Способ комбинированного лечения местного отграниченного перитонита в эксперименте Российский патент 2024 года по МПК A61B17/00 A61N5/67 G09B23/28 A61M27/00 A61K33/30 A61K33/34 A61K33/26 A61K33/14 A61K47/14 A61K9/08 A61K9/107 A61P43/00 

Изобретение относится к области биологии и медицины, в частности к гнойной хирургии, и может быть использовано для лечения отграниченных гнойных внутренних полостей, в том числе местного отграниченного перитонита.

Быстрое формирование устойчивости микроорганизмов к антибиотикам диктует необходимость поиска новых, альтернативных антимикробных препаратов. Препараты на основе наночастиц металлов являются одними из перспективных претендентов на создание нового класса антибактериальных средств, поскольку помимо высокой антимикробной активности с широким спектром обладают пролонгированным действием, в биотических дозах стимулируют функциональную активность ферментных систем [Физико-химические закономерности биологического действия высокодисперсных порошков металлов / Н.Н. Глущенко и др. // Химическая физика. 2012. Т. 21. № 4. С. 79-85].

В литературе описаны антибактериальная активность наночастиц меди, ее бактерицидное воздействие в отношении штаммов Micrococcus luteus, S.aureus, E.coli, Klebsiella pneumonia, P. aeruginosa, также Aspergillus flavus, A. niger и Candida albicans и регенеративное действие [Investigations into the antibacterial behavior of copper nanoparticles against Escherichia coli / M. Raffi et al. // Annals of Microbiology. 2015. V. 60, Is. 1. P. 75-80].

Установлено, что использование наночастиц цинка в виде суспензии достоверно повышает скорость репаративной регенерации экспериментальной раны по отношению к группе сравнения [Регенерация экспериментальной раны под влиянием наночастиц цинка / И.В. Бабушкина и др. // ВНМТ. 2012. №4.].

В 2008 году Федеральное Агентство по Охране Окружающей Среды США (US EPA) официально присвоило ряду металлов (серебру, меди, цинку) статус веществ с бактерицидными свойствами. Было доказано их бактерицидное и бактериостатическое действие на наиболее токсические виды бактерий (в частности, на синегнойную палочку, золотистый стафилококк, энтерококк), а ярко выраженная биологическая активность, оказывает колоссальное влияние на регенерацию тканей. При изучении антимикробного влияния наночастиц металлов на грамотрицательные микроорганизмы в ряде экспериментальных работ было продемонстрировано, что при введении наночастиц металлов в рану стимулируются механизмы регуляции микроэлементного состава и активность антиоксидантных ферментов, отмечается ранозаживляющий эффект, что является перспективой создания нового класса антибактериальных препаратов.

Широкое распространение в лечении гнойных заболеваний получили лазерные технологии. Полученные в исследованиях данные свидетельствуют о том, что процессы созревания грануляционной ткани активнее проявляются в случае облучения раны низкоинтенсивным лазерным излучением (НИЛИ). Наблюдается 2-3-дневное опережение процессов созревания грануляционной ткани по сравнению с контрольной группой, где клеточная реакция менее активна. Основой механизма взаимодействия НИЛИ с биообъектом являются фотофизические и фотохимические реакции, связанные с резонансным поглощением тканями света и нарушением слабых межмолекулярных связей, а также восприятие и перенос эффекта лазерного облучения жидкими средами организма [Илларионов В.Е. Основы лазерной терапии. М.: Издательство "РЕСПЕКТ" Объединения ИНОТЕХ-Прогресс. 1992. С.42-43]. НИЛИ стимулирует выработку универсального источника энергии АТФ в митохондриях, ускоряет скорость его образования, повышает эффективность работы дыхательной цепи митохондрий. В то же время количество потребляемого кислорода уменьшается. НИЛИ оказывает антиоксидантный эффект [Терапевтическая эффективность низкоинтенсивного лазерного излучения / А.С. Крюк и др.]. Высокая терапевтическая эффективность НИЛИ показана в исследованиях у хирургических больных при лечении послеоперационных осложнений, анастомозитов, послеоперационных парезов кишечника, ран, ожогов, облитерирующих заболеваний сосудов конечностей и других хирургических заболеваниях. Таким образом, НИЛИ способствует ускорению процессов регенерации, способствует уменьшению микрофлоры, рассасыванию инфильтратов, нормализации показателей крови и приводит, в конечном итоге, к заживлению ран.

