Способ получения олигонуклеотидной вакцины против вируса SARS-Cov-2 Российский патент 2024 года по МПК A61K39/12 C12N7/00 

Изобретение относится к области медицины, фундаментальным исследованиям в области биомедицинских технологий.

Основной проблемой при создании противокоронавирусных вакцин, нацеленных преимущественно на белки внешней оболочки вируса, остается быстрая изменчивость РНК-генома возбудителя, кодирующего эти белки. Кроме того, требуется внедрение технологий, способных обеспечить доступное и быстрое производство гибких формул вакцин, легко адаптирующихся к появлению новых подтипов SARS-CoV-2. Некоторые разработки в этом направлении ведутся с целью использования консервативных участков РНК генома коронавируса в качестве антигенпрезентирующей части формулы вакцины с целью активации адаптивного иммунитета. Такого рода универсальные вакцины могут учитывать динамику быстрых изменений генома вируса, а также синтезироваться на автоматических ДНК-синтезаторах в больших количествах в короткие сроки.

Ведущие мировые фармацевтические компании приступили к разработке вакцины после того, как 11 января 2020 года была обнародована последовательность генома SARS-CoV-2 (Smith T.R.F., Patel A., Ramos S., Elwood D., Zhu X., Yan J., Gary E.N., Walker S.N., Schultheis K., Purwar M, et al. Immunogenicity of a DNA vaccine candidate. Nat. Commun. 2020; 11:2601). В настоящее время многие типы вакцин находятся в клинической или доклинической разработке. Коммерчески доступные вакцины включают белковые инактивированные вирусы, нереплицирующиеся вирусные векторы и вакцины на основе РНК. Среди всех упомянутых вакцин мРНК-вакцины проявляют наибольшую эффективность, в то время как все вакцины кажутся защитными и безопасными.

Проводились исследования эффективности вакцины против вирусной инфекции, иммунизированных золотистых сирийских хомячков заразили SARS-CoV-2. Иммунизировали ДНК-вакциной три раза каждые 2 недели (14 дней) и заражали вирусом SARS-CoV-2 интраназально. После заражения вирусом каждый день измеряли массу тела, поскольку мониторинг массы тела можно использовать в качестве параметра тяжести инфекции (Smith T.R.F., Patel A., Ramos S., Elwood D., Zhu X., Yan J., Gary E.N., Walker S.N., Schultheis K., Purwar M., et al. Immunogenicity of a DNA vaccine candidate. Nat. Commun. 2020; 11:2601). В контрольной группе хомячки потеряли массу тела к 6 дню после заражения, но не в группе, вакцинированной ДНК. Затем специфические антитела к SARS-CoV-2 оценивали на 2, 4, 7 и 14 день после заражения с помощью ELISA. Антитела против спайков RBD были выше по сравнению с контрольной группой с инфекцией SARS-CoV-2 при 7 pdi. Антинуклеокапсидные антитела не различались между контрольной и вакцинированной группами. Количество РНК вируса SARS-CoV-2 в легких оценивали с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Уровни вРНК были повышены на 2 и 4 днях в контрольной группе с инфекцией SARS-CoV-2. Однако ДНК-вакцина значительно подавляла уровень вРНК в легких. Затем также измеряли тканевые вирусные нагрузки в легких при 4 pdi с помощью анализа дозы инфицирования тканевой культуры. Вирусная нагрузка была подавлена в группе вакцинированных ДНК, но не в контрольной группе. ДНК-вакцина подавляла воспаление, связанные с вирусной инфекцией цитокины, такие как IL10 и IFNγ, а ДНК-вакцина имела тенденцию к снижению воспалительных цитокинов, TNFα, IL6 (рис. S8c-S8f). Наконец, патологическая оценка также была снижена в вакцинированной группе. Эти данные свидетельствуют о том, что ДНК-вакцина SARS-CoV-2 защищает хомяков от инфекции COVID-19.

