1-[(5-Нитрофуран-2-ил)карбонил]-2'-пропил-1H,7'H-спиро[азетидин-3,5'-фуро[3,4-d]пиримидин], обладающий противотуберкулезной активностью в отношении возбудителя туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью, и способ его получения Российский патент 2024 года по МПК C07D491/20 A61K31/519 A61P31/06 

Изобретение относится к химии органических гетероциклических соединений, а именно к индивидуальному 1-[(5-нитрофуран-2-ил)карбонил]-2'-пропил-1H,7'H-спиро[азетидин-3,5'-фуро[3,4-d]пиримидину]формулы 1, проявляющему противотуберкулезные свойства, и способу его получения.

Уверенная тенденция к снижению заболеваемости туберкулезом - одной из ведущей в мире причины смертности от инфекционных заболеваний, отмеченная в начале XXI века, легла в основу разработанной ВОЗ стратегии по сокращению смертности и заболеваемости туберкулезом на 90 и 80% соответственно к 2030 г. и ликвидации туберкулеза к 2035 году [World Health Organisation. Global ltuberculosis report 2018. Geneva: 2018].Однако ее реализация требует разработки эффективных способов лечения, способных преодолеть лекарственную устойчивость M.tuberculosis (ЛУ МБТ), все шире распространяющейся даже в развитых странах [Dean A. S., Zigno l М., Cabibbe А. М., Falzon D., Glaziou P., Cirillo D.M., Köser C.U., Gonzalez-Angulo L.Y., Tosas-Auget O., Ismai IN., Tahseen S., Ama M.C.G, Skrahina A., Alikhanova N., Kamal S.M.M., Floyd K. Prevalence and genetic profiles of isoniazid resistance in tuberculosis patients: A multicountry analysis of cross-sectional data. // PLoS Med. 2020; 17(1):e1003008; Mohammed K.A.S., Khudhair G.S., Al-Rabei D.B. Prevalence and Drug Resistance Pattern of Mycobacterium Tuberculosis Isolated from Tuberculosis Patients in Basra, Iraq // Pol J Microbiol. 2022; 71(2): 205-215]. Способность МБТ вырабатывать устойчивость к противотуберкулезным препаратам существенно снижает эффективность лечения, в результате чего часто развиваются хронические формы инфекции с фиброзным поражением легких и сохранением не-реплецирующих/dormant микобактерий, что неизбежно ведет к рецидивам [Rudgard W.E, Evans С.А., Sweeney S., WingfieldT., Lönnroth K., BarreiraD., Boccia D. Comparison of Two Cash Transfer Strategies to Prevent Catastrophic Costsfor Poor Tuberculosis-Affected House holdsin Low- And Middle-Income Countries: An Economic Modelling Study //PLoSMed.2017 Nov 7;14(11):e1002418, doi: 10.1371/journal.pmed.l002418; Wang J., Zhou M., Chen Z., Chen C, Wu G., Zuo Y., Ren X, Chen Z, Wang W., Pang Y. Survival of patients with multidrug-resistant tuberculosis in Central China: a retrospective cohort study // Epidemiol. Infect. 2020; 148: е50]. По некоторым прогнозам, при сохранении темпов роста МЛУ/ШЛУ (множественной/широкой лекарственной устойчивости) существует высокая вероятность развития тотальной ЛУ МБТ к препаратам I, II и резервного ряда, при которой смертность от туберкулеза к 2050 г. сможет превзойти таковую от онкологических заболеваний.

