ИММУНОЛОГИЧЕСКИ ПРИВИЛЕГИРОВАННЫЕ БИОАКТИВНЫЕ ПОЧЕЧНЫЕ КЛЕТКИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ ПОЧЕК Российский патент 2024 года по МПК C12N15/113 A61K39/39 A61P13/12 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По настоящей заявке испрашивается приоритет на основании предварительной патентной заявки США № 62/523241, поданной 21 июня 2017 г., содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.

ВКЛЮЧЕНИЕ СПИСКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИ

Полное содержание текстового файла со списком последовательностей, носящего название «050400-516001WO_SEQUENCE_LISTING.txt», который был создан 21 июня 2018 г. и имеет размер 88654 байт, включено в настоящий документ посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение, в частности, относится к клеткам, композициям и способам для лечения заболевания почек. Некоторые аспекты относятся к композициям и способам для создания генетически модифицированных, предпочтительно, не аллореактивных, биоактивных популяций почечных клеток для лечения субъектов с заболеванием почек, а также к способам оказания регенеративного действия на естественные почки с использованием популяций отобранных почечных клеток.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Терапия, основанная на почечных клетках, в последнее время вызывает особый интерес, поскольку в области современной медицины регенерация тканей и органов технологически осуществима (Ludlow et al. The Future of Regenerative Medicine: Urinary System. Tissue Engineering. 2012; 18:218-24). Описаны новые парадигмы лечения с применением тканевой инженерии и клеточной терапии, которые обеспечивают существенное и длительное улучшение функции почек, замедляют прогрессирование заболевания и способствуют улучшению качества жизни данной категории пациентов. Эти технологии регенеративной медицины следующего поколения позволяют получать выделенные почечные клетки в качестве терапевтического инструмента для лечения хронической почечной недостаточности (ХПН). В публикациях Presnell et al. WO/2010/056328 и Ilagan et al. PCT/US2011/036347 описаны выделенные биоактивные почечные клетки, способы их выделения и культивирования, а также способы лечения с использованием популяций клеток. В доклинических исследованиях инъекция этих биоактивных почечных клеток в почки реципиента приводила к значительному улучшению показателей выживаемости и почечной функции животных, о чем свидетельствовали, например, функции концентрирования и фильтрования мочи.

Современный протокол лечения пациентов с использованием отобранных почечных клеток основан на переносе аутологичных клеток. В данном подходе биоактивные почечные клетки получают от пациентов, отбирают ex vivo, культивируют in vitro для увеличения количества клеток, при необходимости, и затем вводят инфузией пациенту. Каждый пациент получает лечебный препарат, индивидуально изготовленный с использованием естественных почечных клеток пациента (то есть, аутологичный метод лечения). Аутологичные методы лечения имеют существенные технические и логистические препятствия для их практического применения; для их создания требуются дорогостоящие специализированные учреждения и опытный персонал, препараты должны быть созданы в короткие сроки после постановки диагноза пациенту, а в некоторых случаях, в зависимости от степени прогрессирования заболевания, клетки пациента могут неудовлетворительно функционировать и/или присутствовать в очень малых количествах. Вследствие таких сложностей, аутологичные клеточные препараты могут существенно отличаться с точки зрения эффективности и безопасности.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится, в частности, к клеткам с пониженной иммуногенностью для использования в лечении субъектов с заболеванием почек. В конкретных вариантах осуществления клетки, полученные от донора, которые обычно не вводят пациенту (например, из-за возможности воспаления и отторжения иммунной системой), генетически модифицируют для оказания ими полезного воздействия на пациента (например, таким образом, что клетки будут способны персистировать и стимулировать улучшение почечной функции). Настоящее изобретение также относится к способам получения таких клеток.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения генетически модифицированной биоактивной почечной клетки (БПК). В конкретных вариантах осуществления генетически модифицированная БПК представляет собой геномно модифицированную БПК (то есть, БПК с генетической модификацией в ее геноме). В конкретных вариантах осуществления генетически модифицированная БПК содержит экзогенный полинуклеотид (такой как плазмида или вирусный вектор), который экспрессирует молекулу для РНК-интерференции (РНКи), вызывающую уменьшение экспрессии отвечающего за иммуногенность геномного гена БПК. В конкретных вариантах осуществления молекула для РНКи представляет собой молекулу короткой интерферирующей или короткой шпилечной РНК. В конкретных вариантах осуществления способ включает генетическое модифицирование отвечающего за иммуногенность геномного гена в БПК.

В конкретных вариантах осуществления ген кодирует белок в молекуле главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I или молекуле MHC класса II. В конкретных вариантах осуществления ген представляет собой ген бета-2 микроглобулина (B2M, также известного как β2M), человеческого лейкоцитарного антигена (HLA)-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRA, HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DPA1, HLA-DPA2, HLA-DQA1 или HLA-DQB1.

В конкретных вариантах осуществления ген кодирует минорный антиген гистосовместимости (MiHA или mHA). В конкретных вариантах осуществления ген представляет собой ген HA-1, HA-2, HA-8, HB-1, HY-A1, HY-A2, HY-B7, HY-B8, HY-B60 или HY-DQ5.

В вариантах осуществления любой аллельный вариант гена, упомянутого в настоящем документе (например, гена HLA, B2M или гена mHA), может быть модифицирован (например, делетирован) или служить мишенью для РНК-интерференции.

В конкретных вариантах осуществления генетическое модифицирование гена включает внесение мутации в ген. В конкретных вариантах осуществления внесение мутации в ген включает делецию гена или его части.

В конкретных вариантах осуществления генетическое модифицирование клетки включает внесение мутации в любое сочетание двух или более из генов B2M, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRA, HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DPA1, HLA-DPA2, HLA-DQA1 и/или HLA-DQB1.

В конкретных вариантах осуществления генетически модифицированная БПК представляет собой генетически модифицированную первичную почечную клетку. В конкретных вариантах осуществления генетически модифицированная первичная почечная клетка была пересеяна по меньшей мере примерно 1, 2, 3, 4, 5, или более, раз до или после генетической модификации. В конкретных вариантах осуществления способ дополнительно включает получение ОПК из генетически модифицированных БПК. В конкретных вариантах осуществления ОПК получают, а затем генетически модифицируют.

В конкретных вариантах осуществления БПК находится в популяции БПК. В конкретных вариантах осуществления БПК представляет собой отобранную почечную клетку (ОПК). В конкретных вариантах осуществления ОПК находится в популяции ОПК. Различные неограничивающие примеры ОПК приведены в настоящем документе. В конкретных вариантах осуществления ОПК представляет собой клетку почечного канальца. В конкретных вариантах осуществления клетка почечного канальца представляет собой клетку проксимального почечного канальца. В конкретных вариантах осуществления ОПК представляет собой эндокринную, сосудистую или гломерулярную клетку. В конкретных вариантах осуществления популяция ОПК включает устойчивые к гипоксии и устойчивые к йодиксанолу клетки. В конкретных вариантах осуществления популяция ОПК включает клетки, которые экспрессируют синтазу гиалуроновой кислоты 2. В конкретных вариантах осуществления популяция ОПК включает клетки, которые способны к рецептор-опосредованному переносу альбумина. В конкретных вариантах осуществления ОПК характеризуется экспрессией CK18 и GGT1. В конкретных вариантах осуществления метаболизм PrestoBlue и продуцирование VEGF и KIM-1 используют в качестве маркеров присутствия жизнеспособного и функционального клеточного потомства. В конкретных вариантах осуществления БПК получают путем биопсии почки.

В конкретных вариантах осуществления БПК генетически модифицируют, когда она находится в популяции БПК, при этом менее, чем все, из клеток в популяции БПК становятся генетически модифицированными. В конкретных вариантах осуществления способ дополнительно включает выделение или обогащение генетически модифицированных БПК из популяции БПК. В конкретных вариантах осуществления способ дополнительно включает выделение или обогащение генетически модифицированных ОПК из популяции ОПК. В конкретных вариантах осуществления популяцию БПК (например, ОПК) подвергают генетической модификации для получения популяции БПК, в которой некоторые клетки генетически модифицированы, а другие клетки не модифицированы. В некоторых вариантах осуществления некоторые из генетически модифицированных клеток являются гомозиготными по модификации. В конкретных вариантах осуществления некоторые из генетически модифицированных клеток являются гетерозиготными по модификации. В конкретных вариантах осуществления клетки, которые являются гомозиготными по модификации, обогащают или отбирают. В конкретных вариантах осуществления клетки, которые являются гетерозиготными по модификации, обогащают или отбирают. В конкретных вариантах осуществления клетки, которые являются гомозиготными или гетерозиготными по модификации, обогащают или отбирают. В конкретных вариантах осуществления модификация представляет собой мутацию, которая приводит к уменьшению экспрессии белка, закодированного данным геном. В конкретных вариантах осуществления мутация приводит к уменьшению уровня белка на поверхности модифицированных клеток. В конкретных вариантах осуществления клетки, которые экспрессируют белок, истощают или исключают. В конкретных вариантах осуществления мутация приводит к уменьшению уровня молекулы MHC класса I и/или молекулы MHC класса II на поверхности клетки. В конкретных вариантах осуществления клетки с мутацией не имеют на своей поверхности молекулу MHC класса I и/или молекулу MHC класса II. В конкретных вариантах осуществления клетки, которые экспрессируют на поверхности молекулу MHC класса I, истощают или исключают. В конкретных вариантах осуществления клетки, которые экспрессируют на поверхности молекулу MHC класса II, истощают или исключают. В конкретных вариантах осуществления используют метод сортировки клеток для удаления клеток, которые экспрессируют белок молекулы MHC класса I и/или молекулы MHC класса II, из популяции. В конкретных вариантах осуществления метод сортировки клеток включает использование средства (такого как антитело), которое связывает белок молекулы MHC класса I и/или молекулы MHC класса II. В конкретных вариантах осуществления истощение или отбор клеток включает связывание с гранулой/антителом для извлечения клеток с определенными белками на их клеточной поверхности. В конкретных вариантах осуществления метод сортировки клеток представляет собой магнитную сортировку активированных клеток (MACS) или активированную флуоресценцией сортировку клеток (FACS). В конкретных вариантах осуществления ген, выбранный для генетической модификации, представляет собой ген, белок которого экспрессируется на клеточной поверхности, таким образом, технология FACS и/или MACS позволяет дифференцировать (например, на основании связывания антитела на поверхности) живые клетки. В вариантах осуществления MACS используют для удаления клеток, которые экспрессируют молекулу MHC (такую как молекула MHC класса I или молекула MHC класса II), из не экспрессирующих молекулу MHC клеток. В конкретных вариантах осуществления можно использовать интегрирующий или не интегрирующий вектор для экспрессии другого полипептидного компонента HLA с целью дальнейшей модификации или модуляции адаптивной или врожденной иммунной системы, например, для предотвращения нацеливания и лизиса клетками – естественными киллерами (NK).

В конкретных вариантах осуществления генетическое модифицирование (например, внесение мутаций) гена включает (i) экспрессию редактирующего ген белка в БПК; или (ii) доставку редактирующего ген белка через клеточную мембрану БПК. В конкретных вариантах осуществления редактирующий ген белок представляет собой нуклеазу «цинковые пальцы» (ZFN), эффекторную нуклеазу, подобную активаторам транскрипции (TALEN), megaTAL или РНК-направляемую эндонуклеазу. В конкретных вариантах осуществления РНК-направляемая эндонуклеаза представляет собой белок Cas. В конкретных вариантах осуществления белок Cas представляет собой белок Cas9. В конкретных вариантах осуществления генетическое модифицирование гена дополнительно включает (i) экспрессию единой гид-РНК (гРНК) в БПК; или (ii) доставку единой гид-РНК (гРНК) через клеточную мембрану БПК. В конкретных вариантах осуществления белок Cas9 и гРНК являются частью рибонуклеопротеидного комплекса.

В конкретных вариантах осуществления способ получения геномно модифицированной БПК включает генетическое модифицирование отвечающего за иммуногенность геномного гена в БПК для получения геномно модифицированной БПК, с последующим культивированием модифицированной БПК для получения потомства с генетической модификацией в гене. В конкретных вариантах осуществления потомство имеет меньшую вероятность иммунного отторжения в сравнении с соответствующими клетками, которые не имеют генетическую модификацию в гене. В конкретных вариантах осуществления способ включает размножение потомства. В конкретных вариантах осуществления размножение потомства включает пересев потомства по меньшей мере 1, 2, 3, 4 или 5 раз. В конкретных вариантах осуществления кинетику роста и/или жизнеспособность клеток контролируют при каждом пересеве. В конкретных вариантах осуществления жизнеспособность размноженного потомства анализируют. В конкретных вариантах осуществления определяют количество размноженных клеток. В конкретных вариантах осуществления количество клеток и жизнеспособность потомства контролируют методом с исключением красителя трипанового синего и методом анализа метаболизма PrestoBlue. В конкретных вариантах осуществления функциональность БПК или ОПК оценивают путем профилирования генной экспрессии или измерения ферментативной активности. В конкретных вариантах осуществления ферментативную активность измеряют для LAP и/или GGT.

В конкретных вариантах осуществления редактирующий ген белок экспрессируется с трансфицированной мРНК. В конкретных вариантах осуществления белок Cas экспрессируется с трансфицированной мРНК, и гРНК экспрессируется с плазмидной ДНК. В конкретных вариантах осуществления трансфицированная мРНК стабилизирована за счет включения модифицированных нуклеотидных оснований или последовательностей полиаденилирования. В конкретных вариантах осуществления трансфицированная мРНК связана с по меньшей мере одним проникающим в клетку пептидом. В конкретных вариантах осуществления белок Cas экспрессируется с ДНК вектора. В конкретных вариантах осуществления экспрессию белка Cas индуцируют в течение по меньшей мере части времени, в течение которого гРНК экспрессируется в клетке. В конкретных вариантах осуществления ДНК вектор не интегрируется в геном. В конкретных вариантах осуществления ДНК вектор представляет собой эписомный вектор. В конкретных вариантах осуществления ДНК вектор представляет собой транспозон. В конкретных вариантах осуществления гРНК представляет собой транскрипт с ДНК вектора. В конкретных вариантах осуществления редактирующий ген белок представляет собой рекомбинантный белок и находится в комплексе с гРНК ex vivo. В конкретных вариантах осуществления редактирующий ген белок представляет собой рекомбинантный белок и находится в комплексе с гРНК ex vivo, и комплекс белок/гРНК доставляют в клетку путем трансфекции, липофекции, электропорации, микроинъекции или другим методом, известным специалистам в данной области. В конкретных вариантах осуществления дополнительные элементы нуклеиновой кислоты, кодирующие селективный маркер и/или конкретные мутации гена-мишени, вводят в клетку совместно с комплексом белок Cas9/гРНК.

В конкретных вариантах осуществления генетическое модифицирование гена приводит к уменьшению количества MHC класса I на поверхности клетки. В конкретных вариантах осуществления генетическое модифицирование гена приводит к уменьшению количества MHC класса II на поверхности клетки. В конкретных вариантах осуществления способ включает генетическое модифицирование двух или более генов, при этом по меньшей мере один из генов кодирует белок в молекуле MHC класса I и по меньшей мере один из генов кодирует белок в молекуле MHC класса II. В конкретных вариантах осуществления по меньшей мере один из генов представляет собой ген HLA.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к популяции сконструированных (например, генетически модифицированных) БПК, получаемых способом, раскрытым в настоящем документе. В конкретных вариантах осуществления популяция генетически модифицированных БПК представляет собой популяцию геномно модифицированных БПК. В конкретных вариантах осуществления популяция включает как генетически не модифицированные, так и генетически модифицированные, клетки. В конкретных вариантах осуществления популяция является обогащенной по генетически модифицированным БПК. В конкретных вариантах осуществления генетически модифицированные БПК являются гомозиготными по генетической модификации.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к сконструированной (например, генетически модифицированной) БПК, имеющей мутацию в гене, кодирующем белок в молекуле главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I или молекуле MHC класса II. В конкретных вариантах осуществления по меньшей мере часть гена была делетирована, при этом ген представляет собой ген B2M, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRA, HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DPA1, HLA-DPA2, HLA-DQA1 или HLA-DQB1. В конкретных вариантах осуществления генетически модифицированная БПК находится в популяции БПК. В конкретных вариантах осуществления популяция генетически модифицированных БПК представляет собой популяцию геномно модифицированных БПК. В конкретных вариантах осуществления популяция включает как генетически не модифицированные, так и генетически модифицированные, клетки. В конкретных вариантах осуществления популяция является обогащенной по генетически модифицированным БПК. В конкретных вариантах осуществления генетически модифицированные БПК являются гомозиготными по генетической модификации.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания почек у пациента, включающему введение популяции БПК пациенту, при этом популяция БПК включает генетически модифицированные БПК, при этом генетически модифицированные БПК имеют мутацию в гене, кодирующем белок в молекуле главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I или молекуле MHC класса II.

В конкретных вариантах осуществления заболевание почек представляет собой хроническую почечную недостаточность.

В конкретных вариантах осуществления популяция БПК представляет собой популяцию ОПК. В конкретных вариантах осуществления популяция ОПК получена от пациента. В конкретных вариантах осуществления популяция ОПК получена от одного или более доноров. В конкретных вариантах осуществления популяция ОПК получена после воздействия гипоксических условий культивирования. В конкретных вариантах осуществления популяция ОПК получена после разделения в градиенте плотности размноженных почечных клеток. В конкретных вариантах осуществления популяция ОПК имеет плавучую плотность, превышающую примерно 1,04, 1,0419 или 1,045 г/мл. В конкретных вариантах осуществления популяция ОПК содержит большую процентную долю одного или более типов клеток и лишена, или содержит меньшее количество, одного или более других типов клеток, в сравнении с исходной популяцией почечных клеток.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к инъекционному препарату. В конкретных вариантах осуществления препарат включает a) термочувствительный стабилизирующий клетки биологический материал и b) популяцию БПК, при этом популяция БПК включает генетически модифицированные БПК, при этом генетически модифицированные БПК имеют мутацию в гене, кодирующем белок в молекуле главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I или молекуле MHC класса II. В конкретных вариантах осуществления термочувствительный стабилизирующий клетки биологический материал представляет собой гидрогель, который (i) сохраняет практически твердое состояние при температуре примерно 8°C или ниже, при этом практически твердое состояние представляет собой состояние геля, (ii) сохраняет практически жидкое состояние при температуре около температуры окружающей среды или выше, и (iii) имеет переходное состояние из твердого тела в жидкость в диапазоне температур от примерно 8°C до температуры окружающей среды или выше.

В конкретных вариантах осуществления гидрогель содержит внеклеточный матриксный белок рекомбинантного происхождения, получен из внеклеточного матрикса почки, либо другой ткани или органа, или содержит желатин. В конкретных вариантах осуществления гидрогель содержит желатин. В конкретных вариантах осуществления желатин получен из коллагена типа I, альфа-1. В конкретных вариантах осуществления желатин получен из свиного коллагена типа I, альфа-1, или рекомбинантного человеческого коллагена типа I, альфа-1. В конкретных вариантах осуществления популяция БПК представляет собой популяцию отобранных почечных клеток (ОПК), и генетически модифицированные БПК представляют собой генетически модифицированные ОПК.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания почек у пациента, включающему введение инъекцией препарата генетически модифицированных БПК, раскрытых в настоящем документе, пациенту, при этом препарат инъецируют через иглу 18-30 калибра. В конкретных вариантах осуществления игла имеет диаметр, соответствующий примерно 27 калибру, примерно 26 калибру, примерно 25 калибру, примерно 24 калибру, примерно 23 калибру, примерно 22 калибру, примерно 21 калибру или примерно 20 калибру.

Настоящее изобретение относится к способам генетической модификации БПК в не проявляющие иммуногенность аллогенные БПК, получаемые от доноров, чтобы сделать их подходящими для терапевтических целей, при этом в способах используют РНК-направляемые эндонуклеазы, такие как Cas9/короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами (CRISPR). Более конкретно, способы, предложенные в настоящем документе, позволяют производить точную модификацию генома БПК, важных для регенерации почечной ткани, путем инактивации и/или замены генов, вовлеченных в иммунологическое узнавание БПК (например, узнавание MHC и/или белка иммунных контрольных точек), что позволяет вводить данные клетки в качестве аллогенного имплантата без элиминации их иммунной системой.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения популяции геномно модифицированных иммунологически привилегированных биоактивных почечных клеток, включающему этап (a) генетического модифицирования БПК или ОПК, включающего введение, и/или экспрессию внутри клеток, РНК-направляемые эндонуклеазы; и конкретной гид-РНК, которая направляет эндонуклеазу к по меньшей мере одному отвечающему за иммуногенность гену-мишени в геноме БПК или ОПК; и (b) размножения полученных клеток, которые являются иммунологически привилегированными с низкой, или меньшей, вероятностью иммунного отторжения. В конкретных вариантах осуществления РНК-направляемая эндонуклеаза представляет собой Cas9. РНК-направляемая эндонуклеаза может экспрессироваться с трансфицированной мРНК, или РНК-направляемая эндонуклеаз экспрессируется с трансфицированной мРНК и гРНК экспрессируется с плазмидной ДНК. В конкретных вариантах осуществления трансфицированная мРНК стабилизирована за счет включения модифицированных нуклеотидных оснований или последовательностей полиаденилирования. В конкретных вариантах осуществления трансфицированная мРНК связана с по меньшей мере одним проникающим в клетку пептидом. В конкретных вариантах осуществления способа эндонуклеаза экспрессируется с ДНК вектора. Экспрессия эндонуклеазы может быть индуцирована в то время, когда гид-РНК продуцируется в клетке. В конкретных вариантах осуществления ДНК вектор не интегрируется в геном. ДНК вектор может представлять собой эписомный вектор, искусственную хромосому или транспозон. В конкретных вариантах осуществления гид-РНК представляет собой транскрипт с ДНК вектора. В конкретных вариантах осуществления белок Cas представляет собой очищенный рекомбинантный белок, находящийся в комплексе ex vivo с гид-РНК и/или ДНК-нацеленным конструктом, содержащим определенные мутации. В конкретных вариантах осуществления комплекс Cas/гРНК или плазмиду вводят в клетку методом электропорации.

В конкретных вариантах осуществления по меньшей мере один отвечающий за иммуногенность ген-мишень представляет собой один или более генов, контролирующих MHC класса I. В конкретных вариантах осуществления по меньшей мере один отвечающий за иммуногенность ген-мишень представляет собой один или более генов, контролирующих MHC класса II. В конкретных вариантах осуществления по меньшей мере один отвечающий за иммуногенность ген-мишень представляет собой один или более генов, контролирующих MHC класса I и MHC класса II. В конкретных вариантах осуществления по меньшей мере один локус-мишень может представлять собой ген HLA. В конкретных вариантах осуществления ген HLA выбирают из группы, состоящей из HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DRB3/4/5, гена семейства HLA-DQ (например, HLA-DQA1 и/или HLA-DQB1) и гена семейства HLA-DP (например, HLA-DPA1 и/или HLA-DPA2).

В конкретных вариантах осуществления супрессия MHC в БПК (например, ОПК) позволяет разрабатывать готовый к применению генетически модифицированный/регенеративный медицинский препарат аллогенной ткани для лечения хронической почечной недостаточности (ХПН). В конкретных вариантах осуществления модифицированные БПК (например, модифицированные ОПК, такие как универсальные донорские ОПК) создают путем нокдауна MHC класса I на поверхности ОПК. В конкретных вариантах осуществления используют генное редактирование (такое как генное редактирование при помощи CRISPR/Cas9) для оказания воздействия (например, внесения мутации, например, путем частичной или полной делеции, или путем редактирования пар оснований, или путем введения экзогенного элемента ДНК, такого как селективный маркер и/или модифицированный геномный фрагмент) на компонент B2M или HLA-A (α-субъединица) комплекса MHC класса I.

В конкретных вариантах осуществления способа генетически модифицированные БПК размножают in vitro. В конкретных вариантах осуществления способ используют для получения БПК или ОПК, используемых в качестве лечебного препарата. В конкретных вариантах осуществления способ используют для получения БПК или ОПК для лечения хронической почечной недостаточности у пациента, который нуждается в этом.

В одном из аспектов предложена популяция генетически модифицированных БПК или ОПК, получаемых способом по настоящему изобретению.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу лечения пациента, включающему (a) получение популяции генетически модифицированных БПК или ОПК способом, описанным выше; и (b) введение генетически модифицированных БПК или ОПК пациенту. В конкретных вариантах осуществления у пациента диагностирована хроническая почечная недостаточность. В конкретных вариантах осуществления БПК или ОПК получены от пациента, который будет получать лечение. В конкретных вариантах осуществления БПК или ОПК получены от одного или более доноров.

В одном из аспектов популяция биоактивных почечных клеток получена путем выделения и размножения почечных клеток из почечной ткани в условиях культивирования, приводящих к обогащению по клеткам, способным обеспечивать регенерацию почки. В конкретных вариантах осуществления популяция биоактивных почечных клеток получена после воздействия гипоксических условий культивирования. В конкретных вариантах осуществления популяция БПК представляет собой популяцию ОПК, полученную после разделения в градиенте плотности размноженных почечных клеток. В конкретных вариантах осуществления ОПК имеют плавучую плотность, превышающую примерно 1,04, 1,0419 или 1,045 г/мл. В конкретных вариантах осуществления популяция БПК или ОПК содержит большую процентную долю одного или более типов клеток и лишена, или содержит меньшее количество, одного или более других типов клеток, в сравнении с исходной популяцией почечных клеток. В конкретных вариантах осуществления кинетику клеточного роста популяции БПК или ОПК можно контролировать при каждом пересеве. Например, количество и жизнеспособность БПК или ОПК можно контролировать методом с исключением красителя трипанового синего и методом анализа метаболизма PrestoBlue. В конкретных вариантах осуществления БПК или ОПК могут быть охарактеризованы на основании фенотипической экспрессии определенных маркеров жизнеспособности и функциональности, например, CK18 и GGT1. В конкретных вариантах осуществления продуцированные VEGF и KIM-1 можно использовать в качестве маркеров наличия жизнеспособных и функциональных БПК или ОПК. В конкретных вариантах осуществления жизнеспособность и функциональность можно определять путем профилирования генной экспрессии или измерения ферментативной активности. В конкретных вариантах осуществления БПК или ОПК характеризуют путем измерения ферментативной активности для LAP и/или GGT.

Настоящее изобретение охватывает, но не ограничивается ими, выделенные клетки или клеточные популяции, имеющие генетические модификации, описанные в настоящем документе (например, в кратком изложении, подробном описании, примерах и на фигурах), а также любые из белков, полипептидов или векторов, полезных для осуществления генетической модификации почечных клеток с целью придания им меньшей иммуногенности (например, иммунологической привилегированности). Модифицированные почечные клетки, предложенные по настоящему изобретению, можно использовать в качестве терапевтических препаратов, в идеале, в качестве «готового к применению» препарата (например, который можно использовать для многих, если не для большинства или всех, пациентов) в способах лечения или предотвращения хронической почечной недостаточности.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

ФИГ. 1: Представлена блок-схема технологического процесса производства генетически модифицированных человеческих аллогенных почечных клеток, предназначенных для использования в лечении хронической почечной недостаточности.

ФИГ. 2: Представлена блок-схема для неограничивающего примера полного процесса производства NKA.

ФИГ. 3A-D: Представлены более подробные блок-схемы для неограничивающего примера процесса, представленного на ФИГ. 2.

ФИГ. 4: Схематическое изображение комплекса MHC класса I.

ФИГ. 5: Геномный каркас в области гена B2M с изображением сайта связывания гид-РНК.

ФИГ. 6: Результаты FACS-анализа, показывающие опосредованный CRISPR/Cas9 нокдаун B2M (неизменной субъединицы MHC-I) в человеческих первичных почечных клетках.

ФИГ. 7: Результаты FACS-анализа, показывающие опосредованный CRISPR/Cas9 нокдаун B2M (неизменной субъединицы MHC-I) в человеческих первичных почечных клетках.

ФИГ. 8: Результаты анализа расщепления генома, демонстрирующие успешное редактирование гена в локусе B2M. Показанный блот представляет собой окрашенный бромидом этидия гель с ДНК, черный/белый цвета инвертированы для четкости изображения. В неограничивающих примерах анализ расщепления генома или прямое секвенирование локуса-мишени можно использовать для подтверждения направленной модификации генома.

ФИГ. 9: Результаты FACS-анализа, демонстрирующие опосредованное CRISPR редактирование локуса B2M в ОПК. Обратите внимание на разные гаплотипы ABO доноров, это указывает на возможность проводить генное редактирование MHC I независимо от гаплотипа ABO:

донор тип крови TCHK006 O(+) TCHK011 AB(-) TCHK004 O(-)

ФИГ. 10: График, построенный по результатам анализа пролиферации лимфоцитов, показывающий, что ОПК с CRISPR-модифицированным B2M вызывают уменьшение пролиферации лимфоцитов, в сравнении с не модифицированными контрольными ОПК, это является доказательством того, что направленное воздействие CRISPR на B2M приводит к снижению иммуногенности CRISPR-модифицированных ОПК.

ФИГ. 11: График, построенный по результатам анализа активности, в котором тестировали ОПК с CRISPR-модифицированным B2M, показывающий отсутствие существенных отличий в секреции VEGF и KIM1 у модифицированных и не модифицированных ОПК. Модификация за счет CRISPR не влияет на функциональность ОПК.

ФИГ. 12: Схематическое изображение комплекса HLA MHC на хромосоме 6 человека.

ФИГ. 13: Изображение, показывающее морфологию иллюстративных человеческих почечных клеток в культуре.

ФИГ. 14: Изображение, показывающее разделение на полосы иллюстративных ОПК при центрифугировании через границу между фазами с разной плотностью.

ФИГ. 15: График, показывающий иллюстративный температурный профиль гелеобразования для раствора желатина.

ФИГ. 16: График, показывающий иллюстративное распределение клеток в зависимости от времени вращения в процессе гелеобразования NKA.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение, в частности, относится к препаратам и способам для получения популяций почечных клеток, которые могут быть использованы для многих пациентов. В конкретных вариантах осуществления популяции клеток являются менее иммуногенными, чем популяции, из которых они получены. В конкретных вариантах осуществления используют генное редактирование для получения популяции аллогенных почечных клеток с целью введения пациентам без применения иммуносуппрессии. Настоящее изобретение относится к подходящим донорским клеткам из разных типов тканей, или от разных доноров, которые могут быть успешно трансплантированы субъектам-реципиентам независимо от отличий гаплотипов по отвечающим за иммуногенность генам.

В идеале, было бы желательно использовать стандартизированную терапию, в которой аллогенные терапевтические клетки можно было бы предварительно производить, подробно характеризовать и предоставлять для немедленного введения пациентам. К сожалению, доступность подходящих донорских клеток с совпадающими аллелями в одном или более локусах отвечающих за иммуногенность генов ограничена вследствие гетерогенности гаплотипов в человеческих популяциях. Например, HLA представляют собой отвечающие за иммуногенность гены, которые были впервые идентифицированы в процессе ранних клинических процедур по трансплантации гемопоэтических стволовых клеток/клеток-предшественников (HSCT) костного мозга. Несовпадение HLA у донора и реципиента может вызывать иммунные реакции, когда T-клетки реципиента могут воспринимать введенную в организм донорскую аллогенную ткань, как чужеродную, вследствие узнавания белков HLA или специфических для донора антигенов, экспрессированных или представленных на поверхности аллогенных донорских клеток, что в итоге приводит к отторжению трансплантата. (Bhatia S. Expert Rev Hematol. 2011; 4(4):437-452; Garnett C, et al. TherAdv Hematol. 4(6): 366-78 (2013)). Несмотря на успехи медицины в области подавления иммунных ответов против аллогенных трансплантированных донорских клеток, сохраняется потребность в дополнительных способах и композициях, способных уменьшать отторжение и/или повышать иммунологическую совместимость донорских клеток. Что особенно важно, сохраняется потребность в повышении доступности подходящих донорских клеток, которые могут быть успешно трансплантированы субъектам-реципиентам независимо от отличий гаплотипов по отвечающим за иммуногенность генам.

Одним из подходов к преодолению иммунологического барьера для трансплантации клеток являются генетические манипуляции с молекулами HLA. За счет использования нуклеаз «цинковые пальцы» Torikai с соавторами избирательно элиминировали человеческий лейкоцитарный антиген (HLA) класса I в эмбриональных стволовых клетках (ЭСК) и продемонстрировали, что HLA-A клетки могут избегать лизиса со стороны HLA-рестрицированных цитотоксических T-лимфоцитов. (Oberg L et al., Eur J Immunol., 2004, 34(6): 1646-1653). В другом исследовании Riolobos с соавторами разрушили ген B2M, который кодирует вспомогательную цепь молекул MHC класса I и необходим для их экспрессии на поверхности (Laura Riolobos et al., 2013, 21(6): 1232-1241). Гомозиготная делеция гена B2M предотвращала транслокацию на поверхность молекул человеческого лейкоцитарного антигена (HLA) класса I и приводила к снижению иммуногенности. Совсем недавно открытие и применение системы CRISPR/Cas9 в клетках млекопитающих позволило производить эффективное и точное редактирование генов-мишеней, например, за счет негомологичного соединения концов (NHEJ), гомологичной репарации (HDR) или других путей репарации ДНК. (Gasiunas, Barrangou et al. 2012; Jinek, Chylinski et al. 2012). Совместная доставка молекулы Cas9 и специфичной для мишени молекулы гид-РНК (гРНК) обеспечивает генное редактирование последовательности-мишени в геноме. Таким образом, использование системы CRISPR/Cas9 для модификации генов в клетках также является многообещающей стратегией для повышения иммунологической совместимости донорских клеток, предназначенных для трансплантации субъекту-реципиенту. (WO2016201047 A1).

Результаты экспериментов, относящихся к иммуногенности клеток одного типа (таких как эмбриональные стволовые клетки), нельзя предсказуемо применять или переносить на другие клетки (такие как почечные клетки). Удивительно, но нокаут в некоторой степени экспрессии B2M также приводит к снижению иммуногенности популяции почечных клеток. Более того, снижение иммуногенности имело место несмотря на то, что некоторая экспрессия B2M сохранялась в популяции модифицированных клеток. Настоящее изобретение включает технологии генного редактирования для модификации адаптивной иммунной системы БПК (таких как ОПК) с целью создания универсальных донорских клеток для лечения заболевания почек. В конкретных вариантах осуществления иммуногенность представляет собой способность инициировать адаптивный (например, опосредованный T-клетками) иммунный ответ.

Аспекты настоящего изобретения относятся, по меньшей мере частично, к тому открытию, что ОПК от донора с одним гаплотипом могут быть генетически модифицированы для уменьшения их иммуногенности у субъектов с другим гаплотипом. Настоящее изобретение относится к генетически модифицированным ОПК, которые могут быть успешно трансплантированы субъектам-реципиентам независимо от отличий гаплотипов по отвечающим за иммуногенность генам, а также к способам и препаратам для лечения заболеваний почек такими модифицированными ОПК.

Далее будут подробно описаны некоторые варианты осуществления изобретения. Хотя изобретение будет описано на примере иллюстративных вариантов осуществления, следует понимать, что изобретение не должно быть ограничено данными вариантами осуществления. Напротив, изобретение должно охватывать все альтернативные варианты, модификации и эквиваленты, которые могут быть включены в объем настоящего изобретения на основании формулы изобретения. Специалистам в данной области известно множество способов и материалов, аналогичных или эквивалентных тем, которые описаны в настоящем документе, и которые могут быть использованы при осуществлении на практике настоящего изобретения. Настоящее изобретение никоим образом не ограничено описанными способами и материалами.

Все литературные источники, цитированные в заявке, специально включены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме. В случае, если один или более из включенных литературных источников, патентов и аналогичных материалов отличается, или противоречит настоящей заявке, включая, но без ограничения, определенные термины, использование терминов, описанные методики, или тому подобное, настоящая заявка имеет преимущественную силу.

Определения

Если нет иных указаний, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то значение, которое им обычно придают специалисты в области, к которой относится настоящее изобретение. В сборнике Principles of Tissue Engineering, 3rd Ed. (под редакцией R Lanza, R Langer, & J Vacanti), 2007, специалист в данной области может найти общее руководство для понимания многих терминов, используемых в настоящей заявке. Специалист в данной области понимает, что многие способы и материалы, аналогичные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем документе, могут быть использованы при осуществлении на практике настоящего изобретения. Действительно, настоящее изобретение никоим образом не ограничено описанными способами и материалами.

При использовании в настоящем документе форма единственного числа терминов должна включать также и соответствующую форму множественного числа, если из контекста четко не следует иное. При использовании в настоящем документе термин «и/или» включает любые, и все, сочетания одного или более из связанных перечисленных объектов.

При использовании в настоящей спецификации и формуле изобретения слова «содержать», «содержащий», «включать», «включая» и «включает» должны указывать на присутствие указанных признаков, целых чисел, компонентов или этапов, но они не должны исключать присутствие, или добавление, одного или более других признаков, целых чисел, компонентов, этапов или их групп.

Используемый в настоящем документе термин «примерно» в контексте числового значения или диапазона означает ±10% от указанного или заявленного числового значения или диапазона, если только контекст не подразумевает более ограниченный диапазон.

Используемый в настоящем документе термин «популяция клеток» означает некоторое количество клеток, полученных путем выделения непосредственно из подходящей исходной ткани, как правило, ткани млекопитающего. Например, популяция клеток может включать популяции почечных клеток и их смеси. Выделенную популяцию клеток затем можно культивировать in vitro. Специалисты в данной области понимают, что можно использовать различные способы выделения и культивирования популяций клеток, используемых по настоящему изобретению, и различное количество клеток в популяции клеток, подходящих для использования по настоящему изобретению. Популяция клеток может представлять собой не фракционированную, гетерогенную популяцию клеток или обогащенную гомогенную популяцию клеток, полученных из органа или ткани, например, из почки. Например, гетерогенная популяция клеток может быть выделена из биопсийного образца ткани или из ткани целого органа. Альтернативно, гетерогенная популяция клеток может быть получена из in vitro культур клеток млекопитающих, созданных из биопсийных образцов ткани или из ткани целого органа. Не фракционированную гетерогенную популяцию клеток также можно называть необогащенной популяцией клеток. В конкретных вариантах осуществления популяции клеток содержат биоактивные клетки. Гомогенные популяции клеток содержат большее количество клеток одного и того же клеточного типа, имеющих общий фенотип или имеющих сходные физические свойства, в сравнении с не фракционированной, гетерогенной популяцией клеток. Например, гомогенная популяция клеток может быть выделена, извлечена или обогащена из гетерогенной популяции почечных клеток. В конкретных вариантах осуществления гомогенную популяцию клеток получают в виде фракции клеток при разделении гетерогенной клеточной суспензии методом центрифугирования через границу, барьер или интерфейс между фазами с разной плотностью. В конкретных вариантах осуществления гомогенную популяцию клеток получают в виде фракции клеток при разделении гетерогенной клеточной суспензии методом разделения в непрерывном или прерывистом (одноступенчатом или многоступенчатом) градиенте плотности. В конкретных вариантах осуществления гомогенную или гетерогенную популяцию клеток, полученных из почки, смешивают с гомогенной или гетерогенной популяцией клеток, полученных из ткани или органа, отличного от почки, без дополнительного ограничения.

Используемый в настоящем документе термин «биоактивные» означает «обладающие биологической активностью», например, фармакологической или терапевтической активностью. В конкретных вариантах осуществления биологическая активность представляет собой улучшение почечной функции и/или оказание влияния на почечный гомеостаз. В конкретных вариантах осуществления биологическая активность представляет собой, без ограничения, анальгетическую; противовирусную; противовоспалительную; антинеопластическую; иммуностимулирующую; иммуномодулирующую активность; повышение жизнеспособности клеток, антиоксидантную активность, способность к переносу кислорода, рекрутингу клеток, прикреплению клеток, иммуносупрессии, ангиогенезу, ранозаживляющую активность, мобилизацию стволовых клеток или клеток-предшественников хозяина, способность к пролиферации клеток, стимуляции миграции клеток к поврежденным участкам, ослаблению клеточного и тканевого фиброза, интерференции с каскадом сигнализации эпителиально-мезенхимального перехода, секреции цитокинов, факторов роста, белков, нуклеиновых кислот, активность в отношении экзосом, микровезикул, или любое их сочетание.

Используемый в настоящем документе термин «биоактивные почечные клетки», или «БПК», означает почечные клетки, имеющие одно или более из следующих свойств при введении их в почку субъекта: способность уменьшать (например, замедлять или останавливать) ухудшение состояния или прогрессирование хронической почечной недостаточности или ее симптома, способность улучшать почечную функцию, способность оказывать влияние на (улучшать) почечный гомеостаз и способность стимулировать заживление, восстановление и/или регенерацию почечной ткани или почки. В конкретных вариантах осуществления БПК генетически модифицированы (например, геномно модифицированы и/или модифицированы посредством РНКи) таким образом, что они являются менее иммуногенными в организме пациента, чем они были бы без генетической модификации. В конкретных вариантах осуществления БПК можно вводить пациенту независимо от гаплотипа пациента. В конкретных вариантах осуществления БПК представляют собой генетически модифицированные (например, геномно модифицированные и/или модифицированные посредством РНКи) иммунологически привилегированные клетки, способные улучшать почечную функцию, оказывать влияние на (улучшать) почечный гомеостаз и/или стимулировать заживление, восстановление и/или регенерацию почечной ткани или почки, без иммунологического отторжения. В конкретных вариантах осуществления эти клетки могут включать функциональные клетки почечных канальцев (например, на основании улучшения экскреции креатинина и удержания белка), гломерулярные клетки (например, на основании улучшения удержания белка), сосудистые клетки и другие клетки кортикомедуллярного соединения. В конкретных вариантах осуществления БПК получают путем выделения и размножения почечных клеток из почечной ткани. В конкретных вариантах осуществления БПК получают путем выделения и размножения почечных клеток из почечной ткани с использованием способов, позволяющих отбирать биоактивные клетки (например, клетки с регенеративной способностью). В конкретных вариантах осуществления БПК оказывают регенеративное действие на почку. В конкретных вариантах осуществления БПК включают, состоят в основном из, или состоят из отобранных почечных клеток (ОПК). В конкретных вариантах осуществления БПК представляют собой ОПК. Способы получения биоактивных почечных клеток (БПК) описаны, например, в Presnell et al. WO/2010/056328, Ilagan et al. PCT/US2011/036347 и Jain et al. PCT/US2016/044866.

