1-[(5-нитрофуран-2-ил)карбонил]-2'-циклогексил-1H,7'H-спиро[азетидин-3,5'-фуро[3,4-d]пиримидин], обладающий противотуберкулезной активностью в отношении возбудителя туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью, и способ его получения Российский патент 2024 года по МПК C07D491/20 A61K31/519 A61P31/06 

Изобретение относится к химии органических гетероциклических соединений, а именно к индивидуальному 1-[(5-нитрофуран-2-ил)карбонил]-2'-циклогексил-1Н,7'H-спиро[азетидин-3,5'-фуро[3,4-d]пиримидину]формулы 1, проявляющему противотуберкулезные свойства, и способу его получения.

В XXI веке общественное здравоохранение всех стран столкнулось с одной из важнейших проблем тысячелетия - отсутствием положительного ответа на исход инфекционных заболеваний, в том числе туберкулеза, на проводимое антибактериальное лечение [Наумов А.Г., Павлунин А.В. Механизмы развития лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis: есть ли шанс победить? Пульмонология. 2021; 31 (1): 100-8. https://doi.org/10.18093/0869- 0189-2021-31-1-100-108]. По данным ВОЗ, за последние 10 лет около 3-4% новых случаев туберкулеза (ТБ) и 18-21% рецидивов было вызвано штаммами микобактерий (МБТ), устойчивыми к рифампицину или штаммами с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) - устойчивыми к изониазиду и рифампицину - двум наиболее мощным противотуберкулезным препаратам) [Global tuberculosis report 2022. Geneva: World Health Organization; 2022]. На МЛУ ТБ приходится около 29% смертей, связанных с устойчивостью к антибактериальным препаратам [Singh V., Chibale K. Strategies to Combat Multi-Drug Resistance in Tuberculosis. Acc. Chem. Res. 2021;54(10):2361-2376].

Ассортимент противотуберкулезных препаратов (ПТП) невелик, поэтому возможности химиотерапии для лечения пациентов с МЛУ МБТ ограничены, причем иногда необходимо использование комбинаций ПТП, опыт применения которых достаточно скудный. В рекомендации ВОЗ 2020 года включены новые лекарственные препараты - бедаквилин, линезолид, клофазимин, деламанид, претоманид [Химова Е.С., Перхин Д.В., Свешникова О.М. и др. Деламанид в лечении МЛУ/пре-ШЛУ ТБ в Архангельской области в 2019-2021 годах. Туберкулез и болезни легких. 2023; 101 (3):62-68]. Бедаквилин зарегистрирован как противотуберкулезный препарат в Российской Федерации в 2013 году. Линезолид, зарегистрированный несколькими годами ранее, стал применяться как перепрофилированный препарат для лечения туберкулеза одновременно с бедаквилином. Клофазимин и претоманид не могут быть использованы в Российской Федерации по причине отсутствия их регистрации. Деламанид является вторым новым противотуберкулезным препаратом, зарегистрированным в России (май 2020 г. ), но еще не получил широкого практического применения. Лечение пациентов с устойчивостью МБТ к рифампицину и с МЛУ МБТ длительное, приводящее к развитию побочных эффектов при высокой затратности на организацию и проведение лечебного процесса (≥1000 долларов США на пациента). Мировые показатели успешного лечения МЛУ ТБ, как правило, находятся в диапазоне 50-75%.

Если же допустить дальнейшее распространение и совершенствование механизмов лекарственной устойчивости М. tuberculosis, тогда маловероятно, что человечество сможет достичь установленных индикаторов ВОЗ(2018) в сокращении смертности и заболеваемости туберкулезом к 2030 г. на 90 и 80% соответственно [Наумов А.Г., Павлунин А.В. Механизмы развития лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis: есть ли шанс победить? Пульмонология. 2021; 31 (1): 100-8]. Более того, по некоторым прогнозам, если не препятствовать появлению и развитию МЛУ/ШЛУ-штаммов, то очень скоро мир повсеместно может столкнуться с тотальной ЛУ МБТ к препаратам I, II и резервного ряда, при этом смертность от туберкулеза к 2050 г. сможет превзойти таковую от онкологических заболеваний.