Последнее десятилетие считается эпохой возрождения исследований по созданию новых противотуберкулезных препаратов, однако, несмотря на их появление, возможности химиотерапии для лечения пациентов с МЛУ МБТ ограничены. В рекомендации ВОЗ 2020 года включены новые лекарственные препараты - бедаквилин, линезолид, клофазимин, деламанид, претоманид. При этом клофазимин и претоманид не могут быть использованы в РФ по причине отсутствия их регистрации. Показано, что включение в схему лечения пре-ШЛУ ТБ бедаквилина и линезолида позволяет ускорить негативацию посева мокроты. Применение 4 и более компонентных схем XT, включающих одновременно бедаквилин и линезолид является оптимальным, а вот включение в схему только бедаквилина или только линезолида, а также прием менее 4 эффективных препаратов статистически значимо связано с замедлением негативации посева мокроты. [Кулижская А.И., Гурьева Т.Н., Никишова Е.И., Елисеев П.И., Перхин Д.В., Марьяндышев А.О. Эффективен ли 6-месячный курс лечения изониазид-устойчивого туберкулеза? // Туберкулез и болезни легких. 2022; Т. 100 (2): 13-17]. Показана также эффективность и безопасность химиотерапии с включением деламанида пациентам с МЛУ/пре-ШЛУ ТБ [Химова Е.С., Перхин Д.В., Свешникова О.М. и др. Деламанид в лечении МЛУ/пре-ШЛУ ТБ в Архангельской области в 2019-2021 годах // Туберкулез и болезни легких.2023; 101 (3):62-68]. В то же время уровень излечения туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) и с широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ) остается очень низким и составляет по данным большинства исследователей только 50% и 30% соответственно [Singh V., Chibale K. Strategies to Combat Multi-Drug Resistance in Tuberculosis // Acc. Chem. Res. 2021;54(10):2361-2376].

Задачей предлагаемого изобретения является создание нового неописанного в литературе соединения 1-[(5-нитрофуран-2-ил)карбонил]-2'-пропил-1H,7'H-спиро[азетидин-3,5'-фуро[3,4-d]пиримидина]формулы 1, что позволит расширить арсенал потенциальных противотуберкулезных препаратов для лечения больных с МЛУ/ШЛУ формами туберкулеза.

Техническим результатом при использовании изобретения является получение нового соединения формулы 1, которое потенциально может быть применено в медицине в качестве лекарственного средства; разработка способа его синтеза; выявленная противотуберкулезная активность in vitro в отношении стандартного и клинических лекарственно устойчивых штаммов М. tuberculosis.

Задача решается также тем, что способ получения соединения 1-[(5-нитрофуран-2-ил)карбонил]-2'-пропил-1H,7'H-спиро[азетидин-3,5'-фуро[3,4-d]пиримидина] формулы 1, осуществляется путем взаимодействия в сухом диметилформамидеимидазолида 5-нитрофуран-2-карбоновой кислоты и спироциклического амина, получаемого непосредственно перед реакцией обработкой 2-трет-2-бутил-2'-пропил-1H,7'H-спиро[азетидин-3,5'-фуро[3,4-d]пиримидин]-1-карбоксилата (формулы 5) раствором трифторуксусной кислоты в сухом хлористом метилене при температуре 0°С.

Задача решается также тем, что соединение формулы 1 обладает противотуберкулезной активностью, проявляемой в отношении чувствительного стандартного штамма H₃₇RV и лекарственно устойчивых клинических изолятов МБТ.

Изобретение поясняется чертежами, где:

Фиг 1. Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) соединения 1-[(5-нитрофуран-2-ил)карбонил]-2'-пропил-1H,7'H-спиро[азетидин-3,5'-фуро[3,4-d]пиримидин]формулы 1 в отношении штамма H₃₇R.V, где по оси абсцисс - концентрация соединения (мкг/мл) формулы 1, по оси ординат - индикатор роста культуры, нормированный на контрольные значения медианных величин цвета чистого резазурина без культуры МБТ и культуры МБТ без добавления соединения формулы 1. Значение МИК=0,0284 мкг/мл

Фиг. 2. Минимальная ингибирующая концентрация(МИК) соединения 1-[(5-нитрофуран-2-ил)карбонил]-2'-пропил-1H,7'H-спиро[азетидин-3,5'-фуро[3,4-d]пиримидин]формулы 1 в отношении клинического штамма 4542 с множественной лекарственной устойчивостью, где по оси абсцисс - концентрация соединения (мкг/мл) формулы 1, по оси ординат - индикатор роста культуры, нормированный на контрольные значения медианных величин цвета чистого резазурина без культуры МБТ и культуры МБТ без добавления соединения формулы 1. Значение МИК=0, 0285 мкг/мл

Фиг. 3. Минимальная ингибирующая концентрация(МИК) соединения 1-[(5-нитрофуран-2-ил)карбонил]-2'-пропил-1H,7'H-спиро[азетидин-3,5'-фуро[3,4-d]пиримидин] формулы 1 в отношении клинического штамма 7074 с множественной лекарственной устойчивостью, где по оси абсцисс - концентрация соединения (мкг/мл) формулы 1, по оси ординат - индикатор роста культуры, нормированный на контрольные значения медианных величин цвета чистого резазурина без культуры МБТ и культуры МБТ без добавления соединения формулы 1. Значение МИК=0,0775 мкг/мл

