ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2024 года по МПК C07K16/00 C07K16/10 A61K39/00 

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Настоящая заявка заявляет приоритет предварительной заявки на патент США № 62/370201, поданной 2 августа 2016, и предварительной заявки на патент США № 62/485671, поданной 14 апреля 2017. Содержание вышеуказанных заявок в полном объеме включено здесь посредством ссылки.

Список последовательностей

Настоящая заявка содержит список последовательностей, который был представлен в электронном виде в формате ASCII и в полном объеме включен здесь посредством ссылки. Указанная копия ASCII, созданная 1 августа 2017 года, носит название P2029-7014WO_SL.txt и имеет размер 3490 байт.

Уровень техники

Лекарственные средства на основе моноклональных антител представляют собой класс иммунотерапевтических препаратов, которые включают моноклональные антитела (mAb), способные специфически взаимодействовать с биологическими молекулами, связанными с заболеваниями. В последние годы перечень заболеваний, на которые можно нацеливать терапевтические антитела, значительно расширился, и ряд моноклональных антител и продуктов на основе производных антител был официально одобрен для терапевтического применения в Соединенных Штатах и многих других странах. Лекарственные средства на основе моноклональных антител в настоящее время используются или проходят испытания для лечения различных заболеваний или патологических состояний, включая, например, инфекционные заболевания, рак, иммунные заболевания, трансплантацию органов, сердечно-сосудистые заболевания и метаболические заболевания.

Эффективность моноклональных антител может достигаться посредством различных механизмов действия (Suzuki et al., J. Toxicol. Pathol. 2015, 28 (3): 133-139). Многие терапевтические антитела нейтрализуют патофизиологическую функцию их молекул-мишеней или клеток-мишеней. В последние годы моноклональные антитела, которые блокируют иммунные контрольные точки, применяли для усиления противоопухолевого иммунитета у пациентов с онкологическими заболеваниями, которые потенциально могут вызывать длительные клинические ответы. Некоторые моноклональные антитела могут «запускать» антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксическую (ADCC) активность или комплементзависимую цитотоксическую (CDC) активность. Моноклональные антитела также можно использовать в качестве носителей для доставки лекарственных средств, например, когда они конъюгированы с радиоизотопами, токсинами или другими терапевтическими или диагностическими агентами.

С учетом способности моноклональных антител и продуктов на основе производных антител модулировать различные биологические функции, существует необходимость в разработке новых подходов к получению полипептидов (например, молекул антител или слитых белков), подходящих для лечения, профилактики и диагностики расстройств.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает, по меньшей мере, частично, полипептиды (например, молекулы антител или слитые белки), которые содержат Fc-область иммуноглобулина и которые имеют одно или более структурных или функциональных свойств, раскрытых здесь. В одном варианте осуществления также обеспечиваются молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептиды, экспрессионные векторы, клетки-хозяева, композиции (например, фармацевтические композиции), наборы, контейнеры и способы получения полипептидов (например, молекул антител или слитых белков). Полипептиды (например, молекулы антител или слитые белки), раскрытые в данном документе, можно использовать (самостоятельно или в комбинации с другими агентами или способами лечения) для лечения, профилактики и/или диагностики расстройств, таких как расстройства и патологические состояния, раскрытые здесь.

В одном аспекте изобретение относится к полипептиду, например, молекуле антитела или слитому белку, содержащим Fc-область, где Fc-область содержит мутацию, и где полипептид имеет одно или более (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или все) из следующих свойств:

а) имеет повышенную аффинность связывания (например, пониженную константу диссоциации (Kd)) для неонатального Fc-рецептора (FcRn), например, при рН между 6,0 и 6,5 (например, при рН 6,0), например, по меньшей мере, в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40 или 50 раз выше по сравнению с эталонным полипептидом, например, как определено анализом на основе системы Octet или клеточным анализом;

b) имеет более высокую аффинность связывания (например, более низкую константу диссоциации (Kd)) для FcRn при рН от 6,0 до 6,5 (например, при рН 6,0), например, по меньшей мере, в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или в 50 раз выше, чем аффинность связывания при рН от 7,0 до 7,4 (например, при рН 7,4), например, как определено анализом на основе системы Octet или клеточным анализом;

c) связывается с FcRn с высокой аффинностью, например, при рН от 6,0 до 6,5 (например, при рН 6,0), например, с константой диссоциации (K_d), равной 300 нМ или ниже, например, 250 нМ или ниже, 200 нМ или ниже, 150 нМ или ниже, 100 нМ или ниже, 50 нМ или ниже, например, 25 нМ или ниже, 10 нМ или ниже, 5 нМ или ниже, 2 нМ или ниже, 1 нМ или ниже, 0,5 нМ или ниже, 0,2 нМ или ниже, 0,1 нМ или ниже, 0,05 нМ или ниже, 0,02 нМ или ниже или 0,01 нМ или ниже, например, от 25 нМ до 0,1 нМ, от 20 нМ до 0,5 нМ, от 15 нМ до 1 нМ, от 10 нМ до 5 нМ или от 20 нМ до 10 нМ, например, как определено анализом на основе системы Octet или клеточным анализом;

d) связывается с FcRn с низкой аффинностью, например, при pH от 7,0 до 7,4 (например, при pH 7,4), например, с K_d, равной 50 нМ или выше, например, 60 нМ или выше, 80 нМ или выше, 100 нМ или выше, 150 нМ или выше, 200 нМ или выше, 500 нМ или выше, например, от 50 нМ до 500 нМ или от 100 нМ до 250 нМ, например, как определено анализом на основе системы Octet или клеточным анализом;

e) имеет одинаковую аффинность связывания, аффинность связывания, которая существенно не изменяется (например, уменьшается или увеличивается не более чем на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%) или аффинность связывания, которая повышается (например, по меньшей мере, в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или 50 раз) для рецептора Fcγ (например, одного, двух или всех FcγRI, FcγRIIa/b или FcγRIII), по сравнению с эталонным полипептидом, например, как определено анализом на основе системы Octet или клеточным анализом;

f) имеет одинаковую термостабильность или термостабильность, которая существенно не изменяется (например, температура плавления повышается или снижается не более чем на 1°С, 2°С, 3°С, 4°С, 5°С, 6°С, 7°С, 8°С, 9°С или 10°С), по сравнению с эталонным полипептидом, например, как определено анализом с красителем Sypro Orange;

g) имеет одинаковую аффинность связывания, аффинность связывания, которая существенно не изменяется (например, уменьшается или увеличивается не более чем на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%) или аффинность связывания, которая повышается (например, по меньшей мере, в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или 50 раз) для C1q, по сравнению с эталонным полипептидом, например, как определено с использованием ELISA;

h) имеет одинаковую аффинность связывания, аффинность связывания, которая существенно не изменяется (например, уменьшается или увеличивается не более чем на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%) или аффинность связывания, которая повышается (например, по меньшей мере, в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или 50 раз) для TRIM21, по сравнению с эталонным полипептидом, например, как определено с использованием ELISA;

i) имеет одинаковую эффекторную функцию или эффекторную функцию, которая существенно не изменяется (например, уменьшается или увеличивается не более чем на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%) или эффекторную функцию, которая повышается (например, по меньшей мере, в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или 50 раз), например, в одном или более (например, двух, трех или всех) из комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC), антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC), антителозависимого клеточно-опосредованного фагоцитоза (ADCP) или антителозависимой внутриклеточной нейтрализации (ADIN), по сравнению с эталонным полипептидом;

j) имеет увеличенный период полураспада in vivo, например, по меньшей мере, в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз выше по сравнению с эталонным полипептидом, например, как определено на животной модели;

k) имеет одинаковую биологическую функцию, биологическую фукнцию, которая существенно не изменяется (например, уменьшается или увеличивается не более чем на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%) или биологическую функцию, которая повышается (например, по меньшей мере, в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или 50 раз) in vitro, ex vivo или in vivo по сравнению с эталонным полипептидом;

l) имеет одинаковые показатели для развития, показатели для развития, которые существенно не изменяются (например, уменьшаются или увеличиваются не более чем на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%) или показатели для развития, которые повышаются (например, по меньшей мере, в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или 50 раз), например, в одном или более (например, двух, трех или всех) из стабильности, растворимости, агрегации или уровня экспрессии по сравнению с эталонным полипептидом;

m) имеет одинаковую аффинность, специфичность связывания, или обе, или аффинность, специфичность связывания, или обе, которая существенно не изменяется (например, уменьшается или увеличивается не более чем на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80 % или 90%), или аффинность, специфичность связывания, или обе, которая повышается (например, по меньшей мере, в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или 50 раз) для эпитопа по сравнению с эталонным полипептидом; или

n) имеет повышенное поглощение слизистой, например, по меньшей мере, в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40 или 50 раз по сравнению с эталонным полипептидом, например, как определено анализом трансцитоза.

В одном варианте осуществления полипептид имеет повышенную аффинность связывания (например, пониженную константу диссоциации (K_d)) для неонатального Fc-рецептора (FcRn), например, при рН между 6,0 и 6,5 (например, при рН 6,0), например, по меньшей мере, в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40 или 50 раз выше по сравнению с эталонным полипептидом, например, как определено анализом на основе системы Octet или клеточным анализом.

В одном варианте осуществления полипептид имеет более высокую аффинность связывания (например, более низкую константу диссоциации (K_d)) для FcRn при рН от 6,0 до 6,5 (например, при рН 6,0), например, по меньшей мере, в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или в 50 раз выше, чем аффинность связывания при рН от 7,0 до 7,4 (например, при рН 7,4), например, как определено анализом на основе системы Octet или клеточным анализом.

В одном варианте осуществления полипептид связывается с FcRn с высокой аффинностью, например, при рН от 6,0 до 6,5 (например, при рН 6,0), например, с константой диссоциации (K_d), равной 300 нМ или ниже, например, 250 нМ или ниже, 200 нМ или ниже, 150 нМ или ниже, 100 нМ или ниже, 50 нМ или ниже, например, 25 нМ или ниже, 10 нМ или ниже, 5 нМ или ниже, 2 нМ или ниже, 1 нМ или ниже, 0,5 нМ или ниже, 0,2 нМ или ниже, 0,1 нМ или ниже, 0,05 нМ или ниже, 0,02 нМ или ниже или 0,01 нМ или ниже, например, от 25 нМ до 0,1 нМ, от 20 нМ до 0,5 нМ, от 15 нМ до 1 нМ, от 10 нМ до 5 нМ или от 20 нМ до 10 нМ, например, как определено анализом на основе системы Octet или клеточным анализом.

В одном варианте осуществления полипептид связывается с FcRn с низкой аффинностью, например, при pH от 7,0 до 7,4 (например, при pH 7,4), например, с K_d, равной 50 нМ или выше, например, 60 нМ или выше, 80 нМ или выше, 100 нМ или выше, 150 нМ или выше, 200 нМ или выше, 500 нМ или выше, например, от 50 нМ до 500 нМ или от 100 нМ до 250 нМ, например, как определено анализом на основе системы Octet или клеточным анализом.

В одном варианте осуществления полипептид имеет одинаковую аффинность связывания, аффинность связывания, которая существенно не изменяется (например, уменьшается или увеличивается не более чем на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%) или аффинность связывания, которая повышается (например, по меньшей мере, в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или 50 раз) для рецептора Fcγ (например, одного, двух или всех FcγRI, FcγRIIa/b или FcγRIII), по сравнению с эталонным полипептидом, например, как определено анализом на основе системы Octet или клеточным анализом.

В одном варианте осуществления полипептид имеет одинаковую термостабильность или термостабильность, которая существенно не изменяется (например, температура плавления увеличивается или уменьшается не более чем на 1°С, 2°С, 3°С, 4°С, 5°С, 6°С, 7°С, 8°С, 9°С или 10°С) по сравнению с эталонным полипептидом, например, как определено анализом с красителем Sypro Orange.

В одном варианте осуществления полипептид имеет одинаковую аффинность связывания, аффинность связывания, которая существенно не изменяется (например, уменьшается или увеличивается не более чем на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%) или аффинность связывания, которая повышается (например, по меньшей мере, в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или 50 раз) для C1q, по сравнению с эталонным полипептидом, например, как определено с использованием ELISA.

В одном варианте осуществления полипептид имеет одинаковую аффинность связывания, аффинность связывания, которая существенно не изменяется (например, уменьшается или увеличивается не более чем на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%) или аффинность связывания, которая повышается (например, по меньшей мере, в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или 50 раз) для TRIM21, по сравнению с эталонным полипептидом, например, как определено с использованием ELISA.

В одном варианте осуществления полипептид имеет одинаковую эффекторную функцию или эффекторную функцию, которая существенно не изменяется (например, уменьшается или увеличивается не более чем на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%) или эффекторную функцию, которая повышается (например, по меньшей мере, в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или 50 раз), например, в одном или более (например, двух, трех или всех) из комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC), антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC), антителозависимого клеточно-опосредованного фагоцитоза (ADCP) или антителозависимой внутриклеточной нейтрализации (ADIN), по сравнению с эталонным полипептидом.

В одном варианте осуществления полипептид имеет увеличенный период полураспада in vivo, например, по меньшей мере, в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз выше по сравнению с эталонным полипептидом, например, как определено на животной модели.

В одном варианте осуществления полипептид имеет одинаковую биологическую функцию, биологическую функцию, которая существенно не изменяется (например, уменьшается или увеличивается не более чем на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%) или биологическую функцию, которая повышается (например, по меньшей мере, в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или 50 раз) in vitro, ex vivo или in vivo по сравнению с эталонным полипептидом. В одном варианте осуществления биологическая функция включает ингибирующую (например, нейтрализующую) активность. В одном варианте осуществления биологическая функция включает ингибирование (например, нейтрализацию) патогена, например, вируса, бактерии или гриба. В одном варианте осуществления биологическая функция включает противоопухолевую активность. В одном варианте осуществления биологическая функция включает ингибирование иммунного ответа. В одном варианте осуществления биологическая функция включает агонистическую активность. В одном варианте осуществления биологическая функция включает активацию или восстановление иммунного ответа.

В одном варианте осуществления полипептид имеет одинаковые показатели для развития, показатели для развития, которые существенно не изменяются (например, уменьшаются или увеличиваются не более чем на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%) или показатели для развития, которые повышаются (например, по меньшей мере, в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или 50 раз), например, в одном или более (например, двух, трех или всех) из стабильности, растворимости, агрегации или уровня экспрессии по сравнению с эталонным полипептидом.

В одном варианте осуществления полипептид имеет одинаковую аффинность, специфичность связывания, или обе, или аффинность, специфичность связывания, или обе, которая существенно не изменяется (например, уменьшается или увеличивается не более чем на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80 % или 90%), или аффинность, специфичность связывания, или обе, которая повышается (например, по меньшей мере, в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или 50 раз) для эпитопа по сравнению с эталонным полипептидом.

В одном варианте осуществления полипептид имеет повышенное поглощение слизистой, например, по меньшей мере, в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40 или 50 раз по сравнению с эталонным полипептидом, например, как определено анализом трансцитоза.

В одном варианте осуществления полипептид имеет свойства а) или b), указанные выше. В одном варианте осуществления полипептид имеет свойства а) и b), указанные выше. В одном варианте осуществления полипептид имеет одно или оба свойства а) или b), указанные выше, и одно или оба свойства с) или d), указанные выше. В одном варианте осуществления полипептид имеет одно или оба свойства а) или b), указанные выше и одно, два, три, четыре или все свойства е), f), g), h) или i), указанные выше. В одном варианте осуществления полипептид имеет одно или оба свойства а) или b), указанные выше, и одно или оба свойства с) или d), указанные выше. В одном варианте осуществления полипептид имеет одно или оба свойства а) или b), указанные выше, и одно, два, три, четыре, пять, шесть или все свойства с), d), j), k), l), m) или n), указанные выше. В одном варианте осуществления полипептид имеет одно или оба свойства а) или b), указанные выше, одно, два, три, четыре или все свойства е), f), g), h) или i), указанные выше, и одно, два, три, четыре, пять, шесть или все свойства c), d), j), k), l), m) или n), указанные выше. В одном варианте осуществления полипептид имеет одно, два, три или все свойства a), b), c) или d), указанные выше, одно, два, три, четыре или все свойства e), f), g), h) или i), указанные выше, и одно, два, три, четыре или все свойства j), k), l), m) или n), указанные выше. В одном варианте осуществления полипептид имеет одно или оба свойства a) или c), указанные выше, одно или оба свойства b) или d), указанные выше, одно, два, три, четыре или все свойства e), f), g), h) или i), указанные выше, и одно, два, три, четыре или все свойства j), k), l), m) или n), указанные выше.

В одном варианте осуществления эталонный полипептид представляет собой идентичный в других отношениях полипептид без мутации, например, содержащий Fc-область дикого типа, например, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или аминокислотную последовательность, по меньшей мере, примерно на 85% 90%, 95%, 99% или более идентичную ей, или которая отличается не более чем на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 15 аминокислотных остатков.

В одном варианте осуществления мутация находится в остатке в домене CH2. В еще одном варианте осуществления мутация находится в остатке в домене СН3. В одном варианте осуществления полипептид содержит, по меньшей мере, одну мутацию в остатке в домене СН2, и по меньшей мере, одну мутацию в остатке в домене СН3. В одном варианте осуществления полипептид дополнительно содержит мутацию в остатке в области, отличной от домена СН2 и/или домена СН3.

В одном варианте осуществления мутация не изменяет или по существу не изменяет конформацию линкерной области между доменами CH2 и CH3. В одном варианте осуществления мутация не вводит кластер (например, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более последовательных) гидрофобных или ароматических остатков, например, в поверхностной области (например, области, определенной как область, включающую аминокислотные остатки, которые составляют более 20% доступной для растворителя области).

В одном варианте осуществления полипептид представляет собой молекулу антитела, например, молекулу антитела, описанную здесь.

В одном варианте осуществления полипептид представляет IgG, например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. В одном варианте осуществления полипептид представляет IgG1. В одном варианте осуществления полипептид представляет IgG4.

В одном варианте осуществления полипептид содержит вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина или обе. В одном варианте осуществления полипептид включает тетрамер из двух вариабельных областей тяжелой цепи иммуноглобулина и двух вариабельных областей легкой цепи иммуноглобулина. В одном варианте осуществления полипептид включает молекулу полноразмерного антитела. В одном варианте осуществления полипептид включает фрагмент (например, антигенсвязывающий фрагмент) молекулы антитела.

В одном варианте осуществления полипептид включает молекулу химерного антитела. В одном варианте осуществления полипептид включает молекулу гуманизированного антитела. В одном варианте осуществления полипептид включает молекулу человеческого антитела. В одном варианте осуществления полипептид включает молекулу мышиного антитела. В одном варианте осуществления полипептид включает молекулу биспецифического или мультиспецифического антитела.

В еще одном варианте осуществления полипептид представляет слитый белок, например, слитый белок, описанный здесь. В одном варианте осуществления полипептид содержит фрагмент (например, функциональный фрагмент) слитого полипептида.

В одном варианте осуществления полипептид включает одно или более (например, 2, 3, 4 или все) из следующего:

(i) мутации в остатке в поверхностной области (например, области, определенной как область, включающая аминокислотные остатки, которые составляют более 20% доступной для растворителя области), которая взаимодействует с FcRn, например, контактным остатком FcRn;

(ii) мутации в остатке, который является периферическим остатком вдоль поверхности раздела Fc-FcRn (например, любые аминокислотные остатки на поверхности Fc-области, которые находятся на расстоянии менее 7 от FcRn в комплексе Fc-FcRn);

(iii) мутации, которая находится в остатке, который не является контактным остатком в связывании Fc-FcRn;

(iv) мутации в остатке, который представляет контактный остаток спирали, которая усиливает конформационную динамику 250-спирали, например, спирали, содержащей одно или более (например, 2, 3, 4, 5 или все) из P247, K248 , D249, T250, L251 или M252; или

(v) мутации, которая модулирует pK гистидина и/или представляет введение гистидина вдоль поверхности раздела Fc-FcRn (например, любые аминокислотные остатки на поверхности Fc-области, которые находятся на расстоянии менее чем 7 от FcRn в комплексе Fc-FcRn).

В одном варианте осуществления полипептид содержит (i) и (ii), указанные выше. В одном варианте осуществления полипептид содержит (i) и (iii), указанные выше. В одном варианте осуществления полипептид содержит (i) и (iv), указанные выше. В одном варианте осуществления полипептид содержит (i) и (v), указанные выше. В одном варианте осуществления полипептид содержит (ii) и (iii), указанные выше. В одном варианте осуществления полипептид содержит (ii) и (iv), указанные выше. В одном варианте осуществления полипептид содержит (ii) и (v), указанные выше. В одном варианте осуществления полипептид содержит (iii) и (iv), указанные выше. В одном варианте осуществления полипептид содержит (iii) и (v), указанные выше. В одном варианте осуществления полипептид содержит (iv) и (v), указанные выше.

В одном варианте осуществления полипептид содержит (i), (ii) и (iii), указанные выше. В одном варианте осуществления полипептид содержит (i), (ii) и (iv), указанные выше. В одном варианте осуществления полипептид содержит (i), (ii) и (v), указанные выше. В одном варианте осуществления полипептид содержит (i), (iii) и (iv), указанные выше. В одном варианте осуществления полипептид содержит (i), (iii) и (iv), указанные выше. В одном варианте осуществления полипептид содержит (i), (iv) и (v), указанные выше. В одном варианте осуществления полипептид содержит (ii), (iii) и (iv), указанные выше. В одном варианте осуществления полипептид содержит (ii), (iii) и (v), указанные выше. В одном варианте осуществления полипептид содержит (ii), (iv) и (v), указанные выше. В одном варианте осуществления полипептид содержит (iii), (iv) и (v), указанные выше.

В одном варианте осуществления полипептид содержит (i), (ii), (iii) и (iv), указанные выше. В одном варианте осуществления полипептид содержит (i), (ii), (iii) и (v), указанные выше. В одном варианте осуществления полипептид содержит (i), (ii), (iv) и (v), указанные выше. В одном варианте осуществления полипептид содержит (i), (iii), (iv) и (v), указанные выше. В одном варианте осуществления полипептид содержит (ii), (iii), (iv) и (v), указанные выше.

В одном варианте осуществления полипептид содержит (i), (ii), (iii), (iv) и (v), указанные выше.

В одном варианте осуществления полипептид содержит мутацию в остатке в поверхностной области (например, области, определенной как область, включающая аминокислотные остатки, которые составляют более 20% доступной для растворителя области), которая взаимодействует с FcRn, например, контактным остатком FcRn.

В одном варианте осуществления мутация находится в остатке, выбранном из: L251, I253, R255, P257, H285, N286, K288, T307, V308, L309, Q311, L314, H310, H433, N434, H435 или Y436. В одном варианте осуществления полипептид содержит множество мутаций в двух или более (например, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или всех) остатках, выбранных из L251, I253, R255, P257, H285, N286, K288, T307, V308, L309, Q311, L314, H310, H433, N434, H435 или Y436.

В одном варианте осуществления полипептид содержит мутацию в остатке, который представляет собой периферический остаток вдоль поверхности раздела Fc-FcRn (например, любые аминокислотные остатки на поверхности Fc-области, которые находятся на расстоянии менее чем 7 от FcRn в комплексе Fc-FcRn).

В одном варианте осуществления мутация находится в остатке, выбранном из одного или более (например, 2, 3, 4, 5, 6 или всех) из T256, H285, N286, T307, Q311, N315 или A378. В одном варианте осуществления полипептид содержит множество мутаций в двух или более (например, 2, 3, 4, 5, 6 или всех) остатках, выбранных из T256, H285, N286, T307, Q311, N315 или A378. В одном варианте осуществления полипептид содержит одну или более (например, 2, 3, 4, 5, 6 или все) мутаций, выбранных из T256D, H285N, N286D, T307Q, Q311V, N315D или A378V.

В одном варианте осуществления мутация находится в остатке, выбранном из T256, Q311 или A378. В одном варианте осуществления полипептид содержит множество мутаций в двух или всех остатках, выбранных из T256, Q311 или A378. В одном варианте осуществления полипептид содержит одну, две или все мутации, выбранные из T256D, Q311V или A378V.

В одном варианте осуществления мутация находится в остатке, выбранном из H285, T307 или N315. В одном варианте осуществления полипептид содержит множество мутаций в двух или всех остатках, выбранных из H285, T307 или N315. В одном варианте осуществления полипептид содержит одну, две или все мутации, выбранные из H285N, T307Q или N315D.

В одном варианте осуществления мутация находится в остатке, выбранном из H285, T307 или A378. В одном варианте осуществления полипептид содержит множество мутаций в двух или всех остатках, выбранных из H285, T307 или A378. В одном варианте осуществления полипептид содержит одну, две или все мутации, выбранные из H285D, T307Q или A378V.

В одном варианте осуществления мутация находится в остатке, выбранном из T307, Q311 или A378. В одном варианте осуществления полипептид содержит множество мутаций в двух или всех остатках, выбранных из T307, Q311 или A378. В одном варианте осуществления полипептид содержит одну, две или все мутации, выбранные из T307Q, Q311V или A378V.

В одном варианте осуществления мутация находится в остатке, выбранном из T256, N286, T307, Q311 или A378. В одном варианте осуществления полипептид содержит множество мутаций в двух, трех, четырех или всех остатках, выбранных из T256, N286, T307, Q311 или A378. В одном варианте осуществления полипептид содержит одну, две, три, четыре или все мутации, выбранные из T256D, N286D, T307R, Q311V или A378V.

В одном варианте осуществления мутация находится в остатке, выбранном из T256, H285, T307, Q311 или A378. В одном варианте осуществления полипептид содержит множество мутаций в двух, трех, четырех или всех остатках, выбранных из T256, H285, T307, Q311 или A378. В одном варианте осуществления полипептид содержит одну, две, три, четыре или все мутации, выбранные из T256D, H285D, T307R, Q311V или A378V.

В одном варианте осуществления мутация находится в остатке, выбранном из M252, T256, T307, L309, Q311, H433, N434, Y436, N286 или K288. В одном варианте осуществления полипептид содержит множество мутаций в двух или более (например, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или всех) остатках, выбранных из M252, T256, T307, L309, Q311, H433, N434, Y436, N286 или K288.

В варианте осуществления полипептид содержит мутацию в остатке, который не является контактным остатком в связывании Fc-FcRn.

В одном варианте осуществления мутация находится в остатке, выбранном из A287, V308, N315, L314, L432, H429, E430 или A431. В одном варианте осуществления полипептид содержит множество мутаций в двух или более (например, 3, 4, 5, 6, 7 или всех) остатках, выбранных из A287, V308, N315, L314, L432, H429, E430, или А431.

В одном варианте осуществления полипептид содержит мутацию в остатке, который представляет спиральный контактный остаток, который усиливает конформационную динамику 250-спирали (например, спирали, содержащей одну или более (например, 2, 3, 4, 5 или все) P247, K248, D249, T250, L251 или M252), например, латеральное смещение или конформационная гибкость, проявляемая 250-спиралью (например, как показано сравнением кристаллических структур Fc-области, кристаллизованных при pH 5,0 (ID PDB:4J12) и при рН 6,5 (ID PDB:4Q7D).

В одном варианте осуществления мутация находится в остатке, выбранном из P244, P245, T250, L251, P247, E380, M428, A378, D376, P257, V308, A287, L306 или H427. В одном варианте осуществления полипептид содержит множество мутаций в двух или более (например, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или всех) остатках, выбранных из P244, P245, T250, L251, P247, E380, M428, A378, D376, P257, V308, A287, L306 или H427.

В одном варианте осуществления полипептид содержит мутацию, которая представляет собой введение гистидина вдоль поверхности раздела Fc-FcRn (например, любые аминокислотные остатки на поверхности Fc-области, которые находятся на расстояние менее чем 7 от FcRn в комплексе Fc-FcRn).

В одном варианте осуществления мутация вводит полярный аминокислотный остаток. В еще одном варианте осуществления мутация вводит неполярный аминокислотный остаток. В одном варианте осуществления мутация вводит заряженный аминокислотный остаток. В еще одном варианте осуществления мутация вводит незаряженный аминокислотный остаток. В одном варианте осуществления мутация вводит положительно заряженный (или основный) аминокислотный остаток. В еще одном варианте осуществления мутация вводит отрицательно заряженный (или кислый) аминокислотный остаток. В одном варианте осуществления мутация вводит гидрофобный аминокислотный остаток. В еще одном варианте осуществления мутация вводит гидрофильный аминокислотный остаток.

В одном варианте осуществления полипептид содержит мутацию, по меньшей мере, в одном (например, 2, 3, 4, 5 или более) контактном остатке FcRn. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутацию в одном или более (например, 2 или всех) остатках T256, T307 или N286. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации в остатках T256 и T307, необязательно, дополнительно содержит мутацию в остатке N286. В одном варианте осуществления мутация в остатке T256 представляет полярный остаток, например, выбранный из T256D, T256E или T256R. В одном варианте осуществления мутация в остатке T256 представляет T256D. В одном варианте осуществления мутация в остатке T307 представляет полярный остаток, например, выбранный из T307D, T307E или T307R. В одном варианте осуществления мутация в остатке T307 представляет T307R. В одном варианте осуществления мутация в остатке N286 представляет N286I. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации T256D и T307R. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации T256D, T307R и N286I.

В одном варианте осуществления полипептид содержит мутацию, по меньшей мере, в одном (например, 2, 3, 4, 5 или более) контактном остатке FcRn. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутацию в одном или более (например, 2 или всех) остатках L309, D312 или N315. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутацию в остатке L309, необязательно, дополнительно содержит мутации в остатках D312 и N315. В одном варианте осуществления мутация в остатке L309 представляет L309N. В одном варианте осуществления мутация в остатке D312 представляет D312A. В одном варианте осуществления мутация в остатке N315 представляет N315D. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутацию L309N. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации L309N, D312A и N315D.

В одном варианте осуществления полипептид содержит мутацию, по меньшей мере, в одном (например, 1, 2, 3, 4, 5 или более) неконтактном остатке FcRn. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутацию в одном или более (например, 2 или всех) остатках L209R, D312 или Q311. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации в остатках L309 и D312, необязательно, дополнительно включает мутацию в остатке Q311. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутацию в остатке Q311. В одном варианте осуществления мутация в остатке L309 представляет L309R. В одном варианте осуществления мутация в остатке D312 представляет D312E. В одном варианте осуществления мутация в остатке Q311 представляет Q311P. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации L309R и D312E. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации L309R, D312E и Q311P. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутацию Q311P.

В одном варианте осуществления полипептид содержит мутацию, по меньшей мере, в одном (например, 2, 3, 4, 5 или более) контактном остатке FcRn. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутацию в одном или более (например, 2, 3 или 4) остатках, выбранных из I253, S254, M252 или R255. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутацию в остатке I253. В одном варианте осуществления мутация в остатке I253 представляет I253M. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутацию в остатке S254. В одном варианте осуществления мутация в остатке S254 представляет S254H или S254M. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации в остатках M252 и S254. В одном варианте осуществления мутация в остатке M252 представляет M252E. В одном варианте осуществления мутация в остатке S254 представляет S254R. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации в остатках M252, S254 и R255. В одном варианте осуществления мутация в остатке M252 представляет M252E. В одном варианте осуществления мутация в остатке S254 представляет S254R. В одном варианте осуществления мутация в остатке R255 представляет R255Y.

В одном варианте осуществления полипептид содержит мутацию, по меньшей мере, в одном (например, 2, 3, 4, 5 или более) неконтактном остатке FcRn. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации, которые эквивалентны T250Q и M34L. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутацию в одном или более (например, 2, 3, 4 или всех) остатках, выбранных из D376, K248, E380, M428 или A328. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутацию в остатке D376 и мутацию в остатке, выбранном из K248, E380, M428 или A328. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутацию в остатке D376 и мутацию в остатке K248. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутацию в остатке D376 и мутацию в остатке E380. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутацию в остатке D376 и мутацию в остатке M428. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутацию в остатке D376 и мутацию в остатке A328. В одном варианте осуществления мутация в остатке D376 представляет D376Q или D376N. В одном варианте осуществления мутация в остатке K248 представляет K248S. В одном варианте осуществления мутация в остатке E380 представляет E380A. В одном варианте осуществления мутация в остатке D376 представляет D376Q. В одном варианте осуществления мутация в остатке M428 представляет M428L. В одном варианте осуществления мутация в остатке A328 представляет A328I. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутацию D376Q или D376N и мутацию K248S. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутацию D376Q или D376N и мутацию E380A. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации D376Q и M428L. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации D376Q и A328I.

В одном варианте осуществления полипептид содержит мутацию, по меньшей мере, в одном (например, 2, 3, 4, 5 или более) неконтактном остатке FcRn. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутацию в одном или более (например, 2 или всех) остатках, выбранных из K246, P247 или D376. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутацию в остатке K246 и мутацию в остатке P247, необязательно, дополнительно включает мутацию в остатке D376. В одном варианте осуществления мутация в остатке K246 представляет K246N. В одном варианте осуществления мутация в остатке P247 представляет P247A. В одном варианте осуществления мутация в остатке D376 представляет D376N. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации K246N и P247A, необязательно, дополнительно включает мутацию D376N.

В одном варианте осуществления полипептид содержит мутацию в одном или более (например, 2, 3, 4, 5, 6 или всех) остатках, выбранных из T256, T307, N286, A287, P257, Q311 или P247. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации в остатках T256, T307, N286 и A287. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации в остатках T256, T307 и P257. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации в остатках T256, T307 и Q311. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации в остатках T256, T307 и P247. В одном варианте осуществления мутация в остатке T256 представляет T256D. В одном варианте осуществления мутация в остатке T307 представляет T307R. В одном варианте осуществления мутация в остатке N286 представляет N286I. В одном варианте осуществления мутация в остатке A287 представляет A287S. В одном варианте осуществления мутация в остатке P257 представляет P257L. В одном варианте осуществления мутация в остатке Q311 представляет Q311V или Q311L. В одном варианте осуществления мутация в остатке P247 представляет P247D. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации T256D, T307R, N286D и A287S. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации T256D, T307R и P257L. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации T256D, T307R и Q311V или Q311L. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации T256D, T307R и P247D.

В одном варианте осуществления полипептид содержит мутацию в одном или более (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или всех) остатках, выбранных из N286, A287, P247, Q311, V308, P257, N315 или V279. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации в остатках N286, A287, P247 и Q311. В одном варианте осуществления мутация в остатке N286 представляет N286D. В одном варианте осуществления мутация в остатке A287 представляет A287S. В одном варианте осуществления мутация в остатке P247 представляет P247D. В одном варианте осуществления мутация в остатке Q311 представляет Q311V. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации в остатках V308 и P257. В одном варианте осуществления мутация в остатке V308 представляет V308N. В одном варианте осуществления мутация в остатке P257 представляет P257M. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации в остатках Q311, N315 и V279. В одном варианте осуществления мутация в остатке Q311 представляет Q311L. В одном варианте осуществления мутация в остатке N315 представляет N315T. В одном варианте осуществления мутация в остатке V279 представляет V279I.

В одном варианте осуществления полипептид содержит мутацию в одном или более (например, 2, 3 или всех) остатках, выбранных из G433 или H433, P434 или G434, G434a или H435. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации в остатках G433, P434 и H435. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации в остатках G433, P434, G434a и H435. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации в остатках H433, G434, P434a и H435.

В одном варианте осуществления полипептид содержит одну или более (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) мутаций или одну или более комбинаций мутаций, приведенных в таблице 1. Например, комбинация мутаций может включать одну или более мутаций, приведенных под названием FcMutX, и одну или более мутаций, приведенных под названием FcMutY, где X и Y представляют трехзначные числа, показанные в таблице 1, и X не равен Y.

В одном варианте осуществления полипептид содержит мутацию I253M. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации L309H, D312A и N315D. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутацию L309N. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации M252E и S254R. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации M252E, S254R и R255Y. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутацию S254H. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутацию S254M. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации T256D и T307R. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации T256L, N286I и T307I. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации T256I, N286I и T307I. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации K248S и D376Q. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации K248S и D376N. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации D376Q и E380A. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации D376N и E380A. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации D376Q и M428L. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации K248S и A378I. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутацию L314K. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутацию M252W. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутацию V308F. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации V308F и N434Y. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации T256D, T307R и D376N. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации L309R и D312E. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации L309R, Q311P и D312E. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации K246N и P247A. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации K246N, P247A и D376N. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации T256E и T307R. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации T256R и T307D. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации T256R и T307E. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутацию Q311P. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутацию D376Q. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации T256D, N286D, A287S и T307R. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации T256D, P257L и T307R. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации T256D, T307R и Q311V. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации P247D, T256D и T307R. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации P247D, N286D, A287S и Q311V. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации P257M и V308N. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации V279I, Q311L и N315T. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации H433G и N434P. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации T256D, N286D и T307R. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации T256D, N286E и T307R. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации T256D, N286Q и T307R. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации T256D, P257T и T307R. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации T256D, P257V и T307R. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации T256D, T307R и Q311I. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации T256D, T307R и Q311L. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации T256D, T307R и Q311M. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации T256D, P257L, N286D, T307R и Q311V. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутации T256D, T307R и M428L.

В одном варианте осуществления мутация является отличной от M252Y, S254T, T256E, L309N, T250Q, M428L, N434S, N434A, T307A, E380A, N434A, M252Y, S254T, T256E или их комбинации. В одном варианте осуществления мутация находится в остатке, отличном от остатка M252, S254, T256, L309, T250, M428, N434, N434, T307, E380, N434, M252, S254, T256 или их комбинации. В одном варианте осуществления полипептид не имеет одну или более (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или все) из следующих мутации или мутаций: (i) M252Y, S254T и T256E; (ii) L309N; (iii) T250Q и M428L; (iv) M428L и N434A; (v) N434A; (vi) T307A, E380A и N434A; (vii) M252W; (viii) V308F; (ix) V308F и N434Y; или (х) H435A.

