Область техники
[0001] Настоящее изобретение относится к соединениям, которые можно использовать в качестве зондов на основе активности и/или ингибиторов нейтрофильной эластазы, способам детектирования активности нейтрофильной эластазы и связанным диагностическим способам.
Уровень техники
[0002] Согласно Lechtenberg et al., ACS Chem. Biol. 2015, 10, 945-951, «протеазы являются центральными медиаторами многочисленных физиологических процессов». События протеолитического расщепления лежат в основе деградации белка, активации ферментов и созревания белка и регулируют широкий спектр путей от гибели, миграции и пролиферации клеток, воспаления и иммунного ответа, до свертывания крови (Rawlings N. D. and Salvesen G. (2012)). С другой стороны, аберрантный протеолиз часто связан с серьезными нарушениями. Кроме того, протеазы обычно экспрессируются в клетке или секретируются в виде неактивных зимогенов, которые нуждаются в активации посредством таких процессов, как протеолитическое расщепление или димеризация. Активация протеаз лежит в основе жесткой временной и пространственной регуляции, и, таким образом, обычно расположение протеазы не является идеальным маркером функции протеазы. Напротив, пространственно-временное расположение активной формы данной протеазы необходимо для понимания ее функции. С этой целью были разработаны зонды, основанные на активности, для различных протеаз (Deu E., Verdoes M. and Bogyo M. (2012)). Данные зонды сконструированы в виде ингибиторов протеаз, взаимодействующих с активными центрами, для того, чтобы специфически метить активную протеазу, и, таким образом, они являются эффективными инструментами для исследований и диагностики. Кроме того, эти зонды дополнительно открывают путь для разработки сильных ингибиторов выбранных протеаз для потенциального терапевтического применения (Deu et al., Nat. Struct. Mol. Biol. (2012))». Lechtenberg et al. далее описывают нейтрофильную эластазу (NE) в качестве «яркого примера желательной, но сложной мишени для разработки зонда, основанного на активности».
[0003] NE является сериновой протеазой, которая представляет собой протеазу, использующую остаток серина в своем активном центре в качестве нуклеофильной аминокислоты для протеолиза, обнаруженной в азурофильных гранулах нейтрофилов (Korkmaz et al., Pharmacol. Rev. (2010)). Во время инфекции активная NE способствует уничтожению внутриклеточных патогенов, расщепляя микробные белки (Korkmaz et al., Pharmacol. Rev. (2010); Kobayashi et al., Arch. Immunol. Ther. Exp. (2005)). Мыши, лишенные NE, более восприимчивы к бактериальным и грибковым инфекциям (Reeves et al., Nature (2002)). NE также опосредует воспаление, процессируя цитокины, хемокины и факторы роста (Korkmaz et al., Pharmacol. Rev. (2010)). Кроме того, NE расщепляет внеклеточные N-концы рецепторов, активируемых протеазой (PAR), семейства рецепторов, связанных с G-белком (GPCR), с инициацией клеточных сигнальных событий, которые приводят к воспалению и боли (Jimenez-Vargas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (2018)); Lieu et al., Brit. J. Pharmacol. (2016); Zhao et al., J. Biol. Chem. (2015)). NE также может способствовать разрушению тканей за счет расщепления компонентов внеклеточного матрикса. Все более очевидным становится тот факт, что активность NE повышается при раке молочной железы, предстательной железы, толстой/прямой кишки и легких (Lerman & Hammes. Steroids (2018)). NE также участвует в развитии хронических обструктивных болезней легких (Demkow & Overveld Eur. J. Med. Res. (2010)) и инфекции легких (Polverino et al., Chest (2017)), например, включая инфекции, вызванные Legionella (Narita et al. Nihon Kokyuki Gakkai Zasshi (2007)).
[0004] Помимо своей роли в развитии инфекции и рака, недавно было установлено, что NE вовлечена в патогенез воспалительных заболеваний кишечника (IBD), которые характеризуются хроническим и рецидивирующим воспалением в желудочно-кишечном тракте (Edgington-Mitchell. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. (2015)). IBD включает язвенный колит (UC) и болезнь Крона (CD), которые оба ассоциируются с диареей, ректальным кровотечением, учащением позывов к дефекации и болью. У мышей, лишенных одной копии NE и родственной нейтрофильной сериновой протеиназы, протеиназы 3 (PR3), симптомы ослабляются на мышиных моделях колита (Motta et al., Gastroenterol. (2011)). Усиленная экспрессия элафина, эндогенного ингибитора сериновой протеазы, при введении аденовирусных векторов в толстую кишку или интродукции элафин-экспрессирующих молочнокислых бактерий, приводила к ослаблению симптомов колита на мышиных моделях (Motta et al. Gastroenterol. (2011)). Лечение селективным ингибитором NE также снижало симптомы колита (Morohoshi et al., J. Gastroenterol. (2006)). Биопсия слизистой оболочки толстой кишки у пациентов с IBD показывает повышенную экспрессию NE по сравнению со здоровым контролем как на уровне мРНК, так и на уровне белка (Kuno et al., J. Gastroenterol. (2002); Uchiyama et al., Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. (2012)).
[0005] Поскольку NE экспрессируется в виде неактивного зимогена и может жестко контролироваться эндогенными ингибиторами после активации, то измерение мРНК или общей экспрессии белка редко отражают пул активного функционального фермента (Edgington et al., Curr. Op. Chem. Biol. (2011)). Таким образом, инструменты для измерения специфической активности NE необходимы для более точного определения ее участия в патологиях.
[0006] Коммерчески доступные хромогенные и флуорогенные субстратные зонды, включая AAPV-p-нитроанилид и BODIPY-FL-эластин, соответственно, показали повышение эластазоподобной активности в биоптатах от пациентов с UC и CD и на мышиных моделях IBD (Gecse Ket al. (2008); Morohoshi et al. J. Gastroenterol. (2006); Motta et al., Sci. Trans. Med. (2012); Motta et al., Gastroenterol. (2011)). Однако у этих зондов не только отсутствует специфичность, но они могут расщепляться под действием многочисленных протеаз, присутствующих в тканях и образцах тканей (Edgington et al., Curr. Op. Chem. Biol. (2011); Edgington-Mitchell., Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. (2015)).
[0007] Зонд на основе флуоресцентной активности (ABP) для NE, Cy5-V-DPP, ранее использовался для отслеживания активации NE во время колита (Edgington-Mitchell et al., Bioorganic. Med. Chem. Lett. (2017)). Данный зонд содержал сульфонированный цианин 5(сульфоCy5)флуорофор и остаток валина P1, связанный с дифенилфосфонатным электрофилом (DPP; «активная группа»), который взаимодействует с серином активного центра активной NE ковалентным необратимым образом. В то время как Cy5-V-DPP эффективно метил рекомбинантную NE и эндогенную NE в очищенных клетках с высокой экспрессией (например, в костном мозге), недостаток чувствительности не привел к небольшому успеху в детектировании активности NE в тканях при колите.
[0008] Таким образом, существует потребность в зондах на основе активности NE, позволяющих детектировать активность NE в более сложных образцах, таких как лизаты тканей, например зонды, проявляющие устойчивость к расщеплению другими протеазами и/или достаточно высокую чувствительность для мечения NE и, таким образом, детектирования активности NE в лизатах тканей. Также существует потребность в способах, в которых используются эти зонды на основе активности для детектирования активности NE в лизатах тканей, для ингибирования NE в лизатах тканей и/или для диагностики субъекта с патологиями, в которых активность NE играет роль, тестированием тканевых лизатов.
[0009] Авторы настоящего изобретения обнаружили, что соединения-зонды на основе активности, как описано ниже, несущие детектируемый элемент, последовательность распознавания Nle(O-Bzl)-Met(O)2-Oic-Abu и активную группу DPP, можно использовать в качестве зондов на основе активности для детектирования активности NE в лизатах тканей. Соединения данной структуры, такие как зонд PK101 (содержащий биотиновую метку, линкер PEG, последовательность распознавания Nle(O-Bzl)-Met(O)2-Oic-Abu и активную группу DPP) и зонды серии PK10X (содержащие различные метки, линкер PEG, последовательность распознавания Nle(O-Bzl)-Met(O)2-Oic-Abu и активную группу DPP) до сих пор были описаны как обладающие эффективностью и специфичностью для NE в очищенных клетках (Kasperkiewicz et al., J. Am. Chem. Soc. (2017); Kasperkiewicz et al., FEBS (2017); Kasperkiewicz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (2014); Lechtenberg et al., ACS Chem. Biol. (2015)), которые представляют собой значительно менее сложный тип образца.
Сущность изобретения
[0010] Целью некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения является обеспечение соединений-зондов на основе активности, которые позволяют детектировать активность нейтрофильной эластазы в биологических образцах клеточных лизатов.
[0011] Целью некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения является обеспечение способов диагностики in vitro заболевания, ассоциированного с (повышенной) активностью нейтрофильной эластазы.
[0012] Целью некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения является обеспечение способов диагностики in vitro заболевания, выбранного из группы, состоящей из целиакии, расстройства перистальтики желудочно-кишечного тракта, боли, зуда, кожного заболевания, ожирения, вызванного рационом, метаболического нарушения, астмы, ревматоидного артрита, пародонтита, воспалительного заболевания желудочно-кишечного тракта, функционального расстройства желудочно-кишечного тракта, рака, фиброзного заболевания, метаболической дисфункции, неврологического заболевания, хронической обструктивной болезни легких (COPD) и инфекции.
[0013] Целью некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения является обеспечение способов диагностики in vitro заболевания, выбранного из группы, состоящей из воспалительного заболевания кишечника, инфекции, хронической обструктивной болезни легких и рака у субъекта.
[0014] Целью некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения является обеспечение способов ингибирования нейтрофильной эластазы in vitro.
[0015] Целью некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения является обеспечение соединений-зондов на основе активности, которые позволяют детектировать активность нейтрофильной эластазы с высокой эффективностью для нейтрофильной эластазы, такой как повышенная эффективность для нейтрофильной эластазы по сравнению с зондом Cy5-V-DPP на основе активности, например, в тканевых лизатах.
[0016] Целью некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения является обеспечение ингибиторов нейтрофильной эластазы.
[0017] Целью некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения является обеспечение соединений, которые можно использовать для диагностике заболевания, ассоциированного с активностью нейтрофильной эластазы.
[0018] Целью некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения является обеспечение соединений, которые можно использовать для диагностики заболевания, выбранного из группы, состоящей из целиакии, расстройства перистальтики желудочно-кишечного тракта, боли, зуда, кожного заболевания, ожирения, вызванного рационом, метаболического нарушения, астмы, ревматоидного артрита, пародонтита, воспалительного заболевания желудочно-кишечного тракта, функционального расстройства желудочно-кишечного тракта, рака, фиброзного заболевания, метаболической дисфункции, неврологического заболевания, хронической обструктивной болезни легких (COPD) и инфекции.
[0019] Целью некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения является обеспечение соединений, которые можно использовать для диагностики заболевания, выбранного из группы, состоящей из воспалительного заболевания кишечника, инфекции, хронической обструктивной болезни легких и рака.
[0020] Следует понимать, что вышеуказанные цели также относятся к соответствующим способам, а также к соединениям/композициям для применения в соответствующем способе.
[0021] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу детектирования активности нейтрофильной эластазы (NE) в лизате образца ткани, включающему:
(1) приготовление лизата из образца ткани, полученного от субъекта,
(2) контактирование лизата с соединением формулы I:
[0022]
[0023] или его солью,
где D представляет собой детектируемый элемент,
(3) последующее подвергание, по меньшей мере, аликвоты лизата, полученного на стадии (2), гель-электрофорезу; и затем
(4) измерение детектируемого сигнала.
[0024] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу диагностики заболевания, ассоциированного с активностью NE, у субъекта, включающему:
(1) приготовление лизата из образца ткани, полученного от субъекта,
(2) контактирование лизата с соединением формулы I:
[0025]
[0026] или его солью,
где D представляет собой детектируемый элемент,
(3) последующее подвергание лизата гель-электрофорезу; и затем
(4) измерение детектируемого сигнала.
[0027] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу ингибирования NE in vitro, включающему:
(1) приготовление лизата из образца ткани, полученного от субъекта,
(2) контактирование лизата с соединением формулы I:
[0028]
[0029] или его солью,
где D представляет собой детектируемый элемент.
[0030] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к предшествующим способам, где на стадии (2) лизат контактирует с соединением, имеющим формулу IA:
[0031]
[0032] или его солью,
где D представляет собой детектируемый элемент.
[0033] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу диагностики воспалительного заболевания кишечника у субъекта in vitro, включающему детектирование активированной формы NE, которая представляет собой усеченную форму зрелой NE.
[0034] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к соединению формулы I:
[0035]
[0036] или его соли,
где D представляет собой детектируемый элемент,
при условии, что соединения, в которых D соответствует одной из следующих формул, исключаются:
[0037]
[0038]
[0039]
[0040]
[0041]
[0042] где в каждой из вышеприведенных формул волнистая линия представляет точку соединения с остальной частью молекулы. В некоторых таких вариантах осуществления настоящее изобретение относится к соединению, имеющему формулу IA:
[0043]
[0044] или их соли, где D представляет собой детектируемый элемент.
[0045] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к соединению формулы II:
[0046]
[0047] или его соли.
[0048] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к соединению формулы IIA:
[0049]
[0050] или его соли.
[0051] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композиции, содержащей соединение формулы I, как здесь описано, или его соль, и эксципиент.
Краткое описание фигур
[0052] На фиг. 1А показана чистота синтезированного сульфоCy5-Nle(OBzl)-Met(O)2-Oic-OH измерением оптической плотности при 214 нм с помощью ВЭЖХ.
На фиг. 1В показан анализ API-ES синтезированного сульфоCy5-Nle(OBzl)-Met(O)2-Oic-OH: рассчитано m/z; C60H79N5O14S3 [M - H]- 1189,5, [M - 2 H]2- 593,7; найдено: [M - H]- 1189,0, [M - 2 H]2- 593,6.
На фиг. 2А показана чистота синтезированного PK105b измерением оптической плотности при 214 нм с использованием ВЭЖХ.
На фиг. 2В показан анализ PK105b по API-ES: рассчитано m/z; C75H95N6O16PS3 [M - H]- 1462,8, [M - 2 H]2- 730,3; найдено: [M - H]- 1462,8, [M - 2 H]2- 730,2.
На фиг.3 приведены результаты флуоресценции в геле для зависимого от концентрации связывания Cy5-V-DPP и PK105b с рекомбинантными сериновыми протеазами.
На фиг. 4А приведены результаты флуоресценции в геле для лизатов костного мозга мышей, меченных Cy5-V-DPP или PK105b ex vivo.
На фиг. 4B приведены результаты иммунопреципитации лизатов, меченных PK105b, показанных на фиг. 4A с использованием антитела, специфичного к NE.
На фиг. 4С приведены результаты флуоресценции в геле лизатов поджелудочной железы мышей, меченных Cy5-V-DPP или PK105b ex vivo.
На фиг. 4D приведены результаты иммунопреципитации лизатов, меченных PK105b, показанных на фиг. 4A с использованием антител, специфичных к NE, панкреатической эластазе (PE) и трипсину 3 (Try3).
На фиг. 5А приведены результаты мечения ex vivo дистальных или проксимальных отделов толстого кишечника, отобранных у мышей с острым колитом, индуцированного TNBS, с PK105b, детектированным с помощью флуоресценции в геле (вверху; * указывает высокомолекулярные соединения неизвестной идентичности) и иммуноблоттинга тех же образцов с антителом, специфичным к NE, для детектирования общей экспрессии NE (внизу; n=3-5).
На фиг. 5В приведены результаты иммунопреципитации меченного PK105b лизата воспаленного дистального отдела толстого кишечника с использованием антитела, специфичного к NE.
На фиг. 5С приведены результаты флуоресценции в геле (вверху) и иммуноблоттинга (внизу) лизатов дистальных отделов толстого кишечника с или без мечения PK105b.
На фиг. 6А приведены результаты флуоресценции в геле меченных ex vivo лизатов дистальных отделов толстого кишечника (контрольных или обработанных TNBS) с зондом Cy5-V-DPP.
На фиг. 6В приведены результаты флуоресценции в геле люминальных жидкостей от контрольных мышей или мышей, обработанных TNBS, меченных PK105b.
На фиг. 6С приведены результаты флуоресценции в геле фекальных гранул от контрольных мышей или мышей, обработанных TNBS, меченных PK105b.
На фиг. 6D приведены результаты иммунопреципитации меченных PK105b образцов фекалий с антителом, специфичным к NE, PE или трипсина 3.
На фиг. 7A приведены результаты мечения ex vivo биопсийного материала слизистой оболочки здоровых субъектов или пациентов с воспалительным заболеванием кишечника (IBD) с PK105b, детектированного с помощью флуоресценции в геле (вверху) и иммуноблоттинга тех же образцов с помощью антитела, специфичного к NE, для детектирования общей экспрессии NE (внизу). Активный язвенный колит (UC; n=9) или здоровый контроль (нормальный; n=5).
На фиг. 7B показан денситометрический анализ активной NE (слева) и наиболее усеченных молекул NE, детектированных с помощью иммуноблоттинга (справа; SEM).
На фиг. 7C приведены результаты иммунопреципитации лизатов биопсийного материала при UC, меченных PK105b, с помощью антитела, специфичного к NE.
На фиг. 8А приведены результаты флуоресценции в геле легких, отобранных у контрольных мышей или мышей, инфицированных Legionella, и меченных ex vivo с помощью PK105b (* указывает на высокомолекулярные соединения неизвестной идентичности) и иммуноблоттинга образцов с использованием антитела, специфичного к NE (n=3-5).
На фиг. 8B показан денситометрический анализ активности NE (слева) и зрелой NE, детектированной с помощью иммуноблоттинга (справа), показанного на фиг. 8A.
На фиг. 8С приведены результаты иммунопреципитации лизатов легких, меченных PK105b, с использованием антитела, специфичного к NE.
На фиг.9А приведены результаты флуоресценции в геле образцов нормальных языков мыши или ксенотрансплантатов плоскоклеточной карциномы ротовой полости HSC-3, меченных ex vivo с PK105b (* указывает на высокомолекулярные соединения неизвестной идентичности) и иммуноблоттинга образцов с использованием антитела, специфичного к NE (n=3-5).
На фиг. 9B показан денситометрический анализ активности NE (слева) и зрелой NE, детектированной с помощью иммуноблоттинга (справа) на фиг. 9A.
На фиг. 9С приведены результаты иммунопреципитации опухолевых лизатов, меченных PK105b, с использованием антитела, специфичного к NE.
Подробное описание изобретения
[0053] При описании настоящего изобретения следует использовать следующие термины, как указано ниже.
[0054] В рамках настоящего изобретения, формы единственного числа включают множественные ссылки, если контекст явно не указывает иное.
[0055] Если не указано иное, то все технические и научные термины, используемые здесь, имеют те же значения, которые обычно понимаются специалистами в данной области.
[0056] Термин «активность нейтрофильной эластазы» относится к протеолитической активности сериновой протеазы эластазы нейтрофилов. Эластазу нейтрофилов также называют эластазой лейкоцитов, эластазой-2, сериновой эластазой, подтипом эластазы лейкоцитов человека (HLE), медуллазином, эластазой PMN или эластазой костного мозга.
[0057] Термин «зрелая нейтрофильная эластаза» или «зрелая NE» относится к форме с молекулярной массой 25 кДа, полученной в результате усечения, т.е. укорочения, неактивной формы зимогена с молекулярной массой 37 кДа, которая первоначально продуцируется из гена NE, обозначенного как ELANE или ELA2, посредством транскрипции и трансляции. Зрелая NE может проявлять активность NE.
[0058] Термин «усеченная форма зрелой NE» относится к форме NE, которая возникает в результате дальнейшего усечения зрелой NE и, соответственно, имеет молекулярную массу <25 кДа.
[0059] Термин «активированная форма NE» относится к формам NE, которые могут проявлять активность NE. Зрелые NE и усеченные формы зрелой NE могут быть активированными формами NE.
[0060] Термин «образец ткани» или «биопсийный материал ткани» относится к образцу биологической ткани, полученному от субъекта, такому как образец, полученный путем иссечения, пункционной аспирации, биопсийных щипцов или мазка. Образцы тканей также включают биопсийный материал слизистой оболочки и образцы кала. Отобранная ткань может быть живой, мертвой, здоровой или больной и содержать гетерогенную смесь типов клеток и внеклеточных факторов.