Фиг. 4. Минимальная ингибирующая концентрация(МИК) соединения 1-[(5-нитрофуран-2-ил)карбонил]-2'-пропил-1H,7'H-спиро [азетидин-3,5'-фуро [3,4-d]пиримидин]формулы 1, где по оси абсцисс - концентрация соединения (мкг/мл) формулы 1, по оси ординат - индикатор роста культуры, нормированный на контрольные значения медианных величин цвета чистого резазурина без культуры МБТ и культуры МБТ без добавления соединения формулы 1. Значение МИК=0,0258 мкг/мл

Фиг. 5. Минимальная ингибирующая концентрация(МИК)соединения 1-[(5-нитрофуран-2-ил)карбонил]-2'-пропил-1H,7'H-спиро[азетидин-3,5'-фуро[3,4-d]пиримидин]формулы 1 в отношении клинического штамма 6691 с множественной лекарственной устойчивостью, где по оси абсцисс - концентрация соединения (мкг/мл) формулы 1, по оси ординат - индикатор роста культуры, нормированный на контрольные значения медианных величин цвета чистого резазурина без культуры МБТ и культуры МБТ без добавления соединения формулы 1. Значение МИК=0,0135 мкг/мл

Фиг. 6. Цитотоксические свойства соединения формулы 1 в клетках Vero.

Примеры практического осуществления.

Пример 1. Методика получения 1-[(5-нитрофуран-2-ил)карбонил]-2'-пропил-1H,7'H-спиро[азетидин-3,5'-фуро[3,4-d]пиримидина]формулы 1.

Синтезировали по методике, описанной в литературе [Le Manach, С.; Dam, J.; Woodland et al. Identification and Profiling of a Novel Diazaspiro[3.4]octane Chemical Series Active against Multiple Stages of the Human Malaria Parasite Plasmodium falciparum and Optimization Efforts. J. Med. Chem.2021, 64, 2291-2309.]. К суспензии NaH (60%-ная дисперсия в вазелиновом масле, 1,88 г, 0,047 моль, 1,15 экв.) в ТГФ (150 мл) прикапывали триэтилфосфоноацетат (11 г, 0,054 моль, 1,2 экв.) при 0°С. Полученную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 30 минут. Затем снова охлаждали до 0°С и добавляли трет-бутил-3-оксазетидин-1-карбоксилат (7 г, 0,041 моль, 1,0 экв.) в ТГФ (50 мл). Реакционную смесь вновь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в этих условиях в течение ночи. Затем реакцию разбавляли этилацетатом, промывали насыщенным водным раствором NaHCO₃, водой и насыщенным водным раствором NaCl. Органическую фазу отделяли, сушили над безводным Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле, элюируя смесью этилацетата в гексане 0→10%. Выход 2 - 9 г (92%), прозрачное масло. Спектральные данные соединения 2 соответствовали литературным данным: ¹Н NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 5.74 (дд, J=4.5, 2.2 Hz, 1Н), 4.80 (дд, J=6.3, 2.9 Hz, 2H), 4.57 (дт, J=5.3, 2.7 Hz, 2H), 4.31-4.02 (м, 2H), 1.45 (с, 9H), 1.26 (т, J=7.1 Hz, 3H); LCMS (ESI): m/z рассчитанный для C₂₁H₃₀N₂O₄ (M+H), 242.3; обнаруженный 242.2.

трет-Бутил 7-оксо-5-окса-2-азаспиро[3.4]октан-2-карбоксилат (3)

Синтезировали по методике, описанной в литературе [D.B. Li, М. Rogers-Evans, Е.М. Carreira.Construction of multifunctional modules for drug discovery: synthesis of novel thia/oxa-azaspiro[3.4]octanes. Org. Lett. 2013, 15, 4766-4769.]

