АНТИМИКРОБНОЕ И ПРОТИВОГРИБКОВОЕ СРЕДСТВО НА ОСНОВЕ ЭКСТРАКТА ИЗ ЖИРА ЛИЧИНОК МУХИ "ЧЁРНАЯ ЛЬВИНКА" ДЛЯ БОРЬБЫ С БАКТЕРИОЗАМИ И МИКОЗАМИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ КУЛЬТУР Российский патент 2023 года по МПК A01N63/00 A01N37/00 

Изобретение относится к области средств борьбы с бактериальными и грибковыми патогенами, систем рационального применения средств химической и биологической защиты сельскохозяйственных растений и может быть использовано в сельском хозяйстве для предпосевной предобработки семян широкого спектра сельскохозяйственных растений, зараженных фитопатогенными бактериями и грибками. Заявленное средство на основе экстракта из жира личинок мухи «Черная львинка» (AWME) для борьбы с бактериозами и микозами, фитопатогенами сельскохозяйственных культур обладает антимикробной и противогрибковой активностью.

Состав средства включает объемные %: экстракт жира личинок мухи «Черная львинка» (AWME) в растворе воды, метанола и соляной кислоты в соотношении (90:9:1%) в концентрации 300 мг/л - 99%; адъювант Агропол - 1%.

Изобретение поможет увеличить урожайность и снизить потери в агропромышленном комплексе, связанные с бактериальными и грибковыми болезнями у сельскохозяйственных растений.

В сельскохозяйственной промышленности остро стоит проблема бактериальных и грибковых заболеваний растений, зараженности семян фитопатогенными бактериями и грибками.

Известны способы предпосевной обработки семян сельскохозяйственных растений, позволяющие подавлять жизнеспособность фитопатогенов в семенах, включающие использование в качестве биоцидов антибиотики или высокотоксичные ядохимикаты.

Известны широко распространенные фунгициды класса триазолов, такие как триадименол (FAO Specifications and evaluations for agricultural pesticides Triadimenol), трифлумизол (Commission decision 2007/629/EC), тебуконазол (Голышин H.M., 1993). Их недостатками являются потенциально возможная устойчивость фитопатогенов к данным соединениям, развивающаяся из-за чрезмерного и неправильного использования этих препаратов. Также могут возникать проблемы с фитотоксичностью, если применение происходит в недопустимо высоких дозах.

В качестве бактерицидов и фунгицидов известны помимо прочего медьсодержащие препараты: бордоская жидкость, оксихлорид меди (Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации, 2013 год. Минсельхоз России). Однако медьсодержащие препараты имеют ограниченный спектр действия и могут вызывать накопление токсичных металлических соединений в почве. Их применение также может нанести вред полезным микроорганизмам в почве.

Известны стиролкарбамиды, такие как карбендазим (Commission implementing regulation (EU) 2021/348), беномил (Benomyl. Hazard classification and labelling. EC / List no.: 241-775-7 CAS no.: 17804-35-2). Проблема их использования заключается в том, что некоторые стиролкарбамиды были запрещены или ограничены из-за выявленных проблем с их потенциальной токсичностью для человека и окружающей среды. К стробилириновым препаратам, например, азоксистробин (Commission implementing regulation (EU) No 703/2011) может также возникать устойчивость у фитопатогенов при длительном и непрерывном их использовании.

Также могут возникать проблемы с устойчивостью фитопатогенов к другим классам фунгицидов, в результате чего возрастает риск развития множественной устойчивости. Дихлоран отличается высокой токсичностью для человека и окружающей среды (Паспорт безопасности в соотв. с ГОСТ 30333-2007 Дихлоран глицерин, агар (основа) ISO 11133, ISO 21527-2, для микробиологии). В некоторых странах он был запрещен из-за своего негативного воздействия на окружающую среду.

Фенамидоны также могут вызывать развитие устойчивости у фитопатогенов (Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации, 2013 год. Министерство сельского хозяйства Российской Федерации (Минсельхоз России). Кроме того, они обладают некоторой токсичностью и могут вызывать аллергические реакции у человека (Environmental protection agency 40 CFR Part 180).

Антибиотики используются в сельском хозяйстве для контроля бактериальных инфекций у растений. Частое использование находят стрептомицин и окситетрациклин для контроля огуречной бактериальной пятнистости и других бактериальных инфекций, касугамицин для контроля бактериальных инфекций в рисе и других культурах, а также хлорамфеникол, который применяется в ореховодстве и других сельскохозяйственных культурах (Шарма, Г. и др., 2019). Однако использование антибиотиков в сельском хозяйстве представляет собой серьезную проблему и вызывает обеспокоенность из-за многих факторов. Частое и неправильное применение антибиотиков в сельском хозяйстве может привести к развитию антибиотикоустойчивости у фитопатогенных микроорганизмов. В результате возникают сложности в лечении болезней растений, и снижается эффективность применения антибиотиков в сельскохозяйственной индустрии. Помимо этого, применение антибиотиков в сельском хозяйстве приводит к их накоплению в почве, воде и растениях. Это может привести к росту популяции микроорганизмов, имеющих гены антибиотикоустойчивости, в окружающей среде и способствовать распространению резистентных микроорганизмов. Некоторые антибиотики могут оказывать негативное воздействие на окружающую среду и здоровье животных и людей. Они могут попадать в поверхностные и подземные воды, загрязнять почву и вредить полезным микроорганизмам. Кроме того, остатки антибиотиков в растениях и продуктах питания могут представлять опасность для потребителей. Все это может привести к повышению риска потери урожая.

