGCTTATTCCGAAATAGGCATGAAGGGCGAGCGGAGGCGAGGGAAAGGGCACGACGGACTGTATCAAGGCCTCTCAACCGCGACTAAGGATACGTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCGAGATGATAA (SEQ ID NO: 416) Зрелый белок CAR PI61 QVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGSGTKVTVLTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 107) caggtacaattgcaggagtctggaggcggtgtggtgcaacccggtcgcagcttgcgcctgagttgtgctgcgtctggatttacattttcatcttacggaatgcattgggtacgccaggcaccggggaaaggccttgaatgggtggctgtaatttcatacgatggttccaacaaatactatgctgactcagtcaagggtcgatttacaattagtcgggacaactccaagaacaccctttatcttcaaatgaattcccttagagcagaggatacggcggtctattactgtggtggcagtggttatgcacttcatgatgattactatggcttggatgtctgggggcaagggacgcttgtaactgtatcctctggtggtggtggtagtggtgggggaggctccggcggtggcggctctcaatctgctctgactcaaccagcaagcgtatcagggtcaccgggacagagtattaccataagttgcacggggacctctagcgatgtaggggggtataattatgtatcttggtatcaacaacaccccgggaaagcccctaaattgatgatctacgacgtgagcaatcgacctagtggcgtatcaaatcgcttctctggtagcaagagtgggaatacggcgtcccttactattagcggattgcaagcagaagatgaggccgattactactgcagctcctatactagctcttctacattgtacgtctttgggagcggaacaaaagtaacagtactcacaacaacacctgccccgagaccgcctacaccagccccgactattgccagccagcctctgagcctcaggcctgaggcctgtaggcccgcagcgggcggcgcagttcatacacggggcttggatttcgcttgtgatatttatatttgggctcctttggcggggacatgtggcgtgctgcttctgtcacttgttattacactgtactgtaaacgcgggcgaaaaaaattgctgtatatttttaagcagccatttatgaggcccgttcagacgacgcaggaggaggacggttgctcttgcaggttcccagaagaggaagaagggggctgtgaattgcgggttaaattttcaagatccgcagacgctccagcataccaacagggacaaaaccaactctataacgagctgaatcttggaagaagggaggaatatgatgtgctggataaacggcgcggtagagatccggagatgggcggaaaaccaaggcgaaaaaaccctcaggagggactctacaacgaactgcagaaagacaaaatggcggaggcttattccgaaataggcatgaagggcgagcggaggcgagggaaagggcacgacggactgtatcaaggcctctcaaccgcgactaaggatacgtacgacgccctgcacatgcaggccctgcctccgaga (SEQ ID NO: 259)

Таблица 11A. Дополнительные иллюстративные последовательности связывающих средств для BCMA на основе PI161 SEQ ID NO Область Последовательность 400 VH CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCCGGCGGCGGCGTGGTGCAGCCAGGCCGGTCCCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTTTCCTCTTATGGCATGCACTGGGTGAGACAGGCACCTGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGGCCGTGATCTCCTACGACGGCTCTAACAAGTATTACGCCGATAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCCGCGACAACTCCAAGAATACACTGTATCTGCAGATGAATAGCCTGCGGGCCGAGGATACCGCCGTGTATTACTGCGGAGGCTCCGGCTACGCACTGCACGACGATTATTACGGACTGGACGTGTGGGGACAGGGCACCCTGGTCACAGTGAGCTCC 401 VH CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGCGGAGGAGTGGTGCAGCCAGGCCGGTCCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCAGCGGCTTCACATTTTCTAGCTACGGAATGCACTGGGTGCGCCAGGCACCTGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGGCCGTGATCTCCTATGACGGCTCTAACAAGTACTATGCCGATTCCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCCGCGACAACTCCAAGAATACACTGTACCTGCAGATGAATTCCCTGCGGGCCGAGGATACCGCCGTGTACTATTGTGGCGGCTCTGGCTATGCCCTGCACGACGATTACTATGGACTGGACGTGTGGGGACAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCCTCT 402 VH CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGCGGAGGAGTGGTGCAGCCAGGCCGGAGCCTGAGACTGTCCTGCGCCGCCTCTGGCTTCACCTTTAGCTCCTATGGCATGCACTGGGTGAGACAGGCACCTGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGGCCGTGATCAGCTACGACGGCTCCAACAAGTATTACGCCGATAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCTCTCGCGACAACAGCAAGAATACACTGTATCTGCAGATGAATTCCCTGCGGGCCGAGGATACAGCCGTGTATTACTGCGGAGGCAGCGGCTACGCACTGCACGACGATTATTACGGACTGGACGTGTGGGGACAGGGCACCCTGGTCACAGTGTCTAGC 403 VH CAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCGGCGGCGTGGTGCAGCCCGGCCGGTCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCTCCGGCTTCACCTTTAGCTCCTACGGAATGCACTGGGTGCGCCAGGCACCTGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGGCCGTGATCTCTTATGACGGCAGCAACAAGTACTATGCCGATAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCTCCCGCGACAACTCTAAGAATACACTGTACCTGCAGATGAATAGCCTGCGGGCCGAGGATACCGCCGTGTACTATTGCGGAGGCTCCGGCTATGCACTGCACGACGATTACTATGGACTGGACGTGTGGGGACAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCTAGC 404 VH CAGGTCCAGCTGCAGGAGAGTGGGGGGGGGGTCGTCCAGCCCGGAAGAAGCCTGAGACTGTCATGTGCCGCATCTGGGTTTACTTTTAGCTCCTATGGAATGCACTGGGTGCGCCAGGCACCTGGCAAGTGCCTGGAGTGGGTGGCCGTGATCTCCTACGACGGCTCTAACAAGTACTATGCCGATAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCAGAGACAACTCCAAGAATACACTGTATCTGCAGATGAATTCTCTGCGGGCCGAGGATACCGCCGTGTACTATTGTGGAGGCTCCGGCTACGCACTGCACGACGATTACTATGGACTGGACGTGTGGGGACAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCTAGC 405 VH CAGGTCCAGCTGCAGGAATCCGGCGGAGGAGTGGTGCAGCCAGGCCGGTCTCTGAGACTGAGCTGCGCCGCCTCCGGCTTCACATTTTCCTCTTATGGCATGCACTGGGTGAGACAGGCCCCTGGCAAGTGTCTGGAGTGGGTGGCCGTGATCTCTTACGACGGCAGCAACAAGTATTACGCCGATAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCTCCCGCGACAACTCTAAGAATACACTGTATCTGCAGATGAATTCCCTGCGGGCCGAGGATACCGCCGTGTATTACTGCGGCGGCTCTGGCTACGCCCTGCACGACGACTACTATGGACTGGATGTCTGGGGGCAGGGCACACTGGTCACTGTCTCTTCA 406 VH CAGGTCCAGCTGCAGGAATCAGGGGGGGGGGTCGTCCAGCCCGGAAGAAGTCTGAGACTGTCATGTGCCGCATCAGGGTTTACCTTTAGCTCCTATGGAATGCACTGGGTGCGCCAGGCACCTGGCAAGTGCCTGGAGTGGGTGGCCGTGATCTCCTACGACGGCTCTAACAAGTACTATGCCGATAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCAGAGACAACTCCAAGAATACACTGTATCTGCAGATGAATTCTCTGCGGGCCGAGGATACCGCCGTGTACTATTGTGGAGGCTCCGGCTACGCACTGCACGACGATTACTATGGACTGGACGTGTGGGGACAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCTAGC 407 VH CAGGTCCAGCTGCAGGAATCCGGCGGAGGAGTGGTGCAGCCAGGCCGGTCTCTGAGACTGAGCTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTTTCCTCTTATGGCATGCACTGGGTGAGACAGGCCCCTGGCAAGTGTCTGGAGTGGGTGGCCGTGATCTCTTACGACGGCAGCAACAAGTATTACGCCGATAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCTCCCGCGACAACTCTAAGAATACACTGTATCTGCAGATGAATTCCCTGCGGGCCGAGGATACAGCCGTGTATTACTGTGGCGGCTCTGGCTACGCCCTGCATGATGATTATTATGGACTGGATGTCTGGGGGCAGGGCACACTGGTCACTGTCTCTTCC 408 VL CAGTCTGCCCTGACCCAGCCAGCAAGCGTGTCCGGCTCTCCTGGCCAGAGCATCACAATCTCCTGCACCGGCACAAGCTCCGACGTGGGAGGCTATAACTACGTGAGCTGGTATCAGCAGCACCCAGGCAAGGCCCCCAAGCTGATGATCTACGACGTGAGCAACAGGCCTTCTGGCGTGAGCAATCGCTTCAGCGGCTCCAAGTCTGGCAATACCGCCTCTCTGACAATCAGCGGCCTGCAGGCAGAGGACGAGGCAGATTATTACTGCTCTAGCTATACCTCCTCTAGCACACTGTACGTGTTTGGCAGCGGCACCAAGGTGACAGTGCTG 409 VL CAGAGCGCCCTGACCCAGCCAGCATCCGTGTCTGGCAGCCCAGGCCAGTCTATCACAATCAGCTGCACCGGCACAAGCTCCGACGTGGGAGGCTACAACTATGTGAGCTGGTACCAGCAGCACCCTGGCAAGGCCCCAAAGCTGATGATCTATGACGTGAGCAACCGGCCATCCGGCGTGTCTAATAGATTCTCCGGCTCTAAGAGCGGCAATACCGCCTCCCTGACAATCTCTGGCCTGCAGGCAGAGGACGAGGCAGATTACTATTGTTCTAGCTACACCTCCTCTAGCACACTGTACGTGTTCGGCAGCGGCACCAAGGTGACAGTGCTG 410 VL CAGTCTGCCCTGACCCAGCCAGCAAGCGTGTCCGGCTCTCCTGGCCAGTCCATCACAATCTCTTGTACCGGCACATCCTCTGACGTGGGCGGCTATAACTACGTGTCCTGGTATCAGCAGCACCCAGGCAAGGCCCCCAAGCTGATGATCTACGATGTGAGCAACAGGCCTTCTGGCGTGAGCAATCGCTTCAGCGGCTCCAAGTCTGGCAATACCGCCAGCCTGACAATCTCCGGCCTGCAGGCAGAGGACGAGGCAGATTATTACTGCAGCTCCTATACCTCTAGCTCCACACTGTACGTGTTTGGCAGCGGCACCAAGGTGACAGTGCTG 411 VL CAGAGCGCCCTGACCCAGCCAGCATCCGTGTCTGGCAGCCCAGGCCAGTCCATCACAATCTCTTGCACCGGCACATCTAGCGACGTGGGCGGCTACAACTACGTGAGCTGGTACCAGCAGCACCCTGGCAAGGCCCCAAAGCTGATGATCTATGATGTGAGCAACCGGCCCTCCGGCGTGTCTAATAGATTCTCCGGCTCTAAGAGCGGCAATACCGCCAGCCTGACAATCTCCGGCCTGCAGGCAGAGGACGAGGCAGATTACTATTGCTCCTCTTACACCAGCTCCTCTACACTGTACGTGTTCGGCTCCGGCACCAAGGTGACAGTGCTG 412 VL CAGTCTGCCCTGACCCAGCCTGCAAGCGTGTCCGGCTCTCCAGGCCAGTCTATCACAATCAGCTGTACCGGCACAAGCTCCGACGTGGGCGGCTATAACTACGTGAGCTGGTATCAGCAGCACCCTGGCAAGGCCCCAAAGCTGATGATCTACGACGTGAGCAACCGGCCCTCTGGCGTGAGCAATCGGTTCAGCGGCAGCAAGTCTGGCAATACCGCCTCCCTGACAATCTCTGGCCTGCAGGCAGAGGACGAGGCAGATTATTACTGTAGCAGTTATACTTCAAGCTCAACCCTGTACGTGTTTGGATGCGGCACTAAGGTCACCGTCCTG 413 VL CAGTCTGCTCTGACCCAGCCCGCTTCCGTCTCAGGGTCTCCAGGACAGTCAATTACCATTAGTTGCACAGGCACCTCATCCGATGTGGGCGGCTATAACTACGTGTCCTGGTATCAGCAGCACCCAGGCAAGGCCCCCAAGCTGATGATCTACGACGTGAGCAACAGGCCATCTGGCGTGAGCAATCGCTTCAGCGGCTCCAAGTCTGGCAATACCGCCAGCCTGACAATCTCCGGCCTGCAGGCAGAGGACGAGGCAGATTACTATTGCAGCTCCTATACCTCTAGCTCCACACTGTACGTGTTTGGCTGTGGCACCAAGGTGACAGTGCTG 414 VL CAGTCTGCCCTGACCCAGCCTGCAAGCGTGTCCGGCTCTCCAGGCCAGTCTATCACAATCAGCTGTACCGGCACAAGCTCCGACGTGGGCGGCTATAACTACGTGAGCTGGTATCAGCAGCACCCTGGCAAGGCCCCAAAGCTGATGATCTACGACGTGAGCAACCGGCCCTCTGGCGTGAGCAATCGGTTCAGCGGCAGCAAGTCTGGCAATACCGCCTCCCTGACAATCTCTGGCCTGCAGGCAGAGGACGAGGCAGATTATTACTGTAGCTCCTACACTTCTTCAAGCACACTGTATGTCTTTGGATGCGGAACTAAGGTCACTGTCCTG 415 VL CAGTCTGCTCTGACCCAGCCCGCTTCCGTCTCAGGATCTCCAGGACAGTCTATTACAATTAGTTGCACAGGAACCTCTTCCGATGTGGGCGGCTATAACTACGTGTCCTGGTATCAGCAGCACCCAGGCAAGGCCCCCAAGCTGATGATCTACGACGTGAGCAACAGGCCTTCTGGCGTGAGCAATCGCTTCAGCGGCTCCAAGTCTGGCAATACCGCCAGCCTGACAATCTCCGGCCTGCAGGCAGAGGACGAGGCAGATTACTATTGCAGCTCCTATACCTCTAGCTCCACACTGTACGTGTTTGGCTGTGGCACCAAGGTGACAGTGCTG SEQ ID NO: 93 VH для BCMA (PI61) QVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 102 VL для BCMA (PI61) QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGSGTKVTVL SEQ ID NO: 333 Вариант VH для BCMA (PI61) QVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKCLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 334 Вариант VL для BCMA (PI61) QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGCGTKVTVL

Таблица 12. Аминокислотные последовательности и последовательности нуклеиновой кислоты иллюстративных молекул, связывающихся с BCMA, полученных из гибридомы SEQ ID NO Название/описание Последовательность Hy03 SEQ ID NO: 137 HCDR1 (Kabat) GFWMS SEQ ID NO: 138 HCDR2 (Kabat) NIKQDGSEKYYVDSVRG SEQ ID NO: 139 HCDR3 (Kabat) ALDYYGMDV SEQ ID NO: 140 HCDR1 (Chothia) GFTFSGF SEQ ID NO: 141 HCDR2 (Chothia) KQDGSE SEQ ID NO: 139 HCDR3 (Chothia) ALDYYGMDV SEQ ID NO: 142 HCDR1 (IMGT) GFTFSGFW SEQ ID NO: 143 HCDR2 (IMGT) IKQDGSEK SEQ ID NO: 144 HCDR3 (IMGT) ARALDYYGMDV SEQ ID NO: 145 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGFWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARALDYYGMDVWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 146 ДНК VH GAAGTGCAACTGGTGGAGAGCGGTGGAGGGCTTGTCCAGCCCGGAGGATCGCTGCGGCTGTCCTGTGCTGCGTCCGGGTTCACCTTCTCCGGCTTCTGGATGTCCTGGGTCAGACAGGCACCGGGAAAGGGCCTCGAATGGGTGGCCAACATCAAGCAGGATGGCTCCGAGAAGTACTACGTCGACTCCGTGAGAGGCCGCTTCACCATCTCCCGGGACAACGCCAAGAACTCGCTGTACCTCCAAATGAATAGCCTCAGGGCGGAAGATACTGCTGTGTATTACTGCGCACGCGCCCTTGACTACTACGGCATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACTGTGACCGTGTCTAGC SEQ ID NO: 147 LCDR1 (Kabat) RSSQSLLDSDDGNTYLD SEQ ID NO: 148 LCDR2 (Kabat) TLSYRAS SEQ ID NO: 149 LCDR3 (Kabat) TQRLEFPSIT SEQ ID NO: 150 LCDR1 (Chothia) SQSLLDSDDGNTY SEQ ID NO: 151 LCDR2 (Chothia) TLS SEQ ID NO: 152 LCDR3 (Chothia) RLEFPSI SEQ ID NO: 153 LCDR1 (IMGT) QSLLDSDDGNTY SEQ ID NO: 151 LCDR2 (IMGT) TLS SEQ ID NO: 149 LCDR3 (IMGT) TQRLEFPSIT SEQ ID NO: 154 VL DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSDDGNTYLDWYLQKPGQSPRLLIYTLSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGLYYCTQRLEFPSITFGQGTRLEIK SEQ ID NO: 155 ДНК VL GATATCGTGATGACCCAGACTCCCCTGTCCCTGCCTGTGACTCCCGGAGAACCAGCCTCCATTTCCTGCCGGTCCTCCCAGTCCCTGCTGGACAGCGACGACGGCAACACTTACCTGGACTGGTACTTGCAGAAGCCGGGCCAATCGCCTCGCCTGCTGATCTATACCCTGTCATACCGGGCCTCAGGAGTGCCTGACCGCTTCTCGGGATCAGGGAGCGGGACCGATTTCACCCTGAAAATTTCCCGAGTGGAAGCCGAGGACGTCGGACTGTACTACTGCACCCAGCGCCTCGAATTCCCGTCGATTACGTTTGGACAGGGTACCCGGCTTGAGATCAAG SEQ ID NO: 63 Линкер GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO: 156 scFv (VH-линкер-VL) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGFWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARALDYYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSDDGNTYLDWYLQKPGQSPRLLIYTLSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGLYYCTQRLEFPSITFGQGTRLEIK SEQ ID NO: 157 ДНК scFv GAAGTGCAACTGGTGGAGAGCGGTGGAGGGCTTGTCCAGCCCGGAGGATCGCTGCGGCTGTCCTGTGCTGCGTCCGGGTTCACCTTCTCCGGCTTCTGGATGTCCTGGGTCAGACAGGCACCGGGAAAGGGCCTCGAATGGGTGGCCAACATCAAGCAGGATGGCTCCGAGAAGTACTACGTCGACTCCGTGAGAGGCCGCTTCACCATCTCCCGGGACAACGCCAAGAACTCGCTGTACCTCCAAATGAATAGCCTCAGGGCGGAAGATACTGCTGTGTATTACTGCGCACGCGCCCTTGACTACTACGGCATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACTGTGACCGTGTCTAGCGGAGGCGGAGGTTCAGGGGGCGGTGGATCAGGCGGAGGAGGATCGGGGGGTGGTGGATCGGATATCGTGATGACCCAGACTCCCCTGTCCCTGCCTGTGACTCCCGGAGAACCAGCCTCCATTTCCTGCCGGTCCTCCCAGTCCCTGCTGGACAGCGACGACGGCAACACTTACCTGGACTGGTACTTGCAGAAGCCGGGCCAATCGCCTCGCCTGCTGATCTATACCCTGTCATACCGGGCCTCAGGAGTGCCTGACCGCTTCTCGGGATCAGGGAGCGGGACCGATTTCACCCTGAAAATTTCCCGAGTGGAAGCCGAGGACGTCGGACTGTACTACTGCACCCAGCGCCTCGAATTCCCGTCGATTACGTTTGGACAGGGTACCCGGCTTGAGATCAAG SEQ ID NO: 158 Полная аминокислотная последовательность CAR EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGFWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARALDYYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSDDGNTYLDWYLQKPGQSPRLLIYTLSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGLYYCTQRLEFPSITFGQGTRLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 159 Полная последовательность ДНК CAR GAAGTGCAACTGGTGGAGAGCGGTGGAGGGCTTGTCCAGCCCGGAGGATCGCTGCGGCTGTCCTGTGCTGCGTCCGGGTTCACCTTCTCCGGCTTCTGGATGTCCTGGGTCAGACAGGCACCGGGAAAGGGCCTCGAATGGGTGGCCAACATCAAGCAGGATGGCTCCGAGAAGTACTACGTCGACTCCGTGAGAGGCCGCTTCACCATCTCCCGGGACAACGCCAAGAACTCGCTGTACCTCCAAATGAATAGCCTCAGGGCGGAAGATACTGCTGTGTATTACTGCGCACGCGCCCTTGACTACTACGGCATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACTGTGACCGTGTCTAGCGGAGGCGGAGGTTCAGGGGGCGGTGGATCAGGCGGAGGAGGATCGGGGGGTGGTGGATCGGATATCGTGATGACCCAGACTCCCCTGTCCCTGCCTGTGACTCCCGGAGAACCAGCCTCCATTTCCTGCCGGTCCTCCCAGTCCCTGCTGGACAGCGACGACGGCAACACTTACCTGGACTGGTACTTGCAGAAGCCGGGCCAATCGCCTCGCCTGCTGATCTATACCCTGTCATACCGGGCCTCAGGAGTGCCTGACCGCTTCTCGGGATCAGGGAGCGGGACCGATTTCACCCTGAAAATTTCCCGAGTGGAAGCCGAGGACGTCGGACTGTACTACTGCACCCAGCGCCTCGAATTCCCGTCGATTACGTTTGGACAGGGTACCCGGCTTGAGATCAAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACCAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG Hy52 SEQ ID NO: 160 HCDR1 (Kabat) SFRMN SEQ ID NO: 161 HCDR2 (Kabat) SISSSSSYIYYADSVKG SEQ ID NO: 162 HCDR3 (Kabat) WLSYYGMDV SEQ ID NO: 163 HCDR1 (Chothia) GFTFSSF SEQ ID NO: 164 HCDR2 (Chothia) SSSSSY SEQ ID NO: 162 HCDR3 (Chothia) WLSYYGMDV SEQ ID NO: 165 HCDR1 (IMGT) GFTFSSFR SEQ ID NO: 166 HCDR2 (IMGT) ISSSSSYI SEQ ID NO: 167 HCDR3 (IMGT) ARWLSYYGMDV SEQ ID NO: 168 VH EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSFRMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWLSYYGMDVWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 169 ДНК VH GAAGTGCAACTGGTGGAGAGCGGTGGAGGGCTTGTCAAGCCCGGAGGATCGCTGCGGCTGTCCTGTGCTGCGTCCGGGTTCACCTTCTCCTCGTTCCGCATGAACTGGGTCAGACAGGCACCGGGAAAGGGCCTCGAATGGGTGTCCTCAATCTCATCGTCCTCGTCCTACATCTACTACGCCGACTCCGTGAAAGGCCGCTTCACCATCTCCCGGGACAACGCCAAGAACTCGCTGTACCTCCAAATGAATAGCCTCAGGGCGGAAGATACTGCTGTGTATTACTGCGCACGCTGGCTTTCCTACTACGGCATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACTGTGACCGTGTCTAGC SEQ ID NO: 147 LCDR1 (Kabat) RSSQSLLDSDDGNTYLD SEQ ID NO: 170 LCDR2 (Kabat) TLSFRAS SEQ ID NO: 171 LCDR3 (Kabat) MQRIGFPIT SEQ ID NO: 150 LCDR1 (Chothia) SQSLLDSDDGNTY SEQ ID NO: 151 LCDR2 (Chothia) TLS SEQ ID NO: 172 LCDR3 (Chothia) RIGFPI SEQ ID NO: 153 LCDR1 (IMGT) QSLLDSDDGNTY SEQ ID NO: 151 LCDR2 (IMGT) TLS SEQ ID NO: 171 LCDR3 (IMGT) MQRIGFPIT SEQ ID NO: 173 VL DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSDDGNTYLDWYLQKPGQSPQLLIYTLSFRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKIRRVEAEDVGVYYCMQRIGFPITFGQGTRLEIK SEQ ID NO: 174 ДНК VL GATATCGTGATGACCCAGACTCCCCTGTCCCTGCCTGTGACTCCCGGAGAACCAGCCTCCATTTCCTGCCGGTCCTCCCAGTCCCTGCTGGACAGCGACGACGGCAACACTTACCTGGACTGGTACTTGCAGAAGCCGGGCCAATCGCCTCAGCTGCTGATCTATACCCTGTCATTCCGGGCCTCAGGAGTGCCTGACCGCTTCTCGGGATCAGGGAGCGGGACCGATTTCACCCTGAAAATTAGGCGAGTGGAAGCCGAGGACGTCGGAGTGTACTACTGCATGCAGCGCATCGGCTTCCCGATTACGTTTGGACAGGGTACCCGGCTTGAGATCAAG SEQ ID NO: 63 Линкер GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO: 175 scFv (VH-линкер-VL) EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSFRMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWLSYYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSDDGNTYLDWYLQKPGQSPQLLIYTLSFRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKIRRVEAEDVGVYYCMQRIGFPITFGQGTRLEIK SEQ ID NO: 176 ДНК scFv GAAGTGCAACTGGTGGAGAGCGGTGGAGGGCTTGTCAAGCCCGGAGGATCGCTGCGGCTGTCCTGTGCTGCGTCCGGGTTCACCTTCTCCTCGTTCCGCATGAACTGGGTCAGACAGGCACCGGGAAAGGGCCTCGAATGGGTGTCCTCAATCTCATCGTCCTCGTCCTACATCTACTACGCCGACTCCGTGAAAGGCCGCTTCACCATCTCCCGGGACAACGCCAAGAACTCGCTGTACCTCCAAATGAATAGCCTCAGGGCGGAAGATACTGCTGTGTATTACTGCGCACGCTGGCTTTCCTACTACGGCATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACTGTGACCGTGTCTAGCGGAGGCGGAGGTTCAGGGGGCGGTGGATCAGGCGGAGGAGGATCGGGGGGTGGTGGATCGGATATCGTGATGACCCAGACTCCCCTGTCCCTGCCTGTGACTCCCGGAGAACCAGCCTCCATTTCCTGCCGGTCCTCCCAGTCCCTGCTGGACAGCGACGACGGCAACACTTACCTGGACTGGTACTTGCAGAAGCCGGGCCAATCGCCTCAGCTGCTGATCTATACCCTGTCATTCCGGGCCTCAGGAGTGCCTGACCGCTTCTCGGGATCAGGGAGCGGGACCGATTTCACCCTGAAAATTAGGCGAGTGGAAGCCGAGGACGTCGGAGTGTACTACTGCATGCAGCGCATCGGCTTCCCGATTACGTTTGGACAGGGTACCCGGCTTGAGATCAAG SEQ ID NO: 177 Полная аминокислотная последовательность CAR EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSFRMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWLSYYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSDDGNTYLDWYLQKPGQSPQLLIYTLSFRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKIRRVEAEDVGVYYCMQRIGFPITFGQGTRLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 178 Полная последовательность ДНК CAR GAAGTGCAACTGGTGGAGAGCGGTGGAGGGCTTGTCAAGCCCGGAGGATCGCTGCGGCTGTCCTGTGCTGCGTCCGGGTTCACCTTCTCCTCGTTCCGCATGAACTGGGTCAGACAGGCACCGGGAAAGGGCCTCGAATGGGTGTCCTCAATCTCATCGTCCTCGTCCTACATCTACTACGCCGACTCCGTGAAAGGCCGCTTCACCATCTCCCGGGACAACGCCAAGAACTCGCTGTACCTCCAAATGAATAGCCTCAGGGCGGAAGATACTGCTGTGTATTACTGCGCACGCTGGCTTTCCTACTACGGCATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACTGTGACCGTGTCTAGCGGAGGCGGAGGTTCAGGGGGCGGTGGATCAGGCGGAGGAGGATCGGGGGGTGGTGGATCGGATATCGTGATGACCCAGACTCCCCTGTCCCTGCCTGTGACTCCCGGAGAACCAGCCTCCATTTCCTGCCGGTCCTCCCAGTCCCTGCTGGACAGCGACGACGGCAACACTTACCTGGACTGGTACTTGCAGAAGCCGGGCCAATCGCCTCAGCTGCTGATCTATACCCTGTCATTCCGGGCCTCAGGAGTGCCTGACCGCTTCTCGGGATCAGGGAGCGGGACCGATTTCACCCTGAAAATTAGGCGAGTGGAAGCCGAGGACGTCGGAGTGTACTACTGCATGCAGCGCATCGGCTTCCCGATTACGTTTGGACAGGGTACCCGGCTTGAGATCAAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACCAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG

Таблица 13. CDR по Kabat иллюстративных молекул, связывающихся с BCMA, полученных из гибридомы Kabat HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3 Hy03 GFWMS (SEQ ID NO: 137) NIKQDGSEKYYVDSVRG (SEQ ID NO: 138) ALDYYGMDV (SEQ ID NO: 139) RSSQSLLDSDDGNTYLD (SEQ ID NO: 147) TLSYRAS (SEQ ID NO: 148) TQRLEFPSIT (SEQ ID NO: 149) Hy52 SFRMN (SEQ ID NO: 160) SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID NO: 161) WLSYYGMDV (SEQ ID NO: 162) RSSQSLLDSDDGNTYLD (SEQ ID NO: 147) TLSFRAS (SEQ ID NO: 170) MQRIGFPIT (SEQ ID NO: 171) Консенсусная последовательность X₁FX₂MX₃, где X₁ представляет собой G или S; X₂ представляет собой W или R; и X₃ представляет собой S или N (SEQ ID NO: 179) X₁IX₂X₃X₄X₅SX₆X₇YYX₈DSVX₉G, где X₁ представляет собой N или S; X₂ представляет собой K или S; X₃ представляет собой Q или S; X₄ представляет собой D или S; X₅ представляет собой G или S; X₆ представляет собой E или Y; X₇ представляет собой K или I; X₈ представляет собой V или A; и X₉ представляет собой R или K (SEQ ID NO: 180) X₁LX₂YYGMDV, где X₁ представляет собой A или W; и X₂ представляет собой D или S (SEQ ID NO: 181) RSSQSLLDSDDGNTYLD (SEQ ID NO: 147) TLSXRAS, где X представляет собой Y или F (SEQ ID NO: 182) X₁QRX₂X₃FPX₄IT, где X₁ представляет собой T или M; X₂ представляет собой L или I; X₃ представляет собой E или G; и X₄ представляет собой S или отсутствует (SEQ ID NO: 183)

Таблица 14. CDR по Chothia иллюстративных молекул, связывающихся с BCMA, полученных из гибридомы Chothia HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3 Hy03 GFTFSGF (SEQ ID NO: 140) KQDGSE (SEQ ID NO: 141) ALDYYGMDV (SEQ ID NO: 139) SQSLLDSDDGNTY (SEQ ID NO: 150) TLS (SEQ ID NO: 151) RLEFPSI (SEQ ID NO: 152) Hy52 GFTFSSF (SEQ ID NO: 163) SSSSSY (SEQ ID NO: 164) WLSYYGMDV (SEQ ID NO: 162) SQSLLDSDDGNTY (SEQ ID NO: 150) TLS (SEQ ID NO: 151) RIGFPI (SEQ ID NO: 172) Консенсусная последовательность GFTFSXF, где X представляет собой G или S (SEQ ID NO: 184) X₁X₂X₃X₄SX₅, где X₁ представляет собой K или S; X₂ представляет собой Q или S; X₃ представляет собой D или S; X₄ представляет собой G или S; и X₅ представляет собой E или Y (SEQ ID NO: 185) X₁LX₂YYGMDV, где X₁ представляет собой A или W; и X₂ представляет собой D или S (SEQ ID NO: 181) SQSLLDSDDGNTY (SEQ ID NO: 150) TLS (SEQ ID NO: 151) RX₁X₂FPX₃I, где X₁ представляет собой L или I; X₂ представляет собой E или G; и X₃ представляет собой S или отсутствует (SEQ ID NO: 186)

Таблица 15. CDR по IMGT иллюстративных молекул, связывающихся с BCMA, полученных из гибридомы IMGT HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3 Hy03 GFTFSGFW (SEQ ID NO: 142) IKQDGSEK (SEQ ID NO: 143) ARALDYYGMDV (SEQ ID NO: 144) QSLLDSDDGNTY (SEQ ID NO: 153) TLS (SEQ ID NO: 151) TQRLEFPSIT (SEQ ID NO: 149) Hy52 GFTFSSFR (SEQ ID NO: 165) ISSSSSYI (SEQ ID NO: 166) ARWLSYYGMDV (SEQ ID NO: 167) QSLLDSDDGNTY (SEQ ID NO: 153) TLS (SEQ ID NO: 151) MQRIGFPIT (SEQ ID NO: 171) Консенсусная последовательность GFTFSX₁FX₂, где X₁ представляет собой G или S; и X₂ представляет собой W или R (SEQ ID NO: 187) IX₁X₂X₃X₄SX₅X₆, где X₁ представляет собой K или S; X₂ представляет собой Q или S; X₃ представляет собой D или S; X₄ представляет собой G или S; X₅ представляет собой E или Y; и X₆ представляет собой K или I (SEQ ID NO: 188) ARX₁LX₂YYGMDV, где X₁ представляет собой A или W; и X₂ представляет собой D или S (SEQ ID NO: 189) QSLLDSDDGNTY (SEQ ID NO: 153) TLS (SEQ ID NO: 151) X₁QRX₂X₃FPX₄IT, где X₁ представляет собой T или M; X₂ представляет собой L или I; X₃ представляет собой E или G; и X₄ представляет собой S или отсутствует (SEQ ID NO: 183)

Таблица 20. Аминокислотные последовательности и последовательности нуклеиновой кислоты иллюстративных молекул, связывающихся с BCMA SEQ ID NO Название/
описание Последовательность duBCMA.4 SEQ ID NO: 231 HCDR1 (Kabat) NHGMS SEQ ID NO: 232 HCDR2 (Kabat) GIVYSGSTYYAASVKG SEQ ID NO: 233 HCDR3 (Kabat) HGGESDV SEQ ID NO: 234 HCDR1 (Chothia) GFALSNH SEQ ID NO: 235 HCDR2 (Chothia) VYSGS SEQ ID NO: 233 HCDR3 (Chothia) HGGESDV SEQ ID NO: 236 HCDR1 (IMGT) GFALSNHG SEQ ID NO: 237 HCDR2 (IMGT) IVYSGST SEQ ID NO: 238 HCDR3 (IMGT) SAHGGESDV SEQ ID NO: 239 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFALSNHGMSWVRRAPGKGLEWVSGIVYSGSTYYAASVKGRFTISRDNSRNTLYLQMNSLRPEDTAIYYCSAHGGESDVWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 262 ДНК VH GAAGTGCAATTGGTGGAATCAGGGGGAGGACTTGTGCAGCCTGGAGGATCGCTGAGACTGTCATGTGCCGTGTCCGGCTTTGCCCTGTCCAACCACGGGATGTCCTGGGTCCGCCGCGCGCCTGGAAAGGGCCTCGAATGGGTGTCGGGTATTGTGTACAGCGGTAGCACCTACTATGCCGCATCCGTGAAGGGGAGATTCACCATCAGCCGGGACAACTCCAGGAACACTCTGTACCTCCAAATGAATTCGCTGAGGCCAGAGGACACTGCCATCTACTACTGCTCCGCGCATGGCGGAGAGTCCGACGTCTGGGGACAGGGGACCACCGTGACCGTGTCTAGC SEQ ID NO: 54 LCDR1 (Kabat) RASQSISSYLN SEQ ID NO: 55 LCDR2 (Kabat) AASSLQS SEQ ID NO: 240 LCDR3 (Kabat) QQSYSTPYT SEQ ID NO: 57 LCDR1 (Chothia) SQSISSY SEQ ID NO: 58 LCDR2 (Chothia) AAS SEQ ID NO: 241 LCDR3 (Chothia) SYSTPY SEQ ID NO: 60 LCDR1 (IMGT) QSISSY SEQ ID NO: 58 LCDR2 (IMGT) AAS SEQ ID NO: 240 LCDR3 (IMGT) QQSYSTPYT SEQ ID NO: 242 VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPYTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 263 ДНК VL GACATCCAGCTCACCCAGTCCCCGAGCTCGCTGTCCGCCTCCGTGGGAGATCGGGTCACCATCACGTGCCGCGCCAGCCAGTCGATTTCCTCCTACCTGAACTGGTACCAACAGAAGCCCGGAAAAGCCCCGAAGCTTCTCATCTACGCCGCCTCGAGCCTGCAGTCAGGAGTGCCCTCACGGTTCTCCGGCTCCGGTTCCGGTACTGATTTCACCCTGACCATTTCCTCCCTGCAACCGGAGGACTTCGCTACTTACTACTGCCAGCAGTCGTACTCCACCCCCTACACTTTCGGACAAGGCACCAAGGTCGAAATCAAG SEQ ID NO: 243 Линкер ASGGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO: 200 scFv (VH-линкер-VL) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFALSNHGMSWVRRAPGKGLEWVSGIVYSGSTYYAASVKGRFTISRDNSRNTLYLQMNSLRPEDTAIYYCSAHGGESDVWGQGTTVTVSSASGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPYTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 201 ДНК scFv Gaagtgcaattggtggaatcagggggaggacttgtgcagcctggaggatcgctgagactgtcatgtgccgtgtccggctttgccctgtccaaccacgggatgtcctgggtccgccgcgcgcctggaaagggcctcgaatgggtgtcgggtattgtgtacagcggtagcacctactatgccgcatccgtgaaggggagattcaccatcagccgggacaactccaggaacactctgtacctccaaatgaattcgctgaggccagaggacactgccatctactactgctccgcgcatggcggagagtccgacgtctggggacaggggaccaccgtgaccgtgtctagcgcgtccggcggaggcggcagcgggggtggtggttcagggggcggcggatcggacatccagctcacccagtccccgagctcgctgtccgcctccgtgggagatcgggtcaccatcacgtgccgcgccagccagtcgatttcctcctacctgaactggtaccaacagaagcccggaaaagccccgaagcttctcatctacgccgcctcgagcctgcagtcaggagtgccctcacggttctccggctccggttccggtactgatttcaccctgaccatttcctccctgcaaccggaggacttcgctacttactactgccagcagtcgtactccaccccctacactttcggacaaggcaccaaggtcgaaatcaag SEQ ID NO: 230 Полная аминокислотная последовательность CAR EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFALSNHGMSWVRRAPGKGLEWVSGIVYSGSTYYAASVKGRFTISRDNSRNTLYLQMNSLRPEDTAIYYCSAHGGESDVWGQGTTVTVSSASGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPYTFGQGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

Таблица 26. CDR иллюстративных молекул, связывающихся с BCMA duBCMA.4 HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3 Kabat SEQ ID NO: 231 SEQ ID NO: 232 SEQ ID NO: 233 SEQ ID NO: 54 SEQ ID NO: 55 SEQ ID NO: 240 Chothia SEQ ID NO: 234 SEQ ID NO: 235 SEQ ID NO: 233 SEQ ID NO: 57 SEQ ID NO: 58 SEQ ID NO: 241 IMGT SEQ ID NO: 236 SEQ ID NO: 237 SEQ ID NO: 238 SEQ ID NO: 60 SEQ ID NO: 58 SEQ ID NO: 240

В некоторых вариантах осуществления человеческий домен, связывающий BCMA, содержит CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC.