Известен способ лечения абсцессов мягких тканей в эксперименте [патент RU №2639595], в котором после вскрытия гнойника, эвакуации содержимого и однократного лазерного облучения для разрушения внутриполостного тканевого секвестра, ежедневно заполняют полость комбинированным 1% раствором наночастиц оксида цинка и 1% раствором препарата «Эплан». Препарат «Эплан» - это ранозаживляющее средство, обладающее обезболивающим, бактерицидным и регенерирующим действием. Препарат обладает антибактериальным действием, существенно препятствует прогрессированию гнойно-воспалительного процесса и сокращает сроки лечения.

Недостаток описанного способа заключается в однократном применении низкоинтенсивного лазера, что не позволяет снизить до минимума обсемененность патогенными микроорганизмами в полости раны, образованной гнойным процессом.

В литературе описано воздействие взвеси частиц порошков меди, железа и цинка, полученных из их сплава при воздействии на него плазменным потоком с температурой 5000-6000 К, в физиологическом растворе при массовом соотношении Cu:Fe:Zn=60:15:25, дисперсностью частиц 180-220 нм и концентрации взвеси, равной 10 мг/мл на полость абсцесса при лечении экспериментальных гнойных ран [патент RU №2379042]. Установлена эффективность воздействия как каждого из нанопорошков на подавление микробной флоры и регенерацию, так и усиление антибактериальных свойств при использовании взвеси нанопорошков в изотоническом растворе NaCl.

Наиболее близким аналогом к заявляемому изобретению является способ комбинированного лечения абсцессов в эксперименте [патент RU № 2475251], включающий аспирацию содержимого из полости через катетер, затем одновременное введение в полость суспензии с концентрацией 1 мкг/мл наночастиц меди в физиологическом растворе и воздействия лазерного облучение длиной волны 630 нм в постоянном режиме выходной мощностью 35 мВт. Процедуру проводят ежедневно по 3 минуты в течение десяти суток.

Однако применение в качестве связующего компонента активных веществ в виде наночастиц или их композиции в физиологическом растворе не позволяет эффективно использовать дополнительное применение низкоинстенсивного лазерного излучения при лечении внутренних полостей сложной конфигурации с участками разных диаметров, наличием изгибов и поворотов. Данный растворитель не обеспечивает равномерного распределения лазерного излучения внутри полости, что значительно снижает, а в отдельных случаях доводит до минимума эффект от проводимого лечения, запуская повторное инфицирование за счет наличия необработанных участков.

Задачей заявляемого изобретения является расширение спектра применения способа лечения отграниченных внутренних полостей сложной конфигурации за счет синергетического эффекта используемых компонентов при обеспечении полного подавления патогенных микроорганизмов всех типов в кратчайшие сроки.

Сущность заявляемого изобретения заключается в том, что в способе комбинированного лечения местного отграниченного перитонита в эксперименте, включающем вскрытие абсцесса, аспирацию содержимого из полости, санацию полости фурацилином, введение в полость суспензии наночастиц меди в физиологическом растворе и одновременным облучением низкоинтенсивным лазерным излучением внутренней полости с помещением в нее рабочего конца световода с рассеивателем, отличающийся тем, что дополнительно в физиологический раствор добавляют эмульсию интралипида с концентрацией 0,24% и наночастицы цинка и железа, при этом соотношение наночастиц меди, цинка и железа составляет 1:1:1, а концентрация всех добавленных наночастиц в получившейся суспензии 1 мг/мл; осуществляют облучение полости низкоинтенсивным лазерным излучением в непрерывном режиме с длиной волны 1064 нм, мощностью 14 Вт, ежедневно по 2 минуты в течение 10 дней с последующей санацией полости после каждой процедуры физиологическим раствором.

Технический результат заявляемого изобретения.

Совокупность технических приемов, заключающихся в применении композиции наночастиц металлов с различными типами действий, использование в качестве связующего компонента эмульсии, позволяющей управлять пространственным распределением низконтенсиного лазерного излучения, которое, в свою очередь, служит усилителем как индивидуальных свойств каждого компонента, так и получаемого синергетического эффекта от их совместного применения, обеспечивает расширение спектра типов лечебного воздействия отграниченных внутренних полостей сложной конфигурации.