В конкретных вариантах осуществления ОПК представляют собой клетки, полученные путем выделения и размножения почечных клеток из соответствующей почечной ткани, при этом ОПК содержат большую процентную долю одного или более типов клеток и лишены, или содержат более низкую процентную долю, одного или более других типов клеток, в сравнении с исходной популяцией почечных клеток. В конкретных вариантах осуществления ОПК содержат повышенную процентную долю БПК в сравнении с исходной популяцией почечных клеток. В конкретных вариантах осуществления популяция ОПК представляет собой выделенную популяцию почечных клеток, обогащенную по конкретным биоактивным компонентам и/или типам клеток, и/или истощенную по конкретным неактивным и/или нежелательным компонентам или типам клеток, предназначенную для использования в лечении заболевания почек, то есть, для обеспечения стабилизации и/или улучшения и/или восстановления почечной функции. В конкретных вариантах осуществления ОПК генетически модифицированы (например, геномно модифицированы и/или модифицированы посредством РНКи) таким образом, что они являются менее иммуногенными в организме пациента, чем они были бы без генетической модификации. В конкретных вариантах осуществления ОПК можно вводить пациенту независимо от гаплотипа пациента. В конкретных вариантах осуществления ОПК были генетически модифицированы (например, геномно модифицированы и/или модифицированы посредством РНКи), чтобы они стали иммунологически привилегированными или неспособными вызывать отторжение и способными обеспечивать стабилизацию и/или улучшение, и/или восстановление почечной функции. ОПК обеспечивают превосходные терапевтические и регенеративные результаты, в сравнении с исходной популяцией. В конкретных вариантах осуществления ОПК получают из ткани коркового слоя почки пациента путем биопсии почки. В конкретных вариантах осуществления ОПК отбирают (например, методом MACS или FACS) на основании экспрессии ими одного или более маркеров. В конкретных вариантах осуществления ОПК истощают (например, методом MACS или FACS) по одному или более типам клеток на основании экспрессии одного или более маркеров на этих типах клеток. В конкретных вариантах осуществления истощение или отбор клеток включает связывание с гранулой/антителом для извлечения клеток с определенными белками на их клеточной поверхности. В конкретных вариантах осуществления ОПК выбраны из популяции биоактивных почечных клеток. В конкретных вариантах осуществления ОПК отбирают путем разделения в градиенте плотности размноженных почечных клеток. В конкретных вариантах осуществления ОПК отбирают путем разделения размноженных почечных клеток методом центрифугирования через границу, барьер или интерфейс между фазами с разной плотностью, или путем разделения в прерывистом одноступенчатом градиенте плотности. В конкретных вариантах осуществления ОПК отбирают путем разделения в непрерывном или прерывистом градиенте плотности размноженных почечных клеток, которые были культивированы в гипоксических условиях. В конкретных вариантах осуществления ОПК отбирают путем разделения в градиенте плотности размноженных почечных клеток, которые были культивированы в гипоксических условиях в течение по меньшей мере примерно 8, 12, 16, 20 или 24 часов. В конкретных вариантах осуществления ОПК отбирают путем разделения методом центрифугирования через границу, барьер или интерфейс между фазами с разной плотностью размноженных почечных клеток, которые были культивированы в гипоксических условиях. В конкретных вариантах осуществления ОПК отбирают путем разделения размноженных почечных клеток, которые были культивированы в гипоксических условиях в течение по меньшей мере примерно 8, 12, 16, 20 или 24 часов, методом центрифугирования через границу, барьер или интерфейс между фазами с разной плотностью (например, разделения в прерывистом одноступенчатом градиенте плотности). В конкретных вариантах осуществления ОПК состоят в основном из клеток почечных канальцев. В конкретных вариантах осуществления другие паренхиматозные (например, сосудистые) и стромальные (например, собирающих протоков) клетки могут присутствовать в ОПК. В конкретных вариантах осуществления менее примерно 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1% клеток в популяции ОПК представляют собой сосудистые клетки. В конкретных вариантах осуществления менее примерно 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1% клеток в популяции ОПК представляют собой клетки собирающих протоков. В конкретных вариантах осуществления менее примерно 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1% клеток в популяции ОПК представляют собой сосудистые клетки или клетки собирающих протоков. Способы получения ОПК раскрыты, например, в примере 1 настоящего документа, а также в Presnell et al. WO/2010/056328, Ilagan et al. PCT/US2011/036347 и Jain et al. PCT/US2016/044866.

Термин «естественный орган» означает орган живого субъекта. Субъект может быть здоровым или нездоровым. Нездоровый субъект может иметь заболевание, связанное с этим конкретным органом.

Термин «естественная почка» означает почку живого субъекта. Субъект может быть здоровым или нездоровым. Нездоровый субъект может иметь заболевание почек.

Термин «регенеративный эффект» означает эффект, который приносит пользу естественному органу, такому как почка. Эффект может включать, без ограничения, уменьшение степени повреждения естественного органа, либо улучшение, восстановление или стабилизацию функции, или структуры, естественного органа. Повреждение почек может иметь форму фиброза, воспаления, гломерулярной гипертрофии, атрофии и так далее, и связано с заболеванием естественного органа у субъекта.

Используемый в настоящем документе термин «смесь» в контексте популяции клеток означает сочетание выделенных обогащенных популяций клеток двух или более фенотипов, полученных из не фракционированной, гетерогенной популяции клеток. В конкретных вариантах осуществления популяции клеток по настоящему изобретению представляют собой популяции почечных клеток.

«Обогащенная» популяция клеток, или препарат, означает популяцию клеток, полученную из исходной популяции клеток органа (например, не фракционированной, гетерогенной популяции клеток), которая содержит большую процентную долю клеток определенного типа, чем процентная доля клеток этого типа в исходной популяции. Например, исходная популяция почечных клеток может быть обогащена по первой, второй, третьей, четвертой, пятой, и так далее, интересующей популяции клеток. В настоящем документе термины «популяция клеток», «препарат клеток» и «клеточный фенотип» используют взаимозаменяемо.

Используемый в настоящем документе термин «гипоксические» условия культивирования означает условия культивирования, в которых клетки имеют доступные уровни кислорода в системе культивирования, пониженные относительно стандартных условий, в которых клетки культивируют при атмосферных уровнях кислорода (примерно 21%). Не гипоксические условия в настоящем документе называют нормальными или нормоксическими условиями культивирования.

Настоящее изобретение относится к БПК (например, ОПК), которые являются «генетически модифицированными» или «генетически измененными», или были подвергнуты «геномной модификации». В конкретных вариантах осуществления такие клетки могут быть получены с использованием метода генного редактирования для удаления одного или более специфических антигенов клеточной поверхности, таких как антигены главного комплекса гистосовместимости, из популяций донорских ОПК/БПК. Можно использовать различные методы для генетической модификации таких клеток. Например, клонированная или созданная путем синтеза ДНК может быть введена, заменена или удалена для создания генетически модифицированных ОПК/БПК методами генетического редактирования с использованием генно-инженерных нуклеаз, таких как: a) система CRISPR/Cas; b) эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции (TALEN); c) нуклеазы «цинковые пальцы» (ZFN) и d) генно-инженерные мегануклеазы (хоминг-эндонуклеазы). Различные другие методы доставки полинуклеотидов, известные в данной области, могут быть подходящими для генетической модификации ОПК/БПК, такие как, например, трансфекция, электропорация, трансдукция, липофекция, использование наноинженерных веществ, таких как органически модифицированный диоксид кремния или органически модифицированный силикат (например, ормосил), методы вирусной доставки с использованием аденовирусов, ретровирусов, лентивирусов, аденоассоциированных вирусов, или другие подходящие методы.

Термин «РНК-направляемая эндонуклеаза» означает полипептид, эндонуклеазная активность и специфичность которого зависит от его связи с молекулой РНК. Полная последовательность такой молекулы РНК или, чаще, фрагмент такой молекулы РНК, который имеет последовательность длиной, предпочтительно, более 8 нуклеотидных оснований, более предпочтительно, более 10 нуклеотидных оснований, еще более предпочтительно, более 12 нуклеотидных оснований, обладает способностью узнавать последовательность-мишень в геноме. Как правило, такая молекула РНК может гибридизоваться с последовательностью-мишенью и опосредовать эндонуклеазную активность такой эндонуклеазы. Примером РНК-направляемой эндонуклеазы является Cas9 (CRISPR-ассоциированный белок 9) в виде части системы Cas9/CRISPR. Для подробного описания смотри, например, Sanders and Joung, Nature Biotechnology 32, 347–355 (2014).

Используемый в настоящем документе термин «иммуногенность» означает свойство, позволяющее веществу индуцировать поддающийся обнаружению иммунный ответ (гуморальный или клеточный) при введении субъекту (например, субъекту-человеку).

Термин «отвечающий за иммуногенность ген» охватывает гены, кодирующие антигенный белок главного комплекса гистосовместимости или минорный антиген гистосовместимости. В конкретных вариантах осуществления отвечающий за иммуногенность ген представляет собой любой из, или любое сочетание из, генов B2M, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRA, HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DPA1, HLA-DPA2, HLA-DQA1 и/или HLA-DQB1. В конкретных вариантах осуществления отвечающий за иммуногенность ген представляет собой ген, кодирующий белок, выбранный из группы, состоящей из B2M, HLA-A, HLA-B, HLA-C, представителя семейства HLA-DR (например, HLA-DRA, HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4 и/или HLA-DRB5), представителя семейства HLA-DP (например, HLA-DPA1 и/или HLA-DPA2) и представителя семейства HLA-DQ (например, HLA-DQA1 и/или HLA-DQB1).

Термин «иммунологически совместимая почечная клетка», или «популяция иммунологически совместимых почечных клеток», охватывает почечную клетку, или популяцию клеток, лишенную одного или более аллелей гена, кодирующего антигенный белок главного комплекса гистосовместимости и/или минорный антиген гистосовместимости, который делает клетку иммунологически узнаваемой. В конкретных вариантах осуществления иммунологически совместимая почечная клетка, или популяция иммунологически совместимых почечных клеток, представляет собой почечную клетку, или популяцию клеток, лишенную одного или более аллелей гена, кодирующего B2M. В конкретных вариантах осуществления иммунологически совместимая почечная клетка, или популяция иммунологически совместимых почечных клеток, представляет собой почечную клетку, или популяцию клеток, лишенную одного или более аллелей любого из, или любого сочетания из, генов B2M, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRA, HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DPA1, HLA-DPA2, HLA-DQA1 и/или HLA-DQB1. В конкретных вариантах осуществления иммунологически совместимые почечные клетки, введенные субъекту-реципиенту, являются иммунологически привилегированными и не индуцируют иммунный ответ у субъекта-реципиента.

Используемый в настоящем документе термин «биологический материал» означает природный или синтетический биосовместимый материал, подходящий для введения в живую ткань, поддерживающую отобранные биоактивные клетки в жизнеспособном состоянии. Природный биологический материал представляет собой материал, который создан в живой системе, или происходит из нее. Синтетические биологические материалы представляют собой материалы, которые непосредственно не созданы в живой системе, или не происходят из нее, но являются синтезированными или полученными с использованием определенных химических процедур и протоколов, хорошо известных специалистам в данной области. Биологические материалы, раскрытые в настоящем документе, могут представлять собой сочетание природных и синтетических биосовместимых материалов. Описанные в настоящем документе биологические материалы включают, например, полимерные матрицы и каркасы. Специалисты в данной области понимают, что биологический материал(ы) может быть сконфигурирован в различных формах, например, в виде поропласта, гелей, жидкостей, гранул, твердых веществ, и может содержать один или более природных или синтетических биосовместимых материалов. В конкретных вариантах осуществления биологический материал представляет собой раствор в жидкой форме, который способен превращаться в гидрогель.

Используемый в настоящем документе термин «гидрогель» означает вещество, образующееся, когда в органическом полимере (природном или синтетическом) происходит перекрестная сшивка за счет ковалентных, ионных или водородных связей, с образованием трехмерной структуры с открытой решеткой, которая захватывает воду, образуя гель. Примеры материалов, которые можно использовать для получения гидрогеля, включают полисахариды, такие как альгинат, полифосфазины и полиакрилаты, которые сшиты тонически, или блок-сополимеры, такие как плюроники™ или тетроники™, блок-сополимеры полиэтиленоксида и полипропиленгликоля, сшивки в которых образуются за счет температуры или pH, соответственно. Гидрогель, используемый в настоящем документе, предпочтительно представляет собой биоразлагаемый желатиновый гидрогель.

Описанные в настоящем документе биологические материалы включают, например, внеклеточный матрикс, полученный из почки человека или животного, при этом естественная популяция клеток была элиминирована за счет применения детергентов и/или других химических веществ, известных специалистам в данной области. В конкретных вариантах осуществления биологический материал представляет собой раствор в жидкой форме, который способен превращаться в гидрогель и образует слои с содержанием, или без содержания, определенных популяций клеток за счет применения методологии трехмерной биопечати, известной специалистам в данной области. В конкретных вариантах осуществления биологический материал сконфигурирован для имитации трехмерной фрактальной организации почки, лишенной клеток.

Термин «модифицированное высвобождение» или эквивалентные термины «контролируемое высвобождение», «отсроченное высвобождение» или «замедленное высвобождение» относятся к препаратам, которые высвобождают активное средство, такое как биоактивные клетки, на протяжении некоторого времени или в более, чем один момент времени, после введения индивидууму. Модифицированное высвобождение активного средства, которое может происходить в течение целого ряда желаемых промежутков времени, например, минут, часов, дней, недель, или более длительных периодов времени, в зависимости от препарата, отличается от высвобождения стандартных препаратов, в которых практически вся единица дозы становится доступной непосредственно после введения. Для применения в тканевой инженерии и регенеративной медицине предпочтительные препараты с модифицированным высвобождением обеспечивают высвобождение активного средства в нескольких временных точках после локального введения (например, введения активного средства непосредственно в солидный орган). Например, препарат с модифицированным высвобождением биоактивных клеток обеспечивал бы первоначальное высвобождение клеток непосредственно в момент введения и последующее, второе, высвобождение клеток в более позднее время. Отсрочка по времени для второго высвобождения активного средства может составлять несколько минут, часов или дней после первоначального введения. Как правило, период времени для отсрочки высвобождения соответствует периоду времени, необходимому для того, чтобы биологический материал - носитель активного средства потерял свою структурную целостность. Отсроченное высвобождение активного средства начинается сразу после начала нарушения такой целостности и завершается к моменту времени, когда целостность нарушается полностью. Специалистам в данной области известны и другие подходящие механизмы высвобождения.

Термин «температура окружающей среды» означает температуру, при которой препараты по настоящему изобретению будут введены субъекту. Как правило, температура окружающей среды представляет собой температуру помещения с контролируемой температурой. Температура окружающей среды находится в диапазоне от примерно 18°C до примерно 30°C. В конкретных вариантах осуществления температура окружающей среды составляет примерно 18°C, примерно 19°C, примерно 20°C, примерно 21°C, примерно 22°C, примерно 23°C, примерно 24°C, примерно 25°C, примерно 26°C, примерно 27°C, примерно 28°C, примерно 29°C или примерно 30°C.

Используемый в настоящем документе термин «заболевание почек» означает заболевания, ассоциированные с любой стадией или степенью тяжести острой или хронической почечной недостаточности, которая приводит к утрате почкой способности выполнять функцию фильтрования крови и удаления избытка жидкости, электролитов и продуктов распада из крови. Заболевание почек также может включать эндокринные дисфункции, такие как анемия (недостаток эритропоэтина) и минеральный дисбаланс (недостаток витамина D). Заболевание почек может изначально развиваться в почках, или может быть вторичным по отношению к различным состояниям, включая (но без ограничения,) сердечную недостаточность, гипертензию, диабет, аутоиммунное заболевание или заболевание печени. Заболевание почек может представлять собой состояние хронической почечной недостаточности, которое развивается после острого повреждения почки. Например, повреждение почки вследствие ишемии и/или воздействия токсических веществ может вызывать острую почечную недостаточность; неполное восстановление после острого повреждения почки может приводить к развитию хронической почечной недостаточности.

Термин «лечение» означает как терапевтическое лечение, так и профилактические или превентивные меры в отношении, заболевания почек, анемии, нарушений канальцевого транспорта или нарушений гломерулярной фильтрации, при этом целью является обращение вспять, предотвращение или замедление (облегчение) целевого заболевания. Нуждающиеся в лечении субъекты включают тех, которые уже имеют заболевание почек, анемию, нарушение канальцевого транспорта или нарушение гломерулярной фильтрации, а также тех, которые предрасположены к развитию заболевания почек, анемии, нарушения канальцевого транспорта или нарушения гломерулярной фильтрации, или тех, у кого заболевание почек, анемия, нарушение канальцевого транспорта или нарушение гломерулярной фильтрации должно быть предотвращено. Используемый в настоящем документе термин «лечение» включает стабилизацию и/или улучшение почечной функции.

Используемый в настоящем документе термин «контактирование in vivo» означает прямой контакт in vivo между продуктами, секретируемыми обогащенной популяцией клеток, и естественным органом. Например, продукты, секретируемые обогащенной популяцией почечных клеток (или смесью, или конструкцией, содержащей почечные клетки/фракции почечных клеток), могут in vivo контактировать с естественной почкой. Прямое контактирование in vivo по своему характеру может быть паракринным, эндокринным или юкстакринным. Секретируемые продукты могут представлять собой гетерогенную популяцию разных продуктов, описанных в настоящем документе.

Термины «конструкция» или «препарат» относятся к одной или более популяциям клеток, расположенных на внешней стороне, или на поверхности, каркаса или матрицы из одного или более синтетических или природных биосовместимых материалов. Одна или более популяций клеток могут быть покрыты, расположены на, погружены в, присоединены к, высеяны на, или заключены в биологическом материале, выполненном из одного или более синтетических или природных биосовместимых биологических материалов, полимеров, белков или пептидов. В конкретных вариантах осуществления природный биологический материал представляет собой лишенную клеток почку человека или животного. В конкретных вариантах осуществления из биологического материала была создана структура путем трехмерной биопечати. Одна или более популяций клеток могут быть объединены с биологическим материалом, либо каркасом или матрицей, in vitro или in vivo. Один или более биологических материалов, используемых для создания конструкции, или препарата, можно выбирать для управления, облегчения или создания возможности диспергирования и/или интегрирования клеточных компонентов конструкции в эндогенной ткани хозяина, или для управления, облегчения или создания возможности выживания, приживления, толерантности или функциональной активности клеточных компонентов конструкции или препарата. В конкретных вариантах осуществления один или более биосовместимых материалов, используемых для создания каркаса/биологического материала, выбирают для управления, облегчения или создания возможности образования многоклеточной трехмерной организации из по меньшей мере одной из популяций клеток, нанесенных на него. В конкретных вариантах осуществления биологические материалы управляют сборкой определенных трехмерных клеточных агрегатов, или органоидов, которые повторяют аспекты естественной почечной ткани, включая, но без ограничения, организационную полярность. В конкретных вариантах осуществления биологические материалы управляют сборкой определенных канальцевых структур, которые повторяют аспекты естественной почечной ткани, включая просветы. В конкретных вариантах осуществления биологические материалы стимулируют или облегчают секрецию белков, нуклеиновых кислот и связанных с мембраной везикул из популяций клеток, нанесенных на них. Как правило, один или более биологических материалов, используемых для создания конструкции, также могут быть выбраны для имитации или повторения аспектов конкретной трехмерной организации или экологической ниши внутри естественной почки или почечной паренхимы, представляющей оригинальную биологическую среду, из которой эти популяции клеток были получены. Считается, что воссоздание оригинальной биологической ниши, которая служила источником этих популяций клеток, дополнительно стимулирует или способствует выживанию и активности клеток.

Термин «клеточный агрегат», или «сфероид», означает агрегат или совокупность клеток, культивируемых для достижения 3D роста, в отличие от роста в виде монослоя. Следует отметить, что термин «сфероид» не означает, что агрегат представляет собой геометрическую сферу. Агрегат может быть высокоорганизован с четко определенной морфологией и полярностью, или может представлять собой неорганизованную массу; он может включать один тип клеток или более одного типа клеток. Клетки могут представлять собой первичные изоляты или стабильную линию клеток, или сочетания обоих вариантов. Данное определение охватывает органоиды и органотипические культуры. В конкретных вариантах осуществления сфероиды (например, клеточные агрегаты или органоиды) образуются во вращающейся колбе. В конкретных вариантах осуществления сфероиды (например, клеточные агрегаты или органоиды) образуются в 3-мерной матрице.

Термин «Neo-Kidney Augment (NKA)» относится к биоактивному клеточному препарату, который представляет собой инъекционный препарат, состоящий из отобранных почечных клеток (ОПК), сформулированных в биологическом материале, состоящем из желатинового гидрогеля. Термин «прогрессивная клеточная терапия» («Advance Cell Therapy (ACT)») также используют применительно к лечению препаратом NKA. В конкретных вариантах осуществления NKA представляет собой инъекционный препарат, содержащий популяцию иммунологически совместимых почечных клеток (например, иммунологически совместимых ОПК), сформулированных в биологическом материале, состоящем из желатинового гидрогеля. В конкретных вариантах осуществления NKA представляет собой инъекционный препарат, состоящий из геномно модифицированных иммунологически привилегированных, гомологичных ОПК, неспособных вызывать иммунное отторжение, сформулированных в биологическом материале, состоящем из желатинового гидрогеля.

Термин «субъект» должен означать любого отдельного субъекта-человека, включая пациента, подходящего для лечения, который испытывает или испытывал один или более признаков, симптомов, или других показателей заболевания почек. Такие субъекты включают, без ограничения, субъектов, которым впервые поставлен диагноз, или которым диагноз был поставлен ранее и в настоящее время они испытывают возврат или рецидив заболевания, или имеют риск развития заболевания почек, независимо от причины. Субъект мог ранее получать лечение, или не получать лечение, от заболевания почек.

Термин «пациент» означает любое отдельное животное, более предпочтительно, млекопитающее (включая таких отличных от людей животных, как, например, собаки, кошки, лошади, кролики, животные зоопарка, коровы, свиньи, овцы и приматы), которые нуждаются в лечении. Наиболее предпочтительно, пациент по настоящему изобретению является человеком.

Термин «образец», или «образец от пациента», или «биологический образец», должен, в целом, означать любой биологический образец, полученный от субъекта или пациента, жидкость организма, ткань тела, линию клеток, культуру ткани или другой источник. Термин включает биопсийные образцы ткани, такие как, например, биопсийные образцы почки. Термин включает культивированные клетки, такие как, например, культивированные клетки почки млекопитающего. Методы получения биопсийных образцов тканей и культивированных клеток от млекопитающих хорошо известны в данной области. Если термин «образец» используют отдельно, он все-еще должен означать, что «образец» представляет собой «биологический образец» или «образец от пациента», то есть, термины используют взаимозаменяемо.

Термин «тестируемый образец» означает образец от субъекта, обработанный способом по настоящему изобретению. Тестируемый образец может быть получен из разных источников в организме субъекта-млекопитающего, включая, без ограничения, кровь, сперму, сыворотку, мочу, костный мозг, слизистую оболочку, ткань и так далее.

Термин «контроль», или «контрольный образец», означает отрицательный или положительный контроль, для которого ожидают отрицательный или положительный результат, который можно сопоставлять с результатом тестируемого образца. Контроли, подходящие для настоящего изобретения, включают, без ограничения, образец, который, как известно, обладает признаками, характерными для нормальной функции почек, образец, полученный от субъекта, который, как известно, не страдает заболеванием почек, и образец, полученный от субъекта, который, как известно, страдает заболеванием почек. Кроме того, контролем может быть образец, полученный от субъекта до лечения его способом по настоящему изобретению. Дополнительным подходящим контролем может быть тестируемый образец, полученный от субъекта, который, как известно, страдает заболеванием почек любого типа или стадии, а также образец от субъекта, который, как известно, не страдает заболеванием почек какого-либо типа или стадии. Контролем может быть специально подобранный нормальный здоровый субъект. Специалистам в данной области известны и другие контроли, подходящие для использования по настоящему изобретению.

Термины «прогноз регенерации», «прогноз восстановления» или «прогноз для регенерации», как правило, относятся к прогнозу или предсказанию возможного восстановительного процесса или результата после введения или имплантации популяции, смеси или конструкции клеток, описанных в настоящем документе. В случае прогноза регенерации основанием для прогноза, или предсказания, может являться одно или более из следующего: улучшение функционирования органа (например, почки) после имплантации или введения, развитие функциональной почки после имплантации или введения, появление улучшенной функции или активности почек после имплантации или введения, а также экспрессия определенных маркеров естественной почкой после имплантации или введения.

Термин «регенерированный орган» означает естественный орган после имплантации или введения популяции, смеси или конструкции клеток, описанных в настоящем документе. Регенерированный орган характеризуется различными показателями, включая, без ограничения, развитие функции или активности в естественном органе, улучшение функции или активности в естественном органе, уменьшение определенных маркеров и физиологических показателей, ассоциированных с заболеванием, и/или экспрессия определенных маркеров в естественном органе. Специалисты в данной области понимают, что и другие показатели могут быть подходящими для характеристики регенерированного органа.

Термин «регенерированная почка» означает естественную почку после имплантации или введения популяции, смеси или конструкции клеток, описанных в настоящем документе. Регенерированная почка характеризуется различными показателями, включая, без ограничения, развитие функции или активности в естественной почке, улучшение функции или активности в естественной почке, уменьшение определенных маркеров и физиологических показателей, ассоциированных с почечной недостаточностью, и экспрессия определенных маркеров в естественной почке. Специалисты в данной области понимают, что и другие показатели могут быть подходящими для характеристики регенерированной почки.

Популяции клеток

В конкретных вариантах осуществления терапевтическая композиция, или препарат, по настоящему изобретению содержит выделенную, гетерогенную популяцию почечных клеток, которая обогащена по конкретным биоактивным компонентам или типам клеток, и/или истощена по конкретным неактивным или нежелательным компонентам или типам клеток. В конкретных вариантах осуществления такие композиции и препараты используют в лечении заболевания почек, например, для обеспечения стабилизации и/или улучшения, и/или восстановления почечной функции и/или структуры. В конкретных вариантах осуществления композиции содержат фракции выделенных почечных клеток, которые лишены клеточных компонентов в сравнении с клетками здорового индивидуума, но сохраняют терапевтические свойства, например, обеспечивают стабилизацию и/или улучшение, и/или восстановление почечной функции. В конкретных вариантах осуществления популяции клеток, описанные в настоящем документе, могут быть получены от здоровых индивидуумов, индивидуумов с заболеванием почек или субъектов, описанных в настоящем документе.

Настоящее изобретение относится к терапевтическим композициям популяций отобранных почечных клеток, которые будут введены в целевой орган, или ткань, субъекта. В конкретных вариантах осуществления популяция биоактивных отобранных почечных клеток, как правило, представляет собой популяцию клеток, потенциально обладающих терапевтическими свойствами при введении субъекту. В конкретных вариантах осуществления при введении субъекту, который нуждается в этом, популяция биоактивных почечных клеток может обеспечивать стабилизацию и/или улучшение, и/или восстановление, и/или регенерацию почечной функции у субъекта. В конкретных вариантах осуществления терапевтические свойства могут включать восстановительный или регенеративный эффект.

В конкретных вариантах осуществления популяция почечных клеток представляет собой не фракционированную, гетерогенную популяцию клеток или обогащенную гомогенную популяцию клеток, полученных из почки. В конкретных вариантах осуществления гетерогенную популяцию клеток выделяют из биопсийного образца ткани или из ткани целого органа. В конкретных вариантах осуществления популяцию почечных клеток получают из in vitro культуры клеток млекопитающих, созданной из биопсийных образцов ткани или из ткани целого органа. В конкретных вариантах осуществления популяция почечных клеток содержит подфракции или подпопуляции гетерогенной популяции почечных клеток, обогащенные по биоактивным компонентам (например, биоактивным почечным клеткам) и истощенные по неактивным или нежелательным компонентам или клеткам.

В конкретных вариантах осуществления популяция почечных клеток экспрессирует GGT и цитокератин. В конкретных вариантах осуществления GGT имеет уровень экспрессии, повышенный на примерно 10%, примерно 15%, примерно 18%, примерно 20%, примерно 25%, примерно 30%, примерно 35%, примерно 40%, примерно 45%, примерно 50%, примерно 55% или примерно 60%. В конкретных вариантах осуществления GGT представляет собой GGT-1. В конкретных вариантах осуществления клетки популяции почечных клеток экспрессируют GGT-1, цитокератин, VEGF и KIM-1. В конкретных вариантах осуществления более 18% клеток в популяции почечных клеток экспрессируют GGT-1. В конкретных вариантах осуществления более 80% клеток в популяции почечных клеток экспрессируют цитокератин. В конкретных вариантах осуществления цитокератин выбирают из CK8, CK18, CK19, а также их сочетаний. В конкретных вариантах осуществления цитокератин представляет собой CK8, CK18, CK19, CK8/CK18, CK8/CK19, CK18/CK19 или CK8/CK18/CK19, при этом «/» означает сочетание записанных рядом с этим знаком цитокератинов. В конкретных вариантах осуществления цитокератин имеет уровень экспрессии, повышенный на примерно 80%, примерно 85%, примерно 90% или примерно 95%. В конкретных вариантах осуществления более 80% клеток в популяции почечных клеток экспрессируют цитокератин. В конкретных вариантах осуществления клетки в популяции почечных клеток экспрессируют AQP2. В конкретных вариантах осуществления менее 40% клеток экспрессируют AQP2. В конкретных вариантах осуществления по меньшей мере 3% клеток в популяции почечных клеток экспрессируют AQP2.

В конкретных вариантах осуществления более 18% клеток в популяции клеток экспрессируют GGT-1, и более 80% клеток в популяции клеток экспрессируют цитокератин. В конкретных вариантах осуществления цитокератин представляет собой CK18. В конкретных вариантах осуществления от 4,5% до 81,2% клеток в популяции клеток экспрессируют GGT-1, от 3,0% до 53,7% клеток в популяции клеток экспрессируют AQP2, и от 81,1% до 99,7% клеток в популяции клеток экспрессируют CK18.

В конкретных вариантах осуществления популяция почечных клеток содержит клетки, которые экспрессируют один или более из любого сочетания биомаркеров, выбранных из AQP1, AQP2, AQP4, кальбиндина, кальпонина, CD117, CD133, CD146, CD24, CD31 (PECAM-1), CD54 (ICAM-1), CD73, CK18, CK19, CK7, CK8, CK8, CK18, CK19, сочетания из CK8, CK18 и CK19, коннексина 43, кубилина, CXCR4 (фузина), DBA, E-кадгерина (CD324), EPO (эритропоэтина) GGT1, GLEPP1 (белка гломерулярного эпителия 1), гаптоглобулина, Itgb1 (интегрина 01), KIM-1 (молекулы повреждения почек 1), T1M-1 (T-клеточный иммуноглобулин и муцин-содержащей молекулы), MAP-2 (связанного с микротрубочками белка 2), мегалина, N-кадгерина, нефрина, NKCC (котранспортеров Na-K-Cl), OAT-1 (транспортера органических ионов 1), остеопонтина, пан-кадгерина, PCLP1 (подокаликсин-подобной молекулы 1), подоцина, SMA (альфа-актина гладких мышц), синаптоподина, THP (белка Тамма-Хорсфолла), виментина и αGST-1 (альфа-глутатион-S-трансферазы).

В конкретных вариантах осуществления популяция почечных клеток обогащена по эпителиальным клеткам в сравнении с исходной популяцией, такой как популяция клеток в биопсийном образце ткани почки или первичной культуре клеток (например, популяция почечных клеток содержит по меньшей мере на примерно 5%, 10%, 15%, 20% или 25% больше эпителиальных клеток, чем исходная популяция). В конкретных вариантах осуществления популяция почечных клеток обогащена по клеткам почечных канальцев в сравнении с исходной популяцией, такой как популяция клеток в биопсийном образце ткани почки или первичной культуре клеток (например, популяция почечных клеток содержит по меньшей мере на примерно 5%, 10%, 15%, 20%, или 25% больше клеток почечных канальцев, чем исходная популяция). В конкретных вариантах осуществления клетки почечных канальцев включают клетки проксимальных почечных канальцев. В конкретных вариантах осуществления популяция почечных клеток содержит меньшую относительную долю клеток дистальных почечных канальцев, клеток собирающих протоков, эндокринных клеток, сосудистых клеток или клеток, подобных предшественникам, в сравнении с исходной популяцией. В конкретных вариантах осуществления популяция почечных клеток содержит меньшую относительную долю клеток дистальных почечных канальцев в сравнении с исходной популяцией. В конкретных вариантах осуществления популяция почечных клеток содержит меньшую относительную долю клеток собирающих протоков в сравнении с исходной популяцией. В конкретных вариантах осуществления популяция почечных клеток содержит меньшую относительную долю эндокринных клеток в сравнении с исходной популяцией. В конкретных вариантах осуществления популяция почечных клеток содержит меньшую относительную долю сосудистых клеток в сравнении с исходной популяцией. В конкретных вариантах осуществления популяция почечных клеток содержит меньшую относительную долю клеток, подобных предшественникам, в сравнении с исходной популяцией. В конкретных вариантах осуществления популяция почечных клеток содержит большую относительную долю клеток почечных канальцев и меньшие относительные доли EPO-продуцирующих клеток, гломерулярных клеток и сосудистых клеток в сравнении с необогащенной популяцией (например, исходной популяцией почечных клеток). В конкретных вариантах осуществления популяция почечных клеток содержит большую относительную долю клеток почечных канальцев и меньшие относительные доли EPO-продуцирующих клеток и сосудистых клеток в сравнении с необогащенной популяцией. В конкретных вариантах осуществления популяция почечных клеток содержит большую относительную долю клеток почечных канальцев и меньшие относительные доли гломерулярных клеток и сосудистых клеток в сравнении с необогащенной популяцией.

В конкретных вариантах осуществления клетки популяции почечных клеток экспрессируют гиалуроновую кислоту (HA). В конкретных вариантах осуществления диапазон размеров HA составляет от примерно 5 кДа до примерно 20000 кДа. В конкретных вариантах осуществления HA имеет молекулярную массу 5 кДа, 60 кДа, 800 кДа и/или 3000 кДа. В конкретных вариантах осуществления клетки популяции почечных клеток синтезируют и/или стимулируют синтез высокомолекулярной HA за счет экспрессии синтазы гиалуроновой кислоты 2 (HAS-2), особенно после имплантации в почку. В конкретных вариантах осуществления клетки популяции почечных клеток экспрессируют более высокомолекулярные формы HA in vitro и/или in vivo, вследствие активности HAS-2. В конкретных вариантах осуществления клетки популяции почечных клеток экспрессируют более высокомолекулярные формы HA как in vitro, так и in vivo, вследствие активности HAS-2. В конкретных вариантах осуществления более высокомолекулярные формы HA представляют собой HA, имеющую молекулярную массу по меньшей мере 100 кДа. В конкретных вариантах осуществления более высокомолекулярные формы HA представляют собой HA, имеющую молекулярную массу от примерно 800 кДа до примерно 3500 кДа. В конкретных вариантах осуществления более высокомолекулярные формы HA представляют собой HA, имеющую молекулярную массу от примерно 800 кДа до примерно 3000 кДа. В конкретных вариантах осуществления более высокомолекулярные формы HA представляют собой HA, имеющую молекулярную массу по меньшей мере 800 кДа. В конкретных вариантах осуществления более высокомолекулярные формы HA представляют собой HA, имеющую молекулярную массу по меньшей мере 3000 кДа. В конкретных вариантах осуществления более высокомолекулярные формы HA представляют собой HA, имеющую молекулярную массу примерно 800 кДа. В конкретных вариантах осуществления более высокомолекулярные формы HA представляют собой HA, имеющую молекулярную массу примерно 3000 кДа. В конкретных вариантах осуществления HAS-2 синтезирует HA с молекулярной массой от 2x10⁵ до 2x10⁶ Da. В конкретных вариантах осуществления образуются меньшие по размеру формы HA за счет действия деструктивных гиалуронидаз. В конкретных вариантах осуществления более высокомолекулярные формы HA представляют собой HA, имеющую молекулярную массу от примерно 200 кДа до примерно 2000 кДа. В конкретных вариантах осуществления более высокомолекулярные формы HA представляют собой HA, имеющую молекулярную массу примерно 200 кДа. В конкретных вариантах осуществления более высокомолекулярные формы HA представляют собой HA, имеющую молекулярную массу примерно 2000 кДа. В конкретных вариантах осуществления более высокомолекулярные формы HA представляют собой HA, имеющую молекулярную массу по меньшей мере 200 кДа. В конкретных вариантах осуществления более высокомолекулярные формы HA представляют собой HA, имеющую молекулярную массу по меньшей мере 2000 кДа. В конкретных вариантах осуществления более высокомолекулярные формы HA представляют собой HA, имеющую молекулярную массу по меньшей мере 5000 кДа. В конкретных вариантах осуществления более высокомолекулярные формы HA представляют собой HA, имеющую молекулярную массу по меньшей мере 10000 кДа. В конкретных вариантах осуществления более высокомолекулярные формы HA представляют собой HA, имеющую молекулярную массу по меньшей мере 15000 кДа. В конкретных вариантах осуществления более высокомолекулярные формы HA представляют собой HA, имеющую молекулярную массу примерно 20000 кДа.

В конкретных вариантах осуществления популяция содержит клетки, способные к опосредованному рецептором переносу альбумина.

В конкретных вариантах осуществления клетки популяции почечных клеток являются устойчивыми к гипоксии.

В конкретных вариантах осуществления популяция почечных клеток содержит один или более типов клеток, которые экспрессируют одно или более из любого сочетания из: мегалина, кубилина, N-кадгерина, E-кадгерина, аквапорина 1 и аквапорина 2.

В конкретных вариантах осуществления популяция почечных клеток содержит один или более типов клеток, которые экспрессируют одно или более из любого сочетания из: мегалина, кубилина, синтазы гиалуроновой кислоты 2 (HAS2), 25-гидроксилазы витамина D3 (CYP2D25), N-кадгерина (Ncad), E-кадгерина (Ecad), аквапорина 1 (Aqp1), аквапорина 2 (Aqp2), RAB17, представителя семейства онкогенов RAS (Rab17), GATA-связывающего белка 3 (Gata3), FXYD домен-содержащего регулятора транспорта ионов 4 (Fxyd4), семейства 9 переносчиков растворенных веществ (обменивающего натрий/водород), представителя 4, (Slc9a4), семейства 3 альдегиддегидрогеназ, представителя B1 (Aldh3b1), семейства 1 альдегиддегидрогеназ, представителя A3 (Aldh1a3) и кальпаина 8 (Capn8).

В конкретных вариантах осуществления популяция почечных клеток содержит один или более типов клеток, которые экспрессируют одно или более из любого сочетания из: мегалина, кубилина, синтазы гиалуроновой кислоты 2 (HAS2), 25-гидроксилазы витамина D3 (CYP2D25), N-кадгерина (Ncad), E-кадгерина (Ecad), аквапорина 1 (Aqp1), аквапорина 2 (Aqp2), RAB17, представителя семейства онкогенов RAS (Rab17), GATA-связывающего белка 3 (Gata3), FXYD домен-содержащего регулятора транспорта ионов 4 (Fxyd4), семейства 9 переносчиков растворенных веществ (обменивающего натрий/водород), представителя 4, (Slc9a4), семейства 3 альдегиддегидрогеназ, представителя B1 (Aldh3b1), семейства 1 альдегиддегидрогеназ, представителя A3 (Aldh1a3), кальпаина 8 (Capn8) и аквапорина 4 (Aqp4).

В конкретных вариантах осуществления популяция почечных клеток содержит один или более типов клеток, которые экспрессируют одно или более из любого сочетания из: аквапорина 7 (Aqp7), FXYD домен-содержащего регулятора транспорта ионов 2 (Fxyd2), семейства 17 переносчиков растворенных веществ (фосфата натрия), представителя 3 (Slc17a3), семейства 3 переносчиков растворенных веществ, представителя 1 (Slc3a1), клаудина 2 (Cldn2), аспартат-пептидазы напсина A (Napsa), семейства 2 переносчиков растворенных веществ (облегчающих перенос глюкозы), представителя 2 (Slc2a2), аланинаминопептидазы (мембранной) (Anpep), трансмембранного белка 27 (Tmem27), семейства ацил-КоA-синтетаз жирных кислот со средней длиной цепи, представителя 2 (Acsm2), глутатионпероксидазы 3 (Gpx3), фруктоза-1,6-бифосфатазы 1 (Fbp1), аланин-глиоксилат аминотрансферазы 2 (Agxt2), молекулы адгезии тромбоцитов и эндотелия (Pecam) и подоцина (Podn).

В конкретных вариантах осуществления популяция почечных клеток содержит один или более типов клеток, которые экспрессируют одно или более из любого сочетания из: PECAM, VEGF, KDR, HIF1a, CD31, CD146, подоцина (Podn) и нефрина (Neph), рецептора хемокина (мотив C-X-C) 4 (Cxcr4), рецептора эндотелина типа B (Ednrb), коллагена, типа V, альфа-2 (Col5a2), кадгерина 5 (Cdh5), тканевого активатора плазминогена (Plat), ангиопоэтина 2 (Angpt2), белка-рецептора, содержащего домен вставки киназы (Kdr), секретируемого кислого богатого цистеином белка (остеонектина) (Sparc), серглицина (Srgn), ингибитора 3 TIMP металлопептидазы (Timp3), белка 1 опухоли Вильмса (Wt1), семейства сайтов интеграции MMTV Wingless типа, представителя 4 (Wnt4), регулятора сигнализации G-белков 4 (Rgs4), эритропоэтина (EPO).

В конкретных вариантах осуществления популяция почечных клеток содержит один или более типов клеток, которые экспрессируют одно или более из любого сочетания из: PECAM, vEGF, KDR, HIF1a, подоцина, нефрина, EPO, CK7, CK8/18/19.

В конкретных вариантах осуществления популяция почечных клеток содержит один или более типов клеток, которые экспрессируют одно или более из любого сочетания из: PECAM, vEGF, KDR, HIF1a, CD31, CD146.

В конкретных вариантах осуществления популяция почечных клеток содержит один или более типов клеток, которые экспрессируют одно или более из любого сочетания из: подоцина (Podn) и нефрина (Neph).

В конкретных вариантах осуществления популяция почечных клеток содержит один или более типов клеток, которые экспрессируют одно или более из любого сочетания из: PECAM, vEGF, KDR, HIF1a и EPO.

В конкретных вариантах осуществления присутствие (например, экспрессию) и/или уровень/количество различных биомаркеров в образце или популяции клеток можно анализировать с использованием ряда методов, многие из которых известны в данной области и понятны квалифицированному специалисту, включая, но без ограничения, иммуногистохимические методы («ИГХ»), вестерн-блоттинг, иммунопреципитацию, анализы молекулярного связывания, ELISA, ELIFA, активированную флуоресценцией сортировку клеток («FACS»), MassARRAY, протеомику, биохимические анализы ферментативной активности, in situ гибридизацию, саузерн-блоттинг, нозерн-блоттинг, секвенирование всего генома, полимеразную цепную реакцию («ПЦР»), в том числе количественную ПЦР в реальном времени(«кОТ-ПЦР») и другие основанные на амплификации методы обнаружения, такие как, например, анализ разветвленных ДНК, SISBA, TMA и тому подобные, РНК-секвенирование, FISH, анализ с использованием микрочипов, профилирование генной экспрессии и/или серийный анализ генной экспрессии («SAGE»), а также любой из широкого спектра анализов, которые могут быть выполнены с использованием белковых, генных и/или тканевых микропанелей. Неограничивающие примеры методов для оценки статуса генов и генных продуктов включают нозерн-блоттинг, саузерн-блоттинг, иммуноблоттинг и ПЦР-анализ. В конкретных вариантах осуществления также можно использовать мультиплексные иммуноанализы, такие как те, которые доступны от компаний Rules Based Medicine или Meso Scale Discovery. В конкретных вариантах осуществления присутствие (например, экспрессию) и/или уровень/количество различных биомаркеров в образце или популяции клеток можно анализировать с использованием ряда методов, многие из которых известны в данной области и понятны квалифицированному специалисту, включая, но без ограничения, платформы «-омика», такие как геномная транскриптомика, протеомика, секретомика, липидомика, фосфатомика, экзосомика и так далее, при этом методологии с высокой пропускной способностью объединяют с методами вычислительной биологии и биоинформатики для выяснения полной биологической сигнатуры генов, микроРНК, белков, секретируемых белков, липидов и так далее, которые экспрессируются, и не экспрессируются, изучаемой популяцией клеток.

В конкретных вариантах осуществления способ обнаружения присутствия двух или более биомаркеров в популяции почечных клеток включает создание контакта образца с антителом, направленным на биомаркер, в условиях, допускающих связывание антитела с его соответствующим лигандом (то есть, биомаркером), и обнаружение присутствия связанного антитела, например, путем определения того, образуется ли комплекс между антителом и биомаркером. В конкретных вариантах осуществления присутствие одного или более биомаркеров обнаруживают иммуногистохимическими методами. Используемый в настоящем документе термин «обнаружение» включает количественное и/или качественное обнаружение.

В конкретных вариантах осуществления популяцию почечных клеток идентифицируют при помощи одного или более реагентов, которые позволяют обнаруживать биомаркер, раскрытый в настоящем документе, такой как AQP1, AQP2, AQP4, кальбиндин, кальпонин, CD117, CD133, CD146, CD24, CD31 (PECAM-1), CD54 (ICAM-1), CD73, CK18, CK19, CK7, CK8, CK8/18, CK8/18/19, коннексин 43, кубилин, CXCR4 (фузин), DBA, E-кадгерин (CD324), EPO (эритропоэтин), GGT1, GLEPP1 (белок гломерулярного эпителия 1), гаптоглобулин, Itgbl (интегрин p), KIM-1 (молекула повреждения почек 1), T1M-1 (T-клеточный иммуноглобулин и муцин-содержащая молекула), MAP-2 (связанный с микротрубочками белок 2), мегалин, N-кадгерин, нефрин, NKCC (котранспортеры Na-K-Cl), OAT-1 (транспортер органических ионов 1), остеопонтин, пан-кадгерин, PCLP1 (подокаликсин-подобная молекула 1), подоцин, SMA (альфа-актин гладких мышц), синаптоподин, THP (белок Тамма-Хорсфолла), виментин и αGST-1 (альфа-глутатион-5-трансфераза). В конкретных вариантах осуществления биомаркер обнаруживают при помощи моноклонального или поликлонального антитела.

