Способ моделирования воспалительной реакции у мышей Российский патент 2024 года по МПК A61K39/145 A61P31/14 C12N15/117 G09B23/28 

Описание патента на изобретение RU2823685C1

Изобретение относится к области медицины, фундаментальным исследованиям в области биомедицинских технологий.

Основная проблема в борьбе с вирусами гриппа заключается в их постоянном мутировании, которое приводит к изменениям антигенов, в том числе гликопротеинов - наружных мембран, играющих важнейшую роль при создании современных вакцин. Из-за постоянной микроэволюции вируса формулы противогриппозных вакцин необходимо пересматривать и улучшать каждый год. На данный момент самые распространенные платформы вакцин - инактивированные и живые (ослабленные).

Нуклеиновые кислоты РНК-вирусов содержат протяженные высококонсервативные участки, практически не изменяющиеся со временем, которые представляют собой идеальную мишень для терапевтических разработок. Поразить эту цель до сих пор не удалось из-за того, что концепция была плохо изучена. Однако эти вакцины могут быть универсальными и очень эффективными. Олигонуклеотиды десятилетиями действуют как превосходные адъюванты, и накапливается все больше и больше данных, показывающих, что они также могут быть антигенами. Разработанные вакцины, такие как Спутник-V, Moderna, Vaxigrip Tetra, КовиВак имеют эффективность, они не справляются с проблемами на 100%.

На пути разработки олигонуклеотидных вакцин стоят два препятствия: отсутствие знаний об антителах, способных проникать в клетки и атаковать уникальные последовательности нуклеиновых кислот РНК-вирусов, и неизвестная антигенпрезентирующая способность дендритных клеток по отношению к нуклеиновым кислотам. В то же время не вызывает сомнения тот факт, что олигонуклеотидные вакцины на основе высококонсервативных участков геномов РНК вирусов обладают большим потенциалом в профилактике вирусных заболеваний несмотря на то, что пока не укладываются в рамки современного учебника по иммунологии.

На сегодняшний день стратегически важным направлением исследований является разработка вакцин с длительным оперативным периодом действия. Такие вакцины могут быть созданы на основе консервативных антигенов вируса гриппа.

Традиционные подходы, использующие белки в качестве антигенов, имеют хороший потенциал для решения этой проблемы, но еще не достигли значительных результатов. Не менее перспективна разработка олигонуклеотидных вакцин, использующих в качестве антигенов консервативные участки генома вируса гриппа.

В качестве аналога выбран антисмысловой противовирусный препарат - фомиверсен (витравен), первый модифицированный антисмысловой олигонуклеотид с фосфоротиоатным (PS) остовом, одобренный FDA для лечения цитомегаловирусного ретинита у пациентов с ВИЧ с ослабленным иммунитетом (Stein С.A., Castanotto D. Одобренная FDA терапия олигонуклеотидами в 2017 г. Mol. тер. 2017; 25: 1069-1075. doi: 10.1016/j.ymthe.2017.03.023.). Фомиверсен активно применялся первые три года, а затем был снят с производства из-за неточного механизма действия. В частности, одним из его недостатков было то, что оспаривалась роль РНКазы Н в антисмысловом эффекте, низкой степени эффекта.

В качестве аналога выбраны антисмысловые олигонуклеотиды в качестве противовирусных средств против коронавирусов SARS (Shi Y., Luo Н., Jia J., Xiong J., Yang D., Huang В., Jin Y. Antisense downregulation of SARS-CoV gene expression in Vero E6 cells. J. Gene Med. 2005; 7: 97-107. doi: 10.1002/jgm.640.), было обнаружено несколько хороших целевых участков для антисмыслового подавления экспрессии гена SARS-CoV. Результаты показали специфичный для последовательности подавляющий эффект антисмысловых олигонуклеотидов PS (20mer) в клетках Vero Е6, и установлен диапазон концентраций, при которых антисмысловые олигонуклеотиды ингибировали экспрессию генов Е, М и N SARS-CoV. в зависимости от концентрации.

Недостатком такого вещества являются ограничивающее применение антисмысловых олигонуклеотидов в применениях in vivo из-за проблем чувствительности к нуклеазам и более низкого клеточного поглощения.