В одном варианте осуществления полипептид содержит первую мутацию, выбранную из M252Y, S254T, T256E, L309N, T250Q, M428L, N434S, N434A, T307A, E380A, N434A, M252Y, S254T или T256E, и вторую мутацию, выбранную из мутаций, приведенных в таблице 1, отличных от M252Y, S254T, T256E, L309N, T250Q, M428L, N434S, N434A, T307A, E380A, N434A, M252Y, S254T и T256E.

В одном варианте осуществления полипептид содержит комбинацию мутаций, выбранных из M252Y, S254T, T256E, L309N, T250Q, M428L, N434S, N434A, T307A, E380A, N434A, M252Y, S254T или T256E, где комбинация отличается от (i) M252Y, S254T и T256E; (ii) L309N; (iii) T250Q и M428L; (iv) M428L и N434A; (v) N434A; (vi) T307A, E380A и N434A; (vii) M252W; (viii) V308F; (ix) V308F и N434Y; или (х) H435A.

В одном варианте осуществления полипептид дополнительно содержит мутацию в Fc-области, которая повышает эффекторную функцию. В одном варианте осуществления мутация находится в остатке, выбранном из S239 (например, S239D), A330 (например, A330L), I332 (например, I332E), F243 (например, F243L), G236 (например, G236A) или их комбинации, например, для повышения эффекторной функции.

В одном варианте осуществления полипептид дополнительно содержит мутацию в Fc-области, которая ослабляет эффекторную функцию. В одном варианте осуществления мутация находится в остатке, выбранном из K322 (например, K322A), L234 (например, L234A или L234F), L235 (например, L235A или L235E), P331 (например, P331S), N297 или их комбинации, например, для ослабления эффекторной функции.

В одном варианте осуществления полипептид дополнительно содержит мутацию в области, отличной от Fc-области, например, в Fab-области.

В одном варианте осуществления полипептид дополнительно содержит множество мутаций, где, по меньшей мере, одна мутация является компенсаторной мутацией, например, компенсаторной мутацией, описанной здесь.

В одном варианте осуществления полипептид представляет выделенный полипептид. В одном варианте осуществления полипептид представляет синтетический полипептид.

В одном аспекте изобретение относится к композиции, например, фармацевтической композиции, содержащей полипептид, описанный здесь. В варианте осуществления композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.

В одном аспекте изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, описанный здесь. В одном аспекте раскрытие относится к вектору, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты, описанную здесь. В одном аспекте раскрытие относится к клетке, например, выделенной клетке, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, описанную здесь, или вектор, описанный здесь. В одном аспекте настоящее изобретение относится к набору, содержащему полипептид, описанный здесь, и инструкции по применению полипептида. В одном аспекте раскрытие относится к контейнеру, содержащему полипептид, описанный здесь.

В одном аспекте изобретение относится к способу получения полипептида, описанного здесь, где способ включает культивирование клетки, описанной здесь, в условиях, которые позволяют продуцировать молекулы антитела, тем самым обеспечивая продукцию полипептид. В одном варианте осуществления способ дополнительно включает выделение или очистку полипептида.

В одном аспекте изобретение относится к способу лечения расстройства (например, расстройства, описанного здесь), где способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества полипептида, описанного здесь, или композиции, описанной здесь, тем самым обеспечивая лечение расстройства.

В одном аспекте изобретение относится к полипептиду, описанному здесь, для применения в способе лечения расстройства (например, расстройства, описанного здесь). В еще одном аспекте изобретение относится к применению полипептида, описанного здесь, в производстве лекарственного средства для лечения расстройства (например, расстройства, описанного здесь).

В одном аспекте изобретение относится к способу детектирования молекулы, где способ включает контактирование клетки или образца от субъекта с полипептидом, описанным здесь, тем самым обеспечивая детектирование молекулы.

В изобретении предусматриваются все комбинации любого одного или более из вышеуказанных аспектов и/или вариантов осуществления, а также комбинации с любым одним или более вариантами осуществления, приведенными в подробном описании и примерах.

Другие признаки, объекты и преимущества композиций и способов в данном документе будут очевидны из описания и чертежей, а также из формулы изобретения.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 показано связывание FcRn и IgG1.

На фиг. 2 показаны различные сайты связывания в Fc-области.

На фиг. 3 показана структурная основа для pH-специфического контактирования FcRn.

На фиг. 4 показано картирование поверхности раздела взаимодействия Fc-FcRn. Домены CH2 и CH3 указаны и показаны разными оттенками серого цвета.

На фиг. 5 показано сетевое представление взаимодействия Fc-FcRn.

На фиг. 6 показано связывание FcRn с иммобилизованным анти-CH1-антителом и рН-специфическое повышение.

На фиг. 7 представлены результаты клеточного анализа конкурентного связывания FcRn.

На фиг. 8 показано связывание типичных молекул антител с FcγRI и FcγRIIIa.

На фиг. 9 показана термостабильность типичных молекул антител.

На фиг. 10 показаны периоды полураспада типичных молекул антител у мышей Tg32.

На фиг. 11А приведены значения K_d, k_on и k_off типичных сконструированных Fc антител. Значения представлены в виде кратного изменения по сравнению с IgG, содержащим WT Fc.

На фиг. 11В показано повышенное связывание с FcRn при рН 6,0 и низкое связывание с FcRn при рН 7,4 типичного сконструированного Fc антитела.

На фиг. 11C показано взаимодействие домена CH2 Fc антитела с молекулой FcRn.

На фиг. 12 показаны биофизические свойства сконструированных Fc вариантов.

На фиг. 13А показано повышенное время полураспада in vivo 3 Fc вариантов мотавизумаба по сравнению с мотавизумабом дикого типа (Mota-WT).

На фиг. 13B показаны фармакокинетические свойства 2 Fc вариантов мотавизумаба и мотавизумаба дикого типа.

На фиг. 14А показано повышенное время полураспада in vivo Fc вариантов мотавизумаба более поздней стадии по сравнению с мотавизумабом дикого типа (Mota-WT), при введении в дозе 5 мг/кг.

На фиг. 14В показаны фармакокинетические свойства Fc вариантов мотавизумаба более поздней стадии и мотавизумаба дикого типа, при введении в дозе 5 мг/кг.

На фиг. 14C показано повышенное время полурасапада in vivo Fc вариантов мотавизумаба более поздней стадии по сравнению с мотавизумабом дикого типа (Mota-WT), при введении в дозе 2 мг/кг.

На фиг. 14D показаны фармакокинетические свойства Fc вариантов мотавизумаба более поздней стадии и мотавизумаба дикого типа, при введении в дозе 2 мг/кг.

На фиг. 15 показан более длительный период полураспада in vivo антитела ZVB Zika.

На фиг. 16 показан одинаковый период полураспада ZKB-LS (антитело ZVB с мутацией LS в Fc) и ZKB-156 (антитело ZVB с мутацией Visterra 156 в Fc). Оба этих антитела имели более длительный период полураспада, чем родительское антитело ZVB (ZKB) и мотавизумаб дикого типа.

На фиг. 17А показано связывание типичных Fc вариантов с FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIA и C1q.

На фиг. 17B показано связывание FcMut213 с FcγRIIIA по сравнению с диким типом.

На фиг. 17C показано связывание FcMut213 с FcγRIIA по сравнению с диким типом.

На фиг. 17D показано связывание FcMut213 с C1q по сравнению с диким типом.

На фиг. 18 показана CDC-активность типичных Fc вариантов (ритуксимаб Fab). Расчет основан на концентрации, при которой достигается 50% лизис, а не на средней точке четырехпараметрической кривой.

На фиг. 19А-19В показана ADCC-активность типичных Fc вариантов (ритуксимаб Fab).

На фиг. 20А показана структура Fc IgG и взаимодействие Fc-FcRn.

На фиг. 20B показаны структуры Fc при двух разных значениях pH.

На фиг. 21А показаны типы остатков, которые могут опосредовать взаимодействие Fc-FcRn.

На фиг. 21B показано молекулярное взаимодействие ключевых остатков типичных сконструированных Fc вариантов.

На фиг. 22 показана типичная сенсограмма анализа Octet.

На фиг. 23 показан профиль SEC и Tm типичных Fc вариантов.

На фиг. 24 показано связывание Fc вариантов с FcγRIIIa (ADCC-активность) и с C1q (CDC-активность).

На фиг. 25А представлена фармакокинетическая характеристика IgG с Fc вариантами. График показывает изменение концентрации IgG во времени.

На фиг. 25B представлена ФК характеристика типичных Fc вариантов.

На фиг. 26 показано связывание Fab мотавизумаба с Fc вариантами с TRIM21.

На фиг. 27А показаны структуры комплекса FcRn-Fc, комплекса белок A-Fc, комплекса Trim21-Fc и комплекса гексамер Fc-Fc.

На фиг. 27B показано наложение кристаллических структур Fc-области, подчеркивающее динамику Fc-области.

Подробное описание изобретения

Раскрываются полипептиды (например, молекулы антител или слитые белки), которые связываются с молекулой-мишенью или клеткой-мишенью, например, человеческим белком или клеткой, с высокой аффинностью и специфичностью. Преимущественно, некоторые из полипептидов (например, молекул антител или слитых белков), описанных здесь, имеют одно или более улучшенных или желаемых фармакокинетических свойств, таких как период полураспада в крови. Не желая связываться с теорией, полагается, что полипептиды могут иметь диапазон периодов полураспада в крови у людей, и период полураспада в крови может оказывать влияние, например, на взаимодействие с сывороточными и клеточными компонентами, степень пиноцитоза жидкой фазы, взаимодействие с FcRn, рецептор-опосредованный эндоцитоз, дозы лекарственного средства и продукцию антител против лекарственного средства. Также обеспечиваются молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептиды (например, молекулы антител или слитые белки), экспрессионные векторы, клетки-хозяева, композиции (например, фармацевтические композиции), наборы, контейнеры и способы получения полипептидов (например, молекул антител или слитых белков). Полипептиды (например, молекулы антител или слитые белки) и фармацевтические композиции, раскрытые здесь, могут использоваться (самостоятельно или в комбинации с другими агентами или способами лечения) для лечения, профилактики и/или диагностики расстройств и патологических состояний, например, расстройств и патологических состояний, ассоциированных с молекулой-мишенью (например, белком) или клеткой-мишенью, например, расстройства или патологического состояния, описанного здесь.

Не желая связываться с теорией, полагается, что в некоторых вариантах осуществления длительный период полураспада IgG в крови обеспечивается его способностью минимизировать его деградацию в эндосомах посредством ассоциации с неонатальным Fc-рецептором (FcRn). FcRn играет важную роль в трансплацентарной передаче молекул IgG от матери к плоду и в гомеостазе IgG в сыворотке крови (Leach et al., J. Immunol., 1996. 157 (8): 3317-22; Simister et al., Eur. J. Immunol., 1996 26 (7): 1527-31; Kristoffersen, APMIS Suppl., 1996. 64: 5-36; Roopenian et al., J. Immunol., 2003. 170 (7): 3528-33; Junghans and Anderson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996. 93 (11): 5512-6). Кислая среда ранней эндосомы может обеспечивать связывание IgG и альбумина с FcRn, что защищает IgG от деградации и способствует переносу IgG обратно во внеклеточную среду, где при воздействии физиологического pH молекулы высвобождаются обратно в кровоток. Данный путь может в значительной степени быть ответственен за пролонгированный период полураспада в сыворотке как IgG, так и альбумина (Junghans and Anderson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996. 93 (11): 5512-6; Chaudhury et al., J. Exp. Med., 2003 197 (3): 315-22).

Fc-область антитела в основном ответственна за связывание с FcRn для обеспечения рециркуляции антител. В некоторых вариантах осуществления антитела с идентичными Fc-областями могут иметь разные периоды полураспада в крови, по меньшей мере, частично, за счет ряда факторов, таких как термостабильность, взаимодействие с сывороточными и клеточными компонентами, наличие антител против лекарственного средства, высокая доза, рецептор-опосредованный эндоцитоз и пиноцитоз жидкой фазы, которые могут способствовать деградации антител и отрицательно влиять на период их полураспада. Взаимодействие IgG с FcRn может служить для защиты антитела от эндосомальной деградации и удлинения периода полураспада антитела. Модификация Fc может быть использована для стимуляции взаимодействия с FcRn и, следовательно, для увеличения периода полураспада антител (Ghetie et al., Nat. Biotechnol., 1997. 15 (7): p. 637-40; Dall'Acqua et al., J. Biol. Chem, 2006. 281 (33): 23514-24; Hinton et al., J. Biol. Chem., 2004. 279 (8): 6213-6; Vaccaro et al., Nat. Biotechnol., 2005. 23 (10): 1283- 8; Zalevsky et al., Nat. Biotechnol., 2010. 28 (2): 157-9; Dall'Acqua et al., J. Immunol., 2002. 169 (9): 5171-80; Monnet et al., MAbs, 2014 6 (2): 422-36; Monnet et al., Front Immunol., 2015. 6: 39; Shields et al., J. Biol. Chem., 2001. 276 (9): 6591-604; Robbie et al., Antimicrob. Agents Chemother., 2013. 57 (12): 6147-53).

Fc-область IgG также может связываться с различными другими рецепторами, такими как FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIII, C1q и TRIM21, и эти взаимодействия опосредуют различные эффекторные функции, такие как антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC), комплементзависимая цитотоксичность (CDC), антителозависимый клеточный фагоцитоз (ADCP) и антителозависимая внутриклеточная нейтрализация (ADIN). Традиционные подходы, используемые для идентификации Fc вариантов, в основном базируются на случайном мутагенезе и форматах фагового дисплея, и при этом часто недоцениваются определенные важные свойства антитела, будь то эффекторные функции или биофизическая стабильность.

Не желая связываться с теорией, полагается, что в некотором варианте осуществления конструирование Fc для связывания с FcRn или удлинения периода полураспада, как здесь описано, выполняется в контексте различных эффекторных функций, опосредованных Fc. Например, структурная и сетевая основа могут быть использованы для оценки взаимодействия Fc с FcRn при нейтральном и кислом значении pH. Используя эту структуру, можно идентифицировать различные пути для повышения связывания с FcRn, например, уменьшением k_off взаимодействия. Можно картировать сети взаимодействия мутаций, и мутации могут быть объединены и оценены на связывание с FcRn и другими Fc-рецепторами. Например, можно идентифицировать Fc варианты, которые обеспечивают удлинение периода полураспада и сохраняют, а в некоторых случаях усиливают эффекторные функции, такие как ADCC и CDC. С ростом применения антител и слитых белков в качестве терапевтических средств для профилактики и лечения различных заболеваний возникла большая необходимость в разработке антител и слитых белков с длительным периодом полураспада, например, для лечения или профилактики хронических заболеваний.

Определения

Как здесь используется, артикли «а» и «an» относятся к одному или более (например, по меньшей мере, к одному) грамматическому объекту артикля.

Термин «или» используется здесь для обозначения и используется взаимозаменяемо с термином «и/или», если контекст явно не указывает иное.

«Примерно» и «приблизительно», как правило, означают приемлемую степень погрешности для измеряемого количественного значения с учетом характера или точности измерений. Типичные степени погрешности находятся в пределах 20%, обычно в пределах 10%, и более типично, в пределах 5% от данного значения или диапазона значений.

Композиции и способы, раскрытые здесь, охватывают полипептиды и нуклеиновые кислоты, имеющие указанные последовательности, или последовательности, по существу идентичные или сходные с ними, например, последовательности, по меньшей мере, на 85%, 90%, 95% или более идентичные указанной последовательности.

В контексте аминокислотной последовательности термин «по существу идентичные» используется здесь для обозначения первой аминокислотной последовательности, которая содержит достаточное или минимальное количество аминокислотных остатков, которые являются i) идентичными или ii) консервативными заменами выравненных аминокислотных остатков во второй аминокислотной последовательности, так что первая и вторая аминокислотные последовательности могут иметь общий структурный домен и/или общую функциональную активность. Например, аминокислотные последовательности, которые содержат общий структурный домен, имеющий, по меньшей мере, примерно 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность с эталонной последовательностью, например, последовательностью, представленной здесь.

В контексте нуклеотидной последовательности термин «по существу идентичные» используется здесь для обозначения первой последовательности нуклеиновой кислоты, которая содержит достаточное или минимальное количество нуклеотидов, которые идентичны выравненным нуклеотидам во второй последовательности нуклеиновой кислоты, так что первая и вторая нуклеотидные последовательности кодируют полипептид, имеющий общую функциональную активность, или кодируют общий структурный домен полипептида или общую функциональную активность полипептида. Например, нуклеотидные последовательности, имеющие, по меньшей мере, примерно 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность с эталонной последовательностью, например, последовательностью, представленной здесь.

Термин «функциональный вариант» относится к полипептидам, которые имеют аминокислотную последовательность, по существу идентичную природной последовательности, или кодируются по существу идентичной нуклеотидной последовательностью и способны иметь одну или более активностей природной последовательности.

Расчеты гомологии или идентичности между последовательностями (эти термины используются взаимозаменяемо в данной заявке) выполняются следующим образом.

Для определения процента идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух нуклеиновокислотных последовательностей, последовательности выравнивают для целей оптимального сравнения (например, могут быть введены гэпы в одну или обе первую и вторую аминокислотную последовательность или нуклеиновокислотную последовательность для оптимального выравнивания, и негомологичные последовательности могут не приниматься во внимание для целей сравнения). В предпочтительном варианте осуществления длина эталонной последовательности, выравненной для целей сравнения, составляет, по меньшей мере, 30%, предпочтительно, по меньшей мере, 40%, более предпочтительно, по меньшей мере, 50%, 60%, и еще более предпочтительно, по меньшей мере, 70%, 80%, 90%, 100% от длины эталонной последовательности. Затем проводят сравнение аминокислотных остатков или нуклеотидов в соответствующих аминокислотных положениях или нуклеотидных положениях. Когда положение в первой последовательности занято таким же аминокислотным остатком, что и соответствующее положение во второй последовательности, тогда молекулы идентичны по этому положению.

Процент идентичности между двумя последовательностями зависит от числа идентичных положений, общих для данных последовательностей, с учетом числа гэпов и длины каждого гэпа, которые необходимо ввести для оптимального выравнивания этих двух последовательностей.

Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями может быть выполнено с использованием математического алгоритма. В некоторых вариантах осуществления процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями определяют с использованием алгоритма Нидлмана-Вунша ((1970) J. Mol. Вiоl. 48:444-453), который включен в GAP программу в пакете программ GCG (доступен на сайте www.gcg.com), с использованием матрицы Blossum 62 или матрицы РАМ250, и массы гэпа 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и массы длины 1, 2, 3, 4, 5 или 6. В еще одном предпочтительном варианте осуществления процент идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями определяют с использованием GAP программы в пакете программ GCG (доступен на http://www.gcg.com), используя матрицу NWSgapdna.CMP и массу гэпа 40, 50, 60, 70 или 80 и массу длины 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Особенно предпочтительным набором параметров (и который следует использовать, если не указано иное) является балльная матрица Blossum 62 со штрафом за гэп 12, штрафом за удлинение гэпа 4 и штрафом за гэп со сдвигом рамки считывания 5.

Процент идентичности между двумя аминокислотными или нуклеотидными последовательностями может быть определен с использованием алгоритма Е.Meyers и W.Miller ((1989) CABIOS, 4:11-17), который включен в программу ALIGN (версия 2.0), используя таблицу массы остатков РАМ120, штраф за длину гэпа 12 и штраф за гэп 4.

Последовательности нуклеиновой кислоты и белковые последовательности, описанные здесь, можно использовать в качестве «запросной последовательности» для проведения поиска по общедоступным базам данных, например, для идентификации других членов семейства или родственных последовательностей. Такие поиски можно выполнить с использованием программ NBLAST и XBLAST (версия 2.0) из Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol., 215:403-10. Поиски нуклеотидов в BLAST могут быть осуществлены с помощью программы NBLAST, шкала = 100, длина слова = 12, для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных молекулам нуклеиновой кислоты, описанным здесь. Поиски белков в BLAST могут быть осуществлены с помощью программы XBLAST, шкала = 50, длина слова = 3, для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных белковым молекулам, описанным здесь. Для получения выравниваний с гэпами для целей сравнения можно использовать Gapped BLAST, как описано Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res., 25:3389-3402. При использовании программ BLAST и Gapped BLAST можно использовать значения параметров по умолчанию из соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST). Смотри www.ncbi.nlm.ni.gov.

Как здесь используется, выражение «гибридизуется в условиях низкой жесткости, средней жесткости, высокой жесткости или очень высокой жесткости» описывает условия гибридизации и промывания. Руководство по проведению реакций гибридизации можно найти в монографии Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6, которая включена здесь посредством ссылки. В этой ссылке описаны методы с использованием водных и неводных растворов, и любой из них может быть использован. Конкретные условия гибридизации, указанные здесь, являются следующими: 1) условия гибридизации низкой жесткости в 6X хлориде натрия/цитрате натрия (SSC) при температуре примерно 45°C с последующими двумя промываниями в 0,2X SSC, 0,1% SDS, по меньшей мере, при 50°C (температуру промываний можно повысить до 55°C для условий низкой жесткости); 2) условия гибридизации средней жесткости в 6X SSC при температуре примерно 45°C с последующим одним или более промываниями в 0,2X SSC, 0,1% SDS при 60°C; 3) условия гибридизации высокой жесткости в 6X SSC при температуре примерно 45°C с последующим одним или более промываниями в 0,2X SSC, 0,1% SDS при 65°C; и предпочтительно 4) условия гибридизации очень высокой жесткости представляют собой 0,5 М фосфат натрия, 7% SDS при 65°C, затем одно или более промываний при 0,2X SSC, 1% SDS при 65°C. Условия очень высокой жесткости 4) являются подходящими условиями, и условиями, которые следует использовать, если не указано иное.

Понятно, что молекулы, описанные здесь, могут иметь дополнительные консервативные или несущественные аминокислотные замены, которые не оказывают существенного влияния на их функции.

Термин «аминокислота» предназначен для охвата всех молекул, как природных, так и синтетических, которые содержат функциональную аминогруппу и функциональную карбоксильную группу, и могут включаться в полимер из природных аминокислот. Типичные аминокислоты включают встречающиеся в природе аминокислоты; их аналоги, производные и конгенеры; аналоги аминокислот, имеющие вариантные боковые цепи; и все стереоизомеры любого из вышеуказанного. Как здесь используется, термин «аминокислота» включает как D-, так и L-оптические изомеры и пептидомиметики.

«Консервативная аминокислотная замена» представляет собой замену, при которой аминокислотный остаток заменяется аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, были определены в данной области. Данные семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин).

Термины «полипептид», «пептид» и «белок» (если они одноцепочечные) используются здесь взаимозаменяемо для обозначения полимеров аминокислот любой длины. Полимер может быть линейным или разветвленным, он может содержать модифицированные аминокислоты, и он может прерываться комонентами, отличными от аминокислот. Термины также охватывают аминокислотный полимер, который был модифицирован; например, посредством образования дисульфидной связи, гликозилирования, липидирования, ацетилирования, фосфорилирования или любых других манипуляций, таких как конъюгирование с метящим компонентом. Полипептид может быть выделен из природных источников, может быть получен рекомбинантными способами из эукариотического или прокариотического хозяина или может быть продуктом синтетических процедур. В одном варианте осуществления полипептид представляет собой молекулу антитела. В еще одном варианте осуществления полипептид представляет собой слитый белок.

Термины «нуклеиновая кислота», «последовательность нуклеиновой кислоты», «нуклеотидная последовательность» или «полинуклеотидная последовательность» и «полинуклеотид» используются взаимозаменяемо. Они относятся к полимерной форме нуклеотидов любой длины, либо дезоксирибонуклеотидов, либо рибонуклеотидов, либо их аналогов. Полинуклеотид может быть одноцепочечным или двухцепочечным, и, если он одноцепочечный, то может представлять кодирующую цепь или некодирующую (антисмысловую) цепь. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и аналоги нуклеотидов. Последовательность нуклеотидов может прерываться компонентами, отличными от нуклеотидов. Полинуклеотид может быть дополнительно модифицирован после полимеризации, например, посредством конъюгации с метящим компонентом. Нуклеиновая кислота может представлять собой рекомбинантный полинуклеотид или полинуклеотид геномного, кДНК, полусинтетического или синтетического происхождения, который либо не встречается в природе или связан с другим полинуклеотидом в порядке, который не встречается в природе.

Как здесь используется, термин «выделенный» относится к материалу, который удален из его исходной или нативной среды (например, природной среды, если она встречается в природе). Например, встречающийся в природе полинуклеотид или полипептид, присутствующий в живом животном, не является выделенным, но тот же полинуклеотид или полипептид, отделенный при вмешательстве человека от некоторых или всех сосуществующих материалов в природной системе, является выделенным. Такие полинуклеотиды могут представлять часть вектора, и/или такие полинуклеотиды или полипептиды могут быть частью композиции, и все же быть выделенными, так как такой вектор или композиция не являются частью среды, в которой они встречаются в природе.

Как здесь используется, термин «лечить», например, расстройство, описанное здесь, означает, что субъект (например, человек), который имеет расстройство, например, расстройство, описанное здесь, и/или испытывает симптом расстройства, например, расстройства, описанного здесь, в одном варианте осуществления будет испытывать менее тяжелый симптом и/или быстрее восстанавливаться, когда молекула антитела вводится, чем если бы молекула антитела не вводилась. Лечение может, например, частично или полностью облегчать, ослаблять, снижать, ингибировать или уменьшать тяжесть и/или снижать заболеваемость и, необязательно, задерживать начало одного или более проявлений эффектов или симптомов, признаков и/или причин расстройства. В одном варианте осуществления проводится лечение субъекта, у которого отсутствуют определенные признаки расстройства, и/или субъекта, у которого проявляются только ранние признаки расстройства. В одном варианте осуществления лечение представляет лечение субъекта, у которого проявляется один или более установленных признаков расстройства. В одном варианте осуществления лечение представляет лечение субъекта, у которого диагностировано наличие расстройства.

Как здесь используется, термин «профилактировать» расстройство означает, что у субъекта (например, человек) с меньшей вероятностью будет развиваться расстройство, если субъект получает полипептид (например, молекулу антитела).

Различные аспекты композиций и способов здесь описаны более подробно ниже. Дополнительные определения приводятся по тексту описания.

Молекулы антитела

Раскрываются молекулы антитела, например, молекулы антитела, содержащие Fc-область, например, Fc-область, имеющую одну или более мутаций, описанных здесь, и/или имеющую одно или более структурных или функциональных свойств, описанных здесь.

В одном варианте осуществления молекула антитела сконструирована или получена из молекулы антитела (например, молекулы родительского антитела), которое содержит Fc-область. Например, сконструированная молекула антитела или производное молекулы антитела может иметь Fc-область, отличную, чем в молекуле родительского антитела. В еще одном варианте осуществления молекула антитела сконструирована или получена из молекулы антитела (например, молекулы родительского антитела), которая не содержит Fc-область. Например, сконструированная молекула антитела или производное молекулы антитела может иметь Fc-область, прямо или опосредованно, слитую с молекулой родительского антитела или ее функциональным фрагментом.

Как здесь используется, термин «молекула антитела» относится к белку, например, цепи иммуноглобулина или его фрагменту, содержащему, по меньшей мере, последовательность одной вариабельной области иммуноглобулина. Термин «молекула антитела» включает, например, полноразмерные зрелые антитела и антигенсвязывающие фрагменты антитела. Например, молекула антитела может включать последовательность вариабельной области тяжелой (H) цепи (сокращенно обозначенную здесь как VH) и последовательность вариабельной области легкой (L) цепи (сокращенно обозначенную здесь как VL). В еще одном примере молекула антитела включает две последовательности вариабельной области тяжелой (H) цепи и две последовательности вариабельной области легкой (L) цепи, тем самым образуя два антигенсвязывающих сайта, такие как Fab, Fab', F(ab')₂, Fc, Fd, Fd', Fv, одноцепочечные антитела (например, scFv), антитела с одной вариабельной областью, диатела (Dab) (бивалентные и биспецифические) и химерные (например, гуманизированные) антитела, которые можно получить модификацией целых антител, или которые синтезированы de novo с использованием технологий рекомбинантной ДНК. Эти функциональные фрагменты антител сохраняют способность избирательно связываться с их соответствующим антигеном или рецептором. Антитела и фрагменты антител могут происходить из любого класса антител, включая, не ограничиваясь этим, IgG, IgA, IgM, IgD и IgE и из любого подкласса (например, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4) антител. Молекулы антител могут быть моноклональными или поликлональными. Молекула антитела также может представлять собой человеческое, гуманизированное, CDR-привитое или полученное in vitro антитело. Молекула антитела может иметь константную область тяжелой цепи, выбранную, например, из IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. Молекула антитела также может иметь легкую цепь, выбранную, например, из легких цепей каппа или лямбда. Термин «иммуноглобулин» (Ig) используется здесь взаимозаменяемо с термином «антитело».

Примеры антигенсвязывающих фрагментов включают: (i) Fab-фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) F(ab')₂-фрагмент, двухвалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd-фрагмент, состоящий из доменов VH и CH1; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела, (v) фрагмент (dAb) диатела, который состоит из домена VH; (vi) верблюжий или камелизированный вариабельный домен; (vii) одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv), см., например, Bird et al. (1988) Science, 242: 423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Акад. Sci. USA, 85: 5879-5883); (viii) однодоменное антитело. Данные фрагменты антител могут быть получены с использованием любого подходящего способа, включая несколько общепринятых методик, известных специалистам в данной области техники, и фрагменты можно подвергнуть скринингу на применимость таким же образом, как и интактные антитела.

Термин «антитело» включает интактные молекулы, а также их функциональные фрагменты. Константные области антител можно изменить, например, мутировать, для модификации свойств антитела (например, для увеличения или уменьшения одного или более из: связывания с Fc-рецептором, гликозилирования антитела, числа остатков цистеина, функции эффекторных клеток или функции комплемента).

Молекула антитела может представлять собой одноцепочечное антитело. Можно сконструировать одноцепочечное антитело (scFV) (см., например, Colcher D. et al. (1999) Ann. NY Acad. Sci., 880: 263-80; и Reiter Y. (1996) Clin. Cancer Res. 2: 245-52). Одноцепочечное антитело может быть димеризовано или мультимеризовано с получением мультивалентных антител, имеющих специфичность для разных эпитопов одного и того же белка-мишени.

Молекулы антител, раскрытые здесь, также могут представлять однодоменные антитела. Однодоменные антитела могут включать антитела, чьи определяющие комплементарность участки являются частью однодоменного полипептида. Примеры включают, не ограничиваясь этим, антитела с тяжелой цепью, антитела, естественно лишенные легких цепей, однодоменные антитела, полученные из обычных 4-цепочечных антител, сконструированные антитела и однодоменные каркасы, отличные от полученных из антител. Однодоменные антитела могут представлять любые, известные в данной области техники, или любые однодоменные антитела, которые будут открыты в будущем. Однодоменные антитела можно получить из любых видов, включая, не ограничиваясь этим, мышь, человека, верблюда, ламу, рыбу, акулу, козу, кролика и быка. Согласно некоторым аспектам, однодоменное антитело представляет собой природное однодоменное антитело, известное как антитело с тяжелой цепью, лишенное легких цепей. Такие однодоменные антитела раскрыты, например, в WO 94/04678. Для пояснения такой вариабельный домен, полученный из антитела с тяжелой цепью, естественным образом не содержащего легкой цепи, в настоящем описании обозначают как VHH или нанотело для отличия от общепринятого VH иммуноглобулинов, содержащих четыре цепи. Такую молекулу VHH можно получить из антител, продуцированных у видов Camelidae, например, у верблюда, ламы, дромадера, альпаки и гуанако. Другие виды помимо Camelidae могут продуцировать антитела с тяжелой цепью, естественным образом не содержащие легкой цепи; такие VHH входят в объем изобретения.

Области VH и VL можно подразделить на участки гипервариабельности, называемые «определяющими комплементарность участками» (CDR), чередующиеся с областями, которые являются более консервативными, называемыми «каркасными областями» (FR или FW). Как здесь используется, термины «определяющий комплементарность участок» и «CDR» относятся к последовательностям аминокислот в вариабельных областях антитела, которые придают антигенную специфичность и аффинность связывания. Как здесь используется, термины «каркасная область», «FW» и «FR» используются взаимозаменяемо.

Протяженность каркасной области и CDR была точно определена с использованием ряда методов (см. Kabat, EA, et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917 и AbM определением, используемым программным обеспечением для моделирования антител Oxford Molecular's AbM. См., например, Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. In: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg). В одном варианте осуществления используются следующие определения: AbM определение CDR1 вариабельной области тяжелой цепи и определение по Kabat для других CDR. В варианте осуществления определения по Kabat используются для всех CDR. Кроме того, варианты осуществления, описанные в отношении CDR по Kabat или AbM, также можно выполнить с использованием гипервариабельных петель Chothia. Каждая VH и VL обычно включает три CDR и четыре FR, расположенные от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4.

Как здесь используется, термин «последовательность вариабельной области иммуноглобулина» относится к аминокислотной последовательности, которая может образовывать структуру вариабельной области иммуноглобулина. Например, последовательность может включать всю или часть аминокислотной последовательности встречающейся в природе вариабельной области. Например, последовательность может включать или не включать одну, две или более N- или C-концевых аминокислот или может включать другие изменения, которые совместимы с образованием белковой структуры.

Термин «антигенсвязывающий участок» относится к участку молекулы антитела, который содержит детерминанты, образующие поверхность раздела, которая связывается с антигеном или его эпитопом. По отношению к белкам (или миметикам белков), антигенсвязывающий участок обычно включает одну или более петель (по меньшей мере, например, из четырех аминокислот или миметиков аминокислот), которые образуют поверхность раздела, которая связывается с антигеном. Как правило, антигенсвязывающий участок молекулы антитела включает, по меньшей мере, один или два CDR и/или гипервариабельные петли, или, более типично, по меньшей мере, три, четыре, пять или шесть CDR и/или гипервариабельные петли.

Термины «конкурировать» или «перекрестно конкурировать» используются здесь взаимозаменяемо для обозначения способности молекулы антитела препятствовать связыванию другой молекулы антитела с мишенью. Препятствие связыванию может быть прямым или опосредованным (например, посредством аллостерической модуляции молекулы антитела или мишени). Степень, до которой молекула антитела может препятствовать связыванию другой молекулы антитела с мишенью, и, следовательно, можно сказать, что она конкурирует, можно определить с использованием анализа конкурентного связывания, например, анализа FACS, ELISA или анализа BIACORE. В одном варианте осуществления анализа конкурентного связывания представляет собой количественный конкурентный анализ. В одном варианте осуществления полагается, что первая молекула антитела конкурирует за связывание с мишенью со второй молекулой антитела, когда связывание первой молекулы антитела с мишенью снижается на 10% или более, например, на 20% или более, на 30% или более, на 40% или более, на 50% или более, на 55% или более, на 60% или более, на 65% или более, на 70% или более, на 75% или более, на 80% или более, на 85% или более, на 90% или более, на 95% или более, на 98% или более, на 99% или более в анализе конкурентного связывания (например, конкурентном анализе, описанном здесь).

Как здесь используется, термины «моноклональное антитело» или «композиция моноклонального антитела» относятся к препарату молекул антитела с одним молекулярным составом. Композиция моноклонального антитела проявляет единственную специфичность связывания и аффинность к конкретному эпитопу. Моноклональное антитело может быть получено с помощью гибридомной технологии или способами, в которых не используется гибридомная технология (например, рекомбинантные методы).

«Эффективный человеческий» белок представляет собой белок, который не индуцирует ответной выработки нейтрализующих антител, например, ответа человеческих против мышиных антител (HAMA). В ряде обстоятельств HAMA может представлять проблему, например, если молекулу антитела вводят повторно, например, при лечении хронического или рецидивирующего заболевания. HAMA-ответ может сделать повторное введение антител потенциально неэффективным за счет повышенного клиренса антител из сыворотки крови (см., например, Saleh et al., Cancer Immunol. Immunother., 32: 180-190 (1990)), а также за счет потенциальных аллергических реакций (см., например, LoBuglio et al., Hybridoma, 5: 5117-5123 (1986)).

Молекула антитела может представлять поликлональное или моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело можно получить рекомбинантным способом, например, получить любым подходящим фаговым дисплеем или комбинаторными способами.

В данной области известны различные фаговые дисплеи и комбинаторные способы получения антител (как описано, например, Ladner et al., патент США № 5223409; Kang et al., международная публикация заявки № WO 92/18619; Dower et al., международная публикация заявки WO 91/17271; Winter et al., международная публикация заявки WO 92/20791; Markland et al., международная публикация заявки № WO 92/15679; Breitling et al., международная публикация заявки WO 93/01288; McCafferty et al., международная публикация заявки № WO 92/01047; Garrard et al., международная публикация заявки № WO 92/09690; Ladner et al., международная публикация заявки № WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9: 1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas, 3: 81-85; Huse et al. (1989) Science, 246: 1275-1281; Griffths et al. (1993) EMBO J., 12: 725-734; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol., 226: 889-896; Clackson et al. (1991) Nature, 352: 624-628; Gram et al. (1992) PNAS, 89: 3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology, 9: 1373- 1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuс. Acid Res., 19: 4133-4137; и Barbas et al. (1991) PNAS 88: 7978-7982, содержание которых включено здесь посредством ссылки).

В одном варианте осуществления молекула антитела представляет собой полностью человеческое антитело (например, антитело, полученное в организме мыши, которая была генетически сконструирована для получения антитела из последовательности иммуноглобулина человека), или антитело, отличное от человеческого, например, антитело грызуна (мыши или крысы), козы, примата (например, обезьяны), верблюжье антитело. В одном варианте осуществления антитело, отличное от человеческого, представляет собой антитело грызуна (мышиное или крысиное антитело). Способы получения антител грызунов известны в данной области.