[0061] «Биопсийный материал слизистой оболочки» обычно получают отбором слизи, скопившейся на поверхности другой ткани, например слизистые оболочки или эпителий кишечного тракта. Биопсийный материал слизистой оболочки содержит клетки, выделенные из ткани, на которой скопилась слизь.
[0062] Термин «образец мокроты» относится к образцу, который представляет собой смесь слюны и слизи, откашливаемой из дыхательных путей. «Образец мокроты» можно получить инвазивным или неинвазивным способом. Инвазивные методы включают ротоглоточное или эндотрахеальное отсасывание во время интубации пациента, и полученное содержимое собирают в ловушку для мокроты. С помощью неинвазивных методов собирают содержимое, образующееся при кашле у субъекта, иногда после распыления физиологического раствора для разжижения секрета.
[0063] Термин «образец фекалий» или «образец кала» относится к образцу, взятому из кала субъекта. Образцы кала содержат клетки, выделенные из желудочно-кишечного тракта, и выделения клеток из желудочно-кишечного тракта субъекта.
[0064] Термин «лизат образца ткани» относится к раствору, полученному лизированием клеток образца ткани. Термин «лизирование» или «лизис» относится к дезинтеграции или разрыву клеточных мембран, что приводит к высвобождению содержимого клетки и/или последующей гибели клетки. Лизис может быть выполнен, например, посредством механического, ферментативного или осмотического разрушения клеточных мембран.
[0065] Подразумевается, что термин «зонд на основе активности» имеет такое же значение, какое обычно понимается специалистами в данной области. Зонды, основанные на активности (ABP), представляют собой небольшие молекулы, которые ковалентно связываются с активным сайтом фермента (например, протеазы) или группы ферментов в зависимости от активности (т. е. для реакции мечения требуется активность фермента). ABP обычно включают три элемента: (i) электрофильную группу, называемую «активной группой», (ii) линкер или последовательность распознавания и (iii) детектируемый элемент или «репортерный фрагмент» для детектирования. Фермент атакует электрофильную активную группу, что приводит к образованию ковалентного аддукта, который затем можно детектировать либо непосредственно (например, если детектируемый элемент представляет собой флуоресцентную метку), либо с помощью двухэтапного мечения (например, постмечение модификации маркера для лигирования).
[0066] Термин «детектируемый элемент» или «репортерная группа/фрагмент» относится к функциональной группе в соединении (зонд на основе активности), который можно детектировать с использованием методов, включая, помимо прочего, оптические методы (например, измерение флуоресценции или поглощение УФ-излучения), радиография, биохимические методы (например, с использованием иммунохимического реагента, такого как антитело) и т. д. Термин «детектируемый элемент» включает функциональные группы, которые могут детектироваться «напрямую» (например, измерением флуоресценции после анализа SDS-PAGE), а также функциональные группы, которые можно детектировать после выполнения стадии вторичного мечения и последующего детектирования вторичной метки. Примером таких групп является биотиновая метка, которую можно детектировать, например, после вторичного мечения флуоресцентно-меченным стрептавидином и последующего измерения флуоресценции. Еще одним примером таких групп является клик-химическая метка (биоортогональный маркер для лигирования), которую можно детектировать, например, после вторичного мечения флуоресцентной меткой с использованием клик-химической (биоортогональной) реакции и последующего измерения флуоресценции.
[0067] Таким образом, «биоортогональный маркер для лигирования» представляет собой функциональную группу, присутствующую в соединениях по настоящему изобретению на начальной стадии мечения зондом (in vivo или ex vivo контактирование протеазы/биологического образца/субъекта с соединениями по настоящему изобретению), что обеспечивает последующее присоединение вторичной метки (соответствующей фактически детектированной метке) на стадии вторичного мечения с использованием, например, клик-химической (биоортогональной) реакции, которая проводится in vitro.
[0068] Клик-химические метки и соответствующие реакции клик-химические реакции для вторичного мечения, т. е. присоединения метки, которая должна быть фактически детектирована, описаны, например, в Martell et al., Molecules (2014) и в Willems et al., Acc. Chem. Res. (2011).
[0069] Детектируемые элементы испускают «детектируемые сигналы», которые можно измерить с помощью аналитического метода детектирования, как здесь описано.
[0070] Термин «пациент» означает субъекта, в частности человека, у которого появилось клиническое проявление конкретного симптома или симптомов, указывающих на необходимость лечения, которого лечат превентивно или профилактически от состояния, или у которого было диагностировано состояние, подлежащее лечению.
[0071] Термин «субъект» предназначен для включения субъектов-млекопитающих, в частности субъектов-людей, и включает определение термина «пациент» и не исключает субъектов, которые являются полностью нормальными во всех отношениях или в отношении конкретного состояния.
[0072] В рамках настоящего изобретения, термин «заболевание, ассоциированное с активностью нейтрофильной эластазы» или «заболевание, ассоциированное с активностью NE» обозначает заболевание, при котором активность нейтрофильной эластазы вовлечена в патогенез заболевания. При «заболевании, ассоциированном с активностью NE», уровень активности NE при болезненном состоянии или в пораженной области тела (например, части тела, органе, патологической ткани, включая опухолевую ткань) отклоняется от соответствующего уровня активности NE, детектированного при состоянии без патологии или в соответствующей области тела без патологии. В некоторых вариантах осуществления уровень активности NE при болезненном состоянии или в пораженной области тела повышен по сравнению с соответствующим уровнем активности NE, детектированном при состоянии без патологии или в соответствующей области тела без патологии. Например, при состоянии или в области без патологии уровень активности NE может быть ниже определяемого предела, тогда как при болезненном состоянии или в пораженной области уровень активности NE выше определяемого предела. Заболевания, ассоциированные с активностью нейтрофильной эластазы, включают целиакию, расстройства моторики желудочно-кишечного тракта, боль, зуд, кожные заболевания, такие как атопический дерматит, ожирение, вызванное рационом, метаболические нарушения (включая, помимо прочего, неалкогольный стеатогепатит (NASH), заболевания печени и поджелудочной железы), астму, ревматоидный артрит, пародонтит, воспалительные заболевания желудочно-кишечного тракта (такие как воспалительные заболевания кишечника (IBD), инфекционная диарея, ишемия брыжейки, дивертикулит и некротический энтероколит (NEC)), функциональные расстройства желудочно-кишечного тракта (такие как синдром раздраженного кишечника, функциональная боль в груди, функциональная диспепсия, тошнота и рвота, функциональный запор, функциональная диарея, недержание кала, функциональная аноректальная боль и функциональные нарушения дефекации), рак, фиброзные заболевания, метаболическую дисфункцию, неврологические заболевания, хроническую обструктивную болезнь легких (COPD) и инфекции.
[0073] В рамках настоящего изобретения, термины «воспалительное заболевание желудочно-кишечного тракта», «воспалительное желудочно-кишечное расстройство», «воспалительное расстройство желудочно-кишечного тракта» или «воспалительное желудочно-кишечное заболевание» обозначают желудочно-кишечные заболевания, т. е. заболевания, затрагивающие желудочно-кишечный тракт, а именно ротовую полость, пищевод, желудок, тонкий кишечник, толстый кишечник (ободочную кишку) и прямую кишку, а также дополнительные органы пищеварения (например, язык, слюнные железы, поджелудочную железу, печень и желчный пузырь), в которых наблюдается воспаление одной или более частей желудочно-кишечного тракта. Воспалительные заболевания желудочно-кишечного тракта включают, например, воспалительные заболевания кишечника, инфекционную диарею, ишемию брыжейки, дивертикулит и некротический энтероколит (NEC).
[0074] Термин «воспалительное заболевание кишечника» или «IBD» относится к совокупности заболеваний, характеризующихся хроническим и рецидивирующим воспалением в желудочно-кишечном тракте. IBD, в первую очередь, включает язвенный колит (UC) и болезнь Крона (CD), оба из которых связаны с диареей, ректальным кровотечением, повышенными позывами к дефекации и болью, но также включают менее распространенные заболевания, такие как острый колит, иммуноонкологический колит, колит в результате химиотерапии/лучевой терапии, колит на фоне синдрома «трансплантат против хозяина» (GvHD), коллагенозный колит, лимфоцитарный колит, микроскопический колит, диверсионный колит, болезнь Бехчета и колит неопределенной этиологии и поухит.
[0075] В рамках настоящего изобретения, термин «функциональные расстройства желудочно-кишечного тракта», «функциональные желудочно-кишечные расстройства» или «функциональные заболевания желудочно-кишечного тракта» обозначает нарушения взаимодействия кишечника и головного мозга. Это группа расстройств, классифицируемых по желудочно-кишечным симптомам, связанным с любой комбинацией следующих факторов: нарушение моторики, висцеральная гиперчувствительность, изменение слизистой оболочки и иммунной функции, измененная микробиота кишечника и измененный процессинг центральной нервной системы (ЦНС). Термин «функциональный» обычно применяется к расстройствам, при которых нарушается нормальная деятельность организма с точки зрения моторики кишечника, чувствительности нервов кишечника или того, как мозг контролирует некоторые из этих функций. Однако структурные аномалии, которые можно увидеть с помощью эндоскопии, рентгена или анализов крови, отсутствуют. Таким образом, эти расстройства во многом идентифицируются по характеристикам симптомов. Функциональные расстройства желудочно-кишечного тракта включают синдром раздраженного кишечника, функциональную боль в груди, функциональную диспепсию, тошноту и рвоту, функциональные запоры, функциональную диарею, недержание кала, функциональную аноректальную боль и функциональные нарушения дефекации.
[0076] Термин «инфекция» относится к процессу или состоянию, при котором инфекционный агент (например, такой как патогенные бактерии, грибы, простейшие, вирусы, прионы, вироиды, нематоды и другие гельминты) проникает и размножается в тканях тела инфицированного субъекта.
[0077] Термин «хроническая обструктивная болезнь легких» относится к группе прогрессирующих заболеваний легких и включает эмфизему, хронический бронхит и рефрактерную (необратимую) астму. Данные заболевания характеризуются усилением одышки и плохим обменом воздуха.
[0078] Термин «рак» относится к совокупности заболеваний, характеризующихся неконтролируемым аномальным ростом клеток с возможностью проникновения или распространения в другие части тела. Рак может поражать любую ткань, и получает название по ткани, из которой он развивается. Термин «рак ротовой полости» относится к раку ротовой полости, т. е. к любому разрастанию раковой ткани, локализованному в полости рта субъекта. Типичными гистологическими типами рака ротовой полости являются тератома, аденокарцинома, происходящая из большой или малой слюнной железы, лимфома из миндалин или другой лимфоидной ткани или меланома из клеток слизистой оболочки полости рта, продуцирующих пигмент. Наиболее распространенным типом рака полости рта является плоскоклеточная карцинома, возникающая в тканях, выстилающих ротовую полость и губы, с менее распространенными типами, включающими саркому Капоши. Рак ротовой полости чаще всего поражает язык, но может также развиться на дне ротовой полости, на подкладке щек, деснах, губах или небе. Термин «рак молочной железы» относится к раку молочной железы. Примеры рака молочной железы включают протоковую карциному in situ (DCIS), лобулярную карциному in situ (LCIS), инвазивную протоковую карциному (IDC), инвазивную лобулярную карциному (ILC), рак соска Педжета, филлоидную опухоль и ангиосаркому. Термин «рак предстательной железы» относится к раку предстательной. Примеры рака предстательной железы включают аденокарциномы предстательной железы. Термин «колоректальный рак» относится к раку толстой и/или прямой кишки. Примеры колоректального рака представляют собой аденокарциномы, карциноидные опухоли, стромальные опухоли желудочно-кишечного тракта (GIST), лимфомы и саркомы, происходящие из толстой или прямой кишки.
[0079] Термин «(Cy-Cz)» при использовании в сочетании с химической группой, такой как алкил, алкенил, алкинил, циклоалкил, алкокси, арил и т. д., указывает возможное число атомов углерода в группе (т. е. от y до z атомов углерода).
[0080] В рамках настоящего изобретения, термин «алкил» обозначает алкильную группу с прямой или разветвленной цепью. Примеры алкильных групп включают метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, 2-бутил, изобутил, трет-бутил, н-пентил, 1-метилбутил, 2-метилбутил, 3-метилбутил и 2,2-диметилпропил. В некоторых вариантах осуществления термин «алкил» обозначает алкильную группу с прямой цепью, такую как метил, этил, н-пропил, н-бутил, н-пентил, н-гексил, н-гептил и н-октил.
[0081] В рамках настоящего изобретения, термин «арил» обозначает группы, полученные из моноциклических или полициклических ароматических углеводородов путем удаления атома водорода от атома углерода кольца. Примеры арильных групп включают фенил и нафтил.
[0082] В рамках настоящего изобретения, термин «сульфо» признан в данной области техники и относится к группе -SO3H или ее солевой форме.
[0083] Формулы, указывающие положительно или отрицательно заряженные атомы или группы (такие как N+ или SO3-), означают солевые формы соответствующей формулы (включая «внутренние соли» в случае цвиттерионов).
[0084] Для целей настоящего изобретения термин «соль» включает соли неорганических кислот, такие как гидрохлорид, гидробромид, сульфат, фосфат и т.п.; и соли органических кислот, такие как миристат, формиат, ацетат, трифторацетат, малеат, тартрат, битартрат и т.п.; сульфонаты, такие как метансульфонат, бензолсульфонат, п-толуолсульфонат и т.п.; и соли аминокислот, такие как аргинат, аспарагинат, глутамат и т.п. Термин «соль» включает сольваты, такие как гидраты, соответствующей соли.
[0085] В некоторых вариантах осуществления термин «соль», используемый здесь, означает диагностически приемлемую соль. В некоторых вариантах осуществления термин «соль», используемый здесь, означает диагностически и/или фармацевтически приемлемую соль.
[0086] В рамках настоящего изобретения, термин «фармацевтически приемлемая соль» означает соль соединения настоящего изобретения, которая безопасна и эффективна для местного или системного применения у млекопитающих и которая обладает желаемой биологической активностью. Противоион подходит для предполагаемого применения, нетоксичен и не мешает проявлению желаемого биологического действия соединения. Фармацевтически приемлемые соли в контексте настоящего изобретения включают соли, приведенные в IUPAC Handbook of Pharmaceutically Acceptable Salts (Wermuth, CG и Stahl, PH, Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use - A Handbook, Verlag Helvetica Chimica Acta (2002)).
[0087] В рамках настоящего изобретения, термин «диагностически приемлемая соль» относится к соли соединения по настоящему изобретению, которая пригодна и эффективна для желаемого диагностического метода. Ее противоион не мешает реакции, необходимой для детектирования целевого белка, или проведению способа детектирования/диагностики.
[0088] В некоторых вариантах осуществления соединения по настоящему изобретению находятся в виде трифторацетатной соли, например, после очистки ВЭЖХ в элюирующем растворителе, включающем трифторуксусную кислоту (ТФК).
[0089] В рамках настоящего изобретения, термин «контактирование лизата с соединением формулы I (или его солью)» также включает варианты осуществления, в которых лизат контактирует с композицией, содержащей соединение формулы I (или его соль) и наполнитель.
В некоторых таких вариантах осуществления композиция представляет собой водный раствор, содержащий, например, воду, забуференный фосфатом физиологический раствор или буферный раствор в качестве эксципиента. В некоторых таких вариантах осуществления водный раствор дополнительно содержит детергенты, такие как тритон Х-100.
[0090] В некоторых вариантах осуществления «эксципиент» означает диагностически и/или фармацевтически приемлемый эксципиент. Диагностически и/или фармацевтически приемлемые эксципиенты, которые можно использовать в композициях по настоящему изобретению, известны специалистам в данной области. Примеры таких фармацевтически приемлемых эксципиентов включают, например, те, которые описаны в абзацах [0114] - [0118] WO 2018/119476, содержание которых тем самым вводится в настоящее раскрытие.
[0091] В формулах с волнистой линией, волнистая линия представляет собой или указывает точку соединения с остальной частью молекулы. Если связь внутри химической структуры изображена в виде волнистой линии (как в формулах IA и IIA, как здесь описано), то это указывает на то, что стереохимия в соответствующем положении не определена, то есть заместитель, присоединенный этой связью (в формуле IA и IIA, этильная группа) может указывать назад или вперед.
[0092] Соединение формулы I или II может содержать один или более асимметричных центров и, таким образом, может давать энантиомеры, диастереомеры и другие стереоизомерные формы. Если специально не указано иное, то описание охватывает соединения со всеми такими возможными формами, а также их рацемические и разделенные формы или любую их смесь. Когда соединение формулы (I) содержит олефиновую двойную связь или другой центр геометрической асимметрии, и если специально не указано иное, то предполагается, что оно включает все «геометрические изомеры», например, как геометрические изомеры E, так и Z. Если специально не указано иное, все «таутомеры», например, таутомеры кетон-енол, амид-имидная кислота, лактам-лактим, енамин-имин, амин-имин и енамин-енимин, также охватываются настоящим описанием.
[0093] В рамках настоящего изобретения, термины «стереоизомер», «стереоизомерная форма» и т.п. являются общими терминами для всех изомеров индивидуальных молекул, которые различаются только ориентацией их атомов в пространстве. Он включает энантиомеры и изомеры соединений с более чем одним хиральным центром, которые не являются зеркальным отображением друг друга («диастереомеры»).
[0094] Термин «хиральный центр» относится к атому углерода, к которому присоединены четыре разные группы.
[0095] Термин «энантиомер» или «энантиомер» относится к молекуле, которая не накладывается на свое зеркальное изображение и, следовательно, оптически активна, когда энантиомер вращает плоскость поляризованного света в одном направлении, а его зеркальное изображение вращает плоскость поляризованного света в противоположном направлении.
[0096] Термин «рацемический» относится к смеси равных частей энантиомеров, которая оптически неактивна.
[0097] Термин «разделение» относится к разделению, концентрации или истощению одной из двух энантиомерных форм молекулы. Оптические изомеры соединения формулы (I) могут быть получены известными методами, такими как хиральная хроматография или образование диастереомерных солей из оптически активной кислоты или основания.
[0098] Оптическую чистоту можно выразить в единицах энантиомерного избытка (% ее), который определяется по формуле:
[0099]
[0100] В одном варианте осуществления изобретение относится к соединениям, имеющим абсолютную стереохимию, как указано формулами IA или IIA.
[0101] Соединения по настоящему изобретению могут можно синтезировать с использованием стандартных синтетических химических методик, например, с использованием способов, описанных в разделе «Примеры» ниже. Другие пригодные синтетические методы описаны, например, в March 's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 7th Ed., (Wiley, 2013); Carey and Sundberg, Advanced Organic Chemistry 4thEd., Vols. A and B (Plenum 2000, 2001); Fiesers ' Reagents for Organic Synthesis, Volumes 1 -27 (Wiley, 2013); Rodd's Chemistry of Carbon Compounds, Volumes 1-5 and Supplementals (Elsevier Science Publishers, 1989); Organic Reactions, Volumes 1-81 (Wiley, 2013); and Larock's Comprehensive Organic Transformations (VCH Publishers Inc., 1989) (все они в полном объеме включены здесь посредством ссылки). Соединения обычно синтезируют с использованием исходных веществ, которые обычно доступны из коммерческих источников или которые можно легко получить с использованием методов, хорошо известных специалистам в данной области. См., Например, Fiesers' Reagents for Organic Synthesis, Volumes 1-27 (Wiley, 2013), or Beilsteins Handbuch der organischen Chemie, 4, Aufl. ed. Springer-Verlag, Berlin, включая приложения.
[0102] Способы детектирования активности нейтрофильной эластазы
[0103] В способах детектирования активности нейтрофильной эластазы по настоящему изобретению детектируются только протеолитически активные формы нейтрофильной эластазы.
[0104] Детектируемый сигнал измеряется после того, как произошла реакция между соединением-зондом на основе активности и нейтрофильной эластазой, которая привела к образованию ковалентной связи. Измеренный детектируемый сигнал испускается меченым ферментом, то есть детектируемым элементом соединения-зонда на основе активности, ковалентно присоединенным к цистеиновой протеазе. В некоторых вариантах осуществления детектируемый сигнал измеряется после того, как меченый фермент был подвергнут вторичной стадии мечения.