В качестве прототипа выбран способ получения антисмысловых олигонуклеотидов, нацеленные на структурно консервативные области РНК SARS-CoV-2 (ORF1 и N). Проводились исследования и эксперименты in vitro на клеточной линии человека Huh7.5.1, обеспечивающих примерно 50% снижении выхода РНК SARS-CoV-2 в обработанных клетках (Hasan М.М., Ragnarsson L., Cardoso F.C., Lewis RJ. Transfection Methods for High-Throughput Cellular Assays of Voltage-Gated Calcium and Sodium Channels Involved in Pain. Res. Gate. 2021; 16: e0243645. doi: 10.1371/journal.pone.0243645). Они разработали антисмысловые олигонуклеотиды, нацеленные на структурно консервативные области РНК SARS-CoV-2 (ORF1 и N), которые снижали коэффициент вирусной инфекции на 50% в линии клеток человека Сасо-2, полученной из клеток карциномы толстой кишки человека. Клетки трансфицировали антисмысловыми олигонуклеотидами с использованием липофектамина; механизм трансфекции включает образование катионных липосом, которые обеспечивают интернализацию анионных антисмысловых олигонуклеотидов. Затем при контакте с клеточной мембраной липосомы создавали эндосомы, которые проникали внутрь клетки. Инновационный in silico инструмент, предложенный для дизайна антисмысловых олигонуклеотидов, успешно нацеливался на различные области быстро развивающегося вирусного генома и снижал выход вируса и инфекцию.

Недостатком прототипа является тот факт, что такие разработанные вакцины имели короткосрочный эффект из-за множественных мутаций в геноме вируса, особенно в области шипа. Таким образом, целевые области антисмысловых олигонуклеотидов могут измениться, что приведет к несоответствию между последовательностями, и приведет к снижению их эффективности.

Инновационный подход к созданию вакцин в виде аденовирусных векторов и мРНК-вакцин оказался относительно успешным в профилактике тяжелых форм заболевания и снижении смертности. Однако эффективность этих вакцин сильно зависит от частоты встречаемости различных подтипов вирусов и появления новых.

Задачей изобретения является создание новых, безопасных и эффективных платформ для производства вакцин, способных гибко изменяться и адаптироваться к новым подтипам РНК-вирусов. Появлению новых эффективных платформ для создания противовирусных вакцин во многом способствует развитие вирусных геномных баз данных и совершенствование методов синтеза нуклеиновых кислот.

Поставленная задача решается следующим образом:

Способ моделирования воспалительной реакции у мышей, включает иммунизацию мышей олигонуклеотидной конструкцией на основе последовательностей SB: 5'-CCCCCGGGGGAACACAGGCAGGCAGGCAGGACCCCCCGGGGGAACGCCAACGCC-3';

ВВ: 5'-CCCCCGGGGGCCCCAGGGAGACCAAAAGCACCAGCCCCCGGGGGAACGCCAACGCC-3', полученных путем синтеза антисмысловых последовательностей олигонуклеотидов, где в первый день осуществляют первую иммунизацию мышей, а вторую иммунизацию мышей производят на 14 сутки с концентрацией олигонуклеотидной конструкции 17-117 нг/мкл и молекулярной массой от 15000 до 20000 г/моль.

Общими с прототипами признаками являются использование определенной аминокислотной последовательности.

Отличительные признаки

- Способ включает воздействие биологической молекулой, основанной на искусственном синтезе, вакцина основана на искусственном синтезе, антисмыслового фрагмента вируса гриппа;

- Способ включает разработку вакцинной конструкции с мотивами CpG, которая поможет иммунной системе человека обучиться воспалительной реакции в отсутствие реального патогена и реальной опасности.

Совокупность признаков изобретения обеспечивает изобретательский уровень технического решения.

Способ реализуется следующим образом.

