ЖИДКИЙ СОСТАВ, СОДЕРЖАЩИЙ ЛАКТОБАКТЕРИИ, И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2024 года по МПК A61K35/747 C12N1/20 A61K38/01 C12R1/245 C12R1/25 

Область техники

Настоящее изобретение относится к области фармацевтики, биологически активных веществ и составам, содержащим пробиотики. Предложен состав, содержащий лактобактерии, в жидкой форме, обладающий пролонгированным сроком хранения. Также предложен способ получения такого состава и его применение в качестве биологически активной добавки.

Предшествующий уровень техники

В настоящее время достаточно распространены препараты или биологически активные добавки, содержащие лактобактерии. Как правило, данные препараты используются для нормализации микрофлоры кишечника, например, во время или после приема антибиотиков, снижения проявлений аллергии в виде дерматитов или акне. В состав таких препаратов могут входить бактерии видов Lactobacillus, например, Lactobacteruim acidophilus, fermentum, casei, или Bifidobacterium bifidum, longum, breve и др.

Наиболее распространены в виде препаратов с пробитическим действием составы, содержащие различные виды Lactobacillus. Они применяются как биологически активная добавка (БАД) с пищевыми свойствами. Известен препарат «Лактобактерин», содержащий биомассу живых бактерий антагонистически активного штамма лактобактерий (Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum), лиофилизированную в среде культивирования с добавлением защитной среды высушивания (сахарозо-желатино- молочной). «Лактобактерин» принимает вовнутрь и местно, показания включают множество заболеваний или состояний, включая заболевания ЖКТ, женских половых органов, применение при комплексной терапии заболеваний инфекционной и неинфекционной этиологии, в т.ч. у детей. Следует отдельно отметить, что данный препарат выпускается в виде лиофилизата, и его хранить в разведенном не допускается. Лиофилизат разводят водой in situ, непосредственно перед применением.

К препаратам аналогичного действия можно отнести ряд препаратов: Лактонорм, Нормофлорин-Л, Лактожиналь, Ацилакт Форте, Экофемин, Ацилакт Дуо, Ацилакт и другие. Данные препараты содержат, как правило, один из видов лактобактерий и выпускаются в виде лиофилизата, капсул, или концентрата.

К недостаткам данных препаратов можно отнести: ограниченный срок годности в жидкой форме, необходимость приготовления перед применением или короткий срок хранения препарата.

Настоящее изобретение заключается в создании состава, содержащего лактобактерии, в жидкой форме, без необходимости разведения, а также с длительным сроком хранения, в том числе после вскрытия флакона или после разморозки. Жидкий состав согласно изобретению также можно использовать как для расширения арсенала средств, в случае, например, если средства в другом виде плохо переносятся пациентом или не являются удобными ему.

Все это повышает комплаентность, т.е. приверженность пациенту к лечению и способствует более быстрому выздоровлению и нормализации функции кишечника.

Краткое описание изобретения

Предложен состав в жидкой форме, обладающий пробиотическими свойствами, включающий

- комплекс лактобактерий видов Lactobacillus plantarum 8P-A3, Lactobacillus fermentum 90Tc4 (pLFAp5), Lactobacillus casei С6, вырабатываемый путем культивирования в питательной среде, включающей гидролизат коллагена пищевой - 0,010-0,015%

- вода - до 100%.

При этом, состав содержит комплекс лактобактерий видов Lactobacillus plantarum 8P-A3, Lactobacillus fermentum 90Tc4 (pLFAp5), Lactobacillus casei С6 и получен путем смешивания штаммов лактобактерий в равных пропорциях. В другом варианте реализации, комплекс лактобактерий включает штаммы в следующих соотношениях:

Lactobacillus plantarum 8P-A3 - 3,4* 10⁸ КОЕ в 1 см³, Lactobacillus fermentum 90Tс4 (pLFAp5) - 4 - 4,5* 10⁸ КОЕ в 1 см³, Lactobacillus casei - 3,4* 10⁸ КОЕ в 1 см³.

Кроме того, в указанном составе в качестве лактобактерий могут быть использованы штаммы: Lactobacillus plantarum 8P-A3 - штамм из коллекции ВКПМ В -11007, Lactobacillus fermentum 90Tc4 (pLFAp5 -штамм из коллекции ВКПМ В - 7582, Lactobacillus casei С6 -штамм из коллекции ВКПМ В- 5724. Для получения состава используется гидролизат коллагена пищевой, например, гидролизат коллагена пищевой «КоллАмин - 80».

