ЛЕЧЕНИЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ ПОЧЕК У СУБЪЕКТОВ С АНОМАЛИЯМИ ПОЧЕК И/ИЛИ МОЧЕВЫВОДЯЩИХ ПУТЕЙ Российский патент 2024 года по МПК A61K35/22 A61P13/12 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится, в частности, к способам, композициям и популяциям клеток для лечения субъектов с заболеванием почек.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Аномалии почек, такие как врожденные аномалии почек и мочевыводящих путей (CAKUT) и/или приобретенные аномалии, могут приводить к заболеваниям почек, включая хроническое заболевание и конечную стадию заболевания почек. CAKUT составляют примерно 20-30 процентов всех аномалий, выявленных в пренатальном периоде. См. публикацию Queisser-Luft et al. (2002) Malformations in newborn: results based on 30,940 infants and fetuses from the Mainz congenital birth defect monitoring system (1990-1998). 2002;266(3):163, полное содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится, в частности, к способам, популяциям клеток и композициям для лечения заболевания почек у субъектов с врожденной аномалией почек и/или мочевыводящих путей.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания почек у субъекта, имеющего хроническое заболевание почек (ХЗП), включающему введение субъекту эффективного количества (i) популяции биоактивных почечных клеток; (ii) везикул, секретируемых популяцией почечных клеток; и/или (iii) сфероидов, содержащих популяцию почечных клеток и по меньшей мере одну популяцию не почечных клеток, где субъект имеет аномалию почек и/или мочевыводящих путей.

В некоторых вариантах осуществления субъект имеет аномалию почек. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет аномалию мочевыводящих путей. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет аномалию почек и мочевыводящих путей. В некоторых вариантах осуществления аномалия приобретена до рождения. В некоторых вариантах осуществления аномалия приобретена после рождения. В некоторых вариантах осуществления аномалия представляет собой врожденную аномалию. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет врожденную аномалию почек. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет врожденную аномалию мочевыводящих путей. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет врожденную аномалию почек и мочевыводящих путей. Используемый в настоящем документе термин «врожденная» аномалия означает аномалию, которая имеется при рождении или до рождения. В некоторых вариантах осуществления врожденная аномалия ухудшается или приводит к дополнительным аномалиям после рождения.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания почек у субъекта, который имеет аномалию почек и/или мочевыводящих путей, включающему, состоящему в основном из, или состоящему из введения субъекту эффективного количества (i) популяции биоактивных почечных клеток; (ii) одного или более продуктов, секретируемых популяцией почечных клеток; и/или (iii) сфероидов, содержащих популяцию почечных клеток и по меньшей мере одну популяцию других клеток.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания почек у субъекта, который имеет аномалию почек и/или мочевыводящих путей, включающему введение субъекту эффективного количества (i) популяции биоактивных почечных клеток; (ii) одного или более продуктов (таких как везикулы), секретируемых популяцией почечных клеток; и/или (iii) сфероидов, содержащих популяцию почечных клеток и по меньшей мере одна популяцию других клеток, такую как популяция не почечных клеток.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания почек у субъекта, который имеет аномалию почек и/или мочевыводящих путей, включающему введение субъекту эффективного количества (i) популяции биоактивных почечных клеток; (ii) везикул, секретируемых популяцией почечных клеток; или (iii) сфероидов, содержащих популяцию почечных клеток и по меньшей мере одну популяцию не почечных клеток.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания почек у субъекта, который имеет аномалию почек и/или мочевыводящих путей, включающему введение субъекту эффективного количества (i) популяции биоактивных почечных клеток; (ii) везикул, секретируемых популяцией почечных клеток; и (iii) сфероидов, содержащих популяцию почечных клеток и по меньшей мере одну популяцию не почечных клеток.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания почек у субъекта, который имеет аномалию почек и/или мочевыводящих путей, включающему введение субъекту эффективного количества композиции, содержащей популяцию биоактивных почечных клеток. В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит везикулы, секретируемые популяцией почечных клеток. В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит сфероиды, содержащие популяцию почечных клеток и по меньшей мере одну популяцию не почечных клеток.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания почек у субъекта, который имеет аномалию почек и/или мочевыводящих путей, включающему введение субъекту эффективного количества везикул, секретируемых популяцией почечных клеток.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания почек у субъекта, который имеет аномалию почек и/или мочевыводящих путей, включающему введение субъекту эффективного количества сфероидов, содержащих популяцию почечных клеток и по меньшей мере одну популяцию не почечных клеток.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к популяции биоактивных почечных клеток и ее применению для лечения заболевания почек у субъекта, который имеет аномалию почек и/или мочевыводящих путей.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к продуктам (таким как везикулы), секретируемым популяцией биоактивных почечных клеток, и их применению для лечения заболевания почек у субъекта, который имеет аномалию почек и/или мочевыводящих путей.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к сфероидам, содержащим популяцию биоактивных почечных клеток, и их применению для лечения заболевания почек у субъекта, который имеет аномалию почек и/или мочевыводящих путей.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

ФИГ. 1 представляет собой график, показывающий расчетную скорость клубочковой фильтрации (рСКФ) до и после лечения REACT.

ФИГ. 2 представляет собой график, показывающий концентрацию сывороточного креатинина до и после лечения REACT.

ФИГ. 3 представляет собой фотографию системы доставки продукта REACT.

ФИГ. 4 представляет собой фотографию контейнера для перевозки REACT.

ФИГ. 5 представляет собой блок-схему дизайна исследования.

ФИГ. 6 представляет собой блок-схему для неограничивающего примера всего процесса производства NKA.

ФИГ. 7A-D представляют собой более подробные блок-схемы для неограничивающего примера процесса, представленного на ФИГ. 6.

ФИГ. 8 представляет собой график, показывающий улучшение почечной функции, определяемой на основании рСКФ, у пациента, получающего лечение REACT в связи с заболеванием почек, возникающим вследствие CAKUT; звездочкой отмечена исходная почечная функция пациента до эффекта CAKUT; сплошная серая линия (построенная для периода от -1 до 0 месяцев относительно инъекции) показывает снижение почечной функции пациента, определяемой на основании рСКФ, до инъекции REACT; прерывистая черная линия (построенная для периода от 0 до 3 месяцев относительно инъекции) показывает рСКФ пациента после инъекции REACT.

ФИГ. 9 представляет собой график, показывающий улучшение почечной функции, определяемой на основании отношения альбумин/креатинин, у пациента, получающего лечение REACT в связи с заболеванием почек, возникающим вследствие CAKUT.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем документе описаны некоторые варианты осуществления изобретения и примеры. При том, что изобретение описано в сочетании с иллюстративными вариантами осуществления, следует понимать, что изобретение не должно быть ограничено этими вариантами осуществления. Напротив, изобретение должно охватывать все альтернативные варианты, модификации и эквиваленты, которые могут быть включены в объем настоящего изобретения, определяемый формулой изобретения. Специалисту в данной области известны многие способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в настоящем документе, которые могут быть использованы при осуществлении на практике настоящего изобретения. Настоящее изобретение никоим образом не ограничено описанными способами и материалами.

Все литературные источники, цитированные в заявке, специально включены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме. В случае, если один или более из включенных литературных источников, патентов и аналогичных материалов отличается, или противоречит настоящей заявке, включая, но без ограничения, определенные термины, использование терминов, описанные методики, или тому подобное, настоящая заявка имеет преимущественную силу.

Если нет иных указаний, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то значение, которое им обычно придают специалисты в области, к которой относится настоящее изобретение. Специалист в данной области понимает, что многие способы и материалы, аналогичные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем документе, могут быть использованы при осуществлении на практике настоящего изобретения. Действительно, настоящее изобретение никоим образом не ограничено описанными способами и материалами.

Используемый в настоящем документе термин «примерно» в контексте числового значения или диапазона означает ±10% от указанного или заявленного числового значения или диапазона, если только контекст не подразумевает более ограниченный диапазон.

В описании и в формуле изобретения такие выражения как «по меньшей мере один из» или «один или более из» могут сопровождаться списком элементов или признаков. Термин «и/или» также может встречаться в списке из двух или более элементов или признаков. Если это неявно или явно не противоречит контексту, в котором оно используется, такое выражение подразумевает любой из перечисленных элементов или признаков в отдельности, или любой из перечисленных элементов или признаков в сочетании с любым из других перечисленных элементов или признаков. Например, каждое из выражений «по меньшей мере один из A и B»; «один или более из A и B» и «A и/или B» должно означать «A отдельно, B отдельно или A и B совместно». Аналогичная интерпретация предназначена также для списков, включающих три или более элементов. Например, каждое из выражений «по меньшей мере один из A, B и C», «один или более из A, B и C», «A, B и/или C» должно означать «A отдельно, B отдельно, C отдельно, A и B совместно, A и C совместно, B и C совместно или A и B и C совместно». Кроме того, используемое в описании и в формуле изобретения выражение «на основании» должно означать «по меньшей мере частично на основании», так, что не перечисленные функции или элементы также допустимы.

Понятно, что при описании диапазона параметров все целые числа в диапазоне, и десятые доли, также включены в изобретение. Например, «0,2-5 мг» означает раскрытие 0,2 мг, 0,3 мг, 0,4 мг, 0,5 мг, 0,6 мг и так далее, вплоть до, и включая, 5,0 мг.

Переходный термин «содержащий», который является синонимом терминам «включающий», «заключающий в себе» или «характеризующийся», является инклюзивным или открытым, и не исключает дополнительные, не перечисленные элементы или этапы способа. Напротив, переходный термин «состоящий из» исключает любой элемент, этап или ингредиент, не указанный в формуле изобретения. Переходный термин «состоящий в основном из» ограничивает объем пункта формулы изобретения указанными материалами или этапами «и теми, которые не оказывают существенного влияния на основную и новую характеристику(и)» заявленного изобретения.

При использовании в настоящем документе форма единственного числа терминов включает также и соответствующую форму множественного числа, если из контекста явно не следует иное.

Используемый в настоящем документе термин «лечение» включает, например, ингибирование, регрессию или остановку прогрессирования заболевания. Лечение также включает предотвращение или облегчение любого симптома, или симптомов, заболевания. Используемый в настоящем документе термин «ингибирование» прогрессирования заболевания или осложнения заболевания у субъекта означает предотвращение или уменьшение прогрессирования заболевания и/или осложнения заболевания у субъекта.

Используемый в настоящем документе термин «симптом», связанный с заболеванием, включает любое клиническое или лабораторное проявление, связанное с заболеванием, и не ограничен тем, что субъект может чувствовать или наблюдать.

Используемый в настоящем документе термин «эффективное» применительно к количеству терапевтического средства означает количество средства, которое является достаточным для достижения желаемого терапевтического ответа без чрезмерно неблагоприятных побочных эффектов (таких как токсичность, раздражение или аллергическая реакция) с разумным соотношением польза/риск при использовании в соответствии с настоящим изобретением.

Используемый в настоящем документе термин «биоактивные почечные клетки», или «БПК», означает почечные клетки, имеющие одно или более из следующих свойств при введении их в почку субъекта: способность уменьшать (например, замедлять или останавливать) ухудшение состояния или прогрессирование хронического заболевания почек или его симптома, способность улучшать почечную функцию, способность оказывать влияние на (улучшать) почечный гомеостаз и способность стимулировать заживление, восстановление и/или регенерацию почечной ткани или почки. В некоторых вариантах осуществления эти клетки могут включать функциональные клетки почечных канальцев (например, на основании улучшения экскреции креатинина и удержания белка), гломерулярные клетки (например, на основании улучшения удержания белка), сосудистые клетки и другие клетки кортикомедуллярного соединения. В некоторых вариантах осуществления БПК получают путем выделения и размножения почечных клеток из почечной ткани. В некоторых вариантах осуществления БПК получают путем выделения и размножения почечных клеток из почечной ткани с использованием способов селекции биоактивных клеток. В некоторых вариантах осуществления БПК оказывают регенеративный эффект на почку. В некоторых вариантах осуществления БПК включают, состоят в основном из, или состоят из селективных почечных клеток (СПК). В некоторых вариантах осуществления БПК представляют собой СПК.

В некоторых вариантах осуществления СПК представляют собой клетки, полученные путем выделения и размножения почечных клеток из соответствующей почечной ткани, при этом СПК содержат большую процентную долю одного или более типов клеток и лишены, или содержат более низкую процентную долю, одного или более других типов клеток, в сравнении с исходной популяцией почечных клеток. В некоторых вариантах осуществления СПК содержат повышенную процентную долю БПК в сравнении с исходной популяцией почечных клеток. В некоторых вариантах осуществления популяция СПК представляет собой выделенную популяцию почечных клеток, обогащенную по конкретным биоактивным компонентам и/или типам клеток, и/или истощенную по конкретным неактивным и/или нежелательным компонентам или типам клеток, предназначенную для использования в лечении заболевания почек, то есть, для обеспечения стабилизации и/или улучшения и/или восстановления почечной функции. СПК обеспечивают превосходные терапевтические и регенеративные результаты в сравнении с исходной популяцией. В некоторых вариантах осуществления СПК получают из ткани коркового слоя почки пациента путем биопсии почки. В некоторых вариантах осуществления СПК отбирают (например, методом активированной флуоресценцией сортировки клеток или «FACS») на основании экспрессии ими одного или более маркеров. В некоторых вариантах осуществления СПК истощают (например, методом активированной флуоресценцией сортировки клеток или «FACS») по одному или более типам клеток на основании экспрессии одного или более маркеров на этих типах клеток. В некоторых вариантах осуществления СПК отбирают из популяции биоактивных почечных клеток. В некоторых вариантах осуществления СПК отбирают путем разделения в градиенте плотности размноженных почечных клеток. В некоторых вариантах осуществления СПК отбирают путем разделения размноженных почечных клеток методом центрифугирования через границу, барьер или интерфейс между фазами с разной плотностью, или путем разделения в прерывистом одноступенчатом градиенте плотности. В некоторых вариантах осуществления СПК отбирают путем разделения в непрерывном или прерывистом градиенте плотности размноженных почечных клеток, которые были культивированы в гипоксических условиях. В некоторых вариантах осуществления СПК отбирают путем разделения в градиенте плотности размноженных почечных клеток, которые были культивированы в гипоксических условиях в течение по меньшей мере примерно 8, 12, 16, 20 или 24 часов. В некоторых вариантах осуществления СПК отбирают путем разделения методом центрифугирования через границу, барьер или интерфейс между фазами с разной плотностью размноженных почечных клеток, которые были культивированы в гипоксических условиях. В некоторых вариантах осуществления СПК отбирают путем разделения размноженных почечных клеток, которые были культивированы в гипоксических условиях в течение по меньшей мере примерно 8, 12, 16, 20 или 24 часов, методом центрифугирования через границу, барьер или интерфейс между фазами с разной плотностью (например, разделения в прерывистом одноступенчатом градиенте плотности). В некоторых вариантах осуществления СПК состоят в основном из клеток почечных канальцев. В некоторых вариантах осуществления другие паренхиматозные (например, сосудистые) и стромальные (например, собирающих протоков) клетки могут присутствовать в СПК. В некоторых вариантах осуществления менее примерно 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1% клеток в популяции СПК представляют собой сосудистые клетки. В некоторых вариантах осуществления менее примерно 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1% клеток в популяции СПК представляют собой клетки собирающих протоков. В некоторых вариантах осуществления менее примерно 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1% клеток в популяции СПК представляют собой сосудистые клетки или клетки собирающих протоков.

Термин «сфероид» означает агрегат или совокупность клеток, культивируемых для достижения 3-мерного роста, в отличие от роста в виде монослоя. Следует отметить, что термин «сфероид» не означает, что агрегат представляет собой геометрическую сферу. В некоторых вариантах осуществления агрегат может быть высокоорганизован с четко определенной морфологией, или может представлять собой неорганизованную массу. В некоторых вариантах осуществления сфероид может включать клетки одного типа или клетки более чем одного типа. В некоторых вариантах осуществления клетки могут представлять собой первичные изоляты или стабильную линию клеток, или сочетания обоих вариантов. В некоторых вариантах осуществления сфероиды (например, клеточные агрегаты или органоиды) образуются во вращающейся колбе. В некоторых вариантах осуществления сфероиды (например, клеточные агрегаты или органоиды) образуются в 3-мерной матрице.

Термин «естественный орган» должен означать орган живого субъекта. В некоторых вариантах осуществления субъект может быть здоровым или нездоровым. В некоторых вариантах осуществления нездоровый субъект может иметь заболевание, связанное с этим конкретным органом.

Термин «естественная почка» должен означать почку живого субъекта. В некоторых вариантах осуществления субъект может быть здоровым или нездоровым. В некоторых вариантах осуществления нездоровый субъект может иметь заболевание почек. В некоторых вариантах осуществления нездоровый субъект может иметь аномалию почек и/или мочевыводящих путей.

Настоящее изобретение относится к типам клеток и популяциям клеток (таких как СПК), которые приносят пользу естественному органу, такому как почка. В некоторых вариантах осуществления польза включает остановку или замедление прогрессирования (например, ухудшения одного или более симптомов) хронического заболевания почек. В некоторых вариантах осуществления польза включает регенеративный эффект, например, уменьшение симптома хронического заболевания почек и/или улучшение функции естественной почки. В некоторых вариантах осуществления польза включает, без ограничения, уменьшение степени повреждения естественного органа, либо улучшение, восстановление или стабилизацию функции, или структуры, естественного органа. Повреждение почек может иметь, например, форму фиброза, воспаления, гломерулярной гипертрофии, атрофии и так далее.

В некоторых вариантах осуществления «обогащенная» популяция клеток, или препарат, означает популяцию клеток, полученную из исходной популяции клеток органа (например, не фракционированной, гетерогенной популяции клеток из почки), которая содержит большую процентную долю клеток определенного типа, чем процентная доля клеток этого типа в исходной популяции. Например, исходная популяция почечных клеток может быть обогащена по первой, второй, третьей, четвертой, пятой, и так далее, интересующей популяции клеток.

Используемый в настоящем документе термин «гипоксические» условия культивирования означает условия культивирования, в которых клетки имеют доступные уровни кислорода в системе культивирования, пониженные относительно стандартных условий, в которых клетки культивируют при атмосферных уровнях кислорода (примерно 21%). В настоящем документе не гипоксические условия называют нормальными или нормоксическими условиями культивирования.

Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим биологический материал и клетки одного или более типов. В некоторых вариантах осуществления биологический материал представляет собой природный или синтетический биосовместимый материал, подходящий для введения в живую ткань, поддерживающий клетки в жизнеспособном состоянии. Природный биологический материал представляет собой материал, который создан в живой системе, или происходит из нее. Синтетические биологические материалы представляют собой материалы, которые непосредственно не созданы в живой системе, или не происходят из нее. В некоторых вариантах осуществления биологический материал, раскрытый в настоящем документе, может представлять собой сочетание природных и синтетических биосовместимых материалов. Описанные в настоящем документе биологические материалы включают (но не ограничиваются ими), например, полимерные матрицы и каркасы. Специалисты в данной области понимают, что биологический материал(ы) может быть сконфигурирован в различных формах, например, в виде поропласта, гелей, жидкостей, гранул, твердых веществ, и может включать один или более природных или синтетических биосовместимых материалов. В некоторых вариантах осуществления биологический материал представляет собой раствор в жидкой форме, который способен превращаться в гидрогель. В некоторых вариантах осуществления биологический материал представляет собой гидрогель, который способен превращаться в жидкость.

Используемый в настоящем документе термин «заболевание почек» включает заболевания, ассоциированные с любой стадией или степенью тяжести острого или хронического заболевания почек (например, острой или хронической почечной недостаточности), которое приводит к утрате почкой способности выполнять функцию фильтрования крови и удаления избытка жидкости, электролитов и продуктов распада из крови. В некоторых вариантах осуществления заболевание почек также может включать эндокринные дисфункции, такие как анемия (недостаток эритропоэтина) и минеральный дисбаланс (недостаток витамина D). В некоторых вариантах осуществления заболевание почек может изначально развиваться в почках, или может быть вторичным по отношению к различным состояниям, включая (но без ограничения) врожденные аномалии почек и мочевыводящих путей (CAKUT), пузырно-мочеточниковый рефлюкс, сердечную недостаточность, гипертензию, диабет, аутоиммунное заболевание или заболевание печени. В некоторых вариантах осуществления заболевание почек может представлять собой состояние хронического заболевания почек, которое развивается после острого повреждения почек. Например, повреждение почек вследствие ишемии и/или воздействия токсических веществ может вызывать острое заболевание почек; неполное восстановление после острого повреждения почек может приводить к развитию хронического заболевания почек.

В некоторых вариантах осуществления термин «лечение» может означать терапевтическое лечение и/или профилактические или превентивные меры в отношении заболевания почек, анемии, нарушений канальцевого транспорта или нарушений клубочковой фильтрации, при этом целью является обращение вспять, предотвращение или замедление (облегчение) целевого заболевания. Нуждающиеся в лечении субъекты включают тех, которые уже имеют заболевание почек, анемию, нарушение канальцевого транспорта или нарушение клубочковой фильтрации, а также тех, которые предрасположены к развитию заболевания почек, анемии, нарушения канальцевого транспорта или нарушения клубочковой фильтрации, или тех, у кого заболевание почек, анемия, нарушение канальцевого транспорта или нарушение клубочковой фильтрации должно быть предотвращено. В некоторых вариантах осуществления субъект, который нуждается в лечении, имеет врожденную аномалию почек и/или мочевыводящих путей. Используемый в настоящем документе термин «лечение» включает стабилизацию и/или улучшение почечной функции.

Настоящее изобретение относится к конструкциям или препаратам, включающим клетки одного или более типов (например, популяцию клеток, таких как СПК), отложенные на, или в, поверхности каркаса или матрицы, выполненных из одного или более синтетических или природных биосовместимых материалов. В некоторых вариантах осуществления одна или более популяций клеток могут быть покрыты, нанесены на, погружены в, присоединены к, высеяны или заключены в биологический материал, выполненный из одного или более синтетических или природных биосовместимых биологических материалов, полимеров, белков или пептидов. В некоторых вариантах осуществления одна или более клеточных популяций могут быть объединены с биологическим материалом, или каркасом или матрицей, in vitro или in vivo. В некоторых вариантах осуществления один или более биологических материалов, используемых для создания конструкции или препарата, могут быть выбраны для направления, облегчения или предоставления возможности диспергирования и/или интегрирования клеточных компонентов конструкции в эндогенной ткани хозяина, или для направления, облегчения или предоставления возможности выживания, приживления, толерантности или функциональной активности клеточных компонентов конструкции или препарата.

Термин «Neo-Kidney Augment (NKA)» относится к биоактивному клеточному препарату, который представляет собой инъекционный препарат, состоящий из аутологичных, гомологичных СПК, сформулированных в биологическом материале, состоящем из желатинового гидрогеля. Термин «прогрессивная клеточная терапия» («Advance Cell Therapy (ACT)») означает лечение препаратом NKA.

В некоторых вариантах осуществления субъект является живым животным. В некоторых вариантах осуществления субъект является млекопитающим, таким как собака, кошка, лошадь, кролик, животное из зоопарка, корова, свинья, овца, коза, верблюд, мышь, крыса или морская свинка. В некоторых вариантах осуществления субъект является приматом, таким как человек, шимпанзе, орангутан, мартышка или бабуин. В некоторых вариантах осуществления субъект является человеком. В некоторых вариантах осуществления субъект является пациентом, имеющим право на лечение, который испытывает, или испытывал, один или более признаков, симптомов или показателей заболевания почек. Такие субъекты включают, без ограничения, субъектов, которым впервые поставлен диагноз, или ранее был поставлен диагноз и у которых в настоящее время возник рецидив, или повторное проявление заболевания, или которые имеют риск развития заболевания почек, независимо от причины. В некоторых вариантах осуществления субъект мог ранее получать лечение в связи с заболеванием почек, или не получать такое лечение. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет врожденную аномалию почек и/или мочевыводящих путей. В некоторых вариантах осуществления субъект является человеком с врожденными аномалиями почек и мочевыводящих путей. В некоторых вариантах осуществления у субъекта проявляется, или проявлялся, один или более признаков, симптомов или других показателей связанного с органом заболевания, такого как заболевание почек, анемия или недостаточность эритропоэтин‎а (EPO). В некоторых вариантах осуществления субъект не страдает диабетом. В некоторых вариантах осуществления субъект не страдает диабетом I типа. В некоторых вариантах осуществления субъект не страдает диабетом II типа.

Врожденные аномалии почек и мочевыводящих путей (CAKUT) включают семейство заболеваний различного анатомического спектра, включая аномалии почек, а также аномалии мочевого пузыря и уретры. В некоторых вариантах осуществления термин «CAKUT» относится к одной врожденной аномалии (например, при упоминании субъекта, который имеет CAKUT). В некоторых вариантах осуществления термин CAKUT относится к более чем одной врожденной аномалии (например, при упоминании субъекта, который имеет CAKUT). В некоторых вариантах осуществления субъект с CAKUT имеет одну или более аномалий почек, мочевого пузыря и/или уретры. В некоторых вариантах осуществления субъект с CAKUT имеет аномалию в одной или двух почках. В некоторых вариантах осуществления субъект с CAKUT имеет аномалию в уретре. В некоторых вариантах осуществления CAKUT возникли в результате генетической мутации или аномалии. В некоторых вариантах осуществления CAKUT возникли в результате воздействия фактора окружающей среды. В некоторых вариантах осуществления субъект с CAKUT имеет аномалию в мочевом пузыре. Неограничивающие примеры, относящиеся к CAKUT, приведены в Ristoska-Bojkovska (2017) Pril (Makedon Akad Nauk Umet Odd Med Nauki) 38(1):59-62; и Rodriguez (2014) Fetal Pediatr Pathol. 33(5-6):293-320, полное содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления субъект, имеющий CAKUT, не страдает диабетом. В некоторых вариантах осуществления субъект, имеющий CAKUT, не страдает диабетом I типа. В некоторых вариантах осуществления субъект, имеющий CAKUT, не страдает диабетом II типа.

CAKUT составляют примерно 20-30 процентов всех аномалий, выявленных в пренатальном периоде. Смотри публикацию Queisser-Luft et al. (2002) Malformations in newborn: results based on 30,940 infants and fetuses from the Mainz congenital birth defect monitoring system (1990-1998). Spranger J Arch Gynecol Obstet. 2002;266(3):163, полное содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления дефекты могут быть двусторонними или односторонними, и различные дефекты часто сосуществуют у отдельного ребенка.

В некоторых вариантах осуществления CAKUT включают широкий спектр заболеваний, которые являются результатом аномального эмбриогенного развития почек вследствие пороков развития почечной паренхимы, аномалий почечной миграции или аномалий в развивающейся системе сбора мочи. В некоторых вариантах осуществления CAKUT включают широкий спектр заболеваний и являются результатом аномальных процессов развития почек. В некоторых вариантах осуществления порок развития почечной паренхимы приводит к нарушению нормального развития нефрона, как это наблюдается при дисплазии почек, ревматоидном артрите (РА), дисгенезии почечных канальцев и некоторых типах нефронофтиза. Без связи с какой-либо научной теорией, исследования с использованием молекулярной генетики показали, что почечные пороки развития возникают из-за дефектов в генах, кодирующих сигнальные и транскрипционные факторы. В некоторых вариантах осуществления факторы окружающей среды, такие как пренатальное воздействие тератогенов, также могут нарушать морфогенез почек, что приводит к CAKUT. В некоторых вариантах осуществления аномалии включают аномальную эмбриональную миграцию почек, наблюдаемую при эктопии почек (например, тазовая почка), и аномалии слияния, такие как подковообразная почка. В некоторых вариантах осуществления аномалии развивающейся системы сбора мочи, проявляющиеся в дублировании систем сбора, задних уретральных клапанах и обструкции мочеточниково-тазового соединения, могут приводить к ХЗП/ТСЗП. Дисплазия почек может быть односторонней или двусторонней и встречается у двух-четырех детей на 1000 новорожденных. Соотношение мужчин и женщин с двусторонней дисплазией почек составляет 1,3:1, а с односторонней дисплазией - 1,9:1.

Поскольку CAKUT являются причиной 30-50 процентов случаев терминальной стадии заболевания почек (ТСЗП) у детей (Seikaly et al. 2003 Chronic renal insufficiency in children: the 2001 Annual Report Pediatr Nephrol. 18(8):796), в некоторых вариантах осуществления важно диагностировать эти аномалии и начинать терапию для минимизации повреждения почек, предотвращения или отсрочки развития ТСЗП, а также обеспечения поддерживающей терапии во избежание осложнений ТСЗП. Пациенты с пороками развития, сопровождающимися уменьшением количества или размера почек, чаще всего имеют плохой прогноз для почек (Sanna-Cherchi et al. 2009 Renal outcome in patients with congenital anomalies of the kidney and urinary tract. Kidney Int. 76(5):528). В некоторых вариантах осуществления к 30 годам большинство пациентов будут нуждаться в диализе.

Риск возникновения необходимости в диализе значительно выше для пациентов с единственной почкой или с гиподисплазией почек, связанной с задними уретральными клапанами, в сравнении с пациентами с односторонней или двусторонней почечной гиподисплазией, мультикистозной или подковообразной почкой. В некоторых вариантах осуществления субклинические дефекты единственной почки могут быть причиной более плохого прогноза в сравнении с более доброкачественными формами CAKUT. В некоторых вариантах осуществления, и без ограничения какой-либо научной теорией, дети с единственной почкой подвержены риску развития длительного ХЗП, которое, как считается, обусловлено гломерулярной гиперфильтрацией. В некоторых вариантах осуществления примерно у одной трети пациентов могут иметься признаки повреждения почек, определяемые как протеинурия (например, отношение белка в моче к креатинину >0,2 мг/мг [>22,6 мг/ммоль у детей старше двух лет]), гипертензия (например, артериальное давление ≥95-го процентиля для возраста, пола и роста), повышенный расчетный клиренс креатинина на основании сывороточного содержания креатина и уравнения Шварца, или использование лекарств для защиты почек (например, ингибиторов ангиотензинпревращающего фермента).

В некоторых вариантах осуществления дисплазия почек может быть обнаружена во время обычного антенатального скрининга или постнатально при проведении ультразвукового исследования почек у младенца с дисморфией. В некоторых вариантах осуществления двусторонняя дисплазия, по всей вероятности, будет диагностирована раньше, чем односторонняя дисплазия, особенно при наличии олигогидрамниоза. В некоторых вариантах осуществления ультразвуковые особенности почек включают повышенную эхогенность в результате аномальной почечной паренхимы, слабую кортикомедуллярную дифференциацию и паренхиматозные кисты.

В некоторых вариантах осуществления у младенцев с двусторонней дисплазией функция почек может быть нарушена при рождении, а впоследствии может развиваться прогрессирующая почечная недостаточность. В некоторых вариантах осуществления сопутствующие урологические проблемы включают аномалии почечной лоханки, чашек (например, врожденный гидронефроз) и мочеточников, например, дублирующий мегауретер системы сбора мочи, стеноз мочеточника и пузырно-мочеточниковый рефлюкс [ПМР]. В некоторых вариантах осуществления в результате может возникнуть симптоматика из-за осложнений, связанных с этими урологическими аномалиями, включая инфекцию мочевыводящих путей (ИМП), гематурию, лихорадку и боль в животе.

В некоторых вариантах осуществления из-за частой связи дисплазии почек с аномалией системы сбора мочи может быть рассмотрено применение цистоуретрографии во время мочеиспускания для пациентов с дисплазией почек с наличием или отсутствием ИМП. В некоторых вариантах осуществления при наличии сопутствующей урологической аномалии, такой как ПМР, в нормальной контралатеральной почке у детей с односторонней дисплазией почек может быть повышен риск долгосрочных последствий рубцевания почек в результате рецидивов ИМП. В некоторых вариантах осуществления радионуклидное сканирование с DMSA может дать дополнительную информацию о дифференциальной функции каждой почки. В некоторых вариантах осуществления мультикистозная диспластическая почка (МКДП), как правило, не имеет жизнеспособной функциональной почечной ткани и, вследствие этого, отсутствует почечный кровоток или почечная функция. Однако в некоторых вариантах осуществления изобретения могут встречаться редкие варианты сегментарной дисплазии. В некоторых вариантах осуществления исследования с визуализацией могут быть полезны для определения исходного уровня функции почек и риска будущего повреждения почек, а также способности к регенерации нормально функционирующей почечной паренхимы.

Термин «образец», или «образец от пациента», или «биологический образец», должен, в целом, означать любой биологический образец, полученный от субъекта или пациента, жидкость организма, ткань тела, линию клеток, культуру ткани или другой источник. Термин включает биопсийные образцы ткани, такие как, например, биопсийные образцы почки. Термин включает культивированные клетки, такие как, например, культивированные клетки почки млекопитающего. Методы получения биопсийных образцов тканей и культивированных клеток от млекопитающих хорошо известны в данной области. В некоторых вариантах осуществления образец может быть получен из разных источников в организме субъекта-млекопитающего, включая, без ограничения, кровь, сперму, сыворотку, мочу, костный мозг, слизистую оболочку, ткань и так далее.

Термин «контрольный образец» означает отрицательный или положительный контрольный образец, для которого ожидают отрицательный или положительный результат, который можно сопоставлять с результатом тестируемого образца. В некоторых вариантах осуществления соответствующий контрольный образец включает, без ограничения, образец, который, как известно, обладает признаками, характерными для нормальной функции почек, образец, полученный от субъекта, который, как известно, не страдает заболеванием почек, и образец, полученный от субъекта, который, как известно, страдает заболеванием почек. В некоторых вариантах осуществления контрольный образец может представлять собой образец, полученный от субъекта до лечения его способом по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления контрольный образец может представлять собой тестируемый образец, полученный от субъекта, который, как известно, страдает заболеванием почек любого типа или стадии, а также образец от субъекта, который, как известно, не страдает заболеванием почек какого-либо типа или стадии. В некоторых вариантах осуществления контрольный образец может представлять собой специально подобранный образец от нормального здорового субъекта. Специалистам в данной области известны и другие контрольные образцы, подходящие для использования по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение относится, в частности, к способам и композициям для лечения хронического заболевания почек у субъектов с аномалией почек и/или мочевыводящих путей (например, субъектов, имеющих CAKUT).

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания почек у субъекта, имеющего хроническое заболевание почек, включающему, состоящему в основном из, или состоящему из введения субъекту эффективного количества (i) популяции биоактивных почечных клеток; (ii) везикул, секретируемых популяцией почечных клеток; и/или (iii) сфероидов, содержащих популяцию почечных клеток и по меньшей мере одну популяцию не почечных клеток, где субъект имеет аномалию почек и/или мочевыводящих путей. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет аномалию почек.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания почек у субъекта, который имеет аномалию почек и/или мочевыводящих путей, включающему, состоящему в основном из, или состоящему из введения субъекту эффективного количества (i) популяции биоактивных почечных клеток; (ii) одного или более продуктов, секретируемых популяцией почечных клеток; и/или (iii) сфероидов, содержащих популяцию почечных клеток и по меньшей мере одну популяцию других клеток.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания почек у субъекта, который имеет аномалию почек и/или мочевыводящих путей, включающему введение субъекту эффективного количества (i) популяции биоактивных почечных клеток; (ii) одного или более продуктов (таких как везикулы), секретируемых популяцией почечных клеток; и/или (iii) сфероидов, содержащих популяцию почечных клеток и по меньшей мере одну популяцию других клеток, такую как популяция не почечных клеток.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания почек у субъекта, который имеет аномалию почек и/или мочевыводящих путей, включающему введение субъекту эффективного количества (i) популяции биоактивных почечных клеток; (ii) везикул, секретируемых популяцией почечных клеток; или (iii) сфероидов, содержащих популяцию почечных клеток и по меньшей мере одну популяцию не почечных клеток.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания почек у субъекта, который имеет аномалию почек и/или мочевыводящих путей, включающему введение субъекту эффективного количества (i) популяции биоактивных почечных клеток; (ii) везикул, секретируемых популяцией почечных клеток; и (iii) сфероидов, содержащих популяцию почечных клеток и по меньшей мере одну популяцию не почечных клеток.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания почек у субъекта, который имеет аномалию почек и/или мочевыводящих путей, включающему введение субъекту эффективного количества композиции, содержащей популяцию биоактивных почечных клеток. В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит везикулы, секретируемые популяцией почечных клеток. В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит сфероиды, содержащие популяцию почечных клеток и по меньшей мере одну популяцию не почечных клеток.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания почек у субъекта, который имеет аномалию почек и/или мочевыводящих путей, включающему введение субъекту эффективного количества везикул, секретируемых популяцией почечных клеток.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания почек у субъекта, который имеет аномалию почек и/или мочевыводящих путей, включающему введение субъекту эффективного количества сфероидов, содержащих популяцию почечных клеток и по меньшей мере одну популяцию не почечных клеток.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к популяции биоактивных почечных клеток и их применению для лечения заболевания почек у субъекта, который имеет аномалию почек и/или мочевыводящих путей.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к продуктам (таким как везикулы), секретируемым популяцией биоактивных почечных клеток, и их применению для лечения заболевания почек у субъекта, который имеет аномалию почек и/или мочевыводящих путей.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к сфероидам, содержащим популяцию биоактивных почечных клеток, и их применению для лечения заболевания почек у субъекта, который имеет аномалию почек и/или мочевыводящих путей.

В некоторых вариантах осуществления субъект имеет аномалию мочевыводящих путей. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет аномалию почек и мочевыводящих путей. В некоторых вариантах осуществления аномалия приобретена до рождения. В некоторых вариантах осуществления аномалия приобретена после рождения. В некоторых вариантах осуществления аномалия представляет собой врожденную аномалию. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет врожденную аномалию почек. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет врожденную аномалию мочевыводящих путей. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет врожденную аномалию почек и мочевыводящих путей. В некоторых вариантах осуществления врожденная аномалия ухудшается или приводит к дополнительным аномалиям после рождения. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет аномалию в одной почке. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет одну или более аномалий в каждой почке. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет аномалию в мочевыводящих путях, где аномалия находится в уретре. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет аномалию в мочевыводящих путях, где аномалия находится в мочевом пузыре. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет аномалию в мочевыводящих путях, где аномалия находится в уретре. В некоторых вариантах осуществления аномалия присутствует при рождении, но не проявляется или проявляет симптомы только после рождения.

В некоторых вариантах осуществления заболевание почек представляет собой ХЗП. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет ХЗП в результате аномалий (например, врожденных) почек и мочевыводящих путей.

В некоторых вариантах осуществления аномалия представляет собой врожденную аномалию. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет CAKUT.

В некоторых вариантах осуществления аномалия представляет собой морфологическую аномалию. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет аномально развитую почку.

В некоторых вариантах осуществления субъект имеет, или имел, первичный пузырно-мочеточниковый рефлюкс, рефлюксную нефропатию, почечную рубцовую деформацию или гиподисплазию почек. В некоторых вариантах осуществления у субъекта есть или была рефлюксная нефропатия. В вариантах осуществления изобретения субъект имеет или имел почечный рубец. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет или имел гиподисплазию почек.

В некоторых вариантах осуществления субъект имеет предрасположенность к инфекциям мочевыводящих путей. В некоторых вариантах осуществления субъект имел по меньшей мере примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 инфекций мочевыводящих путей.

В некоторых вариантах осуществления субъект имеет гипертензию или протеинурию.

В некоторых вариантах осуществления субъект перенес антирефлюксную операцию.

В некоторых вариантах осуществления субъект имеет скорость клубочковой фильтрации (СКФ) менее 90 мл/мин/1,73 м², микроальбуминурию или макроальбуминурию. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет СКФ менее 80 мл/мин/1,73 м². В некоторых вариантах осуществления субъект имеет СКФ менее 70 мл/мин/1,73 м². В некоторых вариантах осуществления субъект имеет СКФ менее 60 мл/мин/1,73 м². В некоторых вариантах осуществления субъект имеет СКФ менее 50 мл/мин/1,73 м². В некоторых вариантах осуществления субъект имеет СКФ менее 40 мл/мин/1,73 м². В некоторых вариантах осуществления субъект имеет СКФ менее 30 мл/мин/1,73 м². В некоторых вариантах осуществления субъект имеет СКФ по меньшей мере 10 мл/мин/1,73 м². В некоторых вариантах осуществления субъект имеет СКФ по меньшей мере 15 мл/мин/1,73 м². В некоторых вариантах осуществления субъект имеет СКФ по меньшей мере 20 мл/мин/1,73 м². В некоторых вариантах осуществления субъект имеет СКФ по меньшей мере 30 мл/мин/1,73 м². В некоторых вариантах осуществления субъект имеет СКФ от 10, 15, 20, 25 или 30 мл/мин/1,73 м² до 50, 60, 70, 80 или 90 мл/мин/1,73 м². В некоторых вариантах осуществления СКФ представляет собой расчетную СКФ (рСКФ). В некоторых вариантах осуществления субъект имеет микроальбуминурию. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет макроальбуминурию.

В некоторых вариантах осуществления субъект имеет возраст менее 18 лет. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет возраст менее 60 лет. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет возраст менее 50 лет. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет возраст менее 40 лет. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет возраст менее 35 лет. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет возраст менее 30 лет. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет возраст менее 25 лет. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет возраст менее 20 лет. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет возраст от 1 до 16 лет. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет возраст от 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 до 20, 25, 30, 35 или 40 лет.

В некоторых вариантах осуществления субъект имеет возраст от 20, 25, 30, 35 или 40 до 50, 55, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 лет. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет возраст по меньшей мере 50 лет. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет возраст по меньшей мере 55 лет. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет возраст по меньшей мере 60 лет. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет возраст по меньшей мере 65 лет. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет возраст по меньшей мере 70 лет.

В некоторых вариантах осуществления субъект имеет порок развития почечной паренхимы.

В некоторых вариантах осуществления субъект имеет удвоение мочеточника, обструкцию мочеточнико-тазового соединения, агенезию почки, пузырно-мочеточниковый рефлюкс, дисплазию почек, гипоплазию почек, гиподисплазию почек, врожденный гидронефроз, подковообразную почку, задний уретральный клапан и синдром отвислого живота, обструктивную дисплазию почек или синдром неподвижных ресничек.

В некоторых вариантах осуществления аномалия вызвана или коррелирует с генетическим фактором. В некоторых вариантах осуществления CAKUT вызваны или коррелируют с генетическим фактором. В некоторых вариантах осуществления аномалия вызвана или коррелирует с не генетическим фактором. В некоторых вариантах осуществления CAKUT вызваны или коррелируют с не генетическим фактором. В некоторых вариантах осуществления не генетический фактор представляет собой фактор окружающей среды.

В некоторых вариантах осуществления субъект имеет удвоение мочеточника, обструкцию мочеточнико-тазового соединения, агенезию почки, пузырно-мочеточниковый рефлюкс, гиподисплазию почек, врожденный гидронефроз, подковообразную почку, задний уретральный клапан и синдром отвислого живота, обструктивную дисплазию почек или синдром неподвижных ресничек. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет удвоение мочеточника. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет обструкцию мочеточнико-тазового соединения. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет агенезию почки. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет пузырно-мочеточниковый рефлюкс. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет гиподисплазию почек. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет врожденный гидронефроз. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет подковообразную почку. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет задний уретральный клапан и синдром отвислого живота. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет обструктивную дисплазию почек. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет синдром неподвижных ресничек. В некоторых вариантах осуществления CAKUT вызваны или коррелируют с генетическим фактором.

В некоторых вариантах осуществления аномалия включает синдром Алажиля, синдром Аперта, синдром Барде-Бидля, синдром Беквита-Видемана, бранхио-ото-ренальный синдром (БОР), кампомелическую дисплазию, синдром Ценани-Ленца, синдром Ди Джорджа, синдром Фрейзера, гипопаратиреоз, сенсоневральную глухоту и аномалии почек (HDR), синдром Каллмана, синдром Маммари-Ульнара, синдром Меккеля-Грубера, нефронофтиз, синдром Окихиро, синдром Паллистера-Холла, колобома-ренальный синдром, гипоплазию, дисплазию, дисплазию почек, кистозную дисплазию, некистозную дисплазию, ПМР кистозную дисплазию, гипоплазию почек, изолированную кистозную гипоплазию почек, изолированную некистозную гипоплазию почек, изолированную почечную тубулярную дискенезию, синдром Рубинштейна-Тейби, синдром Симпсона-Голаби-Бехмеля, синдром Таунса-Брока, синдром Зеллвегера, синдром Смита-Лемли-Опица, гидронефроз, медуллярную дисплазию, одностороннюю/двустороннюю агенезию/дисплазию, аномалии системы сбора мочи, агенезию, обструкцию мочеточниково-тазового соединения (ОМТС) агенезию, дисплазию агенезию, одностороннюю агенезию, ПМР, мальротацию, поперечную эктопию, ПМР дисплазию, двойную мутацию серин/треониновой и тирозиновой протеинкиназы (DSTYK), мутацию DSTYK, связанную с ОМТС, тубулярный дисгенез, кисты и/или аплазию.

В некоторых вариантах осуществления заболевание почек представляет собой хроническое заболевание почек. В некоторых вариантах осуществления хроническое заболевание почек представляет собой заболевание почек I, II, III, IV или V стадии. В некоторых вариантах осуществления хроническое заболевание почек представляет собой заболевание почек I стадии. В некоторых вариантах осуществления хроническое заболевание почек представляет собой заболевание почек II стадии. В некоторых вариантах осуществления хроническое заболевание почек представляет собой заболевание почек III стадии. В некоторых вариантах осуществления хроническое заболевание почек представляет собой заболевание почек IV стадии. В некоторых вариантах осуществления хроническое заболевание почек представляет собой заболевание почек V стадии. В некоторых вариантах осуществления субъект получает диализ по меньшей мере 1, 2 или 3 раза в неделю.

В некоторых вариантах осуществления популяцию биоактивных почечных клеток вводят в естественный орган в виде части препарата, описанного в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления секретируемый продукт популяции биоактивных почечных клеток вводят в естественный орган в виде части препарата, описанного в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления клетки получают из естественного органа, в который производят введение, или из источника, который не является целевым естественным органом.

В некоторых вариантах осуществления популяция почечных клеток имеет форму сфероидов. В некоторых вариантах осуществления сфероиды, содержащие биоактивные почечные клетки, вводят субъекту. В некоторых вариантах осуществления сфероиды содержат по меньшей мере один тип, или популяцию, не почечных клеток.

В некоторых вариантах осуществления субъект имеет заболевание почек, о чем свидетельствует микроальбуминурия, которую можно определять на основании отношения альбумин/креатинин в моче (UACR), составляющего ≥30 мг/г, или экскреции альбумина с мочой, составляющей ≥30 мг/сутки при сборе мочи в течение 24 часов.

В некоторых вариантах осуществления почечная функция пациента улучшается в результате лечения. Улучшение почечной функции пациента может представлять собой стабилизацию почечной функции пациента, или может представлять собой изменение почечной функции, которое улучшает почечную функцию. В некоторых вариантах осуществления улучшение почечной функции проявляется в виде уменьшения темпов снижения, стабилизации или увеличения расчетной скорости клубочковой фильтрации (рСКФ). В вариантах осуществления, в которых улучшение почечной функции проявляется в виде увеличения рСКФ, увеличение рСКФ может представлять собой увеличение на по меньшей мере 1%, по меньшей мере 2%, по меньшей мере 3%, по меньшей мере 4%, по меньшей мере 5%, по меньшей мере 6%, по меньшей мере 7%, по меньшей мере 8%, по меньшей мере 9%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, или по меньшей мере 25% относительно исходной рСКФ пациента. В таких вариантах осуществления исходная рСКФ пациента может представлять собой рСКФ пациента до введения первой дозы препарата, например, может представлять собой рСКФ пациента, определяемую не более чем за 3 месяца, 2 месяца, 1 месяц, 3 недели, 2 недели, 10 дней, 7 дней, 6 дней, 5 дней, 4 дня, 3 дня, 2 дня или 1 день до введения первой дозы препарата. Увеличение исходной рСКФ пациента может быть достигнуто в течение 1-6 месяцев или 2-6 месяцев, или 3-6 месяцев, или 4-6 месяцев, или 5-6 месяцев, или 1-5 месяцев, или 1-4 месяцев, или 1-3 месяцев, или 2-5 месяцев, или 2-4 месяцев, или 3-4 месяцев, или 2-3 месяцев, или 2 месяцев, или 3 месяцев, или 4 месяцев, или 5 месяцев или 6 месяцев после введения первой дозы препарата. Увеличение относительно исходной рСКФ пациента не обязательно должно быть на постоянном уровне или до постоянной степени, то есть, у пациента не обязательно должен сохраняться тот же начальный уровень увеличения от исходного значения в результате лечения для «улучшения» почечной функции. Увеличение исходной рСКФ пациента, однажды достигнутое, может снижаться, при условии, однако, что рСКФ пациента продолжает быть увеличенной относительно исходной рСКФ пациента. Увеличение исходной рСКФ пациента, однажды достигнутое, может также дополнительно увеличиваться или может оставаться на том же уровне увеличения относительно исходного значения, что и начальный уровень увеличения относительно исходного значения. Увеличение рСКФ пациента относительно исходного значения может сохраняться в течение по меньшей мере 12 месяцев, 12 месяцев, по меньшей мере 18 месяцев, 18 месяцев, по меньшей мере 24 месяцев, 24 месяцев, по меньшей мере 30 месяцев, 30 месяцев, по меньшей мере 36 месяцев, 36 месяцев, по меньшей мере 42 месяцев, 42 месяцев, по меньшей мере 48 месяцев, 48 месяцев, по меньшей мере 54 месяцев, 54 месяцев, по меньшей мере 60 месяцев, 60 месяцев, по меньшей мере 66 месяцев, 66 месяцев, по меньшей мере 72 месяцев, 72 месяцев, по меньшей мере 78 месяцев, 78 месяцев, или до конца жизни пациента.

В некоторых вариантах осуществления улучшение почечной функции проявляется в виде уменьшения отношения альбумин/креатинин (ACR) у пациента. В вариантах осуществления, в которых улучшение почечной функции проявляется в виде уменьшения ACR у пациента, уменьшение может быть на по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70% или по меньшей мере 80%, или по меньшей мере 90% относительно исходного значения ACR пациента. Альтернативно, уменьшение ACR может быть таким, что, если исходное значение ACR пациента умеренно увеличено, например, от 30 мг/г до 300 мг/г, тогда уменьшение ACR может представлять собой уменьшение ACR пациента до уровня в диапазоне от слабого до нормального, например, менее 30 мг/г. Альтернативно, уменьшение ACR может быть таким, что, если исходное значение ACR пациента сильно увеличено, например, более 300 мг/г, тогда уменьшение ACR может представлять собой уменьшение ACR пациента до уровней, которые умеренно увеличены, например, от 30 мг/г до 300 мг/г, или слабо увеличены относительно нормальных, например, менее 30 мг/г. В таких вариантах осуществления исходное значение ACR пациента может представлять собой ACR пациента до введения первой дозы препарата, например, может представлять собой ACR пациента, определяемую не более чем за 3 месяца, 2 месяца, 1 месяц, 3 недели, 2 недели, 10 дней, 7 дней, 6 дней, 5 дней, 4 дня, 3 дня, 2 дня или 1 день до введения первой дозы препарата. Уменьшение исходного значения ACR пациента может быть достигнуто в течение 1-6 месяцев или 2-6 месяцев, или 3-6 месяцев, или 4-6 месяцев, или 5-6 месяцев, или 1-5 месяцев, или 1-4 месяцев, или 1-3 месяцев, или 2-5 месяцев, или 2-4 месяцев, или 3-4 месяцев, или 2-3 месяцев, или 2 месяцев, или 3 месяцев, или 4 месяцев, или 5 месяцев, или 6 месяцев после введения первой дозы препарата. Уменьшение исходного значения ACR пациента не обязательно должно быть на постоянном уровне или до постоянной степени, то есть, у пациента не обязательно должен сохраняться тот же начальный уровень уменьшения от исходного значения в результате лечения для «улучшения» почечной функции. Уменьшение исходного значения ACR пациента, однажды достигнутое, может увеличиваться, при условии, однако, что ACR пациента продолжает быть уменьшенным относительно исходного значения ACR пациента. Уменьшение исходного значения ACR пациента, однажды достигнутое, может также дополнительно уменьшаться или может оставаться на том же уровне уменьшения относительно исходного значения, что и начальный уровень уменьшения относительно исходного значения. Уменьшение ACR пациента относительно исходного значения может сохраняться в течение по меньшей мере 12 месяцев, 12 месяцев, по меньшей мере 18 месяцев, 18 месяцев, по меньшей мере 24 месяцев, 24 месяцев, по меньшей мере 30 месяцев, 30 месяцев, по меньшей мере 36 месяцев, 36 месяцев, по меньшей мере 42 месяцев, 42 месяцев, по меньшей мере 48 месяцев, 48 месяцев, по меньшей мере 54 месяцев, 54 месяцев, по меньшей мере 60 месяцев, 60 месяцев, по меньшей мере 66 месяцев, 66 месяцев, по меньшей мере 72 месяцев, 72 месяцев, по меньшей мере 78 месяцев, 78 месяцев, или до конца жизни пациента.