Синтезированные олигонуклеотиды являются полными аналогами природных молекул ДНК. Был осуществлен пробный синтез разработанных последовательностей для оценки доступности в параметрах производительности ДНК-синтезатора ASM-800E с использованием стандартного фосфорамидитного метода синтеза, используя в качестве сульфирующего реагента 3-((N,N-диметил-аминометилиден)амино)-3Н-1,2,4-дитиазол-5-тион (ДДТТ). Защитная группа DMT удаляется раствором 3% трихлоруксусной кислоты в хлористом метилене. Образующийся диметокситрильный катион оранжевого цвета вымывается из системы. В результате образуется закрепленный на твердофазном носителе предшественник олигонуклеотида за свободной 5'-гидроксильной группой. Раствор нуклеозидного фосфорамидита 0,1 М в абсолютном ацетонитриле активируют 0,25 М раствором кислотного катализатора 2-этилтиотетразола в сухом ацетонитриле. Смещение компонентов происходит в коммуникационных линиях синтезатора в процессе доставки реагентов в колонку, содержащей твердофазный носитель. Активированный амидофосфит в избытке вводится во взаимодействие с 5'-гидроксильной группой, образуя фосфотриэфирную связь. После завершения реакции избыток реагентов и побочные продукты удаляются из реактора промыванием ацетонитрилом. После завершения стадии конденсации небольшая доля 5'-гидроксильных групп (0,1-1%) остается не прореагировавшими и должна быть выведена из процесса дальнейшего удлинения цепи. С этой целью, оставшиеся гидроксильные группы защищаются ацильными группами, устойчивыми к действию растворов кислот, используемых для снятия DMT-защиты. Кэпирование проводится путем обработки твердофазного носителя растворами пропионового ангидрида и 1-метилимидазола в качестве катализатора. Полученная в результате конденсации межнуклеозидная трехкоординированная фосфитная группа обладает ограниченной стабильностью в условиях синтеза. Обработка носителя ДДТТ в пиридине окисляет фосфит в тиофосфатную группу. Синтетический цикл, включающий описанные стадии, повторяется необходимое число раз для достижения требуемой длины олигонуклеотида. Синтез осуществляется в направлении от 3'- к 5'-концу. После завершения всех циклов синтеза требуется снятие полученного целевого олигонуклеотида с твердофазного носителя, удаление защитных групп в течение ночи при 55°С в концентрированном растворе аммиака и последующая очистка при помощи ВЭЖХ.

Очистку синтезированной вакцины осуществляли при помощи высокоэффективной жидкостной хромотографии с обращенной фазой (ОФ-ВЖЭХ) выполняли на колонке Jupiter 5 μm C18 300 А (4,6 мм × 250 мм) с использованием препаративной системы ВЖЭХ (Azura Р6.1 L, детектор UVD 2.S). Для очистки использовали буферы: (А) 0,1 М ацетата триэтиламмония в воде, (В) 50% MeCN/буфер А. Градиент 30%. Поток 1 мл/мин. После сбора целевой фракции, содержащей очищенную вакцину, ее упаривали до сухого состояния на ротационном испарителе Concentrator Plus (Eppendorf, Германия) под вакуумом для удаления растворителя и буфера, который также является летучим соединением.

Концентрированной формой препарата являются полученные синтезированные высушенные олигонуклеотиды.

Произведенную вакцину следует хранить при температуре - от 2 до 25 градусов Цельсия месте, куда не попадают прямые солнечные лучи (в жидком и сухом, порошкообразном виде). Упаковка для хранения препарата не должна будет сорбировать ДНК и пропускать ультрафиолет.

Транспортировка готовой вакцины должна осуществляться в сухом виде (порошкообразный продукт) в соответствии с Санитарными правилами СП3.3.2. 028-95, при -2-25 градусов Цельсия.

Разработанная вакцина против гриппа основана на лассоподобной конструкции фосфоротиоатных олигонуклеотидов, содержащих CpG-мотивы и антигенпрезентирующую уникальную последовательность (APUS).. В предлагаемой конструкции основную роль антигенпрезентирующей части вакцины будут играть фосфоротиоатные олигонуклеотиды.

Фосфоротиоатные олигонуклеотиды, содержащие немостиковую серу, являются наиболее широко изученными олигонуклеотидами; по сравнению с немодифицированными олигонуклеотидами они обладают более высокой растворимостью и стабильностью к нуклеазам, с улучшенным проникновением через мембрану.

Для применения олигонуклеотидов в качестве антисмысловых препаратов, планируется их модифицировать таким образом, чтобы сохранить или улучшить их способность комплементарно связываться с геномами вирусов.

Нуклеиновые кислоты РНК-вирусов содержат протяженные, высококонсервативные участки, практически не меняющиеся во времени, которые представляют собой идеальную мишень для терапевтических разработок. До сих пор не удалось поразить цель, потому что концепция была плохо изучена. Однако олигонуклеотиды на протяжении десятилетий действуют как превосходные адъюванты, и накапливается все больше и больше данных о том, что они также могут быть антигенами.

