Композиция для защиты клубней картофеля от поражения фитопатогенными бактериями рода Pectobacterium carotovorum Российский патент 2024 года по МПК A01N63/22 A01N31/02 C12N1/20 

Область техники

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к защите клубней картофеля от поражения фитопатогенными бактериями рода Pectobacterium carotovorum при хранении.

Уровень техники.

Болезни растений микробной этиологии представляют серьезную угрозу биобезопасности человека во всем мире. До недавнего времени считалось, что бактерии наносят относительно меньший экономический ущерб по сравнению с грибками и вирусами. Сегодня нет сомнений в том, что болезни растений, вызываемые бактериальными патогенами, накладывают серьезные ограничения на производство сельскохозяйственных культур и приводят к значительным ежегодным потерям в глобальном масштабе (Sundin, G.W., Castiblanco, L.F., Yuan, X., Zeng, Q. and Yang, C.-H. (2016) Bacterial disease management: challenges, experience, innovation and future prospects. Molecular Plant Pathology 17: 1506-1518). Наблюдается рост инфекций растений, вызванных Pseudomonas syringae, Xanthomonas translucens, Pectobacterium sp., Xanthomonas sp., Clavibacter michiganensis и Ralstonia solanacearum (Leadbeater et. al. 2014). Pectobacterium carotovorum — грамотрицательная бактерия, широко распространенная во всем мире. Способность продуцировать ряд ферментов, разлагающих клеточную стенку растений, включая пектиназы, целлюлазы и протеазы, определяет присутствие этого вида в списке 10 основных фитопатогенных микроорганизмов (Mansfield, J., Genin, S., Magori, S., Citovsky, V., Sriariyanum, M., Ronald, P., Dow, M., Verdier, V., Beer, S.V., Machado, M.A., Toth, I., Salmond, G., and Foster, G.D. (2012) Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology 13: 614-629. https://doi.org/10.1111/j.1364-3703.2012.00804.x ). Pectobacterium carotovorum вызывает мягкую гниль на многих типах растений, в том числе на картофеле (Solanum tuberosum).

Известен способ обработки клубней картофеля перед закладкой на хранение (источник [1]: патент RU 2534561). Способ предусматривает обработку клубней картофеля биопрепаратом, содержащим биомассу Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11008 с титром вегетативных клеток и спор 1,24÷1,30×10¹⁰ КОЕ/мл и гуматы. Изобретение обеспечивает ингибирование развития грибных и бактериальных болезней клубней картофеля при хранении.

Известен штамм бактерий Bacillus subtilis Б 93 ВИЗР для защиты картофеля от болезней при хранении (источник [2]: патент RU 2538157). Изобретение позволяет повысить сохранность клубней.

Известна композиция для защиты картофеля в периоды его хранения и вегетации и способ ее получения (источник [3]: патент RU 2602447). Для получения композиции смешивают карбендазим с полисахаридами в соотношении (в мас.ч.): карбендазим: полисахариды - 1:2-1:10, добавляют к полученной смеси мелющие элементы в соотношении (в мас.ч.): смесь карбендазима и полисахаридов : мелющие элементы - 1:30-1:50. Изобретение позволяет эффективно защитить картофель от болезней при его выращивании и в период его хранения.

Известно средство для повышения урожайности и защиты картофеля от фитопатогенных грибов (источник [4]: патент RU 2655848). Средство включает суспензию штамма Bacillus atrophaeus ВКПМ В-11474 с титром вегетативных клеток и спор 1×10⁸ КОЕ/мл, полученную на бобовом отваре. Средство позволяет реализовать указанное назначение.