В некоторых вариантах осуществления улучшение почечной функции проявляется в виде снижения общего сывороточного уровня креатинина или темпов повышения сывороточного уровня креатинина (сКр), или сопоставимого показателя (например, цистатина C, инулина или других показателей клубочковой фильтрации). В некоторых вариантах осуществления улучшение почечной функции проявляется в виде увеличения толщины коркового слоя почек. В некоторых вариантах осуществления улучшение почечной функции может проявляться в структурных и функциональных изменениях. В некоторых вариантах осуществления улучшение размера и/или структуры почек определяют на основании визуализации почек. В некоторых вариантах осуществления способ визуализации почек представляет собой ультразвуковую визуализацию, МРТ или сцинтиграфию почек. В некоторых вариантах осуществления улучшенная почечная функция превосходит прежнее состояние почечной структуры или функции.

В некоторых вариантах осуществления об эффективности лечения заболевания почек у субъекта способами по настоящему изобретению можно судить на основании различных показателей почечной функции. В некоторых вариантах осуществления показатели почечной функции включают, без ограничения, уровень сывороточного альбумина, отношение альбумина и глобулина (отношение A/G), уровень сывороточного фосфора, уровень сывороточного натрия, размер почки (определяемый при помощи ультразвука), уровень сывороточного кальция, отношение фосфор:кальций, уровень сывороточного калия, протеинурию, уровень креатинина в моче, уровень сывороточного креатинина, уровень азота мочевины крови (АМК), уровень холестерина, уровни триглицеридов и скорость клубочковой фильтрации (СКФ). В некоторых вариантах осуществления некоторые показатели общего состояния здоровья и самочувствия включают, без ограничения, увеличение и снижение массы тела, показатель выживаемости, кровяное давление (среднее системное кровяное давление, диастолическое кровяное давление или систолическое кровяное давление) и физическую выносливость.

В некоторых вариантах осуществления на эффективность лечения препаратом биоактивных почечных клеток указывает стабилизация одного или более показателей почечной функции. В некоторых вариантах осуществления о стабилизации почечной функции можно судить на основании изменения какого-либо показателя у субъекта, получающего лечение способом по настоящему изобретению, в сравнении с тем же показателем у субъекта, который не получал лечение способом по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления о стабилизации почечной функции можно судить на основании изменения какого-либо показателя у субъекта, получающего лечение способом по настоящему изобретению, в сравнении с тем же показателем у того же субъекта до начала лечения. В некоторых вариантах осуществления изменение первого показателя может представлять собой увеличение или уменьшение значения. В некоторых вариантах осуществления лечение, предложенное по настоящему изобретению, может включать стабилизацию уровней азота мочевины крови (АМК) у субъекта, при этом уровни АМК, наблюдаемые у субъекта, являются более низкими в сравнении с уровнями у субъекта с аналогичным состоянием заболевания, который не получал лечение способами по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления лечение может включать стабилизацию уровней сывороточного креатинина у субъекта, при этом уровни сывороточного креатинина, наблюдаемые у субъекта, являются более низкими в сравнении с уровнями у субъекта с аналогичным состоянием заболевания, который не получал лечение способами по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления стабилизация одного или более из вышеописанных показателей почечной функции является результатом лечения препаратом селективных почечных клеток.

Специалисты в данной области понимают, что один или более дополнительных показателей, описанных в настоящем документе или известных в данной области, можно измерять для определения эффективности лечения заболевания почек у субъекта.

В некоторых вариантах осуществления на эффективное лечение препаратом биоактивных почечных клеток указывает улучшение одного или более показателей почечной функции. В некоторых вариантах осуществления популяция биоактивных почечных клеток приводит к улучшению уровня сывороточного креатинина. В некоторых вариантах осуществления популяция биоактивных почечных клеток приводит к улучшению удержания белка в сыворотке. В некоторых вариантах осуществления популяция биоактивных почечных клеток приводит к улучшению уровней сывороточного холестерина и/или триглицеридов. В некоторых вариантах осуществления популяция биоактивных почечных клеток приводит к улучшению уровня витамина D. В некоторых вариантах осуществления популяция биоактивных почечных клеток приводит к улучшению отношения фосфор:кальций в сравнении с необогащенной популяцией клеток. В некоторых вариантах осуществления популяция биоактивных почечных клеток приводит к улучшению уровня гемоглобина в сравнении с необогащенной популяцией клеток. В некоторых вариантах осуществления популяция биоактивных почечных клеток приводит к улучшению уровня сывороточного креатинина в сравнении с необогащенной популяцией клеток. В некоторых вариантах осуществления улучшение одного или более из вышеописанных показателей почечной функции является результатом лечения препаратом селективных почечных клеток.

Настоящее изобретение относится к способам регенерации естественной почки у субъекта, который нуждается в этом. В некоторых вариантах осуществления способ включает этап введения или имплантации субъекту популяции биоактивных клеток, препарата или конструкции, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления регенерированная естественная почка может быть охарактеризована рядом показателей, включая, без ограничения, развитие функции, или способности, в естественной почке, улучшение функции, или способности, в естественной почке и экспрессию определенных маркеров в естественной почке. В некоторых вариантах осуществления о развитии или улучшении функции, или способности, можно судить на основании различных показателей почечной функции, описанных выше. В некоторых вариантах осуществления регенерированная почка характеризуется дифференциальной экспрессией одного или более маркеров стволовых клеток. В некоторых вариантах осуществления маркер стволовых клеток может являться одним или более из следующего: SRY (определяющая пол область Y)-бокс 2 (Sox2); фактор транскрипции недифференцированных эмбриональных клеток (UTF1); мышиный лимфоузелковый гомолог (NODAL); проминин 1 (PROM1) или CD133 (CD133); CD24; а также любое их сочетание (смотри Ilagan et al. PCT/US2011/036347, полное содержание заявки включено в настоящий документ посредством ссылки), смотри также публикацию Genheimer et al., 2012. Molecular characterization of the regenerative response induced by intrarenal transplantation of selected renal cells in a rodent model of chronic kidney disease. Cells Tissue Organs 196: 374-384, включенную в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме. В некоторых вариантах осуществления экспрессия маркера(ов) стволовых клеток повышена в сравнении с контролем.

В некоторых вариантах осуществления эффект может быть обеспечен самими клетками и/или продуктами, секретируемыми из клеток. В некоторых вариантах осуществления субъекту вводят продукт, секретируемый из клеток. В некоторых вариантах осуществления продукт был выделен из клеток, например, клеток, которые продуцируют его. В некоторых вариантах осуществления продукт представляет собой везикулу, описанную в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления везикула (например, экзосома) была выделена из популяции почечных клеток, которые продуцируют ее. В некоторых вариантах осуществления везикулы могут включать одно или более из следующего: паракринные факторы, эндокринные факторы, юкстакринные факторы, микровезикулы, экзосомы и РНК. Секретируемые продукты также могут включать продукты, которые не находятся в микровезикулах, включая, без ограничения, паракринные факторы, эндокринные факторы, юкстакринные факторы и РНК. В некоторых вариантах осуществления секретируемые продукты могут быть частью везикулы, полученной из почечных клеток. В некоторых вариантах осуществления везикулы представляют собой секретируемые везикулы. В некоторых вариантах осуществления секретируемые везикулы представляют собой экзосомы, микровезикулы, эктосомы, мембранные частицы, экзосома-подобные везикулы или апоптотические везикулы. В некоторых вариантах осуществления секретируемые везикулы представляют собой экзосомы. В некоторых вариантах осуществления секретируемые везикулы представляют собой микровезикулы. В некоторых вариантах осуществления секретируемые везикулы содержат, или представляют собой, один или более клеточных компонентов. В некоторых вариантах осуществления компоненты могут представлять собой одно или более из следующего: мембранные липиды, РНК, белки, метаболиты, цитозольные компоненты, а также любое их сочетание. В некоторых вариантах осуществления секретируемые везикулы содержат одну или более микроРНК. В некоторых вариантах осуществления одна или более микроРНК включают одну из, или любое сочетание, молекул РНК (например, микроРНК), раскрытых в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления везикулы содержат микроРНК, которая ингибирует ингибитор активации плазминогена 1 типа (PAI-1) и/или TGFβ1. В некоторых вариантах осуществления секретируемый продукт представляет собой паракринный и/или юкстакринный фактор, такой как альфа-1-микроглобулин, бета-2-микроглобулин, кальбиндин, кластерин, фактор роста соединительной ткани, цистатин-C, глутатион-S-трансфераза альфа, молекула повреждения почек 1, желатиназа-ассоциированный липокалин нейтрофилов, остеопонтин, фактор «трилистника» 3, гликопротеин мочи Тамма-Хорсфалла, тканевый ингибитор металлопротеиназы-1, фактор роста эндотелия сосудов, фибронектин, интерлейкин-6 или моноцитарный хемотаксический протеин 1.

В некоторых вариантах осуществления эффект может быть обеспечен самими клетками и/или продуктами, секретируемыми из клеток. В некоторых вариантах осуществления регенеративный эффект может быть охарактеризован одним или более из следующих признаков: уменьшение эпителиально-мезенхимального перехода (что может происходить за счет ослабления сигнализации TGF-β); уменьшение фиброза почек; уменьшение воспаления почек; дифференциальная экспрессия маркера стволовых клеток в естественной почке; миграция имплантированных клеток и/или естественных клеток к месту повреждения почек, например, повреждения канальцев; приживление имплантированных клеток в месте повреждения почек, например, повреждения канальцев; стабилизация одного или более показателей почечной функции (как описано в настоящем документе); de novo образование S-образных телец/запятовидных телец, связанных с нефрогенезом, de novo образование почечных канальцев или нефронов, восстановление эритроидного гомеостаза (как описано в настоящем документе); а также любым их сочетанием (смотри также Basu et al., 2011. Functional evaluation of primary renal cell/biomaterial neo-kidney augment prototypes for renal tissue engineering. Cell Transplantation 20: 1771-90; Bruce et al., 2015. Selected renal cells modulate disease progression in rodent models of chronic kidney disease via NF-κB and TGF-β1 pathways. Regenerative Medicine 10: 815-839, полное содержание каждой публикации включено в настоящий документ посредством ссылки).

В некоторых вариантах осуществления в дополнение к биопсии ткани или в качестве альтернативы биопсии ткани регенеративный результат у субъекта, получающего лечение, можно оценивать на основании исследования телесной жидкости, например, мочи. Установлено, что микровезикулы, полученные из мочи субъекта, содержат определенные компоненты, включая, без ограничения, определенные белки и микроРНК, которые в конечном итоге происходят из популяций почечных клеток. В некоторых вариантах осуществления эти компоненты могут включать факторы, вовлеченные в репликацию и дифференциацию стволовых клеток, апоптоз, воспаление и иммуномодуляцию. В некоторых вариантах осуществления временной анализ паттернов экспрессии связанных с микровезикулой микроРНК/белка позволяет непрерывно контролировать регенеративные результаты в почках у субъектов, получающих популяции клеток или конструкции, описанные в настоящем документе.

Также предложены способы оценки того, отвечает ли пациент с заболеванием почек на лечение терапевтическим препаратом. В некоторых вариантах осуществления способ может включать этап определения или обнаружения количества везикул, или содержимого их просветов, в тестируемом образце, полученном от пациента с заболеванием почек, получавшего лечение терапевтическим средством, в сравнении с, или относительно количества везикул в контрольном образце, при этом большее или меньшее количество везикул, или одного или более содержимого их просветов, в тестируемом образце в сравнении с количеством везикул или содержимого их просветов в контрольном образце является показателем ответа получающего лечение пациента на лечение терапевтическим средством.

В некоторых вариантах осуществления эти происходящие из почки везикулы, и/или содержимое просветов происходящих из почки везикул, также могут попадать в мочу субъекта и могут быть проанализированы на биомаркеры, являющиеся показателем регенеративного результата или эффективности лечения. В некоторых вариантах осуществления неинвазивные прогностические способы могут включать этап получения образца мочи от субъекта до и/или после введения или имплантации популяции клеток, композиции, препарата или конструкции, описанных в настоящем документе. Везикулы и другие секретируемые продукты могут быть выделены из образцов мочи стандартными методами, включая, без ограничения, центрифугирование для удаления нежелательного детрита (Zhou et al. 2008. Kidney Int. 74(5):613-621; Skog et al., опубликованная патентная заявка США № 20110053157, содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме)

В некоторых вариантах осуществления везикулы могут включать одно или более из следующего: паракринные факторы, эндокринные факторы, юкстакринные факторы, микровезикулы, экзосомы и РНК. Секретируемые продукты также могут включать продукты, которые не находятся в микровезикулах, включая, без ограничения, паракринные факторы, эндокринные факторы, юкстакринные факторы и РНК.

В некоторых вариантах осуществления секретируемые продукты могут быть частью везикулы, полученной из почечных клеток. В некоторых вариантах осуществления везикулы представляют собой секретируемые везикулы. В некоторых вариантах осуществления секретируемые везикулы представляют собой экзосомы, микровезикулы, эктосомы, мембранные частицы, экзосома-подобные везикулы или апоптотические везикулы. В некоторых вариантах осуществления секретируемые везикулы представляют собой экзосомы. В некоторых вариантах осуществления секретируемые везикулы представляют собой микровезикулы. В некоторых вариантах осуществления секретируемые везикулы содержат, или представляют собой, один или более клеточных компонентов. В некоторых вариантах осуществления компоненты могут представлять собой одно или более из следующего: мембранные липиды, РНК, белки, метаболиты, цитозольные компоненты, а также любое их сочетание. В некоторых вариантах осуществления секретируемые везикулы содержат одну или более микроРНК. В некоторых вариантах осуществления одна или более микроРНК включают одну, или любое сочетание, из miR-30b-5p, miR-449a, miR-146a, miR-130a, miR-23b, miR-21, miR-124 и miR-151. В некоторых вариантах осуществления одна или более микроРНК включают одну, или любое сочетание, из let-7a-1; let-7a-2; let-7a-3; let-7b; let-7c; let-7d; let-7e; let-7f-1; let-7f-2; let-7 г; let-7i; mir-1-1; mir-1-2; mir-7-1; mir-7-2; mir-7-3; mir-9-1; mir-9-2; mir-9-3; mir-10a; mir-10b; mir-15a; mir-15b; mir-16-1; mir-16-2; mir-17; mir-18a; mir-18b; mir-19a; mir-19b-1; mir-19b-2; mir-20a; mir-20b; mir-21; mir-22; mir-23a; mir-23b; mir-23c; mir-24-1; mir-24-2; mir-25; mir-26a-1; mir-26a-2; mir-26b; mir-27a; mir-27b; mir-28; mir-29a; mir-29b-1; mir-29b-2; mir-29c; mir-30a; mir-30b; mir-30c-1; mir-30c-2; mir-30d; mir-30e; mir-31; mir-32; mir-33a; mir-33b; mir-34a; mir-34b; mir-34c; mir-92a-1; mir-92a-2; mir-92b; mir-93; mir-95; mir-96; mir-98; mir-99a mir-99b; mir-100; mir-101-1; mir-101-2; mir-103-1; mir-103-1-as; mir-103-2; mir-103-2-as; mir-105-1; mir-105-2; mir-106a; mir-106b; mir-107; mir-122; mir-124-1; mir-124-2; mir-124-3; mir-125a; mir-125b-1; mir-125b-2; mir-126; mir-127; mir-128-1; mir-128-2; mir-129-1; mir-129-2; mir-130a; mir-130b; mir-132; mir-132; mir-133a-1; mir-133a-2; mir-133b; mir-134; mir-135a-1; mir-135a-2; mir-135b; mir-136 MI101351120; mir-137; mir-138-1; mir-138-2; mir-139; mir-140; mir-141; mir-142; mir-143; mir-144; mir-145; mir-146a; mir-146b; mir-147; mir-147b; mir-148a; mir-148b; mir-149; mir-150; mir-151; mir-152; mir-153-1; mir-153-2; mir-154; mir-155; mir-181a-1; mir-181a-2; mir-181b-1; mir-181b-2; mir-181c; mir-181d; mir-182; mir-183; mir-184; mir-185; mir-186; mir-187; mir-188; mir-190; mir-190b; mir-191; mir-192; mir-193a; mir-193b; mir-194-1; mir-194-2; mir-195; mir-196a-1; mir-196a-2; mir-196b; mir-197; mir-198; mir-199a-1; mir-199a-2; mir-199b; mir-200a; mir-200b; mir-200c; mir-202; mir-203; mir-204; mir-205; mir-206; mir-208a; mir-208b; mir-210; mir-211; mir-212; mir-214; mir-215; mir-216a; mir-216b; mir-217; mir-218-1; mir-218-2; mir-219-1; mir-219-2; mir-221; mir-222; mir-223; mir-224; mir-296; mir-297; mir-298; mir-299; mir-300; mir-301a; mir-301b; mir-302a; mir-302b; mir-302c; mir-302d; mir-302e; mir-302f; mir-320a; mir-320b-1; mir-320b-2; mir-320c-1; mir-320c-2; mir-320d-1; mir-320d-2; mir-320e; mir-323; mir-323b; mir-324; mir-325; mir-326; mir-328; mir-329-1; mir-329-2; mir-330; mir-331; mir-335; mir-337; mir-338; mir-339; mir-340; mir-342; mir-345; mir-346; mir-361; mir-362; mir-363; mir-365-1; mir-365-2; mir-367; mir-369; mir-370; mir-37; mir-372; mir-373; mir-374a; mir-374b; mir-374c; mir-375; mir-376a-1; mir-376a-2; mir-376b; mir-376c; mir-377; mir-378; mir-378b; mir-378c; mir-379; mir-380; mir-381; mir-382; mir-383; mir-384; mir-409; mir-410; mir-411; mir-412; mir-421; mir-422a; mir-423; mir-424; mir-425; mir-429; mir-431; mir-432; mir-433; mir-448; mir-449a; mir-449b; mir-449c; mir-450a-1; mir-450a-2; mir-450b; mir-451; mir-452; mir-454; mir-455; mir-466; mir-483; mir-484; mir-485; mir-486; mir-487a; mir-487b; mir-488; mir-489; mir-490; mir-491; mir-492; mir-493; mir-494; mir-495; mir-496; mir-497; mir-498; mir-499; mir-500a; mir-500b; mir-501; mir-502; mir-503; mir-504; mir-505; mir-506; mir-507; mir-508; mir-509-1; mir-509-2; mir-509-3; mir-510; mir-511-1; mir-511-2; mir-512-1; mir-512-2; mir-513a-1; mir-513a-2; mir-513b; mir-513c; mir-514-1; mir-514-2; mir-514-3; mir-514b; mir-515-1; mir-515-2; mir-516a-1; mir-516a-2; mir-516b-1; mir-516b-2; mir-517a; mir-517b; mir-517c; mir-518a-1; mir-518a-2; mir-518b; mir-518c; mir-518d; mir-518e; mir-518f; mir-519a-1; mir-519a-2; mir-519b; mir-519c; mir-519d; mir-519e; mir-520a; mir-520b; mir-520c; mir-520d; mir-520e; mir-520f; mir-520 г; mir-520h; mir-521-1; mir-521-2; mir-522; mir-523; mir-524; mir-525; mir-526a-1; mir-526a-2; mir-526b; mir-527; mir-532; mir-539; mir-541; mir-542; mir-543; mir-544; mir-544b; mir-545; mir-548a-1; mir-548a-2; mir-548a-3; mir-548ah-1; mir-548ah-2; mir-548b; mir-548c; mir-548d-1; mir-548d-2; mir-548e; mir-548f-1; mir-548f-2; mir-548f-3; mir-548f-4; mir-548f-5; mir-548 г; mir-548h-1; mir-548h-2; mir-548h-3; mir-548h-4; mir-548i-1; mir-548i-2; mir-548i-3; mir-548i-4; mir-548j; mir-548k; mir-5481; mir-548m; mir-548n; mir-548o; mir-548p; mir-548s; mir-548t; mir-548u; mir-548v; mir-548w; mir-548x; mir-548y; mir-548z; mir-549; mir-550a-1; mir-550a-2; mir-550b-1; mir-550b-2; mir-551a; mir-551b; mir-552; mir-553; mir-554; mir-555; mir-556; mir-557; mir-558; mir-559; mir-561; mir-562; mir-563; mir-564; mir-566; mir-567; mir-568; mir-569; mir-570; mir-571; mir-572; mir-573; mir-574; mir-575; mir-576; mir-577; mir-578; mir-579; mir-580; mir-581; mir-582; mir-583; mir-584; mir-585; mir-586; mir-587; mir-588; mir-589; mir-590; mir-591; mir-592; mir-593; mir-595; mir-596; mir-597; mir-598; mir-599; mir-600; mir-601; mir-602; mir-603; mir-604; mir-605; mir-606; mir-607; mir-608; mir-609; mir-610; mir-611; mir-612; mir-613; mir-614; mir-615; mir-616; mir-617; mir-618; mir-619; mir-620; mir-621; mir-622; mir-623; mir-624; mir-625; mir-626; mir-627; mir-628; mir-629; mir-630; mir-631; mir-632; mir-633; mir-634; mir-635; mir-636; mir-637; mir-638; mir-639; mir-640; mir-641; mir-642a; mir-642b; mir-643; mir-644; mir-645; mir-646; mir-647; mir-648; mir-649; mir-650; mir-651; mir-652; mir-653; mir-654; mir-655; mir-656; mir-657; mir-658; mir-659; mir-660; mir-661; mir-662; mir-663; mir-663b; mir-664; mir-665; mir-668; mir-670; mir-671; mir-675; mir-676; mir-708; mir-711; mir-718; mir-720; mir-744; mir-758; mir-759; mir-760; mir-761; mir-762; mir-764; mir-765; mir-766; mir-767; mir-769; mir-770; mir-802; mir-873; mir-874; mir-875; mir-876; mir-877; mir-885; mir-887; mir-888; mir-889; mir-890; mir-891a; mir-891b; mir-892a; mir-892b; mir-920; mir-921; mir-922; mir-924; mir-933; mir-934; mir-935; mir-936; mir-937; mir-938; mir-939; mir-940; mir-941-1; mir-941-2; mir-941-3; mir-941-4; mir-942; mir-942; mir-943; mir-944; mir-1178; mir-1179; mir-1180; mir-1181; mir-1182; mir-1183; mir-1184-1; mir-1184-2; mir-1184-3; mir-1185-1; mir-1185-2; mir-1193; mir-1197; mir-1200; mir-1202; mir-1203; mir-1204; mir-1205; mir-1206; mir-1207; mir-1208; mir-1224; mir-1225; mir-1226; mir-1227; mir-1228; mir-1229; mir-1231; mir-1233-1; mir-1233-2; mir-1234; mir-1236; mir-1237; mir-1238; mir-1243; mir-1244-1; mir-1244-2; mir-1244-3; mir-1245; mir-1246; mir-1247; mir-1248; mir-1249; mir-1250; mir-1251; mir-1252; mir-1253; mir-1254; mir-1255a; mir-1255b-1; mir-1255b-2; mir-1256; mir-1257; mir-1258; mir-1260; mir-1260b; mir-1261; mir-1262; mir-1263; mir-1264; mir-1265; mir-1266; mir-1267; mir-1268; mir-1269; mir-1270-1; mir-1270-2; mir-1271; mir-1272; mir-1273; mir-1273c; mir-1273d; mir-1273e; mir-1274a; mir-1274b; mir-1275; mir-1276; mir-1277; mir-1278; mir-1279; mir-1280; mir-1281; mir-1282; mir-1283-1; mir-1283-2; mir-1284; mir-1285-1; mir-1285-2; mir-1286; mir-1287; mir-1288; mir-1289-1; mir-1289-2; mir-1290; mir-1291; mir-1292; mir-1293; mir-1294; mir-1295; mir-1296; mir-1297; mir-1298; mir-1299; mir-1301; mir-1302-1; mir-1302-10; mir-1302-11; mir-1302-2; mir-1302-3; mir-1302-4; mir-1302-5; mir-1302-6; mir-1302-7; mir-1302-8; mir-1302-9; mir-1303; mir-1304; mir-1305; mir-1306; mir-1307; mir-1321; mir-1322; mir-1323; mir-1324; mir-1468; mir-1469; mir-1470; mir-1471; mir-1537; mir-1538; mir-1539; mir-1825; mir-1827; mir-1908; mir-1909; mir-1910; mir-1911; mir-1912; mir-1913; mir-1914; mir-1915; mir-1972-1; mir-1972-2; mir-1973; mir-1976; mir-2052; mir-2053; mir-2054; mir-2110; mir-2113; mir-2114; mir-2115; mir-2116; mir-2117; mir-2276; mir-2277; mir-2278; mir-2355; mir-2861; mir-2909; mir-3065; mir-3074; mir-3115; mir-3116-1; mir-3116-2; mir-3117; mir-3118-1; mir-3118-2; mir-3118-3; mir-3118-4; mir-3118-5; mir-3118-6; mir-3119-1;mir-3119-2; mir-3120; mir-3121; mir-3122; mir-3123; mir-3124; mir-3125; mir-3126; mir-3127; mir-3128; mir-3129; mir-3130-1; mir-3130-2; mir-3131; mir-3132; mir-3133; mir-3134; mir-3135; mir-3136; mir-3137; mir-3138; mir-3139; mir-3140; mir-3141; mir-3142; mir-3143; mir-3144; mir-3145; mir-3146; mir-3147; mir-3148; mir-3149; mir-3150; mir-3151; mir-3152; mir-3153; mir-3154; mir-3155; mir-3156-1; mir-3156-2; mir-3156-3; mir-3157; mir-3158-1; mir-3158-2; mir-3159; mir-3160-1; mir-3160-2; mir-3161; mir-3162; mir-3163; mir-3164; mir-3165; mir-3166; mir-3167; mir-3168; mir-3169; mir-3170; mir-3171; mir-3173; mir-3174; mir-3175; mir-3176; mir-3177; mir-3178; mir-3179-1; mir-3179-2; mir-3179-3; mir-3180-1; mir-3180-2; mir-3180-3; mir-3180-4; mir-3180-5; mir-3181; mir-3182; mir-3183; mir-3184; mir-3185; mir-3186; mir-3187; mir-3188; mir-3189; mir-3190; mir-3191; mir-3192; mir-3193; mir-3194; mir-3195; mir-3196; mir-3197; mir-3198; mir-3199-1; mir-3199-2; mir-3200; mir-3201; mir-3202-1; mir-3202-2; mir-3605; mir-3606; mir-3607; mir-3609; mir-3610; mir-3611; mir-3612; mir-3613; mir-3614; mir-3615; mir-3616; mir-3617; mir-3618; mir-3619; mir-3620; mir-3621; mir-3622a; mir-3622b; mir-3646; mir-3647; mir-3648; mir-3649; mir-3650; mir-3651; mir-3652; mir-3653; mir-3654; mir-3655; mir-3656mir-3657; mir-3658; mir-3659; mir-3660; mir-3661; mir-3662; mir-3663; mir-3664; mir-3665; mir-3666; mir-3667; mir-3668; mir-3669; mir-3670; mir-3670; mir-3671; mir-3671; mir-3673; mir-3673; mir-3675; mir-3675; mir-3676; mir-3663; mir-3677; mir-3678; mir-3679; mir-3680; mir-3681; mir-3682; mir-3683; mir-3684; mir-3685; mir-3686; mir-3687; mir-3688; mir-3689a; mir-3689b; mir-3690; mir-3691; mir-3692; mir-3713; mir-3714; mir-3907; mir-3908; mir-3909; mir-3910-1; mir-3910-2; mir-3911; mir-3912; mir-3913-1; mir-3913-2; mir-3914-1; mir-3914-2; mir-3915; mir-3916; mir-3917; mir-3918; mir-3919; mir-3920; mir-3921; mir-3922; mir-3923; mir-3924; mir-3925; mir-3926-1; mir-3926-2; mir-3927; mir-3928; mir-3929; mir-3934; mir-3935; mir-3936; mir-3937; mir-3938; mir-3939; mir-3940; mir-3941; mir-3942; mir-3943; mir-3944; mir-3945; mir-4251; mir-4252; mir-4253; mir-4254; mir-4255; mir-4256; mir-4257; mir-4258; mir-4259; mir-4260; mir-4261; mir-4262; mir-4263; mir-4264; mir-4265; mir-4266; mir-4267; mir-4268; mir-4269; mir-4270; mir-4271; mir-4272; mir-4273; mir-4274; mir-4275; mir-4276; mir-4277; mir-4278; mir-4279; mir-4280; mir-4281; mir-4282; mir-4283-1; mir-4283-2; mir-4284; mir-4285; mir-4286; mir-4287; mir-4288; mir-4289; mir-4290; mir-4291; mir-4292; mir-4293; mir-4294; mir-4295; mir-4296; mir-4297; mir-4298; mir-4299; mir-4300; mir-4301; mir-4302; mir-4303; mir-4304; mir-4305; mir-4306; mir-4307; mir-4308; mir-4309; mir-4310; mir-4311; mir-4312; mir-4313; mir-4314; mir-4315-1; mir-4315-2; mir-4316; mir-4317; mir-4318; mir-4319; mir-4320; mir-4321; mir-4322; mir-4323; mir-4324; mir-4325; mir-4326; mir-4327; mir-4328;mir-4329; mir-4329; и mir-4330.

В некоторых вариантах осуществления микроРНК включают любую из, или две или более из, следующих: miR-21; miR-23a; miR-30c; miR-1224; miR-23b; miR-92a; miR-100; miR-125b-5p; miR-195; miR-10a-5p; а также любое их сочетание. В некоторых вариантах осуществления микроРНК включают любую из, или две или более из, следующих: miR-30b-5p, miR-449a, miR-146a, miR-130a, miR-23b, miR-21, miR-124, miR-151, а также любое их сочетание. В некоторых вариантах осуществления микроРНК включают любую из, или две или более из, следующих: miR-24, miR-195, miR-871, miR-30b-5p, miR-19b, miR-99a, miR-429, let-7f, miR-200a, miR-324-5p, miR-10a-5p, а также любое их сочетание. В некоторых вариантах осуществления сочетание микроРНК может включать 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более отдельных микроРНК.

В некоторых вариантах осуществления секретируемый продукт представляет собой соединение, которое ослабляет сигнальный путь NFkB.

В некоторых вариантах осуществления секретируемый продукт представляет собой паракринный фактор. В некоторых вариантах осуществления паракринные факторы представляют собой молекулы, синтезируемые клеткой, которые могут распространяться на небольшие расстояния и вызывать изменения или эффекты в соседней клетке, то есть, паракринное взаимодействие. В некоторых вариантах осуществления способные к диффузии молекулы называют паракринными факторами. В некоторых вариантах осуществления юкстакринные факторы представляют собой молекулы, которые способствуют межклеточной коммуникации, передаваемой через олигосахаридные, липидные или белковые компоненты клеточной мембраны, и могут воздействовать либо на секретирующую их клетку, либо на непосредственно соседние клетки. В некоторых вариантах осуществления юкстакриннная сигнализация, как правило, предполагает физический контакт между двумя вовлеченными клетками.

В некоторых вариантах осуществления везикулы содержат микроРНК, которая ингибирует ингибитор активации плазминогена 1 типа (PAI-1) и/или TGFβ1.

В некоторых вариантах осуществления секретируемый продукт представляет собой паракринный и/или юкстакринный фактор, такой как альфа-1-микроглобулин, бета-2-микроглобулин, кальбиндин, кластерин, фактор роста соединительной ткани, цистатин-C, глутатион-S-трансфераза альфа, молекула повреждения почек 1, желатиназа-ассоциированный липокалин нейтрофилов, остеопонтин, фактор «трилистника» 3, гликопротеин мочи Тамма-Хорсфалла, тканевый ингибитор металлопротеиназы-1, фактор роста эндотелия сосудов, фибронектин, интерлейкин-6 или моноцитарный хемотаксический протеин 1.

В некоторых вариантах осуществления эффективность лечения заболевания почек у субъекта способами, раскрытыми в настоящем документе, можно определять на основании различных показателей эритропоэза и/или почечной функции. В некоторых вариантах осуществления показатели эритроидного гомеостаза включают, без ограничения, гематокрит (HCT), гемоглобин (HB), средний корпускулярный гемоглобин (MCH), количество эритроцитов (RBC), количество ретикулоцитов, % ретикулоцитов, средний корпускулярный объем (MCV) и ширину распределения эритроцитов (RDW). В некоторых вариантах осуществления показатели почечной функции включают, без ограничения, сывороточный альбумин, отношение альбумина и глобулина (отношение A/G), сывороточный фосфор, сывороточный натрий, размер почки (определяемый при помощи ультразвука), сывороточный кальций, отношение фосфор:кальций, сывороточный калий, протеинурию, креатинин в моче, сывороточный креатинин, азот мочевины крови (АМК), уровни холестерина, уровни триглицеридов и скорость клубочковой фильтрации (GFR). Кроме того, некоторые показатели общего состояния здоровья и самочувствия включают, без ограничения, увеличение и снижение массы тела, показатель выживаемости, кровяное давление (среднее системное кровяное давление, диастолическое кровяное давление или систолическое кровяное давление) и физическую выносливость.

В некоторых вариантах осуществления об эффективности лечения препаратом биоактивных почечных клеток можно судить на основании стабилизации одного или более показателей почечной функции. В некоторых вариантах осуществления о стабилизации почечной функции можно судить на основании изменения какого-либо показателя у субъекта, получающего лечение способом по настоящему изобретению, в сравнении с тем же показателем у того же субъекта до начала лечения. В некоторых вариантах осуществления изменение первого показателя может представлять собой увеличение или уменьшение значения. В некоторых вариантах осуществления лечение, предложенное по настоящему изобретению, может включать стабилизацию уровней азота мочевины крови (АМК) у субъекта, при этом уровни АМК, наблюдаемые у субъекта, являются более низкими в сравнении с уровнями у субъекта с аналогичным состоянием заболевания, который не получал лечение способами по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления лечение может включать стабилизацию уровней сывороточного креатинина у субъекта, при этом уровни сывороточного креатинина, наблюдаемые у субъекта, являются более низкими в сравнении с уровнями у субъекта с аналогичным состоянием заболевания, который не получал лечение способами по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления лечение может включать стабилизацию уровней гематокрита (HCT) у субъекта, при этом уровни HCT, наблюдаемые у субъекта, являются более высокими в сравнении с уровнями у субъекта с аналогичным состоянием заболевания, который не получал лечение способами по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления лечение может включать стабилизацию уровней эритроцитов (RBC) у субъекта, при этом уровни RBC, наблюдаемые у субъекта, являются более высокими в сравнении с уровнями у субъекта с аналогичным состоянием заболевания, который не получал лечение способами по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления один или более дополнительных показателей, описанных в настоящем документе или известных в данной области, можно измерять для определения эффективности лечения заболевания почек у субъекта.

В некоторых вариантах осуществления регенерированная естественная почка может быть охарактеризована рядом показателей, включая, без ограничения, развитие функции, или способности, в естественной почке, улучшение функции, или способности, в естественной почке и экспрессию определенных маркеров в естественной почке. В некоторых вариантах осуществления о развитии или улучшении функции, или способности, можно судить на основании различных показателей эритроидного гомеостаза и почечной функции, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления регенерированная почка характеризуется дифференциальной экспрессией одного или более маркеров стволовых клеток. В некоторых вариантах осуществления маркер стволовых клеток может представлять собой один или более из следующего: Sox2; UTF1; NODAL; PROM1 или CD133; CD24; а также любое их сочетание (смотри Ilagan et al. PCT/US2011/036347, полное содержание которого включено в настоящий документ посредством ссылки). В некоторых вариантах осуществления экспрессия маркера(ов) стволовых клеток повышена в сравнении с контролем.

В некоторых вариантах осуществления популяции клеток, описанные в настоящем документе, включая обогащенные популяции клеток и/или их смеси, а также содержащие их конструкции, могут быть использованы для оказания регенеративного эффекта на естественную почку. В некоторых вариантах осуществления эффект может быть обеспечен самими клетками и/или продуктами, секретируемыми из клеток. В некоторых вариантах осуществления регенеративный эффект может быть охарактеризован одним или более из следующих признаков: уменьшение эпителиально-мезенхимального перехода (что может происходить за счет ослабления сигнализации TGF-β); уменьшение фиброза почек; уменьшение воспаления почек; дифференциальная экспрессия маркера стволовых клеток в естественной почке; миграция имплантированных клеток и/или естественных клеток к месту повреждения почек, например, повреждения канальцев; приживление имплантированных клеток в месте повреждения почек, например, повреждения канальцев; стабилизация одного или более показателей почечной функции (как описано в настоящем документе); восстановление эритроидного гомеостаза (как описано в настоящем документе); а также любым их сочетанием.

В некоторых вариантах осуществления терапевтическая композиция, или препарат, по настоящему изобретению содержит выделенную, гетерогенную популяцию почечных клеток, которая обогащена по конкретным биоактивным компонентам или типам клеток, и/или истощена по конкретным неактивным или нежелательным компонентам, или типам клеток. В некоторых вариантах осуществления такие композиции и препараты используют в лечении заболевания почек, например, для обеспечения стабилизации и/или улучшения, и/или восстановления почечной функции и/или структуры. В некоторых вариантах осуществления композиции содержат фракции выделенных почечных клеток, которые лишены клеточных компонентов в сравнении с клетками здорового индивидуума, но сохраняют терапевтические свойства, например, обеспечивают стабилизацию и/или улучшение, и/или восстановление почечной функции. В некоторых вариантах осуществления популяции клеток, описанные в настоящем документе, могут быть получены от здоровых индивидуумов, индивидуумов с заболеванием почек или субъектов, описанных в настоящем документе.

Настоящее изобретение относится к терапевтическим композициям популяций селективных почечных клеток, которые будут введены в целевой орган или ткань субъекта. В некоторых вариантах осуществления популяция биоактивных селективных почечных клеток, как правило, представляет собой популяцию клеток, потенциально обладающих терапевтическими свойствами при введении субъекту. В некоторых вариантах осуществления при введении субъекту, который нуждается в этом, популяция биоактивных почечных клеток может обеспечивать стабилизацию и/или улучшение, и/или восстановление, и/или регенерацию почечной функции у субъекта. В некоторых вариантах осуществления терапевтические свойства могут включать восстановительный или регенеративный эффект.

В некоторых вариантах осуществления популяция почечных клеток представляет собой не фракционированную, гетерогенную популяцию клеток или обогащенную гомогенную популяцию клеток, полученных из почки. В некоторых вариантах осуществления гетерогенную популяцию клеток выделяют из биопсийного образца ткани или из ткани целого органа. В некоторых вариантах осуществления популяцию почечных клеток получают из in vitro культуры клеток млекопитающих, созданной из биопсийных образцов ткани или из ткани целого органа. В некоторых вариантах осуществления популяция почечных клеток содержит подфракции или подпопуляции гетерогенной популяции почечных клеток, обогащенные по биоактивным компонентам (например, биоактивным почечным клеткам) и истощенные по неактивным или нежелательным компонентам или клеткам.

В некоторых вариантах осуществления популяция почечных клеток экспрессирует GGT и цитокератин. В некоторых вариантах осуществления GGT имеет уровень экспрессии более примерно 10%, примерно 15%, примерно 18%, примерно 20%, примерно 25%, примерно 30%, примерно 35%, примерно 40%, примерно 45%, примерно 50%, примерно 55% или примерно 60%. В некоторых вариантах осуществления GGT представляет собой GGT-1. В некоторых вариантах осуществления клетки популяции почечных клеток экспрессируют GGT-1, цитокератин, VEGF и KIM-1. В некоторых вариантах осуществления более 18% клеток в популяции почечных клеток экспрессируют GGT-1. В некоторых вариантах осуществления более 80% клеток в популяции почечных клеток экспрессируют цитокератин. В некоторых вариантах осуществления цитокератин выбирают из CK8, CK18, CK19, а также их сочетаний. В некоторых вариантах осуществления цитокератин представляет собой CK8, CK18, CK19, CK8/CK18, CK8/CK19, CK18/CK19 или CK8/CK18/CK19, при этом «/» означает сочетание записанных рядом с этим знаком цитокератинов. В некоторых вариантах осуществления цитокератин имеет уровень экспрессии более примерно 80%, примерно 85%, примерно 90% или примерно 95%. В некоторых вариантах осуществления более 80% клеток в популяции почечных клеток экспрессируют цитокератин. В некоторых вариантах осуществления клетки в популяции почечных клеток экспрессируют AQP2. В некоторых вариантах осуществления менее 40% клеток экспрессируют AQP2. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 3% клеток в популяции почечных клеток экспрессируют AQP2.

В некоторых вариантах осуществления более 18% клеток в популяции клеток экспрессируют GGT-1, и более 80% клеток в популяции клеток экспрессируют цитокератин. В некоторых вариантах осуществления цитокератин представляет собой CK18. В некоторых вариантах осуществления от 4,5% до 81,2% клеток в популяции клеток экспрессируют GGT-1, от 3,0% до 53,7% клеток в популяции клеток экспрессируют AQP2, и от 81,1% до 99,7% клеток в популяции клеток экспрессируют CK18.

В некоторых вариантах осуществления популяция почечных клеток содержит клетки, которые экспрессируют один или более из любого сочетания биомаркеров, выбранных из AQP1, AQP2, AQP4, кальбиндина, кальпонина, CD117, CD133, CD146, CD24, CD31 (PECAM-1), CD54 (ICAM-1), CD73, CK18, CK19, CK7, CK8, CK8, CK18, CK19, сочетания из CK8, CK18 и CK19, коннексина 43, кубилина, CXCR4 (фузина), DBA, E-кадгерина (CD324), EPO (эритропоэтина) GGT1, GLEPP1 (белка гломерулярного эпителия 1), гаптоглобулина, Itgb1 (интегрина 01), KIM-1 (молекулы повреждения почек 1), T1M-1 (T-клеточный иммуноглобулин и муцин-содержащей молекулы), MAP-2 (связанного с микротрубочками белка 2), мегалина, N-кадгерина, нефрина, NKCC (котранспортеров Na-K-Cl), OAT-1 (транспортера органических ионов 1), остеопонтина, пан-кадгерина, PCLP1 (подокаликсин-подобной молекулы 1), подоцина, SMA (альфа-актина гладких мышц), синаптоподина, THP (белка Тамма-Хорсфалла), виментина и αGST-1 (альфа-глутатион-S-трансферазы).

В некоторых вариантах осуществления популяция почечных клеток обогащена по эпителиальным клеткам в сравнении с исходной популяцией, такой как популяция клеток в биопсийном образце ткани почки или первичной культуре клеток (например, популяция почечных клеток содержит по меньшей мере на примерно 5%, 10%, 15%, 20% или 25% больше эпителиальных клеток, чем исходная популяция). В некоторых вариантах осуществления популяция почечных клеток обогащена по клеткам почечных канальцев в сравнении с исходной популяцией, такой как популяция клеток в биопсийном образце ткани почки или первичной культуре клеток (например, популяция почечных клеток содержит по меньшей мере на примерно 5%, 10%, 15%, 20%, или 25% больше клеток почечных канальцев, чем исходная популяция). В некоторых вариантах осуществления клетки почечных канальцев включают клетки проксимальных почечных канальцев. В некоторых вариантах осуществления популяция почечных клеток содержит меньшую относительную долю клеток дистальных почечных канальцев, клеток собирающих протоков, эндокринных клеток, сосудистых клеток или клеток, подобных предшественникам, в сравнении с исходной популяцией. В некоторых вариантах осуществления популяция почечных клеток содержит меньшую относительную долю клеток дистальных почечных канальцев в сравнении с исходной популяцией. В некоторых вариантах осуществления популяция почечных клеток содержит меньшую относительную долю клеток собирающих протоков в сравнении с исходной популяцией. В некоторых вариантах осуществления популяция почечных клеток содержит меньшую относительную долю эндокринных клеток в сравнении с исходной популяцией. В некоторых вариантах осуществления популяция почечных клеток содержит меньшую относительную долю сосудистых клеток в сравнении с исходной популяцией. В некоторых вариантах осуществления популяция почечных клеток содержит меньшую относительную долю клеток, подобных предшественникам, в сравнении с исходной популяцией. В некоторых вариантах осуществления популяция почечных клеток содержит большую относительную долю клеток почечных канальцев и меньшие относительные доли EPO-продуцирующих клеток, гломерулярных клеток и сосудистых клеток в сравнении с необогащенной популяцией (например, исходной популяцией почечных клеток). В некоторых вариантах осуществления популяция почечных клеток содержит большую относительную долю клеток почечных канальцев и меньшие относительные доли EPO-продуцирующих клеток и сосудистых клеток в сравнении с необогащенной популяцией. В некоторых вариантах осуществления популяция почечных клеток содержит большую относительную долю клеток почечных канальцев и меньшие относительные доли гломерулярных клеток и сосудистых клеток в сравнении с необогащенной популяцией.

В некоторых вариантах осуществления клетки популяции почечных клеток экспрессируют гиалуроновую кислоту (HA). В некоторых вариантах осуществления диапазон размеров HA составляет от примерно 5 кДа до примерно 20000 кДа. В некоторых вариантах осуществления HA имеет молекулярную массу 5 кДа, 60 кДа, 800 кДа и/или 3000 кДа. В некоторых вариантах осуществления клетки популяции почечных клеток синтезируют и/или стимулируют синтез высокомолекулярной HA за счет экспрессии синтазы гиалуроновой кислоты 2 (HAS-2), особенно после имплантации в почку. В некоторых вариантах осуществления клетки популяции почечных клеток экспрессируют более высокомолекулярные формы HA in vitro и/или in vivo вследствие активности HAS-2. В некоторых вариантах осуществления клетки популяции почечных клеток экспрессируют более высокомолекулярные формы HA как in vitro, так и in vivo, вследствие активности HAS-2. В некоторых вариантах осуществления более высокомолекулярные формы HA представляют собой HA, имеющую молекулярную массу по меньшей мере 100 кДа. В некоторых вариантах осуществления более высокомолекулярные формы HA представляют собой HA, имеющую молекулярную массу от примерно 800 кДа до примерно 3500 кДа. В некоторых вариантах осуществления более высокомолекулярные формы HA представляют собой HA, имеющую молекулярную массу от примерно 800 кДа до примерно 3000 кДа. В некоторых вариантах осуществления более высокомолекулярные формы HA представляют собой HA, имеющую молекулярную массу по меньшей мере 800 кДа. В некоторых вариантах осуществления более высокомолекулярные формы HA представляют собой HA, имеющую молекулярную массу по меньшей мере 3000 кДа. В некоторых вариантах осуществления более высокомолекулярные формы HA представляют собой HA, имеющую молекулярную массу примерно 800 кДа. В некоторых вариантах осуществления более высокомолекулярные формы HA представляют собой HA, имеющую молекулярную массу примерно 3000 кДа. В некоторых вариантах осуществления HAS-2 синтезирует HA с молекулярной массой от 2×10⁵ до 2×10⁶ Да. В некоторых вариантах осуществления образуются меньшие по размеру формы HA за счет действия деструктивных гиалуронидаз. В некоторых вариантах осуществления более высокомолекулярные формы HA представляют собой HA, имеющую молекулярную массу от примерно 200 кДа до примерно 2000 кДа. В некоторых вариантах осуществления более высокомолекулярные формы HA представляют собой HA, имеющую молекулярную массу примерно 200 кДа. В некоторых вариантах осуществления более высокомолекулярные формы HA представляют собой HA, имеющую молекулярную массу примерно 2000 кДа. В некоторых вариантах осуществления более высокомолекулярные формы HA представляют собой HA, имеющую молекулярную массу по меньшей мере 200 кДа. В некоторых вариантах осуществления более высокомолекулярные формы HA представляют собой HA, имеющую молекулярную массу по меньшей мере 2000 кДа. В некоторых вариантах осуществления более высокомолекулярные формы HA представляют собой HA, имеющую молекулярную массу по меньшей мере 5000 кДа. В некоторых вариантах осуществления более высокомолекулярные формы HA представляют собой HA, имеющую молекулярную массу по меньшей мере 10000 кДа. В некоторых вариантах осуществления более высокомолекулярные формы HA представляют собой HA, имеющую молекулярную массу по меньшей мере 15000 кДа. В некоторых вариантах осуществления более высокомолекулярные формы HA представляют собой HA, имеющую молекулярную массу примерно 20000 кДа.

В некоторых вариантах осуществления популяция содержит клетки, способные к опосредованному рецептором переносу альбумина.

В некоторых вариантах осуществления клетки популяции почечных клеток являются устойчивыми к гипоксии.

В некоторых вариантах осуществления популяция почечных клеток содержит один или более типов клеток, которые экспрессируют одно или более из любого сочетания из: мегалина, кубилина, N-кадгерина, E-кадгерина, аквапорина 1 и аквапорина 2.

В некоторых вариантах осуществления популяция почечных клеток содержит один или более типов клеток, которые экспрессируют одно или более из любого сочетания из: мегалина, кубилина, синтазы гиалуроновой кислоты 2 (HAS2), 25-гидроксилазы витамина D3 (CYP2D25), N-кадгерина (Ncad), E-кадгерина (Ecad), аквапорина 1 (Aqp1), аквапорина 2 (Aqp2), RAB17, представителя семейства онкогенов RAS (Rab17), GATA-связывающего белка 3 (Gata3), FXYD домен-содержащего регулятора транспорта ионов 4 (Fxyd4), семейства 9 переносчиков растворенных веществ (обменивающего натрий/водород), представителя 4, (Slc9a4), семейства 3 альдегиддегидрогеназ, представителя B1 (Aldh3b1), семейства 1 альдегиддегидрогеназ, представителя A3 (Aldh1a3) и кальпаина 8 (Capn8).

В некоторых вариантах осуществления популяция почечных клеток содержит один или более типов клеток, которые экспрессируют одно или более из любого сочетания из: мегалина, кубилина, синтазы гиалуроновой кислоты 2 (HAS2), 25-гидроксилазы витамина D3 (CYP2D25), N-кадгерина (Ncad), E-кадгерина (Ecad), аквапорина 1 (Aqp1), аквапорина 2 (Aqp2), RAB17, представителя семейства онкогенов RAS (Rab17), GATA-связывающего белка 3 (Gata3), FXYD домен-содержащего регулятора транспорта ионов 4 (Fxyd4), семейства 9 переносчиков растворенных веществ (обменивающего натрий/водород), представителя 4, (Slc9a4), семейства 3 альдегиддегидрогеназ, представителя B1 (Aldh3b1), семейства 1 альдегиддегидрогеназ, представителя A3 (Aldh1a3), кальпаина 8 (Capn8) и аквапорина 4 (Aqp4).