В конкретных вариантах осуществления источник клеток является таким же, как и намеченный целевой орган или ткань. В конкретных вариантах осуществления БПК или ОПК могут быть получены из почки и использованы в препарате, который будет введен в почку. В конкретных вариантах осуществления популяция клеток получена из биопсийного образца почки. В конкретных вариантах осуществления популяция клеток получена из ткани целой почки. В конкретных вариантах осуществления популяция клеток получена из in vitro культур клеток почки млекопитающего, полученной из биопсийных образцов почки или ткани целой почки.

В конкретных вариантах осуществления БПК или ОПК содержат гетерогенные смеси или фракции биоактивных почечных клеток. В конкретных вариантах осуществления БПК или ОПК могут быть получены из, или сами являются, фракций почечных клеток от здоровых индивидуумов. В конкретных вариантах осуществления изобретение относится к популяции, или фракции, почечных клеток, полученной от нездорового индивидуума, которая может быть лишена определенных типов клеток в сравнении с популяцией почечных клеток от здорового индивидуума (например, в его почке или биопсийном образце). В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения предложена терапевтически активная популяция клеток, лишенная некоторых типов клеток в сравнении с популяцией от здорового индивидуума. В конкретных вариантах осуществления популяцию клеток выделяют и размножают из популяции аутологичных клеток.

В конкретных вариантах осуществления ОПК получают из ткани коркового слоя почки пациента путем биопсии почки. В конкретных вариантах осуществления почечные клетки выделяют из почечной ткани путем ферментативного расщепления, размножают с использованием стандартных методов культивирования клеток и отбирают из размноженных почечных клеток путем центрифугирования через границу, барьер или интерфейс между фазами с разной плотностью. В конкретных вариантах осуществления почечные клетки выделяют из почечной ткани путем ферментативного расщепления, размножают с использованием стандартных методов культивирования клеток и отбирают из размноженных почечных клеток путем центрифугирования в непрерывном или прерывистом, одноступенчатом или многоступенчатом, градиенте плотности. В конкретных вариантах осуществления ОПК состоят в основном из почечных эпителиальных клеток, которые известны своим регенеративным потенциалом. В конкретных вариантах осуществления другие паренхиматозные (сосудистые) и стромальные клетки могут присутствовать в популяции аутологичных ОПК.

Как описано выше, БПК представляют собой выделенную популяцию регенеративных почечных клеток, естественным образом вовлеченных в восстановление и регенерацию почек. В конкретных вариантах осуществления БПК получают из почечных клеток, выделенных из почечной ткани путем ферментативного расщепления, и размножают с использованием стандартных методов культивирования клеток. Среду для культивирования клеток можно выбирать таким образом, чтобы размножались биоактивные почечные клетки с регенеративной способностью. В конкретных вариантах осуществления БПК получены из почечных клеток, выделенных из почечной ткани путем ферментативного расщепления, генетически модифицированы (например, геномно модифицированы и/или модифицированы посредством РНКи), чтобы они стали иммунологически привилегированными или неспособными вызывать отторжение, и размножены с использованием стандартных методов культивирования клеток. Среду для культивирования клеток можно выбирать таким образом, чтобы размножались иммунологически привилегированные биоактивные почечные клетки с регенеративной способностью. В конкретных вариантах осуществления среда для культивирования клеток не содержит какие-либо факторы дифференцировки. В конкретных вариантах осуществления размноженные гетерогенные смеси почечных клеток культивируют в гипоксических условиях для дополнительного обогащения композиции клетками с регенеративной способностью. Без связи с конкретной теорией, это может быть связано с одним или более из следующих явлений: 1) избирательное выживание, гибель или пролиферация определенных клеточных компонентов в период культивирования в гипоксических условиях; 2) изменение гранулярности и/или размера клеток в ответ на культивирование в гипоксических условиях, что приводит к изменениям в плавучей плотности и последующей локализации при разделении в градиенте плотности; и 3) изменение генной/белковой экспрессии в клетках в ответ на культивирование в гипоксических условиях, что приводит к дифференциальным характеристикам клеток в выделенной и размноженной популяции.

В конкретных вариантах осуществления популяцию биоактивных почечных клеток получают путем выделения и размножения почечных клеток из почечной ткани (такой как ткань, полученная при биопсии) в условиях культивирования, которые приводят к обогащению клетками, способными к регенерации почки.

В конкретных вариантах осуществления почечные клетки из почечной ткани (такой как ткань, полученная при биопсии) пересевают 1, 2, 3, 4, 5 или более раз для получения размноженных биоактивных почечных клеток (например, популяции клеток, обогащенной по клеткам, способным к регенерации почки). В конкретных вариантах осуществления почечные клетки из почечной ткани (такой как ткань, полученная при биопсии) пересевают 1 раз для получения размноженных биоактивных почечных клеток. В конкретных вариантах осуществления почечные клетки из почечной ткани (такой как ткань, полученная при биопсии) пересевают 2 раза для получения размноженных биоактивных почечных клеток. В конкретных вариантах осуществления почечные клетки из почечной ткани (такой как ткань, полученная при биопсии) пересевают 3 раза для получения размноженных биоактивных почечных клеток. В конкретных вариантах осуществления почечные клетки из почечной ткани (такой как ткань, полученная при биопсии) пересевают 4 раза для получения размноженных биоактивных почечных клеток. В конкретных вариантах осуществления почечные клетки из почечной ткани (такой как ткань, полученная при биопсии) пересевают 5 раз для получения размноженных биоактивных почечных клеток. В конкретных вариантах осуществления пересев клеток приводит к истощению популяции не биоактивных почечных клеток. В конкретных вариантах осуществления пересев клеток приводит к истощению популяции клеток по меньшей мере одного клеточного типа. В конкретных вариантах осуществления пересев клеток приводит к истощению популяции клеток, имеющих плотность более 1,095 г/мл. В конкретных вариантах осуществления пересев клеток приводит к истощению популяции мелких клеток с низкой гранулярностью. В конкретных вариантах осуществления пересев клеток приводит к истощению популяции клеток, имеющих меньший размер, чем эритроциты. В конкретных вариантах осуществления пересев клеток приводит к истощению популяции клеток с диаметром менее 6 мкм. В конкретных вариантах осуществления пересев клеток приводит к истощению популяции клеток с диаметром менее 2 мкм. В конкретных вариантах осуществления пересев клеток приводит к истощению популяции клеток с меньшей гранулярностью, чем эритроциты. В конкретных вариантах осуществления жизнеспособность популяции клеток возрастает после 1 или более пересевов. В конкретных вариантах осуществления описания мелких клеток и низкой гранулярности используют при анализе клеток методом активированной флуоресценцией сортировки клеток (FACS), например, с использованием осей X-Y диаграммы разброса данных, на которой показаны клетки.

В конкретных вариантах осуществления размноженные биоактивные почечные клетки выращивают в гипоксических условиях в течение по меньшей мере примерно 6, 9, 10, 12 или 24 часов, но менее 48 часов, или в течение 6-9 часов, или 6-48 часов, или от примерно 12 до примерно 15 часов, или примерно 8 часов, или примерно 12 часов, или примерно 24 часов, или примерно 36 часов, или примерно 48 часов. В конкретных вариантах осуществления клетки, выращенные в гипоксических условиях, отбирают на основании плотности. В конкретных вариантах осуществления популяция биоактивных почечных клеток представляет собой популяцию отобранных почечных клеток (ОПК), полученную после разделения размноженных почечных клеток в непрерывном или прерывистом (одноэтапном или многоэтапном) градиенте плотности (например, после пересева и/или культивирования в гипоксических условиях). В конкретных вариантах осуществления популяция биоактивных почечных клеток представляет собой популяцию отобранных почечных клеток (ОПК), полученную после разделения размноженных почечных клеток методом центрифугирования через границу, барьер или интерфейс между фазами с разной плотностью (например, после пересева и/или культивирования в гипоксических условиях). В конкретных вариантах осуществления гипоксические условия культивирования представляют собой условия культивирования, в которых клетки подвергают воздействию пониженных уровней доступного кислорода в системе культивирования, в сравнении со стандартными условиями культивирования, в которых клетки культивируют при атмосферных уровнях кислорода (примерно 21%). В конкретных вариантах осуществления клетки, культивируемые в гипоксических условиях культивирования, культивируют при уровне кислорода от примерно 5% до примерно 15%, или от примерно 5% до примерно 10%, или от примерно 2% до примерно 5%, или от примерно 2% до примерно 7%, или примерно 2%, или примерно 3%, или примерно 4%, или примерно 5%. В конкретных вариантах осуществления ОПК имеют плавучую плотность более примерно 1,0419 г/мл. В конкретных вариантах осуществления ОПК имеют плавучую плотность более примерно 1,04 г/мл. В конкретных вариантах осуществления ОПК имеют плавучую плотность более примерно 1,045 г/мл. В конкретных вариантах осуществления БПК или ОПК содержат большую процентную долю одной или более популяций клеток и лишены, или содержат меньшее количество, одной или более других популяций клеток в сравнении с исходной популяцией почечных клеток.

В конкретных вариантах осуществления размноженные биоактивные почечные клетки могут быть подвергнуты разделению в градиенте плотности для получения ОПК. В конкретных вариантах осуществления ОПК после этого генетически модифицируют. В конкретных вариантах осуществления генетически модифицированные (например, геномно модифицированные и/или модифицированные посредством РНКи) БПК подвергают разделению в градиенте плотности для получения генетически модифицированных ОПК. В конкретных вариантах осуществления генетически модифицированные (например, геномно модифицированные и/или модифицированные посредством РНКи) БПК подвергают как гипоксическим условиям культивирования, так и разделению в градиенте плотности, для получения генетически модифицированных ОПК. В конкретных вариантах осуществления используют центрифугирование в непрерывном или прерывистом, одноступенчатом или многоступенчатом, градиенте плотности для разделения собранных популяций почечных клеток на основании плавучей плотности клеток. В конкретных вариантах осуществления размноженные биоактивные почечные клетки можно разделять центрифугированием через границу, барьер или интерфейс между фазами с разной плотностью для получения ОПК. В конкретных вариантах осуществления центрифугирование через границу, барьер или интерфейс между фазами с разной плотностью используют для разделения собранных популяций почечных клеток на основании плавучей плотности клеток. В конкретных вариантах осуществления ОПК получают с использованием, частично, среды OPTIPREP (Axis-Shield), содержащей 60% (масс/об) раствор неионного йодированного соединения йодиксанола в воде. Однако специалист в данной области понимает, что и другие среды, градиенты плотности (непрерывные или прерывистые), границы, барьеры, интерфейсы между фазами с разной плотностью, или другие методы, например, иммунологическое разделение с использованием клеточных поверхностных маркеров, известные в данной области имеющие необходимые свойства для выделения популяций клеток, описанных в настоящем документе, можно использовать для получения биоактивных почечных клеток. В конкретных вариантах осуществления фракцию клеток, имеющих плавучую плотность более примерно 1,04 г/мл, собирают после центрифугирования в виде четкого осадка клеток. В конкретных вариантах осуществления клетки, имеющие плавучую плотность менее 1,04 г/мл, исключают и отбрасывают. В конкретных вариантах осуществления фракцию клеток, имеющих плавучую плотность более примерно 1,0419 г/мл, собирают после центрифугирования в виде четкого осадка клеток. В конкретных вариантах осуществления клетки, имеющие плавучую плотность менее 1,0419 г/мл, исключают и отбрасывают. В конкретных вариантах осуществления фракцию клеток, имеющих плавучую плотность более примерно 1,045 г/мл, собирают после центрифугирования в виде четкого осадка клеток. В конкретных вариантах осуществления клетки, имеющие плавучую плотность менее 1,045 г/мл, исключают и отбрасывают.

В конкретных вариантах осуществления плавучую плотность клеток используют для получения популяции ОПК и/или определения того, является ли популяция почечных клеток популяцией биоактивных почечных клеток. В конкретных вариантах осуществления плавучую плотность клеток используют для выделения биоактивных почечных клеток. В конкретных вариантах осуществления плавучую плотность клеток определяют путем центрифугирования через одноступенчатый интерфейс плотности OptiPrep (7% йодиксанол; 60% (масс/об) в OptiMEM) (одноступенчатый прерывистый градиент плотности). Optiprep представляет собой 60% (масс/об) раствор йодиксанола в воде. При иллюстративном использовании интерфейса плотности или одноступенчатого прерывистого градиента плотности Optiprep разбавляют OptiMEM (минимальная среда для культивирования клеток) для получения конечного раствора 7% йодиксанола (в воде и OptiMEM). Состав OptiMEM представляет собой модификацию минимальной поддерживающей среды Игла, забуференную HEPES и бикарбонатом натрия, и с добавлением гипоксантина, тимидина, пирувата натрия, L-глутамина или GLUTAMAX, микроэлементов и факторов роста. Уровень белка является минимальным (15 мкг/мл), при этом единственными белковыми добавками являются инсулин и трансферрин. Феноловый красный включают при пониженной концентрации в качестве индикатора pH. В конкретных вариантах осуществления в OptiMEM можно добавлять 2-меркаптоэтанол перед использованием.

В конкретных вариантах осуществления готовят раствор OptiPrep и измеряют коэффициент преломления, в качестве показателя желаемой плотности (К.П. 1,3456 ± 0,0004), перед использованием. В конкретных вариантах осуществления почечные клетки наслаивают поверх раствора. В конкретных вариантах осуществления интерфейс между фазами с разной плотностью или одноступенчатый прерывистый градиент плотности центрифугируют при 800 g в течение 20 мин при комнатной температуре (без торможения) либо в центрифужной пробирке (например, 50-мл конической пробирке), либо в устройстве для обработки клеток (например, COBE 2991). В конкретных вариантах осуществления фракцию клеток, имеющих плавучую плотность более примерно 1,04 г/мл, собирают после центрифугирования в виде четкого осадка клеток. В конкретных вариантах осуществления клетки, имеющие плавучую плотность менее 1,04 г/мл, исключают и отбрасывают. В конкретных вариантах осуществления фракцию клеток, имеющих плавучую плотность более примерно 1,0419 г/мл, собирают после центрифугирования в виде четкого осадка клеток. В конкретных вариантах осуществления клетки, имеющие плавучую плотность менее 1,0419 г/мл, исключают и отбрасывают. В конкретных вариантах осуществления фракцию клеток, имеющих плавучую плотность более примерно 1,045 г/мл, собирают после центрифугирования в виде четкого осадка клеток. В конкретных вариантах осуществления клетки, имеющие плавучую плотность менее 1,045 г/мл, исключают и отбрасывают. В конкретных вариантах осуществления перед оценкой плотности клеток, или отбором на основании плотности, клетки культивируют до состояния по меньшей мере 50% конфлюэнтности и инкубируют в течение ночи (например, по меньшей мере примерно 8 или 12 часов) в гипоксических условиях в инкубаторе, установленном на уровень 2% кислорода в атмосфере с 5% CO₂ при 37°C.

В конкретных вариантах осуществления клетки, полученные из образца почки, размножают, а затем обрабатывают (например, с применением гипоксии и разделения центрифугированием) для получения популяции ОПК. В конкретных вариантах осуществления популяцию ОПК получают с использованием реагентов и способов, описанных в настоящем документе. В конкретных вариантах осуществления образец клеток из популяции ОПК тестируют на жизнеспособность перед введением клеток популяции субъекту. В конкретных вариантах осуществления образец клеток из популяции ОПК тестируют на экспрессию одного или более из маркеров, раскрытых в настоящем документе, перед введением клеток популяции субъекту.

Неограничивающие примеры композиций и способов для получения ОПК приведены в публикации патентной заявки США № 2017/0281684 A1, полное содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки.

В конкретных вариантах осуществления БПК или ОПК получают из естественного образца аутологичной или аллогенной почки. В конкретных вариантах осуществления БПК или ОПК получают из образца не аутологичной почки. В конкретных вариантах осуществления образец может быть получен путем биопсии почки.

В конкретных вариантах осуществления выделение и размножение почечных клеток приводит к получению смеси разных типов почечных клеток, включая почечные эпителиальные клетки и стромальные клетки. В конкретных вариантах осуществления ОПК получают путем разделения в непрерывном или прерывистом градиенте плотности размноженных почечных клеток. В конкретных вариантах осуществления основной тип клеток в разделенной в градиенте плотности популяции ОПК имеет фенотип эпителиальных клеток почечных канальцев. В конкретных вариантах осуществления ОПК получают путем разделения размноженных почечных клеток методом центрифугирования через границу, барьер или интерфейс между фазами с разной плотностью. В конкретных вариантах осуществления основной тип клеток в разделенной через границу/барьер/интерфейс между фазами с разной плотностью популяции ОПК имеет фенотип эпителиальных клеток почечных канальцев. В конкретных вариантах осуществления характеристики ОПК, полученных в результате размножения почечных клеток, оценивают с использованием многоэтапного подхода. В конкретных вариантах осуществления клеточную морфологию, кинетику роста и жизнеспособность клеток контролируют в процессе размножения почечных клеток. В конкретных вариантах осуществления плавучую плотность и жизнеспособность ОПК характеризуют методом центрифугирования на среде, или свозь среду, с градиентом плотности и методом с исключением трипанового синего. В конкретных вариантах осуществления фенотип ОПК характеризуют методом проточной цитометрии, и функцию ОПК определяют на основании экспрессии VEGF и KIM-1. В конкретных вариантах осуществления клеточную функцию ОПК до формулирования также можно оценивать путем измерения активности двух конкретных ферментов; GGT (γ-глютамилтранспептидазы) и LAP (лейцинаминопептидазы), присутствующих в проксимальных канальцах почки.

В конкретных вариантах осуществления клеточные признаки, способствующие разделению субпопуляций клеток в плотной среде (размер и гранулярность), можно использовать для разделения субпопуляций клеток методом проточной цитометрии (прямое светорассеяние отражает размер клеток при проточной цитометрии, и боковое светорассеяние отражает гранулярность). В конкретных вариантах осуществления среда с градиентом плотности, или среда для разделения, должна иметь низкую токсичность для конкретных интересующих клеток. В конкретных вариантах осуществления, при том, что плотная среда должна иметь низкую токсичность для конкретных интересующих клеток, по настоящему изобретению предусмотрено использование сред, которые играют определенную роль в процессе отбора интересующих клеток. В конкретных вариантах осуществления, и без связи с конкретной теорией, очевидно, что популяции клеток, раскрытые в настоящем документе, которые извлекают при помощи среды, содержащей йодиксанол, являются устойчивыми к йодиксанолу, поскольку между этапами нанесения и извлечения имеет место значительная потеря клеток, это свидетельствует о том, что воздействие йодиксанола в условиях градиента плотности, или границы, барьера или интерфейса между фазами с разной плотностью, приводит к элиминации некоторых клеток. В конкретных вариантах осуществления клетки, обнаруживаемые после разделения в градиенте плотности или через интерфейс между фазами с разной плотностью йодиксанола, являются устойчивыми к любым неблагоприятным эффектам воздействия йодиксанола и/или градиента плотности или интерфейса между фазами. В конкретных вариантах осуществления контрастную среду, имеющую содержание нефротоксина от легкого до умеренного, используют для выделения и/или отбора популяции клеток, например, популяции ОПК. В конкретных вариантах осуществления ОПК являются устойчивыми к йодиксанолу. В конкретных вариантах осуществления плотная среда не должна связывать белки в человеческой плазме или отрицательно влиять на ключевые функции интересующих клеток.

В конкретных вариантах осуществления популяция клеток была обогащена и/или истощена по одному или более типам почечных клеток методом активированной флуоресценцией сортировки клеток (FACS). В конкретных вариантах осуществления типы почечных клеток могут быть обогащены и/или истощены с использованием BD FACSAria™ или эквивалента. В конкретных вариантах осуществления типы почечных клеток могут быть обогащены и/или истощены с использованием FACSAria III™ или эквивалента.

В конкретных вариантах осуществления популяция клеток была обогащена и/или истощена по одному или более типам почечных клеток с использованием магнитной сортировки клеток. В конкретных вариантах осуществления один или более типов почечных клеток могут быть обогащены и/или истощены с использованием системы Miltenyi autoMACS^® или эквивалента.

В конкретных вариантах осуществления популяция почечных клеток была подвергнута трехмерному культивированию. В конкретных вариантах осуществления методы культивирования популяций клеток включают непрерывную перфузию. В конкретных вариантах осуществления популяции клеток, культивированных с использованием трехмерного культивирования и непрерывной перфузии, демонстрируют большую насыщенность клетками и межклеточное взаимодействие в сравнении с популяциями клеток, культивируемыми статическим образом. В конкретных вариантах осуществления популяции клеток, культивированных с использованием трехмерного культивирования и непрерывной перфузии, демонстрируют большую степень экспрессии EPO, а также повышенную экспрессию генов, связанных с почечными канальцами, таких как E-кадгерин, в сравнении со статическими культурами таких популяций клеток. В конкретных вариантах осуществления популяция клеток, культивированных с использованием непрерывной перфузии, демонстрирует более высокий уровень потребления глюкозы и глутамина в сравнении с популяцией клеток, культивируемых статическим образом.

В конкретных вариантах осуществления условия низкого содержания, или недостатка, кислорода можно использовать в способах для получения популяции клеток, предложенных по настоящему изобретению. В конкретных вариантах осуществления способ получения популяции клеток может быть использован без этапа культивирования при низком содержании кислорода. В конкретных вариантах осуществления могут быть использованы условия с нормальным содержанием кислорода.

В конкретных вариантах осуществления популяция почечных клеток была выделена и/или культивирована из почечной ткани. В настоящем документе приведены неограничивающие примеры способов для разделения и выделения почечных клеточных компонентов, например, обогащенных популяций клеток, которые будут использованы в препаратах для терапевтического применения, включая лечение заболевания почек, анемии, дефицита EPO, нарушения канальцевого транспорта и нарушения гломерулярной фильтрации. В конкретных вариантах осуществления популяцию клеток выделяют из свежерасщепленной, то есть, механически или ферментативно расщепленной, почечной ткани, или из гетерогенной in vitro культуры почечных клеток млекопитающего.

В конкретных вариантах осуществления популяция почечных клеток включает EPO-продуцирующие почечные клетки. В конкретных вариантах осуществления субъект имеет анемию и/или дефицит EPO. В конкретных вариантах осуществления популяции EPO-продуцирующих почечных клеток характеризуются экспрессией EPO и биологической чувствительностью к кислороду, так, что уменьшение давления кислорода в системе культивирования приводит к индукции экспрессии EPO. В конкретных вариантах осуществления популяции EPO-продуцирующих клеток обогащены по EPO-продуцирующим клеткам. В конкретных вариантах осуществления экспрессия EPO индуцируется, когда популяцию клеток культивируют в условиях, в которых клетки находятся в системе культивирования при пониженных уровнях доступного кислорода, в сравнении с популяцией клеток, культивируемых при нормальных атмосферных (примерно 21%) уровнях доступного кислорода. В конкретных вариантах осуществления EPO-продуцирующие клетки, культивируемые в условиях с пониженным содержанием кислорода, экспрессируют EPO на более высоких уровнях в сравнении с EPO-продуцирующими клетками, культивируемыми в условиях с нормальным содержанием кислорода. Как правило, культивирование клеток при пониженных уровнях доступного кислорода (также называемых гипоксическими условиями культивирования) означает, что уровень кислорода снижен в сравнении с культивированием клеток при нормальных атмосферных уровнях доступного кислорода (также называемых нормальными условиями или нормоксическими условиями). В конкретных вариантах осуществления культивирование клеток в гипоксических условиях включает культивирование клеток при менее примерно 1% кислорода, менее примерно 2% кислорода, менее примерно 3% кислорода, менее примерно 4% кислорода или менее примерно 5% кислорода. В конкретных вариантах осуществления культивирование клеток в нормальных условиях, или нормоксических условиях, включает культивирование клеток при примерно 10% кислорода, примерно 12% кислорода, примерно 13% кислорода, примерно 14% кислорода, примерно 15% кислорода, примерно 16% кислорода, примерно 17% кислорода, примерно 18% кислорода, примерно 19% кислорода, примерно 20% кислорода или примерно 21% кислорода.

В конкретных вариантах осуществления добиваются индукции, или увеличения, экспрессии EPO; ее можно наблюдать в случае культивирования клеток при менее примерно 5% доступного кислорода и сравнивать с уровнями экспрессии EPO в клетках, культивируемых при атмосферных (примерно 21%) уровнях кислорода. В конкретных вариантах осуществления индукции EPO добиваются в культуре клеток, способных экспрессировать EPO, способом, включающим первую фазу культивирования, в которой клетки культивируют при атмосферном уровне кислорода (примерно 21%) в течение некоторого периода времени, и вторую фазу культивирования, в которой уровни доступного кислорода уменьшают, и те же клетки культивируют при менее примерно 5% доступного кислорода. В конкретных вариантах осуществления экспрессия EPO, которая является чувствительной к гипоксическим условиям, регулируется HIF1α. В конкретных вариантах осуществления другие условия культивирования с манипуляциями уровнем кислорода, известные в данной области, могут быть использованы для клеток, описанных в настоящем документе.

В конкретных вариантах осуществления препарат содержит обогащенные популяции EPO-продуцирующих клеток млекопитающего, характеризующихся биологической чувствительностью (такой как, например, экспрессия EPO) к условиям перфузии. В конкретных вариантах осуществления условия перфузии включают временный, прерывистый или непрерывный поток жидкости (перфузию). В конкретных вариантах осуществления экспрессия EPO индуцируется механически, когда среда, в которой клетки культивируются, периодически или непрерывно циркулирует или перемешивается таким образом, что динамические силы передаются клеткам через поток. В конкретных вариантах осуществления клетки, подвергаемые воздействию временного, прерывистого или непрерывного потока жидкости, культивируют таким образом, что они присутствуют в виде трехмерных структур в, или на, материале, который обеспечивает каркас и/или пространство для образования таких трехмерных структур. В конкретных вариантах осуществления клетки культивируют на пористых гранулах и подвергают воздействию прерывистого или непрерывного потока жидкости за счет использования качающейся платформы, вращающейся платформы или вращающейся колбы. В конкретных вариантах осуществления клетки культивируют на трехмерном каркасе и помещают в устройство, обеспечивающее стационарное положение каркаса и протекание жидкости в направлении через, или сквозь, каркас. Специалисты в данной области понимают, что и другие условия культивирования с перфузией, известные в данной области, могут быть использованы для клеток, описанных в настоящем документе.

В конкретных вариантах осуществления популяцию клеток получают из биопсийного образца почки. В конкретных вариантах осуществления популяцию клеток получают из ткани целой почки. В конкретных вариантах осуществления популяцию клеток получают из in vitro культур клеток почки млекопитающего, полученной из биопсийных образцов почки или ткани целой почки. В конкретных вариантах осуществления популяция почечных клеток представляет собой популяцию ОПК. В конкретных вариантах осуществления популяция клеток представляет собой не фракционированную популяцию клеток, также называемую в настоящем документе необогащенной популяцией клеток.

Композиции, содержащие различные активные средства (например, отличные от почечных клеток), входят в объем настоящего изобретения. Неограничивающие примеры подходящих активных средств включают, без ограничения, клеточные агрегаты, бесклеточные биологические материалы, продукты, секретируемые биоактивными клетками, высокомолекулярные и низкомолекулярные терапевтические средства, а также их сочетания. Например, биоактивные клетки одного типа можно объединять с микроносителями на основе биологического материала с терапевтическими молекулами, или без них, или биоактивными клетками другого типа. В конкретных вариантах осуществления неприкрепленные клетки могут быть объединены с бесклеточными частицами.

В конкретных вариантах осуществления клетки популяции почечных клеток находятся внутри сфероидов. В конкретных вариантах осуществления популяция почечных клеток имеет форму сфероидов. В конкретных вариантах осуществления сфероиды, содержащие биоактивные почечные клетки, вводят субъекту. В конкретных вариантах осуществления сфероиды содержат по меньшей мере один тип, или популяцию, не почечных клеток. В конкретных вариантах осуществления сфероиды получают способом, включающим (i) объединение популяции биоактивных почечных клеток и популяции не почечных клеток, и (ii) культивирование популяции биоактивных почечных клеток и популяции не почечных клеток в 3-мерной системе культивирования, включающей вращающуюся колбу, до образования сфероидов.

В конкретных вариантах осуществления популяция не почечных клеток содержит популяцию эндотелиальных клеток или популяцию эндотелиальных клеток-предшественников. В конкретных вариантах осуществления популяция биоактивных клеток представляет собой популяцию эндотелиальных клеток. В конкретных вариантах осуществления популяция эндотелиальных клеток представляет собой линию клеток. В конкретных вариантах осуществления популяция эндотелиальных клеток содержит эндотелиальные клетки пуповинной крови человека (HUVEC). В конкретных вариантах осуществления популяция не почечных клеток представляет собой популяцию мезенхимальных стволовых клеток. В конкретных вариантах осуществления популяция не почечных клеток представляет собой популяцию стволовых клеток из гемопоэтического органа, молочной железы, кишечника, плаценты, легкого, костного мозга, крови, пуповины, эндотелия, пульпы зуба, жировой ткани, нервной ткани, обонятельного эпителия, нервного гребня или яичка. В конкретных вариантах осуществления популяция не почечных клеток представляет собой популяцию клеток-предшественников из жировой ткани. В конкретных вариантах осуществления популяции клеток являются ксеногенными, сингенными, аллогенными, аутологичными, или их сочетанием. В конкретных вариантах осуществления популяцию биоактивных почечных клеток и популяцию не почечных клеток культивируют в соотношении от 0,1:9,9 до 9,9:0,1. В конкретных вариантах осуществления популяцию биоактивных почечных клеток и популяцию не почечных клеток культивируют в соотношении примерно 1:1. В конкретных вариантах осуществления популяцию почечных клеток и популяцию биоактивных клеток суспендируют в ростовой среде.

Размноженные биоактивные почечные клетки затем могут быть подвергнуты разделению в среде с непрерывным или прерывистым градиентом плотности для получения ОПК. В частности, используют центрифугирование в непрерывном или прерывистом, одноступенчатом или многоступенчатом, градиенте плотности для разделения собранных популяций почечных клеток в зависимости от плавучей плотности клеток. В конкретных вариантах осуществления размноженные биоактивные почечные клетки могут быть дополнительно подвергнуты разделению методом центрифугирования через границу, барьер или интерфейс между фазами с разной плотностью для получения ОПК. В частности, центрифугирование через границу, барьер или интерфейс между фазами с разной плотностью используют для разделения собранных популяций почечных клеток в зависимости от плавучей плотности клеток. В конкретных вариантах осуществления ОПК получают с использованием, частично, среды OPTIPREP (Axis-Shield), содержащей 60% (масс/об) раствор неионного йодированного соединения йодиксанола в воде. Однако специалист в данной области понимает, что любые среды с градиентом плотности, без ограничения по конкретным средам, или другие методы, например, иммунологического разделения с использованием клеточных поверхностных маркеров, известных в данной области, имеющие необходимые свойства для выделения популяций клеток по настоящему изобретению, могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением. Например, можно использовать перколл или сахарозу для создания градиента плотности или границы фаз с разной плотностью. В конкретных вариантах осуществления фракцию клеток, имеющих плавучую плотность более примерно 1,04 г/мл, собирают после центрифугирования в виде четкого осадка клеток. В конкретных вариантах осуществления клетки, имеющие плавучую плотность менее 1,04 г/мл, исключают и отбрасывают. В конкретных вариантах осуществления фракцию клеток, имеющих плавучую плотность более примерно 1,0419 г/мл, собирают после центрифугирования в виде четкого осадка клеток. В конкретных вариантах осуществления клетки, имеющие плавучую плотность менее 1,0419 г/мл, исключают и отбрасывают. В конкретных вариантах осуществления фракцию клеток, имеющих плавучую плотность более примерно 1,045 г/мл, собирают после центрифугирования в виде четкого осадка клеток. В конкретных вариантах осуществления клетки, имеющие плавучую плотность менее 1,045 г/мл, исключают и отбрасывают.

Терапевтические композиции, и препараты, по настоящему изобретению могут содержать выделенные гетерогенные популяции почечных клеток, и/или их смеси, обогащенные по конкретным биоактивным компонентам, или типам клеток, и/или истощенные по конкретным неактивным или нежелательным компонентам, или типам клеток, при этом такие популяции были генетически модифицированы путем удаления генетических компонентов, кодирующих клеточные поверхностные антигены, ответственные за иммунное отторжение у реципиента, для использования в лечении заболевания почек, то есть, обеспечения стабилизации и/или улучшения, и/или восстановления почечной функции и/или структуры. Неограничивающие примеры клеток для обеспечения такой стабилизации и/или улучшения ранее описаны в Presnell et al. U.S. 8318484 и Ilagan et al. PCT/US2011/036347, а также Jain et al. PCT/US2016/044866, полное содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки. Композиции могут содержать выделенные фракции почечных клеток, которые лишены клеточных компонентов в сравнении с клетками здорового индивидуума, но сохраняют терапевтические свойства, то есть, обеспечивают стабилизацию и/или улучшение, и/или восстановление почечной функции. Популяции клеток, клеточные фракции и/или смеси клеток, описанные в настоящем документе, могут быть получены от здоровых индивидуумов, индивидуумов с заболеванием почек или субъектов, описанных в настоящем документе.

По настоящему изобретению предусмотрены терапевтические композиции популяций генетически модифицированных (например, геномно модифицированных и/или модифицированных посредством РНКи) иммунологически привилегированных отобранных почечных клеток, которые будут введены в целевые органы или ткани субъекта, который нуждается в этом. «Популяция биоактивных отобранных почечных клеток», как правило, означает популяцию клеток, потенциально имеющих терапевтические свойства при введении субъекту. Например, при введении субъекту, который нуждается в этом, популяция биоактивных почечных клеток может обеспечивать стабилизацию и/или улучшение, и/или восстановление, и/или регенерацию почечной функции у субъекта. Терапевтические свойства могут включать восстановительный или регенеративный эффект.

В конкретных вариантах осуществления источник клеток является таким же, как и намеченный целевой орган или ткань. Например, БПК и/или ОПК могут быть получены из почки и использованы в препарате, который будет введен в почку. В конкретных вариантах осуществления популяция клеток получена из биопсийного образца почки. В конкретных вариантах осуществления популяция клеток получена из ткани целой почки. В конкретных вариантах осуществления популяция клеток получена из in vitro культур клеток почки млекопитающего, полученных из биопсийных образцов почки или ткани целой почки. В конкретных вариантах осуществления БПК и/или ОПК содержат гетерогенные смеси или фракции биоактивных почечных клеток. БПК или ОПК могут быть получены из, или сами являются, фракций почечных клеток от здоровых индивидуумов. Кроме того, настоящее изобретение относится к фракциям почечных клеток, полученных от нездорового индивидуума, которые могут быть лишены определенных типов клеток в сравнении с соответствующими фракциями почечных клеток здорового индивидуума, но все еще сохраняют терапевтические свойства. Настоящее изобретение также относится к популяциям терапевтически активных клеток, лишенным некоторых клеточных компонентов в сравнении с клетками здорового индивидуума, при этом такие популяции клеток в конкретных вариантах осуществления могут быть выделены и размножены из аутологичных источников, находящихся в различных болезненных состояниях.

В конкретных вариантах осуществления ОПК получают путем выделения и размножения почечных клеток из ткани коркового слоя почки пациента, полученной путем биопсии. Почечные клетки выделяют из почечной ткани путем ферментативного расщепления, размножают с использованием стандартных методов культивирования клеток и отбирают методом центрифугирования размноженных почечных клеток через границу, барьер или интерфейс между фазами с разной плотностью. В данном варианте осуществления ОПК состоят в основном из эпителиальных клеток почечных канальцев, которые известны своим регенеративным потенциалом (Bonventre JV. Dedifferentiation and proliferation of surviving epithelial cells in acute renal failure. J Am Soc Nephrol. 2003;14(Suppl. 1):S55–61; Humphreys BD, Czerniak S, DiRocco DP, et al. Repair of injured proximal tubule does not involve specialized progenitors. PNAS. 2011;108:9226–31; Humphreys BD, Valerius MT, Kobayashi A, et al. Intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury. Cell Stem Cell. 2008;2:284–91). И другие паренхиматозные (сосудистые) и стромальные клетки могут присутствовать в популяции аутологичных ОПК. В конкретных вариантах осуществления почечные клетки отбирают путем центрифугирования через непрерывный или прерывистый, одноступенчатый или многоступенчатый, градиент плотности.

По настоящему изобретению предусмотрены терапевтические композиции популяций генетически модифицированных (например, геномно модифицированных и/или модифицированных посредством РНКи) иммунологически привилегированных отобранных почечных клеток, которые будут введены в целевые органы или ткани субъекта, который нуждается в этом. «Популяция биоактивных отобранных почечных клеток», как правило, означает популяцию клеток, потенциально имеющих терапевтические свойства при введении субъекту. Например, при введении субъекту, который нуждается в этом, популяция биоактивных почечных клеток может обеспечивать стабилизацию и/или улучшение, и/или восстановление, и/или регенерацию почечной функции у субъекта. Терапевтические свойства могут включать восстановительный или регенеративный эффект.

В конкретных вариантах осуществления источник клеток является таким же, как и намеченный целевой орган или ткань. Например, БПК и/или ОПК могут быть получены из почки и использованы в препарате, который будет введен в почку. В конкретных вариантах осуществления популяция клеток получена из биопсийного образца почки. В конкретных вариантах осуществления популяция клеток получена из ткани целой почки. В конкретных вариантах осуществления популяция клеток получена из in vitro культур клеток почки млекопитающего, полученных из биопсийных образцов почки или ткани целой почки. В конкретных вариантах осуществления БПК и/или ОПК содержат гетерогенные смеси или фракции генетически модифицированных (например, геномно модифицированных и/или модифицированных посредством РНКи) иммунологически привилегированных биоактивных почечных клеток. БПК или ОПК могут быть получены из, или сами являются, фракций почечных клеток от здоровых индивидуумов. Кроме того, настоящее изобретение относится к фракциям почечных клеток, полученных от нездорового индивидуума, которые могут быть лишены определенных типов клеток в сравнении с соответствующими фракциями почечных клеток здорового индивидуума, но все еще сохраняют терапевтические свойства. Настоящее изобретение также относится к популяциям терапевтически активных клеток, лишенным некоторых клеточных компонентов в сравнении с клетками здорового индивидуума, при этом такие популяции клеток в конкретных вариантах осуществления могут быть выделены и размножены из почек, полученных от различных млекопитающих.

В конкретных вариантах осуществления ОПК получают путем выделения и размножения почечных клеток из ткани коркового слоя почки другого пациента, полученной путем биопсии почки. В конкретных вариантах осуществления почечные клетки выделяют из почечной ткани путем ферментативного расщепления, генетически модифицируют (например, геномно модифицируют и/или модифицируют посредством РНКи), чтобы они стали иммунологически привилегированными или неспособными вызывать отторжение, размножают с использованием стандартных методов культивирования клеток и отбирают методом центрифугирования в градиенте плотности из размноженных почечных клеток. В конкретных вариантах осуществления ОПК состоят в основном из почечных эпителиальных клеток, которые известны своей иммунологической привилегированностью и регенеративным потенциалом. И другие паренхиматозные (сосудистые) и стромальные клетки могут в небольших количествах присутствовать в популяции ОПК.

Как описано в настоящем документе, настоящее изобретение основано, частично, на том удивительном факте, что некоторые подфракции гетерогенной популяции почечных клеток, обогащенные по биоактивным компонентам и истощенные по неактивным или нежелательным компонентам, обеспечивают лучшие терапевтические и регенеративные результаты, чем исходная популяция.

При выделении и размножении почечных клеток получают смесь типов почечных клеток, включая почечные эпителиальные клетки и стромальные клетки. Как отмечено выше, ОПК получают путем разделения в градиенте плотности размноженных почечных клеток. Основной тип клеток в разделенной в градиенте плотности популяции ОПК имеет фенотип эпителиальных клеток почечных канальцев. Характеристики ОПК, полученных в результате размножения почечных клеток, оценивают с использованием многоэтапного подхода. Клеточную морфологию, кинетику роста и жизнеспособность клеток контролируют в процессе размножения почечных клеток. Плавучую плотность и жизнеспособность ОПК характеризуют методом центрифугирования в градиенте плотности и методом с исключением трипанового синего. Фенотип ОПК характеризуют методом проточной цитометрии, и функцию ОПК определяют на основании экспрессии VEGF и KIM-1.

Специалисты в данной области понимают, что и другие способы выделения и культивирования, известные в данной области, могут быть использованы для клеток, описанных в настоящем документе. Специалисты в данной области также понимают, что популяции биоактивных клеток могут быть получены из источников, отличных от тех, которые конкретно перечислены выше, включая, без ограничения, ткани и органы, отличные от почки, жидкости организма и жировую ткань.

Фенотип ОПК

В конкретных вариантах осуществления фенотип клеток контролируют путем анализа экспрессии маркеров почечных клеток методом проточной цитометрии. Фенотипический анализ клеток основан на использовании антигенных маркеров, специфичных для анализируемого типа клеток. Проточно-цитометрический анализ позволяет количественно определять клетки в образце популяции, которые экспрессируют анализируемый антигенный маркер.

В литературе описаны различные маркеры, полезные для анализа фенотипических характеристик эпителиальных клеток почечных канальцев: (i) цитокератины; (ii) транспортные мембранные белки (аквапорины и кубилин); (iii) молекулы клеточного связывания (адгерины и кластер дифференцировки, и лектины); и (iv) метаболические ферменты (глутатион и гамма-глютамилтранспептидаза (GGT)). (Таблица 1). Поскольку большинство клеток, встречающихся в культурах, полученных из гидролизатов целой почки, представляют собой эпителиальные и эндотелиальные клетки, анализ маркеров направлен главным образом на экспрессию белков, характерных для этих двух групп.

Таблица 1. Фенотипические маркеры для анализа ОПК

Антигенный маркер Реактивность CK8/18/19 Эпителиальные клетки, проксимальные и дистальные канальцы CK8 Эпителиальные клетки, проксимальные канальцы CK18 Эпителиальные клетки, проксимальные канальцы CK19 Эпителиальные клетки, собирающие протоки, дистальные канальцы CK7 Эпителиальные клетки, собирающие протоки, дистальные канальцы CXCR4 Эпителиальные клетки, дистальные и проксимальные канальцы E-кадгерин Эпителиальные клетки, дистальные канальцы Кубилин Эпителиальные клетки, проксимальные канальцы Аквапорин 1 Эпителиальные клетки, проксимальные канальцы, нисходящий тонкий отдел GGT1 Клетки эмбриональной и взрослой почки, проксимальные канальцы Аквапорин 2 Клетки собирающих протоков почки, дистальные канальцы DBA Клетки собирающих протоков почки, дистальные канальцы CD31 Эндотелиальные клетки почки (крыса) CD146 Эндотелиальные клетки почки (собака, человек) MHC//минорный антиген HC Редуцирован для придания клеткам иммунологической привилегированности

В Таблице 2 приведены выбранные маркеры, диапазон и средние значения, в процентах, для фенотипических маркеров в популяции ОПК, и обоснование их выбора.

Таблица 2. Маркеры, выбранные для фенотипического анализа ОПК

Фенотипический маркер Диапазон экспрессии Среднее Обоснование Уровень экспрессии CK18 81,1-99,7% (n=87) 96,7% Маркер эпителиальных клеток Высокий GGT1 4,5-81,2%
(n=63) 50,7% Функциональный маркер клеток канальцев Умеренный MHC//минорный антиген HC Редуцирован для придания клеткам иммунологической привилегированности >90% Иммунологическая привилегированность Низкий

Клеточная функция

ОПК активно секретируют белки, которые могут быть обнаружены при анализе кондиционированной среды. Клеточную функцию оценивают на основании способности клеток метаболизировать PrestoBlue и секретировать VEGF (фактор роста эндотелия сосудов) и KIM-1 (молекула повреждения почек 1).

В Таблице 3 приведены количества VEGF и KIM-1 в кондиционированной среде от почечных клеток и культур ОПК. Почечные клетки культивировали до состояния, близкого к конфлюэнтности. Кондиционированную среду, в которой почечные клетки находились в течение ночи, тестировали на VEGF и KIM-1.