[0105] Концепция детектирования активности фермента с использованием зондов на основе активности и соответствующие способы детектирования и лежащие в основе экспериментальные протоколы известны специалистам в данной области (см., например, Edgington and Bogyo, 2013; Edgington-Mitchell, L.E., and Bogyo, M. (2016). Detection of Active Caspases During Apoptosis Using Fluorescent Activity-Based Probes. Methods Mol Biol. 1419, 27-39; and Edgington-Mitchell, L.E., Bogyo, M., and Verdoes, M. (2017). Live Cell Imaging and Profiling of Cysteine Cathepsin Activity Using a Quenched Activity-Based Probe. Methods Mol Biol. 1491, 145-159; содержание которых в полном объеме включено здесь посредством ссылки). Специалисты в данной области знают, как соответствующим образом адаптировать данные способы/протоколы для применения в способах по настоящему изобретению.
[0106] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу детектирования активности нейтрофильной эластазы, включающему:
(1) приготовление лизата из образца ткани, полученного от субъекта,
(2) контактирование лизата с соединением формулы I:
[0107]
[0108] или его солью,
где D представляет собой детектируемый элемент,
(3) последующее проведение гель-электрофореза, по меньшей мере, аликвоты лизата, полученного на стадии (2); и затем
(4) измерение детектируемого сигнала.
[0109] В некоторых таких вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу, дополнительно включающему после стадии (3) стадию:
(5) иммуноблоттинга с анти-NE антителом.
[0110] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу, где дополнительно выполняются следующие стадии:
(3a) иммунопреципитация соединения формулы I в отдельной аликвоте лизата со стадии (2) с использованием антитела, специфичного для соединения формулы I или его фрагмента (т.е. специфичного для фрагмента соединения формулы I),
(4а) последующий анализ сопреципитированного материала.
В некоторых таких вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу, где анализ на стадии (4а) включает:
- гель-электрофорез и последующий иммуноблоттинг с использованием анти-NE антитела, или
- секвенирование белка,
и предпочтительно включает гель-электрофорез и последующий иммуноблоттинг с использованием анти-NE антитела.
[0111] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу по любому из предшествующих вариантов осуществления, где перед стадией (2) аликвоту лизата со стадии (1) предварительно обрабатывают специфическим ингибитором NE, и где предварительно обработанную аликвоту затем обрабатывают аналогично необработанному лизату со стадии (1).
[0112] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу по любому из предшествующих вариантов осуществления, где образец ткани выбран из группы, состоящей из биопсийного материала ротовой полости, образца пищевода, образца желудка, образца тонкого кишечника, образца легкого, образца мокроты, образца поджелудочной железы, образца костного мозга, образца толстого кишечника, образца дистального отдела толстого кишечника, образца проксимального отдела толстого кишечника, биопсийного материала молочной железы, биопсийного материала предстательной железы, биопсийного материала прямой кишки, образца печени, образца кожи, образца опухоли, образца кала и биопсийного материала слизистой оболочки. В некоторых таких вариантах осуществления образец ткани представляет собой биопсийный материал слизистой оболочки, и биопсийный материал слизистой оболочки выбран из группы, состоящей из биопсийного материала слизистой оболочки толстого кишечника, биопсийного материала дистального отдела слизистой оболочки толстого кишечника, биопсийного материала проксимального отдела слизистой оболочки толстого кишечника, биопсийного материала слизистой оболочки тонкого кишечника, биопсийного материала слизистой оболочки легкого, биопсийного материала слизистой оболочки прямой кишки, биопсийного материала слизистой оболочки пищевода и биопсийного материала слизистой оболочки ротовой полости.
[0113] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу по любому из предшествующих вариантов осуществления, где субъектом является человек.
[0114] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу по любому из предшествующих вариантов осуществления, где детектируется активированная форма NE, которая представляет собой усеченную форму зрелой NE. В некоторых таких вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу, где образец ткани выбран из группы, состоящей из биопсийного материала ротовой полости, образца пищевода, образца желудка, образца тонкого кишечника, образца толстого кишечника, образца проксимального отдела толстого кишечника, образца дистального отдела толстого кишечника, образца прямой кишки, образца кала и биопсийного материала слизистой оболочки. В некоторых таких вариантах осуществления образец ткани представляет собой биопсийный материал слизистой оболочки, и биопсийный материал слизистой оболочки выбран из группы, состоящей из биопсийного материала слизистой оболочки ротовой полости, биопсийного материала слизистой оболочки пищевода, биопсийного материала слизистой оболочки тонкого кишечника, биопсийного материала слизистой оболочки толстого кишечника и биопсийного материала слизистой оболочки прямой кишки.
[0115] В некоторых вариантах осуществления вышеуказанных способов получение лизата включает стадию очистки. Стадия очистки может включать стадию осаждения нерастворенного вещества под действием силы тяжести или центрифугирования.
[0116] В некоторых вариантах осуществления гель-электрофорез представляет собой одномерный или двумерный гель-электрофорез (такой как SDS-PAGE или нативный PAGE). В некоторых вариантах осуществления гель-электрофорез представляет собой SDS-PAGE.
[0117] В некоторых вариантах осуществления вышеуказанных способов детектируемый элемент выбран из группы, состоящей из флуоресцентной метки, биотиновой метки, радиоактивной метки, хелатора и биоортогонального маркера для лигирования. В некоторых таких вариантах осуществления детектируемый сигнал измеряется посредством измерения флуоресценции или радиографии. В некоторых таких вариантах осуществления измерение осуществляется посредством измерения флуоресценции, и измерение флуоресценции представляет собой флуоресценцию в геле. В некоторых таких вариантах осуществления измерению флуоресценции предшествует вторичное мечение. В некоторых таких вариантах осуществления вторичное мечение выбрано из группы, состоящей из вторичного мечения меченым стрептавидином, вторичного мечения флуорофором и вторичного мечения меченым антителом.
[0118] В некоторых вариантах осуществления каждого из вышеуказанных способов измерение детектируемого сигнала на стадии (4) включает измерение, выбранное из группы, состоящей из радиографии, гель-электрофореза и последующей радиографии. В некоторых таких вариантах осуществления указанное соединение содержит детектируемый элемент в виде радиоактивной метки. В некоторых других вариантах осуществления указанное соединение содержит детектируемый элемент в форме хелатора для радиоактивной метки. В некоторых других вариантах осуществления указанное соединение содержит детектируемый элемент в виде биоортогонального маркера для лигирования, и стадия (4) дополнительно включает вторичное мечение с помощью клик-химии для включения радиоактивной метки или хелатора для радиоактивной метки перед выполнением радиографического измерения.
[0119] В некоторых вариантах осуществления каждого из вышеуказанных способов измерение детектируемого сигнала на стадии (4) включает измерение, выбранное из группы, состоящей из аффинной очистки и последующей масс-спектрометрии, аффинной очистки и последующей протеомики. В некоторых таких вариантах осуществления указанное соединение содержит детектируемый элемент в виде биотиновой метки. В некоторых других вариантах осуществления указанное соединение содержит детектируемый элемент в виде биоортогонального маркера для лигирования, и стадия (4) дополнительно включает вторичное мечение с помощью клик-химии для включения биотиновой метки перед проведением аффинной очистки. В случае мечения биотином аффинную очистку можно проводить с использованием, например, гранул, покрытых стрептавидином, или гранул, покрытых антителом, специфичным к биотину.
[0120] В некоторых вариантах осуществления аффинную очистку можно проводить с использованием гранул, покрытых антителом, специфичным к определенной метке. В некоторых таких вариантах осуществления указанное соединение включает указанную метку в качестве детектируемого элемента. В некоторых других вариантах осуществления указанное соединение содержит детектируемый элемент в виде биоортогонального маркера для лигирования, и стадия (4) дополнительно включает вторичное мечение с помощью клик-химии для включения указанной метки перед выполнением аффинной очистки.
[0121] В некоторых вариантах осуществления каждого из вышеуказанных методов измерение детектируемого сигнала на стадии (4) включает гель-электрофорез и последующий иммуноблоттинг. В некоторых таких вариантах осуществления указанное соединение содержит детектируемый элемент в виде биотиновой метки, и стадия (4) дополнительно включает вторичное мечение, например, стрептавидином, меченным HRP, перед проведением иммуноблоттинга. В некоторых других вариантах осуществления указанное соединение содержит детектируемый элемент в виде биоортогонального маркера для лигирования, и стадия (4) дополнительно включает вторичное мечение с помощью клик-химии для включения биотиновой метки и последующее мечение, например, стрептавидином, меченным HRP. перед проведением иммуноблоттинга.
[0122] Способы диагностики
[0123] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу диагностики in vitro воспалительного заболевания кишечника (IBD) у субъекта, включающему детектирование активированной формы NE, которая представляет собой усеченную форму зрелой NE. В некоторых таких вариантах осуществления субъектом является человек. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу диагностики воспалительного заболевания кишечника у субъекта in vitro, где способ включает стадию контактирования активированной формы NE с зондом на основе активности. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу диагностики in vitro воспалительного заболевания кишечника у субъекта, где способ включает стадию контактирования активированной формы NE с анти-NE антителом.
[0124] В некоторых других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу диагностики in vitro заболевания, ассоциированного с активностью NE у субъекта, включающему:
(1) приготовление лизата из образца ткани, полученного от субъекта,
(2) контактирование лизата с соединением формулы I:
[0125]
[0126] или его солью,
где D представляет собой детектируемый элемент,
(3) последующее подвергание лизата гель-электрофорезу; и затем
(4) измерение детектируемого сигнала. В некоторых таких вариантах осуществления заболевание выбрано из группы, состоящей из инфекции (такой как раневая инфекция или инфекция легких), воспалительного заболевания (такого как воспалительное заболевание кишечника), аутоиммунного заболевания (такого как диабет), хронической обструктивной болезни легких и рака. В некоторых таких вариантах осуществления вышеуказанный способ дополнительно включает после стадии (3) стадию:
(5) иммуноблоттинга с анти-NE антителом.
[0127] В некоторых таких вариантах осуществления заболевание, ассоциированное с активностью NE, выбрано из группы, состоящей из целиакии, нарушения моторики желудочно-кишечного тракта, боли, зуда, кожного заболевания, ожирения, вызванного рационом, нарушения обмена веществ, астмы, ревматоидного артрита, пародонтита, воспалительного заболевания желудочно-кишечного тракта, функционального расстройства желудочно-кишечного тракта, рака, фиброзного заболевания, метаболической дисфункции, неврологического заболевания, хронической обструктивной болезни легких (COPD) и инфекции.
[0128] В некоторых других таких вариантах осуществления заболевание, ассоциированное с активностью NE, выбрано из группы, состоящей из воспалительного заболевания кишечника, инфекции, хронической обструктивной болезни легких и рака.
[0129] В некоторых вариантах осуществления вышеуказанный способ дополнительно включает после стадии (3) стадию:
(5) иммуноблоттинга с анти-NE антителом.
[0130] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу, где дополнительно выполняют следующие стадии:
(3a) иммунопреципитация соединения формулы I в отдельной аликвоте лизата со стадии (2) с использованием антитела, специфичного к соединению формулы I или его фрагменту,
(4а) последующий анализ сопреципитированного материала. В некоторых таких вариантах осуществления анализ на стадии (4а) включает:
- гель-электрофорез и последующий иммуноблоттинг с использованием анти-NE антитела, или
- секвенирование белка,
и предпочтительно включает гель-электрофорез и последующий иммуноблоттинг с использованием анти-NE антитела.
[0131] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу диагностики по любому из предшествующих вариантов осуществления, где перед стадией (2) аликвоту лизата на стадии (1) предварительно обрабатывают специфическим ингибитором NE, и где предварительно обработанную аликвоту затем обрабатывают аналогично необработанному лизату стадии (1).
[0132] В некоторых вариантах осуществления предшествующих способов диагностики образец ткани выбран из группы, состоящей из биопсийного материала ротовой полости, образца пищевода, образца желудка, образца тонкого кишечника, образца легкого, образца мокроты, образца поджелудочной железы, образца костного мозга, образца толстого кишечника, образца дистального отдела толстого кишечника, образца проксимального отдела толстого кишечника, биопсийного материала молочной железы, биопсийного материала предстательной железы, биопсийного материала прямой кишки, образца печени, образца кожи, образца опухоли, образца кала и биопсийного материала слизистой оболочки. В некоторых таких вариантах осуществления образец ткани представляет собой биопсийный материал слизистой оболочки, и биопсийный материал слизистой оболочки выбран из группы, состоящей из биопсийного материала слизистой оболочки толстого кишечника, биопсийного материала дистальной части слизистой оболочки толстого кишечника, биопсийного материала проксимальной части слизистой оболочки толстого кишечника, биопсийного материала слизистой оболочки тонкого кишечника, биопсийного материала слизистой оболочки легких, биопсийного материала слизистой оболочки прямой кишки, биопсийного материала слизистой оболочки пищевода и биопсийного материала слизистой оболочки ротовой полости.
[0133] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу диагностики по любому из предшествующих вариантов осуществления, где субъектом является человек.
[0134] Воспалительное заболевание кишечника
[0135] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу диагностики по любому из предшествующих вариантов осуществления, где способ предназначен для диагностики воспалительного заболевания кишечника. В некоторых таких вариантах осуществления детектируется активированная форма NE, которая представляет собой усеченную форму зрелой NE. В некоторых таких вариантах осуществления у субъекта диагностируется воспалительное заболевание кишечника, если детектирована активированная форма NE.
[0136] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу диагностики воспалительного заболевания кишечника по любому из вышеуказанных вариантов осуществления, где образец ткани выбран из группы, состоящей из биопсийного материала ротовой полости, образца пищевода, образца желудка, образца тонкого кишечника, образца толстого кишечника, образца проксимального отдела толстого кишечника, образца дистального отдела ободочной кишки, образца прямой кишки, образца кала и биопсийного материала слизистой оболочки. В некоторых таких вариантах осуществления образец ткани представляет собой биопсийный материал слизистой оболочки, и биопсийный материал слизистой оболочки выбран из группы, состоящей из биопсийного материала слизистой оболочки ротовой полости, биопсийного материала слизистой оболочки пищевода, биопсийного материала слизистой оболочки тонкого кишечника, биопсийного материала слизистой оболочки толстого кишечника и биопсийного материала слизистой оболочки прямой кишки.
[0137] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу диагностики воспалительного заболевания кишечника по любому из вышеуказанных вариантов осуществления, где воспалительное заболевание кишечника выбрано из группы, состоящей из острого колита, язвенного колита, болезни Крона, микроскопического колита, колита в результате отравления, болезни Бехчета, иммуноонкологического колита, колита в результате химиотерапии/лучевой терапии, колита на фоне синдрома «трансплантат против хозяина», коллагенозного колита, лимфоцитарного колита и колита неопределенной этиологии и поухита.
[0138] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу диагностики воспалительного заболевания кишечника по любому из вышеуказанных вариантов осуществления, где воспалительное заболевание кишечника представляет собой язвенный колит. В некоторых таких вариантах осуществления образец ткани представляет собой образец толстого кишечника, образец проксимального отдела толстого кишечника, образец дистального отдела толстого кишечника или биопсийный материал слизистой оболочки толстого кишечника.
[0139] В еще одних определенных вариантах осуществления изобретение относится к способу диагностики воспалительного заболевания кишечника по любому из вышеуказанных вариантов осуществления, где воспалительное заболевание кишечника представляет собой болезнь Крона. В некоторых таких вариантах осуществления образец ткани выбран из группы, состоящей из биопсийного материала ротовой полости, образца пищевода, образца желудка, образца тонкого кишечника, образца толстого кишечника, образца проксимального отдела толстого кишечника, образца дистального отдела толстого кишечника, образца прямой кишки, образец кала и биопсийного материала слизистой оболочки. В некоторых таких вариантах осуществления образец ткани представляет собой биопсийный материал слизистой оболочки, и биопсийный материал слизистой оболочки выбран из группы, состоящей из биопсийного материала слизистой оболочки ротовой полости, биопсийного материала слизистой оболочки пищевода, биопсийного материала слизистой оболочки тонкого кишечника, биопсийного материала слизистой оболочки толстого кишечника и биопсийного материала слизистой оболочки прямой кишки.
[0140] Инфекция
[0141] В еще одних определенных вариантах осуществления изобретение относится к способу диагностики, где способ предназначен для диагностики инфекции. В некоторых таких вариантах осуществления инфекция выбрана из группы, состоящей из бактериальной инфекции и грибковой инфекции. В некоторых таких вариантах осуществления образец ткани представляет собой образец инфицированной ткани. В некоторых вариантах осуществления инфицированная ткань выбрана из группы, состоящей из образца раны (например, раневой жидкости), образца легкого, биопсийного материала слизистой оболочки легкого и образца мокроты.
[0142] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу диагностики инфекции по любому из вышеуказанных вариантов осуществления, где инфекция представляет собой инфекцию легкого. В некоторых таких вариантах осуществления инфекция легких представляет собой бактериальную инфекцию. В некоторых таких вариантах осуществления бактериальная инфекция представляет собой инфекцию Legionella.
[0143] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу диагностики инфекции легких по любому из вышеуказанных вариантов осуществления, где образец ткани выбран из группы, состоящей из образца легкого, биопсийного материала слизистой оболочки легкого и образца мокроты.
[0144] Рак
[0145] В еще одних определенных вариантах осуществления изобретение относится к способу диагностики, где способ предназначен для диагностики рака. В некоторых таких вариантах осуществления образец ткани выбран из группы, состоящей из образца опухоли, биопсийного материала ротовой полости, биопсийного материала слизистой оболочки ротовой полости, биопсийного материала молочной железы, биопсийного материала предстательной железы, биопсийного материала толстого кишечника, биопсийного материала слизистой оболочки толстого кишечника, биопсийного материала прямой кишки, биопсийного материала слизистой оболочки прямой кишки, биопсийного материала легкого, биопсийного материала слизистой оболочки легкого и образца мокроты.
[0146] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу диагностики рака по любому из вышеуказанных вариантов осуществления, где рак выбран из группы, состоящей из рака ротовой полости рта, рака молочной железы, рака предстательной железы, рака прямой кишки и рака легких. В некоторых таких вариантах осуществления рак представляет собой рак ротовой полости. В некоторых таких вариантах осуществления рак ротовой полости представляет собой плоскоклеточную карциному.
[0147] В некоторых вариантах осуществления, относящихся к диагностике рака, где рак представляет собой рак молочной железы, ткань представляет собой образец, как описано выше, который получают из молочной железы субъекта, например, из опухоли молочной железы.
[0148] В некоторых вариантах осуществления, относящихся к диагностике рака, где рак представляет собой рак легкого, ткань представляет собой образец, образец мокроты или биопсийный материал слизистой оболочки, как описано выше, который получают из легкого субъекта, например от опухоли легкого.
[0149] В некоторых вариантах осуществления, относящихся к диагностике рака, где рак представляет собой рак предстательной железы, ткань представляет собой образец, как описано выше, который получают из предстательной железы субъекта, например от опухоли предстательной железы.
[0150] В некоторых вариантах осуществления, относящихся к диагностике рака, где рак представляет собой рак ротовой полости, ткань представляет собой образец или биопсийный материал слизистой оболочки, как описано выше, который получают из полости рта субъекта, например, из опухоли ротовой полости.
[0151] В некоторых вариантах осуществления, относящихся к диагностике рака, где рак представляет собой колоректальный рак, ткань представляет собой образец или биопсийный материал слизистой оболочки, как описано выше, который получают из толстой или прямой кишки субъекта, например, из опухоли прямой кишки или толстого кишечника.
[0152] Хроническая обструктивная болезнь легких
[0153] В еще одних определенных вариантах осуществления изобретение относится к способу диагностики, где способ предназначен для диагностики хронической обструктивной болезни легких. В некоторых таких вариантах осуществления образец ткани выбран из группы, состоящей из образца легкого, биопсийного материала слизистой оболочки легкого и образца мокроты.
[0154] В некоторых вариантах осуществления вышеуказанных способов получение лизата включает стадию очистки. Стадия очистки может включать стадию осаждения нерастворенного вещества под действием силы тяжести или центрифугирования.
[0155] В определенных вариантах осуществления каждого из вышеуказанных способов диагностики гель-электрофорез представляет собой одномерный или двумерный гель-электрофорез. В некоторых таких вариантах осуществления гель-электрофорез представляет собой SDS-PAGE или нативный PAGE, предпочтительно SDS-PAGE.