В некоторых вариантах осуществления популяция почечных клеток содержит один или более типов клеток, которые экспрессируют одно или более из любого сочетания из: аквапорина 7 (Aqp7), FXYD домен-содержащего регулятора транспорта ионов 2 (Fxyd2), семейства 17 переносчиков растворенных веществ (фосфата натрия), представителя 3 (Slc17a3), семейства 3 переносчиков растворенных веществ, представителя 1 (Slc3a1), клаудина 2 (Cldn2), аспартат-пептидазы напсина A (Napsa), семейства 2 переносчиков растворенных веществ (облегчающих перенос глюкозы), представителя 2 (Slc2a2), аланинаминопептидазы (мембранной) (Anpep), трансмембранного белка 27 (Tmem27), семейства ацил-КоA-синтетаз жирных кислот со средней длиной цепи, представителя 2 (Acsm2), глутатионпероксидазы 3 (Gpx3), фруктоза-1,6-бифосфатазы 1 (Fbp1), аланин-глиоксилат аминотрансферазы 2 (Agxt2), молекулы адгезии тромбоцитов и эндотелия (Pecam) и подоцина (Podn).

В некоторых вариантах осуществления популяция почечных клеток содержит один или более типов клеток, которые экспрессируют одно или более из любого сочетания из: PECAM, VEGF, KDR, HIF1a, CD31, CD146, подоцина (Podn) и нефрина (Neph), рецептора хемокина (мотив C-X-C) 4 (Cxcr4), рецептора эндотелина типа B (Ednrb), коллагена, типа V, альфа-2 (Col5a2), кадгерина 5 (Cdh5), тканевого активатора плазминогена (Plat), ангиопоэтина 2 (Angpt2), белка-рецептора, содержащего домен вставки киназы (Kdr), секретируемого кислого богатого цистеином белка (остеонектина) (Sparc), серглицина (Srgn), ингибитора 3 TIMP металлопептидазы (Timp3), белка 1 опухоли Вильмса (Wt1), семейства сайтов интеграции MMTV Wingless типа, представителя 4 (Wnt4), регулятора сигнализации G-белков 4 (Rgs4), эритропоэтина (EPO).

В некоторых вариантах осуществления популяция почечных клеток содержит один или более типов клеток, которые экспрессируют одно или более из любого сочетания из: PECAM, vEGF, KDR, HIF1a, подоцина, нефрина, EPO, CK7, CK8/18/19.

В некоторых вариантах осуществления популяция почечных клеток содержит один или более типов клеток, которые экспрессируют одно или более из любого сочетания из: PECAM, vEGF, KDR, HIF1a, CD31, CD146.

В некоторых вариантах осуществления популяция почечных клеток содержит один или более типов клеток, которые экспрессируют одно или более из любого сочетания из: подоцина (Podn) и нефрина (Neph).

В некоторых вариантах осуществления популяция почечных клеток содержит один или более типов клеток, которые экспрессируют одно или более из любого сочетания из: PECAM, vEGF, KDR, HIF1a и EPO.

В некоторых вариантах осуществления присутствие (например, экспрессию) и/или уровень/количество различных биомаркеров в образце или популяции клеток можно анализировать с использованием ряда методов, многие из которых известны в данной области и понятны квалифицированному специалисту, включая, но без ограничения, иммуногистохимические методы («ИГХ»), вестерн-блоттинг, иммунопреципитацию, анализы молекулярного связывания, ELISA, ELIFA, активированную флуоресценцией сортировку клеток («FACS»), MassARRAY, протеомику, биохимические анализы ферментативной активности, in situ гибридизацию, саузерн-блоттинг, нозерн-блоттинг, секвенирование всего генома, полимеразную цепную реакцию («ПЦР»), в том числе количественную ПЦР в реальном времени («кОТ-ПЦР»), и другие основанные на амплификации методы обнаружения, такие как, например, анализ разветвленных ДНК, SISBA, TMA и тому подобные, РНК-секвенирование, FISH, анализ с использованием микрочипов, профилирование генной экспрессии и/или серийный анализ генной экспрессии («SAGE»), а также любой из широкого спектра анализов, которые могут быть выполнены с использованием белковых, генных и/или тканевых микропанелей. Неограничивающие примеры методов для оценки статуса генов и генных продуктов включают нозерн-блоттинг, саузерн-блоттинг, иммуноблоттинг и ПЦР-анализ. В некоторых вариантах осуществления также можно использовать мультиплексные иммуноанализы, такие как те, которые доступны от компаний Rules Based Medicine или Meso Scale Discovery. В некоторых вариантах осуществления присутствие (например, экспрессию) и/или уровень/количество различных биомаркеров в образце или популяции клеток можно анализировать с использованием ряда методов, многие из которых известны в данной области и понятны квалифицированному специалисту, включая, но без ограничения, платформы «-омика», такие как геномная транскриптомика, протеомика, секретомика, липидомика, фосфатомика, экзосомика и так далее, при этом методологии с высокой пропускной способностью объединяют с методами вычислительной биологии и биоинформатики для выяснения полной биологической сигнатуры генов, микроРНК, белков, секретируемых белков, липидов и так далее, которые экспрессируются, и не экспрессируются, изучаемой популяцией клеток.

В некоторых вариантах осуществления способ обнаружения присутствия двух или более биомаркеров в популяции почечных клеток включает создание контакта образца, содержащего популяцию, с антителом, направленным на биомаркер, в условиях, допускающих связывание антитела с его соответствующим лигандом (то есть, биомаркером), и обнаружение присутствия связанного антитела, например, путем определения того, образуется ли комплекс между антителом и биомаркером. В некоторых вариантах осуществления присутствие одного или более биомаркеров обнаруживают иммуногистохимическими методами. Используемый в настоящем документе термин «обнаружение» включает количественное и/или качественное обнаружение.

В некоторых вариантах осуществления популяцию почечных клеток идентифицируют при помощи одного или более реагентов, которые позволяют обнаруживать биомаркер, раскрытый в настоящем документе, такой как AQP1, AQP2, AQP4, кальбиндин, кальпонин, CD117, CD133, CD146, CD24, CD31 (PECAM-1), CD54 (ICAM-1), CD73, CK18, CK19, CK7, CK8, CK8/18, CK8/18/19, коннексин 43, кубилин, CXCR4 (фузин), DBA, E-кадгерин (CD324), EPO (эритропоэтин), GGT1, GLEPP1 (белок гломерулярного эпителия 1), гаптоглобулин, Itgbl (интегрин p), KIM-1 (молекула повреждения почек 1), T1M-1 (T-клеточный иммуноглобулин и муцин-содержащая молекула), MAP-2 (связанный с микротрубочками белок 2), мегалин, N-кадгерин, нефрин, NKCC (котранспортеры Na-K-Cl), OAT-1 (транспортер органических ионов 1), остеопонтин, пан-кадгерин, PCLP1 (подокаликсин-подобная молекула 1), подоцин, SMA (альфа-актин гладких мышц), синаптоподин, THP (белок Тамма-Хорсфолла), виментин и αGST-1 (альфа-глутатион-5-трансфераза). В некоторых вариантах осуществления биомаркер обнаруживают при помощи моноклонального или поликлонального антитела.

В некоторых вариантах осуществления источник клеток является таким же, как и намеченный целевой орган или ткань. В некоторых вариантах осуществления БПК или СПК могут быть получены из почки и использованы в препарате, который будет введен в почку. В некоторых вариантах осуществления популяция клеток получена из биопсийного образца почки. В некоторых вариантах осуществления популяция клеток получена из ткани целой почки. В некоторых вариантах осуществления популяция клеток получена из in vitro культур клеток почки млекопитающего, полученных из биопсийных образцов почки или ткани целой почки.

В некоторых вариантах осуществления БПК или СПК содержат гетерогенные смеси или фракции биоактивных почечных клеток. В некоторых вариантах осуществления БПК или СПК могут быть получены из, или сами являются, фракций почечных клеток от здоровых индивидуумов. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к популяции, или фракции, почечных клеток, полученной от нездорового индивидуума, которая может быть лишена определенных типов клеток в сравнении с популяцией почечных клеток от здорового индивидуума (например, в его почке или биопсийном образце). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложена терапевтически активная популяция клеток, лишенная некоторых типов клеток в сравнении с популяцией от здорового индивидуума. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток выделяют и размножают из популяции аутологичных клеток.

В некоторых вариантах осуществления СПК получают путем выделения и размножения почечных клеток из ткани коркового слоя почки пациента, полученной путем биопсии почки. В некоторых вариантах осуществления почечные клетки выделяют из почечной ткани путем ферментативного расщепления, размножают с использованием стандартных методов культивирования клеток и отбирают из размноженных почечных клеток путем центрифугирования через границу, барьер или интерфейс между фазами с разной плотностью. В некоторых вариантах осуществления почечные клетки выделяют из почечной ткани путем ферментативного расщепления, размножают с использованием стандартных методов культивирования клеток и отбирают из размноженных почечных клеток путем центрифугирования в непрерывном или прерывистом, одноступенчатом или многоступенчатом, градиенте плотности. В некоторых вариантах осуществления СПК состоят в основном из почечных эпителиальных клеток, которые известны своим регенеративным потенциалом. В некоторых вариантах осуществления другие паренхиматозные (сосудистые) и стромальные клетки могут присутствовать в популяции аутологичных СПК.

В некоторых вариантах осуществления биоактивные почечные клетки получают из почечных клеток, выделенных из почечной ткани путем ферментативного расщепления и размноженных с использованием стандартных методов культивирования клеток. В некоторых вариантах осуществления среда для культивирования клеток разработана для размножения биоактивных почечных клеток с регенеративной способностью. В некоторых вариантах осуществления среда для культивирования клеток не содержит какие-либо рекомбинантные или очищенные факторы дифференцировки. В некоторых вариантах осуществления размноженные гетерогенные смеси почечных клеток культивируют в гипоксических условиях для дополнительного обогащения композиции клетками с регенеративной способностью. Без связи с конкретной теорией, это может быть связано с одним или более из следующих явлений: 1) избирательное выживание, гибель или пролиферация определенных клеточных компонентов в период культивирования в гипоксических условиях; 2) изменение гранулярности и/или размера клеток в ответ на культивирование в гипоксических условиях, что приводит к изменениям в плавучей плотности и последующей локализации при разделении в градиенте плотности или центрифугировании через границу, барьер или интерфейс между фазами с разной плотностью; и 3) изменение генной/белковой экспрессии в клетках в ответ на культивирование в гипоксических условиях, что приводит к дифференциальным характеристикам клеток в выделенной и размноженной популяции.

В некоторых вариантах осуществления популяцию биоактивных почечных клеток получают путем выделения и размножения почечных клеток из почечной ткани (такой как ткань, полученная при биопсии) в условиях культивирования, которые приводят к обогащению клетками, способными к регенерации почки.

В некоторых вариантах осуществления почечные клетки из почечной ткани (такой как ткань, полученная при биопсии) пересевают 1, 2, 3, 4, 5 или более раз для получения размноженных биоактивных почечных клеток (например, популяции клеток, обогащенной по клеткам, способным к регенерации почки). В некоторых вариантах осуществления почечные клетки из почечной ткани (такой как ткань, полученная при биопсии) пересевают 1 раз для получения размноженных биоактивных почечных клеток. В некоторых вариантах осуществления почечные клетки из почечной ткани (такой как ткань, полученная при биопсии) пересевают 2 раза для получения размноженных биоактивных почечных клеток. В некоторых вариантах осуществления почечные клетки из почечной ткани (такой как ткань, полученная при биопсии) пересевают 3 раза для получения размноженных биоактивных почечных клеток. В некоторых вариантах осуществления почечные клетки из почечной ткани (такой как ткань, полученная при биопсии) пересевают 4 раза для получения размноженных биоактивных почечных клеток. В некоторых вариантах осуществления почечные клетки из почечной ткани (такой как ткань, полученная при биопсии) пересевают 5 раз для получения размноженных биоактивных почечных клеток. В некоторых вариантах осуществления пересев клеток приводит к истощению популяции не биоактивных почечных клеток. В некоторых вариантах осуществления пересев клеток приводит к истощению популяции клеток по меньшей мере одного клеточного типа. В некоторых вариантах осуществления пересев клеток приводит к истощению популяции клеток, имеющих плотность более 1,095 г/мл. В некоторых вариантах осуществления пересев клеток приводит к истощению популяции мелких клеток с низкой гранулярностью. В некоторых вариантах осуществления пересев клеток приводит к истощению популяции клеток, имеющих меньший размер, чем эритроциты. В некоторых вариантах осуществления пересев клеток приводит к истощению популяции клеток с диаметром менее 6 мкм. В некоторых вариантах осуществления пересев клеток приводит к истощению популяции клеток с диаметром менее 2 мкм. В некоторых вариантах осуществления пересев клеток приводит к истощению популяции клеток с меньшей гранулярностью, чем эритроциты. В некоторых вариантах осуществления жизнеспособность популяции клеток возрастает после 1 или более пересевов. В некоторых вариантах осуществления описания мелких клеток и низкой гранулярности используют при анализе клеток методом активированной флуоресценцией сортировки клеток (FACS), например, с использованием осей X-Y диаграммы разброса данных, на которой показаны клетки.

В некоторых вариантах осуществления размноженные биоактивные почечные клетки выращивают в гипоксических условиях в течение по меньшей мере примерно 6, 9, 10, 12 или 24 часов, но менее 48 часов, или в течение 6-9 часов, или 6-48 часов, или от примерно 12 до примерно 15 часов, или примерно 8 часов, или примерно 12 часов, или примерно 24 часов, или примерно 36 часов, или примерно 48 часов. В некоторых вариантах осуществления клетки, выращенные в гипоксических условиях, отбирают на основании плотности. В некоторых вариантах осуществления популяция биоактивных почечных клеток представляет собой популяцию селективных почечных клеток (СПК), полученную после разделения размноженных почечных клеток в непрерывном или прерывистом (одноэтапном или многоэтапном) градиенте плотности (например, после пересева и/или культивирования в гипоксических условиях). В некоторых вариантах осуществления популяция биоактивных почечных клеток представляет собой популяцию селективных почечных клеток (СПК), полученную после разделения размноженных почечных клеток методом центрифугирования через границу, барьер или интерфейс между фазами с разной плотностью (например, после пересева и/или культивирования в гипоксических условиях). В некоторых вариантах осуществления гипоксические условия культивирования представляют собой условия культивирования, в которых клетки подвергают воздействию пониженных уровней доступного кислорода в системе культивирования, в сравнении со стандартными условиями культивирования, в которых клетки культивируют при атмосферных уровнях кислорода (примерно 21%). В некоторых вариантах осуществления клетки, культивируемые в гипоксических условиях культивирования, культивируют при уровне кислорода от примерно 5% до примерно 15% или от примерно 5% до примерно 10%, или от примерно 2% до примерно 5%, или от примерно 2% до примерно 7%, или примерно 2%, или примерно 3%, или примерно 4%, или примерно 5%. В некоторых вариантах осуществления СПК имеют плавучую плотность более примерно 1,0419 г/мл. В некоторых вариантах осуществления СПК имеют плавучую плотность более примерно 1,04 г/мл. В некоторых вариантах осуществления СПК имеют плавучую плотность более примерно 1,045 г/мл. В некоторых вариантах осуществления БПК или СПК содержат большую процентную долю одной или более популяций клеток и лишены, или содержат меньшее количество, одной или более других популяций клеток в сравнении с исходной популяцией почечных клеток.

В некоторых вариантах осуществления размноженные биоактивные почечные клетки могут быть подвергнуты разделению в градиенте плотности для получения СПК. В некоторых вариантах осуществления используют центрифугирование в непрерывном или прерывистом, одноступенчатом или многоступенчатом, градиенте плотности для разделения собранных популяций почечных клеток на основании плавучей плотности клеток. В некоторых вариантах осуществления размноженные биоактивные почечные клетки можно разделять центрифугированием через границу, барьер или интерфейс между фазами с разной плотностью для получения СПК. В некоторых вариантах осуществления центрифугирование через границу, барьер или интерфейс между фазами с разной плотностью используют для разделения собранных популяций почечных клеток на основании плавучей плотности клеток. В некоторых вариантах осуществления СПК получают с использованием, частично, среды OPTIPREP (Axis-Shield), содержащей 60% (масс/об) раствор неионного йодированного соединения йодиксанола в воде. Однако специалист в данной области понимает, что и другие среды, градиенты плотности (непрерывные или прерывистые), границы, барьеры, интерфейсы между фазами с разной плотностью, или другие методы, например, иммунологическое разделение с использованием клеточных поверхностных маркеров, известные в данной области, имеющие необходимые свойства для выделения популяций клеток, описанных в настоящем документе, можно использовать для получения биоактивных почечных клеток. В некоторых вариантах осуществления фракцию клеток, имеющих плавучую плотность более примерно 1,04 г/мл, собирают после центрифугирования в виде четкого осадка клеток. В некоторых вариантах осуществления клетки, имеющие плавучую плотность менее 1,04 г/мл, исключают и отбрасывают. В некоторых вариантах осуществления фракцию клеток, имеющих плавучую плотность более примерно 1,0419 г/мл, собирают после центрифугирования в виде четкого осадка клеток. В некоторых вариантах осуществления клетки, имеющие плавучую плотность менее 1,0419 г/мл, исключают и отбрасывают. В некоторых вариантах осуществления фракцию клеток, имеющих плавучую плотность более примерно 1,045 г/мл, собирают после центрифугирования в виде четкого осадка клеток. В некоторых вариантах осуществления клетки, имеющие плавучую плотность менее 1,045 г/мл, исключают и отбрасывают.

В некоторых вариантах осуществления плавучую плотность клеток используют для получения популяции СПК и/или определения того, является ли популяция почечных клеток популяцией биоактивных почечных клеток. В некоторых вариантах осуществления плавучую плотность клеток используют для выделения биоактивных почечных клеток. В некоторых вариантах осуществления плавучую плотность клеток определяют путем центрифугирования через одноступенчатый интерфейс плотности OptiPrep (7% йодиксанол; 60% (масс/об) в OptiMEM) (одноступенчатый прерывистый градиент плотности). Optiprep представляет собой 60% (масс/об) раствор йодиксанола в воде. При иллюстративном использовании интерфейса плотности или одноступенчатого прерывистого градиента плотности Optiprep разбавляют OptiMEM (минимальная среда для культивирования клеток) для получения конечного раствора 7% йодиксанола (в воде и OptiMEM). Состав OptiMEM представляет собой модификацию минимальной поддерживающей среды Игла, забуференную HEPES и бикарбонатом натрия, и с добавлением гипоксантина, тимидина, пирувата натрия, L-глутамина или GLUTAMAX, микроэлементов и факторов роста. Уровень белка является минимальным (15 мкг/мл), при этом единственными белковыми добавками являются инсулин и трансферрин. Феноловый красный включают при пониженной концентрации в качестве индикатора pH. В некоторых вариантах осуществления в OptiMEM можно добавлять 2-меркаптоэтанол перед использованием.

В некоторых вариантах осуществления готовят раствор OptiPrep и измеряют коэффициент преломления, в качестве показателя желаемой плотности (К.П. 1,3456 ± 0,0004), перед использованием. В некоторых вариантах осуществления почечные клетки наслаивают поверх раствора. В некоторых вариантах осуществления интерфейс между фазами с разной плотностью или одноступенчатый прерывистый градиент плотности центрифугируют при 800 g в течение 20 мин при комнатной температуре (без торможения) либо в центрифужной пробирке (например, 50-мл конической пробирке), либо в устройстве для обработки клеток (например, COBE 2991). В некоторых вариантах осуществления фракцию клеток, имеющих плавучую плотность более примерно 1,04 г/мл, собирают после центрифугирования в виде четкого осадка клеток. В некоторых вариантах осуществления клетки, имеющие плавучую плотность менее 1,04 г/мл, исключают и отбрасывают. В некоторых вариантах осуществления фракцию клеток, имеющих плавучую плотность более примерно 1,0419 г/мл, собирают после центрифугирования в виде четкого осадка клеток. В некоторых вариантах осуществления клетки, имеющие плавучую плотность менее 1,0419 г/мл, исключают и отбрасывают. В некоторых вариантах осуществления фракцию клеток, имеющих плавучую плотность более примерно 1,045 г/мл, собирают после центрифугирования в виде четкого осадка клеток. В некоторых вариантах осуществления клетки, имеющие плавучую плотность менее 1,045 г/мл, исключают и отбрасывают. В некоторых вариантах осуществления перед оценкой плотности клеток, или отбором на основании плотности, клетки культивируют до состояния по меньшей мере 50% конфлюэнтности и инкубируют в течение ночи (например, по меньшей мере примерно 8 или 12 часов) в гипоксических условиях в инкубаторе, установленном на уровень 2% кислорода в атмосфере с 5% CO₂ при 37°C.

В некоторых вариантах осуществления клетки, полученные из образца почки, размножают, а затем обрабатывают (например, с применением гипоксии и разделения центрифугированием) для получения популяции СПК. В некоторых вариантах осуществления популяцию СПК получают с использованием реагентов и способов, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления образец клеток из популяции СПК тестируют на жизнеспособность перед введением клеток популяции субъекту. В некоторых вариантах осуществления образец клеток из популяции СПК тестируют на экспрессию одного или более из маркеров, раскрытых в настоящем документе, перед введением клеток популяции субъекту.

Неограничивающие примеры композиций и способов для получения СПК приведены в публикации патентной заявки США № 2017/0281684 A1, полное содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки.

В некоторых вариантах осуществления БПК или СПК получают из образца естественной аутологичной или аллогенной почки. В некоторых вариантах осуществления БПК или СПК получают из образца не аутологичной почки. В некоторых вариантах осуществления образец может быть получен путем биопсии почки.

В некоторых вариантах осуществления выделение и размножение почечных клеток приводит к получению смеси разных типов почечных клеток, включая почечные эпителиальные клетки и стромальные клетки. В некоторых вариантах осуществления СПК получают путем разделения в непрерывном или прерывистом градиенте плотности размноженных почечных клеток. В некоторых вариантах осуществления основной тип клеток в разделенной в градиенте плотности популяции СПК имеет фенотип эпителиальных клеток почечных канальцев. В некоторых вариантах осуществления СПК получают путем разделения размноженных почечных клеток методом центрифугирования через границу, барьер или интерфейс между фазами с разной плотностью. В некоторых вариантах осуществления основной тип клеток в разделенной через границу/барьер/интерфейс между фазами с разной плотностью популяции СПК имеет фенотип эпителиальных клеток почечных канальцев. В некоторых вариантах осуществления характеристики СПК, полученных в результате размножения почечных клеток, оценивают с использованием многоэтапного подхода. В некоторых вариантах осуществления клеточную морфологию, кинетику роста и жизнеспособность клеток контролируют в процессе размножения почечных клеток. В некоторых вариантах осуществления плавучую плотность и жизнеспособность СПК характеризуют методом центрифугирования на среде, или свозь среду, с градиентом плотности и методом с исключением трипанового синего. В некоторых вариантах осуществления фенотип СПК характеризуют методом проточной цитометрии, и функцию СПК определяют на основании экспрессии VEGF и KIM-1. В некоторых вариантах осуществления клеточную функцию СПК до формулирования также можно оценивать путем измерения активности двух конкретных ферментов; GGT (γ-глютамилтранспептидазы) и LAP (лейцинаминопептидазы), присутствующих в проксимальных канальцах почки.

В некоторых вариантах осуществления клеточные признаки, способствующие разделению субпопуляций клеток в плотной среде (размер и гранулярность), можно использовать для разделения субпопуляций клеток методом проточной цитометрии (прямое светорассеяние отражает размер клеток при проточной цитометрии, и боковое светорассеяние отражает гранулярность). В некоторых вариантах осуществления среда с градиентом плотности, или среда для разделения, должна иметь низкую токсичность для конкретных интересующих клеток. В некоторых вариантах осуществления, при том, что плотная среда должна иметь низкую токсичность для конкретных интересующих клеток, по настоящему изобретению предусмотрено использование сред, которые играют определенную роль в процессе отбора интересующих клеток. В некоторых вариантах осуществления, и без связи с конкретной теорией, очевидно, что популяции клеток, раскрытые в настоящем документе, которые извлекают при помощи среды, содержащей йодиксанол, являются устойчивыми к йодиксанолу, поскольку между этапами нанесения и извлечения имеет место значительная потеря клеток, это свидетельствует о том, что воздействие йодиксанола в условиях градиента плотности, или границы, барьера или интерфейса между фазами с разной плотностью, приводит к элиминации некоторых клеток. В некоторых вариантах осуществления клетки, обнаруживаемые после разделения в градиенте плотности или через интерфейс между фазами с разной плотностью йодиксанола, являются устойчивыми к любым неблагоприятным эффектам воздействия йодиксанола и/или градиента плотности или интерфейса между фазами. В некоторых вариантах осуществления контрастную среду, имеющую содержание нефротоксина от слабого до умеренного, используют для выделения и/или отбора популяции клеток, например, популяции СПК. В некоторых вариантах осуществления СПК являются устойчивыми к йодиксанолу. В некоторых вариантах осуществления плотная среда не должна связывать белки в человеческой плазме или отрицательно влиять на ключевые функции интересующих клеток.

В некоторых вариантах осуществления популяция клеток была обогащена и/или истощена по одному или более типам почечных клеток методом активированной флуоресценцией сортировки клеток (FACS). В некоторых вариантах осуществления типы почечных клеток могут быть обогащены и/или истощены с использованием BD FACSAria™ или эквивалента. В некоторых вариантах осуществления типы почечных клеток могут быть обогащены и/или истощены с использованием FACSAria III™ или эквивалента.

В некоторых вариантах осуществления популяция клеток была обогащена и/или истощена по одному или более типам почечных клеток с использованием магнитной сортировки клеток. В некоторых вариантах осуществления один или более типов почечных клеток могут быть обогащены и/или истощены с использованием системы Miltenyi autoMACS^® или эквивалента.

В некоторых вариантах осуществления популяция почечных клеток была подвергнута трехмерному культивированию. В некоторых вариантах осуществления методы культивирования популяций клеток включают непрерывную перфузию. В некоторых вариантах осуществления популяции клеток, культивированных с использованием трехмерного культивирования и непрерывной перфузии, демонстрируют большую насыщенность клетками и межклеточное взаимодействие в сравнении с популяциями клеток, культивируемыми статическим образом. В некоторых вариантах осуществления популяции клеток, культивированных с использованием трехмерного культивирования и непрерывной перфузии, демонстрируют большую степень экспрессии EPO, а также повышенную экспрессию генов, связанных с почечными канальцами, таких как E-кадгерин, в сравнении со статическими культурами таких популяций клеток. В некоторых вариантах осуществления популяция клеток, культивированных с использованием непрерывной перфузии, демонстрирует более высокий уровень потребления глюкозы и глутамина в сравнении с популяцией клеток, культивируемых статическим образом.

В некоторых вариантах осуществления условия низкого содержания, или недостатка, кислорода можно использовать в способах для получения популяции клеток, предложенных по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления способ получения популяции клеток может быть использован без этапа культивирования при низком содержании кислорода. В некоторых вариантах осуществления могут быть использованы условия с нормальным содержанием кислорода.

В некоторых вариантах осуществления популяция почечных клеток была выделена и/или культивирована из почечной ткани. В настоящем документе приведены неограничивающие примеры способов для разделения и выделения почечных клеточных компонентов, например, обогащенных популяций клеток, которые будут использованы в препаратах для терапевтического применения, включая лечение заболевания почек, анемии, дефицита EPO, нарушения канальцевого транспорта и нарушения клубочковой фильтрации. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток выделяют из свежерасщепленной, то есть, механически или ферментативно расщепленной, почечной ткани, или из гетерогенной in vitro культуры почечных клеток млекопитающего.

В некоторых вариантах осуществления популяция почечных клеток включает EPO-продуцирующие почечные клетки. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет анемию и/или дефицит EPO. В некоторых вариантах осуществления популяции EPO-продуцирующих почечных клеток характеризуются экспрессией EPO и биологической чувствительностью к кислороду, так что уменьшение давления кислорода в системе культивирования приводит к индукции экспрессии EPO. В некоторых вариантах осуществления популяции EPO-продуцирующих клеток обогащены по EPO-продуцирующим клеткам. В некоторых вариантах осуществления экспрессия EPO индуцируется, когда популяцию клеток культивируют в условиях, в которых клетки находятся в системе культивирования при пониженных уровнях доступного кислорода, в сравнении с популяцией клеток, культивируемых при нормальных атмосферных (примерно 21%) уровнях доступного кислорода. В некоторых вариантах осуществления EPO-продуцирующие клетки, культивируемые в условиях с пониженным содержанием кислорода, экспрессируют EPO на более высоких уровнях в сравнении с EPO-продуцирующими клетками, культивируемыми в условиях с нормальным содержанием кислорода. Как правило, культивирование клеток при пониженных уровнях доступного кислорода (также называемых гипоксическими условиями культивирования) означает, что уровень кислорода снижен в сравнении с культивированием клеток при нормальных атмосферных уровнях доступного кислорода (также называемых нормальными условиями или нормоксическими условиями). В некоторых вариантах осуществления культивирование клеток в гипоксических условиях включает культивирование клеток при менее примерно 1% кислорода, менее примерно 2% кислорода, менее примерно 3% кислорода, менее примерно 4% кислорода или менее примерно 5% кислорода. В некоторых вариантах осуществления культивирование клеток в нормальных условиях, или нормоксических условиях, включает культивирование клеток при примерно 10% кислорода, примерно 12% кислорода, примерно 13% кислорода, примерно 14% кислорода, примерно 15% кислорода, примерно 16% кислорода, примерно 17% кислорода, примерно 18% кислорода, примерно 19% кислорода, примерно 20% кислорода или примерно 21% кислорода.

В некоторых вариантах осуществления добиваются индукции, или увеличения, экспрессии EPO; ее можно наблюдать в случае культивирования клеток при менее примерно 5% доступного кислорода и сравнивать с уровнями экспрессии EPO в клетках, культивируемых при атмосферных (примерно 21%) уровнях кислорода. В некоторых вариантах осуществления индукции EPO добиваются в культуре клеток, способных экспрессировать EPO, способом, включающим первую фазу культивирования, в которой клетки культивируют при атмосферном уровне кислорода (примерно 21%) в течение некоторого периода времени, и вторую фазу культивирования, в которой уровни доступного кислорода уменьшают, и те же клетки культивируют при менее примерно 5% доступного кислорода. В некоторых вариантах осуществления экспрессия EPO, которая является чувствительной к гипоксическим условиям, регулируется HIF1α. В некоторых вариантах осуществления другие условия культивирования с манипуляциями уровнем кислорода, известные в данной области, могут быть использованы для клеток, описанных в настоящем документе.

В некоторых вариантах осуществления препарат содержит обогащенные популяции EPO-продуцирующих клеток млекопитающего, характеризующихся биологической чувствительностью (такой как, например, экспрессия EPO) к условиям перфузии. В некоторых вариантах осуществления условия перфузии включают временный, прерывистый или непрерывный поток жидкости (перфузию). В некоторых вариантах осуществления экспрессия EPO индуцируется механически, когда среда, в которой клетки культивируются, периодически или непрерывно циркулирует или перемешивается таким образом, что динамические силы передаются клеткам через поток. В некоторых вариантах осуществления клетки, подвергаемые воздействию временного, прерывистого или непрерывного потока жидкости, культивируют таким образом, что они присутствуют в виде трехмерных структур в, или на, материале, который обеспечивает каркас и/или пространство для образования таких трехмерных структур. В некоторых вариантах осуществления клетки культивируют на пористых гранулах и подвергают воздействию прерывистого или непрерывного потока жидкости за счет использования качающейся платформы, вращающейся платформы или вращающейся колбы. В некоторых вариантах осуществления клетки культивируют на трехмерном каркасе и помещают в устройство, обеспечивающее стационарное положение каркаса и протекание жидкости в направлении через, или сквозь, каркас. Специалисты в данной области понимают, что и другие условия культивирования с перфузией, известные в данной области, могут быть использованы для клеток, описанных в настоящем документе.

В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток получают из биопсийного образца почки. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток получают из ткани целой почки. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток получают из in vitro культур клеток почки млекопитающего, полученных из биопсийных образцов почки или ткани целой почки. В некоторых вариантах осуществления популяция почечных клеток представляет собой популяцию СПК. В некоторых вариантах осуществления популяция клеток представляет собой не фракционированную популяцию клеток, также называемую в настоящем документе необогащенной популяцией клеток.

Композиции, содержащие различные активные средства (например, отличные от почечных клеток), входят в объем настоящего изобретения. Неограничивающие примеры подходящих активных средств включают, без ограничения, клеточные агрегаты, бесклеточные биологические материалы, продукты, секретируемые биоактивными клетками, высокомолекулярные и низкомолекулярные терапевтические средства, а также их сочетания. Например, биоактивные клетки одного типа можно объединять с микроносителями на основе биологического материала с терапевтическими молекулами, или без них, или биоактивными клетками другого типа. В некоторых вариантах осуществления неприкрепленные клетки могут быть объединены с бесклеточными частицами.

В некоторых вариантах осуществления клетки популяции почечных клеток находятся внутри сфероидов. В некоторых вариантах осуществления популяция почечных клеток имеет форму сфероидов. В некоторых вариантах осуществления сфероиды, содержащие биоактивные почечные клетки, вводят субъекту. В некоторых вариантах осуществления сфероиды содержат по меньшей мере один тип, или популяцию, не почечных клеток. В некоторых вариантах осуществления сфероиды получают способом, включающим (i) объединение популяции биоактивных почечных клеток и популяции не почечных клеток, и (ii) культивирование популяции биоактивных почечных клеток и популяции не почечных клеток в 3-мерной системе культивирования, включающей вращающуюся колбу, до образования сфероидов.

В некоторых вариантах осуществления популяция не почечных клеток содержит популяцию эндотелиальных клеток или популяцию эндотелиальных клеток-предшественников. В некоторых вариантах осуществления популяция биоактивных клеток представляет собой популяцию эндотелиальных клеток. В некоторых вариантах осуществления популяция эндотелиальных клеток представляет собой линию клеток. В некоторых вариантах осуществления популяция эндотелиальных клеток содержит эндотелиальные клетки пуповинной крови человека (HUVEC). В некоторых вариантах осуществления популяция не почечных клеток представляет собой популяцию мезенхимальных стволовых клеток. В некоторых вариантах осуществления популяция не почечных клеток представляет собой популяцию стволовых клеток из гемопоэтического органа, молочной железы, кишечника, плаценты, легкого, костного мозга, крови, пуповины, эндотелия, пульпы зуба, жировой ткани, нервной ткани, обонятельного эпителия, нервного гребня или яичка. В некоторых вариантах осуществления популяция не почечных клеток представляет собой популяцию клеток-предшественников из жировой ткани. В некоторых вариантах осуществления популяции клеток являются ксеногенными, сингенными, аллогенными, аутологичными, или их сочетанием. В некоторых вариантах осуществления популяцию биоактивных почечных клеток и популяцию не почечных клеток культивируют в соотношении от 0,1:9,9 до 9,9:0,1. В некоторых вариантах осуществления популяцию биоактивных почечных клеток и популяцию не почечных клеток культивируют в соотношении примерно 1:1. В некоторых вариантах осуществления популяцию почечных клеток и популяцию биоактивных клеток суспендируют в ростовой среде.

Размноженные биоактивные почечные клетки затем могут быть подвергнуты разделению в среде с непрерывным или прерывистым градиентом плотности для получения СПК. В частности, используют центрифугирование в непрерывном или прерывистом, одноступенчатом или многоступенчатом, градиенте плотности для разделения собранных популяций почечных клеток в зависимости от плавучей плотности клеток. В некоторых вариантах осуществления размноженные биоактивные почечные клетки могут быть дополнительно подвергнуты разделению методом центрифугирования через границу, барьер или интерфейс между фазами с разной плотностью для получения СПК. В частности, центрифугирование через границу, барьер или интерфейс между фазами с разной плотностью используют для разделения собранных популяций почечных клеток в зависимости от плавучей плотности клеток. В некоторых вариантах осуществления СПК получают с использованием, частично, среды OPTIPREP (Axis-Shield), содержащей 60% (масс/об) раствор неионного йодированного соединения йодиксанола в воде. Однако специалист в данной области понимает, что любые среды с градиентом плотности, без ограничения по конкретным средам, или другие методы, например, иммунологического разделения с использованием клеточных поверхностных маркеров, известных в данной области, имеющие необходимые свойства для выделения популяций клеток по настоящему изобретению, могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением. Например, можно использовать перколл или сахарозу для создания градиента плотности или границы фаз с разной плотностью. В некоторых вариантах осуществления фракцию клеток, имеющих плавучую плотность более примерно 1,04 г/мл, собирают после центрифугирования в виде четкого осадка клеток. В некоторых вариантах осуществления клетки, имеющие плавучую плотность менее 1,04 г/мл, исключают и отбрасывают. В некоторых вариантах осуществления фракцию клеток, имеющих плавучую плотность более примерно 1,0419 г/мл, собирают после центрифугирования в виде четкого осадка клеток. В некоторых вариантах осуществления клетки, имеющие плавучую плотность менее 1,0419 г/мл, исключают и отбрасывают. В некоторых вариантах осуществления фракцию клеток, имеющих плавучую плотность более примерно 1,045 г/мл, собирают после центрифугирования в виде четкого осадка клеток. В некоторых вариантах осуществления клетки, имеющие плавучую плотность менее 1,045 г/мл, исключают и отбрасывают.

Терапевтические композиции и препараты могут содержать выделенные гетерогенные популяции почечных клеток, и/или их смеси, обогащенные по конкретным биоактивным компонентам, или типам клеток, и/или истощенные по конкретным неактивным или нежелательным компонентам, или типам клеток, для использования в лечении заболевания почек, то есть, обеспечения стабилизации и/или улучшения, и/или восстановления почечной функции и/или структуры, например, описанные ранее в Presnell et al. U.S. 8318484 и Ilagan et al. PCT/US2011/036347, полное содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки. Композиции могут содержать выделенные фракции почечных клеток, которые лишены клеточных компонентов в сравнении с клетками здорового индивидуума, но сохраняют терапевтические свойства, то есть, обеспечивают стабилизацию и/или улучшение, и/или восстановление почечной функции. Популяции клеток, клеточные фракции и/или смеси клеток, описанные в настоящем документе, могут быть получены от здоровых индивидуумов, индивидуумов с заболеванием почек или субъектов, описанных в настоящем документе.

По настоящему изобретению предусмотрены терапевтические композиции популяций селективных почечных клеток, которые будут введены в целевые органы или ткани субъекта, который нуждается в этом. Популяция биоактивных селективных почечных клеток, как правило, представляет собой популяцию клеток, потенциально обладающих терапевтическими свойствами при введении субъекту. Например, при введении субъекту, который нуждается в этом, популяция биоактивных почечных клеток может обеспечивать стабилизацию и/или улучшение, и/или восстановление, и/или регенерацию почечной функции у субъекта. Терапевтические свойства могут включать регенеративный эффект.

В некоторых вариантах осуществления источник клеток является таким же, как и намеченный целевой орган или ткань. Например, БПК или СПК могут быть получены из почки и использованы в препарате, который будет введен в почку. В некоторых вариантах осуществления популяции клеток получены из биопсийного образца почки. В некоторых вариантах осуществления популяции клеток получены из ткани целой почки. В некоторых вариантах осуществления популяции клеток получены из in vitro культур клеток почки млекопитающего, полученных из биопсийных образцов почки или ткани целой почки. В некоторых вариантах осуществления БПК и/или СПК содержат гетерогенные смеси или фракции биоактивных почечных клеток. БПК и/или СПК могут быть получены из, или сами являются фракциями почечных клеток от здоровых индивидуумов. Кроме того, настоящее изобретение относится к фракциям почечных клеток, полученным от нездорового индивидуума, которые могут быть лишены некоторых клеточных компонентов в сравнении с соответствующими фракциями почечных клеток от здорового индивидуума, но все еще сохраняют терапевтические свойства. Настоящее изобретение также относится к терапевтически активным популяциям клеток, лишенных клеточных компонентов в сравнении с клетками здорового индивидуума, в некоторых вариантах осуществления такие популяции клеток могут быть выделены и размножены из аутологичных источников, находящихся в различных болезненных состояниях.

В некоторых вариантах осуществления СПК получают путем выделения и размножения почечных клеток из ткани коркового слоя почки пациента, полученной путем биопсии. Почечные клетки выделяют из почечной ткани путем ферментативного расщепления, размножают с использованием стандартных методов культивирования клеток и отбирают методом центрифугирования размноженных почечных клеток через границу, барьер или интерфейс между фазами с разной плотностью. В данном варианте осуществления СПК состоят в основном из эпителиальных клеток почечных канальцев, которые известны своим регенеративным потенциалом (Bonventre JV. Dedifferentiation and proliferation of surviving epithelial cells in acute renal failure. J Am Soc Nephrol. 2003;14(Suppl. 1):S55-61; Humphreys BD, Czerniak S, DiRocco DP, et al. Repair of injured proximal tubule does not involve specialized progenitors. PNAS. 2011;108:9226-31; Humphreys BD, Valerius MT, Kobayashi A, et al. Intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury. Cell Stem Cell. 2008;2:284-91). И другие паренхиматозные (сосудистые) и стромальные клетки могут присутствовать в популяции аутологичных СПК. В некоторых вариантах осуществления почечные клетки отбирают путем центрифугирования через непрерывный или прерывистый, одноступенчатый или многоступенчатый, градиент плотности.

Как описано в настоящем документе, настоящее изобретение основано, частично, на том удивительном факте, что некоторые подфракции гетерогенной популяции почечных клеток, обогащенные по биоактивным компонентам и истощенные по неактивным или нежелательным компонентам, обеспечивают лучшие терапевтические и регенеративные результаты, чем исходная популяция.

При выделении и размножении почечных клеток получают смесь типов почечных клеток, включая почечные эпителиальные клетки и стромальные клетки. Как отмечено выше, СПК получают путем разделения размноженных почечных клеток методом центрифугирования через границу, барьер или интерфейс между фазами с разной плотностью. Основной тип клеток в отделенной популяции СПК имеет фенотип эпителиальных клеток почечных канальцев. Характеристики СПК, полученных в результате размножения почечных клеток, оценивают с использованием многоэтапного подхода. Клеточную морфологию, кинетику роста и жизнеспособность клеток контролируют в процессе размножения почечных клеток. Плавучую плотность и жизнеспособность СПК характеризуют методом центрифугирования через интерфейс между фазами с разной плотностью и методом с исключением трипанового синего. Фенотип СПК характеризуют методом проточной цитометрии, и функцию СПК определяют на основании экспрессии VEGF и KIM-1.

Специалисты в данной области понимают, что и другие способы выделения и культивирования, известные в данной области, могут быть использованы для клеток, описанных в настоящем документе. Специалисты в данной области также понимают, что популяции биоактивных клеток могут быть получены из источников, отличных от тех, которые конкретно перечислены выше, включая, без ограничения, ткани и органы, отличные от почки, жидкости организма и жировую ткань.

В некоторых вариантах осуществления один или более из различных биологических материалов можно объединять с активным средством (таким как популяция почечных клеток, ее продукт или сфероид, содержащий популяцию почечных клеток и один или более типов, или популяций, не почечных клеток) для получения терапевтических препаратов. В некоторых вариантах осуществления биологические материалы могут иметь любую подходящую форму (например, гранулы) или консистенцию (например, жидкость, гель, и так далее). Неограничивающие примеры подходящих биологических материалов в форме полимерных матриц описаны в Bertram et al., опубликованной патентной заявке США 20070276507 (полное содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки). В некоторых вариантах осуществления полимерная матрица может представлять собой биосовместимый материал, образованный из различных синтетических или природных материалов, включая, но без ограничения, полимолочную кислоту с открытыми порами (OPLA^®), эфир целлюлозы, целлюлозу, сложный эфир целлюлозы, фторсодержащий полиэтилен, фенольный полимер, поли-4-метилпентен, полиакрилoнитрил, полиамид, полиамидимид, полиакрилат, полибензоксазол, поликарбонат, полицианоариловый эфир, полиэфир, полиэфиркарбонат, полиэфир, полиэфирэфиркетон, полиэфиримид, полиэфиркетон, полиэфирсульфон, полиэтилен, полифторолефин, полиимид, полиолефин, полиоксадиазол, полифениленоксид, полифениленсульфид, полипропилен, полистирол, полисульфид, полисульфон, политетрафторэтилен, политиоэфир, политриазол, полиуретан, поливинил, поливинилиденфторид, регенерированную целлюлозу, силикон, мочевину-формальдегид, коллагены, желатин, альгинат, ламинины, фибронектин, шелк, эластин, альгинат, гиалуроновую кислоту, агарозу, либо их сополимеры или физические смеси. В некоторых вариантах осуществления биологический материал представляет собой гидрогель. Конфигурации каркаса могут иметь форму от мягких пористых каркасов до жестких, сохраняющих форму, пористых каркасов. В некоторых вариантах осуществления каркас сконфигурирован в виде жидкого раствора, способного становиться гидрогелем, например, гидрогелем до температуры плавления.

В некоторых вариантах осуществления каркас получают из живой почки или другого органа человека или животного, при этом естественную популяцию клеток элиминируют за счет применения детергента и/или других химических средств, и/или других ферментативных и/или физических методов, известных специалистам в данной области. В данном варианте осуществления естественная трехмерная структура исходного органа сохраняется, наряду со всеми связанными компонентами внеклеточного матрикса, в их естественном, биоактивном контексте. В некоторых вариантах осуществления каркас представляет собой внеклеточный матрикс, полученный из почки или другого органа человека или животного. В некоторых вариантах осуществления конфигурацию собирают в тканеподобную структуру, применяя методы трехмерной биопечати. В некоторых вариантах осуществления конфигурация представляет собой раствор в жидкой форме, который способен превращаться в гидрогель.

Гидрогели могут быть образованы из различных полимерных материалов и могут иметь различное биологическое применение. Гидрогели могут быть описаны физически, как трехмерные сети гидрофильных полимеров. В зависимости от типа, гидрогели имеют разное процентное содержание воды, но, в целом, не растворяются в воде. Несмотря на высокое содержание в них воды, гидрогели также способны связывать большие объемы жидкости благодаря наличию гидрофильных остатков. Гидрогели интенсивно набухают без изменения своей гелеобразной структуры. Основные физические признаки гидрогеля могут быть специально модифицированы, в зависимости от свойств полимеров и устройства, используемого для введения гидрогеля.

В некоторых вариантах осуществления гидрогель образуется, когда в органическом полимере (природном или синтетическом) происходит перекрестная сшивка за счет ковалентных, ионных или водородных связей, с образованием трехмерной структуры (например, структуры с открытой решеткой), которая захватывает воду, образуя гель. В некоторых вариантах осуществления материал, используемый для получения гидрогеля, включает полисахарид, такой как альгинат, полифосфазины и полиакрилаты, которые сшиты тонически, или блок-сополимеры, такие как плюроники™ или тетроники™, блок-сополимеры полиэтиленоксида и полипропиленгликоля, сшивки в которых образуются за счет температуры или pH, соответственно. В некоторых вариантах осуществления гидрогель содержит желатин (например, гидрогель представляет собой биоразлагаемый желатиновый гидрогель).

В некоторых вариантах осуществления материал гидрогеля не вызывает воспалительный ответ. Неограничивающие примеры других материалов, которые можно использовать для получения гидрогеля, включают (a) модифицированные альгинаты, (b) полисахариды (например, геллановую камедь и каррагинаны), которые образуют гель под воздействием одновалентных катионов, (c) полисахариды (например, гиалуроновую кислоту), которые представляют собой очень вязкие жидкости или являются тиксотропными и образуют гель с течением времени за счет медленной эволюции структуры, (d) желатин или коллаген, и (e) полимерные предшественники гидрогелей (например, блок-сополимеры полиэтиленоксид-полипропиленгликоль и белки). В патенте США № 6224893 B1 приведено подробное описание различных полимеров и химических свойств таких полимеров, которые подходят для получения гидрогелей по некоторым вариантам осуществления, описанным в настоящем документе.

В некоторых вариантах осуществления гидрогель, используемый для формулирования биологического материала, является желатиновым. Желатин представляет собой нетоксичный, биоразлагаемый и водорастворимый белок, получаемый из коллагена, который является основным компонентом внеклеточного матрикса (ВКМ) мезенхимальной ткани. Желатин сохраняет информационные сигналы, включая последовательность аргинин-глицин-аспарагиновая кислота (RGD), которая стимулирует клеточную адгезию, пролиферацию и дифференциацию стволовых клеток. Характерным свойством желатина является то, что он проявляет зависимость от верхней критической температуры растворения (UCST). В некоторых вариантах осуществления выше определенного порога температуры 40°C, желатин может растворяться в воде, образуя гибкие, случайные одиночные спирали. При охлаждении возникают водородные связи и ван-дер-ваальсовы взаимодействия, приводящие к образованию тройных спиралей. В некоторых вариантах осуществления эти коллаген-подобные тройные спирали действуют в качестве зон сочленения, инициируя таким образом переход из золя в гель. Желатин широко используют для фармацевтических и медицинских целей.

Коллаген является основным структурным белком во внеклеточном пространстве различных соединительных тканей в телах животных. Как основной компонент соединительной ткани, он является самым распространенным белком у млекопитающих, составляющим от 25% до 35% общего содержания белка в организме. В зависимости от степени минерализации коллагеновые ткани могут быть твердыми (кости), эластичными (сухожилия), или иметь диапазон от твердого до эластичного (хрящи). Коллаген в форме продолговатых волокон преимущественно встречается в волокнистых тканях, таких как сухожилия, связки и кожа. Он также в изобилии представлен в роговице, хрящах, костях, кровеносных сосудах, пищеварительном тракте, межпозвоночных дисках и дентине зубов. В мышечной ткани он является основным компонентом эндомизия. Коллаген составляет от одного до двух процентов мышечной ткани, и составляет 6% веса сильных сухожильных мышц. Коллаген встречается во многих зонах по всему организму. Однако более 90% коллагена в организме человека относится к I типу.

На сегодняшний день обнаружено и описано 28 видов коллагена. Их можно разделить на несколько групп в зависимости от структуры, которую они образуют: фибриллярный (типа I, II, III, V, XI). Не фибриллярный FACIT (связанные с волокнами коллагены с прерванными тройными спиралями) (типа IX, XII, XIV, XVI, XIX). Короткоцепочечный (типа VIII, X). Базальной мембраны (тип IV). Мультиплексин (множественные трехспиральные домены с прерываниями) (типа XV, XVIII). MACIT (связанные с мембраной коллагены с прерванными тройными спиралями) (типа XIII, XVII). Другие (типа VI, VII). Пятью наиболее распространенными типами являются: тип I: кожа, сухожилия, соединения сосудов, органы, кости (основной компонент органической части костей). Тип II: хрящ (основной коллагеновый компонент хряща). Тип III: ретикулиновый (основной компонент ретикулиновых волокон), обычно встречается вместе с типом I. Тип IV: образует базальную пластинку, эпителиально-секретирующий слой базальной мембраны. Тип V: клеточные поверхности, волосы и плацента.

Желатин сохраняет информационные сигналы, включая последовательность аргинин-глицин-аспарагиновая кислота (RGD), которая стимулирует клеточную адгезию, пролиферацию и дифференциацию стволовых клеток. Характерным свойством желатина является то, что он проявляет зависимость от верхней критической температуры растворения (UCST). В некоторых вариантах осуществления выше определенного порога температуры 40°C, желатин может растворяться в воде, образуя гибкие, случайные одиночные спирали. При охлаждении возникают водородные связи и ван-дер-ваальсовы взаимодействия, приводящие к образованию тройных спиралей. Эти коллаген-подобные тройные спирали действуют в качестве зон сочленения, инициируя таким образом переход из золя в гель. Желатин широко используют для фармацевтических и медицинских целей.