Надлежащая сельскохозяйственная практика, культивация и севооборот являются важными инструментами для сведения к минимуму воздействия патогенных бактерий на сельскохозяйственные культуры. Однако, эти меры не приводят к полному успеху, и бактериальные болезни сельскохозяйственных культур оказываются трудно поддающимися контролю. Если список фунгицидов насчитывает сотни препаратов, то ряд антибактериальных препаратов ограничивается соединениями меди в сочетании с фунгицидами, реже это могут быть антибиотики аминогликозиды или тетрациклины, применяемые для обработки плодовых деревьев в некоторых странах (Leadbeater, A.J. 2014, Plant Health Management: Fungicides and Antibiotics. Encyclopedia of Agriculture and Food Systems 408-424.). Антибиотики являются хорошим решением против бактериозов растений, но большинство из них зарезервировано для медицинской практики.

Макролактин А – это макролидный антибиотик, имеющий в основе своей структуры 24-членное лактонное кольцо. Антимикробное действие макролактина А было исследовано в отношении микроорганизмов, имеющих клиническое значение. Первая работа по изучению антибактериальной активности макролактина А была проведена в 1989 году и показала антибиотический эффект на грамположительные микроорганизмы Staphylococcus aureus и Bacillus subtilis в концентрациях 5 и 20 мкг/диск соответственно (Gustafson et al. 1989). Последующие работы показали, что макролактин А способен подавлять рост грамположительных бактерий S. aureus IFO 12732 и B. subtilis IFO 3134 в концентрациях 10 и 60 мкг/мл, но не способен подавлять грамотрицательные бактерии E. coli IFO3301 и Salinivibrio costicols ATCC 22508 (Nagao et al. 2001). Макролактин А, используемый в работе (Romero-Tabarez et al. 2006), в концентрации 50 мкг/диск подавлял рост различных штаммов S. aureus с зонами подавления 18–35 мм, и показал отсутствие активности в отношении различных штаммов Enterococcus faecalis.

Известен антибактериальный макролактин А, производимый Bacillus polyfermenticus KJS-2 (источник [5]: патент US 2010087516). Изобретение относится к применению макролактина А, продуцируемого Bacillus polyfermenticus KJS-2 (KCCM 10769P), в качестве антибиотика против клинически значимых бактерий. Таким образом, использование макролактина А ограничивается его применением в медицине.

Сущность изобретения.

Технической проблемой, на решение которой направлено заявляемое изобретение является создание композиции на основе антибиотика макролактина А, эффективной для защиты клубней картофеля от поражения фитопатогенными бактериями рода Pectobacterium carotovorum.

Технический результат заключается в защите клубней картофеля от поражения фитопатогенными бактериями рода Pectobacterium carotovorum с целью повышения сроков хранения при применении композиции, содержащей экстракт культуральной среды B.velezensis - продуцента макролактина А и водный раствор диметилсульфоксида.

Указанный технический результат достигается тем, что композиция для защиты клубней картофеля от поражения фитопатогенными бактериями Pectobacterium carotovorum, характеризующаяся тем, что содержит экстракт культуральной среды B.velezensis - продуцента макролактина А с содержанием не менее 75% макролактина А и водный раствор 50% диметилсульфоксида.

Предусмотрено, что композиция содержит 10 мг экстракта культуральной среды B.velezensis с содержанием не менее 75% макролактина А и 10 мл водного раствора 50% диметилсульфоксида.

Осуществление изобретения.

Штамм-продуцент макролактина А B.velezensis X-Bio-1 был получен при изучении образцов почв Краснодарского края России и депонирован в 2021 году в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения под номером RCAM05392 Культивирование штамма проводилось в конической колбе объемом 1 л в среде аналогичной LB-бульону (на литр среды, гр.: триптон – 10, дрожжевого экстракта – 5, NaCl – 2) в течение 48 часов.