В определенных вариантах осуществления молекула CAR, описанная в данном документе, или домен, связывающий BCMA, описанный в данном документе, содержат:

(1) одну, две или три CDR легкой цепи (LC), выбранные из

(i) CDR1 LC под SEQ ID NO: 54, CDR2 LC под SEQ ID NO: 55 и CDR3 LC под SEQ ID NO: 56; и/или

(2) одну, две или три CDR тяжелой цепи (HC) из любой из следующих:

(i) CDR1 HC под SEQ ID NO: 44, CDR2 HC под SEQ ID NO: 45 и CDR3 HC под SEQ ID NO: 84; (ii) CDR1 HC под SEQ ID NO: 44, CDR2 HC под SEQ ID NO: 45 и CDR3 HC под SEQ ID NO: 46; (iii) CDR1 HC под SEQ ID NO: 44, CDR2 HC под SEQ ID NO: 45 и CDR3 HC под SEQ ID NO: 68 или (iv) CDR1 HC под SEQ ID NO: 44, CDR2 HC под SEQ ID NO: 45 и CDR3 HC под SEQ ID NO: 76.

В определенных вариантах осуществления молекула CAR, описанная в данном документе, или домен, связывающий BCMA, описанный в данном документе, содержат:

(1) одну, две или три CDR легкой цепи (LC) из любой из следующих:

(i) CDR1 LC под SEQ ID NO: 95, CDR2 LC под SEQ ID NO: 131 и CDR3 LC под SEQ ID NO: 132; (ii) CDR1 LC под SEQ ID NO: 95, CDR2 LC под SEQ ID NO: 96 и CDR3 LC под SEQ ID NO: 97; (iii) CDR1 LC под SEQ ID NO: 95, CDR2 LC под SEQ ID NO: 114 и CDR3 LC под SEQ ID NO: 115 или (iv) CDR1 LC под SEQ ID NO: 95, CDR2 LC под SEQ ID NO: 114 и CDR3 LC под SEQ ID NO: 97; и/или

(2) одну, две или три CDR тяжелой цепи (HC) из любой из следующих:

(i) CDR1 HC под SEQ ID NO: 86, CDR2 HC под SEQ ID NO: 130 и CDR3 HC под SEQ ID NO: 88; (ii) CDR1 HC под SEQ ID NO: 86, CDR2 HC под SEQ ID NO: 87 и CDR3 HC под SEQ ID NO: 88 или (iii) CDR1 HC под SEQ ID NO: 86, CDR2 HC под SEQ ID NO: 109 и CDR3 HC под SEQ ID NO: 88.

В определенных вариантах осуществления молекула CAR, описанная в данном документе, или домен, связывающий BCMA, описанный в данном документе, содержат:

(1) одну, две или три CDR легкой цепи (LC) из любой из следующих:

(i) CDR1 LC под SEQ ID NO: 147, CDR2 LC под SEQ ID NO: 182 и CDR3 LC под SEQ ID NO: 183; (ii) CDR1 LC под SEQ ID NO: 147, CDR2 LC под SEQ ID NO: 148 и CDR3 LC под SEQ ID NO: 149 или (iii) CDR1 LC под SEQ ID NO: 147, CDR2 LC под SEQ ID NO: 170 и CDR3 LC под SEQ ID NO: 171; и/или

(2) одну, две или три CDR тяжелой цепи (HC) из любой из следующих:

(i) CDR1 HC под SEQ ID NO: 179, CDR2 HC под SEQ ID NO: 180 и CDR3 HC под SEQ ID NO: 181; (ii) CDR1 HC под SEQ ID NO: 137, CDR2 HC под SEQ ID NO: 138 и CDR3 HC под SEQ ID NO: 139 или (iii) CDR1 HC под SEQ ID NO: 160, CDR2 HC под SEQ ID NO: 161 и CDR3 HC под SEQ ID NO: 162.

В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 44, 45, 84, 54, 55 и 56 соответственно. В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 44, 45, 46, 54, 55 и 56 соответственно. В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 44, 45, 68, 54, 55 и 56 соответственно. В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 44, 45, 76, 54, 55 и 56 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 47, 48, 84, 57, 58 и 59 соответственно. В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 47, 48, 46, 57, 58 и 59 соответственно. В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 47, 48, 68, 57, 58 и 59 соответственно. В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 47, 48, 76, 57, 58 и 59 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 49, 50, 85, 60, 58 и 56 соответственно. В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 49, 50, 51, 60, 58 и 56 соответственно. В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 49, 50, 69, 60, 58 и 56 соответственно. В некоторых вариантах осуществления CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 49, 50, 77, 60, 58 и 56 соответственно.

В некоторых вариантах осуществления человеческий домен, связывающий BCMA, содержит scFv, содержащий VH (например, VH, описанную в данном документе) и VL (например, VL, описанную в данном документе). В некоторых вариантах осуществления VH присоединена к VL посредством линкера, например, линкера, описанного в данном документе, например, линкера, описанного в таблице 1. В некоторых вариантах осуществления человеческий домен, связывающий BCMA, содержит линкер (Gly₄-Ser)n, где n равняется 1, 2, 3, 4, 5 или 6, предпочтительно 3 или 4 (SEQ ID NO: 26). Вариабельная область легкой цепи и вариабельная область тяжелой цепи scFv могут быть представлены, например, в любой из следующих ориентаций: вариабельная область легкой цепи-линкер-вариабельная область тяжелой цепи или вариабельная область тяжелой цепи-линкер-вариабельная область легкой цепи.

В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, представляет собой фрагмент, например, одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv). В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий BCMA, представляет собой Fv, Fab (Fab')2 или бифункциональное (например, биспецифическое) гибридное антитело (например, Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)). В некоторых вариантах осуществления антитела и их фрагменты по настоящему изобретению связываются c белком BCMA с аффинностью дикого типа или усиленной аффинностью.

В некоторых случаях scFv можно получить в соответствии со способом, известным из уровня техники (см., например, Bird et al., (1988) Science 242:423-426 и Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Молекулы scFv можно получить путем связывания VH- и VL-областей друг с другом с помощью гибких полипептидных линкеров. Молекулы scFv содержат линкер (например, линкер Ser-Gly) с оптимизированными длиной и/или аминокислотным составом. Длина линкера может сильно влиять на укладку и взаимодействие вариабельных областей scFv. В действительности, если используют короткий полипептидный линкер (например, длиной 5-10 аминокислот), то внутрицепочечное сворачивание предотвращается. Межцепочечное сворачивание также необходимо для объединения двух вариабельных областей вместе с образованием функционального эпитопсвязывающего участка. Примеры ориентации и размера линкеров см., например, в Hollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448, публикациях заявок на патент США №№ 2005/0100543, 2005/0175606, 2007/0014794 и публикациях согласно PCT №№ WO2006/020258 и WO2007/024715, включенных в данный документ посредством ссылки.

ScFv может содержать линкер из по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, или больше аминокислотных остатков между его VL- и VH-областями. Линкерная последовательность может содержать любую встречающуюся в природе аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления линкерная последовательность содержит аминокислоты глицин и серин. В некоторых вариантах осуществления линкерная последовательность содержит группы глициновых и сериновых повторов, таких как (Gly₄Ser)n, где n представляет собой положительное целое число, которое равняется или больше 1 (SEQ ID NO: 25). В некоторых вариантах осуществления линкер может представлять собой (Gly₄Ser)₄ (SEQ ID NO: 27) или (Gly₄Ser)₃(SEQ ID NO: 28). При изменении длины линкера может сохраняться или усиливаться активность, что приводит к улучшению эффективности в исследованиях активности.

CAR для CD20

В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе клетка, экспрессирующая CAR, представляет собой клетку, экспрессирующую CAR для CD20 (например, клетку, экспрессирующую CAR, который связывается с CD20 человека). В некоторых вариантах осуществления клетка, экспрессирующая CAR для CD20, содержит антигенсвязывающий домен согласно WO2016164731 и WO2018067992, включенным в данный документ посредством ссылки. Иллюстративные последовательности, связывающие CD20, или последовательности CAR для CD20 раскрыты, например, в таблицах 1-5 из WO2018067992. В некоторых вариантах осуществления CAR для CD20 содержит CDR, вариабельную область, scFv или полноразмерную последовательность CAR для CD20, раскрытую в WO2018067992 или WO2016164731.

CAR для CD22

В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе клетка, экспрессирующая CAR, представляет собой клетку, экспрессирующую CAR для CD22 (например, клетку, экспрессирующую CAR, который связывается с CD22 человека). В некоторых вариантах осуществления клетка, экспрессирующая CAR для CD22, содержит антигенсвязывающий домен согласно WO2016164731 и WO2018067992, включенным в данный документ посредством ссылки. Иллюстративные последовательности, связывающие CD22, или последовательности CAR для CD22 раскрыты в, например, таблицах 6A, 6B, 7A, 7B, 7C, 8A, 8B, 9A, 9B, 10A и 10B согласно WO2016164731 и таблицах 6-10 согласно WO2018067992. В некоторых вариантах осуществления последовательность CAR для CD22 содержит CDR, вариабельную область, scFv или полноразмерную последовательность CAR для CD22, раскрытую в WO2018067992 или WO2016164731.

В ряде вариантов осуществления молекула CAR содержит антигенсвязывающий домен, который связывается с CD22 (CAR для CD22). В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен нацеливается на CD22 человека. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен содержит последовательность одноцепочечного Fv, описанного в данном документе.

Последовательности CAR для CD22 человека представлены ниже. В некоторых вариантах осуществления CAR для CD22 человека представляет собой CAR22-65.

Последовательность scFv CAR для CD22 человека

EVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSMLSNSDTWNWIRQSPSRGLEWLGRTYHRSTWYDDYASSVRGRVSINVDTSKNQYSLQLNAVTPEDTGVYYCARVRLQDGNSWSDAFDVWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASASGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGTGTQLTVL (SEQ ID NO: 285)

Вариабельная область тяжелой цепи CAR для CD22 человека

EVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSMLSNSDTWNWIRQSPSRGLEWLGRTYHRSTWYDDYASSVRGRVSINVDTSKNQYSLQLNAVTPEDTGVYYCARVRLQDGNSWSDAFDVWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO 286)

Вариабельная область легкой цепи CAR для CD22 человека

QSALTQPASASGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGTGTQLTVL (SEQ ID NO 287)

Таблица 16. CDR вариабельного домена тяжелой цепи CAR для CD22 (CAR22-65) Кандидат HCDR1 SEQ ID NO: HCDR2 SEQ ID NO: HCDR3 SEQ ID NO: CAR22-65 согласно комбинации определений GDSMLSNSDTWN 288 RTYHRSTWYDDYASSVRG 290 VRLQDGNSWSDAFDV 291 CAR22-65 по Kabat SNSDTWN 289 RTYHRSTWYDDYASSVRG 290 VRLQDGNSWSDAFDV 291

Таблица 17. CDR вариабельного домена легкой цепи CAR для CD22 (CAR22-65). Последовательности CDR LC в данной таблице имеют одинаковую последовательность согласно определению по Kabat или комбинации определений Кандидат LCDR1 SEQ ID NO: LCDR2 SEQ ID NO: LCDR3 SEQ ID NO: CAR22-65 согласно комбинации определений TGTSSDVGGYNYVS 95 DVSNRPS 96 SSYTSSSTLYV 97

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен содержит CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC с любыми аминокислотными последовательностями тяжелой цепи связывающего домена, перечисленными в таблице 16. В ряде вариантов осуществления антигенсвязывающий домен дополнительно содержит CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC. В ряде вариантов осуществления антигенсвязывающий домен содержит аминокислотные последовательности CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC, перечисленные в таблице 17.

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен содержит одну, две или все из CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC с любыми аминокислотными последовательностями легкой цепи связывающего домена, перечисленными в таблице 17, и одну, две или все из CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC с любыми аминокислотными последовательностями тяжелой цепи связывающего домена, перечисленными в таблице 16.

В некоторых вариантах осуществления CDR определены в соответствии со схемой нумерации по Kabat, схемой нумерации по Chothia или их комбинацией.

Порядок, в котором VL- и VH-домены представлены в scFv, может варьироваться (т. е. в ориентации VL-VH или VH-VL), и при этом любое количество из одной, двух, трех или четырех копий субъединиц "G4S" (SEQ ID NO: 25), где каждая субъединица содержит последовательность GGGGS (SEQ ID NO: 25) (например, (G4S)₃ (SEQ ID NO: 28) или (G4S)₄ (SEQ ID NO: 27)), может соединять вариабельные домены для создания целого scFv-домена. В качестве альтернативы конструкция CAR может содержать, например, линкер, содержащий последовательность GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 43). В качестве альтернативы конструкция CAR может содержать, например, линкер содержащий последовательность LAEAAAK (SEQ ID NO: 308). В одном варианте осуществления конструкция CAR не содержит линкер между VL- и VH-доменами.

Все эти клоны содержали изменение остатка Q/K в сигнальном домене костимулирующего домена, полученного из дзета-цепи CD3.

CAR для EGFR

В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе клетка, экспрессирующая CAR, представляет собой клетку, экспрессирующую CAR для EGFR (например, клетку, экспрессирующую CAR, который связывается с EGFR человека). В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе клетка, экспрессирующая CAR, представляет собой клетку, экспрессирующую CAR для EGFRvIII (например, клетку, экспрессирующую CAR, который связывается с EGFRvIII человека). Иллюстративные CAR для EGFRvIII могут содержать последовательности, раскрытые в WO2014/130657, например, в таблице 2 из WO2014/130657, включенной в данный документ посредством ссылки.

Иллюстративные последовательности, связывающие EGFRvIII, или последовательности CAR для EGFR могут содержать CDR, вариабельную область, scFv или полноразмерную последовательность CAR из CAR для EGFR, раскрытого в WO2014/130657.

CAR для мезотелина

В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе клетка, экспрессирующая CAR, представляет собой клетку, экспрессирующую CAR для мезотелина (например, клетку, экспрессирующую CAR, который связывается с мезотелином человека). Иллюстративные CAR для мезотелина могут содержать последовательности, раскрытые в WO2015090230 и WO2017112741, например, в таблицах 2, 3, 4 и 5 из WO2017112741, включенных в данный документ посредством ссылки.

Другие иллюстративные CAR

В других вариантах осуществления клетки, экспрессирующие CAR, могут специфично связываться с CD123, например, могут содержать молекулу CAR (например, любую из CAR1-CAR8) или антигенсвязывающий домен согласно таблицам 1-2 из WO 2014/130635, включенной в данный документ посредством ссылки. Аминокислотные последовательности молекул и антигенсвязывающих доменов CAR для CD123 (например, содержащих одну, две, три CDR VH и одну, две, три CDR VL согласно Kabat или Chothia) и нуклеотидные последовательности, кодирующие их, указаны в WO 2014/130635. В других вариантах осуществления клетки, экспрессирующие CAR, могут специфично связываться с CD123, например, могут содержать молекулу CAR (например, любую из молекул от CAR123-1 до CAR123-4 и от hzCAR123-1 до hzCAR123-32) или ее антигенсвязывающий домен согласно таблицам 2, 6 и 9 из WO2016/028896, включенной в данный документ посредством ссылки. Аминокислотные последовательности молекул и антигенсвязывающих доменов CAR для CD123 (например, содержащих одну, две, три CDR VH и одну, две, три CDR VL согласно Kabat или Chothia) и нуклеотидные последовательности, кодирующие их, указаны в WO2016/028896.

В некоторых вариантах осуществления молекула CAR предусматривает CAR для CLL1, описанный в данном документе, например, CAR для CLL1, описанный в US2016/0051651A1, включенной в данный документ посредством ссылки. В ряде вариантов осуществления CAR для CLL1 содержит аминокислотную последовательность или имеет нуклеотидную последовательность, показанные в US2016/0051651A1, включенной в данный документ посредством ссылки. В других вариантах осуществления клетки, экспрессирующие CAR, могут специфично связываться с CLL-1, например, могут содержать молекулу CAR или антигенсвязывающий домен согласно таблице 2 из WO2016/014535, включенной в данный документ посредством ссылки. Аминокислотные последовательности молекул и антигенсвязывающих доменов CAR для CLL-1 (например, содержащих одну, две, три CDR VH и одну, две, три CDR VL согласно Kabat или Chothia) и нуклеотидные последовательности, кодирующие их, указаны в WO2016/014535.

В некоторых вариантах осуществления молекула CAR предусматривает CAR для CD33, описанный в данном документе, например, CAR для CD33, описанный в US2016/0096892A1, включенной в данный документ посредством ссылки. В ряде вариантов осуществления CAR для CD33 содержит аминокислотную последовательность или имеет нуклеотидную последовательность, показанные в US2016/0096892A1, включенной в данный документ посредством ссылки. В других вариантах осуществления клетки, экспрессирующие CAR, могут специфично связываться с CD33, например, могут содержать молекулу CAR (например, любую из молекул от CAR33-1 до CAR-33-9) или антигенсвязывающий домен согласно таблице 2 или 9 из WO2016/014576, включенной в данный документ посредством ссылки. Аминокислотные последовательности молекул и антигенсвязывающих доменов CAR для CD33 (например, содержащих одну, две, три CDR VH и одну, две, три CDR VL согласно Kabat или Chothia) и нуклеотидные последовательности, кодирующие их, указаны в WO2016/014576.

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен содержит одну, две, три (например, все три) CDR тяжелой цепи - CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC - из антитела, описанного в данном документе (например, антитела, описанного в WO2015/142675, US-2015-0283178-A1, US-2016-0046724-A1, US2014/0322212A1, US2016/0068601A1, US2016/0051651A1, US2016/0096892A1, US2014/0322275A1 или WO2015/090230, включенных в данный документ посредством ссылки), и/или одну, две, три (например, все три) CDR легкой цепи - CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC - из антитела, описанного в данном документе (например, антитела, описанного в WO2015/142675, US-2015-0283178-A1, US-2016-0046724-A1, US2014/0322212A1, US2016/0068601A1, US2016/0051651A1, US2016/0096892A1, US2014/0322275A1 или WO2015/090230, включенных в данный документ посредством ссылки). В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен содержит вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи антитела, указанного выше.

В ряде вариантов осуществления антигенсвязывающий домен представляет собой антигенсвязывающий домен, описанный в WO2015/142675, US-2015-0283178-A1, US-2016-0046724-A1, US2014/0322212A1, US2016/0068601A1, US2016/0051651A1, US2016/0096892A1, US2014/0322275A1 или WO2015/090230, включенных в данный документ посредством ссылки.

В ряде вариантов осуществления антигенсвязывающий домен нацеливается на BCMA и описан в US-2016-0046724-A1. В ряде вариантов осуществления антигенсвязывающий домен нацеливается на CD19 и описан в US-2015-0283178-A1. В ряде вариантов осуществления антигенсвязывающий домен нацеливается на CD123 и описан в US2014/0322212A1, US2016/0068601A1. В ряде вариантов осуществления антигенсвязывающий домен нацеливается на CLL1 и описан в US2016/0051651A1. В ряде вариантов осуществления антигенсвязывающий домен нацеливается на CD33 и описан в US2016/0096892A1.

Иллюстративные антигены-мишени, на которые можно нацеливаться с помощью клеток, экспрессирующих CAR, включают без ограничения, среди прочих, CD19, CD123, EGFRvIII, CD33, мезотелин, BCMA и GFR-альфа 4, описанные, например, в WO2014/153270, WO 2014/130635, WO2016/028896, WO 2014/130657, WO2016/014576, WO 2015/090230, WO2016/014565, WO2016/014535 и WO2016/025880, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

В других вариантах осуществления клетки, экспрессирующие CAR, могут специфично связываться с GFR-альфа 4, например, могут содержать молекулу CAR или антигенсвязывающий домен согласно таблице 2 из WO2016/025880, включенной в данный документ посредством ссылки. Аминокислотные последовательности молекул и антигенсвязывающих доменов CAR для GFR-альфа 4 (например, содержащих одну, две, три CDR VH и одну, две, три CDR VL согласно Kabat или Chothia) и нуклеотидные последовательности, кодирующие их, указаны в WO2016/025880.

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен любой из молекул CAR, описанных в данном документе (например, для любого из CD19, CD123, EGFRvIII, CD33, мезотелина, BCMA и GFR-альфа 4), содержит одну, две, три (например, все три) CDR тяжелой цепи - CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC - из антитела, указанного выше, и/или одну, две, три (например, все три) CDR легкой цепи - CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC - из антигенсвязывающего домена, указанного выше. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен содержит вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи антитела, указанного или описанного выше.

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен содержит одну, две, три (например, все три) CDR тяжелой цепи - CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC - из антитела, указанного выше, и/или одну, две, три (например, все три) CDR легкой цепи - CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC - из антитела, указанного выше. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен содержит вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи антитела, указанного или описанного выше.

В некоторых вариантах осуществления опухолевый антиген представляет собой опухолевый антиген, описанный в международной заявке WO2015/142675, поданной 13 марта 2015 года, включенной в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В некоторых вариантах осуществления опухолевый антиген выбран из одного или нескольких из CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS-1 (также называемого CD2 субпопуляции 1, CRACC, SLAMF7, CD319 и 19A24); молекулы 1, подобной лектинам С-типа (CLL-1 или CLECL1); CD33; варианта III рецептора эпидермального фактора роста (EGFRvIII); ганглиозида G2 (GD2); ганглиозида GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer); антигена созревания В-клеток (BCMA), являющегося представителем семейства рецепторов TNF; Tn-антигена ((Ag Tn) или (GalNAcα-Ser/Thr)); простатического специфического мембранного антигена (PSMA); орфанного рецептора 1, подобного рецепторной тирозинкиназе (ROR1); Fms-подобной тирозинкиназы 3 (FLT3); опухолеассоциированного гликопротеина 72 (TAG72); CD38; CD44v6; раково-эмбрионального антигена (СЕА); молекулы адгезии эпителиальных клеток (ЕРСАМ); В7Н3 (CD276); KIT (CD117); альфа-2-субъединицы рецептора интерлейкина-13 (IL-13Ra2 или CD213A2); мезотелина; альфа-субъединицы рецептора интерлейкина 11 (IL-11Ra); антигена стволовых клеток предстательной железы (PSCA); сериновой протеазы 21 (тестизина или PRSS21); рецептора 2 фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR2); антигена системы Льюис (Y); CD24; рецептора фактора роста тромбоцитов бета-типа (PDGFR-бета); стадиеспецифического эмбрионального антигена 4 (SSEA-4); CD20; рецептора фолиевой кислоты альфа; рецепторной тирозинпротеинкиназы ERBB2 (Her2/neu); муцина 1, ассоциированного с клеточной поверхностью (MUC1); рецептора эпидермального фактора роста (EGFR); молекулы адгезии нервных клеток (NCAM); простазы; простатической кислой фосфатазы (РАР); мутантного фактора элонгации 2 (ELF2M); эфрина В2; белка активации фибробластов альфа (FAP); рецептора инсулиноподобного фактора роста 1 (рецептора IGF-I), карбоангидразы IX (CAIX); субъединицы бета-типа 9 протеасомы (просомы, мультикаталитической протеазы) (LMP2); гликопротеина 100 (gp100); онкогенного слитого белка, состоящего из кластерного региона точечных разрывов (BCR) и гомолога 1 онкогена вируса лейкоза мышей Абельсона (Abl) (bcr-abl); тирозиназы; рецептора 2 эфрина А-типа (EphA2); фукозил-GM1; молекулы адгезии, представляющей собой сиалилированный антиген системы Льюис (sLe); ганглиозида GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer); трансглутаминазы 5 (TGS5); высокомолекулярного антигена, ассоциированного с меланомой (HMWMAA); ганглиозида о-ацетил-GD2 (OAcGD2); рецептора фолиевой кислоты бета; опухолевого эндотелиального маркера 1 (TEM1/CD248); белка, родственного опухолевому эндотелиальному маркеру 7 (TEM7R); клаудина 6 (CLDN6); рецептора тиреотропного гормона (TSHR); представителя D группы 5 класса С рецепторов, сопряженных с G-белками (GPRC5D); белка, кодируемого открытой рамкой считывания 61 X-хромосомы (CXORF61); CD97; CD179a; киназы анапластической лимфомы (ALK); полисиаловой кислоты; плацентоспецифического белка 1 (PLAC1); гексасахаридной части гликоцерамида globoH (GloboH); дифференцировочного антигена молочной железы (NY-BR-1); уроплакина 2 (UPK2); клеточного рецептора 1 вируса гепатита A (HAVCR1); бета-3-адренорецептора (ADRB3); паннексина 3 (PANX3); рецептора 20, сопряженного с G-белком (GPR20); антигена локуса K9 комплекса лимфоцитарных антигенов 6 (LY6K); обонятельного рецептора 51Е2 (OR51E2); белка, кодируемого альтернативной рамкой считывания гена TCR-гамма (TARP); белка опухоли Вильмса (WT1); раково-тестикулярного антигена 1 (NY-ESO-1); раково-тестикулярного антигена 2 (LAGE-1a); антигена 1, ассоциированного с меланомой (MAGE-A1); белка, кодируемого транслокационным вариантом 6 гена ETS, локализованным в р-плече 12 хромосомы (ETV6-AML); белка спермы 17 (SPA17); представителя 1А семейства X-антигенов (XAGE1); ангиопоэтин-связывающего рецептора клеточной поверхности 2 (TIE-2); раково-тестикулярного антигена меланомы 1 (MAD-CT-1); раково-тестикулярного антигена меланомы 2 (MAD-CT-2); Fos-родственного антигена 1; опухолевого белка р53 (р53); мутантного р53; простеина; сурвивина; теломеразы; опухолевого антигена 1 карциномы предстательной железы (РСТА-1 или галектина 8), антигена меланомы 1, распознаваемого Т-клетками (MelanA или MART1); мутантного антигена саркомы крыс (Ras); обратной транскриптазы теломеразы человека (hTERT); антигена саркомы с точечными разрывами при транслокации; меланомного ингибитора апоптоза (ML-IAP); ERG (продукта слитого гена трансмембранной сериновой протеазы 2 (TMPRSS2) и ETS); N-ацетилглюкозаминилтрансферазы V (NA17); белка с парным box-доменом Рах-3 (РАХЗ); андрогенового рецептора; циклина В1; нейробластомного гомолога онкогена вируса миелоцитоматоза птиц v-myc (MYCN); представителя С семейства гомологов Ras (RhoC); белка 2, родственного тирозиназе (TRP-2); цитохрома Р450 1В1 (CYP1B1); белка, подобного CCCTC-связывающему фактору (белку с "цинковыми пальцами") (BORIS или "брата регулятора импринтированных сайтов"), антигена плоскоклеточной карциномы 3, распознаваемого Т-клетками (SART3); белка с парным box-доменом Рах-5 (РАХ5); проакрозин-связывающего белка sp32 (OY-TES1); лимфоцитоспецифической протеинтирозинкиназы (LCK); якорного белка 4 киназы A (AKAP-4); антигена 2 синовиальной саркомы с точечным разрывом в X-хромосоме (SSX2); рецептора конечных продуктов гликирования (RAGE-1); почечного убиквитарного белка 1 (RU1); почечного убиквитарного белка 2 (RU2); легумаина; Е6 вируса папилломы человека (Е6 HPV); Е7 вируса папилломы человека (Е7 HPV); кишечной карбоксилэстеразы; мутантного белка теплового шока 70-2 (мутантного варианта hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; иммуноглобулиноподобного рецептора 1, ассоциированного с лейкоцитами (LAIR1); рецептора Fc-фрагмента IgA (FCAR или CD89); представителя 2 подсемейства А лейкоцитарных иммуноглобулиноподобных рецепторов (LILRA2); представителя f семейства белков, подобных молекулам CD300 (CD300LF); представителя А семейства 12 лектиновых доменов С-типа (CLEC12A); антигена 2 стромальных клеток костного мозга (BST2); белка 2, подобного муциноподобному рецептору гормона, содержащего EGF-подобный модуль (EMR2); лимфоцитарного антигена 75 (LY75); глипикана-3 (GPC3); антигена 5, подобного Fc-рецептору (FCRL5); и полипептида 1, подобного иммуноглобулину лямбда (IGLL1).

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен содержит одну, две, три (например, все три) CDR тяжелой цепи - CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC - из антитела, указанного выше, и/или одну, две, три (например, все три) CDR легкой цепи - CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC - из антитела, указанного выше. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен содержит вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи антитела, указанного или описанного выше.

В некоторых вариантах осуществления домен, связывающий опухолевый антиген, представляет собой фрагмент, например, одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv). В некоторых вариантах осуществления связывающий домен для антигена, ассоциированного с раком, описанного в данном документе, представляет собой Fv, Fab (Fab')2 или бифункциональное (например, биспецифическое) гибридное антитело (например, Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)). В некоторых вариантах осуществления антитела и их фрагменты по настоящему изобретению связываются с белком, представляющим собой антиген, ассоциированный с раком, описанный в данном документе, с аффинностью дикого типа или усиленной аффинностью.

В некоторых случаях scFv можно получить согласно способу, известному из уровня техники (см., например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426 и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Молекулы scFv можно получить путем связывания VH- и VL-областей друг с другом с помощью гибких полипептидных линкеров. Молекулы scFv содержат линкер (например, линкер Ser-Gly) с оптимизированными длиной и/или аминокислотным составом. Длина линкера может сильно влиять на укладку и взаимодействие вариабельных областей scFv. В действительности, если используют короткий полипептидный линкер (например, длиной 5-10 аминокислот), то внутрицепочечное сворачивание предотвращается. Межцепочечное сворачивание также необходимо для объединения двух вариабельных областей вместе с образованием функционального эпитопсвязывающего участка. Примеры ориентации и размера линкеров см., например, в Hollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448, публикациях заявок на патент США №№ 2005/0100543, 2005/0175606, 2007/0014794 и публикациях согласно PCT №№ WO2006/020258 и WO2007/024715, которые включены в данный документ посредством ссылки.

ScFv может содержать линкер из по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, или больше аминокислотных остатков между его VL- и VH-областями. Линкерная последовательность может содержать любую встречающуюся в природе аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления линкерная последовательность содержит аминокислоты глицин и серин. В некоторых вариантах осуществления линкерная последовательность содержит группы глициновых и сериновых повторов, таких как (Gly₄Ser)n, где n представляет собой положительное целое число, которое равняется или больше 1 (SEQ ID NO: 25). В некоторых вариантах осуществления линкер может представлять собой (Gly₄Ser)₄ (SEQ ID NO: 27) или (Gly₄Ser)₃(SEQ ID NO: 28). При изменении длины линкера может сохраняться или усиливаться активность, что приводит к улучшению эффективности в исследованиях активности.

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен представляет собой T-клеточный рецептор ("TCR") или его фрагмент, например, одноцепочечный TCR (scTCR). Способы получения таких TCR известны из уровня техники. См., например, Willemsen RA et al, Gene Therapy 7: 1369-1377 (2000); Zhang T et al, Cancer Gene Ther 11: 487-496 (2004); Aggen et al, Gene Ther. 19(4):365-74 (2012) (литературные источники включены в данный документ во всей своей полноте). Например, может быть сконструирован scTCR, который содержит гены Vα и Vβ из клона Т-клеток, связанные с помощью линкера (например, гибкого пептида). Данный подход является весьма применимым для мишени, ассоциированной с раком, которая сама по себе является внутриклеточной, однако фрагмент такого антигена (пептида) презентируется на поверхности раковых клеток с помощью MHC.

Трансмембранный домен

Что касается трансмембранного домена, в различных вариантах осуществления CAR можно разработать таким образом, чтобы он содержал трансмембранный домен, присоединенный к внеклеточному домену CAR. Трансмембранный домен может содержать одну или несколько дополнительных аминокислот, прилегающих к трансмембранной области, например, одну или несколько аминокислот, относящихся к внеклеточной области белка, из которого получен трансмембранный домен (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и вплоть до 15 аминокислот внеклеточной области), и/или одну или несколько дополнительных аминокислот, относящихся к внутриклеточной области белка, из которого получен трансмембранный домен (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и вплоть до 15 аминокислот внутриклеточной области). В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен представляет собой домен, ассоциированный с одним из остальных используемых доменов CAR. В некоторых случаях трансмембранный домен можно выбрать или модифицировать с помощью аминокислотной замены, чтобы избежать связывания таких доменов с трансмембранными доменами тех же или других поверхностных мембранных белков, например, чтобы свести к минимуму взаимодействия с другими элементами рецепторного комплекса. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен способен к гомодимеризации с другим CAR на поверхности клетки, экспрессирующей CAR, например, CAR-T-клетки. В некоторых вариантах осуществления аминокислотную последовательность трансмембранного домена можно модифицировать или подвергнуть замене таким образом, чтобы свести к минимуму взаимодействия со связывающими доменами нативного партнера по связыванию, присутствующего в той же клетке, экспрессирующей CAR, например, CAR-T.

Трансмембранный домен может быть получен из природного либо из рекомбинантного источника. Если источник является природным, то домен может быть получен из любого мембраносвязанного или трансмембранного белка. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен способен передавать сигнал внутриклеточному(внутриклеточным) домену(доменам) всякий раз, когда CAR связался с мишенью. Трансмембранный домен, особенно применимый в настоящем изобретении, может содержать по меньшей мере трансмембранную(трансмембранные) область(области), например, альфа-, бета- или дзета-цепи Т-клеточного рецептора, CD28, CD3-эпсилон, CD45, CD4, CD5, CD8 (например, CD8-альфа, CD8-бета), CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен может содержать по меньшей мере трансмембранную(трансмембранные) область(области) костимулирующей молекулы, например, молекулы MHC I класса, белковых рецепторов TNF, иммуноглобулиноподобных белков, рецепторов цитокинов, интегринов, сигнальных молекул активации лимфоцитов (белков SLAM), активирующих рецепторов NK-клеток, BTLA, лиганда Toll-подобного рецептора, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8-альфа, CD8-бета, IL2R-бета, IL2R-гамма, IL7R-альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a и лиганда, который специфично связывается с CD83.