В некоторых вариантах осуществления гидрогель, используемый для формулирования инъекционных клеточных композиций по настоящему изобретению, имеет в основе свиной желатин, который может быть получен из свиной шкуры и коммерчески доступен, например, от Nitta Gelatin NA Inc. (NC, USA) или Gelita USA Inc. (IA, USA). Желатин можно растворять, например, в фосфатно-солевом буфере Дульбекко (DPBS), получая термочувствительный гидрогель, который может превращаться в гель и разжижаться при разных температурах. В некоторых вариантах осуществления гидрогель, используемый для формулирования инъекционных клеточных композиций по настоящему изобретению, имеет в основе рекомбинантный человеческий или животный желатин, экспрессированный и очищенный методами, известными специалистам в данной области. В некоторых вариантах осуществления экспрессионный вектор, содержащий всю, или часть, кДНК для человеческого коллагена I типа, альфа-1, экспрессируется в дрожжах Pichia pastoris. Другие экспрессионные векторные системы и организмы известны специалистам в данной области. В конкретном варианте осуществления желатиновый гидрогель по настоящему изобретению представляет собой жидкость при комнатной температуре (22-28°C), и выше, и образует гель при охлаждении до температуры охлаждения (2-8°C).

В некоторых вариантах осуществления биологический материал в виде желатинового гидрогеля, используемый для формулирования СПК в NKA, представляет собой свиной желатин, растворенный в буфере, с образованием термочувствительного гидрогеля. В некоторых вариантах осуществления такой гидрогель является жидким при комнатной температуре, но образует гель при охлаждении до температуры охлаждения (2-8°C). СПК формулируют с гидрогелем, получая NKA. В некоторых вариантах осуществления NKA переводят в гель путем охлаждения и отправляют в клинику в условиях охлаждения (2-8°C). В некоторых вариантах осуществления NKA имеет срок хранения 3 дня. В некоторых вариантах осуществления в клиническом центре препарат нагревают до комнатной температуры перед введением инъекцией в почку пациента. В некоторых вариантах осуществления NKA имплантируют в корковый слой почки с использованием иглы и шприца, подходящих для доставки NKA чрескожным или лапароскопическим введением. В некоторых вариантах осуществления гидрогель получают из желатина или другого рекомбинантного белка внеклеточного матрикса. В некоторых вариантах осуществления гидрогель получают из внеклеточного матрикса почки, или другой ткани или органа. В некоторых вариантах осуществления гидрогель получают из рекомбинантного белка внеклеточного матрикса. В некоторых вариантах осуществления гидрогель содержит желатин, полученный из рекомбинантного коллагена (то есть, рекомбинантный желатин).

В некоторых вариантах осуществления характеристики каркаса или биологического материала могут позволять клеткам прикрепляться и взаимодействовать с материалом каркаса или биологического материала, и/или могут создавать пористые пространства, в которых могут заключаться клетки. В некоторых вариантах осуществления пористые каркасы или биологические материалы делают возможным добавление или отложение одной или более популяций клеток на биологическом материале, сконфигурированном в виде пористого каркаса (например, за счет прикрепления клеток), и/или в порах каркаса (например, за счет захвата клеток). В некоторых вариантах осуществления каркасы или биологические материалы делают возможными или стимулируют взаимодействия между клетками и/или между клетками и биологическим материалом в каркасе, с образованием конструкций, описанных в настоящем документе.

В некоторых вариантах осуществления биологический материал состоит из гиалуроновой кислоты (HA) в форме гидрогеля, содержащего молекулы HA в диапазоне размеров от 5,1 кДа до >2×10⁵ кДа. В некоторых вариантах осуществления биологический материал состоит из гиалуроновой кислоты в форме поропласта, также содержащего молекулы HA в диапазоне размеров от 5,1 кДа до >2×10⁵ кДа. В некоторых вариантах осуществления биологический материал состоит из пены на основе полимолочной кислоты (PLA), имеющей структуру с открытыми порами и размер пор от примерно 50 микрон до примерно 300 микрон. В некоторых вариантах осуществления клетки популяции почечных клеток синтезируют и/или стимулируют синтез высокомолекулярной HA за счет экспрессии синтазы гиалуроновой кислоты 2 (HAS-2), особенно после имплантации в почку.

В некоторых вариантах осуществления биологические материалы, описанные в настоящем документе, реагируют на определенные внешние условия, например, in vitro или in vivo. В некоторых вариантах осуществления биологические материалы являются термочувствительными (например, либо in vitro, либо in vivo). В некоторых вариантах осуществления биологические материалы реагируют на ферментативное расщепление (например, либо in vitro, либо in vivo). В некоторых вариантах осуществления реакцию биологического материала на внешние условия можно точно настраивать, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления температурную чувствительность описанного препарата можно варьировать за счет изменения процентного содержания биологического материала в препарате. Например, процентное содержание желатина в растворе можно регулировать для модуляции температурной чувствительности желатина в конечном препарате (например, жидкости, геле, гранулах и так далее). В некоторых вариантах осуществления раствор желатина можно получать в PBS, DMEM или другом подходящем растворителе. В некоторых вариантах осуществления можно производить химическую сшивку биологических материалов для обеспечения большей устойчивости к ферментативному расщеплению. Например, можно использовать сшивающий реагент карбодиимид для осуществления химической сшивки желатиновых гранул, за счет этого уменьшая чувствительность к эндогенным ферментам.

В некоторых вариантах осуществления реакция биологического материала на внешние условия связана с потерей структурной целостности биологического материала. Хотя по настоящему изобретению обеспечивают температурную чувствительность и устойчивости к ферментативному расщеплению, существуют и другие механизмы, за счет которых в разных биологических материалах может происходить потеря материальной целостности. Эти механизмы могут включать, но без ограничения, термодинамические (например, фазовый переход, такой как плавление, диффузия (например, диффузия ионного сшивающего реагента из биологического материала в окружающие ткани)), химические, ферментативные, изменение pH (например, pH-чувствительные липосомы), ультразвуковые механизмы и фоточувствительность (проникновение света). В некоторых вариантах осуществления точный механизм, за счет которого биологический материал теряет структурную целостность, будет варьироваться, но как правило, механизм запускается либо в момент имплантации, либо после имплантации.

В некоторых вариантах осуществления препараты, описанные в настоящем документе, включают биологические материалы, обладающие свойствами, которые создают благоприятную среду для активного средства (такого как популяция почечных клеток, ее продукт или сфероид, содержащий популяцию почечных клеток и один или более типов, или популяций, не почечных клеток), вводимого субъекту. В некоторых вариантах осуществления препарат содержит первый биологический материал, который обеспечивает благоприятную среду с момента формулирования активного средства с биологическим материалом до момента введения препарата субъекту. В некоторых вариантах осуществления благоприятная среда означает наличие преимущества нахождения одного или более активных средств (таких как популяция почечных клеток, ее продукт или сфероид, содержащий популяцию почечных клеток и один или более типов, или популяций, не почечных клеток) в суспендированном состоянии в практически твердой среде, в отличие от клеток в жидкости (как описано в настоящем документе), до введения субъекту. В некоторых вариантах осуществления первый биологический материал представляет собой термочувствительный биологический материал. В некоторых вариантах осуществления термочувствительный биологический материал может находиться в (i) практически твердом состоянии при температуре примерно 8°C, или ниже, и (ii) практически жидком состоянии при температуре окружающей среды, или выше. В некоторых вариантах осуществления температура окружающей среды соответствует температуре, при которой композиция будет введена. В некоторых вариантах осуществления температура окружающей среды соответствует температуре среды с контролируемой температурой. В некоторых вариантах осуществления температура окружающей среды примерно соответствует комнатной температуре. В некоторых вариантах осуществления температура окружающей среды находится в диапазоне от примерно 18°C до примерно 30°C. В некоторых вариантах осуществления температура окружающей среды составляет примерно 18°C, примерно 19°C, примерно 20°C, примерно 21°C, примерно 22°C, примерно 23°C, примерно 24°C, примерно 25°C, примерно 26°C, примерно 27°C, примерно 28°C, примерно 29°C или примерно 30°C. В некоторых вариантах осуществления одно или более активных средств (таких как популяция почечных клеток, ее продукт или сфероид, содержащий популяцию почечных клеток и один или более типов, или популяций, не почечных клеток), описанных в настоящем документе, могут быть покрыты, нанесены на, погружены в, присоединены к, высеяны, суспендированы в, или заключены в термочувствительный биологический материал.

В некоторых вариантах осуществления одно или более активных средств (таких как популяция почечных клеток, ее продукт или сфероид, содержащий популяцию почечных клеток и один или более типов, или популяций, не почечных клеток) равномерно распределены по всему объему стабилизирующего клетки биологического материала.

В некоторых вариантах осуществления препарат представляет собой инъекционный препарат, содержащий одно или более активных средств (таких как популяция почечных клеток, ее продукт или сфероид, содержащий популяцию почечных клеток и один или более типов, или популяций, не почечных клеток) и термочувствительный стабилизирующий клетки биологический материал, который находится в (i) практически твердом состоянии при температуре примерно 8°C, или ниже, и (ii) практически жидком состоянии при температуре окружающей среды, или выше, где биологический материал представляет собой гидрогель, где биологический материал находится в переходном состоянии от твердого состояния к жидкому между температурой 8°C и температурой окружающей среды, или выше; и где одно или более активных средств суспендированы и диспергированы во всем объеме стабилизирующего клетки биологического материала. В некоторых вариантах осуществления температура окружающей среды находится в диапазоне от 18°C до 30°C. В некоторых вариантах осуществления биологический материал находится в жидком состоянии при 37°C. В некоторых вариантах осуществления практически твердое состояние представляет собой гелеобразное состояние. В некоторых вариантах осуществления гидрогель содержит желатин. В некоторых вариантах осуществления желатин присутствует в препарате в концентрации от 0,5% до 1% (масс/об). В некоторых вариантах осуществления желатин присутствует в препарате в концентрации 0,75% (масс/об).

В некоторых вариантах осуществления препарат также содержит антиоксидант, переносчик кислорода, иммуномодулирующий фактор, фактор рекрутинга клеток, фактор прикрепления клеток, противовоспалительное средство, иммуносупрессор, ангиогенный фактор или ранозаживляющий фактор.

В некоторых вариантах осуществления препарат также содержит антиоксидант. В некоторых вариантах осуществления антиоксидант представляет собой 6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления 6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновая кислота присутствует в концентрации от 50 мкМ до 150 мкМ. В некоторых вариантах осуществления 6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновая кислота присутствует в концентрации 100 мкМ.

В некоторых вариантах осуществления препарат также содержит переносчик кислорода. В некоторых вариантах осуществления переносчик кислорода представляет собой перфторуглерод.

В некоторых вариантах осуществления препарат также содержит иммуномодулирующий фактор.

В некоторых вариантах осуществления препарат также содержит иммуносупрессор.

В некоторых вариантах осуществления препарат содержит 0,75% (масс/об) желатин и 100 мкМ 6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновую кислоту.

В некоторых вариантах осуществления препарат также содержит биосовместимые гранулы, содержащие биологический материал. В некоторых вариантах осуществления гранулы являются сшитыми. В некоторых вариантах осуществления сшитые гранулы меньше подвержены ферментативному расщеплению в сравнении с не сшитыми биосовместимыми гранулами. В некоторых вариантах осуществления сшитые гранулы представляют собой сшитые карбодиимидом гранулы. В некоторых вариантах осуществления карбодиимид выбран из группы, состоящей из 1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимида гидрохлорида (EDC), DCC - N, N'-дициклогексилкарбодиимида (DCC) и N, N'-диизопропилкарбодиимида (DIPC). В некоторых вариантах осуществления карбодиимид представляет собой 1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимид гидрохлорид (EDC). В некоторых вариантах осуществления сшитые гранулы имеют меньшее количество свободных первичных аминов в сравнении с не сшитыми гранулами. В некоторых вариантах осуществления количество свободных первичных аминов можно определять спектрофотометрически при 355 нм. В некоторых вариантах осуществления гранулы засевают активным средством (таким как популяция почечных клеток, ее продукт или сфероид, содержащий популяцию почечных клеток и один или более типов, или популяций, не почечных клеток). В некоторых вариантах осуществления препарат также содержит дополнительные биосовместимые гранулы, содержащие термочувствительный биологический материал, который находится в (i) практически твердом состоянии при температуре окружающей среды, или ниже, и (ii) практически жидком состоянии при 37°C, или выше. В некоторых вариантах осуществления биологический материал находится в переходном состоянии от твердого состояния к жидкому между температурой окружающей среды и 37°C. В некоторых вариантах осуществления практически твердое состояние представляет собой гелеобразное состояние. В некоторых вариантах осуществления биологический материал представляет собой гидрогель. В некоторых вариантах осуществления гидрогель содержит желатин. В некоторых вариантах осуществления гранулы содержат желатин в концентрации от 5% (масс/об) до 10% (масс/об). В некоторых вариантах осуществления дополнительные биосовместимые гранулы представляют собой разделительные гранулы. В некоторых вариантах осуществления разделительные гранулы не засеяны активным средством (таким как популяция почечных клеток, ее продукт или сфероид, содержащий популяцию почечных клеток и один или более типов, или популяций, не почечных клеток).

В некоторых вариантах осуществления препарат содержит, или дополнительно содержит, продукт, секретируемый популяцией почечных клеток. В некоторых вариантах осуществления продукт представляет собой паракринный фактор. В некоторых вариантах осуществления продукт представляет собой эндокринный фактор. В некоторых вариантах осуществления продукт представляет собой юкстакринный фактор. В некоторых вариантах осуществления продукт представляет собой везикулы. В некоторых вариантах осуществления везикулы представляют собой микровезикулы. В некоторых вариантах осуществления везикулы представляют собой экзосомы.

В некоторых вариантах осуществления везикулы содержат секретируемый продукт, выбранный из группы, состоящей из паракринных факторов, эндокринных факторов, юкстакринных факторов и РНК. В некоторых вариантах осуществления РНК представляет собой микроРНК. В некоторых вариантах осуществления везикулы содержат микроРНК, которая ингибирует ингибитор активации плазминогена 1 типа (PAI-1) и/или TGFβ1.

В некоторых вариантах осуществления секретируемый продукт представляет собой паракринный и/или юкстакринный фактор, такой как альфа-1-микроглобулин, бета-2-микроглобулин, кальбиндин, кластерин, фактор роста соединительной ткани, цистатин-C, глутатион-S-трансфераза альфа, молекула повреждения почек 1, желатиназа-ассоциированный липокалин нейтрофилов, остеопонтин, фактор «трилистника» 3, гликопротеин мочи Тамма-Хорсфалла, тканевый ингибитор металлопротеиназы-1, фактор роста эндотелия сосудов, фибронектин, интерлейкин-6 или моноцитарный хемотаксический протеин 1.

Настоящее изобретение также относится к препаратам, содержащим биологические материалы, которые распадаются в течение периода времени порядка нескольких секунд, минут, часов или дней. Это отличается от большого количества работ, направленных на имплантацию твердых материалов, которые затем медленно распадаются в течение дней, недель или месяцев. В некоторых вариантах осуществления биологический материал имеет одну или более из следующих характеристик: биологическую совместимость, биоразлагаемость/биовсасываемость, практически твердое состояние до, и в процессе, имплантации субъекту, утрату структурной целостности (практически твердого состояния) после имплантации и совместимую с клетками среду для поддержания жизнеспособности клеток. В некоторых вариантах осуществления способность биологического материала удерживать имплантированные частицы на расстоянии во время имплантации стимулирует врастание естественной ткани. В некоторых вариантах осуществления биологический материал также облегчает имплантацию твердых препаратов. В некоторых вариантах осуществления биологический материал обеспечивает локализацию препарата, описанного в настоящем документе, поскольку введение твердого элемента помогает предотвращать диспергирование доставляемых материалов в ткани во время имплантации. В некоторых вариантах осуществления в случае клеточных препаратов твердый биологический материал также способствует повышению стабильности и жизнеспособности прикрепляющихся клеток, в сравнении с клетками, суспендированными в жидкости. В некоторых вариантах осуществления короткий срок существования структурной целостности означает, что вскоре после имплантации биологический материал больше не создает значительный барьер для врастания ткани или интеграции доставленных клеток/материалов с тканью хозяина.

В некоторых вариантах осуществления конструкция включает биологический материал, сконфигурированный в виде трехмерного (3D) пористого биологического материала, подходящего для захвата и/или прикрепления смеси. В некоторых вариантах осуществления конструкция включает биологический материал, сконфигурированный в виде жидкого или полужидкого геля, подходящего для погружения в него, прикрепления, суспендирования или покрытия клеток млекопитающих. В некоторых вариантах осуществления конструкция включает биологический материал, состоящий из преимущественно высокомолекулярных форм гиалуроновой кислоты (HA) в виде гидрогеля. В некоторых вариантах осуществления конструкция включает биологический материал, состоящий из преимущественно высокомолекулярных форм гиалуроновой кислоты (HA) в виде поропласта. В некоторых вариантах осуществления конструкция включает биологический материал, состоящий из пены на основе полимолочной кислоты с порами размером от примерно 50 микрон до примерно 300 микрон. В некоторых вариантах осуществления конструкция включает одну или более популяций клеток, которые могут быть получены из образца почки, являющегося аутологичным для субъекта, который нуждается в улучшении почечной функции. В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой биопсийный образец почки. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет заболевание почек. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток получают из не аутологичного образца почки. В некоторых вариантах осуществления конструкция приводит к улучшению почечной функции. В некоторых вариантах осуществления конструкция приводит к регенерации почек. В некоторых вариантах осуществления конструкция обеспечивает эритроидный гомеостаз.

В некоторых вариантах осуществления препарат содержит биоактивные клетки в сочетании со вторым биологическим материалом, который обеспечивает благоприятную среду для объединенных с ним клеток с момента формулирования вплоть до момента после введения субъекту. В некоторых вариантах осуществления благоприятная среда, обеспечиваемая вторым биологическим материалом, означает наличие преимущества введения клеток в биологическом материале, который сохраняет структурную целостность вплоть до момента введения субъекту и в течение некоторого периода времени после введения. В некоторых вариантах осуществления структурная целостность второго биологического материала после имплантации сохраняется в течение нескольких минут, часов, дней или недель. В некоторых вариантах осуществления структурная целостность сохраняется в течение менее одного месяца, менее одной недели, менее одного дня или менее одного часа. В некоторых вариантах осуществления в течение относительно короткого периода времени структурная целостность позволяет иметь препарат, который способен доставлять активное средство и биологический материал в целевой участок в ткани или органе, с контролируемой обработкой, размещением или диспергированием, не препятствуя или не мешая взаимодействию включенных элементов с тканью или органом, в который он был помещен.

В некоторых вариантах осуществления второй биологический материал представляет собой термочувствительный биологический материал, который имеет иную чувствительность, чем первый биологический материал. Второй биологический материал может иметь (i) практически твердое состояние при температуре около температуры окружающей среды, или ниже, и (ii) практически жидкое состояние при примерно 37°C, или выше. В некоторых вариантах осуществления температура окружающей среды примерно соответствует комнатной температуре.

В некоторых вариантах осуществления второй биологический материал представляет собой сшитые гранулы. В некоторых вариантах осуществления сшитые гранулы могут иметь тонко настраиваемое время пребывания in vivo в зависимости от степени сшивки, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления сшитые гранулы содержат биоактивные клетки и являются устойчивыми к ферментативному расщеплению, как описано в настоящем документе.

В некоторых вариантах осуществления препараты по настоящему изобретению могут включать первый биологический материал в сочетании с активным средством, например, биоактивными клетками, с добавлением, или без добавления, второго биологического материала в сочетании с активным средством, например, биоактивными клетками. В некоторых вариантах осуществления, если препарат включает второй биологический материал, тот может представлять собой термочувствительные гранулы и/или сшитые гранулы.

В некоторых вариантах осуществления препараты биоактивных клеток и/или конструкции, описанные в настоящем документе, могут быть введены в виде препаратов биоактивных клеток. В некоторых вариантах осуществления препараты включают клетки и один или более биологических материалов, которые обеспечивают стабильность препаратов биоактивных клеток и/или конструкций, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления биологический материал представляет собой термочувствительный биологический материал, который может поддерживать по меньшей мере две разные фазы, или состояния, в зависимости от температуры. В некоторых вариантах осуществления биологический материал способен поддерживать первое состояние при первой температуре, второе состояние при второй температуре и/или третье состояние при третьей температуре. В некоторых вариантах осуществления первое, второе и третье состояния могут представлять собой практически твердое, практически жидкое или практически полутвердое или полужидкое состояния. В некоторых вариантах осуществления биологический материал имеет первое состояние при первой температуре и второе состояние при второй температуре, при этом первая температура является более низкой, чем вторая температура.

В некоторых вариантах осуществления состояние термочувствительного биологического материала является практически твердым состоянием при температуре примерно 8°C, или ниже. В некоторых вариантах осуществления практически твердое состояние сохраняется при температуре примерно 1°C, примерно 2°C, примерно 3°C, примерно 4°C, примерно 5°C, примерно 6°C, примерно 7°C или примерно 8°C. В некоторых вариантах осуществления практически твердое состояние имеет форму геля. В некоторых вариантах осуществления состояние термочувствительного биологического материала является практически жидким состоянием при температуре окружающей среды, или выше. В некоторых вариантах осуществления практически жидкое состояние сохраняется при температуре примерно 25°C, примерно 25,5°C, примерно 26°C, примерно 26,5°C, примерно 27°C, примерно 27,5°C, примерно 28°C, примерно 28,5°C, примерно 29°C, примерно 29,5°C, примерно 30°C, примерно 31°C, примерно 32°C, примерно 33°C, примерно 34°C, примерно 35°C, примерно 36°C или примерно 37°C. В некоторых вариантах осуществления температура окружающей среды примерно соответствует комнатной температуре.

В некоторых вариантах осуществления состояние термочувствительного биологического материала является практически твердым состоянием при температуре около температуры окружающей среды, или ниже. В некоторых вариантах осуществления температура окружающей среды примерно соответствует комнатной температуре. В некоторых вариантах осуществления практически твердое состояние сохраняется при температуре примерно 17°C, примерно 16°C, примерно 15°C, примерно 14°C, примерно 13°C, примерно 12°C, примерно 11°C, примерно 10°C, примерно 9°C, примерно 8°C, примерно 7°C, примерно 6°C, примерно 5°C, примерно 4°C, примерно 3°C, примерно 2°C или примерно 1°C. В некоторых вариантах осуществления практически твердое состояние имеет форму гранулы. В некоторых вариантах осуществления состояние термочувствительного биологического материала является практически жидким состоянием при температуре примерно 37°C или выше. В некоторых вариантах осуществления практически твердое состояние сохраняется при температуре примерно 37°C, примерно 38°C, примерно 39°C или примерно 40°C.

В некоторых вариантах осуществления термочувствительный биологический материал может быть предоставлен в форме раствора, в форме гранул или в других подходящих формах, описанных в настоящем документе и/или известных специалистам в данной области. В некоторых вариантах осуществления популяции клеток и препараты, описанные в настоящем документе, могут быть покрыты, нанесены на, погружены в, присоединены к, высеяны, суспендированы в, или заключены в термочувствительный биологический материал. В некоторых вариантах осуществления термочувствительный биологический материал может быть предоставлен без каких-либо клеток, например, в форме разделительных гранул.

В некоторых вариантах осуществления термочувствительный биологический материал имеет переходное состояние между первым состоянием и вторым состоянием. В некоторых вариантах осуществления переходное состояние представляет собой переходное состояние из твердого вещества в жидкость в диапазоне температур от примерно 8°C до примерно температуры окружающей среды. В некоторых вариантах осуществления температура окружающей среды примерно соответствует комнатной температуре. В некоторых вариантах осуществления переходное состояние из твердого вещества в жидкость имеет место при одной или более температурах, составляющих примерно 8°C, примерно 9°C, примерно 10°C, примерно 11°C, примерно 12°C, примерно 13°C, примерно 14°C, примерно 15°C, примерно 16°C, примерно 17°C и примерно 18°C.

В некоторых вариантах осуществления термочувствительный биологический материал имеет определенную вязкость при конкретной температуре, измеряемую в сантипуазах (сП). В некоторых вариантах осуществления биологический материал имеет вязкость при 25°C, составляющую от примерно 1 сП до примерно 5 сП, от примерно 1,1 сП до примерно 4,5 сП, от примерно 1,2 сП до примерно 4 сП, от примерно 1,3 сП до примерно 3,5 сП, от примерно 1,4 сП до примерно 3,5 сП, от примерно 1,5 сП до примерно 3 сП, от примерно 1,55 сП до примерно 2,5 сП или от примерно 1,6 сП до примерно 2 сП. В некоторых вариантах осуществления биологический материал имеет вязкость при 37°C, составляющую от примерно 1,0 сП до примерно 1,15 сП. Вязкость при 37°C может составлять примерно 1,0 сП, примерно 1,01 сП, примерно 1,02 сП, примерно 1,03 сП, примерно 1,04 сП, примерно 1,05 сП, примерно 1,06 сП, примерно 1,07 сП, примерно 1,08 сП, примерно 1,09 сП, примерно 1,10 сП, примерно 1,11 сП, примерно 1,12 сП, примерно 1,13 сП, примерно 1,14 сП или примерно 1,15 сП. В некоторых вариантах осуществления биологический материал представляет собой раствор желатина. В некоторых вариантах осуществления желатин присутствует в растворе в концентрации примерно 0,5%, примерно 0,55%, примерно 0,6%, примерно 0,65%, примерно 0,7%, примерно 0,75%, примерно 0,8%, примерно 0,85%, примерно 0,9%, примерно 0,95% или примерно 1% (масс/об). В некоторых вариантах осуществления биологический материал представляет собой 0,75% (масс/об) раствор желатина в PBS. В некоторых вариантах осуществления 0,75% (масс/об) раствор имеет вязкость при 25°C, составляющую от примерно 1,6 сП до примерно 2 сП. В некоторых вариантах осуществления 0,75% (масс/об) раствор имеет вязкость при 37°C, составляющую от примерно 1,07 сП до примерно 1,08 сП. В некоторых вариантах осуществления раствор желатина может быть получен в PBS, DMEM или другом подходящем растворителе.

В некоторых вариантах осуществления препарат биоактивных клеток также содержит средство, сохраняющее жизнеспособность клеток. В некоторых вариантах осуществления средство, сохраняющее жизнеспособность клеток, выбрано из группы, состоящей из антиоксиданта, переносчика кислорода, иммуномодулирующего фактора, фактора рекрутинга клеток, фактора прикрепления клеток, противовоспалительного средства, ангиогенного фактора, матриксной металлопротеиназы, ранозаживляющего фактора и продуктов, секретируемых из биоактивных клеток.

В некоторых вариантах осуществления антиоксиданты характеризуются способностью ингибировать окисление других молекул. Антиоксиданты включают, без ограничения, одно или более из 6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновой кислоты (тролокс^®), каротиноидов, флавоноидов, изофлавонов, убихинона, глутатиона, липоевой кислоты, супероксиддисмутазы, аскорбиновой кислоты, витамина E, витамина A, смешанных каротиноидов (например, бета-каротина, альфа-каротина, гамма-каротина, лютеина, ликопина, фитоина, фитофлуена и астаксантина), селена, кофермента Q10, индол-3-карбинола, проантоцианидов, ресвератрола, кверцетина, катехинов, салициловой кислоты, куркумина, билирубина, щавелевой кислоты, фитиновой кислоты, липоевой кислоты, ванильной кислоты, полифенолов, феруловой кислоты, теафлавинов, а также их производных. Специалистам в данной области известны и другие подходящие антиоксиданты, которые могут быть использованы по настоящему изобретению.

В некоторых вариантах осуществления переносчики кислорода представляют собой средства, характеризующиеся способностью переносить и высвобождать кислород. Они включают, без ограничения, перфторуглероды и фармацевтические препараты, содержащие перфторуглероды. Подходящие переносчики кислорода на основе перфторуглерода включают, без ограничения, перфтороктил бромид (C8F17Br); перфтордихоротан (C8F16C12); перфтордецил бромид; перфлуброн; перфтордекалин; перфтортрипопиламин; перфторметилциклопиперидин; флуозол^® (перфтордекалин и перфтортрипопиламин); перфторан^® (перфтордекалин и перфторметилциклопиперидин); оксигент^® (перфтордецилбромид и перфлуброн); оксицит™ (перфтор(трет-бутилциклогексан)). Специалисты в данной области понимают, что и другие подходящие переносчики кислорода на основе перфторуглерода могут быть использованы по настоящему изобретению.

Иммуномодулирующие факторы включают, без ограничения, остеопонтин, факторы FAS-лиганда, интерлейкины, трансформирующий фактор роста бета, тромбоцитарный фактор роста, кластерин, трансферрин, белок, экспрессируемый и секретируемый нормальными T-клетками при активации (RANTES), ингибитор активатора плазминогена 1 (Pai-1), фактор некроза опухоли альфа (TNF-альфа), интерлейкин 6 (IL-6), альфа-1-микроглобулин и бета-2-микроглобулин. Специалисты в данной области понимают, что и другие подходящие иммуномодулирующие факторы могут быть использованы по настоящему изобретению.

В некоторых вариантах осуществления противовоспалительные средства или иммуносупрессоры также могут быть частью препарата. Специалисты в данной области понимают, что и другие подходящие антиоксиданты могут быть использованы в настоящих препаратах и/или методах лечения.

Факторы рекрутинга клеток включают, без ограничения, моноцитарный хемотаксический протеин 1 (MCP-1) и CXCL-1. Специалисты в данной области понимают, что и другие подходящие факторы рекрутинга клеток могут быть использованы в настоящих препаратах и/или методах лечения.

Факторы прикрепления клеток включают, без ограничения, фибронектин, проколлаген, коллаген, ICAM-1, фактор роста соединительной ткани, ламинины, протеогликаны, специфические пептиды клеточной адгезии, такие как RGD и YSIGR. Специалисты в данной области понимают, что и другие подходящие факторы прикрепления клеток могут быть использованы в настоящих препаратах и/или методах лечения.

Ангиогенные факторы включают, без ограничения, фактор роста эндотелия сосудов F (VEGF) и ангиопоэтин-2 (ANG-2). Специалисты в данной области понимают, что и другие подходящие ангиогенные факторы могут быть использованы в конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения.

Матриксные металлопротеазы включают, без ограничения, матриксную металлопротеиназу 1 (MMP1), матриксную металлопротеиназу 2 (MMP2), матриксную металлопротеиназу 9 (MMP-9) и тканевый ингибитор металлопротеиназ 1 (TIMP-1).

Ранозаживляющие факторы включают, без ограничения, фактор роста кератиноцитов 1 (KGF-1), тканевой активатор плазминогена (tPA), кальбиндин, кластерин, цистатин C, фактор «трилистника» 3. Специалисты в данной области понимают, что и другие подходящие ранозаживляющие факторы могут быть использованы в настоящих препаратах и/или методах лечения.

Настоящее изобретение также относится к препаратам биоактивных клеток, содержащим имплантируемые конструкции, включающие биологический материал и биоактивные почечные клетки, для лечения заболевания почек. В некоторых вариантах осуществления конструкция выполнена из биосовместимого материала, или биологического материала, каркаса или матрицы из одного или более синтетических или природных биосовместимых материалов, и одной или более популяций клеток, описанных в настоящем документе, нанесенных на, или погруженных в, поверхность каркаса за счет прикрепления и/или захвата. В некоторых вариантах осуществления конструкция выполнена из биологического материала и одной или более популяций клеток, описанных в настоящем документе, покрытых, нанесенных на, внесенных в, прикрепленных к, заключенных в, погруженных в, высеянных или объединенных с компонентом(ами) биологического материала. Любые из популяций клеток, описанных в настоящем документе, включая обогащенные популяции клеток (например, СПК), могут быть использованы в сочетании с матрицей при формировании конструкции. В некоторых вариантах осуществления препарат биоактивных клеток получен из биосовместимого материала, или биологического материала, и популяции СПК, описанной в настоящем документе.

В некоторых вариантах осуществления препарат биоактивных клеток представляет собой Neo-Kidney Augment (NKA), который представляет собой инъекционный препарат, состоящий из аутологичных, гомологичных селективных почечных клеток (СПК), сформулированных в биологическом материале (желатиновом гидрогеле). В некоторых вариантах осуществления аутологичные, гомологичные СПК получают путем выделения и размножения почечных клеток из ткани коркового слоя почки пациента, полученной при биопсии почки, и отбора методом центрифугирования размноженных почечных клеток через границу, барьер или интерфейс между фазами с разной плотностью (например, одноэтапного прерывистого разделения в градиенте плотности). В некоторых вариантах осуществления аутологичные СПК получают путем выделения и размножения почечных клеток из ткани коркового слоя почки пациента, полученной при биопсии почки, и отбора методом центрифугирования размноженных почечных клеток в непрерывном или прерывистом, одноступенчатом или многоступенчатом, градиенте плотности. В некоторых вариантах осуществления СПК состоят в основном из эпителиальных клеток почечных канальцев, которые хорошо известны своим регенеративным потенциалом (Humphreys et al. (2008) Intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury. Cell Stem Cell. 2(3):284-91). В некоторых вариантах осуществления инъекция СПК в почки реципиента приводила к значительному улучшению показателей выживаемости, функций концентрирования мочи и фильтрования у животных. В некоторых вариантах осуществления СПК имеют ограниченный срок хранения и ограниченную стабильность. В некоторых вариантах осуществления формулирование СПК в биологическом материале, представляющем собой желатиновый гидрогель, обеспечивает повышенную стабильность клеток, за счет чего увеличивается срок хранения препарата, повышается стабильность NKA при транспортировке и доставке NKA в корковый слой почки при клиническом применении.

В некоторых вариантах осуществления NKA производят, сначала получая ткань коркового слоя почки от донора с использованием стандартной клинической процедуры биопсии почки. В некоторых вариантах осуществления донор является субъектом, которому предстоит лечение. В некоторых вариантах осуществления почечные клетки выделяют из почечной ткани путем ферментативного расщепления и размножают с использованием стандартных методов культивирования клеток. В некоторых вариантах осуществления среда для культивирования клеток, используемая для размножения первичных почечных клеток, не содержит какие-либо факторы дифференцировки. В некоторых вариантах осуществления собранные почечные клетки подвергают разделению через границу или интерфейс между фазами с разной плотностью, или в градиенте плотности, получая СПК.

В некоторых вариантах осуществления препарат содержит биологические материалы, разработанные или адаптированные для реагирования на внешние условия, как описано в настоящем документе. В результате, характер связи популяции биоактивных клеток с биологическим материалом в конструкции будет меняться в зависимости от внешних условий. В некоторых вариантах осуществления связь популяции клеток с термочувствительным биологическим материалом меняется в зависимости от температуры. В некоторых вариантах осуществления конструкция содержит популяцию биоактивных почечных клеток и биологический материал, находящийся в практически твердом состоянии при температуре примерно 8°C, или ниже, и в практически жидком состоянии при температуре около температуры окружающей среды, или выше, при этом популяция клеток суспендирована в биологическом материале при температуре примерно 8°C, или ниже. В некоторых вариантах осуществления популяция клеток может практически свободно перемещаться по всему объему биологического материала при температуре около температуры окружающей среды, или выше. В некоторых вариантах осуществления суспендирование популяции клеток в практически твердой фазе при более низкой температуре обеспечивает преимущество стабильности для клеток, таких как прикрепляющиеся клетки, в сравнении с клетками в жидкости. В некоторых вариантах осуществления суспендирование клеток в практически твердом состоянии обеспечивает одно или более из следующих преимуществ: i) предотвращает оседание клеток, ii) позволяет клеткам оставаться заякоренными на биологическом материале в суспендированном состоянии; iii) позволяет клеткам оставаться более равномерно распределенными по всему объему биологического материала; iv) предотвращает образование агрегатов клеток и v) обеспечивает лучшую защиту клеток при хранении и транспортировке препарата. Препарат, способный сохранять такие признаки до введения субъекту, обладает по меньшей мере тем преимуществом, что клетки, в целом, будут более здоровыми в препарате, и может быть введена более однородная и воспроизводимая доза клеток.

В некоторых вариантах осуществления процесс производства препаратов биоактивных клеток разработан для доставки препарата в течение примерно четырех недель от биопсии пациента до имплантации препарата. В некоторых вариантах осуществления вариабельность тканей от разных пациентов создает проблемы с поставкой препарата по фиксированному графику имплантации. В некоторых вариантах осуществления размноженные почечные клетки криоконсервируют в процессе размножения клеток для нивелирования этой вариабельности размножения клеток от разных пациентов. В некоторых вариантах осуществления криоконсервированные почечные клетки являются постоянным источником клеток в случае необходимости другого препарата (например, в случае задержки вследствие болезни пациента, непредвиденных событий и так далее), а также для производства нескольких доз, по мере необходимости, для повторной имплантации.

В некоторых вариантах осуществления композиция биоактивных клеток состоит из аутологичных, гомологичных клеток, сформулированных в биологическом материале (желатиновом гидрогеле). В некоторых вариантах осуществления композиция содержит от примерно 20×10⁶ клеток в мл до примерно 200×10⁶ клеток в мл в растворе желатина с фосфатно-солевым буфером Дульбекко (DPBS). В некоторых вариантах осуществления количество клеток в мл препарата составляет примерно 20×10⁶ клеток в мл, примерно 40×10⁶ клеток в мл, примерно 60×10⁶ клеток в мл, примерно 100×10⁶ клеток в мл, примерно 120×10⁶ клеток в мл, примерно 140×10⁶ клеток в мл, примерно 160×10⁶ клеток в мл, примерно 180×10⁶ клеток в мл или примерно 200×10⁶ клеток в мл. В некоторых вариантах осуществления желатин присутствует в растворе в концентрации примерно 0,5%, примерно 0,55%, примерно 0,6%, примерно 0,65%, примерно 0,7%, примерно 0,75%, примерно 0,8%, примерно 0,85%, примерно 0,9%, примерно 0,95% или примерно 1%, (масс/об). В некоторых вариантах осуществления биологический материал представляет собой 0,88% (масс/об) раствор желатина в DPBS. В некоторых вариантах осуществления инъекционный препарат содержит биологический материал, содержащий примерно 0,88% (масс/об) желатина и композицию, содержащую популяцию биоактивных почечных клеток (БПК), где БПК представляют собой обогащенную популяцию клеток почечных канальцев, имеющих плотность более примерно 1,04 г/мл. В некоторых вариантах осуществления инъекционный препарат содержит биологический материал, содержащий примерно 0,88% (масс/об) желатина и композицию, содержащую популяцию биоактивных почечных клеток (БПК), где БПК представляют собой обогащенную популяцию клеток почечных канальцев, имеющих плотность более примерно 1,0419 г/мл или примерно 1,045 г/мл.

В некоторых вариантах осуществления NKA предоставляют в стерильном 10-мл шприце одноразового использования. В некоторых вариантах осуществления конечный объем рассчитывают, исходя из концентрации NKA, составляющей 100×10⁶ СПК/мл, и целевой дозы 3,0×10⁶ СПК/г массы почки. В некоторых вариантах осуществления масса почка представляет собой массу, оцененную на основании результатов МРТ. В некоторых вариантах осуществления терапевтическую дозу определяют (например, специалист в области медицины, такой как хирург) в момент инъекции на основании массы почки пациента. В некоторых вариантах осуществления доза составляет от примерно 2,5×10⁶ СПК/г массы почки до примерно 3,5×10⁶ СПК/г массы почки.

В некоторых вариантах осуществления общее количество клеток можно выбирать для препарата, и объем препарата можно корректировать для достижения надлежащей терапевтической дозы. В некоторых вариантах осуществления препарат может содержать дозу клеток для субъекта, которая представляет собой однократную дозу или однократную дозу плюс дополнительные дозы. В некоторых вариантах осуществления доза может быть предоставлена в виде конструкции, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество популяции биоактивных почечных клеток, описанных в настоящем документе, может находиться в диапазоне от максимального количества клеток, которое безопасно получать субъекту, до минимального количества клеток, необходимого для лечения заболевания почек, например, стабилизации, снижения темпов ухудшения состояния или улучшения одной или более почечных функций.

В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество популяций биоактивных почечных клеток, описанных в настоящем документе, может быть суспендировано в фармацевтически приемлемом носителе или эксципиенте. Такой носитель включает, но без ограничения, основную среду для культивирования плюс 1% сывороточный альбумин, солевой раствор, забуференный солевой раствор, декстроза, вода, коллаген, альгинат, гиалуроновая кислота, фибриновый клей, полиэтиленгликоль, поливинилспирт, карбоксиметилцеллюлоза, а также их сочетания. Препарат должен соответствовать способу введения.

В некоторых вариантах осуществления препарат, или композицию, биоактивных почечных клеток формулируют обычными способами в виде фармацевтической композиции, адаптированной для введения людям. В некоторых вариантах осуществления композиции для внутривенного введения, внутриартериального введения или введения в почечную капсулу, например, представляют собой растворы в стерильном изотоническом водном буфере. В некоторых вариантах осуществления композиция может также содержать местный анестетик для облегчения боли в участке инъекции. В некоторых вариантах осуществления ингредиенты либо предоставляют отдельно, либо смешивают вместе в стандартной лекарственной форме, например, в виде криоконсервированного концентрата в герметично закрытом контейнере, таком как ампула, с указанием количества активного средства. В некоторых вариантах осуществления, если композицию предстоит вводить инфузией, она может быть расфасована в бутыль для инфузии, содержащую стерильную воду или солевой раствор фармацевтической категории. В некоторых вариантах осуществления, если композицию вводят инъекцией, может быть предоставлена ампула со стерильной водой для инъекций или солевым раствором, чтобы ингредиенты можно было смешивать перед введением.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтически приемлемые носители можно выбирать, частично, в зависимости от конкретной вводимой композиции, а также в зависимости от конкретного используемого способа введения композиции. Соответственно, существует множество подходящих препаратов фармацевтических композиций (смотри, например, публикацию Alfonso R Gennaro (ed), Remington: The Science and Practice of Pharmacy, прежнее название Remington's Pharmaceutical Sciences 20-е издание, Lippincott, Williams & Wilkins, 2003, полное содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки). В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции, как правило, формулируют в виде стерильных, практически изотонических препаратов и в полном соответствии со всеми требованиями Надлежащей производственной практики (GMP), разработанными Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США.

В некоторых вариантах осуществления препарат биоактивных клеток содержит средство, сохраняющее жизнеспособность клеток, выбранное из группы, состоящей из антиоксиданта, переносчика кислорода, иммуномодулирующего фактора, фактора рекрутинга клеток, фактора прикрепления клеток, противовоспалительного средства, ангиогенного фактора, ранозаживляющего фактора и продуктов, секретируемых из биоактивных клеток.

В некоторых вариантах осуществления продукты, секретируемые из биоактивных клеток, описанных в настоящем документе, также могут быть добавлены к препарату биоактивных клеток в качестве средства, сохраняющего жизнеспособность клеток.

В некоторых вариантах осуществления препарат включает термочувствительный биологический материал, описанный в настоящем документе, и популяцию биосовместимых гранул, содержащих биологический материал. В некоторых вариантах осуществления гранулы являются сшитыми. Сшивку можно осуществлять с использованием любого подходящего сшивающего агента, известного специалистам в данной области, такого как, например, карбодиимиды; альдегиды (например, фурфурол, акролеин, формальдегид, глутаральдегид, глицерилальдегид), сшивающие агенты на основе сукцинимида (бис(сульфосукцинимидил)суберат (BS3), дисукцинимидилглутарат (DSG), дисукцинимидилсуберат (DSS), дитиобис(сукцинимидил пропионат), этиленгликоль-бис(сульфосукцинимидилсукцинат), этиленгликоль-бис(сукцинимидилсукцинат) (EGS), бис(сульфосукцинимидил)глутарат (BS2G), дисукцинимидилтартрат (DST)); эпоксиды (диглицидный эфир этиленгликоля, диглицидный эфир 1,4-бутандиола); сахариды (сахара глюкоза и альдоза); сульфоновые кислоты и п-толуолсульфоновая кислота; карбонилдиимидазол; генипин; имины; кетоны; дифенилфосфорилазид (DDPA); терефталоил хлорид; нитрат гексагидрат церия (III); микробная трансглутаминаза и пероксид водорода. Специалистам в данной области известны и другие подходящие сшивающие агенты и методы сшивки для использования в настоящих способах, препаратах и/или методах лечения.

В некоторых вариантах осуществления гранулы представляют собой сшитые карбодиимидом гранулы. В некоторых вариантах осуществления сшитые карбодиимидом гранулы могут быть сшиты при помощи карбодиимида, выбранного из группы, состоящей из 1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимида гидрохлорида (EDC), DCC - N, N'-дициклогексилкарбодиимида (DCC) и N, N'-диизопропилкарбодиимида (DIPC).

В некоторых вариантах осуществления сшитые гранулы в меньшей степени подвержены ферментативному расщеплению в сравнении с не сшитыми биосовместимыми гранулами, что позволяет точно настраивать гранулы для времени существования in vivo. В некоторых вариантах осуществления сшитые гранулы устойчивы к эндогенным ферментам, таким как коллагеназы. В некоторых вариантах осуществления сшитые гранулы являются частью системы доставки, облегчающей одно или более из: (a) доставки прикрепленных клеток в нужные участки и создания пространства для регенерации и врастания естественной ткани и сосудистой сети; (b) возможности существования в нужном участке достаточно долго для того, чтобы клетки адаптировались, функционировали, реконструировали свою микросреду и секретировали их естественный внеклеточный матрикс (ВКМ); (c) стимуляции интеграции трансплантированных клеток с окружающей тканью; (d) возможности имплантации клеток в практически твердой форме; (e) кратковременной структурной целостности, которая не создает существенное препятствие для врастания ткани, de novo ангиогенеза или интеграции доставляемых клеток/материалов с тканью хозяина; (f) локализованной in vivo доставки в практически твердой форме, что предотвращает диспергирование клеток в ткани в процессе имплантации; (g) повышенной стабильности и жизнеспособности прикрепляющихся клеток в сравнении с клетками, суспендированными в жидкости; (h) двухфазного профиля высвобождения при доставке клеток i) в практически твердой форме (например, прикрепленными к гранулам), и ii) в практически жидкой форме (например, суспендированными в жидкости).

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к сшитым гранулам, содержащим желатин. В некоторых вариантах осуществления не сшитые желатиновые гранулы не подходят для препарата биоактивных клеток, поскольку они быстро утрачивают целостность, и клетки рассеиваться от участка инъекции. В некоторых вариантах осуществления желатиновые гранулы с высокой степенью сшивки могут существовать достаточно долго в участке инъекции и могут препятствовать de novo секреции ВКМ, интеграции клеток и регенерации ткани. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение позволяет точно регулировать время существования in vivo сшитых гранул. В некоторых вариантах осуществления для точного регулирования биоразлагаемости биологических материалов используют разные концентрации карбодиимида при сшивке, в то время как общие условия реакции оставляют постоянными для всех образцов. Например, чувствительность к ферментам гранул, сшитых карбодиимидом, может быть тонко настроена путем изменения концентрации сшивающего агента от примерно нуля до примерно 1 M. В некоторых вариантах осуществления концентрация составляет примерно 5 мМ, примерно 6 мМ, примерно 7 мМ, примерно 8 мМ, примерно 9 мМ, примерно 10 мМ, примерно 11 мМ, примерно 12 мМ, примерно 13 мМ, примерно 14 мМ, примерно 15 мМ, примерно 16 мМ, примерно 17 мМ, примерно 18 мМ, примерно 19 мМ, примерно 20 мМ, примерно 21 мМ, примерно 22 мМ, примерно 23 мМ, примерно 24 мМ, примерно 25 мМ, примерно 26 мМ, примерно 27 мМ, примерно 28 мМ, примерно 29 мМ, примерно 30 мМ, примерно 31 мМ, примерно 32 мМ, примерно 33 мМ, примерно 34 мМ, примерно 35 мМ, примерно 36 мМ, примерно 37 мМ, примерно 38 мМ, примерно 39 мМ, примерно 40 мМ, примерно 41 мМ, примерно 42 мМ, примерно 43 мМ, примерно 44 мМ, примерно 45 мМ, примерно 46 мМ, примерно 47 мМ, примерно 48 мМ, примерно 49 мМ, примерно 50 мМ, примерно 55 мМ, примерно 60 мМ, примерно 65 мМ, примерно 70 мМ, примерно 75 мМ, примерно 80 мМ, примерно 85 мМ, примерно 90 мМ, примерно 95 мМ или примерно 100 мМ. Концентрация сшивающего агента также может составлять примерно 0,15 M, примерно 0,2 M, примерно 0,25 M, примерно 0,3 M, примерно 0,35 M, примерно 0,4 M, примерно 0,45 M, примерно 0,5 M, примерно 0,55 M, примерно 0,6 M, примерно 0,65 M, примерно 0,7 M, примерно 0,75 M, примерно 0,8 M, примерно 0,85 M, примерно 0,9 M, примерно 0,95 M или примерно 1 M. В другом варианте осуществления сшивающий агент представляет собой 1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимид гидрохлорид (EDC). В некоторых вариантах осуществления сшитые EDC гранулы представляют собой желатиновые гранулы.

В некоторых вариантах осуществления сшитые гранулы могут обладать определенными характеристиками, которые являются благоприятными для высевания, прикрепления или инкапсуляции. В некоторых вариантах осуществления гранулы могут иметь пористую поверхность и/или могут быть в значительной степени полыми. В некоторых вариантах осуществления наличие пор обеспечивает большую поверхность для прикрепления клеток, что делает возможным прикрепление большего количества клеток, чем в случае непористой или гладкой поверхности. В некоторых вариантах осуществления пористая структура может способствовать интеграции ткани хозяина с пористыми гранулами, облегчая образование de novo ткани. В некоторых вариантах осуществления гранулы имеют распределение по размерам, которое может быть подогнано к графику Вейбулла, соответствующему общей схеме распределения частиц. В некоторых вариантах осуществления сшитые гранулы имеют средний диаметр менее примерно 120 мкм, примерно 115 мкм, примерно 110 мкм, примерно 109 мкм, примерно 108 мкм, примерно 107 мкм, примерно 106 мкм, примерно 105 мкм, примерно 104 мкм, примерно 103 мкм, примерно 102 мкм, примерно 101 мкм, примерно 100 мкм, примерно 99 мкм, примерно 98 мкм, примерно 97 мкм, примерно 96 мкм, примерно 95 мкм, примерно 94 мкм, примерно 93 мкм, примерно 92 мкм, примерно 91 мкм или примерно 90 мкм. В некоторых вариантах осуществления характеристики сшитых гранул варьируются в зависимости от метода изготовления. В некоторых вариантах осуществления для получения гранул, имеющих вышеуказанные характеристики, используют метод, в котором поток воздуха используют для аэрозолизации жидкого раствора желатина и распыления его в жидкий азот с помощью распылителя реагентов для тонкослойной хроматографии (ACE Glassware). Специалисты в данной области понимают, что изменение параметров метода изготовления дает возможность точно регулировать различные характеристики гранул, например, изменять распределение по размерам частиц.

