ПЛАТФОРМА ДЛЯ ИНЖЕНЕРИИ ИМПЛАНТИРУЕМЫХ ТКАНЕЙ И ОРГАНОВ И СПОСОБЫ СОЗДАНИЯ (БИОФАБРИКАЦИИ) ЭТИХ ТКАНЕЙ И ОРГАНОВ Российский патент 2017 года по МПК A61F2/02 

Перекрестные ссылки на родственные заявки

Настоящая заявка претендует на положительный эффект заявки США на патент №61/533,761, поданной 12 сентября 2011 г., и заявки США на патент №61/533,766, поданной 12 сентября 2011 г., содержание каждой из них включено в данную заявку посредством отсылки.

Уровень техники

Перед индустрией здравоохранения возникает ряд серьезных проблем. На декабрь 2009 года Службой обеспечения донорскими органами (UNOS) было зарегистрировано 105305 пациентов, нуждающихся в трансплантатах. За период с января до сентября 2009 года было проведено только 21423 трансплантации. Каждый год к списку UNOS добавляется больше пациентов, чем проводится трансплантаций, в результате наблюдается чистый прирост пациентов, ожидающих трансплантата. Например, в начале 2008 года было зарегистрировано 75834 человека, нуждающихся в пересадке почки; к концу года это число возросло до 80972 человек. В этот год было проведено 16546 операций по пересадке почки, но к списку прибавилось 33005 новых пациентов. В 2008 году доля нуждающихся в почке пациентов, зарегистрированных в UNOS, составляла 20%. Смертность пациентов, внесенных лист ожидания, составляла 7%.

Раскрытие изобретения

Для того чтобы уменьшить настоятельную потребность в имплантируемых тканях и органах, необходимы материалы, инструменты и оборудование, которые способствуют применению регенеративной медицины и методов инженерии тканей. Более того, необходимы имплантируемые ткани и органы, применимые для заживления ран, наращивания тканей, репарации (обновления) органов и замены органов. Поэтому в настоящей заявке авторы изобретения описывают применимые для имплантации (имплантируемые) ткани, органы и способы их изготовления.

В одном аспекте настоящего изобретения раскрываются живые трехмерные инженерные (или биоинженерные) ткани или органы, содержащие один или более слоев, причем эти один или более слоев характеризуется одним или более нижеприведенных признаков: а) практическое отсутствие скаффолда (временного каркаса) во время применения; и б) полученные методом биопечати (биопринтинга), эти один или более слоев применимы для имплантации позвоночному после достаточного созревания; при условии, что по меньшей мере один слой созданных (биоинженерных) ткани или органа содержит мышечные клетки и что биоинженерная(-ый) ткань или орган не является васкулярной трубкой. Согласно некоторым вариантам изобретения по меньшей мере один слой содержит клетки множества типов, расположенные в пространстве друг относительно друга таким образом, чтобы создать пленарную структуру. Согласно другим вариантам изобретения наименьшая толщина по меньшей мере одного слоя в момент (био)фабрикации составляет по меньшей мере 100 мкм. Согласно некоторым вариантам изобретения ткань или орган содержат множество слоев, по меньшей мере один слой по своему составу или по своей структуре отличается по меньшей мере от одного другого слоя, в результате образуется слоистая структура. Согласно другим вариантам изобретения наименьшая толщина по меньшей мере одного слоя в момент (био)фабрикации составляет по меньшей мере 100 мкм. Согласно некоторым вариантам изобретения ткань или орган представляет собой мешок (капсулу), пласт (пластину) или трубку, причем указанная трубка не является васкулярной трубкой. Согласно некоторым вариантам изобретения ткань или орган в момент применения практически не содержит какого-либо преформированного (сформированного заранее) скаффолда. Согласно некоторым вариантам изобретения ткань или органы получены методом биопечати. Согласно некоторым вариантам изобретения один или более слоев образуют внеклеточный матрикс. Согласно некоторым вариантам изобретения мышечные клетки представляют собой клетки гладкой мышечной ткани (гладкомышечные клетки, клетки гладких мышц). Согласно некоторым вариантам изобретения мышечные клетки представляют собой клетки скелетных мышц. Согласно некоторым вариантам изобретения мышечные клетки представляют собой клетки сердечной мышцы. Согласно некоторым вариантам изобретения мышечные клетки образованы из стволовых клеток или клеток-предшественников, способных дифференцироваться в мышечные клетки. Согласно другим вариантам изобретения стволовые клетки или клетки-предшественники дифференцируются в мышечные клетки до, во время или после создания (ткани, органа). Согласно некоторым вариантам изобретения, помимо этого, ткань или орган содержат клетки, выбранные из: эндотелиальных клеток, нервных клеток, периваскулярных клеток (перицитов), фибробластов, тканеспецифических эпителиальных клеток, хондроцитов, клеток скелетной мышечной ткани, кардиомиоцитов, клеток костной ткани (остеоцитов), клеток мягких тканей, мезотелиальных клеток, тканеспецифических стромальных клеток, стволовых клеток, клеток-предшественников, эндодермальных клеток, эктодермальных клеток, мезодермальных клеток и их комбинаций. Согласно некоторым вариантам изобретения клетки, отличные от мышечных клеток, распределены по меньшей мере по одной поверхности одного или более слоев. Согласно другим вариантам изобретения клетки, отличные от мышечных клеток, получали методом биопечати (осуществляли сборку) по меньшей мере на одной поверхности одного или более слоев. Согласно некоторым вариантам изобретения клетки, отличные от мышечных клеток, распределяли на одном или более слоев практически одновременно с созданием (биофабрикацией) одного или более слоев, после создания одного или более слоев, во время созревания одного или более слоев или после созревания одного или более слоев. Согласно некоторым вариантам изобретения клетки, отличные от мышечных клеток, распределялись на одном или более слоев в виде слоя клеток толщиной примерно от 1 примерно до 20 клеток. Согласно некоторым вариантам изобретения один или более слоев являются практически (по существу) плоскими. Согласно другим вариантам изобретения один или более слоев являются практически плоскими. Согласно другим вариантам изобретения ткань или орган представляет собой пласт или лоскут, применимый для заживления ран, замены ткани или наращивания ткани. Согласно некоторым вариантам изобретения один или более слоев являются практически (по существу) тубулярным (трубчатым). Согласно другим вариантам изобретения ткань или орган представляет собой мочеточник, канал мочевого пузыря, канал в верхней части двенадцатиперстной кишки, фаллопиеву трубу, матку, трахею, бронх, лимфатический сосуд, уретру, кишечник, ободочную кишку, пищевод или их часть. Согласно некоторым вариантам изобретения один или более слоев представляет собой по существу мешок. Согласно другим вариантам изобретения ткань или орган представляет собой желудок, мочевой пузырь, матку или желчный пузырь или их часть. Согласно некоторым вариантам изобретения ткань или орган выбран из группы, состоящей из: уретры, канала мочевого пузыря, канала в верхней части двенадцатиперстной кишки, мочеточника, мочевого пузыря, фаллопиевой трубы, матки, трахеи, бронхов, лимфатического сосуда, пищевода, желудка, желчного пузыря, кишечника и ободочной кишки.

В другом аспекте изобретения раскрывается имплантация тканей и/или органов.

В другом аспекте изобретения раскрывается сохранение тканей и/или органов в культуре для исследований ex-vivo.

В другом аспекте изобретения раскрываются способы создания имплантируемых ткани или органа, включающих слой, содержащий мышечные клетки, причем способ включает: биопечатание биочернил, содержащих мышечные клетки, в форму; и слияние (сборку) биочернил в клеточную структуру, обладающую когезионными (когезивными) свойствами; при условии, что ткань или орган имплантируются (приживляются) позвоночному и не являются васкулярной трубкой. Согласно некоторым вариантам изобретения имплантируемая(-ый) ткань или орган практически не содержат какого-либо преформированного скаффолда во время применения. Согласно некоторым вариантам изобретения мышечные клетки представляют собой клетки гладкой мышечной ткани. Согласно некоторым вариантам изобретения мышечные клетки представляют собой клетки скелетных мышц. Согласно некоторым вариантам изобретения мышечные клетки представляют собой клетки сердечной мышцы. Согласно некоторым вариантам изобретения мышечные клетки дифференцируются из клеток-предшественников. Согласно некоторым вариантам изобретения источником мышечных клеток является образец ткани. Согласно другим вариантам изобретения образец ткани представляет собой аспират жировой ткани (липоаспират). Согласно некоторым вариантам изобретения форма представляет собой мешок или пласт (лоскут). Согласно некоторым вариантам изобретения форма представляет собой трубку с внутренним диаметром в момент биопечати около 0.15 мм или более, причем трубка не предполагается для применения в качестве сосудистого шунта-байпаса или в качестве артериовенозного шунта. Согласно некоторым вариантам изобретения биочернила дополнительно содержат клетки, выбранные из: эндотелиальных клеток, нервных клеток, перицитов, фибробластов, тканеспецифических эпителиальных клеток, хондроцитов, клеток скелетной мышечной ткани, кардиомиоцитов, клеток костной ткани, клеток мягких тканей, мезотелиальных клеток, тканеспецифических стромальных клеток, стволовых клеток, клеток-предшественников, эндодермальных клеток, эктодермальных клеток, мезодермальных клеток и их комбинаций. Согласно некоторым вариантам изобретения способ дополнительно включает стадию биопечати, разбрызгивания (распыления), рисования, нанесения, нанесения методом погружения, пересадки, засевания, впрыскивания или наложения слоями клеток, отличных от мышечных клеток, в или на заливочную форму (для биопечати). Согласно некоторым вариантам изобретения способ дополнительно включает стадию биопечати, разбрызгивания (распыления), рисования, нанесения, нанесения методом погружения, пересадки, впрыскивания (шприцевания), засевания или наложения слоями клеток, отличных от мышечных клеток, в или на когезионную (когезивную) клеточную структуру.

В другом аспекте настоящего изобретения раскрываются живые трехмерные биоинженерные ткани или органы, содержащие один или более слоев, характеризующихся тем, что они: а) практически не содержат скаффолда (являются бескаркасными) в период применения; и б) полученные методом биопечати, один или более слоев созревали до состояния, готового для имплантации позвоночному; биоинженерные ткань или орган состоят практически из клеточного материала; при условии, что по меньшей мере один слой биоинженерной ткани или органа содержит мышечные клетки и что биоинженерная ткань или орган не является васкулярной трубкой. Согласно некоторым вариантам изобретения по меньшей мере один слой содержит множество типов клеток, расположенных в пространстве друг относительно друга таким образом, чтобы создать планарную структуру. Согласно другим вариантам изобретения наименьшая толщина по меньшей мере одного слоя в момент (био)фабрикации составляет по меньшей мере 100 мкм. Согласно некоторым вариантам изобретения ткань или орган содержат множество слоев, причем по меньшей мере один слой по своему составу или по своей структуре отличается по меньшей мере от одного другого слоя, образуя слоистую структуру. Согласно другим вариантам изобретения наименьшая толщина по меньшей мере одного слоя в момент (био)фабрикации составляет по меньшей мере 100 мкм. Согласно некоторым вариантам изобретения ткань или орган представляет собой мешок (капсулу), пласт (пластину) или трубку, причем указанная трубка не является васкулярной трубкой. Согласно некоторым вариантам изобретения мышечные клетки представляют собой клетки гладкой мышечной ткани. Согласно некоторым вариантам изобретения мышечные клетки представляют собой клетки скелетных мышц. Согласно некоторым вариантам изобретения мышечные клетки представляют собой клетки сердечной мышцы. Согласно некоторым вариантам изобретения ткань или орган дополнительно содержат клетки, выбранные из: эндотелиальных клеток, нервных клеток, перицитов, фибробластов, тканеспецифических эпителиальных клеток, хондроцитов, клеток скелетной мышечной ткани, кардиомиоцитов, клеток костной ткани, клеток мягких тканей, мезотелиальных клеток, тканеспецифических стромальных клеток, стволовых клеток, клеток-предшественников, эндодермальных клеток, эктодермальных клеток, мезодермальных клеток и их комбинации. Согласно некоторым вариантам изобретения клетки распределены по меньшей мере по одной поверхности по меньшей мере одного слоя. Согласно другим вариантам изобретения клетки получали методом биопечати (осуществляли сборку) по меньшей мере на одной поверхности по меньшей мере одного слоя.

В другом аспекте изобретения раскрывается имплантация тканей и/или органов.

В другом аспекте изобретения раскрывается сохранение тканей и/или органов в культуре для исследований ex-vivo.

Краткое описание фигур

Новые признаки по изобретению подробно представлены в прилагаемой Формуле изобретения. Лучше понять признаки и преимущества настоящего изобретения можно на основании нижеприведенного подробного описания, где излагаются иллюстративные варианты изобретения, в которых применяются принципы изобретения, и на основании прилагающихся фигур:

На Фиг. 1 представлены неограничивающие примеры полученных методом биопечати лоскутов (например, пластов) гладкой мышечной ткани, созданных с применением биочернил, состоящих из клеток гладкой мышечной ткани (SMC) и содержащих также эндотелиальные клетки (ЕС). В данном примере перед процессом биопечати биочернилам был придан цилиндрический формат. Представлено окрашивание различными гистологическими красителями, чтобы показать распределение и положение типов клеток. На фиг. 1 изображены последовательно напечатанные конструкты гладкомышечной ткани непосредственно после биопечати. Н&Е окрашивание тканевого конструкта после 5 дней пребывания в культуре, демонстрирующее слияние соседних частиц "политипических" биочернил и организацию клеток на периферии. CD31 окрашивание конструктов, полученных с применением SMC:EC "политипических" биочернил, показывает организацию CD31-позитивных ЕС на периферии и рассеянных CD31-позитивных клеток в стенке. Трихромное окрашивание конструктов сосудистой стенки через 5 дней показывает активное образование коллагена.

На Фиг. 2 представлены неограничивающие примеры полученных методом биопечати пленарных лоскутов (например, пластов) гладкой мышечной ткани, созданных с применением биочернил, состоящих исключительно из SMC. В данном примере SMC биочернила не содержали никакого скаффолда или дополнительного биоматериала экзогенного происхождения, и лоскуты были "напечатаны" на биопринтере (диспенсере) NovoGen ММХ в цилиндрическом формате биопечати. В данном примере были напечатаны клетки второго типа (эндотелиальные клетки) в виде тонкого слоя на одной поверхности полученного методом биопечати SMC лоскута непосредственно после фабрикации. Представлено окрашивание различными гистологическими красителями, чтобы показать распределение и положение типов клеток. На фиг. 1 изображено последовательно окрашивание с помощью Н&Е, CD31, a-SMA и TUNEL конструктов, напечатанных с применением SMC-содержащих биочернил с последующим нанесением клеток второго типа (эндотелиальных клеток - ECs) в виде концентрированной клеточной суспензии из NovoGen ММХ Bioprinter™. После 5 дней культивирования происходит образование слитой сплошной SMC стенки наряду с формированием ЕС выстилки на поверхности конструкта. Малочисленные TUNEL-позитивные ядра обнаружены повсюду в напечатанной (биоинженерной) структуре, это демонстрирует жизнеспособность клеток в гладкомышечном конструкте.

На Фиг. 3а представлены неограничивающие примеры полученных методом биопечати планарных (плоских) лоскутов (например, пластов) гладких мышц вне (за пределами) биочернил, которые состояли из SMC артерий человека. В данном примере SMCs печатали поверх слоя человеческих дермальных фибробластов (HDF), чтобы имитировать естественные свойства слоя клеток гладких мышц, прилегающего к содержащей фибробласты адвентициальной оболочке. В данном примере клетки третьего типа (человеческие эндотелиальные клетки артерий) печатали в виде тонкого слоя поверх напечатанного гладкомышечного лоскута. HASMC окрашены на альфа SMA. На фиг. 3а представлены гистологические изображения напечатанных гладкомышечных лоскутов. Прямоугольный лоскут был напечатан с применением биочернил, содержащих клетки SMC артерий, напечатанные поверх монослоя HDFa, выращенного на Transwell® пористой биосовместимой мембране, а самый верхний слой образуют засеянные клетки третьего типа, эндотелиальные клетки (ЕС). Окрашивание НАЕС является CD31 - позитивным. Окрашивание HASMC позитивно в отношении альфа SMA. Временная точка = 4 дня после принтинга.

На Фиг. 3b дано макроскопическое изображение, представляющее неограничивающий пример гладкомышечного лоскута (состоящего из SMC биочернил), показанного непосредственно после биопечати на биопринтере NovoGen ММХ. В данном примере материал неадгезивного гидрогеля для локализации (ограничения, заключения (в гидрогель) (NovoGel™) использовали в качестве базовой подложки, на которую печатали конструкцию (конструкт), а также в качестве окна в "место локализации" вокруг напечатанного гладкомышечного лоскута. На фиг. 3b представлено макроскопическое изображение трехмерного напечатанного биоинженерного гладкомышечного лоскута. Дано двукратное увеличение изображения гладкомышечного лоскута, который был напечатан поверх подложки NovoGel™ и, кроме того, находился в пределах границ NovoGel™.

На Фиг. 4а дано макроскопическое изображение, представляющее неограничивающий пример напечатанных пленарных гладкомышечных лоскутов (например, пластов), созданных с использованием биочернил цилиндрической формы из человеческих клеток SMCs артерий в комбинации с человеческими эндотелиальными клетками артерий в соотношении 85:15. На фиг. 4а представлено макроскопическое изображение трехмерного напечатанного биоинженерного гладкомышечного лоскута через 24 часа после принтинга. Гладкомышечный лоскут, напечатанный с применением цилиндрических биочернил, состоящих из SMC из человеческих артерий и ЕС в соотношении 85:15.

На Фиг. 4b представлены неограничивающие примеры напечатанных планарных гладкомышечных лоскутов (например, пластов), созданных с использованием биочернил цилиндрической формы, состоящих из SMC:EC в соотношении 85:15. ЕС (эндотелиальные клетки) идентифицировали с помощью иммуноокрашивания на CD31, специфический маркер эндотелиальных клеток. На фиг. 4b представлено гистологические изображения напечатанных гладкомышечных лоскутов. Гладкомышечный лоскут, напечатанный с применением цилиндрических биочернил, состоящих из HASMC-HAEC (85:15). НАЕС окрашивание позитивно в отношении CD31.

На Фиг. 5 представлен неограничивающий пример полученного методом биопечати планарного гладкомышечного пласта, напечатанного на подложке из неадгезивного гидрогеля, в которой материал для локализации, заключения, помещенный поверх напечатанного гладкомышечного лоскута, имеет решетчатую структуру для обеспечения непосредственного контакта по меньшей мере с каким(и)-либо участком(ами) напечатанного пласта и питательной среды; также показаны типичные стадии фабрикации. На фиг. 4b представлен простой пример решетчатой структуры, напечатанной поверх поверхности трехмерного клеточного пласта. На (А) изображено необязательное диспенсирование базового слоя материала для заключения; (В) - необязательно диспенсирование границ материала для заключения; (С) - биопечать клеток в пределах определенных очертаний; (D) - диспенсирование цилиндров материала для заключения поверх клеток.

На Фиг. 6 представлен неограничивающий пример полученной методом биопечати трубки, содержащей гладкомышечную ткань. В данном примере биочернила содержали SMC в смеси с клетками двух других типов (фибробластами и эндотелиальными клетками) в соотношении (слева направо) 75:25:5, 47.5:47.5:5 и 85:10:5. На фиг. 6 изображены последовательно Н&Е окрашивание гладкомышечного пласта, состоящего из SMC:EC биочернил, через 3 дня после биопечати. Трубчатый гладкомышечный конструкт, состоящий из SMC:Fb:EC в соотношении 75:25:5, непосредственно после биопринтинга с применением NovoGen ММХ Bioprinter™. Трубчатый гладкомышечный конструкт, состоящий из SMC:Fb:EC в соотношении 47.5:47.5:5, и конструкт, состоящий из SMC:Fb:EC в соотношении 85:10:5 SMC:Fb:EC, после биопринтинга и после 7 дней пребывания в перфузионном биореакторе.

На Фиг. 7 дано макроскопическое изображение (неограничивающий пример) биоинженерной печеночной ткани, в данном случае печеночную ткань получали методом биопечати по технологии непрерывного нанесения (напыления), применяя биочернила, состоящие из клеток, инкапсулированных в композицию для экструзии (например, PF-127). (А) схематическое изображение одной функциональной единицы; (В) многослойный пласт с планарной мозаичной геометрией каждого слоя, напечатанный методом биопечати (биочернила с композицией для экструзии PF-127, содержащие 2×108 клеток) в виде многослойной структуры с планарной геометрией каждого слоя; (С) и (D) конструкция после нанесения среды и растворения композиции для экструзии. (С) Через 20 минут после нанесения среды на структуру и (D) Через 18 часов после нанесения среды на структуру.

На Фиг. 8 представлена микрофотография окрашенной с помощью Н&Е многослойной конструкции, представленной на Фиг. 7, показывающая типичную "спицу" в мозаичной структуре. Более подробно на фиг. 8 показано Н&Е окрашивание фиксированных в формалине заключенных в парафин срезов тканей звездчатых клеток, эндотелиальных клеток и дермальных фибробластов, напечатанных методом непрерывного напыления (многослойная ткань с мозаичной планарной геометрией каждого слоя), а затем выращиваемых в течение 18 часов.

На Фиг. 9 представлена линейная диаграмма, показывающая возможные примеси в "двуклеточной" системе (системе из клеток двух типов). Возможны монотипические композиции биочернил (из клеток типа 1 или клеток типа 2). Также возможно непрерывное множество (континуум) политипических смесей. При увеличении числа клеток становится очевидной увеличивающаяся сложность поверхности возможных смесей.

На Фиг. 10 дается принципиальная схема трубчатых конструкций в поперечном разрезе. Типичный способ наименования включает число цилиндрических единиц биочернил, за которым следует число аксиальных цилиндров NovoGel™ (А) 6/1, (В) 12/4, (С) 10/4, and (D) 12/7. Темные круги изображают цилиндрические биочернила во время биопринтинга. Цилиндры содержащих клетки биочернил для устойчивости структуры поддерживаются цилиндрами NovoGel™ (светлые круги). Примерный внутренний диаметр полученных в результате напечатанных трубок находится в диапазоне от 250 мкм до 1500 мкм, если исходить из того, что в биочернилах цилиндры имеют диаметр 250 мкм или 500 мкм.

На Фиг. 11 представлены напечатанные 6/1 трубчатые конструкции с "политипическим" (разнотиповым) составом биочернил состоящим из 70:30 SMC:Fib, созревавших в течение 24 часов в полной среде, включая (А) Макроскопическая морфология, длина ~45 мм с ID 250 мкм. (В) Макроскопическая морфология в увеличении, показана непрозрачная и гладкая поверхность; и микрофотографии гистологии поперечных срезов (нижний ряд). Поперечные срезы и гистология (нижний ряд) показывают полное слияние цилиндрических биочернил и очевидность пролиферации, минорного апоптоза и расположение SMCs.

На Фиг. 12 показаны напечатанные имплантируемые пласты ткани. После 5 дней созревания в статической культуре напечатанные (методом биопринтинга) тканевые лоскуты хирургическим способом соединяют непрерывным швом (А) или несколькими отдельными швами (В).

На Фиг. 13 изображена напечатанная скелетная мышечная ткань, изготовленная в виде многолуночной вставки (вкладыша) для продолжительного хранения и созревания (А). Н&Е окрашивание напечатанной скелетной мышечной ткани после 3 дней и 9 дней выдерживания в культуре (В, С). Н&Е окрашивание после 3 дней выдерживания в культуре демонстрирует начальное выравнивание С2С12, НАЕС и/или HDFa. Н&Е окрашивание напечатанной скелетной мышечной ткани после 9 дней выдерживания в культуре выявляет многоядерные клетки - демонстрируя формирование мышечных волокон.

Осуществление изобретения

Данное изобретение относится к области регенеративной медицины и/или (био)инженерии тканей и органов. Более конкретно, данное изобретение относится к тканям и органам, содержащим по меньшей мере один слой, включающий мышечные клетки, где биоинженерные ткань или орган состоит по существу (практически) из клеточного материала, и к способам их фабрикации. Преимуществом тканей, органов и способов, раскрываемых в настоящей заявке, является, например, гибкая трехмерная структура тканей, которая позволяет изготавливать необязательно слоистые лоскуты (пласты, листы), трубки и мешки, содержащие мышечные клетки. Другим преимуществом является метод послойного получения гибких структур, что делает возможным распределение, диспенсирование (распыление) и/или биопечать (биопринтинг) по меньшей мере на одной поверхности слоя. Эти преимущества приводят к получению биоинженерных тканей и органов, которые имитируют состав и строение естественной ткани.

Согласно некоторым вариантам настоящего изобретения предусматриваются живые трехмерные биоинженерные ткани или органы, содержащие один или более слоев, причем эти один или более слоев характеризуются одним или более нижеприведенных признаков: а) практическое отсутствие скаффолда (временного каркаса) во время применения; и б) полученные методом биопечати, эти один или более слоев применимы для имплантации позвоночному после достаточного созревания; при условии, что по меньшей мере один слой созданных (биоинженерных) ткани или органа содержит мышечные клетки и что биоинженерная(-ый) ткань или орган не является васкулярной трубкой.

Также в некоторых вариантах настоящего изобретения раскрывается имплантация тканей и/или органов.

Также в некоторых вариантах настоящего изобретения раскрываются способы фабрикации (изготовления, создания, биофабрикации) имплантируемых ткани или органа, содержащих слой мышечных клеток, причем этот способ включает: биопечать (биопринтинг) биочернил, содержащих мышечные клетки, в форму; и слияние (сборку) биочернил в когезионную клеточную структуру; при условии, что ткань или орган могут имплантироваться позвоночному и не представляют собой васкулярную трубку.

Также в некоторых вариантах настоящего изобретения предусматриваются живые биоинженерные ткани или органы, содержащие один или более слоев один, причем эти один или более слоев характеризуется одним или более нижеприведенных признаков: а) практическое отсутствие скаффолда (каркаса) во время применения; и б) полученные методом биопечати (биопринтинга), эти один или более слоев созревали до состояния, готового для имплантации позвоночному; созданные (биоинженерные) ткань или орган состоят практически (по существу) из клеточного материала; при условии, что по меньшей мере один слой созданных (биоинженерных) ткани или органа содержит мышечные клетки и что биоинженерная(-ый) ткань или орган не является васкулярной трубкой.

Также в некоторых вариантах настоящего изобретения предусматривается имплантация тканей и/или органов.

Некоторые определения

Если не указано иначе, все технические и научные термины имеют значение, которое обычно понятно специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение.