Наночастицы меди имеют наибольшую из представленных металлов антибактериальную активность, существенно снижая количество жизнеспособных клеток штаммов S. aureus и E. coli. Воздействие нанопорошка железа направлено на подавление контаминированных клеток штаммов S. aureus в отношении гнойного процесса и усиление регенерирующих свойств меди при применении комплексного воздействия нанопорошков. Наночастицы цинка обладают умеренно выраженным антибактериальным действием, в спектр их активности входит фунгицидное действие, что является важным при профилактике рецидивов и при инфицировании грибами рода Candida. Медь, цинк и железо являются компонентами многих органических соединений, выполняющих в биологическом организме важные функции. Таким образом, эти металлы в отношении макроорганизма не являются чужеродными, в дальнейшем они легко метаболизируются и выводятся из организма без каких-либо побочных эффектов.

Доказан эффект усиления антимикробного действия от совместного применения суспензии из композиции наночастиц металлов и НИЛИ, подтверждающийся очищением в кратчайшие сроки инфицированной полости от возбудителя. Это позволяет начать лечение без определения вида возбудителя, полностью подавляя рост патогенных микроорганизмов.

В биоткани, имеющей сложные внутренние полости, необходимо управлять пространственным распределением излучения для осуществления технологий лазерного воздействия. В качестве управляющего параметра выбрана концентрация интралипида – жировой эмульсии для внутривенного питания, не вызывающей иммунного отклика живого организма. Установлено, что при зондировании лазерным излучением ближнего ИК диапазона с длиной волны 1064 нм лазерное излучение имеет равномерное рассеяние при концентрации интралипида в физиологическом растворе равной 0,24%, что позволяет воздействовать на полость абсцесса с равным бактерицидным и противомикробным эффектом в объеме всей полости отграниченного перитонита.

Таким образом, совокупность применения вышеописанных признаков позволяет индивидуально каждому из компонентов раскрыть свои способности, воздействуя на разные механизмы патогенеза воспаления. Спектр применяемых механизмов воздействия покрывает все возможные типы развития инфекционного процесса по течению заболевания, по его локализации и этиологии (вида возбудителя), что обеспечивает полное подавление патогенных микроорганизмов в кратчайшие сроки, снижая риск рецидива.

Способ комбинированного лечения местного отграниченного перитонита в эксперименте осуществляется следующим образом.

Лабораторные животные содержатся в регламентированных условиях вивария при соблюдении всех правил содержания лабораторных животных. Уход за животными и проведение экспериментов осуществляется согласно основным морально-этическим принципам проведения биомедицинских экспериментов на животных, сформулированных в следующих документах: «Правила лабораторной практики в РФ» (Good Laboratory Practice), утвержденные приказом Министерства здравоохранения и социального развития от 23.08.2010 №708н, и «Международные рекомендации по проведению биомедицинских исследований с использованием животных», принятые Международным советом медицинских научных обществ (CIOMS) в 1985 г.