В некоторых вариантах осуществления совместимость с клетками сшитых гранул оценивают in vitro до формулирования препарата, используя методы культивирования клеток, в которых гранулы культивируют с клетками, соответствующими конечному препарату биоактивных клеток. В некоторых вариантах осуществления гранулы культивируют с первичными почечными клетками до изготовления препарата биоактивных почечных клеток, используют анализы на живые/мертвые клетки для подтверждения совместимости с клетками. В некоторых вариантах осуществления биосовместимые сшитые гранулы объединены с термочувствительным биологическим материалом в растворе с концентрацией от примерно 5% (масс/масс) до примерно 15% (масс/масс) от объема раствора. В некоторых вариантах осуществления сшитые гранулы могут присутствовать в концентрации примерно 5% (масс/масс), примерно 5,5% (масс/масс), примерно 6% (масс/масс), примерно 6,5% (масс/масс), примерно 7% (масс/масс), примерно 7,5% (масс/масс), примерно 8% (масс/масс), примерно 8,5% (масс/масс), примерно 9% (масс/масс), примерно 9,5% (масс/масс), примерно 10% (масс/масс), примерно 10,5% (масс/масс), примерно 11% (масс/масс), примерно 11,5% (масс/масс), примерно 12% (масс/масс), примерно 12,5% (масс/масс), примерно 13% (масс/масс), примерно 13,5% (масс/масс), примерно 14% (масс/масс), примерно 14,5% (масс/масс) или примерно 15% (масс/масс) от объема раствора.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к препаратам, содержащим биологические материалы, которые распадаются в течение периода времени порядка нескольких минут, часов или дней. Это отличается от большого количества работ, направленных на имплантацию твердых материалов, которые затем медленно распадаются в течение дней, недель или месяцев. В некоторых вариантах осуществления биологический материал имеет одну или более из следующих характеристик: биологическую совместимость, биоразлагаемость/биовсасываемость, практически твердое состояние до, и в процессе, имплантации субъекту, утрату структурной целостности (практически твердого состояния) после имплантации и совместимую с клетками среду для поддержания жизнеспособности и пролиферации клеток. Способность биологического материала удерживать имплантированные частицы разделенными в пространстве во время имплантации стимулирует врастание естественной ткани. Биологический материал также облегчает имплантацию твердых препаратов. Биологический материал обеспечивает локализацию препарата, описанного в настоящем документе, поскольку введение твердого элемента помогает предотвращать диспергирование доставляемых материалов в ткани во время имплантации. В случае клеточных препаратов твердый биологический материал также способствует повышению стабильности и жизнеспособности прикрепляющихся клеток в сравнении клетками, суспендированными в жидкости. Однако короткий срок существования структурной целостности означает, что вскоре после имплантации биологический материал больше не создает значительный барьер для врастания ткани или интеграции доставленных клеток/материалов с тканью хозяина.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к препаратам, которые содержат биологические материалы, имплантируемые в практически твердой форме, а затем разжижающиеся/плавящиеся или иным образом теряющие структурную целостность после имплантации в тело. Это отличается от большого количества работ, направленных на использование материалов, которые могут быть введены в виде жидкостей, впоследствии затвердевающих в теле.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к препаратам, содержащим биосовместимые сшитые гранулы, засеянные биоактивными клетками, совместно с матрицей для доставки. В некоторых вариантах осуществления матрица для доставки имеет одну или более из следующих характеристик: биологическую совместимость, биоразлагаемость/биовсасываемость, практически твердое состояние до, и в процессе, имплантации субъекту, утрату структурной целостности (практически твердого состояния) после имплантации и совместимую с клетками среду для поддержания жизнеспособности клеток. В некоторых вариантах осуществления способность матрицы для доставки удерживать имплантированные частицы (например, сшитые гранулы) разделенными в пространстве во время имплантации стимулирует врастание естественной ткани. В некоторых вариантах осуществления в отсутствие матрицы для доставки уплотнение засеянных клетками гранул в процессе имплантации может приводить к недостатку пространства для достаточного врастания ткани. В некоторых вариантах осуществления матрица для доставки облегчает имплантацию твердых препаратов. В некоторых вариантах осуществления короткий срок существования структурной целостности означает, что вскоре после имплантации матрица больше не создает значительный барьер для врастания ткани или интеграции доставленных клеток/материалов с тканью хозяина. В некоторых вариантах осуществления матрица для доставки обеспечивает локализацию препарата, описанного в настоящем документе, поскольку введение твердого элемента помогает предотвращать диспергирование доставляемых материалов в ткани во время имплантации. В некоторых вариантах осуществления в случае клеточных препаратов твердая матрица для доставки способствует повышению стабильности и жизнеспособности прикрепляющихся клеток в сравнении клетками, суспендированными в жидкости.

В некоторых вариантах осуществления матрица для доставки представляет собой популяцию биосовместимых гранул, не засеянных клетками. В некоторых вариантах осуществления незасеянные гранулы диспергированы по всему объему, и между отдельными засеянными клетками гранулами. В некоторых вариантах осуществления незасеянные гранулы действуют в качестве «разделительных гранул» между засеянными гранулами до, и сразу после, трансплантации. В некоторых вариантах осуществления разделительные гранулы содержат термочувствительный биологический материал, находящийся в практически твердом состоянии при первой температуре и в практически жидком состоянии при второй температуре, при этом первая температура является более низкой, чем вторая температура. В некоторых вариантах осуществления разделительные гранулы содержат биологический материал, находящийся в практически твердом состоянии при температуре около температуры окружающей среды, или ниже, и в практически жидком состоянии при примерно 37°C, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления температура окружающей среды примерно соответствует комнатной температуре. В некоторых вариантах осуществления биологический материал представляет собой раствор желатина. В некоторых вариантах осуществления раствор желатина используют в концентрации примерно 4%, примерно 4,5%, примерно 5%, примерно 5,5%, примерно 6%, примерно 6,5%, примерно 7%, примерно 7,5%, примерно 8%, примерно 8,5%, примерно 9%, примерно 9,5%, примерно 10%, примерно 10,5% или примерно 11% (масс/об). В некоторых вариантах осуществления раствор желатина может быть получен в PBS, среде для культивирования клеток (например, DMEM) или другом подходящем растворителе.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к препаратам, которые содержат биологические материалы, имплантируемые в практически твердой форме (например, разделительные гранулы), а затем разжижающиеся/плавящиеся или иным образом теряющие структурную целостность после имплантации в тело.

В некоторых вариантах осуществления температурную чувствительность разделительных гранул можно оценивать in vitro до формулирования. В некоторых вариантах осуществления разделительные гранулы можно метить и смешивать с немечеными не термочувствительными гранулами. В некоторых вариантах осуществления смесь затем инкубируют при 37°C, чтобы наблюдать изменения в физическом переходе между состояниями. В некоторых вариантах осуществления потерю формы термочувствительными гранулами при более высокой температуре наблюдают с течением времени. В некоторых вариантах осуществления термочувствительные желатиновые гранулы могут быть изготовлены с красителем альциановым синим, служащим маркером физического перехода между состояниями. В некоторых вариантах осуществления синие желатиновые гранулы смешивают с гранулами Cultispher S (белыми), помещают в катетер, затем экструдируют и инкубируют в 1X PBS, pH 7,4, при 37°C. В некоторых вариантах осуществления потерю формы синими желатиновыми гранулами наблюдают под микроскопом в разные моменты времени. В некоторых вариантах осуществления изменения физического состояния синих желатиновых гранул становятся заметны через 30 мин, становясь более выраженными с увеличением времени инкубации. В некоторых вариантах осуществления гранулы не исчезают полностью из-за вязкости материала.

В некоторых вариантах осуществления препараты биоактивных клеток, описанных в настоящем документе, могут быть использованы для изготовления препаратов на основе почечных клеток для инъекции в почки. Однако специалисты в данной области понимают, что препараты будут подходящими для многих других типов популяций биоактивных клеток. Например, по настоящему изобретению предусмотрены препараты биоактивных клеток для инъекции в любой солидный орган или ткань.

В некоторых вариантах осуществления препараты биоактивных клеток, описанные в настоящем документе, будут содержать заданное количество клеток. В некоторых вариантах осуществления общее количество клеток для препарата составляет примерно 10⁴, примерно 10⁵, примерно 10⁶, примерно 10⁷, примерно 10⁸ или примерно 10⁹. В некоторых вариантах осуществления доза клеток для препарата, описанного в настоящем документе, может быть рассчитана на основании предполагаемой массы или функциональной массы целевого органа или ткани. В некоторых вариантах осуществления препараты биоактивных клеток содержат дозу, соответствующую количеству клеток, исходя из массы органа хозяина, который будет получать лечение препаратом. В некоторых вариантах осуществления препарат биоактивных почечных клеток получают, исходя из средней массы человеческой почки, составляющей примерно 150 грамм. В некоторых вариантах осуществления количество клеток на грамм (г) почки составляет от примерно 600 клеток/г до примерно 7,0×10⁷ клеток/г. В некоторых вариантах осуществления количество клеток на грамм почки составляет примерно 600 клеток/г, примерно 1000 клеток/г, примерно 1500 клеток/г, примерно 2000 клеток/г, примерно 2500 клеток/г, примерно 3000 клеток/г, примерно 3500 клеток/г, примерно 4000 клеток/г, примерно 4500 клеток/г, примерно 5000 клеток/г, примерно 5500 клеток/г, примерно 6000 клеток/г, примерно 6500 клеток/г, примерно 7000 клеток/г, примерно 7500 клеток/г, примерно 8000 клеток/г, примерно 8500 клеток/г, примерно 9000 клеток/г, примерно 9500 клеток/г или примерно 10000 клеток/г.

В некоторых вариантах осуществления количество клеток на грамм почки составляет примерно 1,5×10⁴ клеток/г, примерно 2,0×10⁴ клеток/г, примерно 2,5×10⁴ клеток/г, примерно 3,0×10⁴ клеток/г, примерно 3,5×10⁴ клеток/г, примерно 4,0×10⁴ клеток/г, примерно 4,5×10⁴ клеток/г, примерно 5,0×10⁴ клеток/г, примерно 5,5×10⁴ клеток/г, примерно 6,0×10⁴ клеток/г, примерно 6,5×10⁴ клеток/г, примерно 7,0×10⁴ клеток/г, примерно 7,5×10⁴ клеток/г, примерно 8,0×10⁴ клеток/г, примерно 9,5×10⁴ клеток/г.

В некоторых вариантах осуществления количество клеток на грамм почки составляет примерно 1,0×10⁵ клеток/г, примерно 1,5×10⁵ клеток/г, примерно 2,0×10⁵ клеток/г, примерно 2,5×10⁵ клеток/г, примерно 3,0×10⁵ клеток/г, примерно 3,5×10⁵ клеток/г, примерно 4,0×10⁵ клеток/г, примерно 4,5×10⁵ клеток/г, примерно 5,0×10⁵ клеток/г, примерно 5,5×10⁵ клеток/г, примерно 6,0×10⁵ клеток/г, примерно 6,5×10⁵ клеток/г, примерно 7,0×10⁵ клеток/г, примерно 7,5×10⁵ клеток/г, примерно 8,0×10⁵ клеток/г, примерно 8,5×10⁵ клеток/г, примерно 9,0×10⁵ клеток/г или примерно 9,5×10⁵ клеток/г.

В некоторых вариантах осуществления количество клеток на грамм почки составляет примерно 1,0×10⁶ клеток/г, примерно 1,5×10⁶ клеток/г, примерно 2,0×10⁶ клеток/г, примерно 2,5×10⁶ клеток/г, примерно 3,0×10⁶ клеток/г, примерно 3,5×10⁶ клеток/г, примерно 4,0×10⁶ клеток/г, примерно 4,5×10⁶ клеток/г, примерно 5,0×10⁶ клеток/г, примерно 5,5×10⁶ клеток/г, примерно 6,0×10⁶ клеток/г, примерно 6,5×10⁶ клеток/г, примерно 7,0×10⁶ клеток/г, примерно 7,5×10⁶ клеток/г, примерно 8,0×10⁶ клеток/г примерно 8,5×10⁶ клеток/г, примерно 9,0×10⁶ клеток/г, примерно 9,5×10⁶ клеток/г, 1,0×10⁷ клеток/г или примерно 1,5×10⁷ клеток/г.

В некоторых вариантах осуществления общее количество клеток можно выбирать для препарата, и объем препарата можно корректировать для достижения надлежащей дозы.

В некоторых вариантах осуществления препарат может содержать дозу клеток для субъекта, которая представляет собой однократную дозу или однократную дозу плюс дополнительные дозы. В некоторых вариантах осуществления доза может быть предоставлена в виде конструкции, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество популяции биоактивных почечных клеток, описанных в настоящем документе, может находиться в диапазоне от максимального количества клеток, которое безопасно получать субъекту, до минимального количества клеток, необходимого для лечения заболевания почек, например, стабилизации, снижения темпов ухудшения состояния или улучшения одной или более почечных функций.

В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество популяций биоактивных почечных клеток, описанных в настоящем документе, может быть суспендировано в фармацевтически приемлемом носителе или эксципиенте. Такой носитель включает, но без ограничения, основную среду для культивирования плюс 1% сывороточный альбумин, солевой раствор, забуференный солевой раствор, декстроза, вода, коллаген, альгинат, гиалуроновая кислота, фибриновый клей, полиэтиленгликоль, поливинилспирт, карбоксиметилцеллюлоза, а также их сочетания. Препарат должен соответствовать способу введения.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к применению препарата, содержащего популяцию почечных клеток, для производства лекарственного препарата, предназначенного для лечения заболевания почек у субъекта. В некоторых вариантах осуществления лекарственный препарат дополнительно содержит рекомбинантные полипептиды, такие как факторы роста, хемокины или цитокины. В некоторых вариантах осуществления лекарственные препараты содержат популяцию клеток, полученных из человеческой почки. В некоторых вариантах осуществления клетки, используемые для производства лекарственных препаратов, могут быть выделены, получены или обогащены с использованием любых вариантов способов, описанных в настоящем документе.

В некоторых вариантах осуществления препарат(ы) или композиции почечных клеток, раскрытые в настоящем документе, формулируют обычными способами в виде фармацевтической композиции, адаптированной для введения людям. В некоторых вариантах осуществления композиции для внутривенного введения, внутриартериального введения или введения в почечную капсулу, например, представляют собой растворы в стерильном изотоническом водном буфере. В некоторых вариантах осуществления композиция может также содержать местный анестетик для облегчения боли в участке инъекции. В некоторых вариантах осуществления ингредиенты либо предоставляют отдельно, либо смешивают вместе в стандартной лекарственной форме, например, в виде криоконсервированного концентрата в герметично закрытом контейнере, таком как ампула, с указанием количества активного средства. В некоторых вариантах осуществления, если композицию предстоит вводить инфузией, она может быть расфасована в бутыль для инфузии, содержащую стерильную воду или солевой раствор фармацевтической категории. В некоторых вариантах осуществления, если композицию вводят инъекцией, может быть предоставлена ампула со стерильной водой для инъекций или солевым раствором, чтобы ингредиенты можно было смешивать перед введением.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтически приемлемые носители выбирают, частично, в зависимости от конкретной вводимой композиции, а также в зависимости от конкретного используемого способа введения композиции. Соответственно, существует множество подходящих препаратов фармацевтических композиций (смотри, например, публикацию Alfonso R Gennaro (ed), Remington: The Science and Practice of Pharmacy, прежнее название Remington's Pharmaceutical Sciences 20-е издание, Lippincott, Williams & Wilkins, 2003, полное содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки). В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции, как правило, формулируют в виде стерильных, практически изотонических препаратов и в полном соответствии со всеми требованиями Надлежащей производственной практики (GMP), разработанными Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США.

В некоторых вариантах осуществления препарат по настоящему изобретению предоставляют в виде препарата с модифицированным высвобождением. В некоторых вариантах осуществления модифицированное высвобождение характеризуется начальным высвобождением первого активного средства после введения, с последующим по меньшей мере одним дополнительным высвобождением второго активного средства. В некоторых вариантах осуществления первое и второе активные средства могут быть одинаковыми, или они могут быть разными. В некоторых вариантах осуществления препараты обеспечивают модифицированное высвобождение за счет наличия нескольких компонентов в одном и том же препарате. В некоторых вариантах осуществления препарат с модифицированным высвобождением содержит активное средство в виде части первого компонента, который позволяет активному средству свободно перемещаться по всему объему препарата, что приводит к немедленному высвобождению в целевом участке после введения. В некоторых вариантах осуществления первый компонент может представлять собой термочувствительный биологический материал, имеющий практически жидкую фазу и практически твердую фазу, при этом первый компонент находится в практически жидкой фазе в момент введения. В некоторых вариантах осуществления активное средство находится в практически жидкой фазе, так что оно может практически свободно перемещаться по всему объему препарата и, таким образом, немедленно высвобождается в целевом участке после введения.

В некоторых вариантах осуществления препарат с модифицированным высвобождением содержит активное средство в виде части второго компонента, при этом активное средство прикреплено, нанесено, покрыто, погружено, высеяно или заключено во втором компоненте, который сохраняется до, и после, введения в целевой участок. В некоторых вариантах осуществления второй компонент содержит структурные элементы, с которыми активное средство может связываться, что предотвращает немедленное высвобождение активного средства из второго компонента в момент введения. В некоторых вариантах осуществления второй компонент находится в практически твердой форме, например, в виде биосовместимых гранул, которые могут быть сшиты для предотвращения или отсрочки in vivo ферментативного расщепления. В некоторых вариантах осуществления активное средство в практически твердой фазе сохраняет свою структурную целостность в препарате до, и после, введения и, таким образом, не происходит немедленного высвобождения активного средства в целевом участке после введения. Подходящие носители для препаратов с модифицированным высвобождением описаны в настоящем документе, однако специалистам в данной области известны и другие носители, подходящие для использования по настоящему изобретению.

В некоторых вариантах осуществления препарат обеспечивает начальную быструю доставку/высвобождение доставляемых элементов, включая клетки, наночастицы, терапевтические молекулы, и так далее, с последующим высвобождением элементов в более позднее время. В некоторых вариантах осуществления препараты по настоящему изобретению могут быть спроектированы для такого двухфазного профиля высвобождения, когда доставляемое средство присутствует как в несвязанной форме (например, клетки в растворе), так и в связанной форме (например, клетки, связанные с гранулами или другим подходящим носителем). В некоторых вариантах осуществления после начального введения несвязанное средство немедленно поступает в участок доставки, в то время как высвобождение связанного средства отсрочено до того момента, когда нарушается структурная целостность носителя (например, гранул), после чего высвобождается ранее связанное средство. Как описано в настоящем документе, и другие подходящие механизмы высвобождения известны специалистам в данной области.

В некоторых вариантах осуществления время отсрочки высвобождения можно корректировать в зависимости от природы активного средства. В некоторых вариантах осуществления время отсрочки высвобождения в препарате биоактивных клеток может составлять порядка нескольких секунд, минут, часов или дней. В некоторых вариантах осуществления может быть подходящей отсрочка порядка нескольких недель. В некоторых вариантах осуществления в случае других активных средств, таких как малые и большие молекулы, время отсрочки высвобождения в препарате может составлять порядка нескольких секунд, минут, часов, дней, недель или месяцев. В некоторых вариантах осуществления препарат также может содержать разные биологические материалы, которые обеспечивают профили с разной отсрочкой высвобождения. В некоторых вариантах осуществления первый биологический материал с первым активным средством может иметь первое время высвобождения, и второй биологический материал со вторым активным средством может иметь второе время высвобождения. В некоторых вариантах осуществления первое и второе активные средства могут быть одинаковыми или разными.

В некоторых вариантах осуществления период времени замедленного высвобождения может, в целом, соответствовать периоду времени для утраты структурной целостности биологического материала. Однако специалистам в данной области известны и другие механизмы замедленного высвобождения. В некоторых вариантах осуществления активное средство может непрерывно высвобождаться с течением времени независимо от времени распада какого-либо конкретного биологического материала, например, за счет диффузии лекарственного средства из полимерной матрицы. В некоторых вариантах осуществления биоактивные клетки могут мигрировать из препарата, содержащего биологический материал и биоактивные клетки, в естественную ткань. В некоторых вариантах осуществления биоактивные клетки мигрируют из биологического материала, например, гранулы, в естественную ткань.

В некоторых вариантах осуществления можно использовать биоразлагаемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. В некоторых вариантах осуществления пролонгированной абсорбции инъекционных препаратов можно добиваться путем включения в препарат средства, которое замедляет абсорбцию, например, солей моностеарата и желатина. Многие неограничивающие примеры способов получения таких препаратов запатентованы или общеизвестны специалистам в данной области. Смотри, например, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978. Дополнительные неограничивающие примеры способов получения полипептидных препаратов с контролируемым или пролонгированным высвобождением описаны, например, в патентах США №№ 6306406 и 6346274, а также, например, в патентных заявках США №№ US20020182254 и US20020051808, содержание всех из которых включено в настоящий документ посредством ссылки.

В некоторых вариантах осуществления препарат по настоящему изобретению вводят отдельно. В некоторых вариантах осуществления препарат по настоящему изобретению вводят в сочетании с одной или более другими активными композициями. В некоторых вариантах осуществления препарат подходит для инъекции или имплантации включенных элементов, полученных методами тканевой инженерии, во внутреннюю часть солидного органа для регенерации ткани. В некоторых вариантах осуществления препараты используют для инъекции или имплантации включенных элементов, полученных методами тканевой инженерии, в стенку полого органа для регенерации ткани.

Настоящее изобретение также относится к способам доставки препарата биоактивных клеток в организм субъекта. В некоторых вариантах осуществления источник биоактивных клеток может быть аутологичным, аллогенным, сингенным (аутогенным или изогенным), а также любым их сочетанием. В некоторых вариантах осуществления, в случаях, когда источник не является аутологичным, способы могут включать введение иммуносупрессора (смотри, например, патент США № 7563822). Примеры иммуносупрессоров включают, без ограничения, азатиоприн, циклофосфамид, мизорибин, циклоспорин, такролимус гидрат, хлорамбуцил, иобензарит дисодиум, ауранофин, алпростадил, гусперимус гидрохлорид, биосинсорб, муромонаб, алефасепт, пентостатин, даклизумаб, сиролимус, микофенолат мофетил, лефлономид, базиликсимаб, дорназу а, биндарид, кладрибин, пимекролимус, илодекакин, цеделизумаб, эфализумаб, эверолимус, анисперимус, гавилимомаб, фаралимомаб, клофарабин, рапамицин, сиплизумаб, сайрейто, LDP-03, CD4, SR-43551, SK&F-106615, IDEC-114, IDEC-131, FTY-720, TSK-204, LF-080299, A-86281, A-802715, GVH-313, HMR-1279, ZD-7349, IPL-423323, CBP-1011, MT-1345, CNI-1493, CBP-2011, J-695, UP-920, L-732531, ABX-RB2, AP-1903, IDPS, BMS-205820, BMS-224818, CTLA4-1g, ER-49890, ER-38925, ISAtx-247, RDP-58, PNU-156804, UP-1082, TMC-95A, TV-4710, PTR-262-MG и AGI-1096 (смотри патент США № 7563822). Специалистам в данной области известны и другие подходящие иммуносупрессоры.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно активное средство (такое как популяция почечных клеток, ее продукт или сфероид, содержащий популяцию почечных клеток и один или более типов, или популяций, не почечных клеток) вводят непосредственно в участок предполагаемого воздействия, например, путем инъекции. В некоторых вариантах осуществления субъект может получать лечение путем создания in vivo контакта естественной почки с препаратом биоактивных клеток, описанных в настоящем документе, наряду с продуктами, секретируемыми одной или более обогащенными популяциями почечных клеток, и/или смесью или конструкцией, содержащей их. В некоторых вариантах осуществления этап создания in vivo контакта обеспечивает регенеративный эффект для естественной почки.

Различные способы введения композиций активных средств, таких как селективные почечные клетки, субъектам, с учетом данной спецификации, будут очевидны для специалистов в данной области. Такие способы включают инъекцию клеток в целевую зону в теле субъекта.

Способы введения препаратов включают, но без ограничения, системную, внутрипочечную (например, в паренхиму), внутривенную или внутриартериальную инъекцию, а также инъекцию непосредственно в ткань, в запланированную зону проявления активности. В некоторых вариантах осуществления дополнительные способы введения, используемые в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, включают одну или несколько инъекций путем прямой лапаротомии, путем прямой лапароскопии, трансабдоминальной или чрескожной процедуры. Дополнительные способы введения, используемые в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, включают, например, ретроградную и лоханочно-мочеточниковую инфузию. Хирургические способы введения включают одностадийные процедуры, такие как, но без ограничения, частичная нефрэктомия и имплантация конструкции, частичная нефрэктомия, частичная пиелэктомия, васкуляризация с сальником ± брюшина, введение при мультифокальной биопсии в пункционные каналы, конические или пирамидальные, в цилиндр, и введение путем полюсоподобной замены, а также двухстадийные процедуры, включающие, например, органоидный внутренний биореактор для пересадки. В некоторых вариантах осуществления препараты, содержащие разные активные средства, доставляют одним и тем же путем введения в одно и то же время. В некоторых вариантах осуществления активные средства доставляют отдельно в определенные зоны или определенными методами, либо одновременно, либо в контролируемые моменты времени, одним или более из способов, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно активное средство (такое как популяция почечных клеток, ее продукт или сфероид, содержащий популяцию почечных клеток и один или более типов, или популяций, не почечных клеток) вводят чрескожной инъекцией в корковый слой почки. В некоторых вариантах осуществления направляющую канюлю вводят чрескожно и используют для прокалывания почечной капсулы перед инъекцией композиции в почку.

В некоторых вариантах осуществления, чтобы получить доступ к почке для инъекции сформулированной популяции БПК или СПК, можно использовать лапароскопический или чрескожный способ. В некоторых вариантах осуществления использование лапароскопического хирургического метода делает возможной непосредственную визуализацию почки, так что любое кровотечение или другие нежелательные явления могут быть замечены в процессе инъекции и меры могут быть приняты немедленно. В некоторых вариантах осуществления чрескожный способ для введения в почки используют уже более десяти лет, в основном для абляции внутрипочечных масс. В некоторых вариантах осуществления во время этих процедур электрод или криогенную иглу вводят в определенную массу в почке и оставляют в контакте с ней в течение (как правило) 10-20 минут для абляции лезии. В некоторых вариантах осуществления инструментарий для чрескожной инъекции терапевтического препарата не превосходит ни по размеру, ни по сложности это оборудование, и такой подход обладает преимуществами безопасности ввиду отсутствия хирургической операции (отсутствия колотых ран в брюшной полости и нагнетания газа) и минимального времени иммобилизации. В некоторых вариантах осуществления во входных каналах может быть оставлен гемостатический биоразлагаемый материал для дальнейшего снижения вероятности значительного кровотечения.

В некоторых вариантах осуществления терапевтический препарат инъецируют в корковый слой почки. В некоторых вариантах осуществления важно добиться максимального распределения терапевтического препарата в корковом слое почки. В некоторых вариантах осуществления распределения терапевтического препарата в корковом слое почки добиваются за счет входа иглы в корковый слой почки под углом, позволяющим депонировать терапевтический препарат в корковом слое почки с максимально возможным распределением. В некоторых вариантах осуществления проводят визуализацию почки в продольной или поперечной проекции с использованием оборудования для ультразвуковой визуализации или аксиальной компьютерной томографии (КТ), в зависимости от индивидуальных характеристик пациента. В некоторых вариантах осуществления инъекция будет включать несколько депонирований препарата при постепенном извлечении инъекционной иглы/канюли. В некоторых вариантах осуществления полный объем терапевтического препарата может быть депонирован в одной или нескольких точках входа. В некоторых вариантах осуществления можно использовать до двух точек входа для депонирования полного объема терапевтического препарата в почке. В некоторых вариантах осуществления инъекцию можно выполнять в одну почку с использованием одной или более точек входа, например, одной или двух точек входа. В некоторых вариантах осуществления инъекцию выполняют в обе почки, используя для каждой почки одну или более точек входа, например, одну или две точки входа. В некоторых вариантах осуществления композицию по настоящему изобретению вводят субъекту несколько раз в течение конкретного периода времени, например, два или более раз, при этом каждое введение производят по меньшей мере через примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 12 месяцев после предыдущего введения. В некоторых вариантах осуществления СПК вводят во время одной процедуры в одну почку. В некоторых вариантах осуществления БПК (например, СПК) вводят во время одной процедуры инъекциями в обе почки. В некоторых вариантах осуществления БПК (например, СПК) вводят неоднократными или множественными инъекциями в одну или в обе почки. В некоторых вариантах осуществления первую и вторую инъекции выполняют с интервалом по меньшей мере 3 месяца, с интервалом по меньшей мере 6 месяцев или с интервалом по меньшей мере один год. В некоторых вариантах осуществления БПК (например, СПК) вводят более чем 2 инъекциями. В некоторых вариантах осуществления композицию вводят одной инъекцией или несколькими инъекциями в течение определенного периода времени. В некоторых вариантах осуществления композицию вводят минимум одной инъекцией в одну почку. В некоторых вариантах осуществления композицию вводят двумя или более инъекциями. В некоторых вариантах осуществления первую и вторую инъекции можно выполнять в любой момент времени с интервалом вплоть до 3 месяцев, в любой момент времени с интервалом вплоть до 6 месяцев или с годичными интервалами. В некоторых вариантах осуществления вторую инъекцию выполняют в любой момент времени вплоть до 3 лет после 1-й инъекции. В некоторых вариантах осуществления композицию можно также вводить одной, двумя или более инъекциями в одну или в обе почки. В некоторых вариантах осуществления композицию вводят субъектам, параллельно получающим стандартное лечение в связи с ХЗП, до получения инъекций NKA. В некоторых вариантах осуществления две или более инъекций не приводят к неблагоприятным иммуногенным эффектам. В некоторых вариантах осуществления композицию вводят инъекцией в одну почку пациента. В некоторых вариантах осуществления композицию вводят инъекцией в обе почки пациента. В некоторых вариантах осуществления можно использовать одну или несколько точек входа для инъекции композиции в почку пациента. В некоторых вариантах осуществления инъекцию выполняют в паренхиму почки. В некоторых вариантах осуществления пациент получает терапевтическую дозу в конкретный участок инъекции. В некоторых вариантах осуществления пациент получает дозу 1-9×10⁶ СПК/г почки в любой конкретный участок инъекции.

В некоторых вариантах осуществления этап создания контакта естественной почки in vivo с секретируемыми продуктами может быть осуществлен путем использования/введения препарата, содержащего популяцию секретируемых продуктов из среды для культивирования клеток, например, кондиционированной среды, и/или путем имплантации обогащенной популяции клеток и/или конструкции, способной секретировать продукты in vivo. В некоторых вариантах осуществления этап создания контакта in vivo приводит к регенеративному эффекту для естественной почки.

Различные способы введения клеток и/или секретируемых продуктов субъектам будут, с учетом данной спецификации, очевидны специалистам в данной области. В некоторых вариантах осуществления такие способы включают инъекцию клеток в целевой участок в теле субъекта.

В некоторых вариантах осуществления клетки и/или секретируемые продукты могут быть введены в устройство или среду для доставки, которые облегчают введение субъектам путем инъекции или имплантации. В некоторых вариантах осуществления среда для доставки может включать натуральные материалы. В некоторых вариантах осуществления среда для доставки может включать синтетические материалы. В некоторых вариантах осуществления среда для доставки имеет структуру, имитирующую, или хорошо вписывающуюся в, архитектуру органа. В некоторых вариантах осуществления среда для доставки является жидкой по своей природе. В этих случаях устройства для доставки могут включать трубки, например, катетеры, для инъекции клеток и жидкостей в тело субъекта-реципиента. В некоторых вариантах осуществления трубки также имеют иглу, например, шприц, через который клетки по изобретению могут быть введены в нужную зону в теле субъекта. В некоторых вариантах осуществления популяции почечных клеток млекопитающих сформулированы для введения в кровеносный сосуд через катетер (при этом термин «катетер» должен охватывать любую из различных трубкообразных систем для доставки веществ в кровеносный сосуд). В некоторых вариантах осуществления клетки могут быть помещены в, или на, биологический материал или каркас, включая, но без ограничения, ткань, такую как тканая, вязаная, плетеная, сетчатая и нетканая ткань, перфорированные пленки, губки и пены, а также гранулы, такие как монолитные или пористые гранулы, микрочастицы, наночастицы и тому подобное (например, желатиновые гранулы Cultispher-S - Sigma). В некоторых вариантах осуществления клетки могут быть подготовлены для доставки в самых разных формах. В некоторых вариантах осуществления клетки могут быть суспендированы в растворе или геле. В некоторых вариантах осуществления клетки могут быть смешаны с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем, в котором клетки по изобретению остаются жизнеспособными. В некоторых вариантах осуществления фармацевтически приемлемые носители и разбавители включают солевой раствор, водные растворы буферов, растворители и/или дисперсионные среды. Использование таких носителей и разбавителей хорошо известно в данной области. В некоторых вариантах осуществления раствор является стерильным и жидким, и часто будет изотоническим. В некоторых вариантах осуществления раствор является стабильным в условиях производства и хранения, и предохраненным от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибки, за счет использования, например, парабенов, хлорбутанола, фенола, аскорбиновой кислоты, тимеросала и тому подобного. Специалист в данной области понимает, что среда для доставки, используемая для доставки популяций клеток и/или смесей по настоящему изобретению, может иметь сочетание вышеуказанных характеристик.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания почек у субъекта, включающему инъекцию субъекту препарата, композиции или популяции клеток, раскрытых в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления препарат, композицию или популяцию клеток вводят инъекцией через иглу 18-30 калибра. В некоторых вариантах осуществления препарат, композицию или популяцию клеток вводят инъекцией через иглу менее чем 20 калибра. В некоторых вариантах осуществления препарат, композицию или популяцию клеток вводят инъекцией через иглу менее чем 21 калибра. В некоторых вариантах осуществления препарат, композицию или популяцию клеток вводят инъекцией через иглу менее чем 22 калибра. В некоторых вариантах осуществления препарат, композицию или популяцию клеток вводят инъекцией через иглу менее чем 23 калибра. В некоторых вариантах осуществления препарат, композицию или популяцию клеток вводят инъекцией через иглу менее чем 24 калибра. В некоторых вариантах осуществления препарат, композицию или популяцию клеток вводят инъекцией через иглу менее чем 25 калибра. В некоторых вариантах осуществления препарат, композицию или популяцию клеток вводят инъекцией через иглу менее чем 26 калибра. В некоторых вариантах осуществления препарат, композицию или популяцию клеток вводят инъекцией через иглу менее чем 27 калибра. В некоторых вариантах осуществления препарат, композицию или популяцию клеток вводят инъекцией через иглу менее чем 28 калибра. В некоторых вариантах осуществления препарат, композицию или популяцию клеток вводят инъекцией через иглу менее чем 29 калибра. В некоторых вариантах осуществления препарат, композицию или популяцию клеток вводят инъекцией через иглу примерно 20 калибра. В некоторых вариантах осуществления препарат, композицию или популяцию клеток вводят инъекцией через иглу примерно 21 калибра.

В некоторых вариантах осуществления препарат, композицию или популяцию клеток вводят инъекцией через иглу примерно 22 калибра. В некоторых вариантах осуществления препарат, композицию или популяцию клеток вводят инъекцией через иглу примерно 23 калибра. В некоторых вариантах осуществления препарат, композицию или популяцию клеток вводят инъекцией через иглу примерно 24 калибра. В некоторых вариантах осуществления препарат, композицию или популяцию клеток вводят инъекцией через иглу примерно 25 калибра. В некоторых вариантах осуществления препарат, композицию или популяцию клеток вводят инъекцией через иглу примерно 26 калибра. В некоторых вариантах осуществления препарат, композицию или популяцию клеток вводят инъекцией через иглу примерно 27 калибра. В некоторых вариантах осуществления препарат, композицию или популяцию клеток вводят инъекцией через иглу примерно 28 калибра. В некоторых вариантах осуществления препарат, композицию или популяцию клеток вводят инъекцией через иглу примерно 29 калибра.

В некоторых вариантах осуществления внутренний диаметр иглы составляет менее 0,84 мм. В некоторых вариантах осуществления внутренний диаметр иглы составляет менее 0,61 мм. В некоторых вариантах осуществления внутренний диаметр иглы составляет менее 0,51 мм. В некоторых вариантах осуществления внутренний диаметр иглы составляет менее 0,41 мм. В некоторых вариантах осуществления внутренний диаметр иглы составляет менее 0,33 мм. В некоторых вариантах осуществления внутренний диаметр иглы составляет менее 0,25 мм. В некоторых вариантах осуществления внутренний диаметр иглы составляет менее 0,20 мм. В некоторых вариантах осуществления внутренний диаметр иглы составляет менее 0,15 мм. В некоторых вариантах осуществления наружный диаметр иглы составляет менее 1,27 мм. В некоторых вариантах осуществления наружный диаметр иглы составляет менее 0,91 мм. В некоторых вариантах осуществления наружный диаметр иглы составляет менее 0,81 мм. В некоторых вариантах осуществления наружный диаметр иглы составляет менее 0,71 мм. В некоторых вариантах осуществления наружный диаметр иглы составляет менее 0,64 мм. В некоторых вариантах осуществления наружный диаметр иглы составляет менее 0,51 мм. В некоторых вариантах осуществления наружный диаметр иглы составляет менее 0,41 мм. В некоторых вариантах осуществления наружный диаметр иглы составляет менее 0,30 мм. В некоторых вариантах осуществления игла имеет один из размеров, приведенных в следующей таблице:

ВД НД Калибр дюйм мм дюйм мм 14 0,060 1,55 0,072 1,83 15 0,054 1,37 0,065 1,65 16 0,047 1,19 н/п н/п 18 0,033 0,84 0,050 1,27 20 0,023 0,61 0,036 0,91 21 0,020 0,51 0,032 0,81 22 0,016 0,41 0,028 0,71 23 0,013 0,33 0,025 0,64 25 0,010 0,25 0,020 0,51 27 0,008 0,20 0,016 0,41 30 0,006 0,15 0,012 0,30 32 0,004 0,10 0,009 0,23

Неограничивающим примером содержащего клетки терапевтического препарата является Neo-Kidney Augment (NKA). NKA содержит СПК (то есть, гомологичные, аутологичные селективные почечные клетки) в качестве биологически активного компонента. Без связи с какой-либо научной теорией, эта популяция клеток естественным образом вовлечена в восстановление и регенерацию почек. (Bruce et al. Regen Med. 2015;10:815-39; Bruce et al. Experimental Biology Meeting, Washington, DC, 2011; Genheimer et al. Cells Tissues Organs. 2012;196:374-84; Ilagan et al. TERMIS Conference, Orlando, FL, 2010; Ilagan et al. TERMIS Conference, Orlando, FL, 2010; Ilagan et al. KIDSTEM Conference, Liverpool, UK, 2009; Kelley et al. Cell Transplant. 2013;22:1023-39; Kelley et al. ADA Conference, San Diego, CA, 2011; Kelley et al. ISCT Conference, Philadelphia, PA, 2010; Kelley et al. KIDSTEM Conference, Liverpool, UK, 2008; Kelley et al. TERMIS Conference, Orlando, FL, 2010; Presnell et al. Tissue Engineering Part C Methods. 2010;17:261-73; Presnell et al. Experimental Biology Meeting, New Orleans, LA, 2009; Wallace et al. ISCT Conference, Philadelphia, PA, 2010; Yamaleyeva et al. TERMIS Conference, Orlando, FL, 2010). В некоторых вариантах осуществления терапевтическое вмешательство с использованием NKA приводит к улучшению почечной функции у субъектов с ХЗП и CAKUT, и отсрочивает необходимость проведения почечного диализа или трансплантации, которые, исходя из современных стандартов лечения, неизбежны в случае ТСЗП.

NKA изготавливают из размноженных аутологичных селективных почечных клеток (СПК), полученных из биопсийного образца почки каждого отдельного субъекта. В некоторых вариантах осуществления для производства NKA полученную при биопсии ткань почки субъекта обрабатывают, с последующим размножением почечных клеток и отбором СПК.

В некоторых вариантах осуществления NKA предоставляют в стерильном шприце одноразового использования. В некоторых вариантах осуществления СПК формулируют в желатиновом гидрогеле в концентрации 100×10⁶ клеток/мл, упаковывают в 10-мл шприц и отправляют в клинический центр для использования. В некоторых вариантах осуществления конечный объем рассчитывают, исходя из концентрации 100×10⁶ СПК/мл NKA и целевой дозы 3,0×10⁶ СПК/г массы почки (по оценке, например, методом МРТ). В некоторых вариантах осуществления, как описано в литературе, измеренные показатели объема почки в мл, полученные различными методами, соответствуют примерно 92-97% от измеренных показателей сухой массы в граммах, полученных путем измерения выделенных органов, очищенных от околопочечного жира. В некоторых вариантах осуществления дозу NKA рассчитывают, используя допущение при пересчете, что 1 г соответствует 1 мл. В некоторых вариантах осуществления дозу определяют в момент инъекции на основании массы почки пациента. В некоторых вариантах осуществления максимальный объем для любого пациента будет составлять 8,0 мл; то есть, если какой-либо субъект имеет левую почку с рассчитанной массой ≥259 г, то такой субъект будет получать 8 мл NKA.

Размноженные почечные клетки можно криоконсервировать в процессе размножения клеток для нивелирования вариабельности размножения клеток от разных пациентов. Криоконсервированные почечные клетки являются постоянным источником клеток для производства множества доз препарата биоактивных клеток для повторной инъекции и в случае необходимости другого препарата (например, в случае задержки вследствие болезни пациента, непредвиденных событий и так далее).

Ниже приведены примеры, способствующие более полному пониманию изобретения. Следующие далее примеры иллюстрируют варианты осуществления и применения на практике настоящего изобретения. Однако объем изобретения не ограничен конкретными вариантами осуществления, раскрытыми в данных примерах, которые предназначены исключительно для целей иллюстрации, поскольку для получения аналогичных результатов могут быть использованы альтернативные способы.

ПРИМЕРЫ

Пример 1 - Фазы I открытое исследование безопасности, переносимости и ранней эффективности терапевтического препарата аутологичных почечных клеток (REACT) у пациентов с хроническим заболеванием почек вследствие врожденных аномалий почек и мочевыводящих путей (CAKUT) (REGEN-044)

Краткое описание протокола

Терапевтический препарат

REACT получают из размноженных аутологичных селективных почечных клеток (СПК), полученных из биопсийного образца почки каждого отдельного субъекта. Для производства REACT ткань, полученную при биопсии почки, от каждого включенного в исследование субъекта посылают в Twin City Bio LLC, где почечные клетки размножают и отбирают СПК. СПК формулируют в желатиновом гидрогеле в концентрации 100×10⁶ клеток/мл, упаковывают в 10-мл шприц и отправляют в клинический центр для использования.

Цели исследования

Основная цель: основной целью исследования является оценка безопасности REACT, введенного инъекцией в одну почку реципиента.

Основные оцениваемые показатели:

- изменение в рСКФ в течение 6 месяцев после двух инъекций REACT

- частота случаев нежелательных явлений (НЯ), связанных с используемой для почек процедурой и/или препаратом, в течение 6 месяцев после инъекции.

Второстепенная цель: второстепенной целью исследования является оценка безопасности и переносимости введения REACT путем оценки специфических для почек нежелательных явлений в течение 24-месячного периода после инъекции.

Вторичный оцениваемый показатель:

- оценка специфических для почек лабораторных параметров в течение 24 месяцев после инъекции.

Исследовательская цель: исследовательские задачи исследования заключаются в оценке влияния REACT на почечную функцию в течение 24-месячного периода после инъекции.

Исследовательские оцениваемые показатели:

- клинические диагностические и лабораторные оценки почечной структуры и функции (включая рСКФ, сывороточный креатинин и протеинурию) для оценки изменений в скорости прогрессирования заболевания почек

- уровни витамина D

- визуализация с иогексолом

- контроль кровяного давления

- оценка методом МРТ объема почки

Дизайн исследования

Многоцентровое, проспективное, открытое исследование с одной группой субъектов. Все субъекты получают две инъекции REACT с интервалом 3 месяца (+12 недель) после биопсии.

Рандомизация

Открытое, без рандомизации.

Контрольная группа

Каждый субъект выступает в качестве собственного контроля; предыдущая история болезни пациента, которая должна включать минимум 6-месячный период наблюдения за функцией почек, служит контролем скорости прогрессирования почечной недостаточности.

Размер выборки

До 15 пациентов получают лечение REACT. Поскольку данное исследование является исследованием фазы I для изучения безопасности, исчерпывающий статистический анализ проводиться не будет. Таким образом, размер выборки, предложенный для данного исследования, является типичным для исследований фазы 1, позволяющим определять показатели безопасности в ограниченной популяции.

Популяция исследования

Мужчины или женщины в возрасте от 18 до 65 лет с ХЗП, определяемым на основании рСКФ, составляющей от 14 до 50 мл/мин/1,73 м², вследствие CAKUT. Пациенты должны иметь достаточное количество исторических клинических данных (не менее трех измерений рСКФ) для определения их индивидуальной скорости прогрессирования ХЗП.

Критерии включения: если нет иных указаний, субъекты должны соответствовать каждому критерию включения для участия в исследовании. Критерии включения должны быть оценены во время скринингового посещения, перед биопсией почек и перед каждой инъекцией REACT, если не указано иначе.

1. Пациент является мужчиной или женщиной в возрасте 18-65 лет на дату подписания информированного согласия.

2. Пациент имеет документально подтвержденную историю аномалий почек и/или мочевыводящих путей помимо документально подтвержденной истории CAKUT.

3. Пациент имеет установленный диагноз III/IV стадии ХЗП, не нуждается в почечном диализе, имеет рСКФ от 14 до 50 мл/мин/1,73 м² включительно во время скринингового посещения до инъекции REACT.

4. Субъект имеет кровяное давление менее 140/90 во время скринингового посещения до биопсии почки и до инъекции(й) REACT. Примечание: КД не должно быть значительно ниже 115/70.

5. Минимум три измерения рСКФ или сКр должны быть проведены с интервалом по меньшей мере 3 месяца до скринингового посещения и в течение предыдущих 24 месяцев для определения скорости прогрессирования ХЗП.

6. Пациент желает и может воздерживаться от употребления НПВС (включая аспирин), а также клопидогрела, прасугрела или других ингибиторов агрегации тромбоцитов в течение периода, начиная с 7 дней до, и до 7 дней после, биопсии почки и инъекции(й) REACT.

7. Пациент желает и может воздерживаться от употребления рыбьего жира и ингибиторов агрегации тромбоцитов, таких как дипиридамол (то есть, персантин^®), в течение периода, начиная с 7 дней до, и до 7 дней после, биопсии почки и инъекции(й) REACT.

8. Пациент желает и может следовать всем аспектам протокола.

9. Пациент желает и может предоставить подписанное информированное согласие.

Критерии исключения: субъекты, соответствующие любому из перечисленных ниже критериев исключения, не имеют права участвовать в исследовании. Критерии исключения оценивают во время скринингового посещения, до биопсии почки и до каждой инъекции REACT, если нет иных указаний.

1. Пациент имеет в анамнезе трансплантацию почек.

2. Пациент имеет диагноз гидронефроз 4 или 5 степени SFU.

3. Пациент имеет нескорректированный ПМР 5 степени.

4. Пациент имеет толщину коркового слоя почки менее 5 мм по результатам МРТ.

5. Пациент имеет известную аллергию или противопоказание(я), или перенес тяжелую системную реакцию(и) на канамицин или структурно аналогичный аминогликозидный антибиотик(и).

6. Пациент имеет в анамнезе анафилактическую или тяжелую системную реакцию(и), или противопоказание(я), на препараты человеческой крови или материалы животного происхождения (например, от коровы, свиньи).

7. Пациент имеет в анамнезе тяжелую системную реакцию(и), или какое-либо противопоказание, на местные анестетики или седативные препараты.

8. Пациент имеет клинически значимую инфекцию, требующую применения парентеральных антибиотиков, в пределах 6 недель от инъекции REACT.

9. Пациент имеет острое повреждение почек или испытывает быстрое снижение почечной функция в течение последних 3 месяцев до инъекции REACT.

10. Пациент имеет любое из следующих состояний до инъекции REACT: почечные опухоли, поликистоз почек, анатомические аномалии, которые могут препятствовать процедуре инъекции REACT, или признаки инфекции мочевыводящих путей.

Примечание: анатомические аномалии не являются основанием для исключения, если почка остается доступной и соответствуют критериям для получения инъекции REACT.

11. Пациент имеет сердечную недостаточность класса III или IV (Функциональная классификация NYHA).

12. Пациент имеет ОФВ1/ФВЕ ≥70%.

13. Пациент имеет в анамнезе рак в течение последних 3 лет (за исключением немеланомного рака кожи и карциномы in situ шейки матки).

14. Пациент имеет клинически значимое заболевание печени (АЛТ или АСТ более чем в 3 раза выше верхней границы нормы) при оценке во время скринингового посещения.

15. Пациент имеет положительный результат на активную инфекцию вирусом гепатита В (HBV) или вирусом гепатита C (HCV), и/или вирусом иммунодефицита человека (HIV) при оценке во время скринингового посещения.

16. Пациент имеет в анамнезе активную форму туберкулеза (ТБ), требующую лечения в течение последних 3 лет.

17. Пациент имеет иммунную недостаточность или получает иммуносупрессоры, включая индивидуумов, получающих лечение в связи с хроническим гломерулонефритом, в пределах 3 месяцев от инъекции REACT.

Примечание: ингаляционные кортикостероиды и постоянно принимаемые кортикостероиды в низких дозах (менее чем, или ровно, 7,5 мг в сутки) допустимы в качестве краткого импульсного применения кортикостероидов при перемежающихся симптомах (например, астме).

18. Пациент имеет предположительную продолжительность жизни менее 2 лет.

19. Женщина-пациент беременна, кормит грудью или планирует беременность во время исследования. Или женщина-пациент имеет детородный потенциал и не использует высокоэффективный способ(ы) контроля рождаемости, включая сексуальное воздержание. Или женщина-пациент не желает продолжать использование высокоэффективного способа контроля рождаемости в течение всего периода исследования.

20. Пациент имеет в анамнезе активное злоупотребление алкоголем и/или наркотиками, которое, по мнению исследователя, нарушит способность пациента соблюдать протокол.

21. Состояние здоровья пациента, по мнению исследователя, будет поставлено под угрозу в результате участия в исследовании.

22. Пациент использовал исследуемый продукт в течение 3 месяцев до инъекции REACT без получения письменного согласия медицинского наблюдателя.

Продолжительность исследования

Лечение начинается сразу после того, как препарат REACT становится доступным, и если предположить, что до первой инъекции REACT пройдет один месяц, а до второй - 3 месяца, плюс 24-месячный период наблюдения после последней инъекции, то продолжительность лечения составит:

- 28 месяцев для серии из 2 инъекций REACT.

Включение в исследование

До 15 субъектов включают в исследование. Пациентов, прошедших процедуры отбора, соответствующих всем критериям В/И, включают в исследование непосредственно перед проведением биопсии. Пациентов, не соответствующих всем критериям до проведения биопсии, считают не прошедшими скрининг. Пациенты, прошедшие процедуру биопсии, но по какой-либо причине не получившие инъекцию, прекращают участие в исследовании и могут быть заменены. После получения инъекции пациент завершает лечение, и прилагаются все усилия для того, чтобы пациент выполнил все последующие посещения.

План исследования

Скрининг: субъекты, соответствующие критериям приемлемости и дающие письменное информированное согласие, могут быть включены в исследование. Субъект должен иметь адекватные исторические клинические данные для обоснованной оценки скорости прогрессирования ХЗП после консультации с медицинским наблюдателем. Скрининговые процедуры включают полное физическое обследование, ЭКГ, лабораторные исследования (гематология, клиническая химия, анализ мочи). Проводят УЗИ для подтверждения анатомических особенностей почки, подлежащей биопсии и инъекции. Проводят МРТ или УЗИ для определения размера и объема почки с целью определения объема дозы.