Состав согласно изобретению является готовой к употреблению в пищу формой, при этом концентрация лактобактерий может составлять до 10⁹ живых клеток в 1 см³.

Дополнительно, изобретение предлагает способ получения жидкого состава, содержащего лактобактерии, включающий стадии:

- приготовление питательной среды для накопления биомассы лактобактерий, при этом питательная среда включает гидролизат коллагена пищевой;

- внесение в питательную среду пробиотические культуры лактобактерий в среде углекислого газа;

- внесение биомассы лактобактерий 2-ой генерации в питательную среду;

- ферментация питательной среды с 3-ей генерацией штаммов лактобактерий;

- получение состава в жидкой форме;

- охлаждение состава до температуры +20°С;

- розлив состава;

- доохлаждение до температуры (6±2)°С.

При этом, согласно способу, в некоторых вариантах стадию внесения в питательную среду пробиотической культуры лактобактерий и стадию внесения биомассы лактобактерий 2-ой генерации проводят на каждом штамме отдельно. Также согласно способу, стадию ферментации питательной среды с 3-ей генерацией штаммов можно проводить на смеси штаммов лактобактерий, содержащей Lactobacillus plantarum 8P-A3, Lactobacillus fermentum 90Tc4 (pLFAp5), Lactobacillus casei С6 в равных пропорциях. В другом варианте реализации согласно способу получают жидкий состав, содержащий комплекс лактобактерий при следующих соотношениях:

Lactobacillus plantarum 8P-A3 - 3,4* 10⁸ КОЕ в 1 см³, Lactobacillus fermentum 90Tс4 (pLFAp5) - 4 - 4,5* 10⁸ КОЕ в 1 см³, Lactobacillus casei - 3,4* 10⁸ КОЕ в 1 см³.

Кроме того, заявлено применение описанного состава, содержащего лактобактерии, по изобретению, для поддержании нормальной микрофлоры кишечника и в качестве биологически активной добавки.

Описание фигур

На Фиг. 1 представлена технологическая схема получения лиофилизата.

Подробное описание изобретения

Согласно изобретению, предложен состав в жидкой форме, обладающий пробиотическими свойствами, включающий комплекс лактобактерий видов

Lactobacillus plantarum 8P-A3, Lactobacillus fermentum 90Tc4 (pLFAp5), Lactobacillus casei С6, вырабатываемый путем культивирования в питательной среде, включающей гидролизат коллагена пищевой -0,010-0,015 %

- вода - до 100%.

Данный состав включает указанные 3 вида лактобактерий. Из предшествующего уровня техники известно, что лактобактерии видов Lactobacillus plantarum 8P-A3, Lactobacillus fermentum 90Tc4 (pLFAp5), Lactobacillus casei С6 являются пробиотическими, т.е. способствуют нормализации функции кишечника и поддержанию его нормальной микрофлоры. Как правило, в препаратах -пробиотиках используется один вид бактерий, т.к. смешивание видов может вызывать гибель одного и доминирование другого вида в смеси. Кроме того, технологически достаточно сложно и трудоемко культивировать несколько видов одновременно на одной питательной среде, а смешение в конечном продукте также может приводить к гибели одного из видов. Таким образом, смешивание пробиотических культур друг с другом может быть нецелесообразным.

В составе согласно изобретению используется 3 вида лактобактерий: комплекс лактобактерий видов Lactobacillus plantarum 8P-A3, Lactobacillus fermentum 90Tc4 (pLFAp5), Lactobacillus casei С6, при этом комплекс получен путем смешивания штаммов лактобактерий в равных пропорциях. Также возможно получение состава со следующим содержанием шатммов лактобактерий:

Lactobacillus plantarum 8P-A3 - 3,4* 10⁸ КОЕ в 1 см³, Lactobacillus fermentum 90Tс4 (pLFAp5) - 4 - 4,5* 10⁸ КОЕ в 1 см³, Lactobacillus casei - 3,4* 10⁸ КОЕ в 1 см3. Согласно же способу получения состава по изобретению, данный комплекс получают путем одновременного культивирования, в едином пространстве на одной среде. Также, помимо использования самих видов лактобактерий могут быть использованы их отдельные штаммы, обладающие оптимальными свойствами. Так, в указанном составе в качестве лактобактерий могут быть использованы штаммы: Lactobacillus plantarum 8P-A3 - штамм из коллекции ВКПМ В -11007, Lactobacillus fermentum 90Tc4 (pLFAp5 -штамм из коллекции ВКПМ В - 7582, Lactobacillus casei С6 -штамм из коллекции ВКПМ В- 5724.