К суспензии NaH (60% дисперсия в вазелиновом масле, 4.2 г, 0.105 моль,) в сухом эфире (150 мл) под аргоном по каплям добавляется метиловый эфир гликолевой кислоты (8.1 мл, 105 ммоль). Полученная смесь перемешивается 30 мин при комнатной температуре, после чего растворители удаляются в вакууме, затем добавляется 200 мл сухого ДМСО. После охлаждения до 0°С, добавляется раствор непредельного эфира 2(21 г, 87.2 ммоль) в сухом ДМСО (20 мл). Реакционная смесь нагревается до комнатной температуры и оставляется перемешиваться на ночь. Смесь разбавляется водной HCl (5%) и эфиром, водная фаза дважды экстрагируется эфиром. Органическая фаза отделяется, сушится Na₂SO₄ и концентрируется под вакуумом с образованием желтоватого масла. Полученное масло растворяется в смеси ДМСО (300 мл) и воды (30 мл) с добавлением NaCl (10.2 г, 175 ммоль). Полученная смесь нагревается при 120°С 2 ч под аргоном. После охлаждения до комнатной температуры смесь разбавляется насыщенным раствором NaCl и диэтиловым эфиром, водный слой дважды экстрагируется диэтиловым эфиром. Органические фазы объединяются, полученный раствор промывается водой, сушится над Na₂SO₄ и концентрируется под вакуумом с образованием желтоватого масла которое очищается колоночной хроматографией на силикагеле (элюент гексан: этилацетат 4.5: 1). Выход 2-12 г (61%), прозрачное масло. Спектральные данные соединения 3 соответствовали литературным данным

¹HNMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 4.06-3.81 (м, 6Н), 2.78 (с, 2Н), 1.36 (с, 9Н); LCMS (ESI): m/z (М+Н) рассчитанный для C₁₁H₁₈NO₄, 228.3; обнаруженный, 228.2.

трет-Бутил-2'-пропил-1H,7'Н-спиро[азетидин-3,5'-фуро[3,4-d]пиримидин]-1-карбоксилат (5)

Кетон 3 (2.24 г, 0.01 моль) растворяют в диметилацетале ДМФА (13 мл, 10 экв) иперемешивают при кипячении ночь. Избыток ацеталя ДМФА удаляют в вакууме, затем перерастворяют смесь в толуоле и снова упаривают. Остаток растворяют в 10 мл метанола и прикапывают к предварительно приготовленному охлажденному до 0°С раствору гидрохлорида пропилкарбоксимидамида (1.89 г, 0.015 моль, 1.5 зкв.) в 30 мл метанола и метилата натрия (0.9 г, 0.017 моль, 1.7 экв), раствор нагревают при кипении 8 часов. Растворитель упаривают, распределяют вещество между водным раствором лимонной кислоты и хлористым метиленом. Органическую фазу отделяют, промывают водой, сушат над сульфатом натрия и упаривают. Полученный продукт выделяют хроматографией на силикагеле, система этилацетат: гексан 1:1- чистый этилацетат. Выход соединения 5 1.67 г (55%), белое твердое вещество, t_пл.=54-55°С. ¹HNMR (300 MHz, CDCl₃) δ 8.71 (с, 1Н), 4.99 (с, 2Н), 4.31 (дд, J=9.5, 0.9 Hz, 2Н), 4.15-4.09 (м, 2Н), 3.06-2.80 (м, 2Н), 1.92-1.75 (м, 2Н), 1.46 (с, 9Н), 0.97 (т, J=7.4 Hz, 3Н); ¹³CNMR(75 MHz, CDCl₃) δ 172.08, 169.46, 156.31, 149.68, 129.73, 80.71, 80.27, 71.83, 41.27, 28.31, 22.20, 13.87; HRMS (ESI) m/z рассчитанный для C₁₆H₂₄N₃O₃ [M+H⁺] 306.1812, обнаруженный, 306.1816.

1-[(5-Нитрофуран-2-ил)карбонил]-2'-пропил-1H,7'Н-спиро[азетидин-3,5'-фуро[3,4-d]пиримидин] (1)

Раствор А. К раствору 5-нитрофурановой кислоты (75 мг, 0.47 ммоль) в 3 мл DMF при 0°С добавляли карбонилдиимидазол (97 мг, 0.6 ммоль) и перемешивали 1 час.