Поэтому поиск новых молекул, обладающих антимикобактериальной активностью и низким уровнем токсичности, является одним из важнейших и приоритетных направлений "Стратегии развития здравоохранения в Российской Федерации на период до 2025 года" [http://www.kremlin.ru/acts/bank/44326].

Задачей предлагаемого изобретения является создание нового неописанного в литературе соединения 1-[(5-нитрофуран-2-ил)карбонил]-2'-циклогексил-1H,7'H-спиро[азетидин-3,5'-фуро[3,4-d]пиримидина]формулы 1, что позволит расширить арсенал потенциальных противотуберкулезных препаратов.

Техническим результатом при использовании изобретения является получение нового соединения формулы 1, которое потенциально может быть применено в медицине в качестве лекарственного средства; разработка способа его синтеза; выявленная противотуберкулезная активность in vitro в отношении стандартного и клинических лекарственно устойчивых штаммов М. tuberculosis.

Задача решается также тем, что способ получения соединения 1-[(5-нитрофуран-2-ил)карбонил]-2'-циклогексил-1H,7'H-спиро[азетидин-3,5'-фуро[3,4-d]пиримидина] формулы 1, осуществляется путем взаимодействия в сухом диметилформамидеимидазолида 5-нитрофуран-2-карбоновой кислоты и спироциклического амина, получаемого непосредственно перед реакцией обработкой 2-трет-бутил-2'-циклогексил-1H,7'H-спиро[азетидин-3,5'-фуро[3,4-d]пиримидин]-1-карбоксилата (формулы 5) раствором трифторуксусной кислоты в сухом хлористом метилене при температуре 0°С.

Задача решается также тем, что соединение формулы 1 обладает противотуберкулезной активностью, проявляемой в отношении чувствительного стандартного штамма H₃₇RV и лекарственно устойчивых клинических изолятов МБТ.

Изобретение поясняется чертежами, где:

Фиг 1. Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) соединения 1-[(5-нитрофуран-2-ил)карбонил]-2'-циклогексил-1H,7'H-спиро[азетидин-3,5'-фуро[3,4-d]пиримидин]формулы 1 в отношении штамма H₃₇R.V, где по оси абсцисс - концентрация соединения формулы 1, по оси ординат - индикатор роста культуры, нормированный на контрольные значения медианных величин цвета чистого резазурина без культуры МБТ и культуры МБТ без добавления соединения формулы 1. Величина МИК=0,0 497 мкг/мл

Фиг. 2. Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) соединения 1-[(5-нитрофуран-2-ил)карбонил]-2'-циклогексил-1H,7'H-спиро [азетидин-3,5'-фуро [3,4-йОпиримидин]формулы 1 в отношении клинического штамма 4542 с множественной лекарственной устойчивостью, где по оси абсцисс - концентрация соединения формулы 1, по оси ординат - индикатор роста культуры, нормированный на контрольные значения медианных величин цвета чистого резазурина без культуры МБТ и культуры МБТ без добавления соединения формулы 1. Величина МИК=0,0279 мкг/мл

Фиг. 3. Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) соединения 1-[(5-нитрофуран-2-ил)карбонил]-2'-циклогексил-1H,7'H-спиро[азетидин-3,5'-фуро[3,4-d] пиримидин] формулы 1 в отношении клинического штамма 7074 с множественной лекарственной устойчивостью, где по оси абсцисс - концентрация соединения формулы 1, по оси ординат - индикатор роста культуры, нормированный на контрольные значения медианных величин цвета чистого резазурина без культуры МБТ и культуры МБТ без добавления соединения формулы 1. Величина МИК=0,0829 мкг/мл

Фиг. 4. Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) соединения 1-[(5-нитрофуран-2-ил)карбонил]-2'-циклогексил-1H,7'H-спиро[азетидин-3,5'-фуро[3,4-d]пиримидин]формулы 1 в отношении клинического штамма 396у с множественной лекарственной устойчивостью, где по оси абсцисс - концентрация соединения формулы 1, по оси ординат - индикатор роста культуры, нормированный на контрольные значения медианных величин цвета чистого резазурина без культуры МБТ и культуры МБТ без добавления соединения формулы 1. Величина МИК=0,017 мкг/мл

