СПОСОБ КОНСЕРВАЦИИ ЯИЧНИКОВ Российский патент 2024 года по МПК A01N1/02 

Область техники

Изобретение относится к области медицины, а именно способу консервации яичников высококонцентрированным глицерином или люголем.

Уровень техники

Из уровня техники известен способ консервирования ткани яичника человека (см. авторское свидетельство SU 1017251, МПК A61N1/00, опубл. 15.05.1983) путем инкубирования его в криозащитном растворе в течение 30-40 мин с последующим охлаждением в два этапа и помещением в жидкий азот. Замораживание ведут со скоростью 0,5-2°/мин до (-6) - (-8)°С, после чего осуществляют изотермическую выдержку в течение 8-10 мин, а затем со скоростью 9-10°/мин до (-40) - (-60)° С перед погружением в жидкий азот.

Однако данный способ консервации яичников достаточно трудоемкий и дорогостоящий, требует наличия лаборатории с дорогостоящей аппаратурой, реактивами и высококвалифицированных специалистов, наличие специфических условий реализации, что не всегда возможно. При охлаждении яичника межтканевая вода при кристаллизации может нарушать целостность клеточных оболочек, что приводит к невозможности полной регенерации органа.

Известен способ консервации живых органов с помощью раствора, который содержит следующие компоненты, моль/л: хлорид натрия 100,0-117,0; глюконат калия 12,0-17,0; глюконат кальция 1,2-2,0; сульфат магния 8,0-32,0; тригидроксиметиламинометан 2,0-3,0; местный анестетик 0,33-1,66; производное фенотиазина 0,01-0,04; производное пурина 1, 0-2,0; полиглюкин остальное (см. патент RU 2025973, МПК A61N1/02, опубл. 09.01.1995). Раствор позволяет увеличить длительность консервации органов и исключает необратимые повреждения при последующей реперфузии.

Однако данный раствор предлагается использовать для консервации любых органов, однако для консервации именно ткани яичников важна способность сохранения как можно большего числа фолликулов, что в данном способе не определяется. К недостаткам также можно отнести достаточно небольшой срок хранения консервированных органов (в частности в описанном примере почку предлагается хранить хранится в течение 26 ч при температуре 6°С), нет доказательной базы выживаемости фолликулов при применении к консервации яичников.

Известен способ консервации изолированной ткани или изолированного органа (см. патент RU 2737147, МПК A61N1/02, опубл. 2020.11.25). Данное изобретение относится к области биотехнологии, а именно к раствору для консервации изолированной ткани или изолированного органа, приготовлению указанного раствора, консервации изолированной ткани или изолированного органа, к способу промывания, хранения и/или транспортировки изолированного легкого после его удаления у донора в процессе подготовки к последующей трансплантации реципиенту. Способ включает объединение декстрана, глюкозы, ионов кальция, буфера и воды с получением начального раствора. Затем осуществляют доведение рН начального раствора до значения, лежащего в диапазоне от 7,2 до 7,6, если это необходимо. Далее проводят тепловую стерилизацию начального раствора с получением раствора для консервации изолированной ткани или изолированного органа. Полученный раствор используется для консервации, а также промывания, хранения и/или транспортировки изолированного органа или ткани путем введения указанного раствора в изолированную ткань или изолированный орган. Изобретение позволяет поддерживать более высокую концентрацию глюкозы в растворе и снизить образование потенциально токсичных продуктов разложения за счет предварительного забуферивания и предварительной суплементации кальцием перед тепловой стерилизацией, что обеспечивает защиту глюкозы во время тепловой стерилизации.

К недостаткам данного способа можно отнести отсутствие доказательных примеров для консервации конкретно яичников в фолликулярную фазу с сохранением и выживаемости фолликулов.

Раскрытие сущности

Техническая проблема, на решение которой направлено изобретение, состоит в разработке способа консервации ткани целого яичника.

Технический результат заключается в сохранении максимально возможного числа фолликулов для сохранения репродуктивной функции.

Поставленный результат достигается тем, что яичник (яичники) помещают в 80- 99,5% раствор глицерина или люголя, выдерживают при комнатной температуре в плотно закрытой емкости до полной пропитки не менее 2 часов, хранят в таком состоянии в темном месте при температуре не выше 5° С.

