Штамм бактерий Levilactobacillu brevis ВКШМ-Г-07ПД Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарии и может быть использовано в производстве бактериальных препаратов и кормовых добавок, предназначенных для профилактики сальмонеллеза у сельскохозяйственных животных.

В настоящее время актуальной задачей является разработка новых препаратов пробиотиков и пробиотических кормовых добавок, обладающих антагонистической активностью к антибиотикорезистентным штаммам Salmonella Enteritidis (SE) и Salmonella Typhimurium (ST). Сальмонелла - грамотрицательный факультативно-анаэробный внутриклеточный патоген, относящийся к семейству Enterobacteriaceae. В настоящее время известно более 2600 серотипов сальмонелл [1]. Доминирующие нетифоидные серовары S. enterica, Enteritidis (SE) и Typhimurium (ST) являются распространенными патогенами пищевого происхождения, ответственными за 93,8 миллиона случаев гастроэнтерита, 155 000 смертей ежегодно во всем мире и значительные экономические потери [2-4]. SE и ST считаются социально значимыми зооантропонозными инфекциями, поскольку они могут вызывать желудочно-кишечные заболевания у различных видов хозяев и тяжелые инфекции у младенцев, пожилых людей и лиц с ослабленным иммунитетом [5]. Эти патогены в первую очередь связаны с потреблением зараженного мяса птицы и сырых яиц [6]. SE появился конце 20-го века как основной патоген, способный накапливаться в желтках куриных яиц [7], что привело к эпидемическому росту числа инфекций у людей [8-13]. В период с 1996 по 1999 год число зарегистрированных случаев заражения человека SE, связанных с пищевыми продуктами, увеличилось на 44% [14]. SE заражает столовые яйца путем горизонтальной передачи с фекалиями инфицированных кур-несушек, вертикальной передачи через желток, белок или оболочки яичной скорлупы перед откладкой яиц и загрязнения яичной скорлупы после откладки [15,16]. Безопасность пищевых продуктов стала серьезной глобальной проблемой [12,17]. Широкое использование антибиотиков в качестве кормовых добавок для стимулирования роста сельскохозяйственных животных способствовало появлению патогенных микроорганизмов с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ), включая сальмонеллы [18-26]. Антибиотики традиционно использовались в качестве стратегии борьбы с сальмонеллезными инфекциями. Однако частое и длительное применение антибиотиков не только ведет к повышению устойчивости к антибиотикам среди сероваров сальмонелл, но и нарушает нормальную микробиоту кишечника [27]. Устойчивые к антибиотикам SE и ST штаммы сельскохозяйственных животных могут напрямую передаваться человеку по пищевой цепи или косвенно передавать свои гены устойчивости к патогенам человека, используя мобильные генетические элементы, связанные с конъюгативными плазмидами [28]. Быстрое глобальное распространение патогенов МЛУ представляет значительную угрозу для людей и животных, что требует разработки и внедрения альтернативных антибиотикам методов борьбы с этими патогенами [29]. Одним из многообещающих альтернативных подходов является потенциальное профилактическое и терапевтическое применение пробиотиков, пребиотиков и пробиотических кормовых добавок против различных энтеропатогенов, включая сальмонелы. Преимуществами использования пробиотиков в качестве профилактических и лекарственных средств является их относительная безвредность и физиологичность по сравнению с химическими препаратами. Антагонистическая активность, проявляемая лактобактериями в качестве пробиотиков и пробиотических кормовых добавок, является важной функциональной характеристикой, которая приносит пользу микробиому как человека, так и животных [30-32]. В частности, важной проблемой является пробиотическя профилактика сальмонеллеза у сельскохозяйственных животных, выполняющих функции пищевой цепочки для человека и служащих основным источником инфекции.

Существует большое количество препаратов, в основном БАДов, в состав которых входят лактобациллы. Такие препараты используют для коррекции и стабилизации кишечной микрофлоры при дисбактериозах различной этиологии. Более сорока пяти из них зарегистрированы в России как фармпрепараты [http://www.rlsnet.ru/baa_fg_id_367.htm]. Недостатком является отсутствие данных об антагонистической активности штаммов по отношению к антибиотикорезистентным штаммам SE и ST, включая штаммы с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ).

Существует ряд патентов на пробиотические микроорганизмы с антиоксидантной активностью (KR20120023480 (А) 2012; KR101197203 2012; SG11201504787V (A), 2015). Проявление антиоксидантной активности пробиотического штамма усиливает его анти-сальмонеллезное действие. Недостатком является отсутствие у вышеуказанных штаммов данных об их антагонистической активности по отношению к антибиотикорезистентным SE и ST, включая штаммы с МЛУ.

Известен штамм бактерий L. brevis BA-13, используемый для приготовления пробиотических препаратов и продуктов питания (Патент РФ № 2190015, опубликован 27.09.2002.). Штамм выделен из соскоба слизистой желудка здорового взрослого человека и обладает антагонистической активностью к условно-патогенным микроорганизмам S. aureus и E. coli. Недостатком является отсутствие данных об антагонистической активности штамма по отношению к антибиотикорезистентным штаммам SE и ST, включая штаммы с МЛУ.