Применяемые в данном описании и в прилагаемой Формуле изобретения понятия в форме единственного числа применимы к понятиям во множественном числе, если из контекста не следует иначе. Например, указание на "нуклеиновую кислоту" включает одну или более нуклеиновых кислот, и/или композиции, подобные композициям по настоящему изобретению, станут очевидными специалистам в данной области техники после прочтения настоящей заявки, и т.п. Если не указано иначе, предполагается, что каждый раз слово "или" в данном контексте охватывает выражение "и/или".

В данном контексте термин "биочернила" означает жидкую, полутвердую или твердую композицию, содержащую совокупность клеток. Согласно некоторым вариантам изобретения биочернила представляют собой клеточные растворы, клеточные агрегаты, гели, содержащие клетки, многоклеточные тельца или ткани. Согласно некоторым вариантам изобретения помимо этого биочернила содержат материал для подложки (основы). Согласно некоторым вариантам изобретения помимо этого биочернила содержат неклеточные материалы, которые придают специфические механические свойства, обеспечивающие возможность биопечати.

В данном контексте термин "биопечать", "биопринтинг" означает применение трехмерного точного (прецизионного) нанесения клеток (например, клеточных растворов, гелей, содержащих клетки, клеточных суспензий, клеточных концентратов, многоклеточных агрегатов, многоклеточных телец и т.д.) по методике, совместимой с автоматическим или полуавтоматическим компьютерным устройством для трехмерного (3D) прототипирования (например, биопринтером).

В данном контексте термин "кровеносный сосуд" означает трубку из клеток гладких мышц, дополнительно содержащую васкулярные эндотелиальные клетки и имеющую внутренний диаметр более 100 мкм, и предполагаемую для применения in vivo в качестве промежуточного сосудистого трансплантата, обходного сосудистого шунта (трансплантата) и артерио-венозного сосудистого шунта. В данном контексте "кровеносный сосуд" однозначно не включает компоненты целостной сосудистой системы (артерии, вены, артериолы, венулы, капилляры и микроциркуляторное русло) других органов или тканей. Например, сосудистая сеть, связанная с мочевым пузырем, кишечником или пищеводом в данной заявке не входит в определение "кровеносного сосуда".

В данном контексте термины "слипаться", "сцепляться", "объединяться", "сцепленный" ("когезивный", "когезионный") и "слипание", "сцепление", "когезия" относятся к адгезивному взаимодействию клетка-клетка, которое ведет к связыванию, объединению клеток, клеточных агрегатов, многоклеточных агрегатов, многоклеточных телец и/или их слоев. Эти термины употребляются на равных правах с терминами "сливаться," "слитый" и "слияние."

В данном контексте термин "внеклеточный (экстрацеллюлярный) матрикс" означает белки, продуцируемые клетками и перенесенные из клеток во внеклеточное пространство, где они служат в качестве носителя для удерживания тканей вместе, для создания поверхностного натяжения и/или для содействия передаче сигнала в клетке.

В данном контексте определение "имплантируемый" означает биосовместимый и могущий быть введенным в живой организм или привитым или прикрепленным к нему либо временно, либо практически постоянно.

В данном контексте "слоистый" означает многослойную напечатанную биоткань, в которой два или более планарных слоя объединены для увеличения толщины ткани по оси z. Согласно некоторым вариантам изобретения все пленарные (двумерные) слои практически аналогичны по строению и/или составу. Согласно другим вариантам изобретения все пленарные (двумерные) слои практически различны по строению и/или составу.

В денном контексте определение "многослойный" означает состоящий из двух или более слоев ткани, причем толщина каждого слоя составляет один или более слоев клеток. Согласно некоторым вариантам изобретения слои ткани наносятся поочередно. Согласно другим вариантам изобретения несколько слоев наносятся одновременно. Необязательно, каждый слой состоит из клеток нескольких типов. Далее, клетки нескольких типов в каждом слое необязательно расположены друг относительно друга на плоскости x-y (т.е. на горизонтальной плоскости) в виде пространственно-определенной структуры. Помимо этого, добавление слоев по оси z (т.е. в вертикальной плоскости) в некоторых случаях приводит к контролируемому пространственному позиционированию клеток внутри слоев относительно друг друга таким образом, что пространственно-определенное строение продолжается в плоскости z.

В денном контексте термин "орган" означает совокупность тканей, объединенную в структурный элемент, выполняющий общую функцию. Примеры органов включают, но без ограничения, кожу, уретру, канал, мочеточник, мочевой пузырь, фаллопиеву трубу, матку, трахею, бронх, лимфатический сосуд, пищевод, желудок, желчный пузырь, тонкую кишку, толстую кишку и ободочную кишку.

В данном контексте "планарная (двумерная) структура" означает слой многоклеточной непечатанной биоткани, в которой несколько составов (композиций) биочернил и/или свободных пространств пространственно расположены относительно друг друге в виде определенного рисунке в горизонтальной (x-y) плоскости слоя ткани. При описании формы "пласта" или "лоскута" ткани "пленарный" означает также практически плоский.

В денном контексте "скаффолд" ("каркас", "каркасная структура") относится к синтетическим скаффолдам, таким как полимерные скаффолды и пористые гидрогели, несинтетические скаффолды, такие как преформированные слои внеклеточного матрикса, слои мертвых (фиксированных) клеток и очищенные от клеток (децеллюляризованные) ткани, и любой другой тип преформированного скаффолда, который является неотъемлемой честью физической структуры биоинженерной ткани и/или органа и который невозможно отделить от ткани и/или органа, не повредив/не разрушив указанную ткань и/или орган. Согласно другим вариантам изобретения скаффолды децеллюляризованных природных тканей или децеллюляризованного клеточного материала получали с использованием клеток, выращенных любым способом; например, слои клеток, которые оставлены умирать, или являются децеллюляризованными слоями, оставляющими после себя внеклеточный матрикс (ЕСМ), который они продуцировали, будучи живыми. Выражение "не содержащий скаффолда", "являющийся бескаркасным" в данном контексте указывает на то, что содержащие клетки трубка, мешок или лоскут (пласт) по существу (практически) не содержат скаффолда (по определению выше) в момент применения. "Не содержащий скаффолда" применяется на равных правах с выражениями "бескаркасный" и "не содержит преформированного скаффолда".

В данном контексте термин "стволовая клетка" означает клетку, которая проявляет активность и является самообновляемой. Стволовые клетки включают, но без ограничения, тотипотентные клетки, плюрипотентные клетки, мультипотентные клетки, олигопотентные клетки, унипотентные клетки и клетки-предшественники (прогениторные клетки). Согласно некоторым вариантам изобретения стволовые клетки представляют собой эмбриональные стволовые клетки, перинатальные стволовые клетки, стволовые клетки взрослых, стволовые клетки из околоплодных вод и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки.

В данном контексте "субъект" означает любого отдельного человека. Термин употребляется на равных правах с терминами "пациент", "реципиент" и "донор." Ни один из этих терминов не должен истолковываться как некто, требующий наблюдения (постоянного или иного) специалиста-медика (например, врача, медицинской сестры, фельдшера, помощника врача, санитара, работника хосписа, социального работника и специалиста по клиническим исследованиям) или научного сотрудника.

В данном контексте термин "ткань" означает совокупность клеток. Примеры тканей включают, но без ограничения, соединительную ткань (например, рыхлую соединительную ткань, плотную волокнистую соединительную ткань, эластичную ткань, ретикулярную (сетчатую) соединительную ткань и жировую ткань), мышечную ткань (например, скелетную мышечную ткань, гладкомышечную ткань и сердечную мышечную ткань), ткань мочеполовой системы, ткань желудочно-кишечного тракта, легочную ткань, костную ткань, нервную ткань и эпителиальную ткань (например, однослойный эпителий и многослойный эпителий), эндодермальную ткань, мезодермальную ткань и эктодермальную ткань.

Тканевая инженерия

Тканевая инженерия является междисциплинарной областью, которая применяет и объединяет принципы инженерии и медико-биологических наук в отношении разработки биологических заменителей, которые восстанавливают, сохраняют или усовершенствуют функции тканей посредством наращивания, репарации или замены органа или ткани. Основной метод классической тканевой инженерии заключается в засевании живых клеток в биосовместимую и в конечном счете биоразлагаемую среду (например, скаффолд) с последующим выращиванием этой биоконструкции в биореакторе таким образом, чтобы исходная популяция клеток дополнительно росла и созревала, давая целевую ткань для имплантации. При использовании соответствующего скаффолда, который имитирует биологический внеклеточный матрикс (ЕСМ), полученная ткань принимает как форму, так и функцию заданного органа после in vitro и in vivo созревания. Однако, достижение достаточно высокой плотности клеток, образующих природную тканеподобную структуру, представляет сложность вследствие ограниченной способности контролировать распределение и пространственное расположение клеток по всему скаффолду. Эти ограничения часто являются причиной появления тканей или органов с плохими механическими свойствами и/или недостаточной функцией. Имеются другие трудности в том, что касается биоразложения скаффолда, задерживания остаточного полимера и процессов производства в промышленных масштабах. Были предприняты попытки применения бескаркасных методов. Современные бескаркасные методы подчиняются некоторым ограничениям:

- Структуры со сложной геометрией, такие как многослойные структуры, в которых каждый слой содержит клетки другого типа, часто требуют оптимального с высоким разрешением расположения типов клеток в специфической структуре, чтобы добиться воспроизводимой подобной природной тканевой структуры.

- Масштаб и геометрия ограничены диффузией и/или потребностью функциональных сосудистых сетей в питательных веществах.

- Жизнеспособность тканей во многих случаях ослаблена из-за материала для локализации, заключения, который ограничивает диффузию и доступ клеток к питательным веществам.

В некоторых вариантах изобретения раскрываются биоинженерные ткани и органы и способы фабрикации. Способы тканевой инженерии, раскрываемые в настоящей заявке, имеют следующие преимущества:

- Они позволяют продуцировать ткани и/или органы, содержащие клетки.

- Они имитируют условия, наблюдаемые в ходе развития, гомеостаза и/или патогенеза природных тканей, путем воссоздания межклеточных взаимодействий, подобных взаимодействиям в природных тканях.

- Они, необязательно, позволяют получать широкий спектр комплексной топологии (например, многослойные структуры, сегменты, лоскуты (пласты), трубки, мешки и т.д.).

- Они совместимы с автоматическими способами производства и масштабируемы.

Биопечать позволяет усовершенствовать способы получения содержащих клетки имплантируемых тканей, которые применимы для репарации, наращивания, замены тканей и замены органов (см. ниже).

Биопечать

Согласно некоторым вариантам изобретения был напечатан по меньшей мере один компонент биоинженерных имплантируемых тканей и/или органов. Согласно другим вариантам изобретения биоинженерные имплантируемые ткани и/или органы были полностью получены методом биопечати (биопринтинга). В других вариантах изобретения напечатанные конструкции получены способом, использующим технологию скоростного прототипирования на основе трехмерного автоматического компьютерного нанесения (диспенсирования, напыления) клеток, включая растворы клеток, клеточные суспензии, гели или пасты, содержащие клетки, клеточные концентраты, многоклеточные тельца (например, цилиндры, сфероиды, ленточные (лентообразные) структуры и т.д.), и материал для локализации (заключения) на биосовместимой поверхности (например, состоящей из гидрогеля и/или пористой мембраны) с применением устройства для трехмерной доставки (например, биопринтера). Согласно некоторым вариантам изобретения термин "биоинженерный" в применении к тканям и/или органам, означает, что с помощью компьютерного устройства (например, биопринтера) клетки, клеточные растворы, клеточные суспензии, гели или пасты, содержащие клетки, клеточные концентраты, многоклеточные агрегаты, и их слои располагаются, образуя трехмерные структуры в соответствии с компьютерным скриптом (сценарием). Согласно другим вариантам изобретения компьютерный скрипт представляет собой, например, одну (один) или более компьютерных программ, компьютерных приложений или компьютерных модулей. Согласно другим вариантам изобретения трехмерные тканевые структуры образуются после процесса печатания (принтинга, диспенсирования клеток) в результате слияния клеток или многоклеточных телец аналогично явлению самосборки на ранних стадиях морфогенеза.

Хотя существует ряд методов расположения клеток, многоклеточных агрегатов и/или их слоев на биосовместимой поверхности для получения трехмерной структуры, включая размещение (диспенсирование) вручную, позиционирование с применением автоматизированного компьютеризованного прибора, такого как биопринтер, является предпочтительным. Преимущества доставки клеток или многоклеточных телец таким методом включает быстрое, точное и воспроизводимое диспенсирование (распределение) клеток или многоклеточных телец, образующих (био)конструкции с запланированными или предетерминированными ориентацией или паттернами клеток, многоклеточных агрегатов и/или их слоев различного состава. Преимущества также включают гарантированно высокую плотность клеток при минимальном повреждении клеток.

Согласно некоторым вариантам изобретения метод биопечати является непрерывным и/или по существу (практически) непрерывным. Неограничивающим примером непрерывного процесса биопечати является диспенсирование (распыление) биочернил с помощью биопринтера через наконечник для диспенсирования (например, шприц, капиллярную трубку и т.п.), соединенный с резервуаром для биочернил. Согласно другим неограничивающим вариантам изобретения непрерывный метод биопечати представляет собой диспенсирование (распыление) биочернил при многократном повторении функциональных модулей. Согласно различным вариантам изобретения (многократно) повторяющийся функциональный модуль имеет любую подходящую геометрическую форму, включая, например, форму круга, квадрата, прямоугольника, треугольника, многоугольника и неправильную геометрическую форму. Согласно другим вариантам изобретения повторяющийся паттерн печатаемых функциональных модулей содержит слой, а несколько слоев печатается рядом (например, один над другим), образуя биоинженерную ткань или биоинженерный орган. Согласно различным вариантам изобретения печатается 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или более прилегающих (например, друг над другом) слоев, образуя биоинженерную ткань или биоинженерный орган.

Согласно некоторым вариантам изобретения, напечатанные функциональные модули повторяются в виде мозаичного рисунка. "Мозаичный рисунок" означает плоскость, которую заполняют фигуры без взаимного наложения и без промежутков между ними. На Фиг. 7А представлен пример функционального модуля, который необязательно повторяется, образуя мозаичный рисунок, изображенный на Фиг. 7В. Преимущества непрерывной и/или мозаичной биопечати включают, например, повышенный выход напечатанной ткани. Другим не имеющим ограничительного характера типичным преимуществом является отсутствие необходимости настраивать биопринтер в соответствии с ранее нанесенными элементами биочернил. Непрерывная биопечать также упрощает печатание тканей большего размера при использовании большего запаса биочернил, необязательно с применением шприцевания.

Согласно некоторым вариантам изобретения методы непрерывной биопечати включают параметры оптимизации и/или стабилизации, такие как высота отпечатка, скорость насоса, скорость движения робота или их комбинации, независимо или в зависимости друг от друга. В одном примере скорость головки биопринтера в процессе распыления (нанесения) составляла 3 мм/с, при высоте "печати" (диспенсирования) 0.5 мм для первого слоя, и высота печати увеличивалась на 0.4 мм при диспенсировании каждого последующего слоя. Согласно некоторым вариантам изобретения высота распыления примерно равна диаметру печатающей головки биопринтера. В частности, приемлемое и/или оптимальное расстояние при диспенсировании не должно быть таким, чтобы полученный в результате материал сглаживался или прилипал к дозирующей игле. Согласно некоторым вариантам изобретения печатающая головка биопринтера имеет внутренний диаметр около 20, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 мкм или более, включая инкременты. Согласно некоторым вариантам изобретения объем резервуара для чернил для биопринтера составляет около 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 миллилитров или более, включая инкременты. Согласно некоторым вариантам изобретения скорость насоса является приемлемой и/или оптимальной, когда постепенное увеличение остаточного давления в системе является низким. Согласно некоторым вариантам изобретения предпочтительная скорость насоса зависит от соотношения между площадью поперечного сечения резервуара и дозирующей иглы, причем в случае повышенного соотношения требуется меньшая скорость насоса. Согласно некоторым вариантам изобретения приемлемая и/или оптимальная скорость печати позволяет наносить однородную линию, не влияя на механическую целостность материала.

Изобретение по настоящему описанию включает методы хозяйственно-организационной деятельности. Согласно некоторым вариантам изобретения быстрота и возможность увеличения масштабов (масштабируемость) технологии и методов по настоящему изобретению позволяют создавать, строить и эксплуатировать промышленные и/или хозяйственные объекты для получения биоинженерных тканей и/или органов для имплантации. Согласно другим вариантам изобретения биоинженерные ткани и/или органы для имплантации получают, хранят, распределяют, поставляют на рынок, рекламируют и продают, например, в виде материалов, инструментов и наборов для применения in vivo, например, для лечения повреждения тканей, заболевания тканей, и/или органной недостаточности. Согласно другим вариантам изобретения биоинженерные ткани и/или органы получают, хранят, распределяют, поставляют на рынок, рекламируют и продают, например, в виде материалов, инструментов и наборов для применения in vitro, например, для научных и/или медицинских исследований. Согласно другим вариантам изобретения биоинженерные ткани и/или органы сохраняют в культуральных средах и используют в научных и/или медицинских исследованиях.

Биоинженерные ткани и органы

Согласно некоторым вариантам настоящего изобретения предусматриваются биоинженерные имплантируемые ткани и/или органы, содержащие один или более слоев, в которых по меньшей мере один слой содержит мышечные клетки. Согласно некоторым вариантам изобретения эти один или более слоев характеризуется тем, что он либо практически не содержит скаффолда (каркаса) на момент применения, во время биопечати (технология по настоящему описанию), или в обоих случаях. Согласно другим вариантам изобретения эти один или более слоев и/или биоинженерная ткань или биоинженерный орган состоят по существу (практически) из клеточного материала. Согласно некоторым вариантам изобретения эти один или более слоев применимы для имплантации позвоночному после достаточного созревания. Согласно некоторым вариантам изобретения эти один или более слоев созревают до состояния готовности для имплантации позвоночному.

Согласно некоторым вариантам изобретения биоинженерные ткани и органы состоят по существу (практически) из клеточного материала. Согласно некоторым другим вариантам изобретения содержащие клетки участки биоинженерных тканей и органов в момент создания на 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.9 и 100% состоят из клеточного материала, включая инкременты. Согласно некоторым другим вариантам изобретения содержащие клетки участки биоинженерных тканей и органов в момент применения на 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.9 и 100% состоят из клеточного материала, включая инкременты. Согласно некоторым другим вариантам изобретения биоинженерные ткани представляют собой сцепленные и/или слипшиеся агрегаты клеток. Согласно некоторым вариантам изобретения неклеточные компоненты удаляют перед применением. Согласно некоторым вариантам изобретения неклеточные компоненты удаляют физическими, химическими или ферментативными методами. Согласно некоторым вариантам изобретения часть неклеточных компонентов на момент применения остается связанной с клеточными компонентами. Согласно некоторым вариантам изобретения неклеточные компоненты выбраны из группы, которая включает: гидрогели, поверхностно-активные вещества, полиолы, термочувствительные полимеры, гиалуронаты, альгинаты, коллагены или другие биосовместимые природные или синтетические полимеры.

Биоинженерные ткани необязательно имитируют какую-нибудь ткань человека или млекопитающего. Типичные ткани включают эпителиальную ткань, соединительную ткань, мышечную ткань, нервную ткань и т.п. Согласно некоторым вариантам изобретения биоинженерные органы представляют собой совокупность тканей, объединенных в структурную(ые) элемент(ы), выполняющий(ие) общую функцию. Органы надлежащим образом имитируют какой-либо обычный орган человека или млекопитающего. Примеры органов включают, без ограничения, трахею, бронх, пищевод, желудок, кишечник, ободочную кишку, желчный пузырь, матку, фаллопиеву трубу, мочеточник, мочевой пузырь, уретру, лимфатический сосуд и т.п., включая их участки.

Согласно некоторым вариантам изобретения биоинженерные ткани и органы можно имплантировать. Согласно другим вариантам изобретения имплантируемые ткани и органы являются биосовместимыми, это означает, что в случае их имплантации риск повреждения организма или токсического действия на организм, с которым они контактируют, ограничен. Согласно некоторым вариантам изобретения имплантация включает введение или пересадку (трансплантацию) ткани или органа субъекту. Согласно другим вариантам изобретения введение и/или пересадку (имплантацию) осуществляют хирургическим путем. Согласно другим вариантам изобретения имплантация включает фиксацию ткани или органа в организме субъекта. Ткани и органы по настоящему изобретению соответствующим образом приживляются (имплантируются) для функционирования в течение различного времени. Согласно некоторым вариантам изобретения ткани и/или органы соответствующим образом имплантируются, без ограничения, для временного, полупостоянного и постоянного функционирования. Согласно некоторым вариантам изобретения имплантированные ткани и/или органы со временем усваиваются, встраиваются или растворяются. Согласно другим вариантам изобретения имплантированные ткани и/или органы сохраняют индивидуальную форму в течение определенного периода времени.

Биоинженерные ткани и органы применимы для имплантации любому нуждающемуся в этом позвоночному. Согласно некоторым вариантам изобретения позвоночные включают, но без ограничения, людей, позвоночных домашних животных и животных, относящихся к млекопитающим (Mammalia), птицам (Aves), рептилиям (Reptilia), земноводным (Amphibia), классу костных рыб (Osteichthyes), классу хрящевых рыб (Chondrichthyes), подклассу бесчелюстных (Agnatha) и т.д.

Согласно различным вариантам изобретения биоинженерные ткани и органы применимы для имплантации любому позвоночному, которому необходимы, например, заживление раны, репарация ткани, наращивание ткани, замена ткани и/или замена органа. Согласно некоторым вариантам изобретения биоинженерные ткани применяются для заживления ткани или репарации ткани. Например, биоинженерный лоскут (пласт) применяется для временной или необратимой (постоянной) репарации поврежденной кожи человека. Согласно некоторым вариантам изобретения биоинженерные ткани применяются для наращивания тканей. Например, биоинженерный лоскут (пласт) применяется для наложения временной или постоянной "заплаты" или для временного или постоянного (необратимого) исправления дефекта в мышечной стенке мочевого пузыря или желудка у человека. Согласно некоторым вариантам изобретения биоинженерные ткани применяются для замены тканей. Например, биоинженерные лоскут или трубка применяются для временной или постоянной репарации или замены стенки сегмента тонкой кишки у человека. Согласно некоторым вариантам изобретения биоинженерные органы применяются для замены органов. Например, биоинженерная трубка применяется для временной или постоянной замены фаллопиевой трубы у человека, поврежденной вследствие внематочной беременности. Согласно некоторым вариантам изобретения биоинженерная трубчатая структура (конструкция) применяется для создания новых соединений с системой органов; например, трубку, содержащую гладкомышечную ткань, можно было бы использовать для увеличения длины соединения от желудочно-кишечного тракта или почки через стенку тела, чтобы обеспечить отвод продуктов жизнедеятельности при некоторых заболеваниях. Согласно другим вариантам изобретения биоинженерные трубчатые структуры (конструкции) применяют для увеличения длины некоторых нативных тканей (например, пищевода, кишечника, ободочной кишки и т.д.), чтобы устранить специфические заболевания или уменьшить интенсивность специфических заболеваний, являющихся врожденными (например, синдрома короткого кишечника и т.д.) или возникающих вследствие других заболеваний или повреждений.

Согласно некоторым вариантам изобретения биоинженерные имплантируемые ткани и органы имеют любую подходящую форму (конфигурацию). Согласно некоторым вариантам изобретения форму выбирают таким образом, чтобы имитировать конкретную естественную ткань или конкретный естественный орган.

Согласно некоторым вариантам слой, содержащий мышечные клетки, или целая биоинженерная ткань или целый биоинженерный орган имеет практически форму листа (пласта, широкой полосы) или форму, которая содержит лист. Согласно другим вариантам лист имеет по существу (практически) плоскую (пленарную, двумерную) форму, включая подходящие геометрические фигуры, например, но без ограничения, плоский квадрат, прямоугольник, многоугольник, круг, овал или плоскую фигуру неправильной формы. Напечатанный лист (лоскут) имеет подходящие размеры в широком диапазоне. Согласно некоторым вариантам изобретения размеры выбирают таким образом, чтобы способствовать применению для конкретной цели, включая, например, но без ограничения, залечивание ран, наращивание тканей, репарацию тканей, замену тканей и создание биоинженерного органа. Согласно другим вариантам изобретения размеры выбирают таким образом, чтобы способствовать конкретному применению у конкретного субъекта. Например, согласно одному варианту лист (лоскут) напечатан для того, чтобы исправить дефект в мышечной ткани конкретного человека.

Согласно различным вариантам изобретения биоинженерные имплантируемые ткани или органы имеют любой подходящий размер. Согласно некоторым вариантам изобретения размер биоинженерных тканей и органов, включая напечатанные ткани или органы, меняется со временем. Согласно другим вариантам изобретения напечатанная ткань или орган сжимается или суживается после биопечати вследствие, например, миграции клеток, смерти клеток, сжатия, обусловленного адгезией клеток, или вследствие других форм уменьшения размеров. Согласно другим вариантам изобретения напечатанные ткань или орган увеличиваются или расширяются после биопечати вследствие, например, миграции клеток, роста клеток и пролиферации, созревания клеток или других форм увеличения размеров.

Согласно некоторым вариантам изобретения толщина напечатанного лоскута (листа) в момент напечатания равна по меньшей мере 150 мкм. Согласно некоторым вариантам изобретения толщина напечатанного лоскута (листа) равна около 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 мкм или более, включая инкременты. Согласно другим вариантам изобретения напечатанный лист (лоскут) характеризуется тем, что его длина, ширина, или и то, и другое, составляют около 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 мкм или более, включая инкременты. Согласно другим вариантам изобретения напечатанный лист (лоскут) характеризуется тем, что его длина, ширина, или и то, и другое, составляют около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 мм или более, включая инкременты. Согласно другим различным вариантам изобретения напечатанный лист (лоскут) характеризуется тем, что его длина, ширина, или и то, и другое, составляют около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 см, включая инкременты. См., например, Пример 6 (и Фиг. 1), Пример 7 (и Фиг. 2), Пример 9 (и Фиг. 3а и 3b), Пример 10 (и Фиг. 4а и 4b).