Таблица 3. Продуцирование VEGF и KIM-1 человеческими почечными клетками и ОПК

Кондиционированная среда VEGF KIM-1 нг/мл нг/миллион клеток нг/мл нг/миллион клеток Культура почечных клеток
(n=15) 0,50-2,42 2,98-14,6 0,20-3,41 1,14-15,2 ОПК
(n=14) 0,80-3,85 4,83-23,07 0,32-2,10 1,93-12,59

Ферментативная активность ОПК

Клеточную функцию ОПК, до формулирования, также можно оценивать путем измерения активности двух конкретных ферментов; GGT (γ-глютамилтранспептидазы) и LAP (лейцинаминопептидазы), присутствующих в проксимальных канальцах почки.

Хотя в настоящем документе описаны композиции отобранных почечных клеток, по настоящему изобретению предусмотрены композиции, содержащие различные другие активные средства. Другие подходящие активные средства включают, без ограничения, клеточные агрегаты, бесклеточные биологические материалы, продукты, секретируемые биоактивными клетками, высокомолекулярные и низкомолекулярные терапевтические средства, а также их сочетания. Например, биоактивные клетки одного типа можно объединять с микроносителями на основе биологического материала с терапевтическими молекулами, или без них, или биоактивными клетками другого типа, неприкрепленные клетки можно объединять с бесклеточными частицами.

Иллюстративные методы генетической модификации

В конкретных вариантах осуществления генетическая модификация клетки, такой как БПК (например, ОПК), включает введение (например, за счет экспрессии или путем доставки через клеточную мембрану) редактирующего ген белка и/или нуклеиновой кислоты в БПК.

В конкретных вариантах осуществления редактирующий ген белок представляет собой нуклеазу «цинковые пальцы» (ZFN), эффекторную нуклеазу, подобную активаторам транскрипции (TALEN), megaTAL или белок Cas. В конкретных вариантах осуществления белок представляет собой одноцепочечную редкощепящую нуклеазную структуру («megaTAL»). В конкретных вариантах осуществления редактирующий ген белок, такой как ZFN, megaTAL или белок Cas (например, Cas9), может быть доставлен в виде белка или, альтернативно, в клетки доставляют полинуклеотид (такой как мРНК или вектор), кодирующий белок.

В конкретных вариантах осуществления белок Cas9 доставляют в виде белка. В конкретных вариантах осуществления в клетки доставляют полинуклеотид (такой как мРНК или вектор), кодирующий белок Cas9. В конкретных вариантах осуществления в клетку доставляют редактирующий ген полинуклеотид, такой как гРНК. В контексте системы CRISPR/Cas9 единая гид-РНК («гРНК» или «гид-РНК») содержит как направляющую последовательность (последовательность crРНК), так и последовательность рекрутинга нуклеазы Cas9 (tracrРНК). В конкретных вариантах осуществления в клетку доставляют crРНК и/или tracrРНК. В конкретных вариантах осуществления редактирующий ген полинуклеотид экспрессируется в клетке, например, с мРНК или вектора. В конкретных вариантах осуществления редактирующий ген комплекс, включающий белок Cas9 и гРНК или crРНК и tracrРНК, то есть, рибонуклеопротеидный (РНП) комплекс CRISPR, доставляют в клетку, или он экспрессируется в клетке.

В конкретных вариантах осуществления белок Cas (например, экспрессируемый или доставляемый в виде части РНП) используют для генетической модификации клетки. В конкретных вариантах осуществления белок Cas представляет собой белок Cas9 или его мутанты. Неограничивающие примеры белков Cas (включая Cas9 и неограничивающие примеры мутантов Cas9) описаны в настоящем документе.

В конкретных вариантах осуществления первая и вторая молекулы гРНК, или первая и вторая молекулы crРНК, вместе представляют собой нуклеотидные последовательности, комплементарные последовательностям-мишеням, фланкирующим ген или его фрагмент (например, промотор и/или один или более его экзонов и/или интронов), при этом ген, или его фрагмент, имеет длину примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1-100 тысяч пар нуклеотидов, или имеет длину по меньшей мере примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1-100 тысяч пар нуклеотидов. В конкретных вариантах осуществления пары РНП, включающие первую и вторую молекулы гРНК, или первую и вторую молекулы crРНК, экспрессируются в клетке, или их доставляют в клетку. В конкретных вариантах осуществления один компонент РНП (такой как белок Cas или гРНК) экспрессируется в клетке, а другой компонент (такой как гРНК или белок Cas) доставляют через клеточную мембрану в клетку.

В конкретных вариантах осуществления последовательность-мишень гРНК или crРНК имеет длину от примерно 12 до примерно 25, или примерно 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 17-23, или 18-22 нуклеотидов. В конкретных вариантах осуществления последовательность-мишень имеет длину 20 нуклеотидов или примерно 20 нуклеотидов.

В конкретных вариантах осуществления эпигеномная модификация в геномном локусе-мишени может изменять доступность сайта-мишени ДНК для белка Cas. В конкретных вариантах осуществления гРНК нацелена на ген вблизи его сайта начала транскрипции и/или в области открытого хроматина, характеризуемой обширным метилированием остатка H3K4 (или другого) нуклеосомы. В конкретных вариантах осуществления последовательность-мишень находится в пределах примерно 5000, 2500, 2000, 1500, 1250, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 50 или 25 оснований от сайта начала транскрипции (например, либо на 5’-конце, либо на 3’-конце) гена-мишени. В конкретных вариантах осуществления последовательность-мишень перекрывается с, или комплементарна с, по меньшей мере частью сайта начала транскрипции гена. В конкретных вариантах осуществления можно использовать общедоступные программы (CHOPCHOP, WU-CRISPR) для проектирования направляющих конструктов CRISPR (определяемых связыванием гРНК последовательностей ДНК). Неограничивающие примеры потенциальных сайтов-мишеней гРНК для генов B2M и HLA-A приведены в Таблицах 4 и 5.

Таблица 4. Результаты CHOPCHOP, показывающие потенциальные геномные сайты-мишени для гид-РНК, специально спроектированных для нокдауна гена b2-микроглобулина NM_004048

Список Последовательность-мишень Геномная локализация Экзон Цепь GC (%) Самокомплементарность Мимо цели Эффективность 0 1 2 3 1 CGCGAGCACAGCTAAGGCCACGG (SEQ ID NO: 17) chr15:44711557 1 - 65 2 1 0 0 0 0,68 2 TCACGTCATCCAGCAGAGAATGG (SEQ ID NO: 18) chr15:44715446 2 + 50 0 1 0 0 0 0,55 3 ACAAAGTCACATGGTTCACACGG (SEQ ID NO: 19) chr15:44715655 2 - 40 1 1 0 0 0 0,52 4 GAGTAGCGCGAGCACAGCTAAGG (SEQ ID NO: 20) chr15:44711563 1 - 60 1 1 0 0 1 0,62 5 AGTCACATGGTTCACACGGCAGG (SED ID NO: 21) chr15:44715651 2 - 55 0 1 0 0 1 0,57 6 AAGTCAACTTCAATGTCGGATGG (SEQ ID NO: 22) chr15:44715509 2 - 40 0 1 0 0 1 0,56 7 ACTCACGCTGGATAGCCTCCAGG (SEQ ID NO: 23) chr15:44711597 1 - 60 2 1 0 0 1 0,53 8 TCCTGAATTGCTATGTGTCTGGG (SEQ ID NO: 24) chr15:44715480 2 + 40 0 1 0 0 1 0,44 9 GGCCACGGAGCGAGACATCTCGG (SEQ ID NO: 25) chr15:44711542 1 - 65 2 1 0 0 1 0,45 10 CGTGAGTAAACCTGAATCTTTGG (SEQ ID NO: 26) chr15:44715428 2 - 40 0 1 0 0 1 0,4 11 TTGGAGTACCTGAGGAATATCGG (SEQ ID NO: 27) chr15:44715409 2 - 40 0 1 0 0 1 0,38 12 CAGTAAGTCAACTTCAATGTCGG (SEQ ID NO: 28) chr15:44715513 2 - 35 1 1 0 0 0 0,58 13 GCATACTCATCTTTTTCAGTGGG (SEQ ID NO: 29) chr15:44715629 2 - 35 0 1 0 0 0 0,52 14 AGGGTAGGAGAGACTCACGCTGG (SEQ ID NO: 30) chr15:44711609 1 - 60 0 1 0 0 2 0,6 15 GGCCGAGATGTCTCGCTCCGTGG (SEQ ID NO: 31) chr15:44711540 1 + 70 2 1 0 0 2 0,5 16 GAGACATGTAAGCAGCATCATGG (SEQ ID NO: 32) chr15:44716332 3 + 45 0 1 0 0 2 0,42 17 GTCTTTTCCCGATATTCCTCAGG (SEQ ID NO: 33) chr15:44715401 2 + 45 0 1 0 0 2 0,4 18 CATACTCATCTTTTTCAGTGGGG (SEQ ID NO: 34) chr15:44715628 2 - 35 0 1 0 0 1 0,49 19 ACAGCCCAAGATAGTTAAGTGGG (SEQ ID NO: 35) chr15:44715679 2 + 40 1 1 0 1 1 0,48 20 ACATGTAAGCAGCATCATGGAGG (SEQ ID NO: 36) chr15:44716335 3 + 45 1 1 0 0 3 0,63 21 GGCATACTCATCTTTTTCAGTGG (SEQ ID NO: 37) chr15:44715630 2 - 40 0 1 0 0 3 0,47 22 TGGAGTACCTGAGGAATATCGGG (SEQ ID NO: 38) chr15:44715408 2 - 45 0 1 0 0 3 0,38 23 TTCCTGAATTGCTATGTGTCTGG (SEQ ID NO: 39) chr15:44715479 2 + 40 0 1 0 0 3 0,26 24 TCGATCTATGAAAAAGACAGTGG (SEQ ID NO: 40) chr15:44716311 3 - 35 0 1 0 0 2 0,67 25 CACAGCCCAAGATAGTTAAGTGG (SEQ ID NO: 41) chr15:44715678 2 + 45 1 1 0 0 4 0,51 26 TTCAGACTTGTCTTTCAGCAAGG (SEQ ID NO: 42) chr15:44715568 2 + 40 2 1 0 0 4 0,47 27 ATACTCATCTTTTTCAGTGGGGG (SEQ ID NO: 43) chr15:44715627 2 - 35 0 1 0 0 3 0,64 28 TTACCCCACTTAACTATCTTGGG (SEQ ID NO: 44) chr15:44715683 2 - 35 1 1 0 0 3 0,37 29 ACTTGTCTTTCAGCAAGGACTGG (SEQ ID NO: 45) chr15:44715573 2 + 45 1 1 0 1 3 0,55 30 CAGCCCAAGATAGTTAAGTGGGG (SEQ ID NO: 46) chr15:44715680 2 + 45 1 1 0 0 5 0,58 31 ACCCAGACACATAGCAATTCAGG (SEQ ID NO: 47) chr15:44715481 2 - 45 0 1 0 0 5 0,33 32 TGGGCTGTGACAAAGTCACATGG (SEQ ID NO: 48) chr15:44715664 2 - 50 4 1 0 1 4 0,56 33 GCTACTCTCTCTTTCTGGCCTGG (SEQ ID NO: 49) chr15:44711579 1 + 55 0 1 0 0 6 0,47 34 CTCGCGCTACTCTCTCTTTCTGG (SEQ ID NO: 50) chr15:44711574 1 + 55 0 1 0 0 6 0,27 35 CTCAGGTACTCCAAAGATTCAGG (SEQ ID NO: 51) chr15:44715418 2 + 45 0 1 0 1 8 0,41 36 CTGAATCTTTGGAGTACCTGAGG (SEQ ID NO: 52) chr15:44715417 2 - 45 0 1 0 1 11 0,56 37 ACTCTCTCTTTCTGGCCTGGAGG (SEQ ID NO: 53) chr15:44711582 1 + 55 1 1 0 0 14 0,51 38 CTTACCCCACTTAACTATCTTGG (SEQ ID NO: 54) chr15:44715684 2 - 40 0 1 0 1 13 0,34 39 TTTGACTTTCCATTCTCTGCTGG (SEQ ID NO: 55) chr15:44715455 2 - 40 0 1 0 0 16 0,5 40 GAAGTTGACTTACTGAAGAATGG (SEQ ID NO: 56) chr15:44715521 2 + 35 1 1 0 0 17 0,53 41 TGGAGAGAGAATTGAAAAAGTGG (SEQ ID NO: 57) chr15:44715541 2 + 35 0 1 0 0 19 0,65

Таблица 5. Результаты CHOPCHOP, показывающие потенциальные геномные сайты-мишени для гид-РНК, специально спроектированных для нокдауна гена HLA-A NM_002116

Список Последовательность-мишень Геномная локализация Экзон Цепь GC (%) Самокомплементарность Мимо цели Эффективность 0 1 2 3 1 CAGTTGAGAGCCTACCTGGATGG (SEQ ID NO: 58) chr6:29943459 3 + 55 2 0 0 0 2 0,51 2 TGCCGTCGTAGGCGTCCTGCCGG (SEQ ID NO: 59) chr6:29943335 3 - 70 0 3 0 0 0 0,46 3 GGCGCTTCCTCCGCGGGTACCGG (SEQ ID NO: 60) chr6:29943316 3 + 75 0 3 0 0 0 0,48 4 AGACTGACCGAGTGGACCTGGGG (SEQ ID NO: 61) chr6:29942970 2 + 60 3 0 2 4 1 0,58 5 CAGACTGACCGAGTGGACCTGGG (SEQ ID NO: 62) chr6:29942969 2 + 60 3 0 2 4 1 0,57 6 ACAGACTGACCGAGTGGACCTGG (SEQ ID NO: 63) chr6:29942968 2 + 60 2 0 2 4 2 0,42 7 CTTCCTCCGCGGGTACCGGCAGG (SEQ ID NO: 64) chr6:29943320 3 + 75 0 3 1 1 0 0,6 8 TACCGGCAGGACGCCTACGACGG (SEQ ID NO: 65) chr6:29943333 3 + 65 2 3 1 1 2 0,68 9 AGGCGTCCTGCCGGTACCCGCGG (SEQ ID NO: 66) chr6:29943326 3 - 75 0 3 1 1 2 0,64 10 CGTCCTGCCGGTACCCGCGGAGG (SEQ ID NO: 67) chr6:29943323 3 - 80 0 3 2 0 2 0,73 11 CCAGTCACAGACTGACCGAGTGG (SEQ ID NO: 68) chr6:29942962 2 + 60 3 0 0 2 12 0,55 12 GCAGCCATACATTATCTGGATGG (SEQ ID NO: 69) chr6:29943277 3 - 45 1 2 2 1 10 0,47 13 CCAGGAGACACGGAATGTGAAGG (SEQ ID NO: 70) chr6:29942938 2 + 55 2 1 2 1 13 0,72 14 CTCTCAACTGCTCCGCCTCATGG (SEQ ID NO: 71) chr6:29943446 3 - 60 1 0 3 6 6 0,4 15 TTGTAAAGGTGAGAGCTTGGAGG (SEQ ID NO: 72) chr6:29945274 7 + 45 0 2 5 0 7 0,52 16 TCGCTGCCGTGATGTGGAGGAGG (SEQ ID NO: 73) chr6:29944584 5 + 65 0 2 3 6 4 0,66 17 GGCGCCATGACGGCCATCCTCGG (SEQ ID NO: 74) chr6:29942548 1 - 70 1 6 0 0 9 0,52 18 TGTGTCTTGGGGGGGTCTGACGG (SEQ ID NO: 75) chr6:29944115 4 - 60 0 6 0 3 5 0,47 19 GCGCCCGCGGCTCCATCCTCTGG (SEQ ID NO: 76) chr6:29942881 2 - 80 0 7 3 0 3 0,53 20 CTCAGGTGGAGAAGGGGTGAAGG (SEQ ID NO: 77) chr6:29944612 5 + 60 0 2 3 2 15 0,55 21 ATTTCTTCACATCCGTGTCCCGG (SEQ ID NO: 78) chr6:29942775 2 + 45 0 5 0 3 12 0,5 22 GTGGACCTGGGGACCCTGCGCGG (SEQ ID NO: 79) chr6:29942981 2 + 75 2 2 0 4 17 0,57 23 TTCACATCCGTGTCCCGGCCCGG (SEQ ID NO: 80) chr6:29942780 2 + 65 0 5 0 4 11 0,45 24 AGCTTGTAAAGGTGAGAGCTTGG (SEQ ID NO: 81) chr6:29945271 7 + 45 0 2 5 1 14 0,42 25 ACGGCCATCCTCGGCGTCTGGGG (SEQ ID NO: 82) chr6:29942539 1 - 70 0 6 0 0 16 0,41 26 GACGGCCATCCTCGGCGTCTGGG (SEQ ID NO: 83) chr6:29942540 1 - 70 0 6 0 0 16 0,39 27 TCAGGTGGAGAAGGGGTGAAGGG (SEQ ID NO: 84) chr6:29944613 5 + 55 0 2 2 1 21 0,45 28 GACGCCGAGGATGGCCGTCATGG (SEQ ID NO: 85) chr6:29942544 1 + 70 0 6 0 0 17 0,46 29 TGACGGCCATCCTCGGCGTCTGG (SEQ ID NO: 86) chr6:29942541 1 - 70 3 6 0 0 17 0,4 30 TCTCAACTGCTCCGCCTCATGGG (SEQ ID NO: 87) chr6:29943445 3 - 55 1 0 3 12 12 0,37 31 GTATGGCTGCGACGTGGGGTCGG (SEQ ID NO: 88) chr6:29943290 3 + 65 0 3 4 14 0 0,54 32 CACTCGGTCAGTCTGTGACTGGG (SEQ ID NO: 89) chr6:29942961 2 - 55 2 0 9 8 7 0,56 33 CGCACGGGTACCAGGGGCCACGG (SEQ ID NO: 90) chr6:29943537 3 + 75 1 6 7 5 0 0,58 34 GGATGTGAAGAAATACCTCATGG (SEQ ID NO: 91) chr6:29942766 2 - 40 0 5 0 3 21 0,57 35 CACACCATCCAGATAATGTATGG (SEQ ID NO: 92) chr6:29943273 3 + 40 0 2 2 7 19 0,42 36 CGTCGCAGCCATACATTATCTGG (SEQ ID NO: 93) chr6:29943281 3 - 50 1 2 9 4 10 0,35 37 CGGCTCCATCCTCTGGCTCGCGG (SEQ ID NO: 94) chr6:29942874 2 - 70 0 8 2 0 16 0,61 38 GTGTCTTGGGGGGGTCTGACGGG (SEQ ID NO: 95) chr6:29944114 4 - 65 0 6 0 9 13 0,32 39 ACAGCGACGCCGCGAGCCAGAGG (SEQ ID NO: 96) chr6:29942865 2 + 75 1 8 0 2 18 0,68 40 CGACGCCGCGAGCCAGAGGATGG (SEQ ID NO: 97) chr6:29942869 2 + 75 2 8 2 8 8 0,6 41 GATAATGTATGGCTGCGACGTGG (SEQ ID NO: 98) chr6:29943284 3 + 50 0 2 8 12 10 0,62 42 ATAATGTATGGCTGCGACGTGGG (SEQ ID NO: 99) chr6:29943285 3 + 45 0 2 8 13 9 0,52 43 CACCAAGCGCAAGTGGGAGGCGG (SEQ ID NO: 100) chr6:29943422 3 + 65 0 50 50 50 50 0,74 44 GCTGCAAGTAAGTATGAAGGAGG (SEQ ID NO: 101) chr6:29945085 6 + 45 0 50 50 50 50 0,73 45 CGTGGAGACCAGGCCTGCAGGGG (SEQ ID NO: 102) chr6:29944264 4 + 70 1 50 50 50 50 0,72 46 GGTGGAGAAGGGGTGAAGGGTGG (SEQ ID NO: 103) chr6:29944616 5 + 65 0 50 50 50 50 0,71 47 CTGCAGCGCACGGGTACCAGGGG (SEQ ID NO: 104) chr6:29943531 3 + 70 1 50 50 50 50 0,72 48 CGGCTACTACAACCAGAGCGAGG (SEQ ID NO: 105) chr6:29943001 2 + 60 0 50 50 50 50 0,71 49 AGATCACACTGACCTGGCAGCGG (SEQ ID NO: 106) chr6:29944209 4 + 55 0 50 50 50 50 0,69 50 TGTGGTGGTGCCTTCTGGAGAGG (SEQ ID NO: 107) chr6:29944312 4 + 60 1 50 50 50 50 0,68 51 AGACAGCTCTGGGAAAAGAGGGG (SEQ ID NO: 108) chr6:29944485 5 - 50 2 50 50 50 50 0,69 52 GAAGAGCTCAGGTGGAGAAGGGG (SEQ ID NO: 109) chr6:29944606 5 + 55 0 50 50 50 50 0,67 53 TGAAGAAATACCTCATGGAGTGG (SEQ ID NO: 110) chr6:29942761 2 - 40 0 50 50 50 50 0,67 54 TAGCCCACGGCGATGAAGCGGGG (SEQ ID NO: 111) chr6:29942813 2 - 65 1 50 50 50 50 0,68 55 CGTGTCGTCCACGTAGCCCACGG (SEQ ID NO: 112) chr6:29942826 2 - 65 2 50 50 50 50 0,68 56 GATCACCAAGCGCAAGTGGGAGG (SEQ ID NO: 113) chr6:29943419 3 + 60 0 50 50 50 50 0,66 57 GGACCTGCGCTCTTGGACCGCGG (SEQ ID NO: 114) chr6:29943380 3 + 70 2 50 50 50 50 0,68 58 GGCGCCGTGGATAGAGCAGGAGG (SEQ ID NO: 115) chr6:29942899 2 + 70 0 50 50 50 50 0,66 59 CGCCGTGGATAGAGCAGGAGGGG (SEQ ID NO: 116) chr6:29942901 2 + 65 0 50 50 50 50 0,66 60 TGGATGGCACGTGCGTGGAGTGG (SEQ ID NO: 117) chr6:29943475 3 + 65 1 50 50 50 50 0,67 61 CTTCTCACAGATAGAAAAGGAGG (SEQ ID NO: 118) chr6:29945049 6 + 40 0 50 50 50 50 0,66 62 TGGTCGCTGCCGTGATGTGGAGG (SEQ ID NO: 119) chr6:29944581 5 + 65 0 50 50 50 50 0,66 63 CAGATTCTCCCCAGACGCCGAGG (SEQ ID NO: 120) chr6:29942531 1 + 65 1 50 50 50 50 0,66 64 GGATGGGGAGGACCAGACCCAGG (SEQ ID NO: 121) chr6:29944231 4 + 70 1 50 50 50 50 0,66 65 TGGGGTAAGGAGGGAGATGGGGG (SEQ ID NO: 122) chr6:29944394 4 + 60 0 50 50 50 50 0,65 66 CTCATGGAGTGGGAGCCTGGGGG (SEQ ID NO: 123) chr6:29942750 2 - 65 2 50 50 50 50 0,67 67 CAGATACCTGGAGAACGGGAAGG (SEQ ID NO: 124) chr6:29943503 3 + 55 1 50 50 50 50 0,66 68 GAGCCAGAGGATGGAGCCGCGGG (SEQ ID NO: 125) chr6:29942878 2 + 70 1 50 50 50 50 0,65 69 CCTGGCCCTGACCCAGACCTGGG (SEQ ID NO: 126) chr6:29942601 1 + 70 0 50 50 50 50 0,64 70 CATGGTCAGAGATGGGGTGGTGG (SEQ ID NO: 127) chr6:29944144 4 - 60 0 50 50 50 50 0,64 71 TGGAGGAGGAAGAGCTCAGGTGG (SEQ ID NO: 128) chr6:29944598 5 + 60 0 50 50 50 50 0,64 72 TTGGACCGCGGCGGACATGGCGG (SEQ ID NO: 129) chr6:29943392 3 + 70 4 50 50 50 50 0,67 73 TGGAACCTTCCAGAAGTGGGCGG (SEQ ID NO: 130) chr6:29944288 4 + 55 2 50 50 50 50 0,65 74 CCTCCTCCTGCTACTCTCGGGGG (SEQ ID NO: 131) chr6:29942577 1 + 65 0 50 50 50 50 0,63 75 AGCTCTGGGAAAAGAGGGGAAGG (SEQ ID NO: 132) chr6:29944481 5 - 55 1 50 50 50 50 0,64 76 GGGATGGAACCTTCCAGAAGTGG (SEQ ID NO: 133) chr6:29944284 4 + 55 3 50 50 50 50 0,65 77 AGATGGGGTAAGGAGGGAGATGG (SEQ ID NO: 134) chr6:29944391 4 + 55 0 50 50 50 50 0,62 78 GGTGGCCTCATGGTCAGAGATGG (SEQ ID NO: 135) chr6:29944152 4 - 60 1 50 50 50 50 0,62 79 CTGACCATGAGGCCACCCTGAGG (SEQ ID NO: 136) chr6:29944158 4 + 65 1 50 50 50 50 0,62 80 GGGTCATATGTGTCTTGGGGGGG (SEQ ID NO: 137) chr6:29944123 4 - 55 0 50 50 50 50 0,61 81 CTCCGCAGGGTAGAAGCCCAGGG (SEQ ID NO: 138) chr6:29944188 4 - 65 1 50 50 50 50 0,62 82 AAGCCCCTCACCCTGAGATGGGG (SEQ ID NO: 139) chr6:29944376 4 + 60 1 50 50 50 50 0,62 83 GTGGAGAAGGGGTGAAGGGTGGG (SEQ ID NO: 140) chr6:29944617 5 + 60 0 50 50 50 50 0,61 84 GTGGATAGAGCAGGAGGGGCCGG (SEQ ID NO: 141) chr6:29942905 2 + 65 0 50 50 50 50 0,61 85 TGCTCTATCCACGGCGCCCGCGG (SEQ ID NO: 142) chr6:29942894 2 - 70 1 50 50 50 50 0,62 86 AAAAGGAGGGAGTTACACTCAGG (SEQ ID NO: 143) chr6:29945063 6 + 45 1 50 50 50 50 0,61 87 TGAGGGACACATCAGAGCCCTGG (SEQ ID NO: 144) chr6:29945247 7 - 60 2 50 50 50 50 0,62 88 GAAGGAGACGCTGCAGCGCACGG (SEQ ID NO: 145) chr6:29943521 3 + 65 1 50 50 50 50 0,61 89 TCTCCGCAGGGTAGAAGCCCAGG (SEQ ID NO: 146) chr6:29944189 4 - 65 1 50 50 50 50 0,61 90 GAAGACAGCTCTGGGAAAAGAGG (SEQ ID NO: 147) chr6:29944487 5 - 50 0 50 50 50 50 0,59 91 CCAGAAGTGGGCGGCTGTGGTGG (SEQ ID NO: 148) chr6:29944297 4 + 70 0 50 50 50 50 0,59 92 TCTGGTTGTAGTAGCCGCGCAGG (SEQ ID NO: 149) chr6:29942995 2 - 60 2 50 50 50 50 0,61 93 AATGATGCCCACGATGGGGATGG (SEQ ID NO: 150) chr6:29944518 5 - 55 1 50 50 50 50 0,6 94 TGGAAGGTTCCATCCCCTGCAGG (SEQ ID NO: 151) chr6:29944277 4 - 60 2 50 50 50 50 0,61 95 ACTGACCTGGCAGCGGGATGGGG (SEQ ID NO: 152) chr6:29944216 4 + 65 0 50 50 50 50 0,59 96 AGGAAGAGCTCAGGTGGAGAAGG (SEQ ID NO: 153) chr6:29944604 5 + 55 0 50 50 50 50 0,59 97 ATGTGGAGGAGGAAGAGCTCAGG (SEQ ID NO: 154) chr6:29944595 5 + 55 0 50 50 50 50 0,59 98 GAGCCCCGCTTCATCGCCGTGGG (SEQ ID NO: 155) chr6:29942810 2 + 70 0 50 50 50 50 0,58 99 CAGGTCAGTGTGATCTCCGCAGG (SEQ ID NO: 156) chr6:29944202 4 - 60 0 50 50 50 50 0,58 100 GCGCCGTGGATAGAGCAGGAGGG (SEQ ID NO: 157) chr6:29942900 2 + 65 0 50 50 50 50 0,58 101 AGACCTGGGCGGGTGAGTGCGGG (SEQ ID NO: 158) chr6:29942615 1 + 70 1 50 50 50 50 0,59 102 GGAGGACCAGACCCAGGACACGG (SEQ ID NO: 159) chr6:29944237 4 + 65 2 50 50 50 50 0,6 103 GAGACCAGGCCTGCAGGGGATGG (SEQ ID NO: 160) chr6:29944268 4 + 70 2 50 50 50 50 0,6 104 TATCTCTGCTCCTCTCCAGAAGG (SEQ ID NO: 161) chr6:29944322 4 - 50 1 50 50 50 50 0,59 105 CACCCTGAGATGGGGTAAGGAGG (SEQ ID NO: 162) chr6:29944384 4 + 60 0 50 50 50 50 0,58 106 CGTAGCCCACGGCGATGAAGCGG (SEQ ID NO: 163) chr6:29942815 2 - 65 3 50 50 50 50 0,61 107 TGGGTCATATGTGTCTTGGGGGG (SEQ ID NO: 164) chr6:29944124 4 - 50 0 50 50 50 50 0,57 108 CCCAGGCAGTGACAGTGCCCAGG (SEQ ID NO: 165) chr6:29945229 7 + 70 2 50 50 50 50 0,59 109 GGATGGAACCTTCCAGAAGTGGG (SEQ ID NO: 166) chr6:29944285 4 + 50 3 50 50 50 50 0,6 110 CCAAGCCCCTCACCCTGAGATGG (SEQ ID NO: 167) chr6:29944374 4 + 65 2 50 50 50 50 0,59 111 CAAGTGGGAGGCGGCCCATGAGG (SEQ ID NO: 168) chr6:29943431 3 + 70 1 50 50 50 50 0,58 112 GGAAGAGCTCAGGTGGAGAAGGG (SEQ ID NO: 169) chr6:29944605 5 + 55 0 50 50 50 50 0,56 113 CAGCAATGATGCCCACGATGGGG (SEQ ID NO: 170) chr6:29944522 5 - 55 2 50 50 50 50 0,58 114 ATGGGGTAAGGAGGGAGATGGGG (SEQ ID NO: 171) chr6:29944393 4 + 55 0 50 50 50 50 0,56 115 CTGCGGAGATCACACTGACCTGG (SEQ ID NO: 172) chr6:29944203 4 + 60 1 50 50 50 50 0,57 116 GAAGAAATACCTCATGGAGTGGG (SEQ ID NO: 173) chr6:29942760 2 - 40 0 50 50 50 50 0,56 117 TCAGATCACCAAGCGCAAGTGGG (SEQ ID NO: 174) chr6:29943416 3 + 50 0 50 50 50 50 0,56 118 GCTCTTCCTCCTCCACATCACGG (SEQ ID NO: 175) chr6:29944590 5 - 55 0 50 50 50 50 0,56 119 GGATTACATCGCCCTGAACGAGG (SEQ ID NO: 176) chr6:29943359 3 + 55 0 50 50 50 50 0,56 120 AAGACAGCTCTGGGAAAAGAGGG (SEQ ID NO: 177) chr6:29944486 5 - 45 1 50 50 50 50 0,57 121 CCAGGCAGTGACAGTGCCCAGGG (SEQ ID NO: 178) chr6:29945230 7 + 65 1 50 50 50 50 0,57 122 AGCTGTGATCACTGGAGCTGTGG (SEQ ID NO: 179) chr6:29944561 5 + 55 0 50 50 50 50 0,56 123 AAGGAGACGCTGCAGCGCACGGG (SEQ ID NO: 180) chr6:29943522 3 + 65 1 50 50 50 50 0,56 124 TCACAGCTCCAAGGAGAACCAGG (SEQ ID NO: 181) chr6:29944546 5 - 55 2 50 50 50 50 0,57 125 ACACTGACCTGGCAGCGGGATGG (SEQ ID NO: 182) chr6:29944214 4 + 65 2 50 50 50 50 0,57 126 GGCCCTGGGCTTCTACCCTGCGG (SEQ ID NO: 183) chr6:29944186 4 + 70 1 50 50 50 50 0,56 127 TTCTGTTTTTGTTCTACCCCAGG (SEQ ID NO: 184) chr6:29945212 7 + 40 0 50 50 50 50 0,55 128 CTGGGCACTGTCACTGCCTGGGG (SEQ ID NO: 185) chr6:29945228 7 - 65 2 50 50 50 50 0,57 129 GTGTCCCTCACAGCTTGTAAAGG (SEQ ID NO: 186) chr6:29945260 7 + 50 0 50 50 50 50 0,55 130 AGGTCAGTGTGATCTCCGCAGGG (SEQ ID NO: 187) chr6:29944201 4 - 55 0 50 50 50 50 0,54 131 CAGCCCACCATCCCCATCGTGGG (SEQ ID NO: 188) chr6:29944511 5 + 65 0 50 50 50 50 0,54 132 GATCACACTGACCTGGCAGCGGG (SEQ ID NO: 189) chr6:29944210 4 + 60 2 50 50 50 50 0,56 133 GCAGACCCTCATGCTGCACATGG (SEQ ID NO: 190) chr6:29944351 4 - 60 0 50 50 50 50 0,54 134 GCCAGCAATGATGCCCACGATGG (SEQ ID NO: 191) chr6:29944524 5 - 60 1 50 50 50 50 0,55 135 GATGCCCACGATGGGGATGGTGG (SEQ ID NO: 192) chr6:29944515 5 - 65 1 50 50 50 50 0,55 136 GCTGCAGCGCACGGGTACCAGGG (SEQ ID NO: 193) chr6:29943530 3 + 70 2 50 50 50 50 0,55 137 TGGCCTCATGGTCAGAGATGGGG (SEQ ID NO: 194) chr6:29944150 4 - 55 1 50 50 50 50 0,54 138 ACACGGAGCTCGTGGAGACCAGG (SEQ ID NO: 195) chr6:29944254 4 + 65 3 50 50 50 50 0,56 139 CACGCACGTGCCATCCAGGTAGG (SEQ ID NO: 196) chr6:29943469 3 - 65 0 50 50 50 50 0,53 140 TGGGCTGGGAAGACAGCTCTGGG (SEQ ID NO: 197) chr6:29944495 5 - 60 1 50 50 50 50 0,54 141 ACCCGCCCAGGTCTGGGTCAGGG (SEQ ID NO: 198) chr6:29942606 1 - 70 2 50 50 50 50 0,55 142 GTAGCCCACGGCGATGAAGCGGG (SEQ ID NO: 199) chr6:29942814 2 - 65 2 50 50 50 50 0,55 143 GGTGGGTCATATGTGTCTTGGGG (SEQ ID NO: 200) chr6:29944126 4 - 50 0 50 50 50 50 0,52 144 GAGGGACACATCAGAGCCCTGGG (SEQ ID NO: 201) chr6:29945246 7 - 60 2 50 50 50 50 0,54 145 CTCCGCAGATACCTGGAGAACGG (SEQ ID NO: 202) chr6:29943498 3 + 55 0 50 50 50 50 0,52 146 TTCTCCCCAGACGCCGAGGATGG (SEQ ID NO: 203) chr6:29942535 1 + 65 0 50 50 50 50 0,52 147 GGGGCCGGAGTATTGGGACCAGG (SEQ ID NO: 204) chr6:29942920 2 + 70 2 50 50 50 50 0,54 148 TCCGCAGATACCTGGAGAACGGG (SEQ ID NO: 205) chr6:29943499 3 + 55 0 50 50 50 50 0,52 149 CTTACCCCATCTCAGGGTGAGGG (SEQ ID NO: 206) chr6:29944380 4 - 55 1 50 50 50 50 0,53 150 ATGAGGCCACCCTGAGGTGCTGG (SEQ ID NO: 207) chr6:29944164 4 + 65 1 50 50 50 50 0,53 151 GTGGGCTGGGAAGACAGCTCTGG (SEQ ID NO: 208) chr6:29944496 5 - 65 1 50 50 50 50 0,52 152 GCAGGACGCCTACGACGGCAAGG (SEQ ID NO: 209) chr6:29943338 3 + 70 3 50 50 50 50 0,54 153 GATGGGGTAAGGAGGGAGATGGG (SEQ ID NO: 210) chr6:29944392 4 + 55 0 50 50 50 50 0,51 154 TCCCTCCTTACCCCATCTCAGGG (SEQ ID NO: 211) chr6:29944386 4 - 55 1 50 50 50 50 0,52 155 CCCCAGGCTCCCACTCCATGAGG (SEQ ID NO: 212) chr6:29942751 2 + 70 0 50 50 50 50 0,51 156 CTGGTTGTAGTAGCCGCGCAGGG (SEQ ID NO: 213) chr6:29942994 2 - 60 2 50 50 50 50 0,53 157 CACCTGCCATGTGCAGCATGAGG (SEQ ID NO: 214) chr6:29944345 4 + 60 3 50 50 50 50 0,54 158 CTCACCTTTACAAGCTGTGAGGG (SEQ ID NO: 215) chr6:29945264 7 - 45 0 50 50 50 50 0,51 159 GAGGGTTCGGGGCGCCATGACGG (SEQ ID NO: 216) chr6:29942558 1 - 70 0 50 50 50 50 0,51 160 CCCTCCTCCTGCTACTCTCGGGG (SEQ ID NO: 217) chr6:29942576 1 + 65 0 50 50 50 50 0,51 161 CCACCCCATCTCTGACCATGAGG (SEQ ID NO: 218) chr6:29944147 4 + 60 1 50 50 50 50 0,51 162 GGCCCCTCCTGCTCTATCCACGG (SEQ ID NO: 219) chr6:29942903 2 - 65 0 50 50 50 50 0,5 163 GTCTCCTGGTCCCAATACTCCGG (SEQ ID NO: 220) chr6:29942924 2 - 55 0 50 50 50 50 0,5 164 CCAGCCCACCATCCCCATCGTGG (SEQ ID NO: 221) chr6:29944510 5 + 70 1 50 50 50 50 0,51 165 ACCCTGAGATGGGGTAAGGAGGG (SEQ ID NO: 222) chr6:29944385 4 + 55 1 50 50 50 50 0,51 166 GTGGGTCATATGTGTCTTGGGGG (SEQ ID NO: 223) chr6:29944125 4 - 50 0 50 50 50 50 0,5 167 GATGTAATCCTTGCCGTCGTAGG (SEQ ID NO: 224) chr6:29943346 3 - 50 0 50 50 50 50 0,5 168 CTCAGATCACCAAGCGCAAGTGG (SEQ ID NO: 225) chr6:29943415 3 + 55 0 50 50 50 50 0,5 169 AGTAGCAGGAGGAGGGTTCGGGG (SEQ ID NO: 226) chr6:29942569 1 - 60 1 50 50 50 50 0,51 170 CACAGCCGCCCACTTCTGGAAGG (SEQ ID NO: 227) chr6:29944293 4 - 65 1 50 50 50 50 0,5 171 GTGGCCTCATGGTCAGAGATGGG (SEQ ID NO: 228) chr6:29944151 4 - 55 1 50 50 50 50 0,5 172 GTGGTGGGTCATATGTGTCTTGG (SEQ ID NO: 229) chr6:29944128 4 - 50 0 50 50 50 50 0,49 173 CTCCAGTGATCACAGCTCCAAGG (SEQ ID NO: 230) chr6:29944555 5 - 55 0 50 50 50 50 0,49 174 GACCCAGGACACGGAGCTCGTGG (SEQ ID NO: 231) chr6:29944246 4 + 70 3 50 50 50 50 0,52 175 CTGTGGTCGCTGCCGTGATGTGG (SEQ ID NO: 232) chr6:29944578 5 + 65 0 50 50 50 50 0,48 176 CTACCTGGATGGCACGTGCGTGG (SEQ ID NO: 233) chr6:29943470 3 + 65 1 50 50 50 50 0,49 177 CCTCACCCTGAGATGGGGTAAGG (SEQ ID NO: 234) chr6:29944381 4 + 60 1 50 50 50 50 0,48 178 ACCCTGAGGTGCTGGGCCCTGGG (SEQ ID NO: 235) chr6:29944172 4 + 70 2 50 50 50 50 0,49 179 CTCGTGGAGACCAGGCCTGCAGG (SEQ ID NO: 236) chr6:29944262 4 + 70 1 50 50 50 50 0,48 180 GCACTCACCCGCCCAGGTCTGGG (SEQ ID NO: 237) chr6:29942612 1 - 70 2 50 50 50 50 0,49 181 ACCTCATGGAGTGGGAGCCTGGG (SEQ ID NO: 238) chr6:29942752 2 - 60 3 50 50 50 50 0,5 182 CTTCCAGAAGTGGGCGGCTGTGG (SEQ ID NO: 239) chr6:29944294 4 + 65 0 50 50 50 50 0,46 183 GTGAGACAGCTGCCTTGTGTGGG (SEQ ID NO: 240) chr6:29945452 8 + 55 1 50 50 50 50 0,47 184 TACTACAACCAGAGCGAGGCCGG (SEQ ID NO: 241) chr6:29943005 2 + 55 0 50 50 50 50 0,46 185 TGGACGACACGCAGTTCGTGCGG (SEQ ID NO: 242) chr6:29942838 2 + 60 3 50 50 50 50 0,49 186 TCCCGTTCTCCAGGTATCTGCGG (SEQ ID NO: 243) chr6:29943500 3 - 55 0 50 50 50 50 0,46 187 CTCTTGGACCGCGGCGGACATGG (SEQ ID NO: 244) chr6:29943389 3 + 70 4 50 50 50 50 0,5 188 CCCATCGTGGGCATCATTGCTGG (SEQ ID NO: 245) chr6:29944523 5 + 60 0 50 50 50 50 0,45 189 AGAGTAGCAGGAGGAGGGTTCGG (SEQ ID NO: 246) chr6:29942571 1 - 55 1 50 50 50 50 0,46 190 CAAGCCCCTCACCCTGAGATGGG (SEQ ID NO: 247) chr6:29944375 4 + 60 2 50 50 50 50 0,47 191 CGTGGGCATCATTGCTGGCCTGG (SEQ ID NO: 248) chr6:29944528 5 + 65 0 50 50 50 50 0,44 192 CACGATGGGGATGGTGGGCTGGG (SEQ ID NO: 249) chr6:29944509 5 - 65 0 50 50 50 50 0,44 193 ATCTGGATGGTGTGAGAACCTGG (SEQ ID NO: 250) chr6:29943264 3 - 50 0 50 50 50 50 0,44 194 ACCTGCCATGTGCAGCATGAGGG (SEQ ID NO: 251) chr6:29944346 4 + 55 3 50 50 50 50 0,47 195 TCTCACCTTTACAAGCTGTGAGG (SEQ ID NO: 252) chr6:29945265 7 - 45 0 50 50 50 50 0,44 196 GGTTCCATCCCCTGCAGGCCTGG (SEQ ID NO: 253) chr6:29944272 4 - 70 0 50 50 50 50 0,44 197 CAGACCTGGGCGGGTGAGTGCGG (SEQ ID NO: 254) chr6:29942614 1 + 70 1 50 50 50 50 0,44 198 GGAGTGGCTCCGCAGATACCTGG (SEQ ID NO: 255) chr6:29943491 3 + 65 1 50 50 50 50 0,44 199 AAGAGCGCAGGTCCTCGTTCAGG (SEQ ID NO: 256) chr6:29943371 3 - 60 0 50 50 50 50 0,43 200 TCGTGGAGACCAGGCCTGCAGGG (SEQ ID NO: 257) chr6:29944263 4 + 65 1 50 50 50 50 0,43 201 ATGCCCACGATGGGGATGGTGGG (SEQ ID NO: 258) chr6:29944514 5 - 60 1 50 50 50 50 0,43 202 TTACCCCATCTCAGGGTGAGGGG (SEQ ID NO: 259) chr6:29944379 4 - 55 3 50 50 50 50 0,45 203 CTTCATCGCCGTGGGCTACGTGG (SEQ ID NO: 260) chr6:29942818 2 + 65 0 50 50 50 50 0,42 204 AGAGCGCAGGTCCTCGTTCAGGG (SEQ ID NO: 261) chr6:29943370 3 - 60 0 50 50 50 50 0,41 205 GAGTAGCAGGAGGAGGGTTCGGG (SEQ ID NO: 262) chr6:29942570 1 - 60 1 50 50 50 50 0,42 206 AACCCTCCTCCTGCTACTCTCGG (SEQ ID NO: 263) chr6:29942574 1 + 55 0 50 50 50 50 0,41 207 CTCCTTGGAGCTGTGATCACTGG (SEQ ID NO: 264) chr6:29944553 5 + 55 1 50 50 50 50 0,42 208 TGTGAGACAGCTGCCTTGTGTGG (SEQ ID NO: 265) chr6:29945451 8 + 55 1 50 50 50 50 0,42 209 TGAGGCCACCCTGAGGTGCTGGG (SEQ ID NO: 266) chr6:29944165 4 + 65 1 50 50 50 50 0,41 210 ACTCCACGCACGTGCCATCCAGG (SEQ ID NO: 267) chr6:29943473 3 - 65 1 50 50 50 50 0,41 211 CACTGACCTGGCAGCGGGATGGG (SEQ ID NO: 268) chr6:29944215 4 + 65 1 50 50 50 50 0,41 212 CATCTCAGGGTGAGGGGCTTGGG (SEQ ID NO: 269) chr6:29944373 4 - 60 1 50 50 50 50 0,4 213 TCTCCACGAGCTCCGTGTCCTGG (SEQ ID NO: 270) chr6:29944249 4 - 65 1 50 50 50 50 0,4 214 ACCCTCATGCTGCACATGGCAGG (SEQ ID NO: 271) chr6:29944347 4 - 60 2 50 50 50 50 0,4 215 AGCAGGAGGGGCCGGAGTATTGG (SEQ ID NO: 272) chr6:29942913 2 + 65 1 50 50 50 50 0,39 216 GCGTCTCCTTCCCGTTCTCCAGG (SEQ ID NO: 273) chr6:29943509 3 - 65 0 50 50 50 50 0,38 217 CTCCCTCCTTACCCCATCTCAGG (SEQ ID NO: 274) chr6:29944387 4 - 60 0 50 50 50 50 0,38 218 CGAGCTCCGTGTCCTGGGTCTGG (SEQ ID NO: 275) chr6:29944243 4 - 70 0 50 50 50 50 0,37 219 GTCACTCACCGGCCTCGCTCTGG (SEQ ID NO: 276) chr6:29943013 2 - 70 1 50 50 50 50 0,38 220 ATGGTCAGAGATGGGGTGGTGGG (SEQ ID NO: 277) chr6:29944143 4 - 55 0 50 50 50 50 0,37 221 TGGTGGGTCATATGTGTCTTGGG (SEQ ID NO: 278) chr6:29944127 4 - 45 0 50 50 50 50 0,37 222 TGAACGAGGACCTGCGCTCTTGG (SEQ ID NO: 279) chr6:29943373 3 + 60 1 50 50 50 50 0,38 223 ATTGCTGGCCTGGTTCTCCTTGG (SEQ ID NO: 280) chr6:29944538 5 + 55 1 50 50 50 50 0,37 224 ACCCTCCTCCTGCTACTCTCGGG (SEQ ID NO: 281) chr6:29942575 1 + 60 1 50 50 50 50 0,37 225 TACCTCATGGAGTGGGAGCCTGG (SEQ ID NO: 282) chr6:29942753 2 - 60 1 50 50 50 50 0,36 226 GCAGGAGGGGCCGGAGTATTGGG (SEQ ID NO: 283) chr6:29942914 2 + 65 1 50 50 50 50 0,34 227 GCGGCTGTGGTGGTGCCTTCTGG (SEQ ID NO: 284) chr6:29944307 4 + 70 1 50 50 50 50 0,34 228 GGAGCAGTTGAGAGCCTACCTGG (SEQ ID NO: 285) chr6:29943455 3 + 60 2 50 50 50 50 0,34 229 AGCACCTCAGGGTGGCCTCATGG (SEQ ID NO: 286) chr6:29944162 4 - 65 2 50 50 50 50 0,34 230 CTCCACGAGCTCCGTGTCCTGGG (SEQ ID NO: 287) chr6:29944248 4 - 65 1 50 50 50 50 0,33 231 CGGTGAGTGACCCCGGCCGGGGG (SEQ ID NO: 288) chr6:29943025 2 + 80 1 50 50 50 50 0,78 232 GGGCCCCCGAGAGTAGCAGGAGG (SEQ ID NO: 289) chr6:29942580 1 - 75 1 50 50 50 50 0,75 233 CAGGGCCCAGCACCTCAGGGTGG (SEQ ID NO: 290) chr6:29944170 4 - 75 0 50 50 50 50 0,71 234 GGGAGCCTGGGGGCGAGCAGTGG (SEQ ID NO: 291) chr6:29942740 2 - 80 2 50 50 50 50 0,72 235 CTGAGCCGCCATGTCCGCCGCGG (SEQ ID NO: 292) chr6:29943397 3 - 75 1 50 50 50 50 0,71 236 CCGGTGAGTGACCCCGGCCGGGG (SEQ ID NO: 293) chr6:29943024 2 + 80 2 50 50 50 50 0,71 237 CCTGCGCTCTTGGACCGCGGCGG (SEQ ID NO: 294) chr6:29943383 3 + 75 1 50 50 50 50 0,7 238 CGATGAAGCGGGGCTCCCCGCGG (SEQ ID NO: 295) chr6:29942803 2 - 75 2 50 50 50 50 0,7 239 GACCTGGCAGCGGGATGGGGAGG (SEQ ID NO: 296) chr6:29944219 4 + 75 1 50 50 50 50 0,69 240 TCCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGG (SEQ ID NO: 297) chr6:29942786 2 + 85 3 50 50 50 50 0,67 241 CGGGTGAGTGCGGGGTCGGGAGG (SEQ ID NO: 298) chr6:29942624 1 + 80 0 50 50 50 50 0,64 242 TTTCTTCTCACAGATAGAAAAGG (SEQ ID NO: 299) chr6:29945046 6 + 30 0 50 50 50 50 0,61 243 GGATGGAGCCGCGGGCGCCGTGG (SEQ ID NO: 300) chr6:29942886 2 + 85 1 50 50 50 50 0,62 244 CGGACGGGCGCTTCCTCCGCGGG (SEQ ID NO: 301) chr6:29943310 3 + 80 2 50 50 50 50 0,63 245 TCGGACGGGCGCTTCCTCCGCGG (SEQ ID NO: 302) chr6:29943309 3 + 75 2 50 50 50 50 0,62 246 GCGGGCGCCGTGGATAGAGCAGG (SEQ ID NO: 303) chr6:29942896 2 + 75 0 50 50 50 50 0,6 247 GGAGCCCCGCTTCATCGCCGTGG (SEQ ID NO: 304) chr6:29942809 2 + 75 1 50 50 50 50 0,61 248 TTCTCACAGATAGAAAAGGAGGG (SEQ ID NO: 305) chr6:29945050 6 + 35 0 50 50 50 50 0,6 249 CCGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGG (SEQ ID NO: 306) chr6:29942787 2 + 90 3 50 50 50 50 0,6 250 AAGCGGGGCTCCCCGCGGCCGGG (SEQ ID NO: 307) chr6:29942798 2 - 85 3 50 50 50 50 0,6 251 GGGTGAGTGCGGGGTCGGGAGGG (SEQ ID NO: 308) chr6:29942625 1 + 75 0 50 50 50 50 0,57 252 GGCCCTGACCCAGACCTGGGCGG (SEQ ID NO: 309) chr6:29942604 1 + 75 2 50 50 50 50 0,58 253 GCCCAGGGCCCAGCACCTCAGGG (SEQ ID NO: 310) chr6:29944173 4 - 75 1 50 50 50 50 0,56 254 TGGGCGGGTGAGTGCGGGGTCGG (SEQ ID NO: 311) chr6:29942620 1 + 75 0 50 50 50 50 0,55 255 GCCGGTGAGTGACCCCGGCCGGG (SEQ ID NO: 312) chr6:29943023 2 + 80 0 50 50 50 50 0,55 256 GCACGGGTACCAGGGGCCACGGG (SEQ ID NO: 313) chr6:29943538 3 + 75 2 50 50 50 50 0,57 257 CTCAGCCACTGCTCGCCCCCAGG (SEQ ID NO: 314) chr6:29942735 2 + 75 2 50 50 50 50 0,56 258 GCCCTGACCCAGACCTGGGCGGG (SEQ ID NO: 315) chr6:29942605 1 + 75 3 50 50 50 50 0,56 259 CGTGTCCCGGCCCGGCCGCGGGG (SEQ ID NO: 316) chr6:29942788 2 + 90 3 50 50 50 50 0,55 260 GCGAGGCCGGTGAGTGACCCCGG (SEQ ID NO: 317) chr6:29943018 2 + 75 0 50 50 50 50 0,52 261 CCCTGGCCCTGACCCAGACCTGG (SEQ ID NO: 318) chr6:29942600 1 + 75 1 50 50 50 50 0,53 262 GGGCGGGTGAGTGCGGGGTCGGG (SEQ ID NO: 319) chr6:29942621 1 + 80 0 50 50 50 50 0,52 263 GACCCCGCACTCACCCGCCCAGG (SEQ ID NO: 320) chr6:29942618 1 - 80 0 50 50 50 50 0,51 264 GACCTGGGCGGGTGAGTGCGGGG (SEQ ID NO: 321) chr6:29942616 1 + 75 1 50 50 50 50 0,52 265 GGGGCTCCCCGCGGCCGGGCCGG (SEQ ID NO: 322) chr6:29942794 2 - 95 2 50 50 50 50 0,52 266 GAAGCGGGGCTCCCCGCGGCCGG (SEQ ID NO: 323) chr6:29942799 2 - 85 5 50 50 50 50 0,55 267 AGTAGCCGCGCAGGGTCCCCAGG (SEQ ID NO: 324) chr6:29942986 2 - 75 2 50 50 50 50 0,52 268 GCTGCGACGTGGGGTCGGACGGG (SEQ ID NO: 325) chr6:29943295 3 + 75 2 50 50 50 50 0,5 269 GGGCTCCCCGCGGCCGGGCCGGG (SEQ ID NO: 326) chr6:29942793 2 - 95 2 50 50 50 50 0,5 270 GGCCGGTGAGTGACCCCGGCCGG (SEQ ID NO: 327) chr6:29943022 2 + 80 2 50 50 50 50 0,49 271 CTGACCGCGGGGTCGGGGCCAGG (SEQ ID NO: 328) chr6:29943246 3 + 85 2 50 50 50 50 0,49 272 GGCTGCGACGTGGGGTCGGACGG (SEQ ID NO: 329) chr6:29943294 3 + 75 1 50 50 50 50 0,47 273 CCTGCTACTCTCGGGGGCCCTGG (SEQ ID NO: 330) chr6:29942583 1 + 75 0 50 50 50 50 0,46 274 CACCCTGAGGTGCTGGGCCCTGG (SEQ ID NO: 331) chr6:29944171 4 + 75 2 50 50 50 50 0,45 275 CACCCGCCCAGGTCTGGGTCAGG (SEQ ID NO: 332) chr6:29942607 1 - 75 2 50 50 50 50 0,45 276 AGCCCAGGGCCCAGCACCTCAGG (SEQ ID NO: 333) chr6:29944174 4 - 75 2 50 50 50 50 0,42 277 GGCCGCCTCCCACTTGCGCTTGG (SEQ ID NO: 334) chr6:29943424 3 - 75 1 50 50 50 50 0,41 278 CGCACTCACCCGCCCAGGTCTGG (SEQ ID NO: 335) chr6:29942613 1 - 75 0 50 50 50 50 0,39 279 GTCCTCCCCATCCCGCTGCCAGG (SEQ ID NO: 336) chr6:29944221 4 - 75 1 50 50 50 50 0,35 280 CGCTGCAGCGCACGGGTACCAGG (SEQ ID NO: 337) chr6:29943529 3 + 75 1 50 50 50 50 0,35 281 GCAGGGTCCCCAGGTCCACTCGG (SEQ ID NO: 338) chr6:29942977 2 - 70 0 2 0 18 20 0,46 282 CGAGCCAGAGGATGGAGCCGCGG (SEQ ID NO: 339) chr6:29942877 2 + 70 2 8 2 0 30 0,69 283 AGTATTGGGACCAGGAGACACGG (SEQ ID NO: 340) chr6:29942928 2 + 50 1 9 7 11 2 0,56 284 AGAACCTGGCCCCGACCCCGCGG (SEQ ID NO: 341) chr6:29943250 3 - 75 0 2 11 19 5 0,62 285 TAATGTATGGCTGCGACGTGGGG (SEQ ID NO: 342) chr6:29943286 3 + 50 0 2 16 5 26 0,56 286 GTGGGAGGCGGCCCATGAGGCGG (SEQ ID NO: 343) chr6:29943434 3 + 75 0 7 9 12 18 0,76 287 CACGGGTACCAGGGGCCACGGGG (SEQ ID NO: 344) chr6:29943539 3 + 75 0 6 12 16 14 0,6 288 CAGGCTGCAAGTAAGTATGAAGG (SEQ ID NO: 345) chr6:29945082 6 + 45 0 31 1 1 5 0,6