Известен консорциум штаммов, содержащий L. brevis CECT 7480 и L. plantarum CECT 7481. Штаммы обладают повышенной способностью к адгезии на эпителиоцитах полости рта и антагонистической активностью к патогенам полости рта (Патент WO 2012/022773, опубликован 23.02.2012). Консорциум используют для профилактики инфекционных заболеваний полости рта. Недостатком является отсутствие данных об антагонистической активности штамма по отношению к антибиотикорезистентным штаммам SE и ST, включая штаммы с МЛУ.

Известен консорциум штаммов, содержащий Lactobacillus brevis и Lactobacillus rhamnosus. Штаммы продуцируют глутатион и комплекс внутриклеточных антиоксидантов (Патент РФ RU 2617946 C1, опубликован 28.04.2017). Недостатком является отсутствие данных об антагонистической активности штаммов в отношении к антибиотикорезистентным штаммам SE и ST, включая штаммы с МЛУ. Известен штамм L. brevis SCML 432, обладающий пробиотическими свойствами и антимикробной активностью (Патент ЛК-102065580-B1, опубликован 13.01.2020). Недостатком является отсутствие данных об антагонистической активности штаммов в отношении к антибиотикорезистентным штаммам SE и ST, включая штаммы с МЛУ.

Известен штамм L. brevis TK1905 (Патент CN112813002B, опубликован 08.11.2022). Штамм L. brevis TK1905 обладает высокой термоустойчивостью при высушивании, что позволяет решить проблему низкой выживаемости пробиотических бактерий при получении готовых препаратов. Недостатком является отсутствие данных об антагонистической активности штаммов в отношении к антибиотикорезистентным штаммам SE и ST, включая штаммы с МЛУ.

Задачей изобретения является расширение номенклатуры пробиотических штаммов, обладающих антагонистической активностью к SE и ST патогенам, включая антибиотикорезистентные штаммы, а также штаммы с (МЛУ).

Техническим результатом заявленного изобретения является высокая антагонистическая активность штамма по отношению к антибиотикорезистентным штаммам Salmonella Enteritidis и Salmonella Typhimurium, включая штаммы с множественной лекарственной устойчивостью.

Заявленных технический результат достигается за счет того, что полученный пробиотический штамм Levilactobacillu brevis ВКШМ-Г-07ПД, обладает антагонистической активностью по отношению к SE и ST патогенам, включая антибиотикорезистентные штаммы, а также штаммы с МЛУ. Штамм L. brevis ВКШМ-Г-07ПД выделен из кишечника здорового поросенка.

Принадлежность выделенного штамма лактобацилл к виду L. brevis определена методом секвенирования гена, кодирующего 16S rRNA.

Полученный штамм депонирован ФГБУ «ВГНКИ» под номером Levilactobacillu brevis ВКШМ-Г-07ПД

Штамм L. brevis ВКШМ-Г-07ПД характеризуется следующими биологическими свойствами.

Культурально-морфологические свойства штамма:

грамположительные неспорообразующие палочки. Клетки средние, образуют короткие цепочки, могут образовывать конгломераты. Колонии средние, белые, круглые, выпуклые, блестящие.

Физиолого-биохимические свойства штамма.

L. brevis ВКШМ-Г-07ПД является факультативным анаэробом. Штамм растет в интервале 20-40°C, оптимальная для роста температура 37±1°C. При глубинной ферментации на жидкой питательной среде оптимальный режим аэрации-перемешивания 1 объем воздуха/1 объем питательной среды, что соответствует сульфитному числу 1.

Оптимально для роста pH=6,5±0,4.

Отношение к источникам углеводов.

Хорошо растет на: D-глюкозе, D-фруктозе, D-галактозе, D-сахарозе, D-лактозе, D-мальтозе, D-рибозе, L-арабинозе, D-ксилозе, N ацетил глюкозамине, эскулине, D-целлобиозе, D-мелибиозе, глюконате, кето-глюконате.

Чувствительность к антибиотикам.

Штамм L. brevis ВКШМ-Г-07ПД устойчив к метронидазолу и ванкомицину.

Штамм фенотипически апатогенный. Он не обладает гемолитической, летициназной, гиалуронидазной, антилизоцимной, ДНК-ной и РНК-ной активностью.

Способ, условия и состав сред для культивирования штамма.

Штамм L. brevis ВКШМ-Г-07ПД культивируют на жидкой или агаризованной средах MRS (Himedia) в течении 24-48 час. Состав среды MRS на 1 литр в граммах: протеозопептон - 10,0; мясной экстракт - 10,0; дрожжевой экстракт - 5,0; глюкоза - 20,0; полисорбат 80 - 1,0; цитрат аммония - 2,0; ацетат натрия - 5,0; сульфат магния - 0,1; сульфат марганца - 0,05; фосфат калия двузамещенный - 2,0. рН (при 25°С) 6,5. Культивирование осуществляли как в анаэробных условиях с использованием анаэростата и системы GasPak+, так и в CO₂ инкубаторе. Температура инкубации 37°С.

Способ, условия и состав сред для хранения штамма.