Пример 1

Синтезируют последовательности неизменных частей генома данных вирусов:

, воздействуют на объекты с концентрацией олигонуклеотидной вакцины - 17 нг/мкл, молекулярная масса - 15000 г/моль, подкожно. Исследована безопасность вакцины на модельных животных (мыши), это подтверждается весовыми показателями; отсутствием смертности; биохимическими показателями сыворотки крови.

Синтезированные антисмысловые одноцепочечные последовательности олигонуклеотидов были апробированы в лабораторных условиях на модельных животных (мышах) для изучения воздействия антисмысловых олигонуклеотидов на организм. Преимущество состоит еще в том, что синтез ДНК становится все более недорогим, а комбинация азотистых оснований в каждом отдельном ДНК-олигонуклеотиде уникальна и обеспечивает безопасность для нецелевых клеток.

Олигонуклеотидную вакцину против вируса гриппа (подкожного и интраназального введения) исследовали на беспородных белых мышах в двухкратной повторности эксперимента с разными концентрациями. Животные были разделены на 3 группы (1 - контроль, 2 - с подкожным введением вакцины, 3 - с интраназальным введением вакцины), каждая из которых состояла из 10 особей. Двум группам, в качестве целевого исследования, была введена вакцина в объеме: для интраназального введения - 25 мкл/мышь с буфером для разведения NaCl; для подкожного введения - 100 мкл/мышь с использованием буфера для разведения NaCl. Концентрация препарата при первом эксперименте, измеренная на NanoDrop, составляет 17 нг/мкл, при втором эксперименте – 117 нг/мкл.

В первый день эксперимента была произведена первая иммунизация вакциной (1 доза) подкожно: 100 мкл на особь с использованием буфера для разведения NaCl. Для интраназального введения - 25 мкл/мышь с буфером для разведения NaCl. Взвешивание производили с 1 по 21 день ежедневно. Вторая иммунизация вакциной модельных животных была произведена на 14 сутки.

На протяжении всего эксперимента проводился учет массы тела модельных животных.

После введения 1 дозы вакцины отмечается прирост массы тела у всех трех групп, с незначительным снижением массы в интраназальной группе. После получения 2 дозы (на 14-й день) - у группы подкожного введения идет снижение массы тела. Полученные данные дают основание полагать, что животные таким образом реагируют на введение вакцины. На это указывает снижение массы тела. На 7 сутки эксперимента отмечены показатели прироста массы тела больше всего у группы контроля (32,7 г).

На 28 день была взята кровь из вены, расположенной под челюстью мыши с помощью скарификатора (около 200 мкл у каждой особи). Манипуляция осуществляется данным образом: производится фиксация мыши одной рукой за складку кожи на холке большим и указательным пальцем и удерживание хвоста сомкнутыми безымянными пальцами и мизинцем.

Образцы сыворотки крови подготавливали для дальнейшего биохимического анализа по таким показателям: ALAT (Аланинаминотрансфераза), ASAT (Аспартатаминотрансфераза), ALP (щелочная фосфатаза), UREA (Мочевина), CREA (Креатинин), TP (общий белок).

Подготовленные образцы, калибратор и контроли устанавливали в соответствующие позиции в приборе биохимического анализатора. После выполнения необходимых процедур контроля качества и калибровки, дальнейшим шагом будет регистрация образцов и запуск прибора. Полученные данные отображены в Таблице 1 с указанием среднего значения и ошибки среднего.

Вирус гриппа (Influenzavirus) является одним из самых серьезных вирусов среди инфекционных агентов, поскольку он склонен к антигенному дрейфу и сдвигу с целью изменения генетического материала. Перспективным методом решения проблем с инфекцией и самой болезнью является вакцина, которая будет иметь большую продолжительность действия, учитывая ежегодные мутации самого вируса.

Исследования показали, что олигонуклеотиды могут повышать эффективность вакцин, индуцируя модификацию антигена для усиления экспрессии иммуногенных молекул и воздействуя на определенные компоненты иммунной системы хозяина для достижения иммунного ответа.

В результате исследования был создан дизайн олигонуклеотидной вакцины с использованием биоинформатических инструментов (программа BLAST, RNA fold).

Разработаны условия твердофазного синтеза олигонуклеотидной вакцины на автоматических ДНК-синтезаторах типа ASM-800E, POLYGEN).

Разработана схема эффективной очистки синтезированной олигонуклеотидной вакцины с помощью препаративного ВЭЖХ Azura.