Бактериальную биомассу отделяли центрифугированием: 9 тыс g, 20 минут. Переносили супернатант в отдельную емкость из стекла, проводили экстракцию антимикробного компонента этилацетатом: смешивали культуральную среду и этилацетат в соотношении 1:1, на магнитной мешалке перемешивали смесь в течение 1 часа. Отделяли фазу этилацетата от водной фазы с помощью делительной воронки. Этилацетат упаривали досуха с использованием вакуумного испарителя. Полученный экстракт повторно растворяли в ацетонитриле и высушивали под вакуумом. Полученный препарат представляет собой маслянистую субстанцию желто-коричневого цвета. Выделение обогащенной макролактином А фракции проводили с использованием препаративной хроматографии низкого давления с картриджами типа SepaFlash (Santai Techologies, Китай) в ступенчатом градиенте элюэента: 100 % ацетонитрил (буфер Б) и бидистиллированная вода (буфер А), скорость потока – 30-40 мл/мин, детектирование поглощения на 220 нм. Выход целевой фракции на 10 мин (градиент буфера Б – 70 %) (фиг. 1а). Полученную фракцию высушивали под вакуумом. Полученный обогащенный экстракт представляет собой порошок светло-желтого цвета.

Таким образом, хроматографические подходы к выделению активного компонента из экстракта культуральной жидкости были направлены на минимизацию этапов очистки. Используемый подход позволил достичь чистоты целевого вещества (макролактина А) не менее 75 %, определяемой по соотношению площадей хроматографических пиков (фиг. 1б).

Анализ масс-спектра показал, что антимикробной фракции соответствует молекулярный ион [M+Na]+ 425.06794, для которого была рассчитана брутто-формула C₂₄H₃₄O₅. Аналогично брутто-формулы были рассчитаны для дочерних ионов (табл. 1).Согласно полученным данным, выделенный антибиотик по молекулярной массе и по ионным продуктам является макролактином А.

Композицию готовили путем смешивания экстракта культуральной среды B.velezensis – штамма-продуцента макролактина А и водного раствора диметилсульфоксида.

Таблица 1.

Детектирование макролактина А с использованием ВЭЖХ/ESI-Q-TOF

Ион-продукт
(режим положительных ионов) m/z Молекулярная масса, Да [M+K]⁺ 441.2038 402.2406 [M+Na]⁺ 425.2298 [M-H₂O+Na]⁺ 407.2198 [M-H₂O+H]⁺ 385.2373 [M-2H₂O+H]⁺ 367.2267 [M-3H₂O+H]⁺ 349.2161

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Оценка антимикробных свойств композиции в отношении фитопатогена картофеля P. carotovorum в опыте in vitro.

Для проведения испытания брали экстракт культуральной среды B.velezensi содержанием не менее 75% макролактина А в количестве 10 мг, навешивали в пробирку с последующим добавлением 10 мл водного раствора диметилсульфоксида (ДМСО) (50 % воды и 50 % ДМСО). Оценку минимально бактерицидных концентраций (МБК) проводили согласно руководству M26-A от Clinical and Laboratory Standards Institute (https://clsi.org).

Среди тест-штаммов наибольшая чувствительность к действию композиции была установлена для фитопатогенного штамма P.carotovorum BKM B-1247 (табл. 2).

Таблица 2.

Спектр антимикробной активности композиции для защиты клубней картофеля от поражения фитопатогенными бактериями

рода Pectobacterium carotovorum

Микроорганизмы МИК/МБК, мкг/мл Pseudomonas brassicacearum UTMN 8/>150 Chromobacterium substugae ATCC 31532 75/75 Xanthomonas campestris >150 Pectobacterium carotovorum BKM Б-1247 25

Оценка динамики развития бактерицидного эффекта (кривые «время-элиминация») при воздействии композиции была проведена на наиболее чувствительном штамме P. carotovorum BKM B-1247. Кривые «время-элиминация» позволяют оценить биоцидный потенциал различных противомикробных препаратов. Действие композиции, взятой в концентрации 25 мкг/мл, было бактериостатическим в первые 4 часа и переходило в бактерицидное к 8 часу соинкубирования (фиг. 2). Быстрый бактерицидный эффект в течение 2 часов достигался при концентрации композиции 50 мкг/мл (фиг. 2). Бактерии соинкубировали в течение 24 часов с макролактином А, взятым в концентрациях, соответствовавших 1 МИК и 2 МИК.