Действительно, разрешенные в настоящее время мРНК-вакцины для экстренного применения, такие как BNT162b2, разработанные BioNTech/Pfizer, и мРНК-1273, разработанные Moderna, обеспечивают 95-процентную и 94,5-процентную эффективность профилактики инфекции соответственно. Что касается вакцин, не основанных на мРНК, AstraZeneca объявила об эффективности 70%, в то время как Sinopharm показала эффективность 79% (Chan J.F., Zhang A.J., Yuan S. Simulation of the clinical and pathological manifestations of coronavirus disease 2019 (COVID-19) in a golden Syrian hamster model: implications for disease pathogenesis and transmissibility. Clin Infect Dis. 2020;71(9):2428-2446.) Кроме того, в фазе 1-4 клинических испытаний находится огромное количество вакцин против COVID-19 на основе цельных вирионов, вирусных векторов, нуклеиновых кислот и рекомбинантных белков. Тем не менее, несмотря на наличие и доступность вакцин против SARS-CoV-2 (Tostanoski L.H., Wegmann F., Martinot A.J. Ad26 vaccine protects against SARS-CoV-2 severe clinical disease in hamsters. Nat Med. 2020;26(11):1694-1700), потребность в большем количестве высокоэффективных и безопасных вакцин остается актуальной для окончательной борьбы с этим инфекционным заболеванием.

Используя неонатальную мышиную модель респираторно-синцитиального вируса (RSV), Ripple et al. оценивали, будет ли локальное ингибирование экспрессии IL-4Rα с использованием антисмысловых олигонуклеотидов, специфичного для IL-4Rα, во время первичной инфекции RSV предотвращать Th2-зависимые ответы на вторичную инфекцию RSV и улучшать функцию легких в долгосрочной перспективе. Мышей первоначально заражали РСВ через одну неделю после рождения и повторно заражали в возрасте шести недель. Интраназальное введение IL-4Rα АСО при первичной инфекции RSV не препятствует элиминации вируса; однако лечение АСО устранило легочную дисфункцию, обычно наблюдаемую после повторного заражения у взрослых, со значительным ответом по сравнению с необработанными мышами (Batista-Duharte, A.; Sendra, L.; Herrero, M.J.; Tellez-Martinez, D.; Carlos, I.Z.; Alino, S.F. Progress in the Use of Antisense Oligonucleotides for Vaccine Improvement. Biomolecules 2020,10, 316).

В качестве прототипа, был выбран способ исследования антисмысловых олигонуклеотидов нацеленных на 5'-ли дерную последовательность, нижележащие последовательности в 5'-нетранслируемой области (UTR) ORFla/b и FSE ORF1a/b SARS-CoV-2. Для оценки репрессивного действия LNA АСО на вирусы был проведен первоначальный скрининг клеток гепатомы человека Huh-7, которые демонстрируют превосходную эффективность трансфекции и легко инфицируются SARS-CoV-2. Клетки, трансфицированные LNA АСО, были инфицированы SARS-CoV-2, и клетки и среда были собраны через 48 часов после заражения (hpi) для выделения РНК и определения инфекционных вирусных частиц соответственно. Титр вируса измеряли путем определения уровня экспрессии/количества копий вируса. Для исследования эффектов 5’-АСО#26 in vivo, оценивали доставку 5’-АСО#26 в легкие мышей после интраназального введения. Соответственно, не было обнаружено обогащения нейтрофилами или макрофагами ни в жидкости бронхоальвеолярного лаважа. Поскольку АСО LNA были гэпмерами 23, 24 и 5'-АСО#26 является миксмером, отсутствие иммуностимулирующих эффектов 5'-АСО#26 может быть связано с более низкой иммуногенностью миксмеров LNA АСО, возможно, в дополнение к эффектам, зависящим от последовательности. В целом, эти результаты подтверждают неиммуногенность и безопасность интраназально доставляемых миксмерных LNA АСО. (Qiao Y, Wotring JW, Zhang CJ, Jiang X, Xiao L, Watt A, Gattis D, Scandalis E, Freier S, Zheng Y, Pretto CD, Ellison SJ, Swayze EE, Guo S, Sexton JZ, Chinnaiyan AM. Antisense oligonucleotides to therapeutically target SARS-CoV-2 infection. PLoS One. 2023 Feb 3;18(2):e0281281).