Человеческие моноклональные антитела можно получить с использованием трансгенных мышей, несущих гены человеческого иммуноглобулина, а не мышиную систему. Спленоциты от этих трансгенных мышей, иммунизированных антигеном, представляющим интерес, используются для получения гибридом, которые секретируют человеческие mAb со специфической аффинностью к эпитопам из белка человека (см., например, Wood et al. международная заявка WO 91/00906, Kucherlapati et al. PCT публикация WO 91/10741; Lonberg et al., международная заявка WO 92/03918; Kay et al., международная заявка 92/03917; Lonberg et al., 1994, Nature, 368: 856-859; Green L.L. et al., 1994, Nature Genet., 7: 13-21; Morrison S.L. et al., 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855; Bruggeman et al., 1993, Year Immunol., 7: 33-40; Tuaillon et al., 1993, PNAS, 90: 3720-3724 ; Bruggeman et al., 1991, Eur. J. Immunol., 21: 1323-1326).

Антитело может представлять собой антитело, в котором вариабельная область или ее участок, например CDR, генерируются в организме, отличном от человека, например, в организме крысы или мыши. Химерные, CDR-привитые и гуманизированные антитела входят в объем изобретения. Антитела, полученные в организме, отличном от человека, например, в организме крысы или мыши, и затем модифицируются, например, в вариабельном каркасе или константной области, для снижения антигенности у человека, находятся в объеме изобретения.

Химерные антитела могут быть получены любым подходящим способом рекомбинантной ДНК. Некоторые из них известны в данной области (см. Robinson et al., международной публикация патента PCT/US86/02269; Akira et al., Европейская патентная заявка 184187; Taniguchi M., Европейская патентная заявка 171496; Morrison et al., Европейская патентная заявка 173494; Neuberger et al., международная заявка WO 86/01533; Cabilly et al., патент США № 4816567; Cabilly et al., Европейская патентная заявка 125,023; Better et al. (1988 Science 240: 1041-1043); Liu et al. (1987) PNAS, 84: 3439-3443; Liu et al., 1987, J. Immunol., 139: 3521-3526; Sun et al. (1987) PNAS, 84: 214-218; Nishimura et al., 1987, Canc. Res., 47: 999-1005; Wood et al. (1985) Nature, 314: 446-449; Shaw et al., 1988, J. Natl. Cancer Inst., 80: 1553-1559).

Гуманизированное или CDR-привитое антитело будет иметь, по меньшей мере, один или два, но, как правило, все три реципиентных CDR (тяжелой и/или легкой цепей иммуноглобулина), замещенных донорным CDR. Антитело может быть модифицировано, по меньшей мере, частью CDR, отличного от человеческого, или только некоторые из CDR могут быть заменены CDR, отличными от человеческих. Необходимо заменить только такое число CDR, необходимое для связывания гуманизированного антитела с липополисахаридом. В одном варианте осуществления донором будет антитело грызуна, например, антитело крысы или мыши, а реципиентом будет каркас человека или консенсусный каркас человека. Как правило, иммуноглобулин, обеспечивающий CDR, называется «донором», а иммуноглобулин, обеспечивающий каркас, называется «акцептором». В некоторых вариантах осуществления донорный иммуноглобулин не является иммуноглобулином человека (например, представляет иммуноглобулин грызуна). Акцепторный каркас, как правило, представляет собой встречающийся в природе (например, человеческий) каркас или консенсусный каркас, или последовательность которого примерно на 85% или выше, например, на 90%, 95%, 99% или выше, идентична им.

Как здесь используется, термин «консенсусная последовательность» относится к последовательности, образованной из наиболее часто встречающихся аминокислот (или нуклеотидов) в семействе родственных последовательностей (см., например, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987). В семействе белков каждое положение в консенсусной последовательности занято аминокислотой, которая наиболее часто встречается в этом положении в семействе. Если две аминокислоты встречаются одинаково часто, то любая из них может быть включена в консенсусную последовательность. «Консенсусная каркасная область» относится к каркасной области консенсусной последовательности иммуноглобулина.

Антитело может быть гуманизировано любым подходящим способом и несколькими такими способами, известными в данной области (см., например, Morrison S.L., 1985, Science, 229: 1202-1207, Oi et al., 1986, BioTechniques, 4: 214 и Queen et al., патент США № 5585089, патент США № 5693761 и патент США № 5693762, содержание которых включено здесь посредством ссылки).

Гуманизированные или CDR-привитые антитела могут быть получены CDR-прививкой или CDR-заменой, где могут быть заменены один, два или все CDR иммуноглобулиновой цепи. См., например, патент США № 5225539; Jones et al., 1986, Nature, 321: 552-525; Verhoeyan et al., 1988, Science, 239: 1534; Beidler et al., 1988, J. Immunol., 141: 4053-4060; Winter, патент США № 5225539, содержание которых включено здесь посредством ссылки. Winter описывает способ CDR-прививки, который можно использовать для получения гуманизированных антител (заявка на патент Великобритании GB 2188638A, поданная 26 марта 1987 года; Winter, патент США № 5225539), содержание которых включено здесь посредством ссылки.

Также обеспечиваются гуманизированные антитела, в которых определенные аминокислоты были замещены, делецированы или добавлены. Критерии для выбора аминокислот от донора описаны, например, в патенте США № 5585089, например, столбцы 12-16 в патенте США № 5585089, содержание которого включено здесь посредством ссылки. Другие способы гуманизации антител описаны в Padlan et al., EP 519596 A1, опубликованой 23 декабря 1992 г.

В одном варианте осуществления молекула антитела имеет константную область тяжелой цепи, выбранную, например, из константных областей тяжелой цепи IgG1, IgG2 (например, IgG2a), IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD и IgE; в частности, выбранную, например, из (например, человеческих) константных областей тяжелой цепи IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. В еще одном варианте осуществления молекула антитела имеет константную область легкой цепи, выбранную, например, из (например, человеческих) константных областей легкой цепи каппа или лямбда. Константная область может быть модифицирована, например, мутирована, для изменения свойств молекулы антитела (например, для увеличения или уменьшения одного или более из: связывания с Fc-рецептором, гликозилирования антитела, числа остатков цистеина, функции эффекторных клеток и/или функции комплемента). В одном варианте осуществления молекула антитела имеет эффекторную функцию и может фиксировать комплемент. В еще одном варианте осуществления молекула антитела не обеспечивает рекрутинг эффекторных клеток и не фиксирует комплемент. В определенных вариантах осуществления молекула антитела обладает пониженной способностью связываться с Fc-рецептором, или она отсутствует. Например, это может быть изотип или подтип, фрагмент или другой мутант, который не связывается с Fc-рецептором, например, он имеет мутантную или делецированную область связывания с Fc-рецептором.

В одном варианте осуществления константная область молекулы антитела подвергается модификации. Способы модификации константной области антитела известны в данной области. Молекулы антител с измененной функцией, например, измененной аффинностью к эффекторному лиганду, такому как FcR на клетке или компоненту С1 комплемента, можно получить заменой, по меньшей мере, одного аминокислотного остатка в константной области антитела другим остатком (см., например, EP 388151 A1, патент США № 5624821 и патент США № 5648260, содержание которых включено здесь посредством ссылки). Также предусматриваются аминокислотные мутации, которые стабилизируют структуру антитела, такие как S228P (номенклатура ЕС, S241P в номенклатуре Kabat) в человеческом IgG4. Можно описать аналогичные типы модификаций, которые, если применять к иммуноглобулину мыши или других видов, уменьшают или элиминируют эти функции.

В одном варианте осуществления единственными аминокислотами в молекуле антитела являются канонические аминокислоты. В одном варианте осуществления молекула антитела содержит встречающиеся в природе аминокислоты; их аналоги, производные и конгенеры; аналоги аминокислот, имеющие вариантные боковые цепи; и/или все стереоизомеры любого из вышеуказанного. Молекула антитела может включать D- или L-оптические изомеры аминокислот и пептидомиметики.

Полипептид молекулы антитела, описанной здесь, может быть линейным или разветвленным, он может содержать модифицированные аминокислоты и может прерываться компонентами, отличными от аминокислот. Молекула антитела также может быть модифицирована; например, посредством образования дисульфидной связи, гликозилирования, липидирования, ацетилирования, фосфорилирования или любых других манипуляций, таких как конъюгирование с метящим компонентом. Полипептид может быть выделен из природных источников, может быть получен рекомбинантными способами из эукариотического или прокариотического хозяина или может быть продуктом синтетических процедур.

Молекула антитела, описанная здесь, может использоваться самостоятельно в неконъюгированной форме или может быть связана с веществом, например, токсином или молекулой (например, лекарственным средством; соединением, испускающим излучение; молекулами растительного, грибкового или бактериального происхождения) или биологическим белком (например, белковым токсином) или частицей (например, рекомбинантной вирусной частицей, например, через белок оболочки вируса). Например, молекула антитела может быть связана с радиоактивным изотопом, таким как α-, β- или γ-излучатель, или β- и γ-излучатель.

Молекула антитела может быть дериватизирована или связана с другой функциональной молекулой (например, другим пептидом или белком). Как здесь используется, термин «дериватизированная» молекула антитела представляет собой молекулу, которая была модифицирована. Способы дериватизации включают, не ограничиваясь этим, добавление флуоресцентной группы, радионуклеотида, токсина, фермента или аффинного лиганда, такого как биотин. Следовательно, предполагается, что молекулы антител включают дериватизированные и иным образом модифицированные формы антител, описанных здесь, включая молекулы иммуноадгезии. Например, молекула антитела может быть функционально связана (посредством химического связывания, генетического слияния, нековалентной ассоциации или иным образом) с одним или более другими молекулярными объектами, такими как другое антитело (например, биспецифическое антитело или диатело), детектируемый агент, токсин, фармацевтический агент и/или белок или пептид, которые могут опосредовать ассоциацию антитела или фрагмента антитела с другой молекулой (такой как область ядра стрептавидина или полигистидиновая метка).

Некоторые типы молекул дериватизированных антител получают посредством сшивания двух или более антител (одного и того же типа или разных типов, например, для получения биспецифических антител). Подходящие сшивающие агенты включают такие, которые являются гетеробифункциональными, имеющими две отчетливо реакционноспособные группы, разделенные подходящим спейсером (например, м-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимидный сложный эфир) или гомобифункциональными (например, дисукцинимидилсуберат). Такие линкеры доступны от Pierce Chemical Company, Rockford, Ill.

Пригодные детектируемые агенты, с которыми молекула антитела может быть дериватизирована (или помечена), включают флуоресцентные соединения, различные ферменты, простетические группы, люминесцентные соединения, биолюминесцентные соединения, атомы металлов, излучающих флуоресценцию, например, европий (Eu) и другие антаниды, и радиоактивные вещества (описанные ниже). Типичные детектируемые флуоресцентные агенты включают флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат, родамин, 5-диметиламин-1-нафталинсульфонилхлорид, фикоэритрин и тому подобное. Антитело также может быть дериватизировано детектируемыми ферментами, такими как щелочная фосфатаза, пероксидаза хрена, β-галактозидаза, ацетилхолинэстераза, глюкозооксидаза и тому подобное. Когда антитело дериватизируется детектируемым ферментом, то его детектируют добавлением дополнительных реагентов, которые используются ферментом для образования детектируемого продукта реакции. Например, когда присутствует такой детектируемый агент, как пероксидаза хрена, то добавление перекиси водорода и диаминобензидина приводит к образованию окрашенного продукта реакции, который можно детектировать. Молекула антитела также может быть дериватизирована простетической группой (например, стрептавидин/биотин и авидин/биотин). Например, антитело может быть дериватизировано с использованием биотина, и детектировано посредством опосредованного измерения связывания авидина или стрептавидина. Примеры подходящих флуоресцентных соединений включают умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат, родамин, дихлортриазиниламин флуоресцеин, дансилхлорид или фикоэритрин; пример люминесцентного соединения включает люминол; и примеры биолюминесцентных соединений включают люциферазу, люциферин и экворин.

Молекулы меченых антител можно использовать, например, для диагностики и/или экспериментально в ряде контекстов, включая (i) выделение заранее определенного антигена стандартными методами, такими как аффинная хроматография или иммунопреципитация; (ii) для детектирования заранее определенного антигена (например, в клеточном лизате или клеточном супернатанте), для оценки количества и характера экспрессии белка; (iii) для мониторинга уровней белка в ткани как часть процедуры клинического тестирования, например, для определения эффективности определенного режима лечения.

Молекула антитела может быть конъюгирована с другим молекулярным объектом, как правило, меткой или терапевтическим (например, антимикробным (например, антибактериальным или бактерицидным), иммуномодулирующим, иммуностимулирующим, цитотоксическим или цитостатическим) агентом или фрагментом. Радиоактивные изотопы можно использовать в диагностических или терапевтических применениях. Радиоактивные изотопы, которые могут быть связаны с молекулами антител, включают, не ограничиваясь этим, α-, β- или γ-излучатели или β- и γ-излучатели. Такие радиоактивные изотопы включают, не ограничиваясь этим, йод (¹³¹I или ¹²⁵I), иттрий (⁹⁰Y), лютеций (¹⁷⁷Lu), актиний (²²⁵Ac), празеодим, астатин (²¹¹At), рений (¹⁸⁶Re), висмут (²¹²Bi или ²¹³Bi), индий (¹¹¹In), технеций (⁹⁹mTc), фосфор (³²P), родий (¹⁸⁸Rh), сера (³⁵S), углерод (¹⁴C), тритий (³H), хром (⁵¹Cr), хлор (³⁶Cl), кобальт (⁵⁷Co или ⁵⁸Co), железо (⁵⁹Fe), селен (⁷⁵Se) или галлий (⁶⁷Ga). Радиоизотопы, используемые в качестве терапевтических агентов, включают иттрий (⁹⁰Y), лютеций (¹⁷⁷Lu), актиний (²²⁵Ac), празеодим, астатин (²¹¹At), рений (¹⁸⁶Re), висмут (²¹²Bi или ²¹³Bi) и родий (¹⁸⁸Rh). Радиоизотопы, используемые в качестве меток, например, для применения в диагностике, включают йод (¹³¹I или ¹²⁵I), индий (¹¹¹In), технеций (⁹⁹mTc), фосфор (³²P), углерод (¹⁴C) и тритий (³H) или один или более из терапевтических изотопов, указанных выше.

Настоящее изобретение относится к радиоактивно меченым молекулам антител и способам их мечения. В одном варианте осуществления раскрывается способ мечения молекулы антитела. Способ включает контактирование молекулы антитела с хелатирующим агентом, с получением тем самым конъюгированного антитела. Конъюгированное антитело радиоактивно метят с использованием радиоизотопа, например ¹¹¹индия, ⁹⁰иттрия и ¹⁷⁷лютеция, с получением тем самым меченой молекулы антитела.

В некоторых аспектах настоящее раскрытие обеспечивает способ получения молекулы антитела, раскрытой в данном документе. Способ включает: обеспечение антигена или его фрагмента; получение молекулы антитела, которая специфически связывается с антигеном; оценку эффективности молекулы антитела в модуляции активности антигена и/или организма, экспрессирующего антиген. Способ может дополнительно включает введение молекулы антитела, включая ее производное (например, молекулу гуманизированного антитела), субъекту, например, человеку.

Настоящее изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей вышеуказанную молекулу антитела, векторам и клеткам-хозяевам. Молекула нуклеиновой кислоты включает, не ограничиваясь этим, РНК, геномную ДНК и кДНК.

Слитые белки

Раскрываются слитые белки, например, слитые белки, содержащие Fc-область, например, Fc-область, имеющую одну или более мутаций, описанных здесь, и/или имеющую одно или более структурных или функциональных свойств, описанных здесь.

В одном варианте слитый белок сконструирован или получен из полипептида (например, слитого белка), который содержит Fc-область (например, родительский полипептид). Например, сконструированный полипептид или его производное может иметь Fc-область, отличную от родительского полипептида. В еще одном варианте слитый белок сконструирован или получен из полипептида, который не содержит Fc-область (например, родительский полипептид). Например, сконструированная молекула антитела или производное молекулы антитела может иметь Fc-область, прямо или опосредованно, слитую с родительским полипептидом.

Как здесь используется, термин «слитый белок» относится к белку, содержащему два или более белковых или пептидных компонента. Два или более белковых или пептидных компонента могут происходить из разных источников или кодироваться разными генами. Слитый белок иногда также называют химерным белком. Fc-слитый белок (также известный как химерный Fc-слитый белок, Fc-Ig, химерный слитый белок на основе Ig или Fc-метка белок) может включать Fc-область иммуноглобулина (например, Fc-область, описанную здесь), связанную (например, слитую) с белком или пептидом. Fc-область может быть связана (например, генетически слита) с белком или пептидом прямо или опосредованно, например, через линкер. В одном варианте осуществления Fc-область получена из Fc-области IgG, например, человеческого IgG, например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. В одном варианте осуществления Fc-область получена из Fc-области IgG1, например человеческого IgG1.

Fc-слитый партнер по связыванию может включать множество белков или пептидов или их фрагментов. Например, Fc-область может быть слита с пептидом (например, терапевтическим пептидом), лигандом (например, лигандом, который активируется при связывании с рецептором клеточной поверхности), сигнальной молекулой, внеклеточным доменом рецептора или «наживкой» (например, используемым для идентификации партнера по связыванию, например, в белковом микрочипе).

В одном варианте осуществления Fc-слитый белок содержит внеклеточный домен рецептора или растворимый рецептор, или его лиганд-связывающий участок. В одном варианте осуществления рецептор представляет рецептор фактора роста. В одном варианте осуществления рецептор представляет собой цитокиновый рецептор. В одном варианте осуществления рецептор представляет молекулу иммунной контрольной точки.

В одном варианте слитый белок содержит участок, связывающий фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), из внеклеточного домена рецепторов человеческих VEGF 1 и 2, слитый с Fc-областью человеческого IgG1. В одном варианте слитый белок представляет собой афлиберцепт. В одном варианте осуществления слитый белок (например, афлиберцепт) используется для лечения расстройства, описанного здесь, например, нарушения зрения (например, влажной формы макулярной дегенерации) или рака (например, колоректального рака).

В еще одном варианте слитый белок содержит растворимый рецептор фактора некроза опухоли 2 (TNF), слитый с Fc-областью человеческого IgG1. В одном варианте осуществления слитый белок представляет этанерцепт. В одном варианте осуществления Fc-слитый белок (например, этанерцепт) используется для лечения расстройства, описанного здесь, например, аутоиммунного заболевания (например, ревматоидного артрита).

В еще одном варианте слитый белок содержит лиганд-связывающие домены внеклеточных участков рецептора 1 человеческого интерлейкина-1 (IL-1R1) и вспомогательный белок рецептора IL-1 (IL-1RAcP), слитые с Fc-областью человеческого IgG1. В одном варианте слитый белок представляет собой рилонацепт. В одном варианте осуществления слитый белок (например, рилонацепт) используется для лечения расстройства, описанного здесь, например, криопирин-ассоциированного периодического синдрома (CAPS), например, семейного холодового аутовоспалительного синдрома, синдрома Макла-Веллса или мультисистемного воспалительного заболевания с началом в младенческом возрасте.

В еще одном варианте слитый белок содержит внеклеточный домен CTLA-4, слитый с Fc-областью человеческого IgG1. В одном варианте осуществления слитый белок представляет абатацепт или белатацепт. В одном варианте осуществления слитый белок (например, абатацепт или белатацепт) используется для лечения расстройства, описанного здесь, например, синдрома отторжения органа, аутоиммунного заболевания (например, ревматоидного артрита) или рака.

В одном варианте осуществления Fc-слитый белок содержит пептид, например, терапевтический пептид.

В одном варианте осуществления слитый белок содержит тромбопоэтин-связывающий пептид, слитый с Fc-областью человеческого IgG1. В одном варианте слитый белок представляет собой ромиплостим. В одном варианте слитый белок (например, ромиплостим) используется для лечения расстройства, описанного здесь, например, хронической идиопатической (иммунной) тромбоцитопенической пурпуры (ИТП).

В одном варианте слитый белок содержит внеклеточный CD2-связывающий участок лейкоцитарного антигена-3 (LFA-3) лейкоцитарной человека, слитый с Fc-областью человеческого IgG1. В одном варианте осуществления слитый белок представляет алефацепт. В одном варианте осуществления слитый белок (например, алефацепт) используется для лечения расстройства, описанного здесь, например, аутоиммунного заболевания (например, псориаза) или рака (например, Т-клеточной кожной лимфомы или Т-клеточной неходжкинской лимфомы).

В одном варианте слитый белок содержит фактор свертывания крови.

В одном варианте слитый белок содержит фактор IX, слитый с Fc-областью IgG1. В еще одном варианте слитый белок содержит фактор VIII, слитый с Fc-областью IgG1. В одном варианте осуществления слитый белок (например, слитый белок FIX-Fc или слитый белок FVIII-Fc) используется для лечения расстройства, описанного здесь, например, гемофилии А или гемофилии В.

В одном варианте слитый белок содержит один или более сайтов гликозилирования или является гликозилированным. В еще одном варианте осуществления слитый белок не содержит сайта гликозилирования или не является гликозилированным.

В одном варианте осуществления единственными аминокислотами в слитом белке являются канонические аминокислоты. В одном варианте осуществления слитый белок содержит встречающиеся в природе аминокислоты; их аналоги, производные и конгенеры; аналоги аминокислот, имеющие вариантные боковые цепи; и/или все стереоизомеры любого из вышеуказанного. Слитый белок может содержать D- или L-оптические изомеры аминокислот и пептидомиметики.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ получения слитого белка, раскрытого здесь. Слитые белки, описанные здесь, можно получить любым подходящим методом рекомбинантной ДНК. В одном варианте осуществления способ включает культивирование клетки, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую слитый белок, в условиях, которые обеспечивают продукцию слитого белка. В еще одном варианте осуществления способ дополнительно включает выделение или очистку слитого белка. В еще одном варианте осуществления способ дополнительно включает оценку эффективности слитого белка в клеточном анализе или на животной модели. В еще одном варианте осуществления способ дополнительно включает введение слитого белка субъекту, например, человеку.

Настоящее изобретение обеспечивает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую вышеуказанные слитые белки, векторы и клетки-хозяева. Молекула нуклеиновой кислоты включает, не ограничивается этим, РНК, геномную ДНК и кДНК.

Fc-область

Область «кристаллизуемого фрагмента» или Fc-область относится к области иммуноглобулина, которая способна взаимодействовать с Fc-рецептором. В одном варианте осуществления Fc-область также способна взаимодействовать с белком системы комплемента. Не желая связываться с теорией, полагается, что в одном варианте осуществления взаимодействие между Fc-областью и Fc-рецептором позволяет активировать иммунную систему.

В антителах изотипов IgG, IgA и IgD встречающаяся в природе Fc-область обычно содержит два идентичных белковых фрагмента, полученных из второго и третьего константных доменов двух тяжелых цепей антитела. Встречающиеся в природе Fc-области IgM и IgE обычно содержат три константных домена тяжелой цепи (домены C_H 2-4) в каждой полипептидной цепи. Fc-области IgG могут содержать высококонсервативный сайт N-гликозилирования (Stadlmann et al. (2008). Proteomics, 8 (14): 2858-2871; Stadlmann (2009) Proteomics, 9 (17): 4143-4153). Не желая связываться с теорией, полагается, что в одном варианте осуществления гликозилирование Fc-фрагмента вносит вклад в опосредованную Fc-рецептором активность (Peipp et al. (2008) Blood, 112 (6): 2390-2399). В одном варианте осуществления N-гликаны, присоединенные к этому сайту, являются преимущественно ядро-фукозилированными биантенными структурами сложного типа. В еще одном варианте осуществления небольшие количества этих N-гликанов также содержат бисекторные остатки GlcNAc и/или α-2,6-связанной сиаловой кислоты.

Примерная аминокислотная последовательность Fc-области показана ниже.

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 1)

В SEQ ID NO: 1 первый аминокислотный остаток в этой последовательности обозначен здесь как положение 118. Три гистидина, выделенные жирным шрифтом и подчеркнутые, представляют собой положения 310, 433 и 435 соответственно.

Полипептид (например, молекула антитела или слитый белок), описанный здесь, может иметь одну или более (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более) мутаций или комбинаций мутаций, описанных в таблице 1.

Таблица 1
Типичные мутации Fc Название Мутация FcMut001 I253M FcMut002 L309H_D312A_N315D FcMut003 L309N FcMut004 M252E_S254R FcMut005 M252E_S254R_R255Y FcMut006 S254H FcMut007 S254M FcMut008 T256D_T307R FcMut009 T256L_N286I_T307I FcMut010 T256I_N286I_T307I FcMut011 K248S_D376Q FcMut012 K248S_D376N FcMut013 D376Q_E380A FcMut014 D376N_E380A FcMut015 D376Q_M428L FcMut016 K248S_A378I FcMut017 L314K FcMut018 T250Q_M428L FcMut019 M428L_N434A FcMut020 N434A FcMut021 T307A_E380A_N434A FcMut022 M252W FcMut023 V308F FcMut024 V308F_N434Y FcMut026 T256D_T307R_D376N FcMut027 L309R_D312E FcMut028 L309R_Q311P_D312E FcMut029 K246N_P247A FcMut030 K246N_P247A_D376N FcMut031 T256E_T307R FcMut032 T256R_T307D FcMut033 T256R_T307E FcMut034 Q311P FcMut035 D376Q FcMut036 L234A_L235A FcMut037 L235V_G236A FcMut038 L234P_L235P FcMut039 L235P FcMut040 P329G FcMut041 P329E FcMut042 E233K FcMut043 T256D_N286D_A287S_T307R FcMut044 T256D_P257L_T307R FcMut045 T256D_T307R_Q311V FcMut046 P247D_T256D_T307R FcMut047 P247D_N286D_A287S_Q311V FcMut048 P257M_V308N FcMut049 V279I_Q311L_N315T FcMut050 M428L_N434S FcMut051 N434S FcMut052 H433G_N434P FcMut053 V259I_V308F_M428L FcMut067 T256D_N286D_T307R FcMut068 T256D_N286E_T307R FcMut069 T256D_N286Q_T307R FcMut070 T256D_P257T_T307R FcMut071 T256D_P257V_T307R FcMut072 T256D_T307R_Q311I FcMut073 T256D_T307R_Q311L FcMut074 T256D_T307R_Q311M FcMut075 T256D_P257L_N286D_T307R_Q311V FcMut076 T256D_T307R_M428L FcMut077 M428L FcMut078 M252Y_S254T_T256Q FcMut079 M252Y_S254T_T256E_K288E FcMut080 T256K_K288E FcMut081 T256D_E258T FcMut082 E283Q_H285E FcMut083 R344D_D401R FcMut084 K248E_E380K FcMut085 K248E_E380R FcMut086 K246H FcMut087 K248H FcMut088 T250I FcMut089 T250V FcMut090 L251F FcMut091 L251M FcMut093 P257V FcMut094 N276D FcMut095 H285N FcMut096 H285D FcMut097 K288H FcMut098 K288Q FcMut099 K288E FcMut100 T307E FcMut101 T307Q FcMut102 V308P FcMut103 V308I FcMut104 V308L FcMut105 L309H FcMut106 L309M FcMut107 Q311H FcMut108 L314F FcMut109 Y319H FcMut110 I336T FcMut111 P343D FcMut112 P343V FcMut113 E345Q FcMut114 P346V FcMut115 P374T FcMut116 D376N FcMut117 A378S FcMut118 A431T FcMut119 A431P FcMut120 A431G FcMut121 L432V FcMut122 L432I FcMut123 L432Q FcMut124 N434T FcMut125 H435N FcMut126 Y436H FcMut127 K439Q FcMut128 T256D FcMut129 T307R FcMut130 A378T FcMut131 A378D FcMut132 A378H FcMut133 A378Y FcMut134 A378V FcMut135 D376R FcMut136 D376F FcMut137 D376W FcMut138 L314H FcMut139 L432E_T437Q FcMut140 D376Q_A378T FcMut141 D376Q_I377M_A378T FcMut142 P244Q_D376Q FcMut143 P247T_A378T FcMut144 P247N_A378T FcMut145 T256D_T307R_L309T FcMut146 A339T_S375E_F404Y FcMut147 L235V_G236A_T256D_T307R FcMut148 L235V_G236A_D376Q_M428L FcMut149 L314N FcMut150 N315D FcMut151 A378T FcMut152 T437Q FcMut153 L432E FcMut154 Y436R FcMut155 L314M FcMut156 L234A_L235A_T256D_T307R_Q311V FcMut157 L234A_L235A_T256D_P257V_T307R FcMut158 L234A_L235A_T256D_P257L_N286D_T307R_Q311V FcMut159 L235V_G236A_T256D_T307R_Q311V FcMut160 L235V_G236A_T256D_P257V_T307R FcMut161 L235V_G236A_T256D_P257L_N286D_T307R_Q311V FcMut162 S267T_A327N_A330M FcMut163 S267T_A327N FcMut164 L235V_G236A_S267T_A327N_A330M FcMut165 L235V_G236A_S267T_A327N FcMut166 M252Y_S254T FcMut167 T256E FcMut168 G236A_I332E FcMut169 S239D_I332E FcMut170 G236A_S239D_I332E FcMut171 T256D_N286D_T307R_Q311V FcMut172 T256D_E258T_T307R FcMut173 T256D_E258T_T307R_Q311V FcMut174 T256D_P257V_E258T_T307R FcMut175 T256D_P257L_E258T_N286D_T307R_Q311V FcMut176 T256D_E258T_N286D_T307R_Q311V FcMut177 A378V_M428L FcMut178 A378V_M428I FcMut179 A378V_M428V FcMut180 T256D_N286D FcMut181 T256D_A378V FcMut182 T256D_Q311V FcMut183 T256D_Q311V_A378V FcMut184 T256D_T307R_A378V FcMut185 T256D_N286D_T307R_A378V FcMut186 T256D_T307R_Q311V_A378V FcMut187 H285D_A378V FcMut188 H285D_Q311V FcMut189 T256D_H285D FcMut190 T256D_H285D_Q311V FcMut191 T256D_H285D_T307R FcMut192 T256D_H285D_T307R_A378V FcMut193 H285D_L314M_A378V FcMut194 T256D_E258T_H285D_Q311H FcMut195 T256D_E258T_H285D FcMut196 H285D_N315D FcMut197 H285N_T307Q_N315D FcMut198 H285D_L432E_T437Q FcMut199 T256D_E258T_N315D FcMut200 P257V_H285N FcMut201 H285N_L432F FcMut202 H285N_T437I FcMut203 T256D_E258T_L314M FcMut204 T256D_E258T_T307Q FcMut205 T256D_E258T_A378V FcMut206 V308P_A378V FcMut207 P257V_A378T FcMut208 P257V_V308P_A378V FcMut209 N315D_A378T FcMut210 H285N_L314M FcMut211 L314M_L432E_T437Q FcMut212 T307Q_N315D FcMut213 H285D_T307Q_A378V FcMut214 L314M_N315D FcMut215 T307Q_Q311V_A378V FcMut216 H285D_Q311V_A378V FcMut217 Q311V_N315D_A378V FcMut218 T256D_E258T_Q311V FcMut219 T256D_N315D_A378V FcMut220 T256D_Q311V_N315D FcMut221 T256D_T307Q_A378V FcMut222 T256D_T307Q_Q311V FcMut223 T256D_H285D_A378V FcMut224 T256D_H285D_T307R_Q311V FcMut225 T256D_H285D_N286D_T307R FcMut226 T256D_H285D_N286D_T307R_Q311V FcMut227 T256D_H285D_N286D_T307R_A378V FcMut228 T256D_N286D_T307R_Q311V_A378V FcMut229 T256D_H285D_T307R_Q311V_A378V FcMut230 V308P_Q311V_A378V FcMut231 T256D_V308P_A378V FcMut232 T256D_V308P_Q311V FcMut233 T256D_E258T_V308P FcMut234 H285D_V308P_Q311V FcMut242 E258T FcMut243 N286D FcMut244 Q311V YTE M252Y_S254T_T256E

В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut001. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut002. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut003. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut004. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut005. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut006. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut007. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut008. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut009. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut010. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut011. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut012. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut013. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut014. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut015. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut016. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut017. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut018. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut019. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut020. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut021. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut022. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut023. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut024. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut026. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut027. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut028. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut029. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut030. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut031. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut032. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut033. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut034. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut035. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut036. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut037. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut038. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut039. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut040. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut041. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut042. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut043. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut044. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut045. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut046. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut047. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut048. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut049. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut050. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut051. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut052. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut053. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut067. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut068. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut069. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut070. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut071. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut072. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut073. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut074. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut075. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut076. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut077. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut078. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut079. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut080. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut081. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut082. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut083. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut084. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut085. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut086. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut087. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut088. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut089. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut090. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut091. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut093. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut094. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut095. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut096. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut097. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut098. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut099. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut100. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut101. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut102. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut103. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut104. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut105. В одном вариантеосуществления Fc-область содержит FcMut106. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut107. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut108. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut109. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut110. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut111. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut112. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut113. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut114. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut115. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut116. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut117. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut118. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut119. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut120. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut121. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut122. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut123. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut124. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut125. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut126. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut127. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut128. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut129. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut130. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut131. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut132. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut133. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut134. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut135. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut136. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut137. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut138. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut139. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut140. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut141. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut142. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut143. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut144. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut145. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut146. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut147. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut148. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut149. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut150. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut151. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut152. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut153. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut154. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut155. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut156. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut157. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut158. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut159. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut160. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut161. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut162. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut163. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut164. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut165. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut166. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut167. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut168. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut169. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut170. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut171. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut172. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut173. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut174. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut175. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut176. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut177. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut178. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut179. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut180. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut181. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut182. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut183. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut184. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut185. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut186. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut187. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut188. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut189. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut190. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut191. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut192. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut193. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut194. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut195. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut196. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut197. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut198. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut199. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut200. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut201. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut202. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut203. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut204. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut205. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut206. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut207. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut208. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut209. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut210. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut211. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut212. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut213. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut214. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut215. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut216. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut217. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut218. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut219. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut220. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut221. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut222. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut223. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut224. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut225. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut226. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut227. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut228. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut229. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut230. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut231. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut232. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut233. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut234. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut242. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut243. В одном варианте осуществления Fc-область содержит FcMut244.

В одном варианте осуществления Fc-область содержит одну или более (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более) мутаций или комбинаций мутаций, выбранных из FcMut045, FcMut171, FcMut183, FcMut186, FcMut190 , FcMut197, FcMut213, FcMut215, FcMut216, FcMut219, FcMut222, FcMut223, FcMut224, FcMut226, FcMut227, FcMut228 или FcMut229. В одном варианте осуществления Fc-область содержит одну или более (например, 2, 3, 4, 5, 6 или все) мутаций или комбинаций мутаций, выбранных из FcMut045, FcMut183, FcMut197, FcMut213, FcMut215, FcMut228 или FcMut156. В еще одном варианте осуществления Fc-область содержит одну или более (например, 2, 3, 4, 5 или все) мутаций или комбинаций мутаций, выбранных из FcMut183, FcMut197, FcMut213, FcMut215, FcMut228 или FcMut229.

В одном варианте осуществления Fc-область не содержит одну или более (например, 2, 3, 4 или все) мутаций или комбинаций мутаций, выбранных из FcMut018, FcMut021, FcMut050, FcMut102 или YTE. В одном варианте осуществления Fc-область содержит одну или более (например, 2, 3, 4 или все) мутаций или комбинаций мутаций, выбранных из FcMut018, FcMut021, FcMut050, FcMut102 или YTE, и одну или более других мутаций или комбинаций мутаций, приведенных в таблице 1.

В варианте осуществления Fc-область содержит одну или более (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более) мутаций или комбинаций мутаций, приведенных в таблице 1, которые приводят к синергическому эффекту (например, в аффинности связывания или периоде полураспада в крови), как здесь описано.

В одном варианте осуществления Fc-область содержит одну или более (например, 2, 3, 4, 5, 6 или 7) мутаций в остатках, выбранных из T256, H285, N286, T307, Q311, N315 или A378. В одном варианте осуществления Fc-область содержит одну или более (например, 2, 3, 4, 5, 6 или 7) мутаций, выбранных из T256D, H285N, N286D, T307Q, Q311V, N315D или A378V.

В одном варианте осуществления Fc-область содержит мутацию, приводящую к увеличению периода полураспада, мутацию, которая способна нарушать эффекторную функцию Fc, или обе. В одном варианте осуществления Fc-область содержит одну или более мутаций или комбинаций мутаций, описанных здесь, например, выбранных из M252W, V308F/N434Y, R255Y, P257L/N434Y, V308F, P257N/M252Y, G385N, P257N/V308Y, N434Y, M252Y/S254T/T256E («YTE»), M428L/N434S («LS») или любую их комбинацию. Альтернативно или дополнительно, в варианте осуществления Fc-область содержит: (а) одну или более (например, 2, 3, 4, 5 или все) комбинаций мутаций, выбранных из: T256D/Q311V/A378V, H285N/ T307Q/N315D, H285D/T307Q/A378V, T307Q/Q311V/A378V, T256D/N286D/ T307R/Q311V/A378V или T256D/T307R/Q311V; (b) мутацию или комбинацию мутаций, способных нарушать эффекторную функцию Fc, например, L234A/L235A (также известную как мутация «LALA»), или (c) обе (a) и (b).

