Способ получения клеточных тороидов Российский патент 2024 года по МПК C12M3/04 G09B23/28 

Изобретение относится к медицине, а именно к регенеративной медицине, тканевой инженерии и сосудистой хирургии, и может использоваться для получения клеточных тороидальных конструкций, самоагрегирующихся с образованием полых трубчатых структур, моделирующих кровеносные сосуды.

Ангиология, кардиология и сосудистая хирургия нуждаются в большом количестве трубчатых протезов и экспериментальных моделей для изучения сосудистых патологий и методов их лечения. Имеющиеся на сегодняшний день искусственные протезы, а также алло- и ксенографты не удовлетворяют полностью всему набору требований, предъявляемых к ним. Одним из способов получения новых сосудистых моделей являются методы клеточной и тканевой инженерии, включая агрегацию клеточных структур для получения трубчатых конструкций. Известен способ создания комплексных моделей микротканей [WO 2017011854 A1, опубл. 26.01.2017]. Он заключается в биопечати суспензии клеток в гидрогелевых каплях, которые под контролем программы 3D-биопринтера объединяются в микроткани необходимого размера и формы. Преимуществом данного метода являются высокая точность и возможность получения микротканей любых форм и размеров. Существенные недостатки - необходимость дорогого оборудования, высокая квалификация персонала лаборатории, трудоёмкие исследования цитосовместимости и реологических характеристик гидрогелей, наличие среди клеток гидрогеля ограничивает их объединение друг с другом и формирование целостной тканеподобной структуры.

Другой запатентованной методикой является использование биосовместимых гидрогелевых микропланшетов [FR 3079524 B1, опубл. 18.12.2020]. Для этого из неадгезивных агарозных гидрогелей, получают вставки с лунками, которые помещают в культуральные планшеты или чашки Петри. В лунки гидрогеля заливают суспензию клеток со средой и получают агрегаты в виде клеточных сфероидов. Преимуществами данного метода являются отсутствие токсичности агарозных гидрогелей, удовлетворительная точность формы и размеров получаемых агрегатов, возможность многоразового использования микропланшетов. Недостатками этой техники являются термическая полимеризация агарозного гидрогеля, возможность повреждения сфероидов при их сборе из лунок и неспособность получать клеточные агрегаты любой другой формы, кроме сфероидов.

Прототипом предлагаемого нами изобретения является платформа для слияния клеточных агрегатов в прото-ткани [US 8501476 B2, опубл. 06.08.2013]. Данная платформа также состоит из неадгезивной поверхности с лунками, повторяющими форму будущих клеточно-инженерных конструкций. Однако важным отличием является разнообразие размеров и конфигурации лунок, включая тороидальные шаблоны, и наличие секций для слияния получаемых конструкций друг с другом. Недостатками этой платформы являются низкая воспроизводимость размеров получаемых конструкций, использование термополимеризуемых гидрогелей для производства формы и необходимость ручного извлечения получаемых клеточных агрегатов из платформы.

Описание чертежей

Фиг. 1. Вставка для шаблона.

Фиг. 2. Крышка шаблона.

Фиг. 3. Дно шаблона.

Фиг. 4. Боковая стенка шаблона.

Фиг. 5. Фронтальная стенка шаблона.

1 - цилиндрические выступы.

2 - перфорации.

3 - периметрический желоб.

4 – колышки.

5 - периметрический выступ.

6 - шип.

7 - верхний выступ.

8 - нижний желоб.

9 - паз.

Осуществление изобретения производится следующим образом.