В конкретных вариантах осуществления по меньшей мере примерно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 1-99%, или более, популяции клеток (таких как БПК, например, ОПК) являются жизнеспособными после обработки клеток для доставки белка Cas, молекулы гРНК, РНП и/или одного или более векторов, экспрессирующих белок Cas и/или молекулу гРНК, через их клеточную мембрану (например, методом электропорации или каким-либо иным методом).

Различные аспекты системы CRISPR-Cas известны в данной области. Неограничивающие аспекты этой системы описаны, например, в патенте США № 9023649, выпущенном 5 мая 2015 г.; патенте США № 9074199, выпущенном 7 июля 2015 г.; патенте США № 8697359, выпущенном 15 апреля 2014 г.; патенте США № 8932814, выпущенном 13 января 2015 г.; публикации патентной заявки США № 2016/0298096, опубликованной 13 октября 2016 г.; Cho et al., (2013) Nature Biotechnology Vol. 31 No. 3 pp. 230-232 (включая дополнительную информацию); и Jinek et al., (2012) Science Vol. 337 No. 6096 pp. 816-821, полное содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки.

В системе CRISPR/Cas нуклеазы локус CRISPR кодирует РНК-компоненты системы, и локус Cas (CRISPR-ассоциированный) кодирует белки. Локусы CRISPR в хозяевах-микроорганизмах содержат сочетания CRISPR-ассоциированных (Cas) генов, а также некодирующих РНК элементов, способных программировать специфичность CRISPR-опосредованного расщепления полинуклеотидов.

CRISPR II типа является одной из наиболее полно охарактеризованных систем и вносит направленные двухцепочечные разрывы в процессе четырех последовательных этапов. Во-первых, две некодирующие РНК, пре-crРНК матрица и tracrРНК, транскрибируются с локуса CRISPR. Во-вторых, tracrРНК гибридизуется с областями повторов пре-crРНК и опосредует процессинг пре-crРНК в зрелые crРНК, содержащие индивидуальные спейсерные последовательности. В-третьих, комплекс зрелая crРНК:tracrРНК направляет Cas9 к ДНК-мишени за счет спаривания оснований по принципу Уотсона-Крика между спейсером на crРНК и протоспейсером на ДНК-мишени вблизи мотива, прилегающего к протоспейсеру (PAM), дополнительного необходимого условия для узнавания мишени. В сконструированных системах CRISPR/Cas9 гРНК, также называемая единой гид-РНК («гРНК»), может заменять crРНК и tracrРНК единым конструктом РНК, который включает элемент протоспейсера и последовательность петли линкера. Использование гРНК позволяет сокращать количество компонентов, необходимых для использования CRISPR/Cas9 для редактирования генома. Разновидности Cas9 из разных организмов имеют разные последовательности PAM. Например, Streptococcus pyogenes (Sp) имеет последовательность PAM 5′-NGG-3′, Staphylococcus aureus (Sa) имеет последовательность PAM 5′-NGRRT-3′ или 5′-NGRRN-3′, Neisseria meningitidis (NM) имеет последовательность PAM 5′-NNNNGATT-3′, Streptococcus thermophilus (St) имеет последовательность PAM 5′-NNAGAAW-3′, Treponema denticola (Td) имеет последовательность PAM 5′-NAAAAC-3′. Cas9 опосредует расщепление ДНК-мишени, создавая ДЦР в протоспейсере. Активность системы CRISPR/Cas в естественных условиях включает три этапа: (i) вставку чужеродных последовательностей ДНК в матрицу CRISPR для предотвращения будущих атак, в процессе, называемом «адаптацией», (ii) экспрессию соответствующих белков, а также экспрессию и процессинг матрицы, с последующей (iii) РНК-опосредованной интерференцией с чужеродным полинуклеотидом. Чужеродные полинуклеотиды происходят от вирусов, атакующих бактериальную клетку. Таким образом, в бактериальной клетке несколько из так называемых белков «Cas» участвуют в естественной функции системы CRISPR/Cas и играют определенные роли в таких функциях, как вставка чужеродной ДНК, и так далее. CRISPR также может функционировать с иными нуклеазами, чем Cas9. Белки двух генов из семейства Cpf1 содержат RuvC-подобный домен эндонуклеазы, однако они лишены имеющегося у Cas9 второго HNH-домена эндонуклеазы. Cpf1 расщепляет ДНК со смещением и нуждается лишь в одной РНК, а не в двух (tracrРНК и crРНК), в которых нуждается Cas9 для расщепления. Предпочтительным для Cpf1 PAM является 5′-TTN, отличающийся от такового для Cas9 (3′-NGG) как по локализации в геноме, так и по содержанию GC. Зрелые crРНК для Cpf1-опосредованного расщепления имеют длину 42-44 нуклеотида, примерно того же размера, что и в случае Cas9, но при этом прямой повтор предшествует спейсеру, а не следует за ним. Cpf1 crРНК также имеет намного более простую структуру, чем в случае Cas9; лишь короткая структура стебель-петля в области прямого повтора необходима для расщепления мишени. Cpf1 также не нуждается в дополнительной tracrРНК. В то время как Cas9 создает тупые концы в области на 3 нт выше сайта PAM, Cpf1 производит расщепление со смещением, создавая в 5′-направлении «липкий конец» длиной пять нуклеотидов через 18-23 нт от PAM. И другие CRISPR-ассоциированные белки, помимо Cas9, можно использовать вместо Cas9. Например, CRISPR-ассоциированный белок 1 (Cas1) является одним из двух универсально консервативных белков, встречающихся в прокариотической иммунной защитной системе CRISPR. Cas1 представляет собой метал-зависимую ДНК-специфическую эндонуклеазу, которая создает двухцепочечные фрагменты ДНК. Cas1 образует стабильный комплекс с другим универсально консервативным CRISPR-ассоциированным белком, Cas2, который является частью приобретенного спейсера для системы CRISPR. Также существуют варианты CRISPR/Cas9, которые не используют последовательность PAM, такие как NgAgo. NgAgo функционирует с 24-нуклеотидной гид-оцДНК и, как считают, создает разрез через 8-11 нуклеотидов от начала данной последовательности. оцДНК загружается при сворачивании белка и не может быть заменена на другого гида, если только температура не возрастет до не физиологического уровня 55°C. Несколько нуклеотидов в ДНК-мишени удаляются вблизи сайта разреза. Методики использования NgAgo описаны в публикации Gao, F. et al., DNA-guided Genome Editing Using the Natronobacterium Gregoryi Argonaute, 34 Nature Biotechnology 768 (2016), полное содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки. ДЦР могут быть образованы путем создания двух одноцепочечных разрывов в разных участках, результатом чего является разрезанная молекула ДНК с «липкими концами». Одноцепочечные разрывы, или «ники», могут быть образованы модифицированными вариантами фермента Cas9, содержащими только один активный каталитический домен (называемый «Cas9-никазой»). Cas9-никазы все еще связывают ДНК в зависимости от специфичности гРНК, однако никазы способны разрезать только одну из цепей ДНК. Необходимы две никазы, направленные на противоположные цепи, для создания ДЦР в ДНК-мишени (часто называемые «двойным ником», или системой CRISPR с «двойной никазой»). Это требование значительно повышает специфичность в отношении мишени, так как маловероятно, что два нецелевых ника будут созданы на достаточно близком расстоянии, чтобы вызвать ДЦР. Методики использования системы CRISPR с двойной никазой для создания ДЦР описаны в публикации Ran, et al., Double Nicking by RNA-Guided CRISPR Cas9 for Enhanced Genome Editing Specificity, 154 Cell 6:1380 (2013), полное содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки.

Неограничивающие примеры белков Cas включают Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (также известный как Csn1 и Csx12), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, а также их гомологи и модифицированные варианты. Эти ферменты известны; например, аминокислотную последовательность белка Cas9 S. pyogenes можно найти в базе данных SwissProt под регистрационным номером Q99ZW2 (SEQ ID NO: 1) и в базе данных NCBI под регистрационным номером Q99ZW2.1. Белки в базе данных UniProt с регистрационными номерами A0A0G4DEU5 и CDJ55032 являются другими примерами аминокислотной последовательности белка Cas9 (SEQ ID NO: 2). Другим неограничивающим примером является белок Cas9 Streptococcus thermophilus, аминокислотную последовательность которого можно найти в базе данных UniProt под регистрационным номером Q03JI6.1 (SEQ ID NO: 3). В конкретных вариантах осуществления не модифицированный фермент CRISPR имеет ДНК-расщепляющую активность, например, Cas9. В конкретных вариантах осуществления фермент CRISPR представляет собой Cas9, и может представлять собой Cas9 из S. pyogenes или S. pneumoniae. В конкретных вариантах осуществления фермент CRISPR управляет расщеплением одной или обеих цепей в участке последовательности-мишени, например, в последовательности-мишени и/или в комплементе последовательности-мишени. В конкретных вариантах осуществления фермент CRISPR управляет расщеплением одной или обеих цепей в участке, отдаленном на примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500, или более, пар нуклеотидов от первого или последнего нуклеотида последовательности-мишени. В конкретных вариантах осуществления вектор кодирует фермент CRISPR, который является мутантным относительно соответствующего фермента дикого типа в том, что мутантный фермент CRISPR неспособен расщеплять одну или обе цепи полинуклеотида-мишени, содержащего последовательность-мишень. Например, замена аспартата на аланин (D10A, нумерация аминокислот является такой, как показано для SEQ ID NO: 1) в RuvC I каталитическом домене Cas9 из S. pyogenes превращает Cas9 из нуклеазы, которая расщепляет обе цепи, в никазу (расщепляющую одну цепь). Другие примеры мутаций, превращающих Cas9 в никазу, включают, без ограничения, H840A, N854A и N863A (нумерация аминокислот является такой, как показано для SEQ ID NO: 1). В конкретных вариантах осуществления никазы могут быть использованы для редактирования генома путем гомологичной рекомбинации.

В конкретных вариантах осуществления никазу Cas9 можно использовать в сочетании с последовательностью(ми) гида, например, двумя последовательностями гида, которые направлены, соответственно, на смысловую и антисмысловую цепи ДНК-мишени. Такое сочетание позволяет вносить ники в обе цепи и может быть использовано для индукции NHEJ.

В конкретных вариантах осуществления генетическую манипуляцию осуществляют с использованием редактирующего нуклеотиды белка. В конкретных вариантах осуществления редактирующий нуклеотиды белок представляет собой модифицированный белок (такой как белок Cas, или другой белок), который катализирует переходы и превращения одного нуклеотида в другой (например, A в T, C в G, и так далее) без внесения (исходного или иного) двухцепочечного разрыва ДНК. Системы CRISPR/Cas, содержащие редактирующий нуклеотиды белок Cas, представляют собой систему CRISPR следующего поколения. Неограничивающие описания таких систем приведены в публикациях Gaudelli et al. (2017) Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage, Nature volume 551, pages 464–471; и Gehrke et al. (2018) High-precision CRISPR-Cas9 base editors with minimized bystander and off-target mutations, bioRxiv 273938; doi: https://doi.org/10.1101/273938, полное содержание каждой из которых включено в настоящий документ посредством ссылки. В конкретных вариантах осуществления редактирующий нуклеотиды белок представляет собой редактор нуклеотида аденина (ABE), который опосредует превращение A•T в G•C в геномной ДНК. В конкретных вариантах осуществления редактирующий нуклеотиды белок включают аденозиндезаминазу (например, РНК-аденозиндезаминазу, модифицированную для оказания действия на ДНК), слитую с каталитически неактивным мутантом CRISPR–Cas (таким как мутант CRISPR–Cas9). В конкретных вариантах осуществления редактирующий нуклеотиды белок представляет собой редактор нуклеотида цитидина (ABE), который опосредует превращение C•G в T•A в геномной ДНК. В конкретных вариантах осуществления редактирующий нуклеотиды белок включает нуклеазу Cas9, имеющую мутацию, которая превращает ее в никазу (nCas9), слитую с аполипопротеин B-редактирующим комплексом (APOBEC) (например, цитидиндезаминаза с крысиным APOBEC1 или человеческим APOBEC3A (A3A)) и ингибитором урацил-гликозилaзы (UGI). В конкретных вариантах осуществления редактор нуклеотидов РНК или ДНК включает вариант Cas, отличный от варианта Cas9, например, вариант Cas13. Для редактирования нуклеотидов можно использовать различные редактирующие гены белки и варианты Cas.

В конкретных вариантах осуществления доставляемый редактирующий ген белок (такой как ZFN, megaTAL или белок Cas) может содержать, или быть слит с сигналом субклеточной локализации, образуя редактирующий ген слитый белок. В зависимости от контекста, слитый белок, включающий, например, Cas9 и сигнал ядерной локализации, в настоящем документе может быть назван «Cas9» без уточнения о включении сигнала ядерной локализации. В конкретных вариантах осуществления слитый белок может содержать сигнал ядерной локализации. В конкретных вариантах осуществления белок Cas может содержать более одного сигнала локализации, например, 2, 3, 4, 5, или более, сигналов ядерной локализации. В конкретных вариантах осуществления сигнал локализации находится на N-конце белка Cas, и в других вариантах осуществления сигнал локализации находится на C-конце белка Cas.

Неограничивающие примеры сигналов ядерной локализации включают GGSGPPKKKRKV (SEQ ID NO: 4), PKKKRKV (SEQ ID NO: 5), KR[PAATKKAGQA]KKKK (SEQ ID NO: 6), KR[XXXXXXXXXX]KKKK (SEQ ID NO: 7), KKXK (SEQ ID NO: 8), KRXK (SEQ ID NO: 9), KKXR (SEQ ID NO: 10), KRXR (SEQ ID NO: 11), AVKRPAATKKAGQAKKKKLD (SEQ ID NO: 12), MSRRRKANPTKLSENAKKLAKEVEN (SEQ ID NO: 13), PAAKRVKLD (SEQ ID NO: 14), PPKKKRKV (SEQ ID NO: 15) и KLKIKRPVK (SEQ ID NO: 16).

В конкретных вариантах осуществления кодирующая фермент последовательность, кодирующая фермент CRISPR, кодон-оптимизирована для экспрессии в конкретных клетках, например, клетках млекопитающих, например, клетках человека.

Как правило, последовательность гида представляет собой любую полинуклеотидную последовательность, имеющую достаточную степень комплементарности с последовательностью полинуклеотида-мишени для гибридизации с последовательностью-мишенью и управления специфическим для последовательности связыванием комплекса CRISPR с последовательностью-мишенью. В конкретных вариантах осуществления степень комплементарности между последовательностью гида и ее соответствующей последовательностью-мишенью, при оптимальном выравнивании с использованием подходящего алгоритма выравнивания, составляет, или превышает, примерно 90%, 95%, 97,5%, 98%, 99% или более. В конкретных вариантах осуществления степень комплементарности составляет 100%. Оптимальное выравнивание можно определять при помощи любого из соответствующих алгоритмов для выравнивания последовательностей, неограничивающие примеры которых включают алгоритм Смита-Уотермана, алгоритм Нидлмана-Вунша, алгоритмы на основе преобразования Барроуза-Уилера (например, алгоритм выравнивания Барроуза-Уилера), Clustal W, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies, ELAND (Illumina, San Diego, Calif.), SOAP (доступный на soap.genomics.org.cn) и Maq (доступный на maq.sourceforge.net). В конкретных вариантах осуществления последовательность гида имеет длину примерно, или более чем примерно 15, 16, 17, 18, 19 или 20, или более, нуклеотидов. В конкретных вариантах осуществления последовательность гида имеет длину менее примерно 30, 25, 20, 15, или менее, нуклеотидов. Способность последовательности гида управлять специфичным для последовательности связыванием комплекса CRISPR с последовательностью-мишенью можно оценивать в любом подходящем анализе. Например, компоненты системы CRISPR, достаточные для образования комплекса CRISPR, включая тестируемую последовательность гида, можно вводить в клетку-хозяина, имеющую соответствующую последовательность-мишень, например, путем трансфекции векторами, кодирующими компоненты последовательности CRISPR, с последующей оценкой предпочтительного расщепления в последовательности-мишени. Аналогично, расщепление последовательности полинуклеотида-мишени можно оценивать в пробирке путем внесения последовательности-мишени, компонентов комплекса CRISPR, включая тестируемую последовательность гида и контрольную последовательность гида, отличную от тестируемой последовательности гида, и сравнения связывания или степени расщепления последовательности-мишени в реакциях с тестируемой и контрольной последовательностями гида.

Последовательность гида может быть выбрана для нацеливания на любую последовательность-мишень. В конкретных вариантах осуществления последовательность-мишень представляет собой последовательность в геноме клетки. В конкретных вариантах осуществления последовательность-мишень является уникальной в геноме-мишени.

В конкретных вариантах осуществления используют ZFN для генетической модификации клетки. ZFN представляют собой искусственные ферменты рестрикции, созданные путем слияния ДНК-связывающего домена «цинковые пальцы» с ДНК-расщепляющим доменом. Домены «цинковые пальцы» могут быть спроектированы для нацеливания на определенные нужные последовательности ДНК, и это позволяет нуклеазам «цинковые пальцы» нацеливаться на уникальные последовательности в сложных геномах. Используя эндогенный аппарат репарации ДНК, эти реагенты можно использовать для точного изменения геномов высших организмов. Наряду с белками Cas9 и TALEN, ZFN становится выдающимся инструментом в области редактирования генома. Нуклеаза «цинковые пальцы» представляет собой сайт-специфическую эндонуклеазу, разработанную для связывания и расщепления ДНК в определенных положениях. Она имеет два белковых домена. Первый домен представляет собой ДНК-связывающий домен, который содержит эукариотические факторы транскрипции и «цинковый палец». Второй домен представляет собой домен нуклеазы, который включает фермент рестрикции (такой как фермент рестрикции FokI) и отвечает за каталитическое расщепление ДНК. Каждый из ДНК-связывающих доменов отдельных ZFN, как правило, содержит от трех до шести отдельных повторов «цинковые пальцы» и может узнавать от 9 до 18 пар нуклеотидов. В конкретных вариантах осуществления, если домены «цинковые пальцы» идеально специфичны для их определенного сайта-мишени, тогда даже пара 3-пальцевых ZFN, которые узнают в общей сложности 18 пар нуклеотидов, может нацеливаться на единственный локус в геноме млекопитающего (например, человека). В конкретных вариантах осуществления «модули цинковых пальцев» меньшего размера с известной специфичностью объединяют. В конкретных вариантах осуществления процесс сборки модулей включает объединение трех отдельных «цинковых пальцев», каждый из которых может узнавать 3-нуклеотидную последовательность ДНК, с получением 3-пальцевой матрицы, способной узнавать 9-нуклеотидный сайт-мишень. В конкретных вариантах осуществления домен неспецифического расщепления из эндонуклеазы рестрикции II типа FokI используют в качестве расщепляющего домена в ZFN. Этот расщепляющий домен должен димеризоваться для расщепления ДНК. В конкретных вариантах осуществления пару ZFN используют для нацеливания на не палиндромный сайт ДНК. В конкретных вариантах осуществления расщепляющий домен слит с C-концом каждого домена «цинковые пальцы». В конкретных вариантах осуществления две отдельные ZFN связывают противоположные цепи ДНК своими C-концами на некотором расстоянии друг от друга.

TALEN представляют собой ферменты рестрикции, которые могут быть спроектированы для расщепления определенных последовательностей ДНК. Они могут быть получены путем слияния ДНК-связывающего домена TAL-эффектора с ДНК-расщепляющим доменом (то есть, нуклеазой, которая расщепляет цепи ДНК). Эффекторы, подобные активаторам транскрипции (TALE), могут быть сконструированы для связывания практически с любой нужной последовательностью ДНК, так что, при объединении с нуклеазой, они могут осуществлять разрезание ДНК в конкретных участках. Ферменты рестрикции можно вводить в клетки для использования в генном редактировании или для редактирования генома in situ. ДНК-связывающий домен содержит повторы из высоко консервативной последовательности из 33-34 аминокислот с дивергентными 12-ой и 13-ой аминокислотами. Эти два положения, называемые повторяющейся вариабельной парой остатков (RVD), являются в высокой степени вариабельными и проявляют сильную корреляцию с со специфическим узнаванием нуклеотидов. Эта прямая связь между аминокислотной последовательностью и узнаванием ДНК позволила конструировать специфические ДНК-связывающие домены путем подбора сочетания повторяющихся сегментов, содержащих соответствующие RVD. Примечательно, что внесение небольших изменений в RVD и включение «необычных» последовательностей RVD позволяет повышать специфичность нацеливания. Специалисту в данной области известно, как проектировать и использовать TALEN для создания ДЦР в дцДНК в нужном сайте-мишени. Некоторые соответствующие протоколы можно найти в публикациях Hermann, M. et al., Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases, 86 J. Vis. Exp. 50930 (2014) и Sakuma, T. et al., Efficient TALEN Construction and Evaluation Methods for Human Cell and Animal Applications, 18(4) Genes Cells 315 (2013).

MegaTAL получают путем объединения ДНК-направленных ферментов двух разных классов. Мегануклеазы (также называемые хоминг-эндонуклеазами) представляют собой одиночные пептидные цепи, которые обладают преимуществами как узнавания ДНК, так и нуклеазной активности, в одном и том же домене. Однако узнавание мишени мегануклеазой с трудом поддается изменению, и они часто имеют более низкую специфичность и более низкую эффективность расщепления мишени, чем другие направленные на геном эндонуклеазы. Эффекторы, подобные активаторам транскрипции (TAL), представляют собой ДНК-узнающие белки, которые были связаны с отдельными доменами ДНК-эндонуклеазы для обеспечения создания направленных двухцепочечных разрывов ДНК. В отличие от мегануклеаз, TAL легко модифицировать для нацеливания на конкретные последовательности ДНК. Молекула megaTAL представляет собой объединение TAL-эффектора с мегануклеазой, в ней ДНК-связывающую область TAL-эффектора используют для «адресации» сайт-специфической мегануклеазы на участок вблизи одиночного желаемого геномного сайта-мишени. Неограничивающие описания megaTAL приведены в публикации Boissel et al. (2014) Nucleic Acids Research 42(4):2591-2601, полное содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки.

Аспекты настоящего изобретения относятся к модификации отвечающего за иммуногенность геномного гена, например, путем мутации (например, вставки, делеции или точечной мутации). В конкретных вариантах осуществления ген кодирует компонент MHC-I. В конкретных вариантах осуществления ген кодирует компонент MHC-II. Неограничивающие примеры отвечающих за иммуногенность геномных генов включают гены B2M, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRA, HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DPA1, HLA-DPA2, HLA-DQA1 и/или HLA-DQB1. Многие варианты таких генов существуют естественным образом, например, у человека.

В конкретных вариантах осуществления генетические модификации не являются геномными. В конкретных вариантах осуществления малую интерферирующую и короткошпилечную РНК используют для опосредования выключения гена. В конкретных вариантах осуществления естественный геном не модифицируют, а РНКи действует на уровне РНК для снижения или выключения экспрессии гена-мишени, такого как B2M или HLA-A, за счет чего потенциально достигается конечный результат, аналогичный результату редактирования гена.

Генетически модифицированные популяции почечных клеток

Одной важной целью настоящего изобретения является использование методов генного редактирования (например, CRISPR/Cas9), описанных ранее, в способе конструирования не аллореактивных почечных клеток, в частности, БПК (например, популяций ОПК), для использования в лечении хронической почечной недостаточности. Способы и композиции, описанные в настоящем документе, приводят к повышению иммунологической совместимости (иммунологической привилегированности) донорских клеток (например, БПК, таких как ОПК) для трансплантации субъекту-реципиенту, за счет чего создается возможность использовать популяцию «универсальных донорских» почечных клеток и возможность вводить популяцию «аллогенных» почечных клеток пациентам без применения иммуносупрессии. Это может быть достигнуто за счет специфичной для мишени инактивации или модификации одного или более отвечающих за иммуногенность генов (например, гена HLA) в клетке, с получением донорских клеток, подходящих для трансплантации субъекту-реципиенту.

Открытие и применение системы CRISPR/Cas9 в клетках млекопитающих позволило производить эффективное и точное редактирование генов-мишеней, например, за счет негомологичного соединения концов (NHEJ), гомологичной репарации (HDR) или других путей репарации ДНК. Совместная доставка молекулы Cas9 и специфичной для мишени молекулы гид-РНК (гРНК), необязательно, наряду с донорской молекулой матрицы для репарации ДНК, обеспечивает генное редактирование последовательности-мишени в геноме. Таким образом, использование системы CRISPR/Cas9 для модификации генов в клетках является многообещающей стратегией для лечения многих генетических заболеваний. Для подробного описания смотри, например, Sanders and Joung, Nature Biotechnology 32, 347–355 (2014).

В конкретных вариантах осуществления конкретный аллель HLA изменяют путем создания контакта клеток, описанных в настоящем документе, с молекулой Cas9 и по меньшей мере одной специфичной для мишени гид-РНК (гРНК), которая направлена на эндогенный отвечающий за иммуногенность ген, для получения иммунологически совместимой популяции клеток (например, иммунологически совместимой популяции почечных клеток). Клетки, полученные с использованием способов и композиций, описанных в настоящем документе, с меньшей вероятностью будут индуцировать иммунный ответ при трансплантации субъекту-реципиенту и/или с меньшей вероятностью будут отторгаться иммунной системой субъекта-реципиента. Возможность повышать иммунологическую совместимость донорских клеток, которые могут быть приспособлены для трансплантации любому субъекту, независимо от отвечающего за иммуногенность гаплотипа генов донора, создает особые преимущества, поскольку это приводит к резкому увеличению пула донорских клеток, которые могут быть использованы в области клеточной терапии для самого разного клинического применения.

Инактивация гена означает, что интересующий ген не экспрессируется в форме функционального белка. В конкретных вариантах осуществления способ генетической модификации основан на экспрессии, в подлежащих модификации клетках, направляемой РНК эндонуклеазы таким образом, что она катализирует расщепление в одном гене-мишени, приводящее к инактивации гена-мишени. Разрывы в цепи нуклеиновой кислоты, вызываемые действием эндонуклеазы, как правило, восстанавливаются по определенным механизмам гомологичной рекомбинации или негомологичного соединения концов (NHEJ). Однако NHEJ является несовершенным процессом репарации, который часто приводит к изменениям последовательности ДНК в сайте расщепления. Механизмы включают воссоединение того, что остается от двух концов ДНК, за счет прямого повторного лигирования (Critchlow and Jackson 1998) или за счет так называемого опосредованного микрогомологией соединения концов (Betts, Brenchley et al. 2003; Ma, Kim et al. 2003). Репарация по механизму негомологичного соединения концов (NHEJ) часто приводит к появлению небольших вставок или делеций, и может быть использована для создания нокаутов определенных генов. Указанная модификация может представлять собой замену, делецию или добавление по меньшей мере одного нуклеотида. Клетки, в которых произошло событие вызванного расщеплением мутагенеза, то есть, событие мутагенеза вследствие события NHEJ, могут быть идентифицированы и/или отобраны способами, хорошо известными в данной области. В конкретных вариантах осуществления используют редактирующий нуклеотиды белок CRISPR, который не вносит разрывы ДНК (например, двухцепочечные разрывы ДНК). В конкретных вариантах осуществления редактирующий нуклеотиды белок представляет собой модифицированный белок Cas, который катализирует переходы и превращения одного нуклеотида в другой (например, A в T, C в G, и так далее) без внесения (исходного или иного) двухцепочечного разрыва ДНК. В конкретных вариантах осуществления редактирующий нуклеотиды белок включает аденозиндезаминазу, слитую с каталитически неактивным мутантом CRISPR–Cas (таким как мутант CRISPR–Cas9). В конкретных вариантах осуществления редактирующий нуклеотиды белок включает нуклеазу Cas9, имеющую мутацию, которая превращает ее в никазу (nCas9), слитую с аполипопротеин B-редактирующим комплексом (APOBEC) (например, цитидиндезаминаза с крысиным APOBEC1 или человеческим APOBEC3A (A3A)) и ингибитором урацил-гликозилaзы (UGI). В конкретных вариантах осуществления редактирующий нуклеотиды белок представляет собой мутант Cas13, который специфически действует на РНК.

В конкретных вариантах осуществления предложен способ уменьшения клеточной поверхностной экспрессии первого аллеля эндогенного отвечающего за иммуногенность гена(ов) в почечной клетке, включающий создание контакта почечной клетки со специфической для первого аллеля молекулой гРНК и молекулой Cas9, при этом специфическая для аллеля молекула гРНК и молекула Cas9 связываются с первым аллелем эндогенного отвечающего за иммуногенность гена, таким образом, приводя к уменьшению клеточной поверхностной экспрессии первого аллеля эндогенного отвечающего за иммуногенность гена. В конкретных вариантах осуществления предложен способ получения популяции модифицированных иммунологически совместимых почечных клеток путем создания контакта популяции почечных клеток со специфической для первого аллеля модифицированной молекулой гРНК и молекулой Cas9, при этом специфическая для первого аллеля модифицированная молекула гРНК и молекула Cas9 связываются с первым аллелем эндогенного отвечающего за иммуногенность гена, таким образом, приводя к модификации первого аллеля эндогенного отвечающего за иммуногенность гена и к получению популяции иммунологически совместимых почечных клеток. В конкретных вариантах осуществления генетически модифицированная почечная клетка имеет меньшую вероятность отторжения в организме субъекта-реципиента вследствие большего совпадения между клетками донора и реципиента и сниженной иммуногенности, что определяют в анализе реакции смешанной культуры лимфоцитов, или лейкоцитов. В конкретных вариантах осуществления способы, описанные в настоящем документе, могут быть использованы для изменения первого, второго, третьего, четвертого, пятого, шестого, седьмого, восьмого, девятого, десятого, или более, аллелей с использованием одной или более аллель-специфических молекул гРНК и молекулы Cas9. В конкретных вариантах осуществления изменение аллелей с использованием способов, описанных в настоящем документе, может приводить к инактивации измененного аллеля. В конкретных вариантах осуществления способ может дополнительно включать создание контакта клетки, или популяции клеток, со второй молекулой Cas9.

В конкретных вариантах осуществления предложен ex vivo способ получения композиции, содержащей популяцию клеток, обогащенную по модификации конкретного гена, путем создания контакта популяции клеток со специфической для по меньшей мере одной мишени молекулой гРНК и молекулой Cas9, при этом специфическая для мишени молекула гРНК и молекула Cas9 связываются с геном, кодирующим поддающийся определению генный продукт; и обогащения по клеткам, лишенным экспрессии поддающегося определению генного продукта. В конкретных вариантах осуществления этап обогащения по клеткам, которые экспрессируют генный продукт, в способах, описанных в настоящем документе, может включать сортировку клеток с использованием, например, FACS или MACS. В конкретных вариантах осуществления ex vivo способ включает обогащение по популяции клеток, имеющих специфическую для аллеля генную модификацию, при этом специфическая для аллеля молекула гРНК и молекула Cas9 связываются с одним аллелем гена, кодирующего поддающийся определению генный продукт; и обогащение по клеткам, которые экспрессируют поддающийся определению генный продукт, но не экспрессируют первый аллель. В конкретных вариантах осуществления этап обогащения по клеткам, которые экспрессируют ген, но не экспрессируют первый аллель, может включать создание контакта каждой из множества клеток с первым антителом, которое специфически связывается с первым вариантом поддающегося определению генного продукта, кодируемым первым аллелем гена, и со вторым антителом, которое связывается со вторым вариантом поддающегося определению генного продукта. В конкретных вариантах осуществления этап обогащения по клеткам, которые экспрессируют ген, но не экспрессируют первый аллель, может включать обнаружение, в каждой клетке популяции клеток, вещества или сигнала, связанного с функциональным вариантом поддающегося определению генного продукта. Популяция клеток может представлять собой популяцию биоактивных почечных клеток.

Способы, описанные в настоящем документе, могут, необязательно, также включать отбор клетки, экспрессирующей конкретный аллель гена, путем сортировки популяции клеток с использованием аллель-специфического антитела. В конкретных вариантах осуществления популяцию клеток можно сортировать методом активированной флуоресценцией сортировки клеток (FACS) или сортировки клеток с иммуномагнитными микрогранулами. В конкретных вариантах осуществления способ дополнительно включает определение последовательности клетки для подтверждения модификации.