Для повышения выхода и качества состава используется гидролизат коллагена пищевой, например, гидролизат коллагена пищевой «КоллАмин - 80». Данный гидролизат может иметь состав: гидрализат коллагена (глицин, аланин, пролин, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, аргинин, лейцин, серин, валин, треонин, изолейцин, оксипролин, лизин, фенилаланин, тирозин, таурин, цистеин, гистидин, метионин, орнитин, оксилизин, триптофан), цифрол-5 (супероксиддисмутаза, гесперидин, аскорбиновая кислота, экстракт гибискуса сухой, витамин Е, дигидрокверцетин, бета-каротин, коэнзим Q10), фруктоза кристаллическая, диоксид кремния (согласно № RU.77.99.11.003.Е.045816.09.11).

Получаемый состав согласно изобретению является готовой к употреблению в пищу формой, например, принимаемой перед едой. Концентрация лактобактерий может составлять до 10⁸-10⁹ живых клеток в 1 см³, т.е. минимальное содержание живых клеток лактобактерий составляет 10⁸ в 1 см³.

Согласно изобретению, способ получения жидкого состава, содержащего лактобактерии, включает стадии:

- приготовление питательной среды для накопления биомассы лактобактерий, при этом питательная среда включает гидролизат коллагена пищевой;

- внесение в питательную среду пробиотические культуры лактобактерий в среде углекислого газа;

- внесение биомассы лактобактерий 2-ой генерации в питательную среду;

- ферментация питательной среды с 3-ей генерацией штаммов лактобактерий;

- получение состава в жидкой форме;

- охлаждение состава до температуры +20°С;

- розлив состава;

- доохлаждение до температуры (6±2)°С.

Стадию по получению питательной среды, в частности, с использованием гидролизата коллагена пищевого, проводят в отдельных ампулах или флаконах, и далее, в них вносят культуры лактобактерий и культивируют отдельно друг от друга. Внесение во флакон со средой проводят в среде углекислого газа, в асептических условиях, что также позволяет добиться существенного увеличения сроков хранения (годности) пробиотиков.

Способ производства пробиотических продуктов в асептических условиях имеет значительные по сравнению с другими преимущества, так как позволяет получать стойкие при хранении продукты, в которых сохраняются живые клетки культур достаточно длительное время. Применение комбинации соответствующих условий позволяет избежать эффекта медленного сквашивания, а в некоторых случаях в полном прекращении сквашивания. Этот эффект возникает в питательных средах, содержащих ионы кальция и коллаген. При этом, как правило, причина данного явления заключается в контаминации культуры фагом, который вызывает лизис только определенных видов бактерий, но диапазон его действия широк - он может поражать большое количество штаммов. Одноштаммовая закваска (культура) легче поражается фагом и теряет свою активность. Это послужило основанием для замены одноштаммовой культуры лактобактерий многоштаммовой или смешанной. Процесс лизиса бактериофагом чувствительных штаммов в смешанной культуре (закваске) представляет собой сложный биологический процесс. Как было установлено, культивирование и перенос культуры на питательную среду в среде углекислого газа в асептических условиях позволяет снизить контаминацию бактериофагом и повысить срок хранения жидкого препарата.

Применение углекислого газа в сочетании с асептическими условиями на стадиях внесения в питательную среду пробиотических культур лактобактерий, внесения биомассы лактобактерий 2-ой генерации в питательную среду, а также ферментации питательной среды с 3-ей генерацией штаммов лактобактерий позволяет добиться длительного срока хранения жидкого состава как в закрытом виде, так и после вскрытия флакона, после разморозки в случае замораживания.