Краткое описание чертежей

Изобретение поясняется чертежами, где

на фиг. 1 в качестве примера представлена кинетика СДО образцов ткани яичника кошки в фолликулярной фазе цикла при погружении в 99,5% глицерин;

на фиг. 2 в качестве примера представлена соответствующая кинетика разницы эффективной оптической плотности ΔA(t, λ) при 600, 700 и 800 нм и затем усредненная исследуемых образцов яичников кошки в фолликулярной фазе цикла при погружении в 80 % глицерин. Символы - экспериментальные данные, сплошные кривые - соответствующая аппроксимация экспериментальных данных в рамках модели свободной диффузии;

на фиг. 3 показано сканированное изображение фрагмента гистологических срезов образцов яичников кошек (в качестве иллюстрации взято три образца): столбец а - половина яичника в фолликулярную фазу исходные; столбец б - вторые половины яичников кошек в фолликулярной фазе после консервации в глицерине в течение 10 суток и затем восстановленные в физиологическом растворе;

на фиг. 4 - сканированное изображение фрагмента гистологических срезов образцов яичников трех кошек: столбец а - половина яичника в фолликулярную фазу исходные (до консервации); столбец б - вторые половины яичников кошек в фолликулярной фазе после консервации в люголе в течение 10 суток и затем восстановленные в физиологическом растворе.

Осуществление изобретения

Способ консервации яичников заключается в следующем.

При необходимости консервации яичника, удаленный орган (органы) помещают в 80-99,5% раствор глицерина или фармпрепарата люголь, состоящего из глицерина и йода, выдерживают при комнатной температуре в плотно закрытой емкости для полной пропитки.

В таком состоянии орган хранится в темном месте при температуре от 0°С до 5° С неограниченное время, и при помещении в физиологический раствор полностью восстанавливает свои функции. Поскольку яичник способен регенерироваться из части органа, задача консервации сводится к сохранению максимально возможного числа фолликулов для сохранения репродуктивной функции.

Яичники в фолликулярной фазе цикла брали от беспородных кошек в возрасте от 1 года до 7 лет с диагнозом «клинически здорова» после лапароскопической овариэктомии и овариогистерэктомии. Пропитка осуществлялась в течение 2,5 часов при 25° С. Орган хранился в течение 10 суток при температуре 5° С. После помещения в физиологический раствор на 5 суток провели гистологическими исследования. Гистологические исследования in vitro проводили с использованием половин каждого яичника, которые вручную разрезали скальпелем и фиксировали в 10% забуференном формалине. Материал для гистологического исследования готовили не позднее, чем через 48 часов после овариэктомии и овариогистерэктомии. Для получения гистологических сканов использовали цифровой слайд-конвертер Aperio AT2 (экранный диагностический сканер), оснащенный светодиодным источником света и средствами калибровки. Толщина срезов тканей для сканирования составляла 2-3 мкм. Образцы окрашивали гематоксилин-эозином для гистологических исследований. Толщину срезов тканей (образцов) измеряли электронным микрометром (Union Source CO., Ltd., Китай, Нинбо). Образец помещали между двумя предметными стеклами, затем измеряли в нескольких точках и усредняли. Точность каждого измерения составляла ±0.01 мм. Средняя толщина срезов яичников составила (0.90 ± 0.10) мм. Для измерения спектров диффузного отражения (СДО) образцов тканей в спектральном диапазоне 200-800 нм использовали двухлучевой спектрофотометр Shimadzu UV-2550 (Япония, Токио) с интегрирующей сферой. Источником света служила галогенная лампа с фильтром в исследуемом спектральном диапазоне от 200 до 800 нм. Предельное разрешение спектрометра составляло 0.1 нм. Перед измерениями спектры нормализовали с помощью эталонного отражателя BaSO₄ с подходящей отражательной способностью для всего спектрального диапазона, включая УФ. Все измерения проводились при комнатной температуре (~25°С) и нормальном атмосферном давлении. Каждый образец исследуемой ткани фиксировали двусторонним скотчем в специальной рамке с окном 0,5 × 0,5 см в кварцевой кювете таким образом, чтобы образец ткани прижимался к стенке кюветы и подвергался оптическому измерению СДО.