Находят свое применение неорганические соли, например, сульфаты аммония или сульфат магния (Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации, 2013 год. Минсельхоз России). Хотя сульфаты обладают бактерицидной активностью, их спектр действия ограничен. Кроме того, высокие концентрации сульфатов могут быть токсичными для растений и почвенных микроорганизмов. Органические кислоты наподобие молочной или уксусной кислот (Григорьева М.В. и др. Средства защиты растений, разрешенные в органическом земледелии) обладают антимикробной активностью против некоторых бактериальных возбудителей, но их эффективность ограничивается их спектром действия и необходимостью использовать высокие концентрации для достижения желаемого эффекта.

Также в целях борьбы с бактериальными возбудителями заболеваний сельскохозяйственных растений могут использоваться биологические агенты. Таковыми являются, например, бактериофаги (Jones J.B. et al., 2018). Основной недостаток бактериофагов заключается в их специфичности: каждый штамм бактериофагов специфичен для определенного штамма бактерий, что ограничивает их применение (Махешвараппа, В.Г. и др., 2019). Также возможность развития устойчивости у бактерий к бактериофагам является потенциальной проблемой.

Помимо обработки растений химическими препаратами с фунгицидными и/или бактерицидными свойствами, применяются также в сельском хозяйстве резистентные сорта растений - генетически модифицированные растения, устойчивые к определенным болезням или вредителям (Klümper W. et al., 2014). Они могут обеспечивать устойчивость к фитопатогенам без необходимости применения химических препаратов (Стефановиц, М. и др., 2019). Однако такие генно-модифицированные растения сложны в производстве и применении, что повышает их стоимость.

В целях усиления бактерицидного и противомикотического действия разрабатывают средства защиты растений в комбинации с несколькими химическими соединениями. Так, при изобретении состава из катапола (0,05-0,2%), фурацилина (0,005-0,015%) и диметилсульфоксида (0,1%) (состав для предпосевной обработки семян овощных культур и клубней картофеля от бактериальных болезней. RU 2342833) удалось добиться снижения на 38% числа больных бактериозами клубней картофеля и уменьшения почти в 2 раза развития и распространения ризоктониоза на посадках картофеля. Данное изобретение представляет собой средство защиты растений от возбудителей бактериальных инфекций на основе полимерного препарата Катапол и нашло широкое использование при предпосевной обработке семян овощных культур (томаты, капуста, морковь, редис, тыква), а также клубней картофеля. Была продемонстрирована высокая антибактериальная активность заявленного состава по отношению к бактериям: Bacillus polymyxa, Clavibacter michiganenis, Pseudomonas corrugate, Pseudomonas fluorescens, Erwinia carotovora.

Целью заявленного изобретения является создание нового высокоэффективного средства для усиления защиты сельскохозяйственных культур, для борьбы с бактериозами и микозами сельскохозяйственных растений, с широким спектром действия.

Задачей данного изобретения является разработка и оптимизация состава антимикробного и противогрибкового средства, состоящего на основе экстракта жира личинки мухи «Черная львинка».

Задача была решена посредством создания нового состава с высокой антимикробной и противогрибковой активностью, состоящего из экстракта жира личинок мухи «Черная львинка» (AWME, Acidic-Water-Methanol-extract), полученного путем экстракции свободных жирных кислот и их производных подкисленным водно-метанольным раствором (AWM, Acid-Water-Methanol), и адъюванта «Агропол» в соотношении 99:1 (объемные %).

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что новый состав позволяет получить антимикробное и противогрибковое средство, отличающееся высокой антибактериальной активностью, не вызывающее устойчивости сельскохозяйственных растений к важнейшим фитопатогенам, устойчивое в условиях высоких температур и ультрафиолетового облучения, обладающее стабильностью при длительном хранении при комнатной температуре, позволяющее снизить расход природного сырья без снижения его антимикробной и противогрибковой активностей, позволяющее снизить себестоимость конечного продукта.

Применение средства по настоящему изобретению для защиты сельскохозяйственных растений от заболеваний, вызванных бактериальными и грибковыми патогенами, приводит к повышению защитного эффекта за счет усиленной бактериальной активности, проникающей способности и длительного действия заявленного оригинального состава.

Средство по настоящему изобретению не содержит химически агрессивных агентов. Антимикробная активность средства по настоящему изобретению была впервые показана против 14 важнейших штаммов патогенных микроорганизмов, устойчивых к антибиотикам, а именно против 5-и фитопатогенов сельскохозяйственных растении, 2-х возбудителей микробных инфекций лососевых рыб и 7-ми возбудителей внутрибольничных инфекций человека, включая 2 клинических штамма клебсиелла пневмония.