Для моделирования местного отграниченного перитонита сначала формируют в правой подвздошной области отграниченную гнойную полость по методике, разработанной на кафедре ОХиТА СГМУ. Экспериментальное исследование проводят под комбинированным обезболиваем (рометар, золетил) минилапаротомным доступом. В брюшную полость, после депиляции и антисептической обработки участка кожи размером 3х3 см, транскутанно, под контролем УЗИ, в полость живота вводят троакар диаметром 3 мм. Далее через троакар проводят модифицированный (укороченный до 3 см) катетер Фолея, разработанный на кафедре ОХиТА СГМУ, и после заполнения баллона в дистальной части катетера 2,0 мл физиологического раствора (NaCl 0,9%), производят перевязку катетера проксимальнее баллона и фиксацию дистальной части его при помощи кожной дупликатуры. Затем выполняют контрастное УЗИ-исследование, при которых в подвздошной области определяется сформированная округлая полость диаметром 2 см³ с четкими стенками и подпаянными к ним петлями кишечника. Катетер опорожняют и удаляют. Затем одному животному выполняют лапаротомию, вскрывают просвет слепой кишки и из её содержимого готовят 15% взвесь фекалий в изотоническом растворе хлорида натрия. Далее смесь дважды фильтруют через двойной слой марли и вводят животным в созданную кистозную полость через пункционную иглу под контролем УЗИ из расчета 1 миллилитр на 100 граммов массы животных. На шестые сутки после инфицирования визуализируются характерные клинические признаки местного отграниченного перитонита: животные принимают лежачее положение, плохо реагируют на болевой и звуковой раздражители, отказываются пить и принимать пищу, у них выражена местная болевая реакция в правой подвздошной области при пальпации, отечность кожи и местная гипертермия. Затем выполняют санацию полости раствором фурацилина. После чего вводят физиологический раствор с эмульсией интралипида в концентрации 0,24% с добавлением наночастиц меди, железа и цинка, при этом соотношение наночастиц меди, цинка и железа составляет 1:1:1, а концентрация всех добавленных наночастиц в получившейся суспензии 1 мг/мл. Одновременно проводят облучение полости абсцесса низкоинтенсивным лазерным излучением. При этом параметры лазерного излучения устанавливают следующие: длина волны 1064 нм, непрерывный режим, мощность 14 Вт, время облучения – 2 минуты. Затем полость санируют 0,9% раствором NaC1. Процедуру повторяют ежедневно в течение 10 дней. Для комплексной оценки эффективности лечения гнойного процесса используют планиметрические, инструментальные, бактериологические и морфологические методы.

Пример 1.

Доказательная база применения способа была обоснована в ходе ряда экспериментов, в которых использовался ряд технических аспектов, связанных с методиками проведения НИЛИ, соотношениями и концентрациями интралипида и наночастиц металлов. (Cu+Fe+Zn). В ходе экспериментов с различными соотношениями указанных металлов установлено, что лучшем соотношением металлов является их равномерное распределение 1:1:1. Так, лишь присутствие интралипида и НЧМ в соотношениях 1:1:1 и концентрации 1,0 мг/мл способствовало полному подавлению роста культуры стафилококка. Рост колоний опытного штамма отсутствовал в концентрации 1 мг/мл и только в равном соотношении НЧМ. На 3 часу культивирование в присутствии интралипида и НЧМ в соотношении 1:1:1 в концентрации 0,001 мг/мл количество колоний S. aureus было ниже, чем НЧМ в других соотношениях (р<0,001, относительно 0,001 мг/мл в других концентрациях НЧМ)). Присутствие равных соотношений НЧМ продолжало сдерживать размножение – при 1 мг/мл рост отсутствовал. Сочетанное применение НИЛИ и НЧМ в соотношении 1:1:1 и полученный эффект подавления роста микрофолоры получен нами впервые.

Согласно полученным значениям M±m (среднего арифметического и стандартного отклонения) значения колоний, 0,24% интралипид не оказывает стимулирующего и ингибирующего влияния на все штаммы в данных условиях эксперимента. Доказано, что действие НИЛИ на НЧМ в равных соотношениях 1:1:1 существенно снижает количество жизнеспособных клеток представленных штаммов (табл.1).

Таблица 1 – Влияние наночастиц металлов наночастиц металлов (Cu+Fe+Zn) в равных сотношениях 1:1:1 и лазера на жизнеспособность бактерий

Вариант опыта Кол-во колоний S.aureus 209P E.coli ATCC 25922 К МПБ 920
880
961
920±40 800
789
805
798±8 ИЛ 813
813
891
839±45 889
802
815
835±46 МПБ+л 995
957
986
979±19 870
822
864
852±26 ИЛ+Л 735*
750
772
752±18 912
990
960
954±39 Cu 407
473
508
472±55 318
219
296
269±56 Zn 402
465
501
468±53 312
212
289
262±54 Fe 398
469
506
464±51 309
205
276
256±52 Cu+Zn+Fe
1:1:1 109
233
262
129±22 156
122
135
134±12

В экспериментах на лабораторных животных 0,24% концентрацию интралипида получали, смешав 2 мл его 10% концентрациии и 81,33 мл изотонического раствора хлорида натрия. Ранее нами экспериментально установлено, что концентрация рассеивающей среды, обеспечивающая равномерное распределение ее по внутренней поверхности полости, равна 0,24% (Лебедев М.С.,2016).