Штамм L. brevis ВКШМ-Г-07ПД может храниться:

- в стерильном обезжиренном молоке при 4°С с периодическим пересевом 1 раз в 15-20 дней;

В лиофилизированном состоянии в запаянных ампулах (защитная среда при высушивании - сахароза 10%, рН 7.0 или стерильное обезжиренное молоко) в течение 2-х лет при температуре 4°С;

- в замороженном виде при -70°С. Длительность хранения- 6 месяцев.

Заявленное решение иллюстрируется следующими таблицами:

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Определение устойчивости штамма L. brevis ВКШМ-Г-07ПД к желудочному и кишечному стрессам.

Метод определения устойчивости штаммов лактобацилл к желудочному стрессу.

Для определения устойчивости к ЖКТ стрессу in vitro использовали культуры лактобацилл в стационарной фазе роста, выращенные на жидкой среде MRS, pH 6,5 (Himedia, Индия) в течение 18 ч. при 37°С, 10% CO₂. Для имитации желудочного стресса был использован искусственный желудочный сок следующего состава (г/л):

NaCl (Sigma S9625) 2.2 g/l;

L - молочная кислота (Sigma L1750) 9.9 g/l (0,11 M);

пепсин свиной 600-1800 единиц / мг (Sigma P7125) 3.5 g/l;

pH: 2.7 ± 0.1 (доводить 35 % NaOH)

pH после разведения 1/11: 3.10 ± 0.10 (pH контролировать для каждой культуры).

В опыте к 1 мл искусственного желудочного сока, а в контроле - к 1 мл среды, добавляли 0.1 мл исследуемой культуры в стационарной фазе роста. Оба варианта инкубировали в течение 10мин, 30 мин и 60 мин при 37о С, далее отбирали пробы. Отобранные пробы после инкубирования разводили от 102 до 1010 в MRS-среде, высевали на чашки с агаризованной MRS-средой и инкубировали в течение 24-48 часов при 370 С, 10 % СО2. Количество выживших бактериальных клеток после воздействия желудочного сока (опыт) и без стресса (контроль) определяли путем подсчета количества выросших колоний. Анализ стрессоустойчивости штамма L. brevis ВКШМ-Г-07ПД к ЖКТ in vitro проводили в трех независимых экспериментах, протестированных в трех повторах.

Метод определения устойчивости штамма L. brevis ВКШМ-Г-07ПД к кишечному стрессу.

Для имитации кишечного стресса был использован кишечный сок следующего состава (г/л): желчные соли (желчь свиньи Sigma В8631) - 3.3 (конечная концентрация - 0.3 %); карбонатный буфер NаНСОз (Sigma S8875) -16.5 (конечная концентрация - 1.5%), pH: 6.3.

В опыте 1 мл искусственного кишечного сока, а в контроле - 1 мл MRS-среды, добавляли к 0.1 мл исследуемой культуры в стационарной фазе роста. Оба варианта инкубировали в течение 5 часов, при 37 °C. После инкубации готовили серии разведений опытных и контрольных проб от 10² до 10¹⁰, высевали на чашки с агаризованной MRS-средой и инкубировали в течение 24-48 часов при 37 °C, 10% СО₂. Определяли титр (количество выживших) после воздействия кишечного стресса (опыт) и без стресса (контроль) путем подсчета количества колоний.

Подсчет микроорганизмов в миллилитре культуры (Колонию Образующая Единица/мл - КОЕ/мл осуществляли по формуле:

∑C / (n₁ + 0.1 n₂) d

∑C - сумма всех характерных колоний, подсчитанных на всех чашках, содержащих от 15 до 300 колоний.

n₁ - количество чашек, в самом низком разведении (2 чашки на разведение).

n₂ - количество чашек, в самом высоком разведении (2 чашки на разведение).

d - величина первого разведения (низкое разведение), взятого для подсчета.

Степень устойчивости к желудочному или кишечному стрессам - RD (Resistance Degree) определяли по формуле: RD = n₁/n₂

n₁ - количество колониеформирующих клеток в мл (КОЕ/мл) в контроле.

n₂ - количество колониеформирующих клеток в мл (КОЕ/мл) в опыте.

Оценка устойчивости лактобацилл и бифидобактерий к желудочному или кишечному стрессу:

Очень хорошо: RD ≤ 5

Хорошо: 5 < RD ≤ 10

Приемлемо: 10 < RD ≤ 15

Неприемлемо: 15 < RD

Результаты определения устойчивости штамма L. brevis ВКШМ-Г-07ПД к желудочному и кишечному стрессам in vitro приведены в Таблице 1. Штамм L. brevis ВКШМ-Г-07ПД является устойчивым к желудочному и кишечному стрессам. Резистентность штамма пробиотика к желудочному и кишечному стрессам необходима для реализации его пробиотических свойств в пищеварительной системе.