Биопсия почки: за три дня, или менее, до проведения биопсии почек включенные в исследование субъекты приходят в клинику и проходят промежуточное физическое обследование, а также ЭКГ и МРТ почек (если они не были выполнены во время или после скринингового посещения). Также проводят лабораторные тесты, включая тесты на почечную функцию, гемоглобин и тест на беременность для женщин. Подходящих субъектов, соответствующих всем критериям включения и исключения, госпитализируют в больницу/клинический исследовательский центр для проведения биопсии почки. Минимум 2 биоптата ткани, каждый размером 1,5 см, должны быть собраны с помощью биопсийной иглы 16 калибра, чтобы обеспечить достаточное количество материала для изготовления REACT. Субъекты, у которых не возникло осложнений после биопсии, могут быть выписаны в тот же день в соответствии со стандартной практикой центра. Полученную при биопсии ткань почки каждого отдельного субъекта отправляют в Twin City Bio LLC.

Инъекция REACT: за десять-четырнадцать дней до запланированной даты инъекции субъекты проходят промежуточное медицинское обследование для текущей проверки соответствия критериям включения и исключения. Субъектам также проводят сцинтиграфию почек (то есть, сканирование функции почек с разделением) для выяснения, какой процент каждая почка вносит в общую базовую функцию почек. В день запланированной инъекции REACT подходящих субъектов госпитализируют в больницу/отделение клинических исследований. После нагревания до разжижения гидрогеля REACT вводят инъекцией в ту же почку, для которой ранее была проведена биопсия, используя чрескожный способ. Эта процедура будет проведена по стандартной методике, подобной той, которую используют при абляции почечных образований радиочастотными или криогенными методами. Субъекты без осложнений могут быть выписаны в тот же день в соответствии со стандартной практикой, принятой в центре проведения исследования. На следующий день после инъекции проводят УЗИ для выявления возможных субклинических НЯ. Субъекты получают 2 инъекции REACT, выполняемые с интервалом 3 месяца (+12 недель). Первую и вторую инъекции выполняют в ту же почку, для которой была проведена биопсия. Таким образом, на всем протяжении исследования используют только одну почку.

Последующее наблюдение: для субъектов проводят последующее наблюдение в дни 1, 7, 14, 28 (± 3 дня) и месяц 2 (± 7 дней) после первой и второй инъекций REACT. В зависимости от времени выполнения второй инъекции (то есть, через 3 месяца [+12 недель]) субъекты могут проходить обследование через 3 и 6 месяцев после первой инъекции REACT. После последней инъекции REACT для субъектов проводят долговременную последующую оценку безопасности и эффективности через 6, 9, 12, 15, 18, 21 и 24 месяца после лечения.

Мониторинг безопасности: кровотечение после инъекции REACT является известным и прогнозируемым риском для субъектов, участвующих в данном исследовании. Вследствие этого, измерение гемоглобина проводят в местной лаборатории клинического центра в следующие сроки: a) до, b) после процедуры в соответствии со стандартной практикой центра.

Исследуемый препарат, дозировка и способ введения

Исследуемый препарат: REACT получают из размноженных аутологичных селективных почечных клеток, полученных из биопсийного образца почки каждого отдельного субъекта. Для производства REACT ткань, полученную при биопсии почки, от каждого включенного в исследование субъекта посылают в Twin City Bio LLC, где почечные клетки размножают и отбирают СПК. СПК формулируют в желатиновом гидрогеле в концентрации 100×10⁶ клеток/мл, упаковывают в 10-мл шприц и отправляют в клинический центр.

Дозировка: вводимый объем REACT определяют на основании предпроцедурной 3D оценки объема методом МРТ или по формуле эллипсоида (длина x ширина плоскости AP x ширина поперечного плана x 0,62). Исходя из доклинических данных, доза REACT будет составлять 3×10⁶ клеток/г расчетной массы почки (г МП^расч). Поскольку концентрация СПК на мл REACT составляет 100×10⁶ клеток/мл, объем дозирования будет составлять 3,0 мл на каждые 100 г массы почки. С использованием этой парадигмы дозирования в следующей таблице показан объем дозирования и доставляемое количество СПК относительно расчетной массы почки. Максимальный объем REACT, вводимый инъекцией в подвергнутую биопсии почку, будет составлять 8,0 мл.

Расчетная масса почки (г МП^расч)* Объем дозы (мл) Доставляемые СПК (количество клеток x 10⁶) Средняя масса (г) Диапазон массы (г) 100 95-108 3,0 300 117 109-125 3,5 350 133 126-141 4,0 400 150 142-158 4,5 450 167 159-175 5,0 500 183 176-191 5,5 550 200 192-208 6,0 600 217 209-225 6,5 650 233 226-241 7,0 700 250 242-258 7,5 750 - - - >259 8,0 800 *Масса почки будет оценена на основании результатов проведенной процедуры МРТ

Субъекты получают две запланированные инъекции REACT для подбора дозы и оценки продолжительности эффекта. Первую и вторую инъекции выполняют в ту же почку, для которой была проведена биопсия. В некоторых случаях субъект или исследователь могут принять решение отложить или не выполнять вторую инъекцию REACT. Например, если возникает угроза безопасности или быстрое ухудшение почечной функции, или развитие неконтролируемого диабета или неконтролируемой гипертензии, или развитие злокачественной опухоли или интеркуррентной инфекции, тогда вторую инъекцию REACT выполнять не следует.

Способ введения: REACT вводят инъекцией в подвергнутую биопсии почку, используя чрескожный способ. В чрескожном способе используют стандартизированную методику (например, используемую при абляции почечных образований радиочастотными или криогенными методами).

Методы статистического анализа

Статистический анализ носит преимущественно описательный характер, проверка статистических гипотез в исследовании не планируется. Если не указано иначе, непрерывные переменные обобщают путем представления числа не пропущенных обследований (n), среднего значения, стандартного отклонения, медианы, минимума и максимума. Категориальные переменные обобщают путем представления подсчета частоты и процента для каждой категории.

Сокращения: НЯ (нежелательное явление); СоПреп (сопутствующие препараты); DMSB (Независимый комитет по мониторингу данных и безопасности субъектов исследования); ЭКГ (электрокардиограмма); ЗИ (посещение при завершении исследования); В/И (включение/исключение); KDQOL (опросник для оценки качества жизни при почечных заболеваниях); МРТ (магнитно-резонансная томография); REACT (-Kidney Augment); ФО (физическое обследование).

Примечания:

**Прилагают все усилия для того, чтобы вторая инъекция REACT была выполнена через 3 месяца после первой инъекции.

a. Если скрининговая оценка выпадает за пределы 60-дневного окна до биопсии почки, проводят повторный скрининг, как описано в разделе «Скрининг» (раздел 6.1).

b. Поскольку вторую инъекцию REACT выполняют через 3 месяца (+12 недель) после первой инъекции, посещение через 3 месяца или посещение через 6 месяцев может не быть запланировано.

c. Если не выполняют вторую инъекцию REACT, субъект проходит все последующие обследования после последней инъекции REACT во время ЗИ посещения через 12 месяцев.

d. ЗИ посещение происходит через 12 месяцев после последней инъекции REACT или когда субъект прекращает участие в исследовании по решению исследователя (раздел 8.4), или когда субъект добровольно прекращает участие в исследовании (раздел 5.4).

e. Форма информированного согласия должна быть подписана и датирована до проведения любых процедур, связанных с исследованием, включая процедуры во время скринингового посещения.

f. ФО и промежуточный ФО описаны в разделе 7.2.2.

g. Жизненно важные показатели включают частоту сердечных сокращений, кровяное давление в покое, частоту дыхания и температуру тела. (Раздел 7.2.1).

h. Жизненно важные показатели измеряют на протяжении всей процедуры.

i. Смотри Таблицу 2 для информации о графике лабораторных анализов.

j. Ультразвуковое исследование проводят во время скринингового посещения для проверки соответствия требованиям, подтверждения анатомических особенностей почки, в которой будет проведена биопсия и инъекции, а также для получения базовых показателей эхогенности. При последующих УЗИ контролируют эхогенность.

k. Ультразвуковое исследование проводят после биопсии почки в день 0 и день 1, а также после инъекции(й) препарата REACT в день 0 и день 1 с целью мониторинга возможных субклинических НЯ.

l. МРТ-исследование без контраста проводят со времени скринингового посещения до дня -1 перед биопсией почек для определения размера и объема почек. Это МРТ-исследование повторяют перед второй инъекцией для правильного расчета дозы. УЗИ проводят для определения размера почки с целью расчета дозы, если пациент не может пройти МРТ или если врач считает, что ультразвуковое исследование является адекватным для измерения.

m. Сцинтиграфию почек проводят перед первой инъекцией REACT, перед последней инъекцией REACT, во время посещения через 6 месяцев после последней инъекции REACT и во время ЗИ посещения.

n. С препаратом REACT обращаются и вводят его в соответствии с процедурами, описанными в справочном руководстве по исследованию.

o. КТ-сканирование можно использовать в сочетании с ультразвуком для процедуры инъекции REACT.

p. Субъекты, у которых нет осложнений, могут быть выписаны в тот же день в соответствии со стандартной практикой, принятой в данном учреждении.

Сокращения: АЧТВ (активированное частичное тромбопластиновое время); ФСГ (фолликулостимулирующий гормон; HbA1c (гликозилированный гемоглобин); HIV (вирус иммунодефицита человека); HBV (вирус гепатита B); HCV (вирус гепатита C); НЖАЛ (нейтрофильный желатиназо-ассоциированный липокаин); REACT (Kidney Augment); иПТГ (интактный паратиреоидный гормон); ПВ-МНО (протромбиновое время-международное нормализованное отношение)

Примечания:

*День 1, последующее наблюдение после биопсии представляет собой дополнительный лабораторный набор, который можно использовать только в том случае, если пациент был госпитализирован и оставался на ночь в больнице в соответствии со стандартной практикой учреждения.

**Прилагают все усилия для того, чтобы вторая инъекция REACT была выполнена через 3 месяца после первой инъекции.

a. Если скрининговая оценка выпадает за пределы 60-дневного окна до биопсии почки, проводят повторный скрининг, как описано в разделе «Скрининг» (раздел 6.1).

b. Поскольку вторую инъекцию REACT выполняют через 3 месяца (+12 недель) после первой инъекции, посещение через 3 месяца или посещение через 6 месяцев может не быть запланировано.

c. Если не выполняют вторую инъекцию REACT, субъект проходит все последующие обследования после последней инъекции REACT во время ЗИ посещения через 12 месяцев.

d. ЗИ посещение происходит через 12 месяцев после последней инъекции REACT или когда субъект прекращает участие в исследовании по решению исследователя (раздел 8.4), или когда субъект добровольно прекращает участие в исследовании (раздел 5.4).

e. В клинике проводят тест на беременность с помощью тест-полоски. Если тест положительный, то в центральной лаборатории проводят подтверждающий тест.

f. Женщины после менопаузы с подтверждающим результатом теста на ФСГ не должны проходить тест на беременность в течение всего исследования.

g. В течение 24 часов до дней: 0, проведения биопсии и инъекции(й) REACT подтверждают, что уровни гемоглобина составляют >9 г/дл в соответствии со стандартной практикой учреждения.

h. В дни 0, проведения биопсии почки и введения(й) REACT гемоглобин и гематокрит измеряют до и после процедуры в соответствии со стандартной практикой в местной больнице. Эти образцы обрабатывают в местной лаборатории для ускорения получения результатов и принятия последующих решений, влияющих на клиническую процедуру. Кроме того, образцы крови на гемоглобин и гематокрит после процедуры отправляют в центральную лабораторию, где результаты могут быть внесены в базу данных исследования.

i. До выполнения инъекции REACT проводят микроскопический анализ мочи с использованием тест-полоски для подтверждения отсутствия инфекции.

j. β2-микроглобулин оценивают в образцах как сыворотки, так и мочи.

k. Исследовательские образцы (сыворотка/плазма и моча) собирают, замораживают и хранят для оценки новых биомаркеров.

Таблица 3: Сокращения и специальные термины

Сокращение или специальный термин Объяснение ИАПФ Ингибитор ангиотензинпревращающего фермента НЯ Нежелательное явление АЛТ Аланин-трансаминаза АЧТВ Активированное частичное тромбопластиновое время БРА Блокатор рецепторов ангиотензина АСТ Аспартат-трансаминаза ИМТ Индекс массы тела КД Кровяное давление АМК Азот мочевины крови CAKUT Врожденные аномалии почек и мочевыводящих путей ХЗП Хроническое заболевание почек СоПреп Сопутствующий препарат(ы) ИРК Индивидуальная регистрационная карта C-РБ C-реактивный белок CTCAE Общие терминологические критерии неблагоприятных явлений DMSA Димеркаптосукциновая кислота ЭКГ Электрокардиограмма КЭ Комитет по этике рСКФ Расчетная скорость клубочковой фильтрации ЗИ Завершение исследования ТСЗП Терминальная стадия заболевания почек FDA Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США г грамм(ы) GCP Надлежащая клиническая практика СКФ Скорость клубочковой фильтрации г МП^расч Расчетная масса почки, грамм(ы) GLP Надлежащая лабораторная практика GMP Надлежащая производственная практика Hb Гемоглобин HbA_1c Гликозилированный гемоглобин HBV Вирус гепатита B HCV Вирус гепатита C HIV Вирус иммунодефицита человека HR-QoL Качество жизни, связанное со здоровьем БИ Брошюра исследователя ICH Международная конференция по гармонизации В/И Включение/исключение IND Исследуемый новый лекарственный препарат МНО Международное нормализованное отношение иПТГ Интактный паратиреоидный гормон KDQOL Опросник для оценки качества жизни при почечных заболеваниях MedDRA Медицинский словарь терминов нормативной деятельности Mo Месяц МРТ Магнитно-резонансная томография NCI Национальный институт рака NKA Neo-Kidney Augment NOAEL Уровень отсутствия наблюдаемого вредного воздействия НПВС Нестероидные противовоспалительные лекарственные средства Nx Нефрэктомия ФО Физическое обследование ГИ Главный исследователь ПВ Протромбиновое время ПВ-МНО Протромбиновое время-международное нормализованное отношение QA Служба обеспечения качества REACT Почечная терапия аутологичными клетками ККК Эритроцит СНЯ/СНР Серьезное нежелательное явление/Серьезная нежелательная реакция сКр Сывороточный креатинин SPIO Суперпарамагнитный оксид железа СПК Селективные почечные клетки ПНСНР Подозреваемая неожиданная серьезная нежелательная реакция СД2Т Сахарный диабет 2 типа ТБ Туберкулез UACR Соотношение альбумин/креатинин в моче БКК Лейкоцит

1. CAKUT и хроническое заболевание почек

Общим компонентом CAKUT является пузырно-мочеточниковый рефлюкс, который определяют как обратный ток мочи из мочевого пузыря в один или оба мочеточника, почечные лоханки или и то, и другое. Первичный пузырно-мочеточниковый рефлюкс (ПМР) является самой распространенной врожденной аномалией мочевыводящих путей в детском возрасте, который диагностируется в основном после эпизода инфекции мочевыводящих путей (ИМП). Считается, что ПМР предрасполагает к инфекции мочевыводящих путей (ИМП) и рубцеванию почек. Рубцевание почек, связанное с ПМР, также известно как рефлюкс-нефропатия (РН). Долгосрочные потенциальные осложнения РН включают гипертензию, протеинурию и прогрессирование до терминальной стадии заболевания почек (ТСЗП) [5]. Пациенты с аномально развитыми почками наиболее восприимчивы к развитию ТСЗП, поскольку состояние почек продолжает ухудшаться даже после коррекции ПМР (Brakeman). Ardissino с соавторами обнаружили, что почти в 26% случаев терминальная стадия заболевания почек у пациентов с гиподисплазией была связана с пузырно-мочеточниковым рефлюксом. Точная частота возникновения РН у детей или взрослых неизвестна. РН имеет место у 12% - 21% всех детей с хронической почечной недостаточностью [1, 2]. Согласно отчету о североамериканских испытаниях и совместных исследованиях почек в педиатрии за 2008 год, РН является четвертой по распространенности причиной хронического заболевания почек у 8,4% детей и является основной патологией у 5,2% пациентов после трансплантации и 3,5% пациентов, нуждающихся в диализе [3]. В исследовании CKID, в котором участвовала группа из 586 детей в возрасте от 1 года до 16 лет с расчетной СКФ от 30 до 90 мл/мин/1,73 м², РН являлась первопричиной ХЗП у 87 (14,8%) пациентов. У взрослых обструктивная уропатия составляла 0,3% от общего числа случаев ТСЗП за 2005 год, часть из которых может быть обусловлена РН. Лишь в немногих групповых исследованиях было проведено долгосрочное последующее наблюдение за пациентами после антирефлюксной операции. В одной группе из Израиля только у 1 из 100 пациентов через 20 лет развилось ХЗП. В другой группе пациентов, у которых по результатам ВВП было выявлено рубцевание почек, у 18% через 20 лет развилось ХЗП. Несмотря на это, частота возникновения ТСЗП у взрослых вследствие РН является низкой.

Хроническое заболевание почек (ХЗП) характеризуется прогрессирующей нефропатией, которая без терапевтического вмешательства будет ухудшаться до достижения пациентом ТСЗП. ХЗП определяют как снижение почечной функции, о чем свидетельствует сниженная скорость клубочковой фильтрации (СКФ) или показатели повреждения почек, такие как повышенная экскреция альбумина с мочой. Распространенность ХЗП в мире оценивается в 8-16%. Чтобы выжить, пациенты ТСЗП нуждаются в заместительной почечной терапии (диализе или трансплантации почки). Предотвращение или отсрочка неблагоприятных исходов ХЗП посредством раннего вмешательства является основной стратегией контроля ХЗП. Тем не менее, ранние методы лечения были менее чем оптимальными, что привело к значительной неудовлетворенной медицинской потребности в улучшенных интервенционных стратегиях для контроля ХЗП и замедления прогрессирования до ТСЗП.

Лечение пациентов с ХЗП сосредоточено на замедлении прогрессирования и подготовке к развитию почечной недостаточности/замене почки. У многих пациентов ХЗП происходит в рамках сложного комплекса совместных заболеваний. Когда пациент достигает ТСЗП, показана заместительная почечная терапия (то есть, диализ или трансплантация). Подавляющее большинство пациентов с заболеванием 5-й стадии получают гемодиализ [4]. Диализ заменяет примерно 5-15% почечной функции, в зависимости от интенсивности и частоты использования; диализ также помогает восстановить баланс жидкости и электролитов, когда почка выходит из строя. Однако продолжительность жизни пациентов с ТСЗП, начинающих гемодиализ, составляет всего 4-5 лет [5]. Кроме того, гемодиализ связан с многочисленными серьезными осложнениями, а также с ухудшением качества жизни, например, необходимостью проходить диализ до трех раз в неделю. Хотя в настоящее время трансплантация почки остается наиболее эффективной формой терапии, существует хроническая нехватка органов. Если пациенту удается получить почку для трансплантации, для предотвращения отторжения требуется длительная иммуносупрессорная терапия. Использование этих режимов приводит к повышению частоты инфекций и, в долгосрочной перспективе, к некоторым видам рака [6]. В целом, существует острая медицинская потребность в улучшенных методах лечения ХЗП, которые могли бы значительно замедлить прогрессирование заболевания и существенно отсрочить или уменьшить необходимость в трансплантации почки. В Таблице 4 определены стадии ХЗП в соответствии с измерениями СКФ. Начальная стадия нефропатии (1 стадия) развивается в течение нескольких лет и характеризуется микроальбуминурией (30-300 мг/24 ч), с последующей макроальбуминурией (>300 мг/24 ч). По мере снижения способности почек отфильтровывать отработанные продукты крови повышается уровень сывороточного креатинина. При нарастающем поражении почек (2-4 стадии) повышение кровяного давления еще больше усугубляет заболевание почек. Когда почки полностью перестают функционировать (5 стадия [ТСЗП]), требуется заместительная почечная терапия (диализ или трансплантация).

Таблица 4: Сводные данные по классификации и оценки распространенности для ХЗП

Стадия* Описание СКФ (мл/мин/1,73 м²) 1 Повреждение почек с нормальной или повышенной СКФ >90 2 Повреждение почек с небольшим снижением СКФ 60-89 3 Умеренное снижение СКФ 30-59 4 Сильное снижение СКФ 15-29 5 Почечная недостаточность <15 (или диализ)

*Источник: National Kidney Foundation, 2002. National Kidney Foundation. 2002. KDOQI clinical practice guidelines for chronic kidney disease: evaluation, classification, and stratification. Am J Kidney Dis. 39:S1-266.

1.1 Доклинические фармакологические исследования

В серии доклинических исследований сотрудники Tengion (бывшая компания в области регенеративной медицины) определили фармакологические характеристики СПК и замедлили прогрессирование ХЗП в экспериментальных моделях за счет улучшения структуры и функции почек [7-12]. Впоследствии в Tengion были проведены исследования безопасности, фармакологические и токсикологические исследования в соответствии с требованиями GLP. Обзор этих доклинических исследований представлен в Таблице 5.

Таблица 5: Сводные результаты доклинических фармакологических и токсикологических исследований

Модель Количество животных Продолжительность исследования Доза в расчете на массу почки^a
10⁶ клеток/г Количество инъецированных почек Общая масса (г) инъецированной почки^a Общая^b доза (мл) Общее количество СПК x 10⁶ Концентрация СПК 10⁶/мл Исследование Фармакология (эффективность, кинетика, миграция и персистенция) 5/6 Нефректомия
Крысы Lewis^d 3 6 мес 5-10 1 (1) 1 0,1 5-10 50-100 1 70% Нефректомия
Собаки^d 4 10 мес 6 1 (2) 57,7 5 334 66,8 2 ZSF-1^e 7 12 мес 3 2 (2) 3,2 0,4 10 25 3 5/6 Нефректомия
Крысы Lewis^e 77 4 дня 5-15 1 (1) 1 0,1 5-15 50-150 4 Собаки^e 1 30 мин 12,5 2 (2) 120 10 1500 150 5 Собаки^e 4 30 мин 1,5-9,2 2 (1-2) 120 2,5-10 92,77-553,5 37-55 6 GLP Токсикология ZSF-1 крысы^d 5M/5F
5M/5F
5M/5F
5M/5F 3 мес
6 мес
3 мес
6 мес 3,13
3,13
6,25
6,25 2 (2)
2 (2)
2 (2)
2 (2) 2
2
2
2 0,25
0,25
0,25
0,25 6,25
6,25
12,5
12,5 25
25
50
50 7 Собаки^e 2M/2F
2M/2F
2M/2F
2M/2F 1 мес
3 мес
1 мес
3 мес 2,75
2,75
11,0
11,0 1 (1)
1 (1)
2 (1)
2 (1) 60
60
120
120 3
3
12
12 330
330
1320
1320 110
110
110
110 8 Собаки^{c, e} 0 месяцев 2M/2F н/п 5,5 2 (2) 120 6 660 110 9 3 месяца 6 мес 5,5 2 (2) 120 6 660 110 10

Примечания:

a. Расчетная масса почки на основании животной модели. Фактическая масса указана в отчетах об исследовании, где это применимо.

b. Доза относится к СПК или REACT.

c. Вводили две дозы REACT, одну в 0 месяцев, вторую в 3 месяца.

d. Вводили REACT грызунам, используя шприц с прикрепленной острой иглой, прокалывали капсулу и депонировали REACT.

e. Вводили REACT собакам, используя канюлю для прокалывания капсулы плюс тупоконечная доставляющая канюля для депонирования REACT.

1.1.1. Фармакодинамика

Принципиальное доказательство пользы СПК в качестве биологически активного компонента REACT было получено во многих животных моделях ХЗП. Например, модель ХЗП на грызунах после нефрэктомии (Nx) с уменьшением 5/6-х массы позволила оптимизировать отбор терапевтически значимой популяции клеток СПК. Модель ХЗП на собаках с 70% Nx подтвердила активность СПК у крупных млекопитающих, а крысы ZSF-1 послужили доказательством принципа, с демонстрацией эффектов СПК в модели, соответствующей СД2Т [13]. СПК, доставляемые непосредственно в корковый слой почки, в нескольких экспериментальных моделях ХЗП вызывали регенеративную реакцию за счет прямого приживления или замещения тканей, а также индуцировали секретируемые факторы за счет предполагаемого паракринного механизма [9, 14-17].

Данная стратегия вмешательства приводила к значительному улучшению выживаемости, стабилизации прогрессирования заболевания и увеличению продолжительности жизни в обеих моделях ХЗП на грызунах, 5/6-х Nx и ZSF-1. Морфологическая нормализация множества структур нефронов сопровождалась функциональными улучшениями, включая клубочковую фильтрацию, обработку белка в канальцах, электролитный баланс и способность к концентрированию мочи. В крысиной модели ZSF-1 также наблюдалось снижение кровяного давления и уменьшение уровней циркулирующего ренина. Наблюдаемые функциональные улучшения после введения СПК сопровождались значительным уменьшением клубочкового склероза, дегенерации канальцев, а также интерстициального воспаления и фиброза. В целевом органе или других тканях не было отмечено значимых токсикологических прижизненных, клинических патологических или гистологических изменений. Исходя из результатов многочисленных доклинических исследований, проведенных на различных животных моделях ХЗП, СПК (то есть, активный компонент REACT) были эффективны для значительного замедления прогрессирования ХЗП, будучи инъецированы в пораженный болезнью орган до развития необратимой нефропатии. Эти результаты дают основание для исследования эффектов данной клеточной терапии у пациентов до развития ТСЗП.

1.1.2. Фармакологическая безопасность

1.1.2.1. Внепочечная активность

REACT (то есть, СПК, сформулированные в желатиновом гидрогеле) вводили в различных крысиных и собачьих моделях для оценки немедленного сердечно-сосудистого и респираторного фармакологического эффекта. Немедленное воздействие СПК в низких и высоких концентрациях, сформулированных в желатине различной процентной концентрации (0,75-1,0%), оценивали в модели 5/6-х Nx на грызунах. Потенциальные изменения кровяного давления оценивали непосредственно до, в процессе, и вскоре после введения REACT в нормальной собачьей модели. Исследования влияния REACT на центральную нервную систему не проводили, поскольку: 1) животные демонстрировали нормальное поведение до, во время и после введения REACT; 2) не ожидалось никакого воздействия на центральную нервную систему от исследуемого препарата, содержащего интактные почечные клетки, и 3) REACT доставляли в почку.

1.1.2.2. Гемодинамические эффекты

Крысы в исследовании на модели 5/6-х Nx (исследование № 4) получали REACT или контрольный растворитель, и потенциальные гемодинамические эффекты были отслежены в течение 4 дней. Из 77 экспериментальных животных в этом исследовании препарата REACT 16 животных испытывали апноэ в процессе, или сразу после, введения REACT. Всего погибли 9 животных; причины гибели были классифицированы как апноэ (n=3), почечное кровотечение (n=2) и гибель в связи с ХЗП (n=4). Шесть из 16 животных, у которых наблюдалось апноэ, предварительно не получали атропин; из этих животных, у которых наблюдалось апноэ, двое погибли под воздействием анестезии до применения атропина. Десять из 16 животных, у которых наблюдалось апноэ, получали атропин, и все восстановились после хирургического вмешательства и инъекции REACT.

С другой стороны, апноэ, почечное кровотечение и гибель животных, произошедшие в исследовании на крысиной модели 5/6-х Nx, отсутствовали в исследовании на крысах ZSF-1 или в фармакологических исследованиях на собаках, или в двух пилотных исследованиях на (интактных) собаках, в которых были оценены краткосрочные эффекты вводимого объема на кровяное давление. Без связи с какой-либо теорией, в совокупности, этот специфический для моделей гемодинамический ответ может быть потенциально обусловлен: 1) измененной гемодинамикой сильно уменьшенного в массе остатка почки грызуна [18]; 2) преходящими изменениями в управлении интерстициальным давлением в почках, вызывающими центральный вегетативный ответ [19, 20], и 3) недостаточной перфузией тканей или острой гипоксией в результате кровотечения после доставки в почку. Предварительное введение атропина, конкурентного антагониста парасимпатической нервной системы, помогало смягчать гемодинамические изменения, характерные для данной модели. Эффект атропина позволил предположить возможную вегетативную реакцию на введение REACT, которая была характерна для животных после Nx с сильным уменьшением 5/6-х массы в модели ХЗП на грызунах.

1.1.2.3. Объем дозы

В исследовании с использованием диапазона доз, объемов и концентраций REACT (исследование № 5) использовали нормальных собак для оценки кровяного давления непосредственно до, в процессе, и после введения REACT в почку. В данном исследовании в каждый полюс каждой почки вводили 2,5 мл REACT; таким образом, всего 10 мл/120 г, или 0,083 мл/г, было введено в дозе 12,5×10⁶ клеток/грамм массы почки. Введение REACT переносилось хорошо; не было никаких неблагоприятных системных эффектов (физических или серологических), также не было никаких значительных токсикологических или гистоморфологических изменений, указывающих на травму почки или другие повреждения тканей в результате введения REACT. В отличие от модели ХЗП на грызунах с сильной потерей массы, апноэ, почечное кровотечение или гибель отсутствовали.

1.1.3. Кинетика, миграция и персистенция

Как и в случае других вариантов клеточной терапии, направленных на мягкие органы, данные о биораспределении исследуемого препарата ограничены. В связи с этим три дополнительных исследования предоставляют данные о потенциальной миграции и персистенции REACT в почке в выбранные моменты отбора образцов после введения [16, 17, 21]. Результаты этих исследований обобщены в данном разделе; подробная информация представлена в брошюре исследователя.

1.1.3.1. Крысы ZSF-1

СПК были помечены частицами суперпарамагнитного оксида железа (SPIO) с родамином-B. Это контрастное средство специально разработано для мечения клеток и легко поглощается не фагоцитарными клетками. SPIO-меченые клетки вводили в почку крысам ZSF-1. Через двадцать четыре часа после введения SPIO-меченые клетки обнаруживали методом МРТ и методом оптической визуализации целого органа. Кроме того, крысы ZSF-1 получали СПК, меченые CelSense-19F, количественное определение которых проводили методом ядерного магнитного резонанса через 3 часа, 24 часа и 7 дней после инъекции [16, 22].

Как немедленное обнаружение ZSF-1, так и долгосрочное обнаружение донорских клеток с использованием модели ХЗП с 5/6-х Nx, показали значительное удержание SPIO-меченых клеток. Клинически значимое обнаружение методом МРТ через 24 часа после введения клеток выявило область на переднем полюсе почки, куда были введены инъекцией SPIO-меченые клетки. Получение срезов всей почки и окрашивание берлинской лазурью показало скопление меченных железом SPIO клеток, мигрирующих и распространяющихся из участка инъекции в корковом слое, и подтвердило их присутствие в канальцевых и околоканальцевых пространствах коркового и медуллярного слоя почки.

Аналогично, флуоресцентная визуализация всего органа выявила клетки в участке инъекции, расположенном в верхней части коры переднего полюса почки крыс ZSF-1, и вокруг него. Обнаружение 19F-меченых СПК через 3 и 24 часа после введения подтвердило почти 100% удержание в почке. Через 7 дней было обнаружено на порядок меньше 19F-меченых СПК, что согласуется с непрерывным выделением мочи.

1.1.3.2. Не-GLP анализ не почечной ткани у свиней

В доклиническом не-GLP исследовании SPIO-меченые СПК вводили в почки живым свиньям (n=11). Распределение клеток отслеживали в течение 30-дневного периода исследования методом МРТ. Меченые СПК были распределены в двух основных компартментах: мочевом пузыре и паренхиме почки. Основной путь выведения - с мочой. Примечательно, что не было никаких доказательств эктопической миграции СПК или специфического приживления в нецелевых органах [23].

1.1.3.3. Не-GLP анализ не почечной ткани у собак

В доклиническом не-GLP исследовании SPIO-меченые СПК вводили в почки живым собакам. Распределение клеток отслеживали через 30 минут после инъекции методом МРТ. В соответствии с наблюдениями в экспериментах на модельных живых свиньях, свидетельствующими о том, что введенные инъекцией SPIO-меченые СПК удерживались в паренхиме почки или выводились с мочой, SPIO-меченые СПК также удерживались в паренхиме почки в участке инъекции через 30 минут.

1.1.3.4. Выводы

- СПК распространялись в участке инъекции (паренхима почки) и выводились с мочой, исходя из результатов исследований с мечением СПК SPIO и CelSense-19F.

- СПК, введенные в почки крыс, свиней и собак, не были обнаружены в нецелевых органах (кроме мочевыводящих путей в процессе выведения), исходя из результатов обширного гистологического исследования.

- Исходя из сообщений об аллогенных мезенхимальных стволовых клетках, а также опубликованных данных о безопасности аутологичных мезенхимальных стволовых клеток в клинических испытаниях, аутологичные материалы, относящиеся к REACT, также не должны приводить к эктопическому росту тканей, дисфункции органов или развитию опухолей [24-28].

1.2. Токсикологические исследования

Для оценки безопасности REACT были проведены три исследования безопасности в соответствии с требованиями GLP, то есть, одно исследование было проведено на модели ХЗП на крысах ZSF-1 и два других исследования были проведены на нормальных собаках.

1.2.1. Исследование на крысах ZSF-1 с введением одной дозы

Целью данного исследования являлась оценка безопасности однократного введения REACT крысам ZSF-1, являющимся моделью неконтролируемого метаболического синдрома, включающего СД2Т, гипертензию и сильное ожирение. Крысы получали: 1) высокую дозу REACT; 2) низкую дозу REACT; 3) суррогат или 4) только биологический материал. Каждое животное получало 4 инъекции тестируемого препарата, по одной в каждый полюс каждой почки. Результаты были оценены через 3 и 6 месяцев после введения.

1.2.1.1. Связанные с почками проблемы

Не было отмечено никаких связанных с лечением проблем в почках после оценки 8 областей в каждой почке (3 пятна на область), включая анализ и оценку в баллах 150 клубочков на почку. Помимо изменений, связанных с инъекциями и/или линейными рубцами в участке инъекции, все почки были признаны нормальными в контексте модели заболевания. Не было отмечено никаких связанных с тестируемым препаратом проблем в почках через 3 или 6 месяцев после введения. Все макроскопические и микроскопические изменения в почках были признаны связанными с естественным прогрессированием заболевания почек у модельных тучных крыс ZSF-1 или с процедурой инъекции.

Изменения в почках во всех группах были более сильно выраженными у самцов, и согласовались с различиями в стадиях заболевания между полами. В целом, наблюдалась явная тенденция к снижению показателей тяжести гистологического поражения почек (то есть, более низкий показатель повреждения клубочков, показатель канальцево-интерстициального повреждения и общий показатель повреждения нефронов), которая постоянно наблюдалась в группе введения REACT в низкой концентрации, в сравнении с контрольной группой введения суррогата, через 6 месяцев после процедуры.

На основании отсутствия различий между группами исследования уровнем отсутствия наблюдаемого вредного воздействия (NOAEL) была признана высокая доза, 6,25×10⁶ клеток/г МП^расч.

1.2.1.2. Не связанные с почками проблемы

Никаких проблем с безопасностью, связанных с введением REACT, не наблюдали в нецелевых тканях. Не наблюдали никаких связанных с введением REACT изменений в мочеточниках или мочевом пузыре (основные пути выведения REACT). Отсутствовали связанные с REACT эффекты, и отсутствовали какие-либо клеточные материалы REACT во всех дренирующих (лимфатические узлы) или фильтрующих (печень, легкие, селезенка) исследуемых тканях.

1.2.1.3. Клиническая патология

Результаты клинических лабораторных исследований (включая гематологию, клиническую химию и специальные анализы мочи) оценивали на предмет различий между исходным уровнем и уровнем в конце исследования (3 или 6 месяцев после введения), а также между экспериментальной и контрольной группами. Не было обнаружено никаких связанных с REACT клинически значимых лабораторных аномалий.

1.2.1.4. Выводы

- Все животные выжили до конца исследования (3 или 6 месяцев после введения).

- Отсутствовали значительные клинические патологические проблемы, связанные с безопасностью, или связанные с безопасностью проблемы, имеющие токсикологическое значение, обусловленные лечением.

- Не было обнаружено никаких связанных с REACT клинически значимых лабораторных аномалий.

- Определяемое значение NOAEL составляло 6,25×10⁶ клеток/г МП^расч.

1.2.2. Начальное исследование на собаках с введением одной дозы

В начальном токсикологическом исследовании на собаках оценивали безопасность однократного введения двух разных доз REACT в сравнении с введением суррогата или введением биологического материала. Тестируемый препарат вводили в один полюс каждой почки. Всего в исследовании использовали 32 беспородные собаки; 16 были оценены через один месяц, и 16 были оценены через 3 месяца.

1.2.2.1. Общие результаты

Все 32 животных выжили до назначенного срока их умерщвления через один или 3 месяца после введения препаратов. Животные были здоровы на протяжении всего исследования. Значимые клинические патологические проблемы отсутствовали. Не было признаков почечной недостаточности (азотемии), и не было признаков снижения СКФ.

1.2.2.2. Относящиеся к почкам результаты

Не было обнаружено никаких связанных с введением REACT макроскопических или микроскопических проблем через один или 3 месяца. В почках отсутствовали какие-либо проблемы, связанные с введением, после масштабной оценки 8 областей в каждой почке (3 пятна на область), включая анализ и оценку в баллах 150 клубочков на почку. Помимо изменений, связанных с рубцами в участке инъекции, все почки были нормальными. Все макроскопические и микроскопические изменения в почках были признаны проблемами на уровне фона или связанными с процедурами инъекции.

1.2.2.3. Не связанные с почками проблемы

Не было обнаружено никаких связанных с тестируемым препаратом проблем в других (не почечных) тканях. Все макроскопические и микроскопические изменения были признаны изменениями на уровне фона и в пределах нормы.

1.2.2.4. Связанные с процедурой проблемы

Наиболее распространенными аномалиями были отеки в местах разрезов (образование серомы) и снижение массы тела по окончании исследования. Что касается отека в месте разреза, у десяти из шестнадцати (10/16) животных стерильная серома образовалась после инъекции, и у девяти из шестнадцати (9/16) после лечения.

У животных была разная степень отека в области забрюшинных разрезов, и их лечили на основании решения ветеринара.

У многих животных имела место небольшая потеря аппетита после введения REACT (29 из 32) и лечебных процедур (18 из 32). У многих животных (28 из 32) наблюдалось снижение массы тела от исходного состояния (до инъекции) до умерщвления. Следует отметить, что большее снижение массы тела происходило в промежутке от начала исследования (2 недели до введения) до введения (день 0; инъекции в почку), чем в промежутке от введения до умерщвления. Потеря массы тела также происходила во всех группах введения и была признана связанной со стрессовым характером исследования.

1.2.2.5. Выводы

- Все животные дожили до назначенного срока завершения исследования и были здоровы на протяжении всего исследования, исходя из результатов клинической патологии, анализа мочи и ветеринарной оценки.

- Ни низкая, ни высокая, доза REACT не приводили к макроскопическим или микроскопическим неблагоприятным эффектам через один или 3 месяца после введения, аналогично результатам после введения суррогата или введения биологического материала.

- Патологическое исследование показало отсутствие связанных с введением REACT (макроскопических или микроскопических) проблем в целевом органе (почка) или нецелевых исследуемых органах.

- Исходя из результатов патологоанатомического исследования, определяемое значение NOAEL соответствовало высокой тестируемой концентрации, то есть, 11,7×10⁶ клеток/г МП^расч.

1.2.3. Исследование на собаках с неоднократным введением доз

Во втором токсикологическом исследовании на собаках оценивали безопасность введения двух повторных доз REACT. Каждую дозу вводили в обе почки в начале исследования (момент времени ноль) и через 3 месяца. Для всех животных проводили две почечные биопсии на почку за 4-6 недель до процедуры начальной инъекции. Контрольным животным вводили PBS. Животных наблюдали в течение 6 месяцев после начальной инъекции.

1.2.3.1. Результаты исследования

Все 8 животных были здоровы на протяжении всего исследования и дожили до назначенного срока завершения исследования через 6 месяцев. У 5 из 8 животных наблюдалась легкая или незначительная потеря массы тела, при этом 2 животных потеряли >3% массы тела за время исследования. Большая потеря массы тела происходила между почечной инъекцией и начальным введением, чем между начальным введением и завершением исследования. Данные клинической патологии и анализа мочи не выявили никаких отклонений от нормы. Не было признаков почечной недостаточности, и не было признаков снижения СКФ.

1.2.3.2. Связанные с почками проблемы

Никакие связанные с инъекцией REACT макроскопические или микроскопические проблемы с безопасностью не были выявлены через 6 месяцев. Никакие связанные с введением проблемы в почках не были обнаружены после масштабной оценки 8 областей в каждой почке (3 пятна на область), включая анализ и оценку в баллах 150 клубочков на почку. Все почки выглядели нормальными, не считая изменений, связанных со шрамами в участке инъекции (фиброз/хроническое воспаление в капсуле; линейный фиброз/хроническое воспаление и воспалительные клетки в корковом/медуллярном слое).

1.2.3.3. Не связанные с почками проблемы

Никакие проблемы с безопасностью, связанные с тестируемым препаратом, не были выявлены в нецелевых тканях. Все макроскопические и микроскопические изменения были признаны фоновыми изменениями и, следовательно, были признаны находящимися в пределах нормы.

1.2.3.4. Выводы

- Все животные дожили до назначенного срока окончания исследования, были здоровы по данным клинической патологии, анализа мочи и ветеринарной оценки.

- Патологическая оценка показала отсутствие связанных с REACT (макроскопических или микроскопических) проблем с безопасностью как в целевом органе (почка), так и нецелевых исследуемых органах.

- Через 6 месяцев не наблюдалось никакого вредного воздействия двух повторных доз REACT в сравнении с контрольными животными, которым вводили PBS.

1.3. Неклинические выводы

Данные многочисленных исследований на животных с использованием широкого диапазона доз (3-15 миллионов СПК/г ткани инъецированной почки) и длительных периодов времени после введения REACT (до одного года), включая три исследования в соответствии с требованиями GLP, показали, что потенциальный риск осложнений от введения REACT в почку был аналогичен потенциальному риску осложнений, связанному со стандартной практикой биопсии почек [1-3].

Помимо изменений, связанных с инъекционными процедурами, и сердечно-сосудистых проблем, характерных для грызунов после нефрэктомии с уменьшением 5/6-х массы, модели ХЗП, не было обнаружено никаких непредвиденных прижизненных, гематологических, урологических, серологических или гистологических изменений в целевом органе или нецелевых тканях после введения REACT.

1.4. Клиническое испытание фазы 1: промежуточные результаты

1.4.1.

В апреле 2013 года было начато первое клиническое испытание на людях в Каролинской университетской больнице Худдинге в Стокгольме, Швеция: фазы I открытое исследование безопасности и оптимизации доставки аутологичного усилителя почечной функции (REACT) у пациентов с хроническим заболеванием почек (RMTX-CL001). Данное исследование представляет собой фазы I открытое исследование безопасности и оптимизации доставки REACT, вводимого инъекцией субъектам с ХЗП. REACT производят из СПК, полученных из биопсийного образца почки субъекта, формулируют их с желатиновым биологическим материалом и вводят обратно в левую почку субъекта. Основной целью является оценка безопасности и оптимальной доставки REACT, при введении инъекцией в один участок почки реципиента, на основании развития связанных с процедурой и/или препаратом нежелательных явлений (НЯ) в течение 12 месяцев после введения. Второстепенной целью является оценка почечной функции путем сравнения результатов лабораторных анализов от начала исследования и до 12 месяцев после инъекции REACT, с последующим дополнительным периодом наблюдения продолжительностью 18 месяцев. Исходная скорость прогрессирования заболевания ХЗП каждого субъекта служит его/ее собственным контролем при мониторинге изменений в развитии почечной недостаточности с течением времени. Шесть субъектов, набранных из Каролинской университетской больницы, были включены в исследование. Кроме того, один субъект был включен в исследование в Университете Северной Каролины.

1.4.2. Нежелательные явления

В группе из 7 мужчин в возрасте от 53 до 70 лет с диабетической нефропатией без необходимости в диализе (3b/4 стадия ХЗП) все субъекты восстановились после лапароскопической процедуры введения REACT без непосредственных периоперационных осложнений. Примечательно, что ни у одного из субъектов не наблюдалась гематурия, которая проспективно рассматривалась как наиболее вероятное нежелательное явление. У одного из субъектов развилась кишечная непроходимость в день 2 после инъекции REACT, и потребовалась частичная резекция толстой кишки, которая осложнилась кровотечением из анастомоза. По мнению исследователя, это событие не было связано с тестируемым препаратом или процедурой. У одного субъекта возникла кожная инфекция, связанная с процедурой лапароскопического введения препарата. Еще один субъект восстановился после хирургического вмешательства с воспалением дыхательных путей. Все серьезные нежелательные явления (СНЯ), связанные с клиническим исследованием, представлены в Таблице 6.

Восемь из девяти СНЯ были сочтены возможно связанными с инъекционной хирургией. Ни один из НЯ или СНЯ не сочли связанным с процедурой биопсии. На сегодняшний день не выявлено ни одной отсроченной или поздно развившейся нежелательной реакции, связанной с REACT или другими процедурами исследования (например, негативные опосредованные иммунной системой реакции). Исходя из имеющихся данных, наибольший риск, связанный с лечением REACT, судя по всему, связан с инъекционной хирургией. В связи с этим предпринимаются шаги по сокращению продолжительности хирургической процедуры и улучшению результатов хирургического вмешательства.

Таблица 6: Серьезные нежелательные явления, о которых сообщалось в исследовании RMTX-CL001

Номер субъекта Предпочтительный термин MedDRA Интенсивность Время до начала Исход СНЯ Отношение к REACT 001-002 Усталость Легкая 4 дня Излечение/Разрешение Не связано 001-001 Усталость Легкая 5 дней Излечение/Разрешение Не связано 001-001 Послеоперационная раневая инфекция Легкая 20 дней Излечение/Разрешение Возможно, связано 001-002 Пневмония Умеренная 41 день Излечение/Разрешение Возможно, связано 001-003 Инфекция мочевыводящих путей Легкая 7 дней Излечение/Разрешение Не связано 001-004 Усталость Легкая 4 дня Излечение/Разрешение Не связано 001-005 Непроходимость кишечника Умеренная 2 дня Излечение/Разрешение Не связано 001-003 Задержка жидкости Умеренная 61 день Излечение/Разрешение Не связано 001-005 Кровотечение из анастомоза Умеренная 40 дней Излечение/Разрешение Не связано

1.4.3. Расчетная скорость клубочковой фильтрации (рСКФ)

Семи пациентам-мужчинам с СД2Т и 3b/4 стадией ХЗП вводили инъекцией REACT в левую почку. Информация, полученная для данных субъектов до инъекции, указывала на то, что их среднее снижение рСКФ составляло 6,1 мл/мин/год. После лечения REACT снижение рСКФ для объединенной группы (все субъекты) составляло -3,1 мл/мин/год (серая линия на ФИГ. 1).

После мониторинга потенциального влияния лечения REACT на прогрессирование ХЗП в данной группе пациентов в течение примерно одного года, ожидаемое снижение почечной функции, по-видимому, было изменено одной инъекцией REACT в одну почку. На ФИГ. 1 сравнение рСКФ после введения REACT (серая линия) с рСКФ до введения REACT (черная линия) показывает, что у 6 из 7 субъектов имело место уменьшение темпов снижения рСКФ после лечения. Годовой темп изменений рСКФ, до и после лечения REACT, представлен для каждого субъекта в Таблице 7.

Таблица 7: Расчетная скорость клубочковой фильтрации для каждого субъекта (RMTX-CL001)

Номер субъекта Изменение рСКФ (мл/мин/год) До лечения REACT После лечения REACT 001-001 -14,8 1,5 001-002 -0,2 -1,3 001-003 -6,7 -5,9 001-004 -16,3 -7,5 001-005 -3,9 -2,6 001-006 -11,4 -5,9 001-007 -7,7 1,4

1.4.4. Сывороточный креатинин

Определенные до лечения уровни сывороточного креатинина (сКр), в целом, были повышены в этой группе, что можно было бы ожидать от субъектов с СД2Т и умеренной или тяжелой почечной недостаточностью (3b/4 стадией ХЗП). Годовые темпы изменения сКр до и после лечения REACT представлены для каждого субъекта в Таблице 8. У всех субъектов наблюдалось снижение их индивидуальных темпов увеличения уровней сКр после лечения REACT в сравнении с темпом увеличения уровней сКр, который наблюдался до лечения REACT.

Таблица 8: Сывороточный креатинин у каждого субъекта (RMTX-CL001)

Номер субъекта Изменение уровня сывороточного креатинина (мкмоль/л/год) До лечения REACT После лечения REACT 001-001 153 -41 001-002 17 -21 001-003 214 200 001-004 16 -39 001-005 69 23 001-006 216 95 001-007 48 -40

Коллективный уровень сКр до лечения в этой группе составлял >100 мкмоль/л/год. После лечения REACT уровень сКр снизился до <50 мкмоль/л/год. Как видно на Фигуре 2, сравнение сКр после лечения REACT (серая линия) с сКр до лечения REACT (черная линия) показало, что в группе имело место снижение темпов увеличения уровня сКр после лечения REACT. Это изменение было устойчивым у каждого субъекта.

1.4.5. Толщина коркового слоя почки

У пациентов, страдающих от хронического заболевания почек, происходит утончение функциональной части почки, то есть, коркового слоя. Толщина коркового слоя почек уменьшается при ХЗП в результате фиброза и рубцевания по мере прогрессирования заболевания. В доклинических исследованиях REACT увеличение толщины коркового слоя было связано с регенерацией почки, и было подтверждено гистологически у всех 4 исследованных видов животных. В клинических испытаниях TNG-CL010 и TNG-CL011 толщину коркового слоя оценивали с использованием технологий визуализации; биопсия не была проведена для подтверждения увеличения толщины. Толщину коркового слоя измеряли как в правой, так и в левой, почке для определения того, произошло ли в инъецированной левой почке какое-либо изменение толщины коркового слоя, которое можно было бы объяснить инъекцией REACT. Правая почка служила в качестве не инъецированного контроля.

В среднем, толщина коркового слоя увеличивалась в левой почке от 14 мм в исходном состоянии до примерно 16 мм после одного года лечения REACT. Это изменение толщины коркового слоя было недостаточным для того, чтобы вызвать увеличение общего объема левой почки (данные не представлены). Никакого изменения толщины коркового слоя не наблюдали в правой почке.

1.4.6. Гемоглобин

ХЗП может быть связано с анемией вследствие изменения продуцирования в почках эритропоэтина, а также метаболических нарушений, возникающих в результате хронической уремии [29]. В клиническом исследовании RMTX-CL001 у 3 из 7 субъектов наблюдалось улучшение уровней гемоглобина после лечения REACT, при этом у остальных 4 субъектов сохранялись нормальные уровни в течение исследования.

1.4.7. Кровяное давление

Кровяное давление контролировали в ходе клинических испытаний TNG-CL010 и TNG-CL011. Субъекты получали лекарственные препараты для контроля их кровяного давления. Примечательно, что прием антигипертензивных лекарственных препаратов сократился у 3 из 6 субъектов в течение первых шести месяцев после лечения REACT.

1.5. Потенциальные риски

Как правило, потенциальные риски, связанные с клиническим применением REACT, можно разделить на 3 категории: биопсия почки, препарат REACT и доставка в почку реципиента. Оценка потенциальных рисков, связанных с каждым из этих этапов, представлена в данном разделе.

В настоящее время нет никаких особых предостережений или мер предосторожности, связанных с применением REACT. Однако при применении данного препарата необходимо учитывать предостережения и меры предосторожности, связанные с биопсией почек и процедурой чрескожного введения. Риски биопсии почек были хорошо охарактеризованы за 100 лет использования и развития этой процедуры. Чрескожное введение иглой препаратов в почку имеет более короткую историю.