[0156] В некоторых вариантах осуществления вышеуказанных способов детектируемый элемент выбран из группы, состоящей из флуоресцентной метки, биотиновой метки, радиоактивной метки, хелатора и биоортогонального маркера для лигирования. В некоторых таких вариантах осуществления детектируемый сигнал измеряется посредством измерения флуоресценции или радиографии. В некоторых таких вариантах осуществления измерение осуществляется посредством измерения флуоресценции, и измерение флуоресценции представляет собой флуоресценцию в геле. В некоторых таких вариантах осуществления измерению флуоресценции предшествует вторичное мечение. В некоторых таких вариантах осуществления вторичное мечение выбрано из группы, состоящей из вторичного мечения меченым стрептавидином, вторичного мечения флуорофором и вторичного мечения меченым антителом.
[0157] В некоторых вариантах осуществления каждого из вышеуказанных способов измерение детектируемого сигнала на стадии (4) включает измерение, выбранное из группы, состоящей из радиографии, гель-электрофореза и последующей радиографии. В некоторых таких вариантах осуществления указанное соединение содержит детектируемый элемент в виде радиоактивной метки. В некоторых других вариантах осуществления указанное соединение содержит детектируемый элемент в форме хелатора для радиоактивной метки. В некоторых других вариантах осуществления указанное соединение содержит детектируемый элемент в виде биоортогонального маркера для лигирования, и стадия (4) дополнительно включает вторичное мечение с помощью клик-химии для включения радиоактивной метки или хелатора для радиоактивной метки перед выполнением радиографического измерения.
[0158] В некоторых вариантах осуществления каждого из вышеуказанных способов измерение детектируемого сигнала на стадии (4) включает измерение, выбранное из группы, состоящей из аффинной очистки и последующей масс-спектрометрии, аффинной очистки и последующей протеомики. В некоторых таких вариантах осуществления указанное соединение содержит детектируемый элемент в виде биотиновой метки. В некоторых других вариантах осуществления указанное соединение содержит детектируемый элемент в виде биоортогонального маркера для лигирования, и стадия (4) дополнительно включает вторичное мечение с помощью клик-химии для включения биотиновой метки перед проведением аффинной очистки. В случае мечения биотином аффинную очистку можно проводить с использованием, например, гранул, покрытых стрептавидином, или гранул, покрытых антителом, специфичным к биотину.
[0159] В некоторых вариантах осуществления аффинную очистку можно проводить с использованием гранул, покрытых антителом, специфичным к определенной метке. В некоторых таких вариантах осуществления указанное соединение включает указанную метку в качестве детектируемого элемента. В некоторых других вариантах осуществления указанное соединение содержит детектируемый элемент в виде биоортогонального маркера для лигирования, и стадия (4) дополнительно включает вторичное мечение с помощью клик-химии для применения указанной метки перед выполнением аффинной очистки.
[0160] В некоторых вариантах осуществления каждого из вышеуказанных методов измерение детектируемого сигнала на стадии (4) включает гель-электрофорез и последующий иммуноблоттинг. В некоторых таких вариантах осуществления указанное соединение содержит детектируемый элемент в виде биотиновой метки, и стадия (4) дополнительно включает вторичное мечение, например, стрептавидином, меченным HRP, перед проведением иммуноблоттинга. В некоторых других вариантах осуществления указанное соединение содержит детектируемый элемент в виде биоортогонального маркера для лигирования, и стадия (4) дополнительно включает вторичное мечение с помощью клик-химии для включения биотиновой метки и последующее мечение, например, стрептавидином, меченным HRP, перед проведением иммуноблоттинга.
[0161] Способы ингибирования активности нейтрофильной эластазы
[0162] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу ингибирования NE in vitro, включающему:
(1) приготовление лизата из образца ткани, полученного от субъекта,
(2) контактирование лизата с соединением формулы I:
[0163]
[0164] или его солью,
где D представляет собой детектируемый элемент.
[0165] В некоторых таких вариантах осуществления образец ткани выбран из группы, состоящей из биопсийного материала ротовой полости, образца пищевода, образца желудка, образца тонкого кишечника, образца легких, образца мокроты, образца поджелудочной железы, образца костного мозга, образца толстого кишечника, образца дистального отдела толстого кишечника, образца проксимального отдела толстого кишечника, биопсийного материала молочной железы, биопсийного материала предстательной железы, биопсийного материала прямой кишки, образца печени, образца кожи, образца опухоли, образца кала и биопсийного материала слизистой оболочки. В некоторых таких вариантах осуществления образец ткани представляет собой биопсийный материал слизистой оболочки, и биопсийный материал слизистой оболочки выбран из группы, состоящей из биопсийного материала слизистой оболочки толстого кишечника, биопсийного материала дистального отдела слизистой оболочки толстого кишечника, биопсийного материала проксимального отдела слизистой оболочки толстого кишечника, биопсийного материала слизистой оболочки тонкого кишечника, биопсийного материала слизистой оболочки легких, биопсийного материала слизистой оболочки прямой кишки, биопсийного материала слизистой оболочки пищевода и биопсийного материала слизистой оболочки ротовой полости.
[0166] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу ингибирования активности нейтрофильной эластазы in vitro по любому из вышеуказанных вариантов осуществления, где субъектом является человек.
[0167] В некоторых вариантах осуществления вышеуказанных способов получение лизата включает стадию очистки. Стадия очистки может включать стадию осаждения нерастворенного вещества под действием силы тяжести или центрифугирования.
[0168] Соединения
[0169] Каждый из вышеописанных способов детектирования активности NE, способов диагностики и способов ингибирования NE in vitro включает стадию (2) контактирования лизата с соединением формулы (I):
[0170]
[0171] или его солью, где D представляет собой детектируемый элемент.
[0172] В некоторых таких вариантах осуществления на стадии (2) лизат контактирует с соединением, имеющим формулу IA:
[0173]
[0174] или его солью, где D представляет собой детектируемый элемент.
[0175] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение также относится к соединению формулы I:
[0176]
[0177] или его соли,
или к соединению формулы IA:
[0178]
[0179] или его соли,
где D представляет собой детектируемый элемент,
при условии, что соединения (формулы I или формулы IA), в которых D соответствует одной из следующих формул, не охватываются настоящим изобретением:
[0180]
[0181]
[0182]
[0183]
[0184]
[0185] где в каждой из вышеприведенных формул волнистая линия представляет точку соединения с остальной частью молекулы.
[0186] Детектируемый элемент
[0187] В некоторых вариантах осуществления детектируемый элемент выбран из группы, состоящей из флуоресцентной метки, биотиновой метки, радиоактивной метки, хелатора (например, для радиоактивной метки) и биоортогонального маркера для лигирования.
[0188] Детектируемый элемент, такой как флуоресцентная метка, биотиновая метка, радиоактивная метка, хелатор или биоортогональный маркер для лигирования, может включать линкер для включения в соединения по настоящему изобретению (т.е. для присоединения детектируемого элемента или метки к остальной части молекулы). Подходящие линкеры известны специалистам в данной области. Примеры линкеров, которые можно использовать в соединениях по настоящему изобретению, описаны в WO 2012/118715 A2 (см. стр. 18, строки 9-18), содержание которой включено здесь посредством сылки. Линкер может также включать фрагмент полиэтиленгликоля (ПЭГ), такого как ПЭГ-4, ПЭГ-6 или ПЭГ-8, для присоединения к остальной части молекулы.
[0189] Определение термина «радиоактивная метка» и примеры радиоактивных меток, которые можно использовать в соединениях по настоящему изобретению, описаны в WO 2009/124265 A1 (см. с. 11, строка 25 - стр. 13, строка 3), содержание которой включено здесь посредством ссылки.
[0190] Определение термина «хелатор» и примеры хелаторов, которые можно использовать в соединениях по настоящему изобретению, описаны в WO 2009/124265 A1 (см. с. 10, строка 26 - с. 11, строка 14), содержание которой включено здесь посредством ссылки.
[0191] Определение термина «биоортогональный маркер для лигирования» и примеры биоортогонального маркера для лигирования, которые можно использовать в соединениях по настоящему изобретению, и соответствующие «клик» реакции описаны, например, в монографии Martell et al., Applications of Copper-Catalyzed Click. Chemistry in Activity-Based Protein Profiling, Molecules 2014, 19, 1378-1393, которая включена здесь посредством ссылки. Адаптация этих методов для получения или модификации соединений по настоящему изобретению находится в пределах компетенции специалистов в данной области.
[0192] Биоортогональные реакции или клик-реакции для присоединения вторичной метки включают:
A. бесследное сочетание азидов лигированием по Штаудингеру с триарилфосфинами с образованием амидной связи,
B. циклоприсоединение тетразина с использованием 1,2,4,5-тетразина и напряженного диен (транс-циклооктена),
C. катализируемая медью (I) реакция азид-алкинового циклоприсоединения (CuAAC) между азидом и концевым алкином с образованием 1,4-дизамещенного 1,2,3-триазола, и
D. вариант азид-алкинового циклоприсоединения без присутствия меди с использованием напряженного алкина для ускорения реакции.
В этом отношении, в частности, делается ссылка на фиг. 1B и фиг. 2 в публикации Martell et al., Molecules 2014, 19, 1378-1393, содержание которой включено здесь посредством ссылки.
[0193] Таким образом, в некоторых вариантах осуществления биоортогональный маркер для лигирования содержит функциональную группу, выбранную из группы, состоящей из азида, 1,2,4,5-тетразина и алкина (такого как концевой алкин). Эти функциональные группы позволяют присоединить вторичную метку с использованием одной из вышеуказанных биоортогональных реакций (A)-(D).
[0194] В некоторых вариантах осуществления детектируемый элемент представляет собой флуоресцентную метку. Как известно специалистам в данной области техники, флуоресцентные метки излучают электромагнитное излучение, предпочтительно видимый свет, когда стимулируются поглощением падающего электромагнитного излучения. Является коммерчески доступным широкий спектр флуоресцентных меток, включая метки, содержащие реактивные группы, которые можно использовать для связывания метки с реактивными группами, такими как, например, аминогруппы, тиоловые группы и т.п. См., например, The Molecular Probes® Handbook - Руководство по флуоресцентным зондам и технологиям маркировки, которое в полном объеме включено здесь посредством ссылки.
[0195] Примеры флуоресцентных меток, которые можно использовать в соединениях по настоящему изобретению, описаны в WO 2018/119476 A1 (см. абзацы [0084]-[0095]) и в WO 2012/118715 A2 (см. стр. 15, стр. 18 до стр. 17, строка 12, и страница 18, строка 19 - страница 21, строка 1), содержание которых включено здесь посредством ссылки. Такие флуоресцентные метки могут включать линкер для включения в соединения по настоящему изобретению, например, как описано в WO 2012/118715 A2 (см. стр. 18, строки 9-18), содержание которой включено здесь посредством ссылки.
[0196] В некоторых вариантах осуществления детектируемый элемент представляет собой флуоресцентную метку. В некоторых таких вариантах осуществления флуоресцентная метка выбрана из группы, состоящей из флуоресцеина, Oregon green (фторированное производное флуоресцеина), борадиазаиндеценового красителя, родаминового красителя (такого как тетраметилродамин и карбокситетраметилродамин), красителя на основе бензопириллия, кумаринового красителя, цианиновой метки или бензоиндольной метки (например, индоцианиновый зеленый).
[0197] Коммерчески доступные примеры таких красителей включают красители BODIPY® (борадиазаиндеценовые красители), красители серии Alexa Fluor® (сульфированные родамины), красители серии DyLight® (содержащие, например, сульфированный или несульфированный кумарин, родамин, бензопирил, или цианин в качестве основной структуры), красители серии IRDye® и цианиновые (Cy) красители (например, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, Cy7.5, sCy3, sCy5 и sCy7) . Такие цианиновые этикетки можно приобрести, например, у компаний Abcam, Tocris, GoldBio, ThermoFisher, Kerafast, Lumiprobe, AAT Bioquest или W&J Pharmachem.
[0198] В некоторых вариантах осуществления флуоресцентная метка представляет собой цианиновую метку. В некоторых таких вариантах осуществления флуоресцентная метка представляет собой цианиновую метку, выбранную из группы, состоящей из Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, Cy7.5, sCy3, sCy5 и sCy7. В некоторых таких вариантах осуществления флуоресцентная метка представляет собой Cy5 или sCy5. В некоторых вариантах осуществления флуоресцентная метка представляет собой sCy5.
[0199] В некоторых вариантах осуществления флуоресцентная метка представляет собой цианиновую метку, имеющую формулу, выбранную из следующей группы формул:
[0200]
[0201]
[0202]
[0203]
[0204]
[0205]
[0206] где в каждой из вышеприведенных формул,
A выбран из группы, состоящей из CH2, C(CH3)2, C(C2H5)2, NH, N(CH3), N(C2H5), O, S и Se;
R10 выбран из группы, состоящей из $-(CH2)p-C(= O)-& и $- (CH2)q-C(=O)-NH-[CH2CH2O]r-CH2CH2-C(=O)-&;
где:
p равно 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8;
q равно 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8;
r равно 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8;
$ представляет собой точку соединения с атомом азота цианиновой группы; и & представляет собой точку соединения с остальной частью молекулы;
R11 выбран из группы, состоящей из (C1-C8) алкила и (C6-C10) арила; и
R12 представляет собой H или сульфогруппу. В некоторых вариантах осуществления R10 представляет собой $-(CH2)p-C(=O)-&. В некоторых вариантах осуществления R12 представляет собой сульфогруппу. В некоторых вариантах осуществления р равно 5, q равно 5 и r равно 4.
[0207] В некоторых вариантах осуществления, где флуоресцентная метка представляет собой цианиновую метку, имеющую одну из вышеуказанных формул,
A выбран из группы, состоящей из CH2, C(CH3)2 и C(C2H5)2;
R10 выбран из группы, состоящей из $-(CH2)p-C(=O)-& и $- (CH2)q-C(=O)-NH-[CH2CH2O]r-CH2CH2-C(=O)-&;
где:
p равно 2, 3, 4, 5 или 6;
q равно 2, 3, 4, 5 или 6;
r равно 2, 3, 4, 5 или 6;
$ представляет собой точку присоединения к атому азота цианиновой группы; и & представляет собой точку соединения с остальной частью молекулы;
R11 представляет собой (C1-C8) алкил; и
R12 представляет собой H или сульфогруппу. В некоторых вариантах осуществления R10 представляет собой $-(CH2)p-C(=O)-&. В некоторых вариантах осуществления R12 представляет собой сульфогруппу. В некоторых вариантах осуществления р равно 5, q равно 5 и r равно 4.
[0208] В некоторых вариантах осуществления, где флуоресцентная метка представляет собой цианиновую метку, имеющую одну из вышеуказанных формул,
А представляет собой C(CH3)2 или C(C2H5)2;
R10 выбран из группы, состоящей из $-(CH2)p-C(=O)-& и $- (CH2)q-C(=O)-NH-[CH2CH2O]r-CH2CH2-C(=O)-&;
где:
p равно 2, 3, 4, 5 или 6;
q равно 2, 3, 4, 5 или 6;
r равно 2, 3, 4, 5 или 6;
$ представляет собой точку присоединения к атому азота цианиновой группы; и & представляет собой точку соединения с остальной частью молекулы;
R11 представляет собой метил, этил или пропил; и
R12 представляет собой H или сульфогруппу. В некоторых вариантах осуществления R10 представляет собой $-(CH2)p-C(=O)-&. В некоторых вариантах осуществления R12 представляет собой сульфогруппу. В некоторых вариантах осуществления р равно 5, q равно 5 и r равно 4.
[0209] В некоторых вариантах осуществления, где флуоресцентная метка представляет собой цианиновую метку, имеющую одну из вышеуказанных формул,
А представляет собой C(CH3)2;
R10 выбран из группы, состоящей из $-(CH2)p-C(=O)-& и $- (CH2)q-C(=O)-NH-[CH2CH2O]r-CH2CH2-C(=O)-&;
где:
p равно 4, 5 или 6;
q равно 4, 5 или 6;
r равно 3, 4, 5 или 6;
$ представляет собой точку соединения с атомом азота цианиновой группы; и & представляет собой точку соединения с остальной частью молекулы;
R11 представляет собой метил или этил; и
R12 представляет собой H или сульфогруппу. В некоторых вариантах осуществления R10 представляет собой $-(CH2)p-C(=O)-&. В некоторых вариантах осуществления R12 представляет собой сульфогруппу. В некоторых вариантах осуществления р равно 5, q равно 5 и r равно 4.
[0210] В некоторых вариантах осуществления, где флуоресцентная метка представляет собой цианиновую метку, имеющую одну из вышеуказанных формул,
А представляет собой С(СН3)2;
R10 представляет собой $-(CH2)p-C(=O)-&; где:
p равно 4, 5 или 6; и
$ представляет собой точку присоединения к атому азота цианиновой группы; и & представляет собой точку соединения с остальной частью молекулы;
R11 представляет собой метил или этил; и
R12 представляет собой сульфогруппу. В некоторых вариантах осуществления р равно 5.
[0211] В некоторых вариантах осуществления, где флуоресцентная метка представляет собой цианиновую метку, имеющую одну из вышеуказанных формул,
А представляет собой С(СН3)2;
R10 представляет собой $-(CH2)q-C(=O)-NH-[CH2CH2O]r-CH2CH2-C(= O)-&;
где:
q равно 4, 5 или 6;
r равно 3, 4, 5 или 6;
$ представляет собой точку присоединения к атому азота цианиновой группы; и & представляет собой точку соединения с остальной частью молекулы;
R11 представляет собой метил или этил; и
R12 представляет собой H. В некоторых вариантах осуществления р равно 5 и r равно 4.
[0212] В некоторых вариантах осуществления флуоресцентная метка представляет собой цианиновую метку, имеющую формулу, выбранную из следующей группы формул:
[0213]
[0214]
[0215]
[0216] где в каждой из приведенных выше формул,
волнистая линия представляет собой точку соединения с остальной частью молекулы;
и R11 выбран из группы, состоящей из (C1-C8) алкила и (C6-C10) арила. В некоторых таких вариантах осуществления R11 представляет собой (C1-C8) алкил. В некоторых таких вариантах осуществления R11 представляет собой метил или этил.
[0217] В некоторых вариантах осуществления флуоресцентная метка представляет собой цианиновую метку, имеющую формулу,
[0218]
[0219] где волнистая линия представляет собой точку соединения с остальной частью молекулы; и R11 представляет собой метил или этил.
[0220] Таким образом, в некоторых вариантах осуществления способов детектирования активности NE, способов диагностики и способов ингибирования NE in vitro, как здесь описано на стадии (2) лизат контактирует с соединением формулы II:
[0221]
[0222] или его солью.
[0223] В некоторых таких вариантах осуществления на стадии (2) лизат контактирует с соединением формулы IIA:
[0224]
[0225] или его солью.
[0226] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение также относится к соединению формулы II:
[0227]
[0228] или его соли, или к соединению формулы IIA:
[0229]
[0230] или их соли.
[0231] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композиции, содержащей соединение (формулы I, IA, II или IIA), как здесь описано, или его соль, и эксципиент.
[0232] Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления
[0233] Настоящее изобретение теперь более полно описано со ссылкой на сопроводительные примеры. Однако следует понимать, что нижеследующее описание является только иллюстративным и никоим образом не должно рассматриваться в качестве ограничения изобретения.
[0234] Примеры
I. Синтез и характеристика соединений
[0235] Общая информация
[0236] Fmoc-аминокислоты были приобретены в Chem-Impex и Novabiochem, реагенты для сочетания были приобретены в GL Biochem, и растворители и другие реагенты были приобретены в Merck и использовались без дополнительной очистки.
Смолы были приобретены в Chem-Impex.
Cy5-acid был приобретен в Lumiprobe.