В одном варианте осуществления Fc-область содержит мутации T256D/Q311V/A378V и мутацию или комбинацию мутаций, способных нарушать эффекторную функцию Fc, например L234A/L235A. В одном варианте осуществления Fc-область содержит мутации H285N/T307Q/ N315D и мутацию или комбинацию мутаций, способных нарушать эффекторную функцию Fc, например L234A/L235A. В одном варианте осуществления Fc-область содержит мутации H285D/T307Q/A378V и мутацию или комбинацию мутаций, способных нарушать эффекторную функцию Fc, например L234A/L235A. В одном варианте осуществления Fc-область содержит мутации T307Q/Q311V/A378V и мутацию или комбинацию мутаций, способных нарушать эффекторную функцию Fc, например, L234A/L235A. В одном варианте осуществления Fc-область содержит мутации T256D/N286D/T307R/Q311V/A378V и мутацию или комбинацию мутаций, способных нарушать эффекторную функцию Fc, например, L234A/L235A. В одном варианте осуществления Fc-область содержит мутации T256D/T307R/Q311V и мутацию или комбинацию мутаций, способных нарушать эффекторную функцию Fc, например, L234A/L235A.

Ниже приведена аминокислотная последовательность эталонной Fc-области (включающую нумерацию, использованную здесь) (например, для идентификации положений мутаций, описанных здесь). Последовательность домена CH2 подчеркнута; последовательность шарнирной области выделена курсивом, и последовательность домена СН3 выделена жирным шрифтом.

118 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL

175 QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPA

232 PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN

287 AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP

344 REPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS

401 DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 1)

Любая из мутаций, обеспечивающих увеличение периода полураспада, описанных здесь, может быть использована в комбинации с любой мутацией Fc, способной усиливать или нарушать эффекторную функцию Fc.

Fc-область может связываться с различными клеточными рецепторами (например, Fc-рецепторами) и белками системы комплемента. Fc-область также может опосредовать различные физиологические эффекты молекул антител, например, обнаружение опсонизированных частиц; лизис клеток; дегрануляцию тучных клеток, базофилов и эозинофилов; и другие процессы.

Существует несколько различных типов Fc-рецепторов (FcR), которые можно классифицировать по типу антител, которые они распознают.

Рецепторы Fcγ (FcγR) относятся к суперсемейству иммуноглобулинов и участвуют, например, в индукции фагоцитоза опсонизированных микробов. Это семейство включает несколько членов, FcγRI (CD64), FcγRIIA (CD32), FcγRIIB (CD32), FcγRIIIA (CD16a), FcγRIIIB (CD16b), которые различаются по аффинности к антителам за счет их различной молекулярной структуры. Например, FcγRI может связываться с IgG сильнее, чем FcγRII или FcγRIII. FcγRI также имеет внеклеточный участок, содержащий три иммуноглобулин (Ig)-подобных домена, на один домен больше, чем FcγRII или FcγRIII. Это свойство позволяет FcγRI связываться с одной молекулой IgG (или мономером), но рецепторы Fcγ, как правило, должны связываться с несколькими молекулами IgG в иммунном комплексе для активации.

Рецепторы Fcγ различаются по своей аффинности к IgG, и разные подклассы IgG могут иметь уникальные аффинности к каждому из рецепторов Fcγ. Эти взаимодействия могут дополнительно регулироваться гликаном (олигосахаридом) в определенном положении IgG. Например, создавая стерическое препятствие, фукозосодержащие гликаны CH2-84.4 снижают аффинность IgG к FcγRIIIA, в то время как гликаны G0, у которых отсутствует галактоза и которые вместо заканчиваются группами GlcNAc, имеют повышенную аффинность к FcγRIIIA (Maverakis et al. (2015) Journal of Autoimmunity 57 (6): 1-13)

Неонатальный рецептор Fc (FcRn) экспрессируется на нескольких типах клеток и по структуре сходен с МНС класса I. Этот рецептор также связывается с IgG и участвует в сохранении этого антитела (Zhu et al. (2001). Journal of Immunology 166 (5): 3266-76). FcRn также участвует в передаче IgG от матери через плаценту плоду или с молоком ее младенцу при грудном вскармливании. Данный рецептор также может играть роль в гомеостазе сывороточных уровней IgG.

FcαRI (или CD89) относится к подгруппе FcαR. FcαRI обнаружен на поверхности нейтрофилов, эозинофилов, моноцитов, макрофагов (включая купферовские клетки) и дендритных клеток. Он включает два внеклеточных Ig-подобных домена и является членом как суперсемейства иммуноглобулинов, так и семейства многоцепочечных рецепторов иммунного распознавания (MIRR). Он передает сигналы, связываясь с двумя сигнальными цепями FcRγ.

Рецептор Fc-альфа/мю (Fcα/μR) представляет собой трансмембранный белок I типа. Он может связываться с IgA, хотя обладает более высокой аффинностью к IgM (Shibuya and Honda (2006) Springer Seminars in Immunopathology 28 (4): 377-82). За счет наличия одного Ig-подобного домена во внеклеточной части данный Fc-рецептор также является членом суперсемейства иммуноглобулинов.

Существует два известных типа FcεR. Высокоаффинный рецептор FcRI является членом суперсемейства иммуноглобулинов (он имеет два Ig-подобных домена). FcRI обнаружен на эпидермальных клетках Лангерганса, эозинофилах, тучных клетках и базофилах. Данный рецептор может играть роль в контроле аллергических ответных реакций. FcRI также экспрессируется на антигенпрезентирующих клетках и контролирует выработку иммунных медиаторов, например, цитокинов, которые индуцируют воспаление (von Bubnoff et al. (2003) Clinical and Experimental Dermatology 28 (2): 184-7). Низкоаффинный рецептор FcRII (CD23) представляет собой лектин С-типа. FcεRII выполняет многочисленные функции в виде связанного с мембраной или растворимого рецептора. Он также может контролировать рост и дифференцировку В-клеток и блокирует связывание IgE эозинофилами, моноцитами и базофилами (Kikutani et al. (1989) Ciba Foundation Symposium 147: 23-31).

В одном варианте осуществления Fc-область может быть сконструирована таким образом, чтобы она содержала антигенсвязывающий сайт с образованием фрагмента Fcab (Wozniak-Knopp et al. (2010) Protein Eng Des 23 (4): 289-297). Фрагменты Fcab могут быть вставлены в полноразмерный иммуноглобулин заменой Fc-области, с получением, таким образом, биспецифического антитела (с Fab- и Fcab-областями, содержащими разные сайты связывания).

Связывание и рециркуляция FcRn могут быть иллюстрированы ниже. Например, IgG и альбумин интернализуются в эндотелиальные клетки сосудов посредством пиноцитоза. рН эндосомы составляет 6,0, что облегчает ассоциацию с мембраносвязанным FcRn. Содержимое эндосом может процессироваться одним из двух путей: рециклингом в апикальную клеточную мембрану или трансцитозом из апикальной в базолатеральную сторону. IgG, не связанный с FcRn, расщепляется лизосомами.

Не желая связываться с теорией, полагается, что взаимодействие FcRn с IgG опосредуется через Fc. Связывание Fc с FcRn является рН-специфичным, например, значительное связывание отсутствует при рН 7,4 и сильное связывание имеет место в кислой среде. Структура FcRn в комплексе с Fc-областью молекулы IgG1 известна и показана на фиг. 1. Каждая молекула FcRn обычно связывается с Fc-мономером. В одном варианте осуществления Fab-домены также могут влиять на связывание IgG с FcRn, например, могут оказывать негативное влияние или не влиять на аффинность IgG к FcRn.

Можно привести несколько обоснований для конструирования Fc-области с целью увеличения периода полураспада полипептида. Например, для увеличения периода полураспада и эффективной рециркуляции молекул антител или слитых белков часто требуется рН-специфическое повышение аффинности (например, только при низком рН эндосомы). FcRn связывается проксимальнее линкерной области между доменами CH2 и CH3 Fc-области. Модификации линкера могут влиять на взаимодействие Fc с рецепторами Fcγ. Модификации в Fc-области могут влиять на термостабильность и агрегационные свойства полипептида.

Оптимизация связывания FcRn: уменьшение влияния на другие эффекторные функции

В одном варианте осуществления полипептид (например, молекула антитела или слитый белок), описанный здесь, имеет такую же аффинную функцию или эффекторную функцию, которая существенно не изменяется (например, уменьшается более чем на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%) (например, эффекторная функция, описанная здесь). В одном варианте осуществления эффекторная функция не ассоциирована со связыванием Fc-области и FcRn.

Аминокислотные остатки, которые подвергаются мутации, можно выбрать, по меньшей мере, частично, на основе структурных или функциональных свойств одного или более сайтов связывания в Fc-области. Эти сайты связывания включают, не ограничиваясь этим, сайт связывания с белом А, сайт связывания с C1q, сайт связывания с FcγRI, сайт связывания с FcγRIIa, сайт связывания с FcγRIIIa или сайт связывания с FcRn, например, как показано на фиг. 2. Сайты связывания могут также включать сайт связывания с TRIM21, например, один или более остатков, выбранных из петли 308-316, петли 252-256 или петли 429-436 IgG. В одном варианте осуществления линкерная область между доменами CH2 и CH3 может оказывать влияние на динамику домена CH2, который воздействует на связывание с FcγR.

Структурная основа для pH-специфического взаимодействия с FcRn

Не желая связываться с теорией, полагается, что низкое значение рН эндосомы приводит к протонированию поверхностных гистидинов в доменах СН2 и СН3. Например, протонирование остатка Н310 в СН2 и/или Н433 в СН3 может быть важным для взаимодействия с FcRn, например, при низком значении рН (например, при рН 6,0). Протонирование также может привести к изменению конформационной динамики области, такому как лучшая экспозиция или экранирование линкерной области для связывания растворителя или молекулы лиганда. Следовательно, в одном варианте осуществления полипептид (например, молекула антитела или слитый белок) содержит мутацию в остатке H310, мутацию в остатке H433 или обе. Один или более остатков, смежных с остатками H310 и/или H433, также могут быть мутированы. Полипептид также может включать компенсаторную или полезную мутацию, например мутацию, которая является компенсаторной или полезной для любой из вышеуказанных мутаций, например, для уменьшения негативных последствий этой мутации (например, полярная против неполярной, заряженная против незаряженной, положительно заряженная (основная) против отрицательно заряженной (кислотной) или гидрофобная против гидрофильной). Например, P247D может быть компенсаторной или полезной мутацией.

В одном варианте осуществления протонирование гистидина может привести к дополнительным конформационным изменениям, включая, например, перемещение/смещение остатков поверхности раздела линкер/CH2/CH3. Кристаллические структуры Fc-областей кристаллизовали при различных значениях pH. Как показано на фиг. 3, анализ двух кристаллических структур с высоким разрешением Fc-областей, кристаллизованных при pH 6,5 (голубой) и 5,0 (зеленый), показал потенциальные различия.

Картирование поверхности раздела взаимодействия Fc-FcRn

В одном варианте осуществления полипептид (например, молекула антитела или слитый белок), описанный здесь, содержит мутацию, которая может изменять взаимодействие между Fc-областью и FcRn. В одном варианте осуществления мутация выбрана, по меньшей мере, частично, на основе структурной характеристики поверхности раздела взаимодействия Fc-FcRn.

В одном варианте осуществления Fc-область мономера иммуноглобулина может иметь структуру, показанную на фиг. 4. Как показано на фиг. 4, черная пунктирная линия обозначает поверхность раздела взаимодействия Fc-FcRn. Структура включает контактные остатки FcRn и остатки Fc, повышающие аффинность к FcRn, например, как здесь описано. Остатки Н310 и Н435, которые расположены в доменах СН2 и СН3 соответственно, в первую очередь ответственны за рН-зависимые взаимодействия Fc-FcRn. В одном варианте осуществления FcRn связывается с Fc-областью между ее доменами CH2 и CH3. В еще одном варианте осуществления сайт связывания Fc-FcRn располагается через оба домена CH2 и CH3 Fc мономера.

Сетевой обзор взаимодействия Fc-FcRn дает представление о совместных заменах аминокислот

В одном варианте осуществления полипептид (например, молекула антитела или слитый белок), описанный здесь, содержит множество мутаций, которые могут изменять взаимодействие между Fc-областью и FcRn. В одном варианте осуществления мутация выбрана, по меньшей мере, частично, на основе сетевого представления взаимодействия Fc-FcRn.

Не желая связываться с теорией, полагается, что в одном варианте осуществления остаток H310 играет центральную роль во взаимодействии с FcRn, например, как определено сетевым анализом комплекса Fc-FcRn. Как показано на фиг. 5, остаток H310 тесно связан с множеством других сильно связанных остатков. В варианте осуществления мутация в кластере H310 и соседних (соединенных узлах) может усилить сеть H310. Анализ субсетей информирует о введении синергетических мутаций для благоприятного взаимодействия FcRn с уменьшенным или минимальным воздействием на другие остатки Fc.

Обоснование конструирования для оптимизации связывания FcRn

В одном варианте осуществления полипептид (например, молекула антитела или слитый белок), описанный здесь, может быть сконструирован для оптимизации связывания Fc-FcRn.

В одном варианте осуществления полипептид, имеющий мутацию в Fc-области, обладает рН-специфическим повышением аффинности по сравнению с эталонным полипептидом (например, идентичным в других отношениях полипептидом без мутации). В одном варианте осуществления повышение аффинности достигается за счет усиления ван-дер-ваальсового взаимодействия. В одном варианте осуществления повышение аффинности не достигается введением водородных связей и/или электростатического взаимодействия. В одном варианте осуществления мутация не изменяет или вызывает небольшое или минимальное изменение конформации линкерной области между доменами CH2 и CH3. В одном варианте осуществления полипептид содержит множество мутаций в обоих доменах (четыре круга). В одном варианте осуществления полипептид не содержит крупный кластер гидрофобных или ароматических остатков на поверхности.

В одном варианте осуществления полипептид содержит мутацию, которая увеличивает силу взаимодействия между Fc-областью и FcRn или уменьшает константу диссоциации (K_d) для FcRn, например, при кислом значении pH. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутацию, которая снижает скорость диссоциации (k_off) для FcRn, например, при кислом значении pH. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутацию, которая увеличивает скорость ассоциации (k_on) для FcRn, например, при кислом значении pH. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутацию, которая уменьшает скорость диссоциации (k_off) для FcRn и увеличивает скорость ассоциации (k_on) для FcRn, например, при кислом значении pH. В одном варианте осуществления полипептид содержит мутацию, которая снижает скорость диссоциации (k_off) для FcRn и не влияет или существенно не влияет на скорость ассоциации (k_on) для FcRn, например, при кислом значении pH. Не желая связываться с теорией, полагается, что в одном варианте осуществления изобретения уменьшение константы диссоциации K_d для FcRn в основном обусловлено снижением скорости диссоциации (k_off) для FcRn, а не увеличением скорости ассоциации (k_on).

Экспериментальная оценка: оценка мутаций Fc по нескольким показателям и с использованием разных аналитических платформ

Полипептиды (например, молекулы антител или слитые белки), описанные здесь, можно оценить с использованием ряда методов. рН-специфическое связывание Fc-FcRn (например, связывание при рН 6,0 и рН 7,4) можно определить, например, с помощью анализа на основе системы Octet, конкурентного анализа (например, проточной цитометрией) или поверхностного плазмонного резонанса (SPR).

Может быть выполнена биофизическая характеристика (например, термостабильность, агрегация или экспрессия). Термостабильность можно определить, например, с использованием красителя SYPRO Orange. Агрегация может быть измерена, например, с помощью SEC или ОФ-ВЭЖХ.

Можно тестировать эффекторные функции, например, относящиеся к FcγRI (например, с использованием анализа на основе системы Octet), FcγRIIIa, FcγRIIa, FcγRIIb (например, с использованием ELISA), C1q, ADCC или CDC.

Можно тестировать связывание с белком, содержащим трехсторонний мотив 21 (TRIM21). TRIM21 является цитозольным рецептором, который связывается с Fc-областью IgG. TRIM21 играет роль в опосредовании внутриклеточного распознавания и нейтрализации Fc-связанных патогенов, таких как вирусы, бактерии и грибы. Например, TRIM21 играет важную роль в нейтрализации вирусов без оболочки (McEwan et al. Nat. Immunol., 2013; 14 (4): 327-36). Затем была установлена его роль в направлении иммунных комплексов на деградацию (McEwan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2017; 114 (3): 574-579). TRIM21 связывается с поверхностью раздела CH2:CH3 Fc-области антитела, которая перекрывается с сайтом связывания FcRn. Некоторые мутации Fc-области, которые повышают аффинность к FcRn, уменьшают аффинность для TRIM21 (Foss et al., J. Immunol., 2016; 196 (8): 3452-3459). Ключевые контактные остатки включают, например, положения 253, 433, 434 и 435. Вариант LS (M428L/N434S) содержит мутацию в положении 434, и было показано, что мутация N434S приводит к снижению связывания с TRIM21 в 10 раз. TRIM21-опосредованная нейтрализация известна как антителозависимая внутриклеточная нейтрализация (ADIN).

Можно тестировать поглощение слизистой оболочкой. FcRn транспортирует IgG через различные клеточные барьеры, такие как эпителий слизистой оболочки, выстилающий кишечник и поверхности альвеол. Модификация связывания FcRn обеспечивает механизм повышения локализации на слизистой оболочке, который обеспечивает иммунную защиту.

Период полураспада полипептида можно определить, например, с использованием трансгенных мышей (например, мышей Tg32 и Tg276 из лаборатории Jackson) или приматов (например, обезьян cynomolgus).

Примерные анализы описаны более подробно как следующие:

1. Анализ связывания FcRn

а. Анализ на основе системы Octet с иммобилизацией FcRn на биосенсорах NiNTA.

Иммобилизация FcRn на биосенсоре NiNTA через 6× гистидиновую метку (SEQ ID NO: 2) позволяет проводить последующее исследование связывания с молекулами IgG в кислых (рН 6,0) и физиологических (рН 7,4) условиях. Эта стратегия была описана ранее (1), и приведенное описание детализирует адаптацию указанного протокола. Вкратце, рекомбинантный человеческий FcRn в концентрации 5 мкг/мл нагружают на биосенсор NiNTA в течение 180 с. После 60-с базовой стадии в 1× PBS pH 6,0 наконечник, нагруженный FcRn, подвергают воздействию IgG в концентрации 250 нМ (37,5 мкг/мл) в течение 60 с с последующей диссоциацией в течение 60 с в PBS, pH 6,0 и дополнительно 30 с в PBS, pH 7,4. После завершения анализа проводят количественную оценку константы аффинности (K_D) при pH 6,0 с использованием программного обеспечения ForteBio octet, и качественную оценку проводят построением графика зависимости ответа от времени, что позволяет визуализировать ассоциацию IgG с FcRn при pH 6,0 и последующую диссоциацию при рН 6,0 и рН 7,4.

b. Анализ на основе системы Octet с иммобилизацией IgG на биосенсорах анти-CH1

Иммобилизация IgG на биосенсоре анти-СН1 позволяет проводить последующее исследование связывания с молекулами FcRn в кислых (рН 6,0) и физиологических (рН 7,4) условиях. Эта стратегия была описана ранее (2), и приведенное описание детализирует адаптацию указанного протокола. Вкратце, очищенный IgG в концентрации 5 мкг/мл нагружают на биосенсор анти-CH1 в течение 180 с. После 60-с базовой стадии в 1× PBS, pH 6,0 наконечник, нагруженный IgG, подвергают воздействию FcRn в концентрации 50 мкг/мл в течение 60 с с последующей диссоциацией в течение 60 с в PBS, pH 6,0 и дополнительно 30 с в PBS, рН 7,4. После завершения анализа проводят количественную оценку константы аффинности (K_D) при pH 6,0 с использованием программного обеспечения ForteBio octet, и качественную оценку проводят построением графика зависимости ответа от времени, что позволяет визуализировать ассоциацию IgG с FcRn при pH 6,0 и последующую диссоциацию при рН 6,0 и рН 7,4.

с. Клеточный анализ

Клеточные анализы также используются для тестирования взаимодействия между FcRn и IgG (Ref: PMID:23384837). Экспрессия связанного с мембраной FcRn на поверхности клетки тесно отражает физиологическую презентацию FcRn, где плазматическая мембрана и молекулярные ориентации оказывают влияние на взаимодействие между FcRn и IgG. Анализ, используемый здесь, представляет конкурентный анализ, в котором IgG, представляющие интерес, оценивают на их способность конкурировать за связывание с клетками флуоресцентно меченного, конкурентного высокоаффинного Fc-реагента (Fc-A488). Клетки Expi293, экспрессирующие полноразмерный мембраносвязанный гетеродимер FcRn, инкубируют со смесями с постоянной концентрацией Fc-A488 (0,5 мкг/мл) и различными концентрациями IgG, представляющим интерес (0,001-10 мкМ). Связанную с клетками флуоресценцию детектируют проточной цитометрией. IgG с повышенным связыванием с FcRn будут конкурировать с Fc-конкурентом при более низких концентрациях IgG. Данный анализ является надежным, линейным и специфичным и может использоваться для демонстрации различий в относительном связывании вариантов IgG/Fc с FcRn.

2. Анализ термостабильности

Стабильность вариантов IgG оценивали с помощью дифференциальной сканирующей флуориметрии (DSF), представляющей анализ с использованием оранжевого красителя SYPRO^® для мониторинга развертывания белка при тепловом стрессе. SYPRO^® Orange представляет флуоресцентный краситель, который неспецифически связывается с гидрофобными поверхностями, и его флуоресценция гасится в водных средах. Белки начинают терять свою вторичную структуру и развертываются при повышении температуры, тем самым экспонируя их гидрофобные остатки ядра и позволяя красителю флуоресцировать. Максимальный флуоресцентный сигнал достигается при полном развертывании, после чего белок начинает агрегировать, уменьшая экспонированные гидрофобные остатки и, таким образом, уменьшая флуоресцентный сигнал. В средней точке между нативным состоянием и полностью развернутым состоянием белка находится температура перехода или температура плавления (Tm), которую можно использовать для непосредственного сравнения белковых конструкций или условий формуляции на предмет относительной стабильности.

В одном варианте осуществления факторы, отличные от связывания FcRn, также могут влиять на наблюдаемый период полураспада полипептида (например, молекулы антитела или слитого белка). Эти факторы могут включать, например, склонность к агрегации, неспецифическое связывание, стабильность или состав Fab.

В одном варианте осуществления мутация вводится не в Fc-область, например, для обеспечения существенного повышения периода полураспада в контексте субоптимальной матрицы. Например, полипептиды (например, молекулы антител или слитые белки) с более низким начальным периодом полураспада могут указывать на наличие субоптимальных свойств. Усилия при конструировании также могут быть сосредоточены на снижении основной причины более низкого периода полураспада, например, на поддержании необходимого профиля связывания (например, аффинности и/или специфичности), или на получении подходящих показателей для развития (например, стабильности, растворимости, уровня экспрессии или агрегация). В одном варианте осуществления дополнительное конструирование выполняется для полипептида (например, молекул антител или слитых белков) с субоптимальными биофизическими свойствами для реализации максимального увеличения периода полураспада.

Фармакокинетика

Полипептиды (например, молекулы антител или слитые белки), описанные здесь, могут иметь одно или более желаемых фармакокинетических свойств, например, одно или более (например, 2, 3, 4, 5 или более) фармакокинетических свойств, описанных здесь.

Фармакокинетику (ФК) можно использовать для определения судьбы соединений, введенных в живой организм. Исследования ФК можно использовать для анализа метаболизма лекарственного средства и определения судьбы лекарственного средства с момента его введения до момента его полного выведения из организма. Фармакокинетика описывает, например, как организм воздействует на конкретное лекарственное средство после введения в результате механизмов всасывания и распределения, химические изменения соединения в организме (например, под действием метаболических ферментов, таких как ферменты цитохром P450 или глюкуронозилтрансфераза), или эффекты и пути выделения метаболитов препарата. Фармакокинетические свойства лекарственных средств могут зависеть от таких факторов, как место введения и доза вводимого препарата, которые могут влиять на скорость всасывания. Фармакокинетику можно анализировать в сочетании с фармакодинамикой (например, изучением биохимических и физиологических эффектов лекарственных средств).

Для исследования фармакокинетики был разработан ряд различных моделей. Например, фармакокинетическое моделирование может выполняться с использованием бескамерных или камерных методов.

С использованием бескамерных методов оценивают экспозицию лекарственного средства, определением площади под кривой концентрация-время. Бескамерный ФК анализ существенно зависит от оценки общей экспозиции препарата. Общая экспозиция лекарственного средства часто оценивается методами на основе определения площади под кривой (AUC), где наиболее распространенным методом является метод трапеции (численное интегрирование). За счет зависимости от длины 'x' в методе трапеции, оценка площади сильно зависит от схемы отбора проб крови/плазмы. То есть, чем ближе друг к другу временные точки, тем лучше трапеции отражают фактическую форму кривой концентрация-время.

С использованием камерных методов оценивают кривую концентрация-время с использованием кинетических моделей. В камерном ФК анализе используются кинетические модели для описания и прогнозирования кривой концентрация-время. Камерные ФК модели часто сходны с кинетическими моделями, используемыми в других научных дисциплинах, таких как химическая кинетика и термодинамика. Преимущество камерного анализа по сравнению с некоторыми бескамерными анализами заключается в возможности прогнозировать концентрацию в любое время. Бескамерное моделирование, основанное на снятии кривой, не имеет этого ограничения. Простейшей ФК камерной моделью является однокамерная ФК модель с внутривенным введением болюса и исключением первого порядка. Более сложные ФК модели (например, модели PBPK) основаны на использовании физиологической информации для облегчения разработки и проверки.

В однокамерной модели кривая зависимости между различными вовлеченными факторами (например, дозой, концентрацией в плазме крови или элиминацией) дает прямую линию или приближение к ней (т. е. линейную фармакокинетику). Для того чтобы лекарственные средства были эффективными, они должны иметь возможность быстро перемещаться из плазмы крови в другие жидкости и ткани организма.

В многокамерных моделях график нелинейных отношений между различными факторами представлен кривой, затем можно найти отношения между факторами, рассчитав площади различных областей под кривой. Модели, используемые в нелинейной фармакокинетике, в значительной степени основаны на кинетике Михаэлиса-Ментена.

Различные камеры, на которые делится модель, обычно называются схемой ADME (также называемой LADME, если высвобождение включается как отдельная стадия от всасывания): высвобождение (например, процесс высвобождения лекарственного препарата из фармацевтической композиции); всасывание (например, процесс попадания вещества в кровь); распределение (например, дисперсия или распространение веществ по жидкостям и тканям организма); метаболизм (или биотрансформация, или инактивация) (например, распознавание организмом присутствия чужеродного вещества и необратимое превращение исходных соединений в дочерние метаболиты); и выделение (например, удаление веществ из организма). В редких случаях некоторые лекарственные препараты необратимо накапливаются в тканях организма. Две фазы метаболизма и экскреции также могут быть сгруппированы вместе под названием элиминации.

Все эти параметры могут быть представлены с использованием математических формул, которые имеют соответствующее графическое представление. Использование этих моделей позволяет понять свойства молекулы, а также то, как конкретное лекарственное средство будет вести себя, с учетом информации о некоторых из его основных характеристиках, таких как его константа диссоциации кислоты (pKa), биодоступность и растворимость, способность к всасыванию и распределение в организме.

Выходные данные модели для лекарственного средства могут быть использованы в производственных целях (например, при расчете биоэквивалентности при разработке препаратов дженериков) или в клиническом применении фармакокинетических концепций. Клиническая фармакокинетика обеспечивает ряд рекомендаций по эффективному и действенному применению лекарственных средств для специалистов в области гуманной медицины и ветеринарии.

Примерные фармакокинетические свойства включают, не ограничиваясь этим, дозу (например, количество введенного лекарственного средства), интервал дозирования (например, время между введениями лекарственного средства), C_max (например, максимальную концентрацию лекарственного средства в плазме после введения), t_max (например, время достижения C_max), C_min (например, самую низкую концентрацию, которую лекарственное средство достигает до введения следующей дозы), объем распределения (например, кажущийся объем распределения лекарственного средства, например, отношение концентрации лекарственного средства к количеству лекарственного средства в организме), концентрацию (например, количество лекарственного средства в данном объеме плазмы), период полувыведения или период полураспада (например, время, необходимое для того, чтобы концентрация лекарственного средства достигла половины от ее исходного значения), константу скорости элиминации (например, скорость, с которой препарат выводится из организма), скорость инфузии (например, скорость инфузии, необходимой для баланса элиминации), площадь под кривой (например, интеграл кривой концентрация-время, например, после однократного приема или в состоянии равновесия), клиренс (например, объем плазмы, очищенной от лекарственного средства в единицу времени), биодоступность (например, системно доступная фракция лекарственного средства) или колебание (например, максимальное колебание в пределах одного интервала дозирования в состоянии равновесия).

Фармакокинетические свойства могут быть определены различными методами. Например, можно использовать биоаналитические методы для построения профиля концентрация-время. Можно использовать химические методы для измерения концентрации лекарственного средства в биологическом веществе, например, в плазме. Правильные биоаналитические методы должны быть избирательными и чувствительными. Например, микромасштабный термофорез может быть использован для количественной оценки того, как биологическое вещество/жидкость влияет на аффинность лекарственного средства к его мишени (Baaske et al. (2010). Angew. Chem. Int. Ed., 49 (12): 1-5; Wienken и др. (2010). Nature Communications, 1 (7): 100).

Фармакокинетические свойства также можно изучать с помощью масс-спектрометрии, например, когда существует необходимость в высокой чувствительности для определения концентраций после введения в низкой дозе и в течение длительного периода времени. Обычным прибором, используемым в данном применении, является ЖХ-МС с масс-спектрометром с тройным квадруполем. Тандемная масс-спектрометрия может использоваться для обеспечения дополнительной специфичности. Стандартные кривые и внутренние стандарты можно использовать для количественного определения фармацевтического препарата в образцах. Образцы представляют различные временные точки, когда лекарственный препарат вводится, и затем метаболизируется или выводится из организма. Контрольные образцы, отобранные до введения, используются для определения фона и обеспечения целостности данных с такими сложными матриксами образцов. Стандартная кривая может быть линейной, или для построения кривой может использоваться более сложные функции, такие как квадратичные, поскольку отклик большинства масс-спектрометров является менее линейным в больших диапазонах концентраций (Hsieh and Korfmacher (2006) Current Drug Metabolism, 7 (5): 479-89; Covey et al. (1986) Anal. Chem. 58 (12): 2453-60; Covey et al. (1985). Anal. Chem. 57 (2): 474-81).

Типичные молекулы антител

Способы, описанные здесь, можно использовать для конструирования множества молекул антител, например, любой молекулы антитела, содержащей Fc-область.

В одном варианте осуществления молекула антитела представляет собой молекулу химерного антитела, молекулу гуманизированного антитела или молекулу человеческого антитела.

В одном варианте осуществления молекула антитела представляет собой полное моноклональное антитело. В еще одном варианте осуществления молекула антитела представляет производное, содержащее Fc-область молекулы антитела, которое не содержит Fc-область (например, антигенсвязывающий фрагмент, описанный здесь). Типичные антигенсвязывающие фрагменты включают, не ограничиваясь этим, Fab, F(ab')₂, Fab', scFv, ди-scFv или sdAb. В еще одном варианте осуществления молекула антитела представляет биспецифическое моноклональное антитело, например, трифункциональное антитело (3-функциональное) или биспецифический активатор T-клеток (BiTE).

В одном варианте осуществления молекула антитела нацелена на молекулу (например, белок), ассоциированную с инфекционным заболеванием (например, вирусной инфекцией, бактериальной инфекцией или грибковой инфекцией). В еще одном варианте осуществления молекула антитела нацелена на молекулу (например, белок) или клетку, ассоциированную с раком. В еще одном варианте осуществления молекула антитела нацелена на молекулу (например, белок) или клетку, ассоциированную с иммунным расстройством. В еще одном варианте осуществления молекула антитела нацелена на молекулу (например, белок) или клетку, ассоциированную с сердечно-сосудистым заболеванием. В еще одном варианте осуществления молекула антитела нацелена на молекулу (например, белок) или клетку, ассоциированную с метаболическим расстройством. В еще одном варианте осуществления молекула антитела нацелена на молекулу (например, белок) или клетку, ассоциированную с неврологическим расстройством.

Типичные молекулы антител включают, не ограничиваясь этим, молекулы антител, которые нацелены на одно или более (например, 2) из следующих молекул или клеток: β-амилоид, 4-1BB, 5AC, 5T4, ACF9, ACFIX, подобная рецептору активина киназа-1, ACVR2B, антиген аденокарциномы, AGS-22M6, альфа-фетопротеин, ангиопоэтин 2, ангиопоэтин 3, защитный антиген токсина возбудителя сибирской язвы, AOC3 (VAP-1), B7-H3, Bacillus anthracis, BAFF, антиген C242, C5, CA-125 (миметик), кальцитонин, собачий IL-31, карбоангидраза 9 (CA-IX), сердечный миозин, CCL11 (эотаксин-1), CCR2, CCR4, CCR5, CD11, CD18, CD125, CD140a, CD147 (басигин), CD15, CD152, CD154 (CD40L), CD19, CD2, CD20, CD200, CD22, CD221, CD23 (рецептор IgE), CD25 (α-цепь рецептора IL-2), CD27, CD274, CD276, CD28, CD3, CD3-эпсилон, CD30 (TNFRSF8), CD33, CD37, CD38 (циклическая (АДФ-рибоза)гидролаза), CD4, CD40, лиганд CD40, CD41 (интегрин альфа-IIb), CD44 v6, CD5, CD51, CD52, CD56, CD6, CD70, CD74, CD79B, CD80, CEA, CEA-связанный антиген, CFD, CGRP, ch4D5, CLDN18.2, Clostridium difficile, фактор слипания A, фактор свертывания крови III, CSF1R, CSF2, CTGF, CTLA-4, хемокиновый рецептор C-X-C типа 4, цитомегаловирус, цитомегаловирусный гликопротеин B, дабигатран, DLL, DLL3, DPP4, DR5, токсин E.coli типа 1, токсин E.coli типа 2, EGFL7, EGFR, эндоглин, эндотоксин, EpCAM, рецептор эфрина A3, эпизиалин, ERBB3, E.coli, белок F респираторно-синцитиального вируса, FAP, бета-цепь фибрина II, дополнительный домен B фибронектина, фолатгидролаза, фолатный рецептор 1, фолатный рецептор альфа, рецептор Frizzled, ганглиозид GD2, GCGR, GD2, GD3 ганглиозид, GDF-8, глипикан 3, α-цепь рецептора GMCSF, GPNMB, ростовый фактор дифференцировки 8, GUCY2C, гемагглютинин, поверхностный антиген вируса гепатита B, вирус гепатита B, HER1, HER2/neu, HER3, HGF, HHGFR, гистоновый комплекс, ВИЧ-1, HLA-DR, HNGF, Hsp90, киназа рецептора рассеивающего фактора человека, человеческий TNF, человеческий бета-амилоид, ICAM-1 (CD54), ICOSL, IFN-α, IFN-γ, IgE, Fc-область IgE, рецептор IGF-1, IGF-I, IGHE, IL-20, IL-1, IL-12, IL-13, IL-17, IL-17A, IL-17F, IL-1, IL2, IL-22, IL-23, IL23A, IL31RA, IL-4, IL-4, IL-5, IL6, рецептор IL-6 (IL6R), IL-9, ILGF2, гемагглютинин вируса гриппа A (HA), рецептор инсулиноподобного фактора роста I, интегрин α4, интегрин α4β7, интегрин α5β1, интегрин α7β7, интегрин αIIbβ3, интегрин αvβ3, рецептор интерферона, рецептор интерферона α/β, интерферон гамма-индуцируемый белок, ITGA2, ITGB2 (CD18), калликреин, KIR2D, KLRC1, антиген Lewis-Y, LFA-1 (CD11a), LFA-1 (CD11a), LINGO-1, липотейхоевая кислота, LOXL2, L-селектин (CD62L), LTA, MCP-1, мезотелин, MIF, MS4A1, MSLN, MUC1, муцин CanAg, миелин-ассоциированный гликопротеин, миостатин, NCA-90 (гранулоцитарный антиген), NCA-90 (гранулоцитарный антиген), нейрональная апоптоз-регулируемая протеиназа 1, нейрональная апоптоз-регулируемая протеиназа 1, NGF, NGF, N-гликолилнейраминовая кислота, NOGO-A, Notch 1, рецептор Notch, NRP1, Oryctolagus cuniculus, OX-40, oxLDL, PCSK9, PD-1, PD-1, PDCD1, PDGF-R α, переносчик фосфатов-натрия, фосфатидилсерин, бета-рецептор фактора роста тромбоцитов, клетки карциномы предстательной железы, Pseudomonas aeruginosa, система секреции Pseudomonas aeruginosa типа III, гликопротеин вируса бешенства, гликопротеин вируса бешенства, RANKL, респираторно-синцитиальный вирус, RHD, резус-фактор, RON, RTN4, склеростин, SDC1, селектин P, SLAMF7, SOST, сфингозин-1-фосфат, Staphylococcus aureus, STEAP1, TAG-72, T-клеточный рецептор, TEM1, тенасцин-C, TFPI, TGF бета 1, TGF бета 2, TGF-β, член 4 суперсемейства TNFR, TNF-α, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TSLP, опухолевый антиген CTAA16.88, опухолеспецифическое гликозилирование MUC1, опухолеассоциированный трансдуктор кальциевого сигнала 2, рецептор TWEAK, TYRP1 (гликопротеин 75), VEGFA, VEGFR-1, VEGFR2, виментин или VWF.