Согласно некоторым вариантам слой, содержащий мышечные клетки, или целые биоинженерные ткань или орган имеют практически форму трубки или форму, которая включает трубку. Согласно другим вариантам изобретения напечатанная трубка представляет собой по существу свернутый лист или полый цилиндр. Согласно некоторым вариантам напечатанную трубку применяют для создания (конструирования) биоинженерного органа. Согласно другим вариантам изобретения напечатанную трубку применяют для конструирования биоинженерных органов: мочеточника, канала мочевого пузыря, фаллопиевой трубы, матки, трахеи, бронха, лимфатического сосуда, уретры, кишечника, ободочной кишки, пищевода или их части. Согласно другим вариантам изобретения трубки по настоящему описанию не являются кровеносными сосудами или васкулярными трубками. Размеры напечатанной трубки находятся в широком интервале. Согласно некоторым вариантам изобретения размеры выбирают таким образом, чтобы способствовать применению для конкретной цели, включая, например, но без ограничения, залечивание ран, репарацию тканей, наращивание тканей, замену тканей, создание биоинженерного органа и замену органа. Согласно другим вариантам изобретения размеры выбирают таким образом, чтобы способствовать конкретному применению у конкретного субъекта. Например, согласно одному варианту трубка напечатана для того, чтобы исправить конкретный сегмент лимфатического сосуда у конкретного человека. Согласно некоторым вариантам напечатанная трубка характеризуется тем, что толщина стенки трубки в момент биопечати составляет по меньшей мере 150 мкм. Согласно различным вариантам изобретения толщина стенки напечатанной трубки равна около 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 мкм или более, включая инкременты. Согласно некоторым вариантам изобретения напечатанная трубка характеризуется тем, что ее внутренний диаметр в момент биопечати составляет по меньшей мере около 250 мкм. Согласно различным вариантам изобретения внутренний диаметр напечатанной трубки составляет около 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 мкм или более, включая инкременты. Согласно различным другим вариантам изобретения внутренний диаметр напечатанной трубки составляет около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 мм или более, включая инкременты. Согласно некоторым другим вариантам длина напечатанной трубки равна около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 мм или более, включая инкременты. Согласно другим вариантам длина напечатанной трубки равна около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 см или более, включая инкременты. См., например, Пример 13 (и Фиг. 6).

Согласно некоторым вариантам слой, содержащий мышечные клетки, или целая биоинженерная ткань или целый биоинженерный орган имеют по существу форму мешка или форму, которая содержит мешок. Согласно другим вариантам мешок представляет собой по существу свернутый лист или полый цилиндр, у которого закрыт по меньшей мере один конец (например, мешок, чашу, полость, баллон и т.д.). Согласно некоторым вариантам мешок представляет собой расширяющуюся (растягивающуюся) структуру, предполагаемую для удержания проглоченного материала, плода (зародыша) и связанных с ним жидкостей, физиологических жидкостей или продуктов выделения (экскрементов) и имеющую по меньшей мере один просвет (отверстие) для ввода и по меньшей мере один просвет (отверстие) для вывода. Согласно некоторым вариантам напечатанный мешок применяется для увеличения, наращивания имеющихся органа или ткани. Согласно другим вариантам напечатанный методом биопечати мешок применяется для замены имеющегося органа или ткани. Согласно другим вариантам изобретения напечатанный мешок применяется для создания биоинженерного желудка, мочевого пузыря, матки, желчного пузыря или их части. Подходящие размеры полученного методом биопечати мешка меняются в широком интервале. Согласно некоторым вариантам размеры выбирают таким образом, чтобы способствовать применению для конкретной цели, включая, например, но без ограничения, залечивание ран, репарацию тканей, наращивание тканей, замену тканей, создание биоинженерного органа и замену органа. Согласно другим вариантам изобретения размеры выбирают таким образом, чтобы способствовать конкретному применению у конкретного субъекта. Например, согласно одному варианту мешок создают методом биопечати для увеличения или замены мочевого пузыря у конкретного человека. Согласно некоторым вариантам напечатанный мешок характеризуется тем, что толщина его стенки в момент печати равна по меньшей мере 150 мкм. Согласно различным вариантам толщина напечатанного мешка равна около 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 мкм или более, включая инкременты.

Согласно некоторым вариантам имплантируемые ткань или орган применяются для научных и/или медицинских исследований. Соответствующие научные и/или медицинские исследования включают как in vivo, так и in vitro исследования. Согласно другим вариантам биоинженерные ткани и/или органы по настоящей заявке предназначены для in vitro исследований, включая, например, но без ограничения, моделирование заболевания, поиск новых лекарств и скрининг лекарств.

Клетки

Согласно некоторым вариантам настоящего изобретения предусматриваются биоинженерные имплантируемые ткани и органы, содержащие клетки одного или более типов. Так, согласно некоторым вариантам клетки включают мышечные клетки (например, клетки гладких мышц, клетки скелетных мышц, клетки сердечной мышцы). Согласно другим вариантам слой, содержащий мышечные клетки, включает также клетки других типов, такие как клетки, описываемые в настоящей заявке (например, фибробласты, эндотелиальные клетки и т.д.). Согласно некоторым вариантам биоинженерные ткани и органы включают клетки, отличные от мышечных клеток, распределенные (распыленные, диспенсированные) по меньшей мере на одной поверхности слоя, содержащего мышечные клетки. Согласно другим вариантам клетки, распыленные по меньшей мере на одной поверхности слоя, содержащего мышечные клетки, включают, например, но без ограничения, эндотелиальные клетки, нервные клетки, перициты, фибробласты, тканеспецифические эпителиальные клетки, хондроциты, клетки скелетных мышц, кардиомиоциты, клетки костной ткани (остеоциты), клетки мягких тканей, мезотелиальные клетки, тканеспецифические стромальные клетки, стволовые клетки, клетки-предшественники и их комбинации.

Согласно некоторым вариантам любые клетки позвоночных применимы для включения в биоинженерные имплантируемые ткани и органы. Согласно другим вариантам клетки представляют собой, например, но без ограничения, сократительные или мышечные клетки (например, клетки скелетных мышц, кардиомиоциты, клетки гладких мышц и миобласты), соединительнотканные клетки (например, клетки костной ткани, клетки хрящевой ткани, фибробласты и клетки, дифференцирующиеся в клетки, формирующие кости (остеобласты), хондроциты или лимфоидные ткани), клетки костного мозга, эндотелиальные клетки, клетки кожи, эпителиальные клетки, клетки молочной железы, сосудистые клетки, клетки крови (гемоциты), лимфоциты, нервные клетки (нейроны), шванновские клетки (леммоциты), клетки желудочно-кишечного тракта, печеночные клетки (гепатоциты), клетки поджелудочной железы, легочные клетки, клетки трахеи, клетки роговицы, клетки мочеполовой системы, почечные клетки, гаметы (репродуктивные клетки), жировые клетки (адипоциты), клетки паренхимы, перициты, мезотелиальные клетки, стромальные клетки, недифференцированные клетки (например, эмбриональные клетки, стволовые клетки и клетки-предшественники), эндодермальные клетки, эктодермальные клетки, мезодермальные клетки и их комбинации.

Согласно одному варианту клетки представляют собой клетки гладких мышц. Согласно другому варианту клетки представляют собой клетки гладких мышц в сочетании с клетками другого, по меньшей мере одного, типа. Согласно некоторым вариантам клетки другого типа представляют собой фибробласты. Согласно некоторым вариантам фибробласты обеспечивают структурную и биологическую основу (подложку) для биоинженерной ткани. Согласно еще одному варианту клетки другого типа представляют собой эпителиальные клетки. Согласно некоторым вариантам эндотелиальные клетки способствуют васкуляризации и/или микроваскуляризации биоинженерной ткани. Согласно еще одному варианту клетки представляют собой клетки гладких мышц, фибробласты и эндотелиальные клетки. Согласно вариантам, включающим клетки более чем одного типа, клетки разных типов присутствуют в различных подходящих соотношениях, примеры которых приводятся в настоящей заявке.

Согласно некоторым вариантам клетки представляют собой "взрослые" дифференцированные клетки. Согласно другим вариантам "дифференцированные клетки" означают клетки с тканеспецифическим фенотипом, соответствующим, например, мышечной клетке, фибробласту или эндотелиальной клетке в момент выделения, причем тканеспецифический фенотип (или способность выявить фенотип) сохраняется от момента выделения до момента использования. Согласно другим вариантам клетки являются взрослыми недифференцированными клетками. Согласно другим вариантам выражение "недифференцированные клетки" означает клетки, которые не имеют, или утратили, отличительные тканеспецифические признаки, например, мышечных клеток, фибробластов или эндотелиальных клеток. Согласно некоторым вариантам недифференцированные клетки включают стволовые клетки. Согласно другим вариантам "стволовые клетки" означают клетки, которые проявляют активность и обладают способностью к самообновлению. Стволовые клетки включают, но без ограничения, тотипотентные клетки, плюрипотентные клетки, мультипотентные клетки, олигопотентные клетки, унипотентные клетки и клетки-предшественники (прогениторные клетки). Согласно различным вариантам изобретения стволовые клетки представляют собой эмбриональные стволовые клетки (ESC, ЭСК), взрослые стволовые клетки, стволовые клетки амниотической жидкости и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки. Согласно другим вариантам клетки представляют собой смесь взрослых дифференцированных клеток и взрослых недифференцированных клеток.

Согласно некоторым вариантам гладкомышечные клетки представляют собой клетки гладких мышц человека (человеческие гладкомышечные клетки). Согласно некоторым вариантам соответствующие гладкомышечные клетки получены из ткани, включающей, например, но без ограничения, кровеносный сосуд, лимфатический сосуд, ткань пищеварительного тракта, ткань мочеполового тракта, жировую ткань, ткань дыхательной системы, ткань репродуктивной системы, костный мозг и ткань пупочной области. Согласно некоторым вариантам дополнительные (не-гладкомышечные) клеточные компоненты получены из ткани, отличной от соответствующей целевой ткани. Согласно другим вариантам некоторые или все клетки выращивают, используя стромально-сосудистую фракцию липоаспирата млекопитающего. См. Пример 1.

Согласно различным вариантам типы клеток и/или источники клеток отбирают, придают форму, обрабатывают или модулируют в зависимости от конкретной цели или задачи. Согласно некоторым вариантам клетки одного или более конкретных типов получены от двух или более разных человек (доноров). Согласно некоторым вариантам клетки одного или более конкретных типов получены от конкретного позвоночного. Согласно другим вариантам клетки одного или более конкретных типов получены от конкретного млекопитающего. Согласно другим вариантам клетки одного или более конкретных типов получены от конкретного человека.

Методы культивирования клеток

Типы клеток, используемых в биоинженерных тканях по изобретению, соответствующим образом культивируют (выращивают) любым известным из уровня техники методом. Методы культивирования клеток и тканей известны из уровня техники и описаны, например, в учебнике Freshney, R., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques, Wiley (1987), содержание которого включено в настоящее изобретение посредством отсылки. Общие методы технологии клеточных культур, клеточных линий и клеточных систем в культуре, применяемых в контексте настоящего изобретения, описаны также в руководстве Doyle, A., Griffiths, J.В., Newell, D.G., (eds.) Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures, Wiley (1998), описание которого включено в настоящее изобретение посредством отсылки.

Оптимальные условия выращивания клеток млекопитающих хорошо известны из уровня техники. См., например, Пример 1. Клеточная культуральная среда обычно включает необходимые питательные вещества и, необязательно, дополнительные компоненты, такие как факторы роста, соли. Минералы, витамины и т.д., выбранные в соответствии с типом (типами) культивируемых клеток. Конкретные ингредиенты, необязательно, выбирают с целью активизировать рост (пролиферацию), дифференцировку клеток, секрецию конкретных белков и т.д. Как правило, стандартные условия выращивания включают выращивание в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM) с низким содержанием глюкозы, содержащей 110 мг/л пирувата и глутамина, дополненной 1-20% фетальной бычьей сыворотки (FBS), телячьей сыворотки или сыворотки человеческой крови и 100 Ед/мл пенициллина, 0.1 мг/мл стрептомицина, так же как различные другие среды, общеизвестные специалистам в данной области техники. Предпочтительно, клетки культивируют в стерильных условиях в атмосфере 1-21% O₂ и, предпочтительно, 3-5% CO₂, при температуре тела, или близкой к температуре тела животного, из которого получена клетка. Например, человеческие клетки, предпочтительно, культивируют при температуре примерно 37°C.

Клетки, необязательно, культивируют с агентами, способствующими дифференцировке клеток, дли индукции дифференцировки клеток заданной линии. Например, клетки, необязательно, культивируют с факторами роста, цитокинами и т.д. Согласно некоторым вариантам термин "фактор роста" относится к белку, полипептиду или комплексу полипептидов, включая цитокины, которые продуцируются клеткой и влияют на саму клетку и/или на различные другие соседние или дальние клетки. Как правило, факторы роста влияют на рост и/или дифференцировку клеток конкретных типов, либо в процессе развития, либо в ответ на совокупность физиологических или внешних (экзогенных) раздражителей. Некоторые, но не все, факторы роста представляют собой гормоны. Примеры факторов роста включают инсулин, инсулиноподобный фактор роста (IGF), фактор роста нервов (NGF), сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), фактор роста кератиноцитов (KGF), факторы роста фибробластов (FGFs), включая основной FGF (bFGF), факторы роста тромбоцитов (PDGFs), включая PDGF-AA и PDGF-AB, фактор роста гепатоцитов (HGF), трансформирующий фактор роста альфа (TGF-α), трансформирующий фактор роста бета (TGF-β), включая TGFβ1 и TGFβ3, эпидермальный фактор роста (EGF), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), интерлейкин-6 (IL-6), IL-8 и т.п. Факторы роста обсуждаются, наряду с другими документами, в, Molecular Cell Biology, Scientific American Books, Darnell et al., eds., 1986; Principles of Tissue Engineering, 2d ed., Lanza et al., eds., Academic Press, 2000. Специалист в данной области понимает, что любые факторы роста в кондиционированной культуральной среде по настоящему описанию входят в объем изобретения.

Биочернила и многоклеточные агрегаты

Согласно некоторым вариантам в настоящем изобретении предусматриваются биоинженерные имплантируемые ткани и/или органы, содержащие один или более слоев, причем по меньшей мере один слой содержит мышечные клетки. Согласно некоторым вариантам один или более слоев и/или биоинженерные ткань или орган состоят практически (по существу) из клеточного материала. Согласно другим вариантам клетки, отличные от мышечных клеток, диспенсировали (распыляли) по меньшей мере на одной поверхности одного или более слоев. Согласно некоторым вариантам эти один или более слоев практически не содержат скаффолда во время применения.

Согласно некоторым вариантам клетки и/или слои печатают, напыляя или выдавливая (экструдируя) из биопринтера. Согласно некоторым вариантам "биочернила" включают жидкие, полутвердые или твердые композиции, содержащие совокупность клеток. Согласно некоторым вариантам биочернила представляют собой жидкие или полутвердые клеточные растворы, клеточные суспензии или клеточные концентраты. Согласно другим вариантам клеточный раствор, суспензия или концентрат содержит жидкий или полутвердый (например, вязкий) носитель и совокупность клеток. Согласно другим вариантам носитель представляет собой соответствующую питательную среду для культуры клеток, например, такую как среда по настоящему описанию. Согласно некоторым вариантам биочернила содержат полутвердые или твердые многоклеточные агрегаты или многоклеточные тельца. Согласно еще одним вариантам биочернила получают 1) смешением совокупности клеток или клеточных агрегатов и биосовместимой жидкости или геля в заданном соотношении с получением биочернил, и 2) уплотнением (сжатием) биочернил с образованием биочернил с заданной плотностью клеток и вязкостью. Согласно некоторым вариантам уплотнение биочернил достигается центрифугированием, тангенциальной поточной фильтрацией ("TFF") или их сочетанием. Согласно некоторым вариантам уплотнение биочернил дает экструдируемую композицию, которую можно выдавливать с образованием многоклеточных агрегатов или многоклеточных телец. Согласно некоторым вариантам, термин "экструдируемая", композиция означает композицию, способную принимать форму при выдавливании (например, под давлением) через сопло или наконечник (например, через одно или более отверстий или через одну или более трубок). Согласно некоторым вариантам уплотнение биочернил является следствием выращивания клеток до соответствующей плотности. Плотность клеток необходима, поскольку биочернила изменяются в процессе применения клеток и образования ткани или органа. Согласно некоторым вариантам клетки биочернил являются сцепленными и/или слипшимися. Согласно некоторым вариантам "сцепляться (слипаться)," "сцепленный (слипшийся, когезивный, когезионный)" и "когезия, слипание" относятся к адгезионным свойствам в парах клетка-клетка, которые связывают клетки, многоклеточные агрегаты, многоклеточные тельца и/или их слои. Согласно другим вариантам эти термины применяются на равных правах с терминами "сливаться," "слитый" и "слияние." Согласно некоторым вариантам биочернила дополнительно содержат материал носителя (подложки), клеточную культуральную среду (или добавки к ней), внеклеточный матрикс (или его компоненты), агенты, способствующие клеточной адгезии, ингибиторы клеточной смерти, антиапоптотические агенты, антиоксиданты, композиции для экструзии и их комбинации.

Согласно различным вариантам клетки представляют собой любые подходящие клетки. Согласно другим различным вариантам клетки являются клетками позвоночных, клетками млекопитающих, человеческими клетками или их комбинацией. Согласно некоторым вариантам тип клеток, применяемый в способе по настоящему изобретению, зависит от типа получаемой конструкции или ткани. Согласно некоторым вариантам биочернила содержат клетки одного типа (их также называют "гомогенными" или "монотипическими" (однотипными) биочернилами). Согласно некоторым вариантам биочернила содержат клетки более чем одного типа (их также называют "гетерогенными" или "политипическими" биочернилами).

Согласно некоторым вариантам биочернила содержат 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.9 и 100% клеточный материал, включая инкременты, при приготовлении биочернил. Согласно некоторым вариантам биочернила содержат 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.9 и 100% клеточный материал, включая инкременты, при применении их для биопечати.

Среды для культур клеток

Согласно некоторым вариантам биочернила содержат среду для культур клеток (среду для клеточных культур, культуральную среду). Среда для культур клеток представляет собой любую подходящую питательную среду. Согласно различным вариантам подходящие среды для клеточных культур включают, например, но без ограничения, физиологический раствор, забуференный фосфатом Дульбекко, сбалансированный солевой раствор Эрла, сбалансированный солевой раствор Хэнкса, раствор Тироде, раствор Альзевера, сбалансированный солевой раствор Гея, буферный раствор Кребса-Хенселейта, бикарбонатный буферный раствор Кребса-Рингера, солевой раствор Пака (Puck's), модифицированную по способу Дульбекко среду Игла, модифицированную по способу Дульбекко среду Игла /Субстрат Хэма F-12, питательную смесь Хэма F-10 (F-10 Хэма), Среду 199, минимальную поддерживающую среду Игла, среду RPMI-1640, среду Эймса, среду BGJb (в модификации Фиттона-Джексона), среду Клика (Click's), среду CMRL-1066, среду Фишера, модифицированную по способу Глазго минимальную поддерживающую среду (GMEM), модифицированную по способу Исков среду Дульбекко (IMDM), среду L-15 (Лейбовица), модифицированную среду МакКоя (McCoy's) 5А, среду NCTC, среду Свима (Swim's) S-77, среду Веймаута (Waymouth), среду Е Вильямса (William's) или их комбинации. Согласно некоторым вариантам среда для клеточных культур дополнительно содержит альбумин, селен, трансферрины, фетуины, сахара, аминокислоты, витамины, факторы роста, цитокины, гормоны, антибиотики, липиды, липидные носители, циклодекстрины, обогащенную тромбоцитами плазму или их комбинацию.

Внеклеточный матрикс

Согласно некоторым вариантам биочернила дополнительно содержат один или более компонентов внеклеточного матрикса или их производных. Согласно некоторым вариантам "внеклеточный матрикс" включает белки, которые продуцируются клетками и переносятся из клеток во внеклеточное пространство, где они служат в качестве подложки для удерживания тканей вместе, создания поверхностного натяжения и/или содействия клеточной сигнализации. Примеры компонентов внеклеточного матрикса включают, но без ограничения, коллаген, фибронектин, гиалуронаты, эластин и протеогликаны. Например, многоклеточные агрегаты в некоторых случаях содержат различные ЕСМ белки (например, желатин, фибриноген, фибрин, коллаген, фибронектин, эластин и/или протеогликаны). Согласно некоторым вариантам ЕСМ компоненты или производные ЕСМ компонентов добавляют в клеточную пасту, применяемую для получения многоклеточного агрегата. Согласно другим вариантам ЕСМ компоненты или производные ЕСМ компонентов, добавляемые в клеточную пасту, очищают от компонентов человеческого или животного происхождения или получают методами рекомбинантных ДНК, известными из уровня техники. Или же ЕСМ компоненты или производные ЕСМ компонентов естественным образом секретируются клетками в удлиненном клеточном теле, или на клетки, применяемые для получения удлиненного клеточного тела, генетически воздействуют любым подходящим методом, известным в уровне техники, чтобы изменить уровень экспрессии одного или более ЕСМ компонентов или производных ЕСМ компонентов и/или молекул одного или более соединений (агентов) клеточной адгезии или молекул адгезии клетка-субстрат (например, селектинов, интегринов, иммуноглобулинов и кадгеринов (adherins). Согласно некоторым вариантам ЕСМ компоненты или производные ЕСМ компонентов стимулируют слипание (когезию) клеток в многоклеточных агрегатах. Например, согласно некоторым вариантам в клеточную пасту, применяемую для получения многоклеточных агрегатов, целесообразно добавлять желатин и/или фибриноген. Согласно другим вариантам фибриноген превращают в фибрин, добавляя тромбин.

Согласно некоторым вариантам помимо этого биочернила содержат агент, который содействует клеточной адгезии.

Согласно некоторым вариантам биочернила дополнительно содержат агент, который ингибирует клеточную смерть (например, некроз, апоптоз или аутофагоцитоз). Согласно некоторым вариантам биочернила далее содержат антиапоптотический агент. Агенты, которые ингибируют клеточную смерть, включают, но без ограничения, малые молекулы (низкомолекулярные соединения), антитела, пептиды, пептидные антитела или их комбинацию. Согласно некоторым вариантам агент, который ингибирует клеточную смерть, выбран из: антител против TNF, агентов, которые ингибируют активность интерлейкина, агентов, которые ингибируют активность интерферона, агентов, которые ингибируют активность GCSF (гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, Г-КСФ), агентов, которые ингибируют активность макрофагального белка воспаления, агентов, которые ингибируют активность TGF-B (трансформирующего фактора роста В), агентов, которые ингибируют активность ММР (матриксных металлопротеиназ), агентов, которые ингибируют активность каспазы, агентов, которые ингибируют активность сигнального каскада MAPK/JNK, агентов, которые ингибируют активность Src киназы, агентов, которые ингибируют активность JAK (Янус-киназы), их комбинации. Согласно некоторым вариантам биочернила содержат антиоксидант.

Композиции для экструзии

Согласно некоторым вариантам биочернила дополнительно содержат композицию для экструзии (т.е. композицию, которая модифицирует экструзионные свойства биочернил). Примеры композиций для экструзии включают, но без ограничения, гели, гидрогели, пептидные гидрогели, гели на основе аминокислот, поверхностно-активные полнолы (например, Pluronic (Плюроник) F-127, или PF-127), термочувствительные полимеры, гиалуронаты, альгинаты, компоненты внеклеточного матрикса (и их производные), коллагены, другие биосовместимые натуральные или синтетические полимеры, нановолокна и нановолокна, полученные самосборкой.

Гели, иногда называемые желе, определяют по-разному. Например, Фармакопея США определяет гели как полутвердые системы, состоящие из любой суспензии, приготовленной из взаимопроникающих малых неорганических частиц или больших органических молекул и жидкости. Гели включают однофазную или двухфазную систему. Однофазная система состоит из органических макромолекул, равномерно распределенных в жидкости таким образом, что между диспергированными макромолекулами и жидкостью не наблюдается границ. Некоторые однофазные гели готовят из синтетических макромолекул (например, карбомера) или из натуральных камедей (например, трагакантовой камеди). Согласно некоторым вариантам однофазные гели обычно являются водными, но могут также готовиться с применением спиртов и масел. Двухфазные гели представляют собой дисперсную структуру, содержащую небольшие дискретные частицы.

Гели иногда определяют как гидрофобные или гидрофильные. Согласно некоторым вариантам основа гидрофобного геля состоит из жидкого парафина с полиэтиленом или жирными кислотами с коллоидным диоксидом кремния или цинковым или алюминиевым мылом. Напротив, основа гидрофобных гелей обычно состоит из воды, глицерина или пропиленгликоля, которые желатинизированы, загущены с помощью подходящего гелеобразующего агента (например, трагаканта, крахмала, производных целлюлозы, карбоксивиниловых полимеров и силикатов магния-алюминия). Согласно некоторым вариантам реология композиций или устройств по настоящей заявке характеризуется псевдопластическими, пластическими, тиксотропными свойствами или способностью расширяться (дилатация).

Подходящие гидрогели включают гидрогели, полученные из коллагена, гиалуроната, фибрина, альгината, агарозы, хитозана и их комбинаций. Согласно другим вариантам подходящие гидрогели представляют собой синтетические полимеры. Согласно другим вариантам подходящие гидрогели включают гидрогели, полученные из полимеров акриловой кислоты и ее производных, поливинилового спирта, полифосфазена и их комбинаций. Согласно различным конкретным вариантам материал для локализации, заключения выбран из: гидрогеля, NovoGel™, агарозы, альгината, желатина, Matrigel™, гиалуронана, полоксамера, пептидного гидрогеля, поли(N-изопропил)акриламида, диакрилата полиэтиленгликоля (PEG-DA), гидроксиэтилметакрилата, полидиметилсилоксана, полиакриламида, полимолочной кислоты, диоксида? кремния, шелка или их комбинаций.