Фиг. 5. Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) соединения 1-[(5-нитрофуран-2-ил)карбонил]-2'-циклогексил-1H,7'H-спиро[азетидин-3,5'-фуро[3,4-d] пиримидин] формулы 1 в отношении клинического штамма 6691 с множественной лекарственной устойчивостью, где по оси абсцисс - концентрация соединения формулы 1, по оси ординат - индикатор роста культуры, нормированный на контрольные значения медианных величин цвета чистого резазурина без культуры МБТ и культуры МБТ без добавления соединения формулы 1. Величина МИК=01,0152 мкг/мл

Фиг. 6. Цитотоксические свойства соединения формулы 1 в клетках Vero.

Примеры практического осуществления.

Пример 1. Методика получения 1-[(5-нитрофуран-2-ил)карбонил]-2'-циклогексил-1H,7'H-спиро[азетидин-3,5'-фуро[3,4-d]пиримидина]формулы 1.

трет-Бутил 3-(2-оксо-2-этоксиэтилиден)азетидин-1-карбоксилат(2)

Синтезировали по методике, описанной в литературе [Le Manach, С; Dam, J.; Woodland et al. Identification and Profiling of a Novel Diazaspiro[3.4]octane Chemical Series Active against Multiple Stages of the Human Malaria Parasite Plasmodium falciparum and Optimization Efforts. J. Med. С hem. 2021, 64, 2291-2309.]. К суспензии NaH (60%-ная дисперсия в вазелиновом масле, 1,88 г, 0,047 моль, 1,15 экв.) в ТГФ (150 мл) прикапывали триэтилфосфоноацетат (11 г, 0,054 моль, 1,2 экв.) при 0°С. Полученную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 30 минут. Затем снова охлаждали до 0°С и добавляли трет-бутил-3-оксазетидин-1-карбоксилат (7 г, 0,041 моль, 1,0 экв.) в ТГФ (50 мл). Реакционную смесь вновь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в этих условиях в течение ночи. Затем реакцию разбавляли этилацетатом, промывали насыщенным водным раствором NaHCO₃, водой и насыщенным водным раствором NaCl. Органическую фазу отделяли, сушили над безводным Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле, элюируя смесью этилацетата в гексане 0→10%. Выход 2-9 г (92%), прозрачное масло. Спектральные данные соединения 2 соответствовали литературным данным: 'Н NMR (300 MHz, CDCl) δ 5.74 (дд, J=4.5, 2.2 Hz, 1Н), 4.80 (дд, J=6.3, 2.9 Hz, 2H), 4.57 (дт, J=5.3, 2.7 Hz, 2H), 4.31-4.02 (м, 2H), 1.45 (с, 9H), 1.26 (т, J=7.1 Hz, 3H); LCMS (ESI): m/z рассчитанный для C₂₁H₃₀N₂O₄ (M+H), 242.3; обнаруженный 242.2.

трет-Бутил 7-оксо-5-окса-2-азаспиро[3.4]октан-2-карбоксилат (3)

Синтезировали по методике, описанной в литературе [D.B. Li, М. Rogers-Evans, Е.М.Carreira. Construction of multifunctional modules for drug discovery: synthesis of novel thia/oxa-azaspiro[3.4]octanes. Org. Lett. 2013, 15, 4766-4769.]

К суспензии NaH (60% дисперсия в вазелиновом масле, 4.2 г, 0.105 моль,) в сухом эфире (150 мл) под аргоном по каплям добавляется метиловый эфир гликолевой кислоты (8.1 мл, 105 ммоль). Полученная смесь перемешивается 30 мин при комнатной температуре, после чего растворители удаляются в вакууме, затем добавляется 200 мл сухого ДМСО. После охлаждения до 0°С, добавляется раствор непредельного эфира 2(21 г, 87.2 ммоль) в сухом ДМСО (20 мл). Реакционная смесь нагревается до комнатной температуры и оставляется перемешиваться на ночь. Смесь разбавляется водной НС1 (5%) и эфиром, водная фаза дважды экстрагируется эфиром. Органическая фаза отделяется, сушится Na₂SO₄ и концентрируется под вакуумом с образованием желтоватого масла. Полученное масло растворяется в смеси ДМСО (300 мл) и воды (30 мл) с добавлением NaCl (10.2 г, 175 ммоль). Полученная смесь нагревается при 120°С 2 ч под аргоном. После охлаждения до комнатной температуры смесь разбавляется насыщенным раствором NaCl и диэтиловым эфиром, водный слой дважды экстрагируется диэтиловым эфиром. Органические фазы объединяются, полученный раствор промывается водой, сушится над Na₂SO₄ и концентрируется под вакуумом с образованием желтоватого масла которое очищается колоночной хроматографией на силикагеле (элюент гексан: этилацетат 4.5: 1). Выход 2-12 г (61%), прозрачное масло. Спектральные данные соединения 3 соответствовали литературным данным

'HNMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 4.06-3.81 (м, 6Н), 2.78 (с, 2Н), 1.36 (с, 9Н); LCMS (ESI): m/z (М+Н) рассчитанный для C₁₁H₁₈NO₄, 228.3; обнаруженный, 228.2.

трет-Бутил-2'-циклогексил-1H,7'Н-спиро[азетидин-3,5'-фуро[3,4-d]пиримидин]-1-арбоксилат (5)

Кетон3 (2.24 г, 0.01 моль) растворяют в диметилацетале ДМФА (13 мл, 10 экв) и перемешивают при кипячении ночь. Избыток ацеталя ДМФА удаляют в вакууме, затем перерастворяют смесь в толуоле и снова упаривают. Остаток растворяют в 10 мл метанола и прикапывают к предварительно приготовленному охлажденному до 0 С раствору гидрохлорида циклогексанкарбоксимидамида (2.45 г, 0.015 моль, 1.5 зкв.) в 30 мл метанола и метилата натрия (0.9 г, 0.017 моль, 1.7 экв), раствор нагревают при кипении 8 часов. Растворитель упаривают, распределяют вещество между водным раствором лимонной кислоты и хлористым метиленом. Органическую фазу отделяют, промывают водой, сушат над сульфатом натрия и упаривают.Полученный продукт выделяют хроматографией на силикагеле, система этилацетат:гексан 1:1 - чистый этилацетат. Выход соединения 5 1.6 г (54%), белое твердое вещество, t_пл.=72-73°C.'HNMR (300 MHz, CDC1₃) δ 8.74 (с, 1Н), 5.02 (с, 2Н), 4.34 (дд, J=9.5, 0.9 Hz, 2Н), 4.23 - 4.06 (м, 2Н), 2.94 (тт, J=11.7, 3.5 Hz, 1Н), 2.11 -1.82 (м, 5Н), 1.79 - 1.54 (м, 4Н), 1.49 (с, 9Н), 1.47 - 1.20 (м, 6Н); ¹³CNMR (75 MHz, CDCl₃) δ 175.38, 169.34, 156.29, 149.64, 129.69, 80.67, 80.23, 71.83, 63.73, 47.45, 31.93, 28.26, 26.11, 25.80; HRMS (ESI) m/z рассчитанный для C₁₉H₂₈N₃O₃ [M+H⁺] 346.2125, обнаруженный, 346.2128.

1-[(5-Нитрофуран-2-ил) карбон ил)-2 '-циклогексил-1H,7'Н-спиро[азетидин-3,5'-фуро(3,4-d]пиримидин] (1)

Раствор А. К раствору 5-нитрофурановой кислоты (75 мг, 0.47 ммоль) в 3 мл DMF при 0°С добавляли карбонилдиимидазол (97 мг, 0.6 ммоль) и перемешивали 1 час.