В некоторых случаях трансмембранный домен может быть присоединен к внеклеточной области CAR, например, антигенсвязывающему домену CAR, с помощью шарнирной области, например, шарнирной области из белка человека. Например, в некоторых вариантах осуществления шарнирная область может представлять собой шарнирную область Ig (иммуноглобулина) человека, например, шарнирную область IgG4 или шарнирную область CD8a. В некоторых вариантах осуществления шарнирная область или спейсер содержат аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2 (например, состоят из нее). В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен содержит трансмембранный домен под SEQ ID NO: 6 (например, состоит из него).

В некоторых вариантах осуществления шарнирная область или спейсер включают шарнирную область IgG4. Например, в некоторых вариантах осуществления шарнирная область или спейсер включают шарнирную область под SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления шарнирная область или спейсер включают шарнирную область, кодируемую нуклеотидной последовательностью под SEQ ID NO: 14.

В некоторых вариантах осуществления шарнирная область или спейсер включают шарнирную область IgD. Например, в некоторых вариантах осуществления шарнирная область или спейсер включают шарнирную область с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления шарнирная область или спейсер включают шарнирную область, кодируемую нуклеотидной последовательностью под SEQ ID NO: 15.

В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен может быть рекомбинантным, и в этом случае он будет содержать главным образом гидрофобные остатки, такие как лейцин и валин. В некоторых вариантах осуществления на каждом конце рекомбинантного трансмембранного домена может находиться триплет из фенилаланина, триптофана и валина.

Короткий олиго- или полипептидный линкер длиной от 2 до 10 аминокислот необязательно может образовывать связь между трансмембранным доменом и цитоплазматической областью CAR. Глицин-сериновый дублет является особенно подходящим линкером. Например, в некоторых вариантах осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления линкер кодируется нуклеотидной последовательностью под SEQ ID NO: 16.

В некоторых вариантах осуществления шарнирная область или спейсер включают в себя шарнирную область KIR2DS2.

Цитоплазматический домен

Цитоплазматические домен или область CAR по настоящему изобретению содержат внутриклеточный сигнальный домен. Внутриклеточный сигнальный домен обычно отвечает за активацию по меньшей мере одной из нормальных эффекторных функций иммунной клетки, в которую был введен CAR.

Примеры внутриклеточных сигнальных доменов для применения в CAR по настоящему изобретению включают цитоплазматические последовательности Т-клеточного рецептора (TCR) и корецепторов, которые действуют совместно с инициированием передачи сигнала после вступления в контакт с антигенным рецептором, а также любое производное или вариант этих последовательностей и любую рекомбинантную последовательность, которая обладает такими же функциональными способностями.

Известно, что сигналы, образуемые при участии только TCR, являются недостаточными для полной активации Т-клетки, и что также необходим вторичный и/или костимулирующий сигнал. Таким образом, можно сказать, что активация Т-клеток опосредуется двумя различными классами цитоплазматических сигнальных последовательностей: теми, которые инициируют антигензависимую первичную активацию посредством TCR (первичные внутриклеточные сигнальные домены), и теми, которые действуют антигеннезависимым образом, передавая вторичный или костимулирующий сигнал (вторичный цитоплазматический домен, например, костимулирующий домен).

Первичный сигнальный домен регулирует первичную активацию комплекса TCR стимулирующим образом либо ингибирующим образом. Первичные внутриклеточные сигнальные домены, которые действуют стимулирующим образом, могут содержать сигнальные мотивы, известные как иммунорецепторные тирозиновые активирующие мотивы или ITAM.

Примеры ITAM-содержащих первичных внутриклеточных сигнальных доменов, которые являются особенно применимыми в настоящем изобретении, включают домены из TCR-дзета, FcR-гамма, FcR-бета, CD3-гамма, CD3-дельта, CD3-эпсилон, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 (также известного как "ICOS"), FcεRI, DAP10, DAP12 и CD66d. В некоторых вариантах осуществления CAR по настоящему изобретению содержит внутриклеточный сигнальный домен, например, первичный сигнальный домен CD3-дзета.

В некоторых вариантах осуществления первичный сигнальный домен содержит модифицированный домен ITAM, например, мутантный домен ITAM, который обладает измененной (например, повышенной или пониженной) активностью по сравнению с нативным доменом ITAM. В некоторых вариантах осуществления первичный сигнальный домен содержит модифицированный ITAM-содержащий первичный внутриклеточный сигнальный домен, например, оптимизированный и/или усеченный ITAM-содержащий первичный внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления первичный сигнальный домен содержит один, два, три, четыре или больше мотивов ITAM.

Дополнительные примеры молекул, содержащих первичный внутриклеточный сигнальный домен, являющихся особенно применимыми в настоящем изобретении, включают молекулы DAP10, DAP12 и CD32.

Внутриклеточный сигнальный домен CAR может содержать первичный сигнальный домен, например, сигнальный домен CD3-дзета, в отдельности или в комбинации с любым(любыми) другим(другими) требуемым(требуемыми) внутриклеточным(внутриклеточными) сигнальным(сигнальными) доменом(доменами), применимым(применимыми) в качестве составной части CAR по настоящему изобретению. Например, внутриклеточный сигнальный домен CAR может содержать первичный сигнальный домен, например, часть дзета-цепи CD3, и костимулирующий сигнальный домен. Костимулирующий сигнальный домен относится к части CAR, содержащей внутриклеточный домен костимулирующей молекулы. Костимулирующая молекула представляет собой молекулу клеточной поверхности, отличную от антигенного рецептора или его лигандов, которая необходима для эффективного ответа лимфоцитов на антиген. Примеры такой молекулы включают молекулу MHC I класса, белковые рецепторы TNF, иммуноглобулиноподобные белки, рецепторы цитокинов, интегрины, сигнальные молекулы активации лимфоцитов (белки SLAM), активирующие рецепторы NK-клеток, BTLA, лиганд Toll-подобного рецептора, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8-альфа, CD8-бета, IL2R-бета, IL2R-гамма, IL7R-альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a и лиганд, который специфично связывается с CD83, и т. п. Например, было продемонстрировано, что костимуляция с помощью CD27 усиливает размножение, эффекторную функцию и выживание CAR-T-клеток человека in vitro и усиливает персистенцию и противоопухолевую активность T-клеток человека in vivo (Song et al. Blood. 2012; 119(3):696-706). Внутриклеточные сигнальные последовательности в цитоплазматической части CAR по настоящему изобретению могут быть связаны друг с другом в случайном или установленном порядке. Короткий олиго- или полипептидный линкер, например, длиной от 2 до 10 аминокислот (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот) необязательно может образовывать связь между внутриклеточными сигнальными последовательностями. В некоторых вариантах осуществления в качестве подходящего линкера может применяться глицин-сериновый дублет. В некоторых вариантах осуществления в качестве подходящего линкера может применяться одна аминокислота, например, аланин, глицин.

В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен разработан таким образом, что он содержит два или более, например, 2, 3, 4, 5 или более, костимулирующих сигнальных доменов. В некоторых вариантах осуществления два или более, например, 2, 3, 4, 5 или более, костимулирующих сигнальных доменов разделены линкерной молекулой, например, линкерной молекулой, описанной в данном документе. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит два костимулирующих сигнальных домена. В некоторых вариантах осуществления линкерная молекула представляет собой глициновый остаток. В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой аланиновый остаток.

В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен разработан таким образом, что он содержит сигнальный домен CD3-дзета и сигнальный домен CD28. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен разработан таким образом, что он содержит сигнальный домен CD3-дзета и сигнальный домен 4-1BB. В некоторых вариантах осуществления сигнальный домен 4-1BB представляет собой сигнальный домен под SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления сигнальный домен CD3-дзета представляет собой сигнальный домен под SEQ ID NO: 9 (мутантный CD3-дзета) или SEQ ID NO: 10 (CD3-дзета человека дикого типа).

В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен разработан таким образом, что он содержит сигнальный домен CD3-дзета и сигнальный домен CD27. В некоторых вариантах осуществления сигнальный домен CD27 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах осуществления сигнальный домен CD27 кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 19.

В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный домен разработан таким образом, что он содержит сигнальный домен CD3-дзета и сигнальный домен CD28. В некоторых вариантах осуществления сигнальный домен CD28 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 36. В некоторых вариантах осуществления сигнальный домен CD28 кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 37.

В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный домен разработан таким образом, что он содержит сигнальный домен CD3-дзета и сигнальный домен ICOS. В некоторых вариантах осуществления сигнальный домен ICOS содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 38. В некоторых вариантах осуществления сигнальный домен ICOS кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 39.

Конфигурации CAR

Двойные CAR

В одном варианте осуществления иммунная клетка (например, T-клетка или NK-клетка) экспрессирует два CAR, например, первый CAR, который связывается с первым антигеном, и второй CAR, который связывается со вторым антигеном. В одном варианте осуществления первый антиген и второй антиген являются разными. В одном варианте осуществления первый или второй антиген выбран из антигена, экспрессируемого на B-клетках, антигена, экспрессируемого на клетках острого миелоидного лейкоза, или антигена на клетках солидной опухоли. В одном варианте осуществления первый или второй антиген выбран из CD10, CD19, CD20, CD22, CD34, CD123, BCMA, FLT-3, ROR1, CD79b, CD179b, CD79a, CD34, CLL-1, рецептора фолиевой кислоты бета, FLT3, EGFRvIII, мезотелина, EGFRvIII, GD2, Tn-антигена, sTn-антигена, Tn-O-гликопептидов, sTn-O-гликопептидов, PSMA, CD97, TAG72, CD44v6, CEA, EPCAM, KIT, IL-13Ra2, легумана, GD3, CD171, IL-11Ra, PSCA, MAD-CT-1, MAD-CT-2, VEGFR2, антигена Y системы Льюис, CD24, PDGFR-бета, SSEA-4, рецептора фолиевой кислоты альфа, ERBB (например, ERBB2), Her2/neu, MUC1, EGFR, NCAM, эфрина B2, CAIX, LMP2, sLe, HMWMAA, o-ацетил-GD2, рецептора фолиевой кислоты бета, TEM1/CD248, TEM7R, FAP, легумаина, E6 или E7 HPV, ML-IAP, CLDN6, TSHR, GPRC5D, ALK, полисиаловой кислоты, Fos-родственного антигена, эластазы нейтрофилов, TRP-2, CYP1B1, белка спермы 17, бета-субъединицы хорионического гонадотропина человека, AFP, тиреоглобулина, PLAC1, globoH, RAGE1, MN-CA IX, обратной транскриптазы теломеразы человека, кишечной карбоксилэстеразы, мутантного варианта hsp 70-2, NA-17, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, NY-ESO-1, GPR20, Ly6k, OR51E2, TARP, GFRα4 или пептида любого из этих антигенов, презентированного на MHC.

В одном варианте осуществления первый антиген представляет собой CD19. В одном варианте осуществления второй антиген не представляет собой CD19. В одном варианте осуществления второй антиген представляет собой антиген, раскрытый в данном документе, который не представляет собой CD19.

В одном варианте осуществления первый антиген представляет собой BCMA. В одном варианте осуществления второй антиген не представляет собой BCMA. В одном варианте осуществления второй антиген представляет собой антиген, раскрытый в данном документе, который не представляет собой BCMA. В одном варианте осуществления второй антиген выбран из антигена, экспрессируемого на B-клетках, антигена, экспрессируемого на клетках острого миелоидного лейкоза, или антигена на клетках солидной опухоли. В одном варианте осуществления второй антиген выбран из CD10, CD19, CD20, CD22, CD34, CD123, FLT-3, ROR1, CD79b, CD179b, CD79a, CD34, CLL-1, рецептора фолиевой кислоты бета, FLT3, EGFRvIII, мезотелина, EGFRvIII, GD2, Tn-антигена, sTn-антигена, Tn-O-гликопептидов, sTn-O-гликопептидов, PSMA, CD97, TAG72, CD44v6, CEA, EPCAM, KIT, IL-13Ra2, легумана, GD3, CD171, IL-11Ra, PSCA, MAD-CT-1, MAD-CT-2, VEGFR2, антигена Y системы Льюис, CD24, PDGFR-бета, SSEA-4, рецептора фолиевой кислоты альфа, ERBB (например, ERBB2), Her2/neu, MUC1, EGFR, NCAM, эфрина B2, CAIX, LMP2, sLe, HMWMAA, o-ацетил-GD2, рецептора фолиевой кислоты бета, TEM1/CD248, TEM7R, FAP, легумаина, E6 или E7 HPV, ML-IAP, CLDN6, TSHR, GPRC5D, ALK, полисиаловой кислоты, Fos-родственного антигена, эластазы нейтрофилов, TRP-2, CYP1B1, белка спермы 17, бета-субъединицы хорионического гонадотропина человека, AFP, тиреоглобулина, PLAC1, globoH, RAGE1, MN-CA IX, обратной транскриптазы теломеразы человека, кишечной карбоксилэстеразы, мутантного варианта hsp 70-2, NA-17, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, NY-ESO-1, GPR20, Ly6k, OR51E2, TARP, GFRα4 или пептида любого из этих антигенов, презентированного на MHC. В одном варианте осуществления первый антиген представляет собой BCMA, а второй антиген представляет собой CD19.

В одном варианте осуществления первый CAR кодируется первой последовательностью нуклеиновой кислоты. В одном варианте осуществления второй CAR кодируется второй последовательностью нуклеиновой кислоты. В одном варианте осуществления первая и вторая последовательности нуклеиновой кислоты расположены в одной молекуле нуклеиновой кислоты. В одном варианте осуществления первая и вторая последовательности нуклеиновой кислоты расположены в отдельных молекулах нуклеиновой кислоты. В одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты или молекулы нуклеиновой кислоты представляют собой молекулы ДНК или РНК. В ряде вариантов осуществления первая и вторая последовательности нуклеиновой кислоты находятся в одинаковой ориентации, например, транскрипция первой и второй последовательностей нуклеиновой кислоты происходит в одном и том же направлении. В ряде вариантов осуществления первая и вторая последовательности нуклеиновой кислоты находятся в разных ориентациях. В ряде вариантов осуществления один промотор контролирует экспрессию первой и второй последовательностей нуклеиновой кислоты. В ряде вариантов осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая сайт расщепления протеазами (такой как сайт расщепления T2A, P2A, E2A или F2A), находится между первой и второй последовательностями нуклеиновой кислоты. В ряде вариантов осуществления сайт расщепления протеазами размещен таким образом, что клетка может экспрессировать слитый белок, содержащий первый CAR и второй CAR, и слитый белок впоследствии подвергается процессингу посредством протеолитического расщепления с образованием двух пептидов. В некоторых вариантах осуществления первая последовательность нуклеиновой кислоты расположена выше второй последовательности нуклеиновой кислоты, или вторая последовательность нуклеиновой кислоты расположена выше первой последовательности нуклеиновой кислоты. В ряде вариантов осуществления первый промотор контролирует экспрессию первой последовательности нуклеиновой кислоты, а второй промотор контролирует экспрессию второй последовательности нуклеиновой кислоты. В ряде вариантов осуществления молекула нуклеиновой кислоты представляет собой плазмиду. В ряде вариантов осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит вирусный элемент упаковки. В ряде вариантов осуществления иммунная клетка может содержать протеазу (например, эндогенную или экзогенную протеазу), которая расщепляет сайт расщепления T2A, P2A, E2A или F2A.

В одном варианте осуществления первый CAR содержит первый антигенсвязывающий домен, а второй CAR содержит второй антигенсвязывающий домен. В одном варианте осуществления первый или второй антигенсвязывающий домен содержит CDR, VH, VL или scFv, раскрытые в данном документе, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ними. В одном варианте осуществления первый или второй антигенсвязывающий домен содержит CDR, VH, VL или scFv антигенсвязывающего домена для BCMA, раскрытого в данном документе (например, аминокислотную последовательность, раскрытую в таблицах 3-15, 19, 20, 22 и 26, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней). В одном варианте осуществления первый или второй антигенсвязывающий домен содержит CDR, VH, VL или scFv антигенсвязывающего домена для CD19, раскрытого в данном документе (например, аминокислотную последовательность, раскрытую в таблицах 2, 19 и 22, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней).

В одном варианте осуществления первый антиген представляет собой BCMA, а второй антиген представляет собой CD19. В одном варианте осуществления иммунная клетка (например, T-клетка или NK-клетка) экспрессирует CAR для BCMA, например, CAR для BCMA, описанный в данном документе, и CAR для CD19, например, CAR для CD19, описанный в данном документе. В одном варианте осуществления иммунная клетка (например, T-клетка или NK-клетка) содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR для BCMA, например, CAR для BCMA, описанный в данном документе, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR для CD19, например, CAR для CD19, описанный в данном документе. В таблице 19 показаны иллюстративные аминокислотные последовательности и последовательности нуклеиновой кислоты конструкций двойных CAR.

Таблица 19. Иллюстративные конструкции двойных CAR для BCMA/CD19 и их компоненты Конструкции двойных CAR для BCMA/CD19 Идентификация Последовательность белка Последовательность ДНК (5'-3') Сигнальный пептид
(в плече CAR для BCMA) MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO: 1) Atggccctccctgtcaccgccctgctgcttccgctggctcttctgctccacgccgctcggccc (SEQ ID NO: 199) ScFv R1G5 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARREWWGESWLFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 80) Gaagtgcagttgctggagtcaggcggaggactggtgcagcccggaggatcgcttcgcttgagctgcgcagcctcaggctttaccttctcctcctacgccatgtcctgggtcagacaggctcccgggaagggactggaatgggtgtccgccattagcggttccggcggaagcacttactatgccgactctgtgaagggccgcttcactatctcccgggacaactccaagaacaccctgtatctccaaatgaattccctgagggccgaagataccgcggtgtactactgcgctagacgggagtggtggggagaaagctggctgttcgactactggggacagggcactctcgtgactgtgtcctccggtggtggtggatcggggggtggtggttcgggcggaggaggatctggaggaggagggtcggacattcaaatgactcagtccccgtcctccctctccgcctccgtgggagatcgcgtcacgatcacgtgcagggccagccagagcatctccagctacctgaactggtaccagcagaagccagggaaggcaccgaagctcctgatctacgccgctagctcgctgcagtccggcgtcccttcacggttctcgggatcgggctcaggcaccgacttcaccctgaccattagcagcctgcagccggaggacttcgcgacatactactgtcagcagtcatactccacccctctgaccttcggccaagggaccaaagtggagatcaag (SEQ ID NO: 81) ScFv PI61 QVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGSGTKVTVL (SEQ ID NO: 105) Caagtgcagctgcaggaatccggtggcggagtcgtgcagcctggaaggagcctgagactctcatgcgccgcgtcagggttcaccttttcctcctacgggatgcattgggtcagacaggcccccggaaagggactcgaatgggtggctgtgatcagctacgacggctccaacaagtactacgccgactccgtgaaaggccggttcactatctcccgggacaactccaagaacacgctgtatctgcaaatgaattcactgcgcgcggaggataccgctgtgtactactgcggtggctccggttacgccctgcacgatgactattacggccttgacgtctggggccagggaaccctcgtgactgtgtccagcggtggaggaggttcgggcggaggaggatcaggagggggtggatcgcagagcgcactgactcagccggcatccgtgtccggtagccccggacagtcgattaccatctcctgtaccggcacctcctccgacgtgggagggtacaactacgtgtcgtggtaccagcagcacccaggaaaggcccctaagttgatgatctacgatgtgtcaaaccgcccgtctggagtctccaaccggttctccggctccaagtccggcaacaccgccagcctgaccattagcgggctgcaagccgaggatgaggccgactactactgctcgagctacacatcctcgagcaccctctacgtgttcggctcggggactaaggtcaccgtgctg (SEQ ID NO: 106) ScFv R1B6 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARREWVPYDVSWYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 64) Gaagtgcagttgctggagtcaggcggaggactggtgcagcccggaggatcgcttcgcttgagctgcgcagcctcaggctttaccttctcctcctacgccatgtcctgggtcagacaggctcccgggaagggactggaatgggtgtccgccattagcggttccggcggaagcacttactatgccgactctgtgaagggccgcttcactatctcccgggacaactccaagaacaccctgtatctccaaatgaattccctgagggccgaagataccgcggtgtactactgcgctagacgggagtgggtgccctacgatgtcagctggtacttcgactactggggacagggcactctcgtgactgtgtcctccggtggtggtggatcggggggtggtggttcgggcggaggaggatctggaggaggagggtcggacattcaaatgactcagtccccgtcctccctctccgcctccgtgggagatcgcgtcacgatcacgtgcagggccagccagagcatctccagctacctgaactggtaccagcagaagccagggaaggcaccgaagctcctgatctacgccgctagctcgctgcagtccggcgtcccttcacggttctcgggatcgggctcaggcaccgacttcaccctgaccattagcagcctgcagccggaggacttcgcgacatactactgtcagcagtcatactccacccctctgaccttcggccaagggaccaaagtggagatcaag (SEQ ID NO: 65) ScFv duBCMA.4 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFALSNHGMSWVRRAPGKGLEWVSGIVYSGSTYYAASVKGRFTISRDNSRNTLYLQMNSLRPEDTAIYYCSAHGGESDVWGQGTTVTVSSASGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPYTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 200) Gaagtgcaattggtggaatcagggggaggacttgtgcagcctggaggatcgctgagactgtcatgtgccgtgtccggctttgccctgtccaaccacgggatgtcctgggtccgccgcgcgcctggaaagggcctcgaatgggtgtcgggtattgtgtacagcggtagcacctactatgccgcatccgtgaaggggagattcaccatcagccgggacaactccaggaacactctgtacctccaaatgaattcgctgaggccagaggacactgccatctactactgctccgcgcatggcggagagtccgacgtctggggacaggggaccaccgtgaccgtgtctagcgcgtccggcggaggcggcagcgggggtggtggttcagggggcggcggatcggacatccagctcacccagtccccgagctcgctgtccgcctccgtgggagatcgggtcaccatcacgtgccgcgccagccagtcgatttcctcctacctgaactggtaccaacagaagcccggaaaagccccgaagcttctcatctacgccgcctcgagcctgcagtcaggagtgccctcacggttctccggctccggttccggtactgatttcaccctgaccatttcctccctgcaaccggaggacttcgctacttactactgccagcagtcgtactccaccccctacactttcggacaaggcaccaaggtcgaaatcaag (SEQ ID NO: 201) Шарнирная область и трансмембранный домен
(в плече CAR для BCMA) TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC (SEQ ID NO: 202) Accactaccccagcaccgaggccacccaccccggctcctaccatcgcctcccagcctctgtccctgcgtccggaggcatgtagacccgcagctggtggggccgtgcatacccggggtcttgacttcgcctgcgatatctacatttgggcccctctggctggtacttgcggggtcctgctgctttcactcgtgatcactctttactgt (SEQ ID NO: 203) Шарнирная область
(в плече CAR для BCMA) TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO: 2) Accactaccccagcaccgaggccacccaccccggctcctaccatcgcctcccagcctctgtccctgcgtccggaggcatgtagacccgcagctggtggggccgtgcatacccggggtcttgacttcgcctgcgat (SEQ ID NO: 337) Трансмембранный домен
(в плече CAR для BCMA) IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC (SEQ ID NO: 6) Atctacatttgggcccctctggctggtacttgcggggtcctgctgctttcactcgtgatcactctttactgt (SEQ ID NO: 338) 4-1BB
(в плече CAR для BCMA) KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (SEQ ID NO: 7) Aagcgcggtcggaagaagctgctgtacatctttaagcaacccttcatgaggcctgtgcagactactcaagaggaggacggctgttcatgccggttcccagaggaggaggaaggcggctgcgaactg (SEQ ID NO: 204) CD3-дзета
(в плече CAR для BCMA) RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 10) Cgcgtgaaattcagccgcagcgcagatgctccagcctaccagcaggggcagaaccagctctacaacgaactcaatcttggtcggagagaggagtacgacgtgctggacaagcggagaggacgggacccagaaatgggcgggaagccgcgcagaaagaatccccaagagggcctgtacaacgagctccaaaaggataagatggcagaagcctatagcgagattggtatgaaaggggaacgcagaagaggcaaaggccacgacggactgtaccagggactcagcaccgccaccaaggacacctatgacgctcttcacatgcaggccctgccgcctcgg (SEQ ID NO: 205) Линкер GSG (SEQ ID NO: 206) Ggaagcgga (SEQ ID NO: 207) Последовательность P2A ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 208) Gctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacct (SEQ ID NO: 209) Сигнальный пептид
(в плече CAR для CD19) MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO: 1) Atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccg (SEQ ID NO: 210) ScFv duCD19.1 EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 211) Gaaattgtgatgacccagtcacccgccactcttagcctttcacccggtgagcgcgcaaccctgtcttgcagagcctcccaagacatctcaaaataccttaattggtatcaacagaagcccggacaggctcctcgccttctgatctaccacaccagccggctccattctggaatccctgccaggttcagcggtagcggatctgggaccgactacaccctcactatcagctcactgcagccagaggacttcgctgtctatttctgtcagcaagggaacaccctgccctacacctttggacagggcaccaagctcgagattaaaggtggaggtggcagcggaggaggtgggtccggcggtggaggaagccaggtccaactccaagaaagcggaccgggtcttgtgaagccatcagaaactctttcactgacttgtactgtgagcggagtgtctctccccgattacggggtgtcttggatcagacagccaccggggaagggtctggaatggattggagtgatttggggctctgagactacttactaccaatcatccctcaagtcacgcgtcaccatctcaaaggacaactctaagaatcaggtgtcactgaaactgtcatctgtgaccgcagccgacaccgccgtgtactattgcgctaagcattactattatggcgggagctacgcaatggattactggggacagggtactctggtcaccgtgtccagc (SEQ ID NO: 212) Шарнирная область и трансмембранный домен
(в плече CAR для CD19) TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC (SEQ ID NO: 202) Accacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgc (SEQ ID NO: 213) Шарнирная область
(в плече CAR для CD19) TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO: 2) Accacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgat (SEQ ID NO: 13) Трансмембранный домен
(в плече CAR для CD19) IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC (SEQ ID NO: 6) Atctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgc (SEQ ID NO: 17) 4-1BB
(в плече CAR для CD19) KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (SEQ ID NO: 7) Aaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactg (SEQ ID NO: 18) CD3-дзета
(в плече CAR для CD19) RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 10) Agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc (SEQ ID NO: 21) R1G5-P2A-duCD19.1 MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARREWWGESWLFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 214) atggccctccctgtcaccgccctgctgcttccgctggctcttctgctccacgccgctcggcccgaagtgcagttgctggagtcaggcggaggactggtgcagcccggaggatcgcttcgcttgagctgcgcagcctcaggctttaccttctcctcctacgccatgtcctgggtcagacaggctcccgggaagggactggaatgggtgtccgccattagcggttccggcggaagcacttactatgccgactctgtgaagggccgcttcactatctcccgggacaactccaagaacaccctgtatctccaaatgaattccctgagggccgaagataccgcggtgtactactgcgctagacgggagtggtggggagaaagctggctgttcgactactggggacagggcactctcgtgactgtgtcctccggtggtggtggatcggggggtggtggttcgggcggaggaggatctggaggaggagggtcggacattcaaatgactcagtccccgtcctccctctccgcctccgtgggagatcgcgtcacgatcacgtgcagggccagccagagcatctccagctacctgaactggtaccagcagaagccagggaaggcaccgaagctcctgatctacgccgctagctcgctgcagtccggcgtcccttcacggttctcgggatcgggctcaggcaccgacttcaccctgaccattagcagcctgcagccggaggacttcgcgacatactactgtcagcagtcatactccacccctctgaccttcggccaagggaccaaagtggagatcaagaccactaccccagcaccgaggccacccaccccggctcctaccatcgcctcccagcctctgtccctgcgtccggaggcatgtagacccgcagctggtggggccgtgcatacccggggtcttgacttcgcctgcgatatctacatttgggcccctctggctggtacttgcggggtcctgctgctttcactcgtgatcactctttactgtaagcgcggtcggaagaagctgctgtacatctttaagcaacccttcatgaggcctgtgcagactactcaagaggaggacggctgttcatgccggttcccagaggaggaggaaggcggctgcgaactgcgcgtgaaattcagccgcagcgcagatgctccagcctaccagcaggggcagaaccagctctacaacgaactcaatcttggtcggagagaggagtacgacgtgctggacaagcggagaggacgggacccagaaatgggcgggaagccgcgcagaaagaatccccaagagggcctgtacaacgagctccaaaaggataagatggcagaagcctatagcgagattggtatgaaaggggaacgcagaagaggcaaaggccacgacggactgtaccagggactcagcaccgccaccaaggacacctatgacgctcttcacatgcaggccctgccgcctcggggaagcggagctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacctatggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggaaattgtgatgacccagtcacccgccactcttagcctttcacccggtgagcgcgcaaccctgtcttgcagagcctcccaagacatctcaaaataccttaattggtatcaacagaagcccggacaggctcctcgccttctgatctaccacaccagccggctccattctggaatccctgccaggttcagcggtagcggatctgggaccgactacaccctcactatcagctcactgcagccagaggacttcgctgtctatttctgtcagcaagggaacaccctgccctacacctttggacagggcaccaagctcgagattaaaggtggaggtggcagcggaggaggtgggtccggcggtggaggaagccaggtccaactccaagaaagcggaccgggtcttgtgaagccatcagaaactctttcactgacttgtactgtgagcggagtgtctctccccgattacggggtgtcttggatcagacagccaccggggaagggtctggaatggattggagtgatttggggctctgagactacttactaccaatcatccctcaagtcacgcgtcaccatctcaaaggacaactctaagaatcaggtgtcactgaaactgtcatctgtgaccgcagccgacaccgccgtgtactattgcgctaagcattactattatggcgggagctacgcaatggattactggggacagggtactctggtcaccgtgtccagcaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc (SEQ ID NO: 215) PI61-P2A-duCD19.1 MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGSGTKVTVLTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 216) atggccctccctgtcaccgccctgctgcttccgctggctcttctgctccacgccgctcggccccaagtgcagctgcaggaatccggtggcggagtcgtgcagcctggaaggagcctgagactctcatgcgccgcgtcagggttcaccttttcctcctacgggatgcattgggtcagacaggcccccggaaagggactcgaatgggtggctgtgatcagctacgacggctccaacaagtactacgccgactccgtgaaaggccggttcactatctcccgggacaactccaagaacacgctgtatctgcaaatgaattcactgcgcgcggaggataccgctgtgtactactgcggtggctccggttacgccctgcacgatgactattacggccttgacgtctggggccagggaaccctcgtgactgtgtccagcggtggaggaggttcgggcggaggaggatcaggagggggtggatcgcagagcgcactgactcagccggcatccgtgtccggtagccccggacagtcgattaccatctcctgtaccggcacctcctccgacgtgggagggtacaactacgtgtcgtggtaccagcagcacccaggaaaggcccctaagttgatgatctacgatgtgtcaaaccgcccgtctggagtctccaaccggttctccggctccaagtccggcaacaccgccagcctgaccattagcgggctgcaagccgaggatgaggccgactactactgctcgagctacacatcctcgagcaccctctacgtgttcggctcggggactaaggtcaccgtgctgaccactaccccagcaccgaggccacccaccccggctcctaccatcgcctcccagcctctgtccctgcgtccggaggcatgtagacccgcagctggtggggccgtgcatacccggggtcttgacttcgcctgcgatatctacatttgggcccctctggctggtacttgcggggtcctgctgctttcactcgtgatcactctttactgtaagcgcggtcggaagaagctgctgtacatctttaagcaacccttcatgaggcctgtgcagactactcaagaggaggacggctgttcatgccggttcccagaggaggaggaaggcggctgcgaactgcgcgtgaaattcagccgcagcgcagatgctccagcctaccagcaggggcagaaccagctctacaacgaactcaatcttggtcggagagaggagtacgacgtgctggacaagcggagaggacgggacccagaaatgggcgggaagccgcgcagaaagaatccccaagagggcctgtacaacgagctccaaaaggataagatggcagaagcctatagcgagattggtatgaaaggggaacgcagaagaggcaaaggccacgacggactgtaccagggactcagcaccgccaccaaggacacctatgacgctcttcacatgcaggccctgccgcctcggggaagcggagctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacctatggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggaaattgtgatgacccagtcacccgccactcttagcctttcacccggtgagcgcgcaaccctgtcttgcagagcctcccaagacatctcaaaataccttaattggtatcaacagaagcccggacaggctcctcgccttctgatctaccacaccagccggctccattctggaatccctgccaggttcagcggtagcggatctgggaccgactacaccctcactatcagctcactgcagccagaggacttcgctgtctatttctgtcagcaagggaacaccctgccctacacctttggacagggcaccaagctcgagattaaaggtggaggtggcagcggaggaggtgggtccggcggtggaggaagccaggtccaactccaagaaagcggaccgggtcttgtgaagccatcagaaactctttcactgacttgtactgtgagcggagtgtctctccccgattacggggtgtcttggatcagacagccaccggggaagggtctggaatggattggagtgatttggggctctgagactacttactaccaatcatccctcaagtcacgcgtcaccatctcaaaggacaactctaagaatcaggtgtcactgaaactgtcatctgtgaccgcagccgacaccgccgtgtactattgcgctaagcattactattatggcgggagctacgcaatggattactggggacagggtactctggtcaccgtgtccagcaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc (SEQ ID NO: 217) R1B6-P2A-duCD19.1 MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARREWVPYDVSWYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 218) atggccctccctgtcaccgccctgctgcttccgctggctcttctgctccacgccgctcggcccgaagtgcagttgctggagtcaggcggaggactggtgcagcccggaggatcgcttcgcttgagctgcgcagcctcaggctttaccttctcctcctacgccatgtcctgggtcagacaggctcccgggaagggactggaatgggtgtccgccattagcggttccggcggaagcacttactatgccgactctgtgaagggccgcttcactatctcccgggacaactccaagaacaccctgtatctccaaatgaattccctgagggccgaagataccgcggtgtactactgcgctagacgggagtgggtgccctacgatgtcagctggtacttcgactactggggacagggcactctcgtgactgtgtcctccggtggtggtggatcggggggtggtggttcgggcggaggaggatctggaggaggagggtcggacattcaaatgactcagtccccgtcctccctctccgcctccgtgggagatcgcgtcacgatcacgtgcagggccagccagagcatctccagctacctgaactggtaccagcagaagccagggaaggcaccgaagctcctgatctacgccgctagctcgctgcagtccggcgtcccttcacggttctcgggatcgggctcaggcaccgacttcaccctgaccattagcagcctgcagccggaggacttcgcgacatactactgtcagcagtcatactccacccctctgaccttcggccaagggaccaaagtggagatcaagaccactaccccagcaccgaggccacccaccccggctcctaccatcgcctcccagcctctgtccctgcgtccggaggcatgtagacccgcagctggtggggccgtgcatacccggggtcttgacttcgcctgcgatatctacatttgggcccctctggctggtacttgcggggtcctgctgctttcactcgtgatcactctttactgtaagcgcggtcggaagaagctgctgtacatctttaagcaacccttcatgaggcctgtgcagactactcaagaggaggacggctgttcatgccggttcccagaggaggaggaaggcggctgcgaactgcgcgtgaaattcagccgcagcgcagatgctccagcctaccagcaggggcagaaccagctctacaacgaactcaatcttggtcggagagaggagtacgacgtgctggacaagcggagaggacgggacccagaaatgggcgggaagccgcgcagaaagaatccccaagagggcctgtacaacgagctccaaaaggataagatggcagaagcctatagcgagattggtatgaaaggggaacgcagaagaggcaaaggccacgacggactgtaccagggactcagcaccgccaccaaggacacctatgacgctcttcacatgcaggccctgccgcctcggggaagcggagctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacctatggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggaaattgtgatgacccagtcacccgccactcttagcctttcacccggtgagcgcgcaaccctgtcttgcagagcctcccaagacatctcaaaataccttaattggtatcaacagaagcccggacaggctcctcgccttctgatctaccacaccagccggctccattctggaatccctgccaggttcagcggtagcggatctgggaccgactacaccctcactatcagctcactgcagccagaggacttcgctgtctatttctgtcagcaagggaacaccctgccctacacctttggacagggcaccaagctcgagattaaaggtggaggtggcagcggaggaggtgggtccggcggtggaggaagccaggtccaactccaagaaagcggaccgggtcttgtgaagccatcagaaactctttcactgacttgtactgtgagcggagtgtctctccccgattacggggtgtcttggatcagacagccaccggggaagggtctggaatggattggagtgatttggggctctgagactacttactaccaatcatccctcaagtcacgcgtcaccatctcaaaggacaactctaagaatcaggtgtcactgaaactgtcatctgtgaccgcagccgacaccgccgtgtactattgcgctaagcattactattatggcgggagctacgcaatggattactggggacagggtactctggtcaccgtgtccagcaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc (SEQ ID NO: 219) duBCMA.4-P2A-duCD19.1 MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFALSNHGMSWVRRAPGKGLEWVSGIVYSGSTYYAASVKGRFTISRDNSRNTLYLQMNSLRPEDTAIYYCSAHGGESDVWGQGTTVTVSSASGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPYTFGQGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 220) atggccctccctgtcaccgccctgctgcttccgctggctcttctgctccacgccgctcggcccgaagtgcaattggtggaatcagggggaggacttgtgcagcctggaggatcgctgagactgtcatgtgccgtgtccggctttgccctgtccaaccacgggatgtcctgggtccgccgcgcgcctggaaagggcctcgaatgggtgtcgggtattgtgtacagcggtagcacctactatgccgcatccgtgaaggggagattcaccatcagccgggacaactccaggaacactctgtacctccaaatgaattcgctgaggccagaggacactgccatctactactgctccgcgcatggcggagagtccgacgtctggggacaggggaccaccgtgaccgtgtctagcgcgtccggcggaggcggcagcgggggtggtggttcagggggcggcggatcggacatccagctcacccagtccccgagctcgctgtccgcctccgtgggagatcgggtcaccatcacgtgccgcgccagccagtcgatttcctcctacctgaactggtaccaacagaagcccggaaaagccccgaagcttctcatctacgccgcctcgagcctgcagtcaggagtgccctcacggttctccggctccggttccggtactgatttcaccctgaccatttcctccctgcaaccggaggacttcgctacttactactgccagcagtcgtactccaccccctacactttcggacaaggcaccaaggtcgaaatcaagaccactaccccagcaccgaggccacccaccccggctcctaccatcgcctcccagcctctgtccctgcgtccggaggcatgtagacccgcagctggtggggccgtgcatacccggggtcttgacttcgcctgcgatatctacatttgggcccctctggctggtacttgcggggtcctgctgctttcactcgtgatcactctttactgtaagcgcggtcggaagaagctgctgtacatctttaagcaacccttcatgaggcctgtgcagactactcaagaggaggacggctgttcatgccggttcccagaggaggaggaaggcggctgcgaactgcgcgtgaaattcagccgcagcgcagatgctccagcctaccagcaggggcagaaccagctctacaacgaactcaatcttggtcggagagaggagtacgacgtgctggacaagcggagaggacgggacccagaaatgggcgggaagccgcgcagaaagaatccccaagagggcctgtacaacgagctccaaaaggataagatggcagaagcctatagcgagattggtatgaaaggggaacgcagaagaggcaaaggccacgacggactgtaccagggactcagcaccgccaccaaggacacctatgacgctcttcacatgcaggccctgccgcctcggggaagcggagctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacctatggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggaaattgtgatgacccagtcacccgccactcttagcctttcacccggtgagcgcgcaaccctgtcttgcagagcctcccaagacatctcaaaataccttaattggtatcaacagaagcccggacaggctcctcgccttctgatctaccacaccagccggctccattctggaatccctgccaggttcagcggtagcggatctgggaccgactacaccctcactatcagctcactgcagccagaggacttcgctgtctatttctgtcagcaagggaacaccctgccctacacctttggacagggcaccaagctcgagattaaaggtggaggtggcagcggaggaggtgggtccggcggtggaggaagccaggtccaactccaagaaagcggaccgggtcttgtgaagccatcagaaactctttcactgacttgtactgtgagcggagtgtctctccccgattacggggtgtcttggatcagacagccaccggggaagggtctggaatggattggagtgatttggggctctgagactacttactaccaatcatccctcaagtcacgcgtcaccatctcaaaggacaactctaagaatcaggtgtcactgaaactgtcatctgtgaccgcagccgacaccgccgtgtactattgcgctaagcattactattatggcgggagctacgcaatggattactggggacagggtactctggtcaccgtgtccagcaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc (SEQ ID NO: 221) duCD19.1-P2A-duBCMA.4 MALPVTALLLPLALLLHAARPEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFALSNHGMSWVRRAPGKGLEWVSGIVYSGSTYYAASVKGRFTISRDNSRNTLYLQMNSLRPEDTAIYYCSAHGGESDVWGQGTTVTVSSASGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPYTFGQGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 222) atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggaaattgtgatgacccagtcacccgccactcttagcctttcacccggtgagcgcgcaaccctgtcttgcagagcctcccaagacatctcaaaataccttaattggtatcaacagaagcccggacaggctcctcgccttctgatctaccacaccagccggctccattctggaatccctgccaggttcagcggtagcggatctgggaccgactacaccctcactatcagctcactgcagccagaggacttcgctgtctatttctgtcagcaagggaacaccctgccctacacctttggacagggcaccaagctcgagattaaaggtggaggtggcagcggaggaggtgggtccggcggtggaggaagccaggtccaactccaagaaagcggaccgggtcttgtgaagccatcagaaactctttcactgacttgtactgtgagcggagtgtctctccccgattacggggtgtcttggatcagacagccaccggggaagggtctggaatggattggagtgatttggggctctgagactacttactaccaatcatccctcaagtcacgcgtcaccatctcaaaggacaactctaagaatcaggtgtcactgaaactgtcatctgtgaccgcagccgacaccgccgtgtactattgcgctaagcattactattatggcgggagctacgcaatggattactggggacagggtactctggtcaccgtgtccagcaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgcggaagcggagctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacctatggccctccctgtcaccgccctgctgcttccgctggctcttctgctccacgccgctcggcccgaagtgcaattggtggaatcagggggaggacttgtgcagcctggaggatcgctgagactgtcatgtgccgtgtccggctttgccctgtccaaccacgggatgtcctgggtccgccgcgcgcctggaaagggcctcgaatgggtgtcgggtattgtgtacagcggtagcacctactatgccgcatccgtgaaggggagattcaccatcagccgggacaactccaggaacactctgtacctccaaatgaattcgctgaggccagaggacactgccatctactactgctccgcgcatggcggagagtccgacgtctggggacaggggaccaccgtgaccgtgtctagcgcgtccggcggaggcggcagcgggggtggtggttcagggggcggcggatcggacatccagctcacccagtccccgagctcgctgtccgcctccgtgggagatcgggtcaccatcacgtgccgcgccagccagtcgatttcctcctacctgaactggtaccaacagaagcccggaaaagccccgaagcttctcatctacgccgcctcgagcctgcagtcaggagtgccctcacggttctccggctccggttccggtactgatttcaccctgaccatttcctccctgcaaccggaggacttcgctacttactactgccagcagtcgtactccaccccctacactttcggacaaggcaccaaggtcgaaatcaagaccactaccccagcaccgaggccacccaccccggctcctaccatcgcctcccagcctctgtccctgcgtccggaggcatgtagacccgcagctggtggggccgtgcatacccggggtcttgacttcgcctgcgatatctacatttgggcccctctggctggtacttgcggggtcctgctgctttcactcgtgatcactctttactgtaagcgcggtcggaagaagctgctgtacatctttaagcaacccttcatgaggcctgtgcagactactcaagaggaggacggctgttcatgccggttcccagaggaggaggaaggcggctgcgaactgcgcgtgaaattcagccgcagcgcagatgctccagcctaccagcaggggcagaaccagctctacaacgaactcaatcttggtcggagagaggagtacgacgtgctggacaagcggagaggacgggacccagaaatgggcgggaagccgcgcagaaagaatccccaagagggcctgtacaacgagctccaaaaggataagatggcagaagcctatagcgagattggtatgaaaggggaacgcagaagaggcaaaggccacgacggactgtaccagggactcagcaccgccaccaaggacacctatgacgctcttcacatgcaggccctgccgcctcgg (SEQ ID NO: 223) Предсказанные полученные белки из
R1G5-P2A-duCD19.1 Плечо CAR для BCMA:
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARREWWGESWLFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPG (SEQ ID NO: 224)
Плечо CAR для CD19:
EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 225) Предсказанные полученные белки из
PI61-P2A-duCD19.1 Плечо CAR для BCMA:
QVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGSGTKVTVLTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPG (SEQ ID NO: 226)
Плечо CAR для CD19:
EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 225) Предсказанные полученные белки из
R1B6-P2A-duCD19.1 Плечо CAR для BCMA:
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARREWVPYDVSWYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPG (SEQ ID NO: 227)
Плечо CAR для CD19:
EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 225) Предсказанные полученные белки из
duBCMA.4-P2A-duCD19.1 Плечо CAR для BCMA:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFALSNHGMSWVRRAPGKGLEWVSGIVYSGSTYYAASVKGRFTISRDNSRNTLYLQMNSLRPEDTAIYYCSAHGGESDVWGQGTTVTVSSASGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPYTFGQGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPG (SEQ ID NO: 228)
Плечо CAR для CD19:
EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 225) Предсказанные полученные белки из
duCD19.1-P2A-duBCMA.4 Плечо CAR для CD19:
EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPG (SEQ ID NO: 229)
Плечо CAR для BCMA:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFALSNHGMSWVRRAPGKGLEWVSGIVYSGSTYYAASVKGRFTISRDNSRNTLYLQMNSLRPEDTAIYYCSAHGGESDVWGQGTTVTVSSASGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPYTFGQGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 230)