Согласно некоторым вариантам композиции для экструзии на основе гидрогеля представляют собой термообратимые (термореверсивные) гели (также известные как термочувствительные гели или термогели). Согласно некоторым вариантам подходящий термообратимый гель не является жидким при комнатной температуре. Согласно конкретным вариантам температура гелеобразования (Tgel) подходящего гидрогеля равна около 10°C, 11°C, 12°C, 13°C, 14°C, 15°C, 16°C, 17°C, 18°C, 19°C, 20°C, 21°C, 22°C, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C, 30°C, 31°C, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, 39°C, 40°C, включая инкременты. Согласно некоторым вариантам Tgel применимого (подходящего) гидрогеля равна примерно от 10°C примерно до 40°C. Согласно другим вариантам Tgel подходящего гидрогеля равна примерно от 20°C примерно до 30°C. Согласно некоторым вариантам биочернила (например, содержащие гидрогель, клетки одного или более типов и другие добавки, и т.д.) по настоящей заявке не являются жидкими при комнатной температуре. Согласно некоторым вариантам подходящий термочувствительный (термообратимый) гель не является жидким при температуре тела млекопитающего. Согласно конкретным вариантам температура гелеобразования (Tgel) подходящего гидрогеля равна около 22°C, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C, 30°C, 31°C, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, 39°C, 40°C, 41°C, 41°C, 43°C, 44°C, 45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C, 50°C, 51°C, 52°C, включая инкременты. Согласно некоторым вариантам Tgel подходящего гидрогеля равна примерно от 22°C примерно до 52°C. Согласно другим вариантам Tgel подходящего гидрогеля равна примерно от 32°C примерно до 42°C. Согласно некоторым вариантам биочернила (например, содержащие гидрогель, клетки одного или более типов и другие добавки, и т.д.) в данном контексте не является жидким при температуре тела млекопитающего. Согласно некоторым вариантам температура гелеобразования (Tgel) биочернил по данной заявке равна примерно 10°C, примерно 15°C, примерно 20°C, примерно 25°C, примерно 30°C, примерно 35°C, примерно 40°C, примерно 45°C, примерно 50°C, примерно 55°C, включая инкременты. Согласно конкретному варианту Tgel биочернил по настоящей заявке равна примерно от 10°C примерно до 15°C. Согласно другому конкретному варианту Tgel биочернил по настоящей заявке равна примерно от 15°C примерно до 20°C. Согласно другому конкретному варианту Tgel биочернил по настоящей заявке равна примерно от 20°C примерно до 25°C. Согласно другому конкретному варианту Tgel биочернил по настоящей заявке равна примерно от 25°C примерно до 30°C. Согласно другому конкретному варианту Tgel биочернил по настоящей заявке равна примерно от 30°C примерно до 35°C. Согласно другому конкретному варианту Tgel биочернил по настоящей заявке равна примерно от 35°C примерно до 40°C. Согласно другому конкретному варианту Tgel биочернил по настоящей заявке равна примерно от 40°C примерно до 45°C. Согласно другому конкретному варианту Tgel биочернил по настоящей заявке равна примерно от 45°C примерно до 50°C.

Полимеры, состоящие из полиоксипропилена и полиоксиэтилена, образуют термообратимые гели при включении в водные растворы. Эти полимеры обладают способностью переходить из жидкого состояния в гелеобразное состояние при температурах, поддерживаемых в биопринтере. Фазовый переход из жидкого состояния в гелеобразное состояние зависит от концентрации полимера и ингредиентов в растворе.

Полоксамер (Poloxamer) 407 (Плюроник F-127 или PF-127) представляет собой неионное поверхностно-активное вещество, состоящее из сополимеров этиленоксида и пропиленоксида (полиоксиэтилен-полиоксипропилен). Другие полоксамеры включают 188 (марки F-68), 237 (марки F-87), 338 (марки F-108). Водные растворы полоксамеров устойчивы в присутствии кислот, щелочей и ионов металлов. PF-127 представляет собой коммерческий триблок-сополимер полиоксиэтилен-полиоксипропилен общей формулы Е106 Р70 Е106 со средней молярной массой 13000. Согласно некоторым вариантам этот полимер дополнительно очищают соответствующими методами, которые повышают гелеобразующие свойства полимера. Он содержит около 70% этиленоксида, что объясняет его гидрофильность. Он является одним из ABA блок-сополимеров на основе полоксамера. PF-127 обладает высокой солюбилизирующей способностью, низкой токсичностью и поэтому рассматривается как подходящая композиция для экструзии.

Согласно некоторым вариантам вязкость гидрогелей и биочернил по настоящей заявке определяют любым описанным методом. Например, согласно некоторым вариантам для количественного определения вязкости гидрогелей и биочернил применяли вискозиметр с конусом и пластинкой (диском) LVDV-II+CP и конический шпиндель СРЕ-40. Согласно другим вариантам для количественного определения вязкости гидрогелей и биочернил применяли вискозиметр Брукфильда (шпиндель и чашка). Согласно некоторым вариантам интервалы вязкости, указанные в данной заявке, определяют при комнатной температуре. Согласно другим вариантам интервалы вязкости, указанные в данной заявке, определяют при температуре тела (например, при средней температуре тела здорового человека).

Согласно другим вариантам гидрогели и/или биочернила характеризуются вязкостью примерно от 500 примерно до 1000000 сантипуаз; примерно от 750 примерно до 1000000 сантипуаз; примерно от 1000 примерно до 1000000 сантипуаз; примерно от 1000 примерно до 400000 сантипуаз; примерно от 2000 примерно до 100000 сантипуаз; примерно от 3000 примерно до 50000 сантипуаз; примерно от 4000 примерно до 25000 сантипуаз; примерно от 5000 примерно до 20000 сантипуаз; или примерно от 6000 примерно до 15000 сантипуаз.

Согласно некоторым вариантам биочернила содержат клетки и композиции для экструзии, применимые для непрерывной биопечати. Согласно конкретным вариантам вязкость биочернил составляет примерно 1500 мПз. Согласно некоторым вариантам смесь Плюроника F-127 и клеточного материала применима для непрерывной биопечати. Согласно другому варианту такие биочернила получают, растворяя порошок Плюроника F-127 при постоянном перемешивании в холодном (4°С) фосфатно-солевом буферном растворе (PBS) в течение 48 часов до концентрации 30% (вес/об.). Плюроник F-127 также хорошо растворяется в воде. Клетки необязательно культивируют и размножают, применяя стандартные методы культивирования клеток в стерильных условиях. Согласно некоторым вариантам клетки, например, осаждают центрифугированием при скорости 200g и ресуспендируют в 30% растворе Плюроника F-127. Согласно другим вариантам клетки отсасывают в резервуар, присоединенный к биопринтеру, и оставляли затвердевать при температуре гелеобразования примерно от 10 примерно до 25°C. Гелеобразование биочернил перед процессом биопечати является необязательным. Биочернила, включая биочернила, содержащие Плюроник F-127, необязательно, распыляют в жидком виде.

Согласно различным вариантам концентрация Плюроника F-127 имеет любое значение с подходящей вязкостью и/или цитотоксичностью. Согласно некоторым вариантам Плюроник F-127 в подходящей концентрации способен в процессе биопечати поддерживать вес при сохранении формы. Согласно некоторым вариантам концентрация Плюроника F-127 составляет примерно 10%, примерно 15%, примерно 20%, примерно 25%, примерно 30%, примерно 35%, примерно 40%, примерно 45% или примерно 50%. Согласно некоторым вариантам концентрация Плюроника F-127 составляет примерно от 30% примерно до 40% или примерно от 30% примерно до 35%.

Согласно некоторым вариантам неклеточные компоненты биочернил (например, композиции для экструзии и т.д.) удаляют перед применением. Согласно другим вариантам неклеточные компоненты представляют собой, например, гидрогели, пептидные гидрогели, гели на основе аминокислот, поверхностно-активные (сурфактантные) полиолы, термочувствительные полимеры, гиалуронаты, альгинаты, коллагены или другие натуральные или синтетические полимеры. Согласно другим вариантам неклеточные компоненты удаляют физическими, химическими или ферментативными методами. Согласно некоторым вариантам часть неклеточных компонентов во время применения остается ассоциированной с клеточными компонентами.

Согласно некоторым вариантам клетки предварительно обрабатывают с целью усилить клеточное взаимодействие. Например, клетки, необязательно, инкубируют в центрифужной пробирке после центрифугирования для повышения взаимодействия клетка-клетка перед "формированием" биочернил. В другом примере клетки, необязательно, экспонируют с молекулами или реагентами, которые способствуют взаимодействию клеток, например, такие, которые модулируют ионное равновесие.

Типичные соотношения клеток

Согласно некоторым вариантам биочернила, применяемые для создания слоя ткани, содержат многоклеточные тельца, которые далее содержат мышечные клетки (например, гладкомышечные клетки, клетки скелетных мышц и/или клетки сердечной мышцы) и клетки одного или более других типов. Согласно другим вариантам отношение мышечных клеток к другим клеточным компонентам представляет собой любое подходящее отношение. Согласно еще одним вариантам соотношение мышечных клеток и других клеточных компонентов составляет примерно от 90:10 примерно до 60:40. Согласно конкретному варианту многоклеточные тельца содержат мышечные клетки и эндотелиальные клетки, и соотношение мышечных клеток и эндотелиальных клеток составляет примерно 85:15. Согласно другому конкретному варианту многоклеточные тельца содержат мышечные клетки и эндотелиальные клетки, и соотношение мышечных клеток и эндотелиальных клеток составляет примерно 70:30.

Согласно некоторым вариантам биочернила, применяемые для создания слоя ткани, содержат многоклеточные тельца, которые дополнительно содержат мышечные клетки и фибробласты. Согласно другим вариантам соотношение мышечных клеток и фибробластов представляет собой любое подходящее соотношение. Согласно другим вариантам соотношение мышечных клеток и фибробластов составляет примерно от 90:10 примерно до 60:40.

Согласно некоторым вариантам биочернила, применяемые для создания слоя ткани, содержат многоклеточные тельца, которые дополнительно содержат мышечные клетки, фибробласты и эндотелиальные клетки. Согласно другим вариантам соотношение мышечных клеток, фибробластов и эндотелиальных клеток представляет собой любое подходящее соотношение. Согласно другим вариантам соотношение мышечных клеток, фибробластов и эндотелиальным клеткам составляет примерно 70:25:5.

Самосортировка клеток

Согласно некоторым вариантам многоклеточные агрегаты, применяемые для образования конструкции или ткани, содержит клетки всех типов, которые должны быть включены в биоинженерную ткань или орган (например, мышечные клетки и клетки одного или более других типов); согласно такому примеру клетки каждого типа мигрируют в соответствующее положение (например, в процессе созревания), формируя биоинженерную ткань или орган. Согласно другим вариантам многоклеточные агрегаты, применяемые для получения (формирования) структуры, содержат меньшее число типов клеток, нежели число всех типов клеток, необходимых для включения в биоинженерную ткань. Согласно некоторым вариантам клетки каждого типа равномерно распределены в многоклеточных агрегатах, на участке или в слое ткани. Согласно другим вариантам каждый тип клеток локализован на конкретных участках внутри многоклеточных агрегатов, или слоев, или участков ткани.

Например, в случае (био)инженерного гладкомышечного лоскута, содержащего гладкомышечные клетки и эндотелиальные клетки в соответствующем соотношении (например, 85:15, 70:30, и т.д.), сливаются соседние напечатанные методом биопечати когезионные политипические цилиндрические элементы биочернил. В процессе созревания эндотелиальные клетки в определенной степени локализуются на периферии конструкции, и образуется коллаген. См., например, Фиг. 1, 2, 3а и 4b. Еще один пример: в случае напечатанного гладкомышечного лоскута, содержащего гладкомышечные клетки, фибробласты и эндотелиальные клетки в соответствующем соотношении (например, 70:25:5, и т.д.), напечатанные политипические цилиндрические элементы биочернил сливаются, а эндотелиальные клетки в определенной степени локализуются на периферии конструкции. Согласно некоторым вариантам локализация типов клеток внутри конструкции имитирует слоистую структуру in vivo или ex vivo тканей млекопитающих. Согласно некоторым вариантам сортировка или самосортировка клеток ускоряется, интенсифицируется или возрастает при нанесении одного или более слоев клеток. Например, согласно некоторым вариантам на одну или более поверхностей конструкции, напечатанной с помощью политипических чернил, содержащих гладкомышечные клетки и клетки других типов (таких как эндотелиальные клетки и/или фибробласты), далее наносят слой клеток второго тип. Согласно другим вариантам результатом нанесения слоя клеток второго типа является усиление пространственной сортировки клеток в политипических биочернилах.

Преформированный скаффолд (каркас)

Согласно некоторым вариантам настоящее изобретение предусматривает биоинженерные имплантируемые ткани и органы, не содержащие или практически не содержащие никакого преформированного (сформированного заранее) скаффолда. Согласно другим вариантам термин "скаффолд", "каркас" относится к синтетическим скаффолдам, таким как полимерные скаффолды и пористые гидрогели, несинтетические скаффолды, такие как преформированные слои внеклеточного матрикса, слои мертвых (фиксированных) клеток и децеллюляризованные ткани, и любой другой тип скаффолда, который встроен в физическую структуру биоинженерной ткани и/или органа и не удаляется из ткани и/или органа. Согласно другим вариантам скаффолды из децеллюляризованной ткани включают децеллюляризованные нативные ткани или децеллюляризованный клеточный материал, образованный клетками, культивированными любым способом; например, слои клеток, которые оставляют умирать или являются децеллюляризованными, оставляют после себя ЕСМ, которые они продуцировали, будучи живыми.

Согласно некоторым вариантам в биоинженерных имплантируемых тканях и органах не используется никакой преформированный скаффолд, например, для формирования ткани, какого-либо слоя ткани или для придания формы ткани. Согласно некоторым вариантам в биоинженерных тканях по настоящему изобретению не используются какие-либо преформированные синтетические скаффолды, такие как полимерные скаффолды, преформированные слои внеклеточного матрикса или преформированный скаффолд любого другого типа. Согласно некоторым вариантам биоинженерные ткани и органы практически не содержат каких-либо преформированных скаффолдов (каркасов) во время применения.

Согласно другим вариантам ткани и органы во время применения содержат детектируемые, но следовые или незначительные количества скаффолда, например, менее, 2.0% от общей композиции. В других вариантах следовые или незначительные количества скаффолда недостаточны для того, чтобы влиять на поведение ткани в долгосрочной перспективе, или для того, чтобы препятствовать ее основной биологической функции. Согласно другим вариантам компоненты скаффолда удаляют после принтинга физическими, химическими или ферментативными методами, получая биоинженерную ткань, не содержащую или практически не содержащую компоненты скаффолда. Согласно другим вариантам биоинженерные имплантируемые ткани и органы содержат примерно до 70 об.% биосовместимого скаффолда. Согласно другим вариантам в момент применения биоинженерные имплантируемые ткани и органы содержат примерно до 50 об.% биосовместимого скаффолда.

Согласно некоторым вариантам биоинженерные имплантируемые ткани и органы, не содержащие или практически не содержащие преформированный скаффолд в соответствии с настоящей заявкой, кардинально отличаются от имплантируемых тканей и органов, полученных некоторыми другими методами тканевой инженерии, в которых материал каркаса образуется на первой стадии, а затем, на второй стадии, скаффолд (каркас) засевают клетками. Затем клетки пролиферируют, заполняя и принимая, например, форму скаффолда. Согласно одному аспекту способы биопринтинга (биопечати) по настоящему изобретению способствуют получению жизнеспособных и полезных тканей, практически не содержащих преформированного скаффолда. В одном аспекте клетки в соответствии с некоторыми вариантами изобретения сохраняют заданную трехмерную форму за счет применения материала для локализации. Материал для локализации, заключения, отличается от скаффолда по меньшей мере тем, что материал для локализации является временным и/или может легко удаляться из клеток и/или ткани.

Слой, содержащий мышечные клетки

Согласно некоторым вариантам настоящее изобретение предусматривает биоинженерные имплантируемые ткани, причем по меньшей мере один слой биоинженерной ткани или органа содержит мышечные клетки. Согласно некоторым вариантам биоинженерные имплантируемые ткани и органы содержат по меньшей мере один слой мышцы. Соответствующий слой, содержащий мышечные клетки и/или мышцу, включает клеточный материал. Согласно различным вариантам соответствующий слой, содержащий мышечные клетки, во время создания конструкции содержит примерно 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.9 и 100% клеточного материала, включая инкременты. Согласно другим различным вариантам соответствующий слой, содержащий мышечные клетки, во время применения содержит примерно 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.9 и 100% клеточного материала, включая инкременты. Согласно некоторым другим вариантам слой или слои, содержащие мышечные клетки, содержат слитые клеточные элементы в трехмерном формате. Согласно другим вариантам слой или слои, содержащие мышечные клетки, были получены биопринтингом (методом биопечати).

Согласно некоторым вариантам слой, содержащий мышечные клетки, включает гладкую мышцу. Согласно некоторым вариантам слой, содержащий мышечные клетки, включает скелетную мышцу. Согласно некоторым вариантам слой, содержащий мышечные клетки, включает сердечную мышцу. Согласно некоторым вариантам слой или слои, содержащие мышечные клетки, включает клетки млекопитающих любого типа (помимо мышечных клеток), например, описанные в настоящей заявке. Согласно другим различным вариантам слои включают клетки 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более дополнительных типов. Согласно некоторым вариантам биоинженерные ткани или органы включают клетки одного или более типов, взятые у одного человека или у большего количества конкретных людей. Согласно различным вариантам биоинженерные ткани и органы включают клетки различных типов, взятые у 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более конкретных людей. Согласно другим вариантам клетки одного или более конкретных типов взяты у конкретного позвоночного. Согласно другим вариантам клетки одного или более типов взяты у конкретного млекопитающего. Согласно другим вариантам клетки одного или более типов взяты у конкретного человека.

Согласно некоторым вариантам слой гладкой мышцы включает гладкомышечные клетки и эндотелиальные клетки. В Примере 3 демонстрируется фабрикация цилиндрических биочернил, состоящих из гладкомышечных клеток аорты человека и эндотелиальных клеток аорты человека, тогда как в Примере 5 демонстрируется фабрикация биочернил, состоящих из гладкомышечных клеток и эндотелиальных клеток, выращенных в стромально-васкулярной фракции человеческого липоаспирата. В Примере 6 демонстрируется биопечать (биопринтинг) и слияние таких цилиндров с образованием гладкомышечных лоскутов. Согласно другим вариантам слой гладкой мышцы включает гладкомышечные клетки и фибробласты. Согласно другим вариантам слой гладкой мышцы включает гладкомышечные клетки, эндотелиальные клетки и фибробласты. В Примере 4 демонстрируется фабрикация политипических биочернил, состоящих из гладкомышечных клеток аорты человека, человеческих дермальных фибробластов и эндотелиальных клеток аорты человека. Согласно некоторым вариантам клетки слоя гладкой мышцы являются "когезивными" ("когезионными") или "адгезивными" ("адгезионными") относительно друг друга. Согласно другим вариантам когезия или адгезия относится к адгезионным взаимодействиям (свойствам) клетка-клетка, которые связывают клетки, многоклеточные агрегаты, многоклеточные тельца и/или их слои.

Биоинженерные имплантируемые ткани и органы включают любое подходящее число слоев. Согласно различным вариантам биоинженерные ткани и органы включают 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15 или более слоев. Согласно некоторым вариантам слой является напечатанным (методом биопечати) и имеет ориентацию, определяемую местонахождением (компоновкой), паттерном или ориентацией многоклеточных телец (например, удлиненных, цилиндрических или лентообразных (ribbon-like) телец). Согласно другим вариантам биоинженерная ткань или орган включает более одного слоя, И каждый слой характеризуется конкретной ориентацией по отношению к одному или более других слоев. Согласно различным вариантам один или более слоев имеют ориентацию, которая включает поворот (вращение) относительно соседнего слоя, причем этот поворот составляет примерно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 или 180 градусов, или их инкременты. Согласно другим вариантам все слои ориентированы практически аналогично.

Приемлемый (допустимый) слой характеризуется тем, что имеет любую приемлемую толщину. Согласно различным вариантам в момент создания толщина приемлемого слоя составляет примерно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 мкм или более, включая инкременты. Согласно различным вариантам в момент применения толщина приемлемого слоя составляет примерно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 мкм, включая инкременты.

Приемлемый слой, содержащий мышечные клетки, характеризуется тем, что он имеет любую приемлемую толщину. Согласно различным вариантам в момент создания толщина приемлемого слоя, содержащего мышечные клетки, составляет примерно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 мкм или более, включая инкременты. Согласно другим различным вариантам в момент применения толщина приемлемого слоя, содержащего мышечные клетки, составляет примерно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 мкм или более, включая инкременты.

Согласно некоторым вариантам слой, содержащий мышечные клетки, находится по существу (практически) в виде листа (пласта, лоскута) или в форме, содержащей этот лист. Согласно другим вариантам напечатанный лоскут мышц применяют для создания биоинженерной ткани или органа. Согласно другим вариантам напечатанный лоскут мышцы применяют для создания хирургическим путем всей или части мышечной стенки. Согласно другим вариантам напечатанный лоскут мышцы применяют для создания хирургическим путем всей или части стенки желудочно-кишечного тракта, стенки мочеполовой системы или стенки дыхательных путей. Согласно другим вариантам напечатанный лоскут мышцы применяют для создания хирургическим путем целого органа или части мочевого пузыря, желудка, кишечника, пищевода, уретры, матки, мочеточника или их части. Согласно еще одним вариантам напечатанный лоскут мышцы применяют для создания хирургическим путем всей или части стенки мочевого пузыря, стенки желудка, стенки кишечника, стенки пищевода, стенки уретры, стенки матки, стенки мочеточника или их части.

Согласно некоторым вариантам слой, содержащий мышечные клетки, имеет практически форму трубки или форму, которая включает трубку. Согласно другим вариантам напечатанную трубку мышцы применяют для создания (конструирования) биоинженерного органа. Согласно другим вариантам изобретения напечатанную трубку применяют для конструирования биоинженерных органов: мочеточника, канала мочевого пузыря, канала в верхней части двенадцатиперстной кишки, фаллопиевой трубы, матки, трахеи, бронха, лимфатического сосуда, уретры, кишечника, ободочной кишки, пищевода или их части. Согласно другим вариантам изобретения трубки по настоящему описанию не являются кровеносными сосудами.

Согласно некоторым вариантам слой, содержащий мышечные клетки, имеет по существу (практически) форму мешка или форму, которая включает мешок. Согласно другим вариантам напечатанный мешок мышцы применяют для создания биоинженерного желудка, мочевого пузыря, матки, желчного пузыря или их части.

Клетки, отличные от мышечных клеток

Согласно некоторым вариантам биоинженерные имплантируемые ткани или органы в данном контексте включают по меньшей мере один слой, содержащий мышечные клетки. Согласно другим вариантам биоинженерные имплантируемые ткани и органы по настоящему изобретению включают по меньшей мере один слой, содержащий мышцу и/или мышечные клетки. Согласно другим вариантам биоинженерные имплантируемые ткани и органы по настоящему изобретению включают по меньшей мере один слой, содержащий гладкую мышцу и/или гладкомышечные клетки. Согласно другим вариантам биоинженерные имплантируемые ткани и органы по настоящему изобретению включают по меньшей мере один слой, содержащий скелетную мышцу и/или клетки скелетных мышц. Согласно другим вариантам биоинженерные имплантируемые ткани и органы по настоящему изобретению включают по меньшей мере один слой, содержащий сердечную мышцу и/или клетки сердечной мышцы. Согласно другим вариантам биоинженерные имплантируемые ткани и органы по настоящему изобретению вводят клетки, отличные от мышечных клеток. Согласно некоторым вариантам клетки, отличные от мышечных клеток, включают в слой, содержащий мышечные клетки. Согласно различным другим вариантам в слой, содержащий мышечные клетки, вводят клетки 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или более типов. Согласно некоторым вариантам клетки, отличные от мышечных клеток, распыляют (диспенсируют) по меньшей мере на одной поверхности слоя, содержащего мышечные клетки. Согласно некоторым другим вариантам на слое, содержащем мышечные клетки, распыляют клетки 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или более типов. Согласно некоторым другим вариантам клетки, отличные от мышечных клеток, распыляют (диспенсируют) на 1, 2, 3, 4 или более поверхностей слоя, содержащего мышечные клетки.

Согласно некоторым вариантам клетки, диспенсированные по меньшей мере на одной поверхности слоя, содержащего мышечные клетки, включают любого типа клетки млекопитающих, например, клетки, представленные в настоящей заявке. Согласно некоторым вариантам диспенсированные клетки включают клетки одного или более типов, полученные от одного или более конкретных людей. Согласно некоторым вариантам диспенсированные (распыленные) клетки включают типы клеток, полученные от 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более конкретных людей. Согласно другим вариантам клетки одного или более типов получены от конкретного позвоночного. Согласно другим вариантам клетки одного или более конкретных типов получены от конкретного млекопитающего. Согласно другим вариантам клетки одного или более конкретных типов получены от конкретного человека.

Согласно некоторым вариантам клетки, отличные от мышечных клеток, распыляют (диспенсируют) на одной или более поверхностей мышцы в виде слоя клеток. Согласно другим вариантам диспенсированный слой клеток представляет собой монослой клеток. Согласно другим вариантам монослой является сплошным (конфлюэнтным). Согласно другим вариантам монослой не является сплошным. Согласно некоторым вариантам клетки, отличные от мышечных клеток, распыляют на одной или более поверхностей мышцы в виде одного или более пластов клеток. Согласно некоторым вариантам толщина пласта (лоскута, листа) клеток составляет примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 или более клеток, включая инкременты. Согласно некоторым другим вариантам толщина пласта (лоскута) клеток составляет примерно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 мкм или более, включая инкременты. Согласно некоторым вариантам клетки, отличные от мышечных клеток, распыляют на одной или более поверхностей мышцы в виде слитых агрегатов клеток. Согласно другим вариантам перед слиянием агрегаты клеток имеют, например, но без ограничения, практически сферическую, удлиненную, практически цилиндрическую форму и форму ленты. Согласно некоторым вариантам слитые агрегаты клеток образуют слой толщиной примерно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 мкм, включая инкременты.

Согласно некоторым вариантам биоинженерные ткани и органы включают клетки второго типа, отличные от мышечных клеток, распыленные на одной или более поверхностей слоя, содержащего мышцу. В Примере 7 демонстрируется создание гладкомышечного лоскута методом биопечати биочернилами на основе агрегатов человеческих гладкомышечных клеток (например, цилиндров) с последующей биопечатью слоя эндотелиальных клеток на поверхности SMC конструкции. В Примере 8 показано создание гладкомышечных лоскутов методом биопечати биочернилами на основе агрегатов гладкомышечных клеток аорты человека (например, цилиндров) с последующим нанесением поверх этих клеток слоя клеток второго типа, осуществляемым осаждением специфически расположенных капелек суспензии эндотелиальных клеток на SMC конструкции. Согласно некоторым вариантам биоинженерные ткани и органы включают клетки третьего типа, такие как фибробласты, диспенсированные на одной или более поверхностей слоя гладкой мышцы.

В Примере 9 демонстрируется создание гладкомышечных лоскутов методом биопечати биочернилами на основе агрегатов гладкомышечных клеток аорты человека (например, цилиндров) непосредственно на слой, состоящий из клеток второго типа (например, фибробластов), с последующим нанесением слоя клеток третьего типа (например, эндотелиальных клеток) на верхнюю поверхность. Верхний слой клеток наносят осаждением специфически расположенных капелек клеточной суспензии на слой гладкой мышцы. Методом, применяемым в Примере 9, получают ткань, содержащую когезионные (сцепленные) гладкомышечные клетки, слой фибробластов на одной стороне (поверхности) гладкомышечных клеток и слой эндотелиальных клеток на противоположной стороне (поверхности) гладкомышечных клеток.