Исследована безопасность вакцины на модельных животных (мыши).

Похожие патенты RU2823685C1

название год авторы номер документа
Способ получения олигонуклеотидной вакцины против вируса SARS-Cov-2 2023
  • Юрченко Ксения Андреевна
  • Оберемок Владимир Владимирович
  • Юрченко Алёна Андреевна
RU2824405C1
Рекомбинантный вакцинный штамм для живой интраназальной вакцины, обеспечивающей сочетанную профилактику гриппозной и коронавирусной инфекций 2022
  • Исакова-Сиван Ирина Николаевна
  • Степанова Екатерина Алексеевна
  • Меженская Дарья Андреевна
  • Матюшенко Виктория Аркадьевна
  • Руденко Лариса Георгиевна
RU2782531C1
Вакцина против COVID-19 на основе PIV5 2021
  • Хэ Бяо
RU2838536C1
Искусственный ген, кодирующий бицистронную структуру, образованную последовательностями рецептор-связующего домена гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2, P2A-пептида и гликопротеина G VSV, рекомбинантная плазмида pStem-rVSV-Stbl_RBD_SC2, обеспечивающая экспрессию искусственного гена и рекомбинантный штамм вируса везикулярного стоматита rVSV-Stbl_RBD_SC2, используемого для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2 2020
  • Иматдинов Ильназ Рамисович
  • Бочкарева Мария Дмитриевна
  • Прудникова Елена Юрьевна
  • Тишин Антон Евгеньевич
  • Пьянков Олег Викторович
  • Гаврилова Елена Васильевна
  • Максютов Ринат Амирович
RU2733831C1
Вакцина против гриппа типа А, гриппа типа B и COVID-19 2021
  • Лысенко Андрей Александрович
  • Седова Елена Сергеевна
  • Алексеева Светлана Викторовна
  • Щербинин Дмитрий Николаевич
  • Тутыхина Ирина Леонидовна
  • Верховская Людмила Викторовна
  • Артемова Элина Алексеевна
  • Шмаров Максим Михайлович
  • Народицкий Борис Савельевич
  • Логунов Денис Юрьевич
  • Гинцбург Александр Леонидович
RU2751485C1
Пептидные иммуногены, используемые в качестве компонентов вакцинной композиции против коронавирусной инфекции COVID-19 2020
  • Рыжиков Александр Борисович
  • Рыжиков Евгений Александрович
  • Богрянцева Марина Поликарповна
  • Гаврилова Елена Васильевна
  • Даниленко Елена Дмитриевна
  • Иматдинов Ильназ Рамисович
  • Максютов Ринат Амирович
  • Нечаева Елена Августовна
  • Попова Анна Юрьевна
  • Пьянков Олег Викторович
  • Пьянкова Ольга Григорьевна
  • Суслопаров Иван Михайлович
RU2743594C1
Вакцинная композиция против коронавирусной инфекции COVID-19 2020
  • Рыжиков Александр Борисович
  • Рыжиков Евгений Александрович
  • Богрянцева Марина Поликарповна
  • Гаврилова Елена Васильевна
  • Даниленко Елена Дмитриевна
  • Иматдинов Ильназ Рамисович
  • Максютов Ринат Амирович
  • Нечаева Елена Августовна
  • Попова Анна Юрьевна
  • Пьянков Олег Викторович
  • Пьянкова Ольга Григорьевна
  • Суслопаров Иван Михайлович
RU2743595C1
Пептидные иммуногены и вакцинная композиция против коронавирусной инфекции COVID-19 с использованием пептидных иммуногенов 2020
  • Рыжиков Александр Борисович
  • Рыжиков Евгений Александрович
  • Богрянцева Марина Поликарповна
  • Гаврилова Елена Васильевна
  • Даниленко Елена Дмитриевна
  • Иматдинов Ильназ Рамисович
  • Максютов Ринат Амирович
  • Нечаева Елена Августовна
  • Попова Анна Юрьевна
  • Пьянков Олег Викторович
  • Пьянкова Ольга Григорьевна
  • Суслопаров Иван Михайлович
RU2743593C1
Способ создания рекомбинантного штамма энтерококка L3-SARSN1 на основе биологически активного штамма Enterococcus faecium L3 2022
  • Суворов Александр Николаевич
  • Гупалова Татьяна Виталиевна
  • Леонтьева Галина Федоровна
  • Бормотова Елена Алексеевна
  • Крамская Татьяна Анатольевна
  • Дешева Юлия Андреевна
RU2820058C1
Пептидные иммуногены и вакцинная композиция против коронавирусной инфекции COVID-19 с использованием пептидных иммуногенов 2020
  • Рыжиков Александр Борисович
  • Рыжиков Евгений Александрович
  • Богрянцева Марина Поликарповна
  • Гаврилова Елена Васильевна
  • Даниленко Елена Дмитриевна
  • Иматдинов Ильназ Рамисович
  • Максютов Ринат Амирович
  • Нечаева Елена Августовна
  • Попова Анна Юрьевна
  • Пьянков Олег Викторович
  • Пьянкова Ольга Григорьевна
  • Суслопаров Иван Михайлович
RU2738081C1