В конкретных вариантах осуществления ген может представлять собой отвечающий за иммуногенность ген. В конкретных вариантах осуществления поддающийся определению генный продукт может представлять собой клеточный поверхностный маркер. В конкретных вариантах осуществления поддающийся определению генный продукт может представлять собой человеческий лейкоцитарный антиген (HLA). В конкретных вариантах осуществления поддающийся определению генный продукт может представлять собой антигенный белок главного комплекса гистосовместимости или минорный антиген гистосовместимости (MiHA или mHA) (например, хемокиновый рецептор).

Неограничивающие примеры mHA включают:

Примеры mHA Хромосома HA-1 19 HA-2 6 HA-8 9 HB-1 5 HY-A1 Y HY-A2 Y HY-B7 Y HY-B8 Y HY-B60 Y HY-DQ5 Y

Хотя любой генетический полиморфизм может давать начало минорной гистонесовместимости, число генов, кодирующих минорные антигены, ограничено. Примерно 10 минорных антигенов, расположенных на аутосомных хромосомах, были идентифицированы в числе существующих ста, или около того. Y-хромосома также несет некоторые гены, кодирующие mHA. Первым идентифицированным минорным пептидом гистосовместимости был HA-2, mHA, связанный с реакцией трансплантат против хозяина. Наиболее изученными из всех mHA являются HY-антигены. В конкретных вариантах осуществления молекула гРНК может содержать нацеливающий домен, который комплементарен домену-мишени в гене mHA. В конкретных вариантах осуществления молекула гРНК может содержать нацеливающий домен, который комплементарен домену-мишени в гене HA-1, HA-2, HA-8, HB-1, HY-A1, HY-A2, HY-B7, HY-B8, HY-B60 или HY-DQ5.

В конкретных вариантах осуществления молекула гРНК может содержать нацеливающий домен, который комплементарен домену-мишени в гене HLA. Ген HLA может быть выбран из группы, состоящей из HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DRB3/4/5, гена семейства HLA-DQ (например, HLA-DQA1 и/или HLA-DQB1) и гена семейства HLA-DP (например, HLA-DPA1 и/или HLA-DPA2).

В конкретных вариантах осуществления клетка, или популяция клеток, может представлять собой первичную почечную клетку, или популяцию отобранных почечных клеток. В конкретных вариантах осуществления популяция клеток может представлять собой гетерогенную популяцию клеток или гомогенную популяцию клеток.

В конкретных вариантах осуществления для подтверждения того, что один или более аллелей-мишеней HLA были инактивированы за счет активности CRISPR/Cas9, донорские клетки до и после таргетирования можно анализировать на изменение аллелльной последовательности(ей) или экспрессии аллеля(ей) с использованием общепринятых методов (например, одного или более из аллель-специфических ПЦР, кОТ-ПЦР или проточной цитометрии). В конкретных вариантах осуществления донорские клетки, имеющие, или не имеющие, редактированный геном, можно совместно культивировать с NK-клетками, и количественно определять цитолитическую активность, направленную против донорских клеток, для определения понижающей регуляции экспрессии HLA. После валидации, клетки, имеющие инактивированные один или более несовпадающих аллелей HLA донора и/или введенные один или более совпадающих аллелей HLA реципиента, могут быть обогащены, выделены или очищены из не модифицированных клеток общепринятыми методами сортировки.

Клеточные агрегаты

В одном из аспектов препараты по настоящему изобретению содержат клеточные агрегаты или сфероиды. В конкретных вариантах осуществления клеточный агрегат содержит популяцию биоактивных клеток, описанных в настоящем документе. В конкретных вариантах осуществления клеточный агрегат содержит биоактивные почечные клетки, такие как, например, смеси почечных клеток, обогащенные популяции почечных клеток, а также сочетания фракций почечных клеток и смеси почечных клеток с мезенхимальными стволовыми клетками, предшественниками эндотелиальных клеток, клетками, полученными из стромальной сосудистой фракции жировой ткани, или любой другой популяцией не почечных клеток, без ограничения.

В конкретных вариантах осуществления биоактивные почечные клетки по изобретению можно культивировать в 3D-форматах, как описано далее в настоящем документе. В конкретных вариантах осуществления термин «органоид» означает массу клеток с фенотипом и/или функцией, которые воспроизводят аспекты естественной почки. В конкретных вариантах осуществления органоиды содержат смешанные популяции клеток различных линий дифференцировки, которые, как правило, встречаются in vivo в определенной ткани. В конкретных вариантах осуществления органоиды по настоящему изобретению образуются in vitro, любыми способами, посредством которых клетки по изобретению образуют агрегаты, которые, в свою очередь, могут образовывать сфероиды, органоиды, или их сочетание. В некоторых вариантах осуществления такие агрегаты, сфероиды или органоиды принимают структуру, соответствующую конкретному органу. В конкретных вариантах осуществления такие агрегаты, сфероиды или органоиды экспрессируют поверхностные маркеры, которые, как правило, экспрессируются клетками конкретного органа. В конкретных вариантах осуществления такие агрегаты, сфероиды или органоиды продуцируют соединения или материалы, которые, как правило, экспрессируются клетками конкретного органа. В конкретных вариантах осуществления клетки по изобретению можно культивировать на природных субстратах, например, желатине. В конкретных вариантах осуществления клетки по изобретению можно культивировать на синтетических субстратах, например, PLGA.

Биологические материалы

Различные биологические материалы можно объединять с активным средством для получения терапевтических препаратов по настоящему изобретению. В конкретных вариантах осуществления биологические материалы могут иметь любую подходящую форму (например, гранулы) или консистенцию (например, жидкость, гель, и так далее). Подходящие биологические материалы в форме полимерных матриц описаны в Bertram et al., опубликованной патентной заявке США 20070276507 (полное содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки). В конкретных вариантах осуществления полимерным матрицам или каркасам можно придавать самые разные желательные конфигурации для соответствия любому количеству общих системных, геометрических или пространственных ограничений. В конкретных вариантах осуществления биологический материал имеет форму жидкой суспензии. В конкретных вариантах осуществления матрицы или каркасы по настоящему изобретению могут быть трехмерными и иметь форму, согласующуюся с размерами и формами органа или структурой ткани. Например, при использовании полимерного каркаса для лечения заболевания почек, нарушения канальцевого транспорта или нарушения гломерулярной фильтрации может быть использована трехмерная (3-D) матрица, которая воспроизводит отдельные аспекты, или полностью структуру и организацию, ткани естественной почки, а также почечной паренхимы.

Можно использовать множество имеющих разную форму 3-D каркасов. Естественно, полимерная матрица может иметь разные размеры и формы, чтобы быть подходящей для пациентов разного размера. Полимерная матрица также может быть сформирована другими способами для удовлетворения особых потребностей пациентов. В конкретных вариантах осуществления полимерная матрица или каркас может представлять собой биосовместимый материал (например, пористый полимерный каркас). Каркасы могут быть сформированы из различных синтетических или природных материалов, включая, но без ограничения, полимолочную кислоту с открытыми порами (OPLA^®), эфир целлюлозы, целлюлозу, сложный эфир целлюлозы, фторсодержащий полиэтилен, фенольный полимер, поли-4-метилпентен, полиакрилoнитрил, полиамид, полиамидимид, полиакрилат, полибензоксазол, поликарбонат, полицианоариловый эфир, полиэфир, полиэфиркарбонат, полиэфир, полиэфирэфиркетон, полиэфиримид, полиэфиркетон, полиэфирсульфон, полиэтилен, полифторолефин, полиимид, полиолефин, полиоксадиазол, полифениленоксид, полифениленсульфид, полипропилен, полистирол, полисульфид, полисульфон, политетрафторэтилен, политиоэфир, политриазол, полиуретан, поливинил, поливинилиденфторид, регенерированную целлюлозу, силикон, мочевину-формальдегид, коллагены, желатин, альгинат, ламинины, фибронектин, шелк, эластин, альгинат, гиалуроновую кислоту, агарозу, либо их сополимеры или физические смеси. Конфигурации каркаса могут иметь форму от мягких пористых каркасов до жестких, сохраняющих форму, пористых каркасов. В конкретных вариантах осуществления каркас сконфигурирован в виде жидкого раствора, способного становиться гидрогелем, например, гидрогелем до температуры плавления.

В конкретных вариантах осуществления каркас получают из живой почки или другого органа человека или животного, при этом естественную популяцию клеток элиминируют за счет применения детергента и/или других химических средств, и/или других ферментативных и/или физических методов, известных специалистам в данной области. В данном варианте осуществления естественная трехмерная структура исходного органа сохраняется, наряду со всеми связанными компонентами внеклеточного матрикса, в их естественном, биоактивном контексте. В конкретных вариантах осуществления каркас представляет собой внеклеточный матрикс, полученный из почки или другого органа человека или животного. В конкретных вариантах осуществления конфигурацию собирают в тканеподобную структуру, применяя методы трехмерной биопечати. В конкретных вариантах осуществления конфигурация представляет собой раствор в жидкой форме, который способен превращаться в гидрогель.

В конкретных вариантах осуществления биологический материал представляет собой гидрогель. Гидрогели могут быть образованы из различных полимерных материалов и могут иметь различное биологическое применение. Гидрогели могут быть описаны физически, как трехмерные сети гидрофильных полимеров. В зависимости от типа, гидрогели имеют разное процентное содержание воды, но, в целом, не растворяются в воде. Несмотря на высокое содержание в них воды, гидрогели также способны связывать большие объемы жидкости благодаря наличию гидрофильных остатков. Гидрогели интенсивно набухают без изменения своей гелеобразной структуры. Основные физические признаки гидрогеля могут быть специально модифицированы, в зависимости от свойств полимеров и устройства, используемого для введения гидрогеля.

Материал гидрогеля, предпочтительно, не вызывает воспалительный ответ. Примеры других материалов, которые можно использовать для получения гидрогеля, включают (a) модифицированные альгинаты, (b) полисахариды (например, геллановую камедь и каррагинаны), которые образуют гель под воздействием одновалентных катионов, (c) полисахариды (например, гиалуроновую кислоту), которые представляют собой очень вязкие жидкости или являются тиксотропными и образуют гель с течением времени за счет медленной эволюции структуры, (d) желатин или коллаген, и (e) полимерные предшественники гидрогелей (например, блок-сополимеры полиэтиленоксид-полипропиленгликоль и белки). В патенте США № 6224893 B1 приведено подробное описание различных полимеров и химических свойств таких полимеров, которые подходят для получения гидрогелей по настоящему изобретению.

В конкретном варианте осуществления гидрогель, используемый для формулирования биологических материалов по настоящему изобретению, является желатиновым. Желатин представляет собой нетоксичный, биоразлагаемый и водорастворимый белок, получаемый из коллагена, который является основным компонентом внеклеточного матрикса мезенхимальной ткани (ВКМ). Коллаген является основным структурным белком во внеклеточном пространстве различных соединительных тканей в телах животных. Как основной компонент соединительной ткани, он является самым распространенным белком у млекопитающих, составляющим от 25% до 35% общего содержания белка в организме. В зависимости от степени минерализации коллагеновые ткани могут быть твердыми (кости), эластичными (сухожилия), или иметь диапазон от твердого до эластичного (хрящи). Коллаген в форме продолговатых волокон преимущественно встречается в волокнистых тканях, таких как сухожилия, связки и кожа. Он также в изобилии представлен в роговице, хрящах, костях, кровеносных сосудах, пищеварительном тракте, межпозвоночных дисках и дентине зубов. В мышечной ткани он является основным компонентом эндомизия. Коллаген составляет от одного до двух процентов мышечной ткани, и составляет 6% веса сильных сухожильных мышц. Коллаген встречается во многих зонах по всему организму. Однако более 90% коллагена в организме человека относится к типу I.

На сегодняшний день обнаружено и описано 28 видов коллагена. Их можно разделить на несколько групп в зависимости от структуры, которую они образуют: фибриллярный (типа I, II, III, V, XI). Не фибриллярный FACIT (связанные с волокнами коллагены с прерванными тройными спиралями) (типа IX, XII, XIV, XVI, XIX). Короткоцепочечный (типа VIII, X). Базальной мембраны (тип IV). Мультиплексин (множественные трехспиральные домены с прерываниями) (типа XV, XVIII). MACIT (связанные с мембраной коллагены с прерванными тройными спиралями) (типа XIII, XVII). Другие (типа VI, VII). Пятью наиболее распространенными типами являются: тип I: кожа, сухожилия, соединения сосудов, органы, кости (основной компонент органической части костей). Тип II: хрящ (основной коллагеновый компонент хряща). Тип III: ретикулиновый (основной компонент ретикулиновых волокон), обычно встречается вместе с типом I. Тип IV: образует базальную пластинку, эпителиально-секретирующий слой базальной мембраны. Тип V: клеточные поверхности, волосы и плацента.

Желатин сохраняет информационные сигналы, включая последовательность аргинин-глицин-аспарагиновая кислота (RGD), которая стимулирует клеточную адгезию, пролиферацию и дифференциацию стволовых клеток. Характерным свойством желатина является то, что он проявляет зависимость от верхней критической температуры растворения (UCST). Выше определенного порога температуры 40°C, желатин может растворяться в воде, образуя гибкие, случайные одиночные спирали. При охлаждении возникают водородные связи и ван-дер-ваальсовы взаимодействия, приводящие к образованию тройных спиралей. Эти коллаген-подобные тройные спирали действуют в качестве зон сочленения, инициируя таким образом переход из золя в гель. Желатин широко используют для фармацевтических и медицинских целей.

В конкретных вариантах осуществления гидрогель, используемый для формулирования инъекционных клеточных композиций по настоящему изобретению, имеет в основе свиной желатин, который может быть получен из свиной шкуры и коммерчески доступен, например, от Nitta Gelatin NA Inc. (NC, USA) или Gelita USA Inc. (IA, USA). Желатин можно растворять, например, в фосфатно-солевом буфере Дульбекко (DPBS), получая термочувствительный гидрогель, который может превращаться в гель и разжижаться при разных температурах. В конкретных вариантах осуществления гидрогель, используемый для формулирования инъекционных клеточных композиций по настоящему изобретению, имеет в основе рекомбинантный человеческий или животный желатин, экспрессированный и очищенный методами, известными специалистам в данной области. В конкретных вариантах осуществления экспрессионный вектор, содержащий всю, или часть, кДНК для человеческого коллагена типа I, альфа-1, экспрессируется в дрожжах Pichia pastoris. Другие экспрессионные векторные системы и организмы известны специалистам в данной области. В конкретном варианте осуществления желатиновый гидрогель по настоящему изобретению представляет собой жидкость при комнатной температуре (22-28°C), и выше, и образует гель при охлаждении до температуры охлаждения (2-8°C).

Специалисты в данной области понимают, что и другие типы синтетических или природных материалов, известные в данной области, можно использовать для формирования каркасов, описанных в настоящем документе.

В конкретных вариантах осуществления биологический материал, используемый по настоящему изобретению, состоит из гиалуроновой кислоты (HA) в форме гидрогеля, содержащего молекулы HA в диапазоне размеров от 5,1 кДа до >2 x 10⁵ кДа. HA может стимулировать морфогенез с разветвлениями и трехмерную самоорганизацию ассоциированных популяций биоактивных клеток. В конкретных вариантах осуществления биологический материал, используемый по настоящему изобретению, состоит из гиалуроновой кислоты в форме поропласта, также содержащего молекулы HA в диапазоне размеров от 5,1 кДа до >2 x 10⁵ кДа. В конкретных вариантах осуществления гидрогель получен из, или содержит внеклеточный матрикс из почки, или любой другой ткани или органа, без ограничения. В другом варианте осуществления биологический материал, используемый по настоящему изобретению, состоит из пены на основе полимолочной кислоты (PLA), имеющей структуру с открытыми порами и размер пор от примерно 50 микрон до примерно 300 микрон.

Термочувствительные биологические материалы

Биологические материалы, описанные в настоящем документе, также могут быть разработаны, или адаптированы, для реагирования на определенные внешние условия, например, in vitro или in vivo. В конкретных вариантах осуществления биологические материалы являются термочувствительными (например, либо in vitro, либо in vivo). В конкретных вариантах осуществления биологические материалы адаптированы для реакции на ферментативное расщепление (например, либо in vitro, либо in vivo). Биологические материалы, реагирующие на внешние условия, могут быть точно настроены, как описано в настоящем документе. Температурную чувствительность описанного препарата можно варьировать за счет изменения процентного содержания биологического материала в препарате. Например, процентное содержание желатина в растворе можно регулировать для модуляции температурной чувствительности желатина в конечном препарате (например, жидкости, геле, гранулах и так далее). Альтернативно, можно производить химическую сшивку биологических материалов для обеспечения большей устойчивости к ферментативному расщеплению. Например, можно использовать сшивающий реагент карбодиимид для осуществления химической сшивки желатиновых гранул, за счет этого уменьшая чувствительность к эндогенным ферментам.

В одном из аспектов препараты, описанные в настоящем документе, включают биологические материалы, имеющие свойства, которые обеспечивают благоприятную среду для активного средства, такого как биоактивные почечные клетки, которые будут введены субъекту. В конкретных вариантах осуществления препарат содержит первый биологический материал, который обеспечивает благоприятную среду с момента формулирования активного средства с биологическим материалом до момента введения препарата субъекту. В конкретных вариантах осуществления благоприятная среда означает наличие преимущества нахождения биоактивных клеток в суспендированном состоянии в практически твердой среде, в отличие от клеток в жидкости (как описано в настоящем документе), до введения субъекту. В конкретных вариантах осуществления первый биологический материал представляет собой термочувствительный биологический материал. Термочувствительный биологический материал может находиться в (i) практически твердом состоянии при температуре примерно 8°C, или ниже, и (ii) практически жидком состоянии при температуре окружающей среды, или выше. В конкретных вариантах осуществления температура окружающей среды примерно соответствует комнатной температуре.

В конкретных вариантах осуществления биологический материал представляет собой термочувствительный биологический материал, который может поддерживать по меньшей мере две разные фазы, или состояния, в зависимости от температуры. Биологический материал способен поддерживать первое состояние при первой температуре, второе состояние при второй температуре, и/или третье состояние при третьей температуре. Первое, второе и третье состояния могут представлять собой практически твердое, практически жидкое или практически полутвердое или полужидкое состояния. В конкретных вариантах осуществления биологический материал имеет первое состояние при первой температуре и второе состояние при второй температуре, при этом первая температура является более низкой, чем вторая температура.

В конкретных вариантах осуществления состояние термочувствительного биологического материала является практически твердым состоянием при температуре примерно 8°C, или ниже. В конкретных вариантах осуществления практически твердое состояние сохраняется при температуре примерно 1°C, примерно 2°C, примерно 3°C, примерно 4°C, примерно 5°C, примерно 6°C, примерно 7°C или примерно 8°C. В конкретных вариантах осуществления практически твердое состояние имеет форму геля. В конкретных вариантах осуществления состояние термочувствительного биологического материала является практически жидким состоянием при температуре окружающей среды, или выше. В конкретных вариантах осуществления практически жидкое состояние сохраняется при температуре примерно 25°C, примерно 25,5°C, примерно 26°C, примерно 26,5°C, примерно 27°C, примерно 27,5°C, примерно 28°C, примерно 28,5°C, примерно 29°C, примерно 29,5°C, примерно 30°C, примерно 31°C, примерно 32°C, примерно 33°C, примерно 34°C, примерно 35°C, примерно 36°C или примерно 37°C. В конкретных вариантах осуществления температура окружающей среды примерно соответствует комнатной температуре.

В конкретных вариантах осуществления состояние термочувствительного биологического материала является практически твердым состоянием при температуре около температуры окружающей среды, или ниже. В конкретных вариантах осуществления температура окружающей среды примерно соответствует комнатной температуре. В конкретных вариантах осуществления практически твердое состояние сохраняется при температуре примерно 17°C, примерно 16°C, примерно 15°C, примерно 14°C, примерно 13°C, примерно 12°C, примерно 11°C, примерно 10°C, примерно 9°C, примерно 8°C, примерно 7°C, примерно 6°C, примерно 5°C, примерно 4°C, примерно 3°C, примерно 2°C или примерно 1°C. В конкретных вариантах осуществления практически твердое состояние имеет форму гранулы. В конкретных вариантах осуществления состояние термочувствительного биологического материала является практически жидким состоянием при температуре примерно 37°C или выше. В конкретных вариантах осуществления практически твердое состояние сохраняется при температуре примерно 37°C, примерно 38°C, примерно 39°C или примерно 40°C.

Термочувствительные биологические материалы могут быть предоставлены в форме раствора, в форме твердого вещества, в форме гранул или в других подходящих формах, описанных в настоящем документе и/или известных специалистам в данной области. Популяции клеток и препараты, описанные в настоящем документе, могут быть покрыты, нанесены на, погружены в, присоединены к, высеяны, суспендированы в, или заключены в термочувствительный биологический материал. В конкретных вариантах осуществления популяции клеток, описанных в настоящем документе, могут быть организованы в виде трехмерных клеточных агрегатов или органоидов, или трехмерных трубчатых структур, до образования комплекса с термочувствительным биологическим материалом, или могут быть организованы, как указано, при образовании комплекса с термочувствительным биологическим материалом. Альтернативно, термочувствительный биологический материал может быть предоставлен без каких-либо клеток, например, в форме разделительных гранул. В данном варианте осуществления термочувствительный биологический материал играет абсолютно пассивную роль, создавая пространство внутри органа-мишени для проявления регенеративной биологической активности, например, ангиогенеза или инфильтрации и миграции популяций клеток-хозяев.

В конкретных вариантах осуществления термочувствительный биологический материал имеет переходное состояние между первым состоянием и вторым состоянием. В конкретных вариантах осуществления переходное состояние представляет собой переходное состояние из твердого вещества в жидкость в диапазоне температур от примерно 8°C до примерно температуры окружающей среды. В конкретных вариантах осуществления температура окружающей среды примерно соответствует комнатной температуре. В конкретных вариантах осуществления переходное состояние из твердого вещества в жидкость имеет место при одной или более температурах, составляющих примерно 8°C, примерно 9°C, примерно 10°C, примерно 11°C, примерно 12°C, примерно 13°C, примерно 14°C, примерно 15°C, примерно 16°C, примерно 17°C и примерно 18°C.

Термочувствительные биологические материалы имеют определенную вязкость при конкретной температуре, измеряемую в сантипуазах (сП). В конкретных вариантах осуществления биологический материал имеет вязкость при 25°C, составляющую от примерно 1 сП до примерно 5 сП, от примерно 1,1 сП до примерно 4,5 сП, от примерно 1,2 сП до примерно 4 сП, от примерно 1,3 сП до примерно 3,5 сП, от примерно 1,4 сП до примерно 3,5 сП, от примерно 1,5 сП до примерно 3 сП, от примерно 1,55 сП до примерно 2,5 сП или от примерно 1,6 сП до примерно 2 сП. В конкретных вариантах осуществления биологический материал имеет вязкость при 37°C, составляющую от примерно 1,0 сП до примерно 1,15 сП. Вязкость при 37°C может составлять примерно 1,0 сП, примерно 1,01 сП, примерно 1,02 сП, примерно 1,03 сП, примерно 1,04 сП, примерно 1,05 сП, примерно 1,06 сП, примерно 1,07 сП, примерно 1,08 сП, примерно 1,09 сП, примерно 1,10 сП, примерно 1,11 сП, примерно 1,12 сП, примерно 1,13 сП, примерно 1,14 сП или примерно 1,15 сП. В конкретных вариантах осуществления биологический материал представляет собой раствор желатина. Желатин присутствует в растворе в концентрации примерно 0,5%, примерно 0,55%, примерно 0,6%, примерно 0,65%, примерно 0,7%, примерно 0,75%, примерно 0,8%, примерно 0,85%, примерно 0,9%, примерно 0,95% или примерно 1% (масс/об). В одном примере биологический материал представляет собой 0,75% (масс/об) раствор желатина в PBS. В конкретных вариантах осуществления 0,75% (масс/об) раствор имеет вязкость при 25°C, составляющую от примерно 1,6 сП до примерно 2 сП. В конкретных вариантах осуществления 0,75% (масс/об) раствор имеет вязкость при 37°C, составляющую от примерно 1,07 сП до примерно 1,08 сП. Раствор желатина может быть получен в PBS, DMEM или другом подходящем растворителе.

В одном из аспектов препарат содержит биоактивные клетки в сочетании со вторым биологическим материалом, который обеспечивает благоприятную среду для объединенных с ним клеток с момента формулирования вплоть до момента после введения субъекту. В конкретных вариантах осуществления благоприятная среда, обеспечиваемая вторым биологическим материалом, означает наличия преимущества введения клеток в биологическом материале, который сохраняет структурную целостность вплоть до момента введения субъекту и в течение некоторого периода времени после введения. В конкретных вариантах осуществления структурная целостность второго биологического материала после имплантации сохраняется в течение нескольких минут, часов, дней или недель. В конкретных вариантах осуществления структурная целостность сохраняется в течение менее одного месяца, менее одной недели, менее одного дня или менее одного часа. В течение короткого периода времени структурная целостность позволяет иметь препарат, который способен доставлять активное средство и биологический материал в целевой участок в ткани или органе, с контролируемой обработкой, размещением или диспергированием, не препятствуя или не мешая взаимодействию включенных элементов с тканью или органом, в который он был помещен.

В конкретных вариантах осуществления второй биологический материал представляет собой термочувствительный биологический материал, который имеет иную чувствительность, чем первый биологический материал. Второй биологический материал может иметь (i) практически твердое состояние при температуре около температуры окружающей среды, или ниже, и (ii) практически жидкое состояние при примерно 37°C, или выше. В конкретных вариантах осуществления температура окружающей среды примерно соответствует комнатной температуре.

В конкретных вариантах осуществления второй биологический материал представляет собой сшитые гранулы. Сшитые гранулы могут иметь тонко настраиваемое время пребывания in vivo в зависимости от степени сшивки, как описано в настоящем документе. В конкретных вариантах осуществления сшитые гранулы содержат биоактивные клетки и являются устойчивыми к ферментативному расщеплению, как описано в настоящем документе. Препараты по настоящему изобретению могут включать первый биологический материал в сочетании с активным средством, например, биоактивными клетками, с добавлением, или без добавления, второго биологического материала в сочетании с активным средством, например, биоактивными клетками. Если препарат включает второй биологический материал, тот может представлять собой термочувствительные гранулы и/или сшитые гранулы.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к препаратам, содержащим биологические материалы, которые распадаются в течение периода времени порядка нескольких минут, часов или дней. Это отличается от большого количества работ, направленных на имплантацию твердых материалов, которые затем медленно распадаются в течение дней, недель или месяцев. В конкретных вариантах осуществления биологический материал имеет одну или более из следующих характеристик: биологическую совместимость, биоразлагаемость/биовсасываемость, практически твердое состояние до, и в процессе, имплантации субъекту, утрату структурной целостности (практически твердого состояния) после имплантации и совместимую с клетками среду для поддержания жизнеспособности и пролиферации клеток. Способность биологического материала удерживать имплантированные частицы на расстоянии во время имплантации стимулирует врастание естественной ткани. Биологический материал также облегчает имплантацию твердых препаратов. Биологический материал обеспечивает локализацию препарата, описанного в настоящем документе, поскольку введение твердого элемента помогает предотвращать диспергирование доставляемых материалов в ткани во время имплантации. В случае клеточных препаратов твердый биологический материал также способствует повышению стабильности и жизнеспособности прикрепляющихся клеток, в сравнении клетками, суспендированными в жидкости. Однако короткий срок существования структурной целостности означает, что вскоре после имплантации биологический материал больше не создает значительный барьер для врастания ткани или интеграции доставленных клеток/материалов с тканью хозяина.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к препаратам, которые содержат биологические материалы, имплантируемые в практически твердой форме, а затем разжижающиеся/плавящиеся или иным образом теряющие структурную целостность после имплантации в тело. Это отличается от большого количества работ, направленных на использование материалов, которые могут быть введены в виде жидкостей, впоследствии затвердевающих в теле.

Биосовместимые гранулы

В одном из других аспектов препарат включает термочувствительный биологический материал, описанный в настоящем документе, и популяцию биосовместимых гранул, содержащих биологический материал. В конкретных вариантах осуществления гранулы являются сшитыми. Сшивку можно осуществлять с использованием любого подходящего сшивающего агента, известного специалистам в данной области, такого как, например, карбодиимиды; альдегиды (например, фурфурол, акролеин, формальдегид, глутаральдегид, глицерилальдегид), сшивающие агенты на основе сукцинимида (бис(сульфосукцинимидил)суберат (BS3), дисукцинимидилглутарат (DSG), дисукцинимидилсуберат (DSS), дитиобис(сукцинимидил пропионат), этиленгликоль-бис(сульфосукцинимидилсукцинат), этиленгликоль-бис(сукцинимидилсукцинат) (EGS), бис(сульфосукцинимидил)глутарат (BS2G), дисукцинимидилтартрат (DST)); эпоксиды (диглицидный эфир этиленгликоля, диглицидный эфир 1,4-бутандиола); сахариды (сахара глюкоза и альдоза); сульфоновые кислоты и п-толуолсульфоновая кислота; карбонилдиимидазол; генипин; имины; кетоны; дифенилфосфорилазид (DDPA); терефталоил хлорид; нитрат гексагидрат церия (III); микробная трансглутаминаза и пероксид водорода. Специалистам в данной области известны и другие подходящие сшивающие агенты и методы сшивки для использования по настоящему изобретению.

В конкретных вариантах осуществления гранулы представляют собой сшитые карбодиимидом гранулы. Сшитые карбодиимидом гранулы могут быть сшиты при помощи карбодиимида, выбранного из группы, состоящей из 1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимида гидрохлорида (EDC), DCC - N,N'-дициклогексилкарбодиимида (DCC) и N,N'-диизопропилкарбодиимида (DIPC). Считается, что гранулы, обработанные EDC в более низкой концентрации, имеют большее количество свободных первичных аминов, в то время как образцы, обработанные сшивающим агентом в более высокой концентрации, будут иметь большинство первичных аминов, вовлеченных в амидные связи. Интенсивность оранжевой окраски, развивающейся при ковалентном связывании между первичным амином и пикролсульфоновой кислотой, которая может быть определена спектрофотометрическим методом при 335 нм, пропорциональна количеству первичных аминов, присутствующих в образце. При нормировании на миллиграмм белка, присутствующего в образце, можно наблюдать обратную корреляцию между количеством присутствующих свободных аминов и исходной концентрацией EDC, используемого для сшивки. Этот результат указывает на дифференциальное сшивание гранул, обусловленное количеством карбодиимида, использованного в реакции. Как правило, в сшитых гранулах наблюдается меньшее количество свободных первичных аминов в сравнении с не сшитыми гранулами.

Сшитые гранулы в меньшей степени подвержены ферментативному расщеплению в сравнении с не сшитыми биосовместимыми гранулами, что позволяет точно настраивать гранулы для времени существования in vivo. Например, сшитые гранулы устойчивы к эндогенным ферментам, таким как коллагеназы. Использование сшитых гранул является частью системы доставки, облегчающее одно или более из: (a) доставки прикрепленных клеток в нужные участки и создания пространства для регенерации и врастания естественной ткани и сосудистой сети; (b) возможности существования в нужном участке достаточно долго для того, чтобы клетки адаптировались, функционировали, реконструировали свою микросреду и секретировали их естественный внеклеточный матрикс (ВКМ); (c) стимуляции интеграции трансплантированных клеток с окружающей тканью; (d) возможности имплантации клеток в практически твердой форме; (e) кратковременной структурной целостности, которая не создает существенное препятствие для врастания ткани, de novo ангиогенеза или интеграции доставляемых клеток/материалов с тканью хозяина; (f) локализованной in vivo доставки в практически твердой форме, что предотвращает диспергирование клеток в ткани в процессе имплантации; (g) повышенной стабильности и жизнеспособности прикрепляющихся клеток в сравнении с клетками, суспендированными в жидкости; (h) двухфазного профиля высвобождения при доставке клеток 1) в практически твердой форме (например, прикрепленными к гранулам), и 2) в практически жидкой форме (например, суспендированными в жидкости); i) воссоздания и имитации трехмерной биологической ниши или паренхимы почки, из которой эти популяции биоактивных клеток были получены.

В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к сшитым гранулам, содержащим желатин. Не сшитые желатиновые гранулы не подходят для препарата биоактивных клеток, поскольку они быстро утрачивают целостность, и клетки рассеиваться от участка инъекции. Напротив, желатиновые гранулы с высокой степенью сшивки могут существовать достаточно долго в участке инъекции и могут препятствовать de-novo секреции ВКМ, интеграции клеток, ангиогенезу и регенерации ткани. Настоящее изобретение позволяет точно регулировать время существования in vivo сшитых гранул. Для точного регулирования биоразлагаемости биологических материалов используют разные концентрации карбодиимида при сшивке, в то время как общие условия реакции оставляют постоянными для всех образцов. Например, чувствительность к ферментам гранул, сшитых карбодиимидом, может быть тонко настроена путем изменения концентрации сшивающего агента от примерно нуля до примерно 1 M. В конкретных вариантах осуществления концентрация составляет примерно 5 мМ, примерно 6 мМ, примерно 7 мМ, примерно 8 мМ, примерно 9 мМ, примерно 10 мМ, примерно 11 мМ, примерно 12 мМ, примерно 13 мМ, примерно 14 мМ, примерно 15 мМ, примерно 16 мМ, примерно 17 мМ, примерно 18 мМ, примерно 19 мМ, примерно 20 мМ, примерно 21 мМ, примерно 22 мМ, примерно 23 мМ, примерно 24 мМ, примерно 25 мМ, примерно 26 мМ, примерно 27 мМ, примерно 28 мМ, примерно 29 мМ, примерно 30 мМ, примерно 31 мМ, примерно 32 мМ, примерно 33 мМ, примерно 34 мМ, примерно 35 мМ, примерно 36 мМ, примерно 37 мМ, примерно 38 мМ, примерно 39 мМ, примерно 40 мМ, примерно 41 мМ, примерно 42 мМ, примерно 43 мМ, примерно 44 мМ, примерно 45 мМ, примерно 46 мМ, примерно 47 мМ, примерно 48 мМ, примерно 49 мМ, примерно 50 мМ, примерно 55 мМ, примерно 60 мМ, примерно 65 мМ, примерно 70 мМ, примерно 75 мМ, примерно 80 мМ, примерно 85 мМ, примерно 90 мМ, примерно 95 мМ или примерно 100 мМ. Концентрация сшивающего агента также может составлять примерно 0,15 M, примерно 0,2 M, примерно 0,25 M, примерно 0,3 M, примерно 0,35 M, примерно 0,4 M, примерно 0,45 M, примерно 0,5 M, примерно 0,55 M, примерно 0,6 M, примерно 0,65 M, примерно 0,7 M, примерно 0,75 M, примерно 0,8 M, примерно 0,85 M, примерно 0,9 M, примерно 0,95 M или примерно 1 M. В конкретных вариантах осуществления сшивающий агент представляет собой 1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимид гидрохлорид (EDC). В конкретных вариантах осуществления сшитые EDC гранулы представляют собой желатиновые гранулы. Деградация (%) гранул может быть точно отрегулирована в зависимости от концентрации сшивающего агента. В конкретных вариантах осуществления желатиновые гранулы могут быть смешаны с гранулами или микрочастицами, выполненными не из желатина (например, без ограничения, альгината или HA), для дополнительного повышения эффективности доставляемой популяции биоактивных клеток.

Сшитые гранулы могут обладать определенными характеристиками, которые являются благоприятными для высевания, прикрепления или инкапсуляции популяций биоактивных клеток. Например, гранулы могут иметь пористую поверхность и/или могут быть в значительной степени полыми. Наличие пор обеспечивает большую поверхность для прикрепления клеток, что делает возможным прикрепление большего количества клеток, чем в случае непористой или гладкой поверхности. Кроме того, пористая структура может способствовать интеграции ткани хозяина с пористыми гранулами, облегчая образование de novo ткани. Гранулы имеют распределение по размерам, которое может быть подогнано к графику Вейбулла, соответствующему общей схеме распределения частиц. В конкретных вариантах осуществления сшитые гранулы имеют средний диаметр менее примерно 120 мкм, примерно 115 мкм, примерно 110 мкм, примерно 109 мкм, примерно 108 мкм, примерно 107 мкм, примерно 106 мкм, примерно 105 мкм, примерно 104 мкм, примерно 103 мкм, примерно 102 мкм, примерно 101 мкм, примерно 100 мкм, примерно 99 мкм, примерно 98 мкм, примерно 97 мкм, примерно 96 мкм, примерно 95 мкм, примерно 94 мкм, примерно 93 мкм, примерно 92 мкм, примерно 91 мкм или примерно 90 мкм. Характеристики сшитых гранул варьируются в зависимости от метода изготовления. Например, для получения гранул, имеющих вышеуказанные характеристики, используют метод, в котором поток воздуха используют для аэрозолизации жидкого раствора желатина и распыления его в жидкий азот с помощью распылителя реагентов для тонкослойной хроматографии (ACE Glassware). Специалисты в данной области понимают, что изменение параметров метода изготовления дает возможность точно регулировать различные характеристики гранул, например, изменять распределение по размерам частиц. В конкретных вариантах осуществления микротопографию, поверхностные и внутренние характеристики гранул можно дополнительно модифицировать для облегчения прикрепления клеток.

Совместимость с клетками сшитых гранул оценивают in vitro до формулирования препарата, используя методы культивирования клеток, в которых гранулы культивируют с клетками, соответствующими конечному препарату биоактивных клеток. Например, гранулы культивируют с первичными почечными клетками до изготовления препарата биоактивных почечных клеток, используют анализы на живые/мертвые клетки для подтверждения совместимости с клетками. Помимо жизнеспособности клеток, определенные функциональные тесты для определения клеточной метаболической активности, секреции конкретных ключевых цитокинов, факторов роста и экзосом, а также экспрессии конкретных ключевых белковых и нуклеотидных маркеров, включая микроРНК, ассоциированные с функциональными популяциями биоактивных почечных клеток, хорошо известны специалистам в данной области и могут быть дополнительно использованы для подтверждения активности клеток в препарате со сшитыми гранулами.

В некоторых препаратах биосовместимые сшитые гранулы объединены с термочувствительным биологическим материалом в растворе с концентрацией от примерно 5% (масс/масс) до примерно 15% (масс/масс) от объема раствора. Сшитые гранулы могут присутствовать в концентрации примерно 5% (масс/масс), примерно 5,5% (масс/масс), примерно 6% (масс/масс), примерно 6,5% (масс/масс), примерно 7% (масс/масс), примерно 7,5% (масс/масс), примерно 8% (масс/масс), примерно 8,5% (масс/масс), примерно 9% (масс/масс), примерно 9,5% (масс/масс), примерно 10% (масс/масс), примерно 10,5% (масс/масс), примерно 11% (масс/масс), примерно 11,5% (масс/масс), примерно 12% (масс/масс), примерно 12,5% (масс/масс), примерно 13% (масс/масс), примерно 13,5% (масс/масс), примерно 14% (масс/масс), примерно 14,5% (масс/масс) или примерно 15% (масс/масс) от объема раствора.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к препаратам, содержащим биологические материалы, которые распадаются в течение периода времени порядка нескольких минут, часов или дней. Это отличается от большого количества работ, направленных на имплантацию твердых материалов, которые затем медленно распадаются в течение дней, недель или месяцев.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к препаратам, содержащим биосовместимые сшитые гранулы, засеянные биоактивными клетками, совместно с матрицей для доставки. В конкретных вариантах осуществления матрица для доставки имеет одну или более из следующих характеристик: биологическую совместимость, биоразлагаемость/биовсасываемость, практически твердое состояние до, и в процессе, имплантации субъекту, утрату структурной целостности (практически твердого состояния) после имплантации и совместимую с клетками среду для поддержания жизнеспособности клеток. Способность матрицы для доставки удерживать имплантированные частицы (например, сшитые гранулы) разделенными в пространстве во время имплантации стимулирует врастание естественной ткани. В отсутствие матрицы для доставки уплотнение засеянных клетками гранул в процессе имплантации может приводить к недостатку пространства для достаточного врастания ткани. Матрица для доставки облегчает имплантацию твердых препаратов. Кроме того, короткий срок существования структурной целостности означает, что вскоре после имплантации матрица больше не создает значительный барьер для врастания ткани, de novo ангиогенеза или интеграции доставленных клеток/материалов с тканью хозяина. Матрица для доставки обеспечивает локализацию препарата, описанного в настоящем документе, поскольку введение твердого элемента помогает предотвращать диспергирование доставляемых материалов в ткани во время имплантации. В конкретных вариантах осуществления применение матрицы для доставки, описанной в настоящем документе, помогает предотвращать быструю потерю имплантированных клеток при мочеиспускании после доставки в паренхиму почки. В случае клеточных препаратов твердая матрица для доставки способствует повышению стабильности и жизнеспособности прикрепляющихся клеток в сравнении клетками, суспендированными в жидкости.

В конкретных вариантах осуществления матрица для доставки представляет собой популяцию биосовместимых гранул, не засеянных клетками. В конкретных вариантах осуществления незасеянные гранулы диспергированы по всему объему, и между отдельными засеянными гранулами. Незасеянные гранулы действуют в качестве «разделительных гранул» между засеянными гранулами до, и сразу после, трансплантации. Разделительные гранулы содержат термочувствительный биологический материал, находящийся в практически твердом состоянии при первой температуре и в практически жидком состоянии при второй температуре, при этом первая температура является более низкой, чем вторая температура. Например, разделительные гранулы содержат биологический материал, находящийся в практически твердом состоянии при температуре около температуры окружающей среды, или ниже, и в практически жидком состоянии при примерно 37°C, как описано в настоящем документе. В конкретных вариантах осуществления температура окружающей среды примерно соответствует комнатной температуре. В конкретных вариантах осуществления биологический материал представляет собой раствор желатина. Раствор желатина используют в концентрации примерно 4%, примерно 4,5%, примерно 5%, примерно 5,5%, примерно 6%, примерно 6,5%, примерно 7%, примерно 7,5%, примерно 8%, примерно 8,5%, примерно 9%, примерно 9,5%, примерно 10%, примерно 10,5% или примерно 11% (масс/об). Раствор желатина может быть получен в PBS, среде для культивирования клеток (например, DMEM) или другом подходящем растворителе. В конкретных вариантах осуществления биологический материал представляет собой гиалуроновую кислоту. В конкретных вариантах осуществления биологический материал представляет собой лишенный клеток внеклеточный матрикс из почки человека или животного, который может быть в дальнейшем восстановлен в виде гидрогеля.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к препаратам, которые содержат биологические материалы, имплантируемые в практически твердой форме (например, разделительные гранулы), а затем разжижающиеся/плавящиеся или иным образом теряющие структурную целостность после имплантации в тело. Это отличается от большого количества работ, направленных на использование материалов, которые могут быть введены в виде жидкостей, впоследствии затвердевающих в теле.

Температурную чувствительность разделительных гранул можно оценивать in vitro до формулирования. Разделительные гранулы можно метить и смешивать с немечеными не термочувствительными гранулами. Затем смесь инкубируют при 37°C, чтобы наблюдать изменения в физическом переходе между состояниями. Потерю формы термочувствительными гранулами при более высокой температуре наблюдают с течением времени. Например, термочувствительные желатиновые гранулы могут быть изготовлены с красителем альциановым синим, служащим маркером физического перехода между состояниями. Синие желатиновые гранулы смешивают со сшитыми гранулами (белыми), помещают в катетер, затем экструдируют и инкубируют в 1X PBS, pH 7,4, при 37°C. Потерю формы синими желатиновыми гранулами наблюдают под микроскопом в разные моменты времени. Изменения физического состояния синих желатиновых гранул становятся заметны через 30 мин, становясь более выраженными с увеличением времени инкубации. Гранулы не исчезают полностью из-за вязкости материала.