Раствор В. К раствору соединения 5 (0.18 г, 0.6 ммоль) в 5 мл хлористого метилена при 0°С прикапывают 1 мл CF₃COOH, перемешивают 1 час (контроль реакции по ТСХ), упаривают под вакуумом при температуре не более 30°С. Остаток растворяют в 3 мл ДМФА, прикапывают триэтиламин (0.19 г, 1.9 ммоль), перемешивают 30 минут и прикапывают к раствору А. Реакционную массу перемешивают ночь, выливают в 25 мл воды и экстрагируют этилацетатом (3 раза по 20 мл). Органические фазы объединяют, промывают насыщенным раствором NaCl, сушили над Na₂SO₄ и упаривали под вакуумом. Остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле (элюент CH₂Cl₂:МеОН10:1). Выход соединения 1 59 мг (36%), белое твердое вещество, t_пл.=78-79°C. ¹HNMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 9.06 (с, 1Н), 7.81 (д, J=3.9 Hz, 1H), 7.39 (л, J=3.9 Hz, 1H), 5.05 (с, 2H), 4.89 (АВкв, J_AB=10.3 Hz, Δν_AB=37.6 Hz, 2H), 4.43 (АВкв, J_AB=11.3 Hz, Δν_AB=57.9 Hz, 2H), 2.88 (t, J=7.5 Hz, 2H), 1.88 - 1.64 (м, 2H), 0.92 (т, J=7.4 Hz, 3H); ¹³CNMR (75 MHz, DMSO-d₆) 6 171.07, 169.95, 156.84, 151.54, 147.78, 128.99, 117.53, 113.56, 82.00, 71.43, 66.66, 63.26, 21.74, 14.07;HRMS (ESI) m/z рассчитанный для C₁₆H₁₇N₄O₅ [M+H⁺] 345.1193, обнаруженный, 345.1188.

Способ получения соединения1-[(5-нитрофуран-2-ил)карбонил]-2'-пропил-1H,7'H-спиро[азетидин-3,5'-фуро[3,4-d]пиримидина]формулы 1 разработан и проведен в лабораторных условиях. Преимущество данного способа получения заключается в том, что он позволяет напрямую вводить в реакцию ацилирования соединение 5 без предварительного выделения спироциклического амина, что сокращает число синтетических операций и упрощает синтез.

Пример 2. Противотуберкулезная активность соединения 1-[(5-нитрофуран-2-ил)карбонил]-2'-пропил-1H,7'H-спиро[азетидин-3,5'-фуро[3,4-d]пиримидина] формулы 1 (исследование in vitro)

Исследование антимикобактериальной активности проводили методом двукратных серийных микроразведений в жидкой синтетической среде Миддлбрука (Middlebrook 7Н9 BrothBase, Sigma-Aldrich, кат. №M0178) с 10% ростовой добавки OADC (BBL Middlebrook OADC Enrichment, BectonDickinson, кат. №245116) в 96-луночном планшете с индикацией роста микобактерий с помощью 0,01% резазурина (Resazurin sodium salt, Sigma, кат. №R7017) [метод REMA - Resazurin Microdilution Assay; Palomino J.-C., Martin A., Camacho M., Guerra H., Swings J., Portaels F. Resazurin Microtitre Assay Plate Simple and Inexpensive method for Detection of Drug Resistance in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother. 2002. 46(80): 2720-2722]. Исследованный диапазон доз соединения 1 - от 100 до 0.4 мкг/мл и от 1,0 до 0,004 мкг/мл. Во все лунки вносили рабочие суспензии М. tuberculosis H37Rv или клинических штаммов МБТ в объеме 100 мкл, кроме: ряд 10 - контроль суспензии МБТ, ряд 11 - контроль роста суспензии МБТ, разведенной в 100 раз (1% контроль); ряд 12 - контроль питательной среды/«бланк» (200 мкл). На 7 сутки инкубации при +35°С во все лунки добавляли по 30 мкл водного раствора резазурина с концентрацией 0.01%. Планшеты повторно инкубировали 18 ч при +35°С. Рост микобактерий регистрировали визуально по изменению цвета индикатора резазурина (с голубого на розовый).

Величину минимальной ингибирующей концентрация (МИК) вычисляли как средние значения интенсивности свечения индикатора роста (резаруфина, в который превращается резазурин при воздействии комплекса редуктаз микроорганизмов).