Антибактериальную активность наночастиц металлов (Cu+Fe+Zn) определяли методом двукратных серийных разведений в мясо-пептонном бульоне в отношении стандартных штаммов Staphylococcus aureus FDA 209Р, Escherichia coli ATCC 25922 5×105 КОЕ/мл. Взвесь нанопорошков меди, цинка и железа представлена ФГУП РФ «Государственный научно-исследовательский институт химии и технологии элементоорганических соединений» (г. Москва) Наночастицы металлов (Cu+Fe+Zn) использована в равных соотношениях 1:1:1 (по 0,3,0,3,0,3 мл каждый порошок). Наночастиц металлов размерностью 50нм и концентрацией 1мг/мл приготовлены с использованием ультразвукового гомогенизирования на основе 0,24% водного раствора препарата для внутривенного введения – интралипида

Пример 2.

Заявляемый способ был апробирован на 80 лабораторных белых крысах-самках массой 200±50г, которые были разделены на 4 группы, по 20 в каждой, по варианту проводимого местного лечения.

Животным 1 группы проводили санацию полости гнойного абсцесса брюшной полости фурацилином и лечение антибиотиками – бициллин 0,3 млн ЕД 1 раз в течение 3 дней.

Животным 2 группы проводили санацию полости эмульсией интралипида в физиологическом растворе с концентрацией 0,24%, после чего облучали низкоинтенсивным лазерным излучением с длиной волны 1064 нм в непрерывном режиме, мощностью 14 Вт в течение 2 минут

Животным 3 группы выполняли санацию полости фурацилином с последующим применением эмульсией интралипида в физиологическом растворе с концентрацией 0,24%, содержащей взвесь наночастицы металлов меди, цинка и железа в равных соотношениях 1:1:1 (по 0,3,0,3,0,3 мл каждый порошок), путем заполнения полости.

Животным 4 группы выполняли санацию полости раствором фурацилина, после чего вводили физиологический раствор с эмульсией интралипида в концентрации 0,24%, с добавлением в равных соотношениях 1:1:1 наночастиц меди, железа и цинка с образованием концентрации 1 мг/мл в получившейся суспензии. Одновременно проводили облучение низкоинтенсивным лазерным излучением с длиной волны 1064 нм в непрерывном режиме мощностью 14 Вт в течение 2 минут. После чего полость санировали 0,9% раствором NaC1.

Лазерную обработку проводили животным второй и четвертой групп в течение 10 дней. Применение стандартной терапии привело к уменьшению объема полости абсцесса лишь на половину его диаметра.

Использование эмульсии интралипида в физиологическом растворе с концентрацией 0,24%, содержащей нанокомплекс из равного соотношения меди, железа и цинка, способствовало ранозаживляющей активности, но позволило лишь частично облитерировать полость абсцесса.

Комбинированное применение лазерного облучения и суспензии физиологического раствора с эмульсией интралипида в концентрации 0,24%, с добавлением нанокомплекса меди, железа и цинка в соотношении 1 мг/мл получившейся суспензии способствовало практически полной облитерации полости (95,0±4,95%) уже к 10-му послеоперационному дню.

На основе полученных данных формируют таблицу (табл.2),
которая построена на измерении количества вводимых растворов в полость абсцесса, единица измерения – миллилитры (p <0,005).

Таблица 2 – Зависимость объема полости от схемы лечения и суток проводимой терапии

Объем полости в мл Сутки Группа №1 Группа №2 Группа №3 Группа №4 5-е 2,3 ± 0,3 1,2 ± 0,1 0,9 ± 0,2 0,55 ± 0,2 7-е 1,8 ± 0,2 1,0 ± 0,2 0,7 ± 0,2 0,3 ± 0,1 10-е 1,2 ± 0,1 0,5 ± 0,1 0,25 ± 0,1 0,15 ± 0,1 Облитерация, в % 35,0±4,95% 60,0±4,95% 75,0±4,95% 95,0±4,95%

Из таблицы делают вывод о зависимости объема полости от схемы лечения и суток проводимой терапии. Результатами исследования являются следующие выводы: в 1 и 3 группах заметна положительная динамика на фоне лечения, но она не является столь эффективной даже на 10-е сутки эксперимента; во 2 группе также видна отчетливая положительная динамика по уменьшению объема полости; в 4 группе, имеется выраженная регрессия объема полости (до 0,3 ± 0,1 (p <0,05)) на 10-е сутки эксперимента. Подтверждали результаты исследования проведенным после осуществления заявляемого способа лечения планиметрическими, ультразвуковым и рентгеноконтрастные методами исследования.