Клетки, отличные от мышечных клеток, распыляют в и/или на один или более слоев, содержащих мышечные клетки, любым приемлемым методом. Приемлемые методы нанесения (отложения) включают методы, позволяющие доставлять до некоторой степени контролируемые количество или объем клеток без заметного повреждения этих клеток. Согласно некоторым вариантам приемлемые методы нанесения включают, например, но без ограничения, распыление, впрыскивание чернил через сопло, нанесение покрытия ("раскрашивание"), нанесение окунанием (погружением), "прививку" ("пересадку"), засевание, шприцевание, наслаивание, биопечать (биопринтинг) и их комбинации.

Клетки, отличные от мышечных клеток, напыляют на один или более слоев, содержащих мышечные клетки, в любое подходящее время в процессе фабрикации. Согласно некоторым вариантам клетки распыляют практически в то же самое время, когда происходит изготовление или создание мышцы (например, одновременно, сразу же после и т.д.). Согласно другим вариантам клетки распыляют после фабрикации или создания мышцы. Согласно некоторым другим вариантам клетки распыляют через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или более минут, включая инкременты, после фабрикации или построения (создания) мышцы. Согласно некоторым другим вариантам клетки распыляют через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 24, 48 или более часов, включая инкременты, после фабрикации или построения (создания) мышцы. Согласно некоторым другим вариантам клетки распыляют через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более дней, включая инкременты, после фабрикации или построения (создания) мышцы. Согласно некоторым вариантам клетки распыляют в процессе созревания одного или более слоев, содержащих мышечные клетки.

Способы

Согласно некоторым вариантам настоящее изобретение предусматривает способы изготовления (фабрикации) имплантируемых тканей или органов, содержащих слой мышечных клеток. Согласно другим вариантам способ включает "биопечатание" с использованием биочернил, содержащих мышечные клетки, в форму и слияние (сборку) биочернил в клеточную структуру, обладающую когезионными свойствами. Согласно другим вариантам имплантируемая ткань или орган в момент применения практически не содержит никакого предварительно сформированного скаффолда. Согласно другим вариантам мышечные клетки представляют собой гладкомышечные клетки, клетки скелетных мышц и/или клетки сердечной мышцы. Согласно некоторым вариантам способы позволяют получать содержащие клетки биоинженерные ткани и органы, практически не содержащие никакого предварительно сформированного скаффолда..

Изготовление биочернил, содержащих мышечные клетки

Согласно некоторым вариантам способы включают изготовление биочернил, содержащих мышечные клетки. Согласно некоторым вариантам способы включают приготовление слипшихся (объединенных за счет сил когезии, "когезионных") многоклеточных агрегатов, содержащих мышечные клетки. Согласно некоторым вариантам способы включают приготовление объединенных за счет сил когезии многоклеточных агрегатов, дополнительно содержащих другие типы клеток. Согласно другим вариантам способы включают приготовление многоклеточных агрегатов, дополнительно содержащих эндотелиальные клетки. См., например, Примеры 3 и 5. Согласно некоторым вариантам способы включают приготовление объединенных за счет сил когезии многоклеточных агрегатов, дополнительно содержащих фибробласты. См., например, Пример 4.

Существуют различные методы изготовления биочернил, содержащих многоклеточные агрегаты с характеристиками, описанными в настоящей заявке. Согласно некоторым вариантам многоклеточный агрегат формируют из клеточной пасты, содержащей совокупность живых клеток или имеющей заданную плотность и вязкость. Согласно другим вариантам клеточной пасте придают заданную форму, а многоклеточное тельце получают созреванием (например, посредством инкубации). Согласно некоторым вариантам многоклеточные агрегаты имеют практически (по существу) цилиндрическую форму. Согласно некоторым вариантам многоклеточные агрегаты имеют практически сферической формы. Согласно некоторым вариантам биоинженерные ткани формируют из многоклеточных агрегатов самой различной формы. Согласно конкретному варианту удлиненное многоклеточное тельце получают, придавая клеточной пасте, включающей совокупность живых клеток, удлиненную форму (например, форму цилиндра). Согласно другим вариантам клеточную пасту инкубируют в контролируемых условиях, способствующих объединению клеток друг с другом за счет сил адгезии или когезии с образованием удлиненного многоклеточного тельца. Согласно другому конкретному варианту многоклеточное тельце получают, формируя клеточную пасту, содержащую совокупность живых клеток, в устройстве, которое придает клеточной пасте трехмерную форму. Согласно другим вариантам клеточную пасту инкубируют в контролируемых условиях, пока она находится в трехмерной форме в течение достаточного времени, получая тельце, которое обладает достаточной силой когезии для того, чтобы самостоятельно удерживать эту форму на ровной поверхности.

Согласно некоторым вариантам клеточную пасту получают: (А) смешением клеток или клеточных агрегатов (клеток одного или более типов) и биосовместимого геля или жидкости, например, клеточной культуральной среды (например, в заданном соотношении), получают клеточную суспензию, и (В) уплотнением клеточной суспензии получают клеточную пасту с заданной плотностью клеток и вязкостью. Согласно некоторым вариантам уплотнение осуществляют различными методами, такими как концентрирование конкретной клеточной суспензии, полученной при использовании культуры клеток, при этом достигается заданная концентрация клеток (плотность), вязкость и консистенция, необходимая для клеточной пасты. Согласно конкретному варианту сравнительно разбавленную клеточную суспензию из культуры клеток центрифугируют в течение определенного времени, получая такую концентрацию клеток в осадке, которая делает возможным формование. Другим подходящим методом концентрирования или уплотнения клеток является тангенциальная поточная фильтрация ("TFF"). Согласно некоторым вариантам с клеточной суспензией смешивают соответствующие соединения, придающие свойства, необходимые для экструзии. Эти соединения включают, например, но без ограничения, поверхностно-активные полиолы, коллагены, гидрогели, матригель™, нановолокна, полученные самосборкой нановолокна, желатин, фибриноген и т.д.

Согласно некоторым вариантам клеточную пасту получали, смешивая совокупность живых клеток со средой для тканевых культур и уплотняя живые клетки (например, центрифугированием). Один или более компонентов ЕСМ (или производное компонента ЕСМ), необязательно, включали, ресуспендируя клеточный осадок в одном или более физиологически приемлемых буферов, содержащих ЕСМ компонент(ы) (или производное(-ые) ЕСМ компонента(-ов)), и полученную клеточную суспензию снова центрифугировали, получая клеточную пасту.

Согласно некоторым вариантам плотность клеток клеточной пасты, нужная для дальнейшей обработки, меняется в зависимости от типа клеток. Согласно другим вариантам взаимодействие между клетками определяет свойства клеточной пасты, и для клеток различных типов наблюдается различное соотношение между плотностью клеток и взаимодействием клетка-клетка. Согласно другим вариантам клетки, необязательно, предварительно обрабатывают, чтобы повысить клеточное взаимодействие перед приданием клеточной пасте определенной формы. Например, клетки, необязательно, инкубируют внутри центрифужной пробирки после центрифугирования, чтобы усилить взаимодействие клетка-клетка перед приданием клеточной пасте определенной формы.

Согласно различным вариантам для придания клеточной пасте определенной формы применяются многие методы. Например, согласно конкретному варианту клеточную пасту формуют или прессуют вручную (например, после концентрирования/уплотнения), получая нужную форму. В другом примере клеточную пасту отбирают (например, отсасывают, аспирируют) каким-либо устройством (например, микропипеткой (например, капиллярной пипеткой)), в результате клеточная паста принимает форму внутренней поверхности этого устройства. Поперечное сечение микропипетки (например, капиллярной пипетки) имеет либо круглую, квадратную, прямоугольную, треугольную, либо другую некруглую форму. Согласно некоторым вариантам клеточную пасту формуют, помещая ее в подготовленную форму, такую как пластиковая форма, металлическая форма или гелеобразная форма. Согласно некоторым вариантам для формования клеточной пасты применяют метод центробежной отливки или метод непрерывного литья.

Согласно некоторым вариантам практически сферические многоклеточные агрегаты, либо самостоятельно, либо в комбинации с удлиненными клеточными тельцами, также применимы для создания тканей и органов, описанных в настоящей заявке. Сферические агрегаты удобно получать различными методами, включая метод самосборки, метод с применением форм и метод висячей капли. Согласно другим вариантам метод получения практически (по существу) сферических многоклеточных агрегатов включает стадии: 1) предоставления клеточной пасты, содержащей совокупность предварительно отобранных клеток или клеточных агрегатов с заданной плотностью клеток и вязкостью, 2) придания клеточной пасте цилиндрической формы, 3) разрезания цилиндров на равные фрагменты, 4) придания фрагментам округлой формы в течение ночи в ротационном шейкере, и 5) образования практически сферических многоклеточных агрегатов в процессе созревания.

Согласно некоторым вариантам частично объединенную (склеенную) за счет сил адгезии и/или когезии клеточную пасту переносят из формовочного устройства (например, капиллярной пипетки) во второе формовочное устройство (например, форму), в которой клетки могут снабжаться питательными веществами и/или кислородом в то время, пока клетки остаются во втором формовочном устройстве в течение дополнительного периода созревания. Примером подходящего формовочного устройства, в котором к клеткам могут поступать питательные вещества и кислород, является форма для получения совокупности многоклеточных агрегатов (например, практически идентичных многоклеточных агрегатов). В другом примере такая форма включает биосовместимый субстрат, приготовленный из материала, который устойчив к миграции и прорастанию клеток в субстрат и устойчив к адгезии клеток к субстрату. Согласно различным вариантам субстрат, соответственно, сделан из тефлона® (PTFE, политетрафторэтилена), нержавеющей стали, агарозы, полиэтиленгликоля, стекла, пластика или гелеобразных материалов (например, гидрогеля) и аналогичных материалов. Согласно некоторым вариантам форма также имеет такую конфигурацию, которая содействует поступлению тканевых культуральных сред к клеточной пасте (например, посредством напыления сверху культуральных сред на поверхность формы).

Так, согласно вариантам, в которых применяется второе формовочное устройство, клеточную пасту, частично слипшуюся (объединенную) за счет сил адгезии и/или когезии, переносят из первого формовочного устройства (например, капиллярной пипетки) во второе формовочное устройство (например, форму). Согласно другим вариантам клеточную пасту, частично слипшуюся (объединенную) за счет сил адгезии и/или когезии, переносят посредством первого формовочного устройства (например, капиллярной пипетки) в пазы формы. Согласно другим вариантам после периода созревания, в течение которого форма инкубируется вместе с находящейся в ней клеточной пастой в контролируемых условиях, что содействует дальнейшему слипанию клеток друг с другом за счет сил адгезии и/или когезии с образованием многоклеточных агрегатов, когезионные взаимодействия клеток достаточно сильны, что позволяет отбирать полученный многоклеточный агрегат с помощью устройства (например, капиллярной пипетки). Согласно другим вариантам капиллярная пипетка соответственно является частью печатающей головки биопринтера или аналогичного устройства, функционирующего таким образом, чтобы автоматически помещать многоклеточный агрегат в трехмерную конструкцию.

Согласно некоторым вариантам форма поперечного сечения и размер многоклеточных агрегатов по существу (практически) соответствуют форме поперечного сечения и размеру первого формовочного устройства, необязательно, второго формовочного устройства, применяемого для приготовления многоклеточных агрегатов, и специалист в данной области техники сможет выбрать подходящие формовочные устройства, имеющие соответствующую форму поперечного сечения, соответствующие площадь поперечного сечения, диаметр и длину, подходящие для создания многоклеточных агрегатов, имеющих форму поперечного сечения, площадь поперечного сечения, диаметр и длину, обсуждавшиеся выше.

Согласно некоторым вариантам биочернила готовят таким образом, чтобы они были пригодны для биопечати с применением автоматической компьютерной трехмерной системы прототипирования (моделирования), способной формовать и распылять (диспенсировать) биочернила в одну стадию. Согласно некоторым вариантам приготовление биочернил для одностадийного формования и распыления включает добавление композиций для экструзии.

Печать биочернилами в виде некоей формы

Согласно некоторым вариантам методы включают процесс биопечати биочернил в виде некоей формы. Биопечать представляет собой метод, описанный в настоящей заявке. Приемлемыми являются многие трехмерные формы, которые можно получать методом биопечати (биопринтинга). Согласно некоторым вариантам приемлемые формы включают, но без ограничения, пласты (листы, лоскуты), трубки и мешки, описанные ниже. Согласно некоторым вариантам форма печатается с размерами, подходящими для замены, частичной замены или наращивания нативной ткани или органа биоинженерной имплантируемой тканью или органом. Согласно другим вариантам форма печатается с размерами, подходящими для замены, частичной замены или наращивания конкретных ткани или органа у конкретного субъекта.

Согласно некоторым вариантам биочернила содержат многоклеточные агрегаты различных очертаний (форм) и размеров. Согласно некоторым вариантам многоклеточные агрегаты являются вытянутыми с любой из ряда подходящих форм поперечного сечения, включая, например, но без ограничения, круглую, овальную, квадратную, многоугольную и неправильную форму. Согласно другим вариантам многоклеточные агрегаты являются вытянутыми и имеют форму цилиндра. Согласно некоторым вариантам удлиненные многоклеточные агрегаты имеют аналогичные (близкие) длину и/или диаметр. Согласно другим вариантам удлиненные многоклеточные агрегаты имеют различные длину и/или диаметр. Согласно некоторым вариантам многоклеточные агрегаты являются по существу (практически) сферическими. Согласно некоторым вариантам биоинженерные ткани включают практически сферические многоклеточные агрегаты, которые являются практически близкими по размеру. Согласно другим вариантам биоинженерные ткани включают практически сферические многоклеточные агрегаты разных размеров. Согласно некоторым вариантам биоинженерные ткани разных форм и размеров формуют, определенным образом располагая многоклеточные агрегаты различных форм и размеров.

Согласно некоторым вариантам связанные (объединенные) за счет сил когезии многоклеточные агрегаты помещают на подложку. Согласно различным вариантам подложка представляет собой любую подходящую биосовместимую поверхность. Согласно другим вариантам подходящие биосовместимые поверхности включают, например, но без ограничения, полимерный материал, пористые мембраны, пластик, стекло, металл, гидрогель и их комбинацию. Согласно некоторым вариантам подложку покрывают биосовместимым веществом, включая, например, но без ограничения, гидрогель, белок, химическое вещество, пептид, антитела, факторы роста или их комбинации. Согласно одному варианту покрытием подложки является NovoGel™.

Согласно некоторым вариантам по завершении распределения когезионных многоклеточных агрегатов тканевую культуральную среду сверху заливают на конструкцию. Согласно другим вариантам тканевая культуральная среда занимает пространство между многоклеточными тельцами, закрепляя клетки в многоклеточных тельцах.

Согласно некоторым вариантам напечатанная методом биопринтинга форма представляет собой лоскут (лист, пласт). Согласно другим вариантам лоскут (лист, пласт) имеет практически планарную (плоскую) форму различной конфигурации, включая, например, но без ограничения, плоский квадрат, треугольник, многоугольник, круг, овал или фигуру неправильной формы. Соответствующие размеры напечатанного лоскута могут меняться в широком диапазоне. Согласно некоторым вариантам изобретения размеры выбирают таким образом, чтобы способствовать применению для конкретной цели, включая, например, но без ограничения, залечивание ран, репарацию тканей, наращивание тканей, замену тканей и создание биоинженерного органа. Согласно другим вариантам изобретения размеры выбирают таким образом, чтобы способствовать конкретному применению у конкретного субъекта. Например, согласно одному варианту лист (лоскут) напечатан для того, чтобы залечить конкретную рану или исправить дефект в мышечной стенке органа или ткани конкретного человека. Согласно некоторым вариантам изобретения толщина напечатанного лоскута (листа) в момент напечатания равна по меньшей мере 150 мкм. Согласно некоторым вариантам изобретения толщина напечатанного лоскута (листа) равна около 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 мкм или более, включая инкременты. Согласно другим вариантам изобретения напечатанный лист (лоскут) характеризуется тем, что его длина, ширина, или и то, и другое, составляют около 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 мкм или более, включая инкременты. Согласно другим вариантам изобретения напечатанный лист (лоскут) характеризуется тем, что его длина, ширина, или и то, и другое, составляют около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 мм или более, включая инкременты. Согласно другим различным вариантам изобретения напечатанный лист (лоскут) характеризуется тем, что его длина, ширина, или и то, и другое, составляют около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 см, включая инкременты. См., например, Пример 6 (и Фиг. 1), Пример 7 (и Фиг. 2), Пример 9 (и Фиг. 3a и 3b), Пример 10 (и Фиг. 4а и 4b).

Согласно некоторым вариантам напечатанная форма представляет собой трубку. Согласно другим вариантам изобретения напечатанная трубка представляет собой по существу свернутый лист или полый цилиндр. Согласно некоторым вариантам напечатанную трубку применяют для создания (конструирования) биоинженерного органа. Согласно другим вариантам изобретения напечатанную трубку применяют для конструирования биоинженерных органов: мочеточника, канала мочевого пузыря, фаллопиевой трубы, матки, трахеи, бронха, лимфатического сосуда, уретры, кишечника, ободочной кишки, пищевода или их части. Согласно другим вариантам изобретения напечатанную трубку применяют для того, чтобы увеличить длину нативной тубулярной (трубчатой, полой, цилиндрической) ткани, такой как пищевод, кишечник, ободочная кишка или уретра. Согласно другим вариантам напечатанную трубку применяют для создания нового соединения, которое служит в качестве канала или в качестве шунта-байпаса, например, в качестве канала мочевого пузыря, или, например, в качестве шунта-байпаса в верхней части двенадцатиперстной кишки). Согласно другим вариантам изобретения трубки по настоящему описанию не являются кровеносными сосудами. Размеры напечатанной трубки находятся в широком интервале. Согласно некоторым вариантам изобретения размеры выбирают таким образом, чтобы способствовать применению для конкретной цели, включая, например, но без ограничения, залечивание ран, репарацию тканей, наращивание тканей, замену тканей, создание биоинженерного органа и замену органа. Согласно другим вариантам изобретения размеры выбирают таким образом, чтобы способствовать конкретному применению у конкретного субъекта. Например, согласно одному варианту трубка напечатана для того, чтобы исправить или заменить конкретный сегмент лимфатического сосуда у конкретного человека. Согласно некоторым вариантам напечатанная трубка характеризуется тем, что толщина стенки трубки в момент биопечати составляет по меньшей мере 150 мкм. Согласно различным вариантам изобретения толщина стенки напечатанной трубки равна около 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 мкм или более, включая инкременты. Согласно некоторым вариантам изобретения напечатанная трубка характеризуется тем, что ее внутренний диаметр в момент биопечати составляет по меньшей мере около 250 мкм. Согласно различным вариантам изобретения внутренний диаметр напечатанной трубки составляет около 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 мкм или более, включая инкременты. Согласно различным другим вариантам изобретения внутренний диаметр напечатанной трубки составляет около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 мм или более, включая инкременты. Согласно некоторым другим вариантам длина напечатанной трубки равна около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 мм или более, включая инкременты. Согласно другим вариантам длина напечатанной трубки равна около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 см или более, включая инкременты. См., например, Пример 13 (и Фиг. 6).

Согласно некоторым вариантам форма представляет собой мешок. Согласно другим вариантам мешок представляет собой по существу свернутый лист или полый цилиндр, у которого закрыт по меньшей мере один конец (например, мешок, чашу, полость, баллон и т.д.). Согласно некоторым вариантам напечатанный мешок применяется для увеличения, наращивания или замены содержащего мышцу органа или ткани. Согласно другим вариантам изобретения напечатанный мешок применяется для создания целого или части биоинженерного желудка, мочевого пузыря, матки или желчного пузыря. Подходящие размеры полученного методом биопечати мешка меняются в широком интервале. Согласно некоторым вариантам размеры выбирают таким образом, чтобы способствовать применению для конкретной цели, включая, например, но без ограничения, залечивание ран, репарацию тканей, наращивание тканей, замену тканей, создание биоинженерного органа и замену органа. Согласно другим вариантам изобретения размеры выбирают таким образом, чтобы способствовать конкретному применению у конкретного субъекта. Например, согласно одному варианту мешок создают методом биопечати для увеличения или замены мочевого пузыря у конкретного человека. Согласно некоторым вариантам напечатанный мешок характеризуется тем, что толщина его стенки в момент печати равна по меньшей мере 150 мкм. Согласно различным вариантам толщина напечатанного мешка равна около 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 мкм или более, включая инкременты.

Слияние (сборка) биочернил

Согласно некоторым вариантам способы включают слияние биочернил в связанную силами когезии (когезионную) клеточную структуру. Согласно другим вариантам слиянию биочернил, содержащих многоклеточные агрегаты, способствует инкубация. Согласно другим вариантам инкубация делает возможной адгезию и/или когезию с образованием ткани или органа. Согласно некоторым вариантам многоклеточные агрегаты объединяются (слипаются) с образованием ткани в клеточной культуре (например, в чашке Петри, флаконе для клеточных культур, биореакторе). Согласно другим вариантам многоклеточные агрегаты слипаются (объединяются) с образованием ткани в условиях среды, способствующих росту типов клеток, входящих в состав многоклеточных агрегатов. Согласно одному варианту многоклеточные агрегаты инкубируют примерно при 37°C в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO₂ с содержание около 1%-21% O₂, в присутствии культуральной среды, содержащей факторы и/или ионы, способствующие адгезионным и/или когезионным взаимодействиям.

Согласно различным вариантам продолжительность инкубации может быть различной. Согласно другим вариантам продолжительность инкубации может составлять примерно 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180 или более минут, включая инкременты. Согласно другим вариантам продолжительность инкубации может составлять примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 36, 48 или более часов, включая инкременты. Согласно другим вариантам продолжительность инкубации может составлять примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более дней, включая инкременты. На время, необходимое для сцепления (объединения за счет сил когезии) многоклеточных агрегатов с образованием ткани, влияет несколько факторов, включая, например, но без ограничения, типы клеток, соотношение клеток разных типов, условия культивирования и присутствие добавок, таких как факторы роста.

Внесение (нанесение) клеток в или на напечатанную форму

Согласно некоторым вариантам методы далее включают в(на)несение клеток в или на напечатанную форму. Ряд методов дополнительно включают в(на)несение клеток в или на напечатанную форму. Согласно некоторым вариантам клетки в(на)носят методами биопечати, разбрызгивания (распыления), рисования, нанесения методом погружения, пересадки, засевания, впрыскивания (шприцевания), наложения слоями или биопечати в или на заливочную форму (для биопечати). Например, согласно некоторым вариантам нанесение клеток включает нанесение на одну или более поверхностей мышечной конструкции покрытия в виде суспензии, лоскута, монослоя или слитых агрегатов клеток. Согласно некоторым вариантам покрытие наносят на 1, 2, 3, 4 или более поверхностей мышечной конструкции.

Согласно некоторым вариантам нанесение клеток включает биопечать дополнительного слоя слитых многоклеточных агрегатов. Согласно другим вариантам нанесение слоя клеток включает биопечать, разбрызгивание (распыление) или впрыскивание струей раствора, суспензии или жидкого концентрата клеток. Согласно другим вариантам соответствующая клеточная суспензия содержит примерно от 1×10⁴ примерно до 1×10⁶ клеток/мкл. Согласно другим вариантам соответствующая клеточная суспензия содержит примерно от 1×10⁵ примерно до 1.5×10⁵ клеток/мкл. Согласно другим вариантам нанесение клеток включает распыление суспензии клеток непосредственно на одной или более поверхности тканевой конструкции (тканевого конструкта) в виде пространственно-распределенных капелек. Еще в одних вариантах изобретения нанесение клеток включает распыление (распределение) суспензии клеток непосредственно на одной или более поверхностей тканевой конструкции (тканевого конструкта) в виде спрея. Согласно некоторым вариантам слои клеток наносят в любое подходящее время в процессе конструирования (создания конструкта). Согласно некоторым вариантам один или более слоев наносят на одну или более внешних поверхностей гладкомышечной конструкции сразу же после процесса биопечати (например, в пределах 10 мин.). Согласно другим вариантам один или более слоев наносят после процесса биопечати (например, уже позже, чем через 10 мин.). Согласно еще одним вариантам один или более слоев наносят в процессе созревания конструкции.

Клетка любого типа пригодна для нанесения методом биопечати в виде сцепленных за счет сил когезии многоклеточных агрегатов. Более того, клетка любого типа применима для нанесения методом осаждения в виде капелек суспензии, раствора или концентрата, или методом распыления (пульверизацией) в виде суспензии, раствора или концентрата. Согласно некоторым вариантам фибробласты наносят на одну или более внешних поверхностей гладкомышечной конструкции (конструкта). Согласно другим вариантам эндотелиальные клетки наносят на одну или более внешних поверхностей гладкомышечного конструкта. Согласно другим вариантам слой эндотелиальных клеток наносят на одну или более внешних поверхностей гладкомышечного конструкта, а слой фибробластов наносят на одну или более других поверхностей гладкомышечного конструкта.

В Примере 7 представлены гладкомышечные конструкции (конструкты), напечатанные с применением сцепленных за счет когезионных сил агрегатов гладкомышечных клеток, на которые далее нанесены клетки второго типа в виде концентрата эндотелиальных клеток (например, 1-1.5×10⁵ клеток/мкл). Методами, применяемыми в Примере 7, получают в результате гладкомышечную конструкцию, состоящую из SMC. См., например, Фиг. 2.

В Примере 8 представлены гладкомышечные конструкции (конструкты), напечатанные с применением сцепленных за счет когезионных сил агрегатов гладкомышечных клеток аорты человека. Затем клетки второго типа, состоящие из гладкомышечных клеток аорты человека, с применением биопринтера распределяли на верхней стороне напечатанного слоя гладкомышечных клеток в виде капелек размером 2.5 мкл.

Согласно некоторым вариантам методы далее включают стадию культивирования слоя клеток на подложке. Согласно таким вариантам нанесение клеток в некоторых случаях включает расположение одной или более поверхностей гладкомышечного конструкта в непосредственном контакте с уже существующим слоем клеток. Согласно другим вариантам конструкт печатается непосредственно на поверхности слоя культивируемых клеток или монослоя клеток. Подходящим является слой культивируемых клеток любого типа на биосовместимой подложке. Согласно некоторым вариантам многоклеточные агрегаты печатают поверх слоя эндотелиальных клеток. Согласно другому варианту многоклеточные агрегаты печатают поверх слоя фибробластов. Согласно другим вариантам слой клеток, за счет сил адгезии или когезии, сцеплен (слипается) с многоклеточными агрегатами напечатанного конструкта.

На Фигуре 9 представлено создание тех же самых конструктов, что и в Примере 8; однако, конструкты были напечатаны на подложке, на которой предварительно был выращен (культивирован) сплошной монослой человеческих дермальных фибробластов. Методами, применяемыми в Примере 9, получают в результате гладкомышечный конструкт, состоящий из SMC с дополнительными слоями, содержащими как слой эндотелиальных клеток, так и слой фибробластов. См., например, Фиг. 3a и 3b.