Таким образом, композиция, обогащенная макролактином А, обладает бактерицидным механизмом антимикробного действия, с более выраженным эффектом в отношении фитопатогенов вида P.carotovorum.

Пример 2.

Оценка антимикробных свойств композиции в отношении фитопатогена картофеля Pectobacterium carotovorum в опыте ex vivo. Обработка композицией клубней картофеля.

Эффективность композиции как протравителя определяли в биологических испытаниях с использованием клубней картофеля. Экстракт культуральной среды B.velezensi с содержанием не менее 75% макролактина А навешивали в количестве 10 мг в емкость пульверизатора. Растворяли концентрат путем добавления 10 мл водного раствора диметилсульфоксида (ДМСО) (50 % воды и 50 % ДМСО). Контрольный образец содержал используемый растворитель.

Картофель подготавливали к обработке. Для этого клубни отмывали от частиц земли, обрабатывали 3% перекисью водорода в течение 30 минут и нарезали на поперечные доли толщиной 5-7 мм. Наносили экстракт на поверхность картофеля пульверизатором. После подсыхания поверхности иннокулировали культуру P. carotovorum BKM Б-1247 в титре 10⁷ КОЕ/мл в обьеме 10 мкл на поверхность картофеля. Инкубировали картофель в чашках Петри в течении 72 часов, при температуре 28 °С.

Предварительная обработка клубней картофеля композицией с содержанием макролактин А не менее 75% замедляла развитие симптомов мацерации тканей по сравнению с контрольной группой (клубни без обработки). На фиг. 3 показаны обработанные композицией картофельные диски – 3г, 3д, 3е, и не обработанные композицией картофельные диски – 3а, 3б, 3в. Репрезентативные фото развития симптомов мягкой гнили на необработанных - контроль (а-в) и предварительно обработанных - опыт (г-е). Фотографии сделаны через 24 (а, г), 48 (б, д) и 72 ч (в, е).

В первые сутки на необработанных образцах картофеля появились признаки мацерации тканей (фиг. 3а). Через 48-72 часа четко были выражены симптомы поражения тканей картофеля (фиг. 3б, 3в), масса пораженной ткани составляла около 50% от массы всего картофеля (фиг. 3ж). В свою очередь, ткани картофеля, обработанного композицией, содержащей не менее 75% макролактина А, оставались визуально целостными даже к третьим суткам проведения эксперимента (фиг. 3г, 3д, 3е). Оценка степени мацерации тканей показала, что не более 10 процентов биомассы картофеля было затронуто действием фитопатогена (фиг. 3ж).

Таким образом, проведенные биологические испытания подтвердили, что заявляемая композиция для защиты клубней картофеля от поражения фитопатогенными бактериями рода P.carotovorum с содержанием не менее 75% макролактина А эффективна и может быть использована для защиты клубней картофеля с целью повышения сроков хранения.

Изобретение относится к сельскому хозяйству. Композиция для защиты клубней картофеля от поражения фитопатогенными бактериями Pectobacterium carotovorum характеризуется тем, что содержит экстракт культуральной среды B. velezensis - продуцента макролактина А с содержанием не менее 75% макролактина А и водный раствор 50% диметилсульфоксида. Изобретение позволяет защитить клубни картофеля от поражения фитопатогенными бактериями рода Pectobacterium carotovorum с целью повышения сроков хранения. 1 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл., 2 пр.

1. Композиция для защиты клубней картофеля от поражения фитопатогенными бактериями Pectobacterium carotovorum, характеризующаяся тем, что содержит экстракт культуральной среды B. velezensis - продуцента макролактина А с содержанием не менее 75% макролактина А и водный раствор 50% диметилсульфоксида.

2. Композиция по п. 1, характеризующаяся тем, что содержит 10 мг экстракта культуральной среды B. velezensis с содержанием не менее 75% макролактина А и 10 мл водного раствора 50% диметилсульфоксида.