Таблица 22. Аминокислотные последовательности иллюстративных компонентов двойных CAR SEQ ID NO Название/
описание Последовательность PI61 SEQ ID NO: 86 HCDR1 (Kabat) SYGMH SEQ ID NO: 87 HCDR2 (Kabat) VISYDGSNKYYADSVKG SEQ ID NO: 88 HCDR3 (Kabat) SGYALHDDYYGLDV SEQ ID NO: 47 HCDR1 (Chothia) GFTFSSY SEQ ID NO: 89 HCDR2 (Chothia) SYDGSN SEQ ID NO: 88 HCDR3 (Chothia) SGYALHDDYYGLDV SEQ ID NO: 90 HCDR1 (IMGT) GFTFSSYG SEQ ID NO: 91 HCDR2 (IMGT) ISYDGSNK SEQ ID NO: 92 HCDR3 (IMGT) GGSGYALHDDYYGLDV SEQ ID NO: 93 VH QVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 94 ДНК VH CAAGTGCAGCTGCAGGAATCCGGTGGCGGAGTCGTGCAGCCTGGAAGGAGCCTGAGACTCTCATGCGCCGCGTCAGGGTTCACCTTTTCCTCCTACGGGATGCATTGGGTCAGACAGGCCCCCGGAAAGGGACTCGAATGGGTGGCTGTGATCAGCTACGACGGCTCCAACAAGTACTACGCCGACTCCGTGAAAGGCCGGTTCACTATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAATTCACTGCGCGCGGAGGATACCGCTGTGTACTACTGCGGTGGCTCCGGTTACGCCCTGCACGATGACTATTACGGCCTTGACGTCTGGGGCCAGGGAACCCTCGTGACTGTGTCCAGC SEQ ID NO: 95 LCDR1 (Kabat) TGTSSDVGGYNYVS SEQ ID NO: 96 LCDR2 (Kabat) DVSNRPS SEQ ID NO: 97 LCDR3 (Kabat) SSYTSSSTLYV SEQ ID NO: 98 LCDR1 (Chothia) TSSDVGGYNY SEQ ID NO: 99 LCDR2 (Chothia) DVS SEQ ID NO: 100 LCDR3 (Chothia) YTSSSTLY SEQ ID NO: 101 LCDR1 (IMGT) SSDVGGYNY SEQ ID NO: 99 LCDR2 (IMGT) DVS SEQ ID NO: 97 LCDR3 (IMGT) SSYTSSSTLYV SEQ ID NO: 102 VL QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGSGTKVTVL SEQ ID NO: 103 ДНК VL CAGAGCGCACTGACTCAGCCGGCATCCGTGTCCGGTAGCCCCGGACAGTCGATTACCATCTCCTGTACCGGCACCTCCTCCGACGTGGGAGGGTACAACTACGTGTCGTGGTACCAGCAGCACCCAGGAAAGGCCCCTAAGTTGATGATCTACGATGTGTCAAACCGCCCGTCTGGAGTCTCCAACCGGTTCTCCGGCTCCAAGTCCGGCAACACCGCCAGCCTGACCATTAGCGGGCTGCAAGCCGAGGATGAGGCCGACTACTACTGCTCGAGCTACACATCCTCGAGCACCCTCTACGTGTTCGGCTCGGGGACTAAGGTCACCGTGCTG SEQ ID NO: 104 Линкер GGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO: 105 scFv (VH-линкер-VL) QVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGSGTKVTVL SEQ ID NO: 106 ДНК scFv CAAGTGCAGCTGCAGGAATCCGGTGGCGGAGTCGTGCAGCCTGGAAGGAGCCTGAGACTCTCATGCGCCGCGTCAGGGTTCACCTTTTCCTCCTACGGGATGCATTGGGTCAGACAGGCCCCCGGAAAGGGACTCGAATGGGTGGCTGTGATCAGCTACGACGGCTCCAACAAGTACTACGCCGACTCCGTGAAAGGCCGGTTCACTATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAATTCACTGCGCGCGGAGGATACCGCTGTGTACTACTGCGGTGGCTCCGGTTACGCCCTGCACGATGACTATTACGGCCTTGACGTCTGGGGCCAGGGAACCCTCGTGACTGTGTCCAGCGGTGGAGGAGGTTCGGGCGGAGGAGGATCAGGAGGGGGTGGATCGCAGAGCGCACTGACTCAGCCGGCATCCGTGTCCGGTAGCCCCGGACAGTCGATTACCATCTCCTGTACCGGCACCTCCTCCGACGTGGGAGGGTACAACTACGTGTCGTGGTACCAGCAGCACCCAGGAAAGGCCCCTAAGTTGATGATCTACGATGTGTCAAACCGCCCGTCTGGAGTCTCCAACCGGTTCTCCGGCTCCAAGTCCGGCAACACCGCCAGCCTGACCATTAGCGGGCTGCAAGCCGAGGATGAGGCCGACTACTACTGCTCGAGCTACACATCCTCGAGCACCCTCTACGTGTTCGGCTCGGGGACTAAGGTCACCGTGCTG R1B6 SEQ ID NO: 44 HCDR1 (Kabat) SYAMS SEQ ID NO: 45 HCDR2 (Kabat) AISGSGGSTYYADSVKG SEQ ID NO: 46 HCDR3 (Kabat) REWVPYDVSWYFDY SEQ ID NO: 47 HCDR1 (Chothia) GFTFSSY SEQ ID NO: 48 HCDR2 (Chothia) SGSGGS SEQ ID NO: 46 HCDR3 (Chothia) REWVPYDVSWYFDY SEQ ID NO: 49 HCDR1 (IMGT) GFTFSSYA SEQ ID NO: 50 HCDR2 (IMGT) ISGSGGST SEQ ID NO: 51 HCDR3 (IMGT) ARREWVPYDVSWYFDY SEQ ID NO: 52 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARREWVPYDVSWYFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 53 ДНК VH GAAGTGCAGTTGCTGGAGTCAGGCGGAGGACTGGTGCAGCCCGGAGGATCGCTTCGCTTGAGCTGCGCAGCCTCAGGCTTTACCTTCTCCTCCTACGCCATGTCCTGGGTCAGACAGGCTCCCGGGAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCCATTAGCGGTTCCGGCGGAAGCACTTACTATGCCGACTCTGTGAAGGGCCGCTTCACTATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTATCTCCAAATGAATTCCCTGAGGGCCGAAGATACCGCGGTGTACTACTGCGCTAGACGGGAGTGGGTGCCCTACGATGTCAGCTGGTACTTCGACTACTGGGGACAGGGCACTCTCGTGACTGTGTCCTCC SEQ ID NO: 54 LCDR1 (Kabat) RASQSISSYLN SEQ ID NO: 55 LCDR2 (Kabat) AASSLQS SEQ ID NO: 56 LCDR3 (Kabat) QQSYSTPLT SEQ ID NO: 57 LCDR1 (Chothia) SQSISSY SEQ ID NO: 58 LCDR2 (Chothia) AAS SEQ ID NO: 59 LCDR3 (Chothia) SYSTPL SEQ ID NO: 60 LCDR1 (IMGT) QSISSY SEQ ID NO: 58 LCDR2 (IMGT) AAS SEQ ID NO: 56 LCDR3 (IMGT) QQSYSTPLT SEQ ID NO: 61 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 62 ДНК VL GACATTCAAATGACTCAGTCCCCGTCCTCCCTCTCCGCCTCCGTGGGAGATCGCGTCACGATCACGTGCAGGGCCAGCCAGAGCATCTCCAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAGGCACCGAAGCTCCTGATCTACGCCGCTAGCTCGCTGCAGTCCGGCGTCCCTTCACGGTTCTCGGGATCGGGCTCAGGCACCGACTTCACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAGGACTTCGCGACATACTACTGTCAGCAGTCATACTCCACCCCTCTGACCTTCGGCCAAGGGACCAAAGTGGAGATCAAG SEQ ID NO: 63 Линкер GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO: 64 scFv (VH-линкер-VL) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARREWVPYDVSWYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 65 ДНК scFv GAAGTGCAGTTGCTGGAGTCAGGCGGAGGACTGGTGCAGCCCGGAGGATCGCTTCGCTTGAGCTGCGCAGCCTCAGGCTTTACCTTCTCCTCCTACGCCATGTCCTGGGTCAGACAGGCTCCCGGGAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCCATTAGCGGTTCCGGCGGAAGCACTTACTATGCCGACTCTGTGAAGGGCCGCTTCACTATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTATCTCCAAATGAATTCCCTGAGGGCCGAAGATACCGCGGTGTACTACTGCGCTAGACGGGAGTGGGTGCCCTACGATGTCAGCTGGTACTTCGACTACTGGGGACAGGGCACTCTCGTGACTGTGTCCTCCGGTGGTGGTGGATCGGGGGGTGGTGGTTCGGGCGGAGGAGGATCTGGAGGAGGAGGGTCGGACATTCAAATGACTCAGTCCCCGTCCTCCCTCTCCGCCTCCGTGGGAGATCGCGTCACGATCACGTGCAGGGCCAGCCAGAGCATCTCCAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAGGCACCGAAGCTCCTGATCTACGCCGCTAGCTCGCTGCAGTCCGGCGTCCCTTCACGGTTCTCGGGATCGGGCTCAGGCACCGACTTCACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAGGACTTCGCGACATACTACTGTCAGCAGTCATACTCCACCCCTCTGACCTTCGGCCAAGGGACCAAAGTGGAGATCAAG R1G5 SEQ ID NO: 44 HCDR1 (Kabat) SYAMS SEQ ID NO: 45 HCDR2 (Kabat) AISGSGGSTYYADSVKG SEQ ID NO: 76 HCDR3 (Kabat) REWWGESWLFDY SEQ ID NO: 47 HCDR1 (Chothia) GFTFSSY SEQ ID NO: 48 HCDR2 (Chothia) SGSGGS SEQ ID NO: 76 HCDR3 (Chothia) REWWGESWLFDY SEQ ID NO: 49 HCDR1 (IMGT) GFTFSSYA SEQ ID NO: 50 HCDR2 (IMGT) ISGSGGST SEQ ID NO: 77 HCDR3 (IMGT) ARREWWGESWLFDY SEQ ID NO: 78 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARREWWGESWLFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 79 ДНК VH GAAGTGCAGTTGCTGGAGTCAGGCGGAGGACTGGTGCAGCCCGGAGGATCGCTTCGCTTGAGCTGCGCAGCCTCAGGCTTTACCTTCTCCTCCTACGCCATGTCCTGGGTCAGACAGGCTCCCGGGAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCCATTAGCGGTTCCGGCGGAAGCACTTACTATGCCGACTCTGTGAAGGGCCGCTTCACTATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTATCTCCAAATGAATTCCCTGAGGGCCGAAGATACCGCGGTGTACTACTGCGCTAGACGGGAGTGGTGGGGAGAAAGCTGGCTGTTCGACTACTGGGGACAGGGCACTCTCGTGACTGTGTCCTCC SEQ ID NO: 54 LCDR1 (Kabat) RASQSISSYLN SEQ ID NO: 55 LCDR2 (Kabat) AASSLQS SEQ ID NO: 56 LCDR3 (Kabat) QQSYSTPLT SEQ ID NO: 57 LCDR1 (Chothia) SQSISSY SEQ ID NO: 58 LCDR2 (Chothia) AAS SEQ ID NO: 59 LCDR3 (Chothia) SYSTPL SEQ ID NO: 60 LCDR1 (IMGT) QSISSY SEQ ID NO: 58 LCDR2 (IMGT) AAS SEQ ID NO: 56 LCDR3 (IMGT) QQSYSTPLT SEQ ID NO: 61 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 62 ДНК VL GACATTCAAATGACTCAGTCCCCGTCCTCCCTCTCCGCCTCCGTGGGAGATCGCGTCACGATCACGTGCAGGGCCAGCCAGAGCATCTCCAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAGGCACCGAAGCTCCTGATCTACGCCGCTAGCTCGCTGCAGTCCGGCGTCCCTTCACGGTTCTCGGGATCGGGCTCAGGCACCGACTTCACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAGGACTTCGCGACATACTACTGTCAGCAGTCATACTCCACCCCTCTGACCTTCGGCCAAGGGACCAAAGTGGAGATCAAG SEQ ID NO: 63 Линкер GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO: 80 scFv (VH-линкер-VL) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARREWWGESWLFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 81 ДНК scFv GAAGTGCAGTTGCTGGAGTCAGGCGGAGGACTGGTGCAGCCCGGAGGATCGCTTCGCTTGAGCTGCGCAGCCTCAGGCTTTACCTTCTCCTCCTACGCCATGTCCTGGGTCAGACAGGCTCCCGGGAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCCATTAGCGGTTCCGGCGGAAGCACTTACTATGCCGACTCTGTGAAGGGCCGCTTCACTATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTATCTCCAAATGAATTCCCTGAGGGCCGAAGATACCGCGGTGTACTACTGCGCTAGACGGGAGTGGTGGGGAGAAAGCTGGCTGTTCGACTACTGGGGACAGGGCACTCTCGTGACTGTGTCCTCCGGTGGTGGTGGATCGGGGGGTGGTGGTTCGGGCGGAGGAGGATCTGGAGGAGGAGGGTCGGACATTCAAATGACTCAGTCCCCGTCCTCCCTCTCCGCCTCCGTGGGAGATCGCGTCACGATCACGTGCAGGGCCAGCCAGAGCATCTCCAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAGGCACCGAAGCTCCTGATCTACGCCGCTAGCTCGCTGCAGTCCGGCGTCCCTTCACGGTTCTCGGGATCGGGCTCAGGCACCGACTTCACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAGGACTTCGCGACATACTACTGTCAGCAGTCATACTCCACCCCTCTGACCTTCGGCCAAGGGACCAAAGTGGAGATCAAG duBCMA.4 SEQ ID NO: 231 HCDR1 (Kabat) NHGMS SEQ ID NO: 232 HCDR2 (Kabat) GIVYSGSTYYAASVKG SEQ ID NO: 233 HCDR3 (Kabat) HGGESDV SEQ ID NO: 234 HCDR1 (Chothia) GFALSNH SEQ ID NO: 235 HCDR2 (Chothia) VYSGS SEQ ID NO: 233 HCDR3 (Chothia) HGGESDV SEQ ID NO: 236 HCDR1 (IMGT) GFALSNHG SEQ ID NO: 237 HCDR2 (IMGT) IVYSGST SEQ ID NO: 238 HCDR3 (IMGT) SAHGGESDV SEQ ID NO: 239 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFALSNHGMSWVRRAPGKGLEWVSGIVYSGSTYYAASVKGRFTISRDNSRNTLYLQMNSLRPEDTAIYYCSAHGGESDVWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 262 ДНК VH GAAGTGCAATTGGTGGAATCAGGGGGAGGACTTGTGCAGCCTGGAGGATCGCTGAGACTGTCATGTGCCGTGTCCGGCTTTGCCCTGTCCAACCACGGGATGTCCTGGGTCCGCCGCGCGCCTGGAAAGGGCCTCGAATGGGTGTCGGGTATTGTGTACAGCGGTAGCACCTACTATGCCGCATCCGTGAAGGGGAGATTCACCATCAGCCGGGACAACTCCAGGAACACTCTGTACCTCCAAATGAATTCGCTGAGGCCAGAGGACACTGCCATCTACTACTGCTCCGCGCATGGCGGAGAGTCCGACGTCTGGGGACAGGGGACCACCGTGACCGTGTCTAGC SEQ ID NO: 54 LCDR1 (Kabat) RASQSISSYLN SEQ ID NO: 55 LCDR2 (Kabat) AASSLQS SEQ ID NO: 240 LCDR3 (Kabat) QQSYSTPYT SEQ ID NO: 57 LCDR1 (Chothia) SQSISSY SEQ ID NO: 58 LCDR2 (Chothia) AAS SEQ ID NO: 241 LCDR3 (Chothia) SYSTPY SEQ ID NO: 60 LCDR1 (IMGT) QSISSY SEQ ID NO: 58 LCDR2 (IMGT) AAS SEQ ID NO: 240 LCDR3 (IMGT) QQSYSTPYT SEQ ID NO: 242 VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPYTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 263 ДНК VL GACATCCAGCTCACCCAGTCCCCGAGCTCGCTGTCCGCCTCCGTGGGAGATCGGGTCACCATCACGTGCCGCGCCAGCCAGTCGATTTCCTCCTACCTGAACTGGTACCAACAGAAGCCCGGAAAAGCCCCGAAGCTTCTCATCTACGCCGCCTCGAGCCTGCAGTCAGGAGTGCCCTCACGGTTCTCCGGCTCCGGTTCCGGTACTGATTTCACCCTGACCATTTCCTCCCTGCAACCGGAGGACTTCGCTACTTACTACTGCCAGCAGTCGTACTCCACCCCCTACACTTTCGGACAAGGCACCAAGGTCGAAATCAAG SEQ ID NO: 243 Линкер ASGGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO: 200 scFv (VH-линкер-VL) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFALSNHGMSWVRRAPGKGLEWVSGIVYSGSTYYAASVKGRFTISRDNSRNTLYLQMNSLRPEDTAIYYCSAHGGESDVWGQGTTVTVSSASGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPYTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 201 ДНК scFv Gaagtgcaattggtggaatcagggggaggacttgtgcagcctggaggatcgctgagactgtcatgtgccgtgtccggctttgccctgtccaaccacgggatgtcctgggtccgccgcgcgcctggaaagggcctcgaatgggtgtcgggtattgtgtacagcggtagcacctactatgccgcatccgtgaaggggagattcaccatcagccgggacaactccaggaacactctgtacctccaaatgaattcgctgaggccagaggacactgccatctactactgctccgcgcatggcggagagtccgacgtctggggacaggggaccaccgtgaccgtgtctagcgcgtccggcggaggcggcagcgggggtggtggttcagggggcggcggatcggacatccagctcacccagtccccgagctcgctgtccgcctccgtgggagatcgggtcaccatcacgtgccgcgccagccagtcgatttcctcctacctgaactggtaccaacagaagcccggaaaagccccgaagcttctcatctacgccgcctcgagcctgcagtcaggagtgccctcacggttctccggctccggttccggtactgatttcaccctgaccatttcctccctgcaaccggaggacttcgctacttactactgccagcagtcgtactccaccccctacactttcggacaaggcaccaaggtcgaaatcaag duCD19.1 SEQ ID NO: 244 HCDR1 GVSLPDYGVS SEQ ID NO: 245 HCDR2 VIWGSETTYYQSSLKS SEQ ID NO: 246 HCDR3 HYYYGGSYAMDY SEQ ID NO: 295 HCDR1 (Kabat) DYGVS SEQ ID NO: 245 HCDR2 (Kabat) VIWGSETTYYQSSLKS SEQ ID NO: 246 HCDR3 (Kabat) HYYYGGSYAMDY SEQ ID NO: 310 HCDR1 (Chothia) GVSLPDY SEQ ID NO: 311 HCDR2 (Chothia) WGSET SEQ ID NO: 246 HCDR3 (Chothia) HYYYGGSYAMDY SEQ ID NO: 312 HCDR1 (IMGT) GVSLPDYG SEQ ID NO: 313 HCDR2 (IMGT) IWGSETT SEQ ID NO: 314 HCDR3 (IMGT) AKHYYYGGSYAMDY SEQ ID NO: 250 VH QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 315 ДНК VH CAGGTCCAACTCCAAGAAAGCGGACCGGGTCTTGTGAAGCCATCAGAAACTCTTTCACTGACTTGTACTGTGAGCGGAGTGTCTCTCCCCGATTACGGGGTGTCTTGGATCAGACAGCCACCGGGGAAGGGTCTGGAATGGATTGGAGTGATTTGGGGCTCTGAGACTACTTACTACCAATCATCCCTCAAGTCACGCGTCACCATCTCAAAGGACAACTCTAAGAATCAGGTGTCACTGAAACTGTCATCTGTGACCGCAGCCGACACCGCCGTGTACTATTGCGCTAAGCATTACTATTATGGCGGGAGCTACGCAATGGATTACTGGGGACAGGGTACTCTGGTCACCGTGTCCAGC SEQ ID NO: 247 LCDR1 RASQDISKYLN SEQ ID NO: 248 LCDR2 HTSRLHS SEQ ID NO: 249 LCDR3 QQGNTLPYT SEQ ID NO: 247 LCDR1 (Kabat) RASQDISKYLN SEQ ID NO: 248 LCDR2 (Kabat) HTSRLHS SEQ ID NO: 249 LCDR3 (Kabat) QQGNTLPYT SEQ ID NO: 316 LCDR1 (Chothia) SQDISKY SEQ ID NO: 317 LCDR2 (Chothia) HTS SEQ ID NO: 318 LCDR3 (Chothia) GNTLPY SEQ ID NO: 319 LCDR1 (IMGT) QDISKY SEQ ID NO: 317 LCDR2 (IMGT) HTS SEQ ID NO: 300 LCDR3 (IMGT) QQGNTLPYT SEQ ID NO: 251 VL EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIK SEQ ID NO: 320 ДНК VL GAAATTGTGATGACCCAGTCACCCGCCACTCTTAGCCTTTCACCCGGTGAGCGCGCAACCCTGTCTTGCAGAGCCTCCCAAGACATCTCAAAATACCTTAATTGGTATCAACAGAAGCCCGGACAGGCTCCTCGCCTTCTGATCTACCACACCAGCCGGCTCCATTCTGGAATCCCTGCCAGGTTCAGCGGTAGCGGATCTGGGACCGACTACACCCTCACTATCAGCTCACTGCAGCCAGAGGACTTCGCTGTCTATTTCTGTCAGCAAGGGAACACCCTGCCCTACACCTTTGGACAGGGCACCAAGCTCGAGATTAAA SEQ ID NO: 104 Линкер GGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO: 211 scFv-домен CAR2 - a. к. (линкер подчеркнут) EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 305 scFv-домен CAR2 - н. к. GAAATTGTGATGACCCAGTCACCCGCCACTCTTAGCCTTTCACCCGGTGAGCGCGCAACCCTGTCTTGCAGAGCCTCCCAAGACATCTCAAAATACCTTAATTGGTATCAACAGAAGCCCGGACAGGCTCCTCGCCTTCTGATCTACCACACCAGCCGGCTCCATTCTGGAATCCCTGCCAGGTTCAGCGGTAGCGGATCTGGGACCGACTACACCCTCACTATCAGCTCACTGCAGCCAGAGGACTTCGCTGTCTATTTCTGTCAGCAAGGGAACACCCTGCCCTACACCTTTGGACAGGGCACCAAGCTCGAGATTAAAGGTGGAGGTGGCAGCGGAGGAGGTGGGTCCGGCGGTGGAGGAAGCCAGGTCCAACTCCAAGAAAGCGGACCGGGTCTTGTGAAGCCATCAGAAACTCTTTCACTGACTTGTACTGTGAGCGGAGTGTCTCTCCCCGATTACGGGGTGTCTTGGATCAGACAGCCACCGGGGAAGGGTCTGGAATGGATTGGAGTGATTTGGGGCTCTGAGACTACTTACTACCAATCATCCCTCAAGTCACGCGTCACCATCTCAAAGGACAACTCTAAGAATCAGGTGTCACTGAAACTGTCATCTGTGACCGCAGCCGACACCGCCGTGTACTATTGCGCTAAGCATTACTATTATGGCGGGAGCTACGCAATGGATTACTGGGGACAGGGTACTCTGGTCACCGTGTCCAGC SEQ ID NO: 225 Полный CAR EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

В некоторых вариантах осуществления в данном документе раскрыта выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую первый полипептид CAR, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую второй полипептид CAR, где первый полипептид CAR содержит первый антигенсвязывающий домен, который представляет собой домен, связывающий BCMA (например, человеческий домен, связывающий BCMA), первый трансмембранный домен и первый внутриклеточный сигнальный домен, и где второй полипептид CAR содержит второй антигенсвязывающий домен, который представляет собой домен, связывающий CD19, второй трансмембранный домен и второй внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления первый полипептид CAR содержит VH, содержащую CDR1 HC, CDR2 HC и CDR3 HC последовательности, связывающей BCMA, представленные в таблице 20 или 26, и VL, содержащую CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC последовательности, связывающей BCMA, представленные в таблице 20 или 26, где VH и VL соединены линкером, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 243. В определенном варианте осуществления первый полипептид CAR содержит VH и VL, содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 239 и 242 соответственно, где VH и VL соединены линкером, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 243. В определенном варианте осуществления первый полипептид CAR содержит scFv, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 200. В определенном варианте осуществления первый полипептид CAR содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 230 или 228. В некоторых вариантах осуществления второй полипептид CAR содержит CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и/или CDR3 LC последовательности, связывающей CD19, представленные в таблице 19 или таблице 22 (например, CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC, содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 295 и 245-249 соответственно). В некоторых вариантах осуществления второй полипептид CAR содержит VH и/или VL последовательности, связывающей CD19, представленные в таблице 19 или таблице 22 (например, VH и VL, содержащие аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 250 и 251 соответственно), или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ними. В некоторых вариантах осуществления второй полипептид CAR содержит scFv последовательности, связывающей CD19, представленный в таблице 19 или таблице 22 (например, scFv, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 211), или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ним. В некоторых вариантах осуществления второй полипептид CAR включает в себя полипептид CAR с последовательностью, связывающей CD19, представленный в таблице 19 или таблице 22 (например, полипептид CAR, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 225 или 229), или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ним. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 221 или 223. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты кодирует аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 220 или 222 с сигнальным пептидом или без сигнального пептида под SEQ ID NO: 1.

Полиспецифические CAR

В одном варианте осуществления CAR по настоящему изобретению представляет собой полиспецифический CAR. В одном варианте осуществления полиспецифический CAR представляет собой биспецифический CAR. В одном варианте осуществления биспецифический CAR содержит антигенсвязывающий домен, который представляет собой молекулу биспецифического антитела. Биспецифическое антитело характеризуется специфичностью в отношении не более чем двух антигенов. Молекула биспецифического антитела характеризуется наличием первой последовательности вариабельного домена иммуноглобулина, которая характеризуется специфичностью связывания с первым эпитопом, и второй последовательности вариабельного домена иммуноглобулина, которая характеризуется специфичностью связывания со вторым эпитопом. В одном варианте осуществления первый и второй эпитопы находятся на одном и том же антигене, например, на одном и том же белке (или субъединице мультимерного белка). В одном варианте осуществления первый и второй эпитопы перекрываются. В одном варианте осуществления первый и второй эпитопы не перекрываются. В одном варианте осуществления первый и второй эпитопы находятся на разных антигенах, например, на разных белках (или на разных субъединицах мультимерного белка). В одном варианте осуществления молекула биспецифического антитела содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи и последовательность вариабельного домена легкой цепи, которые характеризуются специфичностью связывания с первым эпитопом, и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи и последовательность вариабельного домена легкой цепи, которые характеризуются специфичностью связывания со вторым эпитопом. В одном варианте осуществления молекула биспецифического антитела содержит полуантитело, характеризующееся специфичностью связывания с первым эпитопом, и полуантитело, характеризующееся специфичностью связывания со вторым эпитопом. В одном варианте осуществления молекула биспецифического антитела содержит полуантитело или его фрагмент, характеризующиеся специфичностью связывания с первым эпитопом, и полуантитело или его фрагмент, характеризующиеся специфичностью связывания со вторым эпитопом. В одном варианте осуществления молекула биспецифического антитела содержит scFv или его фрагмент, характеризующиеся специфичностью связывания с первым эпитопом, и scFv или его фрагмент, характеризующиеся специфичностью связывания со вторым эпитопом.