В качестве кривой «доза-эффект» использовалась стандартная для биохимических и биомедицинских исследований [Motulsky H., Christopoulos A. Fittingmodels to biological data using linear and nonlinear regression: a practical guide to curvefitting. Oxford University Press, 2004] функция Хилла

с четырьмя параметрами: b₁ и b₂ задают, соответственно, верхнюю и нижнюю асимптоты кривой отклика построенной регрессией непосредственно экспериментальных данных (в силу экспериментальной неопределенности данных они могут отличаться от 0 и 1), b₃=IC₅₀ - концентрация, при которой кривая ингибирования принимает половинное значение между асимптотами; b₄ - феноменологический степенной показатель функции Хилла. Применимость данного подхода для нахождения МИК в резазуриновом тесте с использованием данных о флуоресценции резоруфина была установлена ранее [Postnikov Е.В., Lavrova A.I. Statistical features of REMA data of antimycobacterial drug screening and determining the minimal inhibitory concentration. 2021 6th International Conference on Intelligent Informatics and Biomedical Sciences (ICIIBMS). IEEE, 2021. P. 107-108].

В подходе данной работы за значение МИК принимается концентрация, соответствующая увеличению отклика на расстояния между асимптотами кривой Хилла, полученной нелинейной регрессией (на основе алгоритма Левенберга-Марквардта), что соответствует бинарному характеру классифицирующего метода и характерному масштабу медианного отклонения данных. Для функции Хилла с известными параметрами это значение находится аналитически как

В качестве тест-штаммов использовали:

1) международный стандартный тест-штамм Mycobacterium tuberculosis H₃₇Rv - чувствительный к противотуберкулезным препаратам (ТВС # 1/47, источник - Институт гигиены и эпидемиологии, Прага, 1976 г., получен из ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России).

2) 4 клинических штамма Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью и различными сочетаниями мутаций в генах rpoВ (резистентность к рифампицину), katG, inhA, ahpC (устойчивость к изониазиду) из коллекции ФГБУ «Санкт-Петербургского научно-исследовательского института фтизиопульмонологии» Минздрава России:

- штаммы 4542 (SIT266) и 7074 (SIT252) Евро-Американской линии (Lineage 4), генотип Latin-American Mediterranean (LAM):

- штаммы 396y (SIT1) и 6691 (SIT269) Восточно-Азиатской линии (Lineage 2) генотип Beijing, сублиния early ancient Beijing RD181 - intact.

Результаты определения МИК соединения формулы 1 для стандартного тест-штамма М. tuberculosis H37R.V и клинических лекарственно устойчивых штаммов М. tuberculosis представлены в таблице 1 и Фиг. 1-5.

Из представленных в таблице 1 данных видно, что тестируемое соединение формулы I проявляет антимикобактериальный эффект в отношении всех использованных штаммов МБТ как чувствительного, так и лекарственно устойчивых. Наиболее выраженная ингибирующая активность зарегистрирована в отношении клинического штамма 6691 генотипа Beijing с множественной лекарственной устойчивостью.

Пример 3. Исследование цитотоксичности соединения 1-[(5-нитрофуран-2-ил)карбонил]-2'-пропил-1H,7'H-спиро[азетидин-3,5'-фуро[3,4-d]пиримидина] формулы 1 in vitro

Оценка цитотоксичности соединения формулы I проводилась на клеточной линии Vero (АТСС CCL-81) при помощи метилтетразолиевого метода (МТТ) [MosmannT. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays.// Journal of Immunological Methods. 1983. Dec 16; 65(1-2):55-63.]. Использовали серию трехкратных разведений тестируемого соединения от 300 до 3,7 мкг/мл. Оптическую плотность измеряли с помощью планшетного анализатора Multiscan FC (Thermo Scientific) при длине волны 540 нм.

Процент жизнеспособных клеток в лунке вычисляли по формуле:

V=(ODd/ODc)xODc,

где V - процент жизнеспособных клеток, ODd и ODc -оптическая плотность в лунках с препаратом и в контроле клеток без препарата, соответственно. На основании полученных данных рассчитывали 50% цитотоксическую концентрацию (СС₅₀), т.е. концентрацию соединения I, снижающую оптическую плотность в лунках вдвое по сравнению с контрольными клетками без препаратов. Расчет СС₅₀ проводили при помощи пакета программ GraphPadPrism 6.01 с использованием расчетной опции «нелинейная регрессия, 4-параметрическое уравнение».

Согласно полученным данным, значение СС₅₀ для тестируемого соединения I составило больше 300 мкг/мл, что свидетельствует об отсутствии цитотоксического эффекта в клетках Vero (Фиг. 6).

