ПРИМЕНЕНИЕ СТИМУЛИРУЮЩЕГО СРЕДСТВА ДЛЯ АНАЛИЗА АКТИВНОСТИ ИММУННЫХ КЛЕТОК Российский патент 2024 года по МПК C07K14/54 C12Q1/689 G01N33/68 A61P35/00 A61K39/00 

Родственные заявки

[0001] Согласно настоящей заявке испрашивается приоритет перед предварительной заявкой США № 62/805349, поданной 14 февраля 2019 года, которая включена в данный документ посредством ссылки в полном объеме.

Область изобретения

[0002] Настоящее изобретение относится к иммунотерапии, и более конкретно к тестированию эффекторной функции иммунных клеток.

Предшествующий уровень техники

[0003] Иммунотерапия представляет собой лечение заболевания с помощью активации или подавления иммунной системы. Клетки, полученные из иммунной системы, можно применять для улучшения функциональности и характеристик иммунной системы. В последние годы иммунотерапия вызвала большой интерес у исследователей, врачей и фармацевтических компаний, особенно в связи с ее перспективой лечения различных форм рака. Иммуномодулирующие схемы часто имеют меньше побочных эффектов, чем существующие лекарственные средства, в том числе меньший потенциал для создания резистентности при лечении заболеваний, вызванных микроорганизмами.

[0004] Обычные виды лечения рака направлены на уничтожение или удаление раковых клеток с помощью химиотерапии, хирургического вмешательства и/или облучения. Однако область терапевтических иммунных клеток быстро растет, и их можно применять в сочетании или, в некоторых случаях, вместо традиционных видов лечения для лечения, предупреждения или задержки возникновения рака. Иммунные эффекторные клетки, такие как лимфоциты, макрофаги, дендритные клетки, естественные клетки-киллеры (NK-клетки), цитотоксические Т-лимфоциты (CTL) и т.д., естественным образом функционируют совместно, защищая организм от рака, воздействуя на патологические антигены, экспрессируемые на поверхности опухолевых клеток. Последние разработки в области лечения рака были сосредоточены на том, чтобы заставить иммунную систему пациента атаковать и разрушать опухоли. Различные стратегии применяются или проходят исследования и испытания.

[0005] Адаптивный перенос клеток (ACT) представляет собой перенос клеток пациенту и он показал себя перспективным в борьбе с раком легкого, меланомой и другими видами рака. Клетки могли происходить от пациента (аутологичные) или от другого индивидуума (аллогенные). Аллогенные виды терапии включает клетки, выделенные и экспандированные от донора, отдельно от пациента, получающего клетки. В качестве альтернативы можно применять адаптивный перенос клеток для культивирования и экспансиии аутологичных экстрагированных клеток для последующего переливания. Например, терапия на основе аутологической иммунной стимуляции включает извлечение у субъекта собственных естественных клеток-киллеров периферической крови, цитотоксических Т-лимфоцитов, эпителиальных клеток и других соответствующих иммунных клеток, экспансию этих клеток in vitro, и затем реинфузию этих клеток в организм субъекта.

[0006] В некоторых видах терапии клетки (например, Т-клетки) генетически модифицируются и размножаются in vitro перед возвратом в организм того же самого пациента. Т-клеточная терапия на основе химерного антигенного рецептора (CAR-T) включает сбор Т-клеток у субъекта и затем инфицирование Т-клеток ретровирусом, который содержит копию гена Т-клеточного рецептора (TCR). Ген TCR специализируется на распознавании опухолевых антигенов (например, химерного антигенного рецептора или CAR). Вирус интегрирует рецептор в геном Т-клеток. Клетки неспецифически экспандируются и/или стимулируются. Затем клетки реинфузируются и вызывают иммунный ответ против опухолевых клеток.

[0007] С одобрением первой терапии CAR-T и участием нескольких коммерческих компаний в многочисленных клинических испытаниях эта область стала коммерчески успешной и продемонстрировали перспективное будущее для видов иммунотерапии. По мере того, как в этой области постоянно появляются новые клинические испытания, с тех пор растет потребность в надежных и воспроизводимых тестах активности этих терапевтических иммунных клеток. Промышленным «золотым стандартом» для проверки эффекторной функции иммунных клеток является анализ высвобождения хрома, который был разработан в 1960-х годах и до сих пор применяется, даже несмотря на опасения, связанные с применением радиоактивного вещества и вариабельностью, вызванной целевыми опухолевыми клетками. Доступной альтернативой является анализ на основе кальцеина, который все еще имеет большую вариабельность, вызванную применением различных опухолевых мишеней и захватом кальцеина в апоптотических тельцах опухолевых мишеней.

[0008] Были и другие попытки разработки различных способов визуального наблюдения эффекторной функции этих иммунных клеток, но в этих способах все еще используются целевых опухолевые клетки. Другие упрощенные способы проверки эффекторной функции иммунных клеток представляют собой проверку цитокинов, продуцируемых этими клетками, для которых во всех традиционных способах применяются опухолевые целевые клетки для индукции продуцирования цитокинов иммунными клетками. Применение целевых опухолевых клеток добавляет биологической вариабельности ко всем этим тестам вследствие вариабельности между типами опухолевых клеток. Кроме того, эти анализы требуют трудоемкой настройки, которая привносит в эти анализы групповой эффект. Групповой эффект вызван условиями целевых клеток, вариабельностью загрузки планшета от человека к человеку, условиями планшета, вариабельностью различных реагентов, вариабельностью показаний и т.д. Существует очевидная потребность в анализе активности иммунных клеток, который может устранить все эти виды вариабельности и привести к надежным и воспроизводимым результатам.

[0009] Для оценки качества продуктов иммуноклеточной терапии требуется надежный и воспроизводимый анализ активности. Процесс утверждения строго регулируется, и разработчики лекарственных средств должны будут предоставить значительный объем информации о лекарственном продукте регулирующим органам для получения разрешения. Он может включать информацию относительно эффективности лекарственного средства и анализов для определения этой активности. Согласно требованиям FDA (21 CFR 610.10), эффективность продукта клеточной терапии должна быть подтверждена соответствующими тестами для демонстрации эффекторной функции этих терапевтических иммунных клеток для того, чтобы продемонстрировать активность, которая будет измерять продуцирование соответствующих цитокинов этими иммунными клетками.

Краткое описание сути изобретения

[0010] Подробности одного или нескольких вариантов осуществления настоящего изобретения изложены на прилагаемых чертежах и в описании ниже. Другие характеристики, объекты и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из описания и графических материалов, а также из формулы изобретения.

[0011] В одном аспекте в данном документе раскрыты способы анализа активности иммунной клетки (такой как, например, Т-клетка, макрофаг, NK-клетка, NK-T-клетка, CAR-T-клетка и/или CAR-NK-клетка), включающие приведение иммунной клетки в контакт с эффективным количеством стимулирующего средства (такого как, например, фитогемагглютинин (PHA), форболмиристат ацетат (PMA)/иономицин, конканавалин A (Con A), липополисахарид (LPS) и/или митоген лаконоса (PWM)) и определение содержания одного или нескольких цитокинов (таких как, например, IL-2, IL-6, IFN-γ, TNF-α, BAFF/TNFSF13B, CD163, CD30/TNFRSF8, хитиназа 3-подобный белок 1, gp130, IFN-α2, IL-6Rα, IL-8, IL-10, IL-11, IL-12(p40), IL-12(p70), IL-20, IL-22, IL-26, IL-29/IFN-l1, IL-32, IL-34, IL-35, MMP-1, остеокальцин, OPN, пентраксин-3, TNF-R1, TNF-R2, TSLP, GM-CSF, MIP-1, MIP-1, RANTES и/или TWEAK/TNFSF12), продуцируемых иммунной клеткой. В одном аспекте способ может дополнительно включать сравнение содержания продуцируемого цитокина с уровнем активности цитокина, необходимым для применения иммунной клетки в иммунотерапии.

[0012] В данном документе также раскрыты способы анализа активности иммунной клетки по любому из предыдущих аспектов, где содержание цитокина определяется с помощью иммуноанализа (такого как, например, ELISA, внутриклеточное окрашивание цитокинов, ELISpot, проточная цитометрия, Luminex xMAP®, количественная ПЦР (включая, но не ограничиваясь, qRT-PCR) и/или набора гранул).

[0013] В одном аспекте в данном документе раскрыты способы анализа эффективности иммунной клетки по любому из предыдущих аспектов, в которых иммунная клетка приведена в контакт с эффективным количеством стимулирующего средства (такого как, например, PHA, PMA/иономицин, Con A, LPS и/или PWM) в течение по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 150 минут, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 30, 32, 36, 42, 48, 60 часов, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 45, 60, 61, 62 дня, 3, 4, 5 или 6 месяцев.

[0014] В данном документе также раскрыты способы анализа активности иммунной клетки по любому из предыдущих аспектов, в которых стимулирующее средство (такое как, например, PHA, PMA/иономицин, Con A, LPS и/или PWM) представлены в концентрации от 1,0 мкг/мл до 1000 мкг/мл, включая, но не ограничиваясь ими, концентрацию от 5 до 15 мкг/мл.

[0015] В одном аспекте в данном документе раскрыты наборы для анализа активности иммунной клетки (такой как, например, Т-клетка, макрофаг, NK-клетка, NK-T-клетка, CAR T-клетка и/или CAR NK-клетка), содержащие контейнер (такой как, например, микроцентрифужная пробирка), содержащий эффективное количество стимулирующего средства (такого как, например, PHA, PMA/иономицин, Con A, LPS и/или PWM) и буфер, подходящий для иммунных клеток. В некоторых аспектах набор может дополнительно содержать инструкции по применению набора для стимуляции продуцирования цитокинов иммунной клеткой.

[0016] В данном документе также раскрыты наборы для анализа активности иммунной клетки по любому из предыдущих аспектов, в которых стимулирующее средство (такое как, например, PHA, PMA/иономицин, Con A, LPS и/или PWM) представлены в концентрации от 1,0 мкг/мл до 1000 мкг/мл, включая, но не ограничиваясь ими, концентрацию от 5 до 15 мкг/мл.