N Код Штамм Желудочный стресс Кишечный стресс 10 мин 30 мин 60 мин (5 час) КОЕ/мл КОЕ/мл КОЕ/мл КОЕ/мл Опыт Контроль Опыт Контроль Опыт Контроль Опыт Контроль 1 L. brevis
ВКШМ-Г-07ПД (3,49 ±
0.38) × 10⁷ (3,51 ±
0.49) × 10⁷ (3,52± 0.61) × 10⁷ (3,60± 0.51) × 10⁷ (2.28± 0.55) × 10⁷ (4.11± 0.50) × 10⁷ (7.09± 0.56) × 10⁷ (5,04± 0.62) × 10⁸ RD =1,0
Очень хорошо RD =1,0
Очень хорошо RD = 1,8
Очень хорошо RD = 7.1
Хорошо

Таблица 1. Устойчивость Levilactobacillus brevis ВКШМ-Г-07ПД к желудочному и кишечному стрессам in vitro.

Данные представлены в виде средних значений ± SD трех независимых экспериментов, протестированных в трех повторах.

Пример 2. Определение способности штамма L. brevis ВКШМ-Г-07ПД к адгезии in vitro на Caco-2 энтероцитах человека, IPEC-J2 энтероцитах свиньи и CPCE энтероцитах курицы.

Плучение монослоя Caco-2 энтероцитов кишечника человека

Иммортализованные эпителиальные клетки Caco-2 кишечника человека суспендировали в питательной среде (DMEM плюс 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS) и по 0,02% пенициллина и стрептомицина) и высевали в 12-луночные планшеты для культивирования клеток при плотности 5 × 10⁵ клеток/мл для образования клеточного монослоя. Планшеты инкубировали в течение 48 ч при 37°C в среде с 5% CO₂.

Получение монослоя эпителиальных клеток IPEC-J2 кишечника свиньи

Была использована иммортализованная линия эпителиальных клеток из кишечника свиньи IPEC-J2, соответствующая модельная система in vitro для взаимодействия патогена кишечника свиньи с клеткой-хозяином. Эпителиальные клетки кишечника свиньи IPEC-J2 суспендировали в питательной среде (DMEM плюс 10% FCS и по 0,02% пенициллина и стрептомицина) и высевали в 12-луночные планшеты для культивирования клеток при плотности 5 × 10⁵ клеток/мл для образования клеточного монослоя. Планшеты инкубировали в течение 48 ч при 37°C в среде с 5% CO₂.

Получение монослоя эпителиальных клеток CPCE кишечника курицы.

Клетки CPCE суспендировали в питательной среде (DMEM плюс 2,5% фетальной телячьей сыворотки, 0,1% инсулина, 0,5% трансферрина, 0,007% гидрокортизона, 0,1% фибронектина, по 0,02% пенициллина и стрептомицина) и высевали в 12-луночные планшеты для культивирования клеток при плотности 5 × 105 клеток/мл для образования клеточного монослоя. Планшеты инкубировали в течение 48 ч при 37°C в среде с 5% CO2.

Оценку адгезии бактерий штамма L. brevis ВКШМ-Г-07ПД к энтероцитам проводили по двум параметрам: 1. Адгезивная активность (процент энтероцитов из 100 исследованных, на которых обнаруживались бактерии штамма L. brevis ВКШМ-Г-07ПД); 2. Индекс адгезии (количество бактерий штамма L. brevis ВКШМ-Г-07ПД, адгезированных на одном энтероците).

Результаты исследований приведены в Таблице 2. Бактерии штамма L. brevis ВКШМ-Г-07ПД имеют высокие показатели адгезии к энтероцитам человека и животных.

Таблица 2. Адгезия клеток штамма L. brevis ВКШМ-Г-07ПД к энтероцитам Caco-2 человека, IPEC-J2 свиньи и CPCE курицы.

Индикаторы адгезии
штамма L. brevis ВКШМ-Г-07ПД
Активность адгезии
Индекс адгезии Энтероциты человека и животных Caco-2 человека IPEC-J2 свиньи CPCE курицы 100% 100% 100% 32.6 ± 1.9 37.5 ± 2.4 29.8 ± 1.7

Данные представлены в виде средних значений ± SD шести независимых экспериментов, протестированных в трех повторах.

Пример 3. Определение способности штамма L. brevis ВКШМ-Г-07ПД к аутоагрегации и оценка его гидрофобных свойств.

Способность штамма L. brevis ВКШМ-Г-07ПД в сравнении со штаммом L. brevis ATCC 14869 к аутоагрегации оценивали по методу, предложенному в работе [Jeon HL, et al., 2017]. Гидрофобные свойства штамма L. brevis ВКШМ-Г-07ПД в сравнении со штаммом L. brevis ATCC 14869 оценивали по методу, предложенному в работе [Lee NK, et al., 2015].

Результаты исследований приведены в Таблице 3. Штамм L. brevis ВКШМ-Г-07ПД обладает повышенной способностью к аутоагрегации по сравнению со штаммом L. brevis ATCC 14869 (p< 0.05). Гидрофобность штамма L. brevis ВКШМ-Г-07ПД достоверно выше по сравнению со штаммом L. brevis ATCC 14869 (p< 0.05).

Таблица 3. Аутоагрегация и гидрофобность штаммов L. brevis ВКШМ-Г-07ПД и L. brevis ATCC 14869.