Недостатками этого метода являются медленный цикл производства вакцины, их-за большого количества исследуемых объектов и отсутствие иммунностимуляции.

Задачей заявленного решения является способ получения олигонуклеотидной вакцины против вируса SARS-Cov-2.

Посталенная задача решается следующим образом.

Способ получения олигонуклеотидной вакцины против вируса SARS-Cov-2, включает фосфорамидитный синтез тиофосфатной олигонуклеотидной конструкции, содержащей антигенпрезентирующую часть и адъювантную часть, представленную CpG-островками внутри конструкции, длиной 57 нуклеотидов Lasso-1 5'- CCCCGGGGGGCAGAGACAGAAGAAACAGCAAACCCCCCGGGGGAACGCCAACGCCT-3', при этом в качестве сульфурирующего реагента используют 3-((N,N-диметиламинометилиден)амино)-3Н-1,2,4-дитиазол-5-тион, защитная группа DMT удаляется раствором 3% трихлоруксусной кислоты в хлористом метилене, раствор нуклеозидного фосфорамидита в абсолютном ацетонитриле активируют 2-этилтиотетразолом в сухом ацетонитриле, кэпирование проводится путем обработки твердофазного носителя растворами пропионового ангидрида и 1 -метилимидазола в качестве катализатора, после снятия полученного целевого олигонуклеотида с твердофазного носителя, защитные группы удаляются в течении ночи при 55°С в концентрированном растворе аммиака, после синтеза осуществляют очистку при помощи вэжх.

Общими с прототипом признаками являются:

- олигонуклеотидная вакцина против вируса SARS-Cov-2. Отличительными признаками являются

- олигонуклеотидные вакцины типа La-S-so с CpG-мотивом.

Инновационность разработки заключается в том, что в тиофосфатной олигонуклеотидной вакцине есть участки - CpG-мотивы которые улучшают функцию антигенпрезентирующих клеток и стимулируют генерацию гуморальных и клеточных вакцин-специфических иммунных ответов, что обеспечивает соответствие изобретения признаку «изобретательский уровень».

Преимуществом является, то, что в наших исследованиях олигонуклеотидная вакцина увеличивала выживаемость животных, инфицированных SARS-CoV-2, а также уменьшала разрушительное воздействие вируса на ткани мышей. Полученные первичные результаты показывают перспективность разработки вакцинных конструкций типа La-S-so для профилактики коронавирусных инфекций, в том числе вызванных SARS-CoV-2.

Способ получения осуществляют следующим образом.