[0017] В одном аспекте в данном документе раскрыт способ иммунотерапии, включающий а) осуществления способа анализа активности иммунной клетки (такой как, например, Т-клетка, макрофаг, NK-клетка, NK-T-клетка, CAR-T-клетка, и/или CAR NK-клетка) по любому из предыдущих аспектов на ряде иммунных клеток для определения эффективности каждой иммунной клетки; b) выбор по меньшей мере одной активной иммунной клетки на основе содержания обнаруженного цитокина (такого как, например, IL-2, IL-6, IFN-γ, TNF-α, BAFF/TNFSF13B, CD163, CD30/TNFRSF8, хитиназа 3-подобный белок 1, gp130, IFN-α2, IL-6Rα, IL-8, IL-10, IL-11, IL-12(p40), IL-12(p70), IL-20, IL-22, IL-26, IL-29/IFN-l1, IL-32, IL-34, IL-35, MMP-1, остеокальцин, OPN, пентраксин-3, TNF-R1, TNF-R2, TSLP, GM-CSF, MIP-1, MIP-1, RANTES и/или TWEAK/TNFSF12); и c) введение терапевтически эффективного количества активной иммунной клетки субъекту, нуждающемуся в этом, в качестве иммунотерапевтического средства. В одном аспекте способ может дополнительно включать извлечение ряда иммунных клеток из аллогенного или аутологичного донора до анализа активности иммунной клетки.

[0018] В данном документе также раскрыты способы иммунотерапии по любому из предыдущих аспектов, дополнительно включающие экспансию по меньшей мере одной активной иммунной клетки перед доставкой терапевтически эффективного количества активной иммунной клетки.

[0019] В одном аспекте в данном документе раскрыты способы иммунотерапии по любому из предыдущих аспектов, дополнительно включающие направление ряда иммунных клеток или активных иммунных клеток для ответа на определенный антиген. В одном аспекте способ может дополнительно включать модификацию клеточной линии, из которой происходят экзосомы, или модификацию самих экзосом для включения определенного антигена, на который реагируют представляющие интерес иммунные клетки (например, добавление CD19 для специфического определения активности CD19 CAR Т-клеток в гетерогенном образце).

[0020] В данном документе также раскрыты способы иммунотерапии по любому из предыдущих аспектов, дополнительно включающие генетическое изменение ряда иммунных клеток или активной иммунной клетки для презентации химерного антигенного рецептора.

[0021] В одном аспекте в данном документе раскрыты способы лечения, ингибирования, ослабления, предупреждения и/или облегчения рака и/или метастазирования у субъекта, включающие а) получение одной или нескольких иммунных клеток (таких как, например, Т-клетка, макрофаг, NK-клетка, NK-T-клетка, CAR-T-клетка и/или CAR-NK-клетка), полученных от аллогенного или аутологичного донора); b) приведение иммунной клетки в контакт с эффективным количеством стимулирующего средства (такого как, например, PHA, PMA/иономицин, Con A, LPS и/или PWM); c) определение содержания цитокина (такого как, например, IL-2, IL-6, IFN-γ, TNF-α, BAFF/TNFSF13B, CD163, CD30/TNFRSF8, хитиназа 3-подобный белок 1, gp130, IFN-α2, IL-6Rα, IL-8, IL-10, IL-11, IL-12(p40), IL-12(p70), IL-20, IL-22, IL-26, IL-29/IFN-l1, IL-32, IL-34, IL-35, MMP-1, остеокальцин, OPN, пентраксин-3, TNF-R1, TNF-R2, TSLP, GM-CSF, MIP-1, MIP-1, RANTES и/или TWEAK/TNFSF12), продуцируемого иммунной клеткой; d) выбор по меньшей мере одной активной иммунной клетки на основе обнаруженного содержания цитокина; и e) введение субъекту терапевтически эффективного количества активной иммунной клетки. В некоторых аспектах способ может дополнительно включать извлечение иммунной клетки от аутологичного или аллогенного донора.

[0022] В данном документе также раскрыты способы лечения, ингибирования, ослабления, предупреждения и/или облегчения рака и/или метастазирования у субъекта по любому из предыдущих аспектов, дополнительно включающие экспансию по меньшей мере одной активной иммунной клетки перед доставкой терапевтически эффективного количества по меньшей мере одной активной иммунной клетки.

[0023] В данном документе также раскрыты способы определения идентичности (например, дифференциации Th1, Th2, Th3, Th9, Th17, эффекторных Т-клеток памяти (Tem), центральных Т-клеток памяти (Tcm), γδT-клеток или регуляторных Т-клеток (Treg), покоящихся NK-клеток, экспандированных NK-клеток) по меньшей мере одной иммунной клетки или популяции клеток на основе сигнатуры цитокинов, ассоциированной с этим типом клеток.

Описание графических материалов

[0024] На Фиг. 1 представлен график, изображающий корреляцию между высвобождением цитокинов NK-клетками, индуцированным опухолевыми клетками K562, и высвобождением цитокинов NK-клетками, индуцированными PHA (в пг/миллион клеток/ч).

[0025] На Фиг. 2 представлен график, изображающий анализ результатов на основе времени инкубации.

[0026] На Фиг. 3 представлен график, изображающий анализ результатов на основе количества клеток.

[0027] На Фиг. 4 представлен график, изображающий результаты анализа PHA NK-клеток, экспандированных с использованием mb-IL-21 и TGF-β.

[0028] На Фиг. 5 представлен график, изображающий корреляцию между высвобождением цитокинов свежевыделенными NK-клетками (индуцированным РНА) и высвобождением цитокинов экспандированными NK-клетками, индуцированным РНА (в пг/миллион клеток/ч).

[0029] На Фиг. 6 представлен график, изображающий экспрессию цитокинов NK-клеток после стимуляции PHA в течение 1 часа в экспандированных (N = 18) и свежевыделенных (N = 10) NK-клетках.

[0030] На Фиг. 7 изображено сравнение концентрации экспрессируемых цитокинов между свежевыделенными и экспандированными NK-клетками после стимуляции PHA.

[0031] На Фиг. 8 представлен график, изображающий специфичность и чувствительность дифференцировки экспандированных NK-клеток на основе экспрессии IFN-γ и IL-2.

[0032] На Фиг. 9 изображено, что свежевыделенные NK-клетки и экспандированные NK-клетки можно дифференцировать на основе активации IL-2 и подавления пентраксина-3 или ингибирования хитиназа 3-подобного белка 1.

[0033] На Фиг. 10 изображено, что свежевыделенные NK-клетки и экспандированные NK-клетки можно дифференцировать на основе активации IFN-γ и подавления пентраксина-3 или ингибирования хитиназа 3-подобного белка 1.

Подробное описание сути изобретения

[0034] В настоящем изобретении представлен способ определения активности иммунной клетки, который включает приведение иммунной клетки в контакт с эффективным количеством стимулирующего средства и определение содержания цитокина, продуцируемого иммунной клеткой. Хотя настоящее изобретение представлно в контексте иммунотерапии рака, концепции и инновации, раскрытые в данном документе, могут быть применены к иммунотерапии других заболеваний и нарушений. Например, иммунная клетка, применяемая в иммунотерапии против аутоиммунного заболевания, воспалительных заболеваний или нарушений, вирусных заболеваний и/или бактериальных инфекций, также может быть протестирована в отношении активностей с использованием анализов, раскрытых в данном документе.

Определения

[0035] Для пояснения в понимании и удобства применения в данном документе был составлен список терминов, используемых в разделе краткого описания сути изобретения и остальной части настоящей заявки. Некоторые из терминов хорошо известны из уровня техники и определены в данном документе для ясности, в то время как некоторые из терминов являются уникальными для этой заявки и поэтому должны быть определены для правильного понимания настоящей заявки.

[0036] Как используется в описании и формуле настоящего изобретения, формы единственного числа включают ссылки на формы множественного числа, если контекст явно не диктует иное. Например, термин «клетка» включает множество клеток, включая их смеси. Если в данном документе используется форма множественного числа, она обычно включает единственное число.

[0037] В данном документе диапазоны могут быть выражены как от «приблизительно» одного конкретного значения и/или до «приблизительно» другого конкретного значения. Если выражается такой диапазон, то другой вариант осуществления включает в себя от одного конкретного значения и/или до другого конкретного значения. Аналогично, когда значения выражаются как приближения с использованием предшествующего «приблизительно», следует понимать, что конкретное значение образует другой вариант осуществления. Далее следует понимать, что конечные точки каждого из диапазонов значимы как по отношению к другой конечной точке, так и независимо от другой конечной точки. Перечисление числовых диапазонов с помощью конечных точек включает в себя все числа и доли, включенные в этот диапазон (например, от 1 до 5 включает 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,80, 4, 5 и т.д.). Также следует понимать, что существует ряд значений, раскрытых в данном документе, и что каждое значение также раскрывается в данном документе как «приблизительно» это конкретное значение в дополнение к самому значению. Например, если раскрывается значение «10», то также раскрывается «приблизительно 10». Также следует понимать, что когда раскрывается значение, то также раскрывается понятие «менее значения или равно значению», «более значения или равно значению» и возможные диапазоны между значениями, как надлежащим образом понимает специалист в данной области техники. Например, если раскрывается значение «10», также раскрывается «менее или равно 10», а также «более или равно 10». Также следует понимать, что во всей заявке данные предоставляются в нескольких различных форматах и что эти данные представляют конечные и начальные точки, а также диапазоны для любой комбинации точек данных. Например, если раскрыты конкретная точка данных 10 и конкретная точка данных 15, то подразумевается, что раскрывается значение более, более или равно, менее, менее или равно и равно 10 и 15, а также между 10 и 15. Также понятно, что также раскрывается каждая единица между двумя конкретными единицами. Например, если раскрыты 10 и 15, то также раскрываются 11, 12, 13 и 14.

[0038] Используемый в данном документе термин «содержащий» предполагает обозначение того, что композиции и способы включают в себя упомянутые элементы, но не исключают другие. Термин «состоящий практически из», при использовании для определения композиций и способов, будет означать исключение других элементов, имеющих какое-либо существенное значение для комбинации. Таким образом, композиция, состоящая по практически из элементов, как определено в данном документе, не исключает следовых примесей из способа выделения и очистки и фармацевтически приемлемых носителей, таких как забуференный фосфатом физиологический раствор, консерванты и т.п. Термин «состоящий из» означает исключение более чем следовых элементов других ингредиентов и существенных стадий способа введения композиций по настоящему изобретению. Варианты осуществления, определяемые каждым из этих переходных терминов, входят в объем настоящего изобретения.