Предметом настоящего изобретения является антимикробное и противогрибковое средство на основе экстракта из жира мухи «Черная львинка» (AWME) для борьбы с бактериозами и микозами сельскохозяйственных культур, содержащее экстракт из жира мухи «Черная львинка» (AWME) в концентрации 300 мг/л и адъювант «Агропол» в соотношении (объемные %):

Экстракт AWME 99% Агропол 1%

Методом газовой хроматографии-масс-спектрометрии было установлено, что по химическому составу AWME представляет собой в основном смесь различных жирных кислот, доминирующими среди которых были олеиновая кислота (22,22%), пальметиновая кислота (20,34%) и лауриновая кислота (18,48%). Также были обнаружены следы полиолов и сложных эфиров в составе AWME (Elena Marusich et al., 2020).

Для выполнения цели заявленного изобретения разработки и оптимизации состава антимикробного и противогрибкового средства активность экстракта из жира личинок мухи Черная львинка изучалась в смеси с адъювантами «Агропол» и «Адью». Преимущество данных двух адъювантов заключается в том, что они значительно увеличивают площадь растекания рабочего препарата по поверхности листьев растений за счет снижения поверхностного натяжения, а также ускоряет проникновение рабочего препарата через поверхность растений и увеличивает его биологическую активность (De Ruiter Н. et al., 2002). Вследствие этого расширяется зона покрытия очагов инфекций, вызванных различными вредителями сельскохозяйственных растений, и, таким образом, увеличивается эффективность действия рабочего вещества.

Адъювант «Агропол» состоит их нескольких компонентов: полиалкиленеоксид. модифицированный гептаметилтрисилоксан (60-85%), полиалкиленеоксид (15-30%) - поверхностно-активные неионогенные соединения. По рекомендации производителя «Агропол» (ООО «Листерра», Рязанская область, пос. Денежниково, Россия) норма расхода производителя составляет 100 мкл/1 л.

Действующим веществом адъюванта «Адью» является этоксилат изодецилового спирта в концентрации 900 г/л. Это поверхностно-активное неионогенное соединение. По рекомендации производителя «Адью» (АО «Август», Москва, Россия) норма расхода производителя составляет 1 мл/1 л.

Антибактериальная активность препарата определяли методом тестирования азоны ингибирования Кирби-Бауэра - это стандартный метод оценки чувствительности бактерий к антимикробным препаратам (Bauer A.W. et al., 1966). Он также называется методом дисковой диффузии. Этот метод используется для определения, насколько эффективно антибиотики или другие антимикробные вещества подавляют рост бактерий, что выражается в характерной зоне ингибирования вокруг диска, на который нанесено антимикробное вещество.

Процедура метода Кирби-Бауэра была произведена следующим образом: был произведен посев на чашки Петри с агаром, на которых бактериальная культура данных штаммов бактерий была выращена до определенной плотности. Далее на бактериальный газон были положены диски из материала ватмана 3ММ. На диски было добавлено по 50 мкл AWME в определенных концентрациях. В качестве положительного контроля использовались определенные антибиотики. Отрицательным контролем был используемый для получения AWME экстрагент: смесь воды, метанола и соляной кислоты в объемном соотношении 90:9:1 (AWME). Опыт ставился в двойном повторе для каждой тестируемой концентрации.

Была продемонстрирована антимикробная активность против важнейших фитопатогенов, включая Pantoea agglomerans, Xanthomonas campestris, Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, Pectobacterium atrosepticum, Dickeya solani, Klebsiella pneumoniae и Staphylococcus aureus, являющимися важнейшими возбудителями таких серьезных заболеваний сельскохозяйственных растений как "черноножка" у крестоцветных, бактериальные ожоги у фруктовых деревьев, мягкая гниль у картофеля и другие заболевания, наносящие серьезный урон сельскому хозяйству (разработанная в ходе наших исследований формуляция конечного продукта в комбинации экстракта AWME с адъювантами позволит существенно снизить расход природного сырья без снижения его антимикробной и антигрибковой активности, и приведет к снижению себестоимости продукта (Elena Marusich et al., 2020). Нашими исследованиями было показано, что бактерицидная активность продукта, протестированная микробиологическим методом на дисках на твердом агаре, в 4,8 раз более эффективно ингибирует рост бактерий, чем контрольные антибиотики пенициллин-стрептомицин. Было также показано методом ингибирования пролиферации бактерий в жидкой среде, что минимальная ингибирующая концентрация продукта для всех пяти тестированных патогенов равна 0,78 г/л. В то время как для контрольных антибиотиков она была в 5 раз выше - 3,75 г/л.

Было показано, что AWME подавлял рост всех фитопатогенов дозозависимым образом в диапазоне от 50 до 3,13 мг/мл тестируемых концентраций. При этом штаммы Pantoea agglomerans и Dickeya solani были наиболее чувствительны в течение 12 ч инкубации к обработке AWME при минимальной концентрации 3,13 мг/мл. Напротив, для всех других штаммов тот же эффект наблюдался при концентрации AWME 12,5 мг/мл. Восприимчивость бактерий к обработке AWME снизилась после 24 ч роста бактерий по сравнению с 12 ч.