Вакцина была синтезирована на приборе ASM-800 с использованием стандартного фосфорамидитного метода синтеза, используя в качестве сульфурирующего реагента 3-((N, М-диметиламинометилиден)амино)-3Н-1,2,4-дитиазол-5-тион (ДДТТ). Защитная группа DMT удаляется раствором 3% трихлоруксусной кислоты в хлористом метилене. Образующийся диметокситритильный катион оранжевого цвета вымывается из системы. В результате образуется закрепленный на твердофазном носителе предшественник олигонуклеотида со свободной 5'гидроксильной группой. Раствор нуклеозидного фосфорамидита 0,1 М в абсолютном ацетонитриле активируют 0,25 М раствором кислотного катализатора 2-этилтиотетразола в сухом ацетонитриле. Смешение компонентов происходит в коммуникационных линиях синтезатора в процессе доставки реагентов в колонку, содержащей твердофазный носитель. Активированый амидофосфит в избытке вводится во взаимодействие с 5'гидроксильной группой, образуя фосфотриэфирную связь. После завершения реакции избыток реагентов и побочные продукты удаляются из реактора промыванием ацетонитрилом. После завершения стадии конденсации небольшая доля 5'-гидроксильных групп (0, 94) остается не прореагировавшими и должна быть выведена из процесса дальнейшего удлинения цепи. С этой целью, оставшиеся гидроксильные группы защищаются ацильными группами, устойчивыми к действию растворов кислот, используемых для снятия Т4Т-защиты. Кэпирование проводится путем обработки твердофазного носителя растворами пропионового ангидрида и 1 -метилимидазола в качестве катализатора. Полученная в результате конденсации межнуклеозидная трехкоординированная фосфитная группа обладает ограниченной стабильностью в условиях синтеза. Обработка носителя ДДТТ в пиридине окисляет фосфит в тиофосфатную группу. Синтетический цикл, включающий описанные стадии, повторяется 57 раз для достижения требуемой длины олигонуклеотида. Синтез осуществляется в направлении от 3'- к 5'-концу. После завершения всех циклов синтеза требуется снятие полученного целевого олигонуклеотида с твердофазного носителя, удаление защитных групп в течение ночи при 55°С в концентрированном растворе аммиака и последующая очистка при помощи вэжх.

Очистку синтезированной вакцины осуществляли при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (ОФВЭЖХ) выполняли на колонке Jupiter С18 300 А (4.6 мм х 250 мм) с использованием препаративной системы ВЭЖХ (Azura Рб. 1 L, детектор UVD 2. 1S). Для очистки использовали буферы: (А) М ацетата триэтиламмония в воде, (В) 5094 МеСМбуфер А. Градиент 300/0. Поток 1 мл/мин. После сбора целевой фракции содержащей очищенную вакцину ее упаривали до сухого состояния на ротационном испарителе под вакуумом для удаления растворителя и буфера, который также является летучим соединением.

Произведенную вакцину следует хранить при температуре - от 2 до 25 градусов Цельсия в месте, куда не попадают прямые солнечные лучи (в жидком и сухом, порошкообразном виде). Упаковка для хранения препарата не должна будет сорбировать ДНК и пропускать ультрафиолет. Сравнительно небольшое количество активного вещества, необходимого для достижения эффекта, будет составлять около 4-5 мг. Транспортировка вакцины должна осуществляться в сухом виде (порошкообразный продукт) в соответствии с Санитарными правилами СП З.З. 2. 028-95, при -2-25 градусов Цельсия.

Готовую олигонуклеотидную вакцину можно будет вводить двумя способами: подкожно и интраназально в количестве дозы 5 мг/человека. Кратность применения препарата - 2 раза, с интервалом в 2 недели.

В ходе проведенных исследований обнаружено снижение массы животных зараженного контроляна восьмые сутки эксперимента по сравнению с особями из групп, где проводилась вакцинация. Снижение массы тела является неспецифическим признаком при вирусных заболеваниях, включая SARS-Cov-2. Можно сделать вывод, что примененные четыре конструкции олигонуклеотидной вакцины типа La-S-so смогли уберечь животных от потери массы тела, что согласуется с данными органометрических показателей легких мышей.

В группах с применением вакцины сроки начала заболевания не отличались, манифестация болезни была выраженной, однако в среднем гипертермия была ниже на 1,2°С, быстрее происходило восстановление клинического состояния животных.