Препараты с модифицированным высвобождением

В одном из аспектов препараты по настоящему изобретению предоставляют в виде препаратов с модифицированным высвобождением. Как правило, модифицированное высвобождение характеризуется начальным высвобождением первого активного средства после введения, с последующим по меньшей мере одним дополнительным высвобождением второго активного средства. Первое и второе активные средства могут быть одинаковыми, или они могут быть разными. В конкретных вариантах осуществления препараты обеспечивают модифицированное высвобождение за счет наличия нескольких компонентов в одном и том же препарате. В конкретных вариантах осуществления препарат с модифицированным высвобождением содержит активное средство в виде части первого компонента, который позволяет активному средству свободно перемещаться по всему объему препарата, что приводит к немедленному высвобождению в целевом участке после введения. Первый компонент может представлять собой термочувствительный биологический материал, имеющий практически жидкую фазу и практически твердую фазу, при этом первый компонент находится в практически жидкой фазе в момент введения. В конкретных вариантах осуществления активное средство находится в практически жидкой фазе, так что оно может практически свободно перемещаться по всему объему препарата и, таким образом, немедленно высвобождается в целевом участке после введения.

В конкретных вариантах осуществления препарат с модифицированным высвобождением содержит активное средство в виде части второго компонента, при этом активное средство прикреплено, нанесено, покрыто, погружено, высеяно или заключено во втором компоненте, который сохраняется до, и после, введения в целевой участок. Второй компонент содержит структурные элементы, с которыми активное средство может связываться, что предотвращает немедленное высвобождение активного средства из второго компонента в момент введения. Например, второй компонент находится в практически твердой форме, например, в виде биосовместимых гранул, которые могут быть сшиты для предотвращения или отсрочки in vivo ферментативного расщепления. В конкретных вариантах осуществления активное средство в практически твердой фазе сохраняет свою структурную целостность в препарате до, и после, введения и, таким образом, не происходит немедленного высвобождения активного средства в целевом участке после введения. Подходящие носители для препаратов с модифицированным высвобождением описаны в настоящем документе, однако специалистам в данной области известны и другие носители, подходящие для использования по настоящему изобретению.

В конкретных вариантах осуществления препарат обеспечивает начальную быструю доставку/высвобождение доставляемых элементов, включая клетки, наночастицы, терапевтические молекулы, и так далее, с последующим высвобождением элементов в более позднее время. В конкретных вариантах осуществления препарат обеспечивает начальную быструю доставку/высвобождение экзосом, микроРНК и других биоактивных молекул нуклеиновой кислоты или белка, которые являются растворимыми и секретируемыми биоактивными продуктами из почечных или других популяций клеток. Другие молекулы или лекарственные средства, связанные с регенеративной биологической активностью, известны специалистам в данной области. Препараты по настоящему изобретению могут быть спроектированы для такого двухфазного профиля высвобождения, когда доставляемое средство присутствует как в несвязанной форме (например, клетки в растворе), так и в связанной форме (например, клетки, связанные с гранулами или другим подходящим носителем). После начального введения несвязанное средство немедленно поступает в участок доставки, в то время как высвобождение связанного средства отсрочено до того момента, когда нарушается структурная целостность носителя (например, гранул), после чего высвобождается ранее связанное средство. Как описано ниже, и другие подходящие механизмы высвобождения известны специалистам в данной области.

Время отсрочки высвобождения можно корректировать в зависимости от природы активного средства. Например, время отсрочки высвобождения в препарате биоактивных клеток может быть порядка нескольких секунд, минут, часов или дней. В определенных обстоятельствах может быть подходящей отсрочка порядка нескольких недель. В случае других активных средств, таких как малые и большие молекулы, время отсрочки высвобождения в препарате может быть порядка нескольких секунд, минут, часов, дней, недель или месяцев. Препарат также может содержать разные биологические материалы, которые обеспечивают профили с разной отсрочкой высвобождения. Например, первый биологический материал с первым активным средством может иметь первое время высвобождения, и второй биологический материал со вторым активным средством может иметь второе время высвобождения. Первое и второе активные средства могут быть одинаковыми или разными.

Как описано в настоящем документе, период времени замедленного высвобождения может, в целом, соответствовать периоду времени для утраты структурной целостности биологического материала. Однако специалистам в данной области известны и другие механизмы замедленного высвобождения. Например, активное средство может непрерывно высвобождаться с течением времени независимо от времени распада какого-либо конкретного биологического материала, например, за счет диффузии лекарственного средства из полимерной матрицы. Кроме того, биоактивные клетки могут мигрировать из препарата, содержащего биологический материал и биоактивные клетки, в естественную ткань. В конкретных вариантах осуществления биоактивные клетки мигрируют из биологического материала, например, гранулы, в естественную ткань. В одном варианте осуществления биоактивные клетки мигрируют из биологического материала в естественную ткань и индуцируют секрецию факторов роста, цитокинов, экзосом, микроРНК, других нуклеиновых кислот и белков, связанных с регенеративной биологической активностью. В конкретных вариантах осуществления экзосомы и другие внеклеточные везикулы, а также микроРНК, другие биоактивные нуклеиновые кислоты и белки мигрируют из биологического материала. В другом варианте осуществления биоактивные клетки мигрируют из биологического материала в естественную ткань и опосредуют мобилизацию стволовых клеток и клеток-предшественников хозяина, которые затем мигрируют, или направляются, в участок повреждения или заболевания.

Можно использовать биоразлагаемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Пролонгированной абсорбции инъекционных препаратов можно добиваться путем включения в препарат средства, которое замедляет абсорбцию, например, солей моностеарата и желатина. Многие способы получения таких препаратов запатентованы или общеизвестны специалистам в данной области. Смотри, например, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978. Дополнительные способы получения полипептидных препаратов с контролируемым или пролонгированным высвобождением описаны, например, в патентах США №№ 6306406 и 6346274, а также, например, в патентных заявках США №№ US20020182254 и US20020051808, содержание всех из которых включено в настоящий документ посредством ссылки.

Препараты биоактивных клеток

Препараты биоактивных клеток, описанные в настоящем документе, содержат имплантируемые конструкции, выполненные из вышеописанных биологических материалов, включающие генетически модифицированные биоактивные почечные клетки, описанные в настоящем документе, для лечения заболевания почек у субъекта, который нуждается в этом. В конкретных вариантах осуществления конструкция выполнена из биосовместимого материала, или биологического материала, каркаса или матрицы из одного или более синтетических или природных биосовместимых материалов, и одной или более популяций клеток или смесей клеток, описанных в настоящем документе, нанесенных на, или погруженных в, поверхность каркаса за счет прикрепления и/или захвата. В конкретных вариантах осуществления конструкция выполнена из биологического материала и одной или более популяций клеток или смесей клеток, описанных в настоящем документе, покрытых, нанесенных на, внесенных в, прикрепленных к, заключенных в, погруженных в, высеянных или объединенных с компонентом(ами) биологического материала. Любые из популяций клеток, описанных в настоящем документе, включая обогащенные популяции клеток или их смеси, могут быть использованы в сочетании с матрицей при формировании конструкции. В конкретных вариантах осуществления препарат биоактивных клеток получен из биосовместимого материала, или биологического материала, и популяций генетически модифицированных ОПК, описанных в настоящем документе.

В конкретных вариантах осуществления препарат биоактивных клеток представляет собой инъекционный препарат, состоящий из ОПК, генетически модифицированных для снижения иммуногенности и сформулированных в биологическом материале (например, желатиновом гидрогеле). В одном из аспектов аллогенные ОПК получают путем выделения и размножения почечных клеток из донорской ткани коркового слоя почки пациента, полученной при биопсии почки, генетической модификации ОПК с использованием методов генного редактирования и отбора методом центрифугирования в градиенте плотности из размноженных почечных клеток. ОПК состоят в основном из почечных эпителиальных клеток, которые хорошо известны своим регенеративным потенциалом (Humphreys et al. (2008) Intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury. Cell Stem Cell. 2(3):284-91). И другие паренхиматозные (сосудистые) и стромальные (собирающих протоков) клетки могут в небольших количествах присутствовать в популяции ОПК. Инъекция ОПК в почки реципиента приводила к значительному улучшению показателей выживаемости, функций концентрирования мочи и фильтрования у животных в доклинических исследованиях. Однако ОПК имеют ограниченный срок хранения и ограниченную стабильность. Формулирование ОПК в биологическом материале, представляющем собой желатиновый гидрогель, обеспечивает повышенную стабильность клеток, за счет чего увеличивается срок хранения препарата, повышается стабильность при транспортировке и доставке в корковый слой почки при клиническом применении.

В одном из аспектов препараты биоактивных клеток производят, сначала получая ткань коркового слоя почки от донора с использованием стандартной клинической процедуры биопсии почки. Почечные клетки выделяют из почечной ткани путем ферментативного расщепления и размножают с использованием стандартных методов культивирования клеток. Среда для культивирования клеток разработана для размножения первичных почечных клеток, и не содержит какие-либо факторы дифференцировки. Собранные почечные клетки подвергают разделению в градиенте плотности, получая ОПК. Методы генного редактирования для изменения иммуногенности ОПК можно применять либо до, либо после, разделения в градиенте плотности.

В конкретных вариантах осуществления сформулированная популяция клеток может практически свободно перемещаться по всему объему биологического материала при температуре около температуры окружающей среды, или выше. Суспендирование популяции клеток в практически твердой фазе при более низкой температуре обеспечивает преимущество стабильности для клеток, таких как прикрепляющиеся клетки, в сравнении с клетками в жидкости. Более того, суспендирование клеток в практически твердом состоянии обеспечивает одно или более из следующих преимуществ: i) предотвращает оседание клеток, ii) позволяет клеткам оставаться заякоренными на биологическом материале в суспендированном состоянии; iii) позволяет клеткам оставаться более равномерно распределенными по всему объему биологического материала; iv) предотвращает образование клеточных агрегатов и v) обеспечивает лучшую защиту клеток при хранении и транспортировке препарата. Препарат, способный сохранять такие признаки до введения субъекту, обладает по меньшей мере тем преимуществом, что клетки, в целом, будут более здоровыми в препарате, и может быть введена более однородная и воспроизводимая доза клеток.

В предпочтительном варианте осуществления биологический материал в виде желатинового гидрогеля, используемый для формулирования ОПК, представляет собой свиной желатин, растворенный в буфере, с образованием термочувствительного гидрогеля. Такой гидрогель является жидким при комнатной температуре, но образует гель при охлаждении до температуры охлаждения (2-8°C). ОПК формулируют с гидрогелем, переводят в гель путем охлаждения и отправляют в клинику в условиях охлаждения (2-8°C). В клиническом центре препарат нагревают до комнатной температуры перед введением инъекцией в почку пациента. Препарат биоактивных клеток имплантируют в корковый слой почки с использованием иглы и шприца, подходящих для доставки чрескожным или лапароскопическим введением.

Описание и состав иллюстративной композиции Neo-Kidney Augment

В конкретных вариантах осуществления препарат биоактивных клеток представляет собой Neo-Kidney Augment (NKA), который представляет собой инъекционный препарат, состоящий из аутологичных, отобранных почечных клеток (ОПК), сформулированных в биологическом материале (желатиновом гидрогеле). В одном из аспектов аутологичные ОПК получают путем выделения и размножения почечных клеток из ткани коркового слоя почки пациента, полученной при биопсии почки, и отбора методом центрифугирования размноженных почечных клеток через границу, барьер или интерфейс между фазами с разной плотностью. В конкретных вариантах осуществления аутологичные ОПК получают путем выделения и размножения почечных клеток из ткани коркового слоя почки пациента, полученной при биопсии почки, и отбора методом центрифугирования размноженных почечных клеток в непрерывном или прерывистом, одноступенчатом или многоступенчатом, градиенте плотности. ОПК состоят в основном из эпителиальных клеток почечных канальцев, которые хорошо известны своим регенеративным потенциалом (Humphreys et al. (2008) Intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury. Cell Stem Cell. 2(3):284-91). И другие паренхиматозные (сосудистые) и стромальные (собирающих протоков) клетки могут в небольших количествах присутствовать в популяции аутологичных ОПК. Инъекция ОПК в почки реципиента приводила к значительному улучшению показателей выживаемости, функций концентрирования мочи и фильтрования у животных в доклинических исследованиях. Однако ОПК имеют ограниченный срок хранения и ограниченную стабильность. Формулирование ОПК в биологическом материале, представляющем собой желатиновый гидрогель, обеспечивает повышенную стабильность клеток, за счет чего увеличивается срок хранения препарата, повышается стабильность NKA при транспортировке и доставке NKA в корковый слой почки при клиническом применении.

В одном из аспектов NKA производят, сначала получая ткань коркового слоя почки от донора/реципиента с использованием стандартной клинической процедуры биопсии почки. В конкретных вариантах осуществления почечные клетки выделяют из почечной ткани путем ферментативного расщепления и размножают с использованием стандартных методов культивирования клеток. В конкретных вариантах осуществления среда для культивирования клеток разработана для размножения первичных почечных клеток, и не содержит какие-либо факторы дифференцировки. В конкретных вариантах осуществления собранные почечные клетки подвергают разделению через границу или интерфейс между фазами с разной плотностью, или в градиенте плотности, получая ОПК. В конкретных вариантах осуществления ОПК генетически модифицируют в соответствии с настоящим изобретением.

Настоящее изобретение относится к препарату, полученному из биологических материалов, разработанных или адаптированных для реагирования на внешние условия, как описано в настоящем документе. В результате, характер связи популяции биоактивных клеток с биологическим материалом в конструкции будет меняться в зависимости от внешних условий. Например, связь популяции клеток с термочувствительным биологическим материалом меняется в зависимости от температуры. В конкретных вариантах осуществления конструкция содержит популяцию биоактивных почечных клеток и биологический материал, находящийся в практически твердом состоянии при температуре примерно 8°C, или ниже, и в практически жидком состоянии при температуре около температуры окружающей среды, или выше, при этом популяция клеток суспендирована в биологическом материале при температуре примерно 8°C, или ниже. Однако популяция клеток может практически свободно перемещаться по всему объему биологического материала при температуре около температуры окружающей среды, или выше. Суспендирование популяции клеток в практически твердой фазе при более низкой температуре обеспечивает преимущество стабильности для клеток, таких как прикрепляющиеся клетки, в сравнении с клетками в жидкости. Более того, суспендирование клеток в практически твердом состоянии обеспечивает одно или более из следующих преимуществ: i) предотвращает оседание клеток, ii) позволяет клеткам оставаться заякоренными на биологическом материале в суспендированном состоянии; iii) позволяет клеткам оставаться более равномерно распределенными по всему объему биологического материала; iv) предотвращает образование клеточных агрегатов и v) обеспечивает лучшую защиту клеток при хранении и транспортировке препарата. Препарат, способный сохранять такие признаки до введения субъекту, обладает по меньшей мере тем преимуществом, что клетки, в целом, будут более здоровыми в препарате, и может быть введена более однородная и воспроизводимая доза клеток.

В конкретных вариантах осуществления биологический материал в виде желатинового гидрогеля, используемый для формулирования ОПК в NKA, представляет собой свиной желатин, растворенный в буфере, с образованием термочувствительного гидрогеля. Такой гидрогель является жидким при комнатной температуре, но образует гель при охлаждении до температуры охлаждения (2-8°C). ОПК формулируют с гидрогелем, получая NKA. NKA переводят в гель путем охлаждения и отправляют в клинику в условиях охлаждения (2-8°C). NKA имеет срок хранения 3 дня. В клиническом центре препарат нагревают до комнатной температуры перед введением инъекцией в почку пациента. NKA имплантируют в корковый слой почки с использованием иглы и шприца, подходящих для доставки NKA чрескожным или лапароскопическим введением. В конкретных вариантах осуществления гидрогель получают из желатина или другого рекомбинантного белка внеклеточного матрикса. В конкретных вариантах осуществления гидрогель получают из внеклеточного матрикса почки, или другой ткани или органа. В конкретных вариантах осуществления гидрогель получают из рекомбинантного белка внеклеточного матрикса. В конкретных вариантах осуществления гидрогель содержит желатин, полученный из рекомбинантного коллагена (то есть, рекомбинантный желатин).

Средства, сохраняющие жизнеспособность клеток

В одном из аспектов препарат биоактивных клеток также содержит средство, сохраняющее жизнеспособность клеток. В конкретных вариантах осуществления средство, сохраняющее жизнеспособность клеток, выбирают из группы, состоящей из антиоксиданта, переносчика кислорода, иммуномодулирующего фактора, фактора рекрутинга клеток, фактора прикрепления клеток, противовоспалительного средства, ангиогенного фактора, матриксной металлопротеиназы, ранозаживляющего фактора и продуктов, секретируемых из биоактивных клеток.

Антиоксиданты характеризуются способностью ингибировать окисление других молекул. Антиоксиданты включают, без ограничения, одно или более из 6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновой кислоты (тролокс^®), каротиноидов, флавоноидов, изофлавонов, убихинона, глутатиона, липоевой кислоты, супероксиддисмутазы, аскорбиновой кислоты, витамина E, витамина A, смешанных каротиноидов (например, бета-каротина, альфа-каротина, гамма-каротина, лютеина, ликопина, фитоина, фитофлуена и астаксантина), селена, кофермента Q10, индол-3-карбинола, проантоцианидов, ресвератрола, кверцетина, катехинов, салициловой кислоты, куркумина, билирубина, щавелевой кислоты, фитиновой кислоты, липоевой кислоты, ванильной кислоты, полифенолов, феруловой кислоты, теафлавинов, а также их производных. Специалистам в данной области известны и другие подходящие антиоксиданты, которые могут быть использованы в конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения.

Переносчики кислорода представляют собой средства, характеризующиеся способностью переносить и высвобождать кислород. Они включают, без ограничения, перфторуглероды и фармацевтические препараты, содержащие перфторуглероды. Подходящие переносчики кислорода на основе перфторуглерода включают, без ограничения, перфтороктил бромид (C8F17Br); перфтордихоротан (C8F16C12); перфтордецил бромид; перфлуброн; перфтордекалин; перфтортрипопиламин; перфторметилциклопиперидин; флуозол^® (перфтордекалин и перфтортрипопиламин); перфторан^® (перфтордекалин и перфторметилциклопиперидин); оксигент^® (перфтордецилбромид и перфлуброн); оксицит™ (перrфтор(трет-бутилциклогексан)). Специалисты в данной области понимают, что и другие подходящие переносчики кислорода на основе перфторуглерода могут быть использованы в конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения.

Иммуномодулирующие факторы включают, без ограничения, остеопонтин, факторы FAS-лиганда, интерлейкины, трансформирующий фактор роста бета, тромбоцитарный фактор роста, кластерин, трансферрин, белок, экспрессируемый и секретируемый нормальными T-клетками при активации (RANTES), ингибитор активатора плазминогена 1 (Pai-1), фактор некроза опухоли альфа (TNF-альфа), интерлейкин 6 (IL-6), альфа-1-микроглобулин и бета-2-микроглобулин. Специалисты в данной области понимают, что и другие подходящие иммуномодулирующие факторы могут быть использованы в конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения.

Противовоспалительные средства или иммунодепрессанты (описанные ниже) также могут быть частью препарата. Специалисты в данной области понимают, что и другие подходящие антиоксиданты могут быть использованы в конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения.

Факторы рекрутинга клеток включают, без ограничения, моноцитарный хемотаксический протеин 1 (MCP-1) и CXCL-1. Специалисты в данной области понимают, что и другие подходящие факторы рекрутинга клеток могут быть использованы в конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения.

Факторы прикрепления клеток включают, без ограничения, фибронектин, проколлаген, коллаген, ICAM-1, фактор роста соединительной ткани, ламинины, протеогликаны, специфические пептиды клеточной адгезии, такие как RGD и YSIGR. Специалисты в данной области понимают, что и другие подходящие факторы прикрепления клеток могут быть использованы в конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения.

Ангиогенные факторы включают, без ограничения, фактор роста эндотелия сосудов F (VEGF) и ангиопоэтин-2 (ANG-2). Специалисты в данной области понимают, что и другие подходящие ангиогенные факторы могут быть использованы в конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения.

Матриксные металлопротеазы включают, без ограничения, матриксную металлопротеиназу 1 (MMP1), матриксную металлопротеиназу 2 (MMP2), матриксную металлопротеиназу 9 (MMP-9) и тканевый ингибитор металлопротеиназ 1 (TIMP-1).

Ранозаживляющие факторы включают, без ограничения, фактор роста кератиноцитов 1 (KGF-1), тканевой активатор плазминогена (tPA), кальбиндин, кластерин, цистатин C, фактор «трилистника» 3. Специалисты в данной области понимают, что и другие подходящие ранозаживляющие факторы могут быть использованы в конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения.

Продукты, секретируемые биоактивными клетками, описанными в настоящем документе, также можно добавлять в препарат биоактивных клеток в качестве средства, сохраняющего жизнеспособность клеток.

Композиции, полученные из жидкостей организма, тканей или органов человека или животных, включая, без ограничения, человеческую плазму, лизат человеческих тромбоцитов, эмбриональную бычью сыворотку или экстракт бычьего гипофиза, также можно добавлять в препарат биоактивных клеток в качестве средства, сохраняющего жизнеспособность клеток.

Специалисты в данной области понимают, что существуют несколько подходящих способов нанесения, или иного варианта объединения популяций клеток с биологическими материалами для получения конструкции.

Способы применения

В одном из аспектов клетки и препараты по настоящему изобретению подходят для использования в способах применения, описанных в настоящем документе. В конкретных вариантах осуществления препараты по настоящему изобретению можно вводить для лечения заболевания. Например, генетически модифицированные биоактивные клетки можно вводить в естественный орган в виде части препарата, описанного в настоящем документе. В конкретных вариантах осуществления генетически модифицированные биоактивные клетки могут быть получены из естественного органа, в который будет выполнено введение, или из источника, который не является целевым естественным органом.

В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения заболевания почек у субъекта, который нуждается в этом, препаратами, содержащими популяции биоактивных почечных клеток, описанных в настоящем документе. В конкретных вариантах осуществления терапевтический препарат содержит популяцию отобранных почечных клеток, или их смеси, которые модифицированы путем генного редактирования для уменьшения иммуногенности. В конкретных вариантах осуществления препараты подходят для введения субъекту, который нуждается в улучшении почечной функции.

В одном из аспектов об эффективности лечения заболевания почек у субъекта способами по настоящему изобретению можно судить на основании различных показателей почечной функции. В конкретных вариантах осуществления показатели почечной функции включают, без ограничения, сывороточный альбумин, соотношение альбумина и глобулина (отношение A/G), сывороточный фосфор, сывороточный натрий, размер почки (определяемый при помощи ультразвука), сывороточный кальций, отношение фосфор:кальций, сывороточный калий, протеинурию, креатинин в моче, сывороточный креатинин, азот мочевины крови (BUN), уровни холестерина, уровни триглицеридов и скорость гломерулярной фильтрации (GFR). Кроме того, некоторые показатели общего состояния здоровья и самочувствия включают, без ограничения, увеличение и снижение массы тела, показатель выживаемости, кровяное давление (среднее системное кровяное давление, диастолическое кровяное давление или систолическое кровяное давление) и физическую выносливость.

В одном из аспектов на эффективность лечения препаратом биоактивных почечных клеток указывает стабилизация одного или более показателей почечной функции. О стабилизации почечной функции можно судить на основании изменения какого-либо показателя у субъекта, получающего лечение способом по настоящему изобретению, в сравнении с тем же показателем у субъекта, который не получал лечение способом по настоящему изобретению. Альтернативно, о стабилизации почечной функции можно судить на основании изменения какого-либо показателя у субъекта, получающего лечение способом по настоящему изобретению, в сравнении с тем же показателем у того же субъекта до начала лечения. Изменение первого показателя может представлять собой увеличение или уменьшение значения. В конкретных вариантах осуществления лечение, предложенное по настоящему изобретению, может включать стабилизацию уровней сывороточного креатинина и/или азота мочевины крови (BUN) у субъекта, при этом уровни BUN, наблюдаемые у субъекта, являются более низкими в сравнении с уровнями у субъекта с аналогичным состоянием заболевания, который не получал лечение способами по настоящему изобретению. В конкретных вариантах осуществления лечение может включать стабилизацию уровней сывороточного креатинина у субъекта, при этом уровни сывороточного креатинина, наблюдаемые у субъекта, являются более низкими в сравнении с уровнями у субъекта с аналогичным состоянием заболевания, который не получал лечение способами по настоящему изобретению. В конкретных вариантах осуществления стабилизация одного или более из вышеуказанных показателей почечной функции является результатом лечения препаратом отобранных почечных клеток, модифицированных путем генного редактирования для уменьшения иммуногенности.

Специалисты в данной области понимают, что один или более дополнительных показателей, описанных в настоящем документе или известных в данной области, можно измерять для определения эффективности лечения заболевания почек у субъекта.

В конкретных вариантах осуществления на эффективное лечение препаратом генетически модифицированных биоактивных почечных клеток указывает улучшение одного или более показателей почечной структуры и/или функции. В конкретных вариантах осуществления популяция генетически модифицированных биоактивных почечных клеток приводит к улучшению уровней сывороточного креатинина и/или азота мочевины крови (BUN). В конкретных вариантах осуществления популяция генетически модифицированных биоактивных почечных клеток приводит к улучшению удержания белка в сыворотке. В конкретных вариантах осуществления популяция генетически модифицированных биоактивных почечных клеток приводит к улучшению уровней сывороточного альбумина в сравнении с необогащенной популяцией клеток. В конкретных вариантах осуществления популяция генетически модифицированных биоактивных почечных клеток приводит у улучшению отношения A:G в сравнении с необогащенной популяцией клеток. В конкретных вариантах осуществления популяция генетически модифицированных биоактивных почечных клеток приводит к улучшению уровней сывороточного холестерина и/или триглицеридов. В конкретных вариантах осуществления популяция генетически модифицированных биоактивных почечных клеток приводит к улучшению уровня витамина D. В конкретных вариантах осуществления популяция генетически модифицированных биоактивных почечных клеток приводит к улучшению отношения фосфор:кальций в сравнении с необогащенной популяцией клеток. В конкретных вариантах осуществления популяция генетически модифицированных биоактивных почечных клеток приводит к улучшению уровня гемоглобина в сравнении с необогащенной популяцией клеток. В конкретных вариантах осуществления популяция генетически модифицированных биоактивных почечных клеток приводит к улучшению уровня сывороточного креатинина в сравнении с необогащенной популяцией клеток. В конкретных вариантах осуществления популяция генетически модифицированных биоактивных почечных клеток приводит к улучшению уровня гематокрита в сравнении с необогащенной популяцией клеток. В конкретных вариантах осуществления улучшение одного или более из вышеуказанных показателей почечной функции является результатом лечения препаратом отобранных почечных клеток. В одном из вариантов осуществления улучшение одного или более из вышеуказанных показателей почечной функции является результатом лечения препаратом отобранных почечных клеток, модифицированных путем генного редактирования для уменьшения иммуногенности.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к препаратам для использования в способах регенерации естественной почки у субъекта, который нуждается в этом. В конкретных вариантах осуществления способ включает этап введения или имплантации субъекту популяции, смеси или конструкции генетически модифицированных биоактивных клеток, описанных в настоящем документе. Регенерированная естественная почка может быть охарактеризована рядом показателей, включая, без ограничения, развитие функции, или способности, в естественной почке, улучшение функции, или способности, в естественной почке и экспрессия определенных маркеров в естественной почке. В конкретных вариантах осуществления о развитии или улучшении функции, или способности, можно судить на основании различных показателей почечной функции, описанных выше. В конкретных вариантах осуществления регенерированная почка характеризуется дифференциальной экспрессией одного или более маркеров стволовых клеток. Маркер стволовых клеток может являться одним или более из следующего: SRY (определяющая пол область Y)-бокс 2 (Sox2); фактор транскрипции недифференцированных эмбриональных клеток (UTF1); мышиный лимфоузелковый гомолог (NODAL); проминин 1 (PROM1) или CD133 (CD133); CD24; а также любое их сочетание (смотри Ilagan et al. PCT/US2011/036347, полное содержание заявки включено в настоящий документ посредством ссылки), смотри также публикацию Genheimer et al., 2012. Molecular characterization of the regenerative response induced by intrarenal transplantation of selected renal cells in a rodent model of chronic kidney disease. Cells Tissue Organs 196: 374-384, включенную в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме. В конкретных вариантах осуществления экспрессия маркера(ов) стволовых клеток повышена в сравнении с контролем.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания почек у субъекта, включающему введение инъекцией препарата, композиции или популяции клеток, раскрытых в настоящем документе, субъекту. В конкретных вариантах осуществления препарат, композицию или популяцию клеток вводят инъекцией через иглу 18-30 калибра. В конкретных вариантах осуществления препарат, композицию или популяцию клеток вводят инъекцией через иглу менее чем 20 калибра. В конкретных вариантах осуществления препарат, композицию или популяцию клеток вводят инъекцией через иглу менее чем 21 калибра. В конкретных вариантах осуществления препарат, композицию или популяцию клеток вводят инъекцией через иглу менее чем 22 калибра. В конкретных вариантах осуществления препарат, композицию или популяцию клеток вводят инъекцией через иглу менее чем 23 калибра. В конкретных вариантах осуществления препарат, композицию или популяцию клеток вводят инъекцией через иглу менее чем 24 калибра. В конкретных вариантах осуществления препарат, композицию или популяцию клеток вводят инъекцией через иглу менее чем 25 калибра. В конкретных вариантах осуществления препарат, композицию или популяцию клеток вводят инъекцией через иглу менее чем 26 калибра. В конкретных вариантах осуществления препарат, композицию или популяцию клеток вводят инъекцией через иглу менее чем 27 калибра. В конкретных вариантах осуществления препарат, композицию или популяцию клеток вводят инъекцией через иглу менее чем 28 калибра. В конкретных вариантах осуществления препарат, композицию или популяцию клеток вводят инъекцией через иглу менее чем 29 калибра. В конкретных вариантах осуществления препарат, композицию или популяцию клеток вводят инъекцией через иглу примерно 20 калибра. В конкретных вариантах осуществления препарат, композицию или популяцию клеток вводят инъекцией через иглу примерно 21 калибра.

В конкретных вариантах осуществления препарат, композицию или популяцию клеток вводят инъекцией через иглу примерно 22 калибра. В конкретных вариантах осуществления препарат, композицию или популяцию клеток вводят инъекцией через иглу примерно 23 калибра. В конкретных вариантах осуществления препарат, композицию или популяцию клеток вводят инъекцией через иглу примерно 24 калибра. В конкретных вариантах осуществления препарат, композицию или популяцию клеток вводят инъекцией через иглу примерно 25 калибра. В конкретных вариантах осуществления препарат, композицию или популяцию клеток вводят инъекцией через иглу примерно 26 калибра. В конкретных вариантах осуществления препарат, композицию или популяцию клеток вводят инъекцией через иглу примерно 27 калибра. В конкретных вариантах осуществления препарат, композицию или популяцию клеток вводят инъекцией через иглу примерно 28 калибра. В конкретных вариантах осуществления препарат, композицию или популяцию клеток вводят инъекцией через иглу примерно 29 калибра.

В конкретных вариантах осуществления внутренний диаметр иглы составляет менее 0,84 мм. В конкретных вариантах осуществления внутренний диаметр иглы составляет менее 0,61 мм. В конкретных вариантах осуществления внутренний диаметр иглы составляет менее 0,51 мм. В конкретных вариантах осуществления внутренний диаметр иглы составляет менее 0,41 мм. В конкретных вариантах осуществления внутренний диаметр иглы составляет менее 0,33 мм. В конкретных вариантах осуществления внутренний диаметр иглы составляет менее 0,25 мм. В конкретных вариантах осуществления внутренний диаметр иглы составляет менее 0,20 мм. В конкретных вариантах осуществления внутренний диаметр иглы составляет менее 0,15 мм. В конкретных вариантах осуществления наружный диаметр иглы составляет менее 1,27 мм. В конкретных вариантах осуществления наружный диаметр иглы составляет менее 0,91 мм. В конкретных вариантах осуществления наружный диаметр иглы составляет менее 0,81 мм. В конкретных вариантах осуществления наружный диаметр иглы составляет менее 0,71 мм. В конкретных вариантах осуществления наружный диаметр иглы составляет менее 0,64 мм. В конкретных вариантах осуществления наружный диаметр иглы составляет менее 0,51 мм. В конкретных вариантах осуществления наружный диаметр иглы составляет менее 0,41 мм. В конкретных вариантах осуществления наружный диаметр иглы составляет менее 0,30 мм. В конкретных вариантах осуществления игла имеет один из размеров, приведенных в следующей таблице:

ВД НД Калибр дюйм мм дюйм мм 14 0,060 1,55 0,072 1,83 15 0,054 1,37 0,065 1,65 16 0,047 1,19 н/п н/п 18 0,033 0,84 0,050 1,27 20 0,023 0,61 0,036 0,91 21 0,020 0,51 0,032 0,81 22 0,016 0,41 0,028 0,71 23 0,013 0,33 0,025 0,64 25 0,010 0,25 0,020 0,51 27 0,008 0,20 0,016 0,41 30 0,006 0,15 0,012 0,30 32 0,004 0,10 0,009 0,23

Секретируемые продукты

В конкретных вариантах осуществления эффект может быть произведен самими клетками и/или продуктами, секретируемыми клетками. Регенеративный эффект может быть охарактеризован одним или более из следующего: уменьшение эпителиально-мезенхимального перехода (что может происходить за счет ослабления сигнализации TGF-β); уменьшение почечного фиброза; уменьшение почечного воспаления; дифференциальная экспрессия маркера стволовых клеток в естественной почке; миграция имплантированных клеток и/или естественных клеток к участку повреждения почки, например, повреждению канальцев, приживление имплантированных клеток в участке повреждения почки, например, повреждения канальцев; стабилизация одного или более показателей почечной функции (описанных в настоящем документе); de novo образование S-образных телец/запятовидных телец, связанное с нефрогенезом, de novo образование почечных канальцев или нефронов, восстановление эритроидного гомеостаза (как описано в настоящем документе); а также любое их сочетание (смотри также публикации Basu et al., 2011. Functional evaluation of primary renal cell/biomaterial neo-kidney augment prototypes for renal tissue engineering. Cell Transplantation 20: 1771-90; Bruce et al., 2015. Selected renal cells modulate disease progression in rodent models of chronic kidney disease via NF-κB and TGF-β1 pathways. Regenerative Medicine 10: 815-839, полное содержание каждой из которых включено в настоящий документ посредством ссылки).

В качестве альтернативы биопсии ткани, регенеративный результат у субъекта, получающего лечение, можно оценивать на основании анализов жидкостей организма, например, мочи. Было обнаружено, что микровезикулы, полученные из образцов мочи субъекта, содержат определенные компоненты, включая, без ограничения, определенные белки и микроРНК, которые в конечном итоге получены из популяции почечных клеток, подвергнутых лечению популяциями клеток по настоящему изобретению. Эти компоненты могут включать, без ограничения, факторы, вовлеченные в репликацию и дифференциацию стволовых клеток, апоптоз, воспаление и иммуномодуляцию, фиброз, эпителиально-мезенхимальный переход, сигнализацию TGF-β и сигнализацию PAI-1. Временной анализ паттернов экспрессии связанных с микровезикулами микроРНК/белка позволяет непрерывно контролировать регенеративные результаты в почках у субъектов, получающих популяции, смеси или конструкции клеток по настоящему изобретению.

В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам оценки того, отвечает ли пациент с заболеванием почек (ПН) на лечение терапевтическим препаратом. Способ может включать этап определения или обнаружения количества везикул, или содержимого их просветов, в тестируемом образце, полученном от пациента с ПН, получающего лечение терапевтическим препаратом, в сравнении с, или относительно, количеством везикул в контрольном образце (например, образце, полученном от того же пациента до лечения терапевтическим средством), при этом большее или меньшее количество везикул, или содержимого их просветов, в тестируемом образце в сравнении с количеством везикул, или содержимого их просветов, в контрольном образце является показателем ответа получающего лечение пациента на лечение терапевтическим средством.

Эти полученные из почки везикулы и/или содержимое просветов полученных из почки везикул также может попадать в мочу субъекта и может быть проанализировано на биомаркеры, являющиеся показателем регенеративного результата или эффективности лечения. Неинвазивные прогностические методы могут включать этап получения образца мочи от субъекта до и/или после введения или имплантации популяции, смеси или конструкции генетически модифицированных биоактивных почечных клеток, описанных в настоящем документе. Везикулы и другие секретируемые продукты могут быть выделены из образцов мочи стандартными методами, включая, без ограничения, центрифугирование для удаления нежелательного детрита (Zhou et al. 2008. Kidney Int. 74(5):613-621; Skog et al., опубликованная патентная заявка США № 20110053157, содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме), осаждение для выделения экзосом из мочи, полимеразную цепную реакцию и секвенирование нуклеиновых кислот для идентификации конкретных нуклеиновых кислот и масс-спектроскопию и/или 2D электрофорез в геле для идентификации конкретных белков, связанных с регенеративным результатом.

Способы и пути введения

Препараты биоактивных клеток по настоящему изобретению можно вводить отдельно или в сочетании с другими биоактивными компонентами. Препараты подходят для инъекции или имплантации включенных генетически модифицированных элементов ткани в солидные органы для регенерации ткани. Кроме того, препараты используют для инъекции или имплантации генетически модифицированных элементов ткани в стенку полых органов для регенерации ткани.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способам предоставления препарата биоактивных клеток, описанных в настоящем документе, субъекту, который нуждается в этом. В конкретных вариантах осуществления источник биоактивных клеток может быть аллогенным или сингенным, а также любым их сочетанием. В конкретных вариантах осуществления способы могут включать введение иммунодепрессанта. (Смотри, например, патент США № 7563822).

Способы лечения по настоящему изобретению включают доставку препарата биоактивных клеток, описанных в настоящем документе. В одном варианте осуществления прямое введение клеток в целевую зону является предпочтительным. Субъект, который нуждается в этом, также может получать лечение путем создания in vivo контакта естественной почки с препаратом биоактивных клеток, описанных в настоящем документе, наряду с продуктами, секретируемыми одной или более обогащенными популяциями почечных клеток, и/или смесью или конструкцией, содержащей их. Этап создания in vivo контакта обеспечивает регенеративный эффект для естественной почки.

Различные способы введения композиций отобранных почечных клеток субъектам будут очевидны для специалистов в данной области. Такие способы включают инъекцию клеток в целевую зону в теле субъекта.

Средства доставки

Клетки и/или секретируемые продукты могут быть введены в устройство или среду для доставки, которые облегчают введение субъектам путем инъекции или имплантации. В конкретных вариантах осуществления среда для доставки может включать природные материалы. В других конкретных вариантах осуществления среда для доставки может включать синтетические материалы. В одном варианте осуществления среда для доставки имеет структуру, имитирующую, или хорошо вписывающуюся в, архитектуру органа. В других вариантах осуществления среда для доставки является жидкой по своей природе. В этих случаях устройства для доставки могут включать трубки, например, катетеры, для инъекции клеток и жидкостей в тело субъекта-реципиента. В предпочтительном варианте осуществления трубки также имеют иглу, например, шприц, через который клетки по изобретению могут быть введены в нужную зону в теле субъекта. В некоторых вариантах осуществления популяции почечных клеток млекопитающих сформулированы для введения в кровеносный сосуд через катетер (при этом термин «катетер» должен охватывать любую из различных трубкообразных систем для доставки веществ в кровеносный сосуд). Альтернативно, клетки могут быть помещены в, или на, биологический материал или каркас, включая, но без ограничения, ткань, такую как тканая, вязаная, плетеная, сетчатая и нетканая ткань, перфорированные пленки, губки и пены, а также гранулы, такие как монолитные или пористые гранулы, микрочастицы, наночастицы и тому подобное (например, желатиновые гранулы Cultispher-S - Sigma). Клетки могут быть подготовлены для доставки в самых разных формах. Например, клетки могут быть суспендированы в растворе или геле. Клетки могут быть смешаны с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем, в котором клетки по изобретению остаются жизнеспособными. Фармацевтически приемлемые носители и разбавители включают солевой раствор, водные растворы буферов, растворители и/или дисперсионные среды. Использование таких носителей и разбавителей хорошо известно в данной области. Раствор предпочтительно является стерильным и жидким, и часто будет изотоническим. Предпочтительно, раствор является стабильным в условиях производства и хранения, и предохраненным от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибки, за счет использования, например, парабенов, хлорбутанола, фенола, аскорбиновой кислоты, тимеросала и тому подобного. Специалист в данной области понимает, что среда для доставки, используемая для доставки популяций клеток и их смесей по настоящему изобретению, может иметь сочетание вышеуказанных характеристик.

Способы введения

Способы введения препаратов включают, но без ограничения, системную, внутрипочечную (например, в паренхиму), внутривенную или внутриартериальную инъекцию, а также инъекцию непосредственно в ткань, в запланированную зону проявления активности. Дополнительные способы введения, используемые по настоящему изобретению, включают одну или несколько инъекций путем прямой лапаротомии, путем прямой лапароскопии, трансабдоминальной или чрескожной процедуры. Следующие дополнительные способы введения, используемые по настоящему изобретению, включают, например, ретроградную и лоханочно-мочеточниковую инфузию. Хирургические способы введения включают одностадийные процедуры, такие как, но без ограничения, частичная нефрэктомия и имплантация конструкции, частичная нефрэктомия, частичная пиелэктомия, васкуляризация с сальником ± брюшина, введение при мультифокальной биопсии в пункционные каналы, конические или пирамидальные, в цилиндр, и введение путем полюсоподобной замены, а также двухстадийные процедуры, включающие, например, органоидный внутренний биореактор для пересадки. В конкретных вариантах осуществления препараты, содержащие смеси клеток, доставляют одним и тем же путем введения в одно и то же время. В другом варианте осуществления каждую из композиций клеток, содержащих контролируемую смесь, доставляют отдельно в определенные зоны или определенными методами, либо одновременно, либо в контролируемые моменты времени, одним или более из способов, описанных в настоящем документе. В конкретных вариантах осуществления отобранные почечные клетки вводят чрескожной инъекцией в корковый слой почки. В другом варианте осуществления направляющую канюлю вводят чрескожно и используют для прокалывания почечной капсулы перед инъекцией композиции в почку.

Чтобы получить доступ к почке для инъекции сформулированной популяции БПК или ОПК можно использовать лапароскопический или чрескожный метод. Использование лапароскопического хирургического метода делает возможной непосредственную визуализацию почки, так что любое кровотечение или другие нежелательные явления могут быть замечены в процессе инъекции и меры могут быть приняты немедленно. Чрескожный подход для введения в почки используют уже более десяти лет, в основном для абляции внутрипочечных масс. Во время этих процедур электрод или криогенную иглу вводят в определенную массу в почке и оставляют в контакте с ней в течение (как правило) 10-20 минут для абляции лезии. Инструментарий для чрескожной инъекции терапевтического препарата не превосходит ни по размеру, ни по сложности это оборудование, и такой подход обладает преимуществами безопасности ввиду отсутствия хирургической операции (отсутствия колотых ран в брюшной полости и нагнетания газа) и минимального времени иммобилизации. Кроме того, во входных каналах может быть оставлен гемостатический биоразлагаемый материал для дальнейшего снижения вероятности значительного кровотечения.

В одном варианте осуществления доставки путем инъекции терапевтический препарат биоактивных клеток инъецируют в корковый слой почки. Важно добиться максимального распределения терапевтического препарата в корковом слое почки, что может быть достигнуто, например, за счет входа иглы в корковый слой почки под углом, позволяющим депонировать терапевтический препарат в корковом слое почки с максимально возможным распределением. Для этого может потребоваться визуализация почки в продольной или поперечной проекции с использованием оборудования для ультразвуковой визуализации или аксиальной компьютерной томографии (КТ), в зависимости от индивидуальных характеристик пациента. В идеале инъекция будет включать несколько депонирований препарата при постепенном извлечении инъекционной иглы/канюли. Полный объем терапевтического препарата может быть депонирован в одной или нескольких точках входа. В конкретных вариантах осуществления можно использовать до двух точек входа для депонирования полного объема терапевтического препарата в почке. В конкретных вариантах осуществления инъекцию можно выполнять в одну почку с использованием одной или более точек входа, например, одной или двух точек входа. В конкретных вариантах осуществления инъекцию выполняют в обе почки, используя для каждой почки одну или более точек входа, например, одну или две точки входа.

Приведенное выше описание считается достаточным, чтобы специалист в данной области мог осуществить на практике настоящее изобретение. Следует понимать, что хотя настоящее изобретение конкретно описано с помощью предпочтительных вариантов осуществления и необязательных признаков, специалисты в данной области могут использовать модификации и вариации изложенных в настоящем документе концепций, и такие модификации и вариации должны считаться входящими в объем настоящего изобретения, определяемый прилагаемой формулой изобретения. Следующие далее примеры приведены исключительно с иллюстративными целями и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения каким-либо образом. Действительно, различные модификации изобретения, помимо вариантов, описанных в настоящем документе, будут очевидны для специалистов в данной области из вышеприведенного описания, и должны входить в объем прилагаемой формулы изобретения.