В исследованиях по настоящему изобретению была продемонстрирована антибактериальная активность препарата AWME против следующих фитопатогенов сельскохозяйственных растений: Pantoea agglomerans, Xanthomonas campestris, Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, Pectobacterium atrosepticum, Dickeya solani, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa (примеры 1, 2, 3).

Также изобретение поясняется чертежами.

Рис. 1. Зона ингибирования посева бактерии Pseudomonas aeruginosa экстрактом AWME концентрацией 20 мг/мл (А); 10 мг/мл (Б), а также контрольными антибиотиками пенициллин-стрептомицин (В) и негативным контролем (экстрагентом) (Г) спустя 12 часов инкубации.

Рис. 2. Зона ингибирования посева бактерии Pseudomonas aeruginosa экстрактом AWME концентрацией 20 мг/мл (А); 10 мг/мл (Б); 5 мг/мл (В); 2,5 мг/мл (Г); 1,25 мг/мл (Д), а также контрольными антибиотиками пенициллин-стрептомицин (Е) и негативным контролем (экстрагентом) (Ж) спустя 24 часа инкубации.

Рис. 3. Зона ингибирования посева бактерии Staphylococcus aureus экстрактом AWME концентрацией 20 мг/мл (А); 10 мг/мл (Б); 5 мг/мл (В); 2,5 мг/мл (Г); 1,25 мг/мл (Д), а также контрольными антибиотиками пенициллин-стрептомицин (Е) и негативным контролем (экстрагентом) (Ж) спустя 12 часов инкубации.

Рис. 4. Зона ингибирования посева бактерии Staphylococcus aureus экстрактом AWME концентрацией 20 мг/мл (А); 10 мг/мл (Б); 5 мг/мл (В); 2,5 мг/мл (Г); 1,25 мг/мл (Д), а также контрольными антибиотиками пенициллин-стрептомицин (Е) и негативным контролем (экстрагентом) (Ж) спустя 24 часа инкубации.

Рис. 5. Зона ингибирования штамма бактерий Dickeya solani экстрактом AWME после 4-дневной инкубации при температуре 50°С (А) и без инкубации при повышенной температуре (Б); AWME, разбавленный в 2 раза (В) и в 5 раз (Г) после 4-дневной инкубации при температуре 50°С; положительный контроль (Д); отрицательный контроль (Е).

Рис. 6. Зона ингибирования штамма бактерий Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum экстрактом AWME после 4-дневной инкубации при температуре 50°С (А) и без инкубации при повышенной температуре (Б); AWME, разбавленный в 2 раза (В) и в 5 раз (Г) после 4-дневной инкубации при температуре 50°С; положительный контроль (Д); отрицательный контроль (Е).

Рис. 7. Зона ингибирования Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum контрольным экстрагентом: смесью воды, метанола и соляной кислоты в объемном соотношении 90:9:1. Была произведена аналогичная инкубация в течение 14 дней при 50°С. (А) неразбавленный AWME; (Б) в 2 раза разбавленный AWME; (В) в 5 раз разбавленный AWME.

Рис. 8. Зона ингибирования Dickeya solani контрольным экстрагентом: смесью воды, метанола и соляной кислоты в объемном соотношении 90:9:1. Была произведена аналогичная инкубация экстрагента в течение 14 дней при 50°С. (А) неразбавленный AWME; (Б) в 2 раза разбавленный AWME; (В) в 5 раз разбавленный AWME.

Рис. 9. Зона ингибирования Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum смесью экстракта и адъюванта «Агропол» в 100-кратной норме. (А) неразбавленный экстракт; (Б) в 2 раза разбавленный экстракт; (В) в 5 раз разбавленный экстракт; (Г) отрицательный контроль.

Рис. 10. Зона ингибирования Dickeya solani смесью экстракта и адъюванта «Агропол» в 100-кратной норме. (А) неразбавленный экстракт; (Б) в 2 раза разбавленный экстракт; (В) в 5 раз разбавленный экстракт; (Г) отрицательный контроль.

Рис. 11. Зона ингибирования Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum смесью экстракта и адъюванта «Агропол» в 10-кратной норме. (А) неразбавленный экстракт; (Б) в 2 раза разбавленный экстракт; (В) в 5 раз разбавленный экстракт; (Г) отрицательный контроль.

Рис. 12. Зона ингибирования Dickeya solani смесью экстракта и адъюванта «Агропол» в 10-кратной норме. (А) неразбавленный экстракт; (Б) в 2 раза разбавленный экстракт; (В) в 5 раз разбавленный экстракт; (Г) отрицательный контроль.

Рис. 13. Зона ингибирования Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum смесью экстракта и адъюванта «Агропол» в 1-кратной норме. (А) неразбавленный экстракт; (Б) в 2 раза разбавленный экстракт; (В) в 5 раз разбавленный экстракт; (Г) отрицательный контроль.