Определение эффективного коэффициента тканевой диффузии исследуемого агента/интерстициальной воды основано на измерении кинетики СДО (фиг. 1), применяя модель свободной диффузии для плоскопараллельного образца ткани конечной толщины, второй закон Фика и модифицированный закон Бугера-Бера-Ламберта. Зарегистрированные СДО преобразовывали с помощью стандартного алгоритма Кубелки-Мунка в спектры оптической плотности. Используя полученное после аппроксимации уравнение, вычисляли время полного проникновения агента в образец и эффективный коэффициент диффузии агента/интерстициальной воды (фиг. 2). Эффективный коэффициент диффузии глицерина/тканевой жидкости в образце здорового яичника кошки толщиной 0.8 мм был определен как (1.9±0.2)⋅10^-6 см²/с. Используя уравнение:

нашли τ (время диффузии), которое для образцов здоровых яичников толщиной 0,08 см составило 22.3 мин. Поскольку толщина целого яичника кошки составляет в среднем 0.5 см можно соизмерить, что время полной диффузии агентов в целом органе составит 139.4 мин или 2 ч 32 мин. Таким образом, доказано, что за 2 ч 32 мин произойдет полное обезвоживание целого яичника.

По результатам гистологических исследований доказано, что для исследования были выбраны здоровые, неизмененные ткани. В образцах яичников выявлены корковое и мозговое вещество, оболочка яичника состоит из кубовидного эпителия и белочной оболочки (или субэпителиальный эпителий). Выявлены многочисленные фолликулы: примордиальные с первичными и вторичными фолликулами. Примордиальные фолликулы состоят из первичного ооцита, включающие более крупный ооцит и сформированный вокруг него слои кубовидных гранулезных клеток, а также блестящую оболочку фолликула. Вторичные фолликулы имеют полость, отделяющую ооцит с прилегающими к нему гранулезными клетками. Фолликулы коркового слоя расположены в гиперклеточной волокнистой соединительной ткани, среди которой встречаются разрозненные рубцы.

Количество фолликулов во всей площади яичника оценивали путем подсчета вручную по гистологическим сканам образцов исходных и после консервации в глицерине (80-99,5%) (фиг. 3) или люголе (фиг. 4) с последующим восстановлением в физ. растворе.

Таблица 1. Количество фолликулов в исследуемых образцах яичников кошек после консервации в глицерине

№
образца Количество фолликулов в исходном яичнике (по исследованию ½ органа) Количество фолликулов в восстановленном яичнике (по исследованию ½ того же органа) 1 46 46 2 63 63 3 68 67 4 56 56 5 51 51 Среднее
значение 57 57

Таблица 2. Количество фолликулов в исследуемых образцах яичников кошек после консервации в люголе

№
образца Количество фолликулов в исходном яичнике (по исследованию ½ органа) Количество фолликулов в восстановленном яичнике (по исследованию ½ того же органа) 1 64 64 2 69 69 3 37 36 4 45 44 5 58 58 Среднее
значение 55 55

При гистологическом исследовании в строении яичников определяется четкое деление на мозговой сосудисто-фиброзный и кортикальный слои. В яичниках фолликулярной фазе цикла выявлены многочисленные группы примордиальных фолликулов с близлежащими первичными и вторичными фолликулами. В экземплярах яичников, восстановленных после консервации в глицерине (Фиг. 3) и люголе (Фиг. 4), обнаруживается такое же число фолликулов неизменной гистологической структуры.

По результатам гистологического исследования доказано, что выбранные «нормальные, неизмененные» ткани у исследуемых образцов содержат одинаковое количество фолликулов в исходном варианте и после восстановления, что имеет важное практическое применение при консервации (криоконсервации), новых репродуктивных технологиях и имплантации яичников.

При таком способе яичник консервируется путем обезвоживания всей клеточной массы без повреждения структуры.

При восстановлении органа путем помещения его в физиологический раствор, яичник полностью восстанавливает свою структуру и число фолликулов, что важно при консервации (криоконсервации), новых репродуктивных технологиях и имплантации яичников.

Изобретение относится к области медицины, а именно способу консервации яичников. Способ консервации яичников включает погружение их в 80-99,5% раствор глицерина или люголя, выдерживание при комнатной температуре в плотно закрытой емкости до полной пропитки не менее 2 часов и хранение в растворе в темном месте при температуре не выше 5°С. Предлагаемый способ консервации яичников обеспечивает сохранение максимально возможного числа фолликулов для сохранения репродуктивной функции. 4 ил., 2 табл., 1 пр.

Способ консервации яичников, характеризующийся тем, что целый орган погружают в 80-99,5% раствор глицерина или люголя, выдерживают при комнатной температуре в плотно закрытой емкости до полной пропитки не менее 2 часов, хранят в таком состоянии в темном месте при температуре не выше 5°С.