В некоторых вариантах осуществления CAR по настоящему изобретению содержит антигенсвязывающий домен, который представляет собой молекулу полиспецифического (например, биспецифического или триспецифического) антитела. Протоколы получения молекул биспецифических или гетеродимерных антител известны из уровня техники, включая без ограничения, например, подход "выступ во впадину", как описано, например, в US 5731168; спаривание Fc с использованием направленного электростатического взаимодействия, как описано, например, в WO 09/089004, WO 06/106905 и WO 2010/129304; образование гетеродимеров путем конструирования доменов с обменом нитей (SEED), как описано, например, в WO 07/110205; обмен Fab-фрагментами, как описано, например, в WO 08/119353, WO 2011/131746 и WO 2013/060867; двойные конъюгаты антител, например, получаемые путем сшивания антител с образованием биспецифической структуры с помощью гетеробифункционального реагента, содержащего реакционноспособную аминогруппу и реакционноспособную сульфгидрильную группу, как описано, например, в US 4433059; детерминанты биспецифических антител, получаемые путем рекомбинации полуантител (пары тяжелая-легкая цепь или Fab) из разных антител посредством цикла восстановления и окисления дисульфидных связей между двумя тяжелыми цепями, как описано, например, в US 4444878; трифункциональные антитела, например, три Fab'-фрагмента, сшитые с помощью реакционноспособных сульфгидрильных групп, как описано, например, в US5273743; биосинтетические связывающие белки, например, пары scFv, сшитых на С-концевых хвостах, предпочтительно посредством химической сшивки с помощью дисульфидных связей или реакционноспособных аминогрупп, как описано, например, в US5534254; бифункциональные антитела, например, Fab-фрагменты с различной специфичностью связывания, димеризованные с помощью лейциновых "застежек" (например, c-fos и c-jun), заменивших константный домен, как описано, например, в US5582996; биспецифические и олигоспецифические моно- и олиговалентные рецепторы, например, VH-CH1-области двух антител (два Fab-фрагмента), связанные полипептидным спейсером между CH1-областью одного антитела и VH-областью другого антитела, обычно с ассоциированными легкими цепями, как описано, например, в US5591828; биспецифические конъюгаты ДНК-антитело, например, получаемые путем сшивки антител или Fab-фрагментов двухнитевым фрагментом ДНК, как описано, например, в US5635602; биспецифические слитые белки, например, экспрессионную конструкцию, содержащую два scFv с гидрофильным спиральным пептидным линкером между ними и полную константную область, как описано, например, в US5637481; поливалентные и полиспецифические связывающие белки, например, димеры полипептидов, имеющие первый домен со связывающей областью вариабельной области тяжелой цепи Ig и второй домен со связывающей областью вариабельной области легкой цепи Ig, как правило, называемые диателами (также охватываются структуры более высокого порядка для создания биспецифических, триспецифических или тетраспецифических молекул, как описано, например, в US5837242; конструкции миниантител со связанными VL- и VH-цепями, дополнительно соединенными пептидными спейсерами с шарнирной областью и СН3-областью антитела, которые могут быть димеризованы с образованием биспецифических/поливалентных молекул, как описано, например, в US5837821; VH- и VL-домены, связанные коротким пептидным линкером (например, из 5 или 10 аминокислот) или вовсе не имеющие линкера, в любой ориентации, которые могут образовывать димеры с образованием биспецифических диател; тримеры и тетрамеры, как описано, например, в US5844094; нить из VH-доменов (или VL-доменов у представителей семейства), соединенных пептидными связями со сшиваемыми группами на С-конце, дополнительно ассоциированных с VL-доменами с образованием последовательно соединенных Fv (или scFv), как описано, например, в US5864019; и одноцепочечные связывающие полипептиды как с VH-, так и с VL-доменами, связанными пептидным линкером, объединенные в поливалентные структуры посредством нековалентной или химической сшивки с образованием, например, гомобивалентных, гетеробивалентных, тривалентных и тетравалентных структур с использованием формата как типа scFv, так и типа диатела, как описано, например, в US5869620. Дополнительные иллюстративные полиспецифические и биспецифические молекулы и способы их получения можно найти, например, в US 5910573, US 5932448, US 5959083, US 5989830, US 6005079, US 6239259, US 6294353, US 6333396, US 6476198, US 6511663, US 6670453, US 6743896, US 6809185, US 6833441, US 7129330, US 7183076, US 7521056, US 7527787, US 7534866, US 7612181, US 2002004587 A1, US 2002076406 A1, US 2002103345 A1, US 2003207346 A1, US 2003211078 A1, US 2004219643 A1, US 2004220388 A1, US 2004242847 A1, US 2005003403 A1, US 2005004352 A1, US 2005069552 A1, US 2005079170 A1, US 2005100543 A1, US 2005136049 A1, US 2005136051 A1, US 2005163782 A1, US 2005266425 A1, US 2006083747 A1, US 2006120960 A1, US 2006204493 A1, US 2006263367 A1, US 2007004909 A1, US 2007087381 A1, US 2007128150 A1, US 2007141049 A1, US 2007154901 A1, US 2007274985 A1, US 2008050370 A1, US 2008069820 A1, US 2008152645 A1, US 2008171855 A1, US 2008241884 A1, US 2008254512 A1, US 2008260738 A1, US 2009130106 A1, US 2009148905 A1, US 2009155275 A1, US 2009162359 A1, US 2009162360 A1, US 2009175851 A1, US 2009175867 A1, US 2009232811 A1, US 2009234105 A1, US 2009263392 A1, US 2009274649 A1, EP 346087 A2, WO 0006605 A2, WO 02072635 A2, WO 04081051 A1, WO 06020258 A2, WO 2007044887 A2, WO 2007095338 A2, WO 2007137760 A2, WO 2008119353 A1, WO 2009021754 A2, WO 2009068630 A1, WO 9103493 A1, WO 9323537 A1, WO 9409131 A1, WO 9412625 A2, WO 9509917 A1, WO 9637621 A2, WO 9964460 A1. Содержание вышеупомянутых заявок включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

В каждом антителе или фрагменте антитела (например, scFv) в молекуле биспецифического антитела VH может находиться выше или ниже VL. В некоторых вариантах осуществления вышерасположенные антитело или фрагмент антитела (например, scFv) имеют такую организацию, при которой их VH (VH₁) расположена выше их VL (VL₁), а нижерасположенные антитело или фрагмент антитела (например, scFv) имеют такую организацию, при которой их VL (VL₂) расположена выше их VH (VH₂), так что молекула биспецифического антитела в целом имеет организацию VH₁-VL₁-VL₂-VH₂. В других вариантах осуществления вышерасположенные антитело или фрагмент антитела (например, scFv) имеют такую организацию, при которой их VL (VL₁) расположена выше их VH (VH₁), а нижерасположенные антитело или фрагмент антитела (например, scFv) имеют такую организацию, при которой их VH (VH₂) расположена выше их VL (VL₂), так что молекула биспецифического антитела в целом имеет организацию VL₁-VH₁-VH₂-VL₂. Линкер необязательно располагается между двумя антителами или фрагментами антител (например, scFv), например, между VL₁ и VL₂, если конструкция имеет организацию VH₁-VL₁-VL₂-VH₂, или между VH₁ и VH₂, если конструкция имеет организацию VL₁-VH₁-VH₂-VL₂. Линкер может представлять собой линкер, описанный в данном документе, например, линкер (Gly₄-Ser)n, где n равняется 1, 2, 3, 4, 5 или 6, предпочтительно 4 (SEQ ID NO: 26). Обычно линкер между двумя scFv должен иметь достаточную длину для предотвращения неправильного спаривания между доменами двух scFv. Линкер необязательно располагается между VL и VH первого scFv. Линкер необязательно располагается между VL и VH второго scFv. В конструкциях, которые имеют несколько линкеров, любые два или более линкера могут быть одинаковыми или разными. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления биспецифический CAR содержит VL, VH и необязательно один или несколько линкеров в виде организации, описанной в данном документе.

В одном аспекте молекула биспецифического антитела характеризуется наличием первой последовательности вариабельного домена иммуноглобулина, например, scFv, которая характеризуется специфичностью связывания с BCMA, например, содержит scFv, описанный в данном документе, или содержит CDR легкой цепи и/или CDR тяжелой цепи из scFv для BCMA, описанного в данном документе, и второй последовательности вариабельного домена иммуноглобулина, которая характеризуется специфичностью связывания со вторым эпитопом на другом антигене. В одном аспекте вторая последовательность вариабельного домена иммуноглобулина характеризуется специфичностью связывания с антигеном, экспрессируемым на клетках AML, например, антигеном, отличным от BCMA. Например, вторая последовательность вариабельного домена иммуноглобулина характеризуется специфичностью связывания с CD123. В качестве другого примера вторая последовательность вариабельного домена иммуноглобулина характеризуется специфичностью связывания с CLL-1. В качестве другого примера вторая последовательность вариабельного домена иммуноглобулина характеризуется специфичностью связывания с CD34. В качестве другого примера вторая последовательность вариабельного домена иммуноглобулина характеризуется специфичностью связывания с FLT3. Например, вторая последовательность вариабельного домена иммуноглобулина характеризуется специфичностью связывания с рецептором фолиевой кислоты бета. В некоторых аспектах вторая последовательность вариабельного домена иммуноглобулина характеризуется специфичностью связывания с антигеном, экспрессируемым на B-клетках, например, CD10, CD19, CD20, CD22, CD34, CD123, FLT-3, ROR1, CD79b, CD179b или CD79a.

CAR в формате диатела

В некоторых вариантах осуществления CAR по настоящему изобретению представляет собой биспецифический CAR. В некоторых вариантах осуществления CAR по настоящему изобретению представляет собой CAR в формате диатела. В некоторых вариантах осуществления CAR в формате диатела содержит антигенсвязывающий домен, который связывается с первым антигеном и вторым антигеном. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен содержит VH1, VL1, VH2 и VL2, где VH1 и VL1 связываются с первым антигеном, а VH2 и VL2 связываются со вторым антигеном. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен имеет организацию VH1 - необязательно линкер 1 ("L1") - VH2 - необязательно линкер 2 ("L2") - VL2 - необязательно линкер 3 ("L3") - VL1 от N-конца до C-конца. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен имеет организацию VH1 - необязательно L1 - VL2 - необязательно L2 - VH2 - необязательно L3 - VL1 от N-конца до C-конца. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен имеет организацию VL1 - необязательно L1 - VH2 - необязательно L2 - VL2 - необязательно L3 - VH1 от N-конца до C-конца. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен имеет организацию VL1 - необязательно L1 - VL2 - необязательно L2 - VH2 - необязательно L3 - VH1 от N-конца до C-конца. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен имеет организацию VH2 - необязательно L1 - VH1 - необязательно L2 - VL1 - необязательно L3 - VL2 от N-конца до C-конца. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен имеет организацию VH2 - необязательно L1 - VL1 - необязательно L2 - VH1 - необязательно L3 - VL2 от N-конца до C-конца. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен имеет организацию VL2 - необязательно L1 - VH1 - необязательно L2 - VL1 - необязательно L3 - VH2 от N-конца до C-конца. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен имеет организацию VL2 - необязательно L1 - VL1 - необязательно L2 - VH1 - необязательно L3 - VH2 от N-конца до C-конца. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен имеет организацию VH1 - линкер 1 ("L1") - VH2 - линкер 2 ("L2") - VL2 - линкер 3 ("L3") - VL1 от N-конца до C-конца. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен имеет организацию VH1 - L1 - VL2 - L2 - VH2 - L3 - VL1 от N-конца до C-конца. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен имеет организацию VL1 - L1 - VH2 - L2 - VL2 - L3 - VH1 от N-конца до C-конца. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен имеет организацию VL1 - L1 - VL2 - L2 - VH2 - L3 - VH1 от N-конца до C-конца. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен имеет организацию VH2 - L1 - VH1 - L2 - VL1 - L3 - VL2 от N-конца до C-конца. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен имеет организацию VH2 - L1 - VL1 - L2 - VH1 - L3 - VL2 от N-конца до C-конца. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен имеет организацию VL2 - L1 - VH1 - L2 - VL1 - L3 - VH2 от N-конца до C-конца. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен имеет организацию VL2 - L1 - VL1 - L2 - VH1 - L3 - VH2 от N-конца до C-конца. В некоторых вариантах осуществления вариабельные области слиты с помощью линкера, содержащего аминокислотную последовательность GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 5). В некоторых вариантах осуществления вариабельные области слиты с помощью линкера, содержащего аминокислотную последовательность GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 63). В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления L2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 63. В некоторых вариантах осуществления L3 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления VH1, VL1, VH2 или VL2 содержат последовательность CDR, VH или VL, раскрытую в данном документе, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления диатело, раскрытое в данном документе, содержит сконструированный дисульфидный мостик, например, для стабилизации диатела и/или для содействия правильному спариванию VH и VL. В некоторых вариантах осуществления сконструированный дисульфидный мостик находится между вариабельной областью, которая расположена наиболее проксимально относительно шарнирной области (например, областью VH или VL, которая расположена наиболее проксимально относительно шарнирной области), и ее соответствующим партнером по спариванию (например, соответствующей VL или соответствующей VH).

В некоторых вариантах осуществления первый антиген и второй антиген являются разными. В некоторых вариантах осуществления первый или второй антиген выбран из антигена, экспрессируемого на B-клетках, антигена, экспрессируемого на клетках острого миелоидного лейкоза, или антигена на клетках солидной опухоли. В некоторых вариантах осуществления первый или второй антиген выбран из CD10, CD19, CD20, CD22, CD34, CD123, BCMA, FLT-3, ROR1, CD79b, CD179b, CD79a, CD34, CLL-1, рецептора фолиевой кислоты бета, FLT3, EGFRvIII, мезотелина, EGFRvIII, GD2, Tn-антигена, sTn-антигена, Tn-O-гликопептидов, sTn-O-гликопептидов, PSMA, CD97, TAG72, CD44v6, CEA, EPCAM, KIT, IL-13Ra2, легумана, GD3, CD171, IL-11Ra, PSCA, MAD-CT-1, MAD-CT-2, VEGFR2, антигена Y системы Льюис, CD24, PDGFR-бета, SSEA-4, рецептора фолиевой кислоты альфа, ERBB (например, ERBB2), Her2/neu, MUC1, EGFR, NCAM, эфрина B2, CAIX, LMP2, sLe, HMWMAA, o-ацетил-GD2, рецептора фолиевой кислоты бета, TEM1/CD248, TEM7R, FAP, легумаина, E6 или E7 HPV, ML-IAP, CLDN6, TSHR, GPRC5D, ALK, полисиаловой кислоты, Fos-родственного антигена, эластазы нейтрофилов, TRP-2, CYP1B1, белка спермы 17, бета-субъединицы хорионического гонадотропина человека, AFP, тиреоглобулина, PLAC1, globoH, RAGE1, MN-CA IX, обратной транскриптазы теломеразы человека, кишечной карбоксилэстеразы, мутантного варианта hsp 70-2, NA-17, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, NY-ESO-1, GPR20, Ly6k, OR51E2, TARP, GFRα4 или пептида любого из этих антигенов, презентированного на MHC.

В некоторых вариантах осуществления первый антиген представляет собой BCMA, а второй антиген представляет собой CD19. В некоторых вариантах осуществления CAR содержит антигенсвязывающий домен, который связывается с BCMA и CD19. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен содержит VH₁ и VL₁, которые связываются с BCMA ("VH для BCMA" и "VL для BCMA"), а также VH₂ и VL₂, которые связываются с CD19 ("VH для CD19" и "VL для CD19"). В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен имеет организацию VH для BCMA - необязательно линкер 1 ("L1") - VH для CD19 - необязательно линкер 2 ("L2") - VL для CD19 - необязательно линкер 3 ("L3") - VL для BCMA от N-конца до C-конца. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен имеет организацию VH для BCMA - необязательно L1 - VL для CD19 - необязательно L2 - VH для CD19 - необязательно L3 - VL для BCMA от N-конца до C-конца. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен имеет организацию VL для BCMA - необязательно L1 - VH для CD19 - необязательно L2 - VL для CD19 - необязательно L3 - VH для BCMA от N-конца до C-конца. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен имеет организацию VL для BCMA - необязательно L1 - VL для CD19 - необязательно L2 - VH для CD19 - необязательно L3 - VH для BCMA от N-конца до C-конца. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен имеет организацию VH для CD19 - необязательно L1 - VH для BCMA - необязательно L2 - VL для BCMA - необязательно L3 - VL для CD19 от N-конца до C-конца. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен имеет организацию VH для CD19 - необязательно L1 - VL для BCMA - необязательно L2 - VH для BCMA - необязательно L3 - VL для CD19 от N-конца до C-конца. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен имеет организацию VL для CD19 - необязательно L1 - VH для BCMA - необязательно L2 - VL для BCMA - необязательно L3 - VH для CD19 от N-конца до C-конца. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен имеет организацию VL для CD19 - необязательно L1 - VL для BCMA - необязательно L2 - VH для BCMA - необязательно L3 - VH для CD19 от N-конца до C-конца. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен имеет организацию VH для BCMA - линкер 1 ("L1") - VH для CD19 - линкер 2 ("L2") - VL для CD19 - линкер 3 ("L3") - VL для BCMA от N-конца до C-конца. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен имеет организацию VH для BCMA - L1 - VL для CD19 - L2 - VH для CD19 - L3 - VL для BCMA от N-конца до C-конца. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен имеет организацию VL для BCMA - L1 - VH для CD19 - L2 - VL для CD19 - L3 - VH для BCMA от N-конца до C-конца. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен имеет организацию VL для BCMA - L1 - VL для CD19 - L2 - VH для CD19 - L3 - VH для BCMA от N-конца до C-конца. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен имеет организацию VH для CD19 - L1 - VH для BCMA - L2 - VL для BCMA - L3 - VL для CD19 от N-конца до C-конца. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен имеет организацию VH для CD19 - L1 - VL для BCMA - L2 - VH для BCMA - L3 - VL для CD19 от N-конца до C-конца. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен имеет организацию VL для CD19 - L1 - VH для BCMA - L2 - VL для BCMA - L3 - VH для CD19 от N-конца до C-конца. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен имеет организацию VL для CD19 - L1 - VL для BCMA - L2 - VH для BCMA - L3 - VH для CD19 от N-конца до C-конца. В некоторых вариантах осуществления вариабельные области слиты с помощью линкера, содержащего аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 5 или 63 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью с ней. В некоторых вариантах осуществления L1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления L2 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 63. В некоторых вариантах осуществления L3 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 5.

В некоторых вариантах осуществления VH для BCMA содержит последовательности CDR или VH, раскрытые в данном документе, например, последовательности CDR или VH, раскрытые в таблицах 3-15, 19, 20, 22, 26 и 31, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью с ними. В некоторых вариантах осуществления VL для BCMA содержит последовательности CDR или VL, раскрытые в данном документе, например, последовательности CDR или VL, раскрытые в таблицах 3-15, 19, 20, 22, 26 и 31, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью с ними. В некоторых вариантах осуществления VH для CD19 содержит последовательности CDR или VH, раскрытые в данном документе, например, последовательности CDR или VH, раскрытые в таблицах 2, 19, 22 и 31, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью с ними. В некоторых вариантах осуществления VL для CD19 содержит последовательности CDR или VL, раскрытые в данном документе, например, последовательности CDR или VL, раскрытые в таблицах 2, 19, 22 и 31, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью с ними.

В некоторых вариантах осуществления CAR, например, CAR в формате диатела, дополнительно содержит шарнирную область, трансмембранный домен и/или внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления шарнирная область включает в себя шарнирную область CD8. В некоторых вариантах осуществления шарнирная область содержит последовательность шарнирной области, раскрытую в данном документе, например, аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью с ней. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен включает в себя трансмембранный домен CD8. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен содержит последовательность трансмембранного домена, раскрытую в данном документе, например, аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью с ней. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен включает в себя внутриклеточный домен 4-1BB. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит последовательность костимулирующего сигнального домена, раскрытую в данном документе, например, аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью с ней. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен включает в себя внутриклеточный домен CD3. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит последовательность первичного сигнального домена, раскрытую в данном документе, например, аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9 или 10 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью с ней.

Иллюстративные последовательности диател раскрыты в таблице 31. В некоторых вариантах осуществления CAR содержит антигенсвязывающий домен, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 321-330, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью с ней. В некоторых вариантах осуществления CAR содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 339-348, или аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью с ней.

Таблица 31. Иллюстративные компоненты CAR в формате диатела SEQ ID NO Описание Аминокислотная последовательность* SEQ ID NO: 321 Антигенсвязывающий домен JL1 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKCLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGSGTKVTVLGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSSGGGGSEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGCGTKLEIK SEQ ID NO: 339 Полноразмерный CAR JL1 в формате диатела QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKCLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGSGTKVTVLGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSSGGGGSEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGCGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 322 Антигенсвязывающий домен JL2 EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGCGTKLEIKGGGGSQVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGSGTKVTVLGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKCLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 340 Полноразмерный CAR JL2 в формате диатела EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGCGTKLEIKGGGGSQVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGSGTKVTVLGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKCLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 323 Антигенсвязывающий домен JL3 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKCLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSQVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGSGTKVTVLGGGGSEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGCGTKLEIK SEQ ID NO: 341 Полноразмерный CAR JL3 в формате диатела QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKCLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSQVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGSGTKVTVLGGGGSEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGCGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 324 Антигенсвязывающий домен JL4 EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGCGTKLEIKGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGSGTKVTVLGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKCLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 342 Полноразмерный CAR JL4 в формате диатела EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGCGTKLEIKGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGSGTKVTVLGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKCLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 325 Антигенсвязывающий домен JL5 QVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKCLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSSGGGGSEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGCGTKVTVL SEQ ID NO: 343 Полноразмерный CAR JL5 в формате диатела QVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKCLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSSGGGGSEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGCGTKVTVLTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 326 Антигенсвязывающий домен JL6 QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGCGTKVTVLGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSQVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKCLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 344 Полноразмерный CAR JL6 в формате диатела QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGCGTKVTVLGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSQVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKCLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 327 Антигенсвязывающий домен JL7 QVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKCLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGCGTKVTVL SEQ ID NO: 345 Полноразмерный CAR JL7 в формате диатела QVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKCLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGCGTKVTVLTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 328 Антигенсвязывающий домен JL8 QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGCGTKVTVLGGGGSEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSQVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKCLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 346 Полноразмерный CAR JL8 в формате диатела QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGCGTKVTVLGGGGSEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSQVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKCLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 329 Антигенсвязывающий домен JL9 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKCLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARREWWGESWLFDYWGQGTLVTVSSGGGGSEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGCGTKLEIK SEQ ID NO: 347 Полноразмерный CAR JL9 в формате диатела QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKCLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARREWWGESWLFDYWGQGTLVTVSSGGGGSEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGCGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 330 Антигенсвязывающий домен JL10 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKCLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARREWWGESWLFDYWGQGTLVTVSSGGGGSEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGCGTKVEIK SEQ ID NO: 348 Полноразмерный CAR JL10 в формате диатела EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKCLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARREWWGESWLFDYWGQGTLVTVSSGGGGSEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGCGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 250 VH для CD19 (CTL119) QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 251 VL для CD19 (CTL119) EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIK SEQ ID NO: 331 Вариант VH для CD19 (CTL119) QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKCLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 332 Вариант VL для CD19 (CTL119) EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGCGTKLEIK SEQ ID NO: 93 VH для BCMA (PI61) QVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 102 VL для BCMA (PI61) QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGSGTKVTVL SEQ ID NO: 333 Вариант VH для BCMA (PI61) QVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKCLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGGSGYALHDDYYGLDVWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 334 Вариант VL для BCMA (PI61) QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGCGTKVTVL SEQ ID NO: 78 VH для BCMA (R1G5) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARREWWGESWLFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 61 VL для BCMA (R1G5) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 335 Вариант VH для BCMA (R1G5) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKCLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARREWWGESWLFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 336 Вариант VL для BCMA (R1G5) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGCGTKVEIK SEQ ID NO: 5 Линкер GGGGSGGGGS SEQ ID NO: 63 Линкер GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS *: последовательности VH подчеркнуты, а последовательности VL подчеркнуты двойной чертой. Последовательности, связывающие CD19 (VH и VL), показаны курсивом.

Химерный TCR

В одном аспекте антитела и фрагменты антител по настоящему изобретению могут быть пересажены на один или несколько константных доменов цепи Т-клеточного рецептора ("TCR"), например, альфа-цепи TCR или бета-цепи TCR, с созданием химерного TCR. Не ограничиваясь какой-либо теорией, полагают, что химерные TCR будут передавать сигналы через комплекс TCR при связывании антигена. Например, scFv, раскрытый в данном документе, можно пересадить на константный домен, например, на по меньшей мере часть внеклеточного константного домена, трансмембранного домена и цитоплазматического домена, цепи TCR, например, альфа-цепи TCR и/или бета-цепи TCR. В качестве другого примера, фрагмент антитела, например, VL-домен, описанный в данном документе, можно пересадить на константный домен альфа-цепи TCR, и фрагмент антитела, например, VH-домен, описанный в данном документе, можно пересадить на константный домен бета-цепи TCR (или в качестве альтернативы VL-домен можно пересадить на константный домен бета-цепи TCR, а VH-домен можно пересадить на альфа-цепь TCR). В качестве другого примера CDR антитела или фрагмента антитела, например, CDR антитела или фрагмента антитела, описанного в данном документе, можно пересадить на альфа- и/или бета-цепь TCR для создания химерного TCR. Например, раскрытые в данном документе LCDR можно пересадить на вариабельный домен альфа-цепи TCR, а раскрытые в данном документе HCDR можно пересадить на вариабельный домен бета-цепи TCR или наоборот. Такие химерные TCR можно получить посредством способов, известных из уровня техники (например, Willemsen RA et al, Gene Therapy 2000; 7: 1369-1377; Zhang T et al, Cancer Gene Ther 2004; 11: 487-496; Aggen et al, Gene Ther. 2012 Apr;19(4):365-74).

Дополнительные варианты осуществления

В одном аспекте описанная в данном документе клетка, экспрессирующая CAR, может дополнительно содержать второй CAR, например, второй CAR, который содержит другой антигенсвязывающий домен, например, для той же мишени (BCMA) или другой мишени (например, CD19, CD20 или CS-1 или других мишеней множественной миеломы, например, легкой каппа-цепи, CD138, антигена Y системы Льюис или CD38 (Garfall et al., Discovery Medicine, 2014, 17(91):37-46)). В одном варианте осуществления клетка, экспрессирующая CAR, содержит первый CAR, который нацеливается на первый антиген и содержит внутриклеточный сигнальный домен, имеющий костимулирующий сигнальный домен, а не первичный сигнальный домен, и второй CAR, который нацеливается на второй, другой, антиген и содержит внутриклеточный сигнальный домен, имеющий первичный сигнальный домен, а не костимулирующий сигнальный домен. Без ограничения какой-либо теорией, размещение костимулирующего сигнального домена, например, 4-1BB, CD28, CD27 или OX-40, в первом CAR и первичного сигнального домена, например, CD3-дзета, во втором CAR может ограничивать активность CAR клетками, в которых экспрессируются обе мишени. В одном варианте осуществления клетка, экспрессирующая CAR, содержит первый CAR для BCMA, который содержит домен, связывающий BCMA, трансмембранный домен и костимулирующий домен, и второй CAR, который нацеливается на антиген, отличный от BCMA (например, антиген, экспрессируемый на клетках лейкоза или лимфомы, например, CD19, CD20, CS-1, легкую каппа-цепь, CD139, антиген Y системы Льюиса или CD38), и содержит антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и первичный сигнальный домен. В другом варианте осуществления клетка, экспрессирующая CAR, содержит первый CAR для BCMA, который содержит домен, связывающий BCMA, трансмембранный домен и первичный сигнальный домен, и второй CAR, который нацеливается на антиген, отличный от BCMA (например, антиген, экспрессируемый на клетках лейкоза или лимфомы, например, CD19, CD20, CS-1, легкую каппа-цепь, CD139, антиген Y системы Льюис или CD38), и содержит антигенсвязывающий домен для антигена, трансмембранный домен и костимулирующий сигнальный домен. В одном варианте осуществления клетка, экспрессирующая CAR, содержит CAR для BCMA, описанный в данном документе, и CAR, который нацеливается на CD19 (CAR для CD19).

В одном варианте осуществления клетка, экспрессирующая CAR, содержит CAR для BCMA, описанный в данном документе, и ингибирующий CAR. В одном варианте осуществления ингибирующий CAR содержит антигенсвязывающий домен, который связывает антиген, обнаруживаемый на нормальных клетках, но не на раковых клетках. В одном варианте осуществления ингибирующий CAR содержит антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный домен ингибирующей молекулы. Например, внутриклеточный домен ингибирующего CAR может представлять собой внутриклеточный домен PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, молекулы MHC I класса, молекулы MHC II класса, GAL9, аденозина и TGFR-бета.

В одном варианте осуществления в случае, если клетка, экспрессирующая CAR содержит два или более различных CAR, то антигенсвязывающие домены различных CAR могут быть такими, что антигенсвязывающие домены не взаимодействуют друг с другом. Например, клетка, экспрессирующая первый и второй CAR, может иметь антигенсвязывающий домен первого CAR, например, в качестве фрагмента, например, scFv, который не ассоциирует с антигенсвязывающим доменом второго CAR, например, антигенсвязывающий домен второго CAR представляет собой VHH.

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен содержит однодоменные антигенсвязывающие (SDAB) молекулы, в том числе молекулы, в которых определяющие комплементарность области являются частью однодоменного полипептида. Примеры включают без ограничения вариабельные домены тяжелых цепей, связывающие молекулы, в природных условиях лишенные легких цепей, отдельные домены, полученные из традиционных 4-цепочечных антител, сконструированные домены и однодоменные каркасные структуры, отличные от полученных из антител. Молекулы SDAB могут являться любыми молекулами, известными из уровня техники, или любыми однодоменными молекулами, которые будут известны в будущем. Молекулы SDAB могут быть получены из любых видов, в том числе без ограничения из мыши, человека, верблюда, ламы, миноги, рыбы, акулы, козы, кролика и быка. Этот термин также охватывает встречающиеся в природе молекулы однодоменных антител из видов, отличных от Camelidae и акул.

В одном аспекте молекула SDAB может быть получена из вариабельной области иммуноглобулина, обнаруживаемого у рыб, как, например, та, которая получена из изотипа иммуноглобулина, известного как новый антигенный рецептор (NAR), обнаруживаемого в сыворотке крови акулы. Способы получения однодоменных молекул, получаемых из вариабельной области NAR ("IgNAR"), описаны в WO 03/014161 и Streltsov (2005) Protein Sci. 14:2901-2909.

Согласно другому аспекту молекула SDAB представляет собой встречающуюся в природе однодоменную антигенсвязывающую молекулу, известную как тяжелая цепь, лишенная легких цепей. Такие однодоменные молекулы раскрыты, например, в WO 9404678 и Hamers-Casterman, C. et al. (1993) Nature 363:446-448. В целях ясности этот вариабельный домен, полученный из молекулы тяжелой цепи, в природных условиях лишенной легкой цепи, именуется в данном документе как VHH или нанотело, чтобы отличать его от традиционного VH четырехцепочечных иммуноглобулинов. Такая молекула VHH может быть получена из видов Camelidae, например, из верблюда, ламы, дромадера, альпаки и гуанако. Другие виды, помимо Camelidae, могут продуцировать молекулы тяжелых цепей, в природных условиях лишенные легкой цепи; такие VHH входят в объем настоящего изобретения.

Молекулы SDAB могут быть рекомбинантными, с пересаженными CDR, гуманизированными, камелизированными, деиммунизированными и/или образованными in vitro (например, отобранными с помощью фагового дисплея).

Также было обнаружено, что в клетках, имеющих множество химерных рецепторов, встроенных в мембрану, содержащих антигенсвязывающий домен, взаимодействия между антигенсвязывающими доменами рецепторов могут быть нежелательными, например, поскольку они ингибируют способность одного или нескольких антигенсвязывающих доменов связываться с их когнатными антигенами. Соответственно, в данном документе раскрыты клетки, имеющие первый и второй не встречающиеся в природе химерные рецепторы, встроенные в мембрану, содержащие антигенсвязывающие домены, для которых сведены к минимуму такие взаимодействия. Также в данном документе раскрыты нуклеиновые кислоты, кодирующие первый и второй не встречающиеся в природе химерные рецепторы, встроенные в мембрану, содержащие антигенсвязывающие домены, для которых сведены к минимуму такие взаимодействия, а также способы получения и применения таких клеток и нуклеиновых кислот. В одном варианте осуществления антигенсвязывающий домен одного из указанного первого и указанного второго не встречающихся в природе химерных рецепторов, встроенных в мембрану, содержит scFv, а другой содержит одиночный VH-домен, например, одиночный VH-домен верблюдовых, акулы или миноги или одиночный VH-домен, полученный из последовательности человека или мыши.

В некоторых вариантах осуществления в заявляемом изобретении предусмотрены первый и второй CAR, где антигенсвязывающий домен одного из указанного первого CAR и указанного второго CAR не содержит вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен одного из указанного первого CAR и указанного второго CAR представляет собой scFv, а другой не представляет собой scFv. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен одного из указанного первого CAR и указанного второго CAR содержит одиночный VH-домен, например, одиночный VH-домен верблюдовых, акулы или миноги или одиночный VH-домен, полученный из последовательности человека или мыши. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен одного из указанного первого CAR и указанного второго CAR содержит нанотело. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен одного из указанного первого CAR и указанного второго CAR содержит VHH-домен верблюдовых.

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен одного из указанного первого CAR и указанного второго CAR содержит scFv, а другой содержит одиночный VH-домен, например, одиночный VH-домен верблюдовых, акулы или миноги или одиночный VH-домен, полученный из последовательности человека или мыши. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен одного из указанного первого CAR и указанного второго CAR содержит scFv, а другой содержит нанотело. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен одного из указанного первого CAR и указанного второго CAR содержит scFv, а другой содержит VHH-домен верблюдовых.

В некоторых вариантах осуществления связывание антигенсвязывающего домена указанного первого CAR, при наличии его на поверхности клетки, со своим когнатным антигеном существенно не снижается благодаря наличию указанного второго CAR. В некоторых вариантах осуществления связывание антигенсвязывающего домена указанного первого CAR со своим когнатным антигеном в присутствии указанного второго CAR составляет 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% от связывания антигенсвязывающего домена указанного первого CAR со своим когнатным антигеном в отсутствие указанного второго CAR.

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающие домены указанного первого CAR и указанного второго CAR при наличии их на поверхности клетки ассоциируют друг с другом в меньшей степени, чем в случае, если бы они оба являлись антигенсвязывающими доменами scFv. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающие домены указанного первого CAR и указанного второго CAR ассоциируют друг с другом в на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% меньшей степени, чем в случае, если бы они оба являлись антигенсвязывающими доменами scFv.