Типичные молекулы антител включают, не ограничиваясь этим, молекулы антител, которые нацелены на один или более (например, 2) следующих патогенов (например, бактерий, вирусов или грибов): Actinomyces gerencseriae, Actinomyces israelii, виды Actinomycetoma, Alphavirus, Anaplasma phagocytophilum, виды Anaplasma, Ancylostoma braziliense, Ancylostoma duodenale, Angiostrongylus, Anisakis, Arcanobacterium haemolyticum, Ascaris lumbricoides, виды Aspergillus, семейство Astroviridae, виды Babesia, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, микробиоту бактериального вагиноза, виды Bacteroides, Balantidium coli, Bartonella, Bartonella bacilliformis, Bartonella henselae, Batrachochytrium dendrabatidis, виды Baylisascaris, вирус BK, виды Blastocystis, Blastomyces dermatitidis, Bordetella pertussis, Borrelia afzelii, Borrelia burgdorferi, Borrelia garinii, Borrelia hermsii, Borrelia recurrentis, виды Borrelia, виды Brucella, Brugia malayi, семейство Bunyaviridae, Burkholderia cepacia, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, виды Burkholderia, семейство Caliciviridae, виды Campylobacter, Candida albicans, виды Candida, Capillaria aerophila, Capillaria hepatica, Capillaria philippinensis, Chlamydia trachomatis, Chlamydia trachomatis, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci, Clonorchis sinensis, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, виды Clostridium, Coccidioides immitis, Coccidioides immitis, Coccidioides posadasii, Coccidioides posadasii, вирус клещевой лихорадки Колорадо (CTFV), коронавирусы, Corynebacterium diphtheriae, Coxiella burnetii, вирус Коксаки А и энтеровирус 71 (EV71), вирус геморрагической лихорадки Крым-Конго, Cryptococcus neoformans, виды Cryptosporidium, Cyclospora cayetanensis, Cytomegalovirus, вирусы денге (DEN-1, DEN-2, DEN-3 или DEN-4), Dientamoeba fragilis, Diphyllobothrium, Dracunculus medinensis, Ebolavirus (EBOV), виды Echinococcus, Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia ewingii, виды Ehrlichia, Entamoeba histolytica, семейство Enterobacteriaceae, Enterobius vermicularis, виды Enterococcus, виды энтеровирусов, энтеровирусы, Entomophthorales отряд (Entomophthoramycosis), Epidermophyton floccosum, вирус Эпштейна-Барра (EBV), Escherichia coli O157:H7, виды Eumycetoma, Fasciola hepatica и Fasciola gigantica, Fasciolopsis buski, суперсемейство Filarioidea, флавивирус, Fonsecaea pedrosoi, Francisella tularensis, виды Fusobacterium, Geotrichum cndidum, Giardia lamblia, Gnathostoma hispidum, Gnathostoma spinigerum, зеленые водоросли Desmodesmus armatus, стрептококк группы A, вирус Гуанарито, Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, вирус Хартленда, Helicobacter pylori, вирус гепатита A, вирус гепатита B, вирус гепатита C, вирус гепатита D, вирус гепатита E, вирусы простого герпеса 1 и 2 (HSV-1 и HSV-2), Histoplasma capsulatum, ВИЧ (вирус иммунодефицита человека), Hortaea werneckii, бокавирус человека (HBoV), герпесвирус человека 6 (HHV-6) и герпесвирус человека 7 (HHV-7), метапневмовирус человека (hMPV), вирус папилломы человека (HPV), вирусы парагриппа человека (HPIV), Hymenolepis diminuta, Hymenolepis nana, Isospora belli, вирус JC, вирус Хунин, Kingella kingae, Klebsiella granulomatis, вирус Ласса, Legionella pneumophila, виды Leishmania, виды Leptospira, Listeria monocytogenes, вирус лимфоцитарного хориоменингита (LCMV), вирус Мачупо, виды Malassezia, вирус Маргбург, вирус кори, вирус кори, Metagonimus yokagawai, Microsporidia phylum, коронавирус, вызывающий ближневосточный респираторный синдром, вирус контагиозного моллюска (MCV), вирус оспы обезьян, отряд Mucorales (Mucormycosis), вирус паротита, Mycobacterium leprae, Mycobacterium lepromatosis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium ulcerans, Mycoplasma pneumoniae, Naegleria fowleri, Necator americanus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Nocardia asteroids, виды Nocardia, O111 и O104:H4, Onchocerca volvulus, Opisthorchis felineus, Opisthorchis viverrini, семейство Orthomyxoviridae, Paracoccidioides brasiliensis, Paragonimus westermani, виды Paragonimus, личинки паразитирующих двукрылых мух, парвовирус B19, виды Pasteurella, возбудитель педикулеза человека Pediculus humanus capitis, возбудитель педикулеза человека Pediculus humanus corporis, Phthirus pubis, Piedraia hortae, виды Plasmodium, Pneumocystis jirovecii, Poliovirus, виды Prevotella, PRNP, Propionibacterium propionicus, вирус бешенства, респираторно-синцитиальный вирус (RSV), Rhinosporidium seeberi, Rhinovirus, риновирусы, Rickettsia, Rickettsia akari, Rickettsia prowazekii, Rickettsia rickettsii, Rickettsia typhi, виды Rickettsia, вирус лихорадки долины Рифт, ротавирус, вирус краснухи, Sabia, Salmonella enterica. подвид enterica, виды Salmonella, Sarcoptes scabiei, коронавирус SARS, виды Schistosoma, серовар typhi, виды Shigella, вирус Син Номбре, Sporothrix schenckii, Staphylococcus, виды Staphylococcus, виды Staphylococcus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Strongyloides stercoralis, Taenia solium, виды Taenia, Toxocara canis, Toxocara cati, Toxoplasma gondii, Treponema pallidum, Trichinella spiralis, Trichomonas vaginalis, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum, Trichophyton rubrum, Trichophyton tonsurans, виды Trichophyton, Trichosporon beigelii, Trichuris trichiura, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Ureaplasma urealyticum, вирус ветряной оспы (VZV), Variola major, Variola minor, вирус венесуэльского энцефалита, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, вирус Западного Нила, Wuchereria bancrofti, вирус желтой лихорадки, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis или вирус Зика.

Типичные молекулы антител включают, не ограничиваясь этим, 3f8, 8h9, абаговомаб, абциксимаб, абитузумаб, абрилумаб, актоксумаб, адалимумаб, адекатумумаб, адуканумаб, афасевикумаб, афелимомаб, афутузумаб, алацизумаб пегол, ald518, алемтузумаб, алирокумаб, алтумомаб пентетат, аматуксимаб мафенатокс, анетумаб равтансин, анифролумаб, анрукинзумаб (ima-638), аполизумаб, арцитумомаб, аскринвакумаб, азелизумаб, атезолизумаб, атинумаб, атлизумаб (тоцилизумаб), аторолимумаб, авелумаб, бапинеузумаб, базиликсимаб, бавитуксимаб, бектумомаб, бегеломаб, белимумаб, бенрализумаб, бертилимумаб, бесилезомаб, бевацизумаб, безлотоксумаб, бициромаб, бимагрумаб, бимекизумаб, биватузумаб мертансин, блеселумаб, блинатумомаб, блонтуветмаб, блосозумаб, бокоцизумаб, бразикумаб, брентуксимаб ведотин, бриакинумаб, бродалумаб, бролуцизумаб, бронтикузумаб, кабирализумаб, канакинумаб, кантузумаб мертанзин, кантузумаб равтансин, каплацизумаб, капромаб пендетид, карлумаб, каротуксимаб, катумаксомаб, иммуноконъюгат cbr96-доксорубицин, цеделизумаб, цергутузумаб амуналейкин, цертолизумабумаг пегол, цетуксимаб, ch.14.18, цитатузумаб богатокс, циксутумумаб, клазакизумаб, кленоликсимаб, кливатусумаб тетраксетан, кодритузумаб, колтуксимаб равтансин, конатумумаб, концизумаб, кренезумаб, кротедумаб, cr6261, дацетузумаб, даклизумаб, далотузумаб, дапиролизумаб пегол, даратумумаб, дектрекумаб, демцизумаб, денинтузумаб мафодотин, деносумаб, дерлотуксимаб биотин, детумомаб, динутуксимаб, диридавумаб, домагрозумаб, дорлимомаб аритокс, дрозитумаб, дулиготумаб, дупилумаб, дурвалумаб, дусигитумаб, экромексимаб, экулизумаб, эдобакомаб, эдреколомаб, эфализумаб, эфунгумаб, элделумаб, эльгемтумаб, элотузумаб, элсилимомаб, эмактузумаб, эмибетузумаб, эмицизумаб, энаватузумаб, энфортумаб ведотин, энлимомаб пегол, эноблитузумаб, энокизумаб, энотикумаб, энситуксимаб, эпитумомаб, цитуксетан, эпратузумаб, эренумаб, эрлизумаб, эртумаксомаб, этарацизумаб, этролизумаб, эвинакумаб, эволокумаб, эксбивирумаб, фанолесомаб, фаралимомаб, фарлетузумаб, фасинумаб, fbta05, фелвизумаб, фезакинумаб, фибатузумаб, фиклатузумаб, фигитумумаб, фиривумаб, фланвотумаб, флетикумаб, фонтолизумаб, форалумаб, форавирумаб, фрезолимумаб, фулранумаб, футуксимаб, галканезумаб, галиксимаб, ганитумаб, гантенумамаб, гавилимомаб, гемтузумаб озогамицин, гевокизумаб, гирентуксимаб, глембатумумаб ведотин, голимумаб, гомиликсимаб, гуселкумаб, ибализумаб, ибритумомаб тиуксетан, икрукумаб, идаруцизумаб, иговомаб, imab362, ималумаб, имциромаб, имгатузумаб, инклакумаб, индатуксимаб равтансин, индусатумаб ведотин, инбилизумаб, инфликсимаб, интетумумаб, инолимомаб, инотузумаб, озогамицин, ипилимумаб, иратумумаб, изатуксимаб, итолизумаб, иксекизумаб, келиксимаб, лабетузумаб, ламбролизумаб, лампализумаб, ланаделумаб, ландогрозумаб, лапритуксимаб эмтанзин, лебрикизумаб, лемалесомаб, лендализумаб, лензилумаб, лерделимумаб, лексатумумаб, либивирумаб, лифастузумаб ведотин, лигелизумаб, лилотомаб сатетраксетан, линтузумаб, лирилумаб, лоделцизумаб, локиветмаб, лорвотузумаб мертансин, люкатумумаб, лулизумаб пегол, люмиклисимаб, лумретузумаб, мапатумумаб, маргетуксимаб, маслимомаб, маврилимумаб, матузумаб, меполизумаб, метелимумаб, милатузумаб, минретумомаб, мирветуксимаб соравтансин, митумомаб, могамулизумаб, монализумаб, моролимумаб, мотавизумаб, моксетумомаб пасудотокс, муромонаб-CD3, наколомаб тафенатокс, намилумаб, наптумомаб эстафенатокс, наратуксимаб эмтанзин, нарнатумаб, натализумаб, навициксизумаб, навивумаб, небакумаб, нецитумумаб, немолизумаб, нерелимомаб, несвакумаб, нимотузумаб, ниволумаб, нофетумомаб мерпентан, обилтоксаксимаб, обинутузумаб, окаратузумаб, окрелизумаб, одулимомаб, офатумумаб, оларатумаб, олокизумаб, омализумаб, онартузумаб, онтуксизумаб, опицинумаб, опортузумаб монатокс, ореговомаб, ортикумаб, отеликсизумаб, отлертузумаб, окселумаб, озанезумаб, озорализумаб, пагибаксимаб, паливизумаб, памревлумаб, панитумумаб, панкомаб, панобакумаб, парсатузумаб, пасколизумаб, пасотуксизумаб, патеклизумаб, патритумаб, пембролизумаб, пемтумомаб, перакизумаб, пертузумаб, пекселизумаб, пидилизумаб, пинатузумаб ведотин, пинтумомаб, плакулумаб, плозализумаб, погализумаб, полатузумаб ведотин, понезумаб, презализумаб, приликсимаб, притоксаксимаб, притумумаб, pro140, квилизумаб, ракотумомаб, радретумаб, рафивирумаб, ралпанцизумаб, рамуцирумаб, ранибизумаб, раксибакумаб, рефанезумаб, регавирумаб, реслизумаб, рилотумумаб, ринукумаб, ризанкизумаб, ритуксимаб, ривабазумаб пегол, робатумумаб, роледумаб, ромосозумаб, ронтализумаб, ровалпитузумаб тезирин, ровелизумаб, руплизумаб, сакитузумаб говитекан, самализумаб, сапелизумаб, сарилумаб, сатумомаб пендетид, секукинумаб, серибантумаб, сетоксаксимаб, севирумаб, сибротузумаб, sgn-cd19a, sgn-cd33a, сифалимумаб, силтуксимаб, симтузумаб, сиплизумаб, сирукумаб, софитузумаб ведотин, соланезумаб, солитомаб, сонепцизумаб, сонтузумаб, стамулумаб, сулесомаб, сувизумаб, табалумаб, такатусумаб тетраксетан, тадоцизумаб, тализумаб, тамтуветмаб, танезумаб, таплитумомаб паптокс, тарекстумаб, тефибазумаб, телимомаб аритокс, тенатумомаб, тенеликсимаб, теплизумаб, тепротумумаб, тесидолумаб, тетуломаб, тезепелумаб, tgn1412, тицилимумаб (тремелимумаб), тилдракизумаб, тигатузумаб, тимолумаб, тизотумаб, ведотин, tnx-650, тоцилизумаб (атлизумаб), торализумаб, тосатоксумаб, тоситумомаб, товетумаб, тралокинумаб, трастузумаб, трастузумаб эмтанзин, trbs07, трегализумаб, тремелимумаб, тревогрумаб, тукотузумаб, целмолейкин, тувирумаб, ублитуксимаб, улокуплумаб, урелумаб, уртоксазумаб, устекинумаб, утомилумаб, вадастуксимаб талирин, вандортузумаб ведотин, вантиктумаб, вануцизумаб, вапаликсимаб, варлилумаб, вателизумаб, ведолизумаб, велтузумаб, вепалимомаб, весенкумаб, висилизумаб, вобарилизумаб, волоциксимаб, ворсетузумаб мафодотин, вотумумаб, ксентузумаб, залутумумаб, занолимумаб, затуксимаб, зиралимумаб, золимомаб аритокс или их производные.

В варианте осуществления молекула антитела содержит один, два или три CDR VH-области молекулы антитела, описанной здесь, с использованием определений CDR по Kabat или Chothia. В одном варианте осуществления молекула антитела содержит один, два или три CDR VL-области молекулы антитела, описанной здесь, с использованием определений CDR по Kabat или Chothia. В одном варианте осуществления молекула антитела содержит один или более (например, два или три) CDR VH-области и/или один или более (например, два или три) CDR VL-области молекулы антитела, описанной здесь, с использованием определения CDR по Kabat или Chothia.

В одном варианте осуществления молекула антитела содержит одну, две, три или четыре каркасных областей VH-области молекулы антитела, описанной здесь. В одном варианте осуществления молекула антитела содержит одну, две, три или четыре каркасных областей VL-области молекулы антитела, описанной здесь. В одном варианте осуществления молекула антитела содержит одну или более (например, две, три или четыре) каркасных областей VH-области и/или одну или более (например, два, три или четыре) каркасных областей VL-области молекулы антитела, описанной здесь.

В одном варианте осуществления молекула антитела содержит вариабельную область тяжелой цепи молекулы антитела, описанной здесь, или вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по существу идентичную ей (например, аминокислотную последовательность, по меньшей мере, примерно на 85%, 90%, 95%, 99% или более идентичную ей или которая отличается не более чем на 1, 2, 5, 10 или 15 аминокислотных остатков). В одном варианте осуществления молекула антитела содержит вариабельную область легкой цепи молекулы антитела, описанной здесь, или вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по существу идентичную ей (например, аминокислотную последовательность, по меньшей мере, примерно на 85%, 90%, 95%, 99% или более идентичную ей или которая отличается не более чем на 1, 2, 5, 10 или 15 аминокислотных остатков). В одном варианте осуществления молекула антитела содержит вариабельную область тяжелой цепи или вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по существу, идентичную ей (например, аминокислотную последовательность, по меньшей мере, примерно на 85%, 90%, 95%, 99% или более идентичную ей или которая отличается не более чем на 1, 2, 5, 10 или 15 аминокислотных остатков), и вариабельную область легкой цепи молекулы антитела, описанной здесь, или вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность по существу идентичную ей (например, аминокислотную последовательность, по меньшей мере, примерно на 85%, 90%, 95%, 99% или более идентичную ей или которая отличается не более чем на 1, 2, 5, 10 или 15 аминокислотных остатков).

В одном варианте осуществления молекула антитела дополнительно содержит константную область тяжелой цепи, например, константную область тяжелой цепи молекулы антитела, описанной здесь, или константную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по существу идентичную ей (например, аминокислотную последовательность, по меньшей мере, примерно на 85%, 90%, 95%, 99% или более идентичную ей или которая отличается не более чем на 1, 2, 5, 10 или 15 аминокислотных остатков). В одном варианте осуществления молекула антитела дополнительно содержит константную область легкой цепи, например, константную область легкой цепи молекулы антитела, описанной здесь, или константную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по существу идентичную ей (например, аминокислотную последовательность, по меньшей мере, примерно на 85%, 90%, 95%, 99% или более идентичную ей или которая отличается не более чем на 1, 2, 5, 10 или 15 аминокислотных остатков). В одном варианте осуществления молекула антитела дополнительно содержит константную область тяжелой цепи, или константную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по существу идентичную ей (например, аминокислотную последовательность, по меньшей мере, примерно на 85%, 90%, 95%, 99% или более идентичную ей или которая отличается не более чем на 1, 2, 5, 10 или 15 аминокислотных остатков) и константную область легкой цепи, или константную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, по существу идентичную ей (например, аминокислотную последовательность, по меньшей мере, примерно на 85%, 90%, 95%, 99% или более идентичную ей или которая отличается не более чем на 1, 2, 5, 10 или 15 аминокислотных остатков). В одном варианте осуществления молекула антитела содержит константную область тяжелой цепи, константную область легкой цепи и вариабельные области тяжелой и легкой цепи молекулы антитела, описанной здесь.

Молекулы антител, описанные здесь, могут иметь несколько преимущественных свойств, включая, не ограничиваясь этим, желаемый (например, пролонгированный) период полураспада. Например, молекулы антитела можно использовать для эффективного лечения, профилактики или диагностики расстройства, описанного здесь.

В одном варианте осуществления молекула антитела способна связываться с молекулой-мишенью или клеткой-мишенью. Например, сконструированная молекула антитела способна связываться с молекулой-мишенью или клеткой-мишенью с одинаковой или по существу одинаковой специфичностью и/или аффинностью связывания по сравнению с молекулой родительского антитела. В одном варианте осуществления молекула антитела связывается с молекулой-мишенью или клеткой-мишенью с высокой аффинностью, например, с константой диссоциации (K_d) ниже примерно 100 нМ, обычно примерно 10 нМ и, более типично, примерно 10-0,01 нМ, примерно 5-0,01 нМ, примерно 3-0,05 нМ, примерно 1-0,1 нМ или более, например, ниже примерно 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 8, 6, 4, 3, 2 1, 0,5, 0,2, 0,1, 0,05 или 0,01 нМ. В одном варианте осуществления молекула антитела связывается с молекулой-мишенью или клеткой-мишенью с K_off медленнее чем 1×10^-4, 5×10^-5 или 1×10^-5 с^-1. В одном варианте осуществления молекула антитела связывается с молекулой-мишенью или клеткой-мишенью с K_on быстрее чем 1×10⁴, 5×10⁴, 1×10⁵ или 5×10⁵ М^-1с^-1.

В одном варианте осуществления молекула антитела способна ингибировать или активировать биологическую функцию молекулы-мишени или клетки-мишени. Например, сконструированная молекула антитела способна ингибировать или активировать биологическую функцию молекулы-мишени или клетки-мишени с одинаковым или по существу одинаковым уровнем эффективности по сравнению с молекулой родительского антитела, например, как определено по значениям IC₅₀, EC₅₀ или LD₅₀.

В одном варианте осуществления молекула антитела способна связываться с эпитопом на молекуле-мишени или клетке-мишени. Например, сконструированная молекула антитела способна связываться с таким же или по существу таким же эпитопом на молекуле-мишени или клетке-мишени по сравнению с молекулой родительского антитела.

Типичные слитые белки

Способы, описанные здесь, можно использовать для конструирования множества слитых белков, например, любого Fc-слитого белка, содержащего Fc-область.

Типичные Fc-слитые белки включают, не ограничиваясь этим, слитый белок CTLA-4-Fc (например, белатацепт или абатацепт), слитый белок рецептор фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR)-Fc (например, слитый белок VEGFR1/VEGFR2-Fc, например, афлиберцепт или KH902), слитый белок IL-1R-Fc (например, (рилонацепт), слитый белок тромбопоэтин-связывающий пептид-Fc (например, ромиплостим), слитый белок LFA-3-Fc (например, алефацепт), слитый белок анти-CD40L-Fc (например, димерный слитый белок, содержащий С-конец доменного антитела (dAb), нацеленный на лиганд CD40 (CD40L или CD154), связанный с Fc-фрагментом IgG1, например, BMS-986004 или летолизумаб), слитый белок рецептор TNFR-Fc (TNFR) (например, рекомбинантный рецептор 2 TNF (TNFR2), слитый с Fc-областью IgG1, например, OPRX-106 или этанерцепт), слитый белок фактор свертывания VIII-Fc (например, BIIB031, эфралоктоког-α или rFVIIIFc), слитый белок фактор IX-Fc (например, BIIB029 или эфтренонаког-α), слитый белок фактор IX-Fc (например, rFIXFc), слитый белок гранулоцитарный колониестимулирующий фактор-Fc (например, F-627), слитый белок фолликулостимулирующий гормон (FSH)-Fc (например, KN015), слитый белок рецептор активина типа 2B-Fc (например, STM 434), слитый белок подобная рецептору активина киназа 1 (ALK-1)-Fc (например, далантерцепт), слитый белок РНКаза-Fc (например, RSLV-132), пептидное антитело против ангиопоэтина (например, пептид с ангиопоэтин-связывающими свойствами, который слит с областью Fc, например, AMG 386), слитый белок тканевая неспецифическая щелочная фосфатаза (TNSALP)-Fc (например, асфотаза альфа или ENB-0040), слитый белок CD24-Fc, слитый белок BAFF-Fc (например, блисибимод), слитый белок пептидный аналог GLP1-Fc (например, дулаглутид или LY2189265), слитый белок эритропоэтин-миметический пептид-Fc (например, миметитело эритропоэтин-миметический пептид-IgG1 Fc 52 (например, CNTO 52) или миметитело слитый белок эритропоэтин-миметический пептид-Fc IgG4 (например, CNTO 530)) или слитый белок CD95-Fc (например, APG 101 или апоцепт).

Модели на животных

Полипептиды, описанные здесь (например, молекулы антител или слитые белки) можно оценить in vivo, например, с использованием различных моделей на животных. Например, животную модель можно использовать для оценки эффективности полипептида (например, молекулы антитела или слитых белков), описанного здесь, при модулировании биологической функции молекулы-мишени или клетки-мишени. В качестве другого примера, животную модель также можно использовать для тестирования эффективности полипептида (например, молекулы антитела), описанного здесь, в лечении, профилактике или диагностике расстройства, описанного здесь. Модели на животныъ также можно использовать, например, для исследования побочных эффектов, измерения концентраций молекул антител in situ, демонстрации корреляции между функцией молекулы-мишени или клетки-мишени и расстройством, описанным здесь.

Типичные модели на животных для других заболеваний, описанных здесь, также известны в данной области. Типичные виды животных, которые можно использовать для оценки молекул антител, описанных здесь, включают, не ограничиваясь этим, мышей, крыс, кроликов, морских свинок и обезьян. Приматы, отличные от человека, и трансгенные мыши, экспрессирующие человеческий FcRn, обычно используются в качестве модели выбора для анализа ФК (Avery et al. MAbs., 2016; 8 (6): 1064-78; Fan et al., MAbs. 2016; 8 (5): 848-53; Tam et al., MAbs. 2013; 5 (3): 397-405).

Например, гуманизированные по FcRn мыши можно получить на основе мышей C57BL/6J последовательным путем, включая создание мышиного штамма, несущего делецию в мышином гене FcRn, с последующим введением гена человеческого FcRn. Типичные мышиные линии включают, например, Tg276 и Tg32 (инвентарный номер 004919 и 014565 в лаборатории Jackson). При дальнейшем обратном скрещивании и последовательных изменениях можно создать дополнительные линии. Типичные мышиные модели, которые можно использовать для оценки полипептидов, описанных здесь, включают, не ограничиваясь этим, мышей FcRn-null, гуманизированных по FcRn мышей Tg276 (например, B6.Cg-Fcgrt<tm1Dcr>Tg(CAG-FCGRT)276Dcr/DcrJ с инвентарным номером 004919 в лаборатории Jackson), гуманизированных по FcRn мышей Tg32 (например, B6.Cg-Fcgrt<tm1Dcr>Tg (FCGRT)32Dcr/DcrJ с инвентарным номером 014565 в лаборатории Jackson), иммунодефицитных мышей hFcRn (например, B6.Cg-Fcgrt<tm1Dcr>Prkdc<scid>Tg(CAG-FCGRT)276Dcr/DcrJ с инвентарным номером 021146 в лаборатории Jackson), B6.Cg-Fcgrt<tm1Dcr>Prkdc<scid>Tg(FCGRT)32Dcr/DcrJ с инвентарным номером 018441 в лаборатории Jackson и B6.Cg-Rag1<tm>Mom <Fcgrt>tm1Dcr[Tg(CAG-FCGRT)276Dcr/DcrJ с инвентарным номером 16919 в лаборатории Jackson), например, как описано в Proetzel et al. BioDrugs., 2014; 28 (2): 171-180.

Фармацевтические композиции и наборы

В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к композициям, например, фармацевтически приемлемым композициям, которые включают полипептид (например, молекулу антитела или слитый белок), описанный здесь, формулированный вместе с фармацевтически приемлемым носителем.

Как здесь используется, термин «фармацевтически приемлемый носитель» включает любые и все растворители, дисперсионные среды, изотонические и замедляющие всасывание агенты и тому подобное, которые являются физиологически совместимыми. Носитель может быть подходящим для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, ректального, спинального или эпидермального введения (например, путем инъекции или инфузии). В некоторых вариантах осуществления менее чем примерно 5%, например, менее чем примерно 4%, 3%, 2% или 1% молекул антител в фармацевтической композиции присутствует в виде агрегатов. В еще одних вариантах осуществления, по меньшей мере, примерно 95%, например, по меньшей мере, примерно 96%, 97%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5%, 99,8% или более молекул антител в фармацевтической композиции присутствует в виде мономеров. В некоторых вариантах осуществления уровень агрегатов или мономеров определяют с использованием хроматографии, например, эксклюзионной хроматографии на основе высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ-SEC).

Композиции, описанные здесь, могут иметь различные формы. Они включают, например, жидкие, полутвердые и твердые лекарственные формы, такие как жидкие растворы (например, растворы для инъекций и инфузий), дисперсии или суспензии, липосомы и суппозитории. Подходящая форма зависит от предполагаемого способа введения и терапевтического применения. Типичные подходящие композиции находятся в форме растворов для инъекций или инфузий. Одним подходящим способом введения является парентеральный (например, внутривенный, подкожный, внутрибрюшинный, внутримышечный). В одном варианте осуществления полипептид (например, молекула антитела или слитые белки) вводят внутривенной инфузией или инъекцией. В еще одном варианте осуществления полипептид (например, молекула антитела или слитые белки) вводят внутримышечной или подкожной инъекцией.

Как здесь используется, выражения «парентеральное введение» и «введенный парентерально», означают способы введения, отличные от энтерального и местного введения, обычно путем инъекции, и включают, без ограничения, внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, интратекальную, внутрисуставную, внутриглазничную, внутрисердечную, внутрикожную, внутрибрюшинную, транстрахеальную, подкожную, субкутикулярную, внутрисуставную, субкапсулярную, субарахноидальную, интраспинальную, эпидуральную и интрастернальную инъекцию и инфузию.

Терапевтические композиции обычно должны быть стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Композиция может быть формулирована в виде раствора, микроэмульсии, дисперсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации антител. Стерильные растворы для инъекций могут быть получены включением активного соединения (т.е. антитела или фрагмента антитела) в необходимом количестве в подходящем растворителе с одним или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, по мере необходимости, с последующей стерилизацией фильтрацией. Обычно дисперсии готовят включением активного соединения в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и необходимые другие ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных растворов для инъекций предпочтительными способами приготовления являются вакуумная сушка и сублимационная сушка, которые дают порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный желаемый ингредиент из его предварительно стерильно отфильтрованного раствора. Надлежащая текучесть раствора может поддерживаться, например, путем использования покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и путем использования поверхностно-активных веществ. Пролонгированное всасывание инъекционных композиций может быть достигнуто включением в композицию агента, который замедляет всасывание, например, солей моностеарата и желатина.

Полипептиды (например, молекулы антител или слитые белки), описанные здесь, можно вводить различными способами. Некоторые из них известны в данной области, и для многих терапевтических, профилактических или диагностических применений подходящим путем/способом введения является внутривенная инъекция или инфузия. Например, молекулы антител можно вводить внутривенной инфузией со скоростью ниже 10 мг/мин; предпочтительно ниже или равной 5 мг/мин для достижения дозы примерно от 1 до 100 мг/м², предпочтительно примерно от 5 до 50 мг/м², примерно от 7 до 25 мг/м² и более предпочтительно примерно 10 мг/м². Как будет понятно специалисту в данной области, путь и/или способ введения будут варьироваться в зависимости от получения желаемых результатов. В определенных вариантах осуществления активное соединение может быть приготовлено с носителем, который будет защищать соединение от быстрого высвобождения, таким как формуляция с контролируемым высвобождением, включая имплантаты, трансдермальные пластыри и микрокапсулированные системы доставки. Можно использовать биодеградируемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Многие способы получения таких формуляций запатентованы или общеизвестны специалистам в данной области. См., например, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

В некоторых вариантах осуществления полипептид (например, молекулу антитела или слитый белок) можно вводить перорально, например, с инертным разбавителем или усваиваемым пищевым носителем. Молекула антитела (и другие ингредиенты, если это желательно) также может быть заключена в желатиновую капсулу с твердой или мягкой оболочкой, прессована в таблетки или включена непосредственно в рацион субъекта. Для перорального терапевтического введения молекула антитела может быть включена с эксципиентами и использована в виде проглатываемых таблеток, буккальных таблеток, пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, облаток и тому подобное. Для введения полипептида (например, молекулы антитела) другим путем, чем парентеральное введение, может быть необходимым нанести покрытие на соединение или вводить соединение совместно с веществом для предупреждения его инактивации. Терапевтические, профилактические или диагностические композиции также можно вводить с помощью медицинских устройств, и некоторые из них известны в данной области.

Режимы дозирования корректируют для обеспечения желаемого ответа (например, терапевтического, профилактического или диагностического ответа). Например, можно вводить в виде одного болюса, несколько разделенных доз могут вводиться в течение времени, или доза может быть пропорционально снижена или повышена, как показано в зависимости от терапевтической ситуации. Особенно преимущественно формулировать композиции для парентерального введения в разовой лекарственной форме для простоты введения и единообразия дозировки. Как здесь используется, разовая лекарственная форма относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве разовых доз для субъектов, которые подвергаются лечению; каждая единица содержит заранее определенное количество активного соединения, рассчитанное для получения желаемого терапевтического эффекта в сочетании с необходимым фармацевтическим носителем. Спецификация разовых лекарственных форм определяется и напрямую зависит от (а) уникальных характеристик молекулы антитела и конкретного терапевтического, профилактического или диагностического эффекта, который необходимо достичь, и (b) ограничений, имеющихся в области составления рецептур, таких как молекула антитела для лечения чувствительности у людей.

Типичный неограничивающий диапазон для терапевтически, профилактически или диагностически эффективного количества молекулы антитела составляет примерно 0,1-50 мг/кг, например, примерно 0,1-30 мг/кг, например, примерно 1-30, 1-15, 1-10, 1-5, 5-10 или 1-3 мг/кг, например, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40 или 50 мг/кг. Молекулу антитела можно вводить внутривенной инфузией со скоростью ниже 10 мг/мин, например, ниже или равной 5 мг/мин, для достижения дозы примерно от 1 до 100 мг/м², например, примерно от 5 до 50 мг/м², примерно от 7 до 25 мг/м², например, примерно 10 мг/м². Следует отметить, что дозировки могут варьироваться в зависимости от типа и тяжести патологического состояния, которое должно быть облегчено. Кроме того, следует понимать, что для любого конкретного субъекта конкретные режимы дозировки должны корректироваться с течением времени в соответствии с индивидуальными потребностями субъекта и профессиональным решением лица, проводящего или контролирующего введение композиций, и что диапазоны дозировок, описанные здесь, являются только примерными и не предназначены для ограничения объема или практики заявленных композиций.

Фармацевтические композиции в данном документе могут включать «терапевтически эффективное количество», «профилактически эффективное количество» или «диагностически эффективное количество» полипептида (например, молекулы антитела), описанного в данном документе.

«Терапевтически эффективное количество» относится к количеству, эффективному в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество полипептида (например, молекулы антитела или слитого белка) может варьироваться в зависимости от таких факторов, как болезненное состояние, возраст, пол и масса тела субъекта и способность антитела или фрагмента антитела вызывать желаемый ответ у субъекта. Терапевтически эффективное количество также представляет количество, при котором любое токсическое или вредное действие молекулы антитела перевешивается терапевтически благоприятными эффектами. «Терапевтически эффективная дозировка» обычно ингибирует оцениваемый показатель, по меньшей мере, примерно на 20%, например, по меньшей мере, примерно на 40%, по меньшей мере, примерно на 60% или, по меньшей мере, примерно на 80% по сравнению с субъектами, которые не подвергались лечению. Оцениваемым показателем может быть, например, гематурия, окрашенная моча, пенистая моча, боль, отечность (отек) на руках и ногах или высокое кровяное давление. Способность молекулы антитела ингибировать оцениваемый показатель можно оценить на животной модельной системе, прогнозирующей эффективность лечения или профилактики расстройства, описанного здесь. Альтернативно, это свойство композиции может быть оценено изучением способности полипептида (например, молекулы антитела или слитых белков) модулировать биологическую функцию молекулы-мишени или клетки-мишени, например, анализом in vitro.

«Профилактически эффективное количество» относится к количеству, эффективному в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого профилактического результата. Как правило, поскольку профилактическая доза используется у субъектов до или на более ранней стадии заболевания, то профилактически эффективное количество будет меньше, чем терапевтически эффективное количество.

«Диагностически эффективное количество» относится к количеству, эффективному в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого диагностического результата. Как правило, диагностически эффективное количество представляет собой количество, при котором расстройство, например, расстройство, описанное здесь, может быть диагностировано in vitro, ex vivo или in vivo.

Также настоящее изобретение обеспечивает набор, который содержит полипептид (например, молекулу антитела или слитый белок), описанный здесь. В набор могут входить один или более других элементов, в том числе: инструкция по применению; другие реагенты, например, метка, терапевтический агент или агент, пригодный для хелатирования или иного связывания молекулы антитела с меткой или терапевтическим агентом или радиопротективной композицией; устройства или другие материалы для приготовления полипептида (например, молекулы антитела или слитого белка) для введения; фармацевтически приемлемые носители; и устройства или другие материалы для введения субъекту.

Нуклеиновые кислоты

Настоящее изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, содержащим нуклеотидные последовательности, которые кодируют полипептиды (например, молекулы антител или слитые белки), например, Fc-области полипептидов, как здесь описано.

Например, настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей Fc-область, описанную здесь, например Fc-область, содержащую одну или более мутаций, описанных здесь. Fc-область может быть сконструирована из Fc-области существующего полипептида (например, молекулы антитела или слитого белка), описанного здесь. Нуклеиновая кислота может содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность Fc-области полипептида (например, молекулы антитела или слитого белка), описанного здесь, или нуклеотидную последовательность, по существу, идентичную ей (например, последовательность, по меньшей мере, примерно на 85%, 90%, 95%, 99% или более идентичную ей и/или способную гибридизоваться в условиях жесткости, описанных здесь).

В одном варианте осуществления нуклеиновая кислота дополнительно содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи полипептида (например, молекулы антитела или слитого белка), описанную здесь, или имеющую нуклеотидную последовательность, по существу гомологичную ей (например, последовательность, по меньшей мере, примерно на 85%, 90%, 95%, 99% или более идентичную ей и/или способную гибридизоваться в условиях жесткости, описанных здесь). В еще одном варианте осуществления нуклеиновая кислота дополнительно содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область легкой цепи полипептида (например, молекулы антитела или слитого белка), описанного здесь, или нуклеотидную последовательность, по существу гомологичную ей (например, последовательность, по меньшей мере, примерно на 85%, 90%, 95%, 99% или более идентичную ей и/или способную гибридизоваться в условиях жесткости, описанных здесь). В еще одном варианте осуществления нуклеиновая кислота дополнительно содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи полипептида (например, молекулы антитела или слитого белка), описанного здесь, или нуклеотидную последовательность, по существу гомологичную ей (например, последовательность, по меньшей мере, примерно на 85%, 90%, 95%, 99% или более идентичную ей и/или способную гибридизоваться в условиях жесткости, описанных здесь).