Риски биопсии почек и чрескожного введения иглы в почки включают:

1. Боль в боку/участке инъекции/биопсии

2. Кровотечение при инъекции/биопсии, которое может возникать вокруг почки или в любом участке вдоль пути иглы, и которое может быть достаточным, чтобы повлечь за собой клинически значимую анемию, острое повреждение почки (ОПП), гематому, а в случае субкапсулярного кровотечения «почку Пейджа» и острую гипертензию.

3. Хирургическое повреждение почки в результате травмы иглой, а также травмы других структур, включая соединительные ткани, кости и внутрибрюшные внутренности.

1.5.1. Потенциальные риски, связанные с биопсией почки

Аутологичные почечные клетки будут получены от отдельных субъектов путем биопсии почки, выполняемой в соответствии со стандартной медицинской практикой [1-3] и в соответствии со стандартными операционными процедурами в участвующих больницах/медицинских учреждениях. Необходимо минимум 2 биоптата ткани, взятые при биопсии одной почки, для получения достаточного количества ткани коркового слоя почки для производства REACT. Биопсийная игла 16-го калибра длиной около 10 мм позволяет отбирать 0,01-0,02% от среднего общего объема больной почки. Поскольку будет взято примерно 0,001% от общего числа почечных клубочков [3], ожидается, что биопсия не окажет негативного влияния на почечную функцию.

Биопсия почек для диагностических процедур имеет низкий риск и часто проводится в США под седацией в амбулаторных условиях [30, 31]. При выполнении квалифицированными врачами-хирургами биопсия почки, правильно направленная на корковый слой, приводит к ограниченному повреждению почек [27]. С другой стороны, в сообщениях о повреждении почек в месте биопсии описаны повреждение сосудов и различные степени ишемии и инфаркта. Тяжесть повреждения зависит от размера и количества сосудов, поврежденных во время процедуры биопсии [32].

Кровотечение является наиболее распространенным нежелательным явлением, связанным с рутинной биопсией почек. Почти у всех пациентов в результате биопсии возникает микроскопическая гематурия, но она не является клинически значимой [2, 31]. С другой стороны, обильная гематурия возникает у 3-9% пациентов [30, 31], и обычно проходит через 24 часа после биопсии. Наиболее серьезным осложнением является тяжелое кровотечение, требующее переливания крови и/или приводящее к смерти пациента. Переливание крови требуется менее чем в 1% случаев биопсии почек, а смерть наступает менее чем в 0,01% случаев [33-35].

1.5.2. Потенциальные риски, связанные с препаратом REACT

Исследуемый препарат, REACT, состоит из аутологичных почечных клеток, полученных от того же субъекта путем биопсии почки. Исходя из опыта трансплантации аутологичных стволовых клеток, риск иммунного ответа (например, отторжения трансплантата), вызванного введением REACT в почку, представляется маловероятным.

Поскольку почка является высокоперфузируемым органом, сомнительно, что введенные СПК останутся локализованными в участке инъекции. Тремя зонами, считающимися наиболее вероятными пунктами направления мигрирующих СПК, являются: 1) субкапсулярное пространство; 2) системное кровообращение и 3) мочевыводящие пути. Утечка СПК в субкапсулярное пространство, как ожидается, не будет представлять риск для субъекта. Например, субкапсулярное пространство обычно используют для введения эндокринной ткани, такой как островковые клетки [36]. Почечная капсула также служит нишей для собственных стволовых клеток, способных мигрировать в паренхиму почки [37]. Кроме того, прямое введение в почку уменьшает вероятность попадания СПК в системную циркуляцию, обеспечивая естественный путь элиминации через мочевыводящие пути. Более того, внутривенное введение гетерологичных, аллогенных стволовых клеток (то есть, мезенхимальных стволовых клеток) было оценено в клинических испытаниях и не выявило значительного риска для людей [24-28].

Желатин типа B из кожи свиньи, используемый в препарате REACT, соответствует требованиям Монографии по фармацевтическому и пищевому желатину (Европейская фармакопея 7.0, Фармакопея США - Национальный формуляр USP35 NF30). Желатин широко используется в фармацевтике и медицине, включая клеточную трансплантацию для регенеративных препаратов. Не ожидается, что желатин вызовет нежелательные явления у субъектов в исследовании, исходя из его биосовместимой природы, широкого спектра применения, а также результатов GLP токсикологических исследований с использованием свиного желатина, содержащего REACT.

1.5.3. Потенциальные риски, связанные с введением REACT

Для доступа к почке с целью доставки REACT используют чрескожный способ. Чрескожный способ используют для абляции почечных образований уже более десяти лет. Краткий обзор этого способа можно найти в публикации Salagierski and Salagierski (2010) [38]. В процессе введения REACT и послеоперационного наблюдения будут соблюдены меры предосторожности для снижения вероятности чрезмерного кровотечения и других нежелательных явлений. Пациенты будут находиться под тщательным наблюдением, как описано в разделе 6.

Cain с соавторами (1976) [39] сообщали, что гомогенаты почечных клеток, введенные в почки грызунов, не вызывали существенных нежелательных явлений. Аналогично, наблюдаемые морфологические эффекты после доставки REACT в почку соответствовали тем, о которых сообщалось при повторных биопсиях почек, взятых у собак, то есть, присутствовала дорожка из зрелой соединительной ткани без функциональных нарушений, с минимальными структурными изменениями [32]. Увеличение внутрикапсульного объема воды в почке у собак может приводить к повышению внутрипочечного давления, а также к временному увеличению массы почки и системного артериального давления [19, 20]. Однако в пилотных исследованиях на собаках, в которых оценивалось краткосрочное влияние введения объема на кровяное давление, не было выявлено негативного влияния на кровяное давление после увеличения объема до 6 мл на почку за счет REACT.

1.6. Потенциальная польза

Возможность достижения клинически значимого улучшения при ХЗП подтверждается исследованиями, в которых REACT был протестирован в доклинических животных моделях почечной недостаточности, то есть, хирургических моделях снижения почечной функции у здоровых в остальном крыс и собак, а также в модели СД2Т на крысах ZSF-1. Главный вывод заключался в том, что REACT значительно снижал темпы структурного и функционального ухудшения в уже нездоровых почках до степени, которая была клинически значимой в животной модели. Таким образом, существует вероятность того, что субъекты, участвующие в данном клиническом исследовании, получат терапевтическую пользу от лечения препаратом REACT, например, возможное снижение темпов прогрессирования ХЗП.

2.Задачи и цель испытания фазы I

Данное клиническое испытание относится к применению регенеративного продукта на основе клеток, -Kidney Augment (REACT), с целью улучшения почечной функции у субъектов, страдающих от ХЗП и СД2Т. Терапевтическое вмешательство с использованием REACT призвано отсрочить необходимость заместительной почечной терапии (диализа или трансплантации), которая, согласно действующим стандартам оказания медицинской помощи, неизбежна для пациентов с конечной стадией ХЗП. Цель настоящего исследования заключается в сравнении безопасности и эффективности 2 инъекций REACT, выполняемых с интервалом в 3 месяца (+12 недель) (максимум), у субъектов, рандомизированных для получения первого введения сразу после того, как препарат REACT будет доступен, и у субъектов, рандомизированных для получения современного стандартного лечения ХЗП в течение первых 12-18 месяцев до получения 2 инъекций REACT. Кроме того, годовой темп снижения почечной функции у каждого субъекта, основанный на адекватных исторических клинических данных за 18 месяцев до скринингового посещения, служит в качестве компаратора для мониторинга скорости прогрессирования почечной недостаточности до и после инъекции REACT.

Введение REACT снижает темп (наклон) уменьшения рСКФ и улучшает функцию почек в течение 24 месяцев после последней инъекции REACT.

2.1. Основная цель

Оценка безопасности REACT, вводимого инъекцией в одну почку реципиента.

Основные оцениваемые показатели:

- изменение в рСКФ в течение 6 месяцев после двух инъекций REACT

- частота случаев нежелательных явлений (НЯ), связанных с используемой для почек процедурой и/или препаратом, в течение 6 месяцев после инъекции.

2.2. Второстепенная цель

Оценка безопасности и переносимости введения REACT путем оценки специфических для почек нежелательных явлений в течение 24-месячного периода после инъекции.

Вторичный оцениваемый показатель: оценка специфических для почек лабораторных параметров в течение 24 месяцев после инъекции.

2.3. Исследовательская цель

Оценка влияния REACT на почечную функцию в течение 24-месячного периода после инъекции.

Исследовательские оцениваемые показатели:

- клинические диагностические и лабораторные оценки почечной структуры и функции (включая рСКФ, сывороточный креатинин и протеинурию) для оценки изменений в скорости прогрессирования заболевания почек

- уровни витамина D

- визуализация с иогексолом

- контроль кровяного давления

- оценка методом МРТ объема почки.

3. Исследуемый препарат

3.1. Описание исследуемого лекарственного средства

REACT представляет собой инъекционный препарат, состоящий из СПК, сформулированных в биологическом материале (желатиновом гидрогеле). В Таблице 9 приведен обзор исследуемого препарата. Смотри брошюру исследователи для подробного описания СПК и REACT, а также производственного процесса.

Таблица 9: Исследуемый препарат

Исследуемый препарат Название препарата: REACT (-Kidney Augment) Лекарственная форма: Почечные клетки, полученные из аутологичной почечной ткани, полученной при биопсии, размножают, и СПК отбирают. СПК формулируют в желатиновом гидрогеле в концентрации 100×10⁶ клеток/мл. Этот стерильный клеточный препарат (REACT) помещают в стерильный 10-мл шприц и отправляют в клинический центр для использования. Стандартная доза Дозу REACT доводят до 3×10⁶ клеток/г расчетной массы почки, определяемой методом МРТ. Путь введения Чрескожная инъекция в корковый слой подвергнутой биопсии почки Физическое описание Стерильный, маркированный, 10-мл шприц, содержащий до 8 мл REACT Производитель Twin City Bio LLC, Winston-Salem, North Carolina, USA

3.2. Закупка и производство REACT

REACT производят на соответствующем требованиям GMP предприятии в Twin City Bio LLC, расположенном в городе Уинстон-Салем, Северная Каролина, США.

3.2.1. Биопсия

Биопсийный материал собирают с использованием стандартных хирургических методов для оценки левой или правой почки. Минимум 2 биоптата ткани, каждый размером 1,5 см, должны быть собраны с помощью биопсийной иглы 16 калибра, чтобы обеспечить достаточное количество материала для производства аутологичного REACT. После получения биопсийного материала в Twin City Bio LLC образцы маркируют, и соблюдают строгие требования по документированию для обеспечения прослеживаемости препарата. Twin City Bio LLC уведомляет клинический центр об адекватности и качестве биопсийного образца для производства REACT, и подтверждает запланированную дату введения REACT. Если биопсийный материал не может быть использован, субъект должен прекратить участие в исследовании.

3.2.2. Отбор СПК

Примерно за 4 недели до запланированного введения REACT субъекту аутологичные почечные клетки извлекают из паровой фазы жидкого азота морозильной камеры, размораживают и выделяют из почечной ткани путем ферментативного расщепления. Клетки культивируют и размножают стандартными методами.

Среда для культивирования клеток предназначена для размножения первичных почечных клеток и не содержит какие-либо факторы дифференцировки. Собранные почечные клетки подвергают разделению в градиенте плотности для получения СПК, которые состоят преимущественно из почечных эпителиальных клеток, известных своим регенеративным потенциалом [40]. В популяции аутологичных СПК в незначительном количестве могут присутствовать и другие паренхиматозные (сосудистые) и стромальные (собирающих протоков) клетки.

При наличии достаточного количества клеток тот же биопсийный материал используют для получения дополнительных препаратов REACT для исследовательских целей, и хранят в соответствии с требованиями GMP в паровой фазе жидкого азота в морозильной камере.

Все субъекты получают серию из 2 инъекций REACT. В Таблице периодов времени и событий показано, что серию из 2 инъекций REACT выполняют с интервалом 3 месяца с периодом посещений в исследовании, составляющим 12 недель. В любом случае принимают все необходимые меры, чтобы вторая инъекция REACT была выполнена через 3 месяца после первой инъекции. Twin City Bio LLC уведомляет клинический центр для получения информации о примерной запланированной дате второй инъекции.

3.2.3. Препарат

СПК формулируют в желатиновом гидрогеле для повышения стабильности во время транспортировки и доставки инъекцией в корковый слой почки. Свиной желатин растворяют в буфере, получая термочувствительный гидрогель. Будучи жидким при комнатной температуре, этот биологический материал образует гель при охлаждении до температуры охлаждения (2-8°C). перед инъекцией исследуемый препарат REACT должен быть нагрет до температуры от ≥20°C до 26°C для разжижения гидрогеля.

3.2.4. Препарат REACT для инъекции

За десять-четырнадцать дней до запланированной даты введения REACT субъект приходит в клинику и проходит оценку для подтверждения права на дальнейшее участие в исследовании. Если субъект не подходит для инъекции REACT, исследователь и спонсор обсуждают возможные варианты, например, имеется ли достаточная стабильность для попытки проведения инъекции REACT в будущем. Если субъект все-еще подходит для инъекции, препарат REACT производят и отправляют в клинический центр. Клинический центр отвечает за то, чтобы препараты REACT были доставлены непосредственно персоналу центра. REACT вводят инъекцией в подвергнутую биопсии почку подходящим для этого субъектам, используя чрескожный способ. В чрескожном способе используют стандартизированную методику (например, используемую при абляции почечных образований радиочастотными или криогенными методами) [38].

Две инъекции REACT запланированы для каждого субъекта. Однако, если возникает угроза безопасности или быстрое ухудшение почечной функции, или развитие неконтролируемого диабета или неконтролируемой гипертензии, или развитие злокачественной опухоли или интеркуррентной инфекции, тогда вторую инъекцию REACT выполнять не следует.

Почечные клетки, которые, возможно, были заморожены, но не использованы для производства REACT, остаются в паровой фазе жидкого азота в морозильной камере в Twin City Bio LLC до посещения в период ЗИ. В это время, если эти почечные клетки больше не нужны, их лишают идентификации, основанной на како-либо личной информации, и хранят в паровой фазе жидкого азота в морозильной камере в течение максимум 5 лет. Целью является тестирование этих почечных клеток в лабораторных исследованиях. Во время подписания информированного согласия каждый субъект предоставляет письменное согласие на хранение и использование в будущем аутологичных клеток, не использованных для инъекции REACT. Субъекты имеют возможность дать указание на уничтожение этих клеток по завершении исследования.

3.2.5. Доза REACT

Доза REACT для субъектов в клинических испытаниях фазы 1 (TNG-CL010 и TNG-CL011) составляла 3×10⁶ СПК/г расчетной массы почки (г МП^расч). Аналогично, в настоящем исследовании каждая инъекция REACT составляет 3×10⁶ клеток/г МП^расч. Поскольку концентрация СПК составляет 100×10⁶ клеток/мл REACT, объем дозирования составляет 3,0 мл на каждые 100 г массы почки. Вводимый объем REACT определяют на основании предпроцедурной 3D оценки объема методом МРТ или по формуле эллипсоида (длина x ширина плоскости AP x ширина поперечного плана x 0,62). Примеры объемов дозирования на основании расчетной массы почки приведены в Таблице 10.

Таблица 10: Дозирование REACT на основании расчетной массы почки

Расчетная масса почки (г МП^расч)^{a, b} Объем дозы REACT (мл) Доставляемые СПК (количество клеток x 10⁶) Средняя масса (г) Диапазон массы (г) 100 95-108 3,0 300 117 109-125 3,5 350 133 126-141 4,0 400 150 142-158 4,5 450 167 159-175 5,0 500 183 176-191 5,5 550 200 192-208 6,0 600 217 209-225 6,5 650 233 226-241 7,0 700 250 242-258 7,5 750 ― ― ― >259 8,0^c 800

Сокращения: Расчетная масса почки (г МП^расч); СПК (селективные почечные клетки).

Примечания:

a. Доза REACT будет составлять 3×10⁶ клеток/г расчетной массы почки.

b. Масса почки будет оценена на основании результатов МРТ, проведенной до биопсии почки.

c. Объем 8 мл будет максимальным объемом дозирования (мл).

Доза REACT основана на объеме почки, рассчитанном методом МРТ. В отличие от других способов, измерение объема почки методом МРТ является более точным и позволяет получать достоверные томографические данные в любой ориентации без риска, присущего ионизирующему излучению или нефротоксичным контрастным веществам. Показатели объема почки (мл), измеренные методом МРТ, соответствуют примерно 92-97% от измеренных показателей сухой массы в граммах для выделенных органов, очищенных от околопочечного жира. В качестве консервативного подхода дозу REACT рассчитывают, используя допущение при пересчете, что один г соответствует одному мл. Вводимый объем REACT определяют на основании предпроцедурной 3D оценки объема методом МРТ или по формуле эллипсоида (длина x ширина плоскости AP x ширина поперечного плана x 0,62). Это гарантирует, что субъекты не получат более высокие дозы REACT, чем дозы, протестированные ранее в исследованиях на животных.

3.2.5.1. Обоснование для двух инъекций REACT

Все субъекты должны получить две запланированные инъекции РЕАКТ для определения дозы и оценки продолжительности эффекта. Научное обоснование, основанное на доклинических исследованиях, заключается в том, что биологически активный компонент REACT (гомологичные, аутологичные СПК) замедляет прогрессирование ХЗП в экспериментальных моделях за счет улучшения почечной структуры и функции [7-12]. В результате, чем больше клеток может быть введено, тем больше потенциальное улучшение почечной функции. Однако общее количество клеток, которое можно вводить в почку за один раз, ограничено размером почки, а также неэластичностью почечной капсулы. Следовательно, есть вероятность повышения терапевтического эффекта за счет введения большего количества СПК со второй инъекцией, выполняемой после того, как клетки, введенные путем первой инъекции, становятся частью почки.

Помимо увеличения количества СПК за счет выполнения 2 инъекций REACT в одну и ту же почку может быть оценена продолжительность эффектов. Процессы, в результате которых функциональные нефроны становятся неработоспособными в почках с ХЗП, могут со временем негативно влиять на «новые» клетки, вводимые инъекцией REACT. Как следствие, REACT может не приводить к длительному терапевтическому эффекту. Изучение эффекта от второй инъекции REACT, выполненной через соответствующий интервал времени после первой инъекции, позволило бы решить этот вопрос.

В настоящем исследовании субъектам выполняют вторую инъекцию REACT через 3 месяца после первой инъекции, с периодом посещений в исследовании, составляющим 12 недель. В любом случае принимают все необходимые меры, чтобы вторая инъекция REACT была выполнена через 3 месяца после первой инъекции. Однако, если возникает угроза безопасности или быстрое ухудшение почечной функции, или развитие неконтролируемого диабета или неконтролируемой гипертензии, или развитие злокачественной опухоли или интеркуррентной инфекции, тогда вторую инъекцию REACT не выполняют.

3.2.5.2. Безопасность двух инъекций REACT

Для оценки безопасности введения двух доз REACT в подвергнутую биопсии почку было проведено токсикологическое исследование на собаках в соответствии с требованиями GLP (смотри раздел 1.2.2). Аналогично дизайну клинического исследования, в исследовании животные (n=8) были подвергнуты биопсии почек за 4-6 недель до начала исследования. Каждая доза была введена в обе почки в начале исследования и через 3 месяца; животные находились под наблюдением в течение 6 месяцев после начальной инъекции. При том, что контрольные животные получали PBS, получающие REACT животные получали в два раза большую дозу, чем доза, используемая в настоящем клиническом исследовании.

Вкратце, не было отмечено никакого вредного воздействия двух доз REACT, введенных в подвергнутую биопсии почку, в сравнении с контрольными животными через 6 месяцев после начального введения. Патологоанатомическое исследование не выявило никаких связанных с REACT (макроскопических или микроскопических) проблем с безопасностью в целевом органе (почка) или в нецелевых исследуемых органах. Никакие связанные с введением проблемы в почках не были обнаружены после масштабной оценки 8 областей в каждой почке (3 пятна на область), включая анализ и оценку в баллах 150 клубочков на почку. Все почки выглядели нормальными, не считая изменений, связанных со шрамами в участке инъекции. Отсутствовали признаки почечной недостаточности, и отсутствовали признаки снижения СКФ. Подробная информация представлена в брошюре исследователя.

3.3. Упаковка исследуемого лекарственного средства

Система доставки препарата состоит из 3 компонентов:

1) 10-мл стандартный шприц Luer-Lok^®

2) Упаковка для хранения шприца

3) Контейнер для перевозки REACT для доставки упаковки в клинический центр.

Шприц, содержащий REACT, доставляют в клинический центр в упаковке, предназначенной для сохранения целостности препарата, а также стерильности препарата и шприца. Репрезентативное изображение системы доставки препарата приведено на ФИГ. 3.

Система доставки препарата выполнена из компонентов, перечисленных в Таблице 11. Материалы, контактирующие с препаратом REACT, относятся к классу VI USP или имеют эквивалентное качество. Шприц, трубки и вспомогательные детали получают от поставщиков, перечисленных в Таблице 11, или других поставщиков, продукция которых соответствует требованиям классификации биосовместимости и тестирования на совместимость с препаратом. Шприц предварительно стерилизуют в упаковке гамма-излучением. После заполнения трубку герметично закрывают и отрезают.

Таблица 11: Компоненты системы доставки препарата

Компоненты Поставщик Материал изготовления Контакт с REACT Тест на биосовместимость, ссылка* Шприц Merit Medical или Becton-Dickinson Поликарбонат, силикон или полипропилен, силикон Прямой ISO 10993
USP класс VI Трубки Saint-Gobain Performance Plastics Поливинилхлорид Прямой Ph Eur 3.1.1.2
ISO 10993
USP класс VI Luer-Lok^®
гарнитура PAW BioScience Полиэтилен Прямой USP класс VI Value Plastics Полипропилен
MABS Прямой USP класс VI

*Было проведено дополнительное тестирование (цитотоксичность, элюция в MEM, in vitro: USP <87>; Гемолиз клеток крови кролика: ASTM F756-00; Физико-химические испытания пластика: USP <661>).

3.4. Маркировка исследуемого лекарственного средства

Препарат REACT изготовлен из размноженных аутологичных СПК, полученных из биопсийного образца почки каждого отдельного субъекта, и, следовательно, является специфическим для субъекта. К каждой упаковке, содержащей шприц, прикреплена этикетка со следующей информацией: «ТОЛЬКО ДЛЯ АУТОЛОГИЧНОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ». Кроме того, на этикетке указано, что данное лекарственное средство (REACT) предназначено «ТОЛЬКО для исследовательских целей».

3.5. Транспортировка исследуемого лекарственного средства

Все биопсийные образцы перевозят в Twin City Bio LLC с использованием упаковки, предусмотренной Кодексом федеральных нормативных актов (42 CFR часть 72) и в соответствии с индивидуальными правилами перевозчика.

Поскольку препарат REACT в гидрогеле должен находиться при температуре от 2 до 8°C в процессе перевозки, препарат REACT перевозят из Twin City Bio LLC в клинический центр в контейнере для перевозки, гарантированно поддерживающем температуру 2-8°C. Упаковку REACT помещают в пластиковый внешний защитный пакет, а затем в охлаждаемый контейнер для перевозки от компании Minnesota Thermal Sciences. В контейнер для перевозки также входит регистратор температуры. Репрезентативное изображение контейнера для перевозки представлено на ФИГ. 4.

Когда контейнер для перевозки прибывает в клинику к моменту запланированной инъекции, внутреннюю упаковку REACT извлекают из контейнера для перевозки и оставляют нагреваться до контролируемой комнатной температуры (от ≥20°C до 26°C).

Два сотрудника независимо проверяют идентифицирующую информацию в присутствии субъекта, тем самым подтверждая, что информация правильно сопоставлена с конкретным участником исследования.

После разжижения гидрогеля ассистент хирурга вскрывает контейнер в стерильном поле, и передает шприц врачу, который выполняет чрескожную инъекцию РЕАКТ в корковый слой подвергнутой биопсии почки.

3.5.1. Размещение хранящихся образцов

Образцы хранят в паровой фазе жидкого азота в морозильной камере.

4. План исследования

4.1. Общий дизайн исследования

Обзор хода исследования представлен диаграммой на ФИГ. 5.

После подписания ФИС пациенты проходят скрининг на включение в исследование. Скрининговые оценки включают лабораторные анализы, физическое обследование, а также процедуры ЭКГ и МРТ, все из которых выполняют до проведения биопсии. Проводят биопсию левой почки у пациентов, соответствующих всем критериям В/И, в пределах 45 дней от первой скрининговой оценки. Во время процедуры биопсии собирают два биоптата ткани и посылают в Twin City Bio для производства REACT. Если пациент испытывает значительные НЯ/СНЯ после биопсии (например, обильное кровотечение, образование АВ-фистулы), исключающие возможность безопасной инъекции, пациент прекращает участие в исследовании.

Через одну-две недели после получения образца в соответствующем требованиям GMP здании Twin City Bio в Северной Каролине, США, Twin City Bio сообщает в центр, была ли полученная ткань достаточного размера и качества для производства REACT. Если результаты положительные, центр подтверждает запланированную дату инъекции. Если биопсийный образец не может быть использован для изготовления REACT (по любой причине), пациент прекращает участие в исследовании.

За десять-четырнадцать дней до запланированной инъекции пациент приходит в клинику для квалификационного посещения перед инъекцией, включающего окончательную проверку соответствия критериям В/И и проведение сцинтиграфического исследования почек. Центр дает указание Twin City Bio производить препарат REACT из замороженных почечных клеток, если пациент подходит для инъекции. В день инъекции (день 0) пациент приходит в больницу и получает инъекцию REACT в почку, которая была подвергнута биопсии.

4.2. Количество субъектов

До 15 субъектов, прошедших скрининговые процедуры и соответствующих всем критериям включения и исключения, включают в исследование.

4.3. Соблюдение режима лечения

Подходящие субъекты получают их аутологичные препараты REACT в серии из двух инъекций. Исследуемый препарат вводят в подвергнутую биопсии почку, используя чрескожный способ. Подготовка препарата REACT и процедуры дозирования описаны в данном протоколе, а также в справочном руководстве по проведению исследования.

Для всех субъектов запланировано получение двух инъекций REACT. Если возникнет угроза безопасности или если состояние здоровья субъекта может быть поставлено под угрозу, тогда вторую инъекцию REACT не выполняют.

4.4. Продолжительность исследования

Субъекты начинают свою серию инъекций REACT, как только аутологичный препарат REACT становится доступным. С интервалом в один месяц до первой инъекции REACT, и с 3-месячным интервалом до второй инъекции, плюс 24-месячный период последующего наблюдения после последней инъекции, продолжительность исследования составляет 28 месяцев для серии из 2 инъекций REACT.

5. Популяция исследования

5.1. Критерии включения в исследование субъектов

Если нет иных указаний, субъекты должны соответствовать каждому критерию включения для участия в исследовании. Соответствие критериям включения оценивают во время скринингового посещения, перед биопсией почки и перед каждой инъекцией REACT, если не указано иначе.

1. Пациент является мужчиной или женщиной в возрасте 18-65 лет на дату подписания информированного согласия.

2. Пациент имеет документально подтвержденную историю аномалий почек и/или мочевыводящих путей помимо документально подтвержденной истории CAKUT.

3. Пациент имеет установленный диагноз III/IV стадии ХЗП, не нуждается в почечном диализе, имеет рСКФ от 14 до 50 мл/мин/1,73 м² включительно во время скринингового посещения до инъекции REACT.

4. Субъект имеет кровяное давление менее 140/90 во время скринингового посещения, до биопсии почки и до инъекции(й) REACT. Примечание: КД не должно быть значительно ниже 115/70.

5. Минимум три измерения рСКФ или сКр должны быть проведены с интервалом по меньшей мере 3 месяца до скринингового посещения и в течение предыдущих 24 месяцев для определения скорости прогрессирования ХЗП.

6. Пациент желает и может воздерживаться от употребления НПВС (включая аспирин), а также клопидогрела, прасугрела или других ингибиторов агрегации тромбоцитов в течение периода, начиная с 7 дней до, и до 7 дней после, биопсии почки и инъекции(й) REACT.

7. Пациент желает и может воздерживаться от употребления рыбьего жира и ингибиторов агрегации тромбоцитов, таких как дипиридамол (то есть, персантин^®), в течение периода, начиная с 7 дней до, и до 7 дней после, биопсии почки и инъекции(й) REACT.

8. Пациент желает и может следовать всем аспектам протокола.

9. Пациент желает и может предоставить подписанное информированное согласие.

5.2. Критерии исключения из исследования субъектов

Субъекты, соответствующие любому из перечисленных ниже критериев исключения, не имеют права участвовать в исследовании. Критерии исключения оценивают во время скринингового посещения, перед биопсией почки и перед каждой инъекции REACT, если нет иных указаний.

1. Пациент имеет в анамнезе трансплантацию почек.

2. Пациент имеет диагноз гидронефроз 4 или 5 степени SFU.

3. Пациент имеет нескорректированный ПМР 5 степени.

4. Пациент имеет толщину коркового слоя почки менее 5 мм по результатам МРТ.

5. Пациент имеет известную аллергию или противопоказание(я), или перенес тяжелую системную реакцию(и) на канамицин или структурно аналогичный аминогликозидный антибиотик(и).

6. Пациент имеет в анамнезе анафилактическую или тяжелую системную реакцию(и), или противопоказание(я), на препараты человеческой крови или материалы животного происхождения (например, от коровы, свиньи).

7. Пациент имеет в анамнезе тяжелую системную реакцию(и), или какое-либо противопоказание, на местные анестетики или седативные препараты.

8. Пациент имеет клинически значимую инфекцию, требующую применения парентеральных антибиотиков, в пределах 6 недель от инъекции REACT.

9. Пациент имеет острое повреждение почек или испытывает быстрое снижение почечной функция в течение последних 3 месяцев до инъекции REACT.

10. Пациент имеет любое из следующих состояний до инъекции REACT: почечные опухоли, поликистоз почек, анатомические аномалии, которые могут препятствовать процедуре инъекции REACT, или признаки инфекции мочевыводящих путей.

Примечание: анатомические аномалии не являются основанием для исключения, если почка остается доступной и соответствуют критериям для получения инъекции REACT.

11. Пациент имеет сердечную недостаточность класса III или IV (Функциональная классификация NYHA).

12. Пациент имеет ОФВ1/ФВЕ ≥70%.

13. Пациент имеет в анамнезе рак в течение последних 3 лет (за исключением немеланомного рака кожи и карциномы in situ шейки матки).

14. Пациент имеет клинически значимое заболевание печени (АЛТ или АСТ более чем в 3 раза выше верхней границы нормы) при оценке во время скринингового посещения.

15. Пациент имеет положительный результат на активную инфекцию вирусом гепатита В (HBV) или вирусом гепатита C (HCV), и/или вирусом иммунодефицита человека (HIV) при оценке во время скринингового посещения.

16. Пациент имеет в анамнезе активную форму туберкулеза (ТБ), требующую лечения в течение последних 3 лет.

17. Пациент имеет иммунную недостаточность или получает иммуносупрессоры, включая индивидуумов, получающих лечение в связи с хроническим гломерулонефритом, в пределах 3 месяцев от инъекции REACT.

Примечание: ингаляционные кортикостероиды и постоянно принимаемые кортикостероиды в низких дозах (менее чем, или ровно, 7,5 мг в сутки) допустимы в качестве краткого импульсного применения кортикостероидов при перемежающихся симптомах (например, астме).

18. Пациент имеет предположительную продолжительность жизни менее 2 лет.

19. Женщина-пациент беременна, кормит грудью или планирует беременность во время исследования. Или женщина-пациент имеет детородный потенциал и не использует высокоэффективный способ(ы) контроля рождаемости, включая сексуальное воздержание. Или женщина-пациент не желает продолжать использование высокоэффективного способа контроля рождаемости в течение всего периода исследования.

20. Пациент имеет в анамнезе активное злоупотребление алкоголем и/или наркотиками, которое, по мнению исследователя, нарушит способность пациента соблюдать протокол.

21. Состояние здоровья пациента, по мнению исследователя, будет поставлено под угрозу в результате участия в исследовании.

22. Пациент использовал исследуемый продукт в течение 3 месяцев до инъекции REACT.

5.3. Запрещенные и сопутствующие препараты

- Употребление НПВС (включая аспирин), а также клопидогрела, прасугрела или других ингибиторов агрегации тромбоцитов запрещено в процессе исследования, начиная с 7 дней до, и до 7 дней после, биопсии почки и инъекции(й) REACT.

- Аспирин в дозе до 100 г/сутки допускается для первичной профилактики сердечных заболеваний у субъектов с диабетом в возрасте старше 40 лет, или имеющих дополнительные факторы риска развития сердечно-сосудистого заболевания или инсульта, и для которых предполагаемые преимущества терапии аспирином перевешивают риски, связанные с лечением.

- Употребление рыбьего жира и ингибиторов агрегации тромбоцитов, таких как дипиридамол (то есть, персантин), запрещено в процессе исследования, начиная с 7 дней до, и до 7 дней после, биопсии почки и инъекции(й) REACT.

- Субъекты, получающие лечение ИАПФ или БРА, должны начать терапию по меньшей мере за 8 недель до биопсии почки. Лечение должно быть стабильным в течение 6-недельного периода непосредственно перед инъекцией REACT. Стабильное лечение определяют как лечение с корректировкой дозы не менее чем на половину от текущей дозы и не более чем в 2 раза от текущей дозы. Кроме того, за исключением случаев, когда это необходимо по медицинским показаниям, не должны быть внесены изменения в режим дозирования ИАПФ или БРА с момента скрининга и до ЗИ посещения через 12 месяцев. Допускаются перерывы в приеме дозы до 7 дней по медицинской необходимости.

- В течение исследования следует избегать лекарственных препаратов, мешающих измерению сКр, таких как триметоприм, дронедарон и циметидин. Если такие препараты необходимы по медицинским показаниям, то это обстоятельство должно быть обсуждено с медицинским наблюдателем и задокументировано в ИРК.

- Использование экспериментальных лекарственных средств запрещено во время проведения исследования. Экспериментальные лекарственные средства определяют как лекарственные средства, которые не были одобрены для применения FDA.

5.4. Прекращение участия субъектов в исследовании

Если субъект прекращает участие в исследовании до проведения биопсии почки, субъекта считают не прошедшим скрининг. Если субъект прекращает участие в исследовании после биопсии почки, но до первой инъекции REACT, субъект не считается не прошедшим скрининг, но и не считается включенным в исследование и может быть заменен. Если субъект прекращает участие в исследовании после инъекции REACT, но до завершения периода последующего наблюдения, субъект не может быть заменен.

Необходимо приложить все усилия для того, чтобы субъекты, которым был введен NKA, выполняли все последующие посещения и процедуры, включая ЗИ посещение.

6. Посещения в процессе исследования

Расписания клинических оценок и процедур, которые будут проведены в ходе исследования, приведены в таблицах периодов времени и событий, то есть, Таблице 1. Аналогично, расписания сбора образцов и клинических лабораторных анализов, запланированных для исследования, приведены в таблицах периодов времени и событий, то есть, Таблице 2. Перед проведением любых оценок или процедур (включая скрининг), специфических для данного исследования, субъект предоставляет подписанное информированное согласие в соответствии с требованиями ICH GCP и 21 CFR часть 50.

6.1. Скрининг

Все скрининговые оценки проводят в сроки, позволяющие назначать биопсию почек в пределах 60 дней после скринингового посещения. Например, если субъект подписывает форму информированного согласия, а затем через два дня идет в лабораторию для забора крови, то дата забора крови считается датой первого скринингового обследования (то есть, не дата подписания информированного согласия).

Ультразвуковое исследование почек проводят во время скринингового посещения для подтверждения соответствия субъекта требованиям (то есть, отсутствия признаков опухолей почек, поликистоза почек, почечных кист или других анатомических аномалий, которые могли бы помешать процедуре инъекции REACT), наряду с получением исходных данных по эхогенности. Кроме того, проводят МРТ-исследование без контраста со времени скринингового посещения до дня -1 перед биопсией почек для определения размера и объема почек.

Чтобы получить право на участие в исследовании субъект должен иметь рСКФ от 15 до 50 мл/мин/1,73 м² включительно во время скринингового посещения. Для определения рСКФ в качестве критерия включения в центре используют рСКФ, определенную в процессе скрининга, и производят расчеты с использованием уравнения CKD-EPI [41].

6.2. Биопсия

Биопсию назначают в пределах 60 дней после скринингового посещения. Биопсию проводят в сроки, позволяющие назначать первую инъекцию REACT примерно через месяц. Биоптаты почки собирают, как правило, в среду или четверг.

Субъекты приходят в больницу или центр клинических исследований за один-три дня до биопсии для оценки состояния перед биопсией. По мере возможности собирают лабораторные образцы до биопсии и оценивают для подтверждения дальнейшего права субъектов на участие в исследовании. После приема и окончательной проверки критериев включения и исключения проводят биопсию, как описано в разделе 7.5.1.

Минимум 2 биоптата, каждый длиной 1,5 см, собранные с помощью биопсийной иглы 16 калибра в стерильных условиях от каждого включенного в исследование субъекта, посылают в Twin City Bio LLC в охлаждаемом контейнере для перевозки. Twin City Bio LLC связывается с центром для подтверждения достаточности биопсийного материала для производства REACT. Если биопсийный образец не может быть использован для изготовления REACT, субъект прекращает участие в исследовании.

Субъектов, у которых нет осложнений после биопсии, выписывают в тот же день в соответствии со стандартной практикой центра. В противном случае субъект остается в больнице на ночь для наблюдения. Субъекта выписывают на следующий день после биопсии при условии, что все связанные с биопсией НЯ разрешились, стабилизировались или вернулись к исходному уровню.

6.3. Инъекция REACT

Субъекты получают две запланированные инъекции REACT для определения дозы и оценки продолжительности эффектов. Как указано в таблицах периодов времени и событий (то есть, Таблице 1), серию из 2 инъекций REACT выполняют с интервалом 3 месяца, с периодом посещений в исследовании, составляющим 12 недель. В любом случае принимают все необходимые меры, чтобы вторая инъекция REACT была выполнена через 3 месяца после первой инъекции.

Если возникает угроза безопасности или быстрое ухудшение почечной функции, или развитие неконтролируемого диабета или неконтролируемой гипертензии, или развитие злокачественной опухоли или интеркуррентной инфекции, тогда вторую инъекцию REACT не выполняют.

Соответствующие требованиям субъекты прибывают в больницу или клинический исследовательский центр утром в день введения REACT. Субъекту вводят инъекцией аутологичный препарат REACT, используя чрескожный способ, как описано в разделе 7.5.2.

6.4. Выписка после инъекции REACT

В день после инъекции REACT и перед выпиской проводят ультразвуковое исследование для обнаружения возможных субклинических нежелательных явлений (например, отека, скопления жидкости). Если после инъекции REACT возникли НЯ, связанные с продуктом или процедурой, субъекта не выписывают до тех пор, пока НЯ не разрешатся, не стабилизируются или не вернутся к исходному уровню. Если это соответствует стандартной практике центра, субъекта выписывают в день выполнения инъекции REACT после не менее 2 часов наблюдения и мониторинга.

6.5. Посещения в период последующего наблюдения

Субъект посещает клинику для последующего наблюдения в дни 7, 14 и 28 (± 3 дня) и месяц 2 (± 7 дней) после первой и второй инъекций REACT. Если серию из 2 инъекций REACT проводят с интервалом 3 месяца, субъект не выполняет посещения в период последующего наблюдения, назначенные через 3 и 6 месяцев. Эти посещения показаны как «необязательные» в таблицах периодов времени и событий (Таблице 1) и в таблицах периодов времени и событий для лабораторных анализов (Таблице 2). Вместо этого, субъект посещает клинический центр за 10-14 дней до запланированной последней инъекции REACT для прохождения предварительного обследования.

После последней инъекции REACT субъекты проходят полное обследование в долгосрочном периоде последующего наблюдения в отношении безопасности и эффективности в месяцы 6, 9, 12, 15, 18, 21 и 24 (± 7 дней) после введения препарата.

6.6. Посещение при завершении исследования

В данном разделе описаны ситуации, при которых субъект выполняет ЗИ посещение; например, по причине преждевременного прекращения исследования или завершения всех предусмотренных протоколом последующих посещений.

- Если субъект прекращает участие в исследовании после биопсии почки, но до инъекции REACT, то такой субъект проходит все оценки ЗИ, за исключением МРТ и/или сцинтиграфии почек. Если субъект испытывает связанные с исследуемым препаратом или процедурой исследования СНЯ, то субъект не прекращает участие в исследовании до тех пор, пока СНЯ не разрешится, не стабилизируется или не вернется к исходному уровню.

- Если субъект прекращает участие в исследовании после получения одной или двух инъекций REACT, но до выполнения всех предусмотренных протоколом последующих визитов, тогда он/она выполняет ЗИ посещение в момент прекращения участия в исследовании. Если субъект испытывает связанные с исследуемым препаратом или процедурой исследования СНЯ, то субъект не прекращает участие в исследовании до тех пор, пока СНЯ не разрешится, не стабилизируется или не вернется к исходному уровню.

- Если субъект выполняет все предусмотренные протоколом последующие визиты, он/она проходит все оценки ЗИ через 24 месяца после последней инъекции REACT во время ЗИ посещения. Если субъект испытывает связанные с исследуемым препаратом или процедурой исследования СНЯ, то субъект не прекращает участие в исследовании до тех пор, пока СНЯ не разрешится, не стабилизируется или не вернется к исходному уровню.

6.7. Завершение исследования

Завершение исследования определяют как момент времени, когда последний субъект завершает ЗИ посещение, или когда последний субъект считается потерянным для последующего наблюдения, отзывает согласие или умирает.

7. Оценки и процедуры исследования

7.1. Демография и история болезни

Демографические характеристики получают для каждого субъекта во время скринингового посещения.

Вся историю болезни, связанную с ХЗП, и всю другую значимую историю болезни записывают в ИРК, начиная со времени скринингового посещения. На протяжении всего исследования записи о продолжающихся медицинских состояниях регулярно обновляются в ИРК.

7.2. Клинические оценки

7.2.1. Жизненно важные показатели

Жизненно важные показатели, которые необходимо измерять, включают систолическое/диастолическое кровяное давление, частоту сердечных сокращений, частоту дыхания и температуру. Кровяное давление измеряют после того, как субъект отдохнул в сидячем положении в течение минимум 5 минут. Во время посещения перед проведением биопсии (с дня -3 до дня -1) и посещения перед инъекцией (посещение с дня -14 до дня -10) проводят три измерения КД, среднее значение из трех измерений (для систолического и диастолического давления) используют для проверки на соответствие критериям включения и вносят в ИРК.

7.2.2. Физическое обследование

В ходе полного обследования оценивают все соответствующие системы организма, в то время как во время промежуточного обследования проводят конкретную оценку тех систем организма, которые считаются важными для данного субъекта. В качестве общего правила для промежуточного обследования, нежелательные явления у субъекта рассматривают до, или в связи с обследованием и включают оценку соответствующих систем организма, если это необходимо. Только клинически значимые аномалии записывают в ИРК.

Массу тела субъекта измеряют при каждом посещении, которое включает полное или промежуточное физическое обследование. Индекс массы тела (ИМТ) рассчитывают в размерности кг/м².

7.2.3. ЭКГ

ЭКГ в 12 отведениях регистрируют после того, как субъект в течение 5 минут лежит на спине, манжета для измерения кровяного давления надета, но не надута, и находится на уровне сердца. Результаты ЭКГ анализируют и вносят в ИРК.

7.2.4. Сопутствующие препараты

Применение сопутствующих препаратов регистрируют в ИРК следующим образом:

- От скринингового посещения до первой инъекции REACT: записывают любые характерные для ХЗП лекарственные препараты, а также лекарственные препараты, которые могут повлиять на почечную гемодинамику и/или измерения сывороточного креатинина. Кроме того, записывают любые препараты, используемые для лечения НЯ, которое задокументировано в ИРК. Хирургические препараты, используемые в процедуре биопсии, не должны быть отмечены в ИРК, если их использование не выходит за пределы ожидаемой дозы и/или частоты введения.

- От первой инъекции REACT до 3-6 месяцев последующего наблюдения: записывают любые лекарственные препараты, принимаемые до срока 3-6 месяцев после введения, в зависимости от того, когда выполняют вторую инъекцию REACT. Хирургические препараты, используемые в процедуре инъекции REACT, не должны быть отмечены в ИРК, если их использование не выходит за пределы ожидаемой дозы и/или частоты введения.

- От второй (последней) инъекции REACT до 6 месяцев последующего наблюдения: записывают любые лекарственные препараты, принимаемые до срока 6 месяцев после последнего введения REACT. Хирургические препараты, используемые в процедуре инъекции REACT, не должны быть отмечены в ИРК, если их использование не выходит за пределы ожидаемой дозы и/или частоты введения.

- От 6 месяцев последующего наблюдения до ЗИ посещения: записывают характерные для ХЗП лекарственные препараты, которые могут повлиять на почечную гемодинамику, и препараты, которые могут повлиять на измерения сывороточного креатинина. Записывают препараты, используемые для лечения НЯ, которое задокументировано в ИРК.

7.3. Лабораторные анализы

Запланированные клинические лабораторные анализы перечислены в Таблице 12. Анализы будут проведены в центральной лаборатории, за исключением особо отмеченных случаев. Расписание сбора биологических образцов на протяжении исследования приведено в Таблице 2.

Таблица 12: Клинические лабораторные анализы

Клиническая химия Гематология Анализ мочи Щелочная фосфатаза
АЛТ
АСТ
β2-микроглобулин
Билирубин
Креатинин-киназа
ФСГ (только женщины)
ГГТП
HbA_1c
ЛДГ
ПТГ (интактный) Гематокрит
Гемоглобин
Количество ККК и индексы
Количество БКК и дифференциал Альбумин
β2-микроглобулин
Креатинин
Белок
Белок и отношение альбумин: креатинин
НЖАЛ Беременность ХГЧ (сыворотка) - подтверждающий Серология Стандартная панель HBV
HCV
HIV pH
Кетоны
Белок
Кровь
Глюкоза
Беременность
Микроскопический анализ Почечные аналиты Состояние коагуляции Альбумин
АМК
Кальций
CO₂, общий
Креатинин
Цистатин-C
C-РБ
рСКФ (расчетная)
Глюкоза
Фосфор
Калий
Натрий APTT
ПВ-МНО
Количество тромбоцитов Липидная панель Скрининг на наркотики Холестерин
ЛПНП
ЛПВП
Отношение ЛПНП: ЛПВП
Триглицериды Амфетамин
Барбитураты
Бензодиазепины
Кокаин
Опиаты
Тетрагидроканнабинол
Фенциклидин

7.3.1. рСКФ

СКФ определяют с использованием уравнения, разработанного Коллаборацией в области эпидемиологии хронической болезни почек (CKD-EPI), которое включает как сывороточный креатинин, так и цистатин-C [41]. Для сравнения с историческими значениями у каждого субъекта может потребоваться проведение повторного анализа в лаборатории, использованной для получения исторических данных.

7.3.2. Обычный анализ мочи

Мочу собирают и анализируют с использованием стандартной панели. Расписание сбора образцов мочи каждого типа приведено в Таблице 2.

Мочу собирают в течение двух различных периодов времени: 24-часовой сбор и сбор «разовой порции» мочи. Собранные разовые порции мочи используют для анализов с тест-полосками. Расписание сбора образцов мочи каждого типа приведено в Таблице 2. Для получения полной картины экскреции белка и альбумина во всех образцах оценивают как общий белок, так и альбумин.

7.3.3. Гематология

Кровотечение после инъекции REACT является известным и прогнозируемым риском для субъектов, участвующих в данном исследовании. Вследствие этого, гемоглобин и гематокрит измеряют в местной лаборатории центра a) до, b) через 4 часа после каждой инъекции REACT и сравнивают с исходными уровнями. Также измеряют и другие показатели кровотечения (например, АЧТВ, ПВ-МНО, тромбоциты.

7.3.4. Серологический анализ на вирусы

Биоптаты, полученные от каждого субъекта, используют для размножения клеток и отбора СПК. Загрязнение HIV, HBV и/или HCV будет препятствовать производству препарата REACT для данного субъекта. Таким образом, каждый субъект проходит тестирование на вирусные передаваемые с кровью патогены, включая HIV, HBV и HCV.

7.3.5. Скрининг на наркотики

В соответствии с критерием исключения № 24 (смотри раздел 5.2) субъекты не имеют права участвовать в исследовании, если они имеют «…в анамнезе активное злоупотребление … наркотиками, которое, по мнению исследователя, нарушит способность пациента соблюдать протокол». Следовательно, субъекты проходят тестирование на наркотики.

7.3.6. Скрининг на беременность

Качественный анализ мочи на беременность проводят в клиническом центре с использованием тест-полосок. Если тест положительный, то в клинической лаборатории проводят подтверждающий тест. Если в местных центрах не принимают результаты тест-полосок, то образец мочи отправляют в центральную лабораторию для анализа. Женщины после менопаузы с подтверждающим результатом теста на ФСГ не должны проходить тест на беременность в течение всего исследования.

7.4. Визуализация почек

7.4.1. Ультразвуковое исследование

Ультразвуковое исследование почек проводят во время скринингового посещения для подтверждения соответствия субъекта требованиям (то есть, отсутствия признаков опухолей почек, поликистоза почек, почечных кист или других анатомических аномалий, которые могли бы помешать процедуре инъекции REACT), наряду с получением исходных данных по эхогенности. Ультразвуковое исследование также проводят после биопсии почки пациента в день 0 и день 1, а также после инъекции(й) REACT пациенту в день 0 и день 1 с целью мониторинга возможных субклинических НЯ. Результаты ультразвукового исследования (например, индекс сопротивления, длину и так далее) записывают в ИРК.

7.4.2. Компьютерная томография

Компьютерную томографию (КТ) можно использовать в сочетании с ультразвуковым исследованием во время процедуры инъекции REACT в соответствии с обычными стандартами лечения в центре проведения исследования.

7.4.3. Магнитно-резонансная томография

МРТ-исследование без контраста проводят со времени скринингового посещения до дня -1 перед биопсией почек для определения размера и объема почек. Во время начального посещения центра процедуру МРТ определяют для каждого центра в зависимости от доступного оборудования для МРТ. Как правило, следует использовать прибор 1,5-Т. МРТ-исследования помогают определять объем почки (для расчета доз). МРТ выполняют с использованием стандартной последовательности без введения контрастных веществ. Измерение объема почки можно выполнять, например, с использованием трехмерной последовательности быстрого градиент-эха, VIBE, со временем регистрации 22 секунды и пространственным разрешением 2×1,4×1,2 мм. Параметры изображения записывают в документах источника и ИРК. Всего для пациентов проводят четыре МРТ.

7.4.4. Сцинтиграфия почек

Сцинтиграфию почек используют для оценки функции левой и правой почек с использованием радиоактивного индикатора ^99mTc-димеркаптосукциновой кислоты (DMSA) или ^99mTc-MAG3 (меркаптоацетил-триглицин). Этот способ считается наиболее надежным для измерения функции коркового слоя почек. Если стандартная практика центра считается достаточно эквивалентной процедуре с использованием ^99mTc-DMSA или ^99mTc-MAG3, тогда в центре выполняют эту процедуру. Для всех пациентов в данном исследовании проводят четыре сцинтиграфии почек. Сцинтиграфию почек проводят перед первой инъекцией REACT, перед последней инъекцией REACT, во время посещения через 6 месяцев после последней инъекции REACT, и во время ЗИ посещения для всех пациентов.