В другом аспекте описанная в данном документе клетка, экспрессирующая CAR, может дополнительно экспрессировать другое средство, например, средство, которое усиливает активность клетки, экспрессирующей CAR. Например, в одном варианте осуществления средство может представлять собой средство, которое ингибирует ингибирующую молекулу, например, средство, описанное в данном документе. Ингибирующие молекулы, например, PD1, в некоторых вариантах осуществления могут снижать способность клетки, экспрессирующей CAR, осуществлять иммунный эффекторный ответ. Примеры ингибирующих молекул включают PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, молекулу MHC I класса, молекулу MHC II класса, GAL9, аденозин и TGFR-бета. В одном варианте осуществления средство, которое ингибирует ингибирующую молекулу, содержит первый полипептид, например, ингибирующую молекулу, ассоциированный со вторым полипептидом, который обеспечивает положительный сигнал для клетки, например, с внутриклеточным сигнальным доменом, описанным в данном документе. В одном варианте осуществления средство содержит первый полипептид, например, из ингибирующей молекулы, такой как PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, молекула MHC I класса, молекула MHC II класса, GAL9, аденозин и TGFR-бета или фрагмент любого из них (например, по меньшей мере часть внеклеточного домена любого из них), и второй полипептид, который представляет собой внутриклеточный сигнальный домен, описанный в данном документе (например, содержащий костимулирующий домен (например, 4-1BB, CD27, ICOS или CD28, например, описанный в данном документе) и/или первичный сигнальный домен (например, сигнальный домен CD3-дзета, описанный в данном документе). В одном варианте осуществления средство содержит первый полипептид из PD1 или его фрагмента (например, по меньшей мере часть внеклеточного домена PD1) и второй полипептид, представляющий собой внутриклеточный сигнальный домен, описанный в данном документе (например, сигнальный домен CD28, описанный в данном документе, и/или сигнальный домен CD3-дзета, описанный в данном документе). В ряде вариантов осуществления описанная в данном документе клетка, экспрессирующая CAR, содержит переключающий костимулирующий рецептор, например, описанный в WO 2013/019615, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. PD1 является ингибирующим представителем семейства рецепторов CD28, которое также включает CD28, CTLA-4, ICOS и BTLA. PD-1 экспрессируется на активированных B-клетках, T-клетках и миелоидных клетках (Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75). Было показано, что два лиганда PD1 - PD-L1 и PD-L2 - подавляют активацию Т-клеток при связывании с PD1 (Freeman et al. 2000 J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43). PD-L1 является широко распространенным при различных формах рака у человека (Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7; Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094). Иммуносупрессию можно устранить путем ингибирования локального взаимодействия PD1 с PD-L1.

В одном варианте осуществления средство, содержащее внеклеточный домен (ECD) ингибирующей молекулы, например, белка 1 запрограммированной гибели клеток (PD1), может быть слито с трансмембранным доменом и внутриклеточными сигнальными доменами, такими как 4-1BB и CD3-дзета (также называется в данном документе CAR на основе PD1). В одном варианте осуществления CAR на основе PD1 при применении в комбинациях с CAR для BCMA, описанным в данном документе, улучшает персистенцию клетки, экспрессирующей CAR, например, T-клетки или NK-клетки. В одном варианте осуществления CAR представляет собой CAR на основе PD1, содержащий внеклеточный домен PD1, указанный подчеркиванием в SEQ ID NO: 24. В одном варианте осуществления CAR на основе PD1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 24.

В одном варианте осуществления CAR на основе PD1 содержит аминокислотную последовательность, представленную ниже (SEQ ID NO: 22).

В одном варианте осуществления средство содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR на основе PD1, например, CAR на основе PD1, описанный в данном документе. В одном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты для CAR на основе PD1 представлена под SEQ ID NO: 23, при этом ECD PD1 подчеркнут.

В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрена популяция клеток, экспрессирующих CAR, например, CAR-T-клеток или NK-клеток, экспрессирующих CAR. В некоторых вариантах осуществления популяция клеток, экспрессирующих CAR, содержит смесь клеток, экспрессирующих различные CAR. Например, в одном варианте осуществления популяция клеток, экспрессирующих CAR (например, CAR-T-клеток или NK-клеток, экспрессирующих CAR), может содержать первую клетку, экспрессирующую CAR, имеющий домен, связывающий BCMA, описанный в данном документе, и вторую клетку, экспрессирующую CAR, имеющий другой домен, связывающий BCMA, например, домен, связывающий BCMA, описанный в данном документе, который отличается от домена, связывающего BCMA, в CAR, экспрессируемом первой клеткой. В качестве другого примера, популяция клеток, экспрессирующих CAR, может содержать первую клетку, экспрессирующую CAR, который содержит домен, связывающий BCMA, например, описанный в данном документе, и вторую клетку, экспрессирующую CAR, который содержит антигенсвязывающий домен для мишени, отличной от BCMA (например, CD19, CD20, CS-1, легкой каппа-цепи, CD139, антигена Y системы Льюис или CD38). В одном варианте осуществления популяция клеток, экспрессирующих CAR, содержит первую клетку, экспрессирующую CAR, содержащий домен, связывающий BCMA, например, описанный в данном документе, и вторую клетку, экспрессирующую CAR, содержащий антигенсвязывающий домен, нацеливающийся на CD19 (CAR для CD19). В одном варианте осуществления популяция клеток, экспрессирующих CAR, содержит, например, первую клетку, экспрессирующую CAR, который содержит первичный внутриклеточный сигнальный домен, и вторую клетку, экспрессирующую CAR, который содержит вторичный сигнальный домен.

В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрена популяция клеток, где по меньшей мере одна клетка в популяции экспрессирует CAR, имеющий домен, связывающий BCMA, описанный в данном документе, и вторая клетка экспрессирует другое средство, например, средство, которое усиливает активность клетки, экспрессирующей CAR. Например, в одном варианте осуществления средство может представлять собой средство, которое ингибирует ингибирующую молекулу. Ингибирующие молекулы, например, могут в некоторых вариантах осуществления снижать способность клетки, экспрессирующей CAR, осуществлять иммунный эффекторный ответ. Примеры ингибирующих молекул включают PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, молекулу MHC I класса, молекулу MHC II класса, GAL9, аденозин и TGFR-бета. В одном варианте осуществления средство, которое ингибирует ингибирующую молекулу, содержит первый полипептид, например, ингибирующую молекулу, ассоциированный со вторым полипептидом, который обеспечивает положительный сигнал для клетки, например, с внутриклеточным сигнальным доменом, описанным в данном документе. В одном варианте осуществления средство содержит первый полипептид, например, из ингибирующей молекулы, такой как PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, молекула MHC I класса, молекула MHC II класса, GAL9, аденозин и TGFR-бета или фрагмент любого из них (например, по меньшей мере часть внеклеточного домена любого из них), и второй полипептид, который представляет собой внутриклеточный сигнальный домен, описанный в данном документе (например, содержащий костимулирующий домен (например, 4-1BB, CD27, ICOS или CD28, например, описанный в данном документе) и/или первичный сигнальный домен (например, сигнальный домен CD3-дзета, описанный в данном документе). В одном варианте осуществления средство содержит первый полипептид из PD1 или его фрагмента (например, по меньшей мере часть внеклеточного домена PD1) и второй полипептид, представляющий собой внутриклеточный сигнальный домен, описанный в данном документе (например, сигнальный домен CD28, описанный в данном документе, и/или сигнальный домен CD3-дзета, описанный в данном документе).

В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрены способы, включающие введение популяции клеток, экспрессирующих CAR (например, CAR-T-клеток или NK-клеток, экспрессирующих CAR), например, смеси клеток, экспрессирующих различные CAR, в комбинации с другим средством, например, ингибитором киназы, таким как ингибитор киназы, описанный в данном документе. В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрены способы, включающие введение популяции клеток, где по меньшей мере одна клетка в популяции экспрессирует CAR, имеющий антигенсвязывающий домен для антигена, ассоциированного с раком, описанного в данном документе, и вторую клетку, экспрессирующую другое средство, например, средство, которое усиливает активность клетки, экспрессирующей CAR, в комбинации с другим средством, например, ингибитором киназы, таким как ингибитор киназы, описанный в данном документе.

CAR, содержащие рецепторы естественных клеток-киллеров (NKR)

В одном варианте осуществления молекула CAR, описанная в данном документе, содержит один или несколько компонентов рецептора естественных клеток-киллеров (NKR), образуя тем самым NKR-CAR. Компонент NKR может представлять собой трансмембранный домен, шарнирный домен или цитоплазматический домен любого из следующих рецепторов естественных клеток-киллеров: иммуноглобулиноподобного рецептора клеток-киллеров (KIR), например, KIR2DL1, KIR2DL2/L3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, DIR2DS5, KIR3DL1/S1, KIR3DL2, KIR3DL3, KIR2DP1 и KIR3DP1; рецептора естественной цитотоксичности (NCR), например, NKp30, NKp44, NKp46; семейства рецепторов иммунных клеток, являющихся сигнальными молекулами активации лимфоцитов (SLAM), например, CD48, CD229, 2B4, CD84, NTB-A, CRACC, BLAME и CD2F-10; Fc-рецептора (FcR), например, CD16 и CD64; и рецепторов Ly49, например, LY49A, LY49C. Молекулы NKR-CAR, описанные в данном документе, могут взаимодействовать с адапторной молекулой или внутриклеточным сигнальным доменом, например, DAP12. Иллюстративные конфигурации и последовательности молекул CAR, содержащих компоненты NKR, описаны в международной публикации № WO2014/145252, содержание которой включено в данный документ посредством ссылки.

Каркасные структуры, отличные от антител

В ряде вариантов осуществления антигенсвязывающий домен содержит каркасную структуру, отличную от антитела, например, фибронектин, анкирин, доменное антитело, липокалин, малое модульное иммунофармацевтическое средство, максиантитело, белок A или аффилин. Каркасная структура, отличная от антитела, обладает способностью связываться с антигеном-мишенью на клетке. В ряде вариантов осуществления антигенсвязывающий домен представляет собой полипептид или его фрагмент из встречающегося в природе белка, экспрессируемого на клетке. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен содержит каркасную структуру, отличную от антитела. Можно использовать большое разнообразие каркасных структур, отличных от антител, при условии, что полученный в результате полипептид содержит по меньшей мере одну связывающую область, которая специфично связывается с антигеном-мишенью на клетке-мишени.

Каркасные структуры, отличные от антител, включают фибронектин (Novartis, Массачусетс), анкирин (Molecular Partners AG, Цюрих, Швейцария), доменные антитела (Domantis, Ltd., Кембридж, Массачусетс и Ablynx NV, Звейнарде, Бельгия), липокалин (Pieris Proteolab AG, Фрайзинг, Германия), малые модульные иммунофармацевтические средства (Trubion Pharmaceuticals Inc., Сиэтл, Вашингтон), максиантитела (Avidia, Inc., Маунтин-Вью, Калифорния), белок A (Affibody AG, Швеция) и аффилин (гамма-кристаллин или убиквитин) (Scil Proteins GmbH, Галле, Германия).

Стратегии регуляции химерных антигенных рецепторов

Существует множество путей, которыми можно регулировать формы активности CAR. В некоторых вариантах осуществления регулируемый CAR (RCAR), в котором можно контролировать активность CAR, является желательным для оптимизации безопасности и эффективности CAR-терапии. Например, индуцирование апоптоза с помощью, например, каспазы, слитой с димеризационным доменом (см., например, Di et al., N Engl. J. Med. 2011 Nov. 3; 365(18):1673-1683), можно применять в качестве защитного переключателя в CAR-терапии по настоящему изобретению. В другом примере клетки, экспрессирующие CAR, могут также экспрессировать молекулу индуцируемой каспазы-9 (iCaspase-9), которая при введении димеризующего лекарственного средства (например, римидуцида (также называемого AP1903 (Bellicum Pharmaceuticals) или AP20187 (Ariad)) приводит к активации каспазы-9 и апоптозу клеток. Молекула iCaspase-9 содержит связывающий домен для химического индуктора димеризации (CID), который опосредует димеризацию в присутствии CID. Это приводит к индуцируемому и селективному истощению по клеткам, экспрессирующим CAR. В некоторых случаях молекула iCaspase-9 кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, отдельной от вектора(векторов), кодирующего(кодирующих) CAR. В некоторых случаях молекула iCaspase-9 кодируется той же молекулой нуклеиновой кислоты, что и вектор, кодирующий CAR. iCaspase-9 может обеспечивать защитное переключение для избежания возможной токсичности клеток, экспрессирующих CAR. См., например, Song et al. Cancer Gene Ther. 2008; 15(10):667-75; Clinical Trial Id. № NCT02107963; и Di Stasi et al. N. Engl. J. Med. 2011; 365:1673-83.

Альтернативные стратегии регуляции средства CAR-терапии по настоящему изобретению включают использование малых молекул или антител, которые деактивируют или выключают активность CAR, например, путем удаления клеток, экспрессирующих CAR, например, путем индукции антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (ADCC). Например, клетки, экспрессирующие CAR, описанные в данном документе, могут также экспрессировать антиген, который распознается молекулами, способными индуцировать гибель клеток, например, ADCC или комплемент-индуцированную гибель клеток. Например, клетки, экспрессирующие CAR, описанные в данном документе, также могут экспрессировать рецептор, на который могут нацеливаться антитело или фрагмент антитела. Примеры таких рецепторов включают EpCAM, VEGFR, интегрины (например, интегрины ανβ3, α4, αΙ¾β3, α4β7, α5β1, ανβ3, αν), представителей суперсемейства рецепторов TNF (например, TRAIL-R1 , TRAIL-R2), рецептор PDGF, рецептор интерферона, рецептор фолиевой кислоты, GPNMB, ICAM-1, HLA-DR, CEA, CA-125, MUC1, TAG-72, рецептор IL-6, 5T4, GD2, GD3, CD2, CD3, CD4, CD5, CD1 1, CD1 1 a/LFA-1, CD15, CD18/ITGB2, CD19, CD20, CD22, CD23/рецептор IgE, CD25, CD28, CD30, CD33, CD38, CD40, CD41, CD44, CD51, CD52, CD62L, CD74, CD80, CD125, CD147/базиджин, CD152/CTLA-4, CD154/CD40L, CD195/CCR5, CD319/SLAMF7 и EGFR и их усеченные варианты (например, варианты, в которых сохраняются один или несколько внеклеточных эпитопов, но отсутствуют одна или несколько областей в цитоплазматическом домене). Например, клетки, экспрессирующие CAR, описанные в данном документе, также могут экспрессировать усеченный рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), у которого отсутствует способность к передаче сигнала, но сохраняется эпитоп, распознаваемый молекулами, способными индуцировать ADCC, например, цетуксимабом (ERBITUX®), так что введение цетуксимаба индуцирует ADCC и последующее истощение популяции клеток, экспрессирующих CAR (см., например, WO2011/056894 и Jonnalagadda et al., Gene Ther. 2013; 20(8)853-860). Другая стратегия предусматривает обеспечение экспрессии высококомпактного маркерного/"суицидального" гена, в котором объединены эпитопы-мишени обоих из антигенов CD32 и CD20 в клетках, экспрессирующих CAR, описанных в данном документе, которые связываются с ритуксимабом, что приводит к избирательному истощению популяции клеток, экспрессирующих CAR, например, посредством ADCC (см., например, Philip et al., Blood. 2014; 124(8)1277-1287). Другие способы истощения популяции клеток, экспрессирующих CAR, описанных в данном документе, включают введение CAMPATH® - моноклонального антитела к CD52, которое избирательно связывается со зрелыми лимфоцитами, например, клетками, экспрессирующими CAR, и направляет их на разрушение, например, посредством индукции ADCC. В других вариантах осуществления на клетки, экспрессирующие CAR, можно осуществлять избирательное нацеливание с помощью лиганда CAR, например, антиидиотипического антитела. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело может обуславливать активность эффекторных клеток, например, формы активности ADCC или ADC, за счет чего обеспечивается снижение количества клеток, экспрессирующих CAR. В других вариантах осуществления лиганд CAR, например, антиидиотипическое антитело, может быть связан со средством, которое индуцирует уничтожение клеток, например, токсином, за счет чего обеспечивается снижение количества клеток, экспрессирующих CAR. В качестве альтернативы молекулы CAR сами по себе могут быть представлены в такой конфигурации, при которой активность можно регулировать, например, путем включения или выключения, как описано ниже.

В некоторых вариантах осуществления RCAR содержит набор полипептидов, как правило, в простейших вариантах осуществления два, в которых составляющие стандартного CAR, описанного в данном документе, например, антигенсвязывающий домен и внутриклеточный сигнальный домен, разделены на отдельные полипептиды или компоненты. В некоторых вариантах осуществления набор полипептидов содержит димеризационный переключатель, который при наличии димеризующей молекулы может связывать полипептиды друг с другом, например, может связывать антигенсвязывающий домен с внутриклеточным сигнальным доменом. Дополнительное описание и иллюстративные конфигурации таких регулируемых CAR предусмотрены в данном документе и в международной публикации № WO 2015/090229, включенной в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

В одном варианте осуществления RCAR содержит два полипептида или компонента: 1) внутриклеточный сигнальный компонент, содержащий внутриклеточный сигнальный домен, например, первичный внутриклеточный сигнальный домен, описанный в данном документе, и первый переключающий домен; 2) антигенсвязывающий компонент, содержащий антигенсвязывающий домен, например, который нацеливается на опухолевый антиген, описанный в данном документе, и второй переключающий домен. RCAR необязательно содержит трансмембранный домен, описанный в данном документе. В одном варианте осуществления трансмембранный домен может быть расположен во внутриклеточном сигнальном компоненте, в антигенсвязывающем компоненте или в них обоих. (Если не указано иное, то при описании в данном документе компонентов или элементов RCAR порядок может быть таким, как предусмотрено, но также включены и другие порядки. Другими словами, в одном варианте осуществления порядок является таким, как изложено в тексте, но в других вариантах осуществления порядок может быть другим. Например, порядок элементов с одной стороны от трансмембранной области может отличаться от примера, например, размещение переключающего домена относительно внутриклеточного сигнального домена может быть другим, например, обратным).

В одном варианте осуществления первый и второй переключающий домены могут образовывать внутриклеточный или внеклеточный димеризационный переключатель. В одном варианте осуществления димеризационный переключатель может представлять собой гомодимеризационный переключатель, например, если первый и второй переключающие домены являются одинаковыми, или гетеродимеризационный переключатель, например, если первый и второй переключающие домены отличаются друг от друга.

В ряде вариантов осуществления RCAR может содержать "мультипереключатель". Мультипереключатель может содержать гетеродимеризационные переключающие домены или гомодимеризационные переключающие домены. Мультипереключатель содержит множество, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10, переключающих доменов отдельно в первом компоненте, например, антигенсвязывающем компоненте, и втором компоненте, например, внутриклеточном сигнальном компоненте. В одном варианте осуществления первый компонент может содержать множество первых переключающих доменов, например, переключающих доменов на основе FKBP, и второй компонент может содержать множество вторых переключающих доменов, например, переключающих доменов на основе FRB. В одном варианте осуществления первый компонент может содержать первый и второй переключающий домен, например, переключающий домен на основе FKBP и переключающий домен на основе FRB, и второй компонент может содержать первый и второй переключающий домен, например, переключающий домен на основе FKBP и переключающий домен на основе FRB.

В одном варианте осуществления внутриклеточный сигнальный компонент содержит один или несколько внутриклеточных сигнальных доменов, например, первичный внутриклеточный сигнальный домен и один или несколько костимулирующих сигнальных доменов.

В одном варианте осуществления антигенсвязывающий компонент может содержать один или несколько внутриклеточных сигнальных доменов, например, один или несколько костимулирующих сигнальных доменов. В одном варианте осуществления антигенсвязывающий компонент содержит множество, например, 2 или 3, костимулирующих сигнальных доменов, описанных в данном документе, например, выбранных из 4-1BB, CD28, CD27, ICOS и OX40, и в ряде вариантов осуществления первичный внутриклеточный сигнальный домен отсутствует. В одном варианте осуществления антигенсвязывающий компонент содержит следующие костимулирующие сигнальные домены в направлении от внеклеточного к внутриклеточному пространству: 4-1BB-CD27; 4-1BB-CD27; CD27-4-1BB; 4-1BB-CD28; CD28-4-1BB; OX40-CD28; CD28-OX40; CD28-4-1BB или 4-1BB-CD28. В таких вариантах осуществления внутриклеточный связывающий компонент содержит домен CD3-дзета. В одном таком варианте осуществления RCAR содержит (1) антигенсвязывающий компонент, содержащий антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и два костимулирующих домена, а также первый переключающий домен; и (2) внутриклеточный сигнальный домен, содержащий трансмембранный домен или домен прикрепления к мембране и по меньшей мере один первичный внутриклеточный сигнальный домен и второй переключающий домен.

В одном варианте осуществления представлены RCAR, где антигенсвязывающий компонент не прикреплен к поверхности CAR-клетки. Это дает возможность клетке, имеющей внутриклеточный сигнальный компонент, успешно соединяться с одним или несколькими антигенсвязывающими доменами без трансформации клетки последовательностью, которая кодирует антигенсвязывающий компонент. В таких вариантах осуществления RCAR содержит 1) внутриклеточный сигнальный компонент, содержащий первый переключающий домен, трансмембранный домен, внутриклеточный сигнальный домен, например, первичный внутриклеточный сигнальный домен, и первый переключающий домен; и 2) антигенсвязывающий компонент, содержащий антигенсвязывающий домен и второй переключающий домен, где антигенсвязывающий компонент не содержит трансмембранный домен или домен прикрепления к мембране и необязательно не содержит внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления RCAR может дополнительно содержать 3) второй антигенсвязывающий компонент, содержащий второй антигенсвязывающий домен, например, второй антигенсвязывающий домен, который связывает антиген, отличный от того, который связывается антигенсвязывающим доменом; и второй переключающий домен.

Также в данном документе предусмотрены RCAR, где антигенсвязывающий компонент обладает способностью к биспецифической активации и нацеливанию. В таком варианте осуществления антигенсвязывающий компонент может содержать множество, например, 2, 3, 4 или 5, антигенсвязывающих доменов, например, scFv, где каждый антигенсвязывающий домен связывается с антигеном-мишенью, например, с разными антигенами или одним тем же антигеном, например, с одним и тем же или разными эпитопами на одном и том же антигене. В одном варианте осуществления множество антигенсвязывающих доменов находятся в тандеме, и между каждыми двумя следующими друг за другом антигенсвязывающими доменами необязательно располагается линкер или шарнирная область. Подходящие линкеры и шарнирные области описаны в данном документе.

В одном варианте осуществления представлены RCAR, имеющие конфигурацию, которая обеспечивает переключение пролиферации. В таком варианте осуществления RCAR содержит 1) внутриклеточный сигнальный компонент, содержащий необязательно трансмембранный домен или домен прикрепления к мембране; один или несколько костимулирующих сигнальных доменов, например, выбранных из 4-1BB, CD28, CD27, ICOS и OX40, и переключающий домен; и 2) антигенсвязывающий компонент, содержащий антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и первичный внутриклеточный сигнальный домен, например, домен CD3-дзета, где антигенсвязывающий компонент не содержит переключающий домен или не содержит переключающий домен, который димеризуется с переключающим доменом во внутриклеточном сигнальном компоненте. В одном варианте осуществления антигенсвязывающий компонент не содержит костимулирующий сигнальный домен. В одном варианте осуществления внутриклеточный сигнальный компонент содержит переключающий домен из гомодимеризационного переключателя. В одном варианте осуществления внутриклеточный сигнальный компонент содержит первый переключающий домен из гетеродимеризационного переключателя, и RCAR содержит второй внутриклеточный сигнальный компонент, который содержит второй переключающий домен из гетеродимеризационного переключателя. В таких вариантах осуществления второй внутриклеточный сигнальный компонент содержит те же внутриклеточные сигнальные домены, что и внутриклеточный сигнальный компонент. В одном варианте осуществления димеризационный переключатель является внутриклеточным. В одном варианте осуществления димеризационный переключатель является внеклеточным.

В любой из конфигураций RCAR, описанных в данном документе, первый и второй переключающие домены содержат переключатель на основе FKBP-FRB, как описано в данном документе.

Также в данном документе предусмотрены клетки, содержащие RCAR, описанный в данном документе. Любая клетка, сконструированная таким образом, что она экспрессирует RCAR, может применяться в качестве RCARX-клетки. В одном варианте осуществления RCARX-клетка представляет собой T-клетку и называется RCAR-T-клеткой. В одном варианте осуществления RCARX-клетка представляет собой NK-клетку и называется RCAR-N-клеткой.

Также в данном документе предусмотрены нуклеиновые кислоты и векторы, содержащие последовательности, кодирующие RCAR. Последовательности, кодирующие различные составляющие RCAR, могут быть расположены в одной и той же молекуле нуклеиновой кислоты, например, в одних и тех же плазмиде или векторе, например, в вирусном векторе, например, лентивирусном векторе. В одном варианте осуществления (i) последовательность, кодирующая антигенсвязывающий компонент, и (ii) последовательность, кодирующая внутриклеточный сигнальный компонент, могут находиться в одной и той же нуклеиновой кислоте, например, векторе. Продуцирование соответствующих белков может быть достигнуто, например, путем применения отдельных промоторов или путем применения продукта бицистронной транскрипции (что может приводить к продуцированию двух белков путем расщепления одного продукта трансляции или путем трансляции двух отдельных белковых продуктов). В одном варианте осуществления последовательность, кодирующая расщепляемый пептид, например, последовательность P2A или F2А, располагается между (i) и (ii). В одном варианте осуществления последовательность, кодирующая IRES, например, IRES EMCV или EV71, располагается между (i) и (ii). В этих вариантах осуществления (i) и (ii) транскрибируются в виде одной РНК. В одном варианте осуществления первый промотор функционально связан с (i), и второй промотор функционально связан с (ii), так что (i) и (ii) транскрибируются в виде отдельных мРНК.

В качестве альтернативы последовательности, кодирующие различные составляющие RCAR, могут быть расположены в разных молекулах нуклеиновой кислоты, например, в разных плазмидах или векторах, например, в вирусных векторах, например, в лентивирусных векторах. Например, (i) последовательность, кодирующая антигенсвязывающий компонент, может находиться в первой нуклеиновой кислоте, например, в первом векторе, и (ii) последовательность, кодирующая внутриклеточный сигнальный компонент, может находиться во второй нуклеиновой кислоте, например, во втором векторе.

Димеризационные переключатели

Димеризационные переключатели могут быть нековалентными или ковалентными. В нековалентном димеризационном переключателе димеризующая молекула способствует нековалентному взаимодействию между переключающими доменами. В ковалентном димеризационном переключателе димеризующая молекула способствует ковалентному взаимодействию между переключающими доменами.

В одном варианте осуществления RCAR содержит димеризационный переключатель на основе FKBP/FRAP или FKBP/FRB. FKBP12 (FKBP или FK506-связывающий белок) является широко распространенным цитоплазматическим белком, который служит в качестве исходной внутриклеточной мишени для рапамицина - природного продукта, представляющего собой иммуносупрессивное лекарственное средство. Рапамицин связывается с FKBP и с большим гомологом PI3K, представляющим собой FRAP (RAFT, mTOR). FRB является частью FRAP из 93 аминокислот, которая является достаточной для связывания комплекса FKBP-рапамицин (Chen, J., Zheng, X. F., Brown, E. J. & Schreiber, S. L. (1995) Identification of an 11-kDa FKBP12-rapamycin-binding domain within the 289-kDa FKBP12-rapamycin-associated protein and characterization of a critical serine residue. Proc Natl Acad Sci U S A 92: 4947-51).

В ряде вариантов осуществления для переключателя на основе FKBP/FRAP, например, на основе FKBP/FRB, может применяться димеризующая молекула, например, рапамицин или аналог рапамицина.

Иллюстративная аминокислотная последовательность FKBP является следующей:

D V P D Y A S L G G P S S P K K K R K V S R G V Q V E T I S P G D G R T F P K R G Q T C V V H Y T G M L E D G K K F D S S R D R N K P F K F M L G K Q E V I R G W E E G V A Q M S V G Q R A K L T I S P D Y A Y G A T G H P G I I P P H A T L V F D V E L L K L E T S Y (SEQ ID NO: 275)

В ряде вариантов осуществления переключающий домен на основе FKBP может содержать фрагмент FKBP, обладающий способностью связываться с FRB или его фрагментом или аналогом в присутствии рапамицина или рапалога. В одном варианте осуществления переключающий домен на основе FKBP содержит следующую аминокислотную последовательность:

V Q V E T I S P G D G R T F P K R G Q T C V V H Y T G M L E D G K K F D S S R D R N K P F K F M L G K Q E V I R G W E E G V A Q M S V G Q R A K L T I S P D Y A Y G A T G H P G I I P P H A T L V F D V E L L K L E T S (SEQ ID NO: 276)

Аминокислотная последовательность FRB является следующей:

ILWHEMWHEG LEEASRLYFG ERNVKGMFEV LEPLHAMMER GPQTLKETSF NQAYGRDLME AQEWCRKYMK SGNVKDLTQA WDLYYHVFRR ISK (SEQ ID NO: 277)

Используемый в данном документе термин "переключатель на основе FKBP/FRAP, например, на основе FKBP/FRB" относится к димеризационному переключателю, содержащему первый переключающий домен, который содержит фрагмент FKBP или его аналог, обладающий способностью связываться с FRB или его фрагментом или аналогом в присутствии рапамицина или рапалога, например, RAD001, и характеризующийся по меньшей мере 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью с последовательностью FKBP под SEQ ID NO: 275 или 276 или отличающийся не более чем 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотным остатком от нее; и второй переключающий домен, который содержит фрагмент FKBP или его аналог, обладающий способностью связываться с FRB или его фрагментом или аналогом в присутствии рапамицина или рапалога и характеризующийся по меньшей мере 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью с последовательностью FRB под SEQ ID NO: 277 или отличающийся не более чем 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотным остатком от нее. В одном варианте осуществления RCAR, описанный в данном документе, содержит один переключающий домен, содержащий аминокислотные остатки, раскрытые под SEQ ID NO: 275 (или SEQ ID NO: 276), и один переключающий домен, содержащий аминокислотные остатки, раскрытые под SEQ ID NO: 277.

В ряде вариантов осуществления димеризационный переключатель на основе FKBP/FRB содержит модифицированный переключающий домен на основе FRB, который демонстрирует измененное, например, улучшенное, образование комплекса между переключающим доменом на основе FRB, например, модифицированным переключающим доменом на основе FRB, переключающим доменом на основе FKBP и димеризующей молекулой, например, рапамицином или рапалогом, например, RAD001. В одном варианте осуществления модифицированный переключающий домен на основе FRB содержит одну или несколько мутаций, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше, выбранных из мутаций в аминокислотных положениях L2031, E2032, S2035, R2036, F2039, G2040, T2098, W2101, D2102, Y2105 и F2108, где аминокислота дикого типа в результате мутации заменяется любой другой встречающейся в природе аминокислотой. В одном варианте осуществления мутантный FRB содержит мутацию в E2032, где E2032 в результате мутации заменяется фенилаланином (E2032F), метионином (E2032M), аргинином (E2032R), валином (E2032V), тирозином (E2032Y), изолейцином (E2032I), например, в SEQ ID NO: 278, или лейцином (E2032L), например, в SEQ ID NO: 279. В одном варианте осуществления мутантный FRB содержит мутацию в T2098, где T2098 в результате мутации заменяется фенилаланином (T2098F) или лейцином (T2098L), например, в SEQ ID NO: 280. В одном варианте осуществления мутантный FRB содержит мутацию в E2032 и в T2098, где E2032 в результате мутации заменяется любой аминокислотой, и где T2098 в результате мутации заменяется любой аминокислотой, например, в SEQ ID NO: 281. В одном варианте осуществления мутантный FRB содержит мутацию E2032I и T2098L, например, в SEQ ID NO: 282. В одном варианте осуществления мутантный FRB содержит мутацию E2032L и T2098L, например, в SEQ ID NO: 283.

Таблица 18. Иллюстративный мутантный FRB, характеризующийся повышенной аффинностью в отношении димеризующей молекулы Мутантный FRB Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: Мутантная форма E2032I ILWHEMWHEGLIEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLTQAWDLYYHVFRRISKTS 278 Мутантная форма E2032L ILWHEMWHEGLLEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLTQAWDLYYHVFRRISKTS 279 Мутантная форма T2098L ILWHEMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLLQAWDLYYHVFRRISKTS 280 Мутантная форма E2032, T2098 ILWHEMWHEGLXEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLXQAWDLYYHVFRRISKTS, wherein X is any amino acid residue 281 Мутантная форма E2032I, T2098L ILWHEMWHEGLIEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLLQAWDLYYHVFRRISKTS 282 Мутантная форма
E2032L, T2098L ILWHEMWHEGLLEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLLQAWDLYYHVFRRISKTS 283

Другие подходящие димеризационные переключатели включают димеризационный переключатель на основе GyrB-GyrB, димеризационный переключатель на основе гиббереллина, димеризационный переключатель на основе метки/связывающего средства и димеризационный переключатель на основе галогеновой метки/SNAP-метки. В соответствии с указаниями, представленными в данном документе, такие переключатели и подходящие димеризующие молекулы будут очевидны специалисту средней квалификации.

Димеризующая молекула

Ассоциации между переключающими доменами способствует димеризующая молекула. В присутствии димеризующей молекулы взаимодействие или ассоциация между переключающими доменами обеспечивает передачу сигнала между полипептидом, ассоциированным, например, слитым, с первым переключающим доменом, и полипептидом, ассоциированным, например, слитым, со вторым переключающим доменом. В присутствии неограничивающих уровней димеризующей молекулы передача сигнала усиливается в 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 5, 10, 50, 100 раз, например, при измерении в системе, описанной в данном документе.

Рапамицин и аналоги рапамицина (иногда называемые рапалогами), например, RAD001, могут применяться в качестве димеризующих молекул в димеризационном переключателе на основе FKBP/FRB, описанном в данном документе. В одном варианте осуществления димеризующая молекула может быть выбрана из рапамицина (сиролимуса), RAD001 (эверолимуса), зотаролимуса, темсиролимуса, AP-23573 (ридафоролимуса), биолимуса и AP21967. Дополнительные аналоги рапамицина, подходящие для применения с димеризационными переключателями на основе FKBP/FRB, далее описываются в разделе под названием "Виды комбинированной терапии" или в подразделе под названием "Комбинация с низкой дозой, усиливающей иммунный ответ, ингибитора mTOR".

Разделенный CAR

В некоторых вариантах осуществления в клетке, экспрессирующей CAR, используется разделенный CAR. Подход с разделенным CAR более подробно описан в публикациях WO2014/055442 и WO2014/055657, включенных в данный документ посредством ссылки. Вкратце, система разделенного CAR содержит клетку, экспрессирующую первый CAR, имеющий первый антигенсвязывающий домен и костимулирующий домен (например, 4-1BB), и эта клетка также экспрессирует второй CAR, имеющий второй антигенсвязывающий домен и внутриклеточный сигнальный домен (например, CD3-дзета). Когда клетка встречается с первым антигеном, то активируется костимулирующий домен, и клетка пролиферирует. Когда клетка встречается со вторым антигеном, то активируется внутриклеточный сигнальный домен, и запускается активность уничтожения клеток. Таким образом, клетка, экспрессирующая CAR, полностью активируется только в присутствии обоих антигенов. В ряде вариантов осуществления первый антигенсвязывающий домен распознает BCMA, например, содержит антигенсвязывающий домен, описанный в данном документе, и второй антигенсвязывающий домен распознает антиген, экспрессируемый на клетках острого миелоидного лейкоза, например, CD123, CLL-1, CD34, FLT3 или рецептор фолиевой кислоты бета. В ряде вариантов осуществления первый антигенсвязывающий домен распознает BCMA, например, содержит антигенсвязывающий домен, описанный в данном документе, и второй антигенсвязывающий домен распознает антиген, экспрессируемый на B-клетках, например, CD10, CD19, CD20, CD22, CD34, CD123, FLT-3, ROR1, CD79b, CD179b или CD79a.

Совместная экспрессия CAR с другими молекулами или средствами

Совместная экспрессия второго CAR

В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе клетка, экспрессирующая CAR, может дополнительно содержать второй CAR, например, второй CAR, который содержит другой антигенсвязывающий домен, например, для той же мишени (например, CD19) или другой мишени (например, для мишени, отличной от CD19, например, мишени, описанной в данном документе). В некоторых вариантах осуществления клетка, экспрессирующая CAR, содержит первый CAR, который нацеливается на первый антиген и содержит внутриклеточный сигнальный домен, имеющий костимулирующий сигнальный домен, но не первичный сигнальный домен, и второй CAR, который нацеливается на второй, другой, антиген и содержит внутриклеточный сигнальный домен, имеющий первичный сигнальный домен, но не костимулирующий сигнальный домен. Размещение костимулирующего сигнального домена, например, 4-1BB, CD28, CD27, OX-40 или ICOS, в первом CAR и первичного сигнального домена, например, CD3-дзета, во втором CAR может ограничивать активность CAR клетками, в которых экспрессируются обе мишени. В некоторых вариантах осуществления клетка, экспрессирующая CAR, содержит первый CAR, который содержит антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и костимулирующий домен, и второй CAR, который нацеливается на другой антиген и содержит антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и первичный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления клетка, экспрессирующая CAR, содержит первый CAR, который содержит антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и первичный сигнальный домен, и второй CAR, который нацеливается на другой антиген и содержит антигенсвязывающий домен для антигена, трансмембранный домен и костимулирующий сигнальный домен.