[0039] «Повышение» может относиться к любому изменению, которое приводит к большему количеству симптома, заболевания, состава, состояния или активности. Повышение может быть любым индивидуальным, медианным или средним повышением состояния, симптома, активности, состава в статистически значимой величине. Таким образом, повышение может составлять 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70. , 75, 80, 85, 90, 95 или 100% повышения, пока это повышение является статистически значимым.

[0040] «Снижение» может относиться к любому изменению, которое приводит к меньшему количеству симптома, заболевания, состава, состояния или активности. Также считается, что вещество снижает генетический выход гена, когда генетический выход продукта гена с веществом меньше по сравнению с выходом продукта гена без вещества. Также, например, уменьшение может представлять собой изменение симптомов нарушения, так что симптомы становятся меньше, чем наблюдались ранее. Уменьшение может быть любым индивидуальным, медианным или средним уменьшением состояния, симптома, активности, состава в статистически значимой величине. Таким образом, уменьшение может составлять 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70. , 75, 80, 85, 90, 95 или 100% уменьшения, пока это уменьшение является статистически значимым.

[0041] «Ингибировать», «осуществление ингибирования» и «ингибирование» означают снижение активности, ответа, состояния, заболевания или другого биологического параметра. Оно может включать, но не ограничиваясь ими, полное устранение активности, реакции, состояния или заболевания. Оно также может включать, например, снижение активности, реакции, состояния или заболевания на 10% по сравнению с нативным или контрольным уровнем. Таким образом, снижение может составлять 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% или любое промежуточное снижение по сравнению с нативным или контрольным уровнями.

[0042] Под «ослаблять» или другими формами слова, такими как «осуществления ослабления» или «ослабление», подразумевается уменьшение явления или характеристики (например, опухолевого роста). Следует понимать, что это обычно относится к некоторому стандартному или ожидаемому значению, другими словами, это относительное значение, но не всегда необходимо ссылаться на стандартное или относительное значение. Например, термин «ослабляет опухолевый рост» означает снижение скорости роста опухоли по сравнению со стандартом или контролем.

[0043] Под термином «предупреждать» или другими формами слова, такими как «осуществление предупреждения» или «предупреждение», подразумевается остановка конкретного явления или характеристики, стабилизация или задержка развития или прогрессирования определенного явления или характеристики или сведение к минимуму вероятности того, что произойдет определенное явление или характеристика. Термин «предупреждать» не требует сравнения с контролем, поскольку он обычно более абсолютен, чем, например, «ослаблять». Как используется в данном документе, что-то могло быть ослаблено, но не предупреждено, но что-то, что ослаблено, также могло быть предупреждено. Аналогично что-то могло быть предупреждено, но не ослаблено, но что-то, что предупреждено, также могло быть ослаблено. Следует понимать, что там, где используется ослабление или предупреждение, если специально не указано иное, использование другого слова также явно раскрывается.

[0044] Термин «терапевтически эффективный» предназначен для определения количества или содержания активного средства (такого как иммунотерапевтические клетки), которое будет достигать цели уменьшения тяжести заболевания при одновременном предупреждении неблагоприятных побочных эффектов, таких как те, которые обычно ассоциированы с альтернативными видами терапии. Терапевтически эффективное количество можно вводить в виде одной или нескольких доз. Виды лечения, которые является терапевтически эффективным, включает лечение, которое улучшает качество жизни субъекта, даже если оно не улучшает исход заболевания как таковой.

[0045] «Эффективное количество» обычно означает количество, которое обеспечивает необходимый местный или системный эффект, например, эффективное для стимуляции образования цитокинов, включая достижение конкретных необходимых эффектов, описанных в настоящей заявке. Например, эффективное количество представляет собой количество, достаточное для достижения полезного или необходимого клинического результата.

[0046] Термин «субъект» относится к любому индивидууму, который является целью введения или лечения. Субъект может представлять собой позвоночное, например, млекопитающее. В одном аспекте субъект может представлять собой человека, отличного от человека примата, корову, лошадь, свинью, собаку или кошку. Субъект также может представлять собой морскую свинку, крысу, хомяка, кролика, мышь или крота. Таким образом, субъект может представлять собой пациента-человека или пациента ветеринарного назначения. Термин «пациент» относится к субъекту, находящемуся на лечении у клинициста, например врача.

[0047] Термин «терапевтически приемлемый носитель» означает носитель или наполнитель, который применим при приготовлении композиции, которая обычно является безопасной и нетоксичной, и включает носитель, приемлемый для применения в ветеринарии и/или у человека. В способах внутривенной доставки будет применяться терапевтически приемлемый носитель, который физиологически сбалансирован (например, при осмотическом уровне и уровне pH, безопасном для внутривенного применения). Используемый в данном документе термин «терапевтически приемлемый носитель» охватывает любой из стандартных носителей, такой как физиологический раствор, раствор Рингера, фосфатно-солевой буферный раствор, вода, декстроза в воде и эмульсии, такие как эмульсия масло/вода или вода/масло, и различные типы смачивающих средств. Используемый в данном документе термин «носитель» охватывает любой наполнитель, разбавитель, филлер, соль, буфер, стабилизатор, солюбилизатор, липид или другое вещество, хорошо известное из уровня техники для применения в терапевтических составах. Терапевтически приемлемый носитель также может включать консерванты (включая криоконсерванты), такие как те, которые сохраняют жизнеспособность и/или эффективность иммунной клетки. Термин «терапевтически приемлемый носитель», используемый в описании и формуле изобретения, включает как один, так и более одного такого носителя.

[0048] Термин «лечение» относится к медицинскому ведению пациента с намерением вылечить, облегчить, стабилизировать или предупредить заболевание, патологическое состояние или нарушение. Указанный термин включает в себя активное лечение, т.е. лечение, направленное, в частности, на нормализацию заболевания, патологического состояния или нарушения, а также включает в себя причинное лечение, т.е. лечение, направленное на устранение причины ассоциированного заболевания, патологического состояния или нарушения. Кроме того, указанный термин включает в себя паллиативное лечение, т.е. лечение, предназначенное для облегчения симптомов, а не лечения заболевания, патологического состояния или нарушения; профилактическое лечение, т.е. лечение, направленное на сведение к минимуму или частичное или полное подавление развития ассоциированного заболевания, патологического состояния или нарушения; и поддерживающее лечение, т.е. лечение, применяемое для дополнения другой специфической терапии, направленной на нормализацию ассоциированного заболевания, патологического состояния или нарушения.

[0049] «Введение» субъекту включает любой путь введения или доставки субъекту агента. Введение может осуществляться любым подходящим путем, включая пероральный, местный, внутривенный, подкожный, чрескожный, трансдермальный, внутримышечный, внутрисуставной, парентеральный, внутриартериольный, внутрикожный, внутрижелудочковый, внутричерепной, внутрибрюшинный, внутриочаговый, интраназальный, ректальный, вагинальный, путем ингаляции, через имплантированный резервуар, парентеральный (например, с помощью подкожных, внутривенных, внутримышечных, внутрисуставных, внутрисиновиальных, внутригрудинных, интратекальных, внутрибрюшинных, внутрипеченочных, внутриочаговых и внутричерепных инъекций или инфузионных методик) и т.п. Термины «одновременное введение», «введение в комбинации», «одновременное введение» или «вводимые одновременно», используемые в данном документе, означают, что соединения вводят в один и тот же момент времени или по сути сразу друг за другом. В последнем случае два соединения вводят в достаточно близкие друг к другу моменты времени таким образом, что наблюдаемые результаты неотличимы от результатов, достигаемых при введении соединений в один и тот же момент времени. «Системное введение» относится к введению или доставке субъекту агента посредством пути, с помощью которого агент вводится или доставляется в обширные области тела субъекта (например, более чем 50% тела), например, через вход в кровеносную или лимфатические системы. В отличие от этого, «местное введение» относится к введению или доставке субъекту средства таким путем, с помощью которого средство вводится или доставляется в область или область, непосредственно прилегающую к месту введения, и средство не вводится системно в терапевтически значимом количестве. Например, средства, вводимые местно, легко обнаруживаются в непосредственной близости от места введения, но не обнаруживаются или обнаруживаются в незначительных количествах в дистальных частях тела субъекта. Введение включает в себя самовведение и введение другим лицом.

[0050] Термины «лечить», «осуществление лечения», «лечение» и их грамматические вариации, используемые в данном документе, включают введение композиции с намерением или целью частичного или полного предупреждения, задержки, лечения, излечения, нормализации, ослабления, изменения, исцеления, облегчения, улучшения, стабилизации, смягчения и/или снижение интенсивности или частоты одного или нескольких заболеваний или состояний, симптома заболевания или состояния или основной причины заболевания или состояния. Лечебные процедуры по настоящему изобретению можно применять с превентивной целью, профилактической целью, паллиативной целью или лечебной целью. Профилактические виды лечения назначают субъекту до начала (например, до появления явных признаков рака), во время раннего начала (например, при начальных признаках и симптомах рака) или после подтвержденного развития рака. Профилактическое введение может происходить за день (дни) или за годы до проявления симптомов заболевания или инфекции.

[0051] В раскрытых в данном документе способах и наборах применяется стимулирующее средство. Используемое в данном документе стимулирующее средство может представлять собой любую молекулу, пептид, полипептид, белок, лектин и/или митоген, которые могут действовать в качестве антигена и/или иммуногена для стимуляции секреции цитокинов иммунной клеткой. Стимулирующие средства включают, но не ограничиваясь ими, фитогемагглютинин (PHA), форболмиристат ацетат (PMA)/иономицин, конканавалин A (Con A), липополисахарид (LPS) и/или митоген лаконоса (PWM), агглютинин арахиса (PNA), агглютинин зародышей пшеницы и рицин.

[0052] Во всей настоящей заявке даются ссылки на различные публикации. Раскрытия этих публикаций в их полном объеме включены в настоящую заявку посредством ссылки, чтобы более полно описать уровень техники, к которому настоящая заявка относится. Раскрытые ссылки также отдельно и конкретно включены в данный документ в качестве ссылки для содержащегося в них материала, который обсуждается в предложении, в котором сделана ссылка.