При этом, согласно способу, в некоторых вариантах стадию внесения в питательную среду пробиотической культуры лактобактерий и стадию внесения биомассы лактобактерий 2-ой генерации проводят на каждом штамме отдельно. Также согласно способу, стадию ферментации питательной среды с 3-ей генерацией штаммов можно проводить на смеси штаммов лактобактерий, содержащей Lactobacillus plantarum 8P-A3, Lactobacillus fermentum 90Tc4 (pLFAp5), Lactobacillus casei С6 в равных пропорциях или при соотношениях Lactobacillus plantarum 8P-A3 - 3,4* 10⁸ КОЕ в 1 см³, Lactobacillus fermentum 90Tс4 (pLFAp5) - 4 - 4,5* 10⁸ КОЕ в 1 см³, Lactobacillus casei - 3,4* 10⁸ КОЕ в 1 см³. Использование углекислого газа при внесении позволяет культивировать несколько штаммов одновременно.

Также, согласно изобретению, можно применять данный состав для восстановления и поддержания микрофлоры кишечника и желудочно-кишечного тракта в целом, и в качестве вспомогательного средства для предотвращения дисбактериоза, в том числе во время и после принятия антибиотиков, и устранения тяжести, вздутия в животе (метеоризма), расстройства стула (диареи), тошноты, рвоты, отрыжки. В связи с тем, что было показано, что именно лактобактерии кишечной микрофлоры влияют на иммунитет, то в случае поддержания нормальной микрофлоры кишечника можно использовать состав, содержащий лактобактерии, согласно изобретению, в случае, если пациенту необходима выработка собственного интерферона и укрепление иммунитета, например, во время сезонных обострений простудных заболеваний. Также лактобактерии применяют для улучшения перистальтики пищевода, желудка, кишечника, снятия кишечных спазмов и непроходимости, в качестве профилактики «диареи путешественника», а также в качестве средства для снижения симптомов диареи неинфекционной природы.

Примеры

Пример 1

Получение комплекса лактобактерий

Питательной средой для накопления биомассы лактобактерий являлось «Гидролизат коллагена пищевой «КоллАмин» ферментативный сухой, используемый в пищевой промышленности в качестве источника аминокислот при производстве специализированных пищевых продуктов и биологических активных добавок к пище. Данный гидролизат коммерчески доступен под торговым наименованием «КоллАмин 80».

К 20,0±0,5 г питательной среды добавляли 3,5±0,5 г хлористого натрия, 10‚0±0,5 г лактозы, 0,75±0,05 г агар-агара и дистиллированной воды до 1 л. Допускается использование других питательных сред, которые использовали для культивирования лактобактерий.

Приготовленную питательную среду разливали в стерильные флаконы емкостью 80-150 мл и затем стерилизовали в автоклаве при температуре (112±2)°С и избыточном давлении 0,5 кгс/см в течение 30±2 минут. После охлаждения до +37°С -38°С питательную среду использовали для выращивания чистой культуры лактобактерий, рН готовой питательной среды - 7,1±0,2.

Приготовление культуры лактобактерий.

Первая генерация.

Для приготовления культуры, стерильной пипеткой вносили в асептических условиях в ампулу 1,5-2,0 мл стерильной питательной среды. Содержимое ампулы переносили в две пробирки (или флакона) со стерильной питательной средой, разлитой по 30 мл и хорошо перемешивали. Ампулы выдерживали в термостате, при температуре (37-38)°С, до получения биомассы с содержанием не менее 10⁸ в 1 мл лактобактерий. Использовали лактобактерии типов: Lactobacillus plantarum 8P-A3, Lactobacillus fermentum 90Tc4 (pLFAp5), Lactobacillus casei С6, при этом их культивировали отдельно друг от друга.

Вторая генерация.

Выросшую культуру каждого из штаммов 1 генерации объёмом (3,5-5) % вносили в питательную среду и культивировали в термостате при температуре (37-38) °С до получения биомассы с содержанием микробных тел не менее 10⁸ в 1 мл.

1 и 2 генерацию проводили в специальном боксе.