Штаммы Аутоагрегация (%) Гидрофобность (%) L. brevis ATCC 14869 54.67 ± 1.20 42.31 ± 2.82 L. brevis ВКШМ-Г-07ПД 79.58 ± 2.43^* 67.45 ± 3.15^*

Данные представлены в виде средних значений ± SD шести независимых экспериментов, протестированных в трех повторах. *- p< 0.05 достоверное превышение аутоагрегации и гидрофобности у штамма L. brevis ВКШМ-Г-07ПД по сравнению со штаммом L. brevis ATCC 14869.

Пример 4. Определение способности штамма L. brevis ВКШМ-Г-07ПД к ко-агрегации с патогенами S. Enteritidis и S. Typhimurium.

Способность штамма L. brevis ВКШМ-Г-07ПД к ко-агрегации с различными штаммами сальмонелл оценивали по методу, предложенному в работе [Jeon HL, et al., 2017].

Результаты исследований по оценке способности штамма L. brevis ВКШМ-Г-07ПД к ко-агрегации с различными штаммами S. Enteritidis и S. Typhimurium представлены в таблице 4. При рН 7.0 штамм L. brevis ВКШМ-Г-07ПД образует ко-агрегаты с различными штаммами S. Enteritidis и S. Typhimurium. Снижение рН среды до 5.0 значительно повышает способность штамма L. brevis ВКШМ-Г-07ПД к ко-агрегаци с сальмонеллами (p< 0.05).

Таблица 4. Ко-агрегация штамма L. brevis ВКШМ-Г-07ПД с патогенами S. Enteritidis и S. Typhimurium.

Тест-культура, штамм 20°С, рН 7.0¹ 20°С, рН 5.0² S. Enteritidis ATCC 13076 39.4 ± 6.2 74.6 ± 5.2^* S. Enteritidis ATCC 4931 38.5 ± 3.4 75.5 ± 5.8^* S. Enteritidis IIE Egg 6215 36.3 ± 4.5 72.4 ± 4.9^* S. Enteritidis IIE Egg 6218 37.5 ± 3.1 68.5 ± 4.0^* S. Enteritidis IIE Egg 6219 42.6 ± 5.3 75.8 ± 6.2^* S. Enteritidis IIE Egg 6235 37.8 ± 3.7 65.4 ± 5.3^* S. Typhimurium ATCC 700720 41.5 ± 3.8 71.5 ± 5.0^* S. Typhimurium ATCC 14028 40.7 ± 4.2 69.7 ± 4.8^* S. Typhimurium IIE Br 6458 36.5 ± 3.4 64.8 ± 4.7^* S. Typhimurium IIE Br 6461 41.8 ± 4.7 71.5 ± 5.6^*

Данные представлены в виде средних значений ± SD шести независимых экспериментов, протестированных в трех повторах. *- p< 0.05 достоверное повышение способности к ко-агрегации штамма L. brevis ВКШМ-Г-07ПД со штаммами S. Enteritidis и S. Typhimurium при рН 5.0 по сравнению с рН 7.0.

Пример 5. Определение антагонистической активности штамма L. brevis ВКШМ-Г-07ПД по отношению к антибиотикорезистентным штаммам S. Enteritidis и S. Typhimurium.

Антагонистическую активность штамма L. brevis ВКШМ-Г-07ПД оценивали in vitro методом отсроченного антагонизма. Взвесь исследуемого штамма L. brevis ВКШМ-Г-07ПД 2×10⁹ микробных клеток/мл высевали штрихом по диаметру чашки Петри петлей диаметром (3.5±0.5) мм на подсушенную в течение 24 ч агаризованную среду. После 72 ч инкубации при температуре (37 ±1)°С в анаэробных условиях перпендикулярно к выросшей культуре подсевали культуры тест-штаммов сальмонелл. Готовили суспензию культуры бактерий 2-3 пассажа в 0.9% растворе натрия хлорида в концентрации 5×10⁸ микробных клеток/мл. Посев тест-штаммов производили петлей шириной 2 мм в направлении перпендикулярном зоне роста штамма L. brevis ВКШМ-Г-07ПД, не касаясь его зоны роста. Чашки закрывали крышкой, помещали в термостат и инкубировали в течение 24 ч при температуре (37 ±1)°С. Предварительный учет результатов производили через 24 ч. Через 48 ч окончательно учитывали величину зоны угнетения роста тест-штаммов в мм. Чем больше величина угнетения роста тест-культур, тем выше антагонистическая активность изучаемого штамма L. brevis ВКШМ-Г-07ПД.

Результаты исследований по определению антагонистической активности штамма L. brevis ВКШМ-Г-07ПД по отношению к антибиотикорезистентным штаммам S. Enteritidis и S. Typhimurium приведены в Таблице 5. Антагонистическая активность бактерий штамма L. brevis ВКШМ-Г-07ПД по отношению к антибиотикорезистентным штаммам Salmonella Enteritidis и Salmonella Typhimurium является высокой. Штамм S. Enteritidis IIE Egg 6215, имеющий множественную лекарственную устойчивость (МЛУ) оказался также высокочувствительным к бактерицидному действию штамма L. brevis ВКШМ-Г-07ПД.

Таблица 5. Антагонистическая активность штамма L. brevis ВКШМ-Г-07ПД по отношению к антибиотикорезистентным штаммам Salmonella Enteritidis и Salmonella Typhimurium.