Анализ иммунной активности

[0053] В одном аспекте в настоящем изобретении представлен способ определения активности иммунной клетки. Способ включает стадии приведения иммунной клетки в контакт с эффективным количеством стимулирующего средства (такого как, например, PHA, PMA/иономицин, Con A, LPS и/или PWM) и определения количества цитокина, продуцируемого иммунной клеткой. Например, иммунная клетка может быть приведена в контакт со стимулирующим средством (таким как, например, PHA, PMA/иономицин, Con A, LPS и/или PWM) путем суспендирования стимулирующего средства в клеточной среде и воздействия на иммунные клетки клеточной среды.

[0054] В некоторых вариантах осуществления способ включает стадию сравнения количества продуцируемого цитокина с уровнем активности цитокина, необходимым для применения иммунной клетки в иммунотерапии. Анализ активности служит для характеристики продукта (например, иммунных клеток), для мониторинга консистенции от партии к партии и для обеспечения стабильности продукта, и поэтому должен быть достаточно чувствительным, чтобы обнаруживать различия, которые могут повлиять на механизм действия и функции продукта и, следовательно, имеют потенциальное клиническое значение. Анализ также можно применять в качестве прогнозирующего биомаркера или фармакодинамического анализа для клеточно-опосредованной иммунотерапии. Предпочтительно, чтобы анализ активности имел максимально возможную связь с предполагаемой физиологической/фармакологической активностью продукта. Анализ активности, описанный в данном документе, обеспечивает возможность измерения значения активности в пределах технических характеристик продукта; высокую чувствительность для обнаружения различий, потенциально имеющих клиническое значение; тесную связь с механизмом действия и предполагаемой физиологической/фармакологической активностью продукта. Предпочтительно, анализ активности также удовлетворяет следующим вторичным критериям: достаточно низкие вариации внутри и между анализами (для получения точности, необходимой для поддержания технических характеристик продукта); достаточная надежность; и поддается высокопроизводительному анализу. В некоторых вариантах осуществления анализ используется в качестве клинического анализа для количественной оценки функции Т-клеток, макрофагов, NK-клеток, NK-T-клеток, CAR-T-клеток и/или CAR-NK-клеток (диагностика иммунодефицита NK-клеток, биомаркер для мониторинга иммунодепрессантов или эффективность иммуноактиватора).

[0055] Как отмечалось выше, раскрытые способы обеспечивают определение активности иммунной клетки. Иммунные клетки, определенные в данном документе, представляют собой любые клетки иммунной системы, которые продуцируют цитокины (т.е. иммунные клетки, продуцирующие цитокины). Примеры иммунных клеток, продуцирующих цитокины, включают лимфоциты, нейтрофилы, макрофаги и естественные клетки-киллеры. Лимфоциты включают как В-клетки, так и Т-клетки (включая CD4 и CD8 Т-клетки). В одном аспекте иммунная клетка может включать лимфоцит, инфильтрирующий опухоль (TIL), Т-клетку, макрофаг, естественную клетку-киллер (NK), NK-T-клетку, Т-клетку с химерным антигенным рецептором (CAR) и/или CAR-NK. Иммунные клетки могут быть получены из клеточной культуры или могут быть получены от субъекта (такого как, например, аллогенный донор или аутологичный донор).

[0056] В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка представляет собой Т-клетку. Т-клетки играют центральную роль в клеточном иммунитете, и их можно отличить от других лимфоцитов, таких как В-клетки и естественные клетки-киллеры, по наличию Т-клеточного рецептора на поверхности клетки. Примеры Т-клеток включают Т-хелперы (ТН-клетки), цитотоксические Т-клетки (Т-клетки), Т-клетки памяти, регуляторные или «супрессорные» Т-клетки и естественные Т-клетки-киллеры (NKT-клетки), которые отличаются от NK-клеток и распознают гликолипидный антиген, а не пептиды, представленные молекулой MHC. Различные типы Т-клеток отличаются друг от друга характером продуцирования цитокинов). Т-клетки могут представлять собой CD4 или CD8 Т-клетки. Кроме того, Т-клетки могут содержать Т-клетки с химерным антигенным рецептором (CAR) или лимфоциты, инфильтрирующие опухоль (TIL).

[0057] В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка представляет собой NK-клетку. Естественные клетки-киллеры представляют собой тип цитотоксических лимфоцитов иммунной системы. NK-клетки обеспечивают быстрый ответ на инфицированные вирусом клетки и реагируют на трансформированные клетки. Обычно иммунные клетки обнаруживают пептиды от патогенов, презентируемых молекулами главного комплекса гистосовместимости (MHC) на поверхности инфицированных клеток, запуская высвобождение цитокинов, вызывая лизис или апоптоз. Однако NK-клетки уникальны, поскольку они обладают способностью распознавать клетки, подвергшиеся стрессу, независимо от того, присутствуют ли пептиды от патогенов на молекулах MHC. Их назвали «естественными убийцами» в связи с первоначальными представления о том, что им не требуется предварительная активация, чтобы уничтожить мишень. NK-клетки представляют собой большие гранулярные лимфоциты (LGL), которые, как известно, дифференцируются и созревают в костном мозге, откуда они затем попадают в кровоток. В некоторых аспектах NK-клетка может представлять собой CAR-NK-клетку.

[0058] Таким образом, в одном аспекте в настоящем документе раскрыты способы анализа активности иммунной клетки (такой как, например, Т-клетка, макрофаг, NK-клетка, NK-T-клетка, CAR-T-клетка и/или CAR-NK клетка), включающие приведение иммунной клетки в контакт с эффективным количеством стимулирующего средства (такого как, например, PHA, PMA/иономицин, Con A, LPS и/или PWM) и определение количества одного или нескольких цитокинов, продуцируемых иммунной клеткой. В одном аспекте способ может дополнительно включать сравнение содержания продуцируемого цитокина с уровнем активности цитокина, необходимым для применения иммунной клетки в иммунотерапии.

[0059] Анализ включает стадию определения содержания цитокина, продуцируемого иммунной клеткой после стимуляции иммунных клеток стимулирующим средством. Используемый в данном документе термин «цитокин» относится к небольшому белку (~ 5-20 кДа), который важен для передачи сигналов клетки и, в частности, иммуномодуляции, который может продуцироваться иммунной клеткой. Примеры цитокинов включают хемокины, интерфероны, интерлейкины, лимфокины и факторы некроза опухоли. Обнаруженные цитокины могут включать цитокины, которые, как известно, вырабатываются оцениваемыми иммунными клетками, или обнаружение может охватывать более широкий спектр цитокинов, включая цитокины, которые, как известно, не продуцируются иммунными клетками.

[0060] В некоторых вариантах осуществления обнаруживаемые цитокины включают цитокины, которые, как известно, продуцируются Т-клетками или естественными клетками-киллерами. В некоторых вариантах осуществления цитокины включают цитокины, которые, как известно, продуцируются Т-клетками. T-клетки включают Th1- и Th2-клетки; Th1-клетки главным образом продуцируют интерферон (IFN)-γ (IFN-γ), фактор некроза опухоли (TNF)-α (TNF-α) и IL-2; Th2-клетки продуцируют интерлейкин (IL)-2 (IL-2), IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-13 и IL-22. Примеры цитокинов, продуцируемых стимулированными естественными клетками-киллерами, включают IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-5, IL-8, IL-10, IL-13, IFN-γ, TNF-α, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), фактор ингибирования лейкоза (LIF) и хемокиновый макрофагальный воспалительный белок (MIP)-1α (MIP-1α), MIP-1β и RANTES. Другие цитокины, применимые для определения активности иммунных клеток, включают, но не ограничиваясь ими, фактор активации B-клеток/ член 13B суперсемейства лигандов фактора некроза опухоли (TNF) (BAFF/TNFSF13B), кластер дифференцировки (CD) 163 (CD163), CD30/TNFRSF8, хитиназа 3-подобный белок 1, gp130, IFN-α2, IL-6Rα, IL-11, IL-12(p40), IL-12(p70), IL-20, IL-26, IL-29/IFN-l1, IL-32, IL-34, IL-35, матриксную металлопротеиназу-1 (MMP-1), остеокальцин, остеопонтин (OPN), пентраксин-3, рецептор 1 фактора некроза опухоли (TNF) (TNF-R1), TNF-R2, тимический стромальный лимфопоэтин (TSLP) или связанный с TNF слабый индуктор апоптоза (TWEAK)/член 12 суперсемейства TNF (TWEAK/TNFSF12). Таким образом, в одном аспекте в данном документе раскрыты способы анализа активности иммунной клетки (такой как, например, Т-клетка, макрофаг, NK-клетка, NK-T-клетка, CAR-T-клетка и/или CAR-NK-клетка), включающие приведение иммунной клетки в контакт с эффективным количеством стимулирующего средства (такого как, например, фитогемагглютинин (PHA), форболмиристат ацетат (PMA)/иономицин, конканавалин A (Con A), липополисахарид (LPS) и/или митоген лаконоса (PWM)) и определение содержания одного или нескольких цитокинов (таких как, например, IL-2, IL-6, IFN-γ, TNF-α, BAFF/TNFSF13B, CD163, CD30/TNFRSF8, хитиназа 3-подобный белок 1, gp130, IFN-α2, IL-6Rα, IL-8, IL-10, IL-11, IL-12(p40), IL-12(p70), IL-20, IL-22, IL-26, IL-29/IFN-l1, IL-32, IL-34, IL-35, MMP-1, остеокальцин, OPN, пентраксин-3, TNF-R1, TNF-R2, TSLP, GM-CSF, LIF, MIP-1α, MIP-1β, RANTES и/или TWEAK/TNFSF12), продуцируемых иммунной клеткой. В данном документе раскрыты способы анализа активности иммунной клетки (такой как, например, Т-клетка, макрофаг, NK-клетка, NK-T-клетка, CAR-T-клетка и/или CAR-NK-клетка), включающие приведение иммунной клетки в контакт с эффективным количеством стимулирующего средства (такого как, например, PHA, PMA/иономицин, Con A, LPS и/или PWM) и определение содержания одного или нескольких цитокинов (таких как, например, IL-2, IL-6, IFN-γ, TNF-α, BAFF/TNFSF13B, CD163, CD30/TNFRSF8, хитиназа 3-подобный белок 1, gp130, IFN-α2, IL-6Rα, IL-8, IL-10, IL-11, IL-12(p40), IL-12(p70), IL-20, IL-22, IL-26, IL-29/IFN-l1, IL-32, IL-34, IL-35, MMP-1, остеокальцин, OPN, пентраксин-3, TNF-R1, TNF-R2, TSLP, GM-CSF, MIP-1α, MIP-1β, RANTES и/или TWEAK/TNFSF12), продуцируемых иммунной клеткой. В одном аспекте способ может дополнительно включать сравнение содержания продуцируемого цитокина с уровнем активности цитокина, необходимым для применения иммунной клетки в иммунотерапии. В некоторых вариантах осуществления определяют уровни ряда цитокинов. В дополнительных вариантах осуществления цитокин выбран из группы, состоящей из интерлейкина-2, интерлейкина-6 и интерферона-γ.