Рис. 14. Зона ингибирования Dickeya solani смесью экстракта и адъюванта «Агропол» в 1-кратной норме. (А) неразбавленный экстракт; (Б) в 2 раза разбавленный экстракт; (В) в 5 раз разбавленный экстракт; (Г) отрицательный контроль.

Рис. 15. Зона ингибирования Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum смесью экстракта и адъюванта «Адью» в 100-кратной норме. (А) неразбавленный экстракт; (Б) в 2 раза разбавленный экстракт; (В) в 5 раз разбавленный экстракт; (Г) отрицательный контроль.

Рис. 16. Зона ингибирования Dickeya solani смесью экстракта и адъюванта «Адью» в 100-кратной норме. (А) неразбавленный экстракт; (Б) в 2 раза разбавленный экстракт; (В) в 5 раз разбавленный экстракт; (Г) отрицательный контроль.

Рис. 17. Зона ингибирования Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum смесью экстракта и адъюванта «Адью» в 10-кратной норме. (А) неразбавленный экстракт; (Б) в 2 раза разбавленный экстракт; (В) в 5 раз разбавленный экстракт; (Г) отрицательный контроль.

Рис. 18. Зона ингибирования Dickeya solani смесью экстракта и адъюванта «Адью» в 10-кратной норме. (А) неразбавленный экстракт; (Б) в 2 раза разбавленный экстракт; (В) в 5 раз разбавленный экстракт; (Г) отрицательный контроль.

Рис. 19. Зона ингибирования Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum смесью экстракта и адъюванта «Адью» в 1-кратной норме. (А) неразбавленный экстракт; (Б) в 2 раза разбавленный экстракт; (В) в 5 раз разбавленный экстракт; (Г) отрицательный контроль.

Рис. 20. Зона ингибирования Dickeya solani смесью экстракта и адъюванта «Адью» в 1-кратной норме. (А) неразбавленный экстракт; (Б) в 2 раза разбавленный экстракт; (В) в 5 раз разбавленный экстракт; (Г) отрицательный контроль.

Рис. 21. Семена сои, предварительно замоченные в растворе AWME с адъювантом «Агропол» объемом 1,5 мл на 3 часа перед инкубацией на чистом агаре. А - концентрация AWME 600 мг/л; Б - концентрация AWME 500 мг/л; В - концентрация AWME 400 мг/л; Г - концентрация AWME 300 мг/л; Д - экстрагент AWM; Е - доксициклин 100 мг/л; Ж - амоксиклав 800 мг/л; 3 - дистиллированной воде. Мониторинг на 2 сутки инкубации.

Рис. 22. Семена сои, предварительно замоченные в растворе AWME с адъювантом «Агропол» объемом 1,5 мл на 3 часа перед инкубацией на чистом агаре. А - концентрация AWME 600 мг/л; Б - концентрация AWME 500 мг/л; В - концентрация AWME 400 мг/л; Г - концентрация AWME 300 мг/л; Д - экстрагент AWM; Е - доксициклин 100 мг/л; Ж - амоксиклав 800 мг/л; 3 - дистиллированной воде. Мониторинг на 4 сутки инкубации.

Рис. 23. Семена сои, предварительно замоченные в растворе AWME с адъювантом Агропол объемом 1,5 мл на 3 часа перед инкубацией на чистом агаре. А - экстрагент AWM; Б - концентрация AWME 400 мг/л; В - концентрация AWME 300 мг/л; Г - доксициклин 100 мг/л; Д - амоксиклав 800 мг/л. Мониторинг на 7 сутки инкубации.

Представленные ниже примеры иллюстрируют, но не ограничивают настоящее изобретение.

Пример 1. Антимикробную активность AWME по отношению к бактериям Pantoea agglomerans, Xanthomonas campestris и Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum.

Эффект стабильного антимикробного действия всех протестированных штаммов бактерий наблюдался при концентрации AWME 12,5 мг/мл. Восприимчивость бактерий к обработке AWME снижалась через 24 ч инкубации по сравнению с 12 ч. Диаметр зоны ингибирования (ДЗИ) после 12 ч инкубации был наибольшим для штамма X. campestris (23,5±0,35 мм) и наименьшим для штамма P. atrosepticum (14,75±0,75 мм) при концентрации AWME 50 мг/мл, а через 24 ч снизился до 19,0±0,28 мм и 12,2±0,56 мм, соответственно. Снижение уровня AWME в диапазоне от 50 мг/мл до 3,13 мг/мл привело к существенному уменьшению размера диаметра зоны ингибирования (ДЗИ) в течение 12 ч инкубации по сравнению с 24 ч. Так, для наиболее восприимчивого штамма X. campestris размер ДЗИ через 12 ч инкубации уменьшился на 69,1% (с 23,5±0,35 мм до 7,25±0,28 мм), а через 24 ч - только на 57,0% (с 19,0±0,28 мм до 8,0±0,7 мм). Было установлено незначительное колебание размера ДЗИ между 20,63±0,53 мм и 24,0±0,35 мм для положительного контроля пенициллин / стрептомицин концентрацией 100 мг/мл между 12 и 24 ч инкубации (Табл. 1).