В некоторых вариантах осуществления клетка, экспрессирующая CAR, содержит XCAR, описанный в данном документе, и ингибирующий CAR. В некоторых вариантах осуществления ингибирующий CAR содержит антигенсвязывающий домен, который связывается с антигеном, обнаруживаемым на нормальных клетках, но не на раковых клетках, например, на нормальных клетках, которые также экспрессируют X. В некоторых вариантах осуществления ингибирующий CAR содержит антигенсвязывающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный домен ингибирующей молекулы. Например, внутриклеточный домен ингибирующего CAR может представлять собой внутриклеточный домен PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, молекулы MHC I класса, молекулы MHC II класса, GAL9, аденозина и TGF (например, TGF-бета).

В некоторых вариантах осуществления в случае, если клетка, экспрессирующая CAR, содержит два или более различных CAR, то антигенсвязывающие домены различных CAR могут быть такими, что антигенсвязывающие домены не взаимодействуют друг с другом. Например, клетка, экспрессирующая первый и второй CAR, может иметь антигенсвязывающий домен первого CAR, например, в качестве фрагмента, например, scFv, который не ассоциирует с антигенсвязывающим доменом второго CAR, например, антигенсвязывающий домен второго CAR представляет собой VHH.

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен содержит однодоменные антигенсвязывающие (SDAB) молекулы, в том числе молекулы, в которых определяющие комплементарность области являются частью однодоменного полипептида. Примеры включают без ограничения вариабельные домены тяжелых цепей, связывающие молекулы, в природных условиях лишенные легких цепей, отдельные домены, полученные из традиционных 4-цепочечных антител, сконструированные домены и однодоменные каркасные структуры, отличные от полученных из антител. Молекулы SDAB могут являться любыми молекулами, известными из уровня техники, или любыми однодоменными молекулами, которые будут известны в будущем. Молекулы SDAB могут быть получены из любых видов, в том числе без ограничения из мыши, человека, верблюда, ламы, миноги, рыбы, акулы, козы, кролика и быка. Этот термин также охватывает встречающиеся в природе молекулы однодоменных антител из видов, отличных от Camelidae и акул.

В некоторых вариантах осуществления молекула SDAB может быть получена из вариабельной области иммуноглобулина, обнаруживаемого у рыб, как, например, та, которая получена из изотипа иммуноглобулина, известного как новый антигенный рецептор (NAR), обнаруживаемого в сыворотке крови акулы. Способы получения однодоменных молекул, получаемых из вариабельной области NAR ("IgNAR"), описаны в WO 03/014161 и Streltsov (2005) Protein Sci. 14:2901-2909.

В некоторых вариантах осуществления молекула SDAB представляет собой встречающуюся в природе однодоменную антигенсвязывающую молекулу, известную как тяжелая цепь, лишенная легких цепей. Такие однодоменные молекулы раскрыты, например, в WO 9404678 и Hamers-Casterman, C. et al. (1993) Nature 363:446-448. В целях ясности этот вариабельный домен, полученный из молекулы тяжелой цепи, в природных условиях лишенной легкой цепи, именуется в данном документе как VHH или нанотело, чтобы отличать его от традиционного VH четырехцепочечных иммуноглобулинов. Такая молекула VHH может быть получена из видов Camelidae, например, из верблюда, ламы, дромадера, альпаки и гуанако. Другие виды, помимо Camelidae, могут продуцировать молекулы тяжелых цепей, в природных условиях лишенные легкой цепи; такие VHH входят в объем настоящего изобретения.

Молекулы SDAB могут быть рекомбинантными, с пересаженными CDR, гуманизированными, камелизированными, деиммунизированными и/или образованными in vitro (например, отобранными с помощью фагового дисплея).

Также было обнаружено, что в клетках, имеющих множество химерных рецепторов, встроенных в мембрану, содержащих антигенсвязывающий домен, взаимодействия между антигенсвязывающими доменами рецепторов могут быть нежелательными, например, поскольку они ингибируют способность одного или нескольких антигенсвязывающих доменов связываться с их когнатными антигенами. Соответственно, в данном документе раскрыты клетки, имеющие первый и второй не встречающиеся в природе химерные рецепторы, встроенные в мембрану, содержащие антигенсвязывающие домены, для которых сведены к минимуму такие взаимодействия. Также в данном документе раскрыты нуклеиновые кислоты, кодирующие первый и второй не встречающиеся в природе химерные рецепторы, встроенные в мембрану, содержащие антигенсвязывающие домены, для которых сведены к минимуму такие взаимодействия, а также способы получения и применения таких клеток и нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен одного из первого и второго не встречающихся в природе химерных рецепторов, встроенных в мембрану, содержит scFv, а другой содержит одиночный VH-домен, например, одиночный VH-домен верблюдовых, акулы или миноги или одиночный VH-домен, полученный из последовательности человека или мыши.

В некоторых вариантах осуществления композиция, описанная в данном документе, содержит первый и второй CAR, где антигенсвязывающий домен одного из первого и второго CAR не содержит вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен одного из первого и второго CAR представляет собой scFv, а другой не представляет собой scFv. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен одного из первого и второго CAR содержит одиночный VH-домен, например, одиночный VH-домен верблюдовых, акулы или миноги или одиночный VH-домен, полученный из последовательности человека или мыши. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен одного из первого и второго CAR содержит нанотело. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен одного из первого и второго CAR содержит VHH-домен верблюдовых.

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен одного из первого и второго CAR содержит scFv, а другой содержит одиночный VH-домен, например, одиночный VH-домен верблюдовых, акулы или миноги или одиночный VH-домен, полученный из последовательности человека или мыши. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен одного из первого и второго CAR содержит scFv, а другой содержит нанотело. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен одного из первого и второго CAR содержит scFv, а другой содержит VHH-домен верблюдовых.

В некоторых вариантах осуществления связывание антигенсвязывающего домена первого CAR, при наличии его на поверхности клетки, со своим когнатным антигеном существенно не снижается благодаря наличию второго CAR. В некоторых вариантах осуществления связывание антигенсвязывающего домена первого CAR со своим когнатным антигеном в присутствии второго CAR составляет по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, например, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, от связывания антигенсвязывающего домена первого CAR со своим когнатным антигеном в отсутствие второго CAR.

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающие домены первого и второго CAR при наличии их на поверхности клетки ассоциируют друг с другом в меньшей степени, чем в случае, если бы они оба являлись антигенсвязывающими scFv-доменами. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающие домены первого и второго CAR ассоциируют друг с другом в степени, на по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% меньшей, например, на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% меньшей, чем в случае, если бы они оба являлись антигенсвязывающими scFv-доменами.

Совместная экспрессия средства, усиливающего активность CAR

В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе клетка, экспрессирующая CAR, может дополнительно экспрессировать другое средство, например, средство, усиливающее активность или приспособленность клетки, экспрессирующей CAR.

Например, в некоторых вариантах осуществления данное средство может представлять собой средство, ингибирующее молекулу, которая модулирует или регулирует, например, ингибирует, Т-клеточную функцию. В некоторых вариантах осуществления молекула, которая модулирует или регулирует Т-клеточную функцию, представляет собой ингибирующую молекулу. Ингибирующие молекулы, например, PD1, в некоторых вариантах осуществления могут снижать способность клеток, экспрессирующих CAR, осуществлять иммунный эффекторный ответ. Примеры ингибирующих молекул включают PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, молекулу MHC I класса, молекулу MHC II класса, GAL9, аденозин или TGF-бета.

В ряде вариантов осуществления средство, например, ингибирующую нуклеиновую кислоту, например, dsRNA, например, siRNA или shRNA; или, например, ингибирующие белок или систему, например, короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами (CRISPR), эффекторную нуклеазу, подобную активаторам транскрипции (TALEN), или эндонуклеазу с "цинковыми пальцами" (ZFN), например, описанные в данном документе, можно применять для ингибирования экспрессии молекулы, которая модулирует или регулирует, например, ингибирует, Т-клеточную функцию в клетке, экспрессирующей CAR. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой shRNA, например, shRNA, описанную в данном документе. В некоторых вариантах осуществления средство, которое модулирует или регулирует, например, ингибирует, Т-клеточную функцию, ингибируется в клетке, экспрессирующей CAR. Например, молекула dsRNA, ингибирующая экспрессию молекулы, которая модулирует или регулирует, например, ингибирует, Т-клеточную функцию, связана с нуклеиновой кислотой, которая кодирует компонент, например, все компоненты, CAR.

В некоторых вариантах осуществления средство, которое ингибирует ингибирующую молекулу, содержит первый полипептид, например, ингибирующую молекулу, ассоциированный со вторым полипептидом, который обеспечивает положительный сигнал для клетки, например, внутриклеточный сигнальный домен, описанный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления средство содержит первый полипептид, например, из ингибирующей молекулы, такой как PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 или CD270), KIR, A2aR, молекула MHC I класса, молекула MHC II класса, GAL9, аденозин или TGF-бета или фрагмент любого из них (например, по меньшей мере часть внеклеточного домена любого из них), и второй полипептид, который представляет собой внутриклеточный сигнальный домен, описанный в данном документе (например, содержащий костимулирующий домен (например, 4-1BB, CD27 или CD28, например, описанные в данном документе) и/или первичный сигнальный домен (например, сигнальный домен CD3-дзета, описанный в данном документе). В некоторых вариантах осуществления средство содержит первый полипептид из PD1 или его фрагмента (например, по меньшей мере часть внеклеточного домена PD1) и второй полипептид, представляющий собой внутриклеточный сигнальный домен, описанный в данном документе (например, сигнальный домен CD28, описанный в данном документе, и/или сигнальный домен CD3-дзета, описанный в данном документе). PD1 является ингибирующим представителем семейства рецепторов CD28, которое также включает CD28, CTLA-4, ICOS и BTLA. PD-1 экспрессируется на активированных B-клетках, T-клетках и миелоидных клетках (Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75). Было показано, что два лиганда PD1 - PD-L1 и PD-L2 - подавляют активацию Т-клеток при связывании с PD1 (Freeman et al. 2000 J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43). PD-L1 является широко распространенным при различных формах рака у человека (Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7; Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094). Иммуносупрессию можно устранить путем ингибирования локального взаимодействия PD1 с PD-L1.

В некоторых вариантах осуществления средство, содержащее внеклеточный домен (ECD) ингибирующей молекулы, например, белка 1 запрограммированной гибели клеток (PD1), может быть слито с трансмембранным доменом и внутриклеточными сигнальными доменами, такими как 4-1BB и CD3-дзета (также называется в данном документе CAR на основе PD1). В некоторых вариантах осуществления CAR на основе PD1 при применении в комбинациях с XCAR, описанным в данном документе, улучшает персистенцию Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления CAR представляет собой CAR на основе PD1, содержащий внеклеточный домен PD1, указанный подчеркиванием в SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления CAR на основе PD1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 24.

В некоторых вариантах осуществления CAR на основе PD1 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 22.

В некоторых вариантах осуществления средство содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR на основе PD1, например, CAR на основе PD1, описанный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты для CAR на основе PD1 представлена под SEQ ID NO: 23, при этом ECD PD1 подчеркнут.

В другом примере в некоторых вариантах осуществления средство, которое усиливает активность клетки, экспрессирующей CAR, может представлять собой костимулирующую молекулу или лиганд костимулирующей молекулы. Примеры костимулирующих молекул включают молекулу MHC I класса, BTLA и лиганд Toll-подобного рецептора, а также OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278) и 4-1BB (CD137). Дополнительные примеры таких костимулирующих молекул включают CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, CD4, CD8-альфа, CD8-бета, IL2R-бета, IL2R-гамма, IL7R-альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a и лиганд, который специфично связывается с CD83, например, описанные в данном документе. Примеры лигандов костимулирующих молекул включают CD80, CD86, CD40L, ICOSL, CD70, OX40L, 4-1BBL, GITRL и LIGHT. В ряде вариантов осуществления лиганд костимулирующей молекулы является лигандом костимулирующей молекулы, отличной от костимулирующей молекулы, домен которой используется в CAR. В ряде вариантов осуществления лиганд костимулирующей молекулы является лигандом той же костимулирующей молекулы, что и костимулирующая молекула, домен которой используется в CAR. В некоторых вариантах осуществления лиганд костимулирующей молекулы представляет собой 4-1BBL. В одном варианте осуществления лиганд костимулирующей молекулы представляет собой CD80 или CD86. В некоторых вариантах осуществления лиганд костимулирующей молекулы представляет собой CD70. В ряде вариантов осуществления описанная в данном документе иммунная эффекторная клетка, экспрессирующая CAR, может быть дополнительно сконструирована таким образом, чтобы она экспрессировала одну или несколько дополнительных костимулирующих молекул или лигандов костимулирующих молекул.

Совместная экспрессия CAR с рецептором хемокина

В ряде вариантов осуществления описанная в данном документе клетка, экспрессирующая CAR, например, клетка, экспрессирующая CAR для CD19, дополнительно содержит молекулу рецептора хемокина. Трансгенная экспрессия рецепторов хемокинов CCR2b или CXCR2 в Т-клетках усиливает их миграцию к солидным опухолям, секретирующим CCL2 или CXCL1, в том числе к меланоме и нейробластоме (Craddock et al., J Immunother. 2010 Oct; 33(8):780-8 и Kershaw et al., Hum Gene Ther. 2002 Nov 1; 13(16):1971-80). Таким образом, не ограничиваясь какой-либо теорией, полагают, что рецепторы хемокинов, экспрессируемые в клетках, экспрессирующих CAR, которые распознают хемокины, секретируемые опухолями, например, солидными опухолями, могут улучшать "хоминг" клетки, экспрессирующей CAR, в опухоль, содействовать инфильтрации клетки, экспрессирующей CAR, в опухоль и усиливать противоопухолевую эффективность клетки, экспрессирующей CAR. Молекула рецептора хемокина может содержать встречающийся в природе или рекомбинантный рецептор хемокина или его хемокинсвязывающий фрагмент. Молекула рецептора хемокина, подходящая для экспрессии в клетке, экспрессирующей CAR (например, CAR-Tx), описанной в данном документе, включает рецептор хемокина CXC (например, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6 или CXCR7), рецептор хемокина CC (например, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10 или CCR11), рецептор хемокина CX3C (например, CX3CR1), рецептор хемокина XC (например, XCR1) или их хемокинсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления молекулу рецептора хемокина, которая должна экспрессироваться вместе с CAR, описанным в данном документе, выбирают с учетом хемокина(хемокинов), секретируемых опухолью. В некоторых вариантах осуществления описанная в данном документе клетка, экспрессирующая CAR, дополнительно содержит, например, экспрессирует, рецептор CCR2b или рецептор CXCR2. В некоторых вариантах осуществления CAR, описанный в данном документе, и молекула рецептора хемокина находятся в одном и том же векторе или находятся в двух разных векторах. В ряде вариантов осуществления, в которых CAR, описанный в данном документе, и молекула рецептора хемокина находятся в одном и том же векторе, CAR и молекула рецептора хемокина находятся под контролем двух разных промоторов или находятся под контролем одного и того же промотора.

Конструкции нуклеиновых кислот, кодирующие CAR

В настоящем изобретении также предусмотрена иммунная эффекторная клетка, например, полученная посредством способа, описанного в данном документе, которая содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую одну или несколько конструкций CAR, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты представлена в виде транскрипта, представляющего собой матричную РНК. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты представлена в виде ДНК-конструкции.

Молекулы нуклеиновой кислоты, описанные в данном документе, могут представлять собой молекулу ДНК, молекулу РНК или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты представляет собой мРНК, кодирующую полипептид CAR, описанный в данном документе. В других вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты представляет собой вектор, который содержит любую из вышеуказанных молекул нуклеиновой кислоты.

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен CAR по настоящему изобретению (например, scFv) кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, последовательность которой была кодон-оптимизирована для экспрессии в клетке млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления целая конструкция CAR по настоящему изобретению кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, целая последовательность которой была кодон-оптимизирована для экспрессии в клетке млекопитающего. Оптимизация кодонов относится к обнаружению того, что частота встречаемости синонимичных кодонов (т. е. кодонов, кодирующих одну и ту же аминокислоту) в кодирующей ДНК смещена у разных видов. Такая вырожденность кодонов обеспечивает возможность кодирования идентичного полипептида различными нуклеотидными последовательностями. Из уровня техники известны различные способы оптимизации кодонов, и они включают, например, способы, раскрытые по меньшей мере в патентах США №№ 5786464 и 6114148.

Соответственно, в некоторых вариантах осуществления иммунная эффекторная клетка, например, полученная посредством способа, описанного в данном документе, содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую химерный антигенный рецептор (CAR), где CAR содержит антигенсвязывающий домен, который связывается с опухолевым антигеном, описанным в данном документе, трансмембранный домен (например, трансмембранный домен, описанный в данном документе) и внутриклеточный сигнальный домен (например, внутриклеточный сигнальный домен, описанный в данном документе), содержащий стимулирующий домен, например, костимулирующий сигнальный домен (например, костимулирующий сигнальный домен, описанный в данном документе), и/или первичный сигнальный домен (например, первичный сигнальный домен, описанный в данном документе, например, дзета-цепь, описанную в данном документе).

В настоящем изобретении также предусмотрены векторы, в которые вставлена молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая CAR, например, молекула нуклеиновой кислоты, описанная в данном документе. Векторы, полученные из ретровирусов, таких как лентивирус, являются подходящими инструментами для достижения долгосрочного переноса генов, поскольку они обеспечивают долгосрочную стабильную интеграцию трансгена и его размножение в дочерних клетках. Лентивирусные векторы обладают дополнительным преимуществом по сравнению с векторами, полученными из онкоретровирусов, таких как вирусы лейкоза мышей, заключающимся в том, что ими можно трансдуцировать непролиферирующие клетки, такие как гепатоциты. Они также обладают дополнительным преимуществом низкой иммуногенности. Ретровирусный вектор также может представлять собой, например, гамма-ретровирусный вектор. Гамма-ретровирусный вектор может содержать, например, промотор, сигнал упаковки (ψ), сайт связывания праймера (PBS), один или несколько (например, два) длинных концевых повторов (LTR) и трансген, представляющий интерес, например, ген, кодирующий CAR. В гамма-ретровирусном векторе могут отсутствовать структурные гены вирусов, такие как gag, pol и env. Иллюстративные гамма-ретровирусные векторы включают вирус лейкоза мышей (MLV), вирус некроза селезенки (SFFV) и вирус миелопролиферативной саркомы (MPSV), а также векторы, полученные из них. Другие гамма-ретровирусные векторы описаны, например, в Tobias Maetzig et al., "Gammaretroviral Vectors: Biology, Technology and Application" Viruses. 2011 Jun; 3(6): 677-713.

В некоторых вариантах осуществления вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую требуемый CAR, представляет собой аденовирусный вектор (A5/35). В некоторых вариантах осуществления экспрессии нуклеиновых кислот, кодирующих CAR, можно достичь с помощью транспозонов, таких как "спящая красавица", CRISPR, CAS9 и нуклеазы с "цинковыми пальцами". См. ниже June et al. 2009, Nature Reviews Immunology 9.10: 704-716, включенную в данный документ посредством ссылки.

Вкратце, экспрессия природных или синтетических нуклеиновых кислот, кодирующих CAR, как правило, достигается путем образования функциональной связи нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид CAR или его части, с промотором и включения конструкции в состав экспрессионного вектора. Векторы могут подходить для репликации и интеграции у эукариот. Типичные клонирующие векторы содержат терминаторы транскрипции и трансляции, последовательности инициации и промоторы, применимые для регуляции экспрессии необходимой последовательности нуклеиновой кислоты.

Нуклеиновую кислоту можно клонировать в векторы множества типов. Например, нуклеиновую кислоту можно клонировать в вектор, включающий без ограничения плазмиду, фагмиду, производное фага, вирус животных и космиду. Векторы, представляющие особый интерес, включают экспрессионные векторы, репликационные векторы, векторы для образования зондов и векторы для секвенирования.

Кроме того, экспрессионный вектор может предоставляться клетке в форме вирусного вектора. Технология вирусных векторов хорошо известна из уровня техники и описана, например, в Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, тома 1-4, Cold Spring Harbor Press, Нью-Йорк, и в других руководствах по вирусологии и молекулярной биологии. Вирусы, применимые в качестве векторов, включают без ограничения ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, герпесвирусы и лентивирусы. Как правило, подходящий вектор содержит точку начала репликации, функционирующую в по меньшей мере одном организме, промоторную последовательность, подходящие сайты для эндонуклеаз рестрикции и один или несколько селектируемых маркеров (например, из WO 01/96584; WO 01/29058 и патента США № 6326193).

Для переноса генов в клетки млекопитающих был разработан целый ряд систем на основе вирусов. Например, ретровирусы обеспечивают удобную платформу для систем доставки генов. Выбранный ген можно вставить в вектор и упаковать в ретровирусные частицы с помощью методик, известных из уровня техники. Затем рекомбинантный вирус можно выделить и доставить в клетки субъекта in vivo либо ex vivo. Из уровня техники известен целый ряд ретровирусных систем. В некоторых вариантах осуществления применяются аденовирусные векторы. Из уровня техники известен целый ряд аденовирусных векторов. В некоторых вариантах осуществления применяются лентивирусные векторы.

Дополнительные промоторные элементы, например, энхансеры, регулируют частоту инициации транскрипции. Как правило, они расположены в области на 30-110 п. о. выше сайта начала транскрипции, хотя было показано, что ряд промоторов также содержит функциональные элементы ниже сайта начала транскрипции. Расстояние между промоторными элементами часто является гибким, так что промоторная функция сохраняется при инверсии элементов или их перемещении друг относительно друга. В промоторе гена тимидинкиназы (tk) расстояние между промоторными элементами можно увеличить до 50 п. о., прежде чем активность начнет снижаться. В зависимости от промотора оказывается, что отдельные элементы могут функционировать для активации транскрипции совместно либо независимо. Иллюстративные промоторы включают промоторы генов IE CMV, EF-1α, убиквитина С или фосфоглицераткиназы (PGK).

Примером промотора, который способен обеспечивать экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, в Т-клетке млекопитающего, является промотор EF1a. Нативный промотор EF1a управляет экспрессией альфа-субъединицы комплекса фактора элонгации-1, который отвечает за ферментативную доставку аминоацил-тРНК к рибосоме. Промотор EF1a широко использовался в экспрессионных плазмидах для млекопитающих, и было показано, что он эффективно управляет экспрессией CAR с молекул нуклеиновой кислоты, клонированных в лентивирусный вектор. См., например, Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009). В некоторых вариантах осуществления промотор EF1a содержит последовательность, представленную в примерах.

Другим примером промотора является последовательность немедленно-раннего промотора цитомегаловируса (CMV). Эта промоторная последовательность является последовательностью сильного конститутивного промотора, способного управлять экспрессией любой полинуклеотидной последовательности, функционально связанной с ней, на высоких уровнях. Однако можно также использовать последовательности других конститутивных промоторов, в том числе без ограничения раннего промотора вируса обезьян 40 (SV40), промотора вируса опухоли молочной железы мышей (MMTV), промотора длинного концевого повтора (LTR) вируса иммунодефицита человека (HIV), промотора MoMuLV, промотора вируса лейкоза птиц, немедленно-раннего промотора вируса Эпштейна-Барр, промотора вируса саркомы Рауса, а также промоторы генов человека, такие как, без ограничения, промотор гена актина, промотор гена миозина, промотор гена фактора элонгации-1α, промотор гена гемоглобина и промотор гена креатинкиназы. Кроме того, настоящее изобретение не должно ограничиваться использованием конститутивных промоторов. Индуцируемые промоторы также рассматриваются как часть настоящего изобретения. Использование индуцируемого промотора обеспечивает наличие молекулярного переключателя, способного включать экспрессию полинуклеотидной последовательности, с которой он функционально связан, если такая экспрессия требуется, или отключать экспрессию, если экспрессия не требуется. Примеры индуцируемых промоторов включают без ограничения металлотионеин-индуцируемый промотор, глюкокортикоид-индуцируемый промотор, прогестерон-индуцируемый промотор и тетрациклин-индуцируемый промотор.

Другим примером промотора является промотор гена фосфоглицераткиназы (PGK). В ряде вариантов осуществления может быть необходим усеченный промотор гена PGK (например, промотор гена PGK с одной или несколькими, например, 1, 2, 5, 10, 100, 200, 300 или 400, делециями нуклеотидов по сравнению с последовательностью промотора гена PGK дикого типа).

Нуклеотидные последовательности иллюстративных промоторов гена PGK представлены ниже.

Промотор гена PGK WT:

ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCGCGGCGACGCAAAGGGCCTTGGTGCGGGTCTCGTCGGCGCAGGGACGCGTTTGGGTCCCGACGGAACCTTTTCCGCGTTGGGGTTGGGGCACCATAAGCT (SEQ ID NO: 190)

Иллюстративные усеченные промоторы гена PGK:

PGK100:

ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTG (SEQ ID NO: 198)

PGK200:

ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACG (SEQ ID NO: 191)

PGK300:

ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCG (SEQ ID NO: 192)

PGK400:

ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCG (SEQ ID NO: 193)

Вектор также может содержать, например, сигнальную последовательность, содействующую секреции, сигнал полиаденилирования и терминатор транскрипции (например, из гена бычьего гормона роста (BGH)), элемент, обеспечивающий возможность эписомальной репликации и репликации у прокариот (например, точку начала репликации SV40 и ColE1 или другие, известные из уровня техники), и/или элементы для обеспечения возможности осуществления отбора (например, ген устойчивости к ампициллину и/или маркер устойчивости к зеоцину).

Для оценки экспрессии полипептида CAR или его частей экспрессионный вектор, который должен быть введен в клетку, также может содержать селектируемый маркерный ген или репортерный ген либо их оба для облегчения идентификации и отбора экспрессирующих клеток из популяции клеток, в отношении которых стремились провести трансфекцию или инфицирование посредством вирусных векторов. В некоторых вариантах осуществления селектируемый маркер может переноситься на отдельном фрагменте ДНК и использоваться в процедуре котрансфекции. Как селектируемые маркеры, так и репортерные гены могут быть фланкированы соответствующими регуляторными последовательностями для обеспечения экспрессии в клетках-хозяевах. Применимые селектируемые маркеры включают, например, гены устойчивости к антибиотикам, такие как neo и т. п.

Репортерные гены используют для идентификации потенциально трансфицированных клеток и для оценивания функциональных свойств регуляторных последовательностей. Как правило, репортерный ген представляет собой ген, который отсутствует или не экспрессируется в организме- или ткани-реципиенте и который кодирует полипептид, экспрессия которого проявляется в некотором легко выявляемом свойстве, например, ферментативной активности. Экспрессию репортерного гена анализируют в подходящее время после введения ДНК в клетки-реципиенты. Подходящие репортерные гены могут включать гены, кодирующие люциферазу, бета-галактозидазу, хлорамфениколацетилтрансферазу, секретируемую щелочную фосфатазу, или ген зеленого флуоресцентного белка (например, Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82). Подходящие системы экспрессии хорошо известны и могут быть получены с помощью известных методик или приобретены коммерческим путем. Как правило, конструкцию с минимальной 5'-фланкирующей областью, демонстрирующую наивысший уровень экспрессии репортерного гена, идентифицируют как промотор. Такие промоторные области могут быть связаны с репортерным геном и использоваться для оценивания средств в отношении способности к модулированию транскрипции, управляемой промотором.

В ряде вариантов осуществления вектор может содержать две или более последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие CAR, например, CAR, описанный в данном документе, например, CAR для CD19, и второй CAR, например, ингибирующий CAR или CAR, который специфично связывается с антигеном, отличным от CD19. В таких вариантах осуществления две или более последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие CAR, кодируются одной молекулой нуклеиновой кислоты в одной и той же рамке считывания и в виде одной полипептидной цепи. В некоторых вариантах осуществления два или более CAR могут, например, быть разделены одним или несколькими сайтами расщепления пептидов (например, сайтом саморасщепления или субстратом для внутриклеточной протеазы). Примеры сайтов расщепления пептидов включают сайты T2A, P2A, E2A или F2A.

Способы введения генов в клетку и обеспечения их экспрессии в ней известны из уровня техники. Что касается экспрессионного вектора, то вектор можно легко ввести в клетку-хозяина, например, клетку млекопитающего, бактерии, дрожжей или насекомого, любым способом, например, способом, известным из уровня техники. Например, экспрессионный вектор можно перенести в клетку-хозяина физическим, химическим или биологическим способом.

Физические способы введения полинуклеотида в клетку-хозяина включают осаждение фосфатом кальция, липофекцию, бомбардировку частицами, микроинъекцию, электропорацию и т. п. Способы получения клеток, содержащих векторы и/или экзогенные нуклеиновые кислоты, хорошо известны из уровня техники. См., например, Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, тома 1-4, Cold Spring Harbor Press, Нью-Йорк. Подходящим способом введения полинуклеотида в клетку-хозяина является трансфекция с использованием фосфата кальция.

Биологические способы введения полинуклеотида, представляющего интерес, в клетку-хозяина включают использование векторов на основе ДНК и РНК. Вирусные векторы, и особенно ретровирусные векторы, стали наиболее широко применяемым способом вставки генов в клетки млекопитающего, например, человека. Другие вирусные векторы могут быть получены из лентивируса, поксвирусов, вируса простого герпеса I типа, аденовирусов и аденоассоциированных вирусов и т. п. См., например, патенты США №№ 5350674 и 5585362.

Химические средства для введения полинуклеотида в клетку-хозяина включают коллоидные дисперсные системы, такие как макромолекулярные комплексы, нанокапсулы, микросферы, гранулы и липидные системы, в том числе эмульсии типа "масло в воде", мицеллы, смешанные мицеллы и липосомы. Иллюстративной коллоидной системой для применения в качестве средства для доставки in vitro и in vivo является липосома (например, искусственная мембранная везикула). Из уровня техники доступны другие способы целенаправленной доставки нуклеиновых кислот, такие как доставка полинуклеотидов с помощью нацеливающихся наночастиц или другой подходящей системы доставки субмикронного размера.

В случае использования системы доставки, отличной от вирусной, иллюстративным средством для доставки является липосома. Для введения нуклеиновых кислот в клетку-хозяина (in vitro, ex vivo или in vivo) предполагается применение липидных составов. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота может быть ассоциирована с липидом. Нуклеиновая кислота, ассоциированная с липидом, может быть инкапсулированной в водной внутренней части липосомы, помещенной в липидный бислой липосомы, присоединенной к липосоме посредством связывающей молекулы, которая ассоциирована как с липосомой, так и с олигонуклеотидом, захваченной в липосому, образовывать комплекс с липосомой, быть диспергированной в растворе, содержащем липид, смешанной с липидом, объединенной с липидом, содержаться в виде суспензии в липиде, содержаться в мицелле или образовывать комплекс с ней или иным образом быть ассоциированной с липидом. Композиции для ассоциации на основе липидов, липидов/ДНК или липидов/экспрессионного вектора не ограничиваются какой-либо конкретной структурой в растворе. Например, они могут присутствовать в бислойной структуре, в виде мицелл или в "сжатой" структуре. Они также могут быть просто помещены в раствор, при этом по возможности образуют агрегаты, которые не являются однородными по размеру или форме. Липиды представляют собой жирные вещества, которые могут являться встречающимися в природе или синтетическими липидами. Например, липиды включают жировые капли, которые встречаются в природе в цитоплазме, а также класс соединений, который содержит длинноцепочечные алифатические углеводороды и их производные, такие как жирные кислоты, спирты, амины, аминоспирты и альдегиды.

Подходящие для применения липиды можно получить из коммерческих источников. Например, димиристилфосфатидилхолин ("DMPC") можно получить от Sigma, Сент-Луис, Миссури; дицетилфосфат ("DCP") можно получить от K & K Laboratories (Плейнвью, Нью-Йорк); холестерин ("Choi") можно получить от Calbiochem-Behring; димиристилфосфатидилглицерин ("DMPG") и другие липиды можно получить от Avanti Polar Lipids, Inc. (Бирмингем, Алабама). Исходные растворы липидов в хлороформе или хлороформе/метаноле можно хранить при температуре приблизительно -20°C. Хлороформ используется в качестве единственного растворителя, поскольку он испаряется легче, чем метанол. "Липосома" является общим термином, охватывающим различные одно- и мультиламеллярные липидные носители, образованные путем формирования замкнутых липидных бислоев или агрегатов. Липосомы можно охарактеризовать как имеющие везикулярные структуры с фосфолипидной бислойной мембраной и внутренней водной средой. Мультиламеллярные липосомы имеют несколько липидных слоев, разделенных водной средой. Они образуются самопроизвольно при суспендировании фосфолипидов в избытке водного раствора. Липидные компоненты подвергаются самореорганизации перед образованием замкнутых структур и захватывают воду и растворенные вещества между липидными бислоями (Ghosh et al., 1991, Glycobiology 5: 505-10). Однако также охватываются композиции, которые в растворе имеют структуры, отличные от нормальной везикулярной структуры. Например, липиды могут принимать вид мицеллярной структуры или просто существовать в виде неоднородных агрегатов липидных молекул. Также предполагаются комплексы липофектамин-нуклеиновая кислота.

Чтобы подтвердить присутствие последовательности рекомбинантной нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине, можно проводить различные анализы, независимо от способа, применяемого для введения экзогенных нуклеиновых кислот в клетку-хозяина, или иного воздействия ингибитора по настоящему изобретению на клетку. Такие анализы включают, например, "молекулярно-биологические" анализы, хорошо известные специалистам в данной области, такие как саузерн- и нозерн-блоттинг, ОТ-ПЦР и ПЦР; "биохимические" анализы, такие как выявление присутствия или отсутствия конкретного пептида, например, с помощью иммунологических способов (ELISA и вестерн-блоттинга) или с помощью описанных в данном документе анализов, для идентификации средств, находящихся в пределах объема настоящего изобретения.

Трансфекция РНК

В данном документе раскрыты способы получения РНК, транскрибированной in vitro, кодирующей CAR. РНК, кодирующая CAR, и способы ее применения описаны, например, в абзацах 553-570 международной заявки WO2015/142675, поданной 13 марта 2015 года, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Иммунная эффектoрная клетка может содержать CAR, кодируемый матричной РНК (мРНК). В некоторых вариантах осуществления мРНК, кодирующую CAR, описанную в данном документе, вводят в иммунную эффекторную клетку, например, полученную посредством способа, описанного в данном документе, для получения клетки, экспрессирующей CAR.

В некоторых вариантах осуществления РНК, транскрибированную in vitro, кодирующую CAR, можно вводить в клетку в форме транзиентной трансфекции. РНК получают путем транскрипции in vitro с использованием матрицы, полученной посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР). ДНК, представляющая интерес, из любого источника может быть непосредственно преобразована с помощью ПЦР в матрицу для синтеза мРНК in vitro с использованием соответствующих праймеров и РНК-полимеразы. Источником ДНК может быть, например, геномная ДНК, плазмидная ДНК, фаговая ДНК, кДНК, синтетическая последовательность ДНК или любой другой подходящий источник ДНК. Требуемая матрица для транскрипции in vitro представляет собой CAR, описанный в данном документе. Например, матрица для РНК, кодирующей CAR, содержит внеклеточную область, содержащую одноцепочечный вариабельный домен антитела к опухолеассоциированному антигену, описанный в данном документе; шарнирную область (например, шарнирную область, описанную в данном документе), трансмембранный домен (например, трансмембранный домен, описанный в данном документе, такой как трансмембранный домен CD8a) и цитоплазматическую область, которая содержит внутриклеточный сигнальный домен, например, внутриклеточный сигнальный домен, описанный в данном документе, например, содержащий сигнальный домен CD3-дзета и сигнальный домен 4-1BB.