Реферат патента 2024 года Способ моделирования воспалительной реакции у мышей

Изобретение относится к медицине, а именно к фундаментальным исследованиям в области биомедицинских технологий, и может быть использовано для моделирования воспалительной реакции у мышей. Производят иммунизацию мышей олигонуклеотидной конструкцией на основе последовательностей SB: 5'-CCCCCGGGGGAACACAGGCAGGCAGGCAGGACCCCC CGGGGGAACGCCAACGCC-3'; ВВ: 5'-CCCCCGGGGGCCCCAGGGA GACCAAAAGCACCAGCCCCCGGGGGAACGCCAACGCC-3', полученных путем синтеза антисмысловых последовательностей олигонуклеотидов. В первый день осуществляют первую иммунизацию мышей, вторую иммунизацию мышей производят на 14 сутки с концентрацией олигонуклеотидной конструкции 17-117 нг/мкл и молекулярной массой от 15000 до 20000 г/моль. Способ обеспечивает создание новых, безопасных и эффективных платформ для производства вакцин, способных гибко изменяться и адаптироваться к новым подтипам РНК-вирусов за счет иммунизации мышей олигонуклеотидной конструкцией на основе последовательностей, полученных путем синтеза антисмысловых последовательностей олигонуклеотидов. 2 табл., 1 пр.

Формула изобретения RU 2 823 685 C1

Способ моделирования воспалительной реакции у мышей, включающий иммунизацию мышей олигонуклеотидной конструкцией на основе последовательностей SB: 5'-CCCCCGGGGGAACACAGGCAGGCAGGCAGGACCCCC CGGGGGAACGCCAACGCC-3'; ВВ: 5'-CCCCCGGGGGCCCCAGGGA GACCAAAAGCACCAGCCCCCGGGGGAACGCCAACGCC-3', полученных путем синтеза антисмысловых последовательностей олигонуклеотидов, где в первый день осуществляют первую иммунизацию мышей, а вторую иммунизацию мышей производят на 14 сутки с концентрацией олигонуклеотидной конструкции 17-117 нг/мкл и молекулярной массой от 15000 до 20000 г/моль.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2024 года RU2823685C1

КОНСТРУКЦИЯ ДНК (ВАРИАНТЫ), ДНК-ВЕКТОР, ИММУНОГЕННАЯ КОМПОЗИЦИЯ ПРОТИВ ВИРУСА ГРИППА, СПОСОБ ИНДУКЦИИ ИММУННОГО ОТВЕТА, ВАКЦИНА И СПОСОБ ВАКЦИНАЦИИ 1994
  • Доннелли Джон Дж.
  • Дварки Варавани Дж.
  • Лиу Маргарет А.
  • Монтгомери Донна Л.
  • Паркер Сьюзанн Е.
  • Шивер Джон В.
  • Алмер Джеффри Б.
RU2193065C2
RU 2005136233 A, 10.06.2006
WO 2020245722 A1, 10.12.2020
БОЙЦОВ С.А
и др
Исследование эффективности и безопасности вакцинопрофилактики гриппа у пациентов с болезнями системы кровообращения
Профилактическая медицина
Способ защиты переносных электрических установок от опасностей, связанных с заземлением одной из фаз 1924
  • Подольский Л.П.
SU2014A1
ОНИЩЕНКО Г.Г
и др
Сравнительная характеристика существующих платформ для

RU 2 823 685 C1

Авторы

Андреева Оксана Андреевна

Новиков Илья Александрович

Даты

2024-07-29Публикация

2023-04-11Подача