[0237] Очистку сырых пептидов с помощью ОФ-ВЭЖХ проводили в системе c насосом для четырехкомпонентных смесей Agilent 1200, с детектором на фотодиодной матрице (214 нм), используя колонку Phenomenex Axia (Luna C8(2), 50 × 21,3 мм ID), элюируя в градиенте 5-100% 0,1% ТФК/ацетонитрил в 0,1% водном растворе ТФК, более 60 мин со скоростью потока 10 мл/мин. Собранные соответствующие фракции анализировали с помощью ЖХ-МС в системе Agilent 1260SQ, включающей детектор на фотодиодной матрице (214 нм), подключенный непосредственно к квадрупольному масс-хроматографу API-ES. Объединенные фракции лиофилизировали в течение двух суток с получением очищенных пептидов в виде ТФК солей, и их чистота составила > 90% по результатам анализа обращеннофазовой ВЭЖХ, проведенного с использованием Poroshell 120 EC-C18 3,0 × 50 мм 2,7 мкм, элюируя в градиенте 5-100% ацетонитрила в 0,1% водной муравьиной кислоте в течение 3,8 мин и поддержании 100% ацетонитрила до 5 мин со скоростью потока 0,5 мл/мин, детектирование проводили при 214 нм.
[0238] Было подтверждено, что соединения имеют правильную молекулярную массу с использованием анализа API-ES MS. Масс-спектры получали в режиме отрицательных ионов с диапазоном сканирования 200-2000 m/z.
[0239] Пример 1: синтез сульфоCy5-Nle(OBzl)-Met(O)2-Oic-OH
[0240] Синтез защищенного линейного пептида (Cy5-Nle(OBzl)-Met(O)2-Oic-OH) проводили с использованием ручного пептидного синтеза со стандартной твердофазной пептидной Fmoc-химией. Синтез проводили с использованием хлортритилхлоридной смолы (загрузка 1,0 ммоль/г от Chem-Impex) из расчета 0,2 ммоль (0,3 г смолы). Связывание первой аминокислоты выполняли с Fmoc-Oic-OH (1,2 моль-экв относительно загрузки смолы) в дихлорметане (DCM), активированном 3 моль-экв диизопропилэтиламина (DIPEA). Реакцию проводили в течение ночи при комнатной температуре. Затем смолу промывали ДМФА (3 × 5 мл 2 мин каждый раз, и затем DCM 2 × 5 мл × 2 мин каждый раз), и затем подвергали воздействию раствора для снятия защиты 20% пиперидина в ДМФА (3 × 5 мл × 5 мин каждый раз) и после третьей стадии снятия защиты дали положительный результат теста на бромфеноловый синий.
[0241] Связывание последующих Fmoc-аминокислот проводили с использованием 1,5 моль-экв (относительно загрузки смолы) Fmoc- аминокислоты, PyBOP (1H-бензотриазол-1-илокси)(три-1-пирролидинил)фосфония гексафторфосфата в ДМФА (5 мл/г смолы) с активацией in situ, используя 3 моль-экв DIPEA. Реакцию проводили в течение 1 ч при комнатной температуре (rt). На этой стадии TNBS-тест использовали для контроля пептидного связывания, обеспечивающего отрицательный результат. Затем смолу промывали ДМФА (3 × 5 мл × 2 мин каждый, и затем DCM 2 × 5 мл × 2 мин. каждый раз). Затем смолу подвергали воздействию раствора для снятия защиты 20% пиперидина в ДМФА (3 × 5 мл × 5 мин каждый раз), и после третьей стадии снятия защиты получали положительный результат теста TNBS. Смолу промывали ДМФА (3 × 5 мл × 2 мин каждый рах, и затем DCM 2 × 5 мл × 2 мин каждый), и процесс связывания продолжали со следующей Fmoc-аминокислотой до завершения последовательности.
[0242] Снимали защиту с последней Fmoc-аминокислоты на пептидной смоле с использованием 20% пиперидина в ДМФА (3 × 5 мл × 5 мин каждый раз), и затем тщательно промывали ДМФА, затем DCM. Часть смолы (30 мг, 0,03 ммоль) суспендировали в смеси ДМФА:ДМСО 4:1 и к смеси добавляли сульфоСy5 кислоту (30 мг, 0,046 ммоль), затем PyBOP (0,1 ммоль) и, наконец, DIPEA (0,6 ммоль). Смесь оставляли на 24 ч при периодическом перемешивании, и затем тщательно промывали ДМСО (до получения бесцветного фильтрата), затем ДМФА, DCM, МеОН и, наконец, диэтиловым эфиром. Высушенную смолу растворяли в 5 мл HFIP (гексафторизопропанол):DCM:TIPS (об:об:об: = 30:69:1) и оставляли на 2 ч. Фильтрат отфильтровывали от смолы и смолу промывали HFIP до бесцветного состояния. Объединенный фильтрат и промывные жидкости концентрировали до остатка (10,1 мг), и затем очищали с помощью ОФ-ВЭЖХ с получением 3 мг промежуточного соединения сульфоСy5-Nle(OBzl)-Met(O)2-Oic-OH в виде синего порошка.
[0243] Соединение анализировали на чистоту измерением оптической плотности с использованием ВЭЖХ при 214 нм (фиг. 1A) и подтверждали, что оно имеет правильную молекулярную массу, с помощью анализа API-ES: рассчитано m/z; C60H79N5O14S3 [M - H]- 1189,5, [M - 2 H]2- 593,7; найдено: [M - H] 1189,0, [M - 2 H]2- 593,6 (фиг. 1B).
[0244] Пример 2: синтез PK105b
[0245]
[0246] Cy5-Nle(OBzl)-Met(O)2-Oic-OH из примера 1 (1 мг) помещали в сухой ДМСО (50 мкл) в пробирке Эппендорфа (1,5 мл) и к этой смеси добавляли PyBOP (2 моль экв), AbuP(OPh)2 · HBr (1,2 моль-экв), и затем DIPEA (6 моль-экв). Смесь перемешивали в течение 24 ч, и затем разбавляли ACN (6 мл) и очищали с помощью ОФ-ВЭЖХ с получением 0,7 мг конечного соединения PK105b в виде синего порошка.
[0247] Соединение анализировали на чистоту измерением оптической плотности с использованием ВЭЖХ при 214 нм (фиг. 2A) и подтверждали, что оно имеет правильную молекулярную массу, с помощью анализа API-ES: рассчитано m/z; C75H95N6O16PS3 [M - H] 1462,8, [M - 2 H]2 730,3; найдено: [M - H] 1462,8, [M - 2 H]2 730,2 (фиг. 2B).
[0248] II. Тестирование зондов
[0249] Общая информация
[0250] Материалы и методы
[0251] Синтез и характеристика зонда
[0252] Синтез и характеристику PK105b проводили, как описано в примерах 1 и 2. Синтез и характеристику Cy5-V-DPP проводили, как описано в публикации Edgington-Mitchell et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (2017).
[0253] Мыши
[0254] Мышей C57BL/6J получали из питомника Университета Монаша или питомника Bio21 при Мельбурнском университете. Бестимусных мышей BALB/c получали из питомника Charles River Laboratories. Если не указано иное, то эксперименты на животных были одобрены Комитетом по этике животных Университета Монаша в соответствии с руководящими принципами использования лабораторных животных в исследованиях.
[0255] Мечение рекомбинантных протеаз/флуоресцентный SDS-PAGE
Рекомбинантные протеазы (500 нг) разводили в 20 мкл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS), они включали: нейтрофильную эластазу (Elastin Products Company), трипсин поджелудочной железы свиньи типа II-S (бета-трипсин; Sigma) и протеиназу-3 человека (Sigma). PK105b или Cy5-V-DPP (0, 0,1, 0,5 или 1 мкМ) добавляли из 100× стокового раствора в ДМСО и оставляли взаимодействовать при 37°C в течение 30 мин. Белки солюбилизировали в 4× буфере для образцов (40% глицерина, 200 мМ Трис-Cl [pH 6,8], 8% SDS, 0,04% бромфенолового синего, 5% бета-меркаптоэтанола), кипятили в течение 5 мин и наносили на 15% SDS-PAGE геле. Мечение зондом детектировали сканированием геля на флуоресценцию Cy5 на планшетном лазерном сканере Typhoon 5 (GE Healthcare). Подробные протоколы для применения ABP описаны в публикации в Edgington и Bogyo, Curr. Protoc. Chem. Biol. (2013).
[0256] Мечение тканей ex vivo
[0257] Костный мозг получали вымыванием большеберцовых и бедренных костей здоровых мышей C57BL/6J с использованием PBS. Клетки промывали и ресуспендировали в PBS перед обработкой ультразвуком на льду. Поджелудочную железу, ткани толстого кишечника, биопсийный материал слизистой оболочки, легкие и опухоли лизировали ультразвуком на льду в PBS (10 мкл/мг ткани), и супернатанты очищали центрифугированием при 21 g в течение 10 мин при 4°C. Общий белок (60 мкг, как измерено с помощью анализа BCA, Pierce) разделяли на аликвоты в общем объеме 20 мкл PBS, и мечение зондом и SDS-PAGE выполняли, как описано выше.
[0258] Вестерн-блоттинг
[0259] Флуоресцентные гели переносили на нитроцеллюлозные мембраны и подвергали блоттингу с использованием системы Turbo Blot (BioRad). Мембраны блокировали с использованием блокирующего буфера LiCor Odyssey, разбавленного на 50% PBS, содержащего 0,05% Твина 20. Овечьи антитела против мышиной нейтрофильной эластазы/ELA2 (1:1000; R&D AF4517) инкубировали в течение ночи при 4°C. Вторичное антитело (козье IR800, 1:5000; LiCor) инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Связывание детектировали сканированием с фильтром IRLong на планшетном лазерном сканере Typhoon 5 (GE Healthcare).
[0260] Иммунопреципитация
[0261] Лизаты, меченные PK105b (кипяченные в буфере для образцов в течение 5 мин), разделяли на входные образцы и образцы для иммунопреципитации (IP) (по 100 мкг каждого). Образцы IP разводили в 500 мкл буфера IP (PBS [pH 7,4], 1 мМ EDTA, 0,5% NP-40) вместе с 10 мкл одного из следующих антител: овечьи антитела против нейтрофильной эластазы/ELA2 (R&D AF4517); кроличьи анти-PRSS3 (Трипсин 3; Abcam ab105123); кроличьи против эластазы поджелудочной железы (Abcam ab21593). Гранулы белка A/G (40 мкл суспензии; Santa Cruz) промывали IP-буфером, и затем добавляли к образцу. Пробирки встряхивали в течение ночи при 4°C. Гранулы промывали четыре раза IP-буфером и один раз 0,9% хлоридом натрия. После последней промывки весь буфер удаляли и гранулы кипятили в 2× буфере для образцов (20 мкл) в течение 5 мин. Затем супернатанты анализировали вместе с исходным образцом с использованием флуоресцентного SDS-PAGE, как описано выше.
[0262] Модель колита
[0263] Колит индуцировали у самцов мышей C57BL/6J в возрасте 10 недель инфузией раствора пикрилсульфоновой кислоты в толстую кишку (раствор 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислоты, TNBS; Sigma; 2,5 мг растворенных в 50% этаноле). Массу тела и симптомы колита регистрировали ежедневно, и мышей гуманно умерщвляли через 3 суток. При экстракции толстого кишечника собирали люминальные жидкости промыванием толстого кишечника PBS. Твердые частицы удаляли центрифугированием, и супернатант концентрировали с использованием центробежного фильтра с отсечением по молекулярной массе 3 кДа (Amgen). Кусочки проксимального и дистального отделов толстого кишечника замораживали для анализа протеаз или фиксировали в 4% параформальдегиде в течение ночи, заливали парафином, готовили срезы и окрашивали гематоксилином и эозином.
[0264] Биопсия слизистой оболочки человека
[0265] Биопсийный материал слизистой оболочки человека был отобран у людей во время процедур колоноскопии в больнице Hotel Dieu в Kingston, Ontario, Канада (таблица 1). Пациенты представляли собой хорошо охарактеризованных субъектов с активным язвенным колитом (UC) или здоровых субъектов, которые проходили рутинную колоноскопию для скрининга рака. У пациентов с UC биопсийный материал был отобран из участков активного воспаления. Письменное и устное согласие было получено до включения в исследование, и все протоколы были одобрены Комитетом по этике человека Королевского университета. Свежие биоптаты промывали PBS и затем быстро замораживали для анализа протеаз, как описано выше.
[0266]
Данные по пациентам-людям
20 дефекаций/сутки
препараты
слепые биопсии
шкале Мейо 1-2
[0267] Мышиная модель инфекции Legionella pneumophila
[0268] Данные эксперименты проводили с одобрения Комитета по этике животных Мельбурнского университета в соответствии с руководящими принципами использования лабораторных животных в исследованиях. Мышей C57BL/6J инфицировали интраназальной инокуляцией 2,5 × 106 L. pneumophila 130b ΔflaA в 50 мкл PBS. Через 3 суток после инфицирования легкие собирали, быстро замораживали и обрабатывали, как указано выше, для маркировки PK105b.
[0269] Мышиная модель рака ротовой полости
[0270] Данные эксперименты были одобрены Комитетом по исследованиям на животных Нью-Йоркского университета в соответствии с руководящими принципами использования лабораторных животных в исследованиях. Самкам бестимусных мышей BALB/c (в возрасте 6-8 недель, Charles River Laboratories) инъецировали в левую боковую область языка под анестезией (3 × 105 клеток плоскоклеточной карциномы ротовой полости человека HSC-3, суспендированные в 50 мкл носителя [смесь DMEM и матригеля 1:2]; Becton Dickson] или только носитель). Через две недели полученные опухолевые ксенотрансплантаты и образцы языка с инъецированным носителем вырезали, быстро замораживали и обрабатывали, как описано выше, для мечения PK105b.
[0271] Статистический анализ
[0272] Все эксперименты проводили, по меньшей мере, с тремя биологическими повторами. Данные представлены в виде среднего значения ± SEM. Статистическую достоверность определяли сравнением двух групп с использованием t-критерия Стьюдента, и значения p ниже 0,05 считались значимыми.
[0273] Пример 3: селективность PK105b для очищенных сериновых протеаз
[0274] Проверяли реактивность PK105b для рекомбинантных сериновых протеаз человека, и его эффективность сравнивали с Cy5-V-DPP. После непродолжительной инкубации возрастающих количеств PK105b (0, 0,1, 0,5 или 1 мкМ) с равными количествами сериновых протеаз (нейтрофильная эластаза (NE), протеиназа-3 (PR-3) или трипсин) смеси разделяли SDS-PAGE и связывание Cy5-V-DPP или PK105b с сериновыми протеазами детектировали с помощью флуоресценции в геле.
[0275] Оба зонда четко метили NE и PR-3 в зависимости от концентрации (фиг. 3A), хотя PK105b был более активным, чем Cy5-V-DPP. PK105b также метил трипсин, другую сериновую протеазу, в то время как связывание трипсина с помощью Cy5-V-DPP было незначительным (фиг. 3A, нижние панели).
[0276] Пример 4: профиль селективности PK105b в лизатах тканей
[0277] Способность PK105b детектировать активность сериновой протеазы в лизатах тканей тестировали и сравнивали с Cy5-V-DPP.
[0278] PK105b приводил к мечению нескольких полос в лизатах, приготовленных из костного мозга мышей, в концентрации 0,1, 0,5 и 1 мкМ, и он проявлял большую активность, чем Cy5-V-DPP (фиг. 4A). Из этих полос было подтверждено, что белок 25 кДа представляет собой NE с использованием иммунопреципитации с антителом, специфичным к NE (фиг. 4B).
[0279] Также исследовали реактивность Cy5-V-DPP и PK105b в лизатах, приготовленных из поджелудочной железы мышей, ткани, богатой сериновыми протеазами. В данном случае PK105b эффективно метил белки с молекулярной массой 25 кДа в концентрации 0,1, 0,5 и 1 мкМ, что не наблюдали с Cy5-V-DPP (фиг. 4C). Иммунопреципитация лизатов поджелудочной железы мышей, меченных PK105b, показала, что мишени состояли из комбинации NE, панкреатической эластазы (PE) и трипсина 3 (Try3, также известного как PRSS3 или мезотрипсин; фиг. 4D).
[0280] Пример 5: применение PK105b для оценки активации NE при экспериментальном колите
[0281] PK105b использовали для исследования применения NE во время острого экспериментального колита, вызванного тринитробензолсульфонатом (TNBS). У мышей, у которых был индуцирован экспериментальный колит, наблюдали жидкий стул, замедленную дефекацию, потерю массы тела и укорочение толстой кишки. Гистологическое исследование выявило повреждение слизистой, отек и воспалительный инфильтрат. Лизаты толстой кишки анализировали на активацию NE посредством мечения PK105b и измерения флуоресценции в геле. В дистальном отделе воспаленной толстой кишки, который наиболее подвержен влиянию на модели TNBS, наблюдали четкое мечение одного белка с молекулярной массой 25 кДа (фиг. 5A, верхний ряд, левая панель). Данная полоса практически отсутствовала в дистальных отделах толстой кишки здоровых мышей, которым вводили носитель вместо TNBS, а также в более проксимальных областях здоровой и воспаленной толстой кишки (фиг. 5A, верхний ряд). Идентичность полосы подтверждали как соответствующую NE с помощью иммунопреципитации с NE-специфическим антителом (фиг. 5B).
[0282] Флуоресцентные гели переносили на нитроцеллюлозные мембраны для иммуноблоттинга образцов на общую экспрессию NE. В дистальных отделах толстой кишки здоровых мышей наблюдали проформу NE с молекулярной 37 кДа, а также зрелую форму с молекулярной массой 25 кД (фиг. 5A, нижний ряд, левая панель). В толстой кишке, обработанной TNBS, полоса 25 кДа проявлялась в виде дублета. Только белки с более низкой молекулярной массой были мечены PK105b. Чтобы убедиться, что появление таких вариантов NE с более низкой молекулярной массой не является артефактом мечения зондом, образцы воспаленного дистального отдела толстой кишки были подвергнуты иммуноблоттингу в присутствии и в отсутствие PK105b. Белки с более низкой молекулярной массой детектировались независимо от присутствия PK105b (фиг. 5C). Кроме того, более мелкие белки не детектировались в проксимальном отделе толстой кишки мышей, обработанных TNBS (фиг. 5A, правая колонка панелей). В совокупности, полученные данные позволяют предположить, что NE подвергается усечению в воспаленных областях толстой кишки, что делает возможным ее активацию и, таким образом, ее взаимодействие с зондом PK105b.
[0283] Для сравнения зонд Cy5-V-DPP также тестировали в лизатах дистальных отделов толстого кишечника. Мечение молекул с массой 25 кДа едва отличалось от фона (фиг. 6А). Таким образом, PK105b явно превосходит Cy5-V-DPP по способности детектировать активность NE в лизатах тканей. Оба зонда демонстрируют связывание с несколькими видами в диапазоне 50-75 кДа (фиг. 5A, 6A).
[0284] Кроме того, секретируемые сериновые протеазы, обнаруженные в просвете толстого кишечника (люминальные промывные воды или в фекальных гранулах), также тестировали с PK105b (фиг. 6B-C). В обоих образцах наблюдали две меченые сериновые протеазы с молекулярной массой 25 кДа. Иммунопреципитация подтвердила низкие уровни NE в этих образцах, где преобладающими белками были панкреатическая эластаза и трипсин 3 (фиг. 6D). Тем не менее, активность NE можно четко детектировать с помощью PK105b в лизатах из тканей толстого кишечника.
[0285] Пример 6: применение PK105b для оценки активации NE в биоптатах слизистой оболочки от пациентов с воспалительным заболеванием кишечника (IBD)
[0286] Для переноса данных, полученных при колите у мышей, на пациентов, исследовали мечение PK105b в биоптатах слизистой оболочки толстого кишечника человека. Как и у мышей, наблюдали достоверное увеличение количества меток в образцах от пациентов с активным язвенным колитом (UC) по сравнению со здоровыми людьми, проходившими рутинное обследование колоноскопией (фиг. 7A, верхняя панель, 7B). В отличие от мышей, у которых наблюдали один белок с молекулярной массой 25 кДа, меченный PK105b, три вида белка были меченными в лизатах слизистой оболочки человека, где самый мелкий белок имел наибольшую активность. Картина полос напоминала ту, которую наблюдали с рекомбинантной человеческой NE (фиг. 3A-B и Schultz-Fincke et al., ACS Med. Chem. Lett. (2018), Dau et al, Nat. Comm. (2015)). Было подтверждено, что эти полосы соответствуют NE с использованием иммунопреципитации с помощью специфичного к NE антитела (фиг. 7C).