[0061] Анализ включает в себя стадию определения содержания цитокина, продуцируемого иммунной клеткой. Специалистам в данной области техники известно множество способов обнаружения цитокинов, которые могут варьироваться в зависимости от обнаруживаемого цитокина. В некоторых вариантах осуществления способ или способы можно применять для обнаружения и/или количественной оценки присутствия ряда различных цитокинов. Цитокины могут быть обнаружены, например, с помощью специальных наборов реагентов или иммуноанализов. Цитокины можно обнаружить с помощью наборов, доступных от коммерческих поставщиков, таких как Miltenyi Biotec™, Luminex и Thermo Fisher Scientific™. Примерами наборов, подходящих для обнаружения цитокинов, являются набор для быстрой проверки цитокинов (CD4/CD8) или набор для определения цитокинов T/NK MACSPlex, который может обнаруживать цитокины, образованные либо Т-клетками, либо NK-клетками, оба из которых продаются Miltenyi Biotec™.

[0062] В некоторых вариантах осуществления содержание цитокинов определяется с помощью иммуноанализа. Иммуноанализы бывают разных форматов и вариаций. Иммуноанализы можно проводить в несколько стадий, при этом реагенты добавляются и вымывают или разделяются в разных точках анализа. Иммуноанализы включают гетерогенные иммуноанализы, которые включают несколько стадий, и гомогенные иммуноанализы, которые включают простое смешивание реагентов и образца и выполнение физических измерений. В иммуноанализах часто используется калибратор, представляющий собой раствор, который, как известно, содержит рассматриваемый аналит, и концентрация этого аналита, как правило, известна. Сравнение реакции анализа реального образца с ответом анализа, произведенным калибраторами, позволяет интерпретировать силу сигнала с точки зрения присутствия или концентрации аналита в образце. Типы иммуноанализов включают конкурентные, гомогенные иммуноанализы, конкурентные гетерогенные иммуноанализы, односайтовые неконкурентные иммуноанализы и двухсайтовые неконкурентные иммуноанализы. Иммуноанализы также включают иммуноферментные анализы (ELISA), иммунохроматографические анализы, иммуноферментные анализы пятен (ELIspot), проточную цитометрию, внутриклеточное окрашивание цитокинов, анализы массивов антител и анализы на основе гранул, магнитные иммуноанализы, радиоиммуноанализы и количественные анализы (включая, но не ограничиваясь, qRT-PCR). В одном аспекте анализ включает Luminex xMAP®.

[0063] Способ определения активности иммунной клетки включает стадию приведения иммунной клетки в контакт с эффективным количеством стимулирующего средства (такого как, например, PHA, PMA/иономицин, Con A, LPS и/или PWM).

[0064] Следует понимать и в данном документе предполагается, что иммунные клетки должны подвергаться действию стимулирующего средства в течение периода времени, чтобы вызвать продуцирование цитокинов. В одном аспекте в данном документе раскрыты способы анализа эффективности иммунной клетки, в которых иммунная клетка приведена в контакт с эффективным количеством стимулирующего средства (такого как, например, PHA, PMA/иономицин, Con A, LPS и/или PWM) в течение по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 150 минут, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 30, 32, 36, 42, 48, 60 часов, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 45, 60, 61, 62 дня, 3, 4, 5 или 6 месяцев.

[0065] В данном документе также раскрыты способы анализа активности иммунной клетки по любому из предыдущих аспектов, в которых стимулирующее средство (такое как, например, PHA, PMA/иономицин, Con A, LPS и/или PWM) представлено в концентрации от 5 мкг/мл до 1000 мкг/мл. В одном аспекте концентрация стимулирующего средства составляет 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 125, 130, 140, 150, 160, 170, 175, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 или 1000 мкг/мл. В одном аспекте концентрация стимулирующего средства составляет от приблизительно 1 мкг/мл до 100 мкг/мл, от 1 мкг/мл до 50 мкг/мл, от 1 мкг/мл до 15 мкг/мл или от 5 мкг/мл до 15 мкг/мл.

[0066] В одном аспекте следует понимать и подразумевается, что те же цитокины, продуцируемые для определения активности иммунной клетки, также можно применять для идентификации клеток, продуцирующих цитокины. Иммунные клетки имеют различные профили экспрессии, хорошо известные из уровня техники. В данном документе также раскрыты способы определения идентичности по меньшей мере одной иммунной клетки или полуляции клеток (например, дифференциации Th1, Th2, Th3, Th9, Th17, эффекторных Т-клеток памяти (Tem), центральных Т-клеток памяти (Tcm), γδT-клеток или регуляторных Т-клеток (Treg), покоящихся NK-клеток, экспандированных NK-клеток) на основе сигнатуры цитокинов, ассоциированной с этим типом клеток. Соответственно, в данном документе раскрыты способы идентификации иммунной клетки (такой как, например, Т-клетка, макрофаг, NK-клетка, NK-T-клетка, CAR-T-клетка и/или CAR-NK-клетка), включающие приведение иммунной клетки в контакт с эффективным количеством стимулирующего средства (такого как, например, PHA, PMA/иономицин, Con A, LPS и/или PWM) и определение содержания одного или нескольких цитокинов (таких как, например, IL-2, IL-6, IFN-γ, TNF-α, BAFF/TNFSF13B, CD163, CD30/TNFRSF8, хитиназа 3-подобный белок 1, gp130, IFN-α2, IL-6Rα, IL-8, IL-10, IL-11, IL-12(p40), IL-12(p70), IL-20, IL-22, IL-26, IL-29/IFN-l1, IL-32, IL-34, IL-35, MMP-1, остеокальцин, OPN, пентраксин-3, TNF-R1, TNF-R2, TSLP, GM-CSF, MIP-1, MIP-1, RANTES и/или TWEAK/TNFSF12), продуцируемых иммунной клеткой; при этом идентичность иммунной клетки выявляется на основе профиля экспрессируемых цитокинов.

Наборы для оценки активности иммунных клеток

[0067] В другом аспекте настоящего изобретения представлен набор для определения активности иммунной клетки (такой как, например, Т-клетка, макрофаг, NK-клетка, NK-T-клетка, CAR T-клетка и/или CAR NK-клетка), содержащие контейнер, содержащий эффективное количество стимулирующего средства (такого как, например, PHA, PMA/иономицин, Con A, LPS и/или PWM) и буфер, подходящий для иммунных клеток. В некоторых вариантах осуществления стимулирующее средство в наборе представлено в концентрации от 5 мкг/мл до 1000 мкг/мл. В одном аспекте концентрация стимулирующего средства составляет 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 125, 130, 140, 150, 160, 170, 175, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 или 1000 мкг/мл. В одном аспекте концентрация стимулирующего средства составляет от приблизительно 1 мкг/мл до 100 мкг/мл, от 1 мкг/мл до 50 мкг/мл, от 1 мкг/мл до 15 мкг/мл или от 5 мкг/мл до 15 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления контейнер представляет собой микроцентрифужную пробирку (такую как, например, микроцентрифужная пробирка Эппендорфа). Наборы также могут включать инструмент для получения образца от субъекта, такого как шприц для получения образца, содержащего одну или несколько иммунных клеток. Подходящим буфером является RPMI.

[0068] Наборы могут также содержать компоненты, необходимые для проведения иммуноанализа, такие как твердая фаза, с которой связаны антитела, функционирующие как захватывающие антитела и/или детектирующие антитела в формате сэндвич-иммуноанализа. Твердая фаза может представлять собой материал, такой как магнитная частица, гранула, пробирка, микротитровальный планшет, кювета, мембрана, молекула каркаса, кристалл кварца, пленка, фильтровальная бумага, диск или чип. Набор также может содержать детектируемую метку, которая может быть конъюгирована или конъюгирована с антителом, таким как антитело, функционирующее как детекторное антитело. Обнаруживаемая метка может, например, предсталять собой прямую метку, которая может быть ферментом, олигонуклеотидом, хемилюминофором наночастиц, флуорофором, гасителем флуоресценции, гасителем хемилюминесценции или биотином. Наборы для тестирования могут необязательно содержать любые дополнительные реагенты, необходимые для обнаружения метки.

[0069] Набор может дополнительно содержать инструкции по применению набора для стимуляции продуцирования цитокинов иммунной клеткой с целью оценки активности иммунной клетки. В некоторых вариантах осуществления набор дополнительно содержит инструкции по применению количества цитокина для определения активности клетки. Инструкции, включенные в наборы, могут быть прикреплены к упаковочному материалу или могут быть включены в виде инструкции по применению препарата. Несмотря на то, что инструкции в типичном случае представляют собой письменные или печатные материалы, они не ограничены таковыми. Настоящим изобретением предусмотрен любой носитель, способный хранить такие инструкции и передавать их конечному пользователю. К таким носителям относятся, но не ограничиваясь ими, электронные носители (например, магнитные диски, пленки, картриджи, чипы), оптические носители (например, CD-ROM) и т.п. Используемый в данном документе термин «инструкции» может включать адрес интернет-сайта, который предлагает инструкции.