Раствор В. К раствору соединения 4 (0.21 г, 0.6 ммоль) в 5 мл хлористого метилена при 0°С прикапывают 1 мл CF3COOH, перемешивают 1 час (контроль реакции по ТСХ), упаривают под вакуумом при температуре не более 30°С. Остаток растворяют в 3 мл ДМФА, прикапывают триэтиламин (0.19 г, 1.9 ммоль), перемешивают 30 минут и прикапывают к раствору А. Реакционную массу перемешивают ночь, выливают в 25 мл воды и экстрагируют этилацетатом (3 раза по 20 мл). Органические фазы объединяют, промывают насыщенным раствором NaCl, сушили над Na₂SO₄ и упаривали под вакуумом. Остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле (элюент CH₂Cl₂:МеОН10: 1). Выход соединения 1 65 мг (36%), белое твердое вещество, t_пл.=92-93°C. ¹HNMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 9.06 (с, 1H), 7.81 (д, J=3.8 Hz, 1Н), 7.39 (д, J=3.8 Hz, 1H), 5.05 (с, 2Н), 4.88 (дд, J=39.8, 10.5 Hz, 2Н), 4.43 (дд, J=60.7, 11.3 Hz, 2Н), 2.86 (т, J=9.8 Hz, 1H), 1.99-1.09 (м, 11Н).; ¹³CNMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ 174.36, 169.91, 156.83, 151.59, 147.76, 129.08, 117.53, 113.57, 82.00, 71.47, 66.67, 63.27, 46.97, 31.97, 26.03; HRMS (ESI) m/z рассчитанный для C₁₉H₂₁N₄O₅ [M+H⁺] 385.1506, обнаруженный, 385.1502.

Способ получения соединения 1-[(5-нитрофуран-2-ил) карбонил]-2'-циклогексил-1H,7'H-спиро[азетидин-3,5'-фуро[3,4-d] пиримидина] формулы 1 разработан и проведен в лабораторных условиях. Преимущество данного способа получения заключается в том, что он позволяет напрямую вводить в реакцию ацилирования соединение 5 без предварительного выделения спироциклического амина, что сокращает число синтетических операций и упрощает синтез.

Пример 2. Противотуберкулезная активность соединения 1-[(5-нитрофуран-2-ил)карбонил]-2'-циклогексил-1H,7'H-спиро[азетидин-3,5'-фуро[3,4-d] пиримидина] формулы 1 (исследование in vitro)

Исследование антимикобактериальной активности проводили методом двукратных серийных микроразведений в жидкой синтетической среде Миддлбрука (Middlebrook 7Н9 Broth Base, Sigma-Aldrich, кат.№M0178) с 10% ростовой добавки OADC (BBL Middlebrook OADC Enrichment, BectonDickinson, кат.№245116) в 96-луночном планшете с индикацией роста микобактерий с помощью 0,01% резазурина (Resazurinsodiumsalt, Sigma, кат.№R7017) [метод REMA - Resazurin Microdilution Assay; Palomino J.-С, MartinA., Camacho M., Guerra K, Swings J., Portaels F. Resazurin Microtitre Assay Plate Simple and Inexpensive method for Detection of Drug Resistance in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother. 2002. 46(80): 2720-2722]. Исследованный диапазон доз соединения 1 - от 100 до 0.4 мкг/мл и от 1,0 до 0,004 мкг/мл. Во все лунки вносили рабочие суспензии М. tuberculosis H37Rv или клинических штаммов МБТ в объеме 100 мкл, кроме: ряд 10 - контроль суспензии МБТ. ряд 11 - контроль роста суспензии МБТ, разведенной в 100 раз (1% контроль); ряд 12 - контроль питательной среды/«бланк» (200 мкл). На 7 сутки инкубации при+35°С во все лунки добавляли по 30 мкл водного раствора резазурина с концентрацией 0.01%. Планшеты повторно инкубировали 18 ч при+35°С.Рост микобактерий регистрировали визуально по изменению цвета индикатора резазурина (с голубого на розовый).

В качестве кривой «доза-эффект» использовалась стандартная для биохимических и биомедицинских исследований [Motulsky К, Christopoulos A. Fitting models to biological data usinglinear and nonlinear regression: a practical guide to curvefitting. Oxford University Press, 2004] функция Хилла

с четырьмя параметрами: b₁ и b₂ задают, соответственно, верхнюю и нижнюю асимптоты кривой отклика построенной регрессией непосредственно экспериментальных данных (в силу экспериментальной неопределенности данных они могут отличаться от 0 и 1), b₃=IС₅₀ - концентрация, при которой кривая ингибирования принимает половинное значение между асимптотами; b₄ - феноменологический степенной показатель функции Хилла. Применимость данного подхода для нахождения МИК в резазуриновом тесте с использованием данных о флуоресценциирезоруфина была установлена ранее [Postnikov Е.В., Lavrova A.I. Statistical features of REMA data of antimycobacterial drug screening and determining the minimal inhibitory concentration. 2021 6th International Conference on Intelligent Informatics and Biomedical Sciences (1CIIBMS). IEEE, 2021, P. 107-108].