[0287] Кроме того, когда те же образцы подвергали иммуноблоттингу на общую экспрессию NE, то наблюдали проформу и зрелые формы NE в здоровой ткани с молекулярной массой 37 и 25 кДа соответственно (фиг. 7A, нижняя панель). Ткани при UC, однако, показали дополнительный дублет, который имел молекулярную массу меньше, чем у белков с массой 25 кДа. Наиболее активные варианты, на что указывает мечение PK105b, соответствуют этим более мелким вариантам. Таким образом, как наблюдали и при колите мышей, NE подвергается дифференциальному усечению во время UC человека, что делает возможным ее активацию и связывание с PK105b.
[0288] Пример 7: применение PK105b для оценки активации NE при инфекции Legionella pneumophila
[0289] Эффективность PK105b для оценки активации NE во время инфекции исследовали на модели инфекции Legionella pneumophila на мышах. Мечение PK105b было достоверно выше в лизатах, приготовленных из инфицированных тканей легких, по сравнению с контрольными легкими (фиг. 8A, верхняя панель, 8B). Идентичность основных белков с молекулярной массой 25 кДа была подтверждена иммуноблоттингом (фиг. 8A, нижняя панель) и иммунопреципитацией (фиг. 8C) специфическим к NE антителом.
[0290] Пример 8: применение PK105b для оценки активации NE при раке ротовой полости
[0291] Для определения применимости PK105b для детектирования активации NE при раке, использовали модель ксенотрансплантата плоскоклеточной карциномы ротовой полости на мышах, где раковые клетки человека (HSC-3) вводили в язык. В этом контексте наблюдали четкое мечение белков 25 кДа в опухолевых тканях, но не в нормальных тканях языка (фиг. 9A, верхняя панель, 9B). Данный продукт совпадал с размером зрелой NE, что определяли иммуноблоттингом (фиг. 9A, нижняя панель), а также иммунопреципитацией (фиг. 9C) со специфическим к NE антителом. Несколько других неидентифицированных высокомолекулярных продуктов в этих лизатах были обильно мечены PK105b.
[0292] Настоящие примеры, способы, процедуры, конкретные соединения и молекулы приведены для примера и иллюстрации изобретения и никоим образом не должны рассматриваться в качестве ограничивающих объем изобретения, который определяется буквальным и эквивалентным объемом прилагаемой формулы изобретения. Любые патенты или публикации, упомянутые здесь, указывают на уровни специалистов в области, к которой относится патент, и предназначены для приведения деталей изобретения, которые не могут быть подробно изложены, но будут понятны специалистам в данной области. Такие патенты или публикации включены в настоящее описание в качестве ссылки в той же степени, как если бы каждый был специально и индивидуально включен в качестве ссылки и с целью описания и возможности использования указанной метода или материала.
[0293] Ссылки
Dau T., Sarker R.S.J., Yildirim A.O., Eickelberg O., Jenne D.E. Autoprocessing of neutrophil elastase near its active site reduces the efficiency of natural and synthetic elastase inhibitors. Nat. Comm., 6: 1-8, 2015.
Demkow U., van Overveld F. Role of elastases in the pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease: implications for treatment. Eur. J. Med. Res., 2:27-35, 2010.
Deu, E., Verdoes, M., and Bogyo, M., New approaches for dissecting protease functions to improve probe development and drug discovery. Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 9−16, 2012.
Edgington L.E., Bogyo M. In vivo imaging and biochemical characterization of protease function using fluorescent activity-based probes. Curr. Protoc. Chem. Biol., 5: 25-44, 2013.
Edgington L.E., Verdoes M., Bogyo M. Functional imaging of proteases: recent advances in the design and application of substrate-based and activity-based probes. Curr. Op. Chem. Biol., 15: 798-805, 2011.
Edgington-Mitchell L.E., Barlow N., Aurelio L., Samha A., Szabo M., Graham B., Bunnett N. Fluorescent diphenylphosphonate-based probes for detection of serine protease activity during inflammation. Bioorganic. Med. Chem. Lett., 27: 254-260, 2017.
Edgington-Mitchell L.E. Pathophysiological roles of proteases in gastrointestinal disease. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 310: G234-239, 2015.
Gecse K., Róka R., Ferrier L., Leveque M., Eutamene H., Cartier C., Ait-Belgnaoui A., Rosztoczy A., Izbeki F., Fioramonti J., Wittmann T., Bueno L. Increased faecal serine protease activity in diarrhoeic IBS patients: a colonic lumenal factor impairing colonic permeability and sensitivity. Gut., 57: 591-599, 2008.
Jimenez-Vargas N.N., Pattison L.A., Zhao P., Lieu T., Latorre R., Jensen D.D., Castro J., Aurelio L., Le G.T., Flynn B., Herenbrink C.K., Yeatman H.R., Edgington-Mitchell L., Porter C.J.H., Halls M.L., Canals M., Veldhuis N.A,, Poole D.P., McLean P., Hicks G.A., Scheff N., Chen E., Bhattacharya A., Schmidt B.L., Brierley S.M., Vanner S.J., Bunnett N.W. Protease-activated receptor-2 in endosomes signals persistent pain of irritable bowel syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci., 115: E7438-E7447, 2018.
Kasperkiewicz P., Altman Y., D’Angelo M., Salvesen G.S., Drag M. Toolbox of Fluorescent Probes for Parallel Imaging Reveals Uneven Location of Serine Proteases in Neutrophils. J. Am. Chem. Soc., 139: 10115-10125, 2017.
Kasperkiewicz P., Poreba M., Groborz K., Drag M. Emerging challenges in the design of selective protease substrates, inhibitors and activity-based probes for indistinguishable proteases. FEBS J., 284: 1518-1539, 2017.
Kasperkiewicz P., Poreba M., Snipas S.J., Parker H., Winterbourn C.C., Salvesen G.S., Drag M. Design of ultrasensitive probes for human neutrophil elastase through hybrid combinatorial substrate library profiling. Proc. Natl. Acad. Sci., 111: 2518-2523, 2014.
Kobayashi S.D., Voyich J.M., Burlak C., DeLeo F.R. Neutrophils in the innate immune response. Arch. Immunol. Ther. Exp., 53:505-517, 2005.
Korkmaz B., Horwitz M.S., Jenne D.E., Gauthier F. Neutrophil elastase, proteinase 3, and cathepsin G as therapeutic targets in human diseases. Pharmacol. Rev., 62: 726-759, 2010.
Kuno Y., Ina K., Nishiwaki T., Tsuzuki T., Shimada M., Imada A., Nishio Y., Nobata K., Suzuki T., Ando T., Hibi K., Nakao A., Yokoyama T., Yokoyama Y., Kusugami K. Possible involvement of neutrophil elastase in impaired mucosal repair in patients with ulcerative colitis. J. Gastroenterol., 37: 22-32, 2002.
Lechtenberg B.C., Kasperkiewicz P., Robinson H., Drag M., Riedl S.J. The Elastase-PK101 Structure: Mechanism of an Ultrasensitive Activity-based Probe Revealed. ACS Chem. Biol., 10: 945-951, 2015.
Lerman I., Hammes S.R. Neutrophil elastase in the tumor microenvironment. Steroids, 133:96-101, 2018.
Lieu T., Savage E, Zhao P., Edgington-Mitchell L., Barlow N., Bron R., Poole D.P., McLean P., Lohman R.J., Fairlie D.P., Bunnett N.W. Antagonism of the proinflammatory and pronociceptive actions of canonical and biased agonists of protease-activated receptor-2. Brit. J. Pharmacol., 173: 2752-2765, 2016.
Martell J., Weerapana E. Applications of Copper-Catalyzed Click Chemistry in Activity-Based Protein Profiling. Molecules, 19:1378-1393, 2014.
Morohoshi Y., Matsuoka K., Chinen H., Kamada N., Sato T., Hisamatsu T., Okamoto S., Inoue N., Takaishi H., Ogata H., Iwao Y., Hibi T. Inhibition of neutrophil elastase prevents the development of murine dextran sulfate sodium-induced colitis. J. Gastroenterol., 41: 318-324, 2006.
Motta J.P., Bermudez-Humaran L.G., Deraison C., Martin L., Rolland C., Rousset P., Boue J., Dietrich G., Chapman K., Kharrat P., Vinel J.P., Alric L., Mas E., Sallenave J.M., Langella P., Vergnolle N. Food-Grade Bacteria Expressing Elafin Protect Against Inflammation and Restore Colon Homeostasis. Sci. Trans. Med., 4: 158ra144-158ra144, 2012.
Motta J.P., Magne L., Descamps D., Rolland C., Dale C.S., Rousset P., Martin L., Cenac N., Balloy V., Huerre M., Fröhlich L.F., Jenne D., Wartelle J., Belaaouaj A., Mas E., Vinel J.P., Alric L., Chignard M., Vergnolle N., Sallenave J.M. Modifying the Protease, Antiprotease Pattern by Elafin Overexpression Protects Mice from Colitis. Gastroenterol., 140: 1272-1282, 2011.
Narita Y., Naoki K., Horiuchi N., Hida N., Okamoto H., Kunikane H., Watanabe K. [A case of legionella pneumonia associated with acute respiratory distress syndrome (ARDS) and acute renal failure treated with methylprednisolone and sivelestat][Article in Japanese]. Nihon Kokyuki Gakkai Zasshi, 45:413-8, 2007.
Polverino E., Rosales-Mayor E., Dale G.E., Dembowsky K., Torres A. The Role of Neutrophil Elastase Inhibitors in Lung Diseases. Chest., 152:249-262, 2017.
Rawlings N.D. and Salvesen G. Handbook of Proteolytic Enzymes, Third edition, Academic Press, Waltham, MA, 2012.
Reeves E.P., Lu H., Jacobs H.L., Messina C.G., Bolsover S., Gabella G., Potma E.O., Warley A., Roes J., Segal A.W. Killing activity of neutrophils is mediated through activation of proteases by K+ flux. Nature, 416:291-297, 2002.
Schulz-Fincke A-C., Blaut M., Braune A., Gütschow M. A BODIPY-Tagged Phosphono Peptide as Activity-Based Probe for Human Leukocyte Elastase. ACS Med. Chem. Lett., 9: 345-350, 2018.
Uchiyama K., Naito Y., Takagi T., Mizushima K., Hirai Y., Hayashi N., Harusato A., Inoue K., Fukumoto K., Yamada S., Handa O., Ishikawa T., Yagi N., Kokura S., Yoshikawa T. Serpin B1 protects colonic epithelial cell via blockage of neutrophil elastase activity and its expression is enhanced in patients with ulcerative colitis. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 302: G1163-G1170, 2012.
Willems L.I., van der Linden W.A, Li N., Li K.Y., Liu N., Hoogendoorn S., van der Marel G.A., Florea B.I., Overkleeft H.S. Bioorthogonal chemistry: Applications in activity-based protein profiling. Acc. Chem. Res., 44:718-729, 2011.
Zhao P., Lieu T., Barlow N., Sostegni S., Haerteis S., Korbmacher C., Liedtke W., Jimenez-Vargas N.N., Vanner S.J., Bunnett N.W. Neutrophil Elastase Activates Protease-activated Receptor-2 (PAR2) and Transient Receptor Potential Vanilloid 4 (TRPV4) to Cause Inflammation and Pain. J. Biol. Chem., 290: 13875-13887, 2015.
[0294] Дополнительные варианты осуществления изобретения включают:
[0295] 1. Способ детектирования активности нейтрофильной эластазы (NE) в лизате образца ткани, включающий:
(1) приготовление лизата из образца ткани, полученного от субъекта,
(2) контактирование лизата с соединением формулы I:
[0296]
[0297] или его солью,
где D представляет собой детектируемый элемент,
(3) последующее подвергание, по меньшей мере, аликвоты лизата со стадии (2) гель-элетрофорезу; и затем
(4) измерение детектируемого сигнала.
[0298] 2. Способ по п.1, дополнительно включающий после стадии (3) стадию:
(5) иммуноблоттинга с анти-NE антителом.
[0299] 3. Способ по пп.1 или 2, где дополнительно выполняют следующие стадии:
(3a) иммунопреципитация соединения формулы I в отдельной аликвоте лизата со стадии (2) с использованием антитела, специфического для соединения формулы I или его фрагмента,
(4а) последующий анализ сопреципитированного материала.
[0300] 4. Способ по п.3, где анализ на стадии (4а) включает:
- гель-электрофорез и последующий иммуноблоттинг с использованием анти-NE антитела, или
- секвенирование белка,
и предпочтительно включает гель-электрофорез и последующий иммуноблоттинг с использованием анти-NE антитела.
[0301] 5. Способ по любому из предшествующих пунктов, где перед стадией (2) аликвоту лизата со стадии (1) предварительно обрабатывают специфическим ингибитором NE, и где предварительно обработанную аликвоту затем обрабатывают аналогично необработанному лизату со стадии (1).
[0302] 6. Способ по любому из предшествующих пунктов, где образец ткани выбран из группы, состоящей из биопсийного материала ротовой полости, образца пищевода, образца желудка, образца тонкой кишки, образца легкого, образца мокроты, образца поджелудочной железы, образца костного мозга, образца толстого кишечника, образца дистального отдела толстого кишечника, образца проксимального отдела толстого кишечника, биопсийного материала молочной железы, биопсийного материала предстательной железы, биопсийного материала прямой кишки, образца печени, образца кожи, образца опухоли, образца кала и биопсийного материала слизистой оболочки.
[0303] 7. Способ по п.6, где биопсийный материал слизистой оболочки выбран из группы, состоящей из биопсийного материала слизистой оболочки толстого кишечника, биопсийного материала дистального отдела слизистой оболочки толстого кишечника, биопсийного материала проксимального отдела слизистой оболочки толстого кишечника, биопсийного материала слизистой оболочки тонкого кишечника, биопсийного материала слизистой оболочки легкого, биопсийного материала слизистой оболочки прямой кишки, биопсийного материала слизистой оболочки пищевода и биопсийного материала слизистой оболочки ротовой полости.
[0304] 8. Способ по любому из предшествующих пунктов, где субъектом является человек.
[0305] 9. Способ по любому из предшествующих пунктов, где детектируют активированную форму NE, которая представляет собой усеченную форму зрелой NE.
[0306] 10. Способ по п.9, где образец ткани выбран из группы, состоящей из биопсийного материала ротовой полости, образца пищевода, образца желудка, образца тонкого кишечника, образца толстого кишечника, образца проксимального отдела толстого кишечника, образца дистального отдела толстого кишечника, образца прямой кишки, образца кала и биопсийного материала слизистой оболочки.
[0307] 11. Способ по п.10, где образец ткани представляет собой биопсийный материал слизистой оболочки, выбранный из группы, состоящей из биопсийного материала слизистой оболочки ротовой полости, биопсийного материала слизистой оболочки пищевода, биопсийного материала слизистой оболочки тонкого кишечника, биопсийного материала слизистой оболочки толстого кишечника и биопсийного материала слизистой оболочки прямой кишки.
[0308] 12. Способ диагностики заболевания, ассоциированного с активностью NE, у субъекта, включающий:
(1) приготовление лизата из образца ткани, полученного от субъекта,
(2) контактирование лизата с соединением формулы I:
[0309]
[0310] или его солью,
где D представляет собой детектируемый элемент,
(3) последующего подвергания лизата гель-электрофорезу; и затем
(4) измерение детектируемого сигнала.
[0311] 13. Способ по п.12, где заболевание, ассоциированное с активностью NE, выбрано из группы, состоящей из целиакии, нарушения моторики желудочно-кишечного тракта, боли, зуда, кожного заболевания, ожирения, вызванного рационом, нарушения обмена веществ, астмы, ревматоидного артрита, пародонтита, воспалительного заболевания желудочно-кишечного тракта, функционального расстройства желудочно-кишечного тракта, рака, фиброзного заболевания, метаболической дисфункции, неврологического заболевания, хронической обструктивной болезни легких (COPD) и инфекции.
[0312] 14. Способ по п.12, где заболевание, ассоциированное с активностью NE, выбрано из группы, состоящей из воспалительного заболевания кишечника, инфекции, хронической обструктивной болезни легких и рака.
[0313] 15. Способ по любому из пп.12-14, дополнительно включающий после стадии (3) стадию:
(5) иммуноблоттинга с анти-NE антителом.
[0314] 16. Способ по любому из пп.12-15, где дополнительно выполняют следующие стадии:
(3a) иммунопреципитация соединения формулы I в отдельной аликвоте лизата со стадии (2) с использованием антитела, специфичного для соединения формулы I или его фрагмента,
(4а) последующий анализ сопреципитированного материала.
[0315] 17. Способ по п.16, где анализ на стадии (4а) включает:
- гель-электрофорез и последующий иммуноблоттинг с использованием анти-NE антитела, или
- секвенирование белка,
и предпочтительно включает гель-электрофорез и последующий иммуноблоттинг с использованием анти-NE антитела.
[0316] 18. Способ по любому из пп.12-17, где перед стадией (2) аликвоту лизата со стадии (1) предварительно обрабатывают специфическим ингибитором NE, и предварительно обработанную аликвоту затем обрабатывают аналогично необработанному лизату со стадии (1).
[0317] 19. Способ по любому из пп.12-18, где образец ткани выбран из группы, состоящей из биопсийного материала ротовой полости, образца пищевода, образца желудка, образца тонкого кишечника, образца легкого, образца мокроты, образца поджелудочной железы, образца костного мозга, образца толстого кишечника, образца дистального отдела толстого кишечника, образца проксимального отдела толстого кишечника, биопсийного материала молочной железы, биопсийного материала предстательной железы, биопсийного материала прямой кишки, образца печени, образца кожи, образца опухоли, образца кала и биопсийного материала слизистой оболочки.
[0318] 20. Способ по п.19, где биопсийный материал слизистой оболочки выбран из группы, состоящей из биопсийного материала слизистой оболочки толстого кишечника, биопсийного материала дистального отдела слизистой оболочки толстого кишечника, биопсийного материала проксимального отдела слизистой оболочки толстого кишечника, биопсийного материала слизистой оболочки тонкого кишечника, биопсийного материала слизистой оболочки легких, биопсийного материала слизистой оболочки прямой кишки, биопсийного материала слизистой оболочки пищевода и биопсийного материала слизистой оболочки ротовой полости.
[0319] 21. Способ по любому из пп.12-20, где субъектом является человек.
[0320] 22. Способ по любому из пп.12-21, где способ предназначен для диагностики воспалительного заболевания кишечника.
[0321] 23. Способ по п.22, где детектируют активированную форму NE, которая является усеченной формой зрелой NE.
[0322] 24. Способ по п.23, где у субъекта диагностируется воспалительное заболевание кишечника, если детектирована активированная форма NE.
[0323] 25. Способ по любому из пп.22-24, где образец ткани выбран из группы, состоящей из биопсийного материала ротовой полости, образца пищевода, образца желудка, образца тонкого кишечника, образца проксимального отдела толстого кишечника, образца дистального отдела толстого кишечника, образца прямой кишки, образца кала и биопсийного материала слизистой оболочки.
[0324] 26. Способ по п.25, где образец ткани представляет собой биопсийный материал слизистой оболочки, выбранный из группы, состоящей из биопсийного материала слизистой оболочки ротовой полости, биопсийного материала слизистой оболочки пищевода, биопсийного материала слизистой оболочки тонкого кишечника, биопсийного материала слизистой оболочки толстого кишечника и биопсийного материала слизистой прямой кишки.
[0325] 27. Способ по любому из пп. 12-26, где воспалительное заболевание кишечника выбрано из группы, состоящей из острого колита, язвенного колита, болезни Крона, микроскопического колита, диверсионного колита, болезни Бехчета, иммуноонкологического колита, колита в результате химиотерапии/ лучевой терапии, колита на фоне синдрома «трансплантат против хозяина», коллагенозного колита, лимфоцитарного колита колита и неопределенной этиологии и поухита.
[0326] 28. Способ по любому из пп.12-27, где воспалительное заболевание кишечника представляет собой язвенный колит.
[0327] 29. Способ по любому из пп.12-27, где воспалительное заболевание кишечника представляет собой болезнь Крона.
[0328] 30. Способ по любому из пп.12-21, где способ предназначен для диагностики инфекции.
[0329] 31. Способ по п.30, где инфекция выбрана из группы, состоящей из бактериальной инфекции и грибковой инфекции.
[0330] 32. Способ по пп.30 или 31, где образец ткани представляет собой образец инфицированной ткани.