Дополнительные стадии повышения жизнеспособности биоинженерной ткани

Согласно некоторым вариантам метод дополнительно включает стадии повышения жизнеспособности биоинженерных ткани или органа после биопечати и до имплантации. Согласно другим вариантам эти стадии включают обеспечение непосредственного контакта между тканью или органом и питательной средой с помощью временной или полупостоянной решетчатой структуры материала для локализации, заключения. Согласно некоторым вариантам ткань заключают в пористый материал или в материал с зазорами. Непосредственный доступ по меньшей мере некоторой части клеток биоинженерной ткани к питательным веществам повышает жизнеспособность биоинженерной ткани.

Согласно другим вариантам дополнительные и необязательные стадии повышения жизнеспособности биоинженерной ткани включают: 1) необязательно, расположение базового слоя материала для локализации, ограничения, заключения прежде, чем разместить сцепленные (за счет когезии) многоклеточные агрегаты; 2) необязательно, расположение внешней границы (периметра) материала для локализации (заключения); 3) печатание (методом биопечати) клеток ткани в пределах заданной конфигурации; и 4) расположение удлиненных телец (например, цилиндров, лент и т.д.) материала для локализации, перекрывающего образующуюся ткань, с паттерном в виде структуры, которая вводит промежутки в материал для локализации, такой как решетчатая, ячеистая или сетчатая структура. См., например, Пример 12 и Фиг. 5.

Многие материалы для локализации применимы для использования в методах по настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам гидрогели являются примером материалов, обладающих одним или более предпочтительными свойствами, в том числе: они не прилипают, являются биосовместимыми, поддаются экструзии, их можно печатать методом биопечати, не являются клеточными, имеют достаточную прочность и нерастворимы в водной среде. Согласно некоторым вариантам подходящими гидрогелями являются натуральные полимеры. Согласно одному варианту материал для локализации, заключения состоит из NovoGel™. Согласно другим вариантам подходящие гидрогели включают гидрогели, полученные из поверхностно-активных полиолов, таких как Плюроник F-127, коллаген, гиалуронат, фибрин, альгинат, агароза, хитозан, их производные или комбинации. Согласно другим вариантам подходящие гидрогели представляют собой синтетические полимеры. Согласно другим вариантам подходящие гидрогели включают гидрогели, полученные из полимеров акриловой кислоты и ее производных, полиэтиленоксида (полиэтиленгликоля) и их сополимеров, поливинилового спирта, полифосфазена и их комбинаций. Согласно различным конкретным вариантам материал для заключения выбран из: гидрогеля, NovoGel™, агарозы, альгината, желатина, Matrigel™, гиалуронана, полоксамера, пептидного гидрогеля, поли(N-изопропил)акриламида, диакрилата полиэтиленгликоля (PEG-DA), гидроксиэтилметакрилата, полидиметилсилоксана, полиакриламида, полимолочной кислоты, (диоксида?) кремния, шелка или их комбинаций.

Согласно некоторым вариантам зазоры (интервалы, щели), перекрывающие паттерн, распределены равномерно или практически равномерно по всей поверхности ткани. Согласно другим вариантам интервалы распределены неравномерно, в результате этого клетки тканей имеют неравномерный доступ к питательным веществам. Согласно вариантам с неравномерными зазорами неодинаковый доступ к питательным веществам используется для того, чтобы влиять на одно или более свойств ткани. Например, в некоторых случаях желательно, чтобы клетки на одной поверхности напечатанной ткани пролиферировали быстрее, чем клетки на другой поверхности напечатанной ткани. Согласно некоторым вариантам экспозиция различных участков ткани с питательными веществами, необязательно, изменяется в разное время, влияя на рост ткани в направлении конечной величины.

Согласно некоторым вариантам материал для заключения удаляют в любое подходящее время, включая, но без ограничения, момент непосредственно после биопечати (например, не позже чем через 10 минут), после биопечати (например, позже, чем через 10 минут), до того, как клетки практически прилипнут одна к другой (сцепятся, объединятся одна с другой), после того, как клетки практически прилипнут одна к другой, до продуцирования клетками внеклеточного матрикса, после продуцирования клетками внеклеточного матрикса, непосредственно перед применением и т.п. Согласно различным вариантам материал для локализации, заключения удаляется любым приемлемым методом. Например, согласно некоторым вариантам материал для заключения отделяется, оттягивается, гидролизуется или растворяется.

Согласно некоторым вариантам методы дополнительно включают стадию, в которой биоинженерную ткань с одной или более сторон подвергают действию поперечной силы (сдвига).

Конкретные примеры вариантов изобретения

Согласно некоторым вариантам в настоящем изобретении раскрываются биоинженерные ткани и органы, включающие по меньшей мере один слой, содержащий мышечные клетки, причем биоинженерная ткань или орган состоит практически из клеточного материала и может имплантироваться позвоночному и не является кровеносным сосудом. Согласно некоторым материалам ткань или орган представляет собой мешок, лоскут (пласт, лист) или трубку, причем трубка не является кровеносным сосудом. Согласно некоторым вариантам слой мышцы был образован путем слияния напечатанных агрегатов клеток. Согласно другим вариантам слой мышцы практически не содержит никакого заранее сформированного скаффолда. Еще в одних вариантах изобретения слой мышцы не был создан с применением заранее сформированного скаффолда. Согласно некоторым вариантам ткань или орган состоит по существу из клеточного материала, который вырабатывает внеклеточный матрикс после процесса биопечати. Согласно некоторым вариантам слой мышцы представляет собой гладкую мышцу и толщина его в момент биопечати составляет 150 мкм. Согласно другим вариантам толщина слоя гладкой мышцы в момент биопечати составляет 250 мкм. Согласно другим вариантам толщина слоя гладкой мышцы в момент биопечати составляет 500 мкм. Согласно некоторым вариантам ткань или орган дополнительно содержат клетки, выбранные из группы, состоящей из: эндотелиальных клеток, нервных клеток, периваскулярных клеток (перицитов), фибробластов, тканеспецифических эпителиальных клеток, хондроцитов, клеток скелетной мышечной ткани, кардиомиоцитов, клеток костной ткани, клеток мягких тканей, мезотелиальных клеток, тканеспецифических стромальных клеток, стволовых клеток, клеток-предшественников и их комбинаций. Согласно некоторым вариантам клетки, отличные от гладкомышечных клеток, распределены по меньшей мере на одной поверхности слоя гладкой мышцы. Согласно другим вариантам клетки выбраны из группы, состоящей из: эндотелиальных клеток, нервных клеток, перицитов, фибробластов, тканеспецифических эпителиальных клеток, хондроцитов, клеток скелетной мышечной ткани, кардиомиоцитов, клеток костной ткани, клеток мягких тканей, мезотелиальных клеток, тканеспецифических стромальных клеток, стволовых клеток, клеток-предшественников и их комбинаций. Согласно некоторым вариантам изобретения клетки, отличные от гладкомышечных клеток, распределяли на гладкомышечном слое практически одновременно с биопечатью гладкомышечного слоя. Согласно некоторым вариантам клетки, отличные от гладкомышечных клеток, распределяли на гладкомышечном слое после биопечати гладкомышечного слоя. Согласно некоторым вариантам клетки, отличные от гладкомышечных клеток, распределяли на гладкомышечном слое практически одновременно с биопечатью гладкомышечного слоя. Согласно некоторым вариантам клетки, отличные от гладкомышечных клеток, распределяли на гладкомышечном слое во время созревания гладкомышечного слоя. Согласно некоторым вариантам клетки, отличные от гладкомышечных клеток, распределяли на гладкомышечном слое после созревания гладкомышечного слоя. Согласно некоторым вариантам клетки, отличные от гладкомышечных клеток, распределяли на гладкомышечном слое в течение 24 часов после печатания гладкомышечного слоя. Согласно некоторым вариантам клетки, отличные от гладкомышечных клеток, распределяли на гладкомышечном слое позже, чем через 24 часа после печатания гладкомышечного слоя. Согласно некоторым вариантам клетки, отличные от гладкомышечных клеток, распределяли на гладкомышечном слое в виде одного или более слоев клеток. Согласно некоторым вариантам клетки, отличные от гладкомышечных клеток, распределяли на гладкомышечном слое в виде слоя клеток толщиной менее примерно 100 мкм. Согласно другим вариантам клетки, отличные от гладкомышечных клеток, распределяли на гладкомышечном слое в виде слоя клеток толщиной более примерно 100 мкм и менее примерно 500 мкм. Согласно некоторым вариантам на гладкомышечном слое распределяли фибробластные клетки. Согласно некоторым вариантам на гладкомышечном слое распределяли эндотелиальные клетки. Согласно другим вариантам эндотелиальные клетки являются тканеспецифическими. Согласно некоторым вариантам гладкомышечный слой является практически пленарным (плоским). Согласно другим вариантам толщина слоя, образующего эту плоскость, составляет по меньшей мере 150 мкм. Согласно еще одним вариантам эта ткань представляет собой пласт (лист) или лоскут, содержащие гладкомышечные клетки, применимый для заживления ран или наращивания ткани. Согласно некоторым тканям слой гладкой мышцы является тубулярным (трубчатым). Согласно другим вариантам внутренний диаметр трубки в момент биопечати равен по меньшей мере 150 мкм. Согласно другим вариантам толщина стенки трубки в момент биопечати равна по меньшей мере 150 мкм. Согласно другим вариантам орган представляет собой мочеточник или участок мочеточника, канал мочевого пузыря или участок канала мочевого пузыря, мочевой пузырь или участок мочевого пузыря, фаллопиеву трубу или часть фаллопиевой трубы, матку или часть матки, трахею или часть трахеи, бронх или часть бронха, лимфатический сосуд или участок лимфатического сосуда, уретру или участок уретры, кишечник или часть кишечника, ободочную кишку или часть ободочной кишки, пищевод или часть пищевода. Согласно некоторым вариантам внутренний диаметр и внешний диаметр трубки по существу сходны с диаметрами соответствующей нативной ткани или органа. Согласно некоторым вариантам гладкомышечный слой представляет собой мешок или часть мешка. Согласно некоторым вариантам толщина стенки мешка в момент биопечати равна по меньшей мере 150 мкм. Согласно другим вариантам мешкообразный орган представляет собой желудок, мочевой пузырь, матку или желчный пузырь. Согласно некоторым вариантам внутренний и внешний размеры мешка по существу аналогичны размерам соответствующего нативного органа. Согласно некоторым вариантам напечатанный гладкомышечный слой имел такие размеры, которые позволяли заменять нативный орган на биоинженерный имплантируемый орган. Согласно некоторым вариантам напечатанный гладкомышечный слой имел такие размеры, которые позволяли частично заменять нативный орган на биоинженерный имплантируемый орган. Согласно некоторым вариантам размеры напечатанного гладкомышечного слоя позволяли применять его для наращивания нативного органа посредством биоинженерного имплантируемого органа. Согласно некоторым вариантам гладкомышечные трубка, лоскут или мешок во время биопечати поддерживались с помощью материала для заключения из неадгезивного гидрогеля. Согласно другим вариантам материал для заключения из неадгезивного гидрогеля после процесса биопечати оставался ассоциированным с гладкомышечными трубкой, лоскутом или мешком. Согласно еще одним вариантам неадгезивный гидрогель для заключения отделялся от гладкомышечной трубки, лоскута или мешка в какой-то момент после процесса биопечати и перед имплантацией in vivo. Согласно другим вариантам неадгезивный гидрогель заключал напечатанные клетки до приемлемых размеров. Согласно еще одним вариантам материалу для заключения из неадгезионного (неадгезивного) гидрогеля придавали такую форму, чтобы по меньшей мере некоторая часть напечатанных клеток могла контактировать с питательной средой. Согласно некоторым вариантам клетки представляют собой взрослые дифференцированные клетки. Согласно некоторым вариантам клетки представляют собой взрослые недифференцированные клетки. Согласно некоторым вариантам гладкомышечные клетки являются тканеспецифическими клетками. Согласно другим вариантам гладкомышечные клетки представляют собой гладкомышечные клетки аорты человека или гладкомышечные клетки пупочной вены человека. Согласно некоторым вариантам гладкомышечные клетки человека выделены из липоаспирата. Согласно некоторым вариантам ткань или орган, помимо гладкомышечных клеток, содержат клетки других типов, полученные из липоаспирата человека. Согласно некоторым вариантам клетки получены от конкретного позвоночного. Согласно некоторым вариантам клетки выбраны таким образом, чтобы имитировать конкретное болезненное состояние. Согласно некоторым вариантам ткань или орган выбран из группы, состоящей из: уретры, канала мочевого пузыря, мочеточника, мочевого пузыря, фаллопиевой трубы, матки, трахеи, бронха, лимфатического сосуда, пищевода, желудка, желчного пузыря, тонкой кишки, толстой кишки и ободочной кишки.

Согласно некоторым вариантам в настоящем изобретении раскрывается имплантация биоинженерных тканей и/или органов позвоночному, причем ткани и органы содержат по меньшей мере один слой гладкой мышцы, биоинженерная ткань или орган состоит практически (по существу) из клеточного материала, и биоинженерная ткань или орган не является кровеносным сосудом.

Согласно некоторым вариантам в настоящем изобретении предусматриваются способы создания ((био)фабрикации) имплантируемых ткани или органа, содержащих гладкомышечную ткань, причем этот способ включает: создание биочернил, содержащих гладкомышечные клетки; биопечать (биопринтинг) биочернил в форму; и слияние биочернил в когезионную (когезивную) клеточную структуру, причем ткань или орган не является кровеносным сосудом. Согласно некоторым вариантам имплантируемые ткань или орган практически не содержат никакого предварительно сформированного скаффолда. Согласно некоторым вариантам гладкомышечные клетки выделяют из нативных гладкомышечных тканей млекопитающего. Согласно некоторым вариантам гладкомышечные клетки получают в процессе дифференцировки клеток-предшественников. Согласно некоторым вариантам гладкомышечные клетки получают из образца ткани. Согласно другим вариантам образец ткани представляет собой липоаспират. Согласно некоторым вариантам форма созревает за период примерно от 2 часов примерно до 10 дней. Согласно другим вариантам созревание происходит за период до 4 недель. Согласно некоторым вариантам форма представляет собой лоскут (пласт). Согласно другим вариантам форма представляет собой мешок. Согласно еще одним вариантам форма представляет собой трубку, внутренний диаметр которой в момент биопринтинга составляет около 0.15 мм или более, при этом трубка не является кровеносным сосудом. Согласно некоторым вариантам биочернила дополнительно содержат клетки, выбранные из группы, состоящей из: эндотелиальных клеток, нервных клеток, перицитов, фибробластов, тканеспецифических эпителиальных клеток, не являющихся сосудистыми гладкомышечных клеток, хондроцитов, клеток скелетной мышечной ткани, кардиомиоцитов, клеток костной ткани, клеток мягких тканей, мезотелиальных клеток, тканеспецифических стромальных клеток, стволовых клеток, клеток-предшественников и их комбинаций. Согласно некоторым вариантам способ дополнительно включает стадию биопечати, разбрызгивания (распыления), рисования, нанесения, нанесения методом погружения, пересадки, засевания, впрыскивания или наложения слоями клеток, отличных от мышечных клеток, в или на заливочную форму (для биопечати). Согласно некоторым вариантам изобретения способ дополнительно включает стадию биопечати, разбрызгивания (распыления), рисования, нанесения, нанесения методом погружения, пересадки, засевания, впрыскивания (шприцевания) или наложения слоями клеток в или на форму для биопечати. Согласно некоторым вариантам изобретения способ дополнительно включает стадию биопечати, разбрызгивания (распыления), рисования, нанесения, нанесения методом погружения, пересадки, впрыскивания (шприцевания), засевания, или наложения слоями клеток в или на когезивную клеточную структуру. Согласно некоторым вариантам способ дополнительно включает стадию регулирования биомеханических или биохимических свойств напечатанной формы, чтобы она была готова (созрела) для целевого применения.

Согласно некоторым вариантам настоящее изобретение предусматривает биоинженерные ткани, применимые для фабрикации (создания) имплантируемого биоинженерного органа, при этом: указанная ткань содержит по меньшей мере один слой гладкой мышцы, указанный по меньшей мере один слой гладкой мышцы содержит слитые клеточные элементы в трехмерном формате, и ткань не является кровеносным сосудом. Согласно некоторым вариантам этот по меньшей мере один слой гладкой мышцы является напечатанным методом биопечати. Согласно другим вариантам ткань практически не содержит никакого предварительно сформированного скаффолда. Согласно некоторым вариантам трехмерная структура была ограничена неадгезивным материалом или неадгезивной отливной формой. Согласно некоторым вариантам ткань дополнительно содержит клетки, выбранные из группы, состоящей из: эндотелиальных клеток, нервных клеток, перицитов, фибробластов, тканеспецифических эпителиальных клеток, не являющихся сосудистыми гладкомышечных клеток, хондроцитов, клеток скелетной мышечной ткани, кардиомиоцитов, клеток костной ткани, клеток мягких тканей, мезотелиальных клеток, тканеспецифических стромальных клеток, стволовых клеток, клеток-предшественников и их комбинаций. Согласно некоторым вариантам клетки, отличные от гладкомышечных клеток, были распределены (распылялись) по меньшей мере на одной поверхности слоя гладкой мышцы. Согласно другим вариантам клетки, отличные от гладкомышечных клеток, были напечатаны по меньшей мере на одной поверхности слоя гладкой мышцы. Согласно другим вариантам клетки, отличные от гладкомышечных клеток, выбраны из группы, состоящей из: эндотелиальных клеток, нервных клеток, перицитов, фибробластов, тканеспецифических эпителиальных клеток, не являющихся сосудистыми гладкомышечных клеток, хондроцитов, клеток скелетной мышечной ткани, кардиомиоцитов, клеток костной ткани, клеток мягких тканей, мезотелиальных клеток, тканеспецифических стромальных клеток, стволовых клеток, клеток-предшественников и их комбинаций. Согласно некоторым вариантам толщина клеточного слоя в момент биопечати составляла 150 мкм. Согласно некоторым вариантам ткань фиксирована на поверхности, совместимой с тканевой культурой. Согласно некоторым вариантам ткань применима для имплантации позвоночному. Согласно некоторым вариантам настоящее изобретение предусматривает биоинженерные системы тканевых культур, содержащих трехмерный клеточный элемент и временное или легкоудаляемое ограничение, где материал для локализации способствует контакту между клетками и питательной средой. Согласно некоторым вариантам биоинженерный трехмерный клеточный элемент был напечатанным. Согласно другим вариантам биоинженерный трехмерный клеточный элемент не содержит никакого предварительно сформированного скаффолда. Согласно некоторым вариантам материал для локализации (заключения) имеет по меньшей мере один из следующих признаков: практически не прилипает к клеткам; является биосовместимым; поддается экструзии; не является клеточным; имеет достаточную прочность, чтобы предоставить подложку для клеток; и нерастворим в водной среде. Согласно другим вариантам материал для локализации (заключения) не является ни пластиком, ни стеклом, ни керамическим материалом. Согласно некоторым вариантам материал для локализации (заключения) представляет собой гидрогель. Согласно некоторым вариантам материалом для локализации (заключения) является NovoGel™. Согласно другим вариантам материал для локализации (заключения) содержит один или более компонентов, выбранных из: агарозы, диакрилата полиэтиленгликоля (PEG-DA), гиалуронана, желатина, полоксамера, гидроксиэтилметакрилата, пептидного гидрогеля, Matrigel™, полидиметилсилоксана, (диоксида?) кремния, шелка, полиакриламида, полимолочной кислоты, поверхностно-активного полиола и альгината. Согласно некоторым вариантам по меньшей мере один из компонентов, выбранный из клеток и/или материала для локализации (заключения), экструдировали (выдавливали) из биопринтера. Согласно другим вариантам в материале для локализации (заключения) имеются щели (зазоры), причем питательная среда могла контактировать с клетками через эти зазоры. Согласно еще одним вариантам ширина зазоров составляла примерно от 100 мкм примерно до 30 мм. Согласно некоторым вариантам зазоры (щели) были распределены по всей структуре неравномерно, в силу чего клетки ткани неравномерно подвергались воздействию питательных веществ. Согласно некоторым вариантам, по меньшей мере около 10% площади поверхности ткани посредством щелей контактировало с питательной средой. Согласно некоторым вариантам материал для локализации (заключения) накладывался на клетки в виде по меньшей мере одного удлиненного элемента. Согласно другим вариантам толщина поперечного сечения удлиненного элемента из материала для локализации составляла примерно от 100 мкм примерно до 1 мм. Согласно некоторым вариантам между удлиненными элементами материала для локализации имелись щели (зазоры). Согласно некоторым вариантам зазоры между удлиненными элементами оставались во время выдавливания (экструзии) материала для локализации (заключения) из биопринтера. Согласно другим вариантам по меньшей мере некоторую часть материала для локализации (заключения) удаляли из системы для создания зазоров. Согласно некоторым вариантам удлиненные элементы материала для локализации были практически параллельны и щели (зазоры) были удлиненными. Согласно некоторым вариантам удлиненные элементы материала для локализации (заключения) располагали в виде решетчатой структуры. Согласно некоторым вариантам удлиненные элементы материала для локализации (заключения) фиксируют структуру к поддерживающей поверхности. Согласно некоторым вариантам система была применима для переноса (транспортировки). Согласно некоторым вариантам напечатанные клетки представляют собой по меньшей мере одни из клеток, выбранных из гладкомышечных клеток, эндотелиальных клеток, фибробластов и эпителиальных клеток. Согласно некоторым вариантам питательная среда содержала по меньшей мере один компонент из: кислорода (O₂), источника углерода, источника азота, факторов роста, солей, минералов, витаминов, сыворотки, антибиотиков, химических соединений, белков, нуклеиновых кислот, фармацевтических соединений и антител.

Согласно некоторым вариантам настоящее изобретение предусматривает биоинженерные живые ткани, содержащие трехмерный клеточный (содержащий клетки) элемент, удерживаемый на месте с помощью гидрогеля, причем гидрогель распределяли, распыляли на указанном содержащем клетки элементе в виде цилиндров или лент с зазорами между цилиндрами или лентами, через которые к клеткам поступают питательные вещества, и гидрогель легко удаляется из ткани.

Согласно некоторым вариантам настоящее изобретение предусматривает способы повышения жизнеспособности биоинженерной ткани, включающие обеспечение непосредственного контакта между тканью и питательной средой за счет временной или полупостоянной решетки, причем ткань не содержит никакого предварительно сформированного скаффолда. Согласно некоторым вариантам стадия обеспечения непосредственного контакта между тканью и питательной средой через временную или полупостоянную решетку включает заключение указанной ткани в пористый или содержащий щели (зазоры, разрывы) материал. Согласно другим вариантам ширина пор или щелей составляла примерно от 100 мкм примерно до 30 ми. Согласно другим вариантам пористый или содержащий щели (зазоры) материал представлял собой гидрогель. Согласно еще одним вариантам пористый или содержащий щели (зазоры) материал представлял собой агарозу. Согласно некоторым вариантам жизнеспособность биоинженерной ткани повышается ex vivo. Согласно некоторым вариантам жизнеспособность по меньшей мере части клеток, содержащихся в биоинженерной ткани, увеличивается. Согласно другим вариантам жизнеспособность клеток продлевается на 1 день или более. Согласно некоторым вариантам по меньшей мере одно питательное вещество выбрано из группы, состоящей из: источника углерода, источника азота, факторов роста, солей, минералов, витаминов, сыворотки, антибиотиков, белков, нуклеиновых кислот, фармацевтических соединений и антител. Согласно некоторым вариантам по меньшей мере одним питательным веществом является кислород (O₂). Согласно другим вариантам пористое или содержащее щели (зазоры) ограничение (заключение) из гидрогеля конструируют таким образом, чтобы обеспечить напечатанным клеткам неравномерный доступ к питательным веществам на одной или более поверхностей.

Согласно некоторым вариантам в настоящем изобретении предусматриваются способы приготовления систем тканевых культур, включающие стадии: создание трехмерного содержащего клетки (клеточного) элемента на биосовместимом субстрате; и распределение (распыление) материала для локализации (заключения), покрывающего трехмерный клеточный элемент, причем распыленный (наложенный, покрывающий) материал для локализации (заключения) позволяет по меньшей мере части клеток контактировать с питательной средой.

Согласно некоторым вариантам в настоящем изобретении предусматриваются способы приготовления систем тканевых культур, включающие стадии: распределения (распыления) материала для локализации (заключения) на поверхности по периметру (вдоль внешней границы); распределения (распыления) клеток внутри периметра; и распределения (распыления) материала для локализации (заключения), покрывающего клетки, причем распыленный (покрывающий) материал для локализации (заключения) позволяет по меньшей мере части клеток контактировать с питательной средой. Согласно некоторым вариантам распределение (распыление) материала для локализации (заключения) выполняется методом биопечати. Согласно некоторым вариантам способ включает или дополнительно включает культивирование системы в подходящей среде для созревания напечатанной клеточной конструкции (конструкта).

ПРИМЕРЫ

Нижеприведенные конкретные примеры следует рассматривать лишь как иллюстративные, но никоим образом не как ограничивающие изобретение. Не уточняя, полагают, что специалист в данной области техники на основе настоящего описания может применять настоящее изобретение в наиболее полном объеме.

Пример 1 - Культура клеток (клеточная культура)

Гладкомышечные клетки

Первичную культуру гладкомышечных клеток аорты человека (HASMC; GIBCO/Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) сохраняли и размножали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла с низким содержанием глюкозы (DMEM; Invitrogen Corp., Carlsbad, СА), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 Ед/мл пенициллина, 0.1 мг/мл стрептомицина, 0.25 мкг/мл амфотерицина В, 0.01 М HEPES (все от Invitrogen Corp., Carlsbad, СА), 50 мг/л пролина, 50 мг/л глицина, 20 мг/л аланина, 50 мг/л аскорбиновой кислоты и 3 мкг/л CuSO₄ (все от Sigma, St. Louis, МО), при 37°C и 5% CO₂. Во всех исследованиях использовались культуры HASMC в виде сплошного монослоя между пассажем 4 и пассажем 8.

Эндотелиальные клетки

Первичную культуру эндотелиальных клеток аорты человека (НАЕС; GIBCO/Invitrogen Corp., Carlsbad, СА) сохраняли и размножали в питательной среде 199 (Invitrogen Corp., Carlsbad, СА), дополненной 10% FBS, 1 мкг/мл гидрокортизона, 10 нг/мл человеческого эпидермального фактора роста, 3 нг/мл основного фактора роста фибробластов, 10 мкг/мл гепарина, 100 Ед/мл пенициллина, 0.1 мг/мл стрептомицина и 0.25 мкг/мл амфотерицина В (все от Invitrogen Corp., Carlsbad, СА). Клетки выращивали в покрытых желатином (из свиной сыворотки; Sigma, St. Louis, МО) флаконах, обработанных тканевой культурой, при 37°C и 5% CO₂. Во всех исследованиях использовались культуры НАЕС в виде сплошного монослоя между пассажем 4 и пассажем 8.