В подходе данной работы за значение МИК принимается концентрация, соответствующая увеличению откликана 1/4 расстояния между асимптотами кривой Хилла, полученной нелинейной регрессией (на основе алгоритма Левенберга-Марквардта), что соответствует бинарному характеру классифицирующего метода и характерному масштабу медианного отклонения данных.Для функции Хилла с известными параметрами это значение находится аналитически как

В качестве тест-штаммов использовали:

1) международный стандартный тест-штамм Mycobacterium tuberculosis H₃₇Rv -чувствительный к противотуберкулезным препаратам (ТВС # 1/47, источник - Институт гигиены и эпидемиологии, Прага, 1976 г., получен из ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России).

2) 4 клинических штамма Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью и различными сочетаниями мутаций в генах rpoB (резистентность к рифампицину), katG, inhA, ahpC (устойчивость к изониазиду) из коллекции ФГБУ «Санкт-Петербургского научно-исследовательского института фтизиопульмонологии» Минздрава России:

- штаммы 4542 (SIT 266) и 7074 (SIT 252) Евро-Американской линии (Lineage 4), генотип Latin-American Mediterranean (LAM):

- штаммы 396y (SIT1) и 6691 (SIT 269) Восточно-Азиатской линии (Lineage 2) генотип Beijing, сублиния earlyancient Beijing RD181-intact.

Результаты определения МИК соединения формулы 1 для стандартного штамма М. tuberculosis H₃₇Rv и лекарственно устойчивых штаммов М. tuberculosis представлены в таблице 1 и Фиг. 1-5.

Из представленных в таблице 1 данных видно, что тестируемое соединения формулы I проявляет антимикобактериальный эффект в отношении всех использованных штаммов МБТ. Наиболее выраженная минимальная ингибирующая активность отмечена в отношении клинических штаммов 396у и 6691 с множественной лекарственной устойчивостью генотипа Beijing.

Пример 3. Исследование цитотоксичности соединения 1-[(5-нитрофуран-2-ил)карбонил]-2'-циклогексил-1H,7'H-спиро[азетидин-3,5'-фуро[3,4-d]пиримидина] формулы 1 in vitro

Оценка цитотоксичности соединения формулы1проводилась на клеточной линии Vero (АТСС CCL-81)при помощи метилтетразолиевого метода (МТТ) [Mosmann Т. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 1983. Dec 16;65(l-2):55-63.]. Использовали серию трехкратных разведений тестируемого соединения от 300 до 3,7 мкг/мл. Оптическую плотность измеряли с помощью планшетного анализатора Multiscan FC (Thermo Scientific) при длине волны 540 нм.

Процент жизнеспособных клеток в лунке вычисляли по формуле:

V=(ODd/ODc)×ODc, где V - процент жизнеспособных клеток, ODd и ODc -оптическая плотность в лунках с препаратом и в контроле клеток без препарата, соответственно. На основании полученных данных рассчитывали 50% цитотоксическую концентрацию (CC₅₀), т.е. концентрацию соединения1, снижающую оптическую плотность в лунках вдвое по сравнению с контрольными клетками без препаратов. Расчет СС₅₀ проводили при помощи пакета программ GraphPadPrism 6.01 с использованием расчетной опции «нелинейная регрессия, 4-параметрическое уравнение».

Согласно полученным данным, значение СС₅₀ для тестируемого соединения доставило больше 184 мкг/мл, что свидетельствует об отсутствии цитотоксического эффекта в клетках Vero (Фиг. 6).

Пример 4. Исследование острой токсичности 1-[(5-нитрофуран-2-ил)карбонил]-2'-циклогексил-1H,7'H-спиро[азетидин-3,5'-фуро[3,4-d]пиримидина] на мышах линии C57black/6.