[0331] 33. Способ по любому из пп.30-32, где инфекция представляет собой инфекцию легкого.
[0332] 34. Способ по п.33, где инфекция легкого представляет собой бактериальную инфекцию.
[0333] 35. Способ по п.34, где бактериальная инфекция представляет собой инфекцию, вызванную Legionella.
[0334] 36. Способ по любому из пп.33-35, где образец ткани выбран из группы, состоящей из образца легкого, биопсийного материала слизистой оболочки легкого или образца мокроты.
[0335] 37. Способ по любому из пп.12-21, где способ предназначен для диагностики рака.
[0336] 38. Способ по п.37, где образец ткани выбран из группы, состоящей из образца опухоли, биопсийного материала ротовой полости, биопсийного материала слизистой оболочки ротовой полости, биопсийного материала молочной железы, биопсийного материала предстательной железы, биопсийного материала толстого кишечника, биопсийного материала слизистой оболочки толстого кишечника, биопсийного материала прямой кишки, биопсийного материала слизистой оболочки прямой кишки, биопсийного материала легкого, биопсийного материала слизистой оболочки легкого и образца мокроты.
[0337] 39. Способ по пп.37 или 38, где рак выбран из группы, состоящей из рака ротовой полости, рака молочной железы, рака предстательной железы, рака прямой кишки и рака легких.
[0338] 40. Способ по любому из пп.37-39, где рак представляет собой рак ротовой полости, и рак ротовой полости представляет собой плоскоклеточную карциному.
[0339] 41. Способ по любому из пп.12-21, где способ предназначен для диагностики хронической обструктивной болезни легких.
[0340] 42. Способ по п.41, где образец ткани выбран из группы, состоящей из образца легкого, биопсийного материала слизистой оболочки легкого и образца мокроты.
[0341] 43. Способ ингибирования NE in vitro, включающий:
(1) приготовление лизата из образца ткани, полученного от субъекта,
(2) контактирование лизата с соединением формулы I:
[0342]
[0343] или его солью,
где D представляет собой детектируемый элемент.
[0344] 44. Способ по п.43, где образец ткани выбран из группы, состоящей из биопсийного материала ротовой полости, образца пищевода, образца желудка, образца тонкого кишечника, образца легкого, образца мокроты, образца поджелудочной железы, образца костного мозга, образца толстого кишечника, образца дистального отдела толстого кишечника, образца проксимального отдела толстого кишечника, биопсийного материала молочной железы, биопсийного материала предстательной железы, биопсийного материала прямой кишки, образца печени, образца кожи, образца опухоли, образца кала и биопсийного материала слизистой оболочки.
[0345] 45. Способ по п.44, где биопсийный материал слизистой оболочки выбран из группы, состоящей из биопсийного материала слизистой оболочки толстого кишечника, биопсийного материала дистального отдела слизистой оболочки толстого кишечника, проксимального отдела слизистой оболочки толстого кишечника, биопсийного материала слизистой оболочки тонкого кишечника, биопсийного материала слизистой оболочки легких, биопсийного материала слизистой оболочки прямой кишки, биопсийного материала слизистой оболочки пищевода и биопсийного материала слизистой оболочки ротовой полости.
[0346] 46. Способ по любому из пп.43-45, где субъектом является человек.
[0347] 47. Способ по любому из предшествующих пунктов, где получение лизата включает стадию очистки.
[0348] 48. Способ по любому из пп.1-42 и 47, где гель-электрофорез представляет собой одномерный или двумерный гель-электрофорез.
[0349] 49. Способ по любому из пп.1-42, 47 и 48, где гель-электрофорез представляет собой SDS-PAGE или нативный PAGE, предпочтительно SDS-PAGE.
[0350] 50. Способ по любому из предшествующих пунктов, где детектируемый элемент выбран из группы, состоящей из флуоресцентной метки, биотиновой метки, радиоактивной метки, хелатора и биоортогонального маркера для лигирования.
[0351] 51. Способ по любому из пп.1-42 и 47-50, где детектируемый сигнал измеряется посредством измерения флуоресценции или радиографии.
[0352] 52. Способ по п.51, где измерение флуоресценции представляет собой флуоресценцию в геле.
[0353] 53. Способ по п.51, где измерению флуоресценции предшествует вторичное мечение.
[0354] 54. Способ по п.53, где вторичное мечение выбрано из группы, состоящей из вторичного мечения меченым стрептавидином, вторичного мечения флуорофором и вторичного мечения меченым антителом.
[0355] 55. Способ по любому из предшествующих пунктов, где на стадии (2) лизат контактирует с соединением, имеющим формулу IA:
[0356]
[0357] или его солью,
где D представляет собой детектируемый элемент.
[0358] 56. Способ по любому из пп.1-55, где детектируемый элемент представляет собой флуоресцентную метку.
[0359] 57. Способ по п.56, где флуоресцентная метка выбрана из группы, состоящей из флуоресцеина, Oregon green, борадиазаиндеценового красителя, родаминового красителя, красителя на основе бензопириллия, кумаринового красителя, цианиновой метки или бензоиндольной метки.
[0360] 58. Способ по п.57, где флуоресцентная метка представляет собой цианиновую метку.
[0361] 59. Способ по п.57, где флуоресцентная метка представляет собой цианиновую метку, имеющую формулу, выбранную из следующей группы формул:
[0362]
[0363]
[0364]
[0365]
[0366]
[0367]
[0368] где в каждой из вышеприведенных формул,
A выбран из группы, состоящей из CH2, C(CH3)2, C(C2H5)2, NH, N(CH3), N(C2H5), O, S и Se;
R10 выбран из группы, состоящей из $-(CH2)p-C(= O)-& и $- (CH2)q-C(=O)-NH-[CH2CH2O]r-CH2CH2-C(=O)-&;
где:
p равно 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8;
q равно 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8;
r равно 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8;
$ представляет собой точку соединения с атомом азота цианиновой группы; и & представляет собой точку соединения с остальной частью молекулы;
R11 выбран из группы, состоящей из (C1-C8) алкила и (C6-C10) арила; и
R12 представляет собой H или сульфогруппу.
[0369] 60. Способ по п. 59, где:
A выбран из группы, состоящей из CH2, C(CH3)2 и C(C2H5)2;
R10 выбран из группы, состоящей из $-(CH2)p-C(=O)-& и $- (CH2)q-C(=O)-NH-[CH2CH2O]r-CH2CH2-C(=O)-&;
где:
p равно 2, 3, 4, 5 или 6;
q равно 2, 3, 4, 5 или 6;
r равно 2, 3, 4, 5 или 6;
$ представляет собой точку присоединения к атому азота цианиновой группы; и & представляет собой точку соединения с остальной частью молекулы;
R11 представляет собой (C1-C8) алкил; и
R12 представляет собой H или сульфогруппу.
[0370] 61. Способ по п. 59, где:
А представляет собой C(CH3)2 или C(C2H5)2;
R10 выбран из группы, состоящей из $-(CH2)p-C(=O)-& и $- (CH2)q-C(=O)-NH-[CH2CH2O]r-CH2CH2-C(=O)-&;
где:
p равно 2, 3, 4, 5 или 6;
q равно 2, 3, 4, 5 или 6;
r равно 2, 3, 4, 5 или 6;
$ представляет собой точку присоединения к атому азота цианиновой группы; и & представляет собой точку соединения с остальной частью молекулы;
R11 представляет собой метил, этил или пропил; и
R12 представляет собой H или сульфогруппу.
[0371] 62. Способ по п. 59, где:
А представляет собой C(CH3)2;
R10 выбран из группы, состоящей из $-(CH2)p-C(=O)-& и $- (CH2)q-C(=O)-NH-[CH2CH2O]r-CH2CH2-C(=O)-&;
где:
p равно 4, 5 или 6;
q равно 4, 5 или 6;
r равно 3, 4, 5 или 6;
$ представляет собой точку соединения с атомом азота цианиновой группы; и & представляет собой точку соединения с остальной частью молекулы;
R11 представляет собой метил или этил; и
R12 представляет собой H или сульфогруппу.
[0372] 63. Способ по любому из пп.59-62, R10 представляет собой $-(CH2)p-C(=O)-&.
[0373] 64. Способ по любому из пп.59-63, где R12 представляет собой сульфогруппу.
[0374] 65. Способ по п. 59, где:
А представляет собой С(СН3)2;
R10 представляет собой $-(CH2)p-C(=O)-&; где:
p равно 4, 5 или 6; и
$ представляет собой точку присоединения к атому азота цианиновой группы; и & представляет собой точку соединения с остальной частью молекулы;
R11 представляет собой метил или этил; и
R12 представляет собой сульфогруппу.
[0375] 66. Способ по п. 59, где:
А представляет собой С(СН3)2;
R10 представляет собой $-(CH2)q-C(=O)-NH-[CH2CH2O]r-CH2CH2-C(=O)-&;
где:
q равно 4, 5 или 6;
r равно 3, 4, 5 или 6;
$ представляет собой точку присоединения к атому азота цианиновой группы; и & представляет собой точку соединения с остальной частью молекулы;
R11 представляет собой метил или этил; и
R12 представляет собой H.
[0376] 67. Способ по любому из пп.59-66, где p равно 5, q равно 5 и r равно 4.
[0377] 68. Способ по п.56, где флуоресцентная метка представляет собой цианиновую метку, имеющую формулу, выбранную из следующей группы формул:
[0378]
[0379]
[0380]
[0381] где в каждой из вышеприведенных формул,
волнистая линия представляет собой точку соединения с остальной частью молекулы;
и R11 выбран из группы, состоящей из (C1-C8) алкила и (C6-C10) арила.
[0382] 69. Способ по п.68, где R11 представляет собой (C1-C8) алкил.
[0383] 70. Способ по п.68, где R11 представляет собой метил или этил.
[0384] 71. Способ по п.56, где флуоресцентная метка представляет собой цианиновую метку, имеющую формулу:
[0385]
[0386] где волнистая линия представляет собой точку соединения с остальной частью молекулы; и R11 представляет собой метил или этил.
[0387] 72. Способ по любому из пп.1-65 и 67-71, где на стадии (2) лизат контактирует с соединением формулы II:
[0388]
[0389] или его солью.
[0390] 73. Способ по любому из пп.1-65 и 67-72, где на стадии (2) лизат контактирует с соединением формулы IIA:
[0391]
[0392] или его солью.
[0393] 74. Способ по любому из пп.56-73, где детектируемый сигнал измеряют с помощью флуоресценции в геле.
[0394] 75. Способ диагностики воспалительного заболевания кишечника у субъекта in vitro, включающий детектирование активированной формы NE, которая представляет собой усеченную форму зрелой NE.
[0395] 76. Способ по п.75, где субъектом является человек.
[0396] 77. Способ по пп.75 или 76, где способ включает стадию контактирования активированной формы NE с зондом на основе активности.
[0397] 78. Способ по любому из пп.75-77, где способ включает стадию контактирования активированной формы NE с анти-NE антителом.
[0398] 79. Соединение формулы I:
[0399]
[0400] или его соль,
где D представляет собой детектируемый элемент,
при условии, что соединения, в которых D соответствует одной из следующих формул, исключаются:
[0401]
[0402]
[0403]
[0404]
[0405]
[0406] где в каждой из вышеприведенных формул волнистая линия представляет точку соединения с остальной частью молекулы.
[0407] 80. Соединение по п.79, имеющее формулу IA:
[0408]
[0409]или его соль,
где D представляет собой детектируемый элемент.
[0410] 81. Соединение по пп.79 или 80, где детектируемый элемент выбран из группы, состоящей из флуоресцентной метки, биотиновой метки, радиоактивной метки, хелатора и биоортогонального маркера для лигирования.
[0411] 82. Соединение по любому из пп.79-81, где детектируемый элемент представляет собой флуоресцентную метку.
[0412] 83. Соединение по п.82, где флуоресцентная метка выбрана из группы, состоящей из флуоресцеина, Oregon green, борадиазаиндеценового красителя, родаминового красителя, красителя на основе бензопириллия, кумаринового красителя, цианиновой метки или бензоиндольной метки.
[0413] 84. Соединение по п.82, где флуоресцентная метка представляет собой цианиновую метку.
[0414] 85. Соединение по п.82, где флуоресцентная метка представляет собой цианиновую метку, имеющую формулу, выбранную из следующей группы формул:
[0415]
[0416]
[0417]
[0418]
[0419]
[0420]
[0421] где в каждой из вышеприведенных формул,
A выбран из группы, состоящей из CH2, C(CH3)2, C(C2H5)2, NH, N(CH3), N(C2H5), O, S и Se;
R10 выбран из группы, состоящей из $-(CH2)p-C(= O)-& и $- (CH2)q-C(=O)-NH-[CH2CH2O]r-CH2CH2-C(=O)-&;
где:
p равно 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8;
q равно 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8;
r равно 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8;
$ представляет собой точку соединения с атомом азота цианиновой группы; и & представляет собой точку соединения с остальной частью молекулы;
R11 выбран из группы, состоящей из (C1-C8) алкила и (C6-C10) арила; и
R12 представляет собой H или сульфогруппу.
[0422] Соединение по п. 85, где:
A выбран из группы, состоящей из CH2, C(CH3)2 и C(C2H5)2;
R10 выбран из группы, состоящей из $-(CH2)p-C(=O)-& и $- (CH2)q-C(=O)-NH-[CH2CH2O]r-CH2CH2-C(=O)-&;
где:
p равно 2, 3, 4, 5 или 6;
q равно 2, 3, 4, 5 или 6;
r равно 2, 3, 4, 5 или 6;
$ представляет собой точку присоединения к атому азота цианиновой группы; и & представляет собой точку соединения с остальной частью молекулы;
R11 представляет собой (C1-C8) алкил; и
R12 представляет собой H или сульфогруппу.
[0423] 87. Соединение по п.85, где:
А представляет собой C(CH3)2 или C(C2H5)2;
R10 выбран из группы, состоящей из $-(CH2)p-C(=O)-& и $- (CH2)q-C(=O)-NH-[CH2CH2O]r-CH2CH2-C(=O)-&;
где:
p равно 2, 3, 4, 5 или 6;
q равно 2, 3, 4, 5 или 6;
r равно 2, 3, 4, 5 или 6;
$ представляет собой точку присоединения к атому азота цианиновой группы; и & представляет собой точку соединения с остальной частью молекулы;
R11 представляет собой метил, этил или пропил; и
R12 представляет собой H или сульфогруппу.
[0424] 88. Соединение по п. 85, где:
А представляет собой C(CH3)2;
R10 выбран из группы, состоящей из $-(CH2)p-C(=O)-& и $- (CH2)q-C(=O)-NH-[CH2CH2O]r-CH2CH2-C(=O)-&;
где:
p равно 4, 5 или 6;
q равно 4, 5 или 6;
r равно 3, 4, 5 или 6;
$ представляет собой точку соединения с атомом азота цианиновой группы; и & представляет собой точку соединения с остальной частью молекулы;
R11 представляет собой метил или этил; и
R12 представляет собой H или сульфогруппу.
[0425] 89. Соединение по любому из пп.85-88, где R10 представляет собой $-(CH2)p-C(=O)-&.
[0426] 90. Соединение по любому из пп.85-89, где R12 представляет собой сульфогруппу.
[0427] 91. Соединение по п. 85, где:
А представляет собой С(СН3)2;
R10 представляет собой $-(CH2)p-C(=O)-&; где:
p равно 4, 5 или 6; и
$ представляет собой точку присоединения к атому азота цианиновой группы; и & представляет собой точку соединения с остальной частью молекулы;
R11 представляет собой метил или этил; и
R12 представляет собой сульфогруппу.
[0428] 92. Соединение по п. 85, где:
А представляет собой С(СН3)2;
R10 представляет собой $-(CH2)q-C(=O)-NH-[CH2CH2O]r-CH2CH2-C(= O)-&;
где:
q равно 4, 5 или 6;
r равно 3, 4, 5 или 6;
$ представляет собой точку присоединения к атому азота цианиновой группы; и & представляет собой точку соединения с остальной частью молекулы;
R11 представляет собой метил или этил; и
R12 представляет собой H.
[0429] 93. Соединение по любому из пп.85-92, где p равно 5, q равно 5, и r равно 4.
[0430] 94. Соединение по п.82, где флуоресцентная метка представляет собой цианиновую метку, имеющую формулу, выбранную из следующей группы формул:
[0431]
[0432]
[0433]
[0434] где в каждой из вышеприведенных формул,
волнистая линия представляет собой точку соединения с остальной частью молекулы;
и R11 выбран из группы, состоящей из (C1-C8) алкила и (C6-C10) арила.
[0435] 95. Соединение по п.94, где R11 представляет собой (C1-C8) алкил.
[0436] 96. Соединение по п.94, где R11 представляет собой метил или этил.
[0437] 97. Соединение по п.82, где флуоресцентная метка представляет собой цианиновую метку, имеющую формулу:
[0438]
[0439] где волнистая линия представляет собой точку соединения с остальной частью молекулы; и R11 представляет собой метил или этил.
[0449] 98. Соединение формулы II:
[0441]
[0442] или его соль.
[0443] 99. Соединение формулы IIA:
[0444]
[0445] или его соль.
[0446] 100. Композиция, содержащая соединение по любому из пп.79-99 или его соль и эксиципиент.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| ПРОИЗВОДНЫЕ ИЛИДА СУЛЬФОКСОНИЯ В КАЧЕСТВЕ ЗОНДОВ ДЛЯ ЦИСТЕИНОВОЙ ПРОТЕАЗЫ | 2019 |
|
RU2815018C2 |
| ПРИМЕНЕНИЕ ПРОСОМАТОСТАТИНА В ДИАГНОСТИКЕ | 2012 |
|
RU2573985C2 |
| НАБОР ДЛЯ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОГО ПРИДАНИЯ НАПРАВЛЕННОСТИ ДЕЙСТВИЯ, СПОСОБ И СРЕДСТВА, ПРИМЕНЯЕМЫЕ В НЕМ | 2010 |
|
RU2539915C2 |
| РЕПРЕЗЕНТАТИВНАЯ ДИАГНОСТИКА | 2016 |
|
RU2743169C2 |
| СПЕЦИФИЧЕСКИЕ К ОПУХОЛИ АНТИТЕЛА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2011 |
|
RU2595403C2 |
| СИНТЕТИЧЕСКАЯ ЛЕТАЛЬНОСТЬ И ЛЕЧЕНИЕ РАКА | 2013 |
|
RU2676697C2 |
| НАБОРЫ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ЗОНДОВ И СПОСОБЫ ПРОФИЛИРОВАНИЯ МИКРОБИОТЫ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА | 2011 |
|
RU2605913C2 |
| КОМПОЗИЦИЯ И СПОСОБ ДЛЯ ДЕТЕКТИРОВАНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОГО НЕОПЛАСТИЧЕСКОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ | 2015 |
|
RU2678135C1 |
| СПОСОБЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ КИШЕЧНИКА | 2008 |
|
RU2502806C2 |
| СВЯЗАННЫЙ С РАКОМ ТОЛСТОГО КИШЕЧНИКА ГЕН ТОМ34 | 2006 |
|
RU2526196C2 |
Группа изобретений относится к соединениям и способам для детектирования активности нейтрофильной эластазы. Раскрыт способ детектирования активности нейтрофильной эластазы в лизате образца ткани, включающий: (1) приготовление лизата из образца ткани, полученного от субъекта; (2) контактирование лизата с соединением-зондом; (3) последующее подвергание по меньшей мере аликвоты лизата, полученного на стадии (2), гель-электрофорезу; (4) измерение детектируемого сигнала. Также раскрыты способ диагностики заболевания, соединения-зонды формулы I, формулы II и формулы IIA, а также композиции для детектирования активности нейтрофильной эластазы и для диагностики заболевания. Группа изобретений обеспечивает возможность анализа лизата тканей для определения активности нейтрофильной эластазы. 7 н. и 33 з.п. ф-лы, 25 ил., 1 табл., 8 пр.