Фибробласты

Первичную культуру дермальных фибробластов (HDF; GIBCO/Invitrogen Corp., Carlsbad, СА) сохраняли и размножали в питательной среде 106 (Invitrogen Corp., Carlsbad, СА), дополненной 2% FBS, 1 мкг/мл гидрокортизона, 10 нг/мл человеческого эпидермального фактора роста, 3 нг/мл основного фактора роста фибробластов, 10 мкг/мл гепарина, 100 Ед/мл пенициллина и 0.1 мг/мл стрептомицина (все от Invitrogen Corp., Carlsbad, С А), при 37°C и 5% CO₂. Во всех исследованиях использовались культуры HDF в виде сплошного монослоя между пассажем 4 и пассажем 8.

SMC-подобные клетки из SVF липоаспирата человека

SMC- подобные клетки получали из адгезивной фракции клеток, выделенных после расщепления липоаспиратов с использованием коллагеназы. При этом расщеплении образуется популяция клеток, известных как стромально-васкулярная фракция (SVF). Клетки SVF, необязательно, засевали на стандартный культуральный пластик для тканевых культур и далее отбирали адгезивные клетки, культивируя в соответствующих условиях. SMC-подобные клетки из SVF липоаспиратов жировой ткани хранили и размножали в модифицированной по методу Дульбекко среде Игла с высоким содержанием глюкозы (DMEM; Invitrogen Corp., Carlsbad, СА), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 Ед/мл пенициллина, 0.1 мг/мл стрептомицина, 0.25 мкг/мл амфотерицина В, 0.01 М HEPES (все от Invitrogen Corp., Carlsbad, СА), 50 мг/л пролина, 50 мг/л глицина, 20 мг/л аланина, 50 мг/л аскорбиновой кислоты и 3 мкг/л CuSO₄ (все от Sigma, St. Louis, МО), при 37°C и 5% CO₂. Во всех исследованиях применяли монослойные субкультуры SVF-SMC между пассажем 3 и пассажем 8.

ЕС из SVF липоаспирата человека

Эндотелиальные клетки из стромально-васкулярной фракции (SVF) сохраняли и размножали в питательной среде, применяемой обычно для выращивания первичных изолятов bona fide (заведомых, подлинных) эндотелиальных клеток (ЕС). Конкретно, SVF-EC хранили в питательной среде M199, дополненной 10% FBS, 1 мкг/мл гидрокортизона, 10 нг/мл человеческого эпидермального фактора роста, 3 нг/мл основного фактора роста фибробластов, 10 мкг/мл гепарина, 100 Ед/мл пенициллина и 0.1 мг/мл стрептомицина Клетки выращивали во флаконах, обработанных тканевой культурой, при 37°C и 5% CO₂. Во всех исследованиях использовались культуры SVF-EC в виде сплошного монослоя между пассажем 3 и пассажем 8.

Пример 2 - Растворы и формы для заливки из NovoGel™

Приготовление 2% и 4% (вес/об) раствора NovoGel™

1 г или 2 г (для 2% или 4% соответственно) NovoGel™ (Organovo, San Diego, СА) растворяли в 50 мл физиологического раствора, забуференного фосфатом Дульбекко (DPBS; Invitrogen Corp., Carlsbad, СА). Коротко говоря, DPBS и NovoGel™ нагревали при 85°C на плитке при постоянном перемешивании до полного растворения NovoGel™. Раствор NovoGel™ стерилизовали паром (в автоклаве) при 125°C в течение 25 минут. Раствор NovoGel™ остается в жидкой фазе до тех пор, пока температура поддерживается выше 65.5°C. Ниже этой температуры происходит фазовый переход, вязкость раствора NovoGel™ повышается и NovoGel™ образует твердый гель.

Приготовление формы для заливки из NovoGel™

Форму из NovoGel™ изготавливали для инкубации цилиндрических биочернил, используя тефлоновую форму, которая соответствовала чашке Петри диаметром 10 см. Коротко говоря, тефлоновую форму предварительно стерилизовали 70% раствором этанола и воздействию УФ излучения в течение 45 минут. Стерилизованную форму помещали поверх чашки Петри диаметром 10 см (VWR International LLC, West Chester, PA) и надежно закрепляли. Эту конструкцию (форма из тефлона^® + чашка Петри) удерживали вертикально и в пространство между тефлоновой формой и чашкой Петри заливали 45 мл предварительно нагретого стерильного 2% раствора NovoGel™. Затем эту конструкцию помещали горизонтально и выдерживали 1 час при комнатной температуре, обеспечивая полное гелеобразование NovoGel™. После гелеобразования тефлоновый штамп вынимали и форму из NovoGel™ дважды промывали с помощью DPBS. Затем в форму из NovoGel™ добавляли 17.5 мл HASMC культуральной среды для инкубации политипических цилиндрических биочернил.

Пример 3 - Изготовление (фабрикация) HASMC-HAEC политипических цилиндрических биочернил

Для приготовления политипических цилиндрических биочернил HASMC и НАЕС собирали по отдельности, а затем смешивали в заранее определенных соотношениях. Коротко говоря, культуральную среду удаляли из флаконов с монослойной культурой и клетки отмывали DPBS (1 мл/5 см² области выращивания). Клетки отделяли от поверхности культуральных флаконов инкубацией в присутствии трипсина (1 мл/15 см² области выращивания; Invitrogen Corp., Carlsbad, СА) в течение 10 минут.HASMC отделяли, используя 0.15% раствор трипсина, тогда как НАЕС отделяли, используя 0.1% раствор трипсина. После инкубации во флаконы добавляли соответствующую культуральную среду (2X объем по отношению к объему трипсина). Клеточную суспензию центрифугировали при 200g в течение 6 минут с последующим полным удалением супернатанта. Клеточный осадок ресуспендировали в соответствующей культуральной среде и считали с помощью гемоцитометра. Соответствующие объемы HASMC и НАЕС смешивали и получали суспензию политипических клеток, содержащую 15% НАЕС и остальные 85% HASMC (в % от общей популяции клеток). Суспензию политипических клеток центрифугировали при 200g в течение 5 минут с последующим полным удалением супернатанта. Осадок политипических клеток (политипический клеточный осадок) ресуспендировали в 6 мл HASMC культуральной среды и переносили в стеклянные виалы на 20 мл (VWR International LLC, West Chester, PA), а затем инкубировали на орбитальном шейкере при 150 об/мин в течение 60 минут при 37°C и 5% CO₂. Это способствовало агрегации клеток друг с другом и инициации адгезии клеток друг к другу. После инкубации клеточную суспензию переносили в центрифужную пробирку на 15 мл и центрифугировали при скорости 200g в течение 5 мин. После удаления супернатанта клеточный осадок ресуспендировали в 400 мкл HASMC культуральной среды и несколько раз отбирали содержимое пипеткой и прикапывали его снова (движением поршня вверх-вниз), чтобы гарантировать, что все кластеры разрушены. Клеточную суспензию переносили в микроцентрифужную пробирку на 0.5 мл (VWR International LLC, West Chester, PA), помещенную в центрифужную пробирку на 15 мл с последующим центрифугированием при 2000g в течение 4 минут с образованием компактного осадка с высокой плотностью. Супернатант отсасывали и клетки переносили в капиллярные трубки (OD (наружный диаметр) 1.5 мм, ID (внутренний диаметр) 0.5 мм, L (длина) 75 мм; Drummond Scientific Co., Broomall, PA) аспирацией таким образом, чтобы получить биочернила в виде цилиндров длиной 50 мм. Клеточную пасту внутри капилляров инкубировали в HASMC среде в течение 20 минут при 37°C и 5% CO₂. Затем биочернила цилиндрической формы выдавливали (экструдировали) из капиллярных трубок в канавки формы из NovoGel™ (см., например, Пример 2) (покрытые HASMC средой) с помощью плунжера, поставляемого с капиллярамив. Цилиндрические биочернила инкубировали в течение 24 часов при 37°C и 5% CO₂.

Пример 4 - Изготовление HASMC-HDF-HAEC политипических цилиндрических биочернил

Для приготовления политипических цилиндрических биочернил HASMC, HDF и НАЕС, собирали по отдельности, а затем смешивали в заранее определенных соотношениях (например, соотношение HASMC:HDF:HAEC равно 70:25:5). Коротко говоря культуральную среду удаляли из флаконов с монослойной культурой и клетки отмывали DPBS (1 мл/10 см² области выращивания). Клетки отделяли от поверхности культуральных флаконов инкубацией в присутствии трипсина (1 мл/15 см² области выращивания; Invitrogen Corp., Carlsbad, С А) в течение 10 минут. HASMC и HDF отделяли, используя 0.15% раствор трипсина, тогда как НАЕС отделяли, используя 0.1% раствор трипсина. После инкубации во флаконы добавляли соответствующую культуральную среду (2X объем по отношению к объему трипсина). Клеточную суспензию центрифугировали при 200g в течение 6 минут с последующим полным удалением супернатанта. Клеточный осадок ресуспендировали в соответствующей культуральной среде и считали с помощью гемоцитометра. Соответствующие объемы HASMC, HDF и НАЕС смешивали и получали суспензию политипических клеток. Суспензию политипических клеток центрифугировали при 200g в течение 5 минут с последующей аспирацией супернатанта. Осадок политипических клеток (политипический клеточный осадок) ресуспендировали в 6 мл HASMC культуральной среды и переносили в стеклянные виалы на 20 мл (VWR International LLC, West Chester, PA), а затем инкубировали на орбитальном шейкере при 150 об/мин в течение 60 минут при 37°C и 5% CO₂. Это способствовало агрегации клеток друг с другом и инициации клеточной адгезии. После инкубации клеточную суспензию переносили в центрифужную пробирку на 15 мл и центрифугировали при скорости 200g в течение 5 мин. После удаления супернатанта клеточный осадок ресуспендировали в 400 мкл HASMC культуральной среды и несколько раз отбирали содержимое пипеткой и прикапывали его снова (движением поршня вверх-вниз), чтобы гарантировать, что все кластеры разрушены. Клеточную суспензию переносили в микроцентрифужную пробирку на 0.5 мл (VWR International LLC, West Chester, PA), помещенную в центрифужную пробирку на 15 мл с последующим центрифугированием при 2000g в течение 4 минут с образованием компактного осадка с высокой плотностью. Супернатант отсасывали и клетки переносили в капиллярные трубки (OD 1.25 мм, ID 0.5 мм, L 75 mm; Drummond Scientific Co., Broomall, PA) аспирацией таким образом, чтобы получить биочернила в виде цилиндров длиной 50 мм. Клеточную пасту внутри капилляров инкубировали в HASMC среде в течение 20 минут при 37°C и 5% CO₂. Затем биочернила цилиндрической формы выдавливали из капиллярных трубок в канавки формы из NovoGel™ (покрытые HASMC средой) с помощью плунжера, поставляемого с капиллярами. Цилиндрические биочернила инкубировали в течение 24 часов при 37°C и 5% СО₂.

Пример 5 - Изготовление SVF-SMC-SVF-EC политипических цилиндрических биочернил

Для приготовления политипических цилиндрических биочернил SVF-SMC и SVF-EC собирали по отдельности, а затем смешивали в заранее определенных соотношениях. Коротко говоря, культуральную среду удаляли из флаконов с монослойной культурой и клетки отмывали DPBS (1 мл/5 см² области выращивания). Клетки отделяли от поверхности культуральных флаконов инкубацией в присутствии TrypLE (Invitrogen Corp., Carlsbad, С А) от 5 до 10 минут. После инкубации во флаконы добавляли соответствующую культуральную среду, чтобы погасить ферментативную активность. Клеточную суспензию центрифугировали при 200g в течение 6 минут с последующим полным удалением супернатанта. Клеточный осадок ресуспендировали в соответствующей культуральной среде и считали с помощью гемоцитометра. Соответствующие объемы SVF-SMC и SVF-ЕС смешивали, получали суспензию политипических клеток, содержащую 15% SVF-ЕС и остальные 85% SVF-SMC (в % от общей популяции клеток). Суспензию политипических клеток центрифугировали при 200g в течение 5 минут с последующим полным удалением супернатанта. Осадок политипических клеток (политипический клеточный осадок) ресуспендировали в 6 мл SVF-SMC культуральной среды и переносили в стеклянные виалы на 20 мл (VWR International LLC, West Chester, PA), а затем инкубировали на орбитальном шейкере при 150 об/мин в течение 60 минут при 37°C и 5% CO₂. Это способствовало агрегации клеток друг с другом и инициации клеточной адгезии. После инкубации клеточную суспензию переносили в центрифужную пробирку на 15 мл и центрифугировали при скорости 200g в течение 5 мин. После удаления супернатанта клеточный осадок ресуспендировали в 400 мкл SVF-SMC культуральной среды и несколько раз отбирали содержимое пипеткой и прикапывали его снова (движением поршня вверх-вниз), чтобы гарантировать, что все кластеры разрушены. Клеточную суспензию переносили в микроцентрифужную пробирку на 0.5 мл (VWR International LLC, West Chester, PA), помещенную в центрифужную пробирку на 15 мл с последующим центрифугированием при 2000g в течение 4 минут с образованием компактного осадка с высокой плотностью. Супернатант отсасывали и клетки переносили в капиллярные трубки (OD 1.25 мм, ID 0.266 мм, L 75 mm; Drummond Scientific Co., Broomall, PA) аспирацией таким образом, чтобы получить биочернила в виде цилиндров длиной 50 мм. Клеточную пасту внутри капилляров инкубировали в SVF-SMC среде в течение 20 минут при 37°C и 5% CO₂. Затем биочернила цилиндрической формы выдавливали из капиллярных трубок в канавки формы из NovoGel™ (покрытые SVF-SMC средой) с помощью плунжера, поставляемого с капиллярами. Цилиндрические биочернила инкубировали в течение 24 часов при 37°C и 5% CO₂.

Пример 6 - Биопечать сегментов стенок кровеносных сосудов, содержащих смесь сосудистых SMC и ЕС

Конструкции стенок кровеносных сосудов печатали с помощью биопринтера NovoGen ММХ Bioprinter™ (Organovo, Inc., San Diego, С А) в лунки 6-луночных культуральных планшетов, на которые предварительно наносили 1.5 мл 2% (вес/об.) NovoGel™. Биочернила в виде содержащих клеточные агрегаты цилиндров готовили из смеси человеческих сосудистых гладкомышечных клеток (SMC) и человеческих эндотелиальных клеток (ЕС) в соотношении SMC:EC 85:15 или 70:30. Цилиндры биочернил получали аспирацией клеточного осадка (SMC:EC) в стеклянную микрокапиллярную трубку с внутренним диаметром (ID) либо 500 мкм, либо 266 мкм. Цилиндры биочернил затем выдавливали в форму NovoGel™, покрытую соответствующей культуральной средой. Перед процессом биопечати цилиндрические биочернила выдерживали от 6 до 18 часов. Применяли цилиндры, содержащие смесь SMC и ЕС. В этих экспериментах ЕС в цилиндрах отсортировывались на периферию цилиндров, в результате получали конструкцию, которая покрыта ЕС и содержит обогащенную по SMC стенку конструкции. Результатом этого процесса является создание гладкомышечной конструкции, которая содержит стенку, состоящую из SMC, и покрытие из ЕС. Конструкции печатали в центре культуральной лунки в соответствии с протоколом биопечати, культуральную лунку заполняли соответствующей культуральной средой и конструкции возвращали в термостат для созревания и анализа. После биопечати конструкцию покрывали (заливали) соответствующим количеством культуральной среды (например, 4 мл на 1 лунку 6-луночного планшета). Итак, в настоящем примере описывается применение сосудистых SMC и ЕС для биопечати небольшой гладкомышечной конструкции в многолуночном культуральном планшете стандартного размера. Полученная гладкомышечная конструкция характеризуется наличием внешнего слоя или внешних слоев ЕС и внутренней стенки, состоящей главным образом или исключительно из SMC.

Пример 7 - Биопечать сегментов стенок кровеносных сосудов, содержащих человеческие сосудистые SMC с покрытием из ЕС

Конструкции стенок кровеносных сосудов печатали с помощью биопринтера NovoGen ММХ Bioprinter™ (Organovo, Inc., San Diego, СА) в лунки 6-луночных культуральных планшетов, на которые предварительно наносили 1.5 мл 2% (вес/об.) NovoGel™. Биочернила в виде содержащих клеточные агрегаты цилиндров получали аспирацией клеточного осадка в стеклянную микрокапиллярную трубку с внутренним диаметром (ID) либо 500 мкм, либо 266 мкм. Цилиндры биочернил затем выдавливали в форму NovoGel™, покрытую соответствующей культуральной средой. Перед процессом биопечати цилиндрические биочернила выдерживали от 6 до 18 часов. ЕС-концентрат (1-1.5×10⁵ клеток/лунка) печатали непосредственно сверху ранее напечатанной SMC структуру. Результатом этого процесса является создание гладкомышечной конструкции, которая содержит стенку, состоящую из SMC, и покрытие из ЕС. Конструкции печатали в центре культуральной лунки в соответствии с протоколами биопечати. После биопечати конструкцию покрывали (заливали) соответствующим количеством культуральной среды (например, 4 мл на 1 лунку 6-луночного планшета) и возвращали в термостат для созревания и анализа. Итак, в настоящем примере описывается применение сосудистых SMC и ЕС для биопечати небольшой гладкомышечной конструкции в многолуночном планшете стандартного размера для тканевых культур. Полученная гладкомышечная конструкция характеризуется наличием внешнего слоя ЕС и внутренней стенки, состоящей главным образом или исключительно из SMC.

Пример 8 - Биопечать сегментов стенок кровеносных сосудов, представляющих собой слоистую конструкцию из наложенных слоями HASMC и НАЕС, с применением защитной оболочки из NovoGel™

Сегменты, имитирующие стенки кровеносных сосудов, печатали на биопринтере NovoGen ММХ Bioprinter™ (Organovo, Inc., San Diego, СА) либо внутри лунок, покрытых NovoGel™, либо непосредственно на вкладыши Corning^® Transwell^® (R трансвел вкладыши из полиэфирной мембраны) в многолуночном планшете (например, в 6-луночных планшетах). Этот способ включал следующие три фазы:

Приготовление (фабрикация) HASMC цилиндров

Культуры гладкомышечных клеток аорты человека (HASMC) трипсинизировали, а затем в течение 60 минут встряхивали на ротационном шейкере. После встряхивания клетки собирали, центрифугировали и отсасывали (аспирация) в стеклянные микрокапилляры с внутренним диаметром (ID) 266 или 500 мкм. Под конец клетки экструдировали в покрытые средой планшеты NovoGel™ и инкубировали по меньшей мере в течение 6 часов.

Биопечать лоскутов HASMC с прослойкой из НАЕС

Перед тем, как печатать лоскуты (например, сегменты), культуры эндотелиальных клеток аорты человека (НАЕС) трипсинизировали, считали, а затем ресуспендировали в среде НАЕС с рабочей концентрацией 1×10⁶ клеток/10 мкл среды. Суспензию клеток НАЕС помещали в биопринтер, который применяется для послойной укладки напечатанных лоскутов. При печати на подложки из NovoGel™ внутри лунок многолуночного планшета печатали первый слой цилиндров из NovoGel™. Затем поверх него печатали форму (бокс, ячейку), используя стержни (цилиндры) из NovoGel™, таким образом, чтобы внутренние размеры были: длина 8 мм × 1.25 мм ширина. Зрелые HASMC цилиндры в конце периода инкубации, см. выше, снова отсасывали (аспирация) и загружали в биопринтер для печати внутри формы. Затем клетки НАЕС в виде суспензии засасывали в чистый микрокапилляр, используя биопринтер, и прибавляли (по каплям) поверх напечатанных цилиндров из HASMC 4 раза близ 4 углов напечатанного лоскута. Объем каждой капли составлял 2.5 мкл. Конструкцию инкубировали в течение 15-30 минут перед тем, как печатать третий слой. Наконец, поверх второго слоя печатали третий слой из цилиндров NovoGel™ для того, чтобы сверху создать структуру типа решетка/сетка. При печатании на вкладыши Transwell^® (R трансвел) внутри лунок планшета первый слой стержней из NovoGel™, описанный выше, исключали. Затем напечатанные конструкции "покрывали" соответствующей клеточной культуральной средой и инкубировали.

Созревание напечатанных конструкций

Напечатанные конструкции инкубировали в течение 1-7 дней для того, чтобы способствовать созреванию конструкции и дать достаточное время для того, чтобы клетки НАЕС образовали однородный тонкий монослой поверх лоскута из клеток HASMC. В некоторых экспериментах трехмерный гладкомышечный лоскут подвергали действию поперечной силы (деформация сдвига) (т.е. пульсирующего потока).

Пример 9 - Биопечать сегментов стенок кровеносных сосудов, представляющих собой слоистую конструкцию из наложенных слоями HASMC и НАЕС на монослой HDFa с применением защитной оболочки из NovoGeI™

Гладкомышечные конструкции печатали на биопринтере NovoGen ММХ Bioprinter™ (Organovo, Inc., San Diego, СА) непосредственно на вкладыши Corning^® Transwell^® (из полиэфирной мембраны) в многолуночном планшете (например, 6-луночных планшетах). Этот способ включал следующие четыре фазы:

Культивирование HDFa на вкладышах R трансвел (Transwell^®)

Дермальные фибробласты взрослого человека (HDFa) засевали на мембраны Transwell^® при плотности 20000 клеток/см² и культивировали минимум в течение 6 дней. Это способствовало адгезии, росту и получению сплошного монослоя на мембране R трансвел (Transwell^®).

Получение (фабрикация) HASMC цилиндров

Культуры гладкомышечных клеток аорты человека (HASMC) трипсинизировали и в течение 60 минут встряхивали на ротационном шейкере. После встряхивания клетки собирали, центрифугировали и отсасывали (аспирация) в стеклянные микрокапилляры с внутренним диаметром (ID) 266 или 500 мкм. Затем клетки экструдировали в покрытые средой планшеты NovoGel™ и инкубировали по меньшей мере в течение 6 часов.

Послойная биопечать лоскутов из слоев клеток HASMC и НАЕС

Непосредственно перед печатью лоскутов (например, сегментов) культуры эндотелиальных клеток аорты человека (НАЕС) трипсинизировали, считали, а затем ресуспендировали в среде НАЕС с рабочей концентрацией 1×10⁶ клеток/10 мкл среды. Суспензию клеток НАЕС помещали в биопринтер для послойной укладки напечатанных лоскутов. Культуральную среду в многолуночных планшетах, содержащую HDFa, выращенные на мембранах Transwell^®, полностью отсасывали (аспирация) и планшет переносили в биопринтер. Форму (бокс, ячейку) печатали, используя стержни (цилиндры) из NovoGel™, таким образом, чтобы заданный участок (пространство) длиной 8 мм × 1.25 мм шириной был расположен непосредственно поверх клеток HDFa на мембране. Зрелые HASMC цилиндры в конце инкубационного периода, см. выше, снова отсасывали (аспирация) в микрокапилляры и загружали в биопринтер для печати внутри формы. Затем клетки НАЕС в виде суспензии засасывали в чистую микрокапиллярную трубку с использованием биопринтера и прибавляли (по каплям) поверх напечатанных цилиндров из HASMC 4 раза близ 4 углов напечатанного лоскута. Объем каждой капли составлял 2.5 мкл. Конструкцию инкубировали в течение 15-30 минут перед тем, как печатать третий слой. Наконец, поверх второго слоя печатали слой из стержней NovoGel™ для того, чтобы сверху создать структуру типа решетка/сетка. Затем напечатанные конструкции "покрывали" соответствующей клеточной культуральной средой и инкубировали. Созревание напечатанных конструкций

Напечатанные конструкции инкубировали в течение 1-7 дней для того, чтобы способствовать созреванию конструкции и дать достаточное время для того, чтобы клетки НАЕС образовали однородный тонкий монослой поверх лоскута из клеток HASMC.

Пример 10 - Биопечать гладкомышечных конструкций, содержащих HASMC и НАЕС политипические биочернила

Гладкомышечные конструкции печатали на биопринтере NovoGen ММХ Bioprinter™ (Organovo, Inc., San Diego, СА) либо на основных плашках NovoGel™ (чашки Петри размером 100 мм), внутри лунок, покрытых NovoGel™, либо непосредственно на вкладыши Corning^® Transwell^® в многолуночном планшете (например, в 6-луночных планшетах). Этот способ включал следующие три фазы:

Приготовление политипических биочернил на основе HASMC-HAEC

Культуры гладкомышечных клеток аорты человека (HASMC) и эндотелиальных клеток аорты человека (НАЕС) трипсинизировали, считали и смешивали в соответствующих количествах для получения цилиндров, которые содержали HASMC:HAEC в соотношении либо 85:15, либо 70:30. Суспензию политипических клеток встряхивали в течение 60 минут на ротационном шейкере, собирали и центрифугировали. Клетки отсасывали в стеклянные микрокапилляры с внутренним диаметром (ID) 266 или 500 мкм, затем экструдировали в покрытые средой планшеты NovoGel™ и инкубировали по меньшей мере в течение 6 часов.

Биопечать лоскутов / трехмерные гладкомышечные пласты (лоскуты)

При печати на NovoGel™ подложки внутри лунок многолуночного планшете или на основные плашки NovoGel™ (чашка Петри размером 100 мм) печатали первый слой цилиндров NovoGel™. Затем поверх этих цилиндров печатали форму (бокс), используя стержни NovoGel™, таким образом, чтобы размеры внутреннего пространства были 8 мм длина × 1.25 мм ширина. Зрелые политипические цилиндрические биочернила после инкубационного периода, см. выше, повторно отсасывали в микрокапилляры и загружали в биопринтер для печати внутри бокса (формы). Наконец, поверх второго слоя печатали третий слой цилиндров NovoGel™, который либо покрывал слой клеток по всей длине, либо создавал наверху структуру типа решетка/ сетка. Если печатали на вкладыши R трансвел (Transwell^®) внутри лунок планшета, описанный ранее первый слой стержней NovoGel™ исключали. Напечатанные конструкции затем покрывали соответствующей культуральной средой и инкубировали, за это время соседние сегменты экструдированных биочернил сливались с образованием трехмерных лоскутов, содержащих клетки. Созревание напечатанных конструкций

Напечатанные конструкции, содержащие HASMC-HAEC политипические биочернила, инкубировали в течение 1-7 дней для того, чтобы способствовать созреванию конструкции и дать достаточное время для того, чтобы отправить ("отсортировать") клетки НАЕС на периферию конструкции, при этом образуется гладкомышечная конструкция со слоем, содержащим клетки второго типа (в данном примере эндотелиальные клетки). В некоторых экспериментах трехмерный гладкомышечный лоскут подвергали действию поперечной силы (деформация сдвига) (т.е. пульсирующего потока), чтобы способствовать сортировке НАЕС.