Способы иммунотерапии

[0070] Способ определения активности иммунной клетки может быть выполнен до применения иммунной клетки в качестве иммунотерапевтического средства. Например, способ определения активности одной или нескольких иммунных клеток может быть выполнен, как описано выше, после чего может быть выбрана по меньшей мере одна активная иммунная клетка (на основе количества обнаруженного цитокина) и терапевтически эффективное количество активной иммунной клетки может быть доставлено субъекту в качестве иммунотерапевтического средства. Таким образом, в одном аспекте в данном документе раскрыты способы иммунотерапии, включающие а) осуществления способа анализа активности иммунной клетки (такой как, например, Т-клетка, макрофаг, NK-клетка, NK-T-клетка, CAR-T-клетка, и/или CAR NK-клетка), раскрытой в данном документе, на ряде иммунных клеток для определения эффективности каждой иммунной клетки; b) выбор по меньшей мере одной активной иммунной клетки на основе содержания обнаруженного цитокина (такого как, например, IL-2, IL-6, IFN-γ, TNF-α, BAFF/TNFSF13B, CD163, CD30/TNFRSF8, хитиназа 3-подобный белок 1, gp130, IFN-α2, IL-6Rα, IL-8, IL-10, IL-11, IL-12(p40), IL-12(p70), IL-20, IL-22, IL-26, IL-29/IFN-l1, IL-32, IL-34, IL-35, MMP-1, остеокальцин, OPN, пентраксин-3, TNF-R1, TNF-R2, TSLP, GM-CSF, MIP-1, MIP-1, RANTES и/или TWEAK/TNFSF12); и c) введение терапевтически эффективного количества активной иммунной клетки субъекту, нуждающемуся в этом, в качестве иммунотерапевтического средства. В одном аспекте способ может дополнительно включать извлечение ряда иммунных клеток из аллогенного или аутологичного донора до анализа активности иммунной клетки.

[0071] В некоторых вариантах осуществления иммунные клетки представляют собой иммунотерапевтические иммунные клетки. Иммунотерапевтические иммунные клетки представляют собой клетки, которые применимы для лечения таких заболеваний, как рак. Becker et al., Cancer Immunol. Immunother 65, 477-484 (2016). Было описано применение экспандированных NK-клеток для лечения рака. Rezvani et al., Front Immunol., 6, 578 (2015). Поскольку во время иммунотерапии полезно иметь возможность вводить большое количество иммунных клеток, в некоторых вариантах осуществления иммунные клетки представляют собой экспандированные иммунные клетки. Экспандированные иммунные клетки представляют собой клетки, которые выращивают ex vivo для выращивания большого количества иммунных клеток. В некоторых вариантах осуществления экспандированные иммунные клетки представляют собой аутологичные клетки, которые можно легко вводить субъекту, не вызывая иммунного ответа. Однако в некоторых вариантах осуществления экспандированные иммунные клетки представляют собой аллогенные иммунные клетки, в которых присущая им аллореактивность может оказывать благоприятное воздействие. В дополнительных вариантах осуществления экспандированные иммунные клетки генетически сконструированы с включением химерных антигенных рецепторов для облегчения целенаправленного воздействия иммунных клеток на пораженную ткань. Получение экспандированных иммунных клеток включает активацию и экспансию иммунных клеток. Koepsell et al., Transfusion, 53(2):404-10 (2013). Было показано, что ряд цитокинов (IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IFN типа I и TGF-β) применимы для активации и экспансии иммунных клеток ex vivo. Например, в некоторых вариантах осуществления оцениваемые NK-клетки представляют собой NK-клетки, экспандированные по IL-21. Соответственно, в одном аспекте в данном документе раскрыты способы иммунотерапии, дополнительно включающие экспансию по меньшей мере одной активной иммунной клетки перед доставкой терапевтически эффективного количества активной иммунной клетки.

[0072] Экспансия относится к пролиферации ex vivo NK-клеток, так что популяция NK-клеток увеличивается. NK-клетки могут быть экспандированы, например, из мононуклеарных клеток периферической крови. Однако NK-клетки также могут быть экспандированы из других типов клеток, таких как гемопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники. Исходная кровь или стволовые клетки могут быть выделены из ряда различных источников, таких как плацента, пуповинная кровь, плацентарная кровь, периферическая кровь, селезенка или печень. Экспансия происходит в среде для культивирования клеток. Подходящие среды для культивирования клеток известны специалистам в данной области техники. Экспандированные клетки могут быть представлены в виде линии клеток, которая представляет собой ряд клеток, которые можно поддерживать в культуре клеток. Таким образом, в одном аспекте в данном документе раскрыты способы иммунотерапии, дополнительно включающие экспансию по меньшей мере одной активной иммунной клетки перед доставкой терапевтически эффективного количества активной иммунной клетки. В некоторых аспектах иммунная клетка была извлечена из организма субъекта с использованием известных способов перед осуществления способа определения активности иммунной клетки. В качестве альтернативы иммунная клетка может быть получена в результате экспансии клеточной культуры.

[0073] В некоторых аспектах иммунная клетка направлена​на ответ на указанный антиген (например, CD19). Иммунная клетка может быть направлена на ответ до осуществления способа определения ее активности или после осуществления способа определения ее активности. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка генетически изменена для ответа на указанный антиген. Антиген может представлять собой, например, опухолеспецифический антиген. В некоторых аспектах способы иммунотерапии включают генетическое изменение иммунных клеток для презентации химерного антигенного рецептора (либо до, либо после определения активности иммунной клетки). В одном аспекте способ может дополнительно включать модификацию клеточной линии, из которой происходят экзосомы, или модификацию самих экзосом для включения определенного антигена, на который реагируют представляющие интерес иммунные клетки (например, добавление CD19 для специфического определения активности CD19 CAR Т-клеток в гетерогенном образце).

[0074] Как отмечалось по всему описанию, способ определения активности иммунной клетки может применяться как часть лечения на основе адаптивного переноса клеток. Активная иммунная клетка может быть доставлена субъекту с использованием терапевтически приемлемого носителя. Внутривенная доставка обычно используется для доставки иммунотерапевтических клеток, но также могут быть рассмотрены другие способы (например, прямая трансплантация в локализованный участок тела, нуждающийся в иммунотерапии).

[0075] Терапевтически эффективное количество можно определить путем сравнения количества цитокина, продуцируемого иммунной клеткой, с уровнем активности цитокина, необходимым для применения иммунной клетки в иммунотерапии. Следует понимать и в данном документе предполагается, что терапевтически эффективное количество зависит от вводимой иммунной клетки, субъекта, подлежащего лечению, и заболевания, нарушения и/или состояния, подлежащего лечению. Специалистам в данной области техники будет известна подходящая для применения дозировка иммунных клеток, которая будет терапевтически эффективной для субъекта, подлежащего лечению.

[0076] Терапевтически эффективное количество активных иммунных клеток включает ряд активных иммунных клеток. Например, после выбора по меньшей мере одной активной иммунной клетки, выбранную клетку можно экспандировать in vitro для получения ряда активных иммунных клеток.

[0077] Субъект, получающий активные иммунные клетки, может представлять собой любого субъекта, на которого будет оказывать благоприятное воздействие иммунотерапя (например, субъекта с аутоиммунным заболеванием, воспалительными заболеваниями или нарушениями, вирусными заболеваниями и/или бактериальными инфекциями). В некоторых вариантах осуществления субъект может представлять собой пациента с раком. В некоторых вариантах осуществления субъект может представлять собой индивидуума с высоким риском развития рака, у которого диагностирован рак, подлежащего лечению рака или выздоравливающего от рака после хирургического вмешательства. В некоторых вариантах осуществления активные иммунные клетки могут быть доставлены субъекту в качестве профилактического средства для предупреждения, ингибирования или задержки возникновения рака или метастазирования.

Способы лечения заболевания

[0078] Следует понимать и в данном документе предполагается, что активные иммунные клетки, идентифицированные в данном документе, могут быть применены для лечения любого заболевания или нарушения, при котором адаптивная иммунотерапия может применяться для лечения, включая, помимо прочего, аутоиммунного заболевания, воспалительных заболеваний или нарушений, вирусных заболеваний и/или бактериальных инфекций. Таким образом, в одном аспекте в данном документе раскрыты способы лечения, ингибирования, ослабления, предупреждения и/или облегчения рака и/или метастазирования у субъекта, включающие а) получение одной или нескольких иммунных клеток (таких как, например, Т-клетка, макрофаг, NK-клетка, NK-T-клетка, CAR-T-клетка и/или CAR-NK-клетка), полученных от аллогенного или аутологичного донора); b) приведение иммунной клетки в контакт с эффективным количеством стимулирующего средства (такого как, например, PHA, PMA/иономицин, Con A, LPS и/или PWM); c) определение содержания цитокина (такого как, например, IL-2, IL-6, IFN-γ, TNF-α, BAFF/TNFSF13B, CD163, CD30/TNFRSF8, хитиназа 3-подобный белок 1, gp130, IFN-α2, IL-6Rα, IL-8, IL-10, IL-11, IL-12(p40), IL-12(p70), IL-20, IL-22, IL-26, IL-29/IFN-l1, IL-32, IL-34, IL-35, MMP-1, остеокальцин, OPN, пентраксин-3, TNF-R1, TNF-R2, TSLP, GM-CSF, MIP-1, MIP-1, RANTES и/или TWEAK/TNFSF12), продуцируемого иммунной клеткой; d) выбор по меньшей мере одной активной иммунной клетки на основе обнаруженного содержания цитокина; и e) введение субъекту терапевтически эффективного количества активной иммунной клетки. В некоторых аспектах способ может дополнительно включать извлечение иммунной клетки от аутологичного или аллогенного донора.

[0079] Следует понимать и в данном документе предполагается, что во время иммунотерапии полезно иметь возможность вводить большое количество иммунных клеток, в некоторых вариантах осуществления иммунные клетки представляют собой экспандированные иммунные клетки. Экспандированные иммунные клетки представляют собой клетки, которые выращивают ex vivo для выращивания большого количества иммунных клеток. Соответственно, в данном документе раскрыты способы лечения, ингибирования, ослабления, предупреждения и/или облегчения аутоиммунного заболевания, воспалительного заболевания или нарушения, вирусного заболевания, бактериальной инфекции, рака и/или метастазирования, дополнительно включающие экспансию по меньшей мере одной активной иммунной клетки перед доставкой терапевтически эффективного количества по меньшей мере одной активной иммунной клетки.