Стадию ферментации и 3 генерации проводили в ферментерах с питательной средой. В стерильные ферментёры объемом 36 л. и более, с углекислым газом подавали стерильную питательную среду, охлажденную до температуры (37-38)°С, с последующим внесением культуры лактобактерий второй генерации каждого штамма по отдельности в ферментеры №1, №2, №3. Объёмная доля внесения культуры лактобактерий по отношению к питательной среде составляла 10%. Культивирование биомассы лактобактерий в ферментерах производили в атмосфере газа СО₂. Содержимое ферментеров перемешивали встроенной мешалкой. Выращивание лактобактерий проводили при температуре (37-38)°С в течение 24-48 часов, ферментеры термостатировали подачей в рубашку воды при температуре +37-38°С. Процесс считался завершенным при достижении показателя рН среды 3,9-4,3. Выращивание биомассы проводили до получения содержания лактобактерий в 1 мл не менее 108 - 10⁹ живых клеток.

Далее, по окончании процесса, выращенную биомассу в ферментере №1, №2, №3 смешивали в равных объёмах в общем ферментёре, получая симбиотический комплекс лактобактерий. Также, в одном из вариантов, получали комплекс лактобактерий, содержащий:

Lactobacillus plantarum 8P-A3 - 3,4* 10⁸ КОЕ в 1 см³, Lactobacillus fermentum 90Tс4 (pLFAp5) - 4 - 4,5* 10⁸ КОЕ в 1 см³, Lactobacillus casei - 3,4* 10⁸ КОЕ в 1 см³.

Полученный комплекс перемешивали и охлаждали до температуры +20°С. Охлажденный состав из ферментёра направляли на фасовку.

Приготовление и фасовку жидкого состава по изобретению проводили в помещении 3 класса чистоты, проводили упаковку и маркировку. Упакованную продукцию доохлаждали в холодильной камере до температуры (6±2)°С, после чего считалось, что финишный продукт получен и готов к реализации.

Полученный состав включал Lactobacillus plantarum 8P-A3, Lactobacillus fermentum 90Tc4 (pLFAp5), Lactobacillus casei С6, вырабатываемый путем культивирования в питательной среде, включающей гидролизат коллагена пищевой - 0,10-0,015%, - вода - до 100%.

Состав не содержал казеина, лактозу и глюкозу. В некоторых случаях для получения состава использовали следующие штаммы:

Lactobacillus plantarum 8P-A3 (штамм из коллекции ВКПМ В -11007), Lactobacillus fermentum 90Tc4 (pLFAp5) (штамм из коллекции ВКПМ В - 7582), Lactobacillus casei С6 (штамм из коллекции ВКПМ В- 5724).

Составы содержали штаммы в равных пропорциях или в указанных ниже соотношениях:

Lactobacillus plantarum 8P-A3 - 3,4* 10⁸ КОЕ,

Lactobacillus fermentum 90Tс4 (pLFAp5) - 4 - 4,5* 10⁸ КОЕ,

Lactobacillus casei - 3,4* 10⁸ КОЕ.

Полученную продукцию контролировали по различным показателям: определение органолептических, физико-химических показателей качества и показателей безопасности.

Пример 2

Исследование свойств состава по изобретению

Полученный состав исследовали по различным показателям, результаты представлены в таблице ниже.

Таблица 1 Наименование показателя Характеристика и норма Внешний вид и консистенция Коллоидный раствор вязкой консистенции Вкус и запах Кислого вкуса со слабым специфическим запахом Цвет Золотисто-коричневый Объем одного флакона, мл 0,5 ± 10 % Кислотность, Т°, не более 180 Концентрация водородных ионов (рН) 3,9-4,3 Концентрация живых клеток не менее 108-109 клеток в 1 см3

Все полученные составы соответствовали указанным выше показателям.

Пример 3

Исследование срока годности

Образцы полученной продукции хранили при температуре +2-+8°С в течение контрольного срока в 12 мес. Каждые месяц измеряли рН, кислотность и контролировали внешний вид, запах, цвет. Результаты представлены в таблице ниже, приведены данные за каждые 3 мес.

Таблица 2 Наименование показателя Характеристика и норма 1 мес 3 мес 6 мес 9 мес 12 мес Внешний вид и консистенция Коллоидный раствор вязкой консистенции + + + + + Вкус и запах Кислого вкуса со слабым специфическим запахом + + + + + Цвет Золотисто-коричневый + + + + + Объем одного флакона, мл 0,5 ± 10 % + + + + + Кислотность, Т°, не более 180 125 138 155 160 173 Концентрация водородных ионов (рН) 3,9-4,3 4,2 4,2 4,0 3,9 3,9

Также контролировали содержание 10⁹ живых клеток в 1 см³ согласно ОФС.1.7.2.0008.15 «Определение концентрации микробных клеток», путем посева на питательную среду. Содержание составляло не менее 10⁸-10⁹ клеток в 1 см³, в том числе в ампулах после хранения в течение 12 мес.