Исследование острой токсичности соединения выполнено на 70 мышах-самцах линии C57black/6 (6-8 недель, 22-25 г), полученных из питомника "Андреевка" - филиала ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий» ФМБА. Животные содержались в условиях сертифицированного вивария ФГБУ «СПб НИИФ» Минздрава России. Все животные были синхронизированы по условиям содержания и кормления. Свежеприготовленные растворы соединения формулы 1 с применением ТВИН-80 (в виде суспензии) вводили мышам однократно внутрибрюшинно в возрастающих дозах. Диапазон исследуемых доз составил 100-3000 мг/кг, интервал между дозами - 500 мг/кг, каждую дозу исследовали на 5 особях. Контрольные животные получали аналогичные объемы стерильной дистиллированной воды. Токсическое действие тестируемого соединения исследовали по параметрам общего состояния, объемам потребления корма и воды, вегетативным реакциям. Период наблюдения составил 14 дней.

Расчет ЛД₅₀ производили по методу Першина [Методы экспериментальной медицины (Практическое руководство) / под редакцией Г.Н. Першина. - Москва: Медицина, 1971. - С.529} по формуле:

где (а+b) - суммасмежных доз; числа животных, погибших; (m-n) - разность % смертности от двух последующих доз.

Расчет: (1500+2000)×(40-0)=140000

(2000+2500)×(60-40)=90000

(2500+3000)×(100-60)=220000

∑[(a+b)×(m-n)]=140000+90000+220000=450000

Проведенными исследованиями установлено, что величина ЛД50 тестируемого соединения составила 2250 мг/кг.Гибель животных при внутрибрюшинном введении смертельных доз (более 2500 мг/кг) наблюдалась в течение суток от момента введения. У остальных экспериментальных животных на дозах менее 1500 мг/кг лишь в первые несколько часов отмечались заторможенность, вялость. В остальные дни общее состояние и поведение экспериментальных животных не отличались от контрольной группы. При аутопсии животных, переживших интоксикацию, не обнаружено видимых изменений внутренних органов.

Анализ изученных параметров острой токсичности, а именно: результаты токсикометрии и наблюдений за экспериментальными животными в постинтоксикационном периоде острого отравления, позволяет отнести тестируемое соединение к V классу - практически не токсично [Hodge Н. et al. Clinical Toxicology of Commercial Products. Acute Poisoning. Ed. IV, Baltimor, 1975, 427p.]

Таким образом, соединение 1-[(5-нитрофуран-2-ил)карбонил]-2'-циклогексил-1N,7'N-спиро[азетидин-3,5'-фуро[3,4-d]пиримидин] формулы 1 обладает выраженным ингибирующим действием in vitro в отношении чувствительного и клинических лекарственно устойчивых штаммов М. tuberculosis, в том числе с множественной лекарственной устойчивостью, не оказывает цитотоксического эффекта в клетках Vero in vitro. Величина ЛД₅₀ (2250 мг/кг) и хорошая переносимость при внутрибрюшинном введении мышам линии C57black/6 позволяет рассматривать тестируемое соединение в качестве перспективного для применения в медицинской практике.

Изобретение относится к 1-[(5-нитрофуран-2-ил)карбонил]-2'-циклогексил-1H,7'H-спиро[азетидин-3,5'-фуро[3,4-d]пиримидину] формулы 1, обладающему противотуберкулезной активностью в отношении возбудителя с множественной лекарственной устойчивостью, и способу его получения. Технический результат: получено новое соединение формулы 1, которое может найти применение в качестве вещества для лечения туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью с малой токсичностью и хорошей переносимостью. 2 н.п. ф-лы, 6 ил., 2 табл., 4 пр.

1. 1-[(5-нитрофуран-2-ил)карбонил]-2'-циклогексил-1H,7'H-спиро[азетидин-3,5'-фуро[3,4-d]пиримидин] формулы 1, обладающий противотуберкулезной активностью в отношении возбудителя туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью

.

2. Способ получения соединения по п. 1, заключающийся во взаимодействии в сухом диметилформамиде имидазолида 5-нитрофуран-2-карбоновой кислоты и спироциклического амина, получаемого непосредственно перед реакцией, обработкой 2-трет-бутил-2'-циклогексил-1H,7'H-спиро[азетидин-3,5'-фуро[3,4-d]пиримидин]-1-карбоксилата раствором трифторуксусной кислоты в сухом хлористом метилене при температуре 0°С.