Тест-культура, штамм Зона подавления роста тест-культуры, мм Резистентность к антибиотикам S. Enteritidis ATCC 13076 22.4 ± 0.5 S. Enteritidis ATCC 4931 21.3 ± 0.7 S. Enteritidis IIE Egg 6215 23.5 ± 0.6 AMP, NAL S. Enteritidis IIE Egg 6218 22.6 ± 0.8 AMP, TET, CIP, NAL, CHL S. Enteritidis IIE Egg 6219 23.9 ± 0.5 AMP, TET, CIP, NAL, AZM S. Enteritidis IIE Egg 6235 25.2 ± 0.8 TET, CHL, LVF, CIP, NAL, SMZ, TMP, AMP S. Typhimurium ATCC 700720 21.5 ± 0.7 S. Typhimurium ATCC 14028 23.7 ± 0.6 S. Typhimurium IIE Br 6458 24.2 ± 0.8 NAL, AMP, TET S. Typhimurium IIE Br 6461 22.4 ± 0.5 AMP, TET, SXT, SMZ

Примечания: Штамм S. Enteritidis IIE Egg 6235 относится к патогенам с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ). Устойчивость к антибиотикам: AMP- ампициллин, NAL - налидиксовая кислота, TET- тетрациклин, CIP-ципрофлоксацин, CHL-хлорамфеникол, LVF - левофлоксацин, CIP-ципрофлоксацин, SMZ- сульфаметоксазол, TMP-триметоприм. Результаты исследований получены на основе шести независимых экспериментов, в трех повторах. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение.

Таким образом, бактерии штамма L .brevis ВКШМ-Г-07ПД обладают высокой антагонистической активностью по отношению к антибиотикорезистентным штаммам Salmonella Enteritidis и Salmonella Typhimurium, включая штаммы с МЛУ.

Литертура.

1. LeLièvre, V.; Besnard, A.; Schlusselhuber, M.; Desmasures, N.; Dalmasso, M. Phages for biocontrol in foods: What opportunities for Salmonella sp. control along the dairy food chain? Food Microbiol. 2019, 78, 89-98. https://doi.org/10.1016/j.fm.2018.10.009.

2. Stanaway, J.D.; Parisi, A.; Sarkar, K.; Blacker, B.F.; Reiner, R.C.; Hay, S.I.; Nixon, M.R.; Dolecek, C.; James, S.L.; Mokdad, A.H.; et al. The global burden of non-typhoidal salmonella invasive disease: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet Infect. Dis. 2019, 19, 1312-1324. https://doi.org/10.1016/S1473-3099(19)30418-9.

3. Marchello, C.S.; Fiorino, F.; Pettini, E.; Crump, J.A.; Martin, L.B.; Breghi, G.; Canals, R.; Gordon, M.A.; Hanumunthadu, B.; Jacobs, J.; et al. Incidence of non-typhoidal Salmonella invasive disease: A systematic review and meta-analysis. J. Infect. 2021, 83, 523-532. https://doi.org/10.1016/j.jinf.2021.06.029.

4. Marchello, C.S.; Birkhold, M.; Crump, J.A.; Martin, L.B.; Ansah, M.O.; Breghi, G.; Canals, R.; Fiorino, F.; Gordon, M.A.; Kim, J.-H.; et al. Complications and mortality of non-typhoidal salmonella invasive disease: A global systematic review and meta-analysis. Lancet Infect. Dis. 2022, 22, 692-705. https://doi.org/10.1016/S1473-3099(21)00615-0.

5. Ceyssens, P.-J.; Mattheus, W.; Vanhoof, R.; Bertrand, S. Trends in serotype distribution and antimicrobial susceptibility in Salmonella enterica isolates from humans in Belgium, 2009 to 2013. Antimicrob. Agents Chemother. 2015, 59, 544-552. https://doi.org/10.1128/AAC.04203-14.

6. Jackson, B.R.; Griffin, P.M.; Cole, D.; Walsh, K.A.; Chai, S.J. Outbreak-associated Salmonella enterica serotypes and food Commodities, United States, 1998-2008. Emerg. Infect. Dis. 2013, 19, 1239-1244. https://doi.org/10.3201/eid1908.121511.

7. Rabsch, W.; Hargis, B.M.; Tsolis, R.M.; Kingsley, R.A.; Hinz, K.H.; Tschäpe, H.; Bäumler, A.J. Competitive exclusion of Salmonella enteritidis by Salmonella gallinarum in poultry. Emerg. Infect. Dis. 2000, 6, 443-448. https://doi.org/10.3201/eid0605.000501.

8. Poppe, C. Salmonella enteritidis in Canada. Int. J. Food Microbiol. 1994, 21, 1-5. https://doi.org/10.1016/0168-1605(94)90193-7.

9. Hogue, A.; White, P.; Guard-Petter, J.; Schlosser, W.; Gast, R.; Ebel, E.; Farrar, J.; Gomez, T.; Madden, J.; Madison, M.; et al. Epidemiology and control of egg-associated Salmonella enteriditis in the United States of America. Rev. Sci. Tech. 1997, 16, 542-553. https://doi.org/10.20506/rst.16.2.1045.