В одном варианте осуществления нуклеиновая кислота дополнительно содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую, по меньшей мере, один, два или три CDR из вариабельной области тяжелой цепи полипептида (например, молекулы антитела или слитого белка), описанного здесь, или нуклеотидную последовательность, по существу, гомологичную ей (например, последовательность, по меньшей мере, примерно на 85%, 90%, 95%, 99% или более идентичную ей и/или способную гибридизоваться в условиях жесткости, описанных здесь). В еще одном варианте осуществления нуклеиновая кислота дополнительно содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую, по меньшей мере, один, два или три CDR из вариабельной области легкой цепи полипептида (например, молекулы антитела или слитого белка), описанного здесь, или нуклеотидную последовательность, по существу, гомологичную ей (например, последовательность, по меньшей мере, примерно на 85%, 90%, 95%, 99% или более идентичную ей и/или способную гибридизоваться в условиях жесткости, описанных здесь). В еще одном варианте осуществления нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую, по меньшей мере, один, два, три, четыре, пять или шесть CDR из вариабельных областей тяжелой и легкой цепи полипептида (например, молекулы антитела или слитого белка), описанных здесь, или нуклеотидную последовательность, по существу гомологичную ей (например, последовательность, по меньшей мере, примерно на 85%, 90%, 95%, 99% или более идентичную ей и/или способную гибридизоваться в условиях жесткости, описанных здесь).

В одном варианте осуществления нуклеиновая кислота содержит участок нуклеотидной последовательности, описанной здесь. Участок может кодировать, например, Fc-область, вариабельную область (например, VH или VL); один, два или три или более (например, четыре, пять или шесть) CDR; или одну, две, три или четыре или более каркасных областей.

Нуклеиновые кислоты, описанные здесь, включают дезоксирибонуклеотиды или рибонуклеотиды или их аналоги. Полинуклеотид может быть одноцепочечным или двухцепочечным, и, если он одноцепочечный, то может представлять кодирующую цепь или некодирующую (антисмысловую) цепь. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и аналоги нуклеотидов. Последовательность нуклеотидов может прерываться компонентами, отличными от нуклеотидов. Полинуклеотид может быть дополнительно модифицирован после полимеризации, например, конъюгацией с метящим компонентом. Нуклеиновая кислота может представлять рекомбинантный полинуклеотид или полинуклеотид геномного, кДНК, полусинтетического или синтетического происхождения, который либо не встречается в природе, либо связан с другим полинуклеотидом в порядке, который не встречается в природе.

В некоторых аспектах заявка включает клетки-хозяева и векторы, содержащие нуклеиновые кислоты, описанные здесь. Нуклеиновые кислоты могут присутствовать в одном векторе или отдельных векторах, присутствующих в одной и той же клетке-хозяине или отдельной клетке-хозяине, как более подробно описано ниже.

Векторы

Настоящее изобретение относится к векторам, которые содержат нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептиды (например, молекулы антител или слитые белки), например, Fc-области полипептидов, описанные здесь.

Например, настоящее изобретение относится к вектору, содержащему нуклеотидную последовательность, кодирующую Fc-область, описанную здесь, например, Fc-область, содержащую одну или более мутаций, описанных здесь. Fc-область может быть сконструирована из Fc-области существующего полипептида (например, молекулы антитела или слитого белка), описанного здесь. Вектор может содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность Fc-области полипептида (например, молекулы антитела или слитого белка), описанного здесь, или нуклеотидную последовательность, по существу идентичную ей (например, последовательность, по меньшей мере, примерно на 85%, 90%, 95%, 99% или более идентичную ей и/или способную гибридизоваться в условиях жесткости, описанных здесь).

Векторы включают, не ограничиваясь этим, вирус, плазмиду, космиду, фаг лямбда или дрожжевую искусственную хромосому (YAC).

Могут быть использованы многочисленные векторные системы. Например, одна группа векторов использует элементы ДНК, которые получены из вирусов животных, например, таких как вирус бычьей папилломы, полиомавирус, аденовирус, вирус коровьей оспы, бакуловирус, ретровирусы (вирус саркомы Рауса, MMTV или MOMLV) или вирус SV40. В еще одной группе векторов используются элементы РНК, полученные из РНК-вирусов, таких как вирус леса Семлики, вирус восточного конского энцефалита и флавивирусы.

Кроме того, клетки, которые стабильно интегрировали ДНК в свои хромосомы, можно подвергнуть селекции введением одного или более маркеров, которые обеспечивают селекцию трансфицированных клеток-хозяев. Маркер может обеспечивать, например, прототропию ауксотрофному хозяину, резистентность к биоцидам (например, антибиотикам) или резистентность к тяжелым металлам, таким как медь, или тому подобное. Селектируемый маркерный ген может быть либо непосредственно связан с последовательностями ДНК, которые должны быть экспрессированы, либо введен в ту же клетку посредством котрансформации. Для оптимального синтеза мРНК также могут быть необходимы дополнительные элементы. Эти элементы могут включать сигналы сплайсинга, а также транскрипционные промоторы, энхансеры и сигналы терминации.

Как только экспрессионный вектор или последовательность ДНК, содержащая конструкции, были приготовлены для экспрессии, экспрессионные векторы могут быть трансфицированы или введены в соответствующую клетку-хозяина. Для достижения этого можно использовать различные методы, например, такие как слияние протопластов, осаждение фосфатом кальция, электропорация, ретровирусная трансдукция, вирусная трансфекция, генная пушка, трансфекция на основе липидов или другие традиционные методы. В случае слияния протопластов клетки культивируют в среде и подвергают скринингу на соответствующую активность.

Способы и условия культивирования полученных трансфицированных клеток и выделения полученного полипептида (например, молекулы антитела) известны специалистам в данной области и могут варьироваться или оптимизироваться в зависимости от конкретного экспрессионного вектора и используемой клетки-хозяина млекопитающего на основе настоящего описания.

Клетки

Настоящее изобретение также относится к клеткам-хозяевам, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид (например, молекулу антитела или слитый белок), описанный здесь. Полипептид (например, молекула антитела или слитый белок) может быть сконструирован в соответствии со способом, описанным здесь. Например, клетки-хозяева могут содержать молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую нуклеотидную последовательность полипептида, описанного здесь (например, молекулы антитела или слитого белка, описанных здесь), последовательность, по существу гомологичную ей (например, последовательность, по меньшей мере, примерно на 85%, 90%, 95%, 99% или более идентичную ей и/или способную гибридизоваться в условиях жесткости, описанных здесь), или участок одной из указанных нуклеиновых кислот.

В некоторых вариантах осуществления клетки-хозяева генетически сконструированы таким образом, чтобы содержать нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептид (например, молекулу антитела или слитый белок), описанный здесь.

В определенных вариантах осуществления клетки-хозяева генетически сконструированы с использованием экспрессионной кассеты. Выражение «экспрессионная кассета» относится к нуклеотидным последовательностям, которые способны влиять на экспрессию гена в хозяевах, совместимых с такими последовательностями. Такие кассеты могут включать промотор, открытую рамку считывания с или без интронов и сигнал терминации. Также могут быть использованы дополнительные факторы, необходимые или полезные для воздействия на экспрессию, такие как, например, индуцибельный промотор.

Изобретение также обеспечивает клетки-хозяева, содержащие векторы, описанные здесь.

Клетка может быть, не ограничиваясь этим, эукариотической клеткой, бактериальной клеткой, клеткой насекомого или клеткой человека. Подходящие эукариотические клетки включают, не ограничиваясь этим, клетки Vero, клетки HeLa, клетки COS, клетки CHO, клетки HEK293, клетки BHK и клетки MDCKII. Подходящие клетки насекомых включают, не ограничиваясь этим, клетки Sf9.

Применения полипептидов

Полипептиды (например, молекулы антител или слитые белки), раскрытые здесь, а также фармацевтические композиции, раскрытые здесь, имеют терапевтические, профилактические и/или диагностические применения in vitro, ex vivo и in vivo.

В одном варианте осуществления полипептид (например, молекула антитела или слитый белок) модулирует (например, уменьшает (например, ингибирует, блокирует или нейтрализует) или увеличивает (например, активирует, инициирует или усиливает)) одну или более биологических активностей молекулы-мишени (например, белка) или клетки-мишени. Например, эти полипептиды (например, молекулы антител или слитые белки) можно вводить в клетки в культуре in vitro или ex vivo или субъекту, например человеку, например, in vivo, для модуляции одной или более биологических активностей молекулы-мишени или клетки-мишени. Следовательно, в одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ лечения, профилактики или диагностики расстройства, например, расстройства, описанного здесь, у субъекта, включающий введение субъекту полипептида (например, молекулы антитела или слитого белка), описанного здесь, так что расстройство лечится, профилактируется или диагностируется. Например, настоящее изобретение относится к способу, включающему контактирование полипептида (например, молекулы антитела или слитого белка), описанного здесь, с клетками в культуре, например, in vitro или ex vivo, или введение полипептида (например, молекулы антитела или слитого белка), описанного здесь, субъекту, например, in vivo, для лечения, профилактики или диагностики расстройства, например, расстройства, ассоциированного с молекулой-мишенью, или клеткой-мишенью (например, расстройства, описанного здесь).

Как здесь используется, термин «субъект» предназначен для включения человека и животных, отличных от человека. В некоторых вариантах осуществления субъект представляет человека, например, человека-пациента, имеющего расстройство, описанное здесь, или с риском развития расстройства, описанного здесь. Термин «животные, отличные от человека» включает млекопитающих и не млекопитающих, таких как приматы, отличные от человека. В варианте осуществления субъект является человеком. Способы и композиции, описанные здесь, подходят для лечения пациентов-людей с расстройством, описанным здесь. Пациенты, имеющие расстройство, описанное здесь, включают пациентов, у которых развилось расстройство, описанное здесь, но (по меньшей мере, временно) бессимптомно, пациентов, у которых проявлялся симптом расстройства, описанного здесь, или пациентов, имеющих расстройство, относящееся или ассоциированное с расстройством, описанным здесь.

Способы лечения или профилактики расстройств

Полипептиды (например, молекулы антител или слитые белки), описанные здесь, можно использовать для лечения или профилактики расстройств или патологических состояний. В одном варианте осуществления полипептид имеет оптимальный или повышенный период полураспада, который может быть желательным для лечения или профилактики расстройства или патологического состояния. Не желая связываться с теорией, полагается, что в одном варианте осуществления полипептид, описанный здесь (например, полипептид, имеющий оптимальный или повышенный период полураспада), может обеспечить одно или более преимуществ по сравнению с другим полипептидом, имеющим аналогичное или сходное связывание, аффинность и/или специфичность (например, полипептид, который не имеет или не был сконструирован так, чтобы иметь оптимальный или улучшенный период полураспада). Такие преимущества могут включать, не ограничиваясь этим, повышенную терапевтическую или профилактическую эффективность, режим с пониженной дозой или улучшенные фармакокинетические свойства. В варианте осуществления полипептид включает мутированную Fc-область, как здесь описано.

Типичные расстройства или патологические состояния, которые можно лечить или профилактировать с помощью полипептидов, описанных здесь, включают, не ограничиваясь этим, рак (например, солидную опухоль или гематологический рак), инфекционное заболевание (например, бактериальную инфекцию или вирусную инфекцию), иммунное заболевание (например, аутоиммунное заболевание), воспалительное заболевание, метаболическое заболевание (например, диабет), сердечно-сосудистое заболевание, синдром отторжения трансплантата органа. В одном варианте осуществления расстройство представляет собой хроническое заболевание.

Типичные виды рака, которые можно лечить или профилактировать с помощью полипептидов, описанных здесь, включают, не ограничиваясь ими, острый лимфобластный лейкоз (ALL), острый миелоидный лейкоз (AML), адренокортикальный рак, саркому Капоши, связанную со СПИДом лимфому, первичную лимфоиу центральной нервной системы (ЦНС), рак ануса, рак аппендикса, астроцитому, атипичную тератоидную/рабдоидную опухоль, базальноклеточный рак, рак желчных протоков, рак мочевого пузыря, рак кости (например, саркому Юинга или остеосаркому, и злокачественную фиброзную гистиоцитому), опухоль головного мозга (например, астроцитомы, глиому ствола головного мозга, атипичную тератоидную/рабдоидную опухоль центральной нервной системы, эмбриональную опухоль центральной нервной системы, эмбрионально-клеточную опухоль центральной нервной системы, краниофарингиому или эпендимому), рак молочной железы, бронхиальную опухоль, лимфому Беркитта, карциноидную опухоль (например, карциноидную опухоль желудочно-кишечного тракта), опухоль сердца, эмбриональную опухоль, эмбрионально-клеточную опухоль, лимфому, рак шейки матки, холангиокарциному, хордому, хронический лимфолейкоз (CLL), хронический миелогенный лейкоз (CML), хроническое миелопролиферативное новообразование, рак толстой кишки, колоректальный рак, краниофарингиому, Т-клеточную кожную лимфому, протоковую карциному in situ (DCIS), рак эндометрия, эпендимому, рак пищевода, эстезионейробластому, саркому Юинга, экстракраниальную эмбрионально-клеточную опухоль, экстрагонадальную эмбрионально-клеточную опухоль, например, рак глаза (внутриглазную меланому или ретинобластому), рак фаллопиевых труб, фиброзную гистиоцитому кости, остеосаркому, рак желчного пузыря, рак желудка, карциноидную опухоль желудочно-кишечного тракта, стромальные опухоли желудочно-кишечного тракта (GIST), эмбрионально-клеточную опухоль (например, опухоль центральной нервной системы, экстракраниальную опухоль), экстрагонадальную опухоль, рак яичников или рак яичка), гестационную трофобластическую болезнь, глиому, волосатоклеточный лейкоз, злокачественные опухоли головы и шеи, гепатоцеллюлярный рак (рак печени), лимфому Ходжкина, гипофарингеальной рак, внутриглазную меланому, опухоль из клеток островков Лангерганса, нейроэндокринную опухоль поджелудочной железы, саркому Капоши, рак почки (например, почечноклеточный рак или опухоль Вильмса), гистиоцитоз из клеток Лангерганса (LCH), рак гортани, лейкоз (например, острый лимфобластный лейкоз (ALL), острый миелоидный лейкоз (AML), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), хронический миелогенный лейкоз (CML) или волосатоклеточный лейкоз), рак губ и ротовой полости, рак печени, рак легкого (например, немелкоклеточный рак легкого (NSCLC) или мелкоклеточный рак легкого), лимфому (например, связанную со СПИДом лимфому, лимфому Беркитта, Т-клеточную кожную лимфому, лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому или первичную лимфому центральной нервной системы (ЦНС)), макроглобулинемию Вальденстрема, рак молочной железы у мужчин, злокачественную фиброзную гистиоцитому кости и остеосаркому, меланому (например, внутриокулярную (глазную) меланому), карциному из клеток Меркеля, мезотелиому, метастатический плоскоклеточный рак шеи, карциному средней линии, рак ротовой полости, синдром множественной эндокринной неоплазии, множественную миелому/новообразование из плазматических клеток, грибовидный микоз, миелодиспластический синдром, миелодиспластическое/миелопролиферативное новообразование, хроническое миелопролиферативное новообразование, рак носовой полости и околоносовых пазух, рак носоглотки, нейробластому, рак ротовой полости, рак губ и ротовой полости, рак ротоглотки, остеосаркому и злокачественную фиброзную гистиоцитому кости, рак яичника (например, эпителиальный рак яичника или эбрионально-клеточную опухоль яичника), рак поджелудочной железы, нейроэндокринные опухоли поджелудочной железы (опухоли из клеток островков Лангерганса), папилломатоз, параганглиому, рак околоносовых пазух и носовой полости, рак паращитовидной железы, рак полового члена, рак глотки, феохромоцитому, опухоль гипофиза, плевропульмональную бластому, рак брюшины, рак предстательной железы, рак прямой кишки, ретинобластому, рабдомиосаркому, рак слюнных желез, саркома (например, саркому Юинга, саркому Капоши, остеосаркому, рабдомиосаркому, саркома мягких тканей или саркому матки), синдром Сезари, рак кожи (например, меланому, карциному из клеток Меркеля или немеланому), рак тонкой кишки, плоскоклеточную карциному, рак яичка, рак горла, тимому и рак тимуса, рак щитовидной железы, переходно-клеточный рак почечной лоханки и мочеточника, рак уретры, рак эндометрия матки, рак влагалища, рак вульвы или их метастатические очаги.

Типичные инфекционные заболевания, которые можно лечить или профилактировать с помощью полипептидов, описанных в настоящем документе, включают, не ограничиваясь этим, инфекции, вызванные Acinetobacter, актиномикоз, африканскую сонную болезнь (африканский трипаносомоз), СПИД (синдром приобретенного иммунодефицита), амебиаз, анаплазмоз, ангиостронгилез, анизакидоз, сибирскую язву, инфекцию, вызванную Arcanobacterium haemolyticum, аргентинскую геморрагическую лихорадку, аскаридоз, аспергиллез, астровирусную инфекцию, бабезиоз, инфекцию, вызванную Bacillus cereus, бактериальную пневмонию, бактериальный вагиноз, инфекцию, вызванную бактероидами, балантидоз, бартонеллез, байлисаскаридоз, инфекцию, вызванную вирусом BK, черную пьедру, бластоцистоз, бластомикоз, боливийскую геморрагическую лихорадку, ботулизм (и детский ботулизм), бразильскую геморрагическую лихорадку, бруцеллез, бубонную чуму, инфекцию, вызванную буркхольдериями, язву Бурули, калицивирусную инфекцию (норовирусную и саповирусную инфекцию), кампилобактериоз, кандидоз (монилиоз; молочницу), капилляриоз, болезнь Карриона, болезнь кошачьих царапин, целлюлит, болезнь Шагаса (американский трипаносомоз), шанкроид, ветряную оспу, лихорадку чикунгунья, хламидийную инфекцию, инфекцию, вызванную Chlamydophila pneumoniae (пневмонию, вызванную тайваньским острым респираторным агентом или twar), холеру, хромобластомикоз, хитридиомикоз, клонорхоз, псевдомембранозный энтероколит, кокцидиоидомикоз, колорадскую клещевую лихорадку (CTF), обычную простуду (острый вирусный ринофарингит; острый ринит), болезнь Крейтцфельда-Якоба (CJD), геморрагическую лихорадку Крым-Конго (CCHF), криптококкоз, криптоспоридиоз, кожные мигрирующие личинки (CLM), циклоспороз, цистицеркоз, цитомегаловирусную инфекцию, лихорадкю денге, демодекоз, диэнтамебиаз, дифтерию, дифиллоботриоз, дракункулез, геморрагическую лихорадку Эбола, эхинококкоз, эрлихиоз, энтеробиоз (оксиуроз), энтерококковую инфекцию, энтеровирусную инфекцию, эпидемический тиф, инфекционную эритему (пятую болезнь), экзантему внезапную (шестую болезнь), фасциолез, фасциолопсидоз, фатальную семейную бессонницу (FFI), филяриоз, пищевое отравление, вызванное Clostridium perfringens, инфекцию, вызванную свободноживующими амебами, инфекцию, вызванную фузобактериями, газовую гангрену (клостридиальный мионекроз), геотрихоз, синдром Герстманна-Штреусслера-Шейнкера (GSS), гиардиаз, сапы, гнатостомоз, гонорею, паховую гранулему, стрептококковую инфекцию группы A, стрептококковую инфекцию группы B, гемофильную инфекцию, синдром «рука-нога-рот» (HFMD), хантавирусный легочный синдром (HPS), вирусную болезнь сердца, инфекцию, вызванную Helicobacter pylori, гемолитико-уремический синдром (HUS), геморрагическую лихорадку с почечным синдромом (HFRS), гепатит А, гепатит В, гепатит С, гепатит D, гепатит Е, простой герпес, гистоплазмоз, анкилостомоз, бокавирусную инфекция человека, эхерлиоз человека, гранулоцитарный анаплазмоз человека (HGA), метапневмовирусную инфекцию человека, моноцитарный эрлихиоз человека, папилломавирусную инфекцию (HPV) человека, парагрипп человека, гименолепидоз, инфекцию, вызванную вирусом Эпштейна-Барра, инфекционный мононуклеоз (Mono), грипп (инфлюэнца), изоспориаз, болезнь Кавасаки, кератит, инфекцию, вызванную Kingella kingae, куру, лихорадку Ласса, легионеллез (болезнь легионеров), легионеллез (лихорадка Понтиак), лейшманиоз, проказу, лептоспироз, листериоз, болезнь Лайма (боррелиоз Лайма), лимфатический филяриоз (элефантиаз), лимфоцитарный хориоменингит, малярию, марбургскую геморрагическую лихорадку (MHF), корь, ближневосточный респираторный синдром (MERS), мелиоидоз (болезнь Уитмора), менингит, менингококковую инфекцию, метагонимоз, микроспоридиоз, контагиозный моллюск (MC), обезьянью оспу, эпидемический паратит, крысиный тиф (эндемический сыпной тиф), микоплазменную пневмонию, мадуромикоз (мадурская стопа), миазы, неонатальный конъюнктивит (офтальмию новорожденных), (новый) вариант болезни Крейтцфельдта-Якоба (vCJD, nvCJD), нокардиоз, онхоцеркоз (речная слепота), описторхоз, паракокцидиоидомикоз (бластомикоз южноамериканский), парагонимоз, пастереллез, педикулез головы (головные вши), платяной педикулез (вши на теле), лобковый педикулез (лобковые вши), воспаление тазовых органов (PID), коклюш (судорожный кашель), чуму, пневмококковую инфекцию, пневмоцистную пневмонию (РСР), пневмонию, полиомиелит, инфекцию, вызванную превотеллами, первичный амебный менингоэнцефалит (PAM), прогрессирующую мультифокальную лейкоэнцефалопатию, орнитоз, лихорадку Q, бешенство, возвратный тиф, респираторно-синцитиальную вирусную инфекцию, риноспоридиоз, риновирусную инфекцию, инфекцию, вызванную риккетсиями, риккетсиоз, лихорадку долины Рифт (ФВР), пятнистую лихорадку Скалистых гор (RMSF), ротавирусную инфекцию, краснуху, сальмонеллез, SARS (тяжелый острый респираторный синдром), чесотку, шистосомоз, сепсис, шигеллез (бациллярную дизентерию), опоясывающий лишай (герпес зостер), натуральную оспу (Variocola), споротрихоз, стафилококковое пищевое отравление, стронгилоидоз, подострый склерозирующий панэнцефалит, сифилис, тениоз, столбняк (Lockjaw), грибковое поражение кожи лица (паразитарный сикоз), трихофитию (стригущий лишай волосистой части головы), грибковое поражение гладкой кожи туловища (трихофитию гладкой кожи), трихофитию промежности (дерматомикоз паховый), грибковое поражение кистей, черный лишaй, грибковое поражение кожи на ногах (нога спортсмена), дерматофитный онихомикоз (Onychomycosis), отрубевидный лишай (разноцветный лишай), токсокароз (глазная форма, вызванная миграцией личинок), токсокароз (висцеральная форма, вызванная миграцией личинок (VLM)), трахому, токсоплазмоз, трихинеллез, трихомониаз, трихоцефалез (инфекция, вызванная власоглавами), туберкулез, туляремию, брюшной тиф, сыпной тиф, уреаплазмоз, долинную лихорадку, венесуэльский энцефалит лошадей, венесуэльскую геморрагическую лихорадку, инфекцию, вызванную Vibrio vulnificus, энтерит, вызванный Vibrio parahaemolyticus, вирусную пневмонию, лихорадку Западного Нила, белая пьедра (Tinea blanca), инфекцию, вызванную Yersinia pseudotuberculosis, иерсиниоз, желтую лихорадку, лихорадку Зика и зигомикоз.

Типичные иммунные заболевания или состояния, которые можно лечить или профилактировать с помощью полипептидов, описанных здесь, включают, не ограничиваясь этим, болезнь Аддисона, агаммаглобулинемию, очаговую алопецию, амилоидоз, анкилозирующий спондилит, анти-GBM/анти-TBM нефрит, антифосфолипидный синдром (APS), аутоиммунный гепатит, аутоиммунное заболевание внутреннего уха (AIED), аксональную&нейрональную нейропатию (AMAN), болезнь Бехчета, буллезный пемфигоид, болезнь Кастлемана (CD), целиакию, болезнь Шагаса, хроническую воспалительную демиелинизирующую полинейропатию (CIDP), хронический рецидивирующий мультифокальный остеомиелит (CRMO), синдром Чарга-Стросса, рубцовый пемфигоид/доброкачественный пемфигоид слизистых оболочек, синдром Когана, болезнь холодовых агглютининов, врожденную блокаду сердца, миокардит Коксаки, синдром CREST, болезнь Крона, герпетиформный дерматит, дерматомиозит, болезнь Девика (оптиконевромиелит), дискоидную красную волчанку, синдром Дресслера, эндометриоз, эозинофильный эзофагит (EoE), эозинофильный фасциит, узловатую эритему, эссенциальную смешанную криоглобулинемию, синдром Эванса, фибромиалгию, фиброзирующий альвеолит, гигантоклеточный артериит (височный артериит), гигантоклеточный миокардит, гломерулонефрит, синдром Гудпасчера, гранулематоз с полиангиитом, болезнь Граве, синдром Гийена-Барре, тиреоидит Хашимото, гемолитическую анемиу, пурпуру Шенлейн-Геноха (HSP), гестационный герпес или гестационный пемфигоид, гипогаммалглобулинемию, IgA-нефропатию, IgG4-связанное склерозирующее заболевание, миозит с тельцами включения (IBM), интерстициальный цистит (IC), ювенильный артрит, ювенильный сахарный диабет 1 типа, ювенильный миозит (JM), болезнь Кавасаки, синдром Ламберта-Итона, лейкоцитокластический васкулит, красный плоский лишай, склерозирующий лишай, деоевянистый конъюнктивит, линейный IgA-зависимый буллезный дерматоз, волчанку, хроническую болезнь Лайма, болезнь Меньера, микроскопический полиангиит (MPA), смешанную болезнь соединительной ткани (MCTD), язву Мурена, болезнь Муха-Хабермана, рассеянный склероз (MS), миастению гравис, миозит, нарколепсию, нейромиелит зрительного нерва, нейтропению, глазной рубцовый пемфигоид, неврит зрительного нерва, палиндромный ревматизм (PR), PANDAS (детские аутоиммунные нервно-психические расстройства, ассоциированные со стрептококковой инфекцией), паранеопластическую мозжечковую дегенерацию (PCD), пароксизмальную ночную гемоглобинурию (PNH), синдром Парри-Ромберга, парспланит (периферический увеит), синдром Персонейджа-Тернера, пемфигус, периферическйю нейропатию, перивенозный энцефаломиелит, пернициозную анемию (PA), синдром POEMS (полинейропатия, органомегалия, эндокринопатия, моноклональная гаммапатия, изменения кожи), узловой полиартериит, ревматическую полимиалгию, полимиозит, синдром постинфарктный, постперикардиотомный синдром, первичный билиарный цирроз, первичный склерозирующий холангит, прогестероновый дерматит, псориаз, псориатический артрит, истинную эритроцитарную аплазию (PRMA), пиодермию гангренозную, феномен Рейно, реактивный артрит, рефлекторную симпатическую дистрофию, синдром Рейтера, рецидивирующий полихондрит, синдром беспокойных ног (RLS), забрюшинный фиброз, ревматизм, ревматоидный артрит (RA), саркоидоз, синдром Шмидта, склерит, склеродермию, синдром Шегрена, аутоиммунные реакции против сперматозоидов, синдром «ригидного человека» (SPS), подострый бактериальный эндокардит (SBE), синдром Сусака, симпатическую офтальмию (SO), артериит Такаясу, височный артериит/гигантоклеточный артериит, тромбоцитопеническую пурпуру (TTP), синдром Толоса-Ханта (THS), поперечный миелит, диабет 1 типа, язвенный колит (UC), недифференцированное заболевание соединительной ткани (UCTD), увеит, васкулит, витилиго или гранулематоз Вегенера (гранулематоз с полиангиитом (GPA)).

Полипептиды (например, молекулы антител или слитые белки), описанные здесь, обычно вводят с частотой, которая поддерживает терапевтически эффективный уровень полипептидов в системе пациента до выздоровления пациента. Например, полипептиды можно вводить с частотой, при которой достигается концентрация в сыворотке, достаточная, по меньшей мере, примерно для 1, 2, 5, 10, 20, 30 или 40 полипептидов для связывания каждой молекулой-мишенью или клеткой-мишенью. В одном варианте осуществления полипептиды вводят каждые 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 дней, каждые 1, 2, 3, 4, 5 или 6 недель или каждые 1, 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев.

Способы введения различных полипептидов (например, молекул антител или слитых белков) известны в данной области и описаны ниже. Подходящие дозировки используемых полипептидов будут зависеть от возраста и массы тела субъекта и конкретного используемого лекарственного средства.

Полипептиды можно использовать самостоятельно или конъюгировать со вторым агентом, например, антибактериальным агентом, токсином или белком, например, вторым полипептидом. Такой способ включает: введение полипептида, одного или конъюгированного со вторым агентом, субъекту, нуждающемуся в таком лечении. Полипептиды можно использовать для доставки различных терапевтических агентов, например, токсина или их смесей.

Комбинированное лечение

Полипептиды (например, молекулы антител или слитые белки) можно использовать в комбинации с другими методами лечения. Например, комбинированная терапия может включать полипептид, совместно формулированный и/или совместно вводимый с одним или более дополнительными терапевтическими агентами, например, с одним или более дополнительными терапевтическими агентами, описанными здесь. В еще одних вариантах осуществления полипептиды вводят в сочетании с другими способами терапевтического лечения, например, другими способами лечения, описанными здесь. В такой комбинированной терапии могут преимущественно использоваться более низкие дозы вводимых терапевтических агентов, таким образом, избегая возможных токсических эффектов или осложнений, связанных с различными монотерапиями.

Как здесь используется, выражение вводимое «в комбинации» означает, что субъект подвергается двум (или более) различным видам лечения до развития или во время течения заболевания у субъекта. В одном из вариантов осуществления два или более вида лечения проводят профилактически, например, до того, как у субъекта возникает расстройство, или у него диагностируют расстройство. В еще одном варианте осуществления два или более вида лечения проводят после того, как у субъекта развилось или диагностировано расстройство. В некоторых вариантах осуществления доставка одного лечения все еще происходит, когда начинается доставка второго, так что имеет место наложение. Это иногда относится здесь к «одновременной» или «сопутствующей доставке». В еще одних вариантах осуществления доставка одного лечения заканчивается до начала доставки другого лечения. В некоторых вариантах осуществления любого случая лечение является более эффективным за счет комбинированного введения. Например, второе лечение является более эффективным, например, эквивалентный эффект наблюдается при меньшем количестве второго лечения, или второе лечение уменьшает проявление симптомов в большей степени, чем это было бы, если бы второе лечение проводилось в отсутствие первого лечения, или аналогичная ситуация наблюдается с первым лечением. В некоторых вариантах осуществления доставка является такой, что уменьшение проявления симптома или другого показателя, связанного с расстройством, больше, чем то, которое наблюдалось бы при одном лечении, проведенном в отсутствие другого. Эффект двух обработок может быть частично аддитивным, полностью аддитивным или большим, чем аддитивный. Доставка может быть такой, что эффект от первого доставленного лечения все еще можно обнаружить, когда второе доставляется.

В одном варианте осуществления полипептид вводят в комбинации со вторым лекарственным препаратом (например, дополнительным агентом) для лечения или предупреждения расстройства, описанного здесь. В одном варианте осуществления дополнительный агент представляет собой второй полипептид (например, молекулу антитела), например, полипептид (например, молекулу антитела), отличный от первого полипептида (например, молекулы антитела). Типичные полипептиды (например, молекулы антител), которые можно использовать в комбинации, включают, не ограничиваясь этим, любую комбинацию полипептидов (например, молекул антител), описанных здесь. В еще одном варианте осуществления дополнительный агент отличается от полипептида (например, молекулы антитела). Например, дополнительный агент может представлять собой небольшую молекулу или молекулу нуклеиновой кислоты. В еще одном варианте осуществления второе лечение выбрано из хирургической операции, лучевой терапии, клеточной терапии (например, терапии стволовыми клетками) или трансплантации органа или ткани.

В варианте осуществления второе лечение включает терапию, выбранную из одного или более из: заместительной терапии андрогенами, антигормональной терапии, антисывороточной терапии, терапии аутологичными препаратами для усиления иммунитета, биотерапии, терапии с облучением крови, брахитерапии, сердечной ресинхронизирующей терапии, клеточной терапии, терапии с пересадкой клеток, хелатной терапии, химиотерапии, хризотерапии, кобальтовой терапии, холодной компрессионной терапии, криотерапии, электросудорожной терапии, электромагнитной терапии, электронной терапии, электротерапии, ферментной заместительной терапии, эпигенетической терапии, заместительной терапии эстрогенами, экстракорпоральной ударно-волновой терапии, терапии быстрми нейтронами, фторидной терапии, генной терапии, тепловой терапии, противогельминтозной терапии, гормональной терапии, гормонозаместительной терапии, терапии хозяина модуляторами, гипербарической кислородной терапии, гипертермии, иммуносупрессивной терапии, иммунотерапии, интраоперационной электронно-лучевой терапии, интраоперационной лучевой терапии, инверсионной терапии, лазеротерапии, светотерапии, литиевой терапии, низкоуровневой лазерной терапии, магнитотерапии, магнитно-резонансной терапии, терапии медицинскими газами, лечебного питания, молекулярной шаперон-терапии, молекулярной терапии, терапии моноклональными антителами, терапии с отрицательной ионизацией воздуха, нейтрон-захватной терапии, нейтронной терапии, оральной регидратационной терапии, осмотерапии, кислородной терапии, озонотерапии, паллиативной терапии, терапии частицами, фаготерапии, фонемической неврологической гипохромной терапии, фотодинамической терапии, фототерапии, фототермической терапии, физиотерапии, пролотерапии, протеиновой терапии, протонной терапии, терапии импульсным электромагнитным полем, терапии PUVA, лучевой терапии, регидратационной терапии, респираторной терапии, терапии спасения, серотерапии, терапии стволовыми клетками, стереотаксической лучевой терапии, таргетной терапии, термотерапии, терапии ТК-клетками, толерогенной терапии, трансдермальной непрерывной кислородной терапии, терапии ультрафиолетовым светом или виротерапии.

Примерные способы лечения, которые можно использовать в сочетании с полипептидом или композицией, описанными здесь, для лечения или профилактики других расстройств, также описаны в разделе «Способы лечения или профилактики расстройств» в данном документе.

Способы диагностики

В некоторых аспектах настоящее избретение обеспечивает способ диагностики для детектирования присутствия молекулы-мишени (например, белка) или клетки-мишени in vitro (например, в биологическом образце, таком как биопсийный образец или жидкость организма (например, кровь, моча) или спинномозговой жидкости) или in vivo (например, визуализация in vivo у субъекта). Способ включает: (i) контактирование образца с полипептидом, описанным здесь (например, с молекулой антитела, описанной здесь), или введение субъекту полипептида (например, молекулы антитела); (необязательно) (ii) контактирование контрольного образца, например, контрольного образца (например, контрольного биологического образца, такого как биопсийный образец или жидкость организма (например, крови, мочи или спинномозговой жидкости)) или контрольного субъекта с полипептидом, описанным здесь (например, молекулой антитела, описанной здесь); и (iii) детектирование образования комплекса между полипептидом (например, молекулой антитела) и молекулой-мишенью или клеткой-мишенью в образце или у субъекта или контрольном образце или у контрольного субъекта, где изменение, например, статистически значимое изменение, в образовании комплекса в образце или у субъекта относительно контрольного образца или контрольного субъекта свидетельствует о наличии молекулы-мишени или клетки-мишени в образце. Полипептид (например, молекула антитела) может быть прямо или опосредованно помечен детектируемым соединененим для облегчения детектирования связанного или несвязанного полипептида (например, молекулы антитела). Подходящие детектируемые соединения включают различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные соединения, люминесцентные соединения и радиоактивные вещества, описанные здесь.

Термин «образец» относится к образцам, используемым для обнаружения бактерий, включает, не ограничиваясь этим, клетки, клеточные лизаты, белки или экстракты мембран клеток, жидкости организма, такие как кровь, моча или СМЖ, или образцы тканей, такие как биопсия.

Образование комплекса между полипептидом (например, молекулой антитела) и молекулой-мишенью или клеткой-мишенью можно детектировать измерением или визуализацией полипептида (например, молекулы антитела), связанного с молекулой-мишенью или клеткой-мишенью, или несвязанного полипептида (например, молекулы антитела). Можно использовать любые подходящие анализы детектирования, и обычные анализы детектирования включают твердофазный иммуносорбентный анализ (ELISA), радиоиммуноанализ (RIA) или иммуногистохимическое исследование тканей. В качестве альтернативы мечению полипептида присутствие молекулы-мишени или клетки-мишени можно анализировать в образце с помощью конкурентного иммуноанализа с использованием стандартов, меченных детектируемым соединением и немеченым полипептидом. В этом анализе биологический образец, меченые стандарты и полипептид объединяют и определяют количество меченого стандарта, связанного с немеченой связывающей молекулой. Количество молекулы-мишени или клетки-мишени в образце обратно пропорционально количеству меченого стандарта, связанного с полипептидом (например, молекулой антитела).

Полипептиды (например, молекулы антител), описанные здесь, можно использовать для диагностики расстройств, которые можно лечить или профилактировать с помощью полипептидов, описанных здесь. Способы детектирования или диагностики, описанные здесь, можно использовать в комбинации с другими способами, описанными здесь, для лечения или профилактики расстройств, описанных здесь.