Шаблон для получения клеточных тороидальных конструкций состоит из 5 видов деталей: «вставка», «крышка», «дно», «боковая стенка» и «фронтальная стенка». Все составляющие шаблона изготавливаются методом фотополимерной 3D-печати, их параметры корректируются под размеры необходимых клеточных тороидов и могут быть изменены на любом этапе проектирования в соответствии с техническим заданием. Для сборки функционирующего шаблона необходимы: 1 вставка, 1 крышка, 1 дно, 2 боковые стенки и 2 фронтальные стенки. Перед закрытием крышкой внутрь шаблона заливается неадгезивный альгинат - желатиновый гидрогель. Таким образом, шаблон образует закрытую камеру, внутри которой гидрогель в дальнейшем будет подвергнут термической и химической полимеризации, в точности повторяя рельеф вставки шаблона. Термическая полимеризация проводится выдерживанием с гелем при температуре 4 °С в течение 30 мин. Химическая полимеризация производится после термической, сопровождается удалением дна, крышки и стенок шаблона и выдерживанием оставшейся гидрогелевой конструкции со вставкой в 2% растворе хлорида кальция в течение суток. Таким образом, получается заготовка из гидрогеля с кольцевидными вдавлениями, которая после освобождения от вставки и стерилизации становится пригодной для клеточного культивирования и получения тороидальных конструкций. Полученные тороидальные конструкции не требуют ручного сбора из гидрогелевой формы, так как альгинатно-желатиновый гидрогель можно растворить, обработав 3,2% раствором цитрата натрия при 37 °С в течение часа в инкубаторе. После разрушения конструкции гидрогелевой формы клеточные тороиды самостоятельно высвобождаются без повреждений. Важной особенностью предлагаемого нами изобретения является воспроизводимость параметров получаемых клеточных тороидов за счёт высокой точности деталей шаблона, изготовленных на 3D-принтере.

Процесс сборки шаблона можно описать так.

Сначала путём соединения колышков (4) и перфораций (2) вставка для шаблона (фиг. 1) соединяется с дном (фиг. 3). Затем при сопоставлении нижних желобов (8) с параметрическим выступом (5) происходит крепление фронтальных стенок (фиг. 5) к полученной ранее конструкции. Соединяя одновременно шипы (6) с пазами (9) и нижние желоба (8) с параметрическим выступом (5), осуществляется прикрепление боковых стенок (фиг. 4) и формирование открытого сверху вместилища для гидрогеля в виде параллелепипеда. Крышка (фиг. 2) закрепляется на шаблоне сверху при сопоставлении периметрического желоба (3) с верхними выступами (7) всех стенок.

Изобретение относится к биотехнологии. Раскрыт способ для получения клеточных тороидов, включающий изготовленные методом фотополимерной 3D-печати вставку, крышку, дно, две боковые стенки и две фронтальные стенки, получаемые путём соединения дна и вставки системой колышков и перфораций, фронтальных стенок - нижних желобов с периметрическим выступом, боковых стенок - шипов с пазами и нижних желобов с параметрическим выступом, крышки - сопоставлением периметрического желоба с верхними выступами всех стенок. При этом полученный шаблон используется для формы из альгинатно-желатинового гидрогеля, который может быть деполимеризован для самопроизвольного высвобождения тороидальных клеточно-инженерных конструкций без повреждений. Изобретение может использоваться для получения клеточных тороидальных конструкций, самоагрегирующихся с образованием полых трубчатых структур, моделирующих кровеносные сосуды. 5 ил.

Способ получения клеточных тороидов, включающий изготовление методом фотополимерной 3D-печати вставки, крышки, дна, двух боковых стенок и двух фронтальных стенок, соединённых системой колышков и перфораций, а также нижних желобов с периметрическим выступом, объединение всех частей с образованием закрытой камеры, далее заливают в полученную камеру неадгезивный альгинат-желатиновый гидрогель, который затем подвергают термической полимеризации при температуре 4°С в течение 30 мин, после чего проводят химическую полимеризацию, сопровождающуюся удалением дна, крышки и стенок камеры и выдерживанием оставшейся гидрогелевой конструкции со вставкой в 2% растворе хлорида кальция в течение суток, получая заготовку из гидрогеля с кольцевидными вдавлениями, которая после освобождения от вставки и стерилизации становится пригодной для клеточного культивирования и получения тороидальных конструкций, при этом для самопроизвольного высвобождения клеточных тороидов альгинат-желатиновый гидрогель обрабатывают 3,2% раствором цитрата натрия при 37°С в течение часа в инкубаторе.