10. Braden, C.R. Salmonella enterica serotype Enteritidis and eggs: A national epidemic in the United States. Clin. Infect. Dis. 2006, 43, 512-517. https://doi.org/10.1086/505973.

11. Betancor, L.; Pereira, M.; Martinez, A.; Giossa, G.; Fookes, M.; Flores, K.; Barrios, P.; Repiso, V.; Vignoli, R.; Cordeiro, N.; et al. Prevalence of Salmonella enterica in poultry and eggs in Uruguay during an epidemic due to Salmonella enterica serovar Enteritidis. J. Clin. Microbiol. 2010, 48, 2413-2423. https://doi.org/10.1128/JCM.02137-09.

12. Galarce, N.E.; Bravo, J.L.; Robeson, J.P.; Borie, C.F. Bacteriophage cocktail reduces Salmonella enterica serovar Enteritidis counts in raw and smoked salmon tissues. Rev. Argent. Microbiol. 2014, 46, 333-337. https://doi.org/10.1016/S0325-7541(14)70092-6.

13. European Food Safety Authority; European Centre for Disease Prevention and Control. The European Union summary report on antimicrobial resistance in zoonotic and indicator bacteria from humans, animals and food in 2017. EFSA J. 2019, 17, e05598. https://doi.org/10.2903/j.efsa.2019.5598.

14. Chai, S.J.; White, P.L.; Lathrop, S.L.; Solghan, S.M.; Medus, C.; McGlinchey, B.M.; Tobin-D’Angelo, M.; Marcus, R.; Mahon, B.E. Salmonella enterica serotype Enteritidis: Increasing incidence of domestically acquired infections. Clin. Infect. Dis. 2012, 54 (Suppl. 5), S488-S497. https://doi.org/10.1093/cid/cis231.

15. De Reu, K.; Grijspeerdt, K.; Messens, W.; Heyndrickx, M.; Uyttendaele, M.; Debevere, J.; Herman, L. Eggshell factors influencing eggshell penetration and whole egg contamination by different bacteria, including Salmonella enteritidis. Int. J. Food Microbiol. 2006, 112, 253-260. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2006.04.011.

16. Arnold, M.E.; Martelli, F.; McLaren, I.; Davies, R.H. Estimation of the rate of egg contamination from Salmonella-infected chickens. Zoonoses Public Health 2014, 61, 18-27. https://doi.org/10.1111/zph.12038.

17. Saleh, S.; Van Puyvelde, S.; Staes, A.; Timmerman, E.; Barbé, B.; Jacobs, J.; Gevaert, K.; Deborggraeve, S. Salmonella Typhi, Paratyphi A, Enteritidis and Typhimurium core proteomes reveal differentially expressed proteins linked to the cell surface and pathogenicity. PLoS Negl. Trop. Dis. 2019, 13, e0007416. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0007416.

18. Li, R.; Lai, J.; Wang, Y.; Liu, S.; Li, Y.; Liu, K.; Shen, J.; Wu, C. Prevalence and characterization of Salmonella species isolated from pigs, ducks and chickens in Sichuan Province, China. Int. J. Food Microbiol. 2013, 163, 14-18. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2013.01.020.

19. Roca, I.; Akova, M.; Baquero, F.; Carlet, J.; Cavaleri, M.; Coenen, S.; Cohen, J.; Findlay, D.; Gyssens, I.; Heure, O.E.; et al. The global threat of antimicrobial resistance: Science for intervention. New Microbes New Infect. 2015, 6, 22-29. https://doi.org/10.1016/j.nmni.2015.02.007.

20. Hiltunen, T.; Virta, M.; Laine, A.-L. Antibiotic resistance in the wild: An eco-evolutionary perspective. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 2017, 372, 20160039. https://doi.org/10.1098/rstb.2016.0039.

21. Zhu, Y.; Lai, H.; Zou, L.; Yin, S.; Wang, C.; Han, X.; Xia, X.; Hu, K.; He, L.; Zhou, K.; et al. Antimicrobial resistance and resistance genes in Salmonella strains isolated from broiler chickens along the slaughtering process in China. Int. J. Food Microbiol. 2017, 259, 43-51. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2017.07.023.

22. Shah, D.H.; Paul, N.C.; Sischo, W.C.; Crespo, R.; Guard, J. Population dynamics and antimicrobial resistance of the most prevalent poultry-associated Salmonella serotypes. Poult. Sci. 2017, 96, 687-702. https://doi.org/10.3382/ps/pew342.

23. Castro-Vargas, R.E.; Herrera-Sánchez, M.P.; Rodríguez-Hernández, R.; Rondón-Barragán, I.S. Antibiotic resistance in Salmonella spp. isolated from poultry: A global overview. Vet. World 2020, 13, 2070-2084. https://doi.org/10.14202/vetworld.2020.2070-2084.

24. Igbinosa, I.H.; Amolo, C.N.; Beshiru, A.; Akinnibosun, O.; Ogofure, A.G.; El-Ashker, M.; Gwida, M.; Okoh, A.I.; Igbinosa, E.O. Identification and characterization of MDR virulent Salmonella spp. isolated from smallholder poultry production environment in Edo and Delta States, Nigeria. PLoS ONE 2023, 18, e0281329. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0281329.