Пример 4. Исследование острой токсичности 1-[(5-нитрофуран-2-ил)карбонил]-2'-пропил-1H,7'H-спиро[азетидин-3,5'-фуро[3,4-d]пиримидина] на мышах линии C57black/6

Исследование острой токсичности соединения выполнено на 80 мышах-самцах линии C57black/6 (6-8 недель, 21-23 г), полученных из питомника "Андреевка" - филиала ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий» ФМБА. Животные содержались в условиях сертифицированного вивария ФГБУ «СПб НИИФ» Минздрава России. Все животные были синхронизированы по условиям содержания и кормления. Свежеприготовленные растворы соединения формулы 1 с применением ТВИН-80 (в виде суспензии) вводили мышам однократно внутрибрюшинно в возрастающих дозах. Диапазон исследуемых доз составил 200-1800 мг/кг, интервал между дозами - 400 мг/кг, каждую дозу исследовали на 5 особях. Контрольные животные получали аналогичные объемы стерильной дистиллированной воды. Токсическое действие тестируемого соединения исследовали по параметрам общего состояния, объемам потребления корма и воды, вегетативным реакциям. Период наблюдения составил 14 дней.

Расчет ЛД₅₀ производили по методу Першина [Методы экспериментальной медицины (Практическое руководство) / под редакцией Г.Н. Першина. - Москва: Медицина, 1971. - С.529] по формуле:

где (а+b) - сумма смежных доз; числа животных, погибших; (m-n) - разность % смертности от двух последующих доз.

Как видно из представленных выше данных, величина ЛД₅₀ тестируемого соединения составила 1280 мг/кг. Гибель животных при внутрибрюшинном введении смертельных доз (более 1800 мг/кг) наблюдалась в течение от трех до двенадцати часов от момента введения вещества. В остальные дни общее состояние и поведение экспериментальных животных не отличались от контрольной группы. При аутопсии животных, переживших интоксикацию, не обнаружено видимых изменений внутренних органов.

Анализ изученных параметров острой токсичности, а именно: результаты токсикометрии и наблюдений за экспериментальными животными в постинтоксикационном периоде острого отравления, позволяет отнести тестируемое соединение к V классу - практически не токсично [Hodge H.et al. Clinical Toxicology of Commercial Products. Acute Poisoning. Ed. TV, Baltimor, 1975, 427p.]

Таким образом, соединение 1-[(5-нитрофуран-2-ил)карбонил]-2'-пропил-1H,7'H-спиро[азетидин-3,5'-фуро[3,4-d]пиримидин]формулы 1 обладает выраженным ингибирующим действием in vitro в отношении чувствительного и клинических лекарственно устойчивых штаммов М. tuberculosis, в том числе с множественной лекарственной устойчивостью, не оказывает цитотоксического эффекта в клетках Vero in vitro. Величина ЛД₅₀(1280 мг/кг) и хорошая переносимость при внутрибрюшинном введении мышам линии C57black/6 позволяет рассматривать изученное соединение в качестве перспективного для применения в медицинской практике.

Изобретение относится к области органической химии и медицины, а именно к индивидуальному 1-[(5-нитрофуран-2-ил)карбонил]-2'-пропил-1H,7'H-спиро[азетидин-3,5'-фуро[3,4d]пиримидину] формулы 1, обладающему противотуберкулезной активностью в отношении возбудителя с множественной лекарственной устойчивостью, а также к способу его получения. Техническим результатом изобретения является получение нового соединения формулы 1, которое потенциально может быть применено в медицине в качестве лекарственного средства, разработка способа его синтеза, а также выявленная противотуберкулезная активность in vitro в отношении стандартного и клинических лекарственно устойчивых штаммов М. tuberculosis. 2 н.п. ф-лы, 6 ил., 2 табл., 4 пр.

1. 1-[(5-Нитрофуран-2-ил)карбонил]-2'-пропил-1H,7'H-спиро[азетидин-3,5'-фуро[3,4-d]пиримидин]формулы 1, обладающий противотуберкулезной активностью в отношении возбудителя туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью

2. Способ получения соединения по п. 1, заключающийся во взаимодействии в сухом диметилформамиде имидазолида 5-нитрофуран-2-карбоновой кислоты и спироциклического амина, получаемого непосредственно перед реакцией обработкой 2-трет-бутил-2'-пропил-1H,7'H-спиро[азетидин-3,5'-фуро[3,4-d]пиримидин]-1-карбоксилата раствором трифторуксусной кислоты в сухом хлористом метилене при температуре 0°С.