Пример 2. Антимикробная активность AWME по отношению к бактериям Pectobacterium atrosepticum и Dickeya solani.

Аналогично результатам антимикробного действия AWME, протестированных для фитопатогенов из Таблицы 1, эффект стабильного антимикробного действия против Pectobacterium atrosepticum и Dickeya solani также наблюдался при концентрации AWME 12,5 мг/мл. Также отмечалось, что восприимчивость бактерий к обработке AWME снижалась через 24 ч инкубации по сравнению с 12 ч. Диаметр зоны ингибирования после 12 ч инкубации был наибольшим для штамма Pectobacterium atrosepticum (20,25±1,76) и Dickeya solani (4,75±0,75) при концентрации AWME 50 мг/мл, а через 24 ч снизился до 14,75±0,35 мм и 12,2±0,6 мм, соответственно. Снижение уровня AWME в диапазоне от 50 мг/мл до 12.5 мг/мл привело к существенному уменьшению размера ДЗИ в течение 12 ч инкубации по сравнению с 24 ч также и для этих тестируемых штаммов. При концентрации AWME 6,25 мг/мл не проявлялось его антимикробное действие после 24 часов инкубации (Табл. 2).

Пример 3. Антимикробная активность AWME по отношению к бактериям Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus.

Наибольшее антимикробное действие AWME проявляет при концентрации 20 мг/мл, и является более чувствительным по отношению к фитопатогену P. aeuroginosa (максимальный ДЗИ=23,25±0,35 мм), по сравнению с S. aureus (максимальный ДЗИ=19,95±0,07 мм). AWME сохраняет свою антимикробную активность вплоть до концентрации 1,25 мг/мл в течение минимум 24 ч (Табл. 1). Результаты эксперимента также проиллюстрированы в рисунках 1-4.

Пример 4. Влияние продолжительности воздействия повышенной температуры на сохранение стабильности и антимикробной активности AWME.

Распространенным методом исследования термической стабильности химических веществ является термогравиметрический анализ - это аналитический метод, используемый для определения термической стабильности материала и доли летучих компонентов путем детектирования изменения веса с течением времени, происходящим при нагревании образца с постоянной скоростью. Температурный спектр проведения данного исследования составляет от 50°С вплоть до 500°С.

Исследование термостабильности препаратов в течение длительного срока хранения можно провести посредством инкубации при более высокой температуре и за более короткий временной интервал (OECD guideline for testing of chemicals 113 "Screening Test for Thermal Stability and Stability in Air"). Была произведена инкубация AWME при температуре 50°С в течение 4 и 14 дней и затем был произведен анализ его антимикробной активности методом тестирования зоны ингибирования.

Было проведено сравнение активности неразбавленного AWME после 4 дней инкубации при температуре 50°С на двух штаммах фитопатогенов - D. solani и Р. carotovorum subsp. carotovorum, и также в тех же условиях проверить активность AWME, разбавленного водой в 2 раза и в 5 раз. Тестирование разбавленного AWME проводилось с целью уменьшения расходования заявленного средства и, следовательно, снижения его себестоимости при условии сохранения антимикробной активности. Тестирование проходило по раннее использованному методу тестирования зоны ингибирования (Bauer A.W. et al., 1966). В качестве положительного контроля был использован антибиотик доксициклин в концентрации 600 мкг/мл. В качестве отрицательного контроля использовался экстрагирующий реагент без активного действующего вещества (AWM). Значения диаметров зон лизиса представлены в Таблице 4 и на рисунках 5-8.

Результаты проведенных испытаний показали, что термическая обработка в течение 4 дней неразбавленным AWME не снижает его антимикробную активность в отношении обоих испытанных фитопатогенов. Так, ДЗИ для D. solani и P. carotovorum subsp. carotovorum составили 10,5±0,5 мм и 10,95±0,05 мм, соответственно, после 4-дневной инкубации при 50°С, по сравнению с ДЗИ 9,25±0,25 мм и 10,9±0,1 мм при использовании AWME без предварительной термической обработки, соответственно. Однако, 4-дневная термическая обработка AWME, разбавленного как в 2 раза, так и в 5 раз, полностью подавляла его антимикробную активность в отношении обоих испытанных фитопатогенов (Табл. 4).

В ходе исследований была изучена продолжительность воздействия повышенной температуры на сохранение стабильности и антимикробной активности AWME в присутствии адъювантов. Тестирование биологической активности AWME в зависимости от концентраций двух адъювантов «Агропол» и «Адью» проводилось на штаммах бактерий D. solani и P. carotovorum subsp. carotovorum. Тестирование проходило по ранее использованному методу тестирования зоны ингибирования (Bauer A.W. et al., 1966).

Два адъюванта «Агропол» и «Адью» смешивались по отдельности с AWME до трех различных концентраций, и затем была произведена инкубация смеси AWME вместе с адъювантами в течение 14 дней при 50°С. Использованные концентрации двух адъювантов:

1) «Агропол» в водном растворе:

(1) по норме расхода производителя 0,1 мкл/мл;

(2) 10-кратную норму (1 мкл/мл);

(3) 100-кратную норму (10 мкл/мл).