Настоящее изобретение также включает любой из следующих нумерованных пунктов:

1. Полипептид, содержащий Fc-область, где Fc-область содержит мутацию, где полипептид имеет 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или все следующие свойства:

а) имеет увеличенную аффинность связывания с неонатальным Fc-рецептором (FcRn) при рН от 6,0 до 6,5 по сравнению с эталонным полипептидом;

b) имеет более высокую аффинность связывания с FcRn при рН между 6,0 и 6,5, чем аффинность связывания при рН между 7,0 и 7,4;

c) связывается с FcRn при pH от 6,0 до 6,5 с константой диссоциации (K_d), равной 300 нМ или ниже;

d) связывается с FcRn при pH от 7,0 до 7,4 с K_d, равной 50 нМ или выше;

е) имеет одинаковую, по существу одинаковую или увеличенную аффинность связывания с рецептором Fcγ по сравнению с эталонным полипептидом;

f) имеет одинаковую или по существу одинаковую термостабильность по сравнению с эталонным полипептидом;

g) имеет одинаковую, по существу одинаковую или увеличенную аффинность связывания с C1q по сравнению с эталонным полипептидом;

h) имеет одинаковую, по существу одинаковую или увеличенную аффинность связывания с TRIM21 по сравнению с эталонным полипептидом;

i) имеет эффекторную функцию, которая является одинаковой, по существу одинаковой или увеличенной по сравнению с эталонным полипептидом;

j) имеет повышенный период полураспада in vivo по сравнению с эталонным полипептидом;

k) имеет биологическую функцию in vitro, ex vivo или in vivo, которая является одинаковой, по существу одинаковой или увеличенной по сравнению с эталонным полипептидом;

l) имеет показатели для развития, которые являются одинаковыми или по существу одинаковыми по сравнению с эталонным полипептидом;

m) имеет одинаковую, по существу одинаковую или увеличенную аффинность, специфичность связывания, или обе, для эпитопа по сравнению с эталонным полипептидом; или

n) имеет повышенное поглощение слизистой по сравнению с эталонным полипептидом, и

где полипептид обладает, по меньшей мере, свойствами а), b) и одним, двумя, тремя, четырьмя или всеми свойствами е), f), g), h) или i).

2. Полипептид по п.1, который имеет, по меньшей мере, свойства а), b), с), d) и одно, два, три, четыре или все свойства е), f), g), h) или i).

3. Полипептид по пп.1 или 2, который имеет, по меньшей мере, свойства а), b), одно, два, три, четыре или все свойства е), f), g), h) или i) и одно, два, три, четыре, пять, шесть или все свойства c), d), j), k), l), m) или n).

4. Полипептид по любому из пп.1-3, который имеет, по меньшей мере, в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40 или 50 раз более высокую аффинность связывания для FcRn при рН 6,0 по сравнению с эталонным полипептидом, как определено анализом на основе системы Octet или клеточным анализом.

5. Полипептид по любому из пп.1-4, который имеет, по меньшей мере, в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или 50 раз более высокую аффинность связывания для FcRn при рН 6,0, чем при рН 7,4, как определено анализом на основе системы Octet или клеточным анализом.

6. Полипептид по любому из пп.1-5, который связывается с FcRn при рН 6,0 с константой диссоциации (K_d) , равной 250 нМ или ниже, 200 нМ или ниже, 150 нМ или ниже, 100 нМ или ниже, 50 нМ или ниже, 25 нМ или ниже, 10 нМ или ниже, 5 нМ или ниже, 2 нМ или ниже, 1 нМ или ниже, 0,5 нМ или ниже, 0,2 нМ или ниже, 0,1 нМ или ниже, 0,05 нМ или ниже, 0,02 нМ или ниже, 0,01 нМ или ниже, от 25 нМ до 0,1 нМ, от 20 нМ до 0,5 нМ, от 15 нМ до 1 нМ, от 10 нМ до 5 нМ или от 20 нМ до 10 нМ, как определено анализом на основе системы Octet или клеточным анализом.

7. Полипептид по любому из пп.1-6, который связывается с FcRn при pH 7,4 с K_d, равной 60 нМ или выше, 80 нМ или выше, 100 нМ или выше, 150 нМ или выше, 200 нМ или выше, 500 нМ или выше, от 50 нМ до 500 нМ или от 100 нМ до 250 нМ, как определено анализом на основе системы Octet или клеточным анализом.

8. Полипептид по любому из пп.1-7, который имеет аффинность связывания для одного, двух или всех FcγRI, FcγRIIa/b или FcγRIII, которая уменьшается не более чем на 10%, 20%, 30%, 40%, или на 50%, или аффинность связывания для одного, двух или всех FcγRI, FcγRIIa/b или FcγRIII, которая увеличивается, по меньшей мере, в 1,5, 2, 3, 4 или 5 раз по сравнению с эталонным полипептидом, как определено анализом на основе системы Octet или клеточным анализом.

9. Полипептид по любому из пп.1-8, который имеет температуру плавления, которая повышается или снижается не более чем на 1°С, 2°С, 3°С, 4°С, 5°С, 6°С, 7°С, 8°С, 9°С или 10°С по сравнению с эталонным полипептидом, как определено анализом с красителем Sypro Orange.

10. Полипептид по любому из пп.1-9, который имеет аффинность связывания для C1q, которая уменьшается не более чем на 10%, 20%, 30%, 40% или 50%, или аффинность связывания для C1q, которая увеличивается, по меньшей мере, в 1,5, 2, 3, 4 или 5 раз по сравнению с эталонным полипептидом, как определено с использованием ELISA.

11. Полипептид по любому из пп.1-10, который имеет аффинность связывания для TRIM21, которая уменьшается не более чем на 10%, 20%, 30%, 40% или 50%, или аффинность связывания для TRIM21, которая увеличивается, по меньшей мере, в 1,5, 2, 3, 4 или 5 раз по сравнению с эталонным полипептидом, как определено с использованием ELISA.

12. Полипептид по любому из пп.1-11, который имеет уменьшение одного, двух, трех или всех из комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC), антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC), антителозависимого клеточно-опосредованного фагоцитоза (ADCP) или антителозависимой внутриклеточной нейтрализации (ADIN) не более чем на 10%, 20%, 30%, 40% или 50%, или увеличение одного, двух, трех или всех из комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC), антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC), антителозависимого клеточно-опосредованного фагоцитоза (ADCP) или антителозависимой внутриклеточной нейтрализации (ADIN), по меньшей мере, в 1,5, 2, 3, 4 или 5 раз по сравнению с эталонным полипептидом.

13. Полипептид по любому из пп.1-12, который имеет период полураспада in vivo, который увеличивается, по меньшей мере, в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз по сравнению с эталонным полипептидом, как определено на животной модели.

14. Полипептид по любому из пп.1-13, который имеет биологическую функцию in vitro, ex vivo или in vivo, которая уменьшается не более чем на 10%, 20%, 30%, 40% или 50%, или биологическую функцию in vitro, ex vivo или in vivo, которая увеличивается, по меньшей мере, в 1,5, 2, 3, 4 или 5 раз по сравнению с эталонным полипептидом.

15. Полипептид по любому из пп.1-14, который имеет изменение одного, двух, трех или всех показателей из стабильности, растворимости, агрегации или экспрессии не более чем на 10%, 20%, 30%, 40% или 50% по сравнению с эталонным полипептидом.

16. Полипептид по любому из пп.1-15, который имеет аффинность, специфичность связывания, или обе, которая уменьшается не более чем на 10%, 20%, 30%, 40% или 50%, или аффинность, специфичность связывания, или обе, которая увеличивается, по меньшей мере, в 1,5, 2, 3, 4 или 5 раз по сравнению с эталонным полипептидом.

17. Полипептид по любому из пп.1-16, который имеет повышенное поглощение слизистой, по меньшей мере, в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз по сравнению с эталонным полипептидом, как определено анализом трансцитоза.

18. Полипептид по любому из пп.1-4 или 8-17, где эталонный полипептид содержит Fc-область дикого типа, Fc-область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или аминокислотную последовательность, по меньшей мере, примерно на 85%, 90%, 95%, 99% или более идентичную ей или которая отличается не более чем на 1, 2, 5, 10 или 15 аминокислотных остатков.

19. Полипептид по любому из пп.1-18, где мутация находится в остатке в домене СН2.

20. Полипептид по любому из пп.1-18, где мутация находится в остатке в домене СН3.

21. Полипептид по любому из пп.1-20, включающий, по меньшей мере, одну мутацию в остатке в домене СН2 и, по меньшей мере, одну мутацию в остатке в домене СН3.

22. Полипептид по любому из пп.1-21, дополнительно включающий мутацию в остатке в области, отличной от домена СН2 и/или домена СН3.

23. Полипептид по любому из пп.1-22, где мутация не изменяет или существенно не изменяет конформацию линкерной области между доменом СН2 и доменом СН3.

24. Полипептид по любому из пп.1-23, где мутация не вносит 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более последовательных гидрофобных или ароматических остатков в поверхностной области.

25. Полипептид по любому из пп.1-24, который включает молекулу антитела.

26. Полипептид по любому из пп.1-25, который включает IgG.

27. Полипептид по любому из пп.1-26, который включает IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.

28. Полипептид по любому из пп.1-27, который включает вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина или обе.

29. Полипептид по любому из пп.1-28, который содержит тетрамер из двух вариабельных областей тяжелой цепи иммуноглобулина и двух вариабельных областей легкой цепи иммуноглобулина.

30. Полипептид по любому из пп.1-29, который включает полноразмерную молекулу антитела.

31. Полипептид по любому из пп.1-30, который включает фрагмент молекулы антитела.

32. Полипептид по любому из пп.1-31, который включает молекулу химерного антитела или молекулу мышиного антитела.

33. Полипептид по любому из пп. 1-32, который включает молекулу человеческого антитела или молекулу гуманизированного антитела.

34. Полипептид по любому из пп.1-24, который включает слитый белок.

35. Полипептид по любому из пп.1-34, содержащий 1, 2, 3, 4 или все из следующего:

(i) мутации в остатке в поверхностной области, которая взаимодействует с FcRn;

(ii) мутации в остатке, который является периферическим остатком вдоль поверхности раздела Fc-FcRn;

(iii) мутации в остатке, который является неконтактным остатком в связывании Fc-FcRn;

(iv) мутации в остатке, который представляет контактный остаток спирали, которая усиливает конформационную динамику спирали, включающей 1, 2, 3, 4, 5 или все из P247, K248 , D249, T250, L251 или M252; или

(v) мутации, которая модулирует pK гистидина и/или представляет введение гистидина вдоль поверхности раздела Fc-FcRn.

36. Полипептид по любому из пп.1-35, содержащий мутацию в остатке в поверхностной области, которая взаимодействует с FcRn.

37. Полипептид по п.36, где мутация находится в остатке, выбранном из: L251, I253, R255, P257, H285, N286, K288, T307, V308, L309, Q311, L314, H310, H433, N434, H435, или Y436.

38. Полипептид по любому из пп.1-37, включающий множество мутаций в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или всех остатках, выбранных из L251, I253, R255, P257, H285, N286, K288, T307, V308, L309, Q311, L314, H310, H433, N434, H435 или Y436.

39. Полипептид по любому из пп.1-38, содержащий мутацию в остатке, который является периферическим остатком вдоль поверхности раздела Fc-FcRn.

40. Полипептид по п.39, где мутация находится в остатке, выбранном из М252, Т256, Т307, L309, Q311, Н433, N434, Y436, N286 или К288.

41. Полипептид по любому из пп.1-40, содержащий множество мутаций в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или всех остатках, выбранных из M252, T256, T307, L309, Q311, H433, N434, Y436, N286 или K288.

42. Полипептид по любому из пп.1-41, содержащий мутацию, которая находится в остатке, который является неконтактным остатком в связывании Fc-FcRn.

43. Полипептид по п.42, где мутация находится в остатке, выбранном из A287, V308, N315, L314, L432, H429, E430 или A431.

44. Полипептид по любому из пп.1-43, содержащий множество мутаций в 2, 3, 4, 5, 6, 7 или всех остатках, выбранных из A287, V308, N315, L314, L432, H429, E430 или А431.

45. Полипептид по любому из пп.1-44, содержащий мутацию в остатке, который находится в контактном остатке спирали, которая усиливает конформационную динамику спирали, включающей 1, 2, 3, 4, 5 или все из P247, K248, D249, T250, L251 или M252.

46. Полипептид по п.45, где мутация находится в остатке, выбранном из P244, P245, T250, L251, P247, E380, M428, A378, D376, P257, V308, A287, L306 или H427.

47. Полипептид по любому из пп.1-46, содержащий множество мутаций в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или всех остатках, выбранных из P244, P245, T250, L251, P247, E380, M428, A378, D376, P257, V308, A287, L306 или H427.

48. Полипептид по любому из пп.1-47, содержащий мутацию, которая представляет введение гистидина вдоль поверхности раздела Fc-FcRn.

49. Полипептид по любому из пп.1-48, содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более мутаций, или одну или более комбинаций мутаций, приведенных в таблице 1.

50. Полипептид по любому из пп.1-49, где мутация является отличной от M252Y, S254T, T256E, L309N, T250Q, M428L, N434S, N434A, T307A, E380A, N434A, M252Y, S254T, T256E или их комбинации.

51. Полипептид по любому из пп.1-50, где мутация находится в остатке, отличном от остатка M252Y, S254T, T256E, L309N, T250, M428, N434, N434, T307, E380, N434, M252, S254, T256 или их комбинации.

52. Полипептид по любому из пп.1-51, который не имеет 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или всех из следующей мутации или мутаций: (i) M252Y, S254T, и T256E; (ii) L309N; (iii) T250Q и M428L; (iv) M428L и N434A; (v) N434A; (vi) T307A, E380A и N434A; (vii) M252W; (viii) V308F; (ix) V308F и N434Y; или (х) H435A.

53. Полипептид по любому из пп.1-52, содержащий первую мутацию, выбранную из M252Y, S254T, T256E, L309N, T250Q, M428L, N434S, N434A, T307A, E380A, N434A, M252Y, S254T или T256E и вторую мутацию, выбранную из мутации, приведенной в таблице 1, отличной от M252Y, S254T, T256E, L309N, T250Q, M428L, N434S, N434A, T307A, E380A, N434A, M252Y, S254T и T256E.

54. Полипептид по любому из пп.1-53, дополнительно содержащий мутацию в Fc-области, которая усиливает эффекторную функцию.

55. Полипептид по п.54, где мутация находится в остатке, выбранном из S239, A330, I332, F243, G236 или их комбинации.

56. Полипептид по любому из пп.1-55, дополнительно содержащий мутацию в Fc-области, которая снижает эффекторную функцию.

57. Полипептид по п.56, где мутация находится в остатке, выбранном из K322, L234, L235, P331, N297 или их комбинации.

58. Полипептид по любому из пп.1-57, где Fc-область содержит:

(a) 1, 2, 3, 4, 5 или все комбинации мутаций, выбранных из: T256D/Q311V/A378V, H285N/T307Q/N315D, H285D/T307Q/A378V, T307Q/Q311V/A378V, T256D/N286D/T307R/Q311V/A378V или T256D/T307R/Q311V;

(b) мутации или комбинации мутаций, способные нарушать эффекторную функцию Fc, или

(c) обе (а) и (b).

59. Полипептид по любому из пп.1-58, который содержит мутации в остатках, выбранных из: (i) T256, Q311 и A378; (ii) H285, T307 и N315; (iii) H285, T307 и A378; (iv) T307, Q311 и A378; (v) T256, N286, T307, Q311 и A378; или (vi) T256, H285, T307, Q311 и A378.

60. Полипептид по любому из пп.1-59, который содержит мутации, выбранные из: (i) T256D, Q311V и A378V; (ii) H285N, T307Q и N315D; (iii) H285D, T307Q и A378V; (iv) T307Q, Q311V и A378V; (v) T256D, N286D, T307R, Q311V и A378V; или (vi) T256D, H285D, T307R, Q311V и A378V.

61. Полипептид по любому из пп.1-60, дополнительно содержащий мутацию в области, отличной от Fc-области.

62. Полипептид по любому из пп.1-61, содержащий множество мутаций, где, по меньшей мере, одна мутация является компенсаторной или полезной мутацией.

63. Полипептид по любому из пп.1-62, который представляет выделенный полипептид.

64. Полипептид по любому из пп.1-62, который представляет синтетический полипептид.

65. Композиция, содержащая полипептид по любому из пп.1-64.

66. Композиция по п.65, дополнительно включающая фармацевтически приемлемый носитель.

67. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид по любому из пп.1-64.

68. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.67.

69. Клетка, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п.67 или вектор по п.68.

70. Набор, содержащий полипептид по любому из пп.1-64 и инструкции по применению полипептида.

71. Контейнер, содержащий полипептид по любому из пп.1-64.

72. Способ получения полипептида, включающий культивирование клетки по п.69 в условиях, позволяющих продуцировать молекулу антитела, тем самым обеспечивая продукцию полипептид.

73. Способ по п.72, дополнительно включающий выделение или очистку полипептида.

74. Способ лечения расстройства, где способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества полипептида по любому из пп.1-64 или композиции по пп.65 или 66, тем самым обеспечивая лечение расстройства.

75. Полипептид по любому из пп.1-64 или композиция по пп.65 или 66 для применения в лечении расстройства у субъекта.

76. Применение полипептида по любому из пп.1-64 или композиции по пп.65 или 66 в производстве лекарственного средства для лечения расстройства у субъекта.

77. Способ детектирования молекулы, включающий контактирование клетки или образца от субъекта с полипептидом по любому из пп.1-64, тем самым обеспечивая детектирование молекулы.

Примеры

Были разработана структура и сетевая основа для изучения взаимодействия IgG с многочисленными Fc-рецепторами (например, FcRn, C1q, TRIM21, FcγRI, FcγRIIa/b и FcγRIIIa). Используя эту основу, были идентифицированы признаки, которые регулируют взаимодействие Fc-FcRn и многочисленные различные пути для усиления связывания FcRn pH-специфичным образом. Сетевой анализ обеспечил объектив для изучения аллостерического влияния оптимизационных мутаций FcRn на отдаленное вовлечение FcγR. Используя эти принципы, была разработана панель различных Fc вариантов, которые усиливают связывание FcRn с устойчивыми биофизическими свойствами и связыванием с активирующими рецепторами как имеет место у дикого типа. Контрольные полипептиды с этими Fc вариантами показали улучшение периода полураспада в > 9 раз и сильные эффекторные функции, такие как ADCC, ADCP, CDC и ADIN, опосредованную TRIM21.

Пример 1: характеристика структуры и молекулярные свойства взаимодействия Fc-FcRn

Недавно сообщалось об общей кристаллической структуре белка FcRn человека в комплексе с Fc-областью человеческого IgG1 и человеческого сывороточного альбумина (Oganesyan et al., J. Biol. Chem., 2014. 289 (11): 7812-2). Исследование структуры (фиг. 20A) показывает, что как альфа-, так и бета-субъединицы молекулы FcRn участвуют в связывании с Fc-областью, обеспечивая контактирование как с доменами CH2, так и с CH3 со стороны Fc. Первичное взаимодействие опосредуется альфа-субъединицей на стороне FcRn и доменом CH2 на стороне Fc. рН-специфический характер связывания определяется остатками гистидина в положениях 310 и 435 (нумерация по Kabat), которые подвергаются протонированию при кислом значении рН и образуют критические контакты с глутаматом FcRn в положении 115 и аспартатом в положении 130. Мутация любого из двух остатков гистидина достоверно снижает аффинность связывания Fc с FcRn (Oganesyan et al., J. Biol. Chem., 2014. 289 (43): 29874-80; Raghavan et al., Biochemistry, 1995, 34 (45): 14649-57). В дополнение к H310 и H435, ряд других остатков Fc (L251, I253, R255, P257, H285, N286, K288, T307, V308, L309, Q311, L314, H433, N434 и Y436) участвуют в обеспечении молекулярных контактов с FcRn.

Структура Fc определяли при различных значениях pH (Crispin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2013. 110 (38): E3544-6; Ahmed et al., J. Mol. Biol., 2014. 426 (18): 3166 -79; Chen et al., ACS Chem. Biol., 2016. 11 (7): 1852-61). Наложение кристаллической структуры Fc при pH 4,0 (pdb id 4BYH) и 6,5 (pdb id 4Q7D) выявляет ряд тонких изменений, включая латеральное смещение 250-спирали и различия в относительной ориентации CH2 (фиг. 20B). С учетом того, что аминокислотные остатки, связывающиеся с FcRn, такие как M252 и I253, расположены в 250-спирали, ожидается, что наблюдаемое смещение спирали повлияет на связывание с FcRn (Oganesyan et al., J. Biol. Chem., 2014. 289 (11): 7812-2).

Кроме того, различие в относительной ориентации CH2 по отношению к CH3 подчеркивает конформационную гибкость области CH2 (фиг. 20B) (Frank et al., J. Mol. Biol., 2014. 426 (8): 1799-811). С учетом того, что поверхность раздела FcRn-Fc обнаружена в обоих доменах CH2/CH3 в Fc, динамика конформации домена CH2 также должна оказывать влияние на связывание FcRn. Исследования с обменом дейтерия с остатками Fc в присутствии и отсутствии FcRn при кислых и нейтральных значениях рН показали, что связывание FcRn с молекулой Fc обеспечивает защиту связывающих остатков Fc; однако в отсутствии молекулы FcRn остатки 250-спирали при кислом значении pH показали усиленный обмен дейтерия, что свидетельствует о том, что изменение pH вызывает конформационные изменения этой области (Walters et al., J. Biol. Chem., 2016. 291 (4): 1817-25; Jensen et al., Mol. Cell Proteomics, 2017. 16 (3): 451-456).

Анализ силы связывания Fc с FcRn при кислом значении pH показывает, что человеческий FcRn связывается с человеческой Fc-областью со слабой аффинностью (> 600 нМ). Кинетические параметры также показывают, что, несмотря на то, что скорость ассоциации (k_on ~10⁵ М^-1с^-1) взаимодействия Fc-FcRn сравнима с типичным взаимодействием антитело-антиген, более низкая аффинность связывания обусловлена, прежде всего, высокой скоростью диссоциации (k_off ~0,1 с^-1) взаимодействия Fc-FcRn (Suzuki et al., J. Immunol., 2010. 184 (4): 1968-76). Полагается, что конформационная гибкость субдомена CH2 способствует низкому значению k_off в связывании FcRn. Оптимизация скорости диссоциации взаимодействия Fc-FcRn может служить ключевым аспектом для повышения периода полураспада (Datta-Mannan et al., J. Biol. Chem., 2007. 282 (3): 1709-17).

В связи с этим были идентифицированы четыре группы остатков Fc, мутации которых могут оказать влияние на взаимодействие с FcRn и скорость диссоциации (k_off) (фиг. 21A). Они включают остатки, которые вступают в прямой контакт с FcRn, а также периферические и не экспонированные на поверхности остатки, которые потенциально могут модифицировать поверхность взаимодействия, и остатки, которые могут оказывать влияние на динамику 250-спирали. Действительно, некоторые из этих положений были ранее исследованы и мутанты, у которых имеет место увеличенные периоды полураспада, такие как M252Y/S254T/T256E (YTE), M428L/N434S (LS), T307A/E380A/N434A (AAA), T250Q/M428L (QL), V308P, включают комбинации мутаций в указанных сайтах.

В ходе анализа роль каждого остатка была впервые исследована in silico, и была идентифицирована сеть взаимодействий, опосредованных остатками (фиг. 21B). Была разработана конкретная группа мутаций для усиления гидрофобных взаимодействий на поверхности раздела Fc-FcRn и для усиления полярных и электростатических взаимодействий на периферии поверхности раздела Fc-FcRn. Мутации неконтактных остатков около поверхности раздела могут усиливать комплементарность электростатического заряда и аффинность за счет снижения скорости k_off (Lee and Tidor, Protein Sci., 2001. 10 (2): 362-77; Whitehead et al., Nat. Biotechnol., 2012. 30 (6): 543-8). Сайт связывания с FcRn на Fc перекрывается с сайтом связывания внутриклеточного рецептора TRIM21, белком А, используемым для очистки антител, и поверхностью раздела взаимодействия Fc-Fc, образованной во время гексамеризации IgG для проявления активности CDC. Замену в каждом положении оценивали на предмет воздействия на связывание TRIM21, белка A и Fc. Было выбрано более 30 различных положений для замены. Было разработано комбинирование отдельных мутаций на основе следующих основных принципов: (а) избегать введения больших кластеров заряда или гидрофобности, чтобы минимизировать связывание с ионами растворителя и влияние на термостабильность IgG, и (b) включать разнообразие типов взаимодействия, а не только электростатические или гидрофобные, (с) включать мутации в домены СН2 и СН3. На основании этих принципов было разработано и экспериментально оценено более 150 уникальных мутантных комбинаций.

IgG1, включающие сконструированные Fc варианты на Fab актоксумаба или мотавизумаба, рекомбинантно экспрессировали и оценивали на связывание с человеческим FcRn методом биослойной интерферометрии с использованием двух разных протоколов: FcRn на биосенсоре NiNTA с IgG в качестве аналита и IgG на биосенсоре анти-CH1 с FcRn в качестве аналита. Анализы использовали для количественной оценки связывания при рН 6,0 с последующей диссоциацией при рН 6,0 и рН 7,4, а также связывания и диссоциации при рН 7,4 (фиг. 11А). Fc варианты, включающие мутации в P257 и V308, имели высокую аффинность при pH 6,0, но демонстрировали заметно более медленные скорости диссоциации при pH 7,4 и не рассматривались для включения в дальнейший анализ. Более 10 различных вариантов имели более чем 5-кратное снижение K_d по сравнению с IgG с Wt Fc. Кроме того, эти варианты имели более низкое значение k_off более чем в 2,5 раза (фиг. 22).

Сайт связывания с FcRn в Fc-области значительно перекрывается с сайтами связывания белка A и Trim21, что определено по их сложным кристаллическим структурам (фиг. 27A). Fc-область также связывается с C1q для опосредования CDC, однако сайт связывания C1q не проявляет перекрывания с сайтом связывания FcRn на Fc. В естественных условиях C1q находится в виде гексамера, и полагается, что гомогексамерная сборка Fc-областей будет иметь не только лучшее связывание с C1q, но и проявление CDC. Поверхность раздела Fc-Fc для образования гомогексамера перекрывается с сайтом связывания FcRn (фиг. 27A). Наложение кристаллических структур Fc-области показывает, что ориентация домена CH2 в этих структурах изменяется относительно домена CH3, свидетельствуя о конформационной гибкости домена CH2 (фиг. 27B). Поскольку сайт связывания FcRn находится на поверхности раздела как домена CH2, так и домена CH3, то эта конформационная гибкость может быть важной для его связывания.

Пример 2: влияние мутаций в Fc-области на рН-специфическое связывание Fc-FcRn

Аффинность связывания FcRn с Fc вариантами FcMut008 и FcMut015 оценивали с использованием анализа на основе системы Octet. Антитело было иммобилизовано на наконечнике Octet анти-CH1-антителом, и FcRn находился в растворе. Как показано на фиг. 6, FcMut008 и FcMut015 имели повышенную аффинность к FcRn. Связывание является рН-специфическим, и наблюдается увеличение связывания при рН 6,0.

Пример 3: клеточный анализ конкурентного связывания FcRn

Конкурентный анализ на основе клеток обеспечивает надежный, специфический, линейный анализ для выявления различий в относительном связывании Fc вариантов. FcRn-экспрессирующие клетки получали транзиентной трансфекцией FcRn-альфа и β2m. Клетки инкубировали при рН 6,0 с разведениями IgG и фиксированной концентрацией флуоресцентно меченной Fc (Fc-A488). Связанную с клетками флуоресценцию определяли FACS. Результаты приведены на фиг. 7. FcMut008 и FcMut015 показали улучшенное связывание с FcRn при pH 6,0.

Пример 4: влияние мутаций Fc-области на взаимодействие с FcγR

Определяли связывание типичных молекул мутантных антител с FcγRI и FcγRIIIa. Как показано на фиг. 8, FcMut008 и FcMut015 сохраняют и в некоторых случаях усиливают взаимодействие с FcγR.

Пример 5: влияние мутаций Fc-области на термостабильность и биофизическую характеристику Fc вариантов

Определяли термостабильность типичных молекул мутантных антител. Термостабильность измеряли с использованием красителя SYPRO Orange. Как показано на фиг. 9, FcMut008 и FcMut015 сохраняли высокую температуру плавления.

Влияние включения типичных Fc вариантов на биофизические характеристики оценивали экспериментально. IgG, включающие Fc варианты на Fab мотавизумаба, тестировали с помощью SE-ВЭЖХ. Все образцы элюировались с такими же значениями времени удерживания, что и Fc дикого типа, и демонстрировали профиль чистого мономера, и агрегаты не были обнаружены (фиг. 23). IgG также оценивали на термостабильность доменов CH2 и CH3 с помощью дифференциальной сканирующей флуориметрии (DSF). Температура плавления (T_m) человеческих доменов CH2 и CH3 дикого типа, согласно полученным данным дифференциальной сканирующей калориметрии, составляет примерно 70°C и 81,5°C соответственно (Ionescu et al., J. Pharm. Sci., 2008. 97 (4): 1414-26). Экспериментальные результаты DSF, приведенные в настоящем примере, дали аналогичные результаты с CH2 и CH3 T_M 68,8°C и 80,8°C соответственно. Сообщалось, что Fc вариант YTE с повышенным периодом полураспада, снижает T_m домена CH2 на 6,7°C (Majumdar et al., MAbs, 2015. 7 (1): стр. 84-95.). В экспериментах, описанных в настоящем примере, T_m домена CH2 YTE была на 7,2°C ниже, чем WT. Кроме того, мутации в положениях 247, 257 и 308 достоверно повлияли на T_m CH2. Типичные Fc варианты (FcMut183, FcMut197, FcMut213, FcMut215, FcMut228, FcMut229) были термически стабильными с Т_m домена СН2 > 64°С (фиг. 23).

Пример 6: оценка Fc вариантов на модели трансгенных мышей

Мыши Tg32 были гомозиготными, 8-недельного возраста, самцы. В каждой группе с каждым испытуемым соединением было 4 мыши. Испытуемые соединения включали CDA1-WT, CDA1-FcMut008 и CDA1-FcMut015. Мышам внутривенно вводили в дозе 10 мг/кг. Данные собирали на тринадцать временных точек (1 ч, 8 ч, 1 сутки, 2 суток, 3 суток, 4 суток, 6 суток, 8 суток, 10 суток, 13 суток, 16 суток, 19 суток и 22 суток). Человеческий IgG определяли количественно с помощью ELISA с использованием поликлонального антитела против hIgG.

Tg32 представляет модель трансгенной по человеческому FcRn мыши, которую можно использовать при разработке лекарственных средств на стадии ранней оценки и прогнозирования фармакокинетики моноклональных антител человека. Клиренс моноклональных антител у гомозиготных мышей Tg32 наиболее сильно коррелирует с клиренсом моноклональных антител у людей (Avery et al. MAbs, 2016; 8 (6): 1064-78).

Известно, что период полураспада CDA1 (актоксумаба) у человека составляет > 25 суток. Проводили оценку in vivo с дополнительными mAb на модели Tg32. Различные конструкции также можно оценить на мышах Tg276, которые, как сообщается, имеют выраженные различия в периоде полураспада между вариантами IgG. Результаты приведены в таблице 2 и на фиг. 10. FcMut015 имел повышенный период полураспада CDA1 у мышей Tg32.

Таблица 2
Периоды полураспада типичных молекул антител у гомозиготных мышей Tg32 Группа t_1/2 (ч) C_max (мкг/мл) C_last (мкг/мл) AUC_inf (ч×мкг/мл) Rsq WT 261,17 116,03 15,40 24108,03 0,99 FcMut008 231,92 131,33 15,74 25687,39 0,99 FCMut015 436,69 151,82 27,69 42735,9 0,93

Пример 7: конструирование Fc типичных антител

Полагается, что взаимодействие FcRn с IgG опосредуется через Fc. Связывание Fc с FcRn обычно является рН-специфическим (обычно слабое или нулевое связывание при рН 7,4 и сильное связывание в кислой среде). Структура FcRn в комплексе с Fc-областью IgG1 известна, и каждая молекула FcRn связывается с Fc-мономером. Fab-домены также могут влиять на связывание IgG с FcRn.

Сетевой анализ комплекса Fc-FcRn подчеркивает центральную роль H310 во взаимодействии с FcRn. H310 тесно связан с многочисленными другими тесно связанными остатками. Мутации в кластере H310 и соседних (связанных узлах) могут укрепить сеть H310. Анализ субсетей информирует о введении синергических мутаций для благоприятного взаимодействия с FcRn с минимальным воздействием на другие остатки Fc.

Для идентификации Fc вариантов с повышенным связыванием с FcRn при pH 6,0 были сконструированы различные мутации Fc в IgG1 мотазивумабе (WT). Все антитела оценивали на связывание с FcRn с использованием биослойной интерферометрии. Вкратце, на биосенсоры анти-СН1 (ForteBio) нагружали каждое антитело, представляющее интерес. Нагруженные биосенсоры подвергали воздействию рекомбинантного белка FcRn при рН 6,0 для выявления связывания. После насыщения биосенсоры подвергали воздействию одного буфера при рН 6,0 для измерения диссоциации FcRn от каждого антитела. Результатом является кривая отклика, представляющая скорость ассоциации и скорость диссоциации антитела. Эти показатели рассчитывали с использованием программного обеспечения ForteBio и сравнивали с показателями скорости мотавизумаба дикого типа. Кратное увеличение скорости ассоциации и кратное уменьшение скорости диссоциации по сравнению с диким типом приведено в таблице. Многочисленные мутации антител достоверно увеличивали и уменьшили скорость ассоциации и скорость диссоциации соответственно (фиг. 11А). Также показано связывание типичного Fc варианта с FcRn в диапазоне рН от 6,0 до 7,4. Важно, что аффинность Fc-мутантных антител для FcRn повышалась при рН 6,0, но незначительно увеличивалась при более высоком рН, таком как рН 7,4. На фиг. 11B показано, что это типичное антитело все еще демонстрирует низкое связывание с FcRn при pH 7,4, что является желательным признаком.

На фиг.11C показано взаимодействие домена CH2 Fc антитела с молекулой FcRn. Усилия в конструировании, описанном здесь, были направлены на улучшение комплементарности формы (SC), комплементарности электростатического заряда (CC) и гидрофобной комплементарности (HC). Несколько положений в Fc отмечены как важные для взаимодействия. Также отмечается 250-спираль. Эта спираль является динамичной и перемещается в зависимости от рН среды. Это важно для связывания Fc-области с FcRn при рН 6,0, но не при рН 7,4.

Типичные Fc варианты тестировали в анализах оценки подходящих показателей для дальнейшего развития, результаты которых обобщены на фиг. 12. Были проведены анализы, включающие краситель Sypro Orange, SDS PAGE и SEC-ВЭЖХ. Для определения экспрессии конструкции трансфицировали в клетки Expi293 в 96-луночных культуральных планшетах, используя ExpiFectamine, как описано изготовителем. Через 5-7 суток супернатанты количественно анализировали с использованием биослойной интерферометрии (системы Octet), снабженной биосенсорами против человеческого CH1, используя стандартную кривую с мотавизумабом. Для оценки связывания белка А было выполнено следующее. Конструкции трансфицировали в клетки Expi293 в 30 мл культурах с использованием ExpiFectamine, как описано изготовителем. Через 5-7 суток супернатанты собирали и антитела очищали. С использованием биослойной интерферометрии с биосенсорами белка А измеряли аффинность Fc-модифицированного антитела к белку А и сравнивали с антителом, содержащим Fc-область дикого типа.

Все Fc варианты, экспрессированные в контексте антитела мотавизумаб, разделяли с помощью SDS-PAGE в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях. Вкратце, 2 мкг антитела в 5 мкл воды смешивали с 5 мкл буфера для образцов Лаэмли (каталог BioRad № 161-0737), с β-меркаптоэтанолом (каталог BioRad № 161-0710). Образцы кипятили при 95°С в течение 10 мин и затем быстро центрифугировали. Затем образцы наносили на 4-12% гель Bis-Tris NuPAGE (Thermo Scientific # NP0321BOX) в 1× рабочем буфере MES в XCell SureLock Gel Electrophoresis Cell (каталог Novex # 090403-839) вместе со стандартом молекулярной массы SeeBlue Plus2 (Invitrogen, каталог № LC5925). Образцы анализировали электрофорезом при 200 В в течение 35 мин. Гели окрашивали красителем SimplyBlue SafeStain (Novex # LC6065), следуя протоколу изготовителя, и визуализировали в системе визуализации BioRad ChemiDoc MP.

Эксклюзионная хроматографии на основе ВЭЖХ (SEC-ВЭЖХ) представляет аналитический инструмент, используемый для определения кажущегося размера белка, мономерной чистоты и кажущегося уровня неспецифической адсорбции на колонке между белком и смолой на основе диоксида кремния. Влияние мутаций Fc на профиль элюции IgG оценивали на колонке Phenomenex Biosep 3000s. Вкратце, IgG с различными Fc вариантами разводили до 1 мг/мл в PBS, pH 7,4, и на колонку наносили 20 мкл. Регистрировали время элюирования и процент чистоты.

Термостабильность mAb определяли методом дифференциальной сканирующей флуоресценции (DSF). DSF контролирует конформационную стабильность белка, по мере того, как он подвергается возрастающему тепловому стрессу. Краситель SYPRO ORANGE^® флуоресцирует в гидрофобной среде, такой как гидрофобные остатки ядра, которые экспонируются во время термического развертывания или денатурации белка. Контролируя флуоресцентный сигнал, можно отслеживать развертывание CH2, CH3 и Fab. Различные Fc варианты с мотавизумабом Fab оценивали в анализе с красителем SYPRO Orange. Вкратце, 15 мкл IgG при ~0,5 мг/мл смешивали с 15 мкл разведенного в пропорции 1:500 красителя SYPRO Orange и оценивали с использованием термоциклера с флуоресцентным считывающим устройством, используя скачки температуры 1°C от 40°С до 99°C. Средняя точка между исходным состоянием и первым событием развертывания была представлена как температура перехода или температура плавления (T_m).