[0080] Следует понимать и в данном документе предполагается, что раскрытые способы лечения могут применяться для лечения любого заболевания или состояния, при котором происходит неконтролируемая клеточная пролиферация, включая, но не ограничиваясь ими, рак и метастазирование. Иллюстративный, но не ограничивающий перечень видов рака, для лечения которых могут быть применены раскрытые способы применения активных иммунных клеток: лимфома, В-клеточная лимфома, Т-клеточная лимфома, грибовидный микоз, болезнь Ходжкина, миелоидный лейкоз, рак мочевого пузыря, рак головного мозга, рак нервной системы, рак головы и шеи, плоскоклеточный рак головы и шеи, рак легкого, такой как мелкоклеточный рак легкого и немелкоклеточный рак легкого, нейробластома/глиобластома, рак яичников, рак кожи, рак печени, меланома, плоскоклеточный рак ротовой полости, горла, гортани и легкого, рак шейки матки, карцинома шейки матки, рак молочной железы и эпителиальный рак, рак почки, рак мочеполовой системы, рак легкого, рак пищевода, рак головы и шеи, рак толстой кишки, гематопоэитические злокачественные новообразования; рак яичек; рак толстой кишки, рак прямой кишки, рак предстательной железы или рак поджелудочной железы.

[0081] Примеры аутоиммунных заболеваний, которые можно лечить с использованием раскрытых способов, включают, но не ограничиваясь ими, ахалазию, острый диссеминированный энцефаломиелит, острую моторную аксональную невропатию, болезнь Аддисона, болезненное ожирение, болезнь Стилла взрослых, агаммаглобулинемию, очаговую алопецию, болезнь Альцгеймера, амилоидоз, анкилозирующий спондилит, нефрит с антителами к GBM/антителами к TBM, антифосфолипидный синдром, апластическую анемию, аутоиммунный ангионевротический отек, аутоиммунную дисавтономию, аутоиммунный энцефаломиелит, аутоиммунную энтеропатию, аутоиммунную гемолитическую анемию, аутоиммунный гепатит, аутоиммунное заболевание внутреннего уха (AIED), аутоиммунный миокардит, аутоиммунный оофорит, аутоиммунный орхит, аутоиммунный панкреатит, аутоиммунный полиэндокринный синдром, аутоиммунную ретинопатию, аутоиммунную крапивницу, аксональную и нейрональную нейропатиб (AMAN), болезнь Бало, болезнь Бехчета, доброкачественный эмфигоид слизистой оболочки, энцефалит Бикерстаффа, буллезный пемфигоид, болезнь Кастлемана (CD), целиакию, болезнь Шагаса, синдром хронической усталости, хроническую воспалительную демиелинизирующую полинейропатию (CIDP), хронический рецидивирующий многоочаговый остеомиелит (CRMO), синдром Черджа-Стросса (CSS), эозинофильный гранулематоз (EGPA), рубцовый пемфигоид, синдром Когана, болезнь холодовых агглютининов, врожденную блокаду сердца, миокардит Коксаки, CREST-синдром, болезнь Крона, герпетиформный дерматит, дерматомиозит, болезнь Девича (оптический нейромиелит), сахарный диабет 1 типа, дискоидную волчанку, синдром Дресслера, эндометриоз, энтезит, эозинофильный эзофагит (EoE), эозинофильный фасциит, узелковую эритему, эссенциальную смешанную криоглобулинемию, синдром Эванса, синдром Фелти, фибромиалгию, фиброзирующий альвеолит, гигантоклеточный артериит (височный артериит), гигантоклеточный миокардит, гломерулонефрит, синдром Гудпастура, гранулематоз с полиангиитом, болезнь Грейвса, синдром Гийена-Барре, энцефалопатию Хашимото, тиреоидит Хашимото, гемолитическую анемию, пурпуру Геноха-Шонлейна (HSP), гестационный герпес или гестационный пемфигоид(PG), гнойный гидраденит (HS) (инверсное акне), гипогаммаглобулинемию, IgA-нефропатию, IgG4-связанную склерозирующую болезнь, иммунную тромбоцитопеническую пурпуру (ITP), миозит с тельцами включения (IBM), интерстициальный цистит (IC), воспалительное заболевание кишечника (IBD), ювенильный артрит, ювенильный сахарный диабет (сахарный диабет 1 типа), ювенильный миозит (JM), болезнь Кавасаки, синдром Ламберта-Итона, лейкоцитокластический васкулит, красный плоский лишай, склерозирующий лихен, деревянистый конъюнктивит, линейный IgA дерматоз (LAD), волчаночный нефрит, волчаночный васкулит, хроническую болезнь Лайма, болезнь Меньера, микроскопический полиангиит (MPA), смешанное заболевание соединительной ткани (MCTD), язву Мурена, болезнь Муха-Габермана, мультифокальную двигательную нейропатию (MMN) или MMNCB, рассеянный склероз, миастению гравис, миозит, нарколепсию, неонатальную волчанку, нейромиелит зрительного нерва, нейтропению, глазной рубцующийся пемфигоид, неврит зрительного нерва, атрофическую форму аутоиммунного тиреоидита, палиндромный ревматизм (PR), PANDAS, паранеопластическую дегенерацию мозжечка (PCD), пароксизмальную ночную гемоглобинурию (PNH), синдром Парри-Ромберга, парспланит (периферический увеит), синдром Парсоннажа-Тернера, пузырчатку, периферическую нейропатию, перивенозный энцефаломиелит, пернициозную анемию (PA), POEMS-синдром, узелковый полиартериит, полигландулярные синдромы I, II, III типа, ревматическую полимиалгию, полимиозит, синдром постмиокардиального инфаркта, постперикардиотомический синдром, первичный билиарный цирроз, первичный склерозирующий холангит, прогестероновый дерматит, псориаз, псориатический артрит, истинную эритроцитарную аплазию (PRCA), гангренозную пиодермию, феномен Рейно, реактивный артрит, рефлекторную симпатическую дистрофию, рецидивирующий полихондрит, синдром беспокойных ног (RLS), ретроперитонеальный фиброз, ревматическую лихорадку, ревматоидный артрит, саркоидоз, синдром Шмидта, синдром Шницлера, склерит, склеродермию, синдром Шегрена, аутоиммунитет сперматозоидов и яичек, синдром скованного человека (SPS), подострый бактериальный эндокардит (SBE), синдром Сусака, хорею Сиденгама, симпатическую офтальмию (SO), системную красную волчанку, системную склеродермию, артериит Такаясу, височный артериит/гигантоклеточный артериит, тромбоцитопеническую пурпуру(TTP), синдром Толоса-Ханта(THS), поперечный миелит, сахарный диабет 1 типа, язвенный колит (UC), недифференцированное заболевание соединительной ткани (UCTD), крапивницу, уртикарный васкулит, увеит, васкулит, витилиго, болезнь Фогта-Коянаги-Харада и гранулематоз Вегенера (или гранулематоз с полиангиитом (GPA)).

[0082] Следующий пример включен для демонстрации предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения. Специалистам в данной области техники будет понятно, что методики, раскрытые в следующих примерах, представляют методики, обнаруженные изобретателем для эффективного практического применения способов, раскрытых в данном документе, и таким образом, могут рассматриваться для формирования предпочтительных путей осуществления на практике. Однако, специалисты в данной области техники должны понимать, что в свете настоящего раскрытия, в определенных вариантах осуществления могут быть выполнены многие изменения, и при этом получены подобный или аналогичный результат без отступления от сути и объема настоящего изобретения.

Пример

[0083] Анализы, раскрытые в данном документе, предназначены для проверки эффективности терапевтических иммунных клеток, которые будут решать проблемы, существующие для существующих стандартных способов, и удовлетворять требованиям FDA. Для этого фитогемагглютинин (PHA) применяется в качестве заменителя для индукции продуцирования цитокинов в иммунных клетках. PHA применяется в клинических условиях для проверки иммунного ответа у пациентов, перенесших трансплантацию. Индуцирование продуцирования цитокинов в терапевтических иммунных клетках с использованием PHA устранит все биологические и групповые вариации из анализа активности иммунных клеток. Анализ устранит необходимость иметь полностью работающую исследовательскую лабораторию для проверки эффективности терапевтических иммунных клеток в нескольких местах клинической инфузии и обеспечит более быстрое выполнение таких тестов. Он обеспечит способ тестирования эффекторной функции терапевтических иммунных клеток в рамках требований к тестированию активности, установленных FDA.

Тестирование эффективности терапевтических иммунных клеток с использованием РНА в качестве стимулирующего средства

[0084] Применение опухолевых клеток для тестирования эффекторной функции терапевтических иммунных клеток представляло собой стандартную практику. Эти целевые клетки добавляют биологические вариации к результатам анализа. Кроме того, эта настройка анализа является более трудоемкой и сложной в дополнение к вариациям вследствие целевого состояния, настройки планшета, разницы в методиках от человека к человеку. Терапевтический ответ NK-клеток осуществляется посредством сравнения анализа цитокинов с использованием PHA против широко применяемого анализа цитокинов, опосредованного опухолевыми клетками (K562). Уровни цитокинов указывают на эффективность ответа NK-клеток.

[0085] На Фиг. 1 представлена корреляция анализа индуцированных PHA цитокинов и стандартного анализа индуцированных К562 цитокинов. Выбросы, представленные на Фиг. 1, являются результатом вариабельности, вносимой применением опухолевых клеток. Более высокая секреция GM-CSF была обнаружена в анализе, опосредованном опухолевыми клетками (GC-CSF обычно секретируется опухолевыми клетками). Она продемонстрировало явное преимущество анализа PHA вследствие отсутствия изменчивости, вносимой опухолевыми клетками.

[0086] На Фиг. 2 изображена гистограмма уровней цитокинов, достигнутых с использованием четырехчасовой инкубации по сравнению с 24-часовой инкубацией (с 1 миллионом NK-клеток). На Фиг. 3 изображена гистограмма уровней цитокинов, достигнутых с использованием менее 1 миллиона клеток и более 1 миллиона клеток. Эти условия тестировали для стандартизации анализа. На Фиг. 4 изображены результаты анализа PHA NK-клеток, экспандированных с использованием mb-IL-21 и TGF-β. На Фиг. 5 изображена разница в цитокиновом профиле между донорскими иммунными клетками и продуктом экспандированных терапевтических NK-клеток, индуцированных PHA.