Все патенты, патентные заявки и литературные источники, цитированные в настоящей спецификации, включены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Неограничивающие примеры способов и композиций для получения ОПК

Пример 1.1 – Приготовление растворов

В данном примере приведены композиции различных сред для препаратов и растворов, используемых для выделения и характеризации гетерогенной популяции почечных клеток, а также производства регенеративного терапевтического препарата.

Таблица 6: Среды для культивирования и растворы

Материал Композиция Среда для транспортировки ткани -Viaspan™ или HypoThermosol-FRS^® или DMEM
-Канамицин: 100 мкг/мл Ростовая среда для почечных клеток -DMEM:KSFM (50:50)
-5% ЭБС
-Ростовые добавки:
-HGF: 10 мг/л
-EGF: 2,5 мкг/л
-Инсулин: 10,0 мг/л,
-Трансферрин: 5,5 мг/л
-Селен: 670 мкг/л
-Канамицин: 100 мкг/мл Раствор для промывания ткани -DMEM
-Канамицин: 100 мкг/мл Раствор для расщепления ткани -Коллагенaза IV: 300 единиц
-Диспаза: 5 мг/мл
-Хлорид кальция: 5 мМ Раствор для диссоциации клеток -TrypLE™ Раствор для градиента плотности -7% OptiPrep
-OptiMEM Раствор для криоконсервирования -DMEM или HypoThermosol-FRS
-10% ДМСО
-10% ЭБС

Для промывания клеток во всех случаях использовали фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS).

Пример 1.2 – Выделение гетерогенной не фракционированной популяции почечных клеток

В данном примере описано выделение не фракционированной (Н/ФР) гетерогенной популяции почечных клеток из человеческой почки. Была проведена начальная диссоциация ткани для получения гетерогенной клеточной суспензии из ткани человеческой почки.

Почечная ткань, полученная при биопсии почки, явилась исходным материалом для получения гетерогенной популяции почечных клеток. Можно использовать почечную ткань, содержащую одно или более из: коркового слоя, кортикомедуллярного соединения или медуллярной ткани. Предпочтительно использовать ткань кортикомедуллярного соединения. Необходимо несколько биоптатов (минимум 2), не затрагивающих рубцовую ткань, для получения образцов из почки с ХПН. Почечную ткань получал клинический исследователь от пациента в клиническом центре примерно за 4 недели до запланированной имплантации конечного препарата NKA. Ткань перевозили в среде для транспортировки ткани, описанной в примере 1.1.

Затем ткань промывали раствором для промывания ткани, описанным в примере 1.1, для уменьшения поступающей бионагрузки перед обработкой ткани для экстракции клеток.

Почечную ткань измельчали, взвешивали и проводили диссоциацию в растворе для расщепления ткани, описанном в примере 1.1. Полученную клеточную суспензию нейтрализовали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM) + 10% эмбриональной бычьей сыворотки (ЭБС) (Invitrogen, Carlsbad Calif.), промывали и ресуспендировали в бессывороточной, не содержащей добавки среде для кератиноцитов (KSFM) (Invitrogen). Затем клеточную суспензию центрифугировали через границу плотности 15% (масс/об) раствора йодиксанола (OptiPrep™, Sigma) для удаления эритроцитов и детрита, с последующим высевом для культивирования в обработанные для культивирования тканей полистирольные флаконы или планшеты при плотности 25000 клеток на см² в ростовой среде для почечных клеток, описанной в примере 1.1. Например, клетки можно высевать во флаконы Nunc T500 при плотности 25x10⁶ клеток/флакон в 150 мл среды 50:50.

Пример 1.3 – Размножение выделенной популяции почечных клеток

Размножение почечных клеток зависит от количества полученной ткани и от успешного выделения почечных клеток из полученной ткани. Выделенные клетки можно криоконсервировать, при необходимости (смотри ниже). Кинетика роста почечных клеток может варьироваться от образца к образцу вследствие неотъемлемой вариабельности клеток, полученных от отдельных пациентов.

Был разработан определенный способ размножения клеток, в котором учтен диапазон извлечения клеток, являющийся результатом вариабельности полученной ткани. Таблица 7. Размножение почечных клеток включает серийные пересевы в закрытых емкостях для культивирования клеток (например, T-флаконах, Cell Factories, HyperStacks^®) в ростовой среде для почечных клеток из Таблицы 6 с использованием определенных методов культивирования клеток.

Не содержащая ЭБГ среда была разработана для клинических испытаний с участием людей в целях устранения характерных рисков, связанных с использованием ЭБГ. Клеточный рост, фенотип (CK18) и клеточную функцию (ферментативную активность GGT и LAP) оценивали в не содержащей ЭБГ среде и сравнивали с результатами для содержащей ЭБГ среды, которую использовали в исследованиях на животных. Рост, фенотип и функция почечных клеток были эквивалентными в двух средах. (Данные не представлены).

Таблица 7. Извлечение клеток из биопсийных образцов человеческой почки

Источник Почечные клетки
(клетки/10 мг ткани) (пересев 0) (пересев 1) Образцы ткани человеческой почки (n=7) 1,44-10,80x106x 10⁶ 4,61-23,10x10⁷

После того, как рост клеток был обнаружен в исходных Т-флаконах (пересев 0), и отсутствовали видимые признаки загрязнения, культуральную среду заменяли, и впоследствии меняли каждые 2-4 дня (ФИГ. 3B). Проводили оценку клеток для подтверждения морфологии почечных клеток путем визуального анализа культур под микроскопом. Культуры, как правило, имели характерный вид плотного дорожного покрытия или крупной гальки из-за образования клетками скоплений. Эти морфологические характеристики меняются в процессе размножения и могут присутствовать не во всех пересеваемых культурах. Конфлюэнтность клеточных культур оценивали при разных уровнях конфлюэнтности в емкостях для культивирования, используемых в процессе размножения клеток.

Почечные клетки пересевали путем обработки трипсином, когда сосуды для культивирования имели конфлюэнтность по меньшей мере 50% (ФИГ. 3B). Открепившиеся клетки собирали в емкости, содержащие ростовую среду для почечных клеток, подсчитывали их количество и рассчитывали жизнеспособность клеток. При каждом пересеве клетки высевали при плотности 500-4000 клеток/см² в достаточное количество емкостей для культивирования, с целью их размножения до количества клеток, необходимого для препарата NKA (ФИГ. 3B). Емкости для культивирования помещали в инкубатор с температурой 37°C и атмосферой с 5% CO₂. Как описано выше, морфологию и конфлюэнтность клеток контролировали, и среду для культивирования клеток заменяли каждые 2-4 дня. В Таблице 8 приведены показатели жизнеспособности человеческих почечных клеток, наблюдаемые при выделении и размножении клеток из шести биопсийных образцов от людей-доноров.

Таблица 8 Жизнеспособность человеческих почечных клеток в культуре

Пересев (n=6) Жизнеспособность клеток (среднее, %) Диапазон (%) P0 88 84-93 P1 91 80-98 P2 94 92-99 P3 98 97-99

Неотъемлемая вариабельность тканей от разных пациентов приводила к разным выходам клеток в культуре. Таким образом, нецелесообразно строго определять время для пересева клеток, или количество и тип емкостей для культивирования, необходимых при каждом пересеве, для достижения целевых количеств клеток. Как правило, почечные клетки проводят через 2 или 3 пересева; однако продолжительность культивирования и выход клеток могут варьироваться в зависимости от скорости роста клеток.

Клетки открепляли для сбора или пересева 0,25% раствором трипсина с ЭДТА (Invitrogen). Жизнеспособность оценивали методом исключения трипанового синего, и подсчет клеток производили вручную при помощи гемоцитометра или при помощи автоматизированной системы Cellometer^® (Nexcelom Bioscience, Lawrence Mass.).

Пример 1.4. Криоконсервирование культивированных клеток

Размноженные почечные клетки, как правило, криоконсервировали для нивелирования неотъемлемой вариабельности скорости роста клеток от отдельных пациентов и доставки препарата по заранее определенному клиническому расписанию. Криоконсервированные клетки также являются запасным источником клеток в случае необходимости другого препарата NKA (например, в случае задержки вследствие болезни пациента, непредвиденных событий и так далее). Были разработаны условия, которые использовали для криоконсервирования клеток и восстановления жизнеспособных функциональных клеток при размораживании.

Для криоконсервирования клетки суспендировали до конечной концентрации примерно 50x10⁶ клеток/мл в растворе для криоконсервирования (смотри пример 1.1) и разливали во флаконы. Флаконы емкостью один миллилитр, содержащие примерно 50x10⁶ клеток/мл, помещали в морозильную камеру морозильной установки с контролируемой скоростью заморозки и замораживали с заранее установленной скоростью. После замораживания клетки переносили в емкость с жидким азотом для промежуточного хранения.

Пример 1.5. Получение клеточной популяции ОПК

Отобранные почечные клетки (ОПК) могут быть получены из емкостей для конечного культивирования, в которых клетки растут из криоконсервированных клеток или непосредственно из размножающихся культур, в зависимости от расписания (ФИГ. 3B).

При использовании криоконсервированных клеток клетки размораживали и помещали в емкости для культивирования ткани на один конечный этап размножения. При достижении конфлюэнтности примерно 50-100% в емкостях для конечного размножения клетки были готовы для процедуры отделения ОПК. При сменах среды и окончательном промывании NKA происходит разбавление любого остаточного раствора для криоконсервирования в конечном препарате.

После достижения в емкостях для конечного размножения по меньшей мере 50% конфлюэнтности клеток емкости для культивирования переносили в инкубатор с гипоксическими условиями, установленный на уровень 2% кислорода в атмосфере с 5% CO₂ при 37°C (ФИГ. 3C), и культивировали в течение ночи. Клетки можно выдерживать в инкубаторе с контролируемым содержанием кислорода, составляющим 2% кислорода, до 48 часов. Воздействие более соответствующего физиологическим условиям низкого уровня кислорода (2%) повышает эффективность разделения клеток и облегчает обнаружение индуцируемых гипоксией маркеров, таких как VEGF.

После того, как клетки были подвергнуты воздействию гипоксических условий в течение достаточного времени (например, в течение ночи или до 48 часов), клетки открепляли 0,25% раствором трипсина с ЭДТА (Invitrogen). Жизнеспособность оценивали методом исключения трипанового синего, и подсчет клеток производили вручную при помощи гемоцитометра или при помощи автоматизированной системы Cellometer^® (Nexcelom Bioscience, Lawrence Mass.). Клетки промывали один раз DPBS и ресуспендировали до плотности примерно 850x10⁶ клеток/мл в DPBS.

Центрифугирование через границу/интерфейс между фазами с разной плотностью использовали для разделения собранных популяций почечных клеток на основании плавучей плотности клеток. Суспензии почечных клеток разделяли центрифугированием через 7% раствор йодиксанола (OptiPrep; 60% (масс/об) в OptiMEM; смотри пример 1.1).

Готовили 7% раствор OptiPrep с интерфейсом между фазами с разной плотностью, и перед использованием измеряли коэффициент преломления, указывающий на желаемую плотность (КП 1,3456 ± 0,0004). Собранные почечные клетки наслаивали сверху на раствор. Центрифугирование проводили при 800 g в течение 20 мин при комнатной температуре (без торможения) либо в центрифужных пробирках, либо в устройстве для обработки клеток (например, COBE 2991). Фракцию клеток, имеющих плавучую плотность более примерно 1,045 г/мл, собирали после центрифугирования в виде четкого осадка клеток. Клетки, имеющие плавучую плотность менее 1,045 г/мл, исключали и отбрасывали.

Осадок клеток ОПК ресуспендировали в DPBS (ФИГ. 3C). Перенесенное остаточное содержание OptiPrep, ЭБС, культуральной среды и вспомогательных материалов в конечном препарате доводили до минимума за счет использования 4 этапов промывания DPBS и 1 этапа промывания раствором желатина.

Пример 2: Получение отобранных почечных клеток

Вкратце, биопсийные образцы почки подвергают ферментативной диссоциации в буфере, содержащем 4,0 единицы/мл диспазы (Stem Cell Technologies, Inc., Vancouver, BC, Canada) и 300 единиц/мл коллагеназы IV (Worthington Biochemical, Lakewood, NJ, USA). Эритроциты и детрит удаляют центрифугированием через 15% раствор йодиксанола (Optiprep^®, Axis Shield, Norton, MA, USA). Первичные почечные клетки высевают в обработанные для культивирования тканей полистирольные планшеты (NUNC, Rochester, NY, USA) и культивируют в среде 50:50, смеси 1:1 модифицированной по способу Дульбекко среды Игла с высоким содержанием глюкозы (DMEM) и бессывороточной среды для кератиноцитов (KSFM), содержащей 5% эмбриональной бычьей сыворотки (ЭБС), 1X ITS (добавка инсулин/трансферрин/селенит натрия для среды) и смесь антибиотика/антимикотика (все от компании Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Перед проведением разделения клеток после культивирования культуры первичных почечных клеток переносят из среды с атмосферным содержанием кислорода (21%) в более физиологичные условия с низким содержанием кислорода (2%) на 24 часа для повышения эффективности разделения клеток. Разделение культур первичных почечных клеток, доведенных до плотности 75x10⁶ клеток в 2 мл не содержащей добавки среды KSFM (uKSFM), проводят путем центрифугирования в четырехступенчатом градиенте плотности йодиксанола (OptiPrep; 60% масс/об в uKSFM) (16%, 13%, 11% и 7%) в 15-мл конических полипропиленовых пробирках при 800 g в течение 20 мин при комнатной температуре. После центрифугирования все полосы промывают 3 раза стерильным фосфатно-солевым буфером (PBS) перед использованием.

В конкретных вариантах осуществления клетки генетически модифицируют для удаления генов, кодирующих иммунологически активные клеточные поверхностные антигены, для придания генетически модифицированным ОПК иммунологической привилегированности с целью уменьшения отторжения в организме реципиента. В конкретных вариантах осуществления клетки генетически модифицируют (например, с использованием РНКи) для уменьшения экспрессии генов, кодирующих иммунологически активные клеточные поверхностные антигены, для придания генетически модифицированным ОПК иммунологической привилегированности с целью уменьшения отторжения в организме реципиента.

Объединяя биоактивные почечные клетки, имеющие плавучую плотность более примерно 1,0419 г/мл, из этапа центрифугирования в градиенте плотности, получают терапевтически биоактивные ОПК. Получение отобранных почечных клеток также описано, например, в Kelley et al. (Am J Physiol Renal Physiol 2010; 299: F1026-39), Kelley et al. (Cell Transplant 2013; 22:1023-39), Bruce et al. (Methods Mol Biol. 2013; 1001:53-64) и Basu et al. (Cell Transplant. 2011; 20:1171-901). Клеточные суспензии (100 мкл) вносят в 10-мл шприц в смеси с биологическим материалом, представляющим собой желатиновый гидрогель, для формулирования терапевтического препарата.

Жизнеспособность клеток определяют при каждом пересеве культуры и в процессе формулирования (исключение трипанового синего). Анализ клеточного фенотипа и активности проводят для конечного препарата, как описано ранее (Basu and Ludlow. Regen Med 2014; 9:497-512). Все процедуры проводят в соответствии с современными принципами Надлежащей производственной практики (cGMP), разработанными FDA и MPA QP.

Пример 3: Общий способ генетической модификации человеческих аллогенных почечных клеток для лечения хронической почечной недостаточности

Лечение пациентов отобранными почечными клетками по настоящему изобретению основано на использовании генетически модифицированных иммунологически привилегированных клеток, лишенных поверхностных антигенов, из-за которых может происходить отторжение клеток. В конкретных вариантах осуществления биоактивные почечные клетки получают от пациента или донора, отбирают ex vivo, культивируют in vitro для увеличения количества клеток, при необходимости, и в итоге вводят инфузией пациенту. Каждый пациент получает лечение, основанное на использовании генетически модифицированных иммунологически привилегированных биоактивных почечных клеток, лишенных поверхностных антигенов, приводящих к отторжению почечных клеток (то есть, терапию иммунологически привилегированными биоактивными почечными клетками). Для лучшего понимания изобретения схематическое изображение этапов производственного процесса для получения иммунологически привилегированного препарата NKA приведено на ФИГ. 1.

Для повышения уровня соответствия между потенциальным донором, имеющим неподходящий уровень соответствия HLA с реципиентом, проводят направленное аллель-специфическое генное редактирование с использованием Cas9 и конкретных молекул гРНК. В результате, вследствие деструкции генов уровень соответствия HLA с клетками от несовпадающего донора становится более подходящим (за счет уменьшения несоответствия HLA) для переноса потенциальному пациенту-реципиенту. Для повышения пригодности донорских ОПК для реципиента можно использовать мультиплексное генное редактирование HLA (MHC класса I и класса II) в первичных человеческих почечных клетках или обогащенных ОПК от пары: потенциальный аллогенный донор и реципиент.

Для уменьшения вероятности отторжения трансплантированных несовпадающих по HLA аллогенных клеток (например, биоактивных почечных клеток) проводят типирование субъекта-реципиента, нуждающегося в трансплантации, по HLA (например, определяют полиморфизм HLA-A, HLA-B и HLA-DRB 1) в 6 аллелях HLA (по 2 аллеля для каждого из HLA-A, HLA-B и HLA-DRB1). В идеале, генотип реципиента совпадает с генотипом донора, имеющего такие же 6/6 аллелей HLA, поскольку 6/6 совпадение аллелей HLA связано с меньшим риском иммунного отторжения после трансплантации. Если донор, имеющий 6/6 совпадение аллелей отсутствует (например, в регистре доноров ГСК костного мозга или пуповинной крови, или среди родственников), но имеются доноры с частичным совпадением, имеющие 5/6, 4/6, 3/6 или 2/6 совпадающих аллелей HLA, способы, описанные в настоящем документе, можно использовать для уменьшения несоответствия между частично совпадающим донором и реципиентом. По мере необходимости, один аллель или несколько аллелей (два, три, четыре, пять или шесть аллелей) могут быть разрушены с использованием способов генного редактирования, описанных в настоящем документе, для уменьшения риска иммуносупрессии и/или риска увеличения степени тяжести заболевания у перенесшего трансплантацию реципиента.

Способы, описанные в настоящем документе, могут быть использованы для модификации донорских почечных клеток (например, БПК и/или ОПК), с получением иммунологически привилегированных почечных клеток. Например, способы могут быть использованы для разрушения (например, нокаута) 1, 2 или 3 аллелей HLA в донорских ОПК для получения клеток, соответствующих генотипам HLA, наиболее часто встречающимся в конкретных популяциях. Например, наиболее часто встречающиеся 10 гаплотипов для четырех этнических групп в Северной Америке могут быть найдены, например, в документе «Данные о частоте встречаемости гаплотипов HLA» Национальной программы донорства костного мозга, доступном по сетевому адресу https://bioinformatics.bethematchclinical.org/hla-resources/haplotype-frequencies/; Burdett et al., Hum. Immunol. 64 (10 Suppl): S6 (2003)).

Для каждой гРНК проектируют и получают один олигонуклеотид. Промотор U6 и каркас гРНК (например, включая все, за исключением нацеливающего домена, например, включая последовательности из crРНК и tracrРНК, например, включая первый домен комплементарности; связывающий домен; второй домен комплементарности; проксимальный домен и концевой домен) отдельно амплифицируют методом ПЦР и очищают в виде молекул дцДНК. Специфический олигонуклеотид гРНК используют в реакции ПЦР для соединения U6 и каркаса гРНК, связанных нацеливающим доменом, определяемым олигонуклеотидом. Полученную молекулу дцДНК очищают для трансфекции. Для управления in vivo транскрипцией или для in vitro транскрипции можно использовать альтернативные промоторы. Любой каркас гРНК можно использовать для создания молекул гРНК, совместимых с молекулами Cas9 из любых видов бактерий.

Каждую тестируемую гРНК трансфицируют, наряду с плазмидой, экспрессирующей Cas9, и небольшим количеством GFP-экспрессирующей плазмиды, в человеческие клетки. В предварительных экспериментах эти клетки могут представлять собой иммортализованные линии клеток человека, такие как 293T, K562 или U20S. Альтернативно, можно использовать первичные человеческие клетки. В этом случае клетки могут быть родственными конечным целевым терапевтическим клеткам (например, эритроидным клеткам). Использование первичных клеток, аналогичных потенциальной терапевтической целевой популяции клеток, может позволить получать важную информацию о частоте таргетирования генов в контексте эндогенного хроматина и о генной экспрессии.

Трансфекцию можно выполнять методом липидной трансфекции (например, с использованием липофектамина или Fugene^®) или методом электропорации (например, Lonza Nucleofection™). После трансфекции можно определять экспрессию GFP либо методом флуоресцентной микроскопии, либо методом проточной цитометрии, для подтверждения постоянных и высоких уровней трансфекции. В этих предварительных экспериментах по трансфекции можно использовать разные гРНК и разные подходы для нацеливания (17-мерные, 20-мерные, нуклеаза, двойная никаза и так далее) для определения того, какие гРНК/сочетания гРНК приводят к наибольшей активности.

Эффективность расщепления с каждой гРНК можно оценивать путем определения NHEJ-индуцированного образования вставки/делеции в локусе-мишени в анализе с T7E1 или путем секвенирования. Альтернативно, также можно использовать и другие чувствительные к несовпадению ферменты, такие как нуклеаза Cell/Surveyor.

Для анализа с T7E1 ПЦР-ампликоны имеют размер примерно 500-700 п.н., с предполагаемым сайтом разреза, размещенным в ампликоне асимметрично. После амплификации, очистки и подтверждения размера ПЦР-продуктов ДНК денатурируют и повторно гибридизуют путем нагревания до 95°C, с последующим медленным охлаждением. Гибридизованные ПЦР-продукты затем расщепляют T7 эндонуклеазой I (или другим чувствительным к несовпадению ферментом), которая узнает и расщепляет участки неточного совпадения в ДНК. Если вставки/делеции присутствуют в оригинальной матричной ДНК, то при денатурации и повторном отжиге ампликонов это приводит к гибридизации цепей ДНК, имеющих разные вставки/делеции, и результатом этого является не идеально совпадающая двухцепочечная ДНК. Продукты расщепления можно визуализировать методом электрофореза в геле или капиллярного электрофореза. Фракцию ДНК, которая расщеплена (плотность расщепленных продуктов, деленная на плотность расщепленных и нерасщепленных продуктов), можно использовать для оценки процентной доли NHEJ при помощи следующей формулы: %NHEJ = (1-(1 -расщепленная фракция)'72). Анализ с T7E1 имеет чувствительность всего примерно 2-5% NHEJ.

Вместо, или помимо, анализа с T7E1 можно использовать секвенирование. Для секвенирования по Сенгеру очищенные ПЦР-ампликоны клонируют в каркас плазмиды, трансформируют клетки, получают минипрепарат и секвенируют с одним праймером. Секвенирование по Сенгеру можно использовать для точного определения природы вставок/делеций после определения степени NHEJ методом с T7E1. Секвенирование также можно выполнять с использованием методов секвенирования следующего поколения. При использовании секвенирования следующего поколения ампликоны могут иметь размер 300-500 п.н., с предполагаемым сайтом разреза, размещенным асимметрично. После ПЦР адаптеры и штрих-коды секвенирования следующего поколения (например, мультиплексные адаптеры и индексы Illumina) можно добавлять на концах ампликона, например, для использования в секвенировании с высокой пропускной способностью (например, на Illumina MiSeq). Этот метод позволяет обнаруживать очень низкую степень NHEJ.

При том, что способы, описанные в настоящем документе, приведены в качестве примера идентификации молекул гРНК для использования с молекулой CRISPR/Cas9, специалисту в данной области будет понятно, что способы идентификации гРНК, описанные в настоящем документе, могут быть использованы для идентификации и выбора последовательностей, которые могут быть использованы с другими нуклеазами (например, TALEN, Cpfl и нуклеазами «цинковые пальцы»). Различные модификации вариантов осуществления примера будут очевидны для специалистов в данной области, и общие принципы, определенные в настоящем документе, могут быть применены к другим вариантам осуществления и вариантам применения без отклонения от сущности и объема изобретения. Кроме того, в следующем описании, многочисленные подробности приведены с целью разъяснения. Однако специалист в данной области понимает, что изобретение может быть осуществлено на практике без использования этих конкретных подробностей.

Пример 4: Исследования иммуногенности и эффективности с генетически модифицированными иммунологически привилегированными ОПК

В первом исследовании на животных геномно модифицированные иммунологически привилегированные ОПК от крысы дикого типа вводят инъекцией в почку мутантных крыс Sprague Dawley (SD) с поликистозом почек (ПКП). Основным оцениваемым результатом является количество геномно модифицированных иммунологически привилегированных ОПК дикого типа, которые сохраняется в нефронах мутантной почки. Крысы SD ПКП, имеющие хроническую почечную недостаточность (ХПН) и получившие инъекцию сингенных ОПК крыс SD дикого типа, будут оценены методами in situ гибридизации и ПЦР тканей, гистологическими методами для качественного определения локализации и на молекулярном уровне для количественного определения степени интеграции и удержания клеток дикого типа в пораженных болезнью нефронах.

Во втором исследовании генное редактирование человеческих ОПК будет оценено в in vitro анализе с использованием 4 анализов активности для оценки функции ОПК после удаления генов, контролирующих MHC класса I, класса II, или классов I и II. Система CRISPR/Cas9 будет введена методом электропорации, и ОПК будут изучены в отношении аффективного хемотаксиса, образования канальцев, высвобождения цитокинов и эффективного хемотаксиса.

Пример 5: Супрессия MHC в ОПК

CRISPR/Cas9 делает возможным специфическое нарушение генома и внесение замен в гибкой и простой системе, что приводит к высокой специфичности и низкой токсичности для клеток. Для системы редактирования генома CRISPR/Cas9 необходима совместная экспрессия белка Cas9 с вектором гид-РНК, экспрессируемой с человеческого промотора U6 для полимеразы III. С мотивом, прилегающим к протоспейсеру (PAM - последовательность NGG), находящимся на 3′-конце, Cas9 раскручивает дуплекс ДНК и расщепляет обе цепи после узнавания гид-РНК последовательности-мишени. Функциональная кассета, синтезированная в спасающем донорском векторе, затем может быть вставлена в раскрученную ДНК. После этого восстановленный геном будет экспрессировать нужную последовательность с метками, или без них. CRISPR изначально использовали для «нокаута» генов-мишеней в различных видах клеток и организмов, однако модификации с использованием фермента Cas9 позволили расширить сферу применения CRISPR для избирательной активации или подавления генов-мишеней, очистки определенных областей ДНК и даже визуализации ДНК в живых клетках с использованием флуоресцентной микроскопии.

Авторы изобретения приняли решение использовать генное редактирование при помощи CRISPR/Cas9 для воздействия на B2M или HLA-A (субъединица) компонент MHC-I. Эпигеномная модификация в геномном локусе-мишени может изменить доступность сайта-мишени ДНК для белка Cas. Авторы изобретения обнаружили, что молекулы гид-РНК успешно осуществляют нокдаун экспрессии гена-мишени B2M вблизи сайта начала транскрипции гена в области открытого хроматина, характеризуемой обширным метилированием остатка H3K4 нуклеосомы. Общедоступную программу (CHOPCHOP, WU-CRISPR) использовали для проектирования конструктов-мишеней для CRISPR (определяемых связыванием гид-РНК последовательностей ДНК), и использовали электропорацию для трансфицирования почечных клеток. Последовательность-мишень ДНК для гена B2M, которая была успешно таргетирована для получения данных FACS, является следующей:

Последовательность-мишень ДНК

GAGTAGCGCGAGCACAGCTA (SEQ ID NO: 346)

Последовательность PAM

AGG

Локус-мишень

Хром. 15: 44711563-44711585 на GRCh38 (смотри NM_004048.2 на chr15:45003685-45010357 на поисковом портале University of California Santa Cruz genome browser genome assembly GRCh37/hg19)

Цепь

Обратная

Электропорацию использовали для введения конструктов CRISPR/Cas9 в первичные человеческие почечные клетки. И другие методы, включая липофекцию, трансфекцию, микроинъекцию, и так далее, известные специалистам в данной области, могут быть использованы для доставки конструктов CRISPR/Cas9. Хотя представленные ниже результаты сфокусированы на субъединице B2M, аналогичные подходы могут быть использованы для нацеливания на полипептид (HLA-A).

В человеческие первичные почечные клетки (1x10⁶) вводили электропорацией конструкт CRISPR/Cas9, специфически направленный на компонент B2M комплекса MHC-I. Все эксперименты, результаты которых приведены на ФИГ. 6-8, проводили с использованием человеческих первичных почечных клеток, культивируемых после ферментативного расщепления почечной ткани. Эти клетки не обрабатывали для получения ОПК. Клетки оставляли для восстановления на 48 часов после электропорации. Экспрессию B2M оценивали методом FACS. Электропорацию выполняли с использованием системы для электропорации Gene pulser Xcell™ (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, California, USA), стандартной программы №1: прямоугольный импульс, в течение 5 миллисекунд, при 160 вольт, в 0,2-см кювете, общий объем 100 мкл.

Отдельно, в человеческие первичные почечные клетки (1x10⁶) вводили электропорацией конструкт CRISPR/Cas9, специфически направленный на компонент B2M комплекса MHC-I. Клетки оставляли для восстановления на 5 дней после электропорации. Экспрессию B2M оценивали методом FACS.

Как показано на ФИГ. 6, авторам изобретения удалось добиться снижения экспрессии B2M на 47%, что было определено методом FACS через 48 час после электропорации. Аналогичное снижение наблюдали через 5 дней после электропорации, это указывало на стабильность трансфекции. Смотри ФИГ. 7.

Что касается положения, молекулярный анализ показал, что нокаут B2M произошел в правильном локусе B2M. Смотри ФИГ. 8. Этот результат важен для безопасности клеточного препарата.

Независимо от гаплотипа ABO донорских клеток ОПК данный подход приводил к успешному нокауту B2M, не влияя на функцию ОПК, что определяли на основании результатов анализов секреции VEGF и KIM1, которые являются анализами на активность ОПК. Смотри ФИГ. 9 и 11.

Реакция смешанной культуры лимфоцитов (MLR) представляет собой тест, используемый фармацевтическими и биотехнологическими организациями для изучения безопасности лекарственного средства или имплантируемого материала. Его обычно используют в качестве части процесса для получения разрешения на производство лекарственных средств от Управления по контролю качества продовольствия и медикаментов США (FDA). Технически, он представляет собой ex vivo клеточный иммунный анализ с использованием двух популяций аллогенных лимфоцитов (от особей одного и того же вида, но генетически отличающихся). В односторонней MLR только одна популяция лимфоцитов может отвечать или пролиферировать. В двусторонней MLR обе популяции могут пролиферировать. MLR проводят для оценки того, каким образом T-клетки реагируют на внешние стимулы. T-клетки представляют собой белые клетки крови, которые осуществляют контроль за клеточными аномалиями и инфекциями. Они жизненно важны для иммунитета человека.

Авторы изобретения выполнили одностороннюю MLR с использованием контрольных и генетически редактированных CRISPER клеток в качестве популяции стимулятора. В случае успешного нокаута или нокдауна экспрессии B2M, можно было прогнозировать уменьшение клеточной пролиферации лимфоцитов. Как показано на ФИГ. 10, при тестировании 3 разных препаратов ОПК, каждый из которых имел разный уровень понижающей регуляции B2M на основании результатов FACS, авторы изобретения наблюдали сопутствующее снижение пролиферации лимфоцитов.

Авторы изобретения имеют систему, с помощью которой они могут продемонстрировать отрегулированную степень нокаута генов и корреляцию с иммунным ответом in vitro. В результате, для людей, получающих такое лечение, потребуется минимальное, или вовсе не потребуется, использование иммуносупрессивных лекарственных средств, которые сами оказывают вредное воздействие на организм.

Пример 6: Компоненты иллюстративного препарата NKA

1. Клеточные компоненты и материалы

ОПК являются биоактивным компонентом NKA. ОПК состоят в основном из эпителиальных клеток почечных канальцев, которые хорошо известны своим регенеративным потенциалом. И другие паренхиматозные (сосудистые), мезенхимальные, эндотелиальные и стромальные (собирающих протоков) клетки могут присутствовать в популяции аутологичных ОПК.

ОПК получают из ткани коркового слоя почки, полученной при стандартной клинической процедуре биопсии почки для сбора биоптатов почечной ткани. Почечные клетки выделяют из почечной ткани путем ферментативного расщепления и размножают с использованием стандартных методов культивирования клеток. Проводят оценку клеток для подтверждения морфологии почечных клеток путем визуального анализа культур под микроскопом. Культуры имеют характерный вид плотного дорожного покрытия или крупной гальки из-за образования клетками скоплений (ФИГ. 13). ОПК получают путем разделения выделенных и размноженных клеток через границу или интерфейс между фазами с разной плотностью, или в одноступенчатом прерывистом градиенте плотности.

Центрифугирование через границу или интерфейс между фазами с разной плотностью используют для разделения собранных популяций почечных клеток на основании плавучей плотности клеток. Суспензии почечных клеток разделяют в растворе OptiPrep (7% йодиксанол; 60% (масс/об) в среде OptiMEM). Фракцию клеток, имеющих плавучую плотность более примерно 1,0419 г/мл, собирают после центрифугирования в виде четкого осадка клеток (ФИГ. 14). Клетки, имеющие плавучую плотность менее 1,0419 г/мл, исключают и отбрасывают.

Осадок клеток ОПК ресуспендируют в DPBS. Перенесенное остаточное содержание OptiPrep, ЭБС, культуральной среды и вспомогательных материалов в конечном препарате доводят до минимума за счет использования этапов промывания.

2. Биологические материалы и вспомогательные материалы

Следующие биологические материалы и вспомогательные материалы используют для формулирования ОПК в NKA:

1. Свиной желатин – используют для создания термочувствительного гидрогеля.

2. Фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS) – используют для растворения свиного желатина. Буфер можно заменять, или смешивать с, человеческой плазмой или лизатом человеческих тромбоцитов.

Изготовление биологического материала

Биологический материал представляет собой раствор желатина, состоящий из свиного желатина в DPBS. Желатин растворяют в DPBS или человеческой плазме/лизате человеческих тромбицитов, или их смеси, до определенной концентрации, получая раствор желатина для термочувствительного гидрогеля. Раствор желатина стерилизуют фильтрованием через 0,1-мкм фильтр и хранят охлажденным или замороженным в аликвотах одноразового применения, готовых для формулирования.

Ключевым свойством биологического материала является то, что он представляет собой термочувствительный гидрогель, который может иметь форму геля, и разжижаться, при разных температурах. Раствор желатина, используемый в препарате NKA, является жидким при комнатной температуре (22-28°C), и выше, и образует гель при охлаждении до температуры охлаждения (2-8°C).

Концентрация раствора желатина

Желатин в диапазоне концентраций 0,5-1,0% оценивали в отношении гелеобразующих свойств – способности образовывать гель при температуре охлаждения (не течет при переворачивании) и становиться жидким при комнатной температуре (свободное течение при переворачивании). В Таблице 9 приведены показатели гелеобразования при разных концентрациях раствора желатина.

Таблица 9 – Гелеобразующие свойства раствора желатина при разных концентрациях

Концентрация желатина Гель
(температура охлаждения) Текучая жидкость
(комнатная температура) 0,50% +/- + 0,63% + + 0,75% + + 0,88% + + 1,00% + +

Поскольку NKA, сформулированный с раствором желатина в концентрации 0,63% и выше, воспроизводимо соответствовал критериям приемлемости, диапазон концентраций 0,88 ± 0,12% был выбран для желатина в препарате NKA. Следует отметить, однако, что препараты, содержащие желатин в диапазоне концентраций от примерно 0,63% до примерно 1%, также являются подходящими.

3. Препарат NKA

ОПК формулируют в NKA с раствором желатина, желатиновым термочувствительным гидрогелем. Желатиновый термочувствительный гидрогель обеспечивает повышенную стабильность клеток, таким образом, способствуя увеличению срока хранения, стабильности при транспортировке и доставке ОПК в корковый слой почки для клинического применения. При разработке препарата оценивают композицию, концентрацию и стабильность раствора желатина.

Промытые ОПК подсчитывают методом с исключением красителя трипанового синего. Раствор желатина извлекают из холодного хранилища и разжижают путем нагревания до 26-30°C. Объем суспензии ОПК, содержащий требуемое количество клеток, центрифугируют, и осадок клеток ресуспендируют в разжиженном растворе желатина для этапа окончательного промывания. Эту суспензию центрифугируют, и осадок ОПК ресуспендируют в достаточном объеме раствора желатина для достижения конечной концентрации ОПК 100x10⁶ клеток/мл в сформулированном препарате NKA.

Внесение NKA в емкости и образование геля

Препарат NKA асептически вносят в шприц. Динамический отбор проб воздуха производится в течение всего процесса наполнения, включая отбор проб на жизнеспособность и не на жизнеспособность. Упаковку с NKA вращают в течение минимум 2 часов для поддержания клеток в суспензии при охлаждении до 2-8°C в процессе получения конечного гелевого препарата NKA. Для гелеобразования охлаждение необходимо производить быстро, чтобы клетки не оседали в растворе желатина. Температуру раствора желатина в шприце контролируют при помещении его в условия охлаждения. Наблюдается быстрое падение температуры, как показано на ФИГ. 15. Через 1 час температура, как правило, падает до температуры в пределах 0,3°C от конечной температуры 4,4°C.

Охлаждение раствора желатина запускает процесс образования геля, однако требуется определенное количество времени для стабилизации сформированного геля, чтобы ОПК оставались суспендированными в геле при хранении. Шприцы, содержащие сформулированный NKA, вращают либо в течение ночи, либо в течение 1,25 часа, а затем выдерживают в вертикальном положении в течение ночи. Затем содержимое извлекают и измеряют концентрацию клеток в четырех разных сегментах препарата. Анализ показывает, что отсутствует разница между четырьмя сегментами, таким образом, отсутствует поддающееся определению оседание клеток, когда NKA вращают при температуре охлаждения в течение минимум 1,25 часа (ФИГ. 16).

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, в частности к способу получения биоактивной почечной клетки (БПК), включающему генетическую модификацию в гене бета-2 микроглобулина(B2M) для оказания регенеративного действия на естественную почку с целью лечения хронической почечной недостаточности. Изобретение позволяет получить популяцию «универсальных донорских» иммунологически привилегированных почечных клеток, к которым было применено генное редактирование для получения популяции модифицированных аллогенных почечных клеток, вводимых пациентам без применения иммуносупрессии. 43 з.п. ф-лы, 16 ил., 9 табл., 6 пр.

1. Способ получения биоактивной почечной клетки (БПК), включающий генетическую модификацию в гене бета-2 микроглобулина(B2M), включающий

генетическое модифицирование гена B2M БПК,

где генетическое модифицирование включает доставку РНК-направляемой эндонуклеазы и гид-РНК (гРНК) в БПК, где гРНК нацеливает РНК-направляемую эндонуклеазу в область из примерно 200 оснований сайта начала транскрипции гена B2M для модификации, и

где генетическое модифицирование снижает экспрессию B2M на поверхности геномно-модифицированной БПК.

2. Способ по п. 1, где гРНК нацеливает РНК-направляемую эндонуклеазу в последовательность, содержащую SEQ ID NO: 346, для модификации.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что генетическое модифицирование гена B2M включает внесение мутации в ген B2M.

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что внесение мутации в ген B2M включает делецию гена B2M или его части.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что БПК представляет собой отобранную почечную клетку (ОПК).

6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что ОПК находится в популяции ОПК.

7. Способ по п. 5, отличающийся тем, что ОПК представляет собой клетку почечного канальца.

8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что клетка почечного канальца представляет собой клетку проксимального канальца.

9. Способ по п. 5, отличающийся тем, что ОПК представляет собой эндокринную, сосудистую или гломерулярную клетку.

10. Способ по п. 6, отличающийся тем, что популяция ОПК содержит устойчивые к гипоксии и устойчивые к йодиксанолу клетки.

11. Способ по п. 6, отличающийся тем, что популяция ОПК содержит клетки, которые экспрессируют синтазу гиалуроновой кислоты 2.

12. Способ по п. 6, отличающийся тем, что популяция ОПК содержит клетки, которые способны к рецептор-опосредованному переносу альбумина.

13. Способ по п. 1, отличающийся тем, что доставка РНК-направляемой эндонуклеазы включает (i) экспрессию гид-РНК эндонуклеазы в БПК; или (ii) доставку РНК-направляемой эндонуклеазы через клеточную мембрану БПК.

14. Способ по п. 1, отличающийся тем, что РНК-направляемая эндонуклеаза представляет собой белок Cas.

15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что белок Cas представляет собой белок Cas9.

16. Способ по п. 1, отличающийся тем, что доставка гРНК включает (i) экспрессию гРНК в БПК; или (ii) доставку гРНК через клеточную мембрану БПК.

17. Способ по п. 15, при этом белок Cas9 и гРНК являются частью рибонуклеопротеидного комплекса.

18. Способ по п. 1, дополнительно включающий культивирование генетически модифицированной БПК.

19. Способ по п. 18, при этом генетически модифицированная БПК является менее иммуногенной в сравнении с соответствующими клетками, которые не имеют генетическую модификацию в гене B2M.

20. Способ по п. 1, отличающийся тем, что РНК-направляемая эндонуклеаза экспрессируется с трансфицированной мРНК.

21. Способ по п. 1, отличающийся тем, что РНК-направляемая эндонуклеаза представляет собой рекомбинантный белок и находится в комплексе с гРНК ex vivo.

22. Способ по п. 1, отличающийся тем, что РНК-направляемая эндонуклеаза представляет собой рекомбинантный белок и находится в комплексе с гРНК ex vivo, и комплекс белок/гРНК доставляют в клетку путем трансфекции, липофекции, электропорации или микроинъекции.

23. Способ по п. 17, отличающийся тем, что дополнительные элементы нуклеиновой кислоты, кодирующие селективный маркер и/или конкретные мутации гена B2M, вводят в клетку совместно с комплексом белок Cas9/гРНК.

24. Способ по п. 14, отличающийся тем, что белок Cas экспрессируется с трансфицированной мРНК, и гРНК экспрессируется с плазмидной ДНК.

25. Способ по п. 20, отличающийся тем, что трансфицированная мРНК стабилизирована за счет включения модифицированных нуклеотидных оснований или последовательностей полиаденилирования.

26. Способ по п. 20, отличающийся тем, что трансфицированная мРНК связана с по меньшей мере одним проникающим в клетку пептидом.

27. Способ по п. 14, отличающийся тем, что белок Cas экспрессируется с ДНК вектора.

28. Способ по п. 27, отличающийся тем, что экспрессию белка Cas индуцируют в течение по меньшей мере части времени, в течение которого гРНК экспрессируется в клетке.

29. Способ по п. 27, отличающийся тем, что ДНК вектор не интегрируется в геном.

30. Способ по п. 27, отличающийся тем, что ДНК вектор представляет собой эписомный вектор или искусственную хромосому.

31. Способ по п. 27, отличающийся тем, что ДНК вектор представляет собой транспозон.

32. Способ по п. 16, отличающийся тем, что гРНК представляет собой транскрипт с ДНК вектора.

33. Способ по п. 1 для получения БПК, предназначенной для использования в качестве лекарственного средства.

34. Способ по п. 1 для получения БПК, предназначенной для лечения хронической почечной недостаточности у пациента.

35. Способ по п. 18, где культивирование включает пересев БПК по меньшей мере один раз.

36. Способ по п. 35, где культивирование включает пересев БПК по меньшей мере два раза.

37. Способ по п. 36, отличающийся тем, что ОПК проявляет плавучую плотность более примерно 1,0419 г/мл.

38. Способ по п. 37, отличающийся тем, что ОПК экспрессирует CK18.

39. Способ по п. 5, отличающийся тем, что ОПК экспрессирует CK18.

40. Способ по п. 39, отличающийся тем, что ОПК экспрессирует GGT1.

41. Способ по п. 36, отличающийся тем, что функцию ОПК определяют путем продуцирования VEGF и KIM-1.

42. Способ по п. 41, отличающийся тем, что функцию ОПК дополнительно оценивают путем измерения ферментативной активности.

43. Способ по п. 42, отличающийся тем, что ферментативные активности представляют собой LAP и/или GGT.

44. Способ по п. 1, отличающийся тем, что БПК получают путем биопсии почки.