2) «Адью» в водном растворе:

(1) по норме расхода производителя 1 мкл/мл;

(2) 10-кратную норму (10 мкл/мл);

(3) 100-кратную норму (100 мкл/мл). AWME тестировали в трех вариантах:

1) Без разведения;

2) Разведенный в 2 раза водой;

3) Разведенный в 5 раз водой.

В качестве негативного контроля использовались растворы адъювантов соответствующей концентрации без AWME, а также используемый для получения AWME экстрагент AWM, представляющий смесь воды, метанола и соляной кислоты в объемном соотношении 90:9:1. Тестирование каждого условия проводилось в двух повторах. Результаты эксперимента представлены в Таблице 5 и в рисунках 9-20.

Результаты показали, что неразбавленный AWME сохраняет антимикробную активность во всем диапазоне тестируемых концентраций обоих адъювантов, что показано на обоих фитопатогенах. С увеличением концентрации адъюванта «Адью» увеличивается антимикробная активность AWME относительно обоих протестированных фитопатогенов. Использование «Адью» в 10-кратной норме концентрации не только стабилизирует активно действующие вещества в разбавленном AWME, но и приводят к увеличению его антимикробной активности по сравнению с неразбавленным AWME в тех же условиях. Фитопатоген D. solani более чувствителен к действию разбавленного водой в 2 раза AWME, по сравнению с фитопатогеном Р. carotovorum subsp. carotovorum при тех же условиях. При 5-кратном разбавлении AWME его активность сохраняется исключительно при добавлении адъюванта «Агропол» в 100-кратной концентрации. При всех других условиях активность AWME, разбавленного в 5 раз, отсутствует. В присутствии адъюванта «Агропол» в 100-кратной концентрации была продемонстрирована его максимальная антимикробная активность в отношении обоих фитопатогенов. Антимикробная активность AWME, разбавленного в 5 раз, существенно снизилась по сравнению с неразбавленным AWME.

Принимая во внимание результаты эксперимента по тестированию термической стабильности AWME (Табл. 4, рис. 5-8), а также с точки зрения экономической целесообразности и практической эффективности было принято решение использовать в дальнейших исследованиях смесь AWME без разведения и адъюванта «Агропол» с добавлением 10 мкл/мл.

Пример 5. Антимикробный и противогрибковый эффект заявленного состава экстракта жира личинок мухи Черная львинка AWME (99%, объемные) в смеси с адъювантом «Агропол» (1%, объемные) был продемонстрирован на зараженной важнейшей сельскохозяйственной культуре сои, пораженной повсеместно распространенным патогеном Agrobacterium tumefaciens. Изучение взаимодействия AWME с соей проводилось при +25°С; семена растения предварительно замачивались в течение 3 часов в диапазоне концентраций AWME от 300 до 600 мг/л. Документировали показатели прорастания семян и их поражения бактерией (Таблица 6, рис. 21-23). В качестве положительного контроля были использованы образцы с добавлением антибиотиков амоксиклав и доксициклин в концентрациях 800 мг/л и 100 мг/л соответственно; в качестве отрицательного контроля были использованы образцы с добавлением экстрагирующего реагента AWM. Для каждого эксперимента тестирование проводилось в пяти повторах.

Исследования показали, что замачивание семян в экстракте перед высадкой дало более эффективное действие по сравнению с действием обоих антибиотиков, в присутствии которых наблюдалось развитие бактериальной инфекции на 4-й день роста, при этом грибковая инфекция продолжалась развиваться в этих чашках до 7 дня эксперимента (Табл. 6, рис. 21-23). Таким образом, в ходе проведенных исследований были установлены оптимальные условия, при которых экстракт AWME способен проявлять свое защитное действие против патогенов бактериальной и грибковой природы. При концентрации AWME 300 мг/л и 400 мг/л зараженная соя была способна активно прорастать и была полностью защищена от заражения патогенами в течение 7 дней проведения эксперимента (Табл. 6, рис. 21-23). Было показано, что максимальное защитное действие против патогенов бактериальной и грибковой природы AWME оказывает при предварительном замачивании зараженных семян в течение 3 часов.

Реализация заявленного изобретения не ограничивается приведенными выше примерами. Использование нового природного средства защиты растений в сельском хозяйстве позволит увеличить производительность сельскохозяйственных культур без привлечения антибиотиков и других химических соединений, наносящих вред здоровью населения и окружающей среде. Изобретение может быть использовано в сельском хозяйстве как для защиты растение, так и для предпосевной предобработки семян широкого спектра сельскохозяйственных растений, зараженных фитопатогенными бактериями и грибками.

Литература:

1. FAO specifications and evaluations for agricultural pesticides. Triadimenol.

2. Commission decision of 20 September 2007 concerning the non-inclusion of trifluralinin Annex I to Council Directive 91/414/EEC and the withdrawal of authorisations for plant protection products containing that substance (2007/629/EC).

3. Голышин H.M. Фунгициды. - M.: Колос, 1993. - 319 с.: ил.

4. Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации, 2013 год. Минсельхоз России.

5. Commission implementing regulation (EU) 2021/348 of 25 February 2021 approving carbendazim as an existing active substance for use in biocidal products of product-types 7 and 10.

6. Benomyl. Hazard classification and labelling. EC / List no.: 241-775-7 CAS no.: 17804-35-2.

7. Commission implementing regulation (EU) No 703/2011 of 20 July 2011 approving the active substance azoxystrobin, in accordance with Regulation (EC) No 1107/2009 of the European Parliament and of the Council concerning the placing of plant protection products on the market, and amending the Annex to Commission Implementing Regulation (EU) No 540/2011.

8. Паспорт безопасности в соотв. с ГОСТ 30333-2007 Дихлоран глицерин, агар (основа) ISO 11133, ISO 21527-2, для микробиологии.

9. Environmental protection agency 40 CFR Part 180 [EPA-HQ-OPP-2016-0064; FRL-9962-96] Fenamidone; Pesticide Tolerances.

10. Использование химических средств для контроля фитопатогенов: Шарма, Г., Камила, А., Кондер, А. и др. (2019). The use of fungicides in plant disease management. Current Research in Agriculture and Horticulture, 6(1), 1-8.

11. Григорьева M.B., Ивойлова Э.А., Уткина B.B. Средства защиты растений, разрешенные в органическом земледелии.

12. Jones, J.B., Svircev, A.M., Obradović, A.Ž. (2018). Crop Use of Bacteriophages. In: Harper, D., Abedon, S., Burrowes, В., McConville, M. (eds) Bacteriophages. Springer, Cham.

13. Биологические агенты в контроле болезней растений: Махешвараппа, В.Г. и др. (2019). Биологические агенты для контроля болезней растений: перспективы и ограничения. В сборнике: "Проблемы биологического управления в сельском хозяйстве" (стр. 19-30). Springer, Сингапур.

14. Klümper W., Qaim М. (2014) A Meta-Analysis of the Impacts of Genetically Modified Crops. PLoS ONE 9(11): e111629.

15. Генетически модифицированные растения в борьбе с фитопатогенами: Стефановиц, М. и др. (2019). Преимущества и недостатки генетически модифицированных растений в сельском хозяйстве. Journal of Process Management. New Technologies, 7(1), 39-43.

16. Патент РФ № 2342833 «Состав для предпосевной обработки семян овощных культур и клубней картофеля от бактериальных болезней».

17. Marusich Е., Mohamed Н., Afanasev Y., Leonov S. Fatty Acids from Hermetia illucens Larvae Fat Inhibit the Proliferation and Growth of Actual Phytopathogens. Microorganisms. 2020; 8(9): 1423.

18. Mohamed H., Marusich E., Afanasev Y., Leonov S. Fatty Acids-Enriched Fractions of Hermetia illucens (Black Soldier Fly) Larvae Fat Can Combat MDR Pathogenic Fish Bacteria Aeromonas spp. Int J Mol Sci. 2021 Aug. 17; 22(16): 8829.

19. Mohamed H., Marusich E., Afanasev Y., Leonov S. Bacterial Outer Membrane Permeability Increase Underlies the Bactericidal Effect of Fatty Acids From Hermetia illucens (Black Soldier Fly) Larvae Fat Against Hypermucoviscous Isolates of Klebsiella pneumoniae. Front Microbiol. 2022 May 6; 13: 844811.

20. Bauer A.W., Kirby W.M., Sherris J.C., Turck M. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. Am J Clin Pathol. 1966 Apr; 45(4): 493-6.

21. OECD guideline for testing of chemicals 113 "Screening Test for Thermal Stability and Stability in Air" (Accelerated Storage Test [CIPAC-Test] - Thermal Analysis Methods, including differential thermal analysis [DTA] and thermogravimetric analysis [TGA]). Adopted: 12 May 1981.

22. De Ruiter H. Developments in adjuvant use for agrochemicals. Meded Rijksuniv Gent Fak Landbouwkd Toegep Biol Wet. 2002; 67(2): 19-25.

Изобретение относится к сельскому хозяйству. Антимикробное и противогрибковое средство на основе экстракта из жира личинок мухи «Черная львинка» (AWME) для борьбы с бактериозами и микозами сельскохозяйственных культур содержит экстракт из жира мухи «Черная львинка» (AWME) в концентрации 300 мг/л и адъювант «Агропол» в соотношении, об. %: экстракт AWME 99%, Агропол 1%. Изобретение позволяет создать высокоэффективное средство для усиления защиты сельскохозяйственных культур, для борьбы с бактериозами и микозами сельскохозяйственных растений, с широким спектром действия. 23 ил., 6 табл., 5 пр.

Антимикробное и противогрибковое средство на основе экстракта из жира личинок мухи «Черная львинка» (AWME) для борьбы с бактериозами и микозами сельскохозяйственных культур, содержащее экстракт из жира мухи «Черная львинка» (AWME) в концентрации 300 мг/л и адъювант «Агропол» в соотношении, об. %:

Экстракт AWME 99% Агропол 1%