[0087] После установления оптимального количества клеток (10⁶) для анализа свежевыделенные NK-клетки периферической крови (N = 10) и экспандированные NK-клетки (N = 18) от несколько доноров стимулировали PHA для продуцирования цитокинов, и через 1 час оценивали цитокины в супернатант. Экспрессия большинства цитокинов является одинаковой у двух типов NK-клеток, но несколько цитокинов и хемокинов, связанных с функцией NK-клеток, очень дифференцированно экспрессировались в ответ на стимуляцию (Фиг.6). Затем измеряли экспрессию 6 цитокинов в свежевыделенных и экспандированных NK-клетках после стимуляции в течение 1 часа с использованием PHA. Пентраксин-3 (среднее 1062 по сравнению с 7), IL-8 (среднее 821 по сравнению с 11) и хитиназа 3-подобный белок 1 (среднее 620 по сравнению с 7) были значительно сверхэкспрессированы в свежевыделенных NK-клетках по сравнению с экспандированными NK-клетками, и IFN-γ (среднее 15 по сравнению с 105), IL-2 (среднее 3 по сравнению с 141) и CD30 (среднее 9 по сравнению с 156) были значительно сверхэкспрессированы в экспандированных NK-клетках по сравнению со свежевыделенными NK-клетками (Фиг. 7). На основании только сверхэкспрессии пороговое значение экспрессии 10 пг/мл как IFN-γ, так и IL-2 имеет 94% специфичность (16 из 17) и 89% чувствительность (16 из 18) при дифференцировке экспандирванных NK-клеток из свежевыделенных NK-клеток периферической крови (Фиг. 8). Применение IL-2 (активированного) вместе с ингибированным цитокином (пентраксин-3 или хитиназа 3-подобный белок 1) характеризовалось 100% чувствительностью и специфичностью в отношении дифференцировки экспандированных NK-клеток из свежевыделенных NK-клеток периферической крови с соотношениями экспрессии (ингибированные:IL-2) > 1 для свежевыделенных клеток и < 1 для экспандированных клеток (Фиг. 9). Применение IFNg (активированного) вместе с ингибированными цитокинами (пентраксин-3 или хитиназа 3-подобный белок 1) характеризовалось 95% эффективностью в отношении дифференцировки экспандированных NK-клеток из свежевыделенных NK-клеток периферической крови. Комбинации нескольких активированных и ингибированных цитокинов могут быть применены для повышения чувствительности и специфичности определенных типов (Фиг. 10).

[0088] Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют те же самые значения, как обычно понимается специалистом в области техники, к которой принадлежит раскрываемое изобретение. Публикации, цитируемые в данном документе, и материалы, в отношении которых они цитируются, включены особым образом посредством ссылки. Однако следует принимать во внимание, что любой патент, публикация или другой раскрывающий материал, полностью или частично, который, как утверждается, включен в данный документ посредством ссылки, включен в данный документ только в той степени, в которой включенный материал не противоречит существующим определениям, заявлениям или другим материалам раскрытия, изложенным в этом изобретении. Как таковое, и в той степени, в которой это необходимо, настоящее изобретение, явно изложенное в данном документе, заменяет любой противоречивый материал, включенный в данный документ посредством ссылки. Любой материал или его часть, который, как утверждается, включен в данный документ посредством ссылки, но который противоречит существующим определениям, заявлениям или другим раскрывающим материалам, изложенным в данном документе, будет включен только в той степени, в которой не возникает конфликта между этим включенным материалом и существующим материалом для раскрытия информации.

[0089] Специалистам в данной области техники будут понятны многие эквиваленты конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения, описанного в данном документе, или с помощью проведения обычных экспериментов они будут способны установить такие эквиваленты. Хотя настоящее изобретение было описано со ссылкой на конкретные варианты осуществления и внедрения, следует понимать, что могут быть внесены различные изменения и дополнительные вариации, а их элементы могут быть заменены эквивалентами без отклонения от объема настоящего изобретения или его изобретательской концепции. Кроме того, можно выполнять много модификаций для адаптации конкретной ситуации или устройства к идее настоящего изобретения, не выходя за рамки его необходимого объема. Предполагается, что такие эквиваленты охвачены следующей формулой изобретения. Предполагается, что настоящее изобретение не ограничено определенными внедрениями, раскрытыми в данном документе, а настоящее изобретение будет включать все внедрения в объеме прилагаемой формулы изобретения.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Раскрыт способ определения активности иммунной клетки, который включает стадии приведения иммунной клетки в контакт с эффективным количеством стимулирующего средства, например, фитогемагглютинина (PHA)) и определения количества цитокина, продуцируемого иммунной клеткой. Также описаны набор для определения активности иммунных клеток и способы применения активных иммунных клеток в качестве иммунотерапевтического лечения. Изобретение используют для лечения рака. 4 н. и 10 з.п. ф-лы, 10 ил., 1 пр.

1. Способ анализа активности терапевтической экспандированной с использованием IL-21 естественной клетки-киллера (NK-клетки), включающий (i) приведение терапевтической экспандированной с использованием IL-21 NK-клетки в контакт с эффективным количеством стимулирующего средства, где стимулирующее средство представляет собой фитогемагглютинин (PHA); (ii) определение содержания цитокина, продуцируемого терапевтической экспандированной с использованием IL-21 NK-клеткой со стадии (i); (iii) сравнение содержания цитокина, продуцируемого экспандированной с использованием IL-21 NK-клеткой со стадии (i), с уровнем активности, необходимым для применения терапевтической экспандированной с использованием IL-21 NK-клетки в иммунотерапии, тем самым показывая эффекторную функцию терапевтической экспандированной с использованием IL-21 NK-клетки; и (iv) выбор активной терапевтической экспандированной с использованием IL-21 NK-клетки со стадии (iii) на основании содержания цитокина, определенного на стадии (ii).

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что определяют указанное содержание ряда цитокинов.

3. Способ по любому из пп. 1, 2, отличающийся тем, что указанное содержание цитокина определяют с помощью иммуноанализа.

4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что указанный цитокин представляет собой один или более из следующего: интерлейкин (IL)-2 (IL-2), IL-6, интерферон (IFN)-γ (IFN-γ), фактор активации B-клеток/член 13B суперсемейства лигандов фактора некроза опухоли (TNF) (BAFF/TNFSF13B), TNF-α, кластер дифференцировки (CD) 163 (CD163), CD30/TNFRSF8, хитиназа 3-подобный белок 1, gp130, IFN-a2, IL-6Ra, IL-8, IL-10, IL-11, IL-12(p40), IL-12(p70), IL-20, IL-22, IL-26, IL- 29/IFN-l1, IL-32, IL-34, IL-35, матриксную металлопротеиназу-1 (MMP-1), остеокальцин, остеопонтин (OPN), пентраксин-3, рецептор 1 фактора некроза опухоли (TNF) (TNF-R1), TNF-R2, тимический стромальный лимфопоэтин (TSLP), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), фактор ингибирования лейкоза (LIF) и хемокины макрофагальный воспалительный белок (MIP) -1α (MIP-1α), MIP-1β, RANTES, и/или связанный с TNF слабый индуктор апоптоза (TWEAK)/член 12 суперсемейства TNF (TWEAK/TNFSF12).

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанную экспандированную с использованием IL-21 NK-клетку приводят в контакт с эффективным количеством стимулирующего средства в течение по меньшей мере 4 ч.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанное стимулирующее средство представлено в концентрации от 5 до 15 мкг/мл.

7. Набор для анализа активности экспандированной с использованием IL-21 NK-клетки, содержащий контейнер, содержащий эффективное количество стимулирующего средства, и буфер, подходящий для NK-клеток, где набор дополнительно включает инструкции по применению согласно способу, включающему стадии: (i) приведение терапевтической экспандированной с использованием IL-21 NK-клетки в контакт с эффективным количеством стимулирующего средства, где стимулирующее средство представляет собой фитогемагглютинин (PHA); (ii) определение содержания цитокина, продуцируемого терапевтической экспандированной с использованием IL-21 NK-клеткой со стадии (i); (iii) сравнение содержания цитокина, продуцируемого экспандированной с использованием IL-21 NK-клеткой со стадии (i), с уровнем активности, необходимым для применения терапевтической экспандированной с использованием IL-21 NK- клетки в иммунотерапии, тем самым показывая эффекторную функцию терапевтической экспандированной с использованием IL-21 NK-клетки; и (iv) выбор активной терапевтической экспандированной с использованием IL-21 NK-клетки со стадии (iii) на основании содержания цитокина, определенного на стадии (ii).

8. Набор по п. 7, отличающийся тем, что указанное стимулирующее средство представлено в концентрации от 5 до 15 мкг/мл.

9. Набор по п. 7, отличающийся тем, что указанный контейнер представляет собой микроцентрифужную пробирку.

10. Способ иммунотерапии, включающий:

a. осуществление способа по любому из пп. 1-7 на ряде терапевтических экспандированных с использованием IL-21 NK-клеток для определения активности каждой клетки;

b. выбор активной терапевтической экспандированной с использованием IL-21 NK-клетки на основе обнаруженного содержания цитокина; и

c. приготовление терапевтически эффективного количества активной терапевтической экспандированной с использованием IL-21 NK-клетки для введения субъекту, нуждающемуся в этом, в качестве иммунотерапевтического средства против рака, аутоиммунного заболевания, воспалительных заболеваний или нарушений, вирусных заболеваний и/или бактериальных инфекций.

11. Способ иммунотерапии по п. 10, дополнительно включающий извлечение ряда NK-клеток из аллогенного или аутологичного донора до анализа активности терапевтических экспандированных с использованием IL-21 NK-клеток.

12. Способ лечения рака у субъекта, включающий:

a. получение одной или нескольких терапевтических экспандированных с использованием IL-21 естественных клеток-киллеров (NK-клеток);

b. приведение терапевтических экспандированных с использованием IL-21 NK-клеток со стадии (а) в контакт с эффективным количеством стимулирующего средства, где стимулирующее средство представляет собой фитогемагглютинин (PHA);

c. определение содержания цитокина, продуцируемого терапевтическими экспандированными с использованием IL-21 NK-клетками со стадии (b);

d. выбор активной терапевтической экспандированной с использованием IL-21 NK-клетки на основе обнаруженного на стадии (с) содержания цитокина; и

e. введение субъекту терапевтически эффективного количества активной терапевтической экспандированной с использованием IL-21 NK-клетки.

13. Способ лечения рака у субъекта по п. 12, отличающийся тем, что активные терапевтические экспандированные с использованием IL-21 NK-клетки получают от аллогенного или аутологичного донора.

14. Способ по любому из пп. 1, 4 или 5, где цитокин выбирают из интерферона (IFN)-γ (IFN-γ), CD-30 и IL-2.