25. Soubeiga, A.P.; Kpoda, D.S.; Compaoré, M.K.A.; Somda-Belemlougri, A.; Kaseko, N.; Rouamba, S.S.; Ouedraogo, S.; Traoré, R.; Karfo, P.; Nezien, D.; et al. Molecular Characterization and the Antimicrobial Resistance Profile of Salmonella spp. Isolated from Ready-to-Eat Foods in Ouagadougou, Burkina Faso. Int. J. Microbiol. 2022, 2022, 9640828. https://doi.org/10.1155/2022/9640828.

26. Urban-Chmiel, R.; Marek, A.; Stępień-Pyśniak, D.; Wieczorek, K.; Dec, M.; Nowaczek, A.; Osek, J. Antibiotic Resistance in Bacteria-A Review. Antibiotics 2022, 11, 1079. https://doi.org/10.3390/antibiotics11081079.

27. Hammad, A.M.; Shimamoto, T. Towards a compatible probiotic-antibiotic combination therapy: Assessment of antimicrobial resistance in the Japanese probiotics. J. Appl. Microbiol. 2010, 109, 1349-1360. https://doi.org/10.1111/j.1365-2672.2010.04762.x.

28. Heider, L.C.; Funk, J.A.; Hoet, A.E.; Meiring, R.W.; Gebreyes, W.A.; Wittum, T.E. Identification of Escherichia coli and Salmonella enterica organisms with reduced susceptibility to ceftriaxone from fecal samples of cows in dairy herds. Am. J. Vet. Res. 2009, 70, 389-393. https://doi.org/10.2460/ajvr.70.3.389.

29. Alcaine, S.D.; Warnick, L.D.; Wiedmann, M. Antimicrobial resistance in nontyphoidal Salmonella. J. Food Prot. 2007, 70, 780-790. https://doi.org/10.4315/0362-028x-70.3.780.

30. Adetoye, A.; Pinloche, E.; Adeniyi, B.A.; Ayeni, F.A. Characterization and anti-salmonella activities of lactic acid bacteria isolated from cattle faeces. BMC Microbiol. 2018, 18, 96. https://doi.org/10.1186/s12866-018-1248-y.

31. Chen, C.-C.; Lai, C.-C.; Huang, H.-L.; Huang, W.-Y.; Toh, H.-S.; Weng, T.-C.; Chuang, Y.-C.; Lu, Y.-C.; Tang, H.-J. Antimicrobial Activity of Lactobacillus Species Against Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae. Front. Microbiol. 2019, 10, 789. https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.00789.

32. Cordeiro, M.A.; Souza, E.L.S.; Arantes, R.M.E.; Balthazar, C.F.; Guimarães, J.T.; Scudino, H.; Silva, H.L.A.; Rocha, R.S.; Freitas, M.Q.; Esmerino, E.A.; et al. Fermented whey dairy beverage offers protection against Salmonella enterica ssp. enterica serovar Typhimurium infection in mice. J. Dairy Sci. 2019, 102, 6756-6765. https://doi.org/10.3168/jds.2019-16340.

33. KR20120023480 (А) 2012

34. KR101197203 2012

35. SG11201504787V (A), 2015

36. RU 2190015

37. WO 2012/022773

38. RU 2617946 C1

39. ЛК-102065580-B1

40. CN112813002B

41. Jeon HL, Lee NK, Yang SJ, Kim WS, Paik HD. Probiotic characterization of Bacillus subtilis P223 isolated from kimchi. Food Sci Biotechnol. 2017. 26:1641-1648.

42. Lee NK, Han KJ, Son SH, Eom SJ, Lee SK, Paik HD. Multifunctional effect of probiotic Lactococcus lactis KC24 isolated from kimchi. LWT-Food Sci Technol.2015. 64:1036-1041.

Изобретение относится к области биотехнологии. Заявленный штамм Levilactobacillu brevis ВКШМ-Г-07ПД, обладает антагонистической активностью по отношению к антибиотикорезистентным штаммам Salmonella Enteritidis и Salmonella Typhimurium. Штамм проявляет высокую устойчивость к желудочному и кишечному стрессам и эффективную адгезию к Caco-2 энтероцитам человека, IPEC-J2 энтероцитам свиньи и CPCE энтероцитам курицы. Штамм L. brevis ВКШМ-Г-07ПД способен к аутоагрегации и ко-агрегации с патогенами S. Enteritidis и S. Typhimurium. Штамм L. brevis ВКШМ-Г-07ПД может быть использован в качестве пробиотической кормовой добавки для снижения распространения сальмонеллёзных инфекций среди сельскохозяйственных животных и снижения возможностей передачи этих инфекций человеку. 5 табл., 5 пр.

Штамм бактерий Levilactobacillu brevis, депонированный в ФГБУ «ВГНКИ» под регистрационным номером ВКШМ-Г-07ПД, обладающий антагонистической активностью по отношению к антибиотикорезистентным штаммам Salmonella Enteritidis и Salmonella Typhimurium, включая штаммы с множественной лекарственной устойчивостью.