Далее приведен пример заявляемого способа в раскрытом виде описания эксперимента на белой лабораторной крысе массой 198 г из 4 группы. Крысе было проведено комбинированное обезболивание (рометар, золетил) минилапаротомным доступом. Смоделирован отграниченный местный перитонит. Затем выполнена пункция гнойника троакаром диаметром 5 мм. После чего через модифицированный катетер, ежедневно, в течение 10 суток, в полость абсцесса вводили 1,5 мл суспензии физиологического раствора с эмульсией интралипида в концентрации 0,24%, с добавлением в равном соотношении наночастиц металлов размерностью 50 нм меди (0,3 мг), железа (0,3 мг) и цинка (0,3 мг), приготовленных с использованием ультразвукового гомогенизирования, обеспечивая при этом концентрация добавленных наночастиц 1 мг/мл получившейся суспензии. Одновременно проводили облучение полости посредством использования низкоинтенсивного лазера «Матрикс» с установленными параметрами: длина волны 1064 нм, мощность 14 Вт, непрерывный режим, в течение 2 минут путем доставки через световод излучения на оптический рассеивающий элемент в полость абсцесса. После процедуры полость санировали 0,9% раствором NaC1.

Через 5 суток лечения полость абсцесса была частично облитерирована и объем ее составлял 0,55 ± 0,2 см. При микробиологическом исследовании установлено отсутствие роста микрофлоры. По данным морфологического исследования на 10 сутки лечения была полностью облитерирована (95,0±4,95%) и заполнена молодой соединительной тканью.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к гнойной, абдоминальной хирургии, и может быть использовано для лечения местного отграниченного перитонита. Проводят вскрытие абсцесса, аспирацию содержимого из полости и санацию полости фурацилином. Затем в полость вводят физиологический раствор с эмульсией интралипида с концентрацией 0,24% с добавлением в него комплекса из наночастиц меди, цинка и железа в соотношении 1:1:1, обеспечивая соотношение всех наночастиц 1 мг/мл получившейся суспензии. Одновременно с этим проводят облучение внутренней полости с помещением в нее рабочего конца световода с рассеивателем низкоинтенсивным лазерным излучением (НИЛИ) в непрерывном режиме с длиной волны 1064 нм, мощностью 14 Вт. Процедуру проводят ежедневно по 2 минуты с последующей санацией полости после каждой процедуры физиологическим раствором. Манипуляции повторяют в течение 10 дней. Способ обеспечивает полное подавление патогенных микроорганизмов при лечении отграниченных внутренних полостей сложной конфигурации в кратчайшие сроки, снижая при этом риск рецидива, не требует определения вида возбудителя за счет совместного применения композиции из наночастиц металлов и НИЛИ. 2 табл., 2 пр.

Способ комбинированного лечения местного отграниченного перитонита в эксперименте, включающий вскрытие абсцесса, аспирацию содержимого из полости, санацию полости фурацилином, введение в полость суспензии наночастиц меди в физиологическом растворе и одновременное облучение низкоинтенсивным лазерным излучением внутренней полости с помещением в нее рабочего конца световода с рассеивателем, отличающийся тем, что дополнительно в физиологический раствор добавляют эмульсию интралипида с концентрацией 0,24% и наночастицы цинка и железа, при этом соотношение наночастиц меди, цинка и железа составляет 1:1:1, а концентрация всех добавленных наночастиц в получившейся суспензии 1 мг/мл; осуществляют облучение полости низкоинтенсивным лазерным излучением в непрерывном режиме с длиной волны 1064 нм, мощностью 14 Вт, ежедневно по 2 минуты в течение 10 дней с последующей санацией полости после каждой процедуры физиологическим раствором.