Вскрытые флаконы также проверяли на срок годности при хранении в течение 3 мес., при +2-+8°С. По истечении 3 мес. контролировали органолептические и иные показатели, приведенные в таблице ниже.

Таблица 3 Наименование показателя Показатели Внешний вид и консистенция Коллоидный раствор вязкой консистенции Вкус и запах Кислого вкуса со слабым специфическим запахом Цвет Золотисто-коричневый Объем одного флакона, мл 0,5 ± 10 % Кислотность, Т°, не более 180 152 Концентрация водородных ионов (рН) 4,0 Концентрация живых клеток не менее 10⁸ клеток в 1 см³

Также флаконы проверяли на стойкость к замораживанию и размораживанию. После размораживания проверяли органолептические показатели и концентрацию живых клеток. После цикла замораживания и размораживания она составляла не менее 10⁸ клеток в 1 см³.

Пример 4

Применение состава для поддержания нормальной микрофлоры кишечника

Состав является полностью пищевым и его можно применять детям и взрослым в виде однократного приема в сутки, курсом в течение 14-30 дней, например, в качестве биологически активной добавки.

Состав применяли для нормализации функции кишечника при диарее неинфекционной природы у взрослых. Добровольцы были разделены на группы по 5 человек, при этом одной группе предложили принимать состав согласно изобретению, вторая группа принимала препарат «Лактобактерин». Обе группы принимали по 5 мл в день, за полчаса до еды. После 2 суток приема работа кишечника нормализовалась, симптомы диареи отсутствовали. Разницы по скорости выздоровления и количеству побочных эффектов между группа отмечено не было.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения жидкого состава, содержащего комплекс лактобактерий видов Lactobacillus plantarum 8P-A3, Lactobacillus fermentum 90Tc4 (pLFAp5), Lactobacillus casei С6, обладающего пробиотическими свойствами. Изобретение обеспечивает получение состава, содержащего лактобактерии, в жидкой форме без необходимости разведения, а также с длительным сроком хранения, в том числе после вскрытия флакона или после разморозки. 1 ил., 3 табл., 4 пр.

Способ получения жидкого состава, содержащего комплекс лактобактерий видов Lactobacillus plantarum 8P-A3, Lactobacillus fermentum 90Tc4 (pLFAp5), Lactobacillus casei С6, обладающего пробиотическими свойствами, при этом способ включает стадии:

- приготовление питательной среды для накопления биомассы лактобактерий, при этом питательная среда включает гидролизат коллагена пищевой «КоллАмин 80» в количестве 2±0,5% мас. от питательной среды;

- внесение в питательную среду пробиотические культуры лактобактерий в асептических условиях для образования 1-ой генерации;

- внесение биомассы лактобактерий 2-ой генерации в питательную среду;

- ферментация питательной среды с 3-ей генерацией штаммов лактобактерий;

- получение состава в жидкой форме;

- охлаждение состава до температуры +20°С;

- розлив состава;

- доохлаждение до температуры (6±2)°С,

при этом, штаммы лактобактерий представляют собой следующие штаммы: Lactobacillus plantarum 8P-A3 – штамм из коллекции ВКПМ В-11007, Lactobacillus fermentum 90Tc4 (pLFAp5) – штамм из коллекции ВКПМ В-7582, Lactobacillus casei С6 – штамм из коллекции ВКПМ В-5724, в равных пропорциях,

а стадия внесения в питательную среду пробиотической культуры лактобактерий и стадия внесения биомассы лактобактерий 2-ой генерации проводится на каждом штамме отдельно,

и стадия ферментации питательной среды с 3-ей генерацией штаммов проводится на смеси штаммов лактобактерий, содержащей Lactobacillus plantarum 8P-A3 – 3,4* 10⁸ КОЕ в 1 см³, Lactobacillus fermentum 90Tс4 (pLFAp5) - 4 - 4,5* 10⁸ КОЕ в 1 см³, Lactobacillus casei – 3,4* 10⁸ КОЕ в 1 см³.