Все мутации Fc вводили в ген тяжелой цепи IgG1 (аллотип m3) и клонировали в pcDNA3.1(C). Гены легкой цепи клонировали в pcDNA3.1(A). Во всех случаях нативный сигнальный пептид заменяли сигнальным пептидом остеонектина (инвентарный номер GenBank № AAA60993). Коэкспрессию векторов тяжелой и легкой цепей осуществляли временной трансфекцией в клетках Expi293 с использованием набора для трансфекции Expi293 (каталог Thermo Fisher # A14524), следуя протоколу изготовителя. Векторы тяжелой и легкой цепи котрансфицировали в соотношении 1:2. Супернатант клеточной культуры собирали через 5-7 суток после трансфекции и очищали в системе AKTA 10 FPLC (GE) с использованием колонок с белком A HiTrap MabSelect SuRe (GE), следуя инструкциям изготовителя.

Все антитела выделяли из супернатанта клеточной культуры с использованием колонок объемом 1 мл, заполненных смолой с белком А для селекции mAb (каталог GE # 17543801), с использованием системы AKTA purifier FPLC 10. Вкратце, стерильный отфильтрованный супернатант клеточной культуры нагружали на колонки со скоростью потока 2 мл/мин. Колонки промывали 10 объемами колонки PBSN (1× PBS с 0,05% азида натрия). Антитела элюировали 10 объемами колонки элюирующего буфера (100 мМ глицина, рН 2,5) и нейтрализовали добавлением 17,5% об/об. нейтрализующего буфера (1М Трис-буфер, 1М NaCl, рН 8,0), и собирали фракции по 1 мл. Хроматограмму поглощения при 280 нм использовали для идентификации элюированных фракций, содержащих антитело. Затем все антитела подвергали диализу в 1× PBS с использованием кассеты с отсечением по молекулярной массе 10000 дальтон (каталог Thermo Fisher # 66380).

Связывание с белком А функционально определяли по способности всех антител подвергаться очистке с помощью FPLC с использованием колонок с белком А. После очистки связывание с белком A дополнительно оценивали количественным определением известного количества антител с использованием системы Octet QKe и биосенсоров белка A (каталог Pall № 18-5012), следуя стандартному протоколу количественного определения, поставляемого с программным обеспечением для сбора данных Octet.

Клетки Expi293 котрансфицировали плазмидой, кодирующей α-FcRn человека, с 6× гистидиновой меткой на С-конце и плазмидой, кодирующей β2М человека. Супернатант клеточной культуры собирали через 4 суток после трансфекции. FcRn выделяли из супернатанта клеточной культуры, используя систему FPTA pure FPLC с колонкой HisTrap HP (каталог GE № 17-5247-01). После очистки белок диализовали в 1× PBS, рН 6,0.

Скрининговые анализы проводили с использованием биосенсоров Fab анти-CH1 в системе Octet QKe. Вкратце, очищенный IgG в концентрации 10 мкг/мл нагружали на биосенсор анти-CH1 на 180 с. После 60-с базовой стадии в 1× PBS, pH 6,0 наконечник, нагруженный IgG, подвергают воздействию FcRn в концентрации 60 мкг/мл в течение 60 с с последующей диссоциацией в течение 60 с в PBS, pH 6,0 и дополнительными 30 с в PBS, рН 7,4. Кроме того, связывание FcRn проводили с использованием биосенсоров NiNTA. Вкратце, рекомбинантный человеческий FcRn в концентрации 5 мкг/мл нагружают на биосенсор NiNTA в течение 180 с. После 60-с базовой стадии в 1× PBS, pH 6,0 наконечник, нагруженный FcRn, подвергают воздействию IgG в концентрации 250 нМ (37,5 мкг/мл) в течение 60 с с последующей диссоциацией в течение 60 с в PBS, pH 6,0 и дополнительным 30 с в PBS, pH 7,4. После завершения каждого анализа выполняется количественная оценка константы аффинности (K_D) при pH 6,0 с использованием программного обеспечения ForteBio octet, и качественная оценка выполняется построением графика скорости ответа во времени, что позволяет визуализировать связывание IgG с FcRn при рН 6,0 и последующую диссоциацию при рН 6,0 и рН 7,4.

Как показано на фиг. 12, все Fc варианты по анализированным показателям были сравнимы с антителом WT во всех этих экспериментах.

Пример 8: оценка периода полураспада in vivo и фармакокинетический анализ сконструированных антител

Мотавизумаб дикого типа сравнивали с мотавизумабом, содержащим три из сконструированных мутаций Fc, при оценке периода полураспада сконструированных антител in vivo. Антитела (2-5 мг/кг) вводили мышам, трансгенным по человеческому FcRn, и собирали суточные образцы мышиной сыворотки (сутки 0-сутки 4). ELISA проводили на сыворотке для количественного определения концентрации мотазивумаба в сыворотке.

Количество человеческого IgG, присутствующего в сыворотке мышей, определяли с использованием набора для постановки ELISA для количественного определения человеческого IgG (каталог Bethyl Labs # E80-104), следуя протоколу изготовителя. Все образцы сыворотки титровали в двукратных серийных разведениях, начиная с разведения 1:50 и заканчивая разведением 1:6400. Каждый планшет для ELISA включал кривую стандарта для человека, поставляемую с набором, в двух или трех повторах. Стандартная кривая содержит следующие концентрации: 500,0, 250,0; 125,0; 62,5; 31,3; 15,6; 7,8 и 3,9 нг/мл. Нижним пределом обнаружения считали значение поглощения A450 нм, полученное в пределах от второй до последней точки стандарта, которое составляло 7,8 нг/мл. Поскольку начальное разведение сыворотки составляло 1:50, то это означает, что предел определения в анализе составляет ~0,4 мкг/мл (7,812 нг/мл ×50-кратное разведение). Проводили следующие процедуры для расчета уровней IgG: (1) строили четырехпараметрическую логистическую модель регрессии (4PL) на стандартной кривой; (2) установили максимально приемлемый сигнал A450 нм в качестве показателя для третьей точки титрования на стандартной кривой; (3) установили минимально приемлемый сигнал A450 нм в качестве показателя для седьмой точки титрования на стандартной кривой; (4) маскировали все точки титрования образцов, которые превышали максимально допустимый сигнал и были ниже минимально приемлемого сигнала; (5) использовали стандартную кривую 4PL, подходящую для расчета концентрации для каждой точки титрования с приемлемым сигналом A450 и умножение этого значения на коэффициент разбавления этой точки титрования; (6) для каждого образца титрования рассчитывали среднее значение для рассчитанной концентрации по серии титрования.

Результаты ELISA преобразовали в процент оставшихся антител на основе временной точки 0, представляющей 100%. Как показано на фиг. 13A-13B, все три варианта антител демонстрировали повышенный период полураспада на данной хорошо установленной мышиной модели для определения периода полураспада антител. Мотавизумаб дикого типа имеет период полураспада 32 ч. Мутанты FcMut043 и FcMut045, сконструированнные на основе FcMut008, показывают достоверное повышение периода полураспада. Мутант FcMut045 увеличивает период полураспада в 5,2 раза (период полураспада примерно 166 ч). Период полураспада, а также другие параметры, представленные на фиг. 13B, были рассчитаны с использованием программного обеспечения Winonlin.

Подобные эксперименты проводили с Fc вариантами поздней стадии в контексте мотазивумаба. Когда варианты мотавизумаба вводили в дозе 5 мг/кг, варианты следующего поколения (FcMut171, FcMut183, FcMut186 и FcMut197) демонстрировали дальнейшее увеличение периода полураспада с более чем девятикратным увеличением периода полураспада, наблюдаемого с FcMut213 (фиг. 14A-14B). Один из ранних вариантов (FcMut045) включали для демонстрации улучшенного периода полураспада, наблюдаемого при конструировании на более поздних стадиях по сравнению с конструированием на ранних стадиях. Аналогичные результаты наблюдали, когда варианты мотавизумаба вводили в дозе 2 мг/кг (фиг. 14C-14D).

Для оценки того, насколько усиленное связывание Fc вариантов с человеческим FcRn отражается в повышенной перзистентности в сыворотке и более длительном периоде полураспада в крови, было проведено фармакокинетическое исследование IgG, содержащих различные Fc варианты, на трансгенных мышах Tg276. Модели трансгенных мышей, экспрессирующих человеческий FcRn, были разработаны лабораторией Jackson (JAX) для изучения ФК Fc-содержащих биотерапевтических препаратов для человека. Мыши Tg276 являются нулевыми для мышиной альфа-цепи FcRn и экспрессируют трансген человеческой альфа-цепи FcRn под контролем конститутивного промотора (актина) и используют мышиный β2-микроглобулин. Гомозиготные или гемизиготные мыши Tg276 широко применяются для дифференциации периодов полураспада вариантов антител.

Для исследования in vivo трансгенным по FcRn мышам Tg276hemi внутривенно вводили mAb в дозе 2 или 5 мг/кг. Каждая группа mAb включала 4 мыши/группу. Кровь отбирали на несколько временных точек между 1 ч и 21 сутками, и титры IgG определяли количественным ELISA, как здесь описано. ФК параметры определяли для каждой группы мышей с использованием бескамерной модели с использованием Phoenix WinNonlin версии 7.0 (Certera).

Результаты показаны на фиг. 14A-14D.

Пример 9: оценка периода полураспада сконструированных антител in vivo

Два антитела Zika (ZVA и ZVB), а также мотавизумаб дикого типа (MVZ) вводили мышам, трансгенным по человеческому FcRn, в дозе 2-5 мг/кг, и собирали суточные образцы мышиной сыворотки (сутки 0-сутки 4). ELISA проводили на образцах сыворотки для количественного определения концентрации мотавизумаба. Результаты ELISA преобразовали в процент оставшихся антител на основе временной точки 0, представляющей 100%. Антитело ZVA представляет собой антитело серии A A-3/2. Антитело ZVB представляет антитело серии A A-5/1, содержащее модификацию легкой цепи S92Y, повышающую аффинность. Как показано на фиг. 15, ZVB имело намного более длительный период полураспада, чем мотавизумаб или ZVA (как ZVA, так и ZVB имели более длительный период полураспада, чем мотавизумаб). Эти антитела содержали Fc-области дикого типа, поэтому длительный период полураспада антитела ZVB является свойством самого антитела, а не какой-либо инженерии Fc.

В следующем эксперименте мотавизумаб дикого типа (MVZ WT) тестировали в сравнении с антителом ZVB (ZB-1/4, ZKB на графике) и антителом ZVB, содержащим модификацию Fc 156 (L234A/L235A («LALA») и T256D/T307R/Q311V (увеличение периода полураспада), ZKB-156 на графике), а также мутацию Fc для увеличения периода полураспада «LS» (ZKB-LS). Модификация LS и Fc 156 достоверно увеличивала период полураспада по сравнению с ZVB дикого типа (фиг. 16). Эти данные показывают, что мутация Visterra сравнима с описанной в литературе мутацией LS, а также демонстрируют, что описанные здесь усилия по разработке FC могут привести к пролонгации периода полураспада антитела, которое уже имеет очень длительный период полураспада на этой модели трансгенных мышей. «ZVB» обозначено как «ZKB» на фиг. 16.

Пример 10: связывание с Fc-рецепторами и влияние на эффекторные функции

Типичные Fc варианты оценивали в многочисленных анализах для FcγRI, FcγRIIA (медиатор опсонофагоцитоза), FcγRIIB, FcγRIIIA (медиатор ADCC) и C1q (медиатор CDC).

Связывание с рецепторами Fcγ I, IIa, IIb, IIIa и IIIa V176F (каталог R & D Systems № 1257-FC-050, 1330-CD-050, 1875-CD-050, 4325-FC-050 и 8894-FC-050) измеряли методом ELISA. Все варианты Fc тестировали в контексте антител метавизумаба, ритуксимаба или актоксумаба. Вкратце, Fc-рецепторы наносили на планшет для ELISA (каталог VWR # 62409-002) из расчета 1 мкг/мл (0,1 мкг/лунку) в PBS и выдерживали при 4°C в течение ночи. Планшеты трижды промывали PBST (1× PBS 0,05% Твин-20). Антитела трижды титровали в PBST-BSA от 100 мкг/мл до 0,05 мкг/мл, и 100 мкл добавляли в каждую лунку планшета для постановки ELISA и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты трижды промывали PBST. Козлиную античеловеческую Fc (каталог Jackson # 109-035-098) разбавляли 1:5000 в PBST-BSA, и в каждую лунку вносили 100 мкл и инкубировали в течение 1 ч при 4°C. Планшеты шесть раз промывали PBST. Планшеты развивали с использованием набора субстратов пероксидазы TMB Microwell (каталог VWR № 95059-156). Реакцию останавливали через 10 мин добавлением 1 Н серной кислоты и измеряли поглощение при 450 нм. Значения концентрации антител (ось х) и оптической плотности при 450 нм (ось у) соответствовали четырехпараметрической логистической модели регрессии (4PL). Затем строили кривую для определения EC₅₀ (средняя точка 4PL) для каждого Fc варианта.

Связывание с Fcγ-рецепторами IIa и IIb измеряли с помощью интерферометрии BioLayer с использованием системы Octet QKe. Вкратце, FcγIIa и FcγIIb (каталог R & D Systems # 1330-CD-050 и 1875-CD-050) разбавляли до 5 мкг/мл в PBS. Рецепторы иммобилизовали через C-концевую 6× гистидиновую метку (SEQ ID NO: 2) на биосенсорах Ni-NTA (каталог Pall # 18-5101) в течение 180 с с последующей 60-с базовой стадией в PBS. Затем биосенсоры подвергали воздействию различных Fc вариантов в концентрации 50 мкг/мл в PBS в течение 120 с с последующей стадией диссоциации в PBS в течение дополнительных 120 с. Регистрировали максимальный ответ связывания во время стадии ассоциации для каждого варианта и сравнивали с ответом Fc дикого типа.

Связывание с C1q измеряли с помощью ELISA. Все Fc варианты тестировали в контексте антитела мотавизумаба. Вкратце, антитела наносили на планшет для ELISA (каталог VWR # 62409-002) из расчета 25 мкг/мл (2,5 мкг/лунку) в PBS и выдерживали при 4°С в течение ночи. Планшеты трижды промывали PBST (1× PBS 0,05% Твин 20). Очищенный C1q (каталог Quidel Corporation # A400) титровали в трехкратных разведениях в PBST-BSA (1× PBS 0,05% Твин-20 1% BSA) в диапазоне от 12,5 мкг/мл до 0,02 мкг/мл и инкубировали в течение 90 мин при комнатной температуре. Жидкость аспирировали из лунок и поликлональное кроличье антитело против человеческого C1q (каталог Agilent № A013602-1) разводили в PBST-BSA до конечной концентрации 1 мкг/мл и в каждую лунку вносили 100 мкл и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты трижды промывали PBST. Поликлональные кроличьи антитела к человеческому C1q (каталог Agilent # P021702-2) разбавляли до 0,5 мкг/мл в PBST-BSA и вносили 100 мкл в каждую лунку и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты шесть раз промывали PBST. Планшеты развивали с использованием набора субстратов пероксидазы TMB Microwell (каталог VWR № 95059-156). Реакцию останавливали через 10 мин добавлением 1 Н серной кислоты и измеряли поглощение при 450 нм. Значения концентрации антител (ось х) и оптической плотности при 450 нм (ось у) соответствовали четырехпараметрической логистической модели регрессии (4PL). Затем строили кривую для определения EC₅₀ (средняя точка 4PL) для каждого варианта Fc.

Результаты показаны на фиг. 17A-17D.

Пример 11: CDC-активность сконструированных антител

Оценивали комплементзависимую цитотоксическую (CDC) активность типичных Fc вариантов (ритуксимаб Fab).

Анализы CDC выполняли с использованием клеток CD20+ Raji и низкотоксичного комплемента морской свинки (Cedarlane Laboratories Product # CL4051). Индуцированный комплементом лизис клеток измеряли с использованием нерадиоактивного анализа цитотоксичности CYTOTOX 96^® от Promega (каталог № G1780), следуя протоколу изготовителя. Все Fc варианты тестировали в контексте антитела против CD20, ритуксимаба. Вкратце, концентрации антител титровали в четырехкратных разведениях в диапазоне от 20 мкг/мл до 0,005 мкг/мл и инкубировали с 20000 клеток-мишеней на лунку при 37°С в течение 30 мин. Затем к клеткам добавляли комплемент и инкубировали еще 2 ч при 37°С. Кроме того, буфер для лизиса клеток, поставляемый с набором CYTOTOX, добавляли в контрольные лунки для измерения максимального лизиса клеток. Антитело мотавизумаб, которое использовали в качестве отрицательного контроля, использовали для измерения фонового сигнала нерелевантного антитела. Фоновый сигнал и максимальный сигнал лизиса использовали для расчета процента лизиса клеток для каждого Fc варианта. Значения концентрации антител (ось х) и процента лизиса (ось у) соответствовали четырехпараметрической логистической модели регрессии. Затем строили кривую для определения ЕС50 (концентрация, необходимая для получения 50% лизиса) и максимального лизиса для каждого варианта Fc.

Результаты показаны на фиг. 18.

Пример 12: ADCC-активность сконструированных антител

Оценивали активность антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) типичных Fc вариантов (ритуксимаб Fab).

Анализ ADCC проводили с использованием биоанализа ADCC Reporter с клетками-мишенями CD20⁺ WIL2-S от Promega (номер по каталогу G7014), следуя протоколу изготовителя. Все Fc варианты тестировали в контексте анти-CD20-антитела, ритуксимаба. Концентрации антител титровали в пятикратных разведениях в диапазоне от 5 мкг/мл до 0,0016 мкг/мл. Значения концентрации антител (ось х) и кратной индукции люминесцентного репортерного гена (ось у) соответствовали четырехпараметрической логистической модели регрессии (4PL). Затем строили кривую для определения EC₅₀ (средняя точка 4PL) и максимальной индукции для каждого варианта Fc.

Результаты показаны на фиг. 19А-19В. Типичные Fc варианты сохраняют, а в некоторых случаях усиливают ADCC-активность.

Пример 13: ADIN-активность сконструированных антител

TRIM21 является цитозольным рецептором, который связывается с Fc IgG. TRIM21 играет роль в обеспечении внутриклеточного распознавания и нейтрализации Fc-связанных вирусов. TRIM21-опосредованная нейтрализация известна как антителозависимая внутриклеточная нейтрализация (ADIN).

Связывание с TRIM21 измеряли с помощью ELISA. Все Fc варианты тестировали в контексте антител мотавизумаба или актоксумаба. Вкратце, антитела наносили на планшет для ELISA (каталог VWR # 62409-002) из расчета 25 мкг/мл (2,5 мкг/лунку) в PBS и выдерживали при 4°С в течение ночи. Планшеты трижды промывали PBST (1× PBS 0,05% Твин-20). TRIM21-GST (онлайн-каталог антител <ABIN1323621) титровали в трехкратных разведениях в PBST-BSA (1× PBS 0,05% Твин-20 1% BSA) в диапазоне от 12,5 мкг/мл до 0,02 мкг/мл и инкубировали в течение 90 мин при комнатной температуре. Жидкость аспирировали из лунок и два кроличьих антитела против TRIM21 (каталог AbCam № ab91423 и ab96800) смешивали вместе в PBST-BSA в конечной концентрации 1 мкг/мл каждое и в каждую лунку вносили 100 мкл и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты трижды промывали PBST. Поликлональные свиные антикроличьи-HRP антитела (каталог Agilent # P021702-2) разбавляли до 0,5 мкг/мл в PBST-BSA и вносили 100 мкл в каждую лунку и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты шесть раз промывали PBST. Планшеты развивали с использованием набора субстратов пероксидазы TMB Microwell (каталог VWR № 95059-156). Реакцию останавливали через 10 мин добавлением 1 Н серной кислоты и измеряли поглощение при 450 нм. Значения концентрации антител (ось х) и оптической плотности при 450 нм (ось у) соответствовали четырехпараметрической логистической модели регрессии (4PL). Затем строили кривую для определения EC₅₀ (средняя точка 4PL) для каждого варианта Fc.

ELISA для оценки связывания с TRIM21 проводили для определения того, насколько Fc варианты оказывают влияние на связывание с TRIM21. Результаты показаны на фиг. 26. Варианты Fc FcMut045, FcMut183, FcMut197, FcMut213, FcMut215, FcMut228 имели значения EC₅₀ для связывания с TRIM21, которые были в 1,5 раза ниже, чем WT EC₅₀.

Пример 14: усиление поглощения слизистой оболочкой за счет мутаций Fc

FcRn транспортирует IgG через различные клеточные барьеры, такие как эпителиальные выстилки слизистой кишечника и альвеол. Модификация связывания FcRn обеспечивает механизм для улучшения локализации в слизистой оболочке, который обеспечивает иммунную защиту. Ожидается, что типичные Fc мутанты также будут иметь повышенное поглощение слизистой.

Пример 15: влияние мутаций, усиливающих аффинность к FcRn, на взаимодействие с Fc-рецепторами и эффекторные функции

Экспериментально оценивали влияние мутаций, усиливающих аффинность к FcRn, на связывание Fc с другими рецепторами. Fc-область IgG способна связываться со многими различными Fc-рецепторами, и механизм действия многих терапевтических антител зависит от взаимодействия с Fc-рецепторами. Мутации, даже в положениях, отдаленных от сайта связывания с Fc-рецептором, могут оказывать влияние на связывание Fc с рецепторами, такими как FcγRI, FcγRIIa/b, FcγRIIIa, C1q, TRIM21. В то время как Fc-рецептор TRIM21 связывается с сайтом, который перекрывается с сайтом связывания FcRn на CH2-CH3, другие рецепторы, такие как Fcγ-рецепторы и C1q, взаимодействуют на поверхности раздела, образованной димерным CH2. Таким образом, любые мутации, введенные для пролонгации периода полураспада, должны оцениваться на предмет их влияния на связывание с другими рецепторами. Мутации, введенные для пролонгации периода полураспада, могут быть подвергнуты оценке Fc вариантов (FcMut183, FcMut197, FcMut213, FcMut215, FcMut228, FcMut229, YTE, LS) в Fab ритуксимаба и вместе с ритуксимабом WT, которые были оценены на связывание с FcγRI, FcRa, FcR FcγRIIIa, C1q и TRIM21. Как показано на фиг. 24, введение Fc вариантов FcMut183, FcMut197, FcMut213, FcMut215, FcMut228 и FcMut229 не оказало достоверного влияния на взаимодействие с тестированными Fc-рецепторами.

Несмотря на то, что связывание с Fc-рецепторами необходимо для таких активностей, как ADCC (FcγRIIIa), CDC (C1q) и ADIN (TRIM21), этого может быть недостаточным для опосредования этих активностей. Например, гексамерная сборка Fc необходима для выявления CDC-активности. Сборка гексамера Fc включает образование границы раздела Fc-Fc, и остатки, участвующие в образовании этой границы раздела, частично перекрываются с сайтом связывания FcRn. В связи с этим было важно оценить влияние мутаций Fc не только на связывание с Fc-рецепторами, но и на такие активности, как CDC и ADCC. Ритуксимаб с различными Fc вариантами (FcMut183, FcMut197, FcMut213, FcMut215, FcMut228, FcMut229, YTE, LS, WT) оценивали на активность ADCC и CDC, как описано в разделе «Методы». Результаты подтвердили, что Fc варианты FcMut183, FcMut197, FcMut213, FcMut215, FcMut228 и FcMut229 не оказывали отрицательного влияния на активность ADCC и фактически демонстрировали небольшое увеличение активности CDC. Ритуксимаб, содержащий YTE, не проявлял детектируемой CDC-активности и достоверно снижал ADCC-активность. Аналогично, другой мутант FcMut197 обладал пониженной ADCC-активностью и CDC-активностью. Проверка сетевой карты этих мутаций дает представление о возможной причине потери активности ADCC и CDC.

Пример 16: перзистентность оптимизированных Fc вариантов в сыворотке трансгенных мышей

Для оценки того, насколько повышенное связывание Fc вариантов с человеческим FcRn отражается в повышении перзистентности в сыворотке и более длительном периоде полураспада в крови, было проведено фармакокинетическое исследование IgG, содержащих различные Fc варианты, на трансгенных мышах Tg276. Модели трансгенных мышей, экспрессирующих человеческий FcRn, можно использовать для изучения ФК Fc-содержащих биотерапевтических средств для человека (Roopenian et al., Methods Mol. Biol., 2010. 602: 93-104; Petkova et al., Int. Immunol., 2006. 18 (12): 1759-69). Мыши Tg276 являются нулевыми для мышиной альфа-цепи FcRn и экспрессируют трансген альфа-цепи человеческого FcRn под контролем конститутивного промотора (актина) и используют мышиный β2-микроглобулин. Гомозиготных и гемизиготных мышей Tg276 можно использовать для дифференциации периодов полураспада вариантов антител. Для исследования ФК трансгенным мышам Tg276hemi FcRn внутривенно вводили 5 мг/кг IgG (Fab мотавизумаба с WT или модифицированной Fc). Отбор крови из ретробульбарного венозного сплетения крови проводили на несколько временных точек, и титры IgG определяли количественным ELISA. IgG, содержащие сконструированные Fc варианты, сохранялись в сыворотке намного дольше, чем мотавизумаб дикого типа (фигура 25А). Фармакокинетические параметры, определенные с использованием бекамерного анализа, указывают на то, что у мотавизумаба с Fc вариантами скорость клиренса была ниже более чем в два раза, а также были достоверно увеличены периоды полураспада в β-фазе элиминации и измерения площади под кривой (AUC) (фигура 25B).

Включение по ссылке

Все публикации, патенты и регистрационные номера, упомянутые в настоящем документе, настоящим включены посредством ссылки во всей их полноте, как если бы каждая отдельная публикация или патент были специально и индивидуально указаны для включения в виде ссылки.

Эквиваленты

Несмотря на то, что были обсуждены конкретные варианты осуществления предмета изобретения, вышеприведенное описание является иллюстративным, а не ограничивающим. Многие варианты изобретения станут очевидными для специалистов в данной области техники после рассмотрения настоящего описания и формулы изобретения, приведенной ниже. Полный объем изобретения должен быть определен посредством ссылки на формулу изобретения вместе с полным объемом эквивалентов и описания таких вариантов.

--->

Список последовательностей

<110> VISTERRA, INC.

<120> ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

<130> P2029-7014WO

<140>

<141>

<150> 62/485,671

<151> 2017-04-14

<150> 62/370,201

<151> 2016-08-02

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 330

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 1

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 2

<211> 6

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетическая 6xHis метка"

<400> 2

His His His His His His

1 5

<---

Группа изобретений относится к биотехнологии. Представлены: молекула антитела, содержащая домены CH2 и CH3 Fc-области, где указанные домены CH2 и CH3 Fc-области содержат мутации, а также способ ее получения и применения данной молекулы антитела в производстве лекарственного средства для лечения расстройства у субъекта. Кроме того, раскрыты фармацевтическая композиция для лечения расстройства, где указанное расстройство ассоциировано с антигеном, который специфически связывается указанной молекулой антитела, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая молекулу антитела, вектор для экспрессии молекулы антитела и клетка для получения молекулы антитела. Также описаны набор для лечения расстройства, способ лечения расстройства, где способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества молекулы антитела и способ детектирования молекулы, специфично связанной молекулой антитела. Изобретение применяется для лечения расстройства у субъекта, где указанное расстройство ассоциировано с антигеном, который специфически связывается указанной молекулой антитела. 10 н. и 10 з.п. ф-лы, 2 табл., 30 ил., 16 пр.

1. Молекула антитела, содержащая домены CH2 и CH3 Fc-области, где указанные домены CH2 и CH3 Fc-области содержат мутации в остатках, выбранных из:

(i) T307Q, Q311V и A378V;

(ii) T256D, Q311V и A378V;

(iii) H285N, T307Q и N315D;

(iv) H285D, T307Q и A378V;

(v) T256D, N286D, T307R, Q311V и A378V; или

(vi) T256D, H285D, T307R, Q311V и A378V,

в соответствии с нумерацией EU;

где указанная молекула антитела имеет период полураспада in vivo, повышенный по меньшей мере в 4 раза по сравнению с эталонной молекулой антитела, содержащей Fc-область дикого типа, содержащую аминокислотную последовательность PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (аминокислоты 121-330 SEQ ID NO: 1).

2. Молекула антитела по п.1, содержащая мутацию в области, отличной от Fc-области.

3. Молекула антитела по любому из пп.1, 2, содержащая шарнирную область между доменами CH2 и CH3 Fc-области.

4. Молекула антитела по любому из пп.1-3, содержащая множество мутаций, где по меньшей мере одна мутация является компенсирующей или полезной мутацией.

5. Молекула антитела по любому из пп.1-4, которая представляет собой выделенную молекулу антитела.

6. Молекула антитела по любому из пп.1-5, которая представляет собой синтетическую молекулу антитела.

7. Молекула антитела по п.1, которая содержит вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина или обе.

8. Молекула антитела по п.1, где молекула антитела представляет собой молекулу химерного антитела, молекулу мышиного антитела, молекулу человеческого антитела или молекулу гуманизированного антитела.

9. Молекула антитела по любому из пп.1-8, где молекула антитела имеет 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или все из следующих свойств:

а) имеет увеличенную аффинность связывания с неонатальным Fc-рецептором (FcRn) при рН от 6,0 до 6,5 по сравнению с указанной эталонной молекулой антитела;

b) имеет более высокую аффинность связывания с FcRn при рН между 6,0 и 6,5, чем аффинность связывания при рН между 7,0 и 7,4;

c) связывается с FcRn при pH от 6,0 до 6,5 с константой диссоциации (K_d), равной 300 нМ или ниже;

d) связывается с FcRn при pH от 7,0 до 7,4 с K_d, равной 50 нМ или выше;

е) имеет одинаковую, по существу одинаковую или увеличенную аффинность связывания с рецептором Fcγ по сравнению с указанной эталонной молекулой антитела;

f) имеет одинаковую или по существу одинаковую термостабильность по сравнению с указанной эталонной молекулой антитела;

g) имеет одинаковую, по существу одинаковую или увеличенную аффинность связывания с C1q по сравнению с указанной эталонной молекулой антитела;

h) имеет одинаковую, по существу одинаковую или увеличенную аффинность связывания с TRIM21 по сравнению с указанной эталонной молекулой антитела;

i) имеет эффекторную функцию, которая является одинаковой, по существу одинаковой или увеличенной по сравнению с указанной эталонной молекулой антитела;

j) имеет повышенный период полураспада in vivo по сравнению с указанной эталонной молекулой антитела;

k) имеет биологическую функцию in vitro, ex vivo или in vivo, которая является одинаковой, по существу одинаковой или увеличенной по сравнению с указанной эталонной молекулой антитела;

l) имеет показатели для развития, которые являются одинаковыми или по существу одинаковыми по сравнению с указанной эталонной молекулой антитела;

m) имеет одинаковую, по существу одинаковую или увеличенную аффинность, специфичность связывания, или обе, для эпитопа по сравнению с указанной эталонной молекулой антитела; или

n) имеет повышенное поглощение слизистой по сравнению с указанной эталонной молекулой антитела, и

где молекула антитела обладает, по меньшей мере, свойствами а), b) и одним, двумя, тремя, четырьмя или всеми из свойств е), f), g), h) или i).

10. Молекула антитела по любому из пп.1-9,

(i) которая имеет, по меньшей мере, в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40 или 50 раз более высокую аффинность связывания для FcRn при рН 6,0 по сравнению с указанной эталонной молекулой антитела, как определено анализом на основе системы Octet или клеточным анализом;

(ii) которая имеет, по меньшей мере, в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или 50 раз более высокую аффинность связывания для FcRn при рН 6,0, чем при рН 7,4, как определено анализом на основе системы Octet или клеточным анализом;

(iii) которая связывается с FcRn при рН 6,0 с константой диссоциации (K_d), равной 250 нМ или ниже, 200 нМ или ниже, 150 нМ или ниже, 100 нМ или ниже, 50 нМ или ниже, 25 нМ или ниже, 10 нМ или ниже, 5 нМ или ниже, 2 нМ или ниже, 1 нМ или ниже, 0,5 нМ или ниже, 0,2 нМ или ниже, 0,1 нМ или ниже, 0,05 нМ или ниже, 0,02 нМ или ниже, 0,01 нМ или ниже, от 25 нМ до 0,1 нМ, от 20 нМ до 0,5 нМ, от 15 нМ до 1 нМ, от 10 нМ до 5 нМ или от 20 нМ до 10 нМ, как определено анализом на основе системы Octet или клеточным анализом;

(iv) которая связывается с FcRn при pH 7,4 с K_d, равной 60 нМ или выше, 80 нМ или выше, 100 нМ или выше, 150 нМ или выше, 200 нМ или выше, 500 нМ или выше, от 50 нМ до 500 нМ или от 100 нМ до 250 нМ, как определено анализом на основе системы Octet или клеточным анализом;

(v) которая имеет аффинность связывания для одного, двух или всех FcγRI, FcγRIIa/b или FcγRIII, которая уменьшается не более чем на 10%, 20%, 30%, 40%, или на 50%, или аффинность связывания для одного, двух или всех FcγRI, FcγRIIa/b или FcγRIII, которая увеличивается, по меньшей мере, в 1,5, 2, 3, 4 или 5 раз по сравнению с указанной эталонной молекулой антитела, как определено анализом на основе системы Octet или клеточным анализом;

(vi) которая имеет температуру плавления, которая повышается или снижается не более чем на 1°С, 2°С, 3°С, 4°С, 5°С, 6°С, 7°С, 8°С, 9°С или 10°С по сравнению с указанной эталонной молекулой антитела, как определено анализом с красителем Sypro Orange;

(vii) которая имеет аффинность связывания для C1q, которая уменьшается не более чем на 10%, 20%, 30%, 40% или 50%, или аффинность связывания для C1q, которая увеличивается, по меньшей мере, в 1,5, 2, 3, 4 или 5 раз по сравнению с указанной эталонной молекулой антитела, как определено с использованием ELISA;

(viii) которая имеет аффинность связывания для TRIM21, которая уменьшается не более чем на 10%, 20%, 30%, 40% или 50%, или аффинность связывания для TRIM21, которая увеличивается, по меньшей мере, в 1,5, 2, 3, 4 или 5 раз по сравнению с указанной эталонной молекулой антитела, как определено с использованием ELISA;

(ix) которая имеет уменьшение одного, двух, трех или всех из комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC), антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC), антителозависимого клеточно-опосредованного фагоцитоза (ADCP) или антителозависимой внутриклеточной нейтрализации (ADIN) не более чем на 10%, 20%, 30%, 40% или 50%, или увеличение одного, двух, трех или всех из комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC), антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC), антителозависимого клеточно-опосредованного фагоцитоза (ADCP) или антителозависимой внутриклеточной нейтрализации (ADIN), по меньшей мере, в 1,5, 2, 3, 4 или 5 раз по сравнению с указанной эталонной молекулой антитела;

(x) которая имеет биологическую функцию in vitro, ex vivo или in vivo, которая уменьшается не более чем на 10%, 20%, 30%, 40% или 50%, или биологическую функцию in vitro, ex vivo или in vivo, которая увеличивается, по меньшей мере, в 1,5, 2, 3, 4 или 5 раз по сравнению с указанной эталонной молекулой антитела;

(xi) которая имеет изменение одного, двух, трех или всех показателей из стабильности, растворимости, агрегации или экспрессии не более чем на 10%, 20%, 30%, 40% или 50% по сравнению с указанной эталонной молекулой антитела;

(xii) которая имеет аффинность, специфичность связывания, или обе, которая уменьшается не более чем на 10%, 20%, 30%, 40% или 50%, или аффинность, специфичность связывания, или обе, которая увеличивается, по меньшей мере, в 1,5, 2, 3, 4 или 5 раз по сравнению с указанной эталонной молекулой антитела; и/или

(xiii) которая имеет повышенное поглощение слизистой, по меньшей мере, в 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз по сравнению с указанной эталонной молекулой антитела, как определено анализом трансцитоза.

11. Фармацевтическая композиция для лечения расстройства, содержащая эффективное количество молекулы антитела по любому из пп.1-10 и фармацевтически приемлемый носитель, где указанное расстройство ассоциировано с антигеном, который специфически связывается указанной молекулой антитела.

12. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая молекулу антитела по любому из пп.1-10.

13. Вектор для экспрессии молекулы антитела, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.12.

14. Клетка для получения молекулы антитела, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п.12 или вектор по п.13.

15. Набор для лечения расстройства, содержащий молекулу антитела по любому из пп.1-10 и инструкции по применению указанной молекулы антитела,

где указанное расстройство ассоциировано с антигеном, который специфически связывается указанной молекулой антитела.

16. Способ получения молекулы антитела, включающий культивирование клетки по п.14 в условиях, позволяющих продуцировать молекулу антитела, тем самым обеспечивая продукцию молекулы антитела,

необязательно где указанный способ дополнительно включает выделение или очистку молекулы антитела.

17. Способ лечения расстройства, где способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества молекулы антитела по любому из пп.1-10 или композиции по п.11, тем самым обеспечивая лечение расстройства,

где указанное расстройство ассоциировано с антигеном, который специфически связывается указанной молекулой антитела.

18. Молекула антитела по любому из пп.1-10 или композиция по п.11 для применения в лечении расстройства у субъекта,

где указанное расстройство ассоциировано с антигеном, который специфически связывается указанной молекулой антитела.

19. Применение молекулы антитела по любому из пп.1-10 или композиции по п.11 в производстве лекарственного средства для лечения расстройства у субъекта,

где указанное расстройство ассоциировано с антигеном, который специфически связывается указанной молекулой антитела.

20. Способ детектирования молекулы, специфично связанной молекулой антитела по любому из пп.1-10, включающий приведение клетки или образца от субъекта в контакт с молекулой антитела по любому из пп.1-10, посредством чего обеспечивается детектирование молекулы.