1. Способ детектирования активности нейтрофильной эластазы (NE) в лизате образца ткани, включающий:
(1) приготовление лизата из образца ткани, полученного от субъекта,
(2) контактирование лизата с соединением формулы I
или его солью,
где D представляет собой детектируемый элемент, где детектируемый элемент выбирают из группы, состоящей из флуоресцентной метки, биотиновой метки, радиоактивной метки, хелатора и биоортогонального маркера для лигирования, где биоортогональный маркер для лигирования представляет собой функциональную группу, которая обеспечивает последующее присоединение вторичной детектируемой метки посредством биоортогональной реакции,
(3) последующее подвергание, по меньшей мере, аликвоты лизата, полученного на стадии (2), гель-элетрофорезу и затем
(4) измерение детектируемого сигнала,
при условии, что соединения, в которых D соответствует одной из следующих формул, исключены:
,
,
,
,
,
где приведенные выше формулы, указывающие положительно заряженный атом (N+), означают солевые формы соответствующей формулы и где в каждой из приведенных выше формул волнистая линия представляет собой точку соединения с остальной частью молекулы.
2. Способ по п. 1, дополнительно включающий после стадии (3) стадию
(5) иммуноблоттинга с анти-NE антителом и/или
где дополнительно выполняют следующие стадии:
(3a) иммунопреципитация соединения формулы I в отдельной аликвоте лизата стадии (2) с использованием антитела, специфичного для соединения формулы I или его фрагмента,
(4а) последующий анализ сопреципитированного материала,
где необязательно анализ на стадии (4а) включает:
- гель-электрофорез и последующий иммуноблоттинг с использованием анти-NE антитела или
- секвенирование белка,
и предпочтительно включает гель-электрофорез и последующий иммуноблоттинг с использованием анти-NE антитела.
3. Способ по п. 1 или 2, где
перед стадией (2) аликвоту лизата со стадии (1) предварительно обрабатывают специфическим ингибитором NE и где предварительно обработанную аликвоту затем обрабатывают аналогично необработанному лизату со стадии (1); и/или
где образец ткани выбран из группы, состоящей из биопсийного материала ротовой полости, образца пищевода, образца желудка, образца тонкой кишки, образца легкого, образца поджелудочной железы, образца костного мозга, образца толстого кишечника, образца дистального отдела толстого кишечника, образца проксимального отдела толстого кишечника, биопсийного материала молочной железы, биопсийного материала предстательной железы, биопсийного материала прямой кишки, образца печени, образца кожи, образца опухоли и биопсийного материала слизистой оболочки; где необязательно биопсийный материал слизистой оболочки выбран из группы, состоящей из биопсийного материала слизистой оболочки толстого кишечника, биопсийного материала дистального отдела слизистой оболочки толстого кишечника, биопсийного материала проксимального отдела слизистой оболочки толстого кишечника, биопсийного материала слизистой оболочки тонкого кишечника, биопсийного материала слизистой оболочки легкого, биопсийного материала слизистой оболочки прямой кишки, биопсийного материала слизистой оболочки пищевода и биопсийного материала слизистой оболочки ротовой полости.
4. Способ по любому из предшествующих пунктов, где субъектом является человек.
5. Способ по любому из предшествующих пунктов, где детектируют усеченную форму зрелой NE, где зрелая NE представляет собой форму NE, проявляющую активность NE и имеющую молекулярную массу 25 кДа, и усеченная форма зрелой NE представляет собой форму NE, проявляющую активность NE, полученную в результате усечения зрелой NE и имеющую молекулярную массу <25 кДа, и
где необязательно образец ткани выбран из группы, состоящей из биопсийного материала ротовой полости, образца пищевода, образца желудка, образца тонкого кишечника, образца толстого кишечника, образца проксимального отдела толстого кишечника, образца дистального отдела толстого кишечника, образца прямой кишки и биопсийного материала слизистой оболочки, где необязательно биопсийный материал слизистой оболочки выбран из группы, состоящей из биопсийного материала слизистой оболочки ротовой полости, биопсийного материала слизистой оболочки пищевода, биопсийного материала слизистой оболочки тонкого кишечника, биопсийного материала слизистой оболочки толстого кишечника и биопсийного материала слизистой оболочки прямой кишки.
6. Способ диагностики заболевания, ассоциированного с активностью NE, у субъекта, включающий:
(1) приготовление лизата из образца ткани, полученного от субъекта,
(2) контактирование лизата с соединением формулы I
или его солью,
где D представляет собой детектируемый элемент, где детектируемый элемент выбирают из группы, состоящей из флуоресцентной метки, биотиновой метки, радиоактивной метки, хелатора и биоортогонального маркера для лигирования, где биоортогональный маркер для лигирования представляет собой функциональную группу, которая обеспечивает последующее присоединение вторичной детектируемой метки посредством биоортогональной реакции,
(3) последующее подвергание лизата гель-электрофорезу и затем
(4) измерение детектируемого сигнала.
7. Способ по п. 6, где заболевание, ассоциированное с активностью NE, выбрано из группы, состоящей из целиакии, нарушения моторики желудочно-кишечного тракта, кожного заболевания, ожирения, вызванного рационом, нарушения обмена веществ, астмы, ревматоидного артрита, пародонтита, воспалительного заболевания желудочно-кишечного тракта, функционального расстройства желудочно-кишечного тракта, рака, фиброзного заболевания, метаболической дисфункции, неврологического заболевания, хронической обструктивной болезни легких (COPD) и инфекции, или
где заболевание, связанное с активностью NE, выбирают из группы, состоящей из воспалительного заболевания кишечника, инфекции, хронической обструктивной болезни легких и рака.
8. Способ по п. 6 или 7, дополнительно включающий после стадии (3) стадию
(5) иммуноблоттинга с анти-NE антителом и/или
где дополнительно выполняют следующие стадии:
(3a) иммунопреципитация соединения формулы I в отдельной аликвоте лизата стадии (2) с использованием антитела, специфичного для соединения формулы I или его фрагмента,
(4а) последующий анализ сопреципитированного материала,
где анализ на стадии (4а) включает:
- гель-электрофорез и последующий иммуноблоттинг с использованием анти-NE антитела или
- секвенирование белка,
и предпочтительно включает гель-электрофорез и последующий иммуноблоттинг с использованием анти-NE антитела.
9. Способ по любому из пп. 6-8,
где перед стадией (2) аликвоту лизата со стадии (1) предварительно обрабатывают специфическим ингибитором NE и предварительно обработанную аликвоту затем обрабатывают аналогично необработанному лизату со стадии (1); и/или
где образец ткани выбран из группы, состоящей из биопсийного материала ротовой полости, образца пищевода, образца желудка, образца тонкого кишечника, образца легкого, образца поджелудочной железы, образца костного мозга, образца толстого кишечника, образца дистального отдела толстого кишечника, образца проксимального отдела толстого кишечника, биопсийного материала молочной железы, биопсийного материала предстательной железы, биопсийного материала прямой кишки, образца печени, образца кожи, образца опухоли и биопсийного материала слизистой оболочки, где необязательно биопсийный материал слизистой оболочки выбран из группы, состоящей из биопсийного материала слизистой оболочки толстого кишечника, биопсийного материала слизистой дистального отдела толстого кишечника, биопсийного материала слизистой проксимального отдела толстого кишечника, биопсийного материала слизистой тонкого кишечника, биопсийного материала слизистой оболочки прямой кишки, биопсийного материала слизистой оболочки пищевода и биопсийного материала слизистой оболочки ротовой полости.
10. Способ по любому из пп. 6 или 9, где субъектом является человек.
11. Способ по любому из пп. 6-10, где способ предназначен для диагностики воспалительного заболевания кишечника.
12. Способ по п. 11, где
детектируют усеченную форму зрелой NE, где зрелая NE представляет собой форму NE, проявляющую активность NE и имеющую молекулярную массу 25 кДа, и усеченная форма зрелой NE представляет собой форму NE, проявляющую активность NE, полученную в результате усечения зрелой NE и имеющую молекулярную массу <25 кДа, и
где необязательно у субъекта диагностируют воспалительное заболевание кишечника, если детектирована усеченная форма NE.
13. Способ по любому из пп.11 или 12, где образец ткани выбран из группы, состоящей из биопсийного материала ротовой полости, образца пищевода, образца желудка, образца тонкого кишечника, образца проксимального отдела толстого кишечника, образца дистального отдела толстого кишечника, образца прямой кишки и биопсийного материала слизистой оболочки, где необязательно образец ткани представляет собой биопсийный материал слизистой оболочки, выбранный из группы, состоящей из биопсийного материала слизистой оболочки ротовой полости, биопсийного материала слизистой оболочки тонкого кишечника, биопсийного материала слизистой оболочки толстого кишечника и биопсийного материала слизистой оболочки прямой кишки.
14. Способ по любому из пп. 6-13, где воспалительное заболевание кишечника выбрано из группы, состоящей из острого колита, язвенного колита, болезни Крона, микроскопического колита, диверсионного колита, болезни Бехчета, иммуноонкологического колита, колита в результате химиотерапии/лучевой терапии, колита на фоне синдрома «трансплантат против хозяина», коллагенозного колита, лимфоцитарного колита и колита неопределенной этиологии и поухита.
15. Способ по любому из пп. 10-14, где воспалительное заболевание кишечника представляет собой язвенный колит или где воспалительное заболевание кишечника представляет собой болезнь Крона.
16. Способ по любому из пп. 6-10, где способ предназначен для диагностики инфекции,
где необязательно инфекция выбрана из группы, состоящей из бактериальной инфекции и грибковой инфекции, и/или
где необязательно образец ткани представляет собой образец инфицированной ткани.
17. Способ по п. 16, где инфекция представляет собой инфекцию легких, где необязательно инфекция легких представляет собой бактериальную инфекцию, где необязательно бактериальная инфекция представляет собой инфекцию, вызванную Legionella, и необязательно где образец ткани выбран из группы, состоящей из образца легкого или биопсийного материала слизистой оболочки легкого.
18. Способ по любому из пп. 6-10, где способ предназначен для диагностики рака,
где необязательно образец ткани выбран из группы, состоящей из образца опухоли, биопсийного материала ротовой полости, биопсийного материала слизистой оболочки ротовой полости, биопсийного материала молочной железы, биопсийного материала предстательной железы, биопсийного материала толстого кишечника, биопсийного материала слизистой оболочки толстого кишечника, биопсийного материала прямой кишки, биопсийного материала слизистой оболочки прямой кишки, биопсийного материала легкого и биопсийного материала слизистой оболочки легкого; и/или
где необязательно рак выбран из группы, состоящей из рака ротовой полости, рака молочной железы, рака предстательной железы, рака прямой кишки и рака легких.
19. Способ по п. 18, где рак представляет собой рак ротовой полости и рак ротовой полости представляет собой плоскоклеточную карциному.
20. Способ по любому из пп. 6-10, где способ предназначен для диагностики хронической обструктивной болезни легких, где необязательно образец ткани выбран из группы, состоящей из образца легкого и биопсийного материала слизистой оболочки легкого.
21. Способ по любому из предшествующих пунктов, где приготовление лизата включает стадию очистки.
22. Способ по любому из предшествующих пунктов, где гель-электрофорез представляет собой одномерный или двумерный гель-электрофорез и/или где гель-электрофорез представляет собой SDS-PAGE или нативный PAGE, предпочтительно SDS-PAGE.
23. Способ по любому из предшествующих пунктов,
где детектируемый сигнал измеряется посредством измерения флуоресценции или радиографии,
где необязательно измерение флуоресценции представляет собой флуоресценцию в геле или
где необязательно измерению флуоресценции предшествует вторичное мечение, где необязательно вторичное мечение выбрано из группы, состоящей из вторичного мечения меченым стрептавидином, вторичного мечения флуорофором и вторичного мечения меченым антителом.
24. Способ по любому из предшествующих пунктов, где на стадии (2) лизат контактирует с соединением, имеющим формулу IA
или его солью,
где D представляет собой детектируемый элемент.
25. Способ по любому из пп. 1-24, где детектируемый элемент представляет собой флуоресцентную метку,
где флуоресцентная метка содержит флуоресцеин, Oregon green, борадиазаиндеценовый краситель, родаминовый краситель, краситель на основе бензопириллия, кумариновый краситель или флуоресцентная метка представляет собой цианиновую метку или бензоиндольную метку.
26. Способ по п. 25, где флуоресцентная метка представляет собой цианиновую метку, предпочтительно имеющую формулу, выбранную из следующей группы формул:
где в каждой из вышеприведенных формул
A выбран из группы, состоящей из CH2, C(CH3)2, C(C2H5)2, NH, N(CH3), N(C2H5), O, S и Se;
R10 выбран из группы, состоящей из $-(CH2)p-C(=O)-& и $-(CH2)q-C(=O)-NH-[CH2CH2O]r-CH2CH2-C(=O)-&;
где p равно 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8;
q равно 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8;
r равно 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8;
$ представляет собой точку соединения с атомом азота цианиновой группы; и
& представляет собой точку соединения с остальной частью молекулы;
R11 выбран из группы, состоящей из (C1-C8) алкила и (C6-C10) арила; и
R12 представляет собой H или сульфогруппу,
и где приведенные выше формулы, указывающие положительно заряженный атом (N+), означают солевые формы соответствующей формулы.
27. Способ по п. 26, где флуоресцентная метка представляет собой цианиновую метку, предпочтительно имеющую формулу, выбранную из следующей группы формул:
,
,
,
где в каждой из вышеприведенных формул
A выбран из группы, состоящей из CH2, C(CH3)2, C(C2H5)2, NH, N(CH3), N(C2H5), O, S и Se;
R10 выбран из группы, состоящей из $-(CH2)p-C(=O)-& и $-(CH2)q-C(=O)-NH-[CH2CH2O]r-CH2CH2-C(=O)-&;
где p равно 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8;
q равно 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8;
r равно 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8;
$ представляет собой точку соединения с атомом азота цианиновой группы; и
& представляет собой точку соединения с остальной частью молекулы;
R11 выбран из группы, состоящей из (C1-C8) алкила и (C6-C10) арила; и
R12 представляет собой сульфогруппу и где один из R12 представляет собой -SO3H и один из R12 представляет собой солевую форму -SO3H.
28. Способ по п. 25, где флуоресцентная метка представляет собой цианиновую метку, имеющую формулу, выбранную из следующей группы формул:
,
,
где в каждой из вышеприведенных формул
волнистая линия представляет собой точку соединения с остальной частью молекулы
и R11 выбран из группы, состоящей из (C1-C8) алкила и (C6-C10) арила и где приведенные выше формулы, указывающие положительно заряженный атом (N+), означают солевые формы соответствующей формулы; или
где флуоресцентная метка представляет собой цианиновую метку, имеющую формулу, выбранную из следующей группы формул:
,
где волнистая линия представляет собой точку соединения с остальной частью молекулы; и
R11 выбран из группы, состоящей из (C1-C8) алкила и (C6-C10) арила, или
где флуоресцентная метка представляет собой цианиновую метку, имеющую формулу
,
где волнистая линия представляет собой точку соединения с остальной частью молекулы; и R11 представляет собой метил или этил.
29. Способ по любому из пп. 1-28,
где на стадии (2) лизат контактирует с соединением формулы II
или его солью или
где на стадии (2) лизат контактирует с соединением формулы IIA
или его солью.
30. Способ по любому из пп. 25-29, где детектируемый сигнал измеряют с помощью флуоресценции в геле.
31. Соединение формулы I
или его соль,
где D представляет собой детектируемый элемент, где детектируемый элемент выбирают из группы, состоящей из флуоресцентной метки, биотиновой метки, радиоактивной метки, хелатора и биоортогонального маркера для лигирования, где биоортогональный маркер для лигирования представляет собой функциональную группу, которая обеспечивает последующее присоединение вторичной детектируемой метки посредством биоортогональной реакции,
при условии, что соединения, в которых D соответствует одной из следующих формул, исключаются:
и где приведенные выше формулы, указывающие положительно заряженный атом (N+), означают солевые формы соответствующей формулы, и
где в каждой из вышеприведенных формул волнистая линия представляет точку соединения с остальной частью молекулы.
32. Соединение по п. 31, имеющее формулу IA
или его соль,
где D представляет собой детектируемый элемент, где детектируемый элемент выбирают из группы, состоящей из флуоресцентной метки, биотиновой метки, радиоактивной метки, хелатора и биоортогонального маркера для лигирования, где биоортогональный маркер для лигирования представляет собой функциональную группу, которая обеспечивает последующее присоединение вторичной детектируемой метки посредством биоортогональной реакции.
33. Соединение по любому из пп. 31, 32, где детектируемый элемент представляет собой флуоресцентную метку,
где флуоресцентная метка содержит флуоресцеин, Oregon green, борадиазаиндеценовый краситель, родаминовый краситель, краситель на основе бензопириллия, кумариновый краситель или где флуоресцентная метка представляет собой цианиновую метку или бензоиндольную метку.
34. Соединение по п. 33, где флуоресцентная метка представляет собой цианиновую метку, предпочтительно имеющую формулу, выбранную из следующей группы формул:
где в каждой из вышеприведенных формул
A выбран из группы, состоящей из CH2, C(CH3)2, C(C2H5)2, NH, N(CH3), N(C2H5), O, S и Se;
R10 выбран из группы, состоящей из $-(CH2)p-C(=O)-& и $-(CH2)q-C(=O)-NH-[CH2CH2O]r-CH2CH2-C(=O)-&;
где p равно 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8;
q равно 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8;
r равно 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8;
$ представляет собой точку соединения с атомом азота цианиновой группы; и
& представляет собой точку соединения с остальной частью молекулы;
R11 выбран из группы, состоящей из (C1-C8) алкила и (C6-C10) арила; и
R12 представляет собой H или сульфогруппу,
и где приведенные выше формулы, указывающие на положительно заряженный атом (N+), означают солевые формы соответствующей формулы.
35. Соединение по п.33, где флуоресцентная метка представляет собой цианиновую метку, имеющую формулу, выбранную из следующей группы формул:
,
,
,
где в каждой из вышеприведенных формул
A выбран из группы, состоящей из CH2, C(CH3)2, C(C2H5)2, NH, N(CH3), N(C2H5), O, S и Se;
R10 выбран из группы, состоящей из $-(CH2)p-C(=O)-& и $-(CH2)q-C(=O)-NH-[CH2CH2O]r-CH2CH2-C(=O)-&;
где p равно 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8;
q равно 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8;
r равно 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8;
$ представляет собой точку соединения с атомом азота цианиновой группы; и
& представляет собой точку соединения с остальной частью молекулы;
R11 выбран из группы, состоящей из (C1-C8) алкила и (C6-C10) арила; и
R12 представляет собой сульфогруппу, где один из R12 представляет собой -SO3H и один из R12 представляет собой соляную форму -SO3H.
36. Соединение по п. 33, где флуоресцентная метка представляет собой цианиновую метку, имеющую формулу, выбранную из следующей группы формул:
,
,
где в каждой из вышеприведенных формул
волнистая линия представляет собой точку соединения с остальной частью молекулы; и
R11 выбран из группы, состоящей из (C1-C8) алкила и (C6-C10) арила, и где приведенные выше формулы, указывающие на положительно заряженный атом (N+), означают солевые формы соответствующей формулы; или
где флуоресцентная метка представляет собой цианиновую метку, имеющую формулу
,
где волнистая линия представляет собой точку соединения с остальной частью молекулы; и
R11 выбран из группы, состоящей из (C1-C8) алкила и (C6-C10) арила; или
где флуоресцентная метка представляет собой цианиновую метку, имеющую формулу
,
где волнистая линия представляет собой точку соединения с остальной частью молекулы; и R11 представляет собой метил или этил.
37. Соединение формулы II
или его соль.
38. Соединение формулы IIA
или его соль.
39. Композиция для детектирования активности нейтрофильной эластазы, содержащая соединение по любому из пп. 31-38 или его соль и эксципиент.
40. Композиция для диагностики заболевания, связанного с активностью нейтрофильной эластазы, содержащая соединение по любому из пп. 31-38 или его соль и эксципиент.
| KASPERKIEWICZ P | |||
| et al | |||
| Toolbox of Fluorescent Probes for Parallel Imaging Reveals Uneven Location of Serine Proteases in Neutrophils // J | |||
| Am | |||
| Chem | |||
| Soc., 2017, V.139, pp.10115−10125; | |||
| WO 2017097990 A1, 15.06.2017 | |||
| US 20120156691 A1, 21.06.2012 | |||
| US 20080255025 A1, 16.10.2008 | |||
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЦИТОМЕГОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ МЕТОДОМ ИММУНОБЛОТТИНГА | 2013 |
|
RU2545785C2 |
| WO 2010022281 A1, 25.02.2010. | |||