В некоторых вариантах осуществления ДНК, подлежащая применению в ПЦР, содержит открытую рамку считывания. ДНК может быть получена из встречающейся в природе последовательности ДНК из генома организма. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота может содержать некоторые или все из 5'- и/или 3'-нетранслируемых областей (UTR). Нуклеиновая кислота может содержать экзоны и интроны. В некоторых вариантах осуществления ДНК, подлежащая применению в ПЦР, представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты человека. В некоторых вариантах осуществления ДНК, подлежащая применению в ПЦР, представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты человека, содержащую 5'- и 3'-UTR. В качестве альтернативы ДНК может представлять собой искусственную последовательность ДНК, которая обычно не экспрессируется у встречающегося в природе организма. Иллюстративная искусственная последовательность ДНК представляет собой последовательность, которая содержит части генов, лигированные друг с другом с образованием открытой рамки считывания, которая кодирует слитый белок. Части ДНК, лигированные друг с другом, могут быть получены из одного организма или из более чем одного организма.

ПЦР применяют для получения матрицы, предназначенной для транскрипции in vitro мРНК, которая применяется для трансфекции. Способы осуществления ПЦР хорошо известны из уровня техники. Праймеры для применения в ПЦР разрабатывают таким образом, чтобы они имели области, по существу комплементарные областям ДНК, подлежащей применению в качестве матрицы для ПЦР. Используемый в данном документе термин "по существу комплементарные" относится к последовательностям нуклеотидов, где большинство или все основания в последовательности праймера являются комплементарными, или одно или несколько оснований являются некомплементарными или несовпадающими. По существу комплементарные последовательности способны отжигаться или гибридизироваться с предполагаемой ДНК-мишенью в условиях отжига, используемых для ПЦР. Праймеры можно разрабатывать таким образом, чтобы они были по существу комплементарными любой части ДНК-матрицы. Например, праймеры можно разрабатывать таким образом, чтобы обеспечить амплификацию части нуклеиновой кислоты, которая обычно транскрибируется в клетках (открытой рамки считывания), включающей 5'- и 3'-UTR. Праймеры также можно разрабатывать таким образом, чтобы обеспечить амплификацию части нуклеиновой кислоты, которая кодирует конкретный домен, представляющий интерес. В некоторых вариантах осуществления праймеры разработаны таким образом, что они обеспечивают амплификацию кодирующей области кДНК человека, в том числе 5'- и 3'-UTR целиком или их частей. Праймеры, применимые для ПЦР, могут быть получены посредством способов синтеза, которые хорошо известны из уровня техники. "Прямые праймеры" представляют собой праймеры, которые содержат область из нуклеотидов, по существу комплементарных нуклеотидам в ДНК-матрице, которые расположены выше последовательности ДНК, подлежащей амплификации. "Вышерасположенный" используется в данном документе для обозначения местоположения в 5'-направлении от последовательности ДНК, подлежащей амплификации, относительно кодирующей нити. "Обратные праймеры" представляют собой праймеры, которые содержат области из нуклеотидов, по существу комплементарных нуклеотидам в двухнитевой ДНК-матрице, которые расположены ниже последовательности ДНК, подлежащей амплификации. "Нижерасположенный" используется в данном документе для обозначения местоположения в 3'-направлении от последовательности ДНК, подлежащей амплификации, относительно кодирующей нити.

В способах, раскрытых в данном документе, может применяться любая ДНК-полимераза, применимая для ПЦР. Реагенты и полимераза являются коммерчески доступными из ряда источников.

Также можно использовать химические структуры, которые могут способствовать стабильности и/или эффективности трансляции. РНК в ряде вариантов осуществления содержит 5'- и 3'-UTR. В некоторых вариантах осуществления длина 5'-UTR составляет от одного до 3000 нуклеотидов. Длину последовательностей 5'- и 3'-UTR, которые подлежат добавлению к кодирующей области, можно изменять с помощью различных способов, включая без ограничения разработку праймеров для ПЦР, которые отжигаются с различными областями UTR. Используя данный подход, специалист средней квалификации в данной области может модифицировать длину 5'- и 3'-UTR, необходимую для достижения оптимальной эффективности трансляции после трансфекции транскрибированной РНК.

5'- и 3'-UTR могут представлять собой встречающиеся в природе эндогенные 5'- и 3'-UTR для нуклеиновой кислоты, представляющей интерес. В качестве альтернативы последовательности UTR, которые не являются эндогенными для нуклеиновой кислоты, представляющей интерес, могут быть добавлены путем включения последовательностей UTR в состав прямого и обратного праймеров или с помощью любых других модификаций матрицы. Использование последовательностей UTR, которые не являются эндогенными для нуклеиновой кислоты, представляющей интерес, может быть применимым для модификации стабильности и/или эффективности трансляции РНК. Например, известно, что AU-богатые элементы в последовательностях 3'-UTR могут уменьшать стабильность мРНК. Следовательно, 3'-UTR могут быть выбраны или разработаны таким образом, чтобы они увеличивали стабильность транскрибированной РНК, исходя из свойств UTR, которые хорошо известны из уровня техники.

В некоторых вариантах осуществления 5'-UTR может содержать последовательность Козак из эндогенной нуклеиновой кислоты В качестве альтернативы, если 5'-UTR, которая не является эндогенной для нуклеиновой кислоты, представляющей интерес, добавляют с помощью ПЦР, как описано выше, консенсусная последовательность Козак может быть видоизменена путем добавления последовательности 5'-UTR. Последовательности Козак могут увеличивать эффективность трансляции некоторых РНК-транскриптов, но, по-видимому, они не являются необходимыми для обеспечения эффективной трансляции всех РНК. Требование наличия последовательностей Козак для многих мРНК известно из уровня техники. В других вариантах осуществления 5'-UTR может представлять собой 5'-UTR из РНК-содержащего вируса, РНК-геном которого является стабильным в клетках. В других вариантах осуществления можно использовать различные аналоги нуклеотидов в 3'- или 5'-UTR, чтобы воспрепятствовать разрушению мРНК под действием экзонуклеаз.

Для обеспечения синтеза РНК с ДНК-матрицы без необходимости клонирования гена промотор транскрипции должен быть присоединен к ДНК-матрице выше последовательности, подлежащей транскрипции. Если последовательность, которая функционирует в качестве промотора для РНК-полимеразы, добавляют к 5'-концу прямого праймера, то промотор для РНК-полимеразы включается в состав продукта ПЦР выше открытой рамки считывания, которая подлежит транскрипции. В некоторых вариантах осуществления промотор представляет собой промотор для полимеразы Т7, как описано в другом разделе в данном документе. Другие применимые промоторы включают без ограничения промоторы для РНК-полимераз Т3 и SP6. Консенсусные нуклеотидные последовательности для промоторов T7, T3 и SP6 известны из уровня техники.

В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит как кэп на 5'-конце, так и 3'-поли(А)-хвост, которые определяют связывание с рибосомой, инициацию трансляции и стабильность мРНК в клетке. На кольцевой ДНК-матрице, например, плазмидной ДНК, РНК-полимераза продуцирует длинный конкатемерный продукт, который не подходит для экспрессии в эукариотических клетках. Транскрипция плазмидной ДНК, линеаризованной на конце 3'-UTR, приводит к образованию мРНК нормального размера, которая не является эффективной для трансфекции у эукариот даже в случае ее полиаденилирования после транскрипции.

На линейной ДНК-матрице РНК-полимераза фага Т7 может удлинять 3'-конец транскрипта за пределы последнего основания матрицы (Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985); Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003).

Традиционный способ интеграции отрезков поли(А)/(Т) в ДНК-матрицу представляет собой молекулярное клонирование. Однако последовательность поли(А)/(Т), интегрированная в плазмидную ДНК, может обуславливать нестабильность плазмиды, вследствие чего плазмидные ДНК-матрицы, полученные из бактериальных клеток, зачастую сильно засорены делециями и другими аберрациями. Это приводит к тому, что процедуры клонирования являются не только трудоемкими и времязатратными, но зачастую и ненадежными. Поэтому существует большая потребность в способе, который позволяет конструировать ДНК-матрицы с отрезками поли(А)/(Т) на 3'-конце без клонирования.

Сегмент поли(A)/(T) в транскрипционной ДНК-матрице можно получить в ходе ПЦР с применением обратного праймера, содержащего поли(T)-хвост, такой как хвост из 100 T (SEQ ID NO: 31) (размер может составлять 50-5000 T (SEQ ID NO: 32)) или после ПЦР с помощью любого другого способа, в том числе без ограничения лигирования или рекомбинации ДНК in vitro. Поли(А)-хвосты также обеспечивают стабильность РНК и уменьшают их разрушение. Как правило, длина поли(А)-хвоста положительно коррелирует со стабильностью транскрибированной РНК. В некоторых вариантах осуществления длина поли(А)-хвоста составляет от 100 до 5000 аденозиновых остатков (например, SEQ ID NO: 33).

Поли(А)-хвосты РНК могут быть дополнительно удлинены после транскрипции in vitro путем использования поли(А)-полимеразы, такой как поли(А)-полимераза Е. coli (E-PAP). В некоторых вариантах осуществления увеличение длины поли(А)-хвоста от 100 нуклеотидов до 300-400 нуклеотидов (SEQ ID NO: 34) дает в результате приблизительно двукратное увеличение эффективности трансляции РНК. Кроме того, присоединение различных химических групп к 3'-концу может увеличивать стабильность мРНК. Такое присоединение может включать присоединение модифицированных/искусственных нуклеотидов, аптамеров и других соединений. Например, в состав поли(А)-хвоста с помощью поли(А)-полимеразы могут быть включены аналоги ATP. Аналоги ATP могут дополнительно увеличивать стабильность РНК.

5'-кэп-структуры также обеспечивают стабильность молекул РНК. В некоторых вариантах осуществления РНК, полученные посредством способов, раскрытых в данном документе, содержат 5'-кэп. Наличие 5'-кэпа обеспечивают с помощью методик, известных из уровня техники и описанных в данном документе (Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001); Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001); Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)).

РНК, полученные посредством способов, раскрытых в данном документе, также могут содержать последовательность участка внутренней посадки рибосомы (IRES). Последовательность IRES может быть любой вирусной, хромосомной или искусственно разработанной последовательностью, которая инициирует кэп-независимое связывание рибосомы с мРНК и содействует инициации трансляции. Могут быть включены любые растворенные вещества, подходящие для электропорации клеток, которые могут включать факторы, содействующие проникновению в клетку и жизнеспособности клеток, такие как сахара, пептиды, липиды, белки, антиоксиданты и поверхностно-активные вещества.

РНК можно вводить в клетки-мишени с помощью любого из целого ряда различных способов, например, коммерчески доступных способов, которые включают без ограничения электропорацию (Amaxa Nucleofector-II (Amaxa Biosystems, Кельн, Германия)), ECM 830 (BTX) (Harvard Instruments, Бостон, Массачусетс) или Gene Pulser II (BioRad, Денвер, Колорадо), Multiporator (Eppendorf, Гамбург, Германия)), трансфекцию, опосредованную катионными липосомами, с применением липофекции, инкапсуляцию в полимеры, трансфекцию, опосредованную пептидами, или биобаллистические системы доставки частиц, такие как "генные пушки" (см., например, Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001).

Невирусные способы доставки

В некоторых вариантах осуществления можно применять невирусные способы для доставки нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, описанный в данном документе, в клетку, или ткань, или организм субъекта.

В некоторых вариантах осуществления невирусный способ включает применение транспозона (также называемого мобильным генетическим элементом). В некоторых вариантах осуществления транспозон представляет собой фрагмент ДНК, который может самостоятельно вставляться в определенное местоположение в геноме, например, фрагмент ДНК, который способен к саморепликации и вставке своей копии в геном, или фрагмент ДНК, который с помощью сплайсинга может быть вырезан из более длинной нуклеиновой кислоты и вставлен в другое место в геноме. Например, транспозон содержит последовательность ДНК, состоящую из инвертированных повторов, фланкирующих гены для транспозиции.

Иллюстративные способы доставки нуклеиновой кислоты с применением транспозона включают транспозонную систему "спящая красавица" (SBTS) и транспозонную систему piggyBac™ (PB). См., например, Aronovich et al. Hum. Mol. Genet. 20.R1(2011):R14-20; Singh et al. Cancer Res. 15(2008):2961-2971; Huang et al. Mol. Ther. 16(2008):580-589; Grabundzija et al. Mol. Ther. 18(2010):1200-1209; Kebriaei et al. Blood. 122.21(2013):166; Williams. Molecular Therapy 16.9(2008):1515-16; Bell et al. Nat. Protoc. 2.12(2007):3153-65; и Ding et al. Cell. 122.3(2005):473-83, все из которых включены в данный документ посредством ссылки.

SBTS содержит два компонента: 1) транспозон, содержащий трансген, и 2) источник фермента транспозазы. Транспозаза может обеспечивать перенос транспозона из плазмиды-носителя (или другой донорной ДНК) в целевую ДНК, такую как хромосома/геном клетки-хозяина. Например, транспозаза связывается с плазмидой-носителем/донорной ДНК, вырезает транспозон (в том числе трансген(трансгены)) из плазмиды и вставляет его в геном клетки-хозяина. См., например, Aronovich et al. выше.

Иллюстративные транспозоны включают транспозон на основе pT2. См., например, Grabundzija et al. Nucleic Acids Res. 41.3(2013):1829-47 и Singh et al. Cancer Res. 68.8(2008): 2961-2971, все из которых включены в данный документ посредством ссылки. Иллюстративные транспозазы включают транспозазу типа Tc1/mariner, например, транспозазу SB10 или транспозазу SB11 (гиперактивную транспозазу, которая может экспрессироваться, например, под контролем промотора цитомегаловируса). См., например, Aronovich et al.; Kebriaei et al. и Grabundzija et al., все из которых включены в данный документ посредством ссылки.

Применение SBTS обеспечивает эффективную интеграцию и экспрессию трансгена, например, нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, описанный в данном документе. В данном документе представлены способы получения клетки, например, T-клетки или NK-клетки, которая стабильно экспрессирует CAR, описанный в данном документе, например, с применением транспозонной системы, такой как SBTS.

В соответствии со способами, описанными в данном документе, в некоторых вариантах осуществления одна или несколько нуклеиновых кислот, например, плазмид, содержащих компоненты SBTS, доставляются в клетку (например, T- или NK-клетку). Например, нуклеиновая(нуклеиновые) кислота(кислоты) доставляются с помощью стандартных способов доставки нуклеиновых кислот (например, плазмидной ДНК), например, с помощью описанных в данном документе способов, например, электропорации, трансфекции или липофекции. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит транспозон, содержащий трансген, например, нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR, описанный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит транспозон, содержащий трансген (например, нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR, описанный в данном документе), а также последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент транспозазу. В других вариантах осуществления представлена система с двумя нуклеиновыми кислотами, например, система с двумя плазмидами, например, где первая плазмида содержит транспозон, содержащий трансген, а вторая плазмида содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент транспозазу. Например, первая и вторая нуклеиновые кислоты совместно доставляются в клетку-хозяина.

В некоторых вариантах осуществления клетки, например, T- или NK-клетки, которые экспрессируют CAR, описанный в данном документе, получают с помощью комбинации вставки гена с помощью SBTS и генетического редактирования с помощью нуклеазы (например, нуклеаз с "цинковыми пальцами" (ZFN), эффекторных нуклеаз, подобных активаторам транскрипции (TALEN), системы CRISPR/Cas или сконструированных мегануклеаз, представляющих собой реконструированные хоминг-эндонуклеазы).

В некоторых вариантах осуществления применение невирусного способа доставки делает возможным перепрограммирование клеток, например, Т- или NK-клеток, и прямую инфузию клеток в организм субъекта. Преимущества невирусных векторов включают без ограничения простоту и относительно низкую стоимость получения достаточных количеств, необходимых для удовлетворения требованиям популяции пациентов, стабильность при хранении и отсутствие иммуногенности.

Способы изготовления/получения

В настоящем изобретении также предусмотрены способы получения клетки, раскрытой в данном документе, например, способы конструирования T-клетки или NK-клетки таким образом, чтобы она экспрессировала молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую одну или несколько конструкций CAR, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления способы изготовления, раскрытые в данном документе, применяют для изготовления клетки, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую два CAR, раскрытых в данном документе (например, CAR для BCMA и CAR для CD19, раскрытые в данном документе). В некоторых вариантах осуществления способы изготовления, раскрытые в данном документе, применяют для изготовления клетки, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR в формате диатела, раскрытый в данном документе, например, CAR для BCMA/CD19 в формате диатела, раскрытый в данном документе. В некоторых вариантах осуществления способы изготовления, раскрытые в данном документе, применяют для изготовления клетки, содержащей две молекулы нуклеиновой кислоты, каждая из которых кодирует CAR, раскрытый в данном документе (например, одну молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR для BCMA, и одну молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR для CD19). В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрена популяция клеток (например, иммунных эффектoрных клеток, например, T-клеток или NK-клеток), полученных посредством любого из способов изготовления, описанных в данном документе.

Способ с использованием активации

В некоторых вариантах осуществления посредством способов, раскрытых в данном документе, можно изготавливать иммунные эффектoрные клетки, сконструированные таким образом, что они экспрессируют один или несколько CAR, за менее чем 24 часа. Не ограничиваясь какой-либо теорией, полагают, что способы, предусмотренные в данном документе, обеспечивают сохранение недифференцированного фенотипа T-клеток, таких как необученные Т-клетки, в ходе способа изготовления. Такие клетки, экспрессирующие CAR, с недифференцированным фенотипом могут персистировать дольше и/или размножаться лучше in vivo после инфузии. В некоторых вариантах осуществления CAR-T-клетки, полученные посредством способов изготовления, предусмотренных в данном документе, содержат более высокую процентную долю T-клеток памяти, представляющих собой стволовые клетки, по сравнению с CAR-T-клетками, полученными посредством способа традиционного изготовления, например, согласно измерению с помощью scRNA-seq (например, согласно измерению посредством способов, описанных в примере 7 в отношении фиг. 25A). В некоторых вариантах осуществления CAR-T-клетки, полученные посредством способов изготовления, предусмотренных в данном документе, содержат более высокую процентную долю эффекторных T-клеток по сравнению с CAR-T-клетками, полученными посредством способа традиционного изготовления, например, согласно измерению с помощью scRNA-seq (например, согласно измерению посредством способов, описанных в примере 7 в отношении фиг. 25B). В некоторых вариантах осуществления CAR-T-клетки, полученные посредством способов изготовления, предусмотренных в данном документе, лучше сохраняют стволовость T-клеток по сравнению с CAR-T-клетками, полученными посредством способа традиционного изготовления, например, согласно измерению с помощью scRNA-seq (например, согласно измерению посредством способов, описанных в примере 7 в отношении фиг. 25C). В некоторых вариантах осуществления CAR-T-клетки, полученные посредством способов изготовления, предусмотренных в данном документе, демонстрируют более низкий уровень гипоксии по сравнению с CAR-T-клетками, полученными посредством способа традиционного изготовления, например, согласно измерению с помощью scRNA-seq (например, согласно измерению посредством способов, описанных в примере 7 в отношении фиг. 25D). В некоторых вариантах осуществления CAR-T-клетки, полученные посредством способов изготовления, предусмотренных в данном документе, демонстрируют более низкий уровень аутофагии по сравнению с CAR-T-клетками, полученными посредством способа традиционного изготовления, например, согласно измерению с помощью scRNA-seq (например, согласно измерению посредством способов, описанных в примере 7 в отношении фиг. 25E). В некоторых вариантах осуществления иммунные эффекторные клетки конструируют таким образом, чтобы они содержали молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую два CAR, раскрытых в данном документе (например, CAR для BCMA и CAR для CD19, раскрытые в данном документе). В некоторых вариантах осуществления иммунные эффекторные клетки конструируют таким образом, чтобы они содержали молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR в формате диатела, раскрытый в данном документе, например, CAR для BCMA/CD19 в формате диатела, раскрытый в данном документе. В некоторых вариантах осуществления иммунные эффекторные клетки конструируют таким образом, чтобы они содержали две молекулы нуклеиновой кислоты, каждая из которых кодирует CAR, раскрытый в данном документе (например, одну молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR для BCMA, и одну молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR для CD19).

В некоторых вариантах осуществления способы, раскрытые в данном документе, не предусматривают применение гранулы, такой как Dynabeads® (например, Dynabeads® с антителами к CD3/CD28), и не предусматривают стадию удаления гранул. В некоторых вариантах осуществления CAR-T-клетки, изготовленные посредством способов, раскрытых в данном документе, можно вводить субъекту при минимальном размножении ex vivo, например, в течение менее 1 дня, менее 12 часов, менее 8 часов, менее 6 часов, менее 4 часов, менее 3 часов, менее 2 часов, менее 1 часа или без размножения ex vivo. Соответственно, способы, описанные в данном документе, предусматривают способ быстрого изготовления для получения улучшенных продуктов на основе клеток, экспрессирующих CAR, для применения в лечении заболевания у субъекта.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрены способы получения популяции клеток (например, T-клеток), которые экспрессируют химерный антигенный рецептор (CAR) (например, один или несколько CAR, например, два CAR), включающие (i) приведение популяции клеток (например, T-клеток, например, T-клеток, выделенных из замороженного или свежего продукта лейкафереза) в контакт со средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу на поверхности клеток; (ii) приведение популяции клеток (например, T-клеток) в контакт с молекулой(молекулами) нуклеиновой кислоты (например, молекулой ДНК или РНК), кодирующими CAR, за счет чего обеспечивается получение популяции клеток (например, T-клеток), содержащих молекулу нуклеиновой кислоты, и (iii) сбор популяции клеток (например, T-клеток) для хранения (например, повторного составления популяции клеток в среде для криоконсервации) или введения, где (a) стадию (ii) проводят вместе со стадией (i) или не позже чем через 20 часов после начала стадии (i), например, не позже чем через 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18 часов после начала стадии (i), например, не позже чем через 18 часов после начала стадии (i), и стадию (iii) проводят не позже чем через 26 часов после начала стадии (i), например, не позже чем через 22, 23 или 24 часа после начала стадии (i), например, не позже чем через 24 часа после начала стадии (i); (b) стадию (ii) проводят вместе со стадией (i) или не позже чем через 20 часов после начала стадии (i), например, не позже чем через 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18 часов после начала стадии (i), например, не позже чем через 18 часов после начала стадии (i), и стадию (iii) проводят не позже чем через 30 часов после начала стадии (ii), например, не позже чем через 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 часов после начала стадии (ii); или (c) популяция клеток из стадии (iii) не является размножившейся или является размножившейся с увеличением численности на не более чем 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или 40%, например, на не более чем 10%, например, согласно оценке по количеству живых клеток, по сравнению с популяцией клеток в начале стадии (i). В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты на стадии (ii) представляет собой молекулу ДНК. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты на стадии (ii) представляет собой молекулу РНК. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты на стадии (ii) находится в вирусном векторе, например, в вирусном векторе, выбранном из лентивирусного вектора, аденовирусного вектора или ретровирусного вектора. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты на стадии (ii) находится в невирусном векторе. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты на стадии (ii) находится в плазмиде. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты на стадии (ii) не находится в каком-либо векторе. В некоторых вариантах осуществления стадия (ii) включает трансдукцию популяции клеток (например, T-клеток) c помощью вирусного(вирусных) вектора(векторов), содержащих молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR.

В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток (например, T-клеток) собирают из образца, полученного путем афереза (например, образца, полученного путем лейкафереза) у субъекта.

В некоторых вариантах осуществления образец, полученный путем афереза (например, образец, полученный путем лейкафереза), собирают у субъекта и транспортируют в виде замороженного образца (например, криоконсервированного образца) в учреждение, осуществляющее изготовление клеток. Затем замороженный образец, полученный путем афереза, размораживают, и T-клетки (например, CD4+ T-клетки и/или CD8+ T-клетки) отбирают из образца, полученного путем афереза, например, с помощью устройства для сортировки клеток (например, устройства CliniMACS® Prodigy®). Отобранные T-клетки (например, CD4+ T-клетки и/или CD8+ T-клетки) затем высевают для изготовления CAR-T посредством способа с использованием активации, описанного в данном документе. В некоторых вариантах осуществления отобранные T-клетки (например, CD4+ T-клетки и/или CD8+ T-клетки) подвергают одному или нескольким циклам замораживания-размораживания перед высеванием для изготовления CAR-T.

В некоторых вариантах осуществления образец, полученный путем афереза (например, образец, полученный путем лейкафереза), собирают у субъекта и транспортируют в виде свежего продукта (например, незамороженного продукта) в учреждение, осуществляющее изготовление клеток. T-клетки (например, CD4+ T-клетки и/или CD8+ T-клетки) отбирают из образца, полученного путем афереза, например, с помощью устройства для сортировки клеток (например, устройства CliniMACS® Prodigy®). Отобранные T-клетки (например, CD4+ T-клетки и/или CD8+ T-клетки) затем высевают для изготовления CAR-T посредством способа с использованием активации, описанного в данном документе. В некоторых вариантах осуществления отобранные T-клетки (например, CD4+ T-клетки и/или CD8+ T-клетки) подвергают одному или нескольким циклам замораживания-размораживания перед высеванием для изготовления CAR-T.

В некоторых вариантах осуществления у субъекта собирают образец, полученный путем афереза (например, образец, полученный путем лейкафереза). T-клетки (например, CD4+ T-клетки и/или CD8+ T-клетки) отбирают из образца, полученного путем афереза, например, с помощью устройства для сортировки клеток (например, устройства CliniMACS® Prodigy®). Отобранные T-клетки (например, CD4+ T-клетки и/или CD8+ T-клетки) затем транспортируют в виде замороженного образца (например, криоконсервированного образца) в учреждение, осуществляющее изготовление клеток. Отобранные T-клетки (например, CD4+ T-клетки и/или CD8+ T-клетки) впоследствии размораживают и высевают для изготовления CAR-T посредством способа с использованием активации, описанного в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления клетки (например, T-клетки) приводят в контакт с антителами к CD3 и антителами к CD28 в течение, например, 12 часов с последующей трансдукцией с помощью вектора (например, лентивирусного вектора) (например, одного или нескольких векторов), кодирующего CAR (например, один или несколько CAR). Через 24 часа после начала культивирования клетки промывают и составляют для хранения или введения.

Не ограничиваясь какой-либо теорией, полагают, что кратковременная стимуляция CD3 и CD28 может способствовать эффективной трансдукции самообновляющихся T-клеток. По сравнению с традиционными подходами к изготовлению CAR-T способ с использованием активации, предусмотренный в данном документе, не предусматривает продолжительного размножения ex vivo. Подобно способу с использованием цитокинов, способ с использованием активации, предусмотренный в данном документе, также обеспечивает сохранение недифференцированных T-клеток в ходе изготовления CAR-T.

В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток приводят в контакт со средством, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и/или средством, которое стимулирует костимулирующую молекулу на поверхности клеток.

В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, представляет собой средство, которое стимулирует CD3. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует костимулирующую молекулу, представляет собой средство, которое стимулирует CD28, ICOS, CD27, HVEM, LIGHT, CD40, 4-1BB, OX40, DR3, GITR, CD30, TIM1, CD2, CD226 или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует костимулирующую молекулу, представляет собой средство, которое стимулирует CD28. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, выбрано из антитела (например, однодоменного антитела (например, антитела из одного вариабельного домена тяжелой цепи), пептитела, Fab-фрагмента или scFv), малой молекулы или лиганда (например, существующего в природе, рекомбинантного или химерного лиганда). В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, представляет собой антитело. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, представляет собой антитело к CD3. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует костимулирующую молекулу, выбрано из антитела (например, однодоменного антитела (например, антитела из одного вариабельного домена тяжелой цепи), пептитела, Fab-фрагмента или scFv), малой молекулы или лиганда (например, существующего в природе, рекомбинантного или химерного лиганда). В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует костимулирующую молекулу, представляет собой антитело. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует костимулирующую молекулу, представляет собой антитело к CD28. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, или средство, которое стимулирует костимулирующую молекулу, не содержит гранулу. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, содержит антитело к CD3, ковалентно присоединенное к коллоидной полимерной наноматрице. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует костимулирующую молекулу, содержит антитело к CD28, ковалентно присоединенное к коллоидной полимерной наноматрице. В некоторых вариантах осуществления средство, которое стимулирует комплекс CD3/TCR, и средство, которое стимулирует костимулирующую молекулу, содержат TransAct™ для T-клеток.

В некоторых вариантах осуществления матрица содержит полимерный, например, биоразлагаемый или биосовместимый, инертный материал, например, который является нетоксичным для клеток, или состоит из такого материала. В некоторых вариантах осуществления матрица состоит из гидрофильных полимерных цепей, которые достигают максимальной подвижности в водном растворе благодаря гидратации цепей. В некоторых вариантах осуществления подвижная матрица может состоять из композиций на основе коллагена, очищенных белков, очищенных пептидов, полисахаридов, гликозаминогликанов или внеклеточного матрикса. Полисахарид может включать, например, простые эфиры целлюлозы, крахмал, аравийскую камедь, агарoзу, декстран, хитозан, гиалуроновую кислоту, пектины, ксантан, гуаровую камедь или альгинат. Другие полимеры могут включать сложные полиэфиры, простые полиэфиры, полиакрилаты, полиакриламиды, полиамины, полиэтиленимины, полимеры поликватерниумы, полифосфазены, поливиниловые спирты, поливинилацетаты, поливинилпирролидоны, блок-сополимеры или полиуретаны. В некоторых вариантах осуществления подвижная матрица представляет собой полимер декстран.

В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток приводят в контакт с молекулой нуклеиновой кислоты (например, одной или несколькими молекулами нуклеиновой кислоты), кодирующей CAR (например, один или несколько CAR). В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток трансдуцируют с помощью молекулы ДНК (например, одной или нескольких молекул ДНК), кодирующей CAR (например, один или несколько CAR).

В некоторых вариантах осуществления в случае котрансдукции двумя молекулами нуклеиновой кислоты (например, лентивирусными векторами), каждая из которых кодирует CAR, раскрытый в данном документе (например, одной молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR для BCMA, и одной молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR для CD19, раскрытые в данном документе), каждый из векторов, содержащих молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие CAR, можно добавлять в реакционную смесь (например, содержащую популяцию клеток) при различной множественности заражения (MOI).

Не ограничиваясь какой-либо теорией, полагают, что в некоторых вариантах осуществления с использование различных MOI для векторов, содержащих молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют различные молекулы CAR, может влиять на конечный состав клеточной популяции. Например, в случае котрансдукции лентивирусным вектором, кодирующим CAR для BCMA, и лентивирусным вектором, кодирующим CAR для CD19, можно использовать различные MOI для доведения до максимума процента моно-BCMA-CAR-Т-клеток и CAR-Т-клеток с двойной специфичностью к BCMA/CD19 с получением при этом меньшего количества моно-CD19-CAR-T-клеток и нетрансдуцированных клеток.

В некоторых вариантах осуществления в случае котрансдукции лентивирусным вектором, кодирующим CAR для BCMA, и лентивирусным вектором, кодирующим CAR для CD19, популяцию клеток приводят в контакт с первым вирусным вектором при множественности заражения (MOI), которая больше, равняется или меньше MOI, при которой популяцию клеток приводят в контакт со вторым вирусным вектором. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток приводят в контакт с первым вирусным вектором при множественности заражения (MOI), которая больше MOI, при которой популяцию клеток приводят в контакт со вторым вирусным вектором.

В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток приводят в контакт с первым вирусным вектором при первой MOI и со вторым вирусным вектором при второй MOI, так что полученная в результате популяция клеток содержит первую популяцию клеток, которые содержат CAR для BCMA, но не CAR для CD19, вторую популяцию клеток, которые содержат CAR для CD19, но не CAR для BCMA, и третью популяцию клеток, которые содержат как CAR для BCMA, так и CAR для CD19, где:

(a) общее количество жизнеспособных клеток в объединенных второй и третьей популяциях меньше или равняется приблизительно 110% (например, меньше или равняется приблизительно 105%, 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1% или меньше) от общего количества жизнеспособных клеток в объединенных первой и третьей популяциях, например, при определении посредством способа, описанного в примере 10;

(b) общее количество жизнеспособных клеток в объединенных первой и третьей популяциях больше или равняется приблизительно 90% (например, больше или равняется приблизительно 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 750%, 1000%, 2000% , 5000, 10000% или больше) от общего количества жизнеспособных клеток в объединенных второй и третьей популяциях, например, при определении посредством способа, описанного в примере 10;

(c) общее количество жизнеспособных клеток в объединенных первой и третьей популяциях больше или равняется приблизительно 5% (например, больше или равняется приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%) от общего количества жизнеспособных клеток в полученной в результате популяции, например, при определении посредством способа, описанного в примере 10;

(d) общее количество жизнеспособных клеток во второй популяции меньше или равняется приблизительно 110% (например, меньше или равняется приблизительно 105%, 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1% или меньше) от общего количества жизнеспособных клеток в объединенных первой и третьей популяциях, например, при определении посредством способа, описанного в примере 10; или

(e) общее количество жизнеспособных клеток в объединенных первой и третьей популяциях больше или равняется приблизительно 90% (например, больше или равняется приблизительно 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 750%, 1000%, 2000% , 5000, 10000% или больше) от общего количества жизнеспособных клеток во второй популяции, например, при определении посредством способа, описанного в примере 10.

В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток приводят в контакт со вторым вирусным вектором при MOI, например, MOI, которая достаточно ниже, чем MOI, при которой популяцию клеток приводят в контакт с первым вирусным вектором, так что в полученной в результате популяции клеток:

(a) общее количество жизнеспособных клеток в объединенных второй и третьей популяциях меньше или равняется приблизительно 110% (например, меньше или равняется приблизительно 105%, 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1% или меньше) от общего количества жизнеспособных клеток в объединенных первой и третьей популяциях, например, при определении посредством способа, описанного в примере 10;

(b) общее количество жизнеспособных клеток в объединенных первой и третьей популяциях больше или равняется приблизительно 90% (например, больше или равняется приблизительно 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 750%, 1000%, 2000%, 5000, 10000% или больше) от общего количества жизнеспособных клеток в объединенных второй и третьей популяциях, например, при определении посредством способа, описанного в примере 10;

(c) общее количество жизнеспособных клеток в объединенных первой и третьей популяциях больше или равняется приблизительно 5% (например, больше или равняется приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%) от общего количества жизнеспособных клеток в полученной в результате популяции, например, при определении посредством способа, описанного в примере 10;

(d) общее количество жизнеспособных клеток во второй популяции меньше или равняется приблизительно 110% (например, меньше или равняется приблизительно 105%, 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1% или меньше) от общего количества жизнеспособных клеток в объединенных первой и третьей популяциях, например, при определении посредством способа, описанного в примере 10; или

(e) общее количество жизнеспособных клеток в объединенных первой и третьей популяциях больше или равняется приблизительно 90% (например, больше или равняется приблизительно 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 750%, 1000%, 2000%, 5000, 10000% или больше) от общего количества жизнеспособных клеток во второй популяции, например, при определении посредством способа, описанного в примере 10.

В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток приводят в контакт с первым вирусным вектором при первой MOI и популяцию клеток приводят в контакт со вторым вирусным вектором при второй MOI, так что полученная в результате популяция клеток содержит:

(a) общее количество жизнеспособных клеток в объединенных второй и третьей популяциях меньше или равняется приблизительно 110% (например, меньше или равняется приблизительно 105%, 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1% или меньше) от общего количества жизнеспособных клеток в объединенных первой и третьей популяциях, например, при определении посредством способа, описанного в примере 10;

(b) общее количество жизнеспособных клеток в объединенных первой и третьей популяциях больше или равняется приблизительно 90% (например, больше или равняется приблизительно 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 750%, 1000%, 2000% , 5000, 10000% или больше) от общего количества жизнеспособных клеток в объединенных второй и третьей популяциях, например, при определении посредством способа, описанного в примере 10;

(c) общее количество жизнеспособных клеток в объединенных первой и третьей популяциях больше или равняется приблизительно 5% (например, больше или равняется приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%) от общего количества жизнеспособных клеток в полученной в результате популяции, например, при определении посредством способа, описанного в примере 10;

(d) общее количество жизнеспособных клеток во второй популяции меньше или равняется приблизительно 110% (например, меньше или равняется приблизительно 105%, 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1% или меньше) от общего количества жизнеспособных клеток в объединенных первой и третьей популяциях, например, при определении посредством способа, описанного в примере 10; или

(e) общее количество жизнеспособных клеток в объединенных первой и третьей популяциях больше или равняется приблизительно 90% (например, больше или равняется приблизительно 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 750%, 1000%, 2000%, 5000, 10000% или больше) от общего количества жизнеспособных клеток во второй популяции, например, при определении посредством способа, описанного в примере 10.

В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток приводят в контакт с