Пример 11 - Напечатанные сегменты стенок кровеносных сосудов, содержащие HASMC, НАЕС и HDFa политипические цилиндрические биочернила

Гладкомышечные конструкции печатали на биопринтере NovoGen ММХ Bioprinter™ (Organovo, Inc., San Diego, СА) либо на основных плашках NovoGel™ (чашки Петри размером 100 мм), либо непосредственно на вкладыши Corning^® Transwell^® (R трансвел вкладыши из полиэфирной мембраны) в многолуночном планшете (например, в 6-луночных планшетах). Этот способ включал следующие три фазы:

Приготовление политипических биочернил на основе HASMC-HDFa-HAEC

Культуры HASMC, НАЕС и HDFa трипсинизировали, считали и смешивали в соответствующих количествах, получая цилиндрические биочернила, содержащие HASMC:HDFa:НАЕС в соотношении 70:15:15. Политипическую суспензию клеток встряхивали в течение 60 минут на ротационном шейкере, собирали и центрифугировали. Клетки отсасывали в стеклянные микрокапилляры с внутренним диаметром (ID) 266 или 500 мкм, затем выдавливали (экструдировали) в покрытые средой планшеты NovoGel™ и инкубировали в течение минимум 6 часов.

Биопечать лоскутов / трехмерные гладкомышечные пласты (лоскуты)

При печати на NovoGel™ подложки внутри лунок многолуночного планшете или на основные плашки NovoGel™ (чашка Петри размером 100 мм) печатали первый слой цилиндров NovoGel™. Затем поверх этих цилиндров печатали форму (бокс), используя стержни NovoGel™, таким образом, чтобы размеры внутреннего пространства были 8 мм длина × 1.25 мм ширина. Зрелые политипические цилиндрические биочернила после инкубационного периода, см. выше, повторно отсасывали в микрокапилляры и загружали в биопринтер для печати внутри бокса (формы). Наконец, поверх второго слоя печатали третий слой цилиндров NovoGel™, который либо покрывал слой клеток по всей длине, либо создавал наверху структуру типа решетка/ сетка. Если печатали на вкладыши R трансвел (Transwell^®) внутри лунок планшета, описанный ранее первый слой стержней NovoGel™ исключали. Напечатанные конструкции затем покрывали соответствующей культуральной средой и инкубировали, за это время соседние сегменты клеточных цилиндров сливались с образованием трехмерных лоскутов, содержащих клетки.

Созревание напечатанных конструкций

Напечатанные конструкции, содержащие HASMC-HDFa-HAEC политипические биочернила, инкубировали в течение 1-7 дней для того, чтобы способствовать созреванию конструкции и дать достаточное время для того, чтобы отправить ("отсортировать") клетки НАЕС на периферию конструкции, при этом образуется гладкомышечная конструкция со слоем (слоями), содержащим(-и) клетки других типов (в данном примере эндотелиальные клетки и фибробласты). В некоторых экспериментах трехмерный гладкомышечный лоскут подвергали действию поперечной силы (деформация сдвига) (т.е. пульсирующего потока), чтобы способствовать сортировке НАЕС.

Пример 12 - Решетка из гидрогеля, применяемая для пространственного ограничения конструкции, но в то же время обеспечивающая непосредственный контакт со средой

Цилиндрические элементы гидрогеля диспенсировали с применением биопринтера NovoGen ММХ Bioprinter™ (Organovo, Inc., San Diego, СА) на участке верхней поверхности трехмерной гладкомьппечной конструкции. Решетка обеспечивала пространственное ограничение напечатанной ткани и делала возможным непосредственный контакт между конструкцией и окружающей (питательной) средой. Первым диспенсировали базовый (основной) слой. Вторым диспенсировали "окно" гидрогеля, очерчивающее пространство 8 мм длиной × 1.25 мм шириной. В третью очередь гладкомышечные чернила наносили (диспенсировали), получая трехмерный клеточный пласт. И в четвертую очередь диспенсировали решетчатую структуру из гидрогеля. В различных экспериментах диаметр элементов (модулей) гидрогеля составлял примерно от 100 мкм до 1 мм, а расстояние между элементами было примерно от 100 мкм до 10 мм.

В некоторых экспериментах элементы гидрогеля диспенсировали (печатали, наносили) в одном направлении, создавая длинные открытые каналы поверх гладкомышечного пласта. В других экспериментах элементы гидрогеля диспенсировали во многих направлениях, создавая поверх пласта подобную решетке структуру (паттерн) с открытыми участками. Гидрогель состоял из NovoGel™. Решетчатая структура необязательно продолжалась за пределами структуры и на поверхности подложки, делая возможным нанесение дополнительного материала для фиксации клеточной структуры на поверхности печати (прототипирования). Полученная в результате решетка применялась для пространственного ограничения клеточной конструкции, но она допускала непосредственный контакт некоторых участков клеточной конструкции с окружающей питательной средой.

Пример 13 - Биопечать имплантируемых трубок, лоскутов (пластов) и мешков без применения синтетической полимерной матрицы или экзогенного внеклеточного матрикса

Человеческие гладкомышечные клетки (SMC) выращивали с использованием источников нативной SMC ткани или получали с использованием стромально-васкулярной фракции (SVF) жировой ткани и применяли для получения биочернил. Биочернила содержали полученные в результате самосборки агрегаты клеток диаметром 180-500 мкм либо в сферической, либо в цилиндрической форме. Биочернила загружали в биопринтер (диспенсер) NovoGen ММХ Bioprinter™ (Organovo, Inc., San Diego, СА) и применяли для послойного построения трехмерных структур. Через 24-72 часа напечатанные структуры сливались, образуя устойчивые трубки или толстые пласты (лоскуты), состоящие из SMC клеток. В некоторых случаях фибробласты, эндотелиальные клетки или эпителиальные клетки добавляли к SMC либо в виде особых слоев, либо в виде компонентов напечатанной конструкции. В некоторых экспериментах после печати наносили дополнительные слои эндотелиальных клеток или тканеспецифических эндотелиальных клеток. В некоторых случаях проводили специфические биомеханические или биохимические испытания напечатанной конструкции для того, чтобы упростить определение конструкции для целевого применения. Полученные в результате конструкции повторяли структуру человеческой ткани и вырабатывали достаточное количество внеклеточного матрикса in situ, так что с ними можно обращаться и работать как с плотными тканями.

Пример 14 - Печеночная ткань, напечатанная по технологии непрерывного нанесения (напыления) с многослойной мозаичной структурой

Биоинженерную печеночную ткань печатали на биопринтере NovoGen ММХ Bioprinter™ (Organovo, Inc., San Diego, СА) по технологии непрерывного нанесения. Трехмерную структуру печеночной ткани строили на основе повторения функционального элемента с планарной (плоской) геометрией, в данном случае шестиугольника. Биочернила состояли из звездчатых клеток печени (клеток Ито, липоцитов) и эндотелиальных клеток, инкапсулированных в композицию для экструзии (поверхностно-активный полиол (эмульгатор) - PF-127).

Приготовление 30% PF-127

Готовили 30% раствор PF-127 (вес/вес) в PBS. Порошок PF-127 перемешивали с охлажденным PBS на магнитной мешалке, поддерживая температуру 4°C. Примерно через 48 часов наблюдали полное растворение.

Подготовка клеток и биопечать

Клеточную суспензию, содержащую 82% звездчатых клеток (SC) и 18% эндотелиальных клеток аорты человека (НАЕС) и дермальных фибробластов взрослого человека (HDFa), распределяли по пробиркам на 15 мл, чтобы получить, после центрифугирования, три концентрации клеток: 50×10⁶ клеток/мл, 100×10⁶ клеток/мл и 200×10⁶ клеток/мл. Каждый клеточный осадок ресуспендировали в 30% PF-127 и отсасывали, посредством биопринтера, в резервуар емкостью 3 мл. С помощью печатающей головки 510 мкм инкапсулированные клетки наносили (диспенсировали) на PDMS базовую плашку в виде единичного шестиугольника (см. Фиг. 7А) или в виде мозаичной (сотовой) структуры из шестиугольных сотов (см. Фиг. 7В). К каждой конструкции добавляли примерно 200 мкл питательной среды и инкубировали в течение 20 минут, чтобы определить целостность конструкции.

Многослойная биопечать

Для экспериментов по созданию гексагональной (шестиугольной) мозаичной структуры печатали до 4 последовательных слоев, в результате получали более высокую структуру, содержащую больше клеточного материала. После фабрикации к каждой конструкции сначала добавляли примерно 200 мкл полной среды для оценки целостности конструкции. Конструкции инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре, а затем погружали в 20 мл полной среды complete media.

Результаты

После культивирования в течение 18 часов в питательной среде, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (которая растворяет PF127), клетки, содержащиеся в напечатанной структуре, сцеплялись (объединялись друг с другом в достаточной степени, чтобы образовать интактный (неповрежденный, целый) непрерывный лоскут (пласт) ткани, который сохранял геометрический рисунок первоначальной конструкции (см. Фиг. 7D). На Фиг. 8 показано Н&Е окрашивание одного сегмента мозаичной конструкции после фиксации в 10%-ном нейтральном забуференном формалине. Было найдено, что клетки являются жизнеспособными, интактными и заключены в первоначальную напечатанную структуру (ограничены этой структурой).

Пример 15 - Пленарная (плоская) структура в многослойном напечатанном тканевом лоскуте

Биочернила, как описано ранее, формовали в виде цилиндрических устойчивых клеточных агрегатов, обычно диаметром 250 мкм или 500 мкм. Коротко говоря клетки размножали в обычных лабораторных условиях, и когда конфлюэнтность клеток достигала 70%-80% от сплошного монослоя, клетки отделяли от поверхности культуры клеток с применением 0.1% трипсина без EDTA. После трипсинизации клетки отмывали один раз в сывороточной среде, собирали, считали и центрифугировали с образованием обильного клеточного осадка. Клеточный осадок либо отсасывали (аспирация) в капилляры для получения однородных (т.е. монотипических) биочернил, либо ресуспендировали, чтобы получить определенные пользователем смеси клеток (Таблица 1, см. ниже), дающие гетерогенные (неоднородные, т.е. политипические) сложные смеси биочернил. См., например, Фиг. 9. Цилиндры из биочернил, полученные таким образом, необязательно применяются непосредственно для биопечати тубулярных (трубчатых) конструкций.

В Таблице 1 представлен неполный перечень композиций биочернил, описываемых их составом входящих в них клеток. Композиции, необязательно, составляли либо из клеток одного типа, либо из смеси клеток различных типов в различных соотношениях с тем, чтобы они соответствовали структуре нативной ткани и/или клеточной реорганизации в напечатанных нео-тканей. Предполагаемые композиции биочернил выражены в процентах с перечнем типов клеток, которые были изучены, и нескольких прототипов, которые были получены.

Рабочие прототипы, перечисленные в Таблице 1, необязательно, получали в виде набора различных размеров с учетом предполагаемого целевого применения трубчатой (тубулярной) конструкции. Например, несколько применяемых обычно схем для тубулярных структур в разрезе (поперечное сечение) представлено на Фиг. 10.

На Фиг. 11 представлена трубчатая (тубулярная) конструкция 6/1 рабочего прототипа, напечатанного биочернилами состава 70:30 SMC:Fib.

Имплантируемые трубчатые ткани из разных смесей клеток, но, в особенности, из гладкомышечных клеток (SMCs), обеспечивают состав и функциональные характеристики, подходящие для применения в целевых частях тела различной локализации. Некоторые примеры такого применения включают имплантаты для дыхательных путей, имплантаты для желудочно-кишечного тракта и имплантаты для мочеполовых путей.

Согласно некоторым вариантам имплантируемые напечатанные пласты (лоскуты) хирургическим путем соединяют либо непрерывным швом, либо несколькими отдельными швами. См. Фиг. 12.

Пример 16 - Напечатанные лоскуты скелетных мышц

Цилиндры содержащих клетки биочернил готовили с использованием миобластов (C2C12), эндотелиальных клеток аорты человека (НАЕС) и/или человеческих дермальных фибробластов (HDFa). Клетки размножали в стандартных лабораторных условиях, используя среды, состоящие из компонентов, которые в базовой литературе обычно указываются как благоприятные для применения в качестве стандартных клеточных культур для данных конкретных типов клеток. По достижении заданного уровня конфлюэнтности монослоя (обычно 60-100%) клетки освобождали из стандартного пластика для тканевых культур, отмывая не содержащим катионов фосфатно-солевым буферным раствором (PBS), а затем экспонировали с 0.05% - 0.1% трипсином (Invitrogen). Освобожденные клетки отмывали в сывороточной среде, собирали, считали, смешивали в соответствующем соотношении и осаждали центрифугированием. Как правило, клетки C2C12 смешивали в следующих соотношениях: 100% C2C12, 90:10 (C2C12:НАЕС), 90:10 (C2C12:HDFa) или 80:10:10 (C2C12:HAEC:HDFa). Удаляли супернатант и клетки ресуспендировали в фибриногене (2 мг/мл). Смесь клеток осаждали центрифугированием, супернатант сливали с клеточного осадка и смесь клеток отсасывали (аспирация) в стеклянный капилляр нужного диаметра, как правило, 250 или 500 мкм. Погружали в (питательную) среду на 15-20 минут, после чего содержимое каждого капилляра экструдировали в неадгезивную форму (для заливки) из гидрогеля, содержащую линейные каналы, и инкубировали в питательной среде от 4 до 24 часов.

Затем конструкции скелетных мышц печатали на мембране вкладыша в лунку для клеточной культуры (Transwell^®, BD), используя биочернила в форме цилиндров, содержащие клетки С2С12, НАЕС и/или HDFa. Сегменты ткани скелетных мышц создавали (биофабрикация) с начальными размерами 1.25 мм × 8.00 мм × 0.25 мм (W×L×H). После биофабрикации лоскуты ткани скелетных мышц погружали в полную (содержащую сыворотку) культуральную среду и помещали в стандартную влажную камеру в атмосферу с 5% CO₂ для созревания. Затем напечатанные (прототипированные) сегменты скелетных мышц культивировали в стационарных условиях или стимулировали, добавляя цитокин(-ы) или с помощью биомеханических сигналов. Напечатанные конструкции скелетных мышц культивировали до девяти дней и анализировали клеточную структуру, продуцирование внеклеточного матрикса, жизнеспособность клеток и целостность конструкции. См., например, Фиг. 13А, В и С.

Результаты

Напечатанные конструкции из тканей скелетных мышц, состоящих из клеток С2С12, НАЕС и/или HDFa, были успешно изготовлены (биофабрикация) и хранились в культуре.

Хотя предпочтительные варианты настоящего изобретения были показаны и описаны в данной заявке, для специалиста в данной области техники является очевидным, что такие варианты представлены только в качестве примеров. Специалисту в данной области техники придут на ум многочисленные вариации, изменения и замены в пределах объема изобретения. Следует понимать, что различные альтернативные варианты способов воплощения настоящего изобретения, необязательно, применяются при использовании настоящего изобретения на практике.

Группа изобретений относится к медицине и касается создания биоинженерных тканей и органов. Для этого предлагаются живые трехмерные инженерные ткань или орган, содержащие множество сцепленных слоев и не содержащие предварительно сформированного скаффолда. При этом они имеют по меньшей мере один компонент, полученный методом биопечати путем экструзии биочернил на биосовместимую поверхность. Биочернила являются твердой или полутвердой композицией, содержащей живые клетки. По меньшей мере один слой инженерной ткани или органа содержит мышечные клетки, при этом инженерная ткань или орган не является васкулярной трубкой. Предлагается также применение указанных ткани или органа для имплантации позвоночному, а также способ их получения. Изобретения обеспечивают создание слоев клеток с определенной плотностью, достаточной для создания целостной ткани без скаффолда, годной для имплантации. 7 н. и 49 з.п. ф-лы, 1 табл., 16 пр., 13 ил.

1. Живые трехмерные инженерные ткань или орган, содержащие множество слоев, характеризующихся тем, что:

а) не содержат предварительно сформированного скаффолда и

б) имеют по меньшей мере один компонент, полученный методом биопечати путем экструзии биочернил на биосовместимую поверхность, где биочернила являются твердой или полутвердой композицией, содержащей живые клетки,

множество слоев являются сцепленными и применимы для имплантации без предварительно сформированного скаффолда позвоночному после соответствующего созревания; при условии, что по меньшей мере один слой инженерной ткани или органа содержит мышечные клетки и что инженерная ткань или орган не является васкулярной трубкой.

2. Ткань или орган по п. 1, в которых по меньшей мере один слой содержит множество типов клеток, эти типы клеток расположены в пространстве относительно друг друга таким образом, что создается плоская структура.

3. Ткань или орган по п. 2, в которых по меньшей мере один слой в момент изготовления имеет толщину по меньшей мере 100 мкм в наименьшем измерении.

4. Ткань или орган по п. 1, в которых по меньшей мере один слой по своему составу или по своей структуре отличается по меньшей мере от одного другого слоя, в результате образуется слоистая структура.

5. Ткань или орган по п. 4, в которых по меньшей мере один слой в момент изготовления имеет толщину по меньшей мере 100 мкм в наименьшем измерении.

6. Ткань или орган по п. 1, которые представляют собой мешок, пласт или трубку, причем указанная трубка не является васкулярной трубкой.

7. Ткань или орган по п. 1, в которых множество слоев продуцируют внеклеточный матрикс.

8. Ткань или орган по п. 1, в которых мышечные клетки представляют собой гладкомышечные клетки.

9. Ткань или орган по п. 1, в которых мышечные клетки представляют собой клетки скелетных мышц.

10. Ткань или орган по п. 1, в которых мышечные клетки представляют собой клетки сердечной мышцы.

11. Ткань или орган по п. 1, в которых мышечные клетки являются полученными из стволовых клеток или клеток-предшественников, способных дифференцироваться в мышечные клетки.

12. Ткань или орган по п. 11, в которых стволовые клетки или клетки-предшественники являются дифференцированными в мышечные клетки до, во время или после изготовления.

13. Ткань или орган по п. 1, дополнительно содержащие клетки, выбранные из эндотелиальных клеток, нервных клеток, перицитов, фибробластов, тканеспецифических эпителиальных клеток, хондроцитов, клеток скелетной мышечной ткани, кардиомиоцитов, клеток костной ткани, клеток мягких тканей, мезотелиальных клеток, тканеспецифических стромальных клеток, стволовых клеток, клеток-предшественников и их комбинаций.

14. Ткань или орган по п. 1, дополнительно содержащие клетки, выбранные из эндодермальных клеток, которые не получены из людей-доноров, эктодермальных клеток, которые не получены из людей-доноров, мезодермальных клеток, которые не получены из людей-доноров, и их комбинаций.

15. Ткань или орган по п. 1, в которых клетки, отличные от мышечных клеток, были распределены по меньшей мере на одной поверхности множества слоев.

16. Ткань или орган по п. 15, в которых клетки, отличные от мышечных клеток, были нанесены путем биопечати по меньшей мере на одну поверхность множества слоев.

17. Ткань или орган по п. 15, в которых клетки, отличные от мышечных клеток, были распределены на множестве слоев по существу в то же время, что изготовляется множество слоев, после изготовления множества слоев, во время созревания множества слоев или после созревания множества слоев.

18. Ткань или орган по п. 15, в которых клетки, отличные от мышечных клеток, были распределены на множестве слоев в виде слоя клеток толщиной от примерно 1 до примерно 20 клеток.

19. Ткань или орган по п. 1, в которых множество слоев является по существу плоскими.

20. Ткань или орган по п. 19, которые представляют собой пласт или лоскут, содержащий мышечные клетки, применяемый для заживления ран, замены ткани или наращивания ткани.

21. Ткань или орган по п. 1, в которых множество слоев являются по существу тубулярными.

22. Ткань или орган по п. 21, которые представляют собой мочеточник, канал мочевого пузыря, кишечный канал между воротами печени и двенадцатиперстной кишкой, фаллопиеву трубу, матку, трахею, бронх, лимфатический сосуд, уретру, кишечник, ободочную кишку, пищевод или их часть.

23. Ткань или орган по п. 1, в которых множество слоев по существу представляют собой мешок.

24. Ткань или орган по п. 23, которые представляют собой желудок, мочевой пузырь, матку или желчный пузырь или их часть.

25. Ткань или орган по п. 1, которые выбраны из группы, состоящей из уретры, канала мочевого пузыря, кишечного канала между воротами печени и двенадцатиперстной кишкой, мочеточника, мочевого пузыря, фаллопиевой трубы, матки, трахеи, бронха, лимфатического сосуда, пищевода, желудка, желчного пузыря, кишечника и ободочной кишки.

26. Применение ткани или органа по п. 1 для имплантации позвоночному.

27. Применение ткани или органа по п. 1 в исследовательской работе, причем ткань или орган хранится в культуре.

28. Способ создания имплантируемых инженерных ткани или органа, включающих слой, содержащий мышечные клетки, включающий:

а) биопечать биочернил, содержащих мышечные клетки, в форму, которая не содержит предварительно сформированного скаффолда, причем биопечать осуществляется путем экструзии биочернил на биосовместимую поверхность, где биочернила представляют собой твердую или полутвердую композицию, содержащую живые клетки; и

б) слияние биочернил в сцепленную клеточную структуру;

при условии, что ткань или орган содержит множество слоев, которые являются сцепленными и могут имплантироваться позвоночному без предварительно сформированного скаффолда, и инженерная ткань или орган не является васкулярной трубкой.

29. Способ по п. 28, в котором имплантируемая(-ый) ткань или орган по существу не содержат какого-либо предварительно сформированного скаффолда в момент применения.

30. Способ по п. 28, в котором мышечные клетки представляют собой гладкомышечные клетки.

31. Способ по п. 28, в котором мышечные клетки представляют собой клетки скелетных мышц.

32. Способ по п. 28, в котором мышечные клетки представляют собой клетки сердечной мышцы.

33. Способ по п. 28, в котором мышечные клетки дифференцируются из клеток-предшественников.

34. Способ по п. 29, в котором источником мышечных клеток является образец ткани.

35. Способ по п. 34, в котором образец ткани представляет собой липоаспират.

36. Способ по п. 28, в котором форма представляет собой мешок или пласт.

37. Способ по п. 28, в котором форма представляет собой трубку с внутренним диаметром в момент биопечати около 0,15 мм или более, причем трубка не предназначена для применения в качестве сосудистого шунта-байпаса или в качестве артериовенозного шунта.

38. Способ по п. 28, в котором биочернила дополнительно содержат клетки, выбранные из эндотелиальных клеток, нервных клеток, перицитов, фибробластов, тканеспецифических эпителиальных клеток, хондроцитов, клеток скелетной мышечной ткани, кардиомиоцитов, клеток костной ткани, клеток мягких тканей, мезотелиальных клеток, тканеспецифических стромальных клеток, стволовых клеток, клеток-предшественников и их комбинаций.

39. Способ по п. 28, в котором биочернила дополнительно содержат клетки, выбранные из эндодермальных клеток, которые не получены из людей-доноров, эктодермальных клеток, которые не получены из людей-доноров, мезодермальных клеток, которые не получены из людей-доноров, и их комбинаций.

40. Способ по п. 28, дополнительно включающий стадию биопечати, распыления, рисования, нанесения, нанесения методом погружения, пересадки, засевания, впрыскивания или наложения слоями клеток по п. 38 или 39 в или на полученную биопечатью форму по п. 28.

41. Способ по п. 28, дополнительно включающий стадию биопечати, распыления, рисования, нанесения, нанесения методом погружения, пересадки, впрыскивания, засевания или наложения слоями клеток по п. 38 или 39 в или на сцепленную клеточную структуру по п. 28.

42. Живые трехмерные инженерные ткань или орган, содержащие множество слоев, характеризующихся тем, что:

а) не содержат предварительно сформированного скаффолда и

б) имеют по меньшей мере один компонент, полученный методом биопечати путем экструзии биочернил на биосовместимую поверхность, где биочернила являются твердой или полутвердой композицией, содержащей живые клетки,

причем множество слоев являются сцепленными и созревали до состояния, готового для имплантации позвоночному без предварительно сформированного скаффолда; инженерные ткань или орган состоят по существу из клеточного материала; при условии, что по меньшей мере один слой инженерной ткани или органа содержит мышечные клетки и что инженерная ткань или орган не является васкулярной трубкой.

43. Ткань или орган по п. 42, в которых по меньшей мере один слой содержит множество типов клеток, расположенных в пространстве относительно друг друга таким образом, чтобы создать планарную структуру.

44. Ткань или орган по п. 43, в которых по меньшей мере один слой в момент изготовления имеет толщину по меньшей мере 100 мкм в наименьшем измерении.

45. Ткань или орган по п. 42, в которых по меньшей мере один слой по своему составу или по своей структуре отличается по меньшей мере от одного другого слоя, в результате чего образуется слоистая структура.

46. Ткань или орган по п. 45, в которых по меньшей мере один слой в момент изготовления имеет толщину по меньшей мере 100 мкм в наименьшем измерении.

47. Ткань или орган по п. 42, представляющие собой мешок, пласт или трубку, причем указанная трубка не является васкулярной трубкой.

48. Ткань или орган по п. 42, в которых мышечные клетки представляют собой гладкомышечные клетки.

49. Ткань или орган по п. 42, в которых мышечные клетки представляют собой клетки скелетных мышц.

50. Ткань или орган по п. 42, в которых мышечные клетки представляют собой клетки сердечной мышцы.

51. Ткань или орган по п. 42, дополнительно содержащие клетки, выбранные из эндотелиальных клеток, нервных клеток, перицитов, фибробластов, тканеспецифических эпителиальных клеток, хондроцитов, клеток скелетной мышечной ткани, кардиомиоцитов, клеток костной ткани, клеток мягких тканей, мезотелиальных клеток, тканеспецифических стромальных клеток, стволовых клеток, клеток-предшественников и их комбинаций.

52. Ткань или орган по п. 42, дополнительно содержащие клетки, выбранные из эндодермальных клеток, которые не получены из людей-доноров, эктодермальных клеток, которые не получены из людей-доноров, мезодермальных клеток, которые не получены из людей-доноров, и их комбинаций.

53. Ткань или орган по п. 51 или 52, в которых клетки распределены по меньшей мере на одной поверхности множества слоев.

54. Ткань или орган по п. 53, в которых клетки нанесены путем биопечати по меньшей мере на одну поверхность множества слоев.

55. Применение ткани или органа по п. 42 для имплантации позвоночному.

56. Применение ткани или органа по п. 42 в исследовательской работе, причем ткань или орган хранится в культуре.