7.5. Хирургические процедуры

7.5.1. Биопсия

Биопсию почки проводят в стерильных условиях под контролем УЗИ или КТ в соответствии с практикой центра. Необходимы два биоптата для получения достаточного количества материала для отбора СПК и производства REACT. Как правило, используют иглу 16 калибра для получения достаточного количества материала коркового слоя. При необходимости можно использовать иглу 15 калибра. При наличии возможности может быть проведено прикроватное исследование биоптатов, чтобы убедиться, что получено достаточное количество материала коркового слоя.

Поскольку полученную при биопсии ткань используют для производства REACT, центр обеспечивает получение биоптатов ткани в стерильных условиях для минимизации риска загрязнения при последующем размножении и отборе клеток.

Субъект будет находиться в лежачем положении в течение 4 часов, с мониторингом гемоглобина, кровяного давления, макрогематурии, боли в животе/боку и подкожных кровоизлияний в боку. Если все связанные с биопсией НЯ разрешились, стабилизировались или вернулись к исходному уровню, субъекта выписывают из больницы на следующий день после биопсии в соответствии со стандартной практикой центра. Важно, чтобы любые обезболивающие препараты, назначаемые после биопсии почек, подбирались тщательно, без использования лекарственных препаратов с нефротоксическим потенциалом.

Если после биопсии у субъекта возникают серьезные нежелательные явления, которые подвергают субъекта повышенному риску возникновения серьезных нежелательных явлений после инъекции REACT, то он/она не получает REACT, но за ним/ней наблюдают до разрешения явления(явлений), а затем выводят из исследования.

7.5.2. Инъекция REACT

Перед выполнением инъекции REACT оперирующий врач оценивает субъекта следующим образом:

- Проводит физическое обследование для определения возможности проведения процедуры.

- Оценивает параметры кровотечения, включая панель коагуляции, ПВ-МНО, тромбоциты, гемоглобин, гематокрит и другие соответствующие лабораторные результаты.

o Примечание: кровотечение после инъекции REACT является известным и прогнозируемым риском для субъектов, участвующих в данном исследовании. Вследствие этого, гемоглобин и гематокрит измеряют a) до, b) через 4 часа после и c) через 24 часа после каждой инъекции REACT и сравнивают с исходными уровнями.

- Проводит обзор результатов визуализации, включая УЗИ, МРТ и/или КТ для определения пути доступа, глубины залегания почки и внешнего вида кортикомедуллярного соединения.

- Картирует потенциальные участки размещения клеток REACT.

- Определяет классификацию и связанный периоперационный/послеоперационный риск согласно руководству Американского общества анестезиологов (ASA) в отношении оценки дыхательных путей, истории болезни, аллергии и принимаемых препаратов.

- Проводит опрос субъекта и его семьи/помощников для обсуждения процедуры, ее рисков и возможных осложнений, отвечает на вопросы и получает письменное информированное согласие.

Профилактические антибиотики вводят внутривенно в соответствии со стандартной практикой центра. При необходимости может быть назначено первичное КТ-сканирование для оценки прилегающих внутренних органов, расположения почек и наличия почечных кист. В сочетании с УЗИ КТ-сканирование также может помогать определять местонахождение кортикомедуллярного соединения.

Препарат REACT предназначен для введения в корковый слой почки через иглу/канюлю и шприц, подходящий для доставки клеток. Целью является введение REACT путем проникновения через почечную капсулу и отложения REACT в нескольких участках коркового слоя почки. Сначала почечную капсулу прокалывают с использованием троакара/обеспечивающей доступ канюли 15-20 калибра, введенного примерно на 1 см в корковый слой почки.

В клиническом исследовании фазы 1 REACT вводят через иглу 18 калибра. В предложенном исследовании фазы 2 для доставки REACT используют иглу 18 или меньшего калибра. Иглу, через которую вводят REACT, пропускают через обеспечивающую доступ канюлю и продвигают в почку. Инъекцию REACT будут производить со скоростью 1-2 мл/мин. После каждых 1-2 минут инъекции внутреннюю иглу вытягивают по ходу иглы внутри коркового слоя до второго участка инъекции, и так далее, пока кончик иглы не достигнет конца обеспечивающей доступ канюли или пока не будет введен весь препарат REACT. При чрескожном способе доставки размещение обеспечивающей доступ канюли/троакара и доставляющей иглы проводят с использованием прямой визуализации в реальном времени. Варианты включают только ультразвуковое исследование или ультразвуковое исследование с дополнительной КТ.

Во время процедуры применяют умеренную седацию; непрерывно измеряют жизненно важные показатели. Инъекцию REACT прекращают при наличии визуальных признаков выхождения клеток в центральные или периферические кровеносные сосуды почки, медуллярный слой почки или через корковый слой почки в забрюшинные мягкие ткани, или при наличии признаков активного кровотечения.

После завершения инъекции REACT внутреннюю иглу извлекают, а внешнюю канюлю оставляют на месте для проведения трековой эмболизации. Во время удаления внешней канюли (троакара) участок прокола коркового слоя почки и путь иглы через забрюшинное пространство эмболизируют рассасывающимися желатинными частицами/тампонами (например, Gelfoam^®[Pfizer]) или фибриновым герметизирующим материалом (например, TISSEEL [Baxter]), или другим подходящим средством для предотвращения чрезмерного почечного кровотечения.

После завершения процедуры проводят неконтрастное КТ-сканирование или ультразвуковое исследование с цветной допплерографией для получения изображения участка прокола для инъекции клеток, любых гематом или кровотечений. Субъекта наблюдают в течение 2-3 часов после процедуры в условиях палаты восстановительного лечения, с оценкой состояния медсестрой и измерением жизненно важных показателей. Субъектов, у которых не возникло осложнений, выписывают в тот же день после инъекции REACT в соответствии со стандартной практикой центра.

8. Оценка безопасности и управление исследованием

8.1. Нежелательные и серьезные нежелательные явления

8.1.1. Определение нежелательных явлений

НЯ представляет собой развитие нежелательного медицинского состояния (включая аномальные лабораторные показатели) или ухудшение ранее существующего медицинского состояния после или в процессе воздействия исследуемого метода лечения, независимо от того, считают ли его находящимся в причинно-следственной связи с процедурами исследования или исследуемым препаратом. Ранее существующее состояние представляет собой клиническое состояние (включая состояние, которое подвергают лечению), диагностированное до подписания субъектом формы информированного согласия и задокументированное как часть истории болезни субъекта. Ранее существующие состояния, которые являются стабильными или неизменными, не должны рассматриваться как нежелательные явления.

Исследователь отвечает за то, чтобы все НЯ, наблюдаемые исследователем или заявленные субъектом, которые происходят со дня процедуры биопсии до 12 месяцев после последней инъекции REACT, отслеживались и регистрировались в медицинской карте субъекта, а также в ИРК, предоставленной спонсором или его уполномоченным лицом. НЯ, возникшие с момента получения согласия и до дня проведения процедуры биопсии, должны быть записаны в истории болезни всех субъектов.

Нежелательные явления, связанные с лечением (НЯЛ), определяют как любые НЯ, которые возникают после первой инъекции REACT, или начались до первой инъекции, но их степень тяжести или частота увеличилась после первой инъекции REACT.

Внеплановые посещения могут быть проведены в любое время в ходе исследования, если это будет сочтено необходимым для оценки и проведения последующего наблюдения за НЯ.

8.1.1.1. Определение серьезных нежелательных явлений

Серьезное нежелательное явление (СНЯ) представляет собой нежелательное явление, возникшее на любом этапе исследования (то есть в начале исследования, в процессе лечения, вымывания или последующего наблюдения) при получении любой дозы исследуемого препарата, компаратора или плацебо, и соответствующее одному или более из следующих условий:

- приводит к смерти

- представляет непосредственную угрозу для жизни

- требуется госпитализация или продление существующей госпитализации

- приводит к стойкой или значительной инвалидности или нетрудоспособности

- приводит к врожденной аномалии или дефекту при рождении

- является важным медицинским явлением, которое может поставить под угрозу субъекта или может потребовать медицинского вмешательства для предотвращения одного из вышеперечисленных исходов.

Все СНЯ, возникшие со дня проведения процедуры биопсии, во время лечения или в течение 12 месяцев после последней инъекции REACT, независимо от того, связаны ли они с процедурами исследования или исследуемым препаратом, должны быть зарегистрированы в медицинской карте субъекта, а также в ИРК.

8.1.1.2. Другие значительные нежелательные явления

Важные явления, имеющие особое клиническое значение, включают СНЯ и НЯ, приводящие к преждевременному прекращению участия субъектов в исследовании. Эти явления регистрируют в медицинских картах субъектов, а также в ИРК. Описание этих явлений может быть подготовлено для включения в отчет о клиническом исследовании.

В следующих разделах описаны «нежелательные явления, представляющие особый интерес», а именно, явления, связанные с процедурой и препаратом. Субъектов тщательно наблюдают на предмет возникновения этих потенциальных НЯ.

8.1.1.3. Связанные с процедурой явления

Боль после процедуры: если субъект испытывает боль после биопсии или инъекции REACT, рекомендуется введение парацетамола или сочетаний парацетамол-кодеин. Более сильные боли в пояснице или животе требуют проведения ультразвукового исследования для исключения значительного внутрибрюшинного кровотечения. При возникновении сильных болей может потребоваться введение опиатов. Если для облегчения боли требуются дозы анальгетиков, превышающие максимально разрешенные дозы, то исследователь должен провести дополнительные клинические обследования для установления вероятной причины (причин) чрезмерной боли.

Кровотечение: после процедур биопсии почки и инъекции REACT у субъектов регулярно контролируют гемоглобин и кровяное давление. Субъекты остаются в постели и находятся под наблюдением для поддержания нормальных показателей свертываемости крови. Если возникает кровотечение и субъект находится в состоянии гипотензии, несмотря на постельный режим, может быть рассмотрен вопрос о переливании крови. Если кровотечение все еще не остановлено, может быть рассмотрена возможность хирургического вмешательства. В редких случаях для выявления источника кровотечения может быть проведена почечная ангиография. Эмболизация спиралью может быть выполнена во время той же процедуры.

Другие осложнения: в очень редких случаях во время процедуры биопсии могут быть повреждены другие органы (например, печень, желчный пузырь и легкие). В этих случаях соответствующее лечение и последующее наблюдение можно будет обсудить с консультирующими хирургами.

Смерть: Смерть в результате биопсии почек наступает у <0,01% пациентов [26, 34, 35]. Соблюдение строгих критериев включения/исключения гарантирует, что субъекты, которые могут быть предрасположены к неконтролируемому или чрезмерному кровотечению, не будут включены в данное исследование.

8.1.1.4. Связанные с препаратом явления

Явления, связанные с REACT, отсутствуют.

8.2. Интенсивность нежелательных явлений и оценка связи

8.2.1. Шкала интенсивности

Интенсивность оценивают с использованием руководства «Общие терминологические критерии нежелательных явлений» (CTCAE) версия 4.03, от Национального института рака США (смотри evs.nci.nih.gov/ftp1/CTCAE/CTCAE_4.03_2010-06-14_QuickReference_8.5×11.pdf).

Если НЯ не включено в CTCAE, тогда интенсивность НЯ определяют в соответствии со следующими критериями:

- Легкая (1 степень): НЯ заметен для субъекта, но не мешает обычной активности.

- Умеренная (2 степень): НЯ нарушает повседневную активность, но отвечает на симптоматическую терапию или отдых.

- Тяжелая (3 степени): НЯ значительно ограничивает способность субъекта заниматься обычной деятельностью, несмотря на симптоматическую терапию. Тяжелые явления обычно приводят к потере трудоспособности.

- Опасная для жизни (4 степень): Субъект находится под непосредственной угрозой смерти.

- Смерть (5 степень).

Если интенсивность (степень) меняется в течение дня, записывают максимальную интенсивность (степень). Если интенсивность (степень) меняется в течение более длительного периода времени, изменения регистрируют как отдельные явления (имеющие отдельные даты начала и прекращения для каждой степени).

Важно проводить различие между серьезными и тяжелыми НЯ. Тяжесть представляет собой меру интенсивности, в то время как серьезность определяется критериями в разделе «Определение серьезных нежелательных явлений» (смотри раздел 8.1.1.1). Таким образом, НЯ тяжелой интенсивности может не обязательно соответствовать критериям серьезности.

8.2.2. Оценка связи

Исследователь должен определять, существует ли разумная вероятность того, что НЯ могло быть вызвано процедурой исследования или исследуемым препаратом. Если нет веских причин для предположения о наличии связи, то НЯ классифицируют как «не связанное». При наличии веской причины, даже не определенной, для подозрений о возможности причинно-следственной связи НЯ считают «возможно связанным» или «связанным» с процедурой исследования или исследуемым препаратом.

Определения категорий связи являются следующими:

- Не связано: воздействие исследуемого лечения не имело места, или возникновение НЯ объективно не связано по времени, или считается маловероятным, что НЯ связано с исследуемым лечением.

- Связь маловероятна: исследуемое лечение и НЯ не были тесно связаны во времени, и/или НЯ могло быть более логично объяснено причинами, отличными от воздействия исследуемого лечебного препарата.

- Возможно связано: исследуемое лечение и НЯ в разумной степени были связаны во времени, и НЯ могло быть в равной степени объяснено причинами, отличными от воздействия исследуемого лечебного препарата.

- Связано: исследуемое лечение и НЯ в разумной степени были связаны во времени, и НЯ с большей вероятностью объясняется воздействием исследуемого препарата, чем другими причинами, или исследуемое лечение было наиболее вероятной причиной НЯ.

Для целей анализа безопасности все НЯ, оцениваемые как «возможно связанные» или «связанные», считают нежелательными явлениями, связанными с лечением.

8.3. Регистрация и сообщение о нежелательных явлениях

Нежелательные явления, сообщенные субъектом спонтанно и/или в ответ на открытый вопрос персонала исследования, или выявленные в результате наблюдения, или задокументированные в лабораторных отчетах, отчетах о визуализации, записях консультаций, опросниках и других инструментах сбора данных, регистрируют в медицинской карте субъекта и ИРК.

Нежелательное явление описывают с использованием стандартной медицинской терминологии, когда это возможно. О клинически значимом изменении лабораторных показателей или жизненно важных показателей не следует сообщать как о НЯ, если только аномальное изменение не представляет собой СНЯ и/или не приводит к прекращению лечения или прекращению участия в исследовании.

Для каждого НЯ регистрируют дату начала, дату прекращения, интенсивность каждого регистрируемого явления, суждение о связи с процедурой исследования или исследуемым препаратом, предпринятые действия, тяжесть (если применимо), а также то, привело ли явление к прекращению лечения или прекращению участия в исследовании.

8.3.1. Беременность

Беременность не является ни НЯ, ни СНЯ, если только не возникло осложнение, связанное с беременностью. Все сообщения о врожденных аномалиях/дефектах при рождении являются СНЯ. О самопроизвольных абортах следует сообщать и рассматривать их как СНЯ. Однако намеренные аборты без осложнений не следует рассматривать как НЯ.

Обо всех беременностях, наступивших у женщин-субъектов, участвующих в данном исследовании, необходимо сообщать в те же сроки, что и СНЯ с использованием формы «Беременность» в ИРК. Течение всех беременностей, включая перинатальные и натальные исходы, независимо от того, прекратил ли субъект участие в исследовании, отслеживают до разрешения, включая наблюдение за состоянием здоровья новорожденного до возраста 6 недель.

Последствия введения исследуемого препарата на беременную женщину или развивающийся плод неизвестны. Вследствие этого, женщины-субъекты с детородным потенциалом, планирующие беременность во время исследования, или не использующие высокоэффективный(ые) способ(ы) контрацепции, или не желающие продолжать использование высокоэффективного(ных) способа(ов) контрацепции в течение всего периода исследования, не имеют права участвовать в исследовании (смотри критерий исключения № 23; раздел 5.2).

8.4. Правила прекращения участия в исследовании для отдельных субъектов

Субъект может быть исключен из исследования по следующим причинам:

- Любое клиническое нежелательное явление, лабораторное отклонение, текущее заболевание, другое медицинское состояние или ситуация, в случае которых продолжение участия в исследовании не будет соответствовать наилучшим интересам субъекта.

- Возникновение соответствия любому критерию исключения.

Если субъект прекращает участие в исследовании, ЗИ оценка должна быть проведена во время последнего посещения.

Если произойдет одно из следующих событий, ни один субъект не сможет получать инъекции REACT до завершения проверки:

- СНЯ, которые оценены как тяжелые или угрожающие жизни и связаны с REACT или процедурами исследования

- Смерть участвующего в исследовании субъекта

- Аналогичные СНЯ у более чем одного субъекта, связанные с REACT

- Невозможность введения минимум 50% дозы REACT более чем одному субъекту из-за хирургических или других проблем.

9. Статистические методы и запланированный анализ

9.1. Размер выборки

В исследование включают до 15 субъектов, прошедших скрининговые процедуры и соответствующих всем критериям включения и исключения.

Статистический анализ носит преимущественно описательный характер. Если не указано иначе, непрерывные переменные обобщают путем представления числа не пропущенных обследований (n), среднего значения, стандартного отклонения, медианы, минимума и максимума. Категориальные переменные обобщают путем представления подсчета частоты и процента для каждой категории.

9.2. Критерии оценки

9.2.1. Анализ целей и оцениваемые показатели

9.2.1.1. Основные

Оценка безопасности препарата REACT, введенного в одну почку реципиента.

Основной оцениваемый показатель: связанные с процедурой и/или препаратом нежелательные явления (НЯ) в течение 24 месяцев после инъекции.

9.2.1.2. Вторичные

Оценка безопасности и переносимости введения REACT путем оценки специфических для почек нежелательных явлений в течение 24-месячного периода после инъекции.

Вторичный оцениваемый показатель: оценка специфических для почек лабораторных параметров в течение 24 месяцев после инъекции.

9.2.1.3. Исследовательские

Оценка влияния REACT на почечную функцию в течение 24-месячного периода после инъекции.

Исследовательские оцениваемые показатели: клинические диагностические и лабораторные оценки почечной структуры и функции (включая рСКФ, сывороточный креатинин и протеинурию) для оценки изменений в скорости прогрессирования заболевания почек.

9.3. Демографические и исходные характеристики

Демографические данные и исходные характеристики обобщают с использованием размера выборки, среднего значения, стандартного отклонения, медианы, минимума и максимума для непрерывных переменных, а также частоты и доли для категориальных переменных. Эти сводки составляют как для полного набора анализов, так и для набора анализов инъекций. Демографические и исходные характеристики представляют в виде описательной статистики; использование инференциальной статистики не планируется. Эти данные представляют в форме таблиц.

9.4. Анализ эффективности

Основным оцениваемым показателем являются серийные измерения рСКФ, выполняемые через 1, 3, 6 и 12 месяцев после последней инъекции REACT. СКФ определяют с использованием уравнения, разработанного Коллаборацией в области эпидемиологии хронической болезни почек (CKD-EPI), которое включает как сывороточный креатинин, так и цистатин-C [1].

Значения расчетной СКФ, определенные в каждый момент времени, обобщают путем представления описательной статистики исходных данных и изменений в сравнении с исходными значениями для каждой группы лечения.

9.5. Исследовательский анализ

Исследовательский анализ проводят для выявления потенциальных изменений качества жизни, связанного со здоровьем (HR-QoL).

9.6. Статистические методы

Субъекты заполняют опросник KDQOL-SF™ (то есть, краткую форму опросника для оценки качества жизни при почечных заболеваниях). KDQOL-SF представляет собой состоящий из 36 пунктов, утвержденный инструмент HR-QoL, используемый для пациентов с заболеванием почек [42]. Этот специфический для заболевания инструмент HR-QoL состоит из следующих подшкал:

- Подшкала «SF-12 мера физической (PCS) и умственной (MCS) функциональности» содержит пункты, относящиеся к общему состоянию здоровья, ограничениям активности, способности выполнять нужные задачи, депрессии и тревожности, уровню энергии и социальной активности.

- Подшкала «Бремя заболевания почек» содержит пункты, относящиеся к тому, как заболевание почек мешает повседневной жизни, отнимает время, вызывает разочарование или заставляет респондента чувствовать себя обузой.

- Подшкала «Симптомы и проблемы» содержит пункты, относящиеся к тому, насколько респондента беспокоят боль в мышцах, боль в груди, спазмы, зуд или сухость кожи, одышка, обморок/головокружение, отсутствие аппетита, чувство бессилия или истощения, онемение рук или ног, тошнота или проблемы с доступом к диализу.

- Подшкала «Влияние заболевания почек на повседневную жизнь» содержит пункты, относящиеся к тому, насколько респондента беспокоят ограничения в жидкости, ограничения в питании, возможности работать по дому или путешествовать, ощущение зависимости от врачей и другого медицинского персонала, стресс или беспокойство, сексуальная жизнь, личный внешний вид.

9.7. Анализ безопасности

9.8. Лабораторные оценки

Исходные показатели определяют непосредственно перед инъекцией REACT. Наблюдаемые изменения в сравнении с исходными лабораторными данными обобщают с использованием размера выборки, среднего значения, стандартного отклонения, медианы, минимума и максимума для непрерывных переменных, а также частоты и доли для категориальных переменных. Лабораторные аномалии определяют с использованием системы присвоения баллов NCI CTCAE. Аномальные лабораторные показатели отмечают, как показатели выше или ниже нормального диапазона. Особый интерес для данного исследования представляют результаты лабораторных исследований почечной функции, а именно сКр, АМК и альбумин в моче.

Частоту возникновения лабораторных отклонений, вызванных лечением, определяемых как значения, которые увеличиваются по меньшей мере на одну степень токсичности от исходного уровня и до любого момента времени после исходного уровня, вплоть до шести месяцев после инъекции REACT, суммируют. Если исходные данные отсутствуют, то в качестве исходного значения используют последнее значение, полученное между биопсией и инъекцией. Если исходные данные и данные до инъекции отсутствуют, то любое отклонение от нормы с присвоенной степенью (то есть, по меньшей мере, 1 степени) рассматривают как вызванное лечением. Эти значения суммируют как для полного набора анализов, так и для набора анализов инъекций. Наблюдаемые значения и изменения в сравнении с исходными значениями представляют в виде описательной статистики; использование инференциальной статистики не планируется. Эти данные представляют в форме таблиц.

9.9. Нежелательные явления

Клинические и лабораторные НЯ кодируют с использованием Медицинского словаря терминов нормативной деятельности (MedDRA) версии 18.1 на основе класса системы органов (SOC) и предпочтительного термина (PT). Нежелательным явлениям присваивают степень в соответствии с CTCAE версии 4.03 от Национального института рака США.

Нежелательное явление, связанное с лечением (НЯЛ), определяют как любое НЯ, которое возникает после первой инъекции REACT, или началось до первой инъекции, но его степень тяжести или частота увеличилась после первой инъекции REACT. Данные (частоту и относительную долю) по связанным с лечением НЯ обобщают по SOC и PT. Дополнительные обобщенные данные включают, но без ограничения, связанные с лечением НЯ, которые считают связанными с процедурой и/или исследуемым препаратом, интенсивность, причину прекращения участия в исследовании субъекта, СНЯ и смертность. Количество явлений (частоту возникновения) и количество субъектов (частоту заболевания), у которых возникли связанные с лечением НЯ, представляют по группам лечения. Данные о нежелательных явлениях представляют в перечне данных.

9.10. Другие оценки безопасности

Изменения в сравнении с исходным уровнем жизненно важных показателей рассчитывают для каждого субъекта и предоставляют в перечне данных. Количество и процент субъектов, у которых наблюдаются изменения при физическом обследовании (например, с нормального на аномальное), обобщают в перечне данных. Количество и процент субъектов, у которых возникли аномальные сердечные ритмы или удлинение QT-интервала во время исследования, указывают в перечне данных. Данные из истории болезни, сопутствующие лекарственные препараты, результаты УЗИ, сцинтиграфии почек и МРТ представляют в перечне данных. Описательную статистику для этих оценок составляют по мере необходимости.

9.11. Биопсия и инъекция(и) REACT

Данные по биопсии и инъекциям REACT представляют в перечне данных.

10. Результаты

Пациент с заболеванием почек вследствие CAKUT получил инъекцию REACT. Пациентом был 55-летний мужчина, имеющий задний уретральный клапан. Через три месяца после инъекции REACT, в самой последней временной точке, для которой имеются данные, у пациента наблюдалось заметное улучшение почечной функции, о чем свидетельствовало увеличение рСКФ и уменьшение отношения альбумина к креатинину (ACR). Как показано на Фигуре 8, введение пациенту REACT привело к улучшению, то есть, усилению, почечной функции пациента, определяемой на основании рСКФ. В месяц, предшествующий инъекции REACT, рСКФ пациента снижалась, сокращаясь от примерно 40 мл/мин/1,73 м² за 1 месяц до инъекции, до примерно 33 мл/мин/1,73 м² в момент инъекции (Фигура 8, сплошная серая линия). Введение пациенту REACT привело к увеличению рСКФ пациента относительно его значения в момент инъекции до примерно 34 мл/мин/1,73 м² через 2 месяца после инъекции и примерно 35 мл/мин/1,73 м² через 3 месяца после инъекции (Фигура 8, ломаная черная линия).

На Фигуре 9 представлено дополнительное свидетельство улучшения почечной функции пациента в виде наблюдаемого уменьшения отношения альбумина к креатинину (ACR). В момент инъекции REACT ACR у пациента было повышено, находясь на уровне примерно 47 мг/г. Однако через 3 месяца после инъекции REACT ACR пациента уменьшилось более чем на 50%, до примерно 21 мг/г, что можно считать значением ACR в «нормальном», то есть, ниже 30 мг/г, диапазоне.

Эти показатели улучшения почечной функции после инъекции REACT являются клинически значимыми; существующие терапевтические возможности для лечения ХЗП, независимо от основной причины, неспособны приводить к улучшению почечной функции, скорее, они лишь уменьшают скорость снижения функции органа.

ЛИТЕРАТУРА

1. Lees, G.E., R.E. Cianciolo, and F.J. Clubb, Jr., Renal biopsy and pathologic evaluation of glomerular disease. Top Companion Anim Med, 2011. 26(3): p. 143-53.

2. Nass, K. and W.C. O'Neill, Bedside renal biopsy: ultrasound guidance by the nephrologist. Am J Kidney Dis, 1999. 34(5): p. 955-9.

3. Oberholzer, M., et al., Minimum sample size of kidney biopsies for semiquantitative and quantitative evaluation. Nephron, 1983. 34(3): p. 192-5.

4. Dhingra, R.K., et al., Type of vascular access and mortality in U.S. hemodialysis patients. Kidney Int, 2001. 60(4): p. 1443-51.

5. USRDS, 2012 Annual Data Report: Atlas of Chronic Kidney Disease and End-Stage Renal Disease in the United States. National Institutes of Health, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, Bethesda, MD, 2012.

6. Almeida, C.C., et al., Safety of immunosuppressive drugs used as maintenance therapy in kidney transplantation: a systematic review and meta-analysis. Pharmaceuticals (Basel), 2013. 6(10): p. 1170-94.

7. Atala, A., et al., Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty. Lancet, 2006. 367(9518): p. 1241-6.

8. Bruce, A.T., et al., Exposure of Cultured Human Renal Cells Induces Mediators of cell migration and attachment and facilitates the repair of tubular cell monolayers in vitro. Experimental Biology, Washington, DC, 2011.

9. Bruce, A.T., et al., Selected renal cells modulate disease progression in rodent models of chronic kidney disease via NF-kappaB and TGF-beta1 pathways. Regen Med, 2015. 10(7): p. 815-39.

10. Jayo, M.J., et al., Long-term durability, tissue regeneration and neo-organ growth during skeletal maturation with a neo-bladder augmentation construct. Regen Med, 2008. 3(5): p. 671-82.

11. Jayo, M.J., et al., Early cellular and stromal responses in regeneration versus repair of a mammalian bladder using autologous cell and biodegradable scaffold technologies. J Urol, 2008. 180(1): p. 392-7.

12. Jayo, M.J., et al., Tissue engineering and regenerative medicine: role of toxicologic pathologists for an emerging medical technology. Toxicol Pathol, 2008. 36(1): p. 92-6.

13. Bilan, V.P., et al., Diabetic nephropathy and long-term treatment effects of rosiglitazone and enalapril in obese ZSF1 rats. J Endocrinol, 2011. 210(3): p. 293-308.

14. Ilagan, R., et al., Exosomes derived from primary renal cells contain microRNAs that can potentially drive therapeutically-relevant outcomes in models of chronic kidney disease. TERMIS Conference, Orlando, FL, 2010.

15. Ilagan, R., et al., Secreted Factors from Bioactive Kidney Cells Attenuate NF-kappa-B. TERMIS Conference, Orlando, FL, 2010.

16. Kelley, R., et al., A Population of Selected Renal Cells Augments Renal Function and Extends Survival in the ZSF1 model of Progressive Diabetic Nephropathy Cell Transplantation (in Press), 2012.

17. Kelley, R., et al., Bioactive Renal Cells Augment Kidney Function In a Rodent Model Of Chronic Kidney Disease. ISCT Conference, Philadelphia, PA, 2010.

18. Brenner, B.M., Nephron adaptation to renal injury or ablation. Am J Physiol, 1985. 249(3 Pt 2): p. F324-37.

19. Montgomery, A.V., et al., The intrarenal pressure; its relation to age, weight, blood pressure, and sex. J Exp Med, 1950. 92(6): p. 637-42.

20. Swann, H.G., et al., The intrarenal pressure during experimental renal hypertension. J Exp Med, 1952. 95(5): p. 281-91.

21. Kelley, R.W., et al., Enhanced renal cell function in dynamic 3D culture system. KIDSTEM Conference, Liverpool, UK, 2008.

22. Kelley, R., et al., Intra-renal Transplantation of Bioactive Renal Cells Preserves Renal Functions and Extends Survival in the ZSFI model of Progressive Diabetic Nephropathy. ADA Conference, San Diego, CA, 2011.

23. Basu J, S.N., Rivera E, Guthrie K, Bertram T, Jain D. . Dynamic distribution of therapeutically bioactive selected renal cells in large animal pre-clinical model. in International Society for Stem Cell Research. 2014. Vancouver, BC.

24. Hare, J.M., et al., Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial. JAMA, 2012. 308(22): p. 2369-79.

25. Hare, J.M., et al., A randomized, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells (prochymal) after acute myocardial infarction. J Am Coll Cardiol, 2009. 54(24): p. 2277-86.

26. Heldman, A.W., et al., Transendocardial mesenchymal stem cells and mononuclear bone marrow cells for ischemic cardiomyopathy: the TAC-HFT randomized trial. JAMA, 2014. 311(1): p. 62-73.

27. Lee, J.S., et al., A long-term follow-up study of intravenous autologous mesenchymal stem cell transplantation in patients with ischemic stroke. Stem Cells, 2010. 28(6): p. 1099-106.

28. Malliaras, K., et al., Intracoronary cardiosphere-derived cells after myocardial infarction: evidence of therapeutic regeneration in the final 1-year results of the CADUCEUS trial (CArdiosphere-Derived aUtologous stem CElls to reverse ventricUlar dySfunction). J Am Coll Cardiol, 2014. 63(2): p. 110-22.

29. Babitt, J.L. and H.Y. Lin, Mechanisms of anemia in CKD. J Am Soc Nephrol, 2012. 23(10): p. 1631-4.

30. Khajehdehi, P., et al., Percutaneous renal biopsy in the 1990s: safety, value, and implications for early hospital discharge. Am J Kidney Dis, 1999. 34(1): p. 92-7.

31. Manno, C., et al., Desmopressin acetate in percutaneous ultrasound-guided kidney biopsy: a randomized controlled trial. Am J Kidney Dis, 2011. 57(6): p. 850-5.

32. Groman, R.P., et al., Effects of serial ultrasound-guided renal biopsies on kidneys of healthy adolescent dogs. Vet Radiol Ultrasound, 2004. 45(1): p. 62-9.

33. Hergesell, O., et al., Safety of ultrasound-guided percutaneous renal biopsy-retrospective analysis of 1090 consecutive cases. Nephrol Dial Transplant, 1998. 13(4): p. 975-7.

34. Lin, W.C., et al., Outpatient versus inpatient renal biopsy: a retrospective study. Clin Nephrol, 2006. 66(1): p. 17-24.

35. Walker, P.D., The renal biopsy. Arch Pathol Lab Med, 2009. 133(2): p. 181-8.

36. Medarova, Z., et al., In vivo imaging of autologous islet grafts in the liver and under the kidney capsule in non-human primates. Transplantation, 2009. 87(11): p. 1659-66.

37. Park, H.C., et al., Renal capsule as a stem cell niche. Am J Physiol Renal Physiol, 2010. 298(5): p. F1254-62.

38. Salagierski, M. and M.S. Salagierski, Radiofrequency ablation: a minimally invasive approach in kidney tumor management. Cancers (Basel), 2010. 2(4): p. 1895-900.

39. Cain, H., E. Egner, and M. Redenbacher, Increase of mitosis in the tubular epithelium following intrarenal doses of various kidney homogenates and hemogenate fractions in the rat. Virchows Arch B Cell Pathol, 1976. 22(1): p. 55-72.

40. Humphreys, B.D., et al., Intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury. Cell Stem Cell, 2008. 2(3): p. 284-91.

41. Inker, L.A., et al., Estimating glomerular filtration rate from serum creatinine and cystatin C. N Engl J Med, 2012. 367(1): p. 20-9.

42. Hays RD, K.J., Mapes DL. . Kidney Disease Quality of Life Short Form KDQOL-SF) Version 1.3. A Manual for Use and Scoring. RAND; Santa Monica, Calif.: 1995. www.rand.org/health/surveys_tools/kdqol.html. Accessed 28 April 2016

Пример 2 - Неограничивающие примеры способов и композиций для получения СПК

Пример 2.1 - Приготовление растворов

В данном примере приведены составы различных сред для препаратов и растворов, используемых для выделения и характеризации гетерогенной популяции почечных клеток, а также производства регенеративного терапевтического препарата.

Таблица 13: Среды для культивирования и растворы

Материал Состав Среда для транспортировки ткани -Viaspan™ или HypoThermosol-FRS^® или DMEM
-Канамицин: 100 мкг/мл Ростовая среда для почечных клеток -DMEM:KSFM (50:50)
-5% ЭБС
-Ростовые добавки:
-HGF: 10 мг/л
-EGF: 2,5 мкг/л
-Инсулин: 10,0 мг/л,
-Трансферрин: 5,5 мг/л
-Селен: 670 мкг/л
-Канамицин: 100 мкг/мл Раствор для промывания ткани -DMEM
-Канамицин: 100 мкг/мл Раствор для расщепления ткани -Коллагенaза IV: 300 единиц
-Диспаза: 5 мг/мл
-Хлорид кальция: 5 мМ Раствор для диссоциации клеток -TrypLE™ Раствор для градиента плотности -7% OptiPrep
-OptiMEM Раствор для криоконсервирования -DMEM или HypoThermosol-FRS
-10% ДМСО
-10% ЭБС

Для промывания клеток во всех случаях использовали фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS).

Пример 2.2 - Выделение гетерогенной не фракционированной популяции почечных клеток

В данном примере описано выделение не фракционированной (Н/ФР) гетерогенной популяции почечных клеток из человеческой почки. Была проведена начальная диссоциация ткани для получения гетерогенной клеточной суспензии из ткани человеческой почки.

Почечная ткань, полученная при биопсии почки, явилась исходным материалом для получения гетерогенной популяции почечных клеток. Можно использовать почечную ткань, содержащую одно или более из: коркового слоя, кортикомедуллярного соединения или медуллярной ткани. В одном варианте осуществления используют ткань кортикомедуллярного соединения. Необходимо несколько биоптатов (минимум 2), не затрагивающих рубцовую ткань, для получения образцов из почки с ХЗП. Почечную ткань получал клинический исследователь от пациента в клиническом центре примерно за 4 недели до запланированной имплантации конечного препарата NKA. Ткань перевозили в среде для транспортировки ткани, описанной в примере 2.1.

Затем ткань промывали раствором для промывания ткани, описанным в примере 2.1, для уменьшения поступающей бионагрузки перед обработкой ткани для экстракции клеток.

Почечную ткань измельчали, взвешивали и проводили диссоциацию в растворе для расщепления ткани, описанном в примере 2.1. Полученную клеточную суспензию нейтрализовали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM) + 10% эмбриональной бычьей сыворотки (ЭБС) (Invitrogen, Carlsbad Calif.), промывали и ресуспендировали в бессывороточной, не содержащей добавки среде для кератиноцитов (KSFM) (Invitrogen). Затем клеточную суспензию центрифугировали через границу плотности 15% (масс/об) раствора йодиксанола (OptiPrep™, Sigma) для удаления эритроцитов и детрита, с последующим высевом для культивирования в обработанные для культивирования тканей полистирольные флаконы или планшеты при плотности 25000 клеток на см² в ростовой среде для почечных клеток, описанной в примере 2.1. Например, клетки можно высевать во флаконы Nunc T500 при плотности 25×10⁶ клеток/флакон в 150 мл среды 50:50.

Пример 2.3 - Размножение выделенной популяции почечных клеток

Размножение почечных клеток зависит от количества полученной ткани и от успешного выделения почечных клеток из полученной ткани. Выделенные клетки можно криоконсервировать, при необходимости (смотри ниже). Кинетика роста почечных клеток может варьироваться от образца к образцу вследствие неотъемлемой вариабельности клеток, полученных от отдельных пациентов.

Был разработан определенный способ размножения клеток, в котором учтен диапазон извлечения клеток, являющийся результатом вариабельности полученной ткани. Таблица 14. Размножение почечных клеток включает серийные пересевы в закрытых емкостях для культивирования клеток (например, T-флаконах, Cell Factories, HyperStacks^®) в ростовой среде для почечных клеток из Таблицы 13 с использованием определенных методов культивирования клеток.

Не содержащая ЭБГ среда была разработана для клинических испытаний с участием людей в целях устранения характерных рисков, связанных с использованием ЭБГ. Клеточный рост, фенотип (CK18) и клеточную функцию (ферментативную активность GGT и LAP) оценивали в не содержащей ЭБГ среде и сравнивали с результатами для содержащей ЭБГ среды, которую использовали в исследованиях на животных. Рост, фенотип и функция почечных клеток были эквивалентными в двух средах. (Данные не представлены).

Таблица 14 Извлечение клеток из биопсийных образцов человеческой почки

Источник Почечные клетки
(клетки/10 мг ткани) (пересев 0) (пересев 1) Образцы ткани человеческой почки (n=7) 1,44-10,80×10⁶ 4,61-23,10×10⁷

После того, как рост клеток был обнаружен в исходных Т-флаконах (пересев 0), и отсутствовали видимые признаки загрязнения, культуральную среду заменяли, и впоследствии меняли каждые 2-4 дня (ФИГ. 7B). Проводили оценку клеток для подтверждения морфологии почечных клеток путем визуального анализа культур под микроскопом. Культуры, как правило, имели характерный вид плотного дорожного покрытия или крупной гальки из-за образования клетками скоплений. Эти морфологические характеристики меняются в процессе размножения и могут присутствовать не во всех пересеваемых культурах. Конфлюэнтность клеточных культур оценивали с использованием библиотеки изображений клеток при разных уровнях конфлюэнтности в емкостях для культивирования, используемых в процессе размножения клеток.

Почечные клетки пересевали путем обработки трипсином, когда сосуды для культивирования имели конфлюэнтность по меньшей мере 50% (ФИГ. 7B). Открепившиеся клетки собирали в емкости, содержащие ростовую среду для почечных клеток, подсчитывали их количество и рассчитывали жизнеспособность клеток. При каждом пересеве клетки высевали при плотности 500-4000 клеток/см² в достаточное количество емкостей для культивирования с целью их размножения до количества клеток, необходимого для препарата NKA (ФИГ. 7B). Емкости для культивирования помещали в инкубатор с температурой 37°C и атмосферой с 5% CO₂. Как описано выше, морфологию и конфлюэнтность клеток контролировали, и среду для культивирования клеток заменяли каждые 2-4 дня. В Таблице 15 приведены показатели жизнеспособности человеческих почечных клеток, наблюдаемые при выделении и размножении клеток из шести биопсийных образцов от людей-доноров.

Таблица 15 Жизнеспособность человеческих почечных клеток в культуре

Пересев (n=6) Жизнеспособность клеток (среднее, %) Диапазон (%) П0 88 84-93 П1 91 80-98 П2 94 92-99 П3 98 97-99

Неотъемлемая вариабельность тканей от разных пациентов приводила к разным выходам клеток в культуре. Таким образом, нецелесообразно строго определять время для пересева клеток, или количество и тип емкостей для культивирования, необходимых при каждом пересеве, для достижения целевых количеств клеток. Как правило, почечные клетки проводят через 2 или 3 пересева; однако продолжительность культивирования и выход клеток могут варьироваться в зависимости от скорости роста клеток.

Клетки открепляли для сбора или пересева 0,25% раствором трипсина с ЭДТА (Invitrogen). Жизнеспособность оценивали методом исключения трипанового синего, и подсчет клеток производили вручную при помощи гемоцитометра или при помощи автоматизированной системы Cellometer^® (Nexcelom Bioscience, Lawrence Mass.).

Пример 2.4 Криоконсервирование культивированных клеток

Размноженные почечные клетки, как правило, криоконсервировали для нивелирования неотъемлемой вариабельности скорости роста клеток от отдельных пациентов и доставки препарата по заранее определенному клиническому расписанию. Криоконсервированные клетки также являются запасным источником клеток в случае необходимости другого препарата NKA (например, в случае задержки вследствие болезни пациента, непредвиденных событий и так далее). Были разработаны условия, которые использовали для криоконсервирования клеток и восстановления жизнеспособных функциональных клеток при размораживании.

Для криоконсервирования клетки суспендировали до конечной концентрации примерно 50×10⁶ клеток/мл в растворе для криоконсервирования (смотри пример 2.1) и разливали во флаконы. Флаконы емкостью один миллилитр, содержащие примерно 50×10⁶ клеток/мл, помещали в морозильную камеру морозильной установки с контролируемой скоростью заморозки и замораживали с заранее установленной скоростью. После замораживания клетки переносили в емкость с жидким азотом для промежуточного хранения.

Пример 2.5 Получение клеточной популяции СПК

Селективные почечные клетки (СПК) могут быть получены из емкостей для конечного культивирования, в которых клетки растут из криоконсервированных клеток или непосредственно из размножающихся культур, в зависимости от расписания (ФИГ. 7B).

При использовании криоконсервированных клеток клетки размораживали и помещали в емкости для культивирования ткани на один конечный этап размножения. При достижении конфлюэнтности примерно 50-100% в емкостях для конечного размножения клетки были готовы для процедуры отделения СПК. При сменах среды и окончательном промывании NKA происходит разбавление любого остаточного раствора для криоконсервирования в конечном препарате.

После достижения в емкостях для конечного размножения по меньшей мере 50% конфлюэнтности клеток емкости для культивирования переносили в инкубатор с гипоксическими условиями, установленный на уровень 2% кислорода в атмосфере с 5% CO₂ при 37°C (ФИГ. 7C), и культивировали в течение ночи. Клетки можно выдерживать в инкубаторе с контролируемым содержанием кислорода, составляющим 2% кислорода, до 48 часов. Воздействие более соответствующего физиологическим условиям низкого уровня кислорода (2%) повышает эффективность разделения клеток и облегчает обнаружение индуцируемых гипоксией маркеров, таких как VEGF.

После того, как клетки были подвергнуты воздействию гипоксических условий в течение достаточного времени (например, в течение ночи или до 48 часов), клетки открепляли 0,25% раствором трипсина с ЭДТА (Invitrogen). Жизнеспособность оценивали методом исключения трипанового синего, и подсчет клеток производили вручную при помощи гемоцитометра или при помощи автоматизированной системы Cellometer^® (Nexcelom Bioscience, Lawrence Mass.). Клетки промывали один раз DPBS и ресуспендировали до плотности примерно 850×10⁶ клеток/мл в DPBS.

Центрифугирование в градиенте плотности использовали для разделения собранных популяций почечных клеток на основании плавучей плотности клеток. Суспензии почечных клеток разделяли одноэтапным центрифугированием через 7% раствор йодиксанола (OptiPrep; 60% (масс/об) в OptiMEM; смотри пример 2.1).

Готовили 7% градиентный раствор OptiPrep, и перед использованием измеряли коэффициент преломления, указывающий на желаемую плотность (КП 1,3456 ± 0,0004). Собранные почечные клетки наслаивали сверху на градиентный раствор. Центрифугирование проводили при 800 g в течение 20 мин при комнатной температуре (без торможения) либо в центрифужных пробирках, либо в устройстве для обработки клеток (например, COBE 2991). Фракцию клеток, имеющих плавучую плотность более примерно 1,045 г/мл, собирали после центрифугирования в виде четкого осадка клеток. Клетки, имеющие плавучую плотность менее 1,045 г/мл, исключали и отбрасывали.

Осадок клеток СПК ресуспендировали в DPBS (ФИГ. 7C). Перенесенное остаточное содержание OptiPrep, ЭБС, культуральной среды и вспомогательных материалов в конечном препарате доводили до минимума за счет использования 4 этапов промывания DPBS и 1 этапа промывания раствором желатина.

Группа изобретений относится к медицине. Способ лечения хронического заболевания почек, а также уменьшения отношения альбумин/креатинин и стабилизации расчетной скорости клубочковой фильтрации у субъекта, имеющего хроническое заболевание почек (ХЗП) вследствие врожденных аномалий почки и мочевыводящих путей (CAKUT), включает чрескожную инъекцию в почечный корковый слой по меньшей мере одной почки субъекта эффективного количества композиции, содержащей популяцию селективных почечных клеток. Группа изобретений обеспечивает улучшение почечной функции. 3 н. и 33 з.п. ф-лы, 15 табл., 2 пр., 9 ил.

1. Способ лечения хронического заболевания почек (ХЗП) вследствие врожденных аномалий почки и мочевыводящих путей (CAKUT), включающий чрескожную инъекцию в почечный корковый слой по меньшей мере одной почки субъекта, имеющего хроническое заболевание почек (ХБП) вследствие врожденных аномалий почки и мочевыводящих путей (CAKUT), эффективного количества композиции, содержащей популяцию селективных почечных клеток.

2. Способ по п. 1, где субъект имеет аномалии развития почек.

3. Способ по п. 1 или 2, где субъект имеет или имел первичный или вторичный пузырно-мочеточниковый рефлюкс, рефлюкс-нефропатию, почечные рубцы или гиподисплазию почек с инфекцией и/или воспалением или без них.

4. Способ по любому из пп. 1-3, где субъект предрасположен к инфекциям мочевыводящих путей.

5. Способ по любому из пп. 1-4, где субъект имеет гипертензию или протеинурию.

6. Способ по любому из пп. 1-5, где субъект перенес антирефлюксную операцию.

7. Способ по любому из пп. 1-6, где субъект имеет скорость клубочковой фильтрации (СКФ) менее 90 мл/мин/1,73 м², микроальбуминурию или макроальбуминурию.

8. Способ по любому из пп. 1-7, где субъект имеет возраст менее 60 лет.

9. Способ по любому из пп. 1-8, где субъект имеет порок развития почечной паренхимы.

10. Способ по любому из пп. 1-9, где CAKUT включает удвоение мочеточника, обструкцию мочеточнико-тазового соединения, агенезию почки, пузырно-мочеточниковый рефлюкс, дисплазию почек, гипоплазию почек, гиподисплазию почек, врожденный гидронефроз, подковообразную почку, задний уретральный клапан и синдром отвислого живота, обструктивную дисплазию почек или синдром неподвижных ресничек.

11. Способ по любому из пп. 2-10, где CAKUT вызваны или коррелируют с генетическим фактором.

12. Способ по любому из пп. 2-10, где CAKUT вызваны или коррелируют с не генетическим фактором.

13. Способ по п. 12, где не генетический фактор представляет собой фактор окружающей среды.

14. Способ по любому из пп. 1-13, где аномалия включает пузырно-мочеточниковый рефлюкс (ПМР).

15. Способ по любому из пп. 1-14, где хроническое заболевание почек представляет собой заболевание почек III или IV стадии.

16. Способ по любому из пп. 1-15, в котором популяцию селективных почечных клеток получают из биопсии почки субъекта.

17. Способ по любому из пп. 1-16, в котором клетки популяции селективных почечных клеток проявляют плавучую плотность более чем 1,04 г/мл.

18. Способ по любому из пп. 1-17, в котором популяция селективных почечных клеток характеризуется активностью γ-глютамилтранспептидазы и лейцинаминопептидазы.

19. Способ по любому из пп. 1-18, в котором выбранная популяция почечных клеток преимущественно содержит канальцевые эпителиальные клетки.

20. Способ по любому из пп. 1-19, где чрескожная инъекция включает первую и вторую инъекции, при этом первую и вторую инъекции выполняют с интервалом по меньшей мере 3 месяца.

21. Способ по любому из пп. 1-20, где композиция дополнительно содержит термочувствительный стабилизирующий клетки биологический материал, который находится в (i) твердом состоянии при температуре 2°C или ниже и (ii) жидком состоянии при температуре окружающей среды или выше, где биологический материал представляет собой гидрогель, где биологический материал находится в переходном состоянии от твердого состояния к жидкому между температурой 8°C и температурой окружающей среды или выше.

22. Способ по п. 21, где популяция селективных почечных клеток суспендирована и диспергирована во всем объеме стабилизирующего клетки биологического материала.

23. Способ по п. 21 или 22, где гидрогель содержит желатин.

24. Способ по любому из пп. 1-23, где популяцию селективных почечных клеток инъецируют через иглу 18-30 калибра.

25. Способ по п. 24, где игла имеет диаметр 27 калибра, 26 калибра, 25 калибра, 24 калибра, 23 калибра, 22 калибра, 21 калибра или 20 калибра.

26. Способ уменьшения отношения альбумин/креатинин (ACR) у субъекта, имеющего хроническое заболевание почек (ХЗП) вследствие врожденных аномалий почки и мочевыводящих путей (CAKUT), включающий чрескожную инъекцию в почечный корковый слой по меньшей мере одной почки субъекта эффективного количества композиции, содержащей популяцию селективных почечных клеток.

27. Способ по п. 26, где уменьшение ACR составляет по меньшей мере 10% относительно исходного значения ACR у субъекта.

28. Способ стабилизации расчетной скорости клубочковой фильтрации (рСКФ) у субъекта, который имеет хроническое заболевание почек (ХЗП) вследствие врожденных аномалий почки и мочевыводящих путей (CAKUT), включающий чрескожную инъекцию в почечный корковый слой по меньшей мере одной почки субъекта эффективного количества композиции, содержащей популяцию селективных почечных клеток.

29. Способ по п. 28, где стабилизация рСКФ включает увеличение рСКФ по меньшей мере на 1% относительно исходной рСКФ у субъекта.

30. Способ по любому из пп. 26-29, где аномалия почек и/или мочевыводящих путей включает собой задний уретральный клапан.

31. Способ по любому из пп. 26-30, в котором популяцию селективных почечных клеток получают из биопсии почки субъекта.

32. Способ по любому из пп. 26-31, в котором клетки популяции селективных почечных клеток проявляют плавучую плотность более чем 1,04 г/мл.

33. Способ по любому из пп. 26-32, в котором популяция селективных почечных клеток характеризуется активностью γ-глютамилтранспептидазы и лейцинаминопептидазы.

34. Способ по любому из пп. 26-33, в котором выбранная популяция почечных клеток преимущественно содержит канальцевые эпителиальные клетки.

35. Способ по любому из пп. 26-34, где чрескожная инъекция включает первую и вторую инъекции, при этом первую и вторую инъекции выполняют с интервалом по меньшей мере 3 месяца.

36. Способ по любому из пп. 1-35, где эффективное количество популяции селективных почечных клеток включает 3×10⁶ клеток/г расчетной массы почки субъекта.