Гистохимические исследования показали сходную с органометрическими показателями картину. Анализ морфометрических данных показал достоверные изменения площади различных участков легкого. Динамика выявлена при изучении трех параметров срезов ткани: площадей отека, сосудов и просвета альвеол. Межальвеолярный и периваскулярный отек во всех группах становится достоверным на 5-е сутки, но уменьшается на 10-е сутки и спадает к 30-м суткам, его площадь становится достоверно ниже относительно ранних сроков заболевания. Полнокровие и площадь сосудов наиболее выражены в группе с интраназальным введением вакцины. В начале болезни на 5-е сутки во всех группах наблюдается наибольшая дилатация капилляров, их полнокровие. На 10-е сутки в группе без лечения и с лечением примерно у половины животных отмечали альвеолярно-геморрагический синдром. Площадь просвета альвеол у животных значительно снижается за счет дистлектаза и ателектаза на 10-е сутки болезни во всех группах, кроме группы с интраназальным введением вакцины. Именно этот показатель является ключевым, на наш взгляд, поскольку он максимально выражен в группе без лечения и клинически сопровождается летальностью, отмеченной только в этой группе.

Применение интраназальной вакцины показало наилучший эффект при оценке морфологии легких экспериментальных животных. На начальных стадиях (до 5 суток) течение болезни оказалось более острым, чем в других группах и сопровождалось значительным отеком в межальвеолярных перегородках и паравазальной области, лимфоидной инфильтрацией, участками ателектаза. На 10-е сутки отек стал менее заметен, однако наблюдалось очаговое полное или частичное спадение альвеол. Сосуды по-прежнему оставались полнокровными, выявлены единичные кровоизлияния. К 30-м суткам отек не выявлен, однако- межальвеолярные перегородки оставались утолщенными за счет лимфоидной инфильтрации и пролиферации выстилающих клеток.

Технология производства олигонуклеотидных вакцин предусматривает более быстрый цикл производства по сравнению с инактивированными и субъединичными вакцинами, поскольку отсутствует необходимость культивирования клеток и их заражения для получения биомассы вирусных частиц. По расчетам в два раза уменьшается время на производство олигонуклеотидной вакцины по сравнению с другими имеющимися платформами.

Инновационность разработки заключается в том, что в тиофосфатной олигонуклеотидной вакцине есть участки - CpG-мотивы которые улучшают функцию антиген-презентирующих клеток и стимулируют генерацию гуморальных и клеточных вакцин-специфических иммунных ответов.

Изобретение относится к области медицины. Описан способ получения олигонуклеотидной вакцины против вируса SARS-Cov-2, включающий тиофосфатную конструкцию олигонуклеотидной вакцины типа La-S-so, содержащую антигенпрезентирующую часть и адъювантную часть, представленную CpG-островками внутри конструкции, длиной 57 нуклеотидов Lasso-1

5'-CCCCGGGGGGCAGAGACAGAAGAAACAG

CAAACCCCCCGGGGGAACGCCAACGCCT-3'. Изобретение позволяет ускорить процесс производства олигонуклеотидных вакцин. По расчетам в два раза уменьшается время на производство олигонуклеотидной вакцины по сравнению с другими имеющимися платформами.

Способ получения олигонуклеотидной вакцины против вируса SARS-Cov-2, включающий фосфорамидитный синтез тиофосфатной олигонуклеотидной конструкции, содержащей антигенпрезентирующую часть и адъювантную часть, представленную CpG-островками внутри конструкции, длиной 57 нуклеотидов Lasso-1 5'-CCCCGGGGGGCAGAGACAGAAGAAACAGCAAACCCCCCGGGGGAACGCCAACGCCT-3', при этом в качестве сульфурирующего реагента используют 3-((N,N-диметиламинометилиден)амино)-3Н-1,2,4-дитиазол-5-тион, защитная группа DMT удаляется раствором 3% трихлоруксусной кислоты в хлористом метилене, раствор нуклеозидного фосфорамидита в абсолютном ацетонитриле активируют 2-этилтиотетразолом в сухом ацетонитриле, кэпирование проводится путем обработки твердофазного носителя растворами пропионового ангидрида и 1-метилимидазола в качестве катализатора, после снятия полученного целевого олигонуклеотида с твердофазного носителя защитные группы удаляются в течение ночи при 55°С в концентрированном растворе аммиака, после синтеза осуществляют